KR20180085800A - Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD3 및 PSMA에 결합하는 이종이합체성 항체에 관한 것이다.

Description

CD3 및 PSMA에 결합하는 이종이합체성 항체
우선권 주장
본 출원은 2015년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/264,261호 및 2016년 4월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/324,823호(이들의 전문이 명확히 참고로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 암(예를 들어, 전립선암)의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
항체 기반 치료제는 암 및 자가면역/염증성 장애를 포함하는 다양한 질환을 치료하기 위해 성공적으로 사용된다. 이 종류의 약물에 대한 더한층의 개선은 특히 이의 임상 효능을 증대시키는 것과 관련하여 특히 요구된다. 조사된 하나의 방안은 단일 면역글로불린 분자가 2개의 상이한 항원을 동시 개입시키도록 항체 기반 약물로의 추가의 및 새로운 항원 결합 부위의 조작이다. 2개의 상이한 항원을 개입시키는 이러한 비네이티브(non-native) 또는 대안적인 항체 포맷은 대개 이중특이체라 불린다. 항체 가변 영역(Fv)의 상당한 다양성이 사실상 임의의 분자를 인식하는 Fv를 제조하는 것을 가능하게 하므로, 이중특이체 생성에 대한 통상적인 접근법은 항체로의 새로운 가변 영역의 도입이다.
다수의 대안적인 항체 포맷은 이중특이적 표적화에 대해 조사되었다(Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; Kontermann, mAbs 4(2):182 (2012)(이들 모두 본 명세서에 명확히 참고로 포함됨)). 초기에, 각각 단일 단일클론 항체를 생성한 2개의 세포주를 융합함으로써 이중특이적 항체를 제조하였다(Milstein et al., 1983, Nature 305:537-540). 생성된 하이브리드 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)는 이중특이적 항체를 생성하지만, 이들은 오직 소수의 집단이고, 원하는 항체를 단리하기 위해 광범위한 정제가 필요하다. 이것에 대한 조작 해결책은 이중특이체를 제조하도록 항체 단편을 사용하는 것이다. 이러한 단편은 전장 항체의 복잡한 4차 구조가 부족하므로, 가변 경쇄 및 중쇄는 단일 유전적 작제물에서 연결될 수 있다. 다이아바디, 단일 사슬 다이아바디, 탠덤 scFv 및 Fab2 이중특이체를 포함하는 많은 상이한 형태의 항체 단편을 생성하였다(Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136(본 명세서에 명확히 참고로 포함됨)). 이 포맷이 박테리아에서 높은 수준으로 발현될 수 있고, 이의 작은 크기로 인해 양호한 침투 이익을 가질 수 있지만, 이것이 생체내 신속히 청소되고, 이의 생성 및 안정성과 관련된 제조 장애를 제시할 수 있다. 이 단점의 주요 원인은 항체 단편이 통상적으로, 더 큰 크기, 높은 안정성 및 혈청에서 긴 반감기를 유지시키는 다양한 Fc 수용체 및 리간드(즉, 신생아 Fc 수용체 FcRn)에 대한 결합을 포함하는, 이의 연관된 기능적 특성을 갖는 항체의 불변 영역이 부족하거나, 정제에 대한 결합 부위(즉, 단백질 A 및 단백질 G)로서 작용한다는 것이다.
전장 항체 유사 포맷으로 이중 결합을 조작함으로써 단편 기반 이중특이체의 단점을 해소하도록 더 최근의 작업이 시도되었다(Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; USSN 12/477,711; Michaelson et al., 2009, mAbs 1[2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; USSN 09/865,198; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; PCT/US2005/025472(본 명세서에 명확히 참고로 포함됨)). 이 포맷은 항체 단편 이중특이체의 장애 중 일부를 극복하는데, 왜냐하면 주로 이것이 Fc 영역을 함유하기 때문이다. 이 포맷의 하나의 상당한 단점은 이것이 동종이합체성 불변 사슬의 상부에서 새로운 항원 결합 부위를 구축하므로, 새로운 항원에 대한 결합이 항상 2가라는 것이다.
치료학적 이중특이적 포맷에서의 공동 표적으로서 매력적인 많은 항원에 대해, 원하는 결합은 2가보다는 1가이다. 많은 면역 수용체에 대해, 세포 활성화는 1가 결합 상호작용의 가교결합에 : 달성된다. 가교결합의 기전은 항체/항원 면역 착체에 의해 또는 표적 세포로 효과기(effector) 세포의 개입을 통해 통상적으로 매개된다. 예를 들어, 저 친화도 Fc 감마 수용체(FcγR), 예컨대 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa는 항체 Fc 영역에 1가로 결합한다. 1가 결합은 이 FcγR을 발현하는 세포를 활성화하지 않지만, 면역 착체화 또는 세포 대 세포 접촉 시, 수용체는 세포 표면에서 가교결합되고 클러스터링되어서, 활성화를 발생시킨다. 천연 살해(NK) 세포에서의 FcγRIIIa와 같은 세포 사멸을 매개하는 것을 책임지는 수용체에 대해, 효과기 세포가 고 친화도 포맷에서 표적 세포를 개입시킬 때 수용체 가교결합 및 세포 활성화가 발생한다(Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99(참고로 명확히 포함됨)). 유사하게, BCR이 인식하는 동일한 항원과의 가용성 IgG의 면역 착체화에 의해 매개되는 기전인 세포 표면 B 세포 수용체(B-cell receptor: BCR)와의 면역 착체로 이것이 개입시킬 때에만 B 세포에서 저해 수용체 FcγRIIb가 B 세포 활성화를 하향조절한다(Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157-161; Smith and Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343(참고로 명확히 포함됨)). 또 다른 예로서, 이의 연관된 T 세포 수용체(T-cell receptor: TCR)가 고 친화도 세포 대 세포 시냅스에서 항원 제시 세포에서 항원 로딩된 MHC를 개입시킬 때에만 T 세포의 CD3 활성화가 생긴다(Kuhns et al., 2006, Immunity 24:133-139). 실제로, 항-CD3 항체를 사용하는 CD3의 비특이적 2가 가교결합은 사이토카인 폭풍 및 독성을 유발한다(Perruche et al., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632(참고로 명확히 포함됨)). 따라서, 실용적인 임상 사용을 위해, 표적 세포의 재지시된 사멸에 대한 CD3 동시 개입의 바람직한 방식은 동시 개입된 표적에 의한 개입 시 오직 활성화를 발생시키는 1가 결합이다.
따라서, 항체 단편으로부터 생성된 이중특이체가 생물물리학적 및 약동학적 장애를 겪지만, 전장 항체 유사 포맷에 의해 구축된 것의 단점은 1차 표적 항원의 부재 하에 공동 표적 항원을 다가로 개입시켜서 비특이적 활성화 및 잠재적으로 독성을 발생시킨다는 것이다. 본 발명은 CD3 및 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen: PSMA)으로 지시된 신규한 이중특이적 항체를 도입함으로서 이 문제를 해소한다.
대부분의 전립선암 세포에서 상당히 과발현된 막관통 단백질인, CD3 및 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 결합하는 이종이합체성 항체(heterodimeric antibody)가 본 명세서에 제공된다. 이러한 항체는 예를 들어 PSMA 발현 종양 세포로 표적화 CD3 + T 세포를 촉진함으로써 암(예를 들어, 전립선암)의 치료에 유용하다.
일 양태에서, a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체; b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 추가의 양태에서, a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산; b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및 c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 핵산 조성물이 본 명세서에 제공된다. 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및 c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체; b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 추가의 양태에서, a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산; b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및 c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 핵산 조성물이 본 명세서에 제공된다. 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및 c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일 양태에서, a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체; b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산; b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및 c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 핵산 조성물이 본 명세서에 제공된다. 추가의 양태에서, a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및 c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일 양태에서, a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체; b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산; b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및 c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 핵산 조성물이 본 명세서에 제공된다. 훨씬 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및 c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인 및 scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커을 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 6을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 7을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.30의 vhCDR(서열 번호 2를 갖는 vhCDR1, 서열 번호 3을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 15를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 16을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.32의 vhCDR(서열 번호 11을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 12를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 24를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 25를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.89의 vhCDR(서열 번호 20을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 21을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 33을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 34를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.90의 vhCDR(서열 번호 29를 갖는 vhCDR1, 서열 번호 30을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 42를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 43을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.33의 vhCDR(서열 번호 38을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 39를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 51을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 52를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 53을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.31의 vhCDR(서열 번호 47을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 48을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 49를 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다.
상기 기재된 항체의 일 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 vhCDR(서열 번호 111을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 112를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 113을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 vlCDR(서열 번호 107을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 108을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 109를 갖는 vlCDR3)을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 가변 중쇄 도메인(서열 번호 110)을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 가변 경쇄 도메인(서열 번호 106)을 포함한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및 ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및 ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 vhCDR(서열 번호 111을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 112를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 113을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 vlCDR(서열 번호 107을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 108을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 109를 갖는 vlCDR3)을 포함한다. 중쇄 가변 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 가변 중쇄 도메인(서열 번호 110)을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1 L1의 가변 경쇄 도메인(서열 번호 106)을 포함한다.
상기 기재된 항체의 몇몇 실시형태에서, 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 변이체를 포함한다.
상기 기재된 항체의 몇몇 실시형태에서, scFv 링커는 하전된 링커이다.
상기 기재된 항체의 몇몇 실시형태에서, 중쇄 불변 도메인은 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함한다.
상기 기재된 항체의 몇몇 실시형태에서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 공통 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인; 2) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및 3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착됨)를 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄를 포함한다. 공통 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 가진다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 인간 PSMA(서열 번호 131)에 결합하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 인간 PSMA에 결합하고, scFv는 인간 CD3에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 공통 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인; 2) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인; 및 3) 제1 가변 경쇄 도메인(여기서, 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착됨)을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 제2 가변 중쇄 도메인; ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인; 및 ⅲ) 제3 가변 중쇄 도메인(여기서, 제3 가변 중쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착됨)을 포함한다. 공통 경쇄는 제2 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 가진다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 제1 가변 경쇄 도메인 및 제3 가변 중쇄 도메인은 CD3에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 공통 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인; 2) 제1 CH1 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및 3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착됨)을 포함하는 제1 중쇄를 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄를 포함한다. 공통 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 가진다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, scFv는 CD3에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 공통 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 ⅰ) ⅰ) 제1 가변 중쇄 도메인; ⅱ) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인; 및 ⅲ) 제1 가변 경쇄 도메인(여기서, 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 불변 중쇄 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착됨)을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 ⅰ) 제2 가변 중쇄 도메인; ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인; 및 ⅲ) 제3 가변 중쇄 도메인(여기서, 제3 가변 중쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제2 불변 중쇄 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제2 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착됨)을 포함한다. 공통 경쇄는 제2 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 가진다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 제1 가변 경쇄 도메인 및 제3 가변 중쇄 도메인은 CD3에 결합한다.
일 양태에서, 제1 단량체, 제2 단량체 및 경쇄를 포함하는 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다. 제1 단량체는 i) i) 1) 제1 가변 중쇄 도메인; 2) 제1 CH1 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및 3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv(여기서, scFv는 도메인 링커를 사용하여 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착됨)을 포함하는 제1 중쇄를 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 제2 Fc 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 가진다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제1 항원에 결합하고, scFv는 제2 항원에 결합하고, 제1 항원 및 제2 항원 중 하나는 PSMA이고, 다른 하나는 CD3이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 해당 이종이합체성 항체를 코딩하는 핵산 조성물이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 조성물은 a) 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산; b) 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및 c) 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함한다.
또 다른 양태에서, XENP14484, XENP16873, XENP16874 및 XENP19722로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이합체성 항체가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 조성물의 임의의 것을 포함하는 발현 벡터 조성물이 본 명세서에 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 조성물 또는 발현 벡터 조성물의 임의의 것을 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 제공된다. 훨씬 또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 이종이합체성 항체를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 몇몇 포맷을 도시한다. scFv를 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인 및 Fab를 포함하는 항-PSMA 항원 결합 도메인을 갖는 것, 및 이들이 역전된 것의 "보틀 오프너" 포맷의 2개의 형태가 도시되어 있다. mAb-Fv, mAb-scFv, 중앙-scFv 및 중앙-Fv, 공통 경쇄 및 이중특이적 IgG 포맷이 모두 도시되어 있다. 이 도면에서 각각의 구조가 scFv 또는 Fv로서 항-PSMA 및 항-CD3 도메인을 도시하지만, 각각의 이 구조의 항-PSMA 및 항-CD3 도메인은 또한 "역전"될 수 있다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 mAb-scFv가 항-PSMA scFv 및 항-CD3 Fv를 가질 수 있다는 것이 또한 고려된다. 게다가, 하나의 아암의 중앙-scFv 및 하나의 아암의 중앙-Fv를 포함하는, 단지 하나의 단량체가 Fc 도메인을 포함하는, "하나의 아암"의 포맷이 도시되어 있다. 이중 scFv 포맷이 또한 도시되어 있다.
도 2는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "고 CD3" 항-CD3_H1.30_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커에 의해 대체될 수 있다.
도 3은 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "고-중 1호" 항-CD3_H1.32_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커에 의해 대체될 수 있다.
도 4는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "고-중 2호" 항-CD3_H1.89_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커에 의해 대체될 수 있다.
도 5는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "고-중 3호" 항-CD3_H1.90_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커에 의해 대체될 수 있다.
도 6은 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "중" 항-CD3_H1.33_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커(예를 들어, 도 14에서의 임의의 하전된 링커)에 의해 대체될 수 있다.
도 7은 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 "저" 항-CD3_H1.31_L1.47 작제물(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 도면에 도시된 모든 서열이 사실인 것처럼, 이 하전된 링커는 필요한 바대로 비하전된 링커 또는 상이한 하전된 링커(예를 들어, 도 14에서의 임의의 하전된 링커)에 의해 대체될 수 있다.
도 8은 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 XENP14484의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인(CDR 밑줄표시), 및 개별 vl 및 vhCDR, 및 하전된 링커를 갖는 scFv 작제물(이중 밑줄표시)의 서열을 도시한다. 그러나, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 하전된 링커, PSMA 실시형태의 경우에, 양으로 하전된 링커는 도 14에 도시된 바와 같은 음으로 하전된 것, 또는 비하전된 전통적인 GS 링커에 의해 또한 대체될 수 있다.
도 9는 XENP14484의 서열을 도시한다.
도 10a-10e는 이종이합체화 변이체 세트의 유용한 쌍(왜곡 및 pI 변이체 포함)을 도시한다. 도 10e에서, 상응하는 "단량체 2" 변이체가 없는 변이체가 있고, 이것은 단량체 중 어느 하나에서 단독으로 사용되거나, 예를 들어 보틀 오프너의 Fab 사이드에 포함될 수 있는, pI 변이체이고, 적절한 하전된 scFv 링커는 제2 항원 결합 도메인으로서 scFv를 사용하는 제2 단량체에서 사용될 수 있다. 적합한 하전된 링커는 도 14에 도시되어 있다.
도 11은 등전자 변이체 항체 불변 영역 및 이의 각각의 치환의 목록을 도시한다. pI_(-)는 더 낮은 pI 변이체를 나타내는 한편, pI_(+)는 더 높은 pI 변이체를 나타낸다. 이것은 임의로 및 독립적으로 본 발명의 다른 이종이합체화 변이체(및 본 명세서에 기재된 바와 같은 또한 다른 변이체 유형)와 조합될 수 있다.
도 12는 FcγR 결합을 절제하는 유용한 절제 변이체(때때로 "넛아웃" 또는 "KO" 변이체라 불림)를 도시한다.
도 13은 본 발명의 2개의 특히 유용한 실시형태를 보여준다.
도 14a-14b는 성분으로서 하나 이상의 scFv를 사용하는 이종이합체성 항체의 pI를 증가시키거나 감소시키는 데 있어서 용도가 발견되는 다수의 하전된 scFv 링커를 도시한다. (+H) 포지티브 링커는 본 명세서에서 특정한 용도가 발견되고, 특히 항-CD3 vl 및 vh 서열은 본 명세서에 기재되어 있다. 단일 하전을 갖는 단일의 선행 기술 scFv 링커는 문헌[Whitlow et al., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993)]로부터 "Whitlow"라 불린다. 이 링커가 scFv에서 응집을 감소시키고 단백질분해 안정성을 증대시키는 데 사용된다는 것에 주목해야 한다.
도 15는 (HPLC-CIEX에 의해 결정된) 이종이합체 수율 및 (DSC에 의해 결정된) 열 안정성을 갖는 조작된 이종이합체-왜곡 Fc 변이체의 목록을 도시한다. 결정되지 않은 열 안정성이 "해당 없음"으로 표시된다.
도 16. 시험 물품은 항-PSMA 또는 항-RSV x 항-CD3 이중특이체이다. 상부 패널: 100k LNCaP 세포에 결합하는 세포 표면. 검출은 FITC 표지된 항-인간 IgG Fc 2차 항체에 의하였다. 하부 패널: 재지향된 T 세포 세포독성 검정, 24시간 항온처리, 10k LNCaP 세포, 400k 정제된 T 세포. 검출은 LDH에 의하였다.
도 17a 및 도 17b는 T 세포 반응 및 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome: CRS)이 원숭이에서의 표적 세포의 개입에 의존적이라는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 시아노몰거스 원숭이(n = 3)에게 XENP14484(항-PSMA x 항-CD3, 30㎍/㎏) 또는 XENP13245(항-RSV x CD3, 3㎎/㎏)의 단일 용량을 주었다. 도 17a: CD4+ T 세포 변연추향(margination)(상부 패널) 및 CD69 MFI에 의한 활성화(중간 패널)를 유세포분석법에 의해 조사하였다. IL-6 혈청 수치를 ELISA에 의해 조사하였다(하부 패널). 도 17b: CD8+ T 세포 변연추향(상부 패널) 및 CD69 MFI에 의한 활성화(중간 패널)를 유세포분석법에 의해 조사하였다. TNF 혈청 수치를 ELISA에 의해 조사하였다(하부 패널).
도 18은 본 발명의 실시형태에 대한 가능한 조합의 매트릭스를 보여준다. "A"는 언급된 항-CD3 서열의 CDR이 왼손 측에서 항-PSMA 작제물의 CDR과 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 예를 들어 상부 왼손 세포에 대해, 가변 중쇄 항-CD3 H1.30 서열로부터의 vhCDR 및 항-CD3 L1.47 서열의 가변 경쇄로부터의 vlCDR은 항-PSMA J591 H1_L1 서열로부터의 vhCDR 및 J591 H1_L1 서열로부터의 vlCDR과 조합될 수 있다(도 20 참조). "B"는 항-CD3 작제물로부터의 CDR이 항-PSMA 작제물로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인과 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 예를 들어 상부 왼손 세포에 대해, 가변 중쇄 항-CD3 H1.30 서열로부터의 vhCDR 및 항-CD3 L1.47 서열의 가변 경쇄로부터의 vlCDR은 가변 중쇄 도메인 J591 H1_L1 서열 및 J591 H1_L1 서열과 조합될 수 있다. "C"는 역전되어서, CD3 서열로부터의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 PSMA 서열의 CDR과 사용된다. "D"는 각각으로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘 다가 조합된 경우이다. "E"는 항-CD3의 scFv가 PSMA 항원 결합 도메인 작제물의 CDR과 사용된 경우이다. "F"는 CD3의 scFv가 PSMA 항원 결합 도메인의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인과 사용된 경우이다. "G"는 항-CD3 작제물의 CDR이 PSMA 작제물의 scFv와 사용된 경우이다. "H"는 항-CD3의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인이 항-PSMA의 scFv와 사용된 경우이다.
도 19는 완전 인간 PSMA, 인간 PSMA 세포외 도메인, 완전 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) PSMA 및 마카카 파시쿨라리스 PSMA 세포외 도메인을 포함하는 다양한 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 20은 비인간화된 항-PSMA 항체 J591 및 인간화된 항-PSMA 항체 J591 H1_L1의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 이 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 포함된 가변 중쇄(vhCDR1-3) 및 가변 경쇄(vlCDR1-3) 도메인의 상보성 결정 영역이 또한 도시된다. 몇몇 실시형태에서, 항-PSMA CDR 및 VH 및 VL은 본 명세서에 기재된 단일특이적 및 이종이합체 항체(예를 들어, 항-PSMA x 항-CD3) 항체에서 사용될 수 있다. 이종이합체성 항체가 항-CD3 결합 도메인을 추가로 포함하는 몇몇 실시형태에서, 항-CD3 결합 도메인은 도 5 내지 도 7에 도시된 임의의 VH, VL 또는 CDR을 포함할 수 있다.
도 21a-21e는 XENP14484(도 21a), XENP16873(도 21b), XENP16874(도 21c) 및 XENP19722(도 21d)를 포함하는, 본 명세서에 기재된 예시적인 항-PSMA x 항-CD3 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 도 22e는 예시적인 보틀 오프너 스캐폴드의 아미노산 서열을 도시한다. 이러한 스캐폴드는 본 명세서에 기재된 다양한 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인 및 scFv와 조합될 수 있다.
도 22는 항-PSMA x 항-CD3 항체 XENP14484 및 XENP19722의 PSMA 친화도(Kd) 결정을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 23은 LNCaP 전립선암 세포(LNCaP)에 대한 예시적인 항-PSMA x 항-CD3 항체 XENP14484 및 XENP19722의 결합(상부) 및 LNCaP 전립선암 세포주의 재지향된 T 세포 세포독성(redirected T cell cytotoxicity: RTCC)을 매개하는 이러한 예시적인 항체의 능력(하부)을 보여주는 그래프이다. 상부 패널: 100k LNCaP 세포에 대한 세포 표면 결합. 검출은 FITC 표지된 항-인간 IgG Fc 2차 항체에 의하였다. 하부 패널: 재지향된 T 세포 세포독성 검정, 밤샘 항온처리, 10k LNCaP 세포, 인간 PBMC로부터의 100k 정제된 T 세포. 검출은 LDH에 의하였다.
도 24는 CD3 친화도가 감소한 항-PSMA x 항-CD3 이중특이적 항체(XENP19722)가 CD3 친화도가 높은 항-PSMA x 항-CD3 이중특이적 항체(XENP14484)와 비교하여 유사한 T 세포 활성화(상부, 중간), 그러나 원숭이에서 더 낮은 CRS(하부)를 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 25a 내지 도 25d는 Fv 서열(예를 들어, Fab 사이드에 대한 vh 및 vl 및 scFv)이 없는 몇몇 유용한 보틀 오프너 포맷 골격의 서열을 보여준다. 당업자에 의해 이해되고 하기 기재된 바대로, 이 서열은 본 명세서에 기재된 임의의 vh 및 vl 쌍과 사용될 수 있고, 하나의 단량체는 (임의로 하전된 scFv 링커를 포함하는) scFv를 포함하고, 다른 단량체는 Fab 서열(예를 들어, "Fab 사이드 중쇄"에 부착된 vh 및 "불변 경쇄"에 부착된 vl)을 포함한다. scFv는 항-CD3 또는 항-TTA일 수 있고, Fab는 다른 하나이다. 즉, 이러한 서열의 CDR을 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 항-CD3 및 항-PSMA Fv 서열은 임의의 조합으로 이 도 25 골격으로 도입될 수 있다.
이 보틀 오프너 골격이 도 1b의 중앙-scFv 포맷에서 용도가 발견되고, 여기서 제1 Fab와 동일한 항원 결합을 갖는 추가의 제2 Fab(vh-CH1 및 vl-불변 경쇄)가 "보틀 오프너 사이드"에서 scFv의 N 말단에 첨가된다는 것에 주목해야 한다.
I. 정의
적용을 더 완전히 이해할 수 있도록, 몇몇 정의가 하기 기재되어 있다. 이러한 정의는 문법상 균등물을 포함하도록 의도된다.
"절제"란 본 명세서에서 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 따라서, 예를 들어, "FcγR 결합의 제거"는 Fc 영역 아미노산 변이체가 특이적 변이체를 함유하지 않는 Fc 영역과 비교하여 50% 미만의 출발 결합을 가진다는 것을 의미하고, 활성의 70-80-90-95-98% 미만의 소실이 바람직하고, 일반적으로, 활성은 Biacore 검정에서 검출 가능한 결합의 수준보다 낮다. 특히 FcγR 결합의 절제에서의 사용은 도 12에 도시된 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "ADCC" 또는 "항체 의존적 세포 매개된 세포독성"이란 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 발생시키는 세포 매개된 반응을 의미한다. ADCC는 FcγRIIIa에 대한 결합과 상관되고, FcγRIIIa에 대한 결합의 증가는 ADCC 활성을 증가시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "ADCP" 또는 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용이란 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 식세포작용을 발생시키는 세포 매개된 반응을 의미한다.
본 명세서에서 "변형"이란 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티에 대한 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본 명세서에서 "아미노산 변형"이란 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 명확성을 위해, 달리 기재되지 않은 한, 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 코딩하는 아미노산, 예를 들어 DNA 및 RNA에서 코돈을 갖는 20개의 아미노산에 대한 것이다.
본 명세서에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"이란 상이한 아미노산에 의한 모 폴리펩타이드 서열에서의 특정한 위치에서의 아미노산의 대체를 의미한다. 특히, 몇몇 실시형태에서, 치환은 특정한 위치에서 천연 발생이 아닌(유기체 내에 또는 임의의 유기체에서 천연 발생이 아닌) 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 E272Y는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우에 272번 위치에서의 글루탐산이 타이로신에 의해 대체된 Fc 변이체를 의미한다. 명확성을 위해, 핵산 코딩 서열을 변경시키도록 조작되지만, 출발 아미노산을 변화시키지 않는(예를 들어, 숙주 유기체 발현 수준을 증가시키도록 (아르기닌을 코딩하는) CGG를 (여전히 아르기닌을 코딩하는) CGA로 교환하는) 단백질은 '아미노산 치환"이 아니고, 즉 단백질이 이것이 시작한 특정한 위치에서 동일한 아미노산을 갖는 경우 동일한 단백질을 코딩하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 이것은 아미노산 치환이 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "아미노산 삽입" 또는 "삽입"이란 모 폴리펩타이드 서열에서의 특정한 위치에서의 아미노산 서열의 추가를 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 후 및 234번 위치 전의 글루탐산의 삽입을 지칭한다. 추가로, -233 ADE 또는 A233ADE는 233번 위치 후의 및 234번 위치 전의 AlaAspGlu의 삽입을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "아미노산 결실" 또는 "결실"이란 모 폴리펩타이드 서열에서의 특정한 위치에서의 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233# 또는 E233()은 233번 위치에서의 글루탐산의 결실을 지칭한다. 추가로, EDA233- 또는 EDA233#는 233번 위치에서 시작하는 서열 GluAspAla의 결실을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"란 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 모 단백질과 다른 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물 또는 이것을 코딩하는 아미노 서열을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 변형, 예를 들어 모 단백질과 비교하여 약 1개 내지 약 70개의 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 가진다. 하기 기재된 바대로, 몇몇 실시형태에서, 모 폴리펩타이드, 예를 들어 Fc 모 폴리펩타이드는 인간 야생형 서열, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 영역이지만, 변이체를 갖는 인간 서열은 또한 "모 폴리펩타이드", 예를 들어 이전에 개시된 바와 같은 IgG1/2 하이브리드로서 작용할 수 있다. 본 명세서에서 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성, 더 바람직하게는 적어도 약 95-98-99%의 동일성을 보유할 것이다. 변이체 단백질은 변이체 단백질 자체, 단백질 변이체를 포함하는 조성물 또는 이것을 코딩하는 DNA 서열을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 모 항체와 다른 항체를 의미하고, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 (다시, 많은 경우에, 인간 IgG 서열 유래의) 모 IgG와 다른 항체를 의미하고, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"이란 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 모 면역글로불린 서열과 다른 면역글로불린 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 Fc 도메인에서 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 한정된다. 따라서, 예를 들어 N434S 또는 434S는 모 Fc 폴리펩타이드에 대한 434번 위치에서 치환 세린을 갖는 Fc 변이체이고, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 마찬가지로, M428L/N434S는 모 Fc 폴리펩타이드에 대해 치환 M428L 및 N434S를 갖는 Fc 변이체를 한정한다. WT 아미노산의 동일성은 비규명될 수 있고, 이 경우에 상기 언급된 변이체는 428L/434S라 칭한다. 치환이 제공되는 순서가 임의이고, 즉 예를 들어 428L/434S가 M428L/N434S와 동일한 Fc 변이체이고, 기타 등등이라는 것에 주목한다. 항체에 관한 본 발명에 기재된 모든 위치에 대해, 달리 기재되지 않은 한, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. EU 인덱스 또는 카밧(Kabat) 또는 EU 넘버링 체계에서처럼 EU 인덱스는 EU 항체의 넘버링을 의미한다(Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85(본 명세서에 완전히 참고로 포함됨)). 변형은 부가, 결실 또는 치환일 수 있다. 치환은 천연 발생 아미노산 및, 몇몇 경우에, 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 예는 미국 특허 제6,586,207호; WO 제98/48032호; WO 제03/073238호; US 제2004-0214988A1호; WO 제05/35727A2호; WO 05/74524A2; 문헌[J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10](모두 완전히 참고로 포함됨)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단백질"은 본 명세서에서 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 적어도 2개의 공유결합으로 부착된 아미노산을 의미한다. 펩티딜기는 천연 발생 아미노산 및 펩타이드 결합 또는 합성 펩티도미메틱 구조, 즉 "유사체", 예컨대 펩토이드(peptoid)를 포함할 수 있다(문헌[Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992)](완전히 참고로 포함됨)을 참조한다). 아미노산은, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 천연 발생 또는 합성(예를 들어, DNA에 의해 코딩되는 아미노산이 아님)일 수 있다. 예를 들어, 호모-페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴 및 노르류신은 본 발명의 목적을 위해 합성 아미노산으로 생각되고, 아미노산으로 생각되는 D- 및 L-(R 또는 S) 둘 다를 사용할 수 있다. 본 발명의 변이체는 문헌[Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, 및 Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7](모두 완전히 참고로 포함됨)에 기재된 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 예를 들어 Schultz 및 동료가 개발한 기술을 이용하여 도입된 합성 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 게다가, 폴리펩타이드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글라이코실화, PEG화, 원순열, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합 및 펩타이드 태그 또는 라벨의 첨가를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "잔기"는 단백질에서의 위치 및 이의 연관된 아미노산 동일성을 의미한다. 예를 들어, (Asn297 또는 N297이라고도 칭하는) 아스파라긴 297은 인간 항체 IgG1에서의 297번 위치에서의 잔기이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fab는 단리에서의 이 영역, 또는 전장 항체, 항체 단편 또는 Fab 융합 단백질의 맥락에서의 이 영역을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"이란 단일 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이것은 일반적으로 2개의 사슬로 이루어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "IgG 하위클래스 변형" 또는 "아이소유형 변형"이란 하나의 IgG 아이소유형의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소유형에서 상응하는 아미노산으로 변환하는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 296번 위치에서 IgG1이 타이로신을 포함하고, IgG2가 페닐알라닌을 포함하므로, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 하위클래스 변형으로 생각된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "비천연 발생 변형"이란 아이소타입이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 중 어느 것도 434번 위치에서 세린을 포함하지 않으므로, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4(또는 이의 하이브리드)에서의 치환 434S는 비천연 발생 변형으로 생각된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "아미노산" 및 "아미노산 동일성"이란 DNA 및 RNA에 의해 코딩된 20개 중 1개의 천연 발생 아미노산을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "효과기 기능"이란 Fc 수용체 또는 리간드와의 항체 Fc 영역의 상호작용으로부터 생긴 생물학적 사건을 의미한다. 효과기 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "IgG Fc 리간드"란 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하도록 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, C1q, C3, 만난 결합, 렉틴, 만노스 수용체, 스타필로코커스 단백질 A, 스트렙토코커스 단백질 G 및 바이러스 FcγR을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 FcγR에 상동성인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 동족체(F receptor homolog: FcRH)를 포함한다(Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136(완전히 참고로 포함됨)). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 비발견된 분자를 포함할 수 있다. 특정한 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "Fc 리간드"란 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하도록 항체의 Fc 영역에 결합하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "Fc감마R"이란 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 코딩된 단백질의 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서, 이 패밀리는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIb-NAl 및 FcγRIIb-NA2 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65(완전히 참고로 포함됨)), 및 임의의 비발견된 인간 FcγR 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 유기체 유래일 수 있다. 마우스 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 임의의 비발견된 마우스 FcγR 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"란 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. FcRn은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 유기체 유래일 수 있다. 당해 분야에 공지된 바대로, 기능적 FcRn 단백질은 대개 중쇄 및 경쇄라 칭하는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 코딩된다. 본 명세서에서 달리 기재되지 않은 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 베타-2-마이크로글로불린과의 FcRn 중쇄의 복합체를 의미한다. 다양한 FcRn 변이체, 예컨대 428L/434S는 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키고, 몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혈청 반감기를 증가시키도록 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "모 폴리펩타이드"란 변이체를 생성하도록 후속하여 변형된 출발 폴리펩타이드를 의미한다. 모 폴리펩타이드는 천연 발생 폴리펩타이드, 또는 천연 발생 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 자체, 모 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "모 면역글로불린"이란 변이체를 생성하도록 변형된 비변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 의미하고, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "모 항체"란 변이체 항체를 생성하도록 변형된 비변형된 항체를 의미한다. "모 항체"가 하기 기재된 바와 같은 공지된 상업적인 재조합으로 제조된 항체를 포함한다는 것에 주목해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"이란 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 몇몇 경우에 힌지의 일부를 배제한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이 도메인에 대한 가요성 힌지 N 말단을 의미한다. IgA 및 IgM에 대해, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1(Cγ1)과 Cγ2(Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 카복실 말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되고, 여기서 넘버링은 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른다. 몇몇 실시형태에서, 하기 더 완전히 기재된 바대로, 예를 들어 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경하도록, Fc 영역에 아미노산 변형이 이루어진다.
본 명세서에서 "중쇄 불변 영역"이란 항체의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미한다.
본 명세서에서 "Fc 융합 단백질" 또는 "면역접합"이란, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 단백질에 대한 결합 모이어티와 같은, 일반적으로 (임의로 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커 모이어티를 통해) 상이한 단백질에 연결된 Fc 영역을 포함하는 단백질을 의미한다. 몇몇 경우에, 이종이합체성 항체의 하나의 단량체는 항체 중쇄(scFv를 포함하거나 추가로 경쇄를 포함)를 포함하고, 다른 단량체는 변이체 Fc 도메인 및 리간드를 포함하는 Fc 융합이다. 몇몇 실시형태에서, 이 "반 항체-반 융합 단백질"은 "융합체"라 불린다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "위치"란 단백질의 서열에서의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 포맷, 예를 들어 항체 넘버링에 대한 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "표적 항원"이란 소정의 항체의 가변 영역에 의해 특이적으로 결합된 분자를 의미한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화학 화합물일 수 있다. 넓은 수의 적합한 표적 항원이 하기 기재되어 있다.
본 명세서에서 본 발명의 이종이합체성 항체의 단량체의 맥락에서 "스트랜드니스(strandedness)"란, '일치하는' DNA의 2개의 가닥과 유사하게, 이종이합체를 형성하도록 '일치하는' 능력을 보존하도록 이종이합체화 변이체가 각각의 단량체로 도입된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 몇몇 pI 변이체가 (예를 들어, pI가 더 높게 하는) 단량체 A로 조작되는 경우, 또한 이용될 수 있는 "전하 쌍"인 입체 변이체는 pI 변이체를 방해하지 않고, 예를 들어 pI가 더 높게 하는 전하 변이체는 동일한 "가닥" 또는 "단량체"에 놓여서 작용성 둘 다를 보존한다. 유사하게, 하기 더 완전히 기재된 바와 같은 세트의 쌍에 들어온 "왜곡" 변이체에 대해, 숙련자는 쌍의 하나의 세트를 도입시키는 어떠한 가닥 또는 단량체가 진행하는지를 결정하는 데 pI를 고려하여서, pI 분리는 또한 왜곡의 pI를 사용하여 최대화된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "표적 세포"란 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "가변 영역"이란 각각 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전좌위를 구성하는 임의의 V.카파., V.람다. 및/또는 VH 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다.
본 명세서에서 "야생형 또는 WT"란 대립유전자 변이를 포함하는 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질은 고의적으로 변형되지 않는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합이다. "단리된"은, 본 명세서에 개시된 다양한 폴리펩타이드를 기재하도록 사용될 때, 세포 또는 이것이 발현된 세포 배양물로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 폴리펩타이드를 의미한다. 보통, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다. "재조합"은 항체가 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기법을 이용하여 생성된다는 것을 의미한다.
특정한 항원 또는 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 비특이적 상호작용으로부터 측정 가능하게 다른 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인, 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정한 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 적어도 약 10-4M, 적어도 약 10-5M, 적어도 약 10-6M, 적어도 약 10-7M, 적어도 약 10-8M, 적어도 약 10-9M, 대안적으로 적어도 약 10-10M, 적어도 약 10-11M, 적어도 약 10-12M, 또는 이것 초과의 항원 또는 에피토프에 대한 KD를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, 여기서 KD는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미한다. 통상적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 비해 대조군 분자에 대해 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 이것 초과인 KD를 가질 것이다.
또한, 특정한 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 대조군에 비해 에피토프에 대해 적어도 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 이것 초과의 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka를 갖는 항체에 의해 나타날 수 있고, 여기서 KA 또는 Ka는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 나타낸다.
II. 개관
표적화된 종양 세포를 공격하고 용해시키기 위하여 T 세포를 재지향시키도록 CD3 및 종양 항원 표적을 공동 개입시키는 이중특이적 항체가 설계되고 사용된다. 예는 CD3 및 종양 항원을 일가로 개입시키는 BiTE 및 DART 포맷을 포함한다. CD3 표적화 접근법이 상당한 가능성을 나타내지만, 이러한 치료의 흔한 부작용은 연관된 사이토카인의 생성이고, 이는 대개 독성 사이토카인 방출 증후군을 발생시킨다. 이중특이적 항체의 항-CD3 결합 도메인이 모든 T 세포를 개입시키므로, 높은 사이토카인 생성 CD4 T 세포 하위집단이 동원된다. 더욱이, CD4 T 세포 하위집단은 조절 T 세포를 포함하고, 이의 동원 및 증식은 잠재적으로 면역 억제를 발생시킬 수 있고, 장기간 종양 억제에 부정적인 영향을 가진다. 게다가, 이 포맷은 Fc 도메인을 함유하지 않고, 환자에서 매우 짧은 혈청 반감기를 나타낸다.
CD3 표적화 접근법이 상당한 장래성을 나타내지만, 이러한 치료의 흔한 부작용은 연관된 사이토카인의 생성이고, 이는 대개 독성 사이토카인 방출 증후군을 발생시킨다. 이중특이적 항체의 항-CD3 결합 도메인이 모든 T 세포를 개입시키므로, 높은 사이토카인 생성 CD4 T 세포 하위집단이 동원된다. 더욱이, CD4 T 세포 하위집단은 조절 T 세포를 포함하고, 이의 동원 및 증식은 잠재적으로 면역 억제를 발생시킬 수 있고, 장기간 종양 억제에 부정적인 영향을 가진다. 사이토카인 생성을 감소시키고 가능하게는 CD4 T 세포의 활성화를 감소시키는 하나의 이러한 가능한 방식은 CD3에 대한 항-CD3 도메인의 친화도를 감소시키는 것에 의한다.
따라서, 몇몇 실시형태에서 본 발명은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 결합하는 항원 결합 도메인과 조합하여 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 작제물을 제공한다.
더욱이, 몇몇 실시형태에서, 항-CD3 항원 결합 도메인은 CD3에 대한 "강한" 또는 "높은 친화도" 결합제(예를 들어, 하나의 예는 H1.30_L1.47로서 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(임의로 적절한 바대로 하전된 링커 포함)임)이고, 또한 PSMA에 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 CD3에 대한 "가벼운" 또는 "더 낮은 친화도" 결합제인 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 작제물을 제공한다. 추가의 실시형태는 또한 PSMA에 결합하는 CD3에 대한 중의 또는 "중간" 친화도를 갖는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 작제물을 제공한다. 친화도는 일반적으로 Biacore 검정을 이용하여 측정된다.
본 발명의 "고, 중, 저" 항-CD3 서열이 다양한 이종이합체화 포맷으로 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서의 개시내용의 대부분이 이종이합체의 "보틀 오프너" 포맷을 사용하지만, 이 가변 중쇄 및 경쇄 서열, 및 scFv 서열(및 이 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 Fab 서열)은 다른 포맷, 예컨대 WO 공보 제2014/145806호(이의 도면, 포맷 및 범례는 본 명세서에 명확히 참고로 포함됨)의 도 2에 도시된 것으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 2개의 상이한 항원에 결합하는 이종이합체성 항체를 제공하고, 예를 들어 항체는 이것이 2개의 상이한 표적 항원, 예를 들어 본 발명에서 CD3 및 PSMA에 결합한다는 점에서 "이중특이적"이다. 이 이종이합체성 항체는 이 표적 항원에 1가로(예를 들어, 단일 항원 결합 도메인, 예컨대 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 쌍이 존재함) 또는 2가로(항원에 각각 독립적으로 결합하는 2개의 항원 결합 도메인이 존재함) 결합할 수 있다. 본 발명의 이종이합체성 항체는 유사하게 하기 기재된 바대로 동종이합체로부터 멀리 이종이합체의 단순한 정제를 허용하는 "pI 변이체"와 커플링된, 하기 기재된 바대로 동종이합체에 비해 이종이합체의 형성을 "왜곡"시키는 아미노산 치환을 함유하는 상이한 단량체의 사용에 기초한다. 본 발명의 이종이합체성 이중특이적 항체에 대해, 본 발명은 일반적으로 이종이합체성 단백질을 생성하도록 생성 세포에서 자가 조립할 수 있는 조작된 또는 변이체 Fc 도메인의 사용, 및 이러한 이종이합체성 단백질을 생성하고 정제하는 방법에 의존한다.
III. 항체
본 발명은 CD3 및 PSMA에 결합하는 이중특이적 항체, 일반적으로 치료학적 항체의 생성에 관한 것이다. 하기 기재된 바대로, 용어 "항체"가 일반적으로 사용된다. 본 발명에서 용도가 발견되는 항체는 전통적인 항체를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 포맷, 및 본 명세서에 기재된 항체 유도체, 단편 및 모방체에서 취할 수 있다.
전통적인 항체 구조적 단위는 통상적으로 사합체를 포함한다. 각각의 사합체는 통상적으로 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(통상적으로 약 25kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중쇄"(통상적으로 약 50 내지 70kDa의 분자량을 가짐)를 가진다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 본 발명은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 몇몇 하위클래스를 갖는 IgG 클래스에 관한 것이다. IgG1이 356(D 또는 E) 및 358(L 또는 M)에서 다형을 갖는 상이한 알로타입을 가진다는 것에 주목해야 한다. 본 명세서에 도시된 서열은 356D/358M 알로타입을 이용하지만, 다른 알로타입은 본 명세서에 포함된다. 즉, 본 명세서에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 알로타입을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다.
게다가, 본 명세서에서의 많은 서열은 세린에 의해 대체된 220번 위치에서의 적어도 하나의 시스테인을 가지고, 일반적으로 이것은 본 명세서에 도시된 대부분의 서열에 대한 "scFv 단량체" 사이드에 있지만, 이것은 또한 다이설파이드 형성을 감소시키도록 "Fab 단량체" 사이드 또는 둘 다에 있을 수 있다. 대체된 이 시스테인 중 하나 또는 둘 다는 구체적으로 본 명세서에서 서열 내에 포함된다(C220S).
따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은, "아이소유형"은 이 불변 영역의 화학 및 항원 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위클래스를 의미한다. 치료학적 항체가 아이소유형 및/또는 하위클래스의 하이브리드를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 미국 공보 제2009/0163699호(참고로 포함됨)에 기재된 바대로, 본 발명은 IgG1/G2 하이브리드의 pI 조작을 포괄한다.
각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 당해 분야 및 본 명세서에서 "Fv 도메인" 또는 "Fv 영역"이라 일반적으로 칭하는, 항원 인식을 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 이것 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변 영역에서, 3개의 루프는 항원 결합 부위를 형성하도록 중쇄 및 경쇄의 각각의 V 도메인에 대해 모인다. 각각의 루프는, 아미노산 서열의 변이가 가장 유의미한, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region)(이하 "CDR"이라 칭함)이라 칭한다. "가변"은 가변 영역의 소정의 분절이 항체 중에서 서열에서 광범위하게 다르다는 사실을 의미한다. 가변 영역 내의 가변성은 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각의 9개 내지 15개 또는 이것 초과의 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라 불리는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15개 내지 30개의 아미노산의 프레임워크 영역(framework region: FR)이라 불리는 비교적 비변이체인 스트레치로 이루어진다.
각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 초가변 영역("상보성 결정 영역", "CDR") 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 약 24-34(LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)의 아미노산 잔기 및 중쇄 가변 영역에서 대략 약 31-35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로부터의 아미노산 잔기[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 및/또는 초가변 루프를 형성하는 이 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 26-32번(LCDR1), 50-52번(LCDR2) 및 91-96번(LCDR3) 잔기 및 중쇄 가변 영역에서 26-32번(HCDR1), 53-55번(HCDR2) 및 96-101번(HCDR3) 잔기[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]을 포괄한다. 본 발명의 구체적인 CDR은 하기 기재되어 있다.
당업자에 의해 이해되는 것처럼, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 중에서 다를 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열의 개시가 연관된 CDR의 개시내용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시는 vhCDR의 개시(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)이고, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시는 vlCDR의 개시(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)이다.
본 명세서에 걸쳐, 카밧 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서의 잔기(대략, 경쇄 가변 영역의 1 내지 107번 잔기 및 중쇄 가변 영역의 1 내지 113번 잔기) 및 Fc 영역에 대한 EU 넘버링 시스템(예를 들어, 상기 카밧 등의 문헌(1991))을 언급할 때 사용된다.
본 발명은 많은 수의 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이 경우에, "전체 CDR 세트"는 3개의 가변 경쇄 및 3개의 가변 중쇄 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이것은 각각 더 큰 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 도메인의 일부일 수 있다. 게다가, 본 명세서에 더 완전히 기재된 것처럼, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인은 중쇄 및 경쇄이 사용될 때(예를 들어, Fab가 사용될 때) 별개의 폴리펩타이드 사슬에, 또는 scFv 서열의 경우에 단일 폴리펩타이드 사슬에 있을 수 있다.
CDR은 항원 결합, 또는 더 구체적으로, 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프(paratope)로 공지된 항체 분자의 가변 영역에서의 특정한 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정부위를 의미한다. 에피토프는 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 그룹화이고, 보통 특정한 구조적 특징, 및 특정한 전하 특징을 가진다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다.
에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우세 성분이라고도 칭함) 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 구체적으로 항원 결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 즉 아미노산 잔기는 구체적으로 항원 결합 펩타이드의 풋프린트 내에 있다.
에피토프는 구성적 또는 선형일 수 있다. 구성적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간상 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 구성적 및 비구성적 에피토프는 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 소실된다는 점에서 구별될 수 있다.
에피토프는 통상적으로 독특한 공간상 입체배좌에서 적어도 3개, 더욱 보통, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 보여주는 단순한 면역검정, 예를 들어 "비닝(binning)"에서 검증될 수 있다.
각각의 사슬의 카복시 말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 한정한다. 카밧 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 다수의 1차 서열을 수집하였다. 서열의 보존의 정도에 기초하여, 이들은 개별 1차 서열을 CDR 및 프레임워크로 분류하고, 이의 목록을 만들었다(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.(전부 참고로 포함됨) 참조).
면역글로불린의 IgG 하위클래스에서, 중쇄에서 몇몇 면역글로불린 도메인이 존재한다. 본 명세서에서 "면역글로불린(Ig) 도메인"이란 구별되는 3차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 불변 중쇄(CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이 본 발명에서 관심 있다. IgG 항체의 맥락에서, IgG 아이소유형은 각각 3개의 CH 영역을 가진다. 따라서, IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 하기와 같다: "CH1"은 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른 118 내지 220번 위치를 의미하고. "CH2"는 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른 237 내지 340번 위치를 의미하고, "CH3"은 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른 341 내지 447번 위치를 의미한다. 본 명세서에 기재되고 하기 기재된 것처럼, pI 변이체는 CH 영역 중 하나 이상, 및 하기 기재된 힌지 영역에 있을 수 있다.
본 명세서에 도시된 서열이 CH1 영역, 118번 위치에서 시작하고, 가변 영역이 표시된 바대로 제외하고 포함되지 않는다는 것에 주목해야 한다. 예를 들어, 서열 목록에서 "1"번 위치로 지정되면서, 서열 번호 2의 제1 아미노산은 EU 넘버링에 따라 CH1 영역의 118번 위치에 상응한다.
중쇄의 Ig 도메인의 또 다른 유형은 힌지 영역이다. 본 명세서에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"이란 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 220번 위치에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 237번 위치에서 시작한다. 따라서, IgG에 대해 항체 힌지는 본 명세서에서 221번 위치(IgG1에서 D221) 내지 236번 위치(IgG1에서 G236)를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 넘버링은 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 Fc 영역의 맥락에서, 하부 힌지가 포함되고, "하부 힌지"는 일반적으로 226 또는 230번 위치를 의미한다. 본 명세서에 기재된 바대로, pI 변이체는 또한 힌지 영역에서 만들어질 수 있다.
경쇄는 일반적으로 가변 경쇄 도메인(Fv 영역을 형성하는 가변 중쇄 도메인과 함께 경쇄 CDR을 함유), 및 불변 경쇄 영역(대개 CL 또는 Cκ라 칭함)인 2개의 도메인을 포함한다.
하기 기재된 추가 치환에 관심 있는 또 다른 영역은 Fc 영역이다.
따라서, 본 발명은 상이한 항체 도메인을 제공한다. 본 명세서에 기재되고 당해 분야에 공지된 바대로, 본 발명의 이종이합체성 항체는 또한 중첩할 수 있는 중쇄 및 경쇄 내에 상이한 도메인을 포함한다. 이 도메인은 Fc 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 도메인, 중쇄 불변 도메인(CH1-힌지-Fc 도메인 또는 CH1-힌지-CH2-CH3), 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, FAb 도메인 및 scFv 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인 및 임의로 힌지 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 실시형태에서, scFv가 Fc 도메인에 부착될 때, 이것은 Fc 도메인의 힌지에 부착된 scFv 작제물의 C 말단이고, 예를 들어 이것은 일반적으로 힌지의 시작인 서열 EPKS에 부착된다. 중쇄는 CH2-CH3을 포함하는 CH1-임의의 힌지-Fc 도메인을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. scFv는 가변 중쇄, scFv 링커 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 대부분의 작제물 및 서열에서, 가변 경쇄의 C 말단은 scFv 링커의 N 말단에 부착되고, 이 링커의 C 말단은 가변 중쇄의 N 말단에 부착(N-vh-링커-vl-C)될 수 있지만, 전환될 수 있다(N-vl-링커-vh-C).
본 발명의 몇몇 실시형태는 천연 발생이 아니면서, scFv 링커에 의해 함께 연결된 일반적으로 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 적어도 하나의 scFv 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바대로, 재조합 기법에 의해 생성된 전통적인 펩타이드 결합을 포함하는 사용될 수 있는 다수의 적합한 scFv 링커가 존재한다.
링커 펩타이드는 Gly, Ser, Ala 또는 Thr의 아미노산 잔기를 주로 포함할 수 있다. 링커 펩타이드는 이들이 원하는 활성을 보유하도록 이들이 서로에 대해 정확한 구성을 띠는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다. 일 실시형태에서, 링커는 약 1개 내지 50개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 1개 내지 30개의 아미노산 길이이다. 일 실시형태에서, 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 링커를 사용할 수 있고, 약 5개 내지 약 10개의 아미노산이 몇몇 실시형태에서 용도가 발견된다. 유용한 링커는 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n(식 중, n은 적어도 1(및 일반적으로 3 내지 4)의 정수임), 글라이신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 다른 가요성 링커를 포함하는 글라이신-세린 중합체를 포함한다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리프로필렌 글라이콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글라이콜 및 폴리프로필렌 글라이콜의 공중합체(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 다양한 비단백질성 중합체는 링커로서 용도가 발견될 수 있다.
다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기가 아닌 CL/CH1 도메인의 임의의 길이의 임의의 서열, 예를 들어 CL/CH1 도메인의 제1의 5개 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 Cκ 또는 Cλ로부터 유래할 수 있다. 링커는 예를 들어 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε 및 Cμ를 포함하는 임의의 아이소유형의 면역글로불린 중쇄로부터 유래할 수 있다. 링커 서열은 또한 다른 단백질, 예컨대 Ig 유사 단백질(예를 들어, TCR, FcR, KIR), 힌지 영역 유래 서열, 및 다른 단백질로부터의 다른 천연 서열로부터 유래할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 2개의 도메인을 함께 연결하도록 사용된 "도메인 링커"이다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 실시형태는 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n(식 중, n은 적어도 1(및 일반적으로 3 내지 4 내지 5)의 정수임)을 포함하는 글라이신-세린 중합체, 및 각각의 도메인이 이의 생물학적 기능을 보유하도록 허용하는 허용하는 충분한 길이 및 가요성을 갖는 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩타이드 서열을 이용한다. 몇몇 경우에, 하기 기재된 바와 같은 "스트랜드니스"에 대해 주의를 기울이면서, scFv 링커의 몇몇 실시형태에서 사용된 바와 같은 하전된 도메인 링커를 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이고, 이의 다수는 도 14에 도시되어 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 제1 단량체와 제2 단량체 사이의 pI의 분리를 수월하게 하도록 하전된 scFv 링커를 제공한다. 즉, 양 또는 음(또는 상이한 단량체에서 scFv를 사용하는 스캐폴드의 경우에 둘 다)인 하전된 scFv 링커를 도입함으로써, 이는 Fc 도메인에서 추가의 변경을 만들지 않으면서 하전된 링커를 포함하는 단량체가 pI를 변경하도록 한다. 이 하전된 링커는 표준 링커를 함유하는 임의의 scFv로 치환될 수 있다. 다시, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 하전된 scFv 링커는 pI의 원하는 변경에 따라 정확한 "표준" 또는 단량체에서 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바대로, 삼중 F 포맷 이종이합체성 항체를 제조하기 위해, 각각의 원하는 항원 결합 도메인에 대한 Fv 영역의 원래의 pI는 계산되고, 하나는 scFv를 제조하도록 선택되고, pI에 따라, 양 또는 음인 링커가 선택된다.
하전된 도메인 링커는 또한 역시 본 발명의 단량체의 pI 분리를 증가시키도록 사용될 수 있고, 따라서 도 14에 포함된 것은 링커가 사용된 본 명세서에서 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 전장이다. 본 명세서에서 "전장 항체"란, 특히 동종이합체로부터 멀리 이종이합체화 형성 또는 이종이합체의 정제를 허용하도록 Fc 도메인에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함하는 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다. 전장 항체는 일반적으로 Fab 및 Fc 도메인을 포함하고, 일반적으로 도 1에 도시된 것처럼, 추가의 항원 결합 도메인, 예컨대 scFv를 추가로 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 pI 조작과 같은 이종이합체를 생성하도록 조작될 수 있는 적어도 하나의 불변 도메인을 함유하는 한 항체 단편이다. 사용될 수 있는 다른 항체 단편은 pI 조작된 본 발명의 CH1, CH2, CH3, 힌지 및 CL 도메인 중 하나 이상을 함유하는 단편을 포함한다. 예를 들어, Fc 융합은 또 다른 단백질에 융합된 Fc 영역(임의로 힌지 영역과, CH2 및 CH3)의 융합이다. 다수의 Fc 융합은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 이종이합체화 변이체의 첨가에 의해 개선될 수 있다. 본 경우에, 항체 융합은 본 명세서에 기재된 이종이합체화 변이체의 임의의 조합을 이용하여 CH1; CH1, CH2 및 CH3; CH2; CH3; CH2 및 CH3; CH1 및 CH3(이들 중 임의 또는 모두는 임의로 힌지 영역과 제조될 수 있음)을 포함하여 제조될 수 있다.
특히, 도 1에 도시된 포맷은 보통 "이종이합체성 항체"라 칭하는 항체이고, 이는 단백질이 이종이합체성 Fc 도메인으로 자가 조립된 적어도 2개의 연관된 Fc 서열을 가진다는 것을 의미한다.
키메라 및 인간화 항체
몇몇 실시형태에서, 항체는 상이한 종, 예를 들어 키메라 항체 및/또는 인간화 항체로부터의 혼합물일 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체" 둘 다는 하나 초과의 종으로부터의 영역을 조합하는 항체를 의미한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 전통적으로 마우스(또는 몇몇 경우에 랫트)로부터의 가변 영역(들) 및 인간으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로 인간 항체에서 발견되는 서열에 대해 스와핑되는 가변 도메인 프레임워크 영역을 갖는 비인간 항체를 의미한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되거나, 이의 CDR 내를 제외하고 이러한 항체에 동일하다. CDR(이의 일부 또는 전부는 비인간 유기체에서 유래한 핵산에 의해 코딩됨)은 항체(이의 특이성은 그래프팅된 CDR에 의해 결정됨)를 생성하도록 인간 항체 가변 영역의 베타 시트 프레임워크로 그래프팅된다. 이러한 항체의 생성은 예를 들어 WO 제92/11018호, 문헌[Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536](모두 완전히 참고로 포함됨)]에 기재되어 있다. 상응하는 도너 잔기에 대한 선택된 억셉터 프레임워크 잔기의 "역돌연변이"는 대개 초기 그래프팅된 작제물에서 소실된 친화도를 다시 얻기에 필요하다(US 제5530101호; US 제5585089호; US 제5693761호; US 제5693762호; US 제6180370호; US 제5859205호; US 제5821337호; US 제6054297호; US 제6407213호(모두 완전히 참고로 포함됨)). 인간화 항체는 최적으로 또한 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이고, 따라서 통상적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 유전적으로 조작된 면역계에 의해 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654(완전히 참고로 포함됨). 비인간 항체를 인간화하고 재성형하기 위한 다양한 기법 및 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(문헌[Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 및 여기 인용된 문헌](이들 모두 완전히 참고로 포함됨) 참조). 인간화 방법은 문헌[Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8](모두 완전히 참고로 포함됨)에 기재된 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키기 위한 인간화 또는 다른 방법은 예를 들어 문헌[Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sri. USA 91:969-973](완전히 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 리서페이싱(resurfacing) 방법을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 특정한 생식선 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정한 생식선 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체는 특정한 생식선 서열의 "생성물"이거나 이로부터 "유래한" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함하거나, 이것으로 이루어질 수 있다. 인간 생식선 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 이로부터 "유래한" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 서열에서 가장 가까운(즉, 가장 큰 퍼센트 동일성) 인간 생식선 면역글로불린 서열을 선택함으로써 식별될 수 있다. 특정한 인간 생식선 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 이로부터 "유래한" 인간 항체는 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위 지시된 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식선 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 인간화 항체는 통상적으로 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열에서 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식선 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 쥣과 생식선 서열)과 비교할 때, 인간 서열로부터 유래한 것으로 항체를 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우에, 인간화 항체는 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 통상적으로, 특정한 인간 생식선 서열로부터 유래한 인간화 항체는 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열로부터 10개 내지 20개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다(본 명세서에서 임의의 왜곡, pI 및 절제 변이체의 도입 전에, 즉, 변이체의 수가 본 발명의 변이체의 도입 전에 일반적으로 낮음). 소정의 경우에, 인간화 항체는 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열로부터 5개 이하, 또는 심지어 4개 이하, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다(다시, 본 명세서에서 임의의 왜곡, pI 및 절제 변이체의 도입 전에, 즉 변이체의 수가 본 발명의 변이체의 도입 전에 일반적으로 낮음).
일 실시형태에서, 모 항체는 당해 분야에 공지된 바대로 친화도 성숙된다. 구조 기반 방법은 예를 들어 USSN 제11/004,590호에 기재된 바대로 인간화 및 친화도 성숙에 사용될 수 있다. 선택 기반 방법은 문헌[Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759](모두 완전히 참고로 포함됨)에 기재된 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 항체 가변 영역을 인간화 및/또는 친화도 성숙시키도록 사용될 수 있다. 다른 인간화 방법은 USSN 제09/810,510호; 문헌[Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084](모두 완전히 참고로 포함됨)에 기재된 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 CDR의 오직 일부의 그래프팅을 수반할 수 있다.
IV. 이종이합체성 항체
따라서, 몇몇 실시형태에서 본 발명은 이종이합체성 항체를 형성하도록 자가 조립하는 2개의 상이한 중쇄 변이체 Fc 도메인의 사용에 의존하는 이종이합체성 항체를 제공한다.
본 발명은, 예를 들어 이중특이적 결합을 허용하도록, 하나 초과의 항원 또는 리간드에 대한 결합을 허용하는 이종이합체성 항체를 제공하도록 신규한 작제물에 관한 것이다. 이종이합체성 항체 작제물은 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인의 자가 조립 성질, 예를 들어 "이합체"로 조립하는 2개의 "단량체"에 기초한다. 이종이합체성 항체는 하기 더 자세히 기재된 바대로 각각의 단량체의 아미노산 서열을 변경함으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 일반적으로, 이종이합체성 형성을 촉진하고/하거나, 동종이합체에 비해 이종이합체의 정제의 용이성을 허용하도록, 각각의 사슬에서 다른 불변 영역의 아미노산 변이체에 의존하여, 몇몇 방식으로 항원을 동시 개입시키는 이종이합체성 항체의 생성에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공한다. 항체 기술에서의 진행중인 문제점은 2개의 상이한 항원에 동시에 결합하는 "이중특이적" 항체에 대한 요망이어서, 일반적으로 상이한 항원이 근접하게 하면서 새로운 작용성 및 새로운 치료제에서 생성되게 허용한다. 일반적으로, 숙주 세포로 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 포함시킴으로써 이 항체를 제조한다. 이것은 일반적으로 원하는 이종이합체(A-B), 및 2개의 동종이합체(A-A 및 B-B(경쇄 이종이합체성 논쟁을 포함하지 않음))를 형성시킨다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성에서의 주요 장애는 동종이합체성 항체로부터 멀리 이종이합체성 항체를 정제하는 것 및/또는 동종이합체의 형성에 비해 이종이합체의 형성을 바이어싱하는 것의 어려움이다.
본 발명의 이종이합체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 기전이 존재한다. 게다가, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 기전은 높은 이종이합체화를 보장하도록 조합될 수 있다. 따라서, 이종이합체를 생성시키는 아미노산 변이체는 "이종이합체화 변이체"라 칭한다. 하기 기재된 바대로, 이종이합체화 변이체는 입체 변이체(예를 들어, 하기 기재된 "손잡이 및 홀" 또는 "왜곡" 변이체 및 하기 기재된 "전하 쌍" 변이체), 및 이종이합체로부터 멀리 동종이합체의 정제를 허용하는 "pI 변이체"를 포함할 수 있다. 일반적으로 WO 제2014/145806호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되고, 구체적으로 "이종이합체화 변이체"의 토의에 대해 하기 기재된 바대로, 이종이합체화에 유용한 기전은 "손잡이 및 홀"("KIH"; 때때로 본 명세서에서 "왜곡" 변이체(WO 제2014/145806호에서의 토의 참조)라 칭함, WO 제2014/145806호에 기재된 바와 같은 "정전기 스티어링" 또는 "전하 쌍", WO 제2014/145806호에 기재된 바와 같은 pI 변이체, 및 WO 제2014/145806호 및 하기에 기재된 바와 같은 일반적인 추가 Fc 변이체를 포함한다.
본 발명에서, 이종이합체성 항체를 정제하는 것을 쉽게 할 수 있는 몇몇 기본적인 기전이 존재하고, 하나는 pI 변이체의 사용에 의존하여서, 각각의 단량체는 상이한 pI를 가져서, A-A, A-B 및 B-B 이합체성 단백질의 등전점 정제를 허용한다. 대안적으로, 몇몇 스캐폴드 포맷, 예컨대 "삼중 F" 포맷은 또한 크기에 기초한 분리를 허용한다. 하기 추가로 기재된 것처럼, 동종이합체에 비해 이종이합체의 형성을 또한 "왜곡"시킬 수 있다. 따라서, 입체 이종이합체화 변이체 및 pI 또는 하전 쌍 변이체의 조합은 본 명세서에서 특정한 용도가 발견된다.
일반적으로, 본 발명에서 특정한 용도의 실시형태는, 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 증가시키는, pI 변이체와 커플링된, 동종이합체화 형성에 비해 이종이합체화 형성을 장려하는, 왜곡 변이체를 포함하는 변이체의 세트에 의존한다.
추가로, 하기 더 완전히 기재된 것처럼, 이종이합체 항체의 포맷에 따라, pI 변이체는 단량체의 불변 및/또는 Fc 도메인 내에 포함될 수 있거나, 도메인 링커 또는 scFv 링커인 하전된 링커를 사용할 수 있다. 즉, scFv(들), 예컨대 삼중 F 포맷을 이용하는 스캐폴드는, 정제 목적을 위해 추가의 pI 부스트를 제공하는, 하전된 scFv 링커(양 또는 음)를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 몇몇 삼중 F 포맷은 추가의 pI 조정 없이 단지 하전된 scFv 링커에 의해 유용하지만, 본 발명은 단량체 중 하나 또는 둘 다인 pI 변이체, 및/또는 하전된 도메인 링커를 또한 제공한다. 게다가, 대안적인 작용성에 대한 추가 아미노산 조작은 또한 pI 변경, 예컨대 Fc, FcRn 및 KO 변이체를 부여할 수 있다.
이종이합체성 단백질의 정제를 허용하는 분리 기전으로서 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변이체는 단량체 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다로 도입될 수 있고, 즉 (본 명세서에서 단순함을 위해 "단량체 A"라 칭하는) 단량체의 하나의 pI는 단량체 B로부터 멀리 조작될 수 있거나, 단량체 A의 pI는 증가하고 단량체 B의 pI는 감소하여 단량체 A 및 B 변경 둘 다는 변경된다. 하기 더 완전히 기재된 바대로, 어느 하나 또는 둘 다의 단량체의 pI 변경은 하전된 잔기를 제거 또는 첨가(예를 들어, 중성 아미노산은 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체됨, 예를 들어 글루탐산으로의 글라이신), 양 또는 음으로부터의 하전된 잔기를 반대 전하로 변경(라이신으로의 아스파르트산) 또는 중성 잔기로 하전된 잔기를 변경(예를 들어, 전하의 소실; 세린으로의 라이신)함으로써 수행될 수 있다. 다수의 이 변이체는 도면에 도시되어 있다.
따라서, 본 발명의 이 실시형태는 이종이합체가 동종이합체로부터 분리될 수 있도록 적어도 하나의 단량체에서의 pI의 충분한 변경을 생성하기 위해 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 하기 추가로 기재된 것처럼, 이것은 "야생형" 중쇄 불변 영역 및 이의 pI를 증가시키거나 감소시키도록 조작된 변이체 영역(wt A- +B 또는 wt A- -B)을 사용함으로써, 또는 하나의 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시킴으로써(A+ -B- 또는 A- B+) 수행될 수 있다.
따라서, 일반적으로, 본 발명의 몇몇 실시형태의 성분은, 단량체의 하나 또는 둘 다로 아미노산 치환("pI 변이체" 또는 "pI 치환")을 도입함으로써, "pI 항체"를 형성하도록 이합체성 단백질의 단량체의 둘 다가 아닌, 적어도 하나의 등전점(pI)을 변경하는 것에 관한 항체의 불변 영역에서의 아미노산 변이체이다. 본 명세서에 기재된 바대로, 2개의 동종이합체로부터의 이종이합체의 분리는 2개의 단량체의 pI가 0.1 pH 단위만큼 작게 다른 경우 달성될 수 있고, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 또는 이것 초과는 모두 본 발명에서 용도가 발견된다.
당업자가 이해하는 것처럼, 양호한 분리를 얻도록 단량체(들)의 각각 또는 둘 다에 포함되는 pI 변이체의 수는 예를 들어 삼중 F 포맷에서의 성분의 출발 pI, 관심 있는 scFv 및 Fab의 출발 pI에 부분적으로 의존할 것이다. 즉, 조작하기 위한 어떤 단량체 또는 어떤 "방향"인지(예를 들어, 더 양성 또는 더 음성)를 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열을 계산하고, 여기로부터 결정을 한다. 당해 분야에 공지된 바대로, 상이한 Fv는 본 발명에 의해 이용되는 상이한 출발 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 바대로, pI는 적어도 약 0.1 log의 각각의 단량체의 전체 pI 차이를 발생시키도록 조작되고, 0.2 내지 0.5가 본 명세서에 기재된 바대로 바람직하다.
더욱이, 당업자에 의해 이해되고 본 명세서에 기재된 바대로, 몇몇 실시형태에서, 이종이합체는 크기에 기초하여 동종이합체로부터 분리될 수 있다. 도 1에 도시된 바대로, 예를 들어, 몇몇 포맷은 크기에 기초한 이종이합체 및 동종이합체의 분리를 허용한다.
중쇄(들)의 불변 영역(들)을 사용함으로써 이종이합체화를 달성하도록 pI 변이체를 사용하는 경우에, 항체를 포함하는 이중특이적 단백질을 설계하고 정제하기 위한 더 모듈식인 접근법이 제공된다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 이종이합체화 변이체(왜곡 및 정제 이종이합체화 변이체 포함)는 가변 영역에 포함되지 않아서, 각각의 개별 항체가 조작되어야 한다. 게다가, 몇몇 실시형태에서, pI 변이체로부터 생긴 면역원성의 가능성은 상이한 IgG 아이소유형으로부터 pI 변이체를 들여옴으로써 유의미하게 감소하여서, 유의미한 면역원성을 도입하지 않으면서 pI가 변한다. 따라서, 해결되어야 하는 추가의 문제점은 높은 인간 서열 함량을 갖는 낮은 pI 불변 도메인의 설명, 예를 들어 임의의 특정한 위치에서 비인간 잔기의 최소화 또는 회피이다.
이 pI 조작에 의해 발생할 수 있는 부수 이익은 또한 혈청 반감기의 연장 및 증가한 FcRn 결합이다. 즉, USSN 제13/194,904호(전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바대로, 항체 불변 도메인(항체 및 Fc 융합에서 발견되는 것 포함)의 pI의 저하는 생체내 더 긴 혈청 보유를 발생시킬 수 있다. 증가한 혈청 반감기에 대한 이 pI 변이체는 또한 정제에 대한 pI 변경을 쉽게 한다.
게다가, 동종이합체가 존재할 때 제거하고 최소화하고 구별하는 능력이 상당하면서, 이종이합체화 변이체의 pI 변이체가 이중특이적 항체의 분석 및 품질 제어 공정에 대한 추가 이익을 제공한다는 것에 주목해야 한다. 유사하게, 이종이합체성 항체 생성의 재현가능성을 신뢰성 있게 시험하는 능력이 중요하다.
이종이합체화 변이체
본 발명은 동종이합체로부터 멀리 이종이합체성 형성 및/또는 정제를 허용하도록 이종이합체성 변이체를 사용하는 다양한 포맷에서 이종이합체성 항체를 포함하는 이종이합체성 단백질을 제공한다.
이종이합체화 왜곡 변이체의 세트의 다수의 적합한 쌍이 존재한다. 이 변이체는 "세트"의 "쌍"에 들어온다. 즉, 쌍의 하나의 세트는 제1 단량체로 도입되고, 쌍의 다른 세트는 제2 단량체로 도입된다. 이 세트가 하나의 단량체에서의 잔기와 다른 것에서의 잔기 사이의 일 대 일 대응으로 "홀에서의 손잡이" 변이체로서 반드시 거동하지는 않는다는 것에 주목해야 하고, 즉 이 세트의 이 쌍은, 예상된 50%보다는 90%이도록(25% 동종이합체 A/A: 50% 이종이합체 A/B: 25% 동종이합체 B/B) 생물학적 조건 하에 자발적으로 형성하는 이종이합체의 백분율을 허용하면서, 이종이합체 형성을 장려하고 동종이합체 형성을 단념시키는, 2개의 단량체 사이의 계면을 형성한다.
입체 변이체
몇몇 실시형태에서, 이종이합체의 형성은 입체 변이체의 첨가에 의해 수월해질 수 있다. 즉, 각각의 중쇄에서의 아미노산을 변경함으로써, 상이한 중쇄는 동일한 Fc 아미노산 서열과 동종이합체를 형성하기보다 이종이합체성 구조를 형성하도록 좀 더 회합할 것 같다. 적합한 입체 변이체는 도 10에 포함된다.
하나의 기전은 일반적으로 당해 분야에서 이종이합체성 형성을 선호하고 동종이합체 형성을 선호하지 않는 입체적인 영향을 생성하는 아미노산 조작을 의미하는, 임의로 또한 사용될 수 있는, "손잡이 및 홀"이라 불리고, 이것은 때때로 USSN 제61/596,846호, 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26]; 미국 특허 제8,216,805호(이들 모두 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 "손잡이 및 홀"이라 불린다. 도면은 "손잡이 및 홀"에 의존하는 다수의 "단량체 A - 단량체 B" 쌍을 확인한다. 게다가, 문헌[Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)]에 기재된 바대로, 이 "손잡이 및 홀" 돌연변이는 이종이합체화에 대한 왜곡 형성에 대한 다이설파이드 결합과 조합될 수 있다.
이종이합체의 생성에서 용도가 발견되는 추가 기전은 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)](본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨]에 기재된 바와 같이 때때로 "정전기 스티어링"이라 칭한다. 이것은 때때로 본 명세서에서 "전하 쌍"이라 칭한다. 이 실시형태에서, 정전기학은 이종이합체화를 향한 형성을 왜곡시키도록 사용된다. 당업자가 이해하는 것처럼, 이것은 또한 pI, 이에 따라 정제에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 몇몇 경우에 또한 pI 변이체인 것으로 생각될 수 있다. 그러나, 이것이 이종이합체화를 강제하도록 생성되고, 정제 도구로서 사용되지 않으면서, 이것은 "입체 변이체"로 분류된다. 이것은 D221R/P228R/K409R과 쌍 지은 D221E/P228E/L368E(예를 들어, 이것은 "단량체 상응하는 세트"임) 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍 지은 C220E/P228E/368E를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가의 단량체 A 및 단량체 B 변이체는 임의로 및 독립적으로 다른 변이체, 예컨대 본 명세서에 기재된 pI 변이체 또는 US 제2012/0149876호의 도 37에 도시된 다른 입체 변이체(이의 도면 및 범례 및 서열 번호는 본 명세서에 명확히 참고로 포함됨)와 임의의 양으로 조합될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 입체 변이체는 임의의 pI 변이체(또는 다른 변이체, 예컨대 Fc 변이체, FcRn 변이체 등)에 의해 하나 또는 둘 다의 단량체로 임의로 및 독립적으로 도입될 수 있고, 본 발명의 단백질로부터 독립적으로 및 임의로 포함되거나 배제될 수 있다.
적합한 왜곡 변이체의 목록은 도 10에서 발견되고, 도 15는 많은 실시형태에서 특정한 유용성의 몇몇 쌍을 보여준다. 특히 많은 실시형태에서 하기(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 세트의 쌍이 사용되고, 특히 바람직한 입체 변이체 쌍은 L368D/K370S:S364K, L368E/K370S:S364K, T411E/K360E/Q362E:D401K, L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q 및 S364K/E357Q:L368D/ 370S를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 명명의 면에서, 쌍 "S364K/E357Q: L368D/K370S"는 단량체 중 하나가 이중 변이체 세트 S364K/E357Q를 가지고 다른 하나가 이중 변이체 세트 L368D/K370S를 가진다는 것을 의미한다.
이종이합체에 대한 pI ( 등전점 ) 변이체
일반적으로, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, pI 변이체의 2개의 일반적인 카테고리가 존재한다: 단백질의 pI를 증가시키는 것(염기성 변경) 및 단백질의 pI를 감소시키는 것(산성 변경). 본 명세서에 기재된 바대로, 이들 변이체의 모든 조합은 수행될 수 있고, 하나의 단량체는 야생형, 또는 야생형과 다른 유의미하게 상이한 pI를 나타내지 않는 변이체일 수 있고, 다른 하나는 더 염기성 또는 더 산성일 수 있다. 대안적으로, 각각의 단량체는 하나가 더 염기성이고 하나가 더 산성이도록 변경된다.
pI 변이체의 바람직한 조합은 도 11에 도시되어 있다. 본 명세서에 기재되고 도면에 도시된 것처럼, 이 변경은 IgG1에 대해 도시되어 있지만, 모든 아이소유형, 및 아이소유형 하이브리드는 이러한 반식으로 변경될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2-4 유래인 경우, R133E 및 R133Q가 또한 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 예를 들어 보틀 오프너 포맷에서, pI 변이체의 바람직한 조합은 208D/295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 대한 것일 때 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함하는 하나의 단량체(음의 Fab 사이드) 및 (GKPGS)4를 포함하는 양으로 하전된 scFv 링커를 포함하는 제2 단량체(양의 scFv 사이드)를 가진다. 그러나, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 제1 단량체는 208번 위치를 포함하는 CH1 도메인을 포함한다. 따라서, (예를 들어, 이중 scFv 포맷에서 도메인 중 하나에 CH1 도메인을 이용하지 않는 예를 들어 이종이합체성 Fc 융합 단백질에 대해) CH1 도메인을 포함하지 않는 작제물에서, 바람직한 네가티브 pI 변이체 Fc 세트는 295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 대한 것일 때 Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함한다.
항체 이종이합체 경쇄 변이체
항체 기반 이종이합체의 경우에, 예를 들어 적어도 하나의 단량체가 중쇄 도메인 이외에 경쇄를 포함할 때, pI 변이체는 또한 경쇄로 제조될 수 있다. 경쇄의 pI를 저하시키기 위한 아미노산 치환은 K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E 및 경쇄의 c 말단에서의 추가 펩타이드 DEDE를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 불변 람다 경쇄에 기초한 이 카테고리의 변경은 R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T 및 Q199E에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 게다가, 경쇄의 pI의 증가를 또한 수행할 수 있다.
아이소타입 변이체
게다가, 본 발명의 많은 실시형태는 하나의 IgG 아이소유형으로부터 또 다른 것으로 특정한 위치에서 pI 아미노산의 "유입"에 의존하여서, 변이체로 도입되는 원치 않는 면역원성의 가능성을 감소시키거나 제거한다. 다수의 이들은 미국 공보 제2014/0370013호(본 명세서에 참고로 포함됨)의 도 21에 도시되어 있다. 즉, IgG1은 높은 효과기 기능을 포함하는 다양한 이유로 치료학적 항체에 대한 공통 아이소유형이다. 그러나, IgG1의 중쇄 불변 영역은 IgG2의 것보다 높은 pI를 가진다(8.10 버전 7.31). IgG1 골격으로 특정한 위치에서 IgG2 잔기를 도입함으로써, 생성된 단량체의 pI는 저하(또는 증가)되고, 추가로 더 긴 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, IgG1은 137번 위치에서 글라이신을 가지고(pI 5.97), IgG2는 글루탐산을 가지고(pI 3.22), 글루탐산의 유입은 생성된 단백질의 pI에 영향을 미칠 것이다. 하기 기재된 바대로, 다수의 아미노산 치환은 일반적으로 변이체 항체의 pI에 유의미하게 영향을 미치도록 필요하다. 그러나, 하기 기재된 바대로 심지어 IgG2 분자의 변경이 증가한 혈청 반감기를 허용한다는 것에 주목해야 한다.
다른 실시형태에서, (예를 들어, 더 높은 pI 아미노산을 더 낮은 pI 아미노산으로 변경함으로써) 생성된 단백질의 전체 전하 상태를 감소시키도록, 또는 하기 더 추가로 기재된 것처럼, 안정성 등을 위해 구조의 수용을 허용하도록 비아이소타입 아미노산 변경이 이루어진다.
게다가, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 둘 다를 pI 조작함으로써, 이종이합체의 각각의 단량체의 유의미한 변경이 보일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바대로, 적어도 0.5만큼 다른 2개의 단량체의 pI를 갖는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 맞춤, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다.
pI의 계산
각각의 단량체의 pI는 변이체 중쇄 불변 도메인의 pI 및 변이체 중쇄 불변 도메인 및 융합 파트너를 포함하는 전체 단량체의 pI에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, pI의 변경은 미국 공보 제2014/0370013호의 도 19에서의 챠트를 사용하여 변이체 중쇄 불변 도메인에 기초하여 계산된다. 본 명세서에 기재된 바대로, 어떤 단량체를 조작할지는 일반적으로 Fv 및 스캐폴드 영역의 고유한 pI에 의해 결정된다. 대안적으로, 각각의 단량체 pI는 비교될 수 있다.
더 양호한 FcRn 생체내 결합을 부여할 수 있는 pI 변이체
pI 변이체가 단량체의 pI를 감소시키는 경우에, 이것은 생체내 혈청 보유를 개선하는 추가 이익을 가질 수 있다.
여전히 실험 중이지만, 엔도솜에서의 pH 6에서 FcRn에 대한 결합이 Fc를 봉쇄하므로, Fc 영역은 생체내 더 긴 반감기를 가진다고 생각된다(Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598(완전히 참고로 포함됨)). 이후, 엔도솜 구획은 Fc를 세포 표면으로 재순환시킨다. 구획이 세포외 공간에 개방하면, 약 7.4인 더 높은 pH는 혈액으로 다시 Fc의 방출을 유도한다. 마우스에서, Dall' Acqua 등은 pH 6 및 pH 7.4에서 증가한 FcRn 결합을 갖는 Fc 돌연변이체가 실제로 야생형 Fc와 동일한 반감기 및 감소한 혈청 농도를 갖는다는 것을 보여주었다(Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180(완전히 참고로 포함됨)). pH 7.4에서의 FcRn에 대한 Fc의 친화도의 증가는 혈액으로 다시 Fc의 방출을 금지한다고 생각된다. 따라서, 생체내 Fc의 반감기를 증가시키는 Fc 돌연변이는, 더 높은 pH에서 Fc의 방출을 여전히 허용하면서, 이상적으로는 더 낮은 pH에서 FcRn 결합을 증가시킬 것이다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에서 이의 전하를 변경시킨다. 따라서, Fc/FcRn 복합체에서 중요한 위치에서 His 잔기를 발견하는 것은 놀랍지 않다.
최근에, 더 낮은 등전점을 갖는 가변 영역을 갖는 항체가 또한 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다는 것이 제안되었다(Igawa et al., 2010 PEDS. 23(5): 385-392(완전히 참고로 포함됨)). 그러나, 이것의 기전은 여전히 불량하게 이해된다. 더욱이, 가변 영역은 항체마다 다르다. 감소한 pI 및 연장된 반감기를 갖는 불변 영역 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 약동학적 특성을 개선시키는 것의 더 모듈식 접근법을 제공할 것이다.
추가의 작용기에 대한 추가의 Fc 변이체
pI 아미노산 변이체 이외에, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합의 변경, FcRn 수용체에 대한 결합의 변경 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 이유로 만들어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 아미노산 변형이 존재한다.
따라서, 본 발명의 단백질은 pI 변이체 및 입체 변이체를 포함하는 본 명세서에 기재된 이종이합체화 변이체를 포함하는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 변이체의 각각의 세트는 독립적으로 및 임의로 임의의 특정한 이종이합체성 단백질로부터 포함되거나 배제될 수 있다.
FcγR 변이체
따라서, FcγR 수용체의 하나 이상에 대한 결합을 변경하도록 이루어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 치환이 존재한다. 결합의 증가, 및 결합의 감소를 발생시키는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 결합의 증가가 일반적으로 ADCC(항체 의존적 세포 매개된 세포독성; FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 발생시키는 세포 매개된 반응)의 증가를 발생시킨다는 것이 공지되어 있다. 유사하게, FcγRIIb(저해 수용체)에 대한 결합의 감소는 또한 몇몇 상황에서 유리할 수 있다. 본 발명에서 용도가 발견되는 아미노산 치환은 USSN 제11/124,620호(특히 도 41), 제11/174,287호, 제11/396,495호, 제11/538,406호(이들 모두 본 명세서에 그 전문이 명확히 참고로 포함됨)에 기재된 것 및 구체적으로 여기에 개시된 변이체에 대한 것을 포함한다. 용도가 발견되는 특정한 변이체는 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243 A, 243L, 264A, 264V 및 299T를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
게다가, 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I 또는 V/434S, 436V/428L 및 259I/308F/428L(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, USSN 제12/341,769호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 구체적으로 개시된 바와 같은, FcRn 수용체에 대한 결합의 증가 및 혈청 반감기의 증가에서 용도가 발견되는 추가 Fc 치환이 존재한다.
절제 변이체
유사하게, 기능성 변이체의 또 다른 카테고리는 "FcγR 절제 변이체" 또는 "Fc 넛아웃(FcKO 또는 KO)" 변이체이다. 이 실시형태에서, 몇몇 치료학적 분야에 대해, 추가 작용 기전을 피하도록 FcγR 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등) 중 하나 이상 또는 모두에 대한 Fc 도메인의 일반 결합을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어 많은 실시형태에서, 특히 CD3에 1가로 결합하는 이중특이적 항체의 사용에서, ADCC 활성을 제거하거나 유의미하게 감소시키도록 FcγRIIIa 결합을 절제하는 것이 일반적으로 바람직하고, 여기서 Fc 도메인 중 하나는 하나 이상의 FcγR 수용체 절제 변이체를 포함한다. 이 절제 변이체는 도 12에 도시되어 있고, 각각은 독립적으로 및 임의로 포함되거나 배제될 수 있고, 바람직한 양태는 G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 및 E233P/L234V/L235A/G236del로 이루어진 군으로부터 선택된 절제 변이체를 이용한다. 본 명세서에서 언급된 절제 변이체가 일반적으로 FcRn 결합이 아니라 FcγR 결합을 절제한다는 것에 주목해야 한다.
이종이합체성 및 Fc 변이체의 조합
당업자에 의해 이해되는 것처럼, 모든 언급된 이종이합체화 변이체(왜곡 및/또는 pI 변이체 포함)는 이의 "스트렌드니스" 또는 "단량체 파티션"을 보유하는 한 임의의 방식으로 임의로 및 독립적으로 조합될 수 있다. 게다가, 모든 이들 변이체는 임의의 이종이합체화 포맷으로 조합될 수 있다.
pI 변이체의 경우에, 특정한 용도가 발견된 실시형태가 도면에 도시되어 있는 한편, 정제를 수월하게 하도록 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 변경하는 기본 규칙에 따라 다른 조합이 생성될 수 있다.
게다가, 왜곡 및 pI인, 임의의 이종이합체화 변이체는 일반적으로, 본 명세서에 기재된 바대로, Fc 절제 변이체, Fc 변이체, FcRn 변이체와 또한 독립적으로 및 임의로 조합될 수 있다.
본 발명의 유용한 포맷
당업자에 의해 이해되고 하기 더 완전히 기재된 것처럼, 본 발명의 이종이합체성 융합 단백질은, 일반적으로 도 1에 도시된 바대로, 매우 다양한 구성에서 취해질 수 있다. 몇몇 도면은 분자의 하나의 "아암"에 하나의 유형의 특이성 및 다른 "아암"에 상이한 특이성이 있는 "단일 말단" 구성을 도시한다. 다른 도면은 분자의 "상부"에 적어도 하나의 유형의 특이성 및 분자의 "하부"에 하나 이상의 상이한 특이성이 있는 "이중 말단" 구성을 도시한다. 따라서, 본 발명은 상이한 제1 항원 및 제2 항원을 동시 개입시키는 신규한 면역글로불린 조성물에 관한 것이다.
당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명의 이종이합체성 포맷은 상이한 원자가, 및 이중특이체를 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 이종이합체성 항체는 2가 및 이중특이적일 수 있고, 여기서 CD3은 하나의 결합 도메인에 의해 결합되고, PSMA는 제2 결합 도메인에 의해 결합된다. 이종이합체성 항체는 또한 3가 및 이중특이적일 수 있고, 여기서 PSMA는 2개의 결합 도메인에 의해 결합되고, CD3은 제2 결합 도메인에 의해 결합된다. 본 명세서에 기재된 바대로, CD3이 오직 1가로 결합하여서, 잠재적인 부작용을 감소시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 항-CD3 항원 결합 도메인 및 항-PSMA 항원 결합 도메인을 이용한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 도면(특히 도 2 내지 도 7 및 도 21 참조)에 도시된 바와 같은 항-CD3 CDR, 항-CD3 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인, Fab 및 scFv의 임의의 수집을 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.30_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 2). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.30_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 2). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 _H1.30_L1.47 scFv를 포함한다(도 2).
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.32_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 3). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.32_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 3). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.32_L1.47 scFv를 포함한다(도 3).
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.89_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 4). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.89_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 4). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.89_L1.47 scFv를 포함한다(도 4).
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.90_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 5). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.90_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 5). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.90_L1.47 scFv를 포함한다(도 5).
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.33_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 6). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.33_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 6). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.33_L1.47 scFv를 포함한다(도 6).
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.31_L1.47의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 7). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.31_L1.47의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함한다(도 7). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-CD3 H1.31_L1.47 scFv를 포함한다(도 7).
유사하게, 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은, 임의의 항-PSMA 항원 결합 도메인(항-PSMA CDR, 항-PSMA 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인, Fab 및 scFv이든)은 사용될 수 있고, 임의의 조합으로 임의로 및 독립적으로 조합된다. 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-PSMA 항원 결합 도메인을 포함한다(도 20). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-PSMA J591 H1_L1의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함하는 항-PSMA 항원 결합 도메인을 포함한다(도 20). 몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인 또는 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 갖는 항-PSMA J591 H1_L1 scFv를 포함한다(도 20).
보틀 오프너 포맷
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1a에 도시된 바와 같은 "삼중 F" 또는 "보틀 오프너" 스캐폴드 포맷이다. 이 실시형태에서, 항체의 하나의 중쇄는 단일 사슬 Fv(하기 정의된 바와 같은, "scFv")를 함유하고, 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 "규칙적인" FAb 포맷이다. 이 구조는 보틀-오프너와 대략적인 시각적인 유사성으로 인해 본 명세서에서 "삼중 F" 포맷(scFv-FAb-Fc) 또는 "보틀-오프너" 포맷이라 때때로 칭한다(도 1 참조). 2개의 사슬은, 하기 더 완전히 기재된 것처럼, 이종이합체성 항체의 형성을 촉진하는, 불변 영역에서의 아미노산 변이체(예를 들어, Fc 도메인, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역)의 사용에 의해 함께 놓인다.
"삼중 F" 포맷을 제시하는 것의 몇몇 뚜렷한 이점이 존재한다. 당해 분야에 공지된 바대로, 2개의 scFv 작제물에 의존하는 항체 유사체는 대개 안정성 및 응집 문제를 가지고, 이들은 "규칙적인" 중쇄 및 경쇄 쌍 짓기의 첨가에 의해 본 발명에서 경감될 수 있다. 게다가, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 포맷과 반대로, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 쌍 짖기(예를 들어, 경쇄 2와의 중쇄 1 쌍 짓기 등)에 의한 논쟁이 없다.
본 명세서에 기재된 많은 실시형태는 일반적으로, (많은 경우에, 하전된) scFv 링커를 사용하여 공유결합으로 부착된, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는, scFv를 포함하는 제1 단량체를 포함하는 보틀 오프너 포맷에 의존하고, 여기서 scFv는 보통 (본 명세서에서 기재된 바대로, 비하전 또는 하전일 수 있는) 도메인 링커를 통해 제1 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된다. 보틀 오프너 포맷의 제2 단량체는 중쇄이고, 상기 조성물은 경쇄를 추가로 포함한다.
일반적으로, 많은 바람직한 실시형태에서, scFv는 CD3에 결합하는 도메인이고, 중쇄 및 경쇄의 Fab는 PSMA에 결합한다. 게다가, 본 발명의 Fc 도메인은 일반적으로 왜곡 변이체(예를 들어, 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 일련의 아미노산 치환, 특히 유용한 왜곡 변이체는 S364K/E357Q:L368D/370S; L368D/K370S:S364K; L368E/370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 도시된 임의의 vh 및 vl 서열(도면에 도시된 모든 항-PSMA 및 항-CD3 vh 및 vl 서열 및 관련 sCDR을 포함)을 도면에 도시된 임의의 항-CD3 scFv 서열을 사용하여 "Fab 사이드"로서 도 25의 보틀 오프너 골격 포맷에 첨가할 수 있다. 이 실시형태에서, 특정한 용도가 발견되는 항-CD3 서열은 도 25에 도시된 골격의 scFv 사이드로서 부착된 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47 및 항-CD3 H1.31_L1.47(각각 도 2 내지 도 7에 도시된 vh, vl 및 CDR 서열)이다.
본 발명은 항-CD3 scFv 서열이 도 25의 골격 포맷과의 임의의 조합을 포함하여 도 2 내지 도 7 및 도 21에 도시된 바와 같은 보틀 오프너 포맷을 제공한다. 게다가, 도 2 내지 도 7 및 도 21에 도시된 바와 같은 임의의 항-CD3 vh, vl 및 CDR 서열은 Fab 사이드로서 사용될 수 있다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 보틀 오프너 포맷을 제공한다. 상기와 유사하게, 각각의 항-PSMA vh, vl 및 관련 CDR 서열은 Fab 사이드 또는 scFv 사이드일 수 있고, 도 25의 것을 포함하는 보틀 오프너 포맷의 항원 결합 도메인 중 하나로서 연결될 수 있다. 항-PSMA 서열이 Fab 사이드일 때, 특히 도 25에 도시된 골격의 scFv 사이드로서 부착된 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47 및 항-CD3 H1.31_L1.47을 포함하는, 도면에 도시된 임의의 항-CD3 scFv 서열 및 관련 vh, vl 및 CDR 서열을 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 해당 항체는 도 21e에 도시된 바와 같은 Fab-Fc 중쇄 스캐폴드, scFv-Fc 중쇄 스캐폴드 및 경쇄 스캐폴드를 갖는 보틀 오프너 포맷 항체이다. 본 명세서에 기재된 임의의 가변 중쇄 도메인(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 가변 중쇄 도메인은 도 21e에 기재된 Fab-Fc 중쇄 스캐폴드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 가변 경쇄 도메인(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 가변 경쇄 도메인은 도 21e에 도시된 경쇄 스캐폴드에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 각각 Fab-Fc 중쇄 스캐폴드 및 경쇄 스캐폴드에 작동 가능하게 연결되고(도 21e), 항-PSMA 결합 도메인의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함한다(도 20). 몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인은 J591 H1_L1의 vhCDR1-3을 포함하고(도 20), 가변 경쇄 도메인은 J591 H1_L1의 vlCDR1-3을 포함한다(도 20).
몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 각각 Fab-Fc 중쇄 스캐폴드 및 경쇄 스캐폴드에 작동 가능하게 연결되고(도 21e), 항-CD3 결합 도메인의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인이다. 몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 항-CD3 H1.30_L1.47(도 2), 항-CD3 H1.32_L1.47(도 3), 항-CD3 H1.89_L1.47(도 4), H1.90_L1.47(도 5), H1.33_L1.47(도 6) 또는 H1.31_L1.47(도 7)의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인은 항-CD3 H1.30_L1.47(도 2), 항-CD3 H1.32_L1.47(도 3), 항-CD3 H1.89_L1.47(도 4), H1.90_L1.47(도 5), H1.33_L1.47(도 6) 또는 H1.31_L1.47(도 7)의 vhCDR1-3을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 각각 항-CD3 H1.30_L1.47(도 2), 항-CD3 H1.32_L1.47(도 3), 항-CD3 H1.89_L1.47(도 4), H1.90_L1.47(도 5), H1.33_L1.47(도 6) 또는 H1.31_L1.47(도 7)의 vlCDR1-3을 포함한다(예를 들어, 가변 중쇄 도메인은 항-CD3 H1.30_L1.47의 vhCDR1-3을 포함하고, 가변 경쇄 도메인은 항-CD3 H1.30_L1.47의 vlCDR1-3을 포함한다).
몇몇 실시형태에서, scFv-Fc 중쇄 스캐폴드(도 21e)는 항-CD3 scFv에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47(도 2), H1.32_L1.47(도 3), H1.89_L1.47(도 4), H1.90_L1.47(도 5), H1.33_L1.47(도 6) 또는 H1.31_L1.47(도 7)의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47(도 2), H1.32_L1.47(도 3), H1.89_L1.47(도 4), H1.90_L1.47(도 5), H1.33_L1.47(도 6) 또는 H1.31_L1.47(도 7)의 vhCDR1-3 및 vlCDR1-3을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47 scFv(도 2), H1.32_L1.47 scFv(도 3), H1.89_L1.47 scFv(도 4), H1.90_L1.47 scFv(도 5), H1.33_L1.47 scFv(도 6) 또는 H1.31_L1.47 scFv(도 7)이다.
몇몇 실시형태에서, scFv-Fc 중쇄 스캐폴드(도 21e)는 항-PSMA scFv에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 항-PSMA scFv는 항-PSMA J591 H1_L1(도 20)의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, scFv는 J591 H1_L1(도 20)의 vhCDR1-3 및 J591 H1_L1(도 20)의 vlCDR1-3을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-PSMA scFv는 J591 H1_L1 scFv(도 20)이다.
소정의 실시형태에서, 해당 항-PSMA x 항 x CD3 항체는 도 9, 도 21a-d 및 도 25에 도시된 보틀 오프너 포맷 중 임의의 하나의 서열을 가진다.
mAb - Fv 포맷
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 mAb-Fv 포맷이다. 이 실시형태에서, 포맷은 하나의 단량체에 대한 "추가의" 가변 중쇄 도메인의 C 말단 부착 및 다른 단량체에 대한 "추가의" 가변 경쇄 도메인의 C 말단 부착의 사용에 의존하여서, 제3 항원 결합 도메인을 형성하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 PSMA에 결합하고, "추가의" Fv 도메인은 CD3에 결합한다.
이 실시형태에서, 제1 단량체는 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착된다. 제2 단량체는 제2 가변 중쇄 도메인, 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인 및 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착된 제3 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 C 말단으로 부착된 가변 도메인은 (2가 CD3 결합을 갖는 것이 덜 바람직하면서) CD3에 결합하는 Fv를 구성한다. 이 실시형태는 추가로, PSMA에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용한다.
몇몇 실시형태에서, 제1 중쇄는 vh1-CH1-힌지-CH2- CH3-[임의의 링커]-vl2를 포함하고, 제2 단량체는 vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[임의의 링커]-vh2를 포함하고, 공통 경쇄는 vl1을 포함한다. 이 실시형태에서, vh1 및 vl1은 PSMA 결합 도메인을 형성하고, vh2 및 vl2는 CD3 결합 도메인을 형성한다.
본 명세서에서의 많은 실시형태에 대해, 이들 작제물은 요망되는 대로 및 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 mAb-Fv 포맷(여기서, 항-CD3 scFv 서열은 도 2 내지 도 7에 도시됨)을 제공한다.
본 발명은 보틀 오프너 포맷(여기서, 항-PSMA 서열은 도 8 및 도 20에 도시됨)을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 mAb-Fv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 mAb-Fv 포맷을 제공한다.
mAb - scFv
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 mAb-scFv 포맷이다. 이 실시형태에서, 포맷은 단량체 중 하나에 대한 scFv의 C 말단 부착의 사용에 의존하여서, 2개의 단량체의 Fab 부분이 PSMA에 결합하고 "추가의" scFv 도메인이 CD3에 결합하는 제3 항원 결합 도메인을 형성한다. 따라서, 제1 단량체는 (가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하는) 제1 중쇄를 포함하고, C 말단으로 공유결합으로 부착된 scFv는 어느 한 배향(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[임의의 링커]-vh2-scFv 링커-vl2 또는 vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[임의의 링커]-vl2-scFv 링커-vh2)으로 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 이 실시형태는 추가로 PSMA에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용한다. 본 명세서에서의 많은 실시형태에 대해, 이들 작제물은 요망되는 대로 및 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 mAb-scFv 포맷(여기서, 항-CD3 scFv 서열은 도 2 내지 도 7에 도시됨)을 제공한다.
본 발명은 mAb-scFv 포맷(여기서, 항-PSMA 서열은 도 8 및 도 20에 도시됨)을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 mAb-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 mAb-scFv 포맷을 제공한다.
중앙 scFv 포맷
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 중앙-scFv 포맷이다. 이 실시형태에서, 포맷은 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하여서, 제3 항원 결합 도메인을 형성하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 PSMA에 결합하고, "추가의" scFv 도메인은 CD3에 결합한다. scFv 도메인은 단량체의 하나의 CH1-Fv 영역과 Fc 도메인 사이에 삽입되어서, 제3 항원 결합 도메인을 제공한다.
이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인(및 임의의 힌지)을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, scFv는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. scFv는 임의의 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된다(예를 들어, vh1-CH1-[임의의 링커]-vh2-scFv 링커- vl2-[힌지를 포함하는 임의의 링커]-CH2-CH3 또는 vh1-CH1-[임의의 링커]-vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 임의의 링커]-CH2-CH3). 제2 단량체는 표준 Fab 부위이다(예를 들어, vh1-CH1-[힌지를 포함하는 임의의 링커]-CH2-CH3). 이 실시형태는 추가로, PSMA에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인(예를 들어, vl1) 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용한다. 본 명세서에서 많은 실시형태에 대해, 이 작제물은 원해지고 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 항-CD3 scFv 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
중앙- Fv 포맷
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 중앙-Fv 포맷이다. 이 실시형태에서, 포맷은 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하여서, 제3 항원 결합 도메인을 형성하고, 2개의 단량체의 Fab 부분은 PSMA에 결합하고, "추가의" Fv 도메인은 CD3에 결합한다. scFv 도메인은 단량체의 CH1-Fv 영역과 Fc 도메인 사이에 삽입되어서, 제3 항원 결합 도메인을 제공하고, 여기서 각각의 단량체는 Fv의 성분을 함유한다(예를 들어, 하나의 단량체는 가변 중쇄 도메인 및 다른 가변 경쇄 도메인을 포함한다).
이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인 및 추가 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 추가 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된다(예를 들어, vh1-CH1-[임의의 링커]-vl2-힌지-CH2-CH3). 다른 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인 및 추가 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다(예를 들어, vh1-CH1-[임의의 링커]-vh2-힌지-CH2-CH3). 추가 가변 중쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된다.
이 실시형태는 추가로, PSMA에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용한다. 본 명세서에서 많은 실시형태에 대해, 이 작제물은 원해지고 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 항-CD3 scFv 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
하나의 아암의 중앙- scFv
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 하나의 아암의 중앙-scFv 포맷이다. 이 실시형태에서, 하나의 단량체는 바로 Fc 도메인을 포함하는 한편, 다른 단량체는 삽입된 scFv 도메인을 사용하여서 제2 항원 결합 도메인을 형성한다. 이 포맷에서, Fab 부분 중 어느 하나는 PSMA에 결합하고, scFv는 CD3에 결합하거나, 그 반대도 그렇다. scFv 도메인은 단량체의 하나의 CH1-Fv 영역과 Fc 도메인 사이에 삽입된다.
이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, scFv는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. scFv는 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된다(예를 들어, vh1-CH1-[임의의 링커]-vh2-scFv 링커-vl2-[힌지를 포함하는 임의의 링커]-CH2-CH3 또는 vh1-CH1-[임의의 링커]-vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 임의의 링커]-CH2-CH3). 제2 단량체는 Fc 도메인(CH2-CH3)을 포함한다. 이 실시형태는 추가로, Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 사용한다. 본 명세서에서 많은 실시형태에 대해, 이 작제물은 원해지고 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 항-CD3 scFv 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 하나의 아암의 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 하나의 아암의 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 하나의 아암의 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 하나의 아암의 중앙-scFv 포맷을 제공한다.
이중 scFv 포맷
본 발명은 또한 당해 분야에 공지되고, 도 1에 도시된 바와 같은 이중 scFv 포맷을 제공한다. 특히, 본 발명은 항-CD3 scFv 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 이중 scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8에 도시된 바와 같은 이중 scFv 포맷을 제공한다. 실시형태의 몇몇에서, 항-PSMA 및 항-CD3 scFv는 scFv 링커를 포함한다. 소정의 실시형태에서, scFv 링커는 도 14에 도시된 scFv 링커이다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 이중 scFv 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 이중 scFv 포맷을 제공한다.
공통 경쇄 포맷
본 발명에서 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 공통 경쇄 포맷이다. 이 실시형태에서, 제1 단량체는 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 각각의 제1 및 제2 단량체는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄와 회합된다. 본 명세서에서 많은 실시형태에 대해, 이 작제물은 원해지고 본 명세서에 기재된 바대로 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 항-CD3 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 공통 경쇄 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 공통 경쇄 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 공통 경쇄 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 공통 경쇄 포맷을 제공한다.
이중특이적 IgG
본 발명에 특정한 용도가 발견되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 이중특이적 포맷이다. 이 실시형태에서, 제1 단량체는 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 제2 단량체는 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 각각의 제1 및 제2 단량체는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄(즉, 각각 제1 경쇄 및 제2 경쇄)와 회합된다. 본 명세서에서 많은 실시형태에 대해, 이 작제물은 원해지고 본 명세서에 기재된 바대로 입체 변이체(예를 들어, 홀로의 손잡이 변이체), 왜곡 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.
본 발명은 항-CD3 서열이 도 2 내지 도 7에 도시된 바와 같은 이중특이적 IgG 포맷을 제공한다.
본 발명은 항-PSMA 서열이 도 8 및 도 20에 도시된 바와 같은 이중특이적 IgG 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 12에 도시된 바와 같은 절제 변이체를 포함하는 이중특이적 IgG 포맷을 제공한다.
본 발명은 도 10 및 도 15에 도시된 바와 같은 왜곡 변이체를 포함하는 이중특이적 IgG 포맷을 제공한다.
본 발명의 핵산
본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 코딩하는 핵산 조성물을 추가로 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 핵산 조성물은 이종이합체성 단백질의 포맷 및 스캐폴드에 따라 달라질 것이다. 따라서, 예를 들어 포맷이 예컨대 삼중 F 포맷에 대한 3개의 아미노산 서열(예를 들어, Fc 도메인 및 scFv을 포함하는 제1 아미노산 단량체, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 아미노산 단량체)을 요구할 때, 3개의 핵산 서열은 발현을 위해 하나 이상의 발현 벡터로 도입될 수 있다. 유사하게, 몇몇 포맷(예를 들어, 도 1에 개시된 것과 같은 이중 scFv 포맷)은 오직 2개의 핵산을 요하고, 다시 이들은 1개 또는 2개의 발현 벡터에 놓일 수 있다.
당해 분야에 공지된 바대로, 본 발명의 성분을 코딩하는 핵산은, 당해 분야에 공지된 바대로, 본 발명의 이종이합체성 항체를 생성하도록 사용된 숙주 세포에 따라 발현 벡터로 도입될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 임의의 수의 조절 유전요소(프로모터, 복제 기원, 선택 가능한 마커, 리보솜 결합 부위, 인듀서 등)에 작동 가능하게 연결된다. 발현 벡터는 염색체외 또는 통합 벡터일 수 있다.
이후, 본 발명의 핵산 및/또는 발현 벡터는 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)에 의해 포유류, 박테리아, 효모, 곤충 및/또는 진균 세포를 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된, 임의의 수의 상이한 유형의 숙주 세포로 형질전환되어서, 많은 실시형태에서 용도가 발견된다.
몇몇 실시형태에서, 포맷에 따라 적용 가능한 바대로, 각각의 단량체를 코딩하는 핵산 및 경쇄를 코딩하는 임의의 핵산은 일반적으로 상이한 또는 동일한 프로모터 조절 하에 각각 단일 발현 벡터 내에 함유된다. 본 발명에서 특정한 용도의 실시형태에서, 이들 2개 또는 3개의 핵산의 각각은 상이한 발현 벡터에 함유된다. 본 명세서 및 제62/025,931호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로, 상이한 벡터 비율은 이종이합체 형성을 추진하도록 사용될 수 있다. 즉, 놀랍게도, 단백질이 (이종이합체성 항체를 포함하는 3개의 폴리펩타이드를 갖는 본 명세서에서 많은 실시형태의 경우에) 1:1:2 비율로 제1 단량체:제2 단량체:경쇄를 포함하지만, 이것은 최고의 결과를 생성시키는 비율이 아니다.
본 발명의 이종이합체성 항체는 당해 분야에 널리 공지된 바대로 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 제조되면, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 전통적인 항체 정제 단계를 수행한다. 본 명세서에 기재된 바대로, 적어도 0.5만큼 다른 2개의 단량체의 pI를 갖는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 맞춤, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다. 즉, 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖고 이종이합체가 또한 명확한 pI를 가져서, "삼중 F" 이종이합체의 등전점 정제(예를 들어, 음이온 교환 칼럼, 양이온 교환 칼럼)를 수월하게 하는, 각각의 단량체의 등전점(pI)을 변경하는 pI 치환의 포함. 이 치환은 또한 정제 후 임의의 오염하는 이중 scFv-Fc 및 mAb 동종이합체의 결정 및 모니터링(예를 들어, IEF 겔, cIEF 및 분석 IEX 칼럼)을 돕는다.
치료
제조되면, 본 발명의 조성물은 전립선암(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 PSMA를 발현하거나 과발현하는 암의 치료를 포함하는 다수의 분야에서 용도가 발견된다.
따라서, 본 발명의 이종이합체성 조성물은 이 암의 치료에서 용도가 발견된다.
생체내 투여를 위한 항체 조성물
본 발명에 따라 사용되는 항체의 제제는 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 임의의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 순도의 원하는 정도를 갖는 항체를 혼합함으로써 저장에 준비된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투약량 및 사용된 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN(상표명), PLURONICS(상표명) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다.
본 명세서에서 제제는 또한 필요한 바대로 치료되는 특정한 적응증에 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 미치지 않는 상호보완적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 다른 특이성을 갖는 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 또는 게다가, 조성물은 세포독성제, 사이토카인, 성장 저해 물질 및/또는 소분자 길항제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀션에서 예를 들어 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에서, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에서 또한 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되어야 하는 제제는 무균이거나 거의 그래야 한다. 이것은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방 제제가 제조될 수 있다. 서방 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 .감마. 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT(상표명)(락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사용 마이크로구) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산이 100일 초과 동안 분자의 방출이 가능하게 하지만, 소정의 하이드로겔은 더 짧은 시간 기간 동안 단백질을 방출한다.
캡슐화된 항체가 긴 시간 동안 체내에 머무를 때, 이것은 37℃에서의 수분의 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있어서, 면역원성의 가능한 변경 및 생물학적 활성의 소실을 발생시킨다. 합당한 전략은 관여된 기전에 따라 안정화에 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-다이설파이드 교환을 통해 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 현상함으로써 달성될 수 있다.
투여 양상
본 발명의 항체 및 화학치료제는 공지된 방법에 따라, 예컨대 일정한 기간에 걸쳐 볼루스로서 또는 연속 점적주사에 의해 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
치료 양상
본 발명의 방법에서, 치료는 질환 또는 병태와 관련하여 긍정적인 치료학적 반응을 제공하도록 사용된다. "긍정적인 치료학적 반응"이란 질환 또는 병태의 의도된 개선 및/또는 질환 또는 병태와 연관된 증상의 개선이다. 예를 들어, 긍정적인 치료학적 반응은 질환에서의 하기 개선 중 하나 이상을 의미할 것이다: (1) 신생 세포의 수의 감소; (2) 신생 세포 사멸의 증가; (3) 신생 세포 생존의 저해; (5) 종양 성장의 저해(즉, 약간의 정도의 느려짐, 바람직하게는 중지); (6) 환자 생존율의 증가; 및 (7) 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 약간의 경감.
임의의 소정의 질환 또는 병태에서의 긍정적인 치료학적 반응은 그 질환 또는 병태에 특정한 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 종양 반응은 스크리닝 기법, 예컨대 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, x-방사선 영상화, 계산된 단층 촬영(CT) 스캔, 골 스캔 영상화, 내시경검사, 및 종양 생검 샘플링, 예를 들어 골수 천자(bone marrow aspiration: BMA) 및 순환 시 종양 세포의 계수를 이용하여 종양 형태(즉, 전체 종양 부담, 종양 크기 등)의 변경에 대해 평가될 수 있다.
이 긍정적인 치료학적 반응 이외에, 치료를 겪은 대상체는 질환과 연관된 증상의 개선의 유리한 효과를 경험할 수 있다.
질환의 개선은 완전한 반응으로 규명될 수 있다. "완전한 반응"이란 임의의 이전에 비정상인 방사선촬영 연구, 골수 및 뇌척수액(CSF)의 정상화를 갖는 임상적으로 검출 가능한 질환 또는 골수종의 경우에 비정상인 단일클론 단백질의 의도된 부재이다.
이러한 반응은 본 발명의 방법에 따른 치료 후 적어도 4주 내지 8주, 또는 때때로 6주 내지 8주 동안 지속할 수 있다. 대안적으로, 질환의 개선은 부분 반응인 것으로 분류화될 수 있다. "부분 반응"이란, 4주 내지 8주, 또는 6주 내지 8주 동안 지속할 수 있는, 새로운 병변의 부재 하의 모든 측정 가능한 종양 부담(즉, 대상체에 존재하는 악성 세포의 수, 또는 종양 덩어리의 측정된 벌크 또는 비정상 단일클론 단백질의 분량)의 의도된 적어도 약 50%의 감소이다.
본 발명에 따른 치료는 사용되는 약제의 "치료학적 유효량"을 포함한다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 달성하기 위해 필요한 시간의 기간 동안 투약량에서 효과적인 양을 의미한다.
치료학적 유효량은 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 원하는 반응을 유발하기 위한 약제의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 능가하는 것이다.
종양 치료에 대한 "치료학적 유효량"은 질환의 진행을 안정화시키는 이의 능력에 의해 또한 측정될 수 있다. 암을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다.
대안적으로, 조성물의 이 특성은 숙련자에게 공지된 시험관내 검정에 의해 아폽토시스를 유도하거나 세포 성장을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료학적 화합물의 치료학적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 그렇지 않으면 대상체에서 증상을 경감시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 대상체의 몸집, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
투약량 섭생은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 몇몇 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 응급성에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소하거나 증가할 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태로 제제화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 분량을 함유한다.
본 발명의 투약량 단위 형태의 사양은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정한 치료학적 효과, 및 (b) 개인에서 감수성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 배합의 분야에 고유한 제한에 의해 기술되고, 이에 직접적으로 의존한다.
본 발명에서 사용되는 이중특이적 항체에 대한 효율적인 투약량 및 투약량 섭생은 치료되는 질환 또는 병태에 따라 달라지고, 당해 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 이중특이적 항체의 치료학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.1 내지 100㎎/㎏, 예컨대 약 0.1 내지 50㎎/㎏, 예를 들어 약 0.1 내지 20㎎/㎏, 예컨대 약 0.1 내지 10㎎/㎏, 예를 들어 약 0.5, 예컨대 약 0.3, 약 1 또는 약 3㎎/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 1㎎/㎏ 이상, 예컨대 1 내지 20㎎/㎏의 용량, 예를 들어 5 내지 20㎎/㎏의 용량, 예를 들어 8㎎/㎏의 용량으로 투여된다.
당해 분야에서 보통의 기술을 갖는 의학 전문가는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료학적 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 약제학적 조성물에서 사용된 약제의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투약량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 10 내지 500㎎/㎏, 예컨대 200 내지 400㎎/㎏의 1주 투약량으로 점적주사에 의해 투여된다. 이러한 투여는 예를 들어 1회 내지 8회, 예컨대 3회 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2시간 내지 24시간, 예컨대 2시간 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 점적주사에 의해 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 독성을 포함하는 부작용을 감소시키기 위해 필요한 경우 긴 기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 연속 점적주사에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 8회 이하, 예컨대 4회 내지 6회 동안 250㎎ 내지 2000㎎, 예컨대 300㎎, 500㎎, 700㎎, 1000㎎, 1500㎎ 또는 2000㎎ 등의 1주 투약량으로 투여된다. 투여는 2시간 내지 24시간, 예컨대 2시간 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 점적주사에 의해 수행될 수 있다. 이러한 섭생은 필요한 바대로 1회 이상, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후 반복될 수 있다. 투약량은 예를 들어 생물학적 샘플을 취하고 이중특이적 항체의 항원 결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용함으로써 투여 시 혈액에서의 본 발명의 화합물의 양을 측정함으로써 결정되거나 조정될 수 있다.
추가의 실시형태는, 이중특이적 항체는 2주 내지 12주, 예컨대 3주 내지 10주, 예컨대 4주 내지 8주 동안 1주 1회 투여된다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 유지 치료에 의해, 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 1주 1회 등으로 투여된다.
일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체의 하나의 점적주사, 이어서 방사선동위원소에 접합된 이중특이적 항체의 점적주사를 포함하는 섭생에 의해 투여된다. 섭생은 예를 들어 나중에 7일 내지 9일 반복될 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 치료는 24시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간 또는 2시간마다의 단일 또는 분할 용량, 또는 임의의 이의 조합을 이용하여 치료의 개시 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일 또는 40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주 또는 20주 중 적어도 하나, 또는 임의의 이의 조합에 매일 약 0.1 내지 100㎎/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100㎎/㎏의 양으로 항체의 1일 투약량으로 제공될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이의 이중특이적 항체 분자는 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들어 화학치료제와 조합되어 사용된다. DNA 손상 화학치료제의 비제한적인 예는 토포아이소머라제 I 저해제(예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신 및 이의 유사체 또는 대사물질 및 독소루비신); 토포아이소머라제 II 저해제(예를 들어, 에토포사이드, 테니포사이드 및 다우노루비신); 알킬화제(예를 들어, 멜팔란, 클로르암부실, 부술판, 티오테파, 이포스파마이드, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 데카르바진, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 및 사이클로포스파마이드); DNA 삽입제(intercalator)(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴); DNA 삽입제 및 유리 라디칼 생성제, 예컨대 블레오마이신; 및 뉴클레오사이드 모방체(예를 들어, 5-플루오로유라실, 카페시티빈, 겜시타빈, 플루다라빈, 사이타라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 하이드록시유레아)를 포함한다.
세포 복제를 파괴하는 화학치료제는 파클리탁셀, 도세탁셀 및 관련 유사체; 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 관련 유사체; 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 관련 유사체(예를 들어, CC-5013 및 CC-4047); 단백질 타이로신 키나제 저해제(예를 들어, 이마티닙, 메실레이트 및 게피티닙); 프로테오솜 저해제(예를 들어, 보르테조밉); NF-κB 저해제, 예를 들어 IκB 키나제의 저해제; 암에서 과발현된 단백질에 결합하고 이로써 세포 복제를 하향조절하는 항체(예를 들어, 트라스투주맙, 리툭시맙, 세툭시맙 및 베바시주맙); 및 단백질의 다른 저해제 또는 암에서 상향조절되거나 과발현되거나 활성화되는 것으로 공지된 효소(이의 저해는 세포 복제를 하향조절함)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 벨케이드(Velcade)(등록상표)(보르테조밉)에 의한 치료 전에, 이것과 동시에, 또는 후에 사용될 수 있다.
모든 인용된 문헌은 본 명세서에 명확히 그 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 특정한 실시형태가 예시의 목적을 위해 상기 기재되어 있지만, 첨부된 청구항에 기재된 바와 같은 발명으로부터 벗어나지 않으면서 상세사항의 다수의 변형이 이루어질 수 있는 것으로 당해 분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다.
실시예
본 발명을 예시하도록 실시예가 하기 제공된다. 이 실시예는 임의의 특정한 분야 또는 조작의 이론에 본 발명을 구속하도록 의도되지 않는다. 본 발명에 기재된 모든 불변 영역 위치에 대해, 넘버링은 카밧에서처럼 EU 인덱스에 따른다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda(완전히 참고로 포함됨)). 항체의 분야의 숙련자는 이 관례가 면역글로불린 서열의 특정한 영역에서의 비순차적인 넘버링으로 이루어져서, 면역글로불린 패밀리에서의 보존된 위치에 대한 일반화된 언급이 가능하게 한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, EU 인덱스에 의해 정의된 바와 같은 임의의 소정의 면역글로불린의 위치는 이의 순차적인 서열에 반드시 상응하지는 않을 것이다.
일반적인 및 구체적인 과학적 기법은 미국 공보 제2015/0307629호, 제2014/0288275호 및 WO 제2014/145806호(이들 모두 그 전문이 명확히 참고로 포함됨)에 및 특히 여기에 기재된 기법에 대해 기재되어 있다.
실시예 1: 이중특이체 생성
항-PSMA x 항-CD3 이중특이체에 대한 아미노산 서열은 도 9 및 도 21a-d에 기재되어 있다. 이중특이적 발현에 필요한 3개의 사슬을 코딩하는 DNA는 유전자 합성(Blue Heron Biotechnology(워싱턴주 보셀))에 의해 생성되고, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 발현 벡터 pTT5로 서브클로닝된다. 부위 지시된 돌연변이유발(QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, Tex.) 또는 추가 유전자 합성 및 서브클로닝을 이용하여 치환을 도입하였다. DNA를 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질감염시키고, 단백질 A 친화도(GE Healthcare) 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 상청액으로부터 생성된 단백질을 정제하였다. 50mM MES(pH 6.0)의 세척/평형 완충제 및 50mM MES(pH 6.0)의 용리 완충제 + 1M NaCl 선형 구배에 의해 HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
예시적인 항체 XENP14484 및 XENP19722에 대한 PSMA 친화도(KD)를 Octet Red 기계(ForteBio)에서 바이오층 간섭측정번(biolayer interferometry: BLI)에 의해 측정하였다(도 22). AHC 센서에 이중특이체(XENP14484, XENP19722)를 포획한 후, 이어서 인간 또는 시아노몰거스 원숭이 PSMA를 50 내지 0.78125nM의 농도(2배 희석)로 희석하였다.
실시예 2: 재지향된 T 세포 세포독성
PSMA+ LNCaP 전립선암 세포주에 대한 세포 표면 결합 및 이것의 재지향된 T 세포 세포독성(RTCC)에 대해 항-PSMA x 항-CD3 이중특이체를 시험관내 규명하였다(도 16 및 도 23). 검정 세부사항은 도면 범례에 표시된다. 이 도면에 도시된 것처럼, 해당 항-PSMA x 항-CD3 항체 XENP14484 및 XENP19722가 LNCaP 전립선암 세포에 결합하고, 시험관내 RTCC 사멸을 매개할 수 있는 한편, 항-RSV 대조군 XENP13245는 PSMA 또는 RTCC를 나타내지 않았다.
실시예 3: 시아노몰거스 원숭이 약리학
시아노몰거스 원숭이(n = 3)에게 XENP14484(항-PSMA x 항-CD3, 30㎍/㎏) 또는 XENP13245(항-RSV x CD3, 3㎎/㎏) 중 어느 하나의 단일 용량을 주었다. 유세포분석법에 의해 CD4+ T 세포 변연추향 및 CD69 MFI에 의한 활성화를 조사하였다. ELISA에 의해 IL-6 혈청 수치를 조사하였다(도 17a). 게다가, 유세포분석법에 의해 CD8+ T 세포 변연추향 및 CD69 MFI에 의한 활성화를 조사하고, ELISA에 의해 TNF 혈청 수치를 조사하였다(도 17b). 도면에 도시된 것처럼, T 세포 반응 및 사이토카인 방출 증후군(CRS)은 원숭이에서의 항-PSMA x 항-CD3 항체에 의한 표적 세포의 개입에 의존적이다.
실시예 4: CD3 친화도 및 사이토카인 방출 증후군
시아노몰거스 원숭이(n = 3)에게 0.06㎎/㎏의 XENP14484(높은 CD3 친화도) 또는 1㎎/㎏의 XENP19722(낮은 CD3 친화도) 중 어느 하나의 단일 정맥내(i.v.) 용량을 투여하였다. 도 24에 도시된 것처럼, XENP14484 및 XENP19722 항체는 상이한 CD3 친화도를 가짐에도 불구하고 유사한 T 세포 변연추향 및 활성화(CD4+(상부 패널) 및 CD8+(중간 패널))를 나타낸다. 그러나, T 세포 활성화에서의 유사성에도 불구하고, CD3에 대한 낮은 친화도를 갖는 XENP19722는 CD3에 대한 높은 친화도를 갖는 XENP14484와 비교하여 사이토카인 감소한 증후군(CRS)을 덜 유발하였다(도 24, 하부 패널). 이러한 더 낮은 CD3 친화도는 심지어 더 높은 용량 수준에서 감소한 사이토카인 방출과 상관된다. 그러므로, 항-PSMA 이중특이체의 효력은 T 세포를 동원하는 능력을 조율함으로써 조정될 수 있다.
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Moore, Gregory Desjarlais, John Chu, Seung <120> HETERODIMERIC ANTIBODIES THAT BIND CD3 AND PSMA <130> 067461-5190-WO <140> PCT/US16/65459 <141> 2016-12-07 <150> US 62/324,823 <151> 2016-04-19 <150> US 62/264,261 <151> 2015-12-07 <160> 141 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (vh) domain <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 137 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv heavy chain <400> 137 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 138 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> constant light chain <400> 138 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 139 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab side heavy chain <400> 139 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Glu Asn Glu Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Ser Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Glu Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 140 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv heavy chain <400> 140 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Lys Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 141 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> constant light chain <400> 141 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (55)

  1. 이종이합체성 항체(heterodimeric antibody)로서,
    a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체;
    b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  2. 핵산 조성물로서,
    a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  3. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 서열 번호 64를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 서열 번호 65를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 서열 번호 66을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
  4. 이종이합체성 항체로서,
    a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체;
    b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  5. 핵산 조성물로서,
    a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  6. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 서열 번호 118을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 서열 번호 119를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 서열 번호 120을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
  7. 이종이합체성 항체로서,
    a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체;
    b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  8. 핵산 조성물로서,
    a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  9. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 서열 번호 121을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 서열 번호 122를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 서열 번호 123을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
  10. 이종이합체성 항체로서,
    a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체;
    b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  11. 핵산 조성물로서,
    a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  12. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 서열 번호 124를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 서열 번호 125를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 서열 번호 126을 포함하는 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이종이합체성 항체를 제조하는 방법으로서, 제13항 또는 제14항의 숙주 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 암의 치료를 요하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항, 제4항, 제7항 및 10항 중 어느 한 항에 따른 이종이합체성 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA(prostate specific membrane antigen)에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  18. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 6을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 7을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 8을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.30의 vhCDR(서열 번호 2를 갖는 vhCDR1, 서열 번호 3을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 4를 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  19. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 15를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 16을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 17을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.32의 vhCDR(서열 번호 11을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 12를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 13을 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  20. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 24를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 25를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 26을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.89의 vhCDR(서열 번호 20을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 21을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 22를 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  21. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 33을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 34를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 35를 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.90의 vhCDR(서열 번호 29를 갖는 vhCDR1, 서열 번호 30을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 31을 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  22. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 42를 갖는 vlCDR1, 서열 번호 43을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 44를 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.33의 vhCDR(서열 번호 38을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 39를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 40을 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  23. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 scFv 가변 경쇄 도메인은 CD3 L1.47의 vlCDR(서열 번호 51을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 52를 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 53을 갖는 vlCDR3)을 포함하고, 상기 scFv 가변 중쇄 도메인은 CD3 H1.31의 vhCDR(서열 번호 47을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 48을 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 49를 갖는 vhCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  24. 제18항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 vhCDR(서열 번호 111을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 112를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 113을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 그리고 상기 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 vlCDR(서열 번호 107을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 108을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 109를 갖는 vlCDR3)을 포함하는, 이종이합체성 항체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 중쇄 도메인(서열 번호 110)을 포함하고, 그리고 상기 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 경쇄 도메인(서열 번호 106)을 포함하는, 이종이합체성 항체.
  26. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 Fc 도메인; 및
    ⅱ) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 N 말단에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 중쇄 가변 도메인; 및
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 vhCDR(서열 번호 111을 갖는 vhCDR1, 서열 번호 112를 갖는 vhCDR2 및 서열 번호 113을 갖는 vhCDR3)을 포함하고, 상기 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 vlCDR(서열 번호 107을 갖는 vlCDR1, 서열 번호 108을 갖는 vlCDR2 및 서열 번호 109를 갖는 vlCDR3)을 포함하며, 그리고 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 중쇄 도메인(서열 번호 110)을 포함하고, 그리고 상기 가변 경쇄 도메인은 항-PSMA J591 H1_L1의 가변 경쇄 도메인(서열 번호 106)을 포함하는, 이종이합체성 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Fc 도메인 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 변이체를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv 링커는 하전된 링커인, 이종이합체성 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 도메인은 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하는, 이종이합체성 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 코딩하는 핵산 조성물로서,
    a) 상기 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 상기 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 상기 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  33. 제32항의 핵산 조성물을 포함하는 발현 벡터 조성물.
  34. 제32항의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  35. 제33항의 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 제조하는 방법으로서, 제35항 또는 제35항의 숙주 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 이종이합체성 항체를 제조하는 방법.
  37. 암의 치료를 요하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  38. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인;
    2) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및
    3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착된,
    제1 중쇄를 포함하는, 제1 단량체;
    b) 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하되;
    상기 제1 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 인간 PSMA(서열 번호 131)에 결합하며, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 인간 PSMA에 결합하고, 그리고 상기 scFv는 인간 CD3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  39. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인;
    2) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인; 및
    3) 제1 가변 경쇄 도메인을 포함하며;
    상기 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 상기 제1 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착된,
    제1 중쇄를 포함하는, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 제2 가변 중쇄 도메인;
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인; 및
    ⅲ) 제3 가변 중쇄 도메인을 포함하며;
    상기 제3 가변 중쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 상기 제2 Fc 도메인의 C 말단에 공유결합으로 부착된, 제2 단량체;
    c) 제2 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하되;
    상기 제1 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하며, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 상기 PSMA에 결합하고, 그리고 상기 제1 가변 경쇄 도메인 및 상기 제3 가변 중쇄 도메인은 CD3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  40. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인;
    2) 제1 CH1 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및
    3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 CH1 도메인의 C 말단과 상기 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된,
    제1 중쇄를 포함하는, 제1 단량체;
    b) 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하되;
    상기 제1 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S: S364K E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하며, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 그리고 상기 scFv는 CD3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  41. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 제1 가변 중쇄 도메인;
    ⅱ) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인; 및
    ⅲ) 제1 가변 경쇄 도메인을 포함하며;
    상기 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 상기 제1 불변 중쇄 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 상기 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된, 제1 단량체;
    b) ⅰ) 제2 가변 중쇄 도메인;
    ⅱ) 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인; 및
    ⅲ) 제3 가변 중쇄 도메인을 포함하며;
    상기 제3 가변 중쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 상기 제2 불변 중쇄 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 상기 제2 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된, 제2 단량체; 및
    c) 제2 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하되;
    상기 제1 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q: L368D/ 370S; L368D/K370S:S364K; L368E K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S: S364K E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하며, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 PSMA에 결합하고, 그리고 상기 제1 가변 경쇄 도메인 및 상기 제3 가변 중쇄 도메인은 CD3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
  42. 이종이합체성 항체로서,
    a) ⅰ) 1) 제1 가변 중쇄 도메인;
    2) 제1 CH1 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄; 및
    3) scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv를 포함하며;
    상기 scFv는 도메인 링커를 사용하여 상기 CH1 도메인의 C 말단과 상기 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유결합으로 부착된,
    제1 중쇄를 포함하는, 제1 단량체;
    b) 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및
    c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하되;
    상기 제1 및 상기 제2 Fc 도메인은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L 및 K370S:S364K/E357Q로 이루어진 군으로부터 선택된 일련의 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 제1 항원에 결합하며, 상기 scFv는 제2 항원에 결합하고, 그리고 상기 제1 항원 및 제2 항원 중 하나는 PSMA이고 다른 하나는 CD3인, 이종이합체성 항체.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 코딩하는 핵산 조성물로서,
    a) 상기 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산;
    b) 상기 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 상기 경쇄를 코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
  44. 제43항의 핵산 조성물을 포함하는 발현 벡터 조성물.
  45. 제43항의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  46. 제44항의 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 제조하는 방법으로서, 제46항 또는 제46항의 숙주 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 이종이합체성 항체를 제조하는 방법.
  48. 암의 치료를 요하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이종이합체성 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  49. XENP14484, XENP16873, XENP16874 및 XENP19722로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이합체성 항체.
  50. XENP14484, XENP16873, XENP16874 및 XENP19722로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이합체성 항체를 코딩하는 3개의 핵산을 포함하는 핵산 조성물.
  51. 3개의 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물로서, 상기 발현 벡터는 각각 상기 3개의 발현 벡터가 XENP14484, XENP16873, XENP16874 및 XENP19722로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이합체성 항체를 코딩하도록 핵산을 함유하는, 발현 벡터 조성물.
  52. 제50항의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  53. 제51항의 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  54. 제49항에 따른 이종이합체성 항체를 제조하는 방법으로서, 제52항 또는 제53항의 숙주 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 이종이합체성 항체를 제조하는 방법.
  55. 암의 치료를 요하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제50항에 따른 이종이합체성 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
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