RU2402548C2

RU2402548C2 - Химические линкеры и их конъюгаты

Info

Publication number: RU2402548C2
Application number: RU2006144958/04A
Authority: RU
Inventors: Шарон БОЙД (US); Шарон Бойд; Лян ЧЭНЬ (US); Лян Чэнь; Санджив ГАНГВАР (US); Санджив Гангвар; Винсен ГЕРЛАВЭ (US); Винсен Герлавэ; Килиан ХОРГАН (US); Килиан Хорган; Чжи-Хун ЛИ (US); Чжи-Хун Ли; Билал СУФИ (US); Билал Суфи
Original assignee: Медарекс, Инк.
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2010-10-27
Also published as: US20100092496A1; US20060024317A1; US7691962B2; RU2006144958A; US8399403B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к конъюгатам лекарство-лиганд, которые представляют собой сильнодействующие цитотоксины, в которых лекарство связано с лигандом через пептидный, гидразиновый или дисульфидный линкер. 5 н. и 58 з.п. ф-лы.

Description

Данная заявка утверждает приоритетное преимущество предварительных патентных заявок US 60/572667, US 60/661174 и US 60/669871, которые включены здесь в качестве ссылок.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается линкеров, которые присоединяются к лекарству и лиганду и отщепляются in vivo. Линкеры используют при получении пролекарств и конъюгатов цитотоксинов данного изобретения, а также других диагностических и терапевтических компонентов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие терапевтические агенты, особенно те, которые особо эффективны в химиотерапии рака, часто демонстрируют высокую токсичность in vivo, главным образом, токсичность в отношении головного мозга и слизистой оболочки, а также хроническую кардиологическую и неврологическую токсичность. Такая высокая токсичность может ограничивать их применения. Для большей эффективности против опухолевых клеток и снижения количества и тяжести побочных эффектов (токсичности, деструкции неопухолевых клеток и др.) требуется проведение разработки новых более безопасных специфических терапевтических агентов, в особенности противоопухолевых агентов.

Другой трудностью применения некоторых имеющихся терапевтических агентов является их меньшая (по сравнению с оптимальной) стабильность в плазме. В результате добавления функциональных групп для стабилизации данных соединений получают существенное снижение активности. Таким образом, желательно идентифицировать способы стабилизации соединений, сохраняя при этом приемлемые уровни терапевтической активности.

Поиск более селективных цитотоксических агентов был чрезвычайно активным в течение многих десятилетий, при этом одной из основных причин неудач в лечении рака является ограничивающая дозу токсичность (т.е. нежелательное действие цитотоксинов на нормальные ткани). Например, известно, что CC-1065 и дуокармицины являются чрезвычайно сильнодействующими цитотоксинами.

CC-1065 был впервые выделен из Streptomyces zelensis в 1981 Upjohn Company (Hanka и др., J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin и др., J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin и др., J. Antibiot. 34: 1119 (1981)) и, как обнаружено, обладает сильной противоопухолевой и противомикробной активностью in vitro и на экспериментальных животных (Li и др., Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065 связывается с двухнитевой B-ДНК в малой бороздке (Swenson и др. Cancer Res. 42: 2821 (1982)) с преимущественной последовательностью 5'-d(A/GNTTA)-3' и 5'-d(AAAAA)-3' и алкилирует N3-положение 3'-аденина по его левостороннему CPI-звену, присутствующему в молекуле (Hurley и др., Science 226: 843 (1984)). Несмотря на его сильное и широкое противоопухолевое действие, CC-1065 нельзя использовать на людях, так как он является причиной отсроченной смерти у экспериментальных животных.

Специалистам известны многие аналоги и производные CC-1065 и дуокармицинов. Имеются обзоры по исследованиям структуры, синтеза и свойств многих соединений. Смотри, например, работы Boger и др., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996) и Boger и др., Chem. Rev. 97: 787 (1997).

Группа исследователей из Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd. получила ряд производных CC-1065. Смотри, например, патенты США №№ 5101038; 5641780; 5187186; 5070092; 5703080; 5070092; 5641780; 5101038 и 5084468; опубликованную PCT-заявку WO 96/10405 и опубликованную Европейскую заявку 0537575 A1.

Компания Upjohn (Pharmacia Upjohn) также активно работала над получением производных CC-1065. Смотри, например, патенты США №№ 5739350; 4978757; 5332837 и 4912227.

Исследование фокусировалось также на разработке новых терапевтических агентов, которые имеют форму пролекарств, т.е. соединений, которые способны превращаться в лекарства (активные терапевтические соединения) in vivo при некоторых химических или ферментативных модификациях их структуры. С целью снижения токсичности данную конверсию предпочтительно ограничивают местом воздействия или целевой тканью и не проводят по кровеносной системе или нецелевой ткани. Однако даже пролекарства являются проблематичными, так как многие характеризуются низкой стабильностью в крови и сыворотке вследствие присутствия ферментов, которые разрушают или активируют пролекарства до того, как они достигнут места требуемого воздействия в организме пациента.

Bristol-Myers Squibb описывает особые лизосомальные разрушаемые ферментом конъюгаты противоопухолевых лекарственных средств. Смотри, например, патент США № 6214345. Данный патент касается аминобензилоксикарбонила.

Компания Seattle Genetics опубликовала патентные заявки США 2003/0096743 и 2003/0130189, которые описывают пара-аминобензильные простые эфиры в агентах доставки лекарств. Описанные в данных заявках линкеры ограничены композициями аминобензильных эфиров.

Другие группы специалистов также описывают линкеры. Смотри, например, работы de Groot и др., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot и др., J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot и др., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); WO 02/083180; Carl и др., J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik и др., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998). Данные линкеры включают спейсер в виде аминобензильного простого эфира, системы с вытянутым электронным каскадом и циклизующиеся спейсерные системы, спейсеры, устраняемые при циклизации, например w-аминокарбонилы и пара-аминобензилоксикарбонильный линкер.

Стабильность цитотоксиновых лекарственных препаратов, включая in vivo стабильность, является еще одним важным предметом, который нуждается в рассмотрении. Кроме того, токсичность многих соединений делает их менее пригодными, так что требуются композиции, которые будут снижать токсичность лекарств, например расщепляемые пролекарства. Следовательно, несмотря на успехи в данной области, остается потребность в разработке улучшенных терапевтических агентов для лечения млекопитающих и людей, в частности более специфичных цитотоксинов, которые демонстрируют высокую специфичность действия, пониженную токсичность и улучшенную стабильность в крови по сравнению с известными соединениями аналогичной структуры. Настоящее изобретение направлено на эти цели.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается конъюгатов лекарство-лиганд, в которых лекарство и лиганд связаны пептидным, гидразиновым или дисульфидным линкером. Данные конъюгаты представляют собой сильнодействующие цитотоксины, которые можно селективно доставить к интересующему месту действия в активном виде и затем расщепить с высвобождением активного лекарства. Новые линкерные участки по данному изобретению могут отщепляться от цитотоксических лекарств, например, ферментативными или восстановительными способами in vivo, высвобождая активную лекарственную часть из производного пролекарства. Кроме того, данное изобретение включает конъюгаты линкерных участков и цитотоксинов данного изобретения и конъюгаты линкерных участков, цитотоксина и направляющего агента, например антитела или пептида.

Изобретение также касается групп, подходящих для стабилизации терапевтических агентов и маркеров. Стабилизирующие группы выбраны, например, таким образом, чтобы ограничивать клиренс и метаболизм терапевтического агента или маркера ферментами, которые могут присутствовать в крови или нецелевой ткани. Стабилизирующие группы могут служить для блокировки разложения агента или маркера и также могут действовать, обеспечивая другие физические характеристики агента или маркера, например, повышение растворимости соединения или снижение агрегационных свойств соединения. Стабилизирующая группа может также улучшать стабильность агента или маркера при хранении в виде препаративной формы или самого по себе.

Первый аспект изобретения касается цитотоксического соединения лекарство-лиганд, имеющего структуру, соответствующую любой из формул 1-3

в которых символ D обозначает лекарственную часть, имеющую подвешенную к своей основной цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем указанная функциональная группа выбрана из группы, включающей первичный или вторичный амин, гидроксил, сульфгидрил, карбоксил, альдегид и кетон.

Символ L¹ обозначает саморазрушающийся спейсер, где m равно целому числу из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Символ X⁴ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей защищенные реакционноспособные функциональные группы, незащищенные реакционноспособные функциональные группы, детектируемые метки и направляющие агенты.

Символ L⁴ обозначает линкерный компонент, и p равно 0 или 1. L⁴ представляет собой фрагмент, который придает конъюгатам повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства. Примеры компонентов L⁴ включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может представлять собой линейный, разветвленный или циклический, положительно или отрицательно заряженный такой аминокислотный полимер, как полилизин или полиаргенин, или другой полимер, например полиэтиленгликоль.

Символы F, H и J обозначают линкеры, которые описаны здесь далее. В одном варианте изобретение относится к конъюгату с пептидным линкером структуры

где

D обозначает лекарственную часть, имеющую подвешенную к своей основной цепи химически реакционноспособную функциональную группу, причем указанная функциональная группа выбрана из группы, включающей первичный или вторичный амин, гидроксил, тиол, карбоксил, альдегид и кетон;

L¹ обозначает саморазрушающийся линкер;

m равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

F обозначает линкер, содержащий структуру

где

AA¹ обозначает один или более компонентов, независимо выбранных из группы, включающей природные аминокислоты и искусственные α-аминокислоты;

c равно целому числу от 1 до 20;

L² обозначает саморазрушающийся линкер;

L³ обозначает спейсерную группу, включающую первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу; в которой присутствует L³, m равно 0 и амин группы L³ образует амидную связь с подвешенной карбоксильной функциональной группой от D, или карбоксил от L³ образует амидную связь с подвешенной аминной функциональной группой от D;

о равно 0 или 1;

L⁴ обозначает линкерный компонент, в котором L⁴ не имеет непосредственно присоединенной к N-концу компонента (AA¹)_c карбоксильной ацильной группы;

p равно 0 или 1; и

X⁴ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей защищенные реакционноспособные функциональные группы, незащищенные реакционноспособные функциональные группы, детектируемые метки и направляющие агенты.

В одном варианте конъюгат с пептидным линкером имеет следующую структуру:

В другом варианте конъюгат с пептидным линкером имеет следующую структуру:

В предпочтительном варианте L³ включает ароматическую группу. Например, L³ может включать бензойную кислотную группу, анилиновую группу или индольную группу. Неограничительные примеры -L³-NH- включают структуры, выбранные из следующих групп:

где Z обозначает компонент, выбранный из O, S и NR²³, и

где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.

В предпочтительных вариантах пептидного линкера (AA¹)_с представляет собой пептидную последовательность, расщепляемую протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани. Предпочтительной протеазой является лизосомальная протеаза. В предпочтительных вариантах c равно целому числу от 2 до 6 или с равно 2, 3 или 4. В некоторых вариантах аминокислота в (AA¹)_с, расположенная ближе всего к лекарственной части, выбрана из группы, включающей: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val. В предпочтительных вариантах (AA¹)_с обозначает пептидную последовательность, выбранную из группы, включающей Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2) и Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3). В особо предпочтительных вариантах (AA¹)_с обозначает Val-Cit или Val-Lys.

В некоторых предпочтительных вариантах пептидный линкер F имеет структуру

где

R²⁴ выбран из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил;

каждый K обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR²¹R²², NR²¹COR²², OCONR²¹R²², OCOR²¹ и OR²¹,

где

R²¹ и R²² независимо выбраны из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил; и

a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4.

В других предпочтительных вариантах -F-(L¹)m- имеет структуру

где

каждый R²⁴ обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил.

Другой аспект изобретения касается конъюгатов с гидразиновыми линкерами структуры

где

L¹ обозначает саморазрушающийся линкер;

m равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

X⁴ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей защищенные реакционноспособные функциональные группы, незащищенные реакционноспособные функциональные группы, детектируемые метки и направляющие агенты;

L⁴ обозначает линкерный компонент;

p равно 0 или 1;

H обозначает линкер, включающий структуру

где

n₁ равно целому числу от 1 до 10;

n₂ равно 0, 1 или 2;

каждый R²⁴ обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил; и

I обозначает либо связь, либо

где n₃ равно 0 или 1 при условии, что если n₃ равно 0, то n₂ не равно 0 и n₄равно 1, 2 или 3,

где если I обозначает связь, n₁ равно 3 и n₂ равно 1, D не может быть

где R обозначает Me или CH₂-CH₂-NMe₂.

В некоторых предпочтительных вариантах замещение в фенильном кольце является пара-замещением. В некоторых предпочтительных вариантах n₁ равно 2, 3 или 4, или n₁ равно 3, или n₂ равно 1.

В некоторых вариантах I обозначает связь. В других вариантах n₃ равно 0 и n₄ равно 2.

Разнообразные аспекты изобретения касаются гидразиновых линкеров H, которые могут образовывать 6-членный линкер, саморазрушающийся при разложении, или два 5-членных линкера, саморазрушающихся при разложении, или один 5-членный линкер, саморазрушающийся при разложении, или один 7-членный линкер, саморазрушающийся при разложении, или 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный линкер, саморазрушающийся при разложении.

В предпочтительном варианте H имеет геминальное диметильное замещение.

В предпочтительном варианте H имеет структуру

Предпочтительно n₁ равно 2, 3 или 4, более предпочтительно n₁ равно 3. Предпочтительно каждый R²⁴ независимо выбран из CH₃ и H. В некоторых предпочтительных вариантах каждый R²⁴ обозначает H.

В другом предпочтительном варианте H имеет структуру

Предпочтительно n₁ равно 3. Предпочтительно каждый R²⁴ независимо выбран из CH₃ и H.

В других предпочтительных вариантах H имеет структуру

Предпочтительно каждый R²⁴ независимо обозначает H или замещенный или незамещенный алкил.

Другой аспект изобретения относится к конъюгатам с гидразиновыми линкерами структуры

где

L¹ обозначает саморазрушающийся линкер;

L⁴ обозначает линкерный компонент;

p равно 0 или 1 и

H имеет структуру

где q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 и

Еще один аспект изобретения относится к конъюгатам с дисульфидными линкерами структуры

где

L¹ обозначает саморазрушающийся линкер;

L⁴ обозначает линкерный компонент;

р равно 0 или 1;

J обозначает линкер, имеющий структуру

где

каждый R²⁴ обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил;

каждый K обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR²¹R²², NR²¹COR²², OCONR²¹R²², OCOR²¹ и OR²¹,

где

R²¹ и R²² независимо выбраны из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил и незамещенный гетероциклоалкил;

a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4 и

d равно целому числу из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В различных вариантах J может иметь одну из следующих структур:

Во всех предыдущих линкерных конъюгатах D предпочтительно представляет собой цитотоксическое лекарственное средство. В предпочтительных вариантах D имеет химически реакционноспособную функциональную группу, выбранную из группы, включающей первичный или вторичный амин, гидроксил, сульфгидрил и карбоксил. Неограничительные примеры предпочтительных лекарственных средств D включают дуокармицины и аналоги и производные дуокармицинов, CC-1065, аналоги дуокармицинов на основе CBI, аналоги дуокармицинов на основе MCBI, аналоги дуокармицинов на основе CCBI, доксорубицин, конъюгаты доксорубицина, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, доластатины, долестатин-10, комбретастатин, калихеамицин, майтанзин, аналоги майтанзина, DM-1, ауристатин E, ауристатин EB (AEB), ауристатин EFP (AEFP), монометилауристатин E (MMAE), AE-сложный эфир 5-бензоилвалериановой кислоты (AEVB), тубулизины, дизоразол, эпотилоны, паклитаксел, доцетаксел, SN-38, топотекан, ризоксин, эхиномицин, колхицин, винбластин, виндезин, эстрамустин, цемадотин, элеутеробин, метотрексат, метоптерин, дихлорметотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, цитозин арабинозид, мелфалан, лейрозин, лейрозидеин, актиномицин, даунорубицин, конъюгаты даунорубицина, митомицин C, митомицин A, карминомицин, аминоптерин, таллизомицин, допофиллотоксин, производные допофиллотоксина, этопозид, этопозидфосфат, винкристин, таксол, таксотер-ретиноевая кислота, масляная кислота, N⁸-ацетилспермидин и камптотецин.

В предпочтительном варианте D представляет собой аналог или производное дуокармицина, которое имеет структуру

где циклическая система A обозначает компонент, выбранный из замещенной или незамещенной арильной, замещенной или незамещенной гетероарильной и замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной группы;

E и G представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, простой связи, или E и G объединены, образуя циклическую систему, выбранную из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;

X обозначает компонент, выбранный из O, S и NR²³;

R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;

R³ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей (=О), SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где

R¹¹ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R¹³, SR¹² и SiR¹²R¹³R¹⁴,

в которых

R¹², R¹³ и R¹⁴ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, имеющую от 4 до 6 элементов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначают компоненты, независимо выбранные из группы, включающей Н, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nN(CH₃)₂, где

n равно целому числу от 1 до 20;

R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, имеющую от 4 до 6 элементов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

R⁶ обозначает простую связь, которая присутствует или отсутствует, и, если присутствует, R⁶ и R⁷ объединены, образуя циклопропильное кольцо; и

R⁷ обозначает CH₂-X¹ или -CH₂-, объединенный в указанное циклопропильное кольцо с R⁶, где

X¹ обозначает уходящую группу,

где, по меньшей мере, один из R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ или R¹⁶ связывает указанное лекарственное средство с L¹, если присутствует, или с F, H, или J.

В предпочтительном варианте D имеет структуру

где Z обозначает компонент, выбранный из O, S и NR²³,

где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;

R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, C(O)R⁸ или CO₂R⁸, где R⁸ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей замещенный алкил, незамещенный алкил, NR⁹R¹⁰, NR⁹NHR¹⁰ и OR⁹,

в которых R⁹ и R¹⁰ представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила; и

R² обозначает H, замещенный алкил или незамещенный низший алкил;

в котором, по меньшей мере, один из R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ или R¹⁶ связывает указанное лекарственное средство с L¹, если присутствует, или с F, H или J.

В указанном выше предпочтительном варианте R² обозначает незамещенный низший алкил.

В другом предпочтительном варианте D имеет структуру

R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, C(O)R⁸ или CO₂R⁸, где R⁸ обозначает компонент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, в которых

R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил или C(O)R⁸, где R⁸ обозначает компонент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, в которых

R² обозначает H, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил, или циано, или алкокси; и

R^2' обозначает H, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил,

Во всех предыдущих структурах линкерных конъюгатов L⁴ предпочтительно содержит нециклический фрагмент. L⁴ предпочтительно повышает растворимость соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴, и/или L⁴ снижает агрегацию соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴. В предпочтительном варианте L⁴ содержит полиэтиленгликольный фрагмент. Полиэтиленгликольный фрагмент может содержать, например, 3-12 повторяющихся звеньев, или 2-6 повторяющихся звеньев, или, более предпочтительно, 4 повторяющихся звена.

Еще один аспект изобретения касается цитотоксического соединения лекарство-лиганд, имеющего структуру, соответствующую следующей формуле:

где символ L¹ представляет собой саморазрушающийся спейсер, где m равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Символ X⁴ обозначает элемент, выбранный из группы, включающей защищенные реакционноспособные функциональные группы, незащищенные реакционноспособные функциональные группы, детектируемые метки и направляющие агенты.

Символ L⁴ обозначает линкерный компонент, и p равно 0 или 1. L⁴ обозначает компонент, который придает конъюгатам повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства. Примеры компонентов L⁴ включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может быть линейным, разветвленным или циклическим, положительно или отрицательно заряженной полимерной аминокислотой, такой как полилизин или полиаргинин, или другими полимерами, например полиэтиленгликолем.

Символ Q обозначает отщепляемый линкер, включающий, но не ограниченный этим, любые пептидные, гидрозоновые и дисульфидные линкеры, описанные здесь. Отщепляемые линкеры включают линкеры, которые могут селективно отщепляться химическим или биологическим способом и при отщеплении отделять лекарство D¹ от X⁴.

Символ D¹ обозначает лекарственное средство, имеющее следующую формулу:

где X и Z обозначают компоненты, независимо выбранные из O, S и NR²³;

R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, C(O)R⁸ или CO₂R⁸,

R^1' обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил или C(O)R⁸,

где R⁸ обозначает компонент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, и R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R² обозначает H, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил, или циано, или алкокси;

R³ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где R¹¹ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R¹³, SR¹² и SiR¹²R¹³R¹⁴, в которых R¹², R¹³ и R¹⁴ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 элементов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

где, по меньшей мере, один из R¹¹, R¹² и R¹³ связывает указанное лекарственное средство с L¹, если присутствует, или с Q,

R⁶ обозначает простую связь, которая присутствует или отсутствует, и, если присутствует, то R⁶ и R⁷ объединены, образуя циклопропильное кольцо; и

R⁷ обозначает CH₂-X¹ или -CH₂-, объединенный в указанном циклопропильном кольце с R⁶, где

X¹ обозначает уходящую группу,

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначают компоненты, независимо выбранные из группы, включающей Н, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵, где n равно целому числу от 1 до 20;

R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

и R²⁴ и R²⁵ независимо выбраны из незамещенного алкила, и,

где, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначает O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵.

Еще один вариант представляет соединение, имеющее структуру, соответствующую формуле 1

в которой X и Z независимо выбраны из O, S и NR²³, где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;

каждый R⁸ обозначает компонент, независимо выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, и R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R² обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, незамещенный гетероалкил, циано или алкокси;

R^2' обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил или незамещенный гетероалкил,

R³ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где R¹¹ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R¹³, SR¹² и SiR¹²R¹³R¹⁴, в которых R¹², R¹³ и R¹⁴ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, или R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 элементов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

R⁶ обозначает простую связь, которая присутствует или отсутствует, и если присутствует, R⁶ и R⁷ объединены, образуя циклопропильное кольцо; и

R⁷ обозначает CH₂-X¹ или -CH₂, объединенный в указанном циклопропильном кольце с R⁶, где X¹ обозначает уходящую группу,

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначают компоненты, независимо выбранные из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵, где n равно целому числу от 1 до 20;

R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 элементов, необязательно включающую два или более гетероатомов;

и R²⁴ и R²⁵ независимо выбраны из незамещенного алкила, и

где, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначает O(CH₂)_nN R²⁴R²⁵.

Еще один аспект изобретения касается фармацевтических препаратов. Такие препараты обычно содержат соединение-конъюгат по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще один аспект изобретения касается способов применения соединений-конъюгатов по данному изобретению. Например, изобретение касается способа уничтожения клетки, в котором соединение-конъюгат по данному изобретению вводят в клетку в количестве, достаточном для ее гибели. В предпочтительном варианте клетка представляет собой опухолевую клетку. В другом варианте изобретение касается способа замедления или прекращения роста опухоли у пациента-млекопитающего, в котором соединение-конъюгат по данному изобретению вводят пациенту в количестве, достаточном для замедления или прекращения роста опухоли.

Другие аспекты, преимущества и цели изобретения будут ясны из обзора приведенного ниже подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сокращения

Используемое здесь сокращение "Ala" относится к аланину.

"Boc" относится к трет-бутилоксикарбонилу.

"CPI" относится к циклопропапирролоиндолу.

"Cbz" обозначает карбобензокси.

Используемое здесь сокращение "ДХМ" относится к дихлорметану.

"DDQ" относится к 2,3-дихлор-5,6-дициано-l,4-бензохинону.

"DIPEA" обозначает диизопропилэтанамин

"DMDA" обозначает N,N'-диметилэтилендиамин

"RBF" обозначает круглодонную колбу.

"ДМФА" обозначает N,N-диметилформамид.

"HATU" обозначает N-[[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридин-1-ил]метилен]-N-метилметанаминийгексафторфосфат N-оксид.

Используемый здесь символ "E" обозначает ферментативно отщепляемую группу.

"EDCI" обозначает 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид.

Используемое здесь сокращение "FMOC" обозначает 9-флуоренилметилоксикарбонил.

"FMOC" обозначает 9-флуоренилметоксикарбонил.

"HOAt" обозначает 7-аза-1-гидроксибензотриазол.

"Leu" обозначает лейцин.

"PABA" обозначает пара-аминобензойную кислоту.

"PEG" обозначает полиэтиленгликоль.

"PMB" обозначает пара-метоксибензил.

"TBAF" обозначает тетрабутиламмонийфторид.

Сокращение "TBSO" обозначает трет-бутилдиметилсилиловый эфир.

Используемое здесь сокращение "TEA" относится к триэтиламину.

"ТФА" относится к трифторуксусной кислоте.

Символ "Q" относится к терапевтическому агенту, диагностическому агенту или детектируемой метке.

Определения

Если не определено по-другому, все используемые здесь технические и научные термины обычно имеют такое же значение, как обычно понимается специалистами в области, к которой принадлежит данное изобретение. Вообще, используемая здесь номенклатура и описанные ниже лабораторные методики по культивированию клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии нуклеиновых кислот и гибридизации хорошо известны и обычно используются в данной области. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов используют стандартные методики. Обычно ферментативные реакции и стадии очистки выполняют согласно инструкциям производителей. Методики и процедуры обычно выполняют согласно общепринятым в данной области способам и различным ссылкам (в большинстве случаев смотри работу Sambrook и др., Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., которая включена здесь в качестве ссылки), которые приведены в тексте данного документа. Используемая здесь номенклатура и описанные ниже лабораторные методики по аналитической химии и органическому синтезу хорошо известны и обычно используются в данной области. Для химического синтеза и химического анализа используют стандартные методики или их модификации.

Выражение "терапевтический агент" предназначено для обозначения соединения, которое, если присутствует в терапевтически эффективном количестве, производит желательный терапевтический эффект у млекопитающего. Для лечения карциномы желательно, чтобы терапевтический агент также был способен входить в клетку-мишень.

Выражение "цитотоксин" предназначено для обозначения терапевтического агента, оказывающего требуемое цитотоксическое воздействие на раковые клетки. Выражение "цитотоксический" подразумевает, что агент задерживает рост или уничтожает клетки. Типичные цитотоксины включают (в качестве примера, а не ограничения) комбретастатины, дуокармицины, противоопухолевые антибиотики CC-1065, антрациклины и родственные соединения. Другие цитотоксины включают микотоксины, рицин и его аналоги, калихеамицины, доксирубицин и мейтанзиноиды.

Термин "пролекарство" и выражение "конъюгат лекарства" используются здесь взаимозаменяемо. Оба выражения относятся к соединению, которое является относительно безопасным для клеток, находясь в виде конъюгата, но которое селективно разрушается до фармакологически активной формы в определенных условиях, например, ферментами, расположенными внутри или поблизости от клеток-мишеней.

Термин "маркер" предназначен для обозначения соединения, полезного при характеристике опухолей или другого медицинского состояния, например диагноза, развития опухоли и при исследовании факторов, секретируемых опухолевыми клетками. Маркеры считаются подмножеством "диагностических агентов".

Термин "селективный", используемый в связи с ферментативными средствами разложения, означает, что скорость разложения линкерного фрагмента больше, чем скорость разложения пептида, имеющего случайную последовательность аминокислот.

Выражения "направляющая группа" и "направляющий агент" предназначены для обозначения фрагмента, который: (1) способен направить объект, к которому он присоединен (например, терапевтический агент или маркер), в клетку-мишень, например в опухолевую клетку специфического типа, или (2) предпочтительно активируется в ткани-мишени, например в опухоли. Направляющая группа или направляющий агент может представлять собой небольшую молекулу, которая, как подразумевается, включает непептиды и пептиды. Направляющая группа может также представлять собой макромолекулу, которая включает сахариды, лектины, рецепторы, лиганд для рецепторов, белки, такие как BSA, антитела и т.д. В предпочтительном варианте данного изобретения, направляющая группа представляет собой антитело или фрагмент антитела, более предпочтительно моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела.

Выражение "саморазрушающийся спейсер" относится к бифункциональному химическому фрагменту, который способен ковалентно связывать два химических компонента в нормально стабильную молекулу. Саморазрушающийся спейсер способен спонтанно отделяться от второго фрагмента, если разрушается связь с первым фрагментом.

Выражение "детектируемая метка" предназначено для обозначения фрагмента, имеющего детектируемое физическое или химическое свойство.

Выражение "отщепляемая группа" предназначено для обозначения фрагмента, который является нестабильным in vivo. Предпочтительная "отщепляемая группа" допускает активацию маркера или терапевтического агента при отщеплении маркера или агента от остатка конъюгата. Оперативно определено, что линкер предпочтительно отщепляется in vivo в биологической среде. Разложение может происходить в результате любого процесса без ограничения, например ферментативного, восстановительного, pH и др. Предпочтительно выбирать отщепляемую группу таким образом, чтобы активация происходила в месте требуемого воздействия, которое может находиться внутри или рядом с клетками-мишенями (например, клетками карциномы) или тканями, например, по месту терапевтического действия или активности маркера. Такое разложение может быть ферментативным, и типичные отщепляемые группы включают природные аминокислоты или пептидные последовательности, которые имеют на конце природную аминокислоту и присоединены к линкеру по своему карбоксильному концу. Притом что степень повышения скорости разложения не является критичной для изобретения, предпочтительными примерами отщепляемых линкеров являются те, в которых, по меньшей мере, примерно 10% отщепляемых групп отщепляются в потоке крови за 24 ч после введения, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 35%.

Термин "лиганд" обозначает любую молекулу, которая специфически связывает или реакционноспособным образом ассоциируется или комплексуется с рецептором, субстратом, антигенной детерминантой или другим сайтом связывания на клетке-мишени или ткани-мишени. Примеры лигандов включают антитела и их фрагменты (например, моноклональное антитело или его фрагмент), ферменты (например, фибринолитические ферменты), модификаторы биологических реакций (например, интерлейкины, интерфероны, эритропоитин или колониестимулирующие факторы), пептидные гормоны и их антиген-связывающие фрагменты.

Выражения "гидразиновый линкер" и "самоциклизующийся гидразиновый линкер" используют здесь взаимозаменяемо. Данные термины относятся к линкерному фрагменту, который при изменении условий, например сдвиге pH, претерпевает циклизацию и образует один или более циклов. Гидразиновый фрагмент превращается в гидразон, когда присоединяется. Данное присоединение может происходить, например, посредством взаимодействия с кетонной группой на фрагменте L⁴. Следовательно, для описания линкера данного изобретения можно также использовать выражение "гидразоновый линкер" из-за данной конверсии в гидразон при присоединении.

Выражение "пятичленный гидразиновый линкер" или "5-членный гидразиновый линкер" относится к гидразин-содержащим молекулярным фрагментам, которые при изменении условий, например сдвиге pH, подвергаются реакции циклизации и образуют один или более 5-членных циклов.

По-другому, данный пятичленный линкер можно аналогично описать как пятичленный гидразоновый линкер, или 5-членный гидразоновый линкер.

Выражение "шестичленный гидразиновый линкер", или "6-членный гидразиновый линкер", относится к гидразин-содержащим молекулярным фрагментам, которые, при изменении условий, например сдвиге pH, подвергаются реакции циклизации и образуют один или более 6-членных циклов. Данный шестичленный линкер можно аналогично описать как шестичленный гидразоновый линкер, или 6-членный гидразоновый линкер.

Выражение "реакция циклизации", если относится к циклизации пептидного, гидразинового или дисульфидного линкера, обозначает циклизацию данного линкера в кольцо и инициирование разделения комплекса лекарство-лиганд. Степень протекания реакции можно определить ex situ и завершить реакцию при образовании, по меньшей мере, 90%, 95% или 100% продукта.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам и неприродным аминокислотным полимерам. Данные термины включают также термин "антитело".

Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые действуют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодированные генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позже подвергают модификации, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют такую же базовую химическую структуру, как и природная аминокислота, т.е. атомы α-углерода, которые связаны с атомами водорода, карбоксильную группу, аминогруппу и группу R, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные основные цепи, но сохраняют такую же базовую химическую структуру, как природная аминокислота. В частности, одной аминокислотой, которую можно использовать, является цитруллин, который представляет собой предшественник аргинина и включен в образование мочевины в печени. Миметики аминокислоты относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но действуют аналогично природной аминокислоте. Выражение "искусственная аминокислота" предназначено для обозначения стереохимической формы "D" двадцати природных аминокислот, описанных выше. Кроме того, понятно, что выражение искусственная аминокислота включает гомологи природных аминокислот и синтетически модифицированные формы природных аминокислот. Синтетически модифицированные формы включают, но не ограничены этим, аминокислоты, имеющие алкиленовые цепи, укороченные или удлиненные на два атома углерода, аминокислоты, включающие необязательно замещенные арильные группы, и аминокислоты, содержащие галогенированные группы, предпочтительно галогенированные алкильные и арильные группы. Если аминокислота присоединена к линкеру или конъюгату по данному изобретению, то она присутствует в виде "аминокислотной боковой цепи", где карбоксильная кислотная группа аминокислоты заменена кето-группой (C(O)). Таким образом, например, аланиновая боковая цепь представляет собой -C(O)-CH(NH₂)-CH₃ и так далее.

Аминокислоты и пептиды могут быть защищены блокирующими группами. Блокирующая группа представляет собой атом или химический фрагмент, который защищает N-конец аминокислоты или пептида от нежелательных реакций, и может быть использована при синтезе конъюгата лекарство-лиганд. Она должна оставаться присоединенной к N-концу на протяжении синтеза и может быть удалена по завершении синтеза конъюгата лекарства посредством химических или других условий, в которых достигается ее селективное удаление. Блокирующие группы, подходящие для защиты N-конца, хорошо известны в области химии пептидов. Типичные блокирующие группы включают, но не ограничены этим, водород, D-аминокислоту и карбобензокси(Cbz) хлорид.

Термин "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в виде одно- или двухниточной формы. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, включая известные нуклеотидные аналоги, или модифицированные остатки основной цепи, или соединения, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют аналогичные свойства связывания, как и рассматриваемая нуклеиновая кислота, и которые претерпевают метаболизм аналогично рассматриваемым нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают (без ограничения) фосфоротиоаты, фосфороамидаты, метил фосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA).

Если не указано по-другому, конкретная последовательность нуклеиновых кислот также полностью охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены дегенеративного кодона) и дополнительные последовательности, а также явно указанную последовательность. Конкретно, замену дегенеративного кодона можно выполнить, генерируя последовательности, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов является замещенным смешанными основными и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer и др., Nucleic Кислот Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka и др., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini и др., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Термин “нуклеиновая кислота” используют взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.

Символ

, используемый для обозначения связи или расположения перпендикулярно к связи, указывает точку, в которой отображаемый фрагмент присоединен к остатку молекулы, твердой подложке и др.

Если не указано по-другому, термин "алкил", сам по себе или как часть другого заместителя, обозначает линейную или разветвленную цепь, или циклический углеводный радикал, или их комбинацию, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, имеющие обозначенное количество атомов углерода (а именно C₁-C₁₀ означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, но не ограничены этим, такие группы как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила, н-гептила, н-октила и подобные. Ненасыщенная алкильная группа представляет собой группу, имеющую одну или более двойных связей или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, но не ограничены этим, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентинил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Пока не отмечено по-другому, подразумевается, что термин "алкил" также включает производные алкила, определенные подробнее ниже, например, "гетероалкил." Алкильные группы, которые ограничены углеводными группами, обозначаются как "гомоалкил".

Термин "алкилен", сам по себе или как часть другого заместителя, обозначает бивалентный радикал, производный алкана, примером которого является (но не ограничен этим) -CH₂CH₂CH₂CH₂-, и, кроме того, включает группы, описанные ниже как "гетероалкилен". Обычно алкильная (или алкиленовая) группа имеет от 1 до 24 атомов углерода, при том, что в настоящем изобретении предпочтительны группы, имеющие 10 или менее атомов углерода. Выражение "низший алкил" или "низший алкилен" обозначают алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, обычно имеющую восемь или менее атомов углерода.

Если не указано по-другому, термин "гетероалкил", сам по себе или в комбинации с другим термином, обозначает стабильную линейную или разветвленную цепь, или циклический углеводный радикал, или их комбинации, включающие указанное количество атомов углерода и, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из группы, включающей O, N, Si и S, где азот, углерод и сера могут необязательно находиться в окисленном состоянии и гетероатом азота может необязательно быть кватернизован. Гетероатом(ы) O, N, S и Si могут размещаться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы или в положении, по которому алкильная группа присоединена к остатку молекулы. Примеры включают, но не ограничены этим, -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ и -CH=CH-N(CH₃)-CH₃. До двух гетероатомов могут располагаться последовательно, например -CH₂-NH-OCH₃ и -CH₂-O-Si(CH₃)₃. Аналогично, термин "гетероалкилен", сам по себе или как часть другого заместителя, обозначает бивалентный радикал, производный гетероалкила, как, например (но не ограничено этим), -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- и -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-. Для гетероалкиленовой группы гетероатомы могут также занимать любой из концов или оба конца цепи (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и подобные). Термины "гетероалкил" и "гетероалкилен" охватывают поли(этиленгликоль) и его производные (смотри, например, Shearwater Polymers Catalog, 2001). Кроме того, для алкиленовых и гетероалкиленовых связующих групп не подразумевается ориентация связующей группы в том направлении, в котором нарисована формула связующей группы. Например, формула -C(O)₂R'- представляет оба положения, -C(O)₂R'- и -R'C(O)₂-.

Термин "низший" в комбинации с терминами "алкил" или "гетероалкил" относится к фрагменту, имеющему от 1 до 6 атомов углерода.

Термины "алкокси", "алкиламино", "алкилсульфонил" и "алкилтио" (или тиоалкокси) используются в их обычном значении и обозначают алкильные группы, присоединенные к остатку молекулы через атом кислорода, аминогруппу, группу SO₂ или атом серы соответственно. Термин "арилсульфонил" относится к арильной группе, присоединенной к остатку молекулы через группу SO₂, и термин "сульфгидрил" относится к группе SH.

Вообще, "ацильный заместитель" также выбран из группы, определенной выше. Используемый здесь термин "ацильный заместитель" относится к группам, присоединенным и заполняющим валентность карбонильного углерода, который непосредственно или непосредственно присоединен к полициклическим ядрам соединений настоящего изобретения.

Если не указано по-другому, термины "циклоалкил" и "гетероциклоалкил", сами по себе или в комбинации с другими терминами, обозначают циклические варианты замещенного или незамещенного "алкила" и замещенного или незамещенного "гетероалкила" соответственно. Кроме того, для гетероциклоалкила гетероатом может занимать положение, по которому гетероцикл присоединен к остатку молекулы. Примеры циклоалкилов включают, но не ограничены этим, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и подобные. Примеры гетероциклоалкилов включают, но не ограничены этим, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и подобные. Гетероатомы и атомы углерода циклических структур необязательно являются окисленными.

Термины "гало" или "галоген" сами по себе или как часть другого заместителя обозначают, если не указано по-другому, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, подразумевается, что такие термины, как "галогеналкил", включают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Например, подразумевается, что термин "галоген(C₁-C₄)алкил" включает, но не ограничен этим, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил и подобные.

Если не указано по-другому, термин "арил" обозначает замещенный или незамещенный полиненасыщенный ароматический углеводный заместитель, который может представлять собой один цикл или несколько циклов (предпочтительно от 1 до 3 циклов), которые сконденсированы вместе или связаны ковалентно. Термин "гетероарил" относится к арильным группам (или циклам), которые содержат от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота, углерода и серы необязательно являются окисленными, и атом(ы) азота необязательно кватернизован. Гетероарильная группа может быть присоединена к остатку молекулы через гетероатом. Неограничительные примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-гуиноксалинил, 5-гуиноксалинил, 3-хинолил и 6-хинолил. Заместители для каждой из указанных выше арильных и гетероарильных циклических систем выбраны из группы приемлемых заместителей, описанных ниже. "Арил" и "гетероарил" также охватывают циклические системы, в которых одна или более неароматических циклических систем сконденсированы или связаны иным образом, образуя арильную или гетероарильную систему.

Для краткости термин "арил", используемый в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил), включает и арильные, и гетероарильные циклы, которые определены выше. Таким образом, предполагается, что термин "арилалкил" включает радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил, пиридилметил и подобные), включая те алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) заменен, например, на атом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и подобные).

Каждый из приведенных выше терминов (например, "алкил", "гетероалкил", "арил" и "гетероарил") включает замещенные и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала приведены ниже.

Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, часто обозначаемые как алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) обычно обозначают как "заместители для алкила" и "заместители для гетероалкила" соответственно, и они могут представлять собой одну или более из множества групп, выбранных из (но не ограниченных этим): -OR', =О, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -галогена, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(О)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN и -NO₂ в ряду от нуля до (2m'+1), где m' равно общему количеству атомов углерода в таком радикале. R', R", R'" и R"", каждый предпочтительно независимо обозначает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, например, арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенный или незамещенный алкил, алкокси- или тиоалкокси-группы или арилалкильные группы. Например, если соединение изобретения включает более одной группы R, каждая из групп R независимо выбрана как каждая группа R', R", R'" и R"", если присутствует более одной из этих групп. Если R' и R" присоединены к одному атому азота, они могут быть объединены с данным атомом азота, образуя 5-, 6- или 7-членный цикл. Например, подразумевается, что -NR'R" включает, но не ограничен этим, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалисту в данной области понятно, что термин "алкил", как подразумевается, включает группы, содержащие связь атомов углерода с группами, отличными от атомов водорода, такие как галогеналкил (например, -CF₃ и -CH₂CF₃) и ацил (например, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ и подобные).

Аналогично заместителям, описанным для алкильного радикала, заместители для арила и заместители для гетероарила обычно обозначают как "заместители для арила" и "заместители для гетероарила" соответственно и варьируют и выбирают, например, из: галогена, -OR', =О, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', галогена, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(О)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN и -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, фтор(C₁-C₄)алкокси и фтор(C₁-C₄)алкила в ряду от нуля до общего количества свободных валентностей ароматической циклической системы; где R', R", R'" и R"", каждый предпочтительно независимо выбран из атома водорода, (С₁-С₈)алкила и гетероалкила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенный арил)-(C₁-C₄)алкила и (незамещенный арил)окси-(C₁-C₄)алкила. Например, если соединение изобретения включает более одной группы R, то каждая из групп R независимо выбрана как каждая группа R', R", R'" и R"", если присутствует более одной из этих групп.

Два из заместителей для арила при соседних атомах арильного или гетероарильного цикла необязательно могут быть заменены заместителем формулы -T-C(O)-(CRR')_q-U-, где T и U независимо представляют собой -NR-, -O-, -CRR'- или простую связь и q равно целому числу от 0 до 3. По-другому, два из заместителей при соседних атомах арильного или гетероарильного цикла необязательно могут быть заменены заместителем формулы -A-(CH₂)_r-B-, где A и B независимо представляют собой -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)₂NR'- или простую связь и r равно целому числу от 1 до 4. Одна из простых связей образованного таким образом нового цикла необязательно может быть заменена двойной связью. По-другому, два из заместителей для арила при соседних атомах арильного или гетероарильного цикла необязательно могут быть заменены на заместитель формулы -(CRR')_S-X-(CR"R"')_d-, где s и d независимо равны целым числам от 0 до 3 и X обозначает -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂- или -S(O)₂NR'-. Заместители R, R', R" и R'" предпочтительно независимо выбраны из водорода или замещенного или незамещенного (C₁-C₆) алкила.

Используемый здесь термин "дифосфат" включает, но не ограничен этим, эфир фосфорной кислоты, содержащий две фосфатные группы. Термин "трифосфат" включает, но не ограничен этим, эфир фосфорной кислоты, содержащий три фосфатные группы. Например, конкретные лекарственные средства, содержащие дифосфат или трифосфат, включают:

Используемый здесь термин "гетероатом" включает атом кислорода (O), азота (N), серы (S) и кремния (Si).

Символ "R" является общим обозначением, которое представляет замещающую группу, которая выбрана из замещенных или незамещенных алкильных, замещенных или незамещенных гетероалкильных, замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклильных групп.

Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или носитель, например жидкий или твердый заполнитель, разбавитель, наполнитель, растворитель или инкапсулирующий материал, включенный в химический носитель или транспортировочный химический агент. Фармацевтически приемлемые носители включают фармацевтически приемлемые соли, где выражение "фармацевтически приемлемые соли" включает соли активных соединений, которые получают из относительно нетоксических кислот или оснований, в зависимости от конкретных заместителей в описанных здесь соединениях. Если соединения настоящего изобретения содержат относительно кислотные функциональности, аддитивные соли оснований можно получить взаимодействием нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством требуемого основания, чистого или в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых аддитивных солей оснований включают соли натрия, калия, кальция, аммония, органического амина или магния или аналогичные соли. Если соединения настоящего изобретения содержат относительно основные функциональности, то можно получить аддитивные соли кислот посредством взаимодействия нейтральной формы такого соединения с достаточным количеством требуемой кислоты, чистой или в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых аддитивных солей кислот включают соли, производные таких неорганических кислот, как соляная, бромистоводородная, азотная, угольная, моногидроугольная, фосфорная, моногидрофосфорная, дигидрофосфорная, серная, моногидросерная, йодистоводородная или фосфористая кислота и подобные, а также соли, производные относительно нетоксических органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, малеиновая, малоновая, бензойная, янтарная, пробковая, фумаровая, молочная, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, пара-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и подобные. Также включены такие соли аминокислот, как аргинат и подобные, и соли таких органических кислот, как глюкуроновая или галактуроновая кислоты и подобные (смотри, например, Berge и др., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Некоторые специфические соединения настоящего изобретения содержат и основные, и кислотные функциональности, что позволяет превращать данные соединения в аддитивные соли оснований или кислот.

При взаимодействии соли с основанием или кислотой предпочтительно восстанавливается нейтральная форма соединения и выделяется исходное соединение обычным образом. Исходная форма соединения отличается от различных солевых форм определенными физическими свойствами, например растворимостью в полярных растворителях, в других отношениях соли эквивалентны исходной форме соединения для целей настоящего изобретения.

Кроме солевых форм настоящее изобретение касается соединений, которые представляют собой пролекарственные формы. Описанные здесь пролекарственные соединения представляют собой соединения, которые легко претерпевают химические изменения в физиологических условиях, обеспечивая соединения настоящего изобретения. Кроме того, пролекарства можно перевести в соединения настоящего изобретения химическими или биохимическими способами в ex vivo среде. Например, пролекарства могут медленно превращаться в соединения настоящего изобретения, если поместить их с подходящим ферментом или химическим реагентом в резервуар пластыря для трансдермального применения.

Некоторые соединения настоящего изобретения могут существовать в несольватированных формах, а также сольватированных формах, включая гидратированные формы. Вообще, сольватированные формы эквивалентны несольватированным формам и входят в область настоящего изобретения. Некоторые соединения настоящего изобретения могут существовать во многих кристаллических или аморфных формах. Вообще, все физические формы эквивалентны для применений, предусмотренных настоящим изобретением, и предполагается, что они включены в область настоящего изобретения.

Некоторые соединения настоящего изобретения имеют асимметрические атомы углерода (оптически активные центры) или двойные связи; рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры и индивидуальные изомеры включены в область настоящего изобретения.

Соединения настоящего изобретения могут также содержать искусственные соотношения атомных изотопов одного или нескольких атомов, которые составляют такие соединения. Например, соединения могут быть меченными радиоактивными изотопами, например, тритием (³H), йодом-125 (¹²⁵I) или углеродом-14 (¹⁴C). Предполагается, что все изотопные варианты соединений настоящего изобретения, радиоактивные или нерадиоактивные, включены в область настоящего изобретения.

Выражение "присоединяемый фрагмент" или "фрагмент для присоединения направляющей группы" относится к фрагменту, который позволяет присоединение направляющей группы к линкеру. Обычно присоединяемые группы включают (для примера, а не для ограничения) алкил, аминоалкил, аминокарбонилалкил, карбоксиалкил, гидроксиалкил, алкил-малеимид, алкил-N-гидроксилсукцинимид, поли(этиленгликоль)-малеимид и поли(этиленгликоль)-N-гидроксилсукцинимид, каждый из которых может быть дополнительно замещенным. Линкер может также иметь присоединяемый фрагмент, фактически подвешенный к направляющей группе.

Используемый здесь термин "уходящая группа" относится к части субстрата, которая отщепляется от субстрата при взаимодействии.

Используемый здесь термин "антитело" включает антитела в целом и любой антиген-связывающий фрагмент (т.е. "антиген-связывающую часть") или его отдельные цепи. Термин "антитело" относится к гликопротеину, включающему, по меньшей мере, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или к его антиген-связывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из изменяющегося участка тяжелой цепи (V_H) и постоянного участка тяжелой цепи. Постоянная область тяжелой цепи состоит из трех доменов C_H1, C_H2 и C_H3 и может представлять собой мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон-изотип. Каждый легкая цепь состоит из изменяющегося участка легкой цепи (V_L) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит из одного домена C_L, который может представлять собой каппа- или лямбда-изотип. Участки V_H и V_L могут быть дополнительно поделены на участки гипервариабильности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), разбросанные среди участков, которые являются более консервативными, называемых каркасными участками (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расставленных следующим образом от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Изменяющиеся участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Постоянные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами носителя, включая разнообразные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплимента.

Используемые здесь выражения "фрагмент антитела" или "антиген-связывающая часть" антитела (или просто "часть антитела") относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Показано, что антиген-связывающая функция антитела может выполняться фрагментами во всю длину антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные выражением "фрагмент антитела" или "антиген-связывающая часть" антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H и C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в области петли; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одной группы антитела, (v) фрагмент dAb (Ward и др., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена V_L и V_H фрагмента Fv кодированы отдельными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные способы, синтетическим линкером, который дает возможность получить их в виде единой белковой цепи, в которой участки V_L и V_H образуют пару, давая одновалентную молекулу (известную как одноцепочечный Fv (scFv); смотри, например, Bird и др. (1988) Science 242: 423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Предполагается также, что такие одноцепочечные антитела охвачены выражением "антиген-связывающая часть" антитела. Данные фрагменты антитела получают, применяя обычные методики, известные специалистам в данной области, и данные фрагменты отбирают по пригодности аналогично целым антителам.

Используемое здесь выражение "моноклональное антитело" относится к получению молекул антител единого молекулярного состава. Состав моноклонального антитела демонстрирует единую специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.

Для получения моноклонального или поликлонального антитела можно использовать любую методику, известную в данной области (смотри, например, работы Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor и др., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole и др., pp. 77-96 в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)).

Способы получения поликлональных антител известны специалистам в данной области. Инбредный штамм мышей (например, мышей BALB/C) или кроликов иммунизируют белком, используя стандартный адъювант, например адъювант Фроинда, и стандартный протокол иммунизации. Иммунную реакцию животных на иммуногенный препарат контролируют, отбирая образцы крови и определяя титр реактивности относительно бета-подъединиц. Если получают приемлемо высокие титры антитела относительно иммуногена, собирают кровь животного и готовят антисыворотки. Кроме того, если требуется, можно выполнить фракционирование антисывороток для обогащения антителами, реакционноспособными относительно белка.

Моноклональные антитела можно получить по различным методикам, известным специалистам в данной области. Клетки селезенки животного, иммунизованного требуемым антигеном, иммортализуют обычно путем слияния с клеткой миеломы (смотри работу Kohler & Milstein, Eur. J. Иммуноl. 6: 511-519 (1976)). Альтернативные способы иммортализации включают трансформацию при помощи вируса Epstein Barr Virus, онкогенов или ретровирусов или другими способами, хорошо известными в данной области. В предпочтительном варианте антитело представляет собой химерное, или очеловеченное, антитело. Химерные или очеловеченные антитела настоящего изобретения можно получить, основываясь на последовательности крысиного моноклонального антитела. ДНК, кодирующую иммуноглобулины с тяжелой и легкой цепью, можно получить из рассматриваемой крысиной гибридомы и сконструировать таким образом, чтобы она содержала не крысиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности, применяя стандартные методики молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела крысиные изменяющиеся участки можно связать с человеческими постоянными участками, применяя способы, известные в данной области (смотри, например, патент США № 4816567 (Cabilly и др.)). Для создания очеловеченного антитела крысиные участки CDR можно вставить в человеческий каркас, применяя способы, известные в данной области (смотри, например, патент США № 5225539 (Winter) и патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 (Queen и др.).

В другом предпочтительном варианте антитело является человеческим антителом. Такие человеческие антитела можно получить посредством иммунизации трансгенных или трансхромосомных мышей, в которых эндогенные мышиные иммуноглобулиновые гены инактивированы и введены экзогенные человеческие иммуноглобулиновые гены. Такие мыши известны в данной области (смотри, например, патенты США №№ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429 (все Lonberg и Kay); патенты США №№ 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 (Kucherlapati и др.) и PCT-публикация WO 02/43478 (Ishida и др.)). Человеческие антитела можно также получить, используя способы выделения фагов для скрининга библиотек человеческих иммуноглобулиновых генов. Такие способы выделения фагов для выделения человеческих антител также известны в данной области (смотри, например, патенты США №№ 5223409; 5403484 и 5571698 (Ladner и др.); патенты США №№ 5427908 и 5580717 (Dower и др.); патенты США №№ 5969108 и 6172197 (McCafferty и др.) и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 (Griffiths и др.).

Используемое здесь выражение "твердый носитель" относится к веществу, которое является по существу нерастворимым в выбранной системе растворителей или которое можно легко отделить (например, осаждением) от выбранной системы растворителей, в которой он растворен. Твердые носители, пригодные для применения на практике настоящего изобретения, могут включать группы, которые активируются или способны активироваться, позволяя выбранным типам образовывать связи с твердым носителем. Твердый носитель может также представлять собой субстрат, например чип, подложку или ячейку, с которой связано индивидуальное соединение или более одного соединения.

Используемое здесь выражение "реакционноспособные функциональные группы" относится к группам, включающим (но не ограниченным этим) олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галогениды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазо, диазоний, нитро, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, изонитрилы сульфеновых кислот, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, орто-сложные эфиры, сульфиты, енамины, инамины, карбамиды, псевдокарбамиды, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азиды, азо-соединения, азокси-соединения и нитрозо-соединения. Реакционноспособные функциональные группы также включают группы, используемые для получения биоконъюгатов, например, N-гидроксисукцинимидных сложных эфиров, малеимидов и подобных (смотри, например, работу Hermanson, Bioconjugat Methods, Academic press, San Diego, 1996). Способы получения каждой из данных функциональных групп хорошо известны в данной области, и их применение или модификация для конкретной цели входят в область возможностей специалиста в данной области (смотри, например, работу Sandler и Karo, eds., Organic Funktional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989). Реакционноспособные функциональные группы могут быть защищенными или незащищенными.

Соединения изобретения получают в виде отдельного изомера (например, энантиомера, цис-транс, позиционного, диастереомера) или в виде смеси изомеров. В предпочтительном варианте соединения получают по существу в виде отдельного изомера. Способы получения по существу изомерно-чистых соединений известны в данной области. Например, энантиомерно-обогащенные смеси и чистые энантиомерные соединения можно получить, используя синтетические промежуточные продукты, которые являются энантиомерно-чистыми, в комбинации с реакциями, которые либо оставляют неизменной стереохимию в хиральном центре, либо дают ее полную инверсию. По-другому, наряду со способом синтеза, конечный продукт или промежуточные продукты можно разделить на отдельные стереоизомеры. Методики инверсии или сохранения неизменного конкретного стереоцентра и методики разделения смесей стереоизомеров хорошо известны в данной области, и специалист в данной области имеет достаточно возможностей выбрать и определить способ для конкретной ситуации. В широком смысле, смотри работу Furniss и др. (eds.),Vogel's Encyclopedia of Practical Organic Chemistry 5th Ed., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp. 809-816; и Heller, Ace. Chem. Res. 23: 128 (1990).

ЛИНКЕРЫ

Настоящее изобретение касается конъюгатов лекарство-лиганд, где лекарство связано с лигандом через химический линкер. Данный линкер представляет собой пептидный, гидразиновый или дисульфидный линкер и изображен здесь как (L⁴)_p-F-(L¹)_m, (L⁴)_p-H-(L¹)_m или (L⁴)_p-J-(L¹)_m соответственно. В дополнение к линкерам, которые присоединены к лекарству, настоящее изобретение также касается отщепляемых линкерных групп, которые подходят для присоединения по существу к любым молекулярным типам. Аспект изобретения, касающийся линкерных групп, проиллюстрирован здесь упоминанием их присоединения к терапевтическому фрагменту. Однако специалисту в данной области ясно, что линкеры могут быть присоединены к различным типам, выключая, но не ограничиваясь этим, диагностические агенты, аналитические агенты, биомолекулы, направляющие агенты, детектируемые метки и подобное.

Один аспект настоящего изобретения касается линкеров, которые пригодны для присоединения направляющих групп к терапевтическим агентам и маркерам. Другой аспект изобретения касается линкеров, которые придают соединениям стабильность, снижают их in vivo токсичность или, по-другому, благоприятным образом влияют на их фармакокинетику, биологическую доступность и/или фармакодинамику. Обычно предпочтительно, чтобы в таких вариантах линкер отщеплялся, высвобождая активное лекарство, как только лекарство доставлено к месту его действия. Таким образом, в одном варианте изобретения линкеры данного изобретения являются бесследными, так что при удалении линкера от терапевтического агента или маркера (как при активации) не остается следов его присутствия.

В другом варианте изобретения линкеры характеризуются своей способностью отщепляться на месте или рядом с клеткой-мишенью, например, на месте терапевтического действия или активности маркера. Такое разложение может быть ферментативным по природе. Данная особенность способствует снижению системной активации терапевтического агента или маркера, снижая токсичность и системные побочные эффекты. Предпочтительные для ферментативного разложения расщепляемые группы включают пептидные связи, сложноэфирные и дисульфидные связи. В других вариантах линкеры чувствительны к pH и отщепляются изменением pH.

Важным аспектом текущего изобретения является способность регулировать скорость, с которой отщепляются линкеры. Например, особо пригодны описанные здесь гидразиновые линкеры, так как, в зависимости от конкретной используемой структуры, можно варьировать скорость, с которой линкер циклизуется и при этом отщепляет лекарство от лиганда. WO 02/096910 касается некоторых специфических комплексов лиганд-лекарство, имеющих гидразиновый линкер. Однако не существует способа "приспособить" линкерную композицию, зависимую от необходимой скорости циклизации, и конкретные описанные соединения отщепляют лиганд от лекарств с меньшей скоростью, чем предпочтительная скорость для многих конъюгатов лекарство-линкер. В противоположность этому, гидразиновые линкеры по настоящему изобретению обеспечивают диапазон скоростей циклизации от очень быстрой до очень медленной, допуская тем самым выбор конкретного гидразинового линкера на основании требуемой скорости циклизации. Например, очень быструю циклизацию можно осуществить с гидразиновыми линкерами, которые дают при разложении один 5-членный цикл. Предпочтительных скоростей циклизации для целевой доставки цитотоксического агента в клетки достигают, используя гидразиновые линкеры, которые дают при разложении либо два 5-членных цикла, либо один 6-членный цикл, получающийся из линкера, имеющего два метила в геминальном положении. Показано, что гем-диметильный эффект увеличивает скорость реакции циклизации по сравнению с одним 6-членным циклом в отсутствие двух метилов в геминальном положении. Это происходит в результате напряжения, которое высвобождается в цикле. Однако иногда заместители могут замедлять реакцию вместо того, чтобы ускорять ее. Часто причинами замедления могут быть стерические препятствия. Как показано в примере 2.4, гем-диметильное замещение допускает значительно более быстрое протекание реакции циклизации по сравнению со случаем, когда геминальный углерод присутствует в виде CH₂.

Однако важно отметить, что в некоторых вариантах линкер, который отщепляется медленнее, может быть предпочтительным. Например, в препарате с замедленным высвобождением или в препарате с обоими компонентами, для быстрого и медленного высвобождения, может быть полезно обеспечить линкер, который отщепляется медленнее. В некоторых вариантах низкой скорости циклизации достигают, используя гидразиновый линкер, который продуцирует при разложении либо один 6-членный цикл без гем-диметильного замещения, либо один 7-членный цикл.

Линкеры также служат для стабилизации терапевтического агента или маркера от разложения в циркулирующей крови. Данная особенность обеспечивает существенное преимущество, так как такая стабилизация дает в результате продление периода полураспада при циркуляции присоединенного агента или маркера. Линкер также служит для ослабления активности присоединенного агента или маркера, поэтому конъюгат является относительно мягким при циркуляции и оказывает требуемый эффект, например, является токсичным после активации в желательном месте действия. Для конъюгатов терапевтических агентов данная особенность линкера служит для улучшения терапевтического индекса агента.

Стабилизирующие группы предпочтительно выбирают с целью ограничения клиренса и метаболизма терапевтического агента или маркера ферментами, которые могут присутствовать в крови или нецелевой ткани и, кроме того, выбирают с целью ограничения транспорта агента или маркера в клетки. Стабилизирующие группы служат для блокировки разложения агента или маркера и могут также действовать, обеспечивая другие физические характеристики агента или маркера. Стабилизирующая группа может также улучшать стабильность агента или маркера при хранении в виде препарата или в нерецептированном виде.

В идеальном случае стабилизирующая группа пригодна для стабилизации терапевтического агента или маркера, если она способствует защите агента или маркера от разложения в исследовании при хранении агента или маркера в крови человека при 37°C в течение 2 ч и дает меньше 20%, предпочтительно меньше 10%, более предпочтительно меньше 5% и еще более предпочтительно меньше 2% разложения агента или маркера ферментами, присутствующими в крови человека в данных условиях исследования.

Настоящее изобретение также касается конъюгатов, содержащих данные линкеры. Более конкретно, изобретение касается пролекарств, которые можно использовать для лечения заболевания, в особенности для химиотерапии рака. Более точно, применение описанных здесь линкеров обеспечивает пролекарства, которые демонстрируют высокую специфичность действия, пониженную токсичность и улучшенную стабильность в крови относительно пролекарств аналогичной структуры.

Линкеры настоящего изобретения, которые здесь описаны, могут присутствовать в любом положении внутри цитотоксического конъюгата.

Таким образом, обеспечен линкер, который может содержать любую из разнообразных групп как часть своей цепи, которая отщепляется in vivo, например, в потоке крови, со скоростью, которая увеличена по сравнению со скоростью для конструкций, которые не имеют таких групп. Обеспечены также конъюгаты линкерных групп с терапевтическими и диагностическими агентами. Линкеры пригодны для образования аналогов пролекарств терапевтических агентов и обратимого связывания терапевтического или диагностического агента с направляющим агентом, детектируемой меткой или твердым носителем. Линкеры могут быть включены в комплексы, которые содержат цитотоксины изобретения.

Кроме отщепляемой пептидной, гидразиновой или дисульфидной группы между цитотоксином и направляющим агентом необязательно вводят одну или более саморазрушающихся линкерных групп L¹. Эти линкерные группы также могут быть описаны как спейсерные группы и содержат, по меньшей мере, две реакционноспособные функциональные группы. Обычно одна химическая функциональность спейсерной группы связана с химической функциональностью терапевтического агента, например цитотоксина, тогда как другая химическая функциональность спейсерной группы используется для связи с химической функциональностью направляющего агента или отщепляемого линкера. Примеры спейсерных групп включают гидрокси, меркапто, карбонил, карбокси, амино, кетоновую и меркапто-группы.

Саморазрушающиеся линкеры, обозначенные как L¹, обычно представляют собой замещенную или незамещенную алкильную, замещенную или незамещенную арильную, замещенную или незамещенную гетероарильную или замещенную или незамещенную гетероалкильную группу. В одном варианте алкильные или арильные группы могут содержать от 1 до 20 атомов углерода. Они могут также содержать полиэтиленгликольный фрагмент.

Типичные спейсерные группы включают, например, 6-аминогексанол, 6-меркаптогексанол, 10-гидроксидекановую кислоту, глицин и другие аминокислоты, 1,6-гександиол, β-аланин, 2-аминоэтанол, цистеамин (2-аминоэтантиол), 5-аминопентановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, 3-малеимидобензойную кислоту, фталид, α-замещенные фталиды, карбонильную группу, животные сложные эфиры, нуклеиновые кислоты, пептиды и подобные.

Спейсер может служить для введения дополнительной молекулярной массы и химической функциональности в комплекс цитотоксин-направляющий агент. Обычно дополнительная масса и функциональность влияют на период полураспада в сыворотке и другие свойства комплекса. Таким образом, путем тщательного выбора спейсерной группы можно получить цитотоксиновые комплексы с набором периодов полураспада в сыворотке.

Спейсер(ы), расположенный в непосредственном соседстве с лекарственным фрагментом, обозначают также (L¹)_m, где m равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Если присутствует много спейсеров L¹, то можно использовать одинаковые или разные спейсеры. L¹ может представлять собой любую саморазрушающуюся группу.

В одном варианте L¹ предпочтительно обозначает замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил, незамещенный гетероциклоалкил и замещенный гетероциклоалкил. Если конъюгат лекарство-лиганд содержит гидразиновый линкер, L¹ не содержит дисульфидной связи.

L⁴ обозначает линкерный фрагмент, который сообщает повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства конъюгатам, использующим линкер, который содержит данный фрагмент. Линкер L⁴ не должен быть саморазрушающимся. В одном варианте фрагмент L⁴ представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, любой из них может быть линейным, разветвленным или циклическим. Заместителем может быть, например, низший (C₁-C₆)алкил, алкокси, алкилтио, алкиламино или диалкиламино. В некоторых вариантах L⁴ содержит нециклический фрагмент. В другом варианте L⁴ содержит любой положительно или отрицательно заряженный такой аминокислотный полимер, как полилизин или полиаргинин. L⁴ может содержать такой полимер, как полиэтиленгликольный фрагмент. Кроме того, линкер L⁴ содержит, например, и полимерный компонент, и небольшой химический фрагмент.

В предпочтительном варианте L⁴ содержит полиэтиленгликольный (PEG) фрагмент. PEG-часть линкера L⁴ может находиться между 1 и 50 единицами по длине. Предпочтительно, если PEG имеет 1-12 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 3-12 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 2-6 повторяющихся звеньев, еще предпочтительнее 3-5 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 4 повторяющихся звена. L⁴ может состоять исключительно из PEG-фрагмента или может также содержать дополнительный замещенный или незамещенный алкил или гетероалкил. Полезно комбинировать PEG как часть фрагмента L⁴ для повышения растворимости комплекса в воде. Кроме того, PEG-фрагмент снижает степень агрегации, которая может происходить во время конъюгации лекарства и антитела.

(1) Пептидные линкеры (F)

Как обсуждается выше, пептидные линкеры изобретения можно представить общей формулой (L⁴)_p-F-(L¹)_m, где F обозначает линкерную часть, включающую пептидный фрагмент. В одном варианте F-часть содержит необязательный дополнительный саморазрушающийся линкер(ы) L² и карбонильную группу. В других вариант F-часть содержит аминогруппу и необязательную спейсерную группу (группы) L³.

Таким образом, в одном варианте конъюгат, включающий пептидный линкер, содержит структуру формулы 4

В данном варианте L¹ обозначает саморазрушающийся линкер, который описан выше, и L⁴ обозначает фрагмент, который придает повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства, как описано выше. L² представляет собой саморазрушающийся линкер(ы); m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; o и p независимо равны 0 или 1. В одном варианте m равно 3, 4, 5 или 6. AA¹ представляет собой одну или более природных аминокислот и/или искусственных α-аминокислот; c равно целому числу от 1 до 20.

В пептидных линкерах данного изобретения, имеющих приведенную выше формулу 4, AA¹ связан по своему амино-концу непосредственно с L⁴ или, если L⁴ отсутствует, непосредственно с группой X⁴ (т.е. направляющим агентом, детектируемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В некоторых вариантах L⁴, если присутствует, не содержит карбоксильной ацильной группы, непосредственно присоединенной к N-концу (AA¹)_c. Таким образом, в данных вариантах не является необходимым наличие карбоксильной ацильной единицы непосредственно между L⁴ или X⁴ и AA¹, как требуется в пептидных линкерах патента США № 6214345.

В другом варианте конъюгат, включающий пептидный линкер, содержит структуру формулы 5

В данном варианте L⁴ обозначает фрагмент, который придает повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства, как описано выше; L³ обозначает спейсерную группу, включающую первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу, и амин линкера L³ образует амидную связь с подвешенной карбоксильной функциональной группой от D или карбоксил линкера L³ образует амидную связь с подвешенной аминной функциональной группой от D; и o и p независимо равны 0 или 1. AA¹ представляет собой одну или более природных аминокислот и/или искусственных α-аминокислот; c равно целому числу от 1 до 20. В данном варианте L¹ отсутствует (т.е. в общей формуле m равно 0).

В пептидных линкерах по данному изобретению, имеющих приведенную выше формулу 5, AA¹ связан по своему амино-концу непосредственно с L⁴ или, если L⁴ отсутствует, непосредственно с X⁴ группой (т.е. направляющим агентом, детектируемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В некоторых вариантах L⁴, если присутствует, не содержит карбоксильной ацильной группы, непосредственно присоединенной к N-концу (AA¹)_c. Таким образом, в данных вариантах не является необходимым наличие карбоксильной ацильной единицы непосредственно между L⁴ или X⁴ и AA¹, как требуется в пептидных линкерах патента США № 6214345.

Саморазрушающийся линкер L²

Саморазрушающийся линкер L² представляет собой бифункциональный химический фрагмент, который способен ковалентно связывать вместе два разнесенных в пространстве химических компонента в нормально стабильную молекулу, состоящую из трех частей, высвобождая один из указанных разнесенных в пространстве химических компонентов из молекулы, состоящей из трех частей, посредством ферментативного разложения; и после указанного ферментативного разложения самопроизвольно отщепляться от оставшейся части молекулы, высвобождая другой из указанных разнесенных в пространстве химических компонентов. Согласно настоящему изобретению, саморазрушающийся спейсер ковалентно связан по одному из своих концов с пептидным фрагментом и ковалентно связан по другому концу с химически реакционноспособным сайтом лекарственного фрагмента, дериватизация которого ингибирует фармакологическую активность, таким образом, чтобы разделить в пространстве и ковалентно связать вместе пептидный фрагмент и лекарственный фрагмент в состоящую из трех частей молекулу, которая стабильна и фармакологически неактивна в отсутствие целевого фермента, но которая способна ферментативно расщепляться таким целевым ферментом по связи, ковалентно соединяющей спейсерный фрагмент и пептидный фрагмент, осуществляя тем самым высвобождение пептидного фрагмента из состоящей из трех частей молекулы. Такое ферментативное разложение, в свою очередь, активирует саморазрушающийся характер спейсерного фрагмента и инициирует самопроизвольное расщепление связи, ковалентно соединяющей спейсерный фрагмент с лекарственным фрагментом, осуществляя тем самым высвобождение лекарства в фармакологически активном виде.

Саморазрушающийся линкер L² может представлять собой любую саморазрушающуюся группу. Предпочтительно L² представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный гетероциклоалкил, замещенный гетероциклоалкил, замещенный и незамещенный арил и замещенный и незамещенный гетероарил.

Один особо предпочтительный саморазрушающийся спейсер L² можно представить формулой 6

Ароматическое кольцо аминобензильной группы может быть замещено одной или несколькими группами "K". Группа "K" представляет собой заместитель в ароматическом кольце, который заменяет атом водорода, в другом случае присоединенный к одному из четырех незамещенных атомов углерода, которые являются частью циклической структуры. Группа "K" может представлять собой отдельный атом, например галоген, или многоатомную группу, например алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Каждая группа K независимо выбрана из групп, включающих замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR²¹R²², NR²¹COR²², OCONR²¹R²², OCOR²¹ и OR²¹, где R²¹ и R²² независимо выбраны из групп, включающих H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил и незамещенный гетероциклоалкил. Типичные заместители K включают, но не ограничены этим, F, Cl, Br, I, NO₂, OH, OCH₃, NHCOCH₃, N(CH₃)₂, NHCOCF₃ и метил. Для группы "K_a" a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4. В одном предпочтительном варианте a равно 0.

Эфирный атом кислорода показанной выше структуры соединен с карбонильной группой. Линия от NR²⁴-функциональности в ароматический цикл указывает, что аминная функциональность может быть связана с любым из пяти атомов углерода, которые образуют данный цикл и не замещены группой -CH₂-O-. Предпочтительно, если NR²⁴-функциональность от X ковалентно связана с ароматическим циклом по пара-положению относительно группы -CH₂-O-. R²⁴ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил. В конкретном варианте R²⁴ обозначает водород.

В предпочтительном варианте изобретение касается пептидного линкера формулы (4), приведенной выше, где F имеет структуру

где

каждый K обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR²¹R²², NR²¹COR²², OCONR²¹R²², OCOR²¹ и OR²¹, где

R²¹ и R² независимо выбраны из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил; и

a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4.

В другом варианте пептидный линкер формулы (4), приведенной выше, содержит -F-(L¹)_m-, который имеет структуру

где

Спейсерная группа L³

Спейсерная группа L³ характеризуется тем, что содержит первичную или вторичную амино или карбоксильную функциональную группу, и амин группы L³ образует амидную связь с подвешенной карбоксильной функциональной группой от D, или карбоксил от L³ образует амидную связь с подвешенной аминной функциональной группой от D. L³ может быть выбран из группы, включающей замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил или замещенный или незамещенный гетероциклоалкил. В предпочтительном варианте L³ содержит ароматическую группу. Более предпочтительно, если L³ содержит бензойную кислотную группу, анилиновую группу или индольную группу. Неограничительные примеры структур, которые могут служить в качестве спейсера -L³-NH-, включают следующие структуры:

После отщепления линкера данного изобретения, содержащего L³, фрагмент L³ остается присоединенным к лекарству D. Поэтому фрагмент L³ выбирают таким образом, чтобы его присутствие присоединенным к D существенно не меняло активности D. В другом варианте часть лекарства D сама функционирует как спейсер L³. Например, в одном варианте лекарство D представляет собой производное дуокармицина, в котором часть лекарства функционирует как спейсер L³. Неограничительные примеры таких вариантов включают варианты, в которых NH₂-(L³)-D имеет структуру, выбранную из группы, включающей

и

где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила; и

где группа NH₂ на каждой структуре взаимодействует с (AA¹)_с, образуя -(AA¹)_с-NH-.

Пептидная последовательность AA¹

Группа AA¹ представляет собой отдельную аминокислоту или множество аминокислот, которые объединены вместе амидными связями. Аминокислоты могут быть природными аминокислотами и/или искусственными α-аминокислотами.

Пептидная последовательность (AA¹)_с функционально представляет собой остаток амидифицирования отдельной аминокислоты (если c=l) или множества аминокислот, объединенных вместе амидными связями. Пептид настоящего изобретения выбирают так, чтобы направить катализируемое ферментом расщепление пептида в требуемое место биологической системы. Например, для конъюгатов, которые направляются в клетку, используя направляющий агент, и затем закрепляются клеткой, выбирают пептид таким образом, чтобы он отщеплялся одной или несколькими лизосомальными протеазами, таким образом, чтобы отщепление пептида происходило внутриклеточно в лизосоме. Количество аминокислот в пептиде может составлять от 1 до 20; но более предпочтительны (AA¹)_с, включающие 2-8 аминокислот, 2-6 аминокислот или 2, 3 или 4 аминокислоты. Пептидные последовательности, которые чувствительны к расщеплению специфическими ферментами или классами ферментов, хорошо известны в данной области.

В данной области известны многие пептидные последовательности, которые расщепляются ферментами в сыворотке, печени, кишечнике и др. Типичная пептидная последовательность по данному изобретению включает пептидную последовательность, которая расщепляется протеазой. Последующее обсуждение сфокусировано на использовании протеаза-чувствительной последовательности для ясности иллюстрации, а не для ограничения области настоящего изобретения.

Если фермент, который расщепляет пептид, является протеазой, то линкер обычно включает пептид, содержащий распознаваемую последовательность для протеазы. Последовательность распознавания расщепления для протеазы представляет собой аминокислотную последовательность, распознаваемую протеазой при протеолитическом разложении. В данной области известны многие сайты протеазного разложения, и эти и другие сайты разложения можно включить в линкерный фрагмент. Смотри, например, работы Matayoshi и др., Science 247: 954 (1990); Dunn и др., Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah и др., Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber и др., Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith и др., Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); Bouvier и др., Meth. Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy и др., в Amyloid Protein Precursor in Development, Aging and Alzheimer's Disease, ed. Masters и др., pp. 190-198 (1994).

Аминокислоты пептидной последовательности (AA¹)_с выбирают на основании их годности для селективного ферментативного разложения конкретными молекулами, например, связанной с опухолью протеазой. Используемые аминокислоты могут быть природными или неприродными аминокислотами. Они могут находиться в L или D конфигурации. В одном варианте используют, по меньшей мере, три разные аминокислоты. В другом варианте используют только две аминокислоты.

В предпочтительном варианте пептидную последовательность (AA¹)_с выбирают на основании ее способности расщепляться лизосомальными протеазами, неограничительные примеры которых включают катепсины B, C, D, H, L и S. Предпочтительно, если пептидная последовательность (AA¹)_с способна расщепляться катепсином B in vitro, что можно проверить, применяя in vitro исследования протеазного разложения, известные в данной области.

В другом варианте пептидную последовательность (AA¹)_с выбирают на основании ее способности расщепляться протеазой, связанной с опухолью, например протеазой, которая обнаружена вне клетки вблизи от опухолевых клеток, неограничительные примеры которой включают тимет-олигопептидазу (TOP) и CD10. Способность пептида расщепляться посредством TOP или CD10 можно проверить, применяя известные в данной области in vitro исследования протеазного разложения.

Подходящие, но неограничительные примеры пептидных последовательностей, подходящих для использования в конъюгатах по данному изобретению, включают Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2) и Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3). Предпочтительными пептидными последовательностями являются Val-Cit и Val-Lys.

В другом варианте аминокислота, расположенная в ближайшем положении к лекарственному фрагменту, выбрана из группы, включающей: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val. Еще в одном варианте аминокислота, расположенная в ближайшем положении к лекарственному фрагменту, выбрана из группы, включающей: Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.

Протеазы причастны к раковым метастазам. Повышенный синтез протеазы урокиназы коррелирует с повышенной способностью образования метастазов при многих раковых заболеваниях. Урокиназа активирует плазмин из плазминогена, который расположен повсеместно во внеклеточном пространстве, и его активация может вызывать разрушение белков во внеклеточном матриксе, через который происходит поражение метастазирующими опухолевыми клетками. Плазмин также может активировать коллагеназы, промотируя, таким образом, разрушение коллагена в основной мембране, окружающей капилляры и лимфотической системе, позволяя тем самым опухолевым клеткам поражать ткани-мишени (Dano, и др., Adv. Рак. Res., 44: 139 (1985)). Таким образом, в область настоящего изобретения входит применение линкерной пептидной последовательности, которая расщепляется урокиназой.

Изобретение также касается применения пептидных последовательностей, которые являются чувствительными к расщеплению триптазами. Тучные клетки человека экспрессируют, по меньшей мере, четыре различных триптазы, обозначенные α, βI, βII и βIII. Данные ферменты не регулируются ингибиторами протеиназ плазмы крови и только расщепляют некоторые физиологические субстраты in vitro. Триптазное семейство серинпротеаз причастно к разнообразным аллергическим и воспалительным заболеваниям, включающим тучные клетки, из-за повышенных уровней триптазы, обнаруженных в биологических жидкостях пациентов с данными нарушениями. Однако точная роль триптазы в патофизиологии заболевания требует выяснения. Область биологических функций и соответствующих физиологических последствий действия триптаз определяется, главным образом, их субстрат-специфичностью.

Триптаза представляет собой сильнодействующий активатор проурокиназного активатора плазминогена (uPA), зимогенной формы протеазы, связанной с метастазом и прорастанием опухолей. Активация плазминогенного каскада, результатом которой является деструкция внеклеточного матрикса вследствие клеточной экстравазации и миграции, может быть функцией триптазной активации проурокиназного активатора плазминогена в последовательности P4-P1 Pro-Arg-Phe-Lys (SEQ ID NO: 4) (Stack и др., Journal of Biological Chemistry 269 (13): 9416-9419 (1994)). Вазоактивный кишечный пептид, нейропептид, который включен в регуляцию пронициемости сосудов, также отщепляется триптазой, главным образом, по последовательности Thr-Arg-Leu-Arg (SEQ ID NO: 5) (Tarn и др., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3: 27-32 (1990)). Связанный с G-белком рецептор PAR-2 можно отщепить и активировать триптазой по последовательности Ser-Lys-Gly-Arg (SEQ ID NO: 6) осуществляя пролиферацию фибробластов, тогда как тромбин-активированный рецептор PAR-1 дезактивируется триптазой по последовательности Pro-Asn-Asp-Lys (SEQ ID NO: 7) (Molino и др., Journal of Biologic Chemistry 272(7): 4043-4049 (1997)). Взятые вместе, данные факты предполагают центральную роль триптазы в коррекции ткани как последствие заболевания. Это согласуется с глубокими изменениями, наблюдаемыми в некоторых нарушениях, опосредованных тучными клетками. Одним признаком хронической астмы и других продолжительных респираторных заболеваний является фиброз и уплотнение подверженных воздействию тканей, которые могут быть результатом активации триптазы физиологических мишеней. Аналогично, ряд сообщений показывает, что ангиогенез связан с плотностью тучных клеток, активностью триптазы и плохим прогнозом при многообразии раковых заболеваний (Coussens и др., Genes and Development 13(11): 1382-97 (1999)); Takanami и др., Cancer 88(12): 2686-92 (2000); Toth-Jakatics и др., Human Pathology 31(8): 955-960 (2000); Ribatti и др., International Journal of Cancer 85(2): 171-5 (2000)).

В данной области известны способы для оценки, расщепляет ли конкретная протеаза выбранную пептидную последовательность. Например, использование 7-амино-4-метилкумариновых (AMC) флуорогенных пептидных субстратов является хорошо известным способом определения специфичности протеазы (Zimmerman, M., и др., (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51). Специфическое расщепление анилидной связи освобождает флуорогенную уходящую группу AMC, допуская простое определение скоростей разложения для индивидуальных субстратов. Позже использовали массивы (Lee, D., и др., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72) и библиотеки позиционного сканирования (Rano, T.A., и др., (1997) Chemistry и Biology 4:149-55) библиотек AMC-пептидных субстратов для быстрого профилирования N-терминальной специфичности протеаз, в одном эксперименте отбирая образцы субстратов в широком диапазоне. Таким образом, специалист в данной области может легко оценить порядок пептидных последовательностей для определения их пригодности в настоящем изобретении, не прибегая к чрезмерному экспериментированию.

(2) Гидразиновые линкеры (H)

Во втором варианте конъюгат по данному изобретению содержит гидразиновый саморазрушающийся линкер, где данный конъюгат имеет структуру

где D, L¹, L⁴ и X⁴ такие, как определено выше и описано здесь далее, и H обозначает линкер, включающий структуру

где

n₁ равно целому числу от 1 до 10;

n₂ равно 0, 1 или 2;

I обозначает либо связь (а именно связь между атомом углерода основной цепи и соседним атомом азота), или

где n₃ равно 0 или 1, при условии, что если n₃ равно 0, то n₂ не равно 0; и

n₄ равно 1, 2 или 3,

где, если I обозначает связь, n₁ равно 3 и n₂ равно 1, то D не может быть

,

где R обозначает Me или CH₂-CH₂-NMe₂.

В одном варианте замещение по фенильному кольцу является пара-замещением. В предпочтительных вариантах n₁ равно 2, 3 или 4 или n₁ равно 3. В предпочтительных вариантах n₂ равно 1. В предпочтительных вариантах I обозначает связь (а именно связь между атомом углерода основной цепи и соседним атомом азота). В одном аспекте гидразиновый линкер H может образовывать при разложении 6-членный саморазрушающийся линкер, например, если n₃ равно 0 и n₄ равно 2. В другом аспекте гидразиновый линкер H может образовывать при разложении два 5-членных саморазрушающихся линкера. В других аспектах H образует при разложении 5-членный саморазрушающийся линкер, H образует 7-членный саморазрушающийся линкер или H образует 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный саморазрушающийся линкер. На скорость разложения влияет размер образующегося при разложении цикла. Таким образом, в зависимости от требуемой скорости разложения можно выбрать цикл подходящего размера, который будет получаться при разложении.

Пятичленные гидразиновые линкеры

В одном варианте гидразиновый линкер представляет собой 5-членный гидразиновый линкер, где H имеет структуру

В предпочтительном варианте, n₁ равно 2, 3 или 4. В другом предпочтительном варианте, n₁ равно 3. В приведенной выше структуре каждый R²⁴ обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил. В одном варианте каждый R²⁴ независимо обозначает H или C₁-C₆ алкил. В другом варианте каждый R²⁴ независимо обозначает H или C₁-C₃ алкил, более предпочтительно H или CH₃. В другом варианте, по меньшей мере, один R²⁴ обозначает метильную группу. В другом варианте каждый R²⁴ обозначает H. Каждый R²⁴ выбран для обеспечения соединений стерическими эффектами и для изменения растворимости.

5-Членные гидразиновые линкеры могут претерпевать одну или более реакций циклизации, которые отделяют лекарство от линкера, и могут быть описаны, например, следующим образом:

Типичным синтетическим способом получения пятичленного линкера по данному изобретению является

Проводят взаимодействие Cbz-защищенного DMDA b с 2,2-диметил-малоновой кислотой a в растворе с тионилхлоридом, получая Cbz-DMDA-2,2-диметилмалоновую кислоту c. Проводят взаимодействие соединения c с Boc-N-метилгидразином d в присутствии водорода, получая DMDA-2,2-диметилмалоновый Boc-N-метилгидразин e.

Шестичленные гидразиновые линкеры

В другом варианте гидразиновый линкер представляет собой 6-членный гидразиновый линкер, где H имеет структуру

В предпочтительном варианте n₁ равно 3. В приведенной выше структуре каждый R²⁴ представляет собой компонент, независимо выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил и незамещенный гетероалкил. В одном варианте каждый R²⁴ независимо обозначает H или C₁-C₆ алкил. В другом варианте каждый R²⁴ независимо обозначает H или C₁-C₃ алкил, более предпочтительно H или CH₃. В другом варианте, по меньшей мере, один R²⁴ обозначает метильную группу. В другом варианте каждый R²⁴ обозначает H. Каждый R²⁴ выбран для обеспечения соединений стерическими эффектами и для изменения растворимости. В предпочтительном варианте H имеет структуру

В одном варианте H имеет геминальное диметильное замещение. В одном варианте представленной выше структуры каждый R²⁴ независимо обозначает H или замещенный или незамещенный алкил.

6-Членные гидразиновые линкеры претерпевают реакцию циклизации, которая отделяет лекарство от линкера, и может быть описана следующим образом:

Типичным синтетическим способом получения шестичленного линкера по данному изобретению является

Проводят взаимодействие Cbz-защищенного диметилаланина в растворе с дихлорметаном с HOAt и CPI, получая Cbz-защищенный диметилаланингидразин b. Удаляют защиту с гидразина b, воздействуя метанолом и получая соединение c.

Другие гидразиновые линкеры

Полагают, что изобретение содержит линкер, имеющий семь компонентов. Данный линкер, вероятно, не будет циклизоваться так быстро, как пяти- или шестичленные линкеры, но это может быть предпочтительным для некоторых конъюгатов лекарство-лиганд. Аналогично, гидразиновый линкер может содержать два шестичленных цикла или гидразиновый линкер, имеющий один шестичленный продукт циклизации и один пятичленный. Рассматривают также пяти и семичленный линкер, а также шести и семичленный линкер.

Другая гидразиновая структура H имеет формулу

где q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

Данная гидразиновая структура может также образовывать пяти-, шести- или семичленные циклы, и можно добавлять дополнительные компоненты, получая разнообразные циклы.

(3) Дисульфидные линкеры (J)

Еще в одном варианте линкер содержит ферментативно отщепляемую дисульфидную группу. В одном варианте изобретение касается цитотоксического соединения лекарство-лиганд, имеющего структуру, соответствующую формуле 3

где D, L¹, L⁴ и X⁴ такие, как определено выше и описано здесь далее, и J представляет собой дисульфидный линкер, включающий группу, имеющую структуру

где

a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4; и

d равно целому числу из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Ароматический цикл дисульфидного линкера может быть замещен одной или несколькими группами "K". Группа "K" представляет собой заместитель в ароматическом цикле, который заменяет атом водорода, в другом случае присоединенный к одному из четырех незамещенных атомов углерода, которые являются частью циклической структуры. Группа "K" может представлять собой отдельный атом, например галоген, или многоатомную группу, например алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Типичные заместители K независимо включают, но не ограничены этим, F, Cl, Br, I, NO₂, OH, OCH₃, NHCOCH₃, N(CH₃)₂, NHCOCF₃ и метил. Для группы "K_a", a равно целому числу из 0, 1, 2, 3 или 4. В одном предпочтительном варианте a равно 0.

В предпочтительном варианте, линкер содержит ферментативно отщепляемую дисульфидную группу следующей формулы:

В данном варианте L⁴, X⁴, p и R²⁴ имеют такие же значения, как описано выше, и d равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В особом варианте d равно 1 или 2.

Более специфический дисульфидный линкер показан в приведенной ниже формуле

Специфическим примером данного варианта является следующий:

Предпочтительно d равно 1 или 2.

Другой дисульфидный линкер показан в приведенной ниже формуле

Предпочтительно d равно 1 или 2.

В различных вариантах дисульфиды находятся в орто-положении относительно амина. В другом специфическом варианте a равно 0. В предпочтительных вариантах R²⁴ независимо выбран из H и CH₃.

Типичным синтетическим способом получения дисульфидного линкера по данному изобретению является следующий:

Проводят взаимодействие раствора 3-меркаптопропионовой кислоты с альдритиолом-2, получая 3-метилбензотиазолиййодид b. Проводят взаимодействие 3-метилбензотиазолиййодида c гидроксидом натрия, получая соединение d. Далее проводят взаимодействие раствора соединения d в метаноле с соединением b, получая соединение e. Удаляют защиту с соединения e, воздействуя ацетилхлоридом и метанолом, получая соединение f.

Конъюгат лекарство-лиганд по настоящему изобретению может необязательно содержать два или более линкеров. Данные линкеры могут быть одинаковыми или разными. Например, можно использовать пептидный линкер для соединения лекарства с лигандом, и второй пептидный линкер может присоединять диагностический агент к комплексу. По-другому, любой из пептидных, гидразиновых и дисульфидных линкеров может связывать комплекс лекарства и лиганда, и любой из пептидных, гидразиновых и дисульфидных линкеров может присоединять диагностический агент к данному комплексу. Другие применения для дополнительных линкеров включают связывание аналитических агентов, биомолекул, направляющих агентов и детектируемых меток с комплексом лекарство-лиганд.

В область настоящего изобретения входят также соединения данного изобретения, которые представляют поли- или многовалентные типы, включая, например, такие типы, как димеры, тримеры, тетрамеры и высшие гомологи соединений данного изобретения или их реакционноспособные аналоги. Поли- и многовалентный тип может состоять из отдельного типа или нескольких типов соединения по данному изобретению. Например, димерная конструкция может быть "гомодимерной" или "гетеродимерной". Кроме того, в область настоящего изобретения входят поли- и многовалентные конструкции, в которых соединение данного изобретения или его реакционноспособный аналог присоединен к олигомерному или полимерному каркасу (например, полилизин, декстран, гидроксиэтилкрахмал и подобные). Каркас предпочтительно является полифункциональным (т.е. имеющим набор реакционноспособных сайтов для присоединения соединений по данному изобретению). Кроме того, каркас можно подвергнуть дериватизации с применением соединений отдельного типа или нескольких типов по данному изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение включает соединения, в которые введены некоторые функции для сообщения соединениям растворимости в воде, которая повышается по сравнению с аналогичными соединениями, которые не имеют подобных функций. Таким образом, любые из указанных здесь заместителей можно заменить аналогичными радикалами, которые обладают повышенной растворимостью в воде. Например, в область данного изобретения входит замена гидроксильной группы диолом, или амина - кватернизованным амином, гидроксиамином или аналогичным, лучше растворимым в воде фрагментом. В предпочтительном варианте дополнительную растворимость в воде сообщают замещением по сайту, несущественному для активности указанных здесь соединений по отношению к ионному каналу, фрагментом, который повышает растворимость исходных соединений в воде. Способы повышения растворимости в воде органических соединений известны в данной области. Такие способы включают, но не ограничены этим, функционализацию органических ядер постоянно заряженными фрагментами, например четвертичным аммонием или группой, которая является заряженной при физиологически подходящем pH, например карбоновой кислотой, амином. Другие способы включают добавление к органическим ядрам гидроксил- или амин-содержащих групп, например спиртов, полиолов, полимерных простых эфиров и подобных. Типичные примеры включают, но не ограничены этим, полилизин, полиэтиленимин, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль. Подходящая химия и стратегия функционализации для данных соединений известны в данной области. Смотри, например, работу Dunn, R.L., и др., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.

ЛЕКАРСТВА

Данное изобретение касается лекарств, обозначенных здесь "D", как части конъюгата лекарство-лиганд, где лекарство связано с лигандом через пептидный, гидразиновый или дисульфидный линкер. Лекарство должно обладать желательной биологической активностью и содержать реакционноспособную функциональную группу для связи с лигандом. Желательная биологическая активность включает диагностику, способ лечения, облегчение, терапию или профилактику заболевания у животного, например у человека. Таким образом, поскольку требуется наличие реакционноспособной функциональной группы, термин "лекарство" относится к химическим реагентам, официально признанным в качестве лекарственных средств в фармакопее США (United States Pharmacopeia), гомеопатической фармакопее США (Homeopathic Pharmacopeia of the United States) или национальном своде правил (National Formulary), или любых его дополнениях. Типичные лекарственные средства изложены в Physician's Desk Reference (PDR) и Orange Book, поддерживаемых Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (U.S. Food and Drug Administration (FDA)). Новые лекарственные средства постоянно открываются и разрабатываются, и настоящее изобретение предусматривает, что эти новые лекарства также можно включать в комплекс лекарство-лиганд по данному изобретению.

Предпочтительные функциональные группы включают первичные или вторичные амины, гидроксилы, сульфгидрилы, карбоксилы, альдегиды и кетоны. Более предпочтительные функциональные группы включают гидроксилы, первичные или вторичные амины, сульфгидрилы и карбоксильные кислотные функциональные группы. Еще более предпочтительные функциональные группы включают гидроксилы, первичные и вторичные амины и карбоксильные кислотные функциональные группы. Лекарство должно иметь, по меньшей мере, одну реакционноспособную функциональную группу, но может иметь 2, 3, 4, 5, 6 или более таких групп. Кроме того, между реакционноспособной функциональной группой лекарства и пептидным, гидразиновым или дисульфидным линкером можно включить саморазрушающийся спейсер L¹.

Конъюгат лекарство-лиганд является эффективным для обычных целей, для которых эффективны соответствующие лекарственные средства, но обладает превосходящей эффективностью благодаря свойственной лиганду способности транспортировать лекарство к требуемой клетке, где оно особо полезно.

Типичные лекарства включают лекарства в виде белков, пептидов и малых молекул, содержащих функциональную группу для связи с лигандом. Более конкретно, данные лекарства включают, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы и ингибиторы тимидилатсинтазы, ДНК-интеркаляторы, агенты расщепления ДНК, ингибиторы тороизомеразы, лекарства семейства антрациклина, лекарства винка, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, лекарства семейства птеридина, диинены, допофиллотоксины, стимуляторы дифференцировки и таксолы.

Предпочтительные лекарства по настоящему изобретению включают цитотоксические лекарства, пригодные в лечении рака, и другие малые молекулы, белки или полипептиды с требуемой биологической активностью, например токсин. Лекарство можно выбрать таким образом, чтобы оно активировалось в клетках опухоли посредством конъюгации с опухоль-специфическим лигандом. Данные опухоль-специфические конъюгаты лекарство-лиганд обладают специфичностью относительно опухоли, появляющейся в результате специфичности лиганда. Примерами этого являются конъюгаты лекарство-лиганд, которые представляют собой высокоселективные субстраты для опухоль-специфических ферментов, где эти ферменты присутствуют по соседству от опухоли, в достаточных количествах для генерации цитотоксических уровней свободного лекарства рядом с опухолью. Одним преимуществом данных опухоль-специфических комплексов лекарство-лиганд является то, что они стабильны относительно случайных протеаз в сыворотке человека. Другим преимуществом комплекса лекарство-лиганд является то, что они менее токсичны, чем соответствующее свободное лекарство; кроме того, специфичность комплекса может позволять использовать меньшие общие концентрации по сравнению со свободным лекарством, так как в результате повышенной специфичности на месте опухоли будет присутствовать более высокая концентрация комплекса.

Цитотоксины

Цитотоксические лекарства, пригодные для настоящего изобретения, включают, например, дуокармицины, CC-1065 и их аналоги, включая аналоги дуокармицинов и CC-1065 на основе CBI (1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-она), на основе MCBI (7-метокси-1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-она) и на основе CCBI (7-циано-1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-она), доксорубицин и конъюгаты доксорубицина, такие как морфолино-доксорубицин и цианоморфолино-доксорубицин, доластатины, такие как долестатин-10, комбретастатин, калихеамицин, майтанзин, аналоги майтанзина, DM-1, ауристатин E, ауристатин EB (AEB), ауристатин EFP (AEFP), монометил ауристатин E (MMAE), AE-эфир 5-бензоилвалериановой кислоты (AEVB), тубулизины, дизоразол, эпотилоны, паклитаксел, доцетаксел, SN-38, топотекан, ризоксин, эхиномицин, колхицин, винбластин, виндезин, эстрамустин, цемадотин, элеутеробин, метотрексат, метоптерин, дихлорметотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, цитозинарабинозид, мелфалан, лейрозин, лейрозидеин, актиномицин, даунорубицин и конъюгаты даунорубицина, митомицин C, митомицин A, карминомицин, аминоптерин, таллизомицин, допофиллотоксин и производные допофиллотоксина, такие как этопозид или этопозидфосфат, винкристин, таксол, таксотер-ретиноевая кислота, масляная кислота, N⁸-ацетилспермидин, камптотецин и их аналоги. Другие известные лекарства можно модифицировать, чтобы снабдить их функциональной группой для конъюгации с описанным здесь линкером. Такая химическая модификация известна в данной области.

Предпочтительные цитотоксины для использования в настоящем изобретении включают: дуокармицины, CC-1065 и их аналоги на основе CCBI и MCBI, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, доластатин-10, комбретастатин, калихеамицин, майтанзин, DM-1, ауристатин E, AEB, AEFP, MMAE, тубулизин A, дизоразол, эпотилон A и эпотилон B.

Особо предпочтительными цитотоксинами по настоящему изобретению являются активные, сильнодействующие производные дуокармицина и CC-1065. Исходные агенты представляют собой исключительно эффективные противоопухолевые антибиотики, биологические эффекты которых являются результатом обратимого, стереоэлектронно-регулируемого последовательность-селективного алкилирования ДНК (Boger и др., J. Org. Chem, 55: 4499 (1990); Boger и др., J. Am. Chem. Soc. 112: 8961 (1990); Boger и др., J. Am. Chem. Soc. 113: 6645 (1991); Boger и др., J. Am. Chem. Soc. 115: 9872 (1993); Boger и др., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 759 (1992)). После начального раскрытия дуокармицинов были предприняты всесторонние попытки для разъяснения селективности дуокармицинов в отношении алкилирования ДНК и их структурного происхождения.

Особо предпочтительный аспект настоящего изобретения касается цитотоксического соединения, имеющего структуру, соответствующую формуле 7:

в которой циклическая система A обозначает компонент, выбранный из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп. Типичные циклические системы включают фенил и пиррол.

Символы E и G независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, простой связи, или E и G необязательно объединены, образуя циклическую систему, выбранную из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила.

Символ X представляет элемент, выбранный из O, S и NR²³. R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.

Символ R³ представляет элемент, выбранный из (=О), SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где R¹¹ обозначает H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R^l3, SR¹² или SiR¹²R¹³R¹⁴. Символы R¹², R¹³ и R¹⁴ независимо представляют H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и замещенный или незамещенный арил, где R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов. Один или более из R¹², R¹³ и R¹⁴ может содержать в своей структуре отщепляемую группу.

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nN(CH₃)₂, где n равно целому числу от 1 до 20. R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляют H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где R¹⁵ и R¹⁶вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов. Одна типичная структура представляет собой анилин.

R⁴, R⁴', R⁵, R⁵' R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ или R¹⁶ необязательно содержат в своей структуре одну или более отщепляемых групп. Типичные отщепляемые группы включают, но не ограничены этим, пептиды, аминокислоты, гидразины и дисульфиды.

По меньшей мере, один из R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ и R¹⁶ используют для присоединения лекарства к линкеру по настоящему изобретению, как здесь описано, например, к L¹, если присутствует, или к F, H или J.

Еще в одном типичном варианте, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵, R⁵', R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ или R¹⁶ несет реакционноспособную группу, подходящую для конъюгации данного соединения. Еще в одном типичном варианте R⁴, R⁴', R⁵, R⁵', R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ или R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного алкила и замещенного гетероалкила и имеют реакционноспособную функциональную группу на свободном конце алкильного или гетероалкильного фрагмента. Один или несколько из R⁴, R⁴', R⁵, R⁵', R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ и R¹⁶ можно конъюгировать с другим видом, например, направляющим агентом, детектируемой меткой, твердым носителем и др.

Как будет ясно из приведенного здесь обсуждения, если, по меньшей мере, один из R¹⁵ и R¹⁶ содержит реакционноспособную функциональную группу, то эта группа может представлять собой компонент связи между лекарством и другой молекулой. В типичном варианте, где, по меньшей мере, один из R¹⁵ и R¹⁶ содержит связь между лекарством и другим видом, то, по меньшей мере, один из R¹⁵ и R¹⁶ представляет собой фрагмент, который отщепляется ферментом.

Еще в одном типичном варианте, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵, R⁵' представляет собой

В формуле 8 символы X² и Z¹ представляют компоненты, независимо выбранные из O, S и NR²³. Группы R¹⁷ и R¹⁸ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NO₂, NR¹⁹R²⁰, NC(O)R¹⁹, OC(O)NR¹⁹, OC(O)OR¹⁹, C(O)R¹⁹, SR¹⁹ или OR¹⁹, при условии, что, по меньшей мере, один из R¹², R¹³, R¹⁹ или R²⁰ содержит линкер по настоящему изобретению, который здесь описан.

Символы R¹⁹ и R²⁰ независимо представляют собой замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный пептидил, где R¹⁹ и R²⁰ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов, при условии, что если Z¹ обозначает NH, то оба R¹⁷ и R¹⁸ не являются H, и R¹⁷ не является NH₂. На всем протяжении настоящего описания символы R¹⁹ и R²⁰ также охватывают группы, указанные для R⁴ и R⁵. Таким образом, в область настоящего изобретения включено обеспечение соединений, имеющих две или более из указанных непосредственно выше конденсированных фенил-гетероциклических циклических систем, связанных в серию, или конденсированный цикл в комбинации с линкером. Кроме того, в вариантах, где присутствует линкер, он может присутствовать как заместитель R⁴, R⁴', R⁵ или R⁵' или как заместитель R¹⁷ и R¹⁸.

R⁶ обозначает простую связь, которая присутствует или отсутствует. Если R⁶ присутствует, то R⁶ и R⁷ объединены, образуя циклопропильное кольцо. R⁷ обозначает CH₂-X¹ или -CH₂-. Если R⁷ обозначает -CH₂-, то он является компонентом циклопропанового цикла. Символ X представляет уходящую группу, такую как галоген, например Cl, Br или F. Комбинации R⁶ и R⁷ интерпретируют таким образом, который не нарушает принципы химической валентности.

Кривая линия внутри шестичленного цикла показывает, что цикл может иметь одну или более степеней ненасыщенности и может быть ароматическим. Таким образом, циклические структуры, такие как структуры, изложенные ниже, и родственные структуры охватываются формулой (9)

В типичном варианте циклическая система A представляет собой замещенный или незамещенный фенильный цикл. Циклическая система A предпочтительно является замещеной одним или несколькими заместителями для арильной группы, как изложено здесь в разделе определений. В одном предпочтительном варианте фенильный цикл является замещенным фрагментом CN или метокси.

В другом типичном варианте изобретение касается соединения, имеющего структуру, соответствующую формуле 10

В данном варианте радикалы R³, R⁴, R⁴', R⁵, R⁵', R⁶, R⁷ и X по существу идентичны описанным выше. Символ Z обозначает компонент, независимо выбранный из O, S и NR²³. Символ R²³ обозначает элемент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила. Каждый R²³ выбран независимо. Символ R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, или C(O)R⁸ или CO₂R⁸. R⁸ обозначает элемент, выбранный из NR⁹R¹⁰, NR⁹NHR¹⁰и OR⁹, R⁹ и R¹⁰ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила.

Радикал R² обозначает H или замещенный или незамещенный низший алкил. Обычно предпочтительно, если R² представляет собой замещенный алкил, он отличен от перфторалкила, например CF₃. В одном варианте R² представляет собой замещенный алкил, где заместитель не является галогеном. В другом варианте R² обозначает незамещенный алкил.

Как обсуждается выше, X¹ может быть уходящей группой. Пригодные уходящие группы включают, но не ограничены этим, галогены, азиды, сульфоновые эфиры (например, алкилсульфонил, арилсульфонил), ионы оксония, алкилперхлораты, сложные эфиры аммониоалкансульфонаты, алкилфторсульфонаты и фторированные соединения (например, трифлаты, нонафлаты, трезилаты) и подобные. Конкретными галогенами, пригодными в качестве уходящих групп, являются F, Cl и Br. Выбор данных и других уходящих групп, подходящих для конкретного набора реакционных условий, входит в область возможностей специалиста в данной области (смотри, например, March J. Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, John Wiley and Sons, 1992; Sandier S.R., Karo W., Organic Functional Group Preparations, 2nd Edition, Academic Press, Inc., 1983; и Wade L.G., Compendium of Organic Synthetic Methods, John Wiley and Sons, 1980).

В типичном варианте R¹ обозначает сложноэфирный фрагмент, такой как CO₂CH₃. Еще в одном типичном варианте R² обозначает низшую алкильную группу, которая может быть замещенной или незамещенной. В настоящее время предпочтительной низшей алкильной группой является CH₃. Еще в одном варианте R¹ обозначает CO₂CH₃, и R обозначает CH₃.

Еще в одном типичном варианте R⁴, R⁴', R⁵, R⁵' представляют компоненты, независимо выбранные из H, галогена, NH₂, OMe, O(CH₂)₂N(Me)₂ и NO₂.

В одном варианте лекарство выбрано таким образом, что уходящая группа X¹ представляет собой компонент, выбранный из группы, включающей галоген, алкилсульфонил, арилсульфонил и азид. В другом варианте Z обозначает O. В некоторых вариантах R¹ может быть CO₂CH₃ или R² может быть CH₃; кроме того, R¹ может быть CO₂CH₃ и R² может быть CH₃. Один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' может представлять собой C(O)R¹⁵ и другие три из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют H. Кроме того, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' может отличаться от элемента, выбранного из H и OCH₃. В одном варианте R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, галогена, NH₂, O(CH₂)₂N(Me)₂ и NO₂.

В предпочтительном варианте один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляет собой O(CH₂)₂N(Me)₂ и другие из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначают H. В другом варианте R⁷ обозначает CH₂-X¹, где X¹ представляет собой F, Cl или Br и R⁶ отсутствует.

Еще в одном типичном варианте изобретение касается соединений, имеющих структуру, соответствующую формулам 11 и 12

В одном варианте приведенной выше формулы X предпочтительно обозначает O; и Z предпочтительно обозначает O. В другом варианте Z обозначает NR²³ или O. По-другому, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' может представлять собой O(CH₂)₂N(Me)₂, тогда как другие три из R⁴, R⁴', R⁵ или R⁵' представляют собой H. В одном варианте R⁴, R⁴', R⁵ или R⁵' могут быть выбраны из группы, включающей R²⁹, COOR²⁹, C(O)NR²⁹ и C(O)NNR²⁹, где R²⁹ выбран из группы, включающей H, OH, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный циклоалкил, незамещенный циклоалкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, замещенный циклогетероалкил, незамещенный циклогетероалкил, замещенный гетероарил и незамещенный гетероарил.

В другом варианте приведенной выше формулы X предпочтительно обозначает O, Z предпочтительно обозначает O, R₁ предпочтительно обозначает CO₂CH₃, R₇ предпочтительно обозначает CH₂-Cl, R₂ предпочтительно обозначает CH₃, R₃ предпочтительно обозначает OH. По-другому, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' может представлять собой NHC(O)(C₆H₄)NH₂, тогда как другие три из R⁴, R⁴', R⁵ или R⁵' обозначают H.

В одном варианте R²⁹ можно выбрать из группы, включающей

Еще в одном варианте лекарства один элемент, выбранный из R⁴ и R⁵, представляет собой

где X² и Z¹ представляют компоненты, независимо выбранные из O, S и NR²³; R¹⁷ и R¹⁸ представляют компоненты, независимо выбранные из группы, включающей H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁹R²⁰, NC(O)R¹⁹, OC(O)NR¹⁹, OC(O)OR¹⁹, C(O)R¹⁹, OR¹⁹ и O(CH₂)_nN(CH₃)₂. В данном варианте n равно целому числу от 1 до 20; R¹⁹ и R²⁰ независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, где R¹⁹ и R²⁰ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов, где один из R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁹ или R²⁰ связывает указанное лекарство с L¹, если присутствует, или с F. В одном предпочтительном варианте X² обозначает O и Z¹ обозначает O или NR²³.

Другой предпочтительной структурой аналога дуокармицина формулы 7 является структура, в которой циклическая система A представляет собой незамещенное или замещенное фенильное кольцо. Предпочтительные заместители в молекуле описанного здесь выше лекарства для структуры формулы 7, когда циклическая система A представляет собой пиррол, также являются предпочтительными заместителями, если циклическая система A представляет собой незамещенное или замещенное фенильное кольцо.

Например, в предпочтительном варианте лекарство (D) имеет структуру

В данной структуре R³, R⁶, R⁷, X являются такими, как описано выше для формулы 7.

Кроме того, Z обозначает компонент, выбранный из O, S и NR²³, где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;

R¹ обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил, C(O)R⁸ или CO₂R⁸, где R⁸ обозначает элемент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, в которых R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R^1' обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил или C(O)R⁸, где R⁸ обозначает элемент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, в которых R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R^2' обозначает H, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил.

По меньшей мере, один из R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁵ и R¹⁶ связывает лекарство с L¹, если присутствует, или с F, H или J.

В предпочтительном варианте один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляет собой O(CH₂)₂N(Me)₂ и другие из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют H. В другом варианте R⁷ обозначает CH₂-X¹, где X¹ обозначает F, Cl или Br и R⁶ отсутствует.

В одном варианте изобретение касается цитотоксического соединения лекарство-лиганд, имеющего структуру, соответствующую следующей формуле:

в которой символ L¹ обозначает саморазрушающийся спейсер, где m равно целому числу из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Символ L⁴ представляет линкерный элемент и p равно 0 или 1. L⁴ представляет собой фрагмент, который придает конъюгатам повышенную растворимость или пониженные агрегационные свойства. Примеры компонентов L⁴ включают замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, любой из которых может быть линейным, разветвленным или циклическим, положительно или отрицательно заряженным аминокислотным полимером, таким как полилизин или полиаргинин, или другими полимерами, такими как полиэтиленгликоль.

Символ Q представляет отщепляемый линкер, включающий, но не ограниченный этим, любые описанные здесь пептидные, гидрозоновые и дисульфидные линкеры. Другие подходящие линкеры включают, но не ограничены этим, линкеры, описанные в патенте США № 6214345; публикациях патентных заявок США №№ 2003/0096743, 2003/0130189 и 2004/121940; публикациях PCT-патентных заявок №№ WO 03/026577 и WO 04/043493 и публикациях Европейских патентных заявок №№ EP1243276 и EP1370298, которые все включены здесь в виде ссылок. Отщепляемые линкеры включают линкеры, которые могут селективно отщепляться химическими или биологическими способами и при разложении отделять лекарство D¹ от X⁴. Разложение может происходить где-нибудь вдоль длины линкера или по любому концу линкера.

R¹' обозначает H, замещенный или незамещенный низший алкил или C(O)R⁸,

где R⁸ обозначает компонент, выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, и R⁹ и R¹⁰ представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R³ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где R¹¹ представляет собой компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R¹³, SR¹² и SiR¹²R¹³R¹⁴, в которых R¹², R¹³ и R¹⁴ представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов;

R⁷ обозначает CH₂-X¹ или -CH₂-, объединенный в указанном циклопропильном кольце с R⁶, где X¹ обозначает уходящую группу,

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют собой компоненты, независимо выбранные из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵, где n равно целому числу от 1 до 20;

R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов;

и R²⁴ и R²⁵ независимо выбраны из незамещенного алкила и

В некоторых вариантах n равно 2. В некоторых вариантах R²⁴ и R²⁵ представляют собой метил. В некоторых вариантах R⁴ обозначает O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵ и R⁴', R⁵ и R⁵' представляют собой H. В некоторых вариантах R⁴ обозначает O(CH₂)₂N(CH₃)₂ и R⁴', R⁵ и R⁵' представляют H. В некоторых вариантах Q представляет собой линкер, выбранный из F, H и J, который описан выше. В некоторых вариантах R¹, R¹', R² и R²' представляют собой H.

Предпочтительной формулой для лекарства D¹ является следующая:

Другим предпочтительным вариантом лекарства D¹ является следующий:

Еще дополнительными предпочтительными вариантами лекарства D¹ являются следующие:

В другом типичном варианте настоящего изобретения цитотоксическим лекарством может быть аналог тубулизина или родственное соединение, например соединения, описываемые структурой, соответствующей формуле 13

где R₁ и R₂ обозначают H или низший алкил, или, более конкретно, изобутил, этил, пропил или трет-бутил и R₃ обозначает H или OH. Тубулизин и его применение при лечении рака описаны, например, в PCT-публикациях WO 2004/005327 и WO 2004/005326. Получение соединений тубулизина описано в DE10008089. Способы, которые можно применять для связывания тубулизина с различными линкерами настоящего изобретения, приведены в примерах. Предпочтительными аналогами тубулизина являются тубулизины A-F.

Аналоги CBI

Данные конкретные соединения представляют собой аналоги CBI, так как они включают 1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-он (CBI)-алкилирующий домен или алкилирующую подъединицу. Данные соединения можно использовать в качестве лекарств. Предпочтительные лекарства по настоящему изобретению включают цитотоксические лекарства, пригодные при лечении рака. Данные соединения могут быть конъюгированы или нет или включать линкеры, которые описаны выше. Цитотоксические лекарства, пригодные в настоящем изобретении, включают, например, аналоги на основе CBI (1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-она), аналоги на основе MCBI (7-метокси-1,2,9,9a-тетрагидроциклопропа[c]бенз[e]индол-4-она) и аналоги на основе CCBI (7-циано-1,2,9,9a-тетрагидроцикло-пропа[c]бенз[e]-индол-4-она).

В одном варианте соединение изобретения имеет следующую формулу (14):

где X и Z независимо выбраны из O, S и NR²³, где R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;

каждый R⁸ представляет собой компонент, независимо выбранный из NR⁹R¹⁰ и OR⁹, и R⁹ и R¹⁰ обозначают компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;

R³ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей SR¹¹, NHR¹¹ и OR¹¹, где R¹¹ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, дифосфаты, трифосфаты, ацил, C(O)R¹²R¹³, C(O)OR¹², C(O)NR¹²R¹³, P(O)(OR¹²)₂, C(O)CHR¹²R¹³, SR¹²и SiR¹²R¹³R¹⁴, в которых R¹², R¹³ и R¹⁴ представляют компоненты, независимо выбранные из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, или R¹² и R¹³ вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, объединены, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов;

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют компоненты, независимо выбранные из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, SR¹⁵, OR¹⁵, CR¹⁵=NR¹⁶ и O(CH₂)_nNR²⁴R²⁵, где n равно целому числу от 1 до 20, предпочтительно n равно целому числу от 2 до 6;

Как обсуждается выше, X¹ может быть уходящей группой. Пригодные уходящие группы включают, но не ограничены этим, галогены, азиды, сульфоновые эфиры (например, алкилсульфонил, арилсульфонил), ионы оксония, алкилперхлораты, аммониоалкансульфонатные сложные эфиры, алкилфторсульфонаты и фторированные соединения (например, трифлаты, нонафлаты, трезилаты) и подобные. Конкретные галогены, пригодные в качестве уходящих групп, представляет собой F, Cl и Br. Выбор данных и других уходящих групп, подходящих для конкретного набора реакционных условий, входит в область возможностей специалиста в данной области (смотри, например, March J., Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, John Wiley and Sons, 1992; Sandler S.R., Karo W., Organic Functional Group Preparations, 2nd Edition, Academic Press, Inc., 1983; и Wade L.G., Compendium of Organic Synthetic Methods, John Wiley and Sons, 1980).

В некоторых вариантах R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют собой компоненты, независимо выбранные из H, галогена, NH₂, OMe, O(CH₂)₂N(Me)₂ и NO₂. В некоторых вариантах, по меньшей мере, один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначает O(CH₂)₂N(Me)₂. В некоторых вариантах один из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' обозначает O(CH₂)₂N(Me)₂ и другие из R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют H. В других вариантах R⁴ обозначает O(CH₂)₂N(Me)₂ и R⁴', R⁵ и R⁵' представляют H.

В некоторых вариантах R⁷ представляет собой CH₂-X¹, где X¹ обозначает F, Cl или Br и R⁶ отсутствует. В некоторых вариантах лекарство выбрано таким образом, что уходящая группа X¹ обозначает компонент, выбранный из группы, включающей галоген, алкилсульфонил, арилсульфонил и азид. В некоторых вариантах X¹ обозначает Cl или Br.

В некоторых вариантах Z обозначает O. В некоторых вариантах X и Z представляют собой O.

В некоторых вариантах R² обозначает H, метил или циано и R¹, R¹' и R²' представляют H. В некоторых вариантах R¹, R¹', R² и R²' обозначают H. В некоторых вариантах R¹, R¹' и R²' обозначают H.

В некоторых вариантах R³ представляет собой реакционноспособную группу, которая описана ниже.

Предпочтительной формулой для соединения формулы (14) является следующая:

Другим предпочтительным вариантом для соединения формулы (14) является следующий:

Дополнительными предпочтительными вариантами для соединения формулы (14) являются следующие:

Предпочтительные конъюгаты дуокармицина и CBI

Пептидные, гидразиновые или дисульфидные линкеры по данному изобретению можно использовать в конъюгатах, содержащих в качестве цитотоксических агентов аналоги дуокармицина или CBI. Предпочтительные конъюгаты данного изобретения описаны ниже с дополнительными подробностями. Пока не указано по-другому, заместители определены, как изложено выше в разделах, касающихся цитотоксинов, пептидных линкеров, гидразиновых линкеров и дисульфидных линкеров.

A. Конъюгаты с пептидными линкерами

В предпочтительном варианте изобретение касается конъюгата с пептидным линкером, имеющего структуру

где X¹ обозначает галоген;

R²³ обозначает компонент, выбранный из H, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и ацил; и

R⁴, R⁴', R⁵ и R⁵' представляют собой компоненты, независимо выбранные из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, OR¹⁵ и O(CH₂)_nN(CH₃)₂, где n равно целому числу от 1 до 20; и

R¹⁵ и R¹⁶независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов.

Неограничительные примеры таких конъюгатов включают следующие структуры:

где X¹ обозначает Cl или Br и

где Ab представляет собой антитело или его фрагмент.

В другом предпочтительном варианте изобретение касается конъюгата, имеющего структуру

или

где X¹ обозначает уходящую группу;

Z и X представляют компоненты, независимо выбранные из O, S и NR²³,

R³ выбран из группы, включающей H, замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероарил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероциклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, галоген, NO₂, NR¹⁵R¹⁶, NC(O)R¹⁵, OC(O)NR¹⁵R¹⁶, OC(O)OR¹⁵, C(O)R¹⁵, OR¹⁵ и O(CH₂)_nN(CH₃)₂,

где n равно целому числу от 1 до 20;

R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из H, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, где R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно объединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную циклическую систему, имеющую от 4 до 6 компонентов, необязательно содержащую два или более гетероатомов.

где каждый b независимо равен целому числу от 0 до 20 и Ab обозначает антитело или его фрагмент.

В других предпочтительных вариантах изобретение касается конъюгата с пептидным линкером, выбранного из следующих структур:

где X¹ обозначает Cl или Br и Ab обозначает антитело или его фрагмент.

В других вариантах изобретение касается конъюгата с пептидным линкером, выбранного из следующих структур:

В других вариантах изобретение касается конъюгата с пептидным линкером, имеющего следующую структуру:

B. Конъюгаты с гидразиновыми линкерами

В предпочтительном варианте изобретение касается конъюгата с гидразиновым линкером, имеющего структуру

В другом предпочтительном варианте изобретение касается конъюгата с гидразиновым линкером, имеющего структуру

В других предпочтительных вариантах изобретение касается конъюгата с гидразиновым линкером, имеющего структуру, выбранную из

и

где PEG обозначает полиэтиленгликольный фрагмент и X¹ обозначает Cl или Br.

Еще в других предпочтительных вариантах изобретение касается конъюгата с гидразиновым линкером, выбранного из следующих структур:

и

В другом предпочтительном варианте имеется конъюгат с гидразиновым линкером, выбранный из следующих структур:

и

C. Конъюгаты с дисульфидными линкерами

В предпочтительном варианте изобретение касается конъюгата с дисульфидным линкером, имеющего структуру

и

Неограничительные примеры таких структур включают следующие:

и

ЛИГАНДЫ

Лиганды настоящего изобретения изображены как "X⁴". В данном изобретении X⁴ представляет собой элемент, выбранный из группы, включающей защищенные реакционноспособные функциональные группы, незащищенные реакционноспособные функциональные группы, детектируемые метки и направляющие агенты. Предпочтительными лигандами являются направляющие агенты, такие как антитела и их фрагменты.

В предпочтительном варианте группу X⁴ можно описать как элемент, выбранный из R²⁹, COOR²⁹, C(O)NR²⁹ и C(O)NNR²⁹, где R²⁹ представляет собой компонент, выбранный из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного гетероарила. Еще в другом типичном варианте R²⁹ представляет собой компонент, выбранный из H, OH, NHNH₂,

где R³⁰ представляет замещенный или незамещенный алкил, имеющий терминальную реакционноспособную функциональную группу, замещенный или незамещенный гетероарил, имеющий терминальную функциональную группу. Приведенные выше структуры действуют как реакционноспособные защитные группы, которые могут взаимодействовать, например, с боковой цепью аминокислоты направляющего агента, такого как антитело, связывая тем самым направляющий агент с фрагментом линкер-лекарство.

Направляющие агенты

Линкерные группы и цитотоксины данного изобретения могут быть связаны с направляющими агентами, которые селективно доставляют полезную нагрузку в клетку, орган или область организма. Типичные направляющие агенты, такие как антитела (например, химерное, очеловеченное антитело и антитело человека), лиганды для рецепторов, лектины, сахариды, антитела и подобные, признаны в данной области и применимы без ограничения в практике настоящего изобретения. Другие направляющие агенты включают класс соединений, которые не включают специфические молекулярные мотивы распознавания, включают макромолекулы, такие как поли(этиленгликоль), полисахарид, полиаминокислоты и подобные, которые добавляют цитотоксину молекулярную массу. Дополнительная молекулярная масса влияет на фармакокинетику цитотоксина, например период полураспада в сыворотке.

В типичном варианте изобретение касается цитотоксина, линкера или конъюгата цитотоксин-линкер с направляющим агентом, который представляет собой биомолекулу, например антитело, рецептор, пептид, лектин, сахарид, нуклеиновую кислоту или их комбинацию. Технологические маршруты получения типичных конъюгатов по данному изобретению изложены в приведенных выше схемах.

Биомолекулы, пригодные для применения на практике настоящего изобретения, можно получить из любого источника. Биомолекулы можно выделить из природных источников или можно получить синтетическими способами. Белки могут быть природными или мутированными белками. Мутации можно выполнить посредством химического мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза или другими способами индуцирования мутаций, известными специалистам в данной области. Белки, пригодные для применения настоящего изобретения, на практике включают, например, ферменты, антигены, антитела и рецепторы. Антитела могут быть или поликлональными, или моноклональными, но наиболее предпочтительны моноклональные антитела. Пептиды и нуклеиновые кислоты могут быть выделены из природных источников или могут быть полностью или частично синтетическими по природе.

В предпочтительном варианте направляющий агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, который выбран на основании его специфичности относительно антигена, экспрессируемого в клетке-мишени или в намеченном интересующем месте. Идентифицировано широкое разнообразие антигенов, опухоль-специфических или специфических относительно других заболеваний, и антитела к этим антигенам используются или предложены к использованию при терапии таких опухолей или других заболеваний. Антитела, которые известны в данной области, можно использовать в конъюгатах по данному изобретению, в частности, для терапии заболевания, с которым связан антиген-мишень. Неограничительные примеры антигенов-мишеней (и связанных с ними заболеваний), на которые может быть нацелен конъюгат антитело-линкер-лекарство по данному изобретению, включают: Her2 (рак молочной железы), CD20 (лимфомы), EGFR (солидные опухоли), CD22 (лимфомы, включая неходжкинскую лимфому), CD52 (хронический лимфоцитарный лейкоз), CD33 (острый миелогенный лейкоз), CD4 (лимфомы, аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит), CD30 (лимфомы, включая неходжкинскую лимфому), Mucl8 (меланома), интегрины (солидные опухоли), PSMA (рак предстательной железы, аденокарцинома предстательной железы), CEA (колоректальный рак), CDlla 5 (псориаз), CD80 (псориаз), CD23 (астма), CD40L (иммунная тромбоцитопеническая пурпура), CTLA4 (T-клеточные лимфомы) и BLys (аутоиммунные заболевания, включая системную красную волчанку).

В тех вариантах, где распознаваемый фрагмент представляет собой белок или антитело, белок может быть привязан к поверхности или компоненту с самоассоциированным монослоем (SAM) или соединен через спейсерную группу с любым доступным реакционноспособным пептидным остатком на поверхности белка. В предпочтительных вариантах реакционноспособные группы представляют собой амины или карбоксилаты. В особо предпочтительных вариантах реакционноспособные группы представляют ε-аминогруппы лизиновых остатков. Кроме того, данные молекулы могут адсорбироваться на поверхности субстрата или SAM посредством неспецифических взаимодействий (например, хемосорбции, физической адсорбции).

Распознаваемые фрагменты, которые являются антителами, можно использовать для распознавания анализируемых веществ, которые представляют собой белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, сахариды или такие малые молекулы, как лекарства, гербициды, пестициды, промышленные химические вещества и военные агенты. Способы получения антител для специфических молекул хорошо известны специалистам в данной области. Смотри патенты США № 5/147786 (Feng и др.) от 15 сентября 1992; No. 5/334528 (Stanker и др.) от 2 августа 1994; No. 5/686237 (Al-Bayati, M.A.S.) от 11 ноября 1997 и No. 5/573922 (Hoess и др.) от 12 ноября 1996. Способы присоединения антител к поверхностям также известны в данной области. Смотри работу Delamarche и др., Langmuir 12:1944-1946 (1996).

Направляющие агенты можно присоединить к линкерам данного изобретения посредством имеющихся реакционноспособных групп. Например, пептиды можно присоединить через аминную, карбоксильную, сульфгидрильную или гидроксильную группу. Такая группа может находиться на конце пептида или на внутреннем сайте пептидной цепи. Нуклеиновые кислоты можно присоединить при помощи реакционноспособной группы на основе (например, экзоциклический амин) или имеющейся гидроксильной группы на фрагменте сахара (например, 3'- или 5'-гидроксил). Пептидные цепи или цепи нуклеиновых кислот можно дополнительно обработать с получением производного по одному или нескольким сайтам, разрешая присоединение к цепи подходящих реакционноспособных групп. Смотри работу Chrisey и др., Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996).

Если пептид или нуклеиновая кислота представляет собой полностью или частично синтетическую молекулу, то реакционноспособную группу или маскированную реакционноспособную группу можно включить в процессе синтеза. Специалистам в данной области известны многие производные мономеры, подходящие для включения реакционноспособной группы в пептиды и нуклеиновые кислоты. Смотри, например, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis" Gross, E. and Melenhofer, J., Eds., Academic Press, New York (1980). Многие пригодные мономеры доступны коммерчески (Bachem, Sigma и др.). После синтеза можно удалить защиту с маскированной группы, тогда она становится доступной для взаимодействия с компонентом соединения данного изобретения.

Типичные направляющие агенты на основе нуклеиновых кислот включают аптамеры, антисмысловые соединения и нуклеиновые кислоты, которые образуют тройные спирали. В качестве необходимой химической функциональности для связи направляющего агента на основе нуклеотида с цитотоксином обычно используют гидроксильную группу от сахарного остатка, аминогруппу от основного остатка или фосфатный кислород от нуклеотида. Однако специалист в данной области легко поймет, что к нуклеиновой кислоте можно подвесить другие "неприродные" реакционноспособные функциональности, применяя общеизвестные методики. Например, гидроксильную группу сахарного остатка можно превратить в меркапто- или аминогруппу, применяя методики, хорошо известные в данной области.

Аптамеры (или антитела к нуклеиновым кислотам) представляют собой молекулы одно- или двухнитевой ДНК или однонитевой РНК, которые связывают конкретные молекулярные мишени. Обычно аптамеры действуют, ингибируя действие молекулярных мишеней, например белков, посредством связывания совокупности мишеней, циркулирующих в крови. Аптамеры обладают химической функциональностью и, таким образом, могут ковалентно связываться с цитотоксинами, которые здесь описаны.

Хотя очень разнообразные молекулярные мишени способны образовывать нековалентные, но специфические ассоциаты с аптамерами, включая лекарства в виде малых молекул, метаболиты, кофакторы, токсины, лекарства на основе сахаридов, лекарства на основе нуклеотидов, гликопротеины и подобные, обычно молекулярная мишень содержит белок или пептид, включая белки сыворотки, кинины, эйкозаноиды, клеточные поверхностные молекулы и подобные. Примеры аптамеров включают антитромбиновый ингибитор от Gilead GS 522 и его производные (Gilead Science, Foster City, Calif.). Смотри также работы Macaya и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3745-9 (1993); Bock и др., Nature (London) 355:564-566 (1992) и Wang и др., Biochem. 32:1899-904 (1993).

Аптамеры, специфические относительно данной биомолекулы, можно идентифицировать, применяя известные в данной области методики. Смотри, например, Toole и др. (1992) PCT-публикация № WO 92/14843; Tuerk and Gold (1991) PCT-публикация № WO 91/19813; Weintraub and Hutchinson (1992) PCT-публикация № 92/05285 и Ellington and Szostak, Nature 346: 818 (1990). Кратко говоря, данные методики обычно включают комплексообразование молекулярных мишеней со случайной смесью олигонуклеотидов. Комплекс аптамер-молекулярная мишень отделяют от незакомплексованных олигонуклеотидов. Аптамер восстанавливают из отделенного комплекса и амплифицируют. Этот цикл повторяют для идентификации последовательностей аптамеров с наибольшим сродством относительно данных молекулярных мишеней.

Для заболеваний, являющихся результатом неуместной экспрессии генов, идеальной терапией является специфическое предотвращение или снижение экспрессии таких генов. В принципе, можно ингибировать, снижать или отключить производство конкретного генного продукта посредством гибридизации одноцепочечного дезоксинуклеотида или рибодезоксинуклеотида, комплементарного доступной последовательности в мРНК, или последовательности в транскрипте, которая существенна для обработки пре-мРНК, или последовательности в самом гене. Данный пример генетического регулирования часто называют антисмысловым, или антигенным, ингибированием. Дополнительную эффективность придают посредством конъюгации с нуклеиновой кислотой алкилирующего агента, такого как агент настоящего изобретения.

Антисмысловые соединения представляют собой нуклеиновые кислоты, предназначенные для связывания и лишения возможности или предотвращения получения мРНК, ответственной за генерацию конкретного белка. Антисмысловые соединения включают антисмысловые РНК или ДНК, одно- или двухнитевые, олигонуклеотиды или их аналоги, которые могут гибридизоваться специфически относительно индивидуального вида мРНК и предотвращать транскрипцию и/или РНК-обработку данного вида мРНК и/или трансляцию кодированного полипептида и снижать тем самым количество соответствующего кодированного полипептида. Ching и др., Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder и др., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau и др., FEBS Letters 274: 53-56 (1990); Holcenberg и др., WO 91/11535; WO 91/09865; WO 91/04753; WO 90/13641; WO 91/13080, WO 91/06629 и EP 386563. Благодаря своей наилучшей целевой чувствительности и селективности антисмысловые олигонуклеотиды пригодны для доставки терапевтических агентов, таких как цитотоксины данного изобретения, к требуемой молекулярной мишени.

Другие сообщают, что нуклеиновые кислоты могут связываться с двойной ДНК посредством образования тройной спирали и ингибировать транскрипцию и/или синтез ДНК. Соединения с тройными спиралями (также обозначаемые как трехнитевые лекарства) представляют собой олигонуклеотиды, которые связываются с последовательностями двухнитевой ДНК и, как предполагается, селективно ингибируют транскрипцию генов, вызывающих заболевание, таких как вирусные гены, например ВИЧ и вирус herpes simplex, и онкогены, а именно они останавливают производство белка в клеточном ядре. Данные лекарства присоединяются непосредственно к двухниточной ДНК в клеточном геноме, образуя тройную спираль и предотвращая производство клеткой целевого белка. Смотри, например, PCT-публикации №№ WO 92/10590, WO 92/09705, WO 91/06626 и патент США № 5176996. Таким образом, цитотоксины настоящего изобретения также конъюгируют с последовательностями нуклеиновых кислот, которые образуют тройные спирали.

На сайт-специфичность нуклеиновых кислот (например, антисмысловых соединений и трехспиральных лекарств) несущественно влияет модификация фосфодиэфирной связи или химическая модификация олигонуклеотидного конца. Следовательно, данные нуклеиновые кислоты можно химически модифицировать, повышая общую стабильность связывания, повышая стабильность в смысле химического разложения, повышая скорость, с которой олигонуклеотиды транспортируются в клетки, и придавая молекулам химическую реакционную способность. Общий подход к конструированию разных нуклеиновых кислот, пригодных при антисмысловой терапии, рассматривается в работах van der Krol и др., Biotechniques 6: 958-976 (1988) и Stein и др., Cancer Res. 48: 2659-2668 (1988). Следовательно, в типичном варианте, цитотоксины данного изобретения конъюгируют с нуклеиновой кислотой при модификации фосфодиэфирной связи.

Кроме того, аптамеры, антисмысловые соединения и трехспиральные лекарства, несущие цитотоксины данного изобретения, могут также включать нуклеотидные замещения, добавления, уничтожения или перемещения, до тех пор, пока сохраняется специфическая гибридизация или ассоциация с подходящей целевой последовательностью как функциональное свойство олигонуклеотида. Например, некоторые варианты используют фосфоротиоатные аналоги, которые более устойчивы к разложению нуклеазами, чем их природные фосфатные диэфирные копии, и, следовательно, как ожидается, имеют более высокую устойчивость in vivo и большую эффективность (смотри, например, Campbell и др., J. Biochem. Biophys. Methods 20: 259-267 (1990)). Также известно, что фосфороамидатные производные олигонуклеотидов связываются с комплементарными полинуклеотидами и обладают дополнительной способностью аккомодировать ковалентно присоединенный вид лиганда и будут соответствовать способам настоящего изобретения. Смотри, например, Froehler и др., Nucleic Acids Res. 16(11):4831 (1988).

В некоторых вариантах аптамеры, антисмысловые соединения и трехспиральные лекарства содержат O-метилрибонуклеотиды (EP публикация № 360609). Можно также использовать химерные олигонуклеотиды (Dagle и др., Nucleic Acids Res. 18: 4751 (1990)). Для некоторых применений антисмысловые олигонуклеотиды и тройные спирали могут содержать полиамиднуклеиновые кислоты (Nielsen и др., Science 254: 1497 (1991) и PCT-публикация № WO 90/15065) или другие катионные производные (Letsinger и др., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470-4471 (1988)). Другие применения могут использовать олигонуклеотиды, где одна или несколько из фосфодиэфирных связей являются замещенными изостерической группой, такой как межнуклеозидная связь длиной в 2-4 атома, которая описана в PCT-публикациях №№ WO 92/05186 и 91/06556, или формацетальная группа (Matteucci и др., J. Am. Chem. Soc. 113: 7767-7768 (1991)), или амидная группа (Nielsen и др., Science 254: 1497-1500 (1991)).

Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать нуклеотидные аналоги, например, те, в которых сахар или основание химически модифицированы. "Аналогичными" формами пуринов и пиримидинов являются формы, обычно известные в данной области, многие из которых используют в качестве химиотерапевтических агентов. Типичный, но не исчерпывающий список включает 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)-урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N⁶-изопентиниладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N⁶-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, β-D-маннозилкуэозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N⁶-изопентиниладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), вибутоксозин, псевдоурацил, куэозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты и 2,6-диаминопурин. Кроме общеизвестных оснований используют галогенированные основания. Кроме того, положение 2'-фуранозы на основании может иметь замещение незаряженной объемной группой. Примеры незаряженных объемных групп включают разветвленные алкилы, сахара и разветвленные сахара.

Терминальная модификация также обеспечивает пригодную методику для конъюгации цитотоксинов с нуклеиновой кислотой, модификации специфичности клеточного типа, фармакокинетики, ядерной проницаемости и абсолютной скорости клеточного поглощения для олигонуклеотидных фармацевтических агентов. Например, известен порядок замещений по 5' и 3' концам для включения реакционноспособных групп, который допускает ковалентное присоединение цитотоксинов. Смотри, например, работы Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (1989) Cohen, Ed., CRC Press; Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapeutic for Cancer and AIDS (1991), Wickstrom, Ed., Wiley-Liss; Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (1992) Erickson and Izant, Eds., Raven Press и Antisense RNA и DNA (1992), Murray, Ed., Wiley-Liss. Общие способы, касающиеся антисмысловых соединений, смотри в работе Antisense RNA and DNA (1988), D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Детектируемые Метки

Особая метка или детектируемая группа, используемая в сопряжении с соединениями и способами по данному изобретению, обычно не является критичным аспектом изобретения, до тех пор, пока она существенно не влияет на активность или применимость соединения данного изобретения. Детектируемой группой может быть любой материал, обладающий детектируемым физическим или химическим свойством. Такие детектируемые метки основательно разработаны в области иммуноисследований, и, вообще, большинство меток, пригодных в таких способах, может применяться в настоящем изобретении. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. Пригодные метки в настоящем изобретении включают магнитные гранулы (например, DYNABEADS^TM), флуоресцентные красители (например, флуоресцеинизотиоцианат, Texas red, родамин и подобные), радиометки (например, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²P), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие, обычно используемые в ELISA) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или пластиковые гранулы (например, полистирол, полипропилен, латекс и др.).

Метка может быть связана непосредственно или не непосредственно с соединением данного изобретения в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Как указано выше, можно использовать широкое многообразие меток, выбирая метку в зависимости от необходимой чувствительности, простоты конъюгации с соединением, требований стабильности, имеющейся аппаратуры и обеспечения ее удаления.

Если соединение данного изобретения представляет собой конъюгат с детектируемой меткой, то данная метка предпочтительно является элементом, выбранным из группы, включающей радиоактивные изотопы, флуоресцентные агенты, предшественники флуоресцентных агентов, хромофоры, ферменты и их комбинации. Способы конъюгации различных групп с антителами хорошо известны в данной области. Например, детектируемая метка, которую часто конъюгируют с антителом, представляет собой фермент, такой как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и глюкозооксидаза.

Нерадиоактивные метки часто присоединяют непрямыми способами. Обычно молекулу лиганда (например, биотина) ковалентно связывают с компонентом конъюгата. Затем присоединяют лиганд к другой молекуле (например, стрептавидина), которая либо по существу является детектируемой, либо ковалентно связана с сигнальной системой, например с детектируемым ферментом, флуоресцентным соединением или хемилюминесцентным соединением.

Компоненты конъюгатов по данному изобретению также могут быть непосредственно конъюгированы с соединениями, генерирующими сигнал, например, при конъюгации с ферментом или флуорофором. Ферменты, представляющие интерес в качестве метки, представляют собой, главным образом, гидролазы, в особенности фосфатазы, эстеразы и гликозидазы, или оксидотазы, в особенности пероксидазы. Флуоресцентные соединения включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и др. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол. Обзор различных меток или сигнал-продуцирующих систем, которые можно использовать, смотри в патенте США № 4391904.

Способы детектирования меток хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, если метка представляет собой, например, радиоактивную метку, средства детектирования включают сцинтилляционный счетчик или фотографическую пленку, как в авторадиографии. Если метка представляют собой флуоресцентную метку, то ее можно детектировать, возбуждая флуорохром при подходящей длине волны света и детектируя полученную флуоресценцию. Можно детектировать флуоресценцию визуально, при помощи фотографической пленки, используя электронные детекторы, такие как приборы с зарядовой связью (ПЗС) или фотоумножители и подобные. Аналогично, ферментативные метки можно детектировать, обеспечивая подходящие субстраты для фермента и детектируя получаемый продукт реакции. В заключение, простые колориметрические метки можно детектировать, просто наблюдая цвет, ассоциированный с данной меткой. Таким образом, в различных исследованиях по индикаторам конъюгированное золото часто выглядит розовым, тогда как различные конъюгированные гранулы имеют цвет данных гранул.

В настоящее время предпочтительны флуоресцентные метки, так как они имеют преимущество, не требуя больших предосторожностей при работе и являясь пригодными для высокопроизводительных визуальных методик (оптический анализ, включающий преобразование в цифровую форму изображения для анализа в интегрированной системе, включающей компьютер). Предпочтительные метки обычно характеризуется одним или несколькими из следующих факторов: высокой чувствительностью, высокой стабильностью, слабым фоном, низкой чувствительностью к окружению и высокой специфичностью при введении метки. Многие флуоресцентные метки доступны коммерчески от химической компании SIGMA (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) и Applied Biosystems (Foster City, CA), а также многих других коммерческих источников, известных специалистам. Кроме того, специалист в данной области определит, как выбрать подходящий флуорофор для конкретного применения, и, если он не является легко доступным коммерчески, специалист способен синтезировать необходимый флуорофор заново или синтетически модифицировать коммерчески доступные флуоресцентные соединения, чтобы получить требуемую флуоресцентную метку.

Кроме того, в настоящем изобретении пригодны флуорофоры в виде малых молекул, природные флуоресцентные белки и сконструированные аналоги таких белков. Такие белки включают, например, зеленые флуоресцентные белки из cnidarians (Ward и др., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine и др., Comp. Biochem, Physiol, 72B:77-85 (1982)), желтый флуоресцентный белок из штамма Vibrio fischeri (Baldwin и др., Biochemistry 29: 5509-15 (1990)), перидинин-хлорофилл из dinoflagellate Symbiodinium sp. (Morris и др., Plant Molecular Biology 24: 673:77 (1994)), фикобилипротеины из морских сине-зеленых водорослей, таких как Synechococcus, например фикоэритрин и фикоцианин (Wilbanks и др., J. Biol Chem. 268: 1226-35 (1993)) и подобные.

Обычно перед образованием связи между цитотоксином и направляющим (или другим) агентом и необязательно спейсерной группой активируют, по меньшей мере, одну из химических функциональностей. Специалист в данной области понимает, что разнообразные химические функциональности, включающие гидрокси, амино и карбокси-группы, можно активировать, используя разнообразные стандартные способы и условия. Например, гидроксильную группу цитотоксина или направляющего агента можно активировать посредством обработки фосгеном, получая соответствующий хлорформиат, или пара-нитрофенилхлорформиатом, получая соответствующий карбонат.

В типичном варианте изобретение использует направляющий агент, который включает карбоксильную функциональность. Карбоксильную группу можно активировать, например, посредством конверсии в соответствующий ацилгалогенид или активный сложный эфир. Данную реакцию можно проводить в различных условиях, как показано в приведенной выше работе March, pp. 388-89. В типичном варианте ацилгалогенид получают посредством взаимодействия карбоксил-содержащей группы с оксалилхлоридом. Проводят взаимодействие активированного агента с цитотоксином или комбинацией цитотоксин-линкерная группа, получая конъюгат по данному изобретению. Специалист в данной области оценит, что использование карбоксил-содержащих направляющих агентов является только иллюстративным, и что агенты, имеющие многие другие функциональные группы, можно конъюгировать с линкерами по данному изобретению.

Реакционноспособные функциональные группы

Для простоты иллюстрации последующее обсуждение фокусируется на конъюгации цитотоксина данного изобретения с направляющим агентом. Центром обсуждения является пример одного варианта по данному изобретению, из которого специалист в данной области легко сделает выводы о других вариантах. Фокусируя обсуждение на одном варианте, не подразумевают никаких ограничений данного изобретения.

Типичные соединения данного изобретения несут реакционноспособную функциональную группу, которая обычно расположена на замещенной или незамещенной алкильной или гетероалкильной цепи, облегчая ее присоединение к другому типу. Обычным расположением для реакционноспособной группы является терминальное положение на цепи.

Реакционноспособными группами и классами реакций, пригодными для применения на практике настоящего изобретения, обычно являются те, которые хорошо известны в данной области химии биоконъюгатов. Реакционноспособная функциональная группа может быть защищенной или незащищенной, и защищенную природу группы можно изменить способами, известными в данной области органического синтеза. В настоящее время преимущественными классами доступных реакций с реакционноспособными аналогами цитотоксинов являются классы реакций, которые протекают в относительно мягких условиях. Они включают, но не ограничены этим, нуклеофильные замещения (например, взаимодействия аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активными сложными эфирами), электрофильные замещения (например, реакции енаминов) и присоединения к кратным связям углерод-углерод и углерод-гетероатом (например, реакция Михаэля, присоединение по Дильсу-Альдеру). Данные и другие подходящие реакции обсуждаются, например, в работе March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 и Feeney и др., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

Характерные типы реакций включают взаимодействие карбоксильных групп и различных их производных, включая, но не ограничиваясь этим, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, N-гидроксибензтриазольные сложные эфиры, галогенангидриды кислот, ацилимидазолы, сложные тиоэфиры, пара-нитрофенильные сложные эфиры, алкильные, алкенильные, алкинильные и ароматические сложные эфиры. Гидроксильные группы можно превратить в сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и др. Галогеналкильные группы превращают в новый тип при взаимодействии, например, с амином, карбоксилат-анионом, тиоловым анионом, карбанионом или алкоксид-ионом. Диенофильные (например, малеимидная) группы участвуют в реакции Дильса-Альдера. Альдегидные или кетонные группы можно превратить в имины, гидразоны, семикарбазоны или оксимы, или применяя такие способы, как присоединение по Гриньяру или присоединение алкиллития. Сульфонилгалогениды легко взаимодействуют с аминами, образуя, например, сульфонамиды. Например, аминные или сульфгидрильные группы ацилируют, алкилируют или окисляют. Алкены можно превратить в ряд новых видов, применяя циклоприсоединения, ацилирование, присоединение по Михаэлю и др. Эпоксиды легко взаимодействуют с аминами и гидроксильными соединениями.

Специалист в данной области легко поймет, что многие из этих связей можно получить разнообразными способами и применяя разнообразные условия. Получение сложных эфиров смотри, например, в приведенной выше работе March, стр. 1157; сложных тиоэфиров - в приведенной выше работе March, стр. 362-363, 491, 720-722, 829, 941 и 1172; карбонатов - в приведенной выше работе March, стр. 346-347; карбаматов - в приведенной выше работе March, стр. 1156-57; амидов - в приведенной выше работе March, стр. 1152; карбамидов и тиокарбамидов - в приведенной выше работе March, стр. 1174; получение ацеталей и кеталей смотри в приведенной выше работе Green и др., стр. 178-210 и приведенной выше работе March, стр. 1146; получение ацилоксиалкильных производных смотри в Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, K. B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992; получение сложных эфиров енолов смотри в приведенной выше работе March, стр. 1160; N-сульфонилимидатов смотри в работе Bundgaard и др., J. Med. Chem., 31: 2066 (1988); ангидридов - в приведенной выше работе March, стр. 355-56, 636-37, 990-91 и 1154; N-ациламидов - в приведенной выше работе March, стр. 379; N-оснований Манниха - в приведенной выше работе March, стр. 800-02 и 828; получение сложных эфиров гидроксиметилкетонов смотри в работе Petracek и др., Annals NY Acad. Set, 507:353-54 (1987); дисульфидов - в приведенной выше работе March, стр. 1160 и фосфонатных сложных эфиров и фосфонамидатов.

Реакционноспособные функциональные группы могут быть незащищенными и выбраны таким образом, что не участвуют во взаимодействиях или не влияют на них. По-другому, реакционноспособные функциональные группы могут быть защищены от участия во взаимодействии благодаря присутствию защитной группы. Специалист в данной области понимает, как защитить конкретную функциональную группу от влияния выбранного набора условий реакции. Примеры пригодных защитных групп смотри в работе Greene и др., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Обычно направляющий агент ковалентно присоединяют к цитотоксину благодаря их соответствующим химическим функциональностями, используя стандартные химические методики. Необязательно, линкер или агент присоединяют к агенту через одну или более спейсерных групп. Спейсерные группы могут быть эквивалентными или разными, если используются в комбинации.

Обычно перед образованием связи между цитотоксином и реакционноспособной функциональной группой и необязательно спейсерной группой, по меньшей мере, одну из химических функциональностей активируют. Специалист в данной области оценит, что разнообразные химические функциональности, включая гидрокси, амино и карбокси-группы, можно активировать, применяя разнообразные стандартные способы и условия. В типичном варианте изобретение содержит карбоксильную функциональность в качестве реакционноспособной функциональной группы. Карбоксильные группы можно активировать, как описано здесь выше.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ И СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение касается фармацевтического препарата, включающего соединение данного изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Описанные здесь соединения, включая фармацевтически приемлемые носители, такие как аддитивные соли или их гидраты, можно доставить пациенту, используя разнообразные методы или способы введения. Подходящие способы введения включают, но не ограничены этим, ингаляцию, трансдермальное, пероральное, ректальное введение, введение через слизистую оболочку, кишечное и парентеральное введение, включая внутримышечные, подкожные и внутривенные инъекции. Предпочтительно вводить конъюгаты данного изобретения, включающие антитело или фрагмент антитела в качестве направляющего фрагмента, парентерально, более предпочтительно внутривенно.

Предполагается, что используемые здесь термины "прием" или "введение" охватывают все способы непосредственной и не непосредственной доставки соединения к назначенному месту действия.

Описанные здесь соединения или их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты можно вводить сами по себе, в комбинации с другими соединениями данного изобретения и/или в виде коктейля, объединив с другими терапевтическими агентами. Конечно, выбор терапевтических агентов, которые можно совместно вводить с соединениями данного изобретения, отчасти зависит от условий обработки.

Например, если соединение вводят пациентам, страдающим от болезненного состояния организма, которое зависит от автостимулятора (автоиндуктора), то соединения данного изобретения можно вводить в виде коктейлей, содержащих агенты, используемые для лечения боли, инфекции и других симптомов и побочных эффектов, обычно связанных с данным заболеванием. Такие агенты включают, например, анальгетики, антибиотики и др.

При введении пациенту, проходящему курс лечения рака, соединения можно вводить в виде коктейлей, содержащих противораковые агенты и/или дополнительные агенты, повышающие эффективность. Соединения можно также вводить в виде коктейлей, содержащих агенты, которые подавляют такие побочные эффекты радиационной терапии, как противорвотные агенты, защитные агенты от радиации и др.

Дополнительные агенты, повышающие эффективность, которые можно вводить совместно с соединениями данного изобретения, включают, например, трициклические антидепрессантные лекарства (например, имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и мапротилин); нетрициклические и антидепрессантные лекарства (например, сертралин, тразодон и циталопрам); Ca⁺²-антагонисты (например, верапамил, нифедипин, нитрендипин и кароверин); амфотерицин; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); лекарства против аритмии (например, гуинидин); антигипертензивные лекарства (например, резерпин); тиол-выводящие агенты (например, бутионин и сульфохимин) и кальций лейковорин.

Активные соединения данного изобретения вводят сами по себе или в виде фармацевтической композиции, где активное соединение (соединения) находится в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями. Фармацевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению обычно составляют общеизвестным способом, используя один или более физиологически приемлемых носителей, включающих наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку активных соединений до препаратов, которые можно использовать фармацевтически. Подходящий препарат зависит от выбранного способа введения.

Для введения через слизистую оболочку в препарате используют проникающие агенты, подходящие для преодоления барьера. Такие проникающие агенты обычно известны в данной области.

Для перорального введения соединения можно легко приготовить, объединяя активное соединение (соединения) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители дают возможность готовить соединения данного изобретения в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и подобного для перорального заглатывания пациентом, подлежащим лечению. Для получения фармацевтических препаратов для перорального использования можно твердый наполнитель необязательно перемолоть в результирующую смесь и, если требуется, обработать данную смесь гранул после добавления подходящих вспомогательных агентов, получая ядра таблеток или драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (PVP). Если требуется, можно добавить разрыхлители, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, например альгинат натрия.

Ядра драже снабжают приемлемыми покрытиями. Для этой цели можно использовать концентрированные сахарные растворы, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Можно добавить к покрытиям таблеток или драже красящие вещества или пигменты для идентификации или характеристики разных комбинаций доз активных соединений.

Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают набитые капсулы из желатина, а также мягкие, закупоренные капсулы из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Набитые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими, такими как крахмалы, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, можно добавить стабилизаторы. Все препараты для перорального введения должны быть в дозированном виде, подходящем для такого введения.

Для буккального введения композиции могут иметь вид таблеток или лепешек, приготовленных общеизвестным способом.

Для введения посредством ингаляции соединения для использования в соответствии с настоящим изобретением обычно доставляют в виде аэрозольного спрея из упаковок под давлением или распылителя с применением подходящего пропелланта, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае герметичного аэрозоля дозировочную единицу можно определить, обеспечив клапан, доставляющий отмеренное количество. Можно приготовить капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Соединения можно приготовить для парентерального введения посредством инъекции, например болюсной инъекции, или непрерывного вливания. Инъекция является предпочтительным методом введения для композиций настоящего изобретение. Препараты для инъекции можно представить, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавкой консервантов. Композиции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать агенты, способствующие получению препарата, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты, можно добавить такие агенты, как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соли, например, альгинат натрия.

Фармацевтические препараты для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений можно получить в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают такие жирные масла, как кунжутное масло, или такие синтетические жирнокислотные сложные эфиры, как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость соединений, допуская приготовление высококонцентрированных растворов. Для инъекций агенты данного изобретения можно приготовить в водных растворах, предпочтительно в таких физиологически совместимых буферах, как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический буфер.

По-другому, активный ингредиент может быть в виде порошка для восстановления перед использованием при помощи подходящего носителя, например стерильной воды, не содержащей пирогенов.

Соединения можно также приготовить в виде композиций для ректального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие общеизвестные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

В дополнение к описанным ранее препаратам можно также приготовить соединения в виде препарата длительного действия. Такие препараты длительного действия можно вводить посредством имплантации или доставлять через кожу (например, подкожно или внутримышечно), при помощи внутримышечной инъекции или трансдермального пластыря. Таким образом, можно формулировать соединения, например, с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде слаборастворимых производных, например слаборастворимых солей.

Фармацевтические композиции также могут содержать подходящие твердые или гелеобразные носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают, но не ограничены этим, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой композицию, приготовленную для инъекции, например внутривенной инъекции, и включает примерно от 0,01 до 100% масс. конъюгата лекарство-лиганд, принимая за 100% массу всей фармацевтической композиции. Конъюгат лекарство-лиганд может представлять собой конъюгат антитело-цитотоксин, где антитело выбрано таким образом, чтобы быть нацеленным на конкретный рак.

БИБЛИОТЕКИ

В область настоящего изобретения входят также библиотеки конъюгатов цитотоксинов цитотоксин-линкер и агент-линкер для цитотоксинов и линкеров данного изобретения. Типичные библиотеки включают, по меньшей мере, 10 соединений, более предпочтительно, по меньшей мере, 100 соединений, еще предпочтительнее, по меньшей мере, 1000 соединений и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 100000 соединений.

Библиотеки существуют в таком виде, что легко делать запрос по конкретному свойству, например цитотоксичности, разложению линкера ферментом или другим реагентом разложения. Типичные формы включают форматы чипов, микромассивы и подобные.

Параллельный или комбинаторный синтез имеет своей главной целью образование библиотеки различных молекул, которые все обладают общим отличительным признаком, обозначенным в данном описании как каркас. При замене различных компонентов в каждой из изменяющихся частей каркасной молекулы растет количество исследуемого пространства в библиотеке. Теории и современная медицинская химия поддерживают концепцию занятого пространства как ключевого фактора в определении эффективности данного соединения против данной биологической мишени. При создании многообразной библиотеки молекул, которая рассматривает большую долю целевого пространства, значительно возрастают случайности развития высокоэффективного начального соединения.

Параллельный синтез обычно проводят на твердофазном носителе, таком как полимерная смола. Каркас или другой подходящий промежуточный продукт привязывают к смоле химическим линкером с возможностью отщепления. Пока каркас привязан к частице, проводят реакции для его модификации.

Вариации реагентов и/или условий реакции дают структурное многообразие, которое является критерием каждой библиотеки.

Попытки проведения параллельного синтеза "малых" молекул (неолигомеров с молекулярной массой 200-1000) были редкими до 1990. Смотри, например, работу Camps и др., Annaks de Quimica, 70: 848 (1990). Недавно Ellmann раскрыл параллельный синтез на твердофазном носителе (также называемый "комбинаторным") одиннадцати аналогов бензодиазепина наряду с некоторыми простагландинами и бета-поворотными миметиками. Данные раскрытия приведены в качестве примеров в патенте США № 5288514. Другое подходящее раскрытие параллельного синтеза малых молекул можно найти в патенте США № 5324483. Данный патент раскрывает параллельный синтез 4-40 соединений в каждом из шестнадцати разных каркасов. Chen и др. также применили стратегии органического синтеза для разработки непептидных библиотек, синтезированных с использованием многостадийных процессов на полимерном носителе (Chen и др., J. Am. Chem. Soc, 116: 2661-2662 (1994)).

Получив библиотеку уникальных соединений, можно получить библиотеку иммуноконъюгатов или антител, используя в качестве исходной точки библиотеку автостимуляторов и описанные здесь способы.

НАБОРЫ

Другой аспект настоящего изобретения касается наборов, содержащих одно или более соединений или композиций по данному изобретению и указания по применению соединения или композиции. В типичном варианте изобретение касается набора для конъюгации линкерной группы данного изобретения с другой молекулой. Набор включает линкер и указания по присоединению данного линкера к конкретной функциональной группе. Набор может также включать одно или несколько из цитотоксических лекарств, направляющих агентов, детектируемых меток, фармацевтических солей или буферов. Набор может также включать контейнер и необязательно один или более пузырьков, тестовых пробирок, склянок, бутылочек или шприцев. Другие форматы для наборов ясны специалистам в данной области и входят в область настоящего изобретения.

ОЧИСТКА

В другом типичном варианте настоящее изобретение касается способа выделения молекулярной мишени для соединения лиганд-цитотоксин по данному изобретению, которая связывается с лигандом X⁴. Данный способ предпочтительно включает взаимодействие клеточного препарата, который содержит мишень, с иммобилизованным соединением с образованием комплекса между рецептором и иммобилизованным соединением.

Цитотоксин данного изобретения можно иммобилизовать на аффинном носителе любыми признанными в данной области способами. По-другому, цитотоксин можно иммобилизовать, используя один или более линкеров данного изобретения.

Еще в другом типичном варианте изобретение касается матрикса для аффинной очистки, который включает линкер данного изобретения.

Способ данного изобретения для выделения мишени обычно использует одну или более методик аффинной хроматографии. Аффинная хроматография дает возможность эффективно выделять вид, например биологические молекулы или биополимеры, используя их сайты распознавания для некоторых химических структур на носителе с высокой степенью селективности. Литература наполнена статьями, монографиями и книгами по аффинной хроматографии, включая такие темы, как носители для аффинной хроматографии, сшитые компоненты, лиганды и их получение и применение. Выборка таких ссылок включает: Ostrove, Methods Enzymol. 182: 357-71 (1990); Ferment, Bioeng. 70: 199-209 (1990). Huang и др., J. Chromatogr. 492: 431-69 (1989); "Purification of enzymes by heparin-Sepharose affinity Chromatography," J. Chromatogr., 184: 335-45 (1980); Farooqi, Enzyme Eng., 4: 441-2 (1978); Nishikawa, Chem. Technol, 5(9): 564-71 (1975); Guilford и др., in, Pract. High Perform. Liq. Chromatogr., Simpson (ed.), 193-206 (1976); Nishikawa, Proc. Int. Workshop Technoi. Protein Sep. Improv. Blood Plasma Fractionation, Sandberg (ed.), 422-35; (1977) " Affinity Chromatography of enzymes," Affinity Chromatogr., Proc. Int. Symp. 25-38, (1977) (Pub. 1978) и Affinity Chromatography: A Practical Approach, Dean и др. (ed.), IRL Press Limited, Oxford, England (1985). Специалисты в данной области имеют достаточно руководств по разработке конкретных способов аффинной хроматографии, использующих материалы данного изобретения.

В настоящем способе можно использовать в качестве носителей среду для аффинной хроматографии различной химической структуры. Например, в качестве материалов носителей пригодны агарозные гели и сшитые агарозные гели, так как гидрофильность делает их относительно свободными от неспецифического связывания. Другие пригодные носители включают, например, стеклянные гранулы с регулированными порами (CPG), частицы целлюлозы, гранулы полиакриламидного геля и гранулы геля Sephadex™, полученные из декстрана и эпихлоргидрина.

СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ЛЕКАРСТВО-ЛИГАНД

Кроме описанных выше композиций и конструкций настоящее изобретение также касается ряда способов, которые можно применять на практике, используя соединения и конъюгаты по данному изобретению. Способы применения конъюгата лекарство-лиганд по настоящему изобретению включают: уничтожение или ингибирование роста или репликации опухолевой клетки или раковой клетки, лечение рака, лечение предракового состояния, уничтожение или ингибирование роста или репликации клетки, которая экспрессирует аутоиммунное антитело, лечение аутоиммунного заболевания, лечение инфекционного заболевания, профилактику размножения опухолевой клетки или раковой клетки, профилактику рака, профилактику размножения клетки, которая экспрессирует аутоиммунное антитело, профилактику аутоиммунного заболевания и профилактику инфекционного заболевания. Данные способы применения включают введение нуждающемуся в этом животному, такому как млекопитающее или человек, эффективного количества конъюгата лекарство-лиганд. Предпочтительные лиганды для многих описанных здесь способов применения включают антитела и фрагменты антител, которые нацелены на конкретную опухолевую клетку, раковую клетку или другую намеченную область.

Комплекс лекарство-лиганд по настоящему изобретению пригоден для лечения рака, аутоиммунного заболевания и инфекционного заболевания у животного. Обеспечены композиции и способы лечения опухолей, доставляющие обсуждаемую композицию фармацевтически приемлемым способом при фармацевтически эффективном количестве композиции настоящего изобретения.

Настоящее изобретение особо пригодно для лечения рака и ингибирования размножения опухолевых клеток или раковых клеток у животного. Рак или предраковое состояние, включая, но не ограничиваясь этим, опухоль, метастаз или любое заболевание или нарушение, характеризующееся нерегулируемым ростом клеток, можно лечить или производить его профилактику посредством введения комплекса лекарство-лиганд по настоящему изобретению. Комплекс доставляет лекарство к опухолевой клетке или раковой клетке. В одном варианте лиганд специфически связывает или ассоциируется с антигеном, ассоциированным с раковой клеткой или опухолевой клеткой. Благодаря своему близкому соседству с лигандом лекарство может поглощаться опухолевой клеткой или раковой клеткой, например, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Антиген может быть присоединен к опухолевой клетке или раковой клетке или может представлять собой внеклеточный матриксный белок, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Будучи внутри клетки, линкер гидролитически отщепляется протеазами, ассоциированными с опухолевой клеткой или раковой клеткой, высвобождая при этом лекарство. Высвобожденное лекарство далее становится свободно для диффузии и индуцирования цитотоксических активностей. В альтернативном варианте лекарство отщепляется от комплекса лекарство-лиганд вне опухолевой клетки или раковой клетки, и затем лекарство проникает в клетку.

Лиганд может быть связан, например, с опухолевой клеткой или раковой клеткой, антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который находится на поверхности опухолевой клетки или раковой клетки, или с антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который представляет собой внеклеточный матриксный белок, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Лиганд может быть предназначен специально для конкретного типа опухолевых клеток или раковых клеток. Следовательно, выбирая лиганд, можно менять тип опухолей или раковых заболеваний, который можно эффективно лечить.

Типичные примеры предраковых состояний, которые могут быть целевыми для конъюгата лекарство-лиганд, включают, но не ограничены этим: метаплазию, гиперплазию, дисплазию, колоректальные полипы, актинический кетатоз, актинический хейлит, человеческий вирус папилломы, лейкоплакию, безболезненное возникновение язв и повреждений кожи и болезнь Боуэна.

Типичные примеры раковых заболеваний или опухолей, которые могут представлять цели для конъюгата лекарство-лиганд, включают, но не ограничены этим: рак легких, рак ободочной кишки, рак простаты, лимфому, меланому, рак молочной железы, рак яичников, тестикулярный рак, рак ЦНС, ренальный рак, рак почки, рак поджелудочной железы, рак желудка, оральный рак, носовой рак, цервикальный рак и лейкозы. Обычный специалист легко поймет, что конкретный направляющий лиганд, используемый в конъюгате, можно выбрать таким образом, чтобы он целенаправленно доставлял лекарство к опухолевой ткани, подлежащей обработке данным лекарством (а именно выбрать направляющий агент, специфический относительно опухоль-специфического антигена). Примеры таких направляющих лигандов хорошо известны в данной области, их неограничительные примеры включают анти-Her2 для лечения рака молочной железы, анти-CD20 для лечения лимфомы, анти-PSMA для лечения рака простаты и анти-CD30 для лечения лимфом, включая неходжкинскую лимфому.

В одном варианте настоящее изобретение касается способа уничтожения клетки. Данный способ включает введение в клетку некоторого количества соединения данного изобретения, достаточного для гибели указанной клетки. В типичном варианте соединение вводят субъекту, несущему данную клетку. Еще в одном типичном варианте введение способствует замедлению или прекращению роста опухоли, которая включает данную клетку (например, клетка может представлять собой опухолевую клетку). Для введения с целью замедления роста скорость роста клеток должна быть, по меньшей мере, на 10% меньше, чем скорость роста до введения. Предпочтительно, чтобы скорость роста замедлялась, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или рост полностью прекращался.

Эффективная дозировка

Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активный ингредиент содержится в терапевтически эффективном количестве, а именно в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Действительное количество, эффективное для конкретного применения, зависит, среди прочего, от условий лечения. Специалист в данной области легко способен выполнить определение эффективного количества, особенно в свете приведенного здесь подробного раскрытия.

Для любого описанного здесь соединения терапевтически эффективное количество можно сначала определить из исследования клеточной культуры. Целевые концентрации в плазме равны таким концентрациям активного соединения (соединений), которые способны ингибировать рост или деление клеток. В предпочтительных вариантах клеточная активность ингибируется, по меньшей мере, на 25%. В настоящее время предпочтительны целевые концентрации в плазме активного соединения (соединений), которые способны вызвать, по меньшей мере, примерно 50%, 75% или даже 90% или более сильное ингибирование клеточной активности. Процент ингибирования клеточной активности у пациента можно контролировать с целью оценки правильности достигнутой концентрации лекарства в плазме, и можно регулировать дозу, повышая ее или понижая, для достижения требуемой степени ингибирования.

Как хорошо известно в данной области, терапевтически эффективные количества для применения на людях также можно определить на животных моделях. Например, дозу для людей можно сформулировать таким образом, чтобы достичь такой циркулирующей концентрации, которая, как обнаружено, является эффективной у животных. Дозировку у людей можно регулировать, контролируя клеточное ингибирование и повышая или понижая дозу, как описано выше.

Терапевтически эффективную дозу можно также определить из данных по применению человеком соединений, для которых известно, что они демонстрируют аналогичные фармакологические активности. Применяемые дозы можно регулировать на основании относительной биологической доступности и эффективности вводимого соединения по сравнению с известным соединением.

Специалист в данной области способен легко определить регулируемую дозу для достижения максимальной эффективности у людей, основываясь на описанных выше способах и других способах, которые хорошо известны в данной области.

В случае локального применения системные циркулирующие в крови концентрации вводимого соединения не являются особо важными. В таких случаях соединение вводят таким образом, чтобы обеспечить в локализованной области концентрацию, эффективную для достижения предполагаемого результата.

Для использования при профилактике и/или лечении заболеваний, относящихся к аномальной клеточной пролиферации, предпочтительной является циркулирующая концентрация вводимого соединения примерно от 0,001 до 20 мкМ, предпочтительно примерно от 0,01 до 5 мкМ.

Дозы для перорального введения пациенту описанных здесь соединений обычно составляют примерно от 1 до 10000 мг/день, чаще примерно от 10 до 1000 мг/день и наиболее типично примерно от 50 до 500 мг/день. Типичные дозы, установленные с учетом массы пациента, составляют примерно от 0,01 до 150 мг/кг/день, чаще примерно от 0,1 до 15 мг/кг/день и наиболее типично примерно от 1 до 10 мг/кг/день, например 5 мг/кг/день или 3 мг/кг/день.

Для других способов введения можно индивидуально регулировать количество доз и интервал между приемами, обеспечивая уровни вводимого соединения в плазме, эффективные для конкретного клинического показания, подлежащего лечению. Например, в одном варианте, можно вводить соединение по данному изобретению при относительно высоких концентрациях несколько раз в день.

По-другому, может быть более желательным вводить соединение данного изобретения при минимальных эффективных концентрациях и применять схему приема с менее частым введением. Это обеспечит терапевтический режим, который соответствует тяжести заболевания индивидуума.

Используя приведенное здесь описание, можно планировать эффективный режим терапевтического лечения, который не дает существенной токсичности и вполне эффективен для лечения клинических симптомов, демонстрируемых конкретным пациентом. Это планирование должно включать тщательный выбор активного соединения при рассмотрении таких факторов, как эффективность соединения, относительная биологическая доступность, масса тела пациента, наличие и тяжесть нежелательных побочных эффектов, предпочтительный способ введения и профиль токсичности выбранного агента.

Соединения, композиции и способы настоящего изобретения дополнительно проиллюстрированы примерами, которые приведены далее. Данные примеры предлагаются для иллюстрации, а не для ограничения заявленного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

В приведенных ниже примерах, если не указано по-другому, температуры даны в градусах Цельсия (°C); операции проводят при комнатной температуре или температуре окружающей среды (обычно в диапазоне примерно 18-25°C); выпаривание растворителя проводят, используя роторный испаритель при пониженном давлении (обычно 4,5-30 мм рт. ст.) при температуре бани до 60°C; за протеканием реакций обычно следят способом ТСХ и времена реакций приводят только для иллюстрации; температуры плавления даны без поправок; продукты демонстрируют удовлетворительные ¹H-ЯМР и/или микроаналитические данные; выходы приведены только для иллюстрации; и также используются следующие общеизвестные сокращения: т.пл. (температура плавления), л (литр(ы)), мл (миллилитр), ммоль (миллимоли), г (граммы), мг (миллиграммы), мин (минуты), ЖХ-МС (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия) и ч (часы). ¹H-ЯМР спектры измерены на спектрометре Varian Mercury 300 МГц и согласуются с заданными структурами. Химические сдвиги приводятся в миллионных долях (м.д.) в области низких полей относительно тетраметилсилана. Масс-спектры с электрораспылением регистрируют на масс-спектрометре Perkin Elmer Sciex API 365. Элементный анализ проводят при помощи Robertson Microlit Laboratories, Madison, NJ. Для флэш-хроматографии используют силикагель марки E. Merck (230-400 меш). Аналитическую ВЭЖХ с обращенной фазой проводят на установке HP 1100 или Varian ProStar 210 с колонкой Phenomenex Luna 5 мкм C-18(2) 150 мм x 4,6 мм или колонкой Varian Microsorb-MV 0,1 мкм C-18 150 мм x 4,6 мм. Скорость потока составляет 1 мл/мин с градиентом от 0 до 50% буфера B за 15 мин или от 10 до 100% буфера B за 10 мин с УФ-детектированием при 254 нм. Буфер A: 20 мМ формиат аммония + 20% ацетонитрил или 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле; буфер B: 20 мМ формиат аммония + 80% ацетонитрил или 0,1% водная трифторуксусная кислота. Препаративную ВЭЖХ с обращенной фазой проводят на установке Varian ProStar 215 с колонкой Waters Delta Pak 15 мкм C-18 300 мм x 7,8 мм.

ПРИМЕР 1: Синтез конъюгатов с пептидными линкерами

1.1a Методология синтеза

Схема 1

Схема 2

Схема 3

Схема 4

Схема 5

Схема 6

1.1b Синтез соединения 1: трет-бутилового эфира N-[2'-(N'-трет-бутоксикарбониламино)этил]валина. К раствору 2-(N-трет-бутоксикарбониламино)этилбромида (1 г, 4,5 ммоль) и трет-бутилового эфира валина (0,936 г, 4,5 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляют карбонат калия (1,85 г, 13,5 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при 100°C в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют и очищают остаток методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь этилацетат/гексан (3/7) и получая указанное в заголовке соединение в виде масла (0,16 г, 12%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 0,94 (нечеткий т, 6H), 1,44 (с, 9H), 1,473 и 1,475 (2с, 9H), 1,88 (м, 1H), 2,51 (м, 1H), 2,78 (м, 2H), 3,11 (м, 1H), 3,22 (м, 1H), 3,39 и 4,13 (2 ш.т, 1H), 5,00 (ш.с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 205 (M+H⁺-112), 261 (M+H⁺-Bu), 317 (M+H⁺).

1.1c Синтез соединения 2: N-(2-Аминоэтил)валина. Соединение 1 (137 мг, 0,43 ммоль) растворяют в растворе ТФА/дихлорметан (2 мл, 1/1) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин Реакционную смесь концентрируют досуха, получая указанное в заголовке соединение в виде масла (0,18 г, 95%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 1,07 и 1,16 (2д, 6H), 2,35 (м, 1H), 3,2 (м, 1H), 3,38 (м, 4H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 217 (M+H⁺).

1.1d Синтез соединения 3. К раствору малеамид-dPEG₄-NHS-эфира (61 мг, 0,16 15 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляют по капле соединение 2 (80,7 мг, 0,16 ммоль) и диизопропилэтиламин (55,5 мкл, 0,32 ммоль) в дихлорметане (1 мл). Полученную таким образом смесь перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют на роторном испарителе и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан, затем 5% метанол в дихлорметане и в завершение 100% метанол и получая указанное в заголовке соединение в виде бесцветного масла (87 мг, 97%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,08 (дд, 6H), 2,25 (м, 1H), 2,49 (т, 2H), 2,52 (т, 2H), 3,10-3,79 (м, 25H), 6,82 (с, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 559 (M+H⁺).

1.1e Синтез соединения 4: Fmoc-Cit-PABOH. К раствору Fmoc-Cit-OH (1,0 г, 2,52 ммоль) и 4-аминобензилового спирта (341 мг, 2,77 ммоль) в дихлорметане (10 мл) и метаноле (5 мл) добавляют 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин [EEDQ] (1,24 г, 5,04 ммоль) одной порцией. Смесь перемешивают в темноте в течение 16 ч. Растворители удаляют на роторном испарителе и твердое вещество белого цвета растирают в эфире (100 мл). Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин и затем оставляют стоять на 30 мин. Твердое вещество белого цвета собирают фильтрованием, промывают эфиром и сушат в вакууме (1,23 г, 97%). ¹H ЯМР (ДМСО) δ: (1,32-1,52 (м, 2H), 1,52-1,74 (дм, 2H), 2,86-3,06 (дм, 2H), 4,1 (м, 1H), 4,42 (д, 2H), 5,07 (т, 1H), 5,40 (ш.с, 2H), 5,97 (т, 1H), 7,19-7,95 (м, 12H), 8,10 (д, 1H), 9,97 (с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 503,1 (M+H⁺).

1.1f Синтез соединения 5: Fmoc-Cit-PABC-PNP. К раствору соединения 4 (309 мг, 0,62 ммоль) и пара-нитрофенилхлорформиата (372 мг, 1,85 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) и 1-метил-2-пирролидине (1 мл) добавляют пиридин (100 мкл, 1,23 ммоль) одной порцией. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворители удаляют на роторном испарителе и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан, затем 3% метанол в дихлорметане и при завершении 10% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (97,9 мг, 70%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 668 (M+H⁺).

1.1g Синтез соединения 6: Fmoc-Lys(Boc)-PABOH. Соединение 6 получают, как описано выше для соединения 4, с 98% выходом. ¹H ЯМР (ДМСО) δ: 1,40 (с, 9H), 1,38 (м, 2H), 1,50 - 1,74 (дм, 2H), 3,04 (т, 2H), 3,30 (кв, 3H), 4,19 - 4,31 (м, 2H), 4,41 (д, 2H), 4,55 (с, 2H), 7,28 - 7,68 (м, 12H), 8,00 (д, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 574 (M+H⁺).

1.1h Синтез соединения 7: Fmoc-Lys(Boc)-PABC-PNP. Соединение 7 получают, как описано выше для соединения 5, с 70% выходом. ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 1,44 (с, 9H), 1,49-1,60 (м, 20 6H), 1,73 (м, 1H), 2,00 (м, 1H), 3,11 (м, 1H), 3,20 (ш.с, 1H), 4,23 (м, 2H), 4,46 (ш.с, 2H), 4,67 (ш.с, 1H), 5,56 (ш.с, 1H), 7,28 (м, 2H), 7,36-7,41 (м, 6H), 7,59 (м, 4H), 7,76 (д, 2H), 8,26 (дд, 2H), 8,45 (ш.с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 639 (M+H⁺-Boc), 684 (M+H⁺-Bu), 739 (M+H⁺), 778.

1.1i Синтез соединения 8: Boc-Val-Cit-OH. К раствору цитруллина (2,54 г, 14,50 ммоль) и бикарбоната натрия (1,28 г) в воде (40 мл) добавляют Boc-Val-OSu (4,34 г, 13,81 ммоль), растворенный в диметоксиэтане (ДМЭ). Для увеличения растворимости смеси добавляют тетрагидрофуран (10 мл). Полученную таким образом смесь оставляют перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре. Добавляют водную лимонную кислоту (15%, 75 мл) и смесь экстрагируют смесью 10% 2-пропанол/этилацетат (2 x 100 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором соли (2 x 150 мл) и растворители удаляют на роторном испарителе. Полученное твердое вещество белого цвета сушат в вакууме в течение 5 ч и затем обрабатывают эфиром (100 мл). После короткой обработки ультразвуком и растирания собирают твердый продукт белого цвета фильтрованием (1,39 г, 27%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 0,91 (дд, 3H), 0,98 (дд, 3H), 1,44 (с, 9H), 1,70 (м, 2H), 1,87 (м, 2H), 2,02 (м, 2H), 3,11 (т, 2H), 3,89 (т, 1H), 4,39 5 (кв, 1H), 8,22 (д, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 375 (M+H⁺).

1.1j Синтез соединения 9: Boc-Val-Cit-PABOH. Соединение 9 получают, как описано выше для соединения 4, с 71% выходом. ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 0,93 и 0,97 (2д, 6H), 1,44 (с, 9H), 1,58 (м, 2H), 1,75 (м, 1H), 1,90 (м, 1H), 2,05 (м, 1H), 3,10 (м, 1H), 3,19 (м, 1H), 3,91 (д, 1H), 4,52 (м, 1H), 5,25 (с, 2H), 7,40 (д, 2H), 7,45 (дд, 2H), 7,64 (д, 4H), 8,29 (дд, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 480 (M+H⁺).

1.1k Синтез соединения 10: Boc-Val-Cit-PABC-PNP. Раствор Boc-Val-Cit-PABOH (178 мг, 0,370 ммоль) в ТГФ (8 мл) в CH₂Cl₂ (4 мл) перемешивают при комнатной температуре с PNP-хлорформиатом (160 мг, 0,80 ммоль) и пиридином (65 мкл, 0,80 ммоль) в течение 3 ч. Добавляют к реакционной смеси этилацетат (100 мл) и 10% водную лимонную кислоту (50 мл) и органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют, остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 5% метанол и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (165 мг, 70%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 0,93 (дд, 3H), 0,97 (дд, 3H), 1,44 (с, 9H), 1,58 (м, 2H), 1,75 (м, 1H), 1,89 (м, 1H), 2,05 (м, 1H), 3,10 (м, 1H), 3,20 (м, 1H), 3,90 (д, 1H), 4,51 (м, 1H), 4,55 (с, 2H), 7,29 (д, 2H), 7,55 (д, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 545 (M+H⁺-Boc), 645 (M+H⁺), 667 (M + Na⁺), 683 (M+K⁺).

1.1l Синтез соединения 12a. Через суспензию соединения 11 (20 мг, 0,078 ммоль) в этилацетате (5 мл) барботируют газообразный HCl в течение 20 мин (пока суспензия не станет прозрачным раствором). Реакционную смесь перемешивают еще 5 мин, затем смесь концентрируют досуха, получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества желтого цвета (26 мг, 100%), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 260 (M+H⁺-Cl), 295 (M+H⁺).

1.1m Синтез соединения 12b. Через суспензию соединения 11 (20 мг, 0,078 ммоль) в этилацетате (5 мл) барботируют газообразный HBr в течение 20 мин (пока суспензия не станет прозрачным раствором). Реакционную смесь перемешивают еще 5 мин , затем смесь концентрируют досуха, получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества желтого цвета (33 мг, 100%) которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 260 (M+H⁺-Br), 339 (M+H⁺), 341(M+H⁺+2).

1.1n Синтез соединения 13b. К раствору соединения 12a (26 мг, 0,078 ммоль) в ДМФА (2 мл) добавляют 5-(2-диметиламиноэтокси)бензофуран-2-карбоновую кислоту (44 мг, 0,155 ммоль) и EDC (30 мг, 0,155 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь концентрируют и остаток растворяют в смеси H₂O/CH₃CN/ТФА (4/1,5/0,5; 6 мл) и помещают в морозилку на 3 ч. Твердое вещество желтого цвета собирают фильтрованием (35 мг, 85%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 2,67 (с, 3H), 3,01 (с, 6H), 3,34 (м, 2H), 3,63 (нечеткий т, 1H), 3,89 (с, 3H), 3,91 (м, 1H), 4,41 (м, 3H), 4,54 (м, 1H), 4,65 (м, 1H), 7,20 (дд, 1H), 7,36 (д, 1H), 7,54 (с, 1H), 7,59 (д, 1H), 7,73 (ш.с, 1H), 11,75 (с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490 (M+H⁺-Cl), 526 (M+H⁺).

1.1о Синтез соединения 13c. К раствору соединения 12b (19 мг, 0,0387) в ДМФА (2 мл) добавляют соль 5-(2-диметиламиноэтокси)бензофуран-2-карбоновой кислоты, HBr (25 мг, 0,0775 ммоль) и PS-карбодиимид (82 мг, ммоль/г: 0,94, 0,0775 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. После фильтрования фильтрат концентрируют и остаток растворяют в смеси H₂O/CH₃CN/ТФА (2/0,75/0,25; 3 мл) и помещают в морозилку на 3 ч. Твердое вещество желтого цвета собирают фильтрованием и сушат, получая указанное в заголовке соединение (18 мг, 82%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490 (M+H⁺-Br), 570 (M+H⁺), 572 (M+H⁺+2).

1.1p Синтез соединения 14a. К суспензии соединения 13a (48 мг, 0,10 ммоль) в дихлорметане (4 мл) добавляют пара-нитрофенил хлорформиат (80 мг, 0,40 ммоль) и триэтиламин (56 мкл, 0,40 ммоль) при -78°C. Смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивание продолжают еще 30 мин К реакционной смеси добавляют соединение N-Boc-N,N'-диметилэтилендиамин (166 мг, 0,80 ммоль) и перемешивают в течение ночи. Смесь концентрируют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1,25% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (71 мг, 100%) ¹H ЯМР δ: 1,45-1,47 (м, 9H), 2,69 (с, 3H), 2,97 (с, 3H), 3,14-3,34 (м, 4H), 3,81-3,92 (м, 8H), 4,38-4,47 (м, 3H), 4,70 (д, 1H), 7,05 (дд, 1H), 7,11 (д, 1H), 7,45 (с, 1H), 7,48 (д, 1H), 7,99 (с, 1H), 10. 43 (с, 1H) м.д. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 710 (M-H⁺).

1.1q Синтез соединения 14b. К суспензии соединения 13b (48 мг, 0,075 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляют 4-нитрофенил хлорформиат (80 мг, 0,4 ммоль) и триэтиламин (40 мг, 0,4 ммоль, 56 мкл) при 0°C. Смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивание продолжают еще 6 ч. Растворитель выпаривают и остаток промывают эфиром, получая промежуточный продукт. Данный промежуточный продукт растворяют в дихлорметане (2 мл) и к реакционному раствору добавляют N-Boc-N,N'-диметилэтилендиамин (44 мг, 0,2 ммоль) и триэтиламин (20 мг, 0,2 ммоль, 28 мкл). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрируют и остаток очищают методом ВЭЖХ на колонке C-18, используя в качестве элюента аммонийформиат (20 мМ, pH 7,0) и ацетонитрил и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (31 мг, 54%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 755 (M+H⁺).

1.1r Синтез соединения 14c. К суспензии соединения 13c (24 мг, 0,04 ммоль) в CH₂Cl₂ (2 мл) добавляют пара-нитрофенилхлорформиат (64 мг, 0,32 ммоль) и триэтиламин (22 мкл, 0,16 ммоль) при 0°C. Полученную таким образом реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч. К реакционной смеси добавляют N-Boc-N,N'-диметилэтилендиамин (94 мг, 0,50 ммоль) и перемешивание продолжают еще 50 мин Реакционную смесь концентрируют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 5% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (28 мг, 83%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 570, 684 (M+H⁺-Boc), 784 (M+H⁺), 805 (M+Na⁺), 722 (M+K⁺).

1.1s Синтез соединения 15a. Соединение 14a (70 мг, 0,10 ммоль) растворяют в трифторуксусной кислоте (5 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и концентрируют досуха, продукт (72 мг, 100%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки. ВЭЖХ показывает, что он имеет чистоту >95%. ¹H ЯМР δ: 2,64 (с, 3H), 2,93 (с, 3H), 3,19 (с, 3H), 3,30 (т, 1H), 3,79 (с, 3H), 3,85 (с, 3H), 3,81-3,85 (м, 1H), 4,27-4,49 (м, 3H), 4,59 (д, 1H), 4,68 (д, 1H), 6,97 (дд, 1H), 7,03 (д, 1H), 7,38 (с, 1H), 7,41 (д, 1H), 8,00 (ш.с, 1H), 10,61 (ш.с, 1H) м.д. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 612 (M+H⁺), 634 (M+Na⁺).

1.1t Синтез соединения 15b. Соединение 15b получают, как описано выше для соединения 15a, со 100% выходом. ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 2,69 (с, 3H), 2,76 (с, 3H), 2,83 (ш.с, 1H), 3,01 (с, 6H), 3,08 (ш.с, 1H), 3,24 (ш.с, 2H), 3,42 (м, 2H), 3,63 (ш.с, 3H), 3,74 (ш.с, 1H), 3,91 (с, 3H), 3,92 (м, 1H), 4,40 (ш.с, 2H), 4,57 (ш.с, 2H), 4,71 (ш.с, 1H), 7,22 (ш.д, 1H), 7,36 (с, 1H), 7,56 (с, 1H), 7,59 (д, 1H), 8,04 (ш.с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 526, 640 (M+H⁺), 678 (M+K⁺).

1.1u Синтез соединения 15c. Соединение 15c получают, как описано выше для соединения 15a, со 100% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 570, 684 (M+H⁺), 722 (M+K⁺).

1.1v Синтез соединения 16a. К раствору соединения 5 (12,5 мг, 0,019 ммоль) и соединения 15a (10 мг, 0,014) в диметилформамиде (200 мкл) добавляют триэтиламин (6 мкл, 0,044 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Добавляют к смеси эфир (5 мл), и из раствора выпадает осадок твердого вещества белого цвета. Твердые вещества отфильтровывают и очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан, затем 1% метанол в дихлорметане, 2% метанол в дихлорметане, 3% метанол в дихлорметане и в завершение 4% метанол в дихлорметане и получая указанное соединение в виде твердого вещества белого цвета (8,7 мг, 56%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 470, 1112 (M+H⁺), 1134 (M+Na⁺), 1150 (M+K⁺).

1.1w Синтез соединения 16b. К раствору соединения 15b (5 мг, 0,0056 ммоль) в ДМФА (0,35 мл) добавляют соединение 5 (3,8 мг, 0,0056 ммоль) и DIEA (2 мкл, 0,011 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Смесь концентрируют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 10% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества (3 мг, 45%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 526, 1169 (M+H⁺), 1208 (M+K⁺).

1.1x Синтез соединения 16c. Соединение 16c получают, как описано выше для соединения 16b, с 50% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 570, 1212 (M+H⁺), 1250 (M+K⁺).

1.1y Синтез соединения 17a. К раствору соединения 16a (8,7 мг, 0,008 ммоль) в диметилформамиде (500 мкл) добавляют пиперидин (100 мкл) одной порцией. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Растворитель удаляют на роторном испарителе и помещают смесь в высокий вакуум на 1,5 ч. Остаток извлекают минимальным количеством дихлорметана (100 мкл) и добавляют к раствору гексан (3 мл), из раствора выпадает твердое вещество белого цвета, которое отфильтровывают и сушат (6,7 мг, 96,7%). МС (электрораспыление) 470, 890,1 (M+H⁺), 912 (M+Na⁺), 928 (M+K⁺).

1.1z Синтез соединения 17b. Соединение 17b получают, как описано выше для соединения 17a, с 95% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 947 (M+H⁺).

1.1aa Синтез соединения 17c. Соединение 17c получают, как описано выше для соединения 17a, с 95% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 1015 (M+Н⁺).

l.1bb Синтез соединения 18a. К раствору соединения 17a (4,2 мг, 0,005 ммоль) и соединения 3 (2,64 мг, 0,005 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют одной порцией PyBOP (3,7 мг, 0,007 ммоль), а затем диизопропилэтиламин (1 мкл). Полученную таким образом смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворители удаляют на роторном испарителе. Остаток очищают методом препаративной ВЭЖХ, получая бежевое твердое вещество (2,6 мг, 38,7%). МС (электрораспыление) 470, 1431 (M+H⁺), 1453 (M+Na⁺), 1469 (M+K⁺).

1.1cc Синтез соединения 18b. К раствору соединения 17b (2,2 мг, 0,0025 ммоль) и соединения 3 в 5% метаноле в дихлорметане (400 мл) добавляют HBTU (9 мг, 0,0046 ммоль) и DIEA (1,4 мкл, 0,0046 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 10 мМ аммонийформиат и ацетонитрил и получая указанное соединение в виде масла (1,1 мг, 30%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 490, 526, 1488 (M+H⁺), 1527 (M+K⁺).

1.1dd Синтез соединения 18c. К раствору соединения 17c (6,5 мг, 0,0065 ммоль) и соединения 3 (5,5 мг, 0,0097 ммоль) в 5% метаноле в дихлорметане (0,5 мл) добавляют HBTU (3,7 мг, 0,0097 ммоль) и DIEA (3,4 мкл, 0,0194 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и очищают остаток методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 30% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла (4 мг, 30%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 1532 (M+H⁺), 1554 (M+Na⁺), 1570 (M+K⁺).

1.2 Методология синтеза дуокармицин-содержащего пептидного линкера без саморазрушающегося спейсера

1.2a Реакция A: Через суспензию алкилирующего ядра (7 мг) в 2 мл этилацетата пропускают медленный поток сухого газообразного HBr до получения прозрачного раствора, что занимает примерно 15 мин Реакционную смесь концентрируют и сушат в течение ночи в высоком вакууме.

1.2b Реакция B: К суспензии бромметилсеко-соединения, полученного на стадии A, в ДМФА добавляют EDC (10 мг, 0,054 ммоль) и 5-нитробензофуранкарбоновую кислоту (12 мг, 0,054 ммоль) и оставляют перемешиваться в течение 6 ч. Затем к данной реакционной смеси добавляют этилацетат и насыщенный раствор соли. Объединенные органические слои концентрируют после трех экстракций этилацетатом и фильтруют через силикагель, используя смесь MeOH/ДХМ при увеличении количества MeOH. Продукт подтверждают методом масс-спектрометрии, M+1 = 530.

1.2c Реакция C: Вводят защиту на 4'-OH, используя метилпипиразинкарбонилхлорид (11 мг, 0,054 ммоль) в 2 мл ДХМ, 200 мкл аллилового спирта и пиридин (21 мкл) в течение 2 ч. Продукт очищают методом колоночной хроматографии на силикагеле и идентифицируют методом масс-спектрометрии, MS⁺¹ = 654.

1.2d Реакция D: Восстановление нитрогруппы выполняют посредством гидрирования над Pd/C в смеси ДХМ/MeOH (2:1) при давлении 40 фунт на кв. дюйм в течение 45 мин Продукт фильтруют и фильтрат концентрируют и сушат в высоком вакууме. Продукт подтверждают методом масс-спектрального анализа МС⁺¹ и переносят на следующую стадию без дополнительной очистки.

1.2e Реакция E: К раствору описанного выше соединения (18 мг, 0,024 ммоль) в смеси MeOH/ДХМ (2:1, 3 мл) добавляют Fmoc-Val-цитрулин (29 мг, 0,06 ммоль), полученную смесь перемешивают в течение 10 мин до растворения всей кислоты. Добавляют 15 мг 0,06 моль EEDQ и перемешивают реакционную смесь в темноте в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрируют, ополаскивают диэтиловым эфиром и остаток очищают препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, получая продукт, который идентифицируют методом масс-спектрометрии M⁺¹=1103.

1.2f Реакция F: Удаление защитной группы Fmoc выполняют, используя 5% пипиридин в 1 мл ДМФА в течение 10 мин После концентрирования реакционной смеси твердый остаток ополаскивают диэтиловым эфиром. Продукт подтверждают методом масс-спектрального анализа, МС⁺¹=880 и M+K = 919.

1.2g Реакция G: К раствору свободного амина в ДМФА (1,5 мл), полученного на стадии F, добавляют Mal-(PEG)₄-NHS-эфир (20 мг) и реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч. Концентрирование с последующей очисткой методом препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой дает 2,8 мг соединения (общий выход 11%, исходя из алкилирующего ядра), которое подтверждают методом масс-спектрального анализа, МС⁺¹=2178, M+Na=1300 и M+K=1316.

1.3 Синтез пептидного линкера, конъюгированного с тубулизином A

Лиганд можно связать с PEG и пептидным линкером посредством показанного синтеза.

Синтез промежуточных продуктов и конъюгата лиганд-лекарство, имеющего пептидный линкер, где лекарство представляет собой тубулизин A, показан здесь выше. Этот основной способ можно использовать с другим лекарством.

1.4a Синтез конъюгата пептид-линкер 111

1.4b Синтез конъюгата пептид-линкер 112

1.4c Синтез конъюгата пептид-линкер 113

ПРИМЕР 2: Синтез 6-членных конъюгатов с гидразиновым линкером

2.1 Синтез 6-членного гем-диметильного гидразинового линкера, конъюгированного с дуокармициновым производным цитотоксином

2.1a Схема синтеза соединения 109

2.1b Синтез соединения 110

К суспензии Cbz-диметилаланина (1 г, 3,98 ммоль) в 30 мл ДХМ при температуре бани со льдом добавляют HOAT (каталитический, 0,25 экв.), DIPEA (2,8 мл, 16 ммоль), а затем 2-хлор-1,3-диметилимидазолидиний гексафторфосфат (CIP) (1,2 г, 4,4 ммоль). Затем к данной реакционной смеси добавляют Boc-NN(Me) (643 моль, 4,4 ммоль). Реакционную смесь оставляют перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляют 10% раствор лимонной кислоты (100 мл) и экстрагируют ДХМ. Органическую фазу промывают водой и затем насыщенным раствором бикарбоната натрия, а затем снова водой. Затем органическую фазу концентрируют и очищают на колонке с силикагелем с повышением полярности этилацетата в гексане, получая 860 мг, 57% выход соединения 107, которое идентифицируют методом масс-спектрометрии, M⁺¹=380 и M+NH₄ ⁺=397.

Защитную группу Cbz удаляют каталитическим гидрированием, используя Pd/C в MeOH и получая соединение 108, которое подтверждают методом МС.

К раствору PNPC-1918 (10 мг, 0,1 ммоль) в 2 мл ДХМ добавляют по капле раствор соединения 108 (60 мг, 0,25 ммоль) в 8 мл ДХМ и оставляют реакционную смесь перемешиваться в течение 2 дней до полного исчезновения исходного вещества. Реакционную смесь фильтруют через небольшую набивку из силикагеля и затем концентрируют и очищают методом препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, получая 4,2 мг соединения 109. Продукт идентифицируют методом масс-спектрометрии, M⁺¹=740. Удаление Boc-защиты с соединения 109 выполняют при помощи чистого ТФА в течение 20 мин, получая соединение 110. Продукт идентифицируют методом масс-спектрометрии, M⁺¹=640.

111

2.1c Синтез соединения 111

Mal-PEG₄-ацетофенон и соединение 110 (3 мг, 0,005 ммоль) объединяют, концентрируют и сушат в течение ночи в высоком вакууме. К данной смеси добавляют 1 мл 5% раствора уксусной кислоты, приготовленного за день до этого, и сушат над молекулярными ситами. Образование гидразона завершается менее чем за ч. После чего реакционную смесь концентрируют и очищают методом препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (аммонийформиат pH = 7), получая 2,8 мг соединения 111 (60% выход). Продукт идентифицируют методом масс-спектрометрии, M⁺¹ = 1129, M+NH₄ = 1146 и M+K = 1168.

2.2 Синтез гем-диметильного 6-членного гидразинового линкера, конъюгированного с тубулизиновым цитотоксином

Методологию, аналогичную показанной в примере 2.1, можно применить к синтезу геминально-диметильного 6-членного гидразинового линкера, образующего комплекс с лекарством, таким как тубулизин A.

2.3 Синтез гидразинового линкера, конъюгированного с аналогом дуокармицина

К раствору бромметилсеко-соединения (0,074 ммоль) в 3 мл ДМФА добавляют 5-актилиндол-2-карбоксилат (30 мг, 0,15 ммоль) и EDC (28 мг, 0,15 ммоль) и полученную смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют и очищают хроматографически на силикагеле, используя 5% MeOH в ДХМ и получая 29 мг (74% выход) продукта, который подтверждают методом масс-спектрометрии, M⁺¹=523.

К раствору соединения, синтезированного на стадии C, в 5 мл ДХМ и 300 мкл аллилового спирта добавляют метилпиперазинкарбонилхлорид (22 мг, 0,11 ммоль) и пиридин (44 мкл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Концентрирование с последующей очисткой методом хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси 5% MeOH/ДХМ дает 48 мг требуемого продукта (73% выход). Продукт подтверждают методом масс-спектрометрии, M⁺¹ = 650.

Раствор описанного выше соединения (8,2 мг, 0,012 ммоль) и Mal-PEG₄-гидразина в 5% уксусной кислоте в безводном ДХМ перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем выпаривают растворитель и проводят препаративную ВЭЖХ с обращенной фазой, используя ацетонитрил и водную фазу с аммонийформиатным буфером, получая 2,5 мг требуемого конечного продукта, который подтверждают методом масс-спектрометрии, M⁺¹ = 1063.

2.4a Скорость циклизации диметильного 6-членного гидразинового линкера

Дуокармициновый аналог, конъюгированный с диметильным 6-членным гидразиновым линкером, инкубируют в буфере при pH 7,4 в течение 24 ч и исследуют во времени образование циклизованного продукта, получающегося в результате циклизации гидразинового линкера, высвобождающей при этом дуокармициновый аналог.

Минимальные количества циклизованного продукта детектируют через 24 ч при pH=7,4, это показывает, что данный вид 6-членного гидразинового линкера демонстрирует относительно низкую скорость циклизации.

2.4b Скорость циклизации гем-диметильного 6-членного гидразинового линкера

Дуокармициновый аналог, конъюгированный с гем-диметильным 6-членным гидразиновым линкером, инкубируют в буфере при pH 7,4 и исследуют во времени образование циклизованного продукта, получающегося в результате циклизации гидразинового линкера, высвобождающей при этом дуокармициновый аналог.

При наличии 6-членного гем-диметильного линкера реакция циклизации является довольно быстрой, протекая до завершения за несколько минут. Таким образом, скорость циклизации для гем-диметильного 6-членного гидразинового линкера значительно больше, чем скорость для 6-членного линкера, не содержащего гем-диметильного фрагмента.

ПРИМЕР 3: Синтез конъюгатов с 5-членным гидразиновым линкером

3.1 Методология синтеза соединения 4

Cbz-DMDA-2,2-диметилмалоновая кислота (1)

К раствору 2,2-диметилмалоновой кислоты (2,0 мг, 0,0151 моль) добавляют тионилхлорид (1,35 мл, 0,0182 моль) в ТГФ (15 мл) в колбе на 25 мл, оснащенной мешалкой, датчиком температуры и обратным холодильником, добавляют каплю ДМФА и нагревают реакционную смесь при кипении с обратным холодильником в течение 2 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Данную реакционную смесь переносят по капле к раствору Cbz-DMDA (4 мг, 0,0182 моль) и триэтиламина (4 мл, 0,0287 моль) в ТГФ (5 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 30 мин при данной температуре. Растворитель удаляют в вакууме и остаток растворяют в 1 н. HCl (50 мл) и экстрагируют ДХМ (2 x 25 мл). Объединенные органические слои экстрагируют 1 н. NaOH (2 x 25 мл) и объединенный водный слой подкисляют (pH<1) концентрированной HCl и экстрагируют EtOAc (2 x 25 мл), сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют в вакууме до липкого твердого вещества грязно-белого цвета, 3,44 мг, 68% выход. Соединение 1 подтверждают методом МС: m/z 337,0 [M+1]⁺.

ВЭЖХ время удерживания: 3,77 мин (масс-спектрометрия).

Cbz-DMDA-2,2-диметилмалоновый-Boc-N'-метилгидразин (2)

К раствору соединения 1 (3,0 мг, 0,0089 моль) и тионилхлорида (0,78 мл, 0,0107 моль) в ТГФ (25 мл) в трехгорлой RBF на 50 мл, снабженной мешалкой, датчиком температуры и обратным холодильником, добавляют каплю ДМФА и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют данную реакционную смесь по капле к раствору Boc-N-метилгидразина (1,33 мг, 0,091 моль) и триэтиламина (3 мл, 0,0215 моль) в ТГФ (25 мл) при 0^oC и перемешивают в течение 30 мин Растворитель удаляют в вакууме и остаток растворяют в EtOAc(50 мл), сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют в вакууме до масла коричневого цвета. Данное масло растворяют в EtOAc и очищают методом колоночной хроматографии (100% EtOAc), получая 3,45 мг, 83% выход прозрачного масла. Соединение 2 подтверждают методом МС: m/z 465,2 [M⁺¹].

ВЭЖХ время удерживания: 3,97 мин (масс-спектроскопия).

DMDA-2,2-диметилмалоновый-Boc-N'-метилгидразин (3)

К раствору соединения 2 (0,5 мг, 0,0011 моль) в MeOH (30 мл) добавляют 10% Pd/C (15 мг) и реакционную смесь оставляют для гидрирования в аппарате Пара на 30 мин Катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме до прозрачного масла, получая соединение 3 (0,38 мг). Продукт подтверждают методом ЯМР (¹H, CDCl₃) δ: 1,45 (с, 15H) 2,45 (с, 3H) 2,85 (с, 6H), 3,16 (с, 3H) 4,64 (м, 1H) 10,6 (ш.с, 1H); ЯМР (¹³C, CDCl₃) δ: 24,1, 28,57, 35,15, 35,58, 36,66, 47,01, 48,51, 81,11, 155,17, 173,56, 176,24.

Синтез соединения 4

В RBF на 15 мл, оснащенной мешалкой, объединяют соединение 3 (50 мг, 0,1513 ммоль), PNPC-1918 (20 мг, 0,0315 ммоль) и ДХМ (5 мл). Раствор перемешивают в течение 30 мин, затем добавляют триэтиламин (25 мкл, 0,1794 ммоль) и перемешивают раствор светло-желтого цвета в течение 1 ч. Данный раствор концентрируют в вакууме до масла желтого цвета и очищают методом колоночной хроматографии (от 100% ДХМ до смеси 1:1 EtOAc/ДХМ), получая соединение 4 в виде твердого вещества грязно-белого цвета (22 мг, 84% выход). Продукт подтверждают методом масс-спектрометрии: m/z 825,7 [M+1]⁺.

ВЭЖХ время удерживания: 7,65 мин (масс-спектрометрия)

3.2 Синтез конъюгата антитело-лекарство, имеющего 5-членный гидразиновый линкер

Данная схема демонстрирует конъюгацию антитела с комплексом линкер-лекарство. Такие методологии хорошо известны в фармацевтической области. Примеры других реакционноспособных сайтов включают малеимиды, галогенацетамиды, которые взаимодействуют с тиолами на лиганде, тиолы, которые взаимодействуют с дисульфидами на лиганде, гидразиды, которые взаимодействуют с альдегидами и кетонами на лиганде, и гидроксисукцинимиды, изоцианаты, изотиоцианаты и ангидриды, которые взаимодействуют с амино-группой на лиганде.

ПРИМЕР 4: Синтез конъюгатов с дисульфидными линкерами

4.1a Синтез соединения 1. В колбу, содержащую PEG₄ (3,88 г, 20 ммоль), добавляют тритон B (40% раствор в метаноле, 1,08 мл, 0,25 ммоль) и через 15 мин трет-бутилакрилат (3,62 мл, 24 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрируют в вакууме и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде бесцветного масла (2,35 г, 36%). ¹H ЯМР δ: 1,45 (с, 9H), 2,5 (т, 2H), 3,65 (м, 18H).

4.1b Синтез соединения 2. К раствору соединения 1 (1,17 г, 3,6 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляют триэтиламин (532 мкл, 4 ммоль) и метансульфонилхлорид (309 мкл, 4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (1,3 г, 89%). ¹H ЯМР δ: 1,43 (с, 9H), 2,48 (т, 2H), 3,07 (с, 3H), 3,62-3,70 (м, 14H), 3,76 (м, 2H), 4,37 (м, 2H).

4.1c Синтез соединения 3. К раствору соединения 2 (1,3 г, 3,25 ммоль) в этаноле (10 мл) добавляют азид натрия (423 мг, 6,5 ммоль). Полученную таким образом смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (1,01 г, 90%). ¹H ЯМР δ: 1,45 (с, 9H), 2,50 (т, 2H), 3,40 (т, 2H), 3,62-3,73 (м, 16H).

4.1d Синтез соединения 4. К раствору соединения 3 (470 мг, 1,35 ммоль) в эфире (5 мл), содержащем H₂O (25 мкл), добавляют трифенилфосфин (391 мг, 1,48 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (325 мг, 75%). ¹H ЯМР δ: 1,45 (с, 9H), 2,24 (ш.с, 2H), 2,51 (т, 2H), 2,91 (т, 2H), 3,56 (м, 2H), 3,63-3,66 (м, 12H), 3,72 (м, 30 2H).

4.1e Синтез соединения 5. К раствору 3-меркаптопропионовой кислоты (1,22 г, 11,5 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляют альдритиол-2 (3,78 г, 17,25 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 30% этилацетат в гексане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла (2,44 г, 98%). ¹H ЯМР δ: 2,8 (т, 2H), 3,05 (т, 2H), 7,14 (м, 1H), 7,67 (м, 2H), 8,48 (м, 1H).

Соединение 5b: ¹H ЯМР δ: 1,43 (д, 3H), 2,61 (м, 1H), 2,76 (м, 1H), 3,40 (м, 1H), 7,17 (м, 1H), 7,66 (м, 2H), 8,45 (м, 1H).

4.1f Синтез соединения 6. 3-Метилбензотиазолий йодид (1 г, 3,6 ммоль) растворяют в 2 н. водном растворе гидроксида натрия (10 мл) и смесь перемешивают в течение 6 ч при 100°C, затем подкисляют 6 н. водным раствором соляной кислоты до pH 4 и экстрагируют диэтиловым эфиром. Органический слой сушат над Na₂SO₄, выпаривают на роторном испарителе в вакууме, остаток растворяют в метаноле (10 мл) и добавляют соединение 5a (776 мг, 3,6 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь концентрируют досуха и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (482 мг, 55%). ¹H ЯМР δ: 2,85 (м, 2H), 2,95 (м, 5H), 6,64 (м, 2H), 7,3 (м, 1H), 7,4 (дд, 1H); МС (электрораспыление) 244 (M+H⁺), 487 (2M+H⁺).

Соединение 6b: ¹H ЯМР δ: 1,35 (д, 3H), 2,48 (м, 1H), 2,92 (с, 3H), 3,02 (м, 1H), 3,34 (м, 1H), 6,62 (м, 2H), 7,28 (м, 1H), 7,44 (м, 1H) ; МС (электрораспыление) 258 (M+H⁺).

Соединение 6c: ¹H ЯМР δ: 1,45 (с, 6H), 2,70 (с, 2H), 2,93 (с, 3H), 6,62 (м, 2H), 7,24 (м, 1H), 7,51 (м, 1H); МС (электрораспыление) 272 (M+H⁺), 294 (M+Na⁺), 310 (M+K⁺).

4.1g Синтез соединения 7. К раствору соединения 6a (28 мг, 0,115 ммоль) в безводном метаноле (1 мл) добавляют ацетилхлорид (13 мкл, 0,173 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 10% этилацетат в гексане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла (24 мг, 83%). ¹H ЯМР δ: 2,08 (м, 2H), 2,93 (с, 3H), 2,95 (м, 2H), 3,70 (с, 3H), 6,63 (м, 2H), 7,28 (м, 2H), 7,40 (м, 2H) ; МС (электрораспыление) 258 (M+H⁺), 280 (M+Na⁺), 296 (M+K⁺).

Соединение 7b: ¹H ЯМР δ: 1,32 (д, 3H), 2,45 (м, 1H), 2,92 (с, 3H), 2,93 (м, 1H), 3,35 (м, 1H), 3,67 (с, 3H), 6,62 (м, 2H), 7,26 (м, 1H), 7,44 (м, 1H) ; МС (электрораспыление) 272 (M+H⁺).

Соединение 7c: ¹H ЯМР δ: 1,42 (с, 6H), 2,66 (с, 2H), 2,93 (с, 3H), 3,62 (с, 3H), 6,62 (м, 2H), 7,24 (м, 1H), 7,51 (м, 1H); МС (электрораспыление) 286 (M+H⁺), 308 (M+Na⁺), 324 (M+K⁺).

4.1h Синтез соединения 8. К раствору соединения 7a (24 мг, 0,093 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют трифосген (28 мг, 0,093 ммоль) и триэтиламин (37 мкл, 0,28 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивают в течение 1 ч. Смесь концентрируют досуха и остаток используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Сырой материал растворяют в дихлорметане (1 мл) и добавляют соединение 8a (35 мг, 0,074 ммоль) и DMAP (23 мг, 0,190 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (53 мг, 76%). ¹H ЯМР δ: 2,70 (с, 3H), 2,74 (м, 2H), 3,06 (м, 2H), 3,34 (м, 1H), 3,35 и 3,36 (2с, 3H), 3,63 и 3,64 (2с, 3H), 3,86 (м, 1H), 3,88 (с, 3H), 3,93 и 3,94 (2с, 3H), 4,48 (м, 1H), 4,55 (м, 1H), 4,79 (м, 1H), 7,05 (м, 1H), 7,11 (м, 1H), 7,26-7,52 (м, 5H), 7,85 (д, 1H), 8,1 (ш.с, 1H), 8,98 и 9,08 (2с, 1H) ; МС (электрораспыление) 753 (M+H⁺).

Соединение 8b: ¹H ЯМР δ: 1,38 (м, 3H), 2,52 (м, 1H), 2,69 (м, 3H), 2,79 (м, 1H), 3,33 (м, 1H), 3,37 (2с, 3H), 3,64 (м, 3H), 3,88 (с, 3H), 3,84-3,90 (м, 1H), 3,93 (2с, 3H), 4,48 (м, 1H), 4,57 (м, 1H), 4,78 (м, 1H), 7,06 (м, 1H), 7,12 (м, 1H), 7,26-7,43 (м, 3H), 7,50 (м, 2H), 7,86 (м, 1H), 8,1 (ш.с, 1H), 8,99, 9,08, 9,13 и 9,22 (4с, 1H) ; МС (электрораспыление) 767 (M+H⁺).

Соединение 8c: ¹H ЯМР δ: 1,44 (м, 6H), 2,63 (д, 2H), 2,70 (с, 3H), 3,35 (м, 1H), 3,38 и 3,39 (2с, 3H), 3,63 и 3,64 (2с, 3H), 3,87 (м, 1H), 3,88 (с, 3H), 3,93 и 3,94 (2с, 3H), 4,48 (м, 1H), 4,55 (м, 1H), 4,79 (м, 1H), 7,05 (м, 1H), 7,12 (м, 1H), 7,31-7,39 (м, 3H), 7,49 (м, 2H), 7,89 (д, 1H), 8,1 (ш.с, 1H), 9,12 и 9,23 (2с, 1H) ; МС (электрораспыление) 781 (M+H⁺).

4.1i Синтез соединений 9 и 10. К раствору соединения 8a (0,1 мг) в смеси PBS-буферный раствор (pH 7,2)/метанол (300 мкл, 2:1) добавляют 20 мМ раствор DTT (100 мкл, 15 экв.) и контролируют протекание реакции методом ВЭЖХ. Взаимодействие протекает слишком быстро для детектирования, через несколько секунд реакция уже завершается, количественно давая продукт - соединение 10. Промежуточный продукт реакции соединение 9 не детектируют.

4.1j Синтез соединения 11. К раствору соединения 6a (66 мг, 0,2 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют DCC (47 мг, 0,22 ммоль), HOBt (31 мг, 0,22 ммоль) и соединение 4 (50 мг, 0,2 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (70 мг, 62%). ¹H ЯМР δ: 1,44 (с, 9H), 2,51 (т, 1H), 2,63 (т, 2H), 2,93 (д, 3H), 3,01 (т, 2H), 3,45 (м, 2H), 3,55 (м, 2H), 3,64 (м, 12H), 3,71 (т, 2H), 5,01 (ш.с, 1H), 6,38 (ш.т, 1H), 6,62 (м, 2H), 7,27 (м, 1H), 7,43 (дд, 1H). МС (электрораспыление) 491 (M-56+H⁺), 513 (M-56+Na⁺), 547 (M+H⁺), 569 (M+Na⁺).

Соединение 11b: ¹H ЯМР δ: 1,34 (д, 3H), 1,45 (с, 9H), 2,30 (м, 1H), 2,5 (т, 2H), 2,69 (м, 1H), 2,93 (д, 3H), 3,37-3,55 (м, 5H), 3,63 (м, 12H), 3,71 (т, 2H), 4,99 (ш.с, 1H), 6,13 (ш.т, 1H), 6,62 (м, 2H), 7,25 (м, 1H), 7,48 (дд, 1H). МС (электрораспыление) 505 (M-56+H⁺), 527 (M-56+Na⁺), 543 (M-56+K⁺), 561 (M+H⁺), 583 (M+Na⁺).

Соединение 11с: 1,43 (с, 3H), 1,45 (с, 9H), 2,46 (с, 2H), 2,5 (т, 2H), 2,92 и 2,94 (2с, 3H), 3,33 (м, 2H), 3,47 (т, 2H), 3,63 (м, 12H), 3,70 (т, 2H), 6,06 (ш.т, 1H), 6,63 (м, 2H), 7,25 (м, 1H), 7,54 (д, 1H) ; МС (электрораспыление) 519 (M-56+H⁺), 541 (M-56+Na⁺), 575 (M+H⁺), 597 (M+Na⁺).

4.1k Синтез соединения 12: К суспензии соединения 11a (20 мг, 0,037 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют триэтиламин (15 мкл, 0,11 ммоль) и 2 н. раствор фосгена в толуоле (55 мкл, 0,11 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь концентрируют, остаток растворяют в дихлорметане (1 мл) и добавляют соединение 10 (14 мг, 0,030 ммоль) и DMAP (9 мг, 0,076 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 1% метанол в дихлорметане и получая указанное в заголовке соединение в виде масла желтого цвета (23 мг, 74%).¹H ЯМР δ: 1,44 (с, 9H), 2,49 (т, 2H), 2,67 (м, 2H), 2,65 и 2,67 (2с, 3H), 3,07 (м, 2H), 3,33 (с, 3H), 3,40 (м, 3H), 3,51 (м, 2H), 3,60 (м, 12H), 3,69 (м, 2H), 3,87 (с, 3H), 3,92 (с, 3H), 3,93 5 (м, 1H), 4,52 (м, 2H), 4,78 (м, 1H), 6,65, 6,74 и 6,97 (3 широких т, 1H), 7,06 (д, 1H), 7,12 (с, 1H), 7,29-7,42 (м, 3H), 7,50 (м, 2H), 7,87 (д, 1H), 8,10 и 8,15 (2ш.с, 1H), 9,79 и 9,58 (2с, 1H) ; МС (электрораспыление) 986 (M+H⁺-56), 1042 (M+H⁺).

Соединение 12b: ¹H ЯМР δ: 1,32 (м, 3H), 1,44 (с, 9H), 2,39 (м, 1H), 2,48 (м, 2H), 2,60 (м, 1H), 2,67 и 2,69 (2с, 3H), 3,32 и 3,35 (2с, 3H), 3,38-3,72 (м, 20H), 3,88 (с, 10 3H), 3,93 (с, 3H), 3,94 (м, 1H), 4,52 (м, 2H), 4,77 (м, 1H), 6,53, 6,67 и 6,72 (3ш.т, 1H), 7,06 (д, 1H), 7,12 (с, 1H), 7,29-7,39 (м, 3H), 7,49 (м, 2H), 7,88 (д, 1H), 8,12 и 8,25 (2ш.с, 1H), 9,13, 9,36, 10,08 и 10,21 (4с, 1H) ; МС (электрораспыление) 1000 (M+H⁺-56), 1056 (M+H⁺), 1078 (M+Na⁺), 1084 (M+K⁺).

Соединение 12c: ¹H ЯМР δ: 1,30-1,42 (м, 3H), 1,44 (с, 9H), 2,45-2,52 (м, 4H), 2,69 и 2,72 (2с, 3H), 3,34 и 3,35 (2с, 3H), 3,39-3,72 (м, 19H), 3,88 (с, 3H), 3,925 и 3,93 (2с, 3H), 3,94 (м, 1H), 4,53 (м, 2H), 4,80 (м, 1H), 6,63 (м, 1H), 7,06 (дд, 1H), 7,13 (д, 1H), 7,25-7,39 (м, 3H), 7,50 (м, 2H), 7,89 (д, 1H), 8,10 и 8,27 (2ш.с, 1H), 9,99 и 10,191 (2с, 1H); МС (электрораспыление) 1014 (M+H⁺-56), 1070 (M+H⁺), 1108 (M+K⁺).

4.1l Синтез соединения 13. Соединение 12a (23 мг, 0,022 ммоль) растворяют в растворе трифторуксусной кислоты и дихлорметана (1 мл, 1/1) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и концентрируют, получая продукт (21 мг, 100%). ¹H ЯМР δ: 2,60 (т, 2H), 2,67 и 2,68 (2с, 3H), 2,75 (м, 2H), 3,07 (м, 2H), 3,34 (с, 3H), 3,38-3,64 (м, 21H), 3,76 (т, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,92 (с, 3H), 3,93 (м, 1H), 4,53 (м, 2H), 4,78 (м, 1H), 7,06 (д, 1H), 7,13 (с, 1H), 7,31-7,43 (м, 3H), 7,49 (м, 2H), 7,87 (д, 1H), 8,10 и 8,15 (2ш.с, 1H), 9,44 и 9,65 (2с, 1H); МС (электрораспыление) 986 (M+H⁺), 1008 (M+Na⁺), 1024 (M+K⁺).

Соединение 13b: ¹H ЯМР δ: 1,34 (м, 3H), 2,56 (м, 1H), 2,62 (м, 2H), 2,68 (м, 3H), 2,8 (м, 1H), 3,35-3,36 (2с, 3H), 3,40-3,70 (м, 18H), 3,77 (т, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,93 и 3,95 (2с, 3H), 3,94 (м, 1H), 4,54 (м, 2H), 4,79 (м, 1H), 7,07 (д, 2H), 7,13 (с, 1H), 7,30-7,42 (м, 3H), 7,49 (м, 2H), 7,88 (д, 1H), 8,11 и 8,25 (2 широких с, 1H), 9,22, 9,37, 9,80 и 9,92 (4с, 1H) ; МС (электрораспыление) 1000 (M+H⁺), 1022 (M+Na⁺), 1038 (M+K⁺).

Соединение 13c: ¹H ЯМР δ: 1,30-1,45 (м, 6H), 2,54 (м, 2H), 2,61 (м, 2H), 2,68 и 2,69 (2с, 3H), 3,35-3,36 (2с, 3H), 3,40-3,70 (м, 17H), 3,77 (т, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,92 и 3,93 (2с, 3H), 3,94 (м, 1H), 4,50 (м, 2H), 4,80 (м, 1H), 7,08 (м, 2H), 7,12 (д, 1H), 7,29-7,39 (м, 3H), 7,49 (м, 2H), 7,89 (м, 1H), 8,10 и 8,25 (ш.с 1H), 9,88 и 10,04 (2с, 1H) ; МС (электрораспыление) 1014 (M+H⁺), 1036 (M+Na⁺), 1054 (M+K⁺).

4.1m Синтез соединения 14a. К раствору соединения 13a (5,4 мг, 0,0054 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют PS-карбодиимид (11,5 мг, 0,94 ммоль/г, 0,0108 ммоль) и PS-DMAP (7,2 мг, 1,49 ммоль/г, 0,0108 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, фильтруют и концентрируют, получая продукт. МС (электрораспыление) 1082 (M+H⁺).

4.2 Синтез дисульфидного линкера, конъюгированного с тубулизином A

Лекарство тубулизин A можно конъюгировать с дисульфидным линкером по настоящему изобретению, применяя показанный здесь выше механизм. Используя аналогичные реакционные схемы, можно синтезировать другие лекарства и другие линкеры по настоящему изобретению.

4.3 Скорость циклизации дисульфидного линкера

К раствору соединения 8a (0,1 мг) в смеси PBS-буферный раствор (pH 7,2)/метанол (300 мкл, 2/1) добавляют 20 мМ раствор DTT (100 мкл, 15 экв.) и контролируют протекание реакции методом ВЭЖХ. В реакционной смеси происходит быстрая циклизация, реакция завершается за несколько секунд, количественно давая продукт 10. Промежуточный продукт реакции 9 не детектируют.

Пример 5

Синтез соединения 32. Через раствор соединения 30 (120 мг, 0,28 ммоль) в этилацетате (10 мл) барботируют газообразный HCl в течение 5 мин Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре еще 30 мин и затем концентрируют. Добавляют к реакционной смеси эфир и собирают осадок белого цвета на фильтровальной воронке. Твердое вещество сушат в течение ночи в вакууме, получая 100 мг требуемого продукта, который подтверждают методом ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 324 (M+H⁺) и используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору данного соединения (100 мг, 0,24 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляют соединение 31 (65 мг, 0,26 ммоль), HATU (100 мг, 0,26 ммоль) и TEA (91 мкл, 0,52 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 0,1% ТФА в воде и ацетонитрил и получая соединение 32 в виде масла (110 мг, 80%). Требуемый продукт подтверждают методом ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 555 (M+H⁺).

Синтез соединения 33. Перемешивают раствор соединения 32 (110 мг, 0,2 ммоль), палладий на угле (20 мг) в ДХМ (10 мл) и метанол (5 мл) в атмосфере водорода при атмосферном давлении и комнатной температуре в течение 12 ч. Палладий отфильтровывают, реакционную смесь концентрируют и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 0,1% ТФА в воде и ацетонитрил и получая требуемое соединение в виде масла (80 мг, 78%). ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 465 (M+H⁺). К раствору остатка (80 мг, 0,17 ммоль) в дихлорметане (10 мл) и ТГФ (5 мл) добавляют PNPCl (4-нитрофенилхлорформиат) (137 мг, 0,68 ммоль) и триэтиламин (144 мкл, 1,02 ммоль) при 0°C. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 30 мин при 0°C и затем при комнатной температуре в течение 12 ч. Данную реакционную смесь концентрируют в вакууме и осаждают остаток, используя этиловый эфир (100 мл), получают соединение 33 в виде твердого вещества желтого цвета (90 мг, 82%), которое сушат в вакууме и подтверждают методом ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 631 (M+H⁺).

Синтез соединения 46: К раствору соединения 33 (60 мг, 0,1 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляют Boc-N,N-диметилэтилдиамин (84 мг, 0,38 ммоль) и триэтиламин (26 мкл, 0,1 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток осаждают, используя этиловый эфир (100 мл), получают Boc-защищенное соединение 34, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. Boc-защищенное соединение 34 растворяют в 10 мл ТФА и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 60 мин Данную реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток осаждают, используя этиловый эфир (100 мл), получают соединение 46 в виде твердого вещества желтого цвета, которое сушат в вакууме и подтверждают методом ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 631 (M+H⁺).

Синтез соединения 34: К раствору 2-бромэтиламинбромида (5 г, 24,4 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют диизопропилэтиламин (8,5 мл, 48,8 ммоль) и бензилхлорформиат (3,48 мл, 24,4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрируют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь этилацетат/гексан (3/7) и получая требуемое соединение 34 в виде масла (4 г, 64%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 3,54 (ш.с, 2H), 3,61 (ш.с, 2H), 5,12 (с, 2H), 7,36 (м, 5H).

Синтез соединения 35: К раствору соединения 34 (3,34 г, 12,99 ммоль) и трет-бутилового эфира валина (3,27 г, 15,59 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют карбонат калия (5,39 г, 38,97 ммоль) и йодид калия (2,59 г, 15,59 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при 100°C в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь этилацетат/гексан (2/8) и получая требуемое соединение 35 в виде масла (3,12 г, 69%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 0,92 (м, 6H), 1,46 (с, 9H), 1,86 (м, 1H), 2,53 (м, 1H), 2,80 (м, 2H), 3,18 (м, 1H), 3,31 (м, 1H), 5,10 (с, 2H), 5,25 (ш.с, 1H), 7,36 (м, 5H); ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 296 (M+H-трет-бутил⁺), 352 (M+H⁺).

Синтез соединения 36. Раствор соединения 35 (3,4 г, 9,72 ммоль) и палладий на угле (200 мг) в метаноле (30 мл) помещают в атмосферу водорода при атмосферном давлении и комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Палладий отфильтровывают и реакционную смесь концентрируют досуха, получая требуемое соединение 36 в виде масла (2,1 г, 98%)

Синтез соединения 37. К раствору соединения 36 (2,1 г, 9,72 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляют FmocOSu (сложный эфир 9-флуоренилметоксикарбонил-N-гидроксисукцинимида) (3,28 г, 9,72 ммоль) при 0°C. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч при 0°C. Растворитель удаляют на роторном испарителе и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан, затем 0,5% метанол в дихлорметане и в завершение 1% метанол в дихлорметане и получая требуемое соединение 37 в виде бесцветного масла (2,55 г, 60%). ¹H ЯМР (CDCl₃) δ: 0,95 (нечеткий т, 6H), 1,48 (с, 9H), 1,90 (м, 1H), 2,55 (м, 1H), 2,82 (м, 2H), 3,18 (м, 1H), 3,32 (м, 1H), 4,24 (м, 1H), 4,37 (м, 2H), 5,40 (ш.с, 1H), 7,30 (м, 2H), 7,39 (м, 2H), 7,60 (д, 2H), 7,75 (д, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 383 (M+H-трет-бутил⁺), 440 (M+H⁺), 462 (M+Na⁺), 478 (M+K⁺).

Синтез соединения 38. Через раствор соединения 37 (177 мг, 0,4 ммоль) в смеси тетрагидрофуран-вода (3/1,8 мл) барботируют газообразный HCl в течение 5 мин Реакционную смесь перемешивают при 37°C в течение ночи, затем концентрируют досуха, получая требуемое соединение 38 в виде твердого вещества (168 мг, 98%), которое подтверждают методом ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 383 (M+H⁺), 405 (M+Na⁺), и используют на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 383 (M+H⁺), 405 (M+Na⁺).

Синтез соединения 39. К раствору соединения 5 (525 мг, 0,79 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляют N-Boc-N,N'-диметилэтилендиамин (177 мг, 0,94 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин Растворитель удаляют и остаток очищают методом флэш-хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан, затем 2% метанол в дихлорметане и в завершение 5% метанол в дихлорметане и получая требуемое соединение 39 в виде бесцветного масла (364 мг, 65%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 1,39 (с, 9H), 1,56 (м, 2H), 1,70 (м, 1H), 1,82 (м, 1H), 2,70 и 2,82 (2с, 3H), 2,90 (с, 3H), 3,09 (м, 1H), 3,17 (м, 1H), 3,30-3,37 (м, 4H), 4,16 (т, 1H), 4,27 (м, 1H), 4,33 (д, 2H), 5,02 (ш.с, 2H), 7,24-7,36 (м, 6H), 7,51-7,65 (м, 4H), 7,74 (д, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 618 (M+H-Boc⁺), 662 (M+H-трет-бутил⁺), 718 (M+H⁺), 740 (M+Na⁺), 1435 (2M+H⁺).

Синтез соединения 40. Соединение 40 получают, как описано выше для соединения 17a, с 98% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 396 (M+H-Boc⁺), 496 (M+H⁺), 517 (M+Na⁺), 533 (M+K⁺), 992 (2M+H⁺).

Синтез соединения 41. К раствору соединения 40 (138 мг, 0,28 ммоль) в ДМФА (4 мл) добавляют соединение 38 (110 мг, 0,28 ммоль), HOBt (36 мг, 0,28 ммоль) и EDC (1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (50 мг, 0,28 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 0,1% ТФА в воде и ацетонитрил и получая требуемое соединение 41 в виде масла (178 мг, 70%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 1,04 и 1,11 (2д, 6H), 40 (с, 9H), 1,58 (м, 2H), 1,77 (м, 1H), 1,88 (м, 1H), 2,24 (м, 1H), 2,72 и 2,84 (2с, 3H), 2,92 (с, 3H), 3,10-3,18 (м, 4H), 3,35-3,46 (м, 6H), 3,82 (д, 1H), 4,22 (т, 1H), 4,41 (м, 2H), 4,59 (м, 1H), 5,04 (ш.с, 2H), 7,28-7,40 (м, 6H), 7,55 (м, 2H), 7,63 (м, 2H), 7,78 (д, 2H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 760 (M+H-Boc⁺), 804 (M+H-трет-бутил⁺), 860 (M+H⁺), 882 (M+Na⁺), 899 (M+K⁺).

Синтез соединения 42. Соединение 42 получают, как описано выше для соединения 17a, с 98% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 538 (M+H-Boc⁺), 582 (M+H-трет-бутил⁺), 638 (M+H⁺), 660 (M+Na⁺).

Синтез соединения 43. К раствору соединения 42 (23 мг, 0,036 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют GMBS (сложный эфир N-(малеимидобутирилокси)сукцинимид) (14 мг, 0,05 ммоль) и диизопропилэтиламин (8,4 мкл, 0,05 ммоль) при 0°C. Смесь медленно нагревают до комнатной температуры и продолжают перемешивание еще 30 мин Растворитель выпаривают и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 0,1% ТФА в воде и ацетонитрил и получая требуемое соединение 43 в виде масла (26 мг, 79%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 1,06 и 1,12 (2д, 6H), 1,41 (с, 9H), 1,59 (м, 2H), 1,78 (м, 1H), 1,86-1,93 (м, 3H), 2,24 (м, 3H), 2,74 и 2,84 (2с, 3H), 2,93 (ш.с, 3H), 3,13-3,22 (м, 4H), 3,40-3,60 (м, 8H), 3,82 (д, 1H), 4,60 (м, 1H), 5,05 (ш.с, 2H), 6,80 (с, 2H), 7,32 (м, 2H), 7,57 (д, 2H), 8,78 (д, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 703 (M+H-Boc⁺), 747 (M+H-трет-бутил⁺), 803 (M+H⁺), 825 (M+Na⁺), 841 (M+K⁺).

Синтез соединения 44. Соединение 44 получают, как описано выше для соединения 15a, с 98% выходом. ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 703 (M+H⁺), 725 (M+Na⁺).

Синтез соединения 45. К раствору соединения 44 (15 мг, 0,016 ммоль) и соединения 33 (10 мг, 0,016 ммоль) в ДМФА (0,8 мл) добавляют диизопропилэтиламин (5,5 мкл, 0,032 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают и остаток очищают методом полупрепаративной ВЭЖХ, используя в качестве элюента 0,1% ТФА в воде и ацетонитрил и получая требуемое соединение 45 в виде масла (10 мг, 45%). ¹H ЯМР (CD₃OD) δ: 1,02-1,13 (м, 6H), 1,55 (м, 2H), 1,74 (м, 1H), 1,84-1,92 (м, 3H), 2,20-2,27 (м, 3H), 2,95-3,14 (м, 16H), 3,47-3,84 (м, 12H), 3,98 (м, 1H), 4,2-4,34 (м, 3H), 4,57 (м, 1H), 4,69 (м, 2H), 5,07-5,17 (м, 2H), 6,78 (с, 2H), 7,16-7,23 (м, 3H), 7,30 (м, 1H), 7,38-7,47 (м, 3H), 7,52-7,58 (м, 3H), 7,81-7,92 (м, 2H), 8,25 (ш.с, 1H) м.д.; ЖХ-МС (ионизация с электрораспылением) 1194 (M+H⁺), 1215 (M+Na⁺), 1233 (M+K⁺).

Пример 6

Синтез соединения (2). Раствор соединения 1 (100 мг, 0,24 ммоль) и 10% Pd-C (35 мг) в смеси MeOH/CH₂Cl₂ (1/2, 10 мл) дегазируют в вакууме в течение 40 с. Полученную смесь помещают в атмосферу водорода и перемешивают при 25°C в течение 7 ч. Данную реакционную смесь фильтруют через целит (промывают CH₂Cl₂). Растворитель удаляют в вакууме. Хроматография на силикагеле с элюированием смесью EtOAc/гексан (2/8) дает соединение 2 (77 мг, 98%). ¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 10,36 (с, 1H), 8,04 (д, 1H, J=8,2 Гц), 7,72 (д, 1H, J=8,2 Гц), 7,61 (ш.с, 1H), 7,45 (т, 1H, J=8,4 Гц), 7,261 (т, 1H, J=8,4 Гц), 4,06 (м, 4H), 3,73 (м, 1H), 1,52 (с, 9H).

Синтез соединения (4). Раствор соединения 2 (35 мг, 0,1 ммоль) в 4M HCl-EtOAc (5 мл) перемешивают при 25°C в атмосфере Ar в течение 30 мин Растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют 5-ацетилиндон-2-карбоновую кислоту (24,4 мг, 0,12 ммоль). Добавляют раствор EDC (22,9 мг, 0,12 ммоль) в ДМФА (3 мл) и реакционную смесь перемешивают при 25°C в течение 5 ч. Растворитель удаляют. Сырой продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 10% MeOH в CH₂CCl₂ и получая соединение 4 (40,7 мг, 93%). ¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 12,13 (с, 1H), 10,47 (с, 1H); 8,45 (с, 1H), 8,10 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,96 (ш.с, 1H), 7,85 (д, 2H, J=8,4 Гц), 7,54 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,51 (т, 1H, J=8,2 Гц), 7,36 (т, 1H, J=7,6), 7,35 (с, 1H), 4,81 (т, 1H, 11,2 Гц), 4,54 (дд, 1H, 8,8 Гц), 4,23 (м, 1H), 4,01 (дд, 1H, J=10,2 Гц), 3,86 (дд, 1H, J=10,7 Гц), 2,61 (с, 3H).

Синтез соединения (5). 4-Метил-1-пиперазинкарбонилхлорид гидрохлорид (19,9 мг, 0,1 ммоль) добавляют к раствору соединения 4 (20 мг, 0,05 ммоль) и безводного пиридина (25 мкл, 0,3 ммоль) в 3% аллиловом спирте в сухом метиленхлориде (4 мл) и смесь перемешивают в течение 16 ч. Очистка сырого продукта на силикагеле дает соединение 5 (23,6 мг, 91%). ¹H ЯМР (ДМСО-d₆) δ : 12,03 (с, 1H), 8,41 (с, 1H), 8,21 (с, 1H), 8,01 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,88 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,82 (дд, 1H, J=8,4 Гц), 7,58 (т, 1H, J=8,1 Гц), 7,51 (д, 1H, J=8,4 Гц), 7,46 (т, 1H, J=7,6 Гц), 7,37 (с, 1H), 4,86 (т, 1H, J=10,8 Гц), 4,57 (дд, 1H, J=10,8 Гц), 4,38 (м, 1H), 4,06 (дд, 1H, J=10,8 Гц), 3,86 (дд, 1H, J=ll Гц), 3,41 (широкий, 4H), 3,29 (широкий, 4H), 2,82 (с, 3H), 2,57 (с, 3H).

Синтез соединения (7). Раствор соединения 5 (13 мг, 24 мкмоль) и линкера 6 (16,9 мг, 31 мкмоль) в 5% уксусной кислоте в сухом метиленхлориде (1 мл) перемешивают в течение 30 мин при 25°C. Растворитель полностью удаляют в вакууме и очищают методом ВЭЖХ (колонка SymmetryPrep C₁₈, 7 мкм, 19 x 150 мм), получая соединение 7 (18,5 мг, 81%). МС: рассчитано для C₄₈H₅₇ClN₈O₁₁ (M+H) m/z 958,38, обнаружено 958,10.

ПРИМЕР 7: Исследования пролиферации

Биологическую активность цитотоксических соединений данного изобретения можно изучать, используя хорошо известное исследование пролиферации с ³H-тимидином. Это удобный способ для количественного определения пролиферации клеток, который оценивает синтез ДНК посредством определения включения экзогенного радиомеченого ³H-тимидина. Данное исследование является высоковоспроизводимым и может использовать большое количество соединений.

Для проведения исследования клетки промиелоцитарного лейкоза HL-60 культивируют в среде RPMI, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FCS), дезактивированную нагреванием. В день исследования клетки собирают, промывают и повторно суспендируют при концентрации 0,5 x 106 клеток/мл в RPMI, содержащей 10% FCS. 100 мкл клеточной суспензии добавляют в 96-ячеечные планшеты. Производят серийные разведения (3-кратные инкременты) доксорубицина (в качестве положительного контроля) или тестовых соединений и добавляют по 100 мкл соединений на ячейку. В завершение добавляют 10 мкл 100 мкКю/мл ³H-тимидина на ячейку и инкубируют планшеты в течение 24 ч. Собирают клетки в планшетах, применяя 96-ячеечный харвестер (Packard Instruments), и измеряют на счетчике Packard Top Count. Строят четырехпараметровые логистические кривые для включения ³H-тимидина как функции молярности лекарства, используя программное обеспечение Prism для определения величин IC₅₀.

Соединения данного изобретения обычно имеют значение IC₅₀ в описанном выше исследовании примерно от 1 пМ до 100 нМ, предпочтительно примерно от 10 пМ до 10 нМ.

ПРИМЕР 8: Конъюгация молекул лекарство-линкер с антителами

Данный пример описывает условия взаимодействия и методологию конъюгации молекулы лекарство-линкер данного изобретения (необязательно включающей другие группы, такие как спейсеры, реакционноспособные функциональные группы и подобные) с антителом в качестве направляющего агента X⁴. Данные условия и методология, как предполагается, являются только типичным примером, а не ограничением. В данной области известны другие подходы к конъюгации молекул лекарство-линкер с антителами.

Описанный здесь способ конъюгации основан на введении свободных тиольных групп в антитело взаимодействием лизинов антитела с 2-иминотиоланом с последующим взаимодействием молекулы лекарство-линкер с активной малеимидной группой. Сначала у антитела, подлежащего конъюгации, меняют буфер на 0,1M фосфатный буфер, pH 8,0, содержащий 50 мМ NaCl, 2 мМ DTPA, pH 8,0 и концентрируют до 5-10 мг/мл. Получение тиолата осуществляют добавлением к антителу 2-иминотиолана. Количество 2-иминотиолана, подлежащее добавлению, определяют в предварительных экспериментах и варьируют от одного антитела к другому. В предварительных экспериментах проводят титрование, добавляя к антителу возрастающие количества 2-иминотиолана, с последующей инкубацией с антителом в течение одного часа при комнатной температуре, антитело высаливают в 50 мМ HEPES-буфер, pH 6,0, используя колонку Sephadex G-25, и быстро определяют количество введенных тиольных групп посредством взаимодействия с дитиодипиридином (DTDP). В результате взаимодействия тиольных групп с DTDP происходит высвобождение тиопиридина, которое контролируют при 324 нм. Используют образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Для точного определения концентрации белка в образцах определяют абсорбцию при 280 нм и затем аликвоту каждого образца (0,9 мл) инкубируют с 0,1 мл DTDP (5 мМ исходный раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Также инкубируют пустые образцы, содержащие только буфер плюс DTDP. Через 10 мин измеряют поглощение при 324 нм и определяют количество присутствующих тиолов, используя коэффициент экстинкции тиопиридина 19800M^-1.

Обычно требуется степень тиолирования три тиольные группы на антитело. Например, для одного конкретного антитела этого достигают, добавляя 15-кратный молярный избыток 2-иминотиолана с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Следовательно, подлежащее конъюгации антитело инкубируют с 2-иминотиоланом при необходимом молярном соотношении и затем высаливают в конъюгационный буфер (50 мМ HEPES-буфер, pH 6,0, содержащий 5 мМ глицин, 3% глицерин и 2 мМ DTPA). Тиолированный материал выдерживают на льду, пока определяют количество введенных тиолов, как описано выше.

После проверки количества введенных тиольных групп добавляют молекулу лекарство-линкер, содержащую активную малеимидную группу, с 3-кратным молярным избытком на тиольную группу. Реакцию конъюгации проводят в конъюгационном буфере, содержащем также конечную концентрацию 5% диметилового эфира этиленгликоля (или подходящего альтернативного растворителя). Обычно исходный раствор лекарство-линкер растворяют в смеси 90% диметилового эфира этиленгликоля и 10% диметилсульфоксида. Для добавления к антителу можно добавлять исходный раствор непосредственно к тиолированному антителу, которое имеет достаточное количество добавленного диметилового эфира этиленгликоля для доведения конечной концентрации до 5%, или предварительно разбавить в конъюгационном буфере, содержащем конечную концентрацию 10% диметилового эфира этиленгликоля, с последующим добавлением к равному объему тиолированного антитела.

Подлежащую конъюгации реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь центрифугируют при 14000 об./мин в течение 15 мин и доводят pH до 7,2, если сразу не производят очистку. Очистку конъюгата производят методом хроматографии, используя ряд способов. Конъюгат можно очистить, применяя метод размер-исключительной хроматографии, на колонке Sephacryl S200, предварительно уравновешенной 50 мМ HEPES-буфером, pH 7,2, содержащим 5 мМ глицин, 50 мМ NaCl и 3% глицерин. Хроматографию выполняют при линейной скорости потока 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат, собирают, объединяют и концентрируют. По-другому, очистку можно проводить методом ион-обменной хроматографии. Условия варьируют от одного антитела к другому, и в каждом случае требуется их оптимизация. Например, реакционную смесь конъюгата антитело-лекарство вносят в колонку SP-Sepharose, предварительно уравновешенную в 50 мМ HEPES, 5 мМ глицине, 3% глицерине, pH 6,0. Конъюгат антитела элюируют, используя градиент 0-1 M NaCl в уравновешивающем буфере. Фракции, содержащие конъюгат, объединяют, доводят pH до 7,2 и, если требуется, концентрируют образец.

Каждое из заявленных в патенте применений, патентов, публикаций и других опубликованных документов, которые были упомянуты или на которые делались ссылки в данном описании, включено здесь во всей своей полноте в качестве ссылки, в той степени, как если бы было специально и индивидуально указано, что каждое индивидуальное патентное применение, патент, публикация и другой опубликованный документ включены в качестве ссылки.

При том что настоящее изобретение описано со ссылкой на его специфические варианты, специалист в данной области должен понимать, что можно делать различные изменения и замены на эквиваленты, не отклоняясь от истинного духа и области данного изобретения и приложенной формулы изобретения. Кроме того, можно произвести многие модификации для адаптации конкретной ситуации, материала, рассматриваемой композиции, способа, стадии или стадий процесса к цели, духу и области настоящего изобретения. Как предполагается, все такие модификации входят в область приложенной формулы изобретения.

Claims

1. Соединение формулы

где D представляет собой

или

X представляет собой О;
Z выбран из О или NH;
R¹ представляет собой C(O)₂R⁸, где R⁸ представляет собой низший алкил;
R² представляет собой низший алкил;
R³ представляет собой OR¹¹; где
R¹¹ представляет собой C(O)NR¹²R¹³, в которых
R¹² и R¹³ образуют 6-членную гетероциклоалкильную циклическую систему, содержащую два атома азота, необязательно замещенную низшим алкилом;
R⁴ представляет собой NR¹⁵, где R⁴ связывает D с F, причем R¹⁵ выбран из Н или низшего алкила;
R⁷ обозначает СН₂-Х¹, где X¹ представляет собой галоген,
F обозначает линкер, включающий структуру:

где АА¹ обозначает один или более компонентов, независимо выбранных из группы, включающей природные аминокислоты и искусственные α-аминокислоты, причем АА¹ представляет собой энзиматически расщепляемую пептидную последовательность;
с представляет собой 2, 3 или 4;
о представляет собой 0 или 1;
где, когда о равно 1, -L³-NH имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из

L⁴ обозначает линкерный компонент, в котором L⁴ не содержит карбоксильной ацильной группы, непосредственно присоединенной к М-концу (АА¹)_с и L⁴ содержит С_1-6алкил или С_1-6гетероалкил с атомом азота в качестве гетероатома, необязательно замещенный =O; и
X⁴ необязательно связан с антителом и представляет собой компонент, выбранный из

и

2. Соединение по п.1, где L⁴ содержит нециклический фрагмент.

3. Соединение по любому из пп.1 и 2, где L⁴ повышает растворимость соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

4. Соединение по любому из пп.1 и 2, где L⁴ снижает агрегацию соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

5. Соединение по любому из пп.1 и 2, где L⁴ содержит полиэтиленгликольный фрагмент.

6. Соединение по п.5, где полиэтиленгликольный фрагмент содержит 3-12 повторяющихся звеньев.

7. Соединение по п.6, где полиэтиленгликольный фрагмент содержит 2-6 повторяющихся звеньев.

8. Соединение по п.7, где полиэтиленгликольный фрагмент содержит 4 повторяющихся звена.

9. Соединение по любому из пп.1 и 2 или 6-8, где (АА¹)_с
представляет собой пептидную последовательность, расщепляемую протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани.

10. Соединение по п.9, где протеаза представляет собой лизосомальную протеазу.

11. Соединение по любому из пп.1 и 2, 6-8 или 10, где с равно целому числу 2 или 3.

12. Соединение по любому из пп.1 и 2, 6-8 или 10, где аминокислота в (АА¹)_с, расположенная ближе всего к лекарственному фрагменту, выбрана из группы, включающей: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gin, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.

13. Соединение по любому из пп.1 и 2, 6-8 или 10, где (AA₁)_c представляет собой пептидную последовательность, выбранную из группы, включающей Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:2) и Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:3).

14. Соединение по любому из пп.1 и 2, 6-8 или 10, где (АА¹)_c представляет собой Val-Cit или Val-Lys.

15. Соединение по п.1, имеющее структуру:

или

16. Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

или

где каждый b независимо равен целому числу от 0 до 20, и где Ab обозначает антитело или его фрагмент.

17. Соединение по п.1, которое выбрано из группы, включающей:

и

где X обозначает Cl или Br, и Ab обозначает антитело или его фрагмент.

18. Соединение, имеющее структуру

где D представляет собой

или

X представляет собой О;
Z выбран из О или NH;
R¹ представляет собой C(O)₂R⁸, где R⁸ представляет собой низший алкил;
R² представляет собой низший алкил;
R³ представляет собой -О- и связан с Н;
R⁴ представляет собой компоненты, независимо выбранные из группы, состоящей из OR¹⁵ и -O(CH₂)₂NR¹⁵R¹⁶,
причем R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из водорода или низшего алкила; и
R⁷ обозначает СН₂-Х¹, где X¹ представляет собой галоген,
X⁴ необязательно связан с антителом, и представляет собой компонент, выбранный из

и

L⁴ обозначает линкерный компонент, содержащий полиэтиленгликольный фрагмент, включающий 2-6 повторяющихся звеньев;
р равно 0 или 1;
Н обозначает in vivo расщепляемый линкер, включающий структуру:

где n₁ равно целому числу от 1 до 10;
n₂ равно 0, 1 или 2;
каждый R²⁴ представляет собой компонент, независимо выбранный из группы, включающей Н или низший алкил; и
I обозначает либо связь, либо:

где n₃ равно 0 или 1 при условии, что если n₃ равно 0, то n₂ не равно 0; и n₄ равно 1, 2 или 3,
где, если I обозначает связь, n₁ равно 3 и n₂ равно 1, то D не может быть:

или

где R обозначает Me или CH₂-CH₂-NMe₂.

19. Соединение по п.18, где замещение по фенильному циклу представляет собой пара-замещение.

20. Соединение по любому из пп.18 или 19, где n₁ равно 2, 3 или 4.

21. Соединение по п.20, где n₁равно 3.

22. Соединение по любому из пп.18 и 19 или 21, где n₂ равно 1.

23. Соединение по п.22, где I обозначает связь.

24. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21 или 23, где Н образует 6-членный саморазрушающийся линкер при отщеплении.

25. Соединение по п.22, где n₃ равно 0 и n₄ равно 2.

26. Соединение по любому из пп.18 и 19 или 21, где Н образует два 5-членных саморазрушающихся линкера при отщеплении.

27. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21 или 23, где Н образует 5-членный саморазрушающийся линкер, Н образует 7-членный саморазрушающийся линкер, или Н образует 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный саморазрушающийся линкер при отщеплении.

28. Соединение по любому из пп.18 и 19 или 21, где Н содержит структуру:

29. Соединение по п.28, где n₁ равно 2, 3 или 4.

30. Соединение по п.28, где n₁ равно 3.

31. Соединение по любому из пп.29 или 30, где каждый R²⁴ независимо выбран из СН₃ и Н.

32. Соединение по любому из пп.29 и 30, где каждый R²⁴ обозначает Н.

33. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21 или 23, где Н имеет структуру:

34. Соединение по п.33, где n₁ равно 3.

35. Соединение по п.33, где каждый R²⁴ независимо выбран из СН₃ и Н.

36. Соединение по п.33, где Н имеет структуру:

37. Соединение по п.33, где Н содержит геминальное диметильное замещение.

38. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21, 23, 25, 29 и 30 или 34-37, где D обозначает цитотоксическое лекарство.

39. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21, 23, 25, 29 и 30 или 34-37, где L⁴ содержит нециклический фрагмент.

40. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21, 23, 25, 29 и 30 или 34-37, где L⁴ повышает растворимость соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

41. Соединение по любому из пп.18 и 19, 21, 23, 25, 29 и 30 или 34-37, где L⁴ снижает агрегацию соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

42. Соединение по п.18, где полиэтиленгликольный фрагмент содержит 4 повторяющихся звена.

43. Соединение по п.18, имеющее структуру:

или

44. Соединение по п.18, имеющее структуру:

или

45. Соединение по п.18, имеющее структуру:

или

где PEG представляет собой полиэтиленгликольный фрагмент, и X¹ обозначает Cl или Br.

46. Соединение по п.18, имеющее структуру:

где X¹ обозначает Cl или Br, и Ab обозначает антитело или его фрагмент.

47. Соединение по п.18, имеющее структуру, выбранную из группы, включающей:

,

,
и

48. Соединение формулы

где D представляет собой

или

X представляет собой О;
Z выбран из О или NH;
R¹ представляет собой C(O)₂R⁸, где R⁸ представляет собой низший алкил;
R² представляет собой низший алкил;
R³ представляет собой -О- и связан с J;
R⁴ представляют собой группу состоящую из OR¹⁵ и O(CH₂)₂NR¹⁵R¹⁶, причем R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из водорода или низшего алкила; и
R⁷ обозначает СН₂-Х¹, где X¹ представляет собой галоген,
X⁴ необязательно связан с антителом, и представляет собой компонент выбранный из

и

L⁴ обозначает линкерный компонент, содержащий фрагмент полиэтиленгликоля, включающий 2-6 повторяющихся звеньев;
р равно 0 или 1;
J обозначает in vivo расщепляемый линкер, включающий структуру:

где каждый R²⁴ представляет собой компонент, независимо выбранный из группы, включающей Н или низший алкил; и d равно целому числу из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

49. Соединение по п.48, где J имеет структуру:

50. Соединение по п.49, где d равно 1 или 2.

51. Соединение по п.48, где J имеет структуру:

52. Соединение по любому из пп.48-51, где D представляет собой цитотоксическое лекарство.

53. Соединение по любому из пп.48-51, где L⁴ содержит нециклический фрагмент.

54. Соединение по любому из пп.48-51, где L⁴ повышает растворимость соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

55. Соединение по любому из пп.48-51, где L⁴ снижает агрегацию соединения по сравнению с соединением, не имеющим L⁴.

56. Соединение по п.48, где полиэтиленгликольный фрагмент содержит 4 повторяющихся звена.

57. Соединение по п.48, имеющее структуру:

или

58. Соединение по п.48, имеющее структуру, выбранную из группы, включающей:

,

,

,

и

59. Соединение, имеющее структуру

где D представляет собой

или

X представляет собой О;
Z выбран из О или NH;
R¹ представляет собой C(O)₂R⁹, где R⁹ представляет собой низший алкил;
R² представляет собой низший алкил; и
R³ представляет собой OR¹¹; где
R¹¹ представляет собой C(O)NR¹²R¹³, в которых
R¹² и R¹³ образуют 6-членную гетероциклоалкильную циклическую систему, содержащую два атома азота, необязательно замещенную низшим алкилом;
R⁴ присоединяет D к Н; и
R⁷ обозначает СН₂-Х¹, где X¹ представляет собой галоген;
X⁴ необязательно связан с антителом, и R²⁹ представляет собой компонент, выбранный из

и

L⁴ обозначает линкерный компонент, который представляет собой незамещенный низший алкил;
р равно 0 или 1;
Н обозначает in vivo расщепляемый линкер, включающий структуру:

где q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и
где каждый R²⁴ обозначает компонент, независимо выбранный из группы, включающей Н и низший алкил.

60. Соединение по п.59, где Н образует 6-членный саморазрушающийся линкер при разложении.

61. Соединение по п.59, где Н образует два 5-членных саморазрушающихся линкера при разложении.

62. Соединение по любому из пп.59-61, где D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство.

63. Соединение по п.59, имеющее структуру:

или

где Ab обозначает антитело или его фрагмент.