CN117157319A - 结合cd3和cldn6的异二聚抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了新型CLDN6结合结构域以及包含此类CLDN6结合结构域的抗CLDN6×抗CD3抗体。本文还提供了使用此类抗体用于治疗CLDN6相关癌症的方法。

Description

结合CD3和CLDN6的异二聚抗体
优先权声明
本申请要求2021年3月9日提交的美国临时专利申请63/158,584的权益，该专利申请特此以全文引用的方式并入。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且特此以全文引用的方式并入。在2022年2月24日创建的所述ASCII拷贝命名为067461-5281-WO_SL.txt，并且大小为991,664字节。
背景技术
基于抗体的治疗剂已经成功地用于治疗各种疾病，包含癌症。正在探索的日益普遍的途径是共接合两种不同抗原的单一免疫球蛋白分子的工程化。接合两种不同抗原的此类替代性抗体形式通常称为双特异性抗体。因为抗体可变区(Fv)的相当大的多样性使得可以产生识别几乎任何分子的Fv，所以产生双特异性抗体的典型方法是将新的可变区引入到抗体中。
双特异性抗体的特别有用的方法是使接合CD3的第一结合结构域和接合与癌细胞相关或在癌细胞上上调的抗原的第二结合结构域工程化，使得双特异性抗体重定向CD3+ T细胞以破坏癌细胞。已经确定密封蛋白6(CLDN6)在胃癌、肺癌和卵巢癌中被上调。有鉴于此，据信抗CLDN6抗体可用于例如将抗肿瘤治疗剂(例如，化学治疗剂和T细胞)定位至此类表达CLDN6的肿瘤。本发明提供了能够将CD3+效应T细胞定位至表达CLDN6的肿瘤的针对CD3和CLDN6的新型双特异性抗体。
发明内容
本文提供了新型CLDN6结合结构域以及包含此类CLDN6结合结构域的抗CLDN6×抗CD3抗体。本文还提供了使用此类抗体用于治疗CLDN6相关癌症的方法。
在第一方面，本文提供了包含CLDN6抗原结合结构域的组合物。在一些实施方案中，CLDN6抗原结合结构域包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)/可变轻链结构域(VL)对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在一些实施方案中，CLDN6抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
3.在一些实施方案中，VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187组成的组。
在一些实施方案中，组合物是单克隆抗体。
在另一方面，本文提供了一种异二聚抗体，该异二聚抗体包含：a)第一单体，b)第二单体，和c)轻链。第一单体包含：i)抗CD3 scFv，该抗CD3 scFv包含第一可变轻链结构域、scFv接头和第一可变重链结构域；和ii)第一Fc结构域，其中scFv使用结构域接头共价附接至第一Fc结构域的N末端。第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重链结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域。轻链包含第二可变轻链结构域。在此实施方案中，第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域形成CLDN6抗原结合结构域(ABD)。
在一些实施方案中，CLDN6结合结构域包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的可变重链结构域/可变轻链结构域对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在一些实施方案中，CLDN6结合结构域包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在某些实施方案中，CLDN6结合结构域包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187。
在异二聚抗体的一些实施方案中，抗CD3 scFv包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
在异二聚抗体的一些实施方案中，scFv接头是带电荷的scFv接头。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域。在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域包含选自由图1A至图1E中所描绘的异二聚化变体组成的组的一组异二聚化变体。在一些实施方案中，一组异二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
在一些实施方案中，所述第一单体和第二单体还包含一种或多种消融变体。在一些实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
在示例性实施方案中，第一单体或第二单体中的一者包含一种或多种pI变体。在一些实施方案中，一种或多种pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
在异二聚抗体的示例性实施方案中，第一单体包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二单体包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。
在一些实施方案中，第一单体和第二单体各自还包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
在另一方面，本文提供了一种异二聚抗体，所述异二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含scFv-接头-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)轻链，所述轻链包含VL-CL。第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(EU编号)。此外，所述VH和所述VL形成包含可变重链结构域和可变轻链结构域的CLDN6结合结构域，所述可变重链结构域和可变轻链结构域分别属于选自H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187的CLDN6结合结构域；并且抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
在一些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
在另一方面，本文提供了一种异二聚抗体，该异二聚抗体包含：a)第一单体，b)第二单体，和c)共同轻链。第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-scFv-接头2-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域，scFv是抗CD3 scFv，接头1和接头2分别是第一结构域接头和第二结构域接头，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域。第一可变重链结构域和可变轻链结构域形成第一CLDN6 ABD，并且第二可变重链结构域和可变轻链结构域形成第二CLDN6 ABD。
在一些实施方案中，第一CLDN6结合结构域和第二CLDN6结合结构域各自包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在示例性实施方案中，第一CLDN6结合结构域和第二CLDN6结合结构域中的每一者包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在一些实施方案中，VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187组成的组。
在一些实施方案中，scFv包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的VH/VL对：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47,L1.47_H1.30,L1.47_H1.30,L1.47_H1.32,L1.47_H1.89,L1.47_H1.90,L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。在示例性实施方案中，scFv包含以下CD3结合结构域中的任一者的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
在异二聚抗体的一些实施方案中，scFv接头是带电荷的scFv接头。在一些实施方案中，scFv接头是具有氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO:1)的带电荷scFv接头。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域。在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域包含选自由图1A至图1E中所描绘的异二聚化变体组成的组的一组异二聚化变体。在一些实施方案中，一组异二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
在一些实施方案中，所述第一单体和第二单体还包含一种或多种消融变体。在一些实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
在示例性实施方案中，第一单体或第二单体中的一者包含一种或多种pI变体。在一些实施方案中，一种或多种pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
在异二聚抗体的示例性实施方案中，第一单体包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二单体包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。
在一些实施方案中，第一单体和第二单体各自还包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
在另一方面，本文提供了异二聚抗体，该异二聚抗体包含：a)第一单体，b)第二单体，和c)共同轻链。第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-scFv-接头2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域。共同轻链包含VL-CL。第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(EU编号)。VH和VL包含选自以下的CLDN6 ABD的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187；并且抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
本文还提供了包含编码本文所述抗体的核酸的核酸组合物、包含此类核酸的表达载体组合物、用于制备包含表达载体组合物的抗体的宿主细胞以及制备抗体的方法。
附图说明
图1A至图1E描绘了导致Fc异二聚化的Fc异二聚化变体组的有用对(包括偏斜变体和pI变体)。存在并无对应“单体2”变体的变体；这些是可以在任一单体上单独使用的pI变体。
图2描绘了同配变体抗体恒定区和其相应取代的列表。pI_(-)指示较低pI变体，而pI_(+)指示较高pI变体。这些可以任选地且独立地与本发明的其它异二聚化变体(以及其它变体类型，如本文所概述的)组合。
图3描绘有用的消融变体，所述有用的消融变体消融FcγR结合(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，消融变体在两个单体上都可以发现，但是在一些情况下，该消融变体可以仅在一个单体上。
图4描绘了本发明的“非Fv”组分的特别有用的实施方案。
图5描绘了用于增大或减小利用一个或多个scFv作为组分的本发明异二聚bsAb的pI的如本文所述的多个带电荷的scFv接头。(+H)阳性接头在本文中特别适用，尤其是与本文所示的抗CD3 VL和VH序列一起使用。根据Whitlow等人，《蛋白质工程(ProteinEngineering)》6(8):989-995(1993)，具有单个电荷的单个现有技术scFv接头被称为“Whitlow”。应注意的是，这种接头用于减少scFv中的聚集和增强scFv中的蛋白水解稳定性。此类带电荷的scFv接头可以用于本文公开的主题抗体格式中的任一种中，所述主题抗体格式包含scFv(例如，1+1Fab-scFv-Fc格式和2+1Fab2-scFv-Fc格式)。
图6描绘了许多示例性结构域接头。在一些实施方案中，这些接头用于将单链Fv连接至Fc链。在一些实施方案中，这些接头可以组合。例如，GGGGS接头(SEQ ID NO:5)可以与“半铰链”接头组合。
图7A至图7D描绘了基于人IgG1的若干有用的1+1Fab-scFv-Fc双特异性抗体形式重链主链的序列，没有Fv序列(例如，Fab侧的scFv和VH)。主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的C220S、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K偏斜变体的链上的C220S、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K:L368E/K370S偏斜变体、具有S364K偏斜变体的链上的C220S、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有D401K偏斜变体的链上的C220S、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的C220S、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的C220S、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体，以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链7与主链6相同。主链8基于人IgG4，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，所述变体消融如本领域已知的Fab臂交换。主链9基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的S267K变体。除了主链11包含M428L/N434S Xtend突变之外，主链11与主链1相同。主链12基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的C220S和P217R/P229R/N276K pI变体，以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。在这些主链的每一条主链内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与附图的“亲本”相比，如本领域技术人员将理解，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链中所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图8A至图8C描绘了基于人IgG1的若干有用的2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式重链主链的序列，没有Fv序列(例如，Fab侧的scFv和VH)。主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368E/K370S偏斜变体、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体，以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链7与主链6相同。除了主链8包含M428L/N434S Xtend突变之外，主链8与主链1相同。主链9基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体、以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。在这些主链的每一条主链内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与附图的“亲本”相比，如本领域技术人员将理解，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链中所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图9描绘了基于人IgG1的几个有用的恒定轻链结构域主链的序列，没有Fv序列(例如scFv或Fab)。本文包含的恒定轻主链序列与所列举的序列是90％、95％、98％和99％同一的(如本文所定义)，和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸修饰。
图10A至图10F描绘了适合用于本发明的双特异性抗体中的示例性抗CD3 scFv的序列。CDR加下划线，scFv接头加双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)4接头(SEQ ID NO:1)，但是如本领域的技术人员将理解的，该接头可以被其他接头替换，包括不带电荷的接头或带负电荷的接头，其中一些描绘在图5中)，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。另外，命名约定展示了scFv从N末端到C末端的取向。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图11描绘了本发明中使用的多种抗原的抗原序列(包括人和食蟹猴两者)，以促进开发易于临床开发的结合到两者的抗原结合结构域。
图12描述了人CLDN6和CLDN9序列的比对，并且突出显示了它们相应的胞外环中的3个差异。图12按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 173-174。
图13描述了示例性鼠CLDN6结合结构域(在本文中称为mC6-30)的可变重链序列和可变轻链序列以及XENP34243(基于mC6-30且具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的二价IgG1 mAb)的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图14描绘了人源化C6-30变体的可变重链序列和可变轻链序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。进一步，如对于附图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。此外，本文描绘的可变重链结构域中的每个可变重链结构域可以与任何其他αCLDN6可变轻链结构域配对；并且本文描绘的可变轻链结构域中的每个可变轻链结构域可以与任何其他αCLDN6可变重链结构域配对。
图15A至图15J描述了C6-30变体的可变重链序列和可变轻链序列，该变体被工程化以减少降解(例如天冬氨酸异构化和脱酰胺)倾向、增强对CLDN6的选择性和/或调节CLDN6结合亲和力。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。进一步，如对于附图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。此外，本文描绘的可变重链结构域中的每个可变重链结构域可以与任何其他αCLDN6可变轻链结构域配对；并且本文描绘的可变轻链结构域中的每个可变轻链结构域可以与任何其他αCLDN6可变重链结构域配对。
图16A至图16V描绘了被格式化为具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的二价抗CLDN6 mAb和IgG1主链的说明性C6-30[CLDN6]变体(亲本人源化变体和进一步工程化的变体)。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv形式或Fab形式使用。
图17A至图17B描绘了本发明的几种形式。图17A描绘了具有结合CLDN6的第一Fab臂和结合CD3的第二scFv臂的“1+1Fab-scFv-Fc”形式。图17B描绘了具有结合CLDN6的第一Fab臂和第二Fab-scFv臂的“2+1Fab2-scFv-Fc”形式，其中Fab结合CLDN6并且scFv结合CD3。
图18描绘了比较物CLDN6结合结构域的序列(如美国专利10,233,253中所公开的序列)，其被格式化为具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的二价抗CLDN6IgG1 mAb(XENP26863)，并且被格式化为具有CD3高的1+1Fab-scFv-Fc bsAb(XENP26849)。
图19描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc形式并包含CD3高scFv(VHVL取向或VLVH取向的H1.30_L1.47)的说明性αCLDN6×αCD3 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其他链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αCLDN6×αCD3 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图20描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc形式并包含CD3高-Int编号1scFv(VHVL取向或VLVH取向的H1.32_L1.47)的说明性αCLDN6×αCD3bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其他链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αCLDN6×αCD3 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图21A至图21B描绘了呈2+1Fab2-scFv-Fc形式并包含CD3高scFv(VHVL取向或VLVH取向的H1.30_L1.47)的说明性αCLDN6×αCD3bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其他链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αCLDN6×αCD3 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图22A至图22H描绘了呈2+1Fab2-scFv-Fc形式并包含CD3高-Int编号1scFv(VHVL取向或VLVH取向的H1.32_L1.47)的说明性αCLDN6×αCD3 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其他链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αCLDN6×αCD3 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图23描绘了命名为A)C6-10、B)C6-11、C)C6-15、D)C6-21、E)C6-24和F)C6-30的六种鼠抗人CLDN6二价mAb与已经转染以稳定表达人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293-Trex细胞以及亲本HEK293-Trex细胞的结合。克隆C6-11、C6-24和C6-30显示相对于CLDN9对CLDN6的选择性。
图24描绘了不同人源化框架中C6-30的人源化变体-(A)H1L1、(B)H1L2、(C)H2L1、(D)H2L2和(E)原始小鼠mAb与已经转染以稳定表达人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293-Trex细胞以及亲本HEK293-Trex细胞的结合。克隆C6-11、C6-24和C6-30显示相对于CLDN9对CLDN6的选择性。C6-30的人源化变体中的每个变体保留相对于CLDN9(以及相对于CLDN3和CLDN4)对CLDN6的选择性。
图25描绘了不同人源化框架中C6-11的人源化变体-(A)H1L1、(B)H1L2、(C)H2L1、(D)H2L2和(E)原始小鼠mAb与已经转染以稳定表达人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293-Trex细胞以及亲本HEK293-Trex细胞的结合。克隆C6-11、C6-24和C6-30显示相对于CLDN9对CLDN6的选择性。C6-30的人源化变体中的每个变体保留相对于CLDN9(以及相对于CLDN3和CLDN4)对CLDN6的选择性。
图26描绘了不同人源化框架中C6-24的人源化变体-(A)H1L1、(B)H1L2、(C)H2L1、(D)H2L2和(E)原始小鼠mAb与已经转染以稳定表达人CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的HEK293-Trex细胞以及亲本HEK293-Trex细胞的结合。克隆C6-11、C6-24和C6-30显示相对于CLDN9对CLDN6的选择性。C6-30的人源化变体中的每个变体保留相对于CLDN9(以及相对于CLDN3和CLDN4)对CLDN6的选择性。
图27描绘了在可变重链结构域中进行取代以去除降解(例如脱酰胺和天冬氨酸异构化)倾向的人源化C6-30的变体及其与CLDN6和CLDN9的结合效力。XENP35093(具有C6-30H1.9_L1)保持选择性，并且对CLDN6结合的损失最小。
图28描绘了A)XENP34228(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-24_H1L1×CD3 bsAb)、B)XENP34232(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-24_H1L1×CD3 bsAb)、C)XENP34229(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-30_H1L1×CD3bsAb)、D)XENP34233(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-30_H1L1×CD3bsAb)、E)XENP34637(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-30_H2L1×CD3bsAb)和F)XENP34638(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-30_H2L1×CD3bsAb)与表达人、食蟹猴和小鼠CLDN6的HEK293E细胞的结合。无论双特异性形式如何，变体中的每种变体均对人、食蟹猴和小鼠CLDN6具有交叉反应性。
图29描绘了A)XENP34228(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-24_H1L1×CD3 bsAb)、B)XENP34232(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-24_H1L1×CD3 bsAb)、C)XENP34229(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-30_H1L1×CD3 bsAb)、D)XENP34233(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-30_H1L1×CD3 bsAb)、E)XENP34637(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的C6-30_H2L1×CD3 bsAb)和F)XENP34638(呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-30_H2L1×CD3 bsAb)与表达CLDN6、CLDN6 I143V同种型、CLDN9、CLDN3和CLDN4的HEK293E细胞的结合。与在1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab2-scFv-Fc形式中显示相似选择性的人源化C6-24变体相反，人源化C6-30变体中的每个变体在2+1Fab2-scFv-Fc形式中显示增强的选择性。
图30描绘了来自人源化C6-30的单点突变文库的变体与表达CLDN6或CLDN9的293细胞的结合。图中的每个点代表测试制品，该测试物经过筛选以单剂量(30ug/ml)与CLDN6和CLDN9结合，并然后用流式细胞术分析以获得MFI值。选择向较高CLDN6 MFI值和较低CLDN9 MFI值偏斜的测试物(诸如散点图上圈出的那些)用于进一步开发。
图31A和图31B描绘了在A)第一实验和b)第二实验中，来自组合偏好的可变重链结构域和可变轻链结构域变体的文库的示例性C6-30变体(在二价mAb的情况下)与表达CLDN6或CLDN9的HEK293E细胞的结合的EC50。XENP26863是基于比较物CLDN6结合结构域的二价mAb。应当注意，来自实验的结合数据不能直接比较，因为转染细胞上的抗原密度在实验之间有所不同。尽管如此，与亲本人源化克隆(即XENP34218_H1L1和XENP34220_H2L1)相比且与比较物XENP26863相比，几种变体在选择性方面得到增强。
图32描绘了来自组合偏好的可变重链结构域和可变轻链结构域变体的文库的示例性C6-30变体与表达A)CLDN6或B)CLDN9的HEK293E细胞的结合。
图33描绘了来自组合偏好的可变重链结构域和可变轻链结构域变体的文库的示例性C6-30变体(在二价mAb的情况下)与表达CLDN6或CLDN9的HEK293E细胞的结合的EC50。XENP26863是基于比较物CLDN6结合结构域的二价mAb。与亲本人源化克隆(即XENP34218_H1L1和XENP34220_H2L1)相比，16种组合变体中的每种变体在选择性方面都得到增强。与比较物XENP26863相比，16种组合变体中的10种显示增强的选择性。
图34描绘了被格式化为二价单特异性mAb和2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的选定的C6-30变体与表达A)CLDN6或B)CLDN9的HEK293E细胞的结合。
图35描绘了1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc中的C6-24_H1L1、C6-30_H1L1和C6-30_H2L1与被转染以表达人A)CLDN5、B)CLDN8和C)CLDN17的细胞的结合。没有一个克隆与所研究的另外的密封蛋白发生交叉反应。
图36A至图36J描绘了本发明的几种形式。第一个是1+1Fab-scFv-Fc形式，具有第一抗抗原结合结构域和第二抗抗原结合结构域。另外，mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、中心-Fv、单臂中心-scFv、单scFv-mAb、scFv-mAb和双scFv形式均已展示。对于所描绘的所有scFv结构域，其可以是由N端到C端，重链可变-(任选的连接子)-轻链可变，或相反。另外，对于单臂scFv-mAb，scFv可以附接至重链单体的N末端或附接至轻链的N末端。
图37描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc bsAb(CD3高)形式的C6-24_H1L1、C6-30_H1L1和C6-30_H2L1对PA-1(CLDN6-高)细胞的RTCC诱导。2+1Fab2-scFv-Fc构建体显示出与1+1构建体相比低20-100倍的EC50。另外，与C6-30_H1L1相比，对于C6-30_H2L1而言，2+1与1+1构建体之间的效力变化高出约半对数。
图38描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的C6-24_H1L1、C6-30_H1L1和C6-30_H2L1在PA-1(CLDN6-高)细胞的存在下对CD8 T细胞的活化，其中CD3高如A)表达CD69的CD8 T细胞的百分比和B)表达CD107a的CD8 T细胞的百分比所示。
图39描绘了格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的RTCC诱导。与1+1形式相比，2+1形式能够对CLDN6+细胞产生更有效的RTCC活性。与比较物bsAb XENP26849相比，基于C6-30的bsAb显示出对CLDN9+细胞弱得多的RTCC诱导。具有较低亲和力CD3_高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc bsAb在脱靶CLDN9+细胞上诱导RTCC的效力低于具有高亲和力CD3_高的2+1bsAb。
图40描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对CD8 T细胞的活化(如CD107a表达所示)。
图41描绘了呈具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的C6-30_H1L1或C6-30_H2L1对A)PA-1(1.1×10^6个CLDN6密度)、B)OV-90(195K个CLDN6密度)、C)NEC-8(175K个CLDN6密度)和D)COV-318(11K个CLDN6密度)细胞的RTCC诱导。细胞杀伤活性与CLDN6抗原密度和CD3结合结构域的亲和力相关。
图42描绘了呈具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的C6-30_H1L1或C6-30_H2L1对PA-1(1.1×10^6个CLDN6密度)和B)OV-90(195K个CLDN6密度)的RTCC诱导的EC50。
图43描绘了在A)PA-1(1.1×10^6个CLDN6密度)、B)OV-90(195K个CLDN6密度)、C)NEC-8(175K个CLDN6密度)和D)COV-318(11K个CLDN6密度)细胞的存在下，呈具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的C6-30_H1L1或C6-30_H2L1对CD8 T细胞的活化(如CD107a表达所示)。T细胞活化与CLDN6抗原密度和CD3结合结构域的亲和力相关。
图44描绘了在A)PA-1(1.1×10^6个CLDN6密度)、B)OV-90(195K个CLDN6密度)、C)NEC-8(175K个CLDN6密度)和D)COV-318(11K个CLDN6密度)细胞的存在下，呈具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的C6-30_H1L1或C6-30_H2L1对CD8 T细胞活化的EC50(如CD107a表达所示)。
图45描绘了格式化为具有CD3高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30变体对以10:1效应子：靶标比率A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的RTCC诱导。与具有亲本C6-30_H1L1和C6-30_H2L1的bsAb相比，具有选择性工程改造的CLDN6结合结构域的bsAb显示出对CLDN6+细胞的调节活性和/或对CLDN9+细胞的调节活性。与亲本克隆相比，XENP37233显示出对CLDN9+细胞的类似活性，但对CLDN6+细胞的活性显著增强。与亲本克隆相比，XENP37227显示出对CLDN9+细胞的活性降低和对CLDN6+细胞的活性增强(尽管与XENP37233相比增强较少)。与亲本克隆相比，XENP37231显示出对CLDN9+细胞很少至没有活性，但对CLDN6+细胞活性略有降低。
图46描绘了格式化为具有CD3高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30变体对以1:1效应子：靶标比率A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的RTCC诱导。
图47描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对CD8 T细胞的活化(如CD69表达所示)。
图48描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对CD8 T细胞的活化(如CD107a表达所示)。
图49描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)比稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对T细胞的IFNγ分泌(如IFNγ分泌所示)。
图50描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对T细胞的IL-2分泌(如IL-2分泌所示)。
图51描绘了在A)HUTU-80(CLDN6高)和B)被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的存在下，格式化为具有CD3高或CD3高-Int编号1的1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc bsAb的C6-30对T细胞的TNFα分泌(如TNFα分泌所示)。
图52A-52H描绘了A)XENP37227(C6-30_H1.9_L1.187)、B)XENP37228(C6-30_H1.19_L1.187)、C)XENP37229(C6-30_H1.22_L1.187)、D)XENP37230(C6-30_H1.22_L1.189)、E)XENP37231(C6-30_H1.24_L1.187)、F)XENP37232(C6-30_H1.24_L1.189)、G)XENP37233(C6-30_H2.91_L1.187)和H)XENP35386(C6-30_H1L1)对HUTU-80(CLDN6高)和被稳定转染以表达CLDN9(CLDN9高)的CLDN293-Trex的RTCC诱导的重叠，前述抗体中的每一者是呈具有CD3高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc形式的双特异性抗体。每种bsAb可以以高浓度给药以实现对CLDN6+细胞的有效杀伤，同时避免对CLDN9+细胞的杀伤。
图53描绘了A)XENP37233、XENP37227、XENP37231和XENP37630以1:1效应子：靶标比率对PA-1(CLDN6高)细胞的RTCC诱导(包括EC50值)，以及如B)CD25表达和C)CD107a表达所示的CD8+T细胞活化。
图54描绘了XENP37541以密度依赖性方式结合表达CLDN6的细胞的能力。将PA-1细胞工程化以稳定表达一定范围的CLDN6抗原密度。将XENP37541与一定剂量范围的细胞一起温育。将细胞洗涤，用二抗染色，并再次洗涤，然后使用流式细胞术进行分析。XENP37541能够结合具有较低水平的CLDN6表达的细胞，甚至水平低至47k CLDN6抗原/细胞。
图55描绘了对经工程化以表达一定范围的CLDN6抗原水平的PA-1细胞的RTCC诱导，其在附图中的EC50图表中进行了注释。在测量RTCC之前，采用1:1的效应子：靶细胞比率和72小时的温育时间。结果显示，XENP37541、XENP37634和XENP37545都能够以CLDN6密度依赖性方式诱导RTCC，而阴性对照RSV×CD3 bsAb XENP32140则不能。XENP37541在所有不同水平的CLDN6表达中显示出最强的效力和最低的EC50值。
图56描绘了以0.3mg/kg、1.0mg/kg或3.0mg/kg*给药PBS和XENP37233、XENP37227、XENP37630或XENP37231的PA-1和huPBMC植入的NSG小鼠中A)随时间、B)第14天和C)第20天(第0天的第1次给药后)的肿瘤体积的变化(如通过卡尺测量所确定的)表示与PBS组相比，p<0.05(使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)对基线校正肿瘤体积进行统计分析)。到第14天，与PBS对照相比，双特异性抗体中的每种抗体都增强了抗肿瘤活性。
图57描绘了在A)XENP37541、B)XENP37545、C)XENP37547和D)XENP37634各自的药代动力学中观察到的剂量响应。
图58描绘了60X剂量后XENP37541、XENP37545、XENP37547和XENP37634各自的血液浓度的叠加。
图59A至图59B描绘了呈2+1Fab2-scFv-Fc形式并包含CD3高-Int编号2scFv(VHVL取向或VLVH取向的H1.89_L1.47)的说明性αCLDN6×αCD3 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其他链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αCLDN6×αCD3bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图60A和图60B描述了包含比较物CLDN6结合结构域Comp_CHO02的序列。XENP37217包含呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的该比较物CLDN6结合结构域，而XENP38084包含呈二价抗体形式的结合结构域。
图61A至图61C描绘了C6-30变体以及比较物CLDN6×CD3 bsAbXENP37217与其他密封蛋白家族成员CLDN3、CLDN4、CLDN8和CLDN17的结合。将293细胞瞬时转染以表达CLDN3、CLDN4、CLDN8或CLDN17。将细胞接种并以100μg/ml剂量将每种测试物添加到每个细胞系中。在4℃处温育1小时后，将细胞洗涤并添加二级AF647抗体。将细胞在4℃处再温育一小时，随后进行另外的洗涤，并然后通过流式细胞术进行分析。比较分子XENP37217显示与CLDN8和CLDN17的结合显著高于任何C6-30变体。
具体实施方式
本发明提供了结合到人CD3ε和人CLDN6的异二聚双特异性抗体。
I.概述
共同结合CD3和肿瘤抗原靶标的抗双特异性抗体用于重定向T细胞以攻击和裂解靶向的肿瘤细胞。示例包括和DART形式，它们单价结合CD3和肿瘤抗原。虽然靶向CD3的方法已显示出相当大的前景，但此类疗法的常见副作用是相关的细胞因子产生，往往会导致毒性细胞因子释放综合征。由于双特异性抗体的抗CD3结合结构域与所有T细胞结合，因此募集了高产生细胞因子的CD4 T细胞亚群。此外，CD4 T细胞亚群包括调节性T细胞，所述调节性T细胞的募集和扩增可能会导致免疫抑制并对长期肿瘤抑制具有负面影响。此外，这些形式不包含Fc结构域并且在患者中显示出非常短的血清半衰期。
本文提供了新型抗CD3×抗CLDN6(也称为抗CLDN6×抗CD3、αCD3×αCLDN6、αCLDN6×αCD3或有时仅为CLDN6×CD3)异二聚双特异性抗体和使用此类抗体用于治疗癌症的方法。具体地，本文提供了多种形式的抗CD3、抗CLDN6双特异性抗体。这些双特异性抗体可用于治疗癌症，尤其是那些CLDN6表达增加的癌症，例如肾细胞癌。此类抗体用于将CD3+效应T细胞引导到CLDN6+肿瘤，从而允许CD3+效应T细胞攻击并裂解CLDN6+肿瘤。
另外，本发明的双特异性抗体还区分CLDN6和CLDN家族的其他成员。虽然CLDN6在癌症上表达，但CLDN9在健康组织(例如子宫颈和食管)中更高地表达，因此CLDN6治疗剂与CLDN9的交叉反应性可能导致脱靶毒性。然而，CLDN6与CLDN9有96％相同性，在它们的胞外环中仅有3个残基不同(如图12中所示)；因此，开发能够相对于CLDN9选择性地结合CLDN6的抗体以及相对于CLDN家族的其他成员(包括CLDN3和CLDN4)优先结合CLDN6的CLDN6抗原结合结构域(ABD)的选择性是重大挑战。因此，本发明包括相对于CLDN9优先结合CLDN6的抗体和/或抗原结合结构域以及抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体中的这些ABD。
此外，在一些实施方案中，本公开提供了对人CD3具有不同结合亲和力的双特异性抗体，该双特异性抗体可以改变或减少抗CD3疗法的潜在副作用。也就是说，在一些实施方案中，本文所述的抗体提供了抗体构建体，所述抗体构建体包含抗CD3抗原结合结构域，所述抗CD3抗原结合结构域是与CD3的“强”或“高亲和力”结合物(例如，一个示例是描述为H1.30_L1.47的重链和轻链可变结构域(任选地包括适当的带电荷接头))并且还与CLDN6结合。在其它实施方案中，本文所述的抗体提供了抗体构建体，所述抗体构建体包含抗CD3抗原结合结构域，所述抗CD3抗原结合结构域是与CD3的“轻度”或“低亲和力”结合物。另外的实施方案提供了抗体构建体，所述抗体构建体包含抗CD3抗原结合结构域，所述抗CD3抗原结合结构域对也结合CLDN6的CD3具有中度或“中等”亲和力。虽然可以使用非常大量的抗CD3抗原结合结构域(ABD)，但特别有用的实施方案使用6种不同的抗CD3 ABD，尽管它们可以如本文所讨论的以两种scFv取向使用。通常使用Biacore测定测量亲和力。
应当理解的是，本文提供的“高、中、低”抗CD3序列可以如本文所讨论的多种异二聚化形式使用。通常，由于T细胞募集的潜在副作用，示例性实施方案利用仅单价结合CD3的形式，诸如图17A和图17B中描绘的，并且在本文描绘的形式中，CD3 ABD是如本文更充分描述的scFv。相比之下，主题双特异性抗体可以单价(例如图17A)或二价(例如图17B)地结合CLDN6。
本文提供了包含CLDN6结合结构域的组合物，该组合物包含具有此类CLDN6结合结构域的抗体(例如，CLDN6×CD3双特异性抗体)。包含此类CLDN6结合结构域的本发明抗体有利地引发一系列不同的免疫应答，这取决于所使用的特定CLDN6结合结构域。例如，本发明抗体在对具有不同CLDN6表达的细胞的选择性、对于CLDN6表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性CLDN6的敏感性方面表现出差异。此类CLDN6结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗CLDN6相关癌症。
因此，在一个方面中，本文提供了与两种不同抗原结合的异二聚抗体，例如抗体是“双特异性的”，因为所述抗体与两种不同的靶抗原结合，通常是如本文所述的CLDN6和CD3。这些异二聚抗体可以与这些靶抗原(例如，存在单个抗原结合结构域，如可变重链和可变轻链结构域对)或二价地(存在各自独立地与抗原结合的两个抗原结合结构域)单价地结合。在一些实施方案中，本文提供的异二聚抗体包含一个CD3结合结构域和一个CLDN6结合结构域(例如，本文描述的“1+1Fab-scFv-Fc”形式的异二聚抗体)。在其他实施方案中，本文提供的异二聚抗体包括一个CD3结合结构域和两个CLDN6结合结构域(例如，本文描述的“2+1Fab2-scFv-Fc”形式的异二聚抗体)。本文提供的异二聚抗体基于使用不同的单体，所述不同的单体含有使异二聚体相比于同源二聚体“偏斜”形成的氨基酸取代，如以下更完整地概述的，所述不同的单体与允许异二聚体远离同源二聚体的简单纯化的“pI变体”结合，如以下类似地概述的。所提供的异二聚双特异性抗体通常依赖于使用可以在生产细胞中自组装以产生异二聚蛋白的工程化或变体Fc结构域，以及产生和纯化此类异二聚蛋白的方法。
II.命名法
本文提供的抗体以若干种不同的格式列出。在一些实例中，特定抗体中的每个单体被给予唯一的“XENP”编号，但是如本领域中将理解的，较长的序列可能含有较短的XENP编号。例如，1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的“scFv-Fc”单体可以具有第一XENP编号，而scFv结构域本身将具有不同的XENP编号。一些分子具有三种多肽，因此具有组分的XENP编号被用作名称。因此，呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的分子XENP37630包含三个序列(参见图59A)：“Fab-Fc重链”单体(“链1”)；2)“Fab-scFv-Fc重链”单体(“链2”)；和3)“轻链”(“链3”)单体或等同物，尽管本领域技术人员能够通过序列比对容易地鉴定这些。这些XENP编号在序列表以及标识符中，并且在附图中使用。另外，包括三个组分的一个分子产生多个序列标识符。例如，Fab的列表包括全重链序列、可变重链结构域序列和可变重链结构域序列的三个CDR、全轻链序列、可变轻链结构域序列和可变轻链结构域序列的三个CDR。Fab-scFv-Fc单体包括全长序列、可变重链结构域序列、3个重链CDR序列和一个scFv序列(包括scFv可变重链结构域序列、scFv可变轻链结构域序列和scFv接头)。应注意，本文中具有scFv结构域的一些分子使用单个带电荷的scFv接头(+H)，但也可以使用其它的。另外，特定抗原结合结构域(例如，CLDN6和CD3结合结构域)的术语命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类形式，其中编号作为特定可变链序列的唯一标识符。因此，抗原结合结构域的Fv结构域是“H1 L1”，其指示可变重链结构域H1与轻链结构域L1组合。在这些序列用作scFv的情况下，名称“H1 L1”指示可变重链结构域，H1与轻链结构域L1组合并且从N末端到C末端处于VH-接头-VL取向。具有重链可变结构域和轻链可变结构域的相同序列但是所述序列处于倒序(从N末端到C末端是VL-接头-VH取向)的这种分子将被命名为“L1_H1.1”。类似地，不同构建体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和附图中将显而易见的。
另外，本发明的双特异性抗体在本文中称为“抗CD3×抗CLDN6”、“αCD3×αCLDN6”、“αCLDN6×αCD3”或有时仅称为“CLDN6 X CD3”。如将在下文中所讨论，抗原的顺序不是决定性的，尽管大多数用作scFv的形式具有作为scFv的抗CD3 ABD。
III.定义
为了可以更全面地理解本申请，下面阐述几个定义。此类定义意在涵盖语法等同物。
本文中的“CLDN6”意指属于密封蛋白家族的蛋白质。CLDN6序列描绘在例如图11中。本发明的ABD与人CLDN6结合。
本文中通过“消融”意指活性的降低或去除。因此举例而言，“消融FcγR结合”意指与不含特定变异体的Fc区相比，Fc区氨基酸变异体具有小于50％起始结合，较佳具有大于70-80-90-95-98％活性损失，且一般而言，活性低于Biacore、SPR或BLI分析中的可侦测结合的水平。特别用于FcγR结合的消融的是图3所示的那些变体，所述变体通常添加到两个单体中。
如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa结合的增加引起ADCC活性的增加。
如本文所用，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬意指其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞吞噬的细胞介导反应。
如本文所用，通常使用术语“抗体”。本文所述的抗体可以采取如本文所述的多种形式，包括传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物，包括本文所述的多种双特异性形式。
传统的免疫球蛋白(Ig)抗体是“Y”形四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”单体(通常分子量为约25kDa)和一个“重链”单体(通常分子量为约50kDa-70kDa)。
其他有用的抗体形式包括但不限于本文所述的1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab-scFv-Fc抗体形式，以及“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心-Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双scFv”和“三叉”形式抗体，如下文所讨论。
抗体重链通常包含可变重链(VH)结构域，该结构域包含vhCDR1-3；以及Fc结构域，该Fc结构域包含CH2-CH3单体。在一些实施方案中，抗体重链包含铰链和CH1结构域。传统的抗体重链是从N末端到C末端如下组织的单体：VH-CH1-铰链-CH2-CH3。CH1-铰链-CH2-CH3统称为抗体的重链“恒定结构域”或“恒定区”，其中有五种不同的类别或“同种型”：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。因此，如本文所用的“同种型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如在以引用方式并入的美国公开2009/0163699中所示，本文所述的抗体包含使用人IgG1/G2杂交体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包括IgG同种型恒定结构域，所述IgG同种型恒定结构域具有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白质结构域。本文中通过“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白的区域。本文所述的抗体中感兴趣的是重链结构域，包括恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情形中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的上下文中，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU编号的位置118-220。“CH2”根据如Kabat中的EU编号是指位置237-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU编号是指位置341-447。如本文所示和下文所描述，pI变体可以处于CH区的一个或多个CH区以及铰链区中，如下文所讨论。
应注意，IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多型性的不同同种异型。本文描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包含IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有替代356D/358M同种异型的356E/358L。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如以引用方式并入的美国公开2009/0163699中所示，本发明的抗体在一些实施方案中包含IgG1/IgG2杂交体。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”指包含抗体的恒定区，在一些情况下不包含所有第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1)或其一部分，并且在一些情况下，任选地包括铰链的全部或一部分的多肽。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白质结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N末端到C末端包括CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施方案中，Fc结构域是来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中人IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3特别用于许多实施方案中。另外，在人IgG1 Fc结构域的情况下，铰链时常包括C220S氨基酸取代。另外，在人IgG4 Fc结构域的情况下，铰链时常包括S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基末端包含残基E216、C226或A231，其中编号是根据如Kabat中的EU索引进行的。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FcγR或FcRn的结合。
本文中的“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部分，不包括可变重链结构域；在人IgG1的EU编号中，这是氨基酸118-447。本文中的“重链恒定区片段”意指从N末端和C末端中的任一者或两者含有较少氨基酸但仍保持能够与另一个重链恒定区形成二聚体的重链恒定区。
重链的另一种类型的Ig域是铰链区。本文的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域结束于EU位置215处，且IgG CH2结构域开始于残基EU位置231处。因此本文中对于IgG而言定义抗体铰链包含位置216(在IgG1中为E216)至230(在IgG1中为p230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N末端和C末端中任一个或两个处含有较少氨基酸。如本文所指出的，pI变体也可以处于铰链区中。在本文中许多抗体具有被丝氨酸代替的在根据EU编码(铰链区)的位置220处的至少一个半胱氨酸。通常，这种修饰在本文所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧上，但是其也可以是在“Fab单体”侧上或在两者上以减少二硫化物形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。
如本领域的技术人员将理解的，在不同的编号系统之间，重恒定区结构域的精确编号和布置可以有所不同。根据EU和Kabat的重恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人，1969,《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》63:78-85，以及Kabat等人，1991,《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，国立卫生研究院(NationalInstitute of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入。
表1
EU编号 Kabat编号
CH1 118-215 114-223
铰链 216-230 226-243
CH2 231-340 244-360
CH3 341-447 361-478
抗体轻链通常包含两个结构域：可变轻链结构域(VL)，所述可变轻链结构域包含轻链CDRvlCDR1-3，以及恒定轻链区(往往称为CL或Cκ)。抗体轻链通常从N末端到C末端如下组织：VL-CL。
本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)在作为多肽序列的一部分存在时与如本文所讨论的靶抗原(例如，CLDN6或CD3)特异性地结合。如本领域中已知，这些CDR通常作为第一组可变重链CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻链CDR(vlCDR或VLCDR)存在，其各自包含三个CDR：vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3可变重链CDR和vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3 vhCDR3可变轻链CDR。CDR存在于可变重链结构域(vhCDR1-3)和可变轻链结构域(vlCDR1-3)中。来自Fv区的可变重链结构域和可变轻链结构域。
本文所述的抗体提供大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链CDR和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以尊敬地是较大可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以在单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下在单个多肽链上。
如本领域技术人员将理解，CDR的确切编号和位置在不同编号系统中可以是不同的。然而，应理解，可变重序列和/或可变轻序列的公开包含相关(固有)CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1):55-77(2003)：
表2
在整个本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统并且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。
CDR有助于形成抗原结合结构域和抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子的组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。
表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，所述免疫分析显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“分箱”。如下所述，本公开不仅包括本文列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域的六个CDR源自可变重链结构域和可变轻链结构域。在“Fab”形式中，该组6个CDR源自两个不同的多肽序列、可变重链结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻链结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C末端附接至重链的CH1结构域的N末端，并且vl结构域的C末端附接至恒定轻链结构域的N末端(从而形成轻链)。在scFv形式中，vh结构域和vl结构域通常通过使用如本文概述的接头(“scFv接头”)二价附接至单个多肽序列中，这可以是(从N末端开始)vh-接头-vl或vl-接头-vh，通常优选的是前者(包含各侧上的任选结构域接头，这取决于所使用的形式(例如，根据图36))。通常，scFv结构域的C末端附接至第二单体中的铰链的N末端。
如本文所用，“可变区”或“可变结构域”意指包括基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因基因座的任何Vκ、Vλ和/或VH基因编码的一个或多个Ig结构域并且含有赋予抗原特异性的CDR的免疫球蛋白的区域。因此，“可变重链结构域”与“可变轻链结构域”配对以形成抗原结合结构域(“ABD”)。另外，每个可变结构域包括从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置的三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)(可变重链结构域的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和可变轻链结构域的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)和四个框架(FR)区：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。高变区通常涵盖来自轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》，第5版贝塞斯达马里兰州国家卫生研究院公共卫生服务部(Public HealthService,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917。表2中描述了本发明的特定CDR。
如本文所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL以及CL免疫球蛋白结构域的多肽，所述结构域通常位于两条不同的多肽链上(例如VH-CH1位于一个链上而VL-CL位于另一个链上)。Fab可以指分离情况下的这个区或在本文所述的双特异性抗体的背景下的这个区。在Fab的情形中，除了CH1和CL结构域之外，Fab还包括Fv区。
如本文所使用的，“Fv”或“Fv片段”意指包括ABD的VL和VH结构域的多肽。Fv区可以格式化为Fab(如上文所讨论的，通常是还包含如上文概述的恒定区的两种不同的多肽)和scFv两者，其中VL和VH结构域组合(通常是与如本文所讨论的接头组合)以形成scFv。
本文中通过“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头来共价附接至可变轻链结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重链结构域。scFv结构域由N末端至C末端可呈任一定向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。在序列表和图中所描绘的序列中，VH和VL结构域的顺序在名称中指示，例如，H.X_L.Y意指N末端到C末端是VH-接头-VL，并且L.Y_H.X是VL-接头-VH。
本文提供的主题抗体的一些实施方案包括至少一个scFv结构域，所述至少一个scFv结构域虽然不是天然发生的但是通常包含通过scFv接头连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常由N末端到C末端定向为VH-scFv接头-VL，但是针对任一个scFv结构域(或使用Fab的vh和vl序列构建的那些)，这种定向可以逆向，成为VL-scFv接头-VH，其中取决于格式，任选的接头位于一个末端或两个末端。
本文中的“修饰”指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中通过“氨基酸修饰”指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。出于清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA中的密码子的20种氨基酸。
本文中通过“氨基酸取代”或“取代”指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施例中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为了清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在其起始的特定位置具有相同氨基酸，则其不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后且在位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，但并没有多得使得变体蛋白质使用如下所述比对程序将不与亲本蛋白质比对。通常，使用下文所述的比对程序(如BLAST)，变体蛋白质(如本文概述的变体Fc结构域等)与亲本蛋白质通常至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。如本文所用，“变体”还指赋予特定功能的特定氨基酸修饰(例如，“异二聚化变体”、“pI变体”、“消融变体”等)。
如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽是人野生型序列，诸如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定结构域或Fc区，但是具有变体的人序列还可以用作“亲本多肽”，例如可以包含美国公开2006/0134105的IgG1/2杂交体。本文的蛋白质变体序列将优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的同一性，并且最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。因此，如本文所用，“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，如本文所用，“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG(再次，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且如本文所用，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括如与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比，在Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。
如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引进行的。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的实体可以是非特异性的，在此情况下前述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如428L/434S与434S/428L是相同的Fc变体，以此类推。对于本文所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段(例如，Fc结构域)的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU索引进行的。“EU索引”或“如Kabat编号或EU编号”方案中的“EU索引”指EU抗体的编号(Edelman等人，1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85，所述文献在此通过引用整体并入)。
一般来说，变异体Fc结构域与对应的亲本人类IgG Fc结构域具有至少约80、85、90、95、97、98或99％的一致性(使用下文论述的一致性算法，其中一个实施例利用如所属领域中已知的BLAST算法，使用默认参数)。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。另外，如本文所讨论的，本文所述的变体Fc结构域仍然保持与另一个Fc结构域形成二聚体的能力，如使用本文所述已知技术如非变性凝胶电泳所测量。
本文的“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，构成本文所述的抗体的多肽可以包含一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、循环变换、环化、其它分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
如本文所用，“残基”意指蛋白质中的位置以及其相关的氨基酸同一性。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所用的“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的对齐的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。举例来说，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
如本文所用，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为人IgG均不包括位置434处的丝氨酸，因此IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被认为是非天然发生修饰。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然发生的氨基酸中的一种。
如本文所用，“效应子功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所用，“IgG Fc配体”意指来自与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人，2002,《免疫学评论(Immunological Reviews)》190:123-136，其通过引用整体并入)。Fc配体可包括结合Fc的未发现的分子。特别的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所用，“Fc配体”意指来自与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。
如本文所用，“Fcγ受体”或“FcγR”或“FcgammaR”意指与IgG抗体Fc区结合并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等人，2002,《免疫快报(Immunol Lett)》82:57-65，其通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包含但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指与IgG抗体Fc区结合并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中所已知，功能FcRn蛋白包括两种多肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。各种FcRn变体用于增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。“FcRn变异体”增强与FcRn受体的结合，且适合的FcRn变异体在下文中展示。
如本文所用，“亲本多肽”意指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程化型式。因此，如本文所用，“亲本免疫球蛋白”意指被修饰以产生变体的未经修饰免疫球蛋白多肽，并且如本文所用，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的未经修饰抗体。应注意，“亲本抗体”包含如下文概述的已知的市售、以重组方式产生的抗体。在此情形中，“亲本Fc结构域”将是相对于所列举变体；因此，将“变体人IgG1 Fc结构域”与人IgG1的亲本Fc结构域相比较，将“变体人IgG4 Fc结构域”与亲本Fc结构域人IgG4相比较等。
如本文所用，“位置”指蛋白质序列中的位置。位置可顺序地或根据已建立格式例如抗体编号的EU索引进行编号。
如本文所用，“靶抗原”意指通过包括给定抗体的可变区的抗原结合结构域来特异性地结合的分子。
本文所述的异二聚抗体的单体的下背景通过“链性(strandedness)”意指与“匹配”的两条DNA链相似，将异二聚化变体并入每种单体中以保留“匹配”以形成异二聚体的能力。举例来说，如果将一些pI变异体工程化到单体A(例如使得pI更高)中，那么同样可以使用的作为“电荷对”的空间变异体不会干扰pI变异体，例如将使得pI更高的电荷变异体放在相同“链”或“单体”上以保留两种功能。类似地，对于如下文更全面概述的组中成对出现的“偏斜”变异体来说，所属领域的技术人员在决定所述一组对将进入哪个链或单体时考虑pI，以使得使用偏斜变异体的pI也使pI分离最大化。
如本文所用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
在产生根据本文所述的双特异性抗体的上下文中，“宿主细胞”意指含有对双特异性抗体的组分进行编码的外源性核酸并且能够在适合条件下表达双特异性抗体的细胞。下文中讨论了适合的宿主细胞。
本文中通过“野生型或WT”意指天然发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。WT蛋白质具有尚未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文提供了与人抗体结构域具有序列同一性的多个抗体结构域。两个类似序列(例如，抗体可变结构域)之间的序列同一性可以通过诸如以下文献中的算法测量：Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“生物序列的比较(Comparison Of Biosequences)”,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482[局部同源算法]；Needleman,S.B.和Wunsch,CD.(1970)“可适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列中的类似性的一般方法(A General MethodApplicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of TwoProteins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443[同源比对算法]，Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988)“用于生物序列比较的改进的工具(Improved Tools For BiologicalSequence Comparison)”,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))》85:2444[类似性搜索方法]；或Altschul,S.F.等人，(1990)“基本局部比对搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)”，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-10，“BLAST”算法，参见https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。当使用前述算法中的任一种时，使用默认参数(用于窗口长度、空位罚分等)。在一个实施方案中，使用默认参数用BLAST算法来完成序列同一性。
本文所述的抗体通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”意指在外源性宿主细胞中使用重组核酸技术产生抗体，并且也可以分离抗体。
“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意味着与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以如下测量：例如相比于对照分子的结合来确定一种分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。
特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体来展现，所述抗体针对抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，特异性结合抗原的抗体的KD是对照分子相对于抗原或表位的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体来展现，所述抗体具有的对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照要大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI测定来测量。
IV.本发明的抗体
本发明提供了与人CLDN6结合的抗体，包括单克隆抗体和双特异性抗体(应注意，为了便于临床前测试，许多(如果不是大多数的话)示例性抗体也与食蟹猴CLDN6结合，但这不是所有实施方案中都需要的)。特别地，提供了结合CD3和CLDN6的双特异性抗体，其呈现如下文更全面描述的多种形式。
特别感兴趣的是相对于CLDN9优先结合CLDN6的抗CLDN6抗原结合结构域(以及含有它们的抗体)。
1.抗体
本文提供的抗体包括不同的抗体结构域，如下文更全面地描述。如本文所述以及所属领域中已知，本文所述的抗体包含重链和轻链内的不同结构域，所述结构域也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重链结构域、可变轻链结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
具体地，图17和图36所描绘的形式通常被称为“异二聚抗体”，意指蛋白质具有自组装成异二聚体Fc结构域中的至少两个相关Fc序列以及至少两个Fv区，无论是作为Fab还是作为scFv。
a.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文所述的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包括人类抗体或由其组成，所述人类抗体包括作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链可变区或轻链可变区。作为人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”其的人类抗体可以通过将人类抗体的氨基酸序列与人类生殖系免疫球蛋白的氨基酸序列比较且选择与人类抗体的序列在序列方面最接近(也就是说，最大同一性％)的人类生殖系免疫球蛋白序列(使用本文所概述的方法)来鉴别出来。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％相同，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，含有将抗体鉴定为源自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人类化抗体的氨基酸序列与生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。通常，来源于特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个-20个氨基酸差异(在引入本文中的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本文所述的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，相比于由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示出不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本文所述的变体之前，变体的数量通常较低)。在一些实施方案中，氨基酸差异在6个CDR中的一者或多者中。在一些实施方案中，氨基酸差异在VH框架区和/或VL框架区中。
在一个实施方案中，亲本抗体已经发生亲和力成熟，如所属领域中已知。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。可以采用基于选择的方法以对抗体可变区进行人源化和/或亲和力成熟，所述方法包含但不限于以下所述的方法：Wu等人，1999,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》294:151-162；Baca等人，1997,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272(16):10678-10684；Rosok等人，1996,《生物化学杂志》271(37):22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》95:8910-8915；Krauss等人，2003,《蛋白质工程化》16(10):753-759，所述文献均通过引用整体并入。其他人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人，2002,《免疫学杂志(J.Immunol.)》169:1119-1125；De Pascalis等人，2002,《免疫学杂志》169:3076-3084，所述文献均通过引用并入。
2.异二聚抗体
在例示性实施方案中，本文提供的双特异性抗体是包含两个变异Fc结构域序列的异二聚双特异性抗体。此类变体Fc结构域包含氨基酸修饰以促进异二聚抗体的自组装和/或纯化。
抗体技术中正存在的一个问题是期望“双特异性”抗体同时与两种不同抗原结合，通常由此允许不同抗原接近且从而产生新功能和新疗法。通常，这些抗体是通过将每条重链和轻链的基因纳入宿主细胞中来产生。这通常导致期望的异二聚体(A-B)以及两个同源二聚(A-A和B-B(不包含轻链异二聚体问题))形成。然而，形成双特异性抗体的主要障碍是难以使期望异二聚抗体的形成偏向于同源二聚的形成和/或难以从同二聚抗体中纯化异二聚抗体。
存在多种机制可以用于产生主题异二聚抗体。另外，如本领域的技术人员将理解的，这些不同的机制可以组合以确保高异二聚化。促进异二聚体的产生和纯化的氨基酸修饰通常统称为“异二聚化变体”。如下文所讨论，异二聚化变体包括“偏斜”变体(例如下文所述的“杵和臼”以及“电荷对”变体)以及“pI变体”，其允许从同源二聚体中纯化异二聚体。如在美国专利US 9,605,084(其全部内容通过引用并入本文)中一般性描述的，并且特别是如下文对异二聚化变体所讨论，异二聚化的有用机理包括美国专利US 9,605,084中所述的“杵和臼”(“KIH”)、美国专利US 9,605,084中描述的“静电转向(electrostaticsteering)”或“电荷对”、美国专利US 9,605,084中描述的pI变体以及美国专利US 9,605,084中概述的一般其它Fc变体及以下内容。
可用于形成和纯化主题异二聚抗体(例如，双特异性抗体)的异二聚化变体在下文进一步详细讨论。
a.偏斜变体
在一些实施方案中，异二聚抗体包含偏斜变体，该偏斜变体是在第一Fc结构域(A)和/或第二Fc结构域(B)中的一个或多个氨基酸修饰，一个或多个氨基酸修饰有利于形成Fc异二聚体(包含第一Fc结构域和第二Fc结构域的Fc二聚体)；(A-B)超过Fc同源二聚体(包含第一Fc结构域中的两个或第二Fc结构域中的两个的Fc二聚体；A-A或B-B)。合适的偏斜变体包括在美国公开申请号2016/0355608的图29以及图1中，该申请在此通过引用整体并入并且具体地并入其对偏斜变体的公开内容。
因此，将允许形成异二聚Fc区的合适的Fc异二聚化变体对在图1中示出。因此，第一Fc结构域具有第一Fc异二聚化变体，并且第二Fc结构域具有选自图1中的对的第二Fc异二聚化变体。
一种机制在本领域中通常称为“杵和臼”，是指也可以任选地使用产生空间影响以利于异二聚体形成和不利于同源二聚体的形成的氨基酸工程；这有时称为“杵和臼”，如USSN 61/596,846，Ridgway等人，《蛋白质工程(Protein Engineering)》9(7):617(1996)；Atwell等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》1997 270:26；美国专利号8,216,805中所述，所有所述文献据此全文以引用方式并入。附图标识了许多依赖于“旋钮和孔”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人，《自然·生物技术(Nature Biotech)》16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以偏斜形成异二聚化。
用于生成异二聚体的另外的机制有时被称为“静电转向”，如Gunasekaran等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》285(25):19637(2010)中所述，所述文献据此全文以引用方式并入。这在本文有时被称为“电荷对”。在此实施方案中，静电用于使形成朝着异二聚化偏斜。如本领域的技术人员将理解的，这些电荷对还可能影响pI并因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些是为了强制发生异二聚化而生成并且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包含但不限于，与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
在一些实施方案中，偏斜变体有利地并且同时有利于基于“杵和臼”机制以及“静电转向”机制的异二聚化。在一些实施方案中，异二聚抗体包含一组或多组此类异二聚化偏斜变体。这些变体以成“对”的“组”出现。也就是说，所述对中的一组并入第一单体中并且所述对中的另一组并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“杵和臼”变体，其中在一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间存在一一对应。也就是说，这些成对的组相反可以形成两个单体之间的界面，所述界面鼓励异二聚体形成并且不鼓励同源二聚形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚A/A:50％异二聚体A/B:25％同源二聚B/B)。图1中描绘了示例性的异二聚化“偏斜”变体。此类“偏斜”变体包括但不限于：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q(EU编号)。
在示例性实施方案中，异二聚抗体包括Fc异二聚化变体作为组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫化物、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)都是Fc异二聚化变体的“偏斜”变体氨基酸取代组。在示例性实施方案中，异二聚抗体包含“S364K/E357Q：L368D/K370S”氨基酸取代集。就命名而言，对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指一个单体包括具有氨基酸取代S364K和E357Q的Fc结构域，且另一单体包括具有氨基酸取代L368D和K370S的Fc结构域；如上所述，这些对的“链性”取决于起始pI。
在一些实施方案中，本文提供的偏斜变体可以任选地并且独立地与任何其他修饰——包括但不限于其他偏斜变体(参见例如，美国公开申请号2012/0149876号的图37中，所述美国公开申请通过引用并入本文，特别是出于其对偏斜变体的公开的原因而并入)、pI变体、同种型变体、FcRn变体、消融变体等——一起结合到异二聚抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一者或两者中。此外，单个修饰也可以独立地并且任选地包含在主题异二聚抗体中或从主题异二聚抗体中排除。
额外单体A和单体B变异体可以任选地且独立地以任何量与其它变异体(如本文所概述的pI变异体或US2012/0149876的图37中所示的其它空间变异体，其中的图和图例和SEQ ID NO特此并入本文中供参考)组合。
在一些实施方案中，本文所概述的空间变体可以任选且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)并入到一个或两个单体中，并且可以独立且任选地包含在本文所述的抗体的蛋白质中或从本文所述的抗体的蛋白质中排除。
合适的偏斜变体的列表在图1中找到。包含但不限于以下的成对的组特别用于许多实施方案中：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。就命名法而言，对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体中的一者具有双变体组S364K/E357Q并且另一者具有双变体组L368D/K370S。
b.用于异二聚体的pI(等电点)变体
在一些实施方案中，异二聚抗体包含有利地允许从同源二聚体蛋白质分离异二聚抗体(例如，抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体)的纯化变体。
存在若干种基本机制可以导致易于纯化异二聚化抗体。例如，对抗体重链单体A和B中的一者或两者的修饰，使得每个单体具有不同的pI，允许从单体A-A和B-B蛋白等电纯化异二聚A-B抗体。可替代地，一些支架形式，如“1+1Fab-scFv-Fc”和“2+1Fab2-scFv-Fc”形式，也允许基于大小进行分离。如本文所述，还可能使用偏斜变体，相对于同源二聚“偏斜”异二聚体的形成。因此，异二聚化偏斜变体和pI变体的组合特别用于本文提供的异二聚抗体中。
另外，如下文更全面地概述的，根据异二聚抗体的格式，可以使用包含在单体的恒定区和/或Fc结构域内的pI变体和/或结构域接头。在一些实施方案中，异二聚抗体包含对于还可以产生pI变化的替代性功能的另外的修饰，如Fc、FcRn和KO变体。
在一些实施方案中，本文提供的主题异二聚抗体包含至少一个单体，所述至少一个单体具有改变单体的pI的一个或多个修饰(即，“pI变体”)。通常，如本领域技术人员将了解的，存在两种一般类别的pI变体：增大蛋白质的pI(碱性变化)的变体和减小蛋白质的pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。作为选择，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。
根据异二聚抗体的格式，pI变体可以包含在单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用带电荷的接头，结构域接头或scFv接头。也就是说，利用如“1+1Fab-scFv-Fc”等一个或多个scFv的抗体格式可以包含出于纯化目的给出另外的pI助推的带电荷的scFv接头(带正电荷或负电荷)。如本领域的技术人员将理解的，一些1+1Fab-scFv-Fc形式可与仅带电荷的scFv接头一起使用而无另外的pI调整，但是本文所述的抗体确实还提供了在单体中的一个或两个上的pI变体和/或带电荷的结构域接头。另外，用于替代性功能的另外的氨基酸工程化还可赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变体。
在将pI用作分离机制以允许纯化异二聚蛋白的本发明异二聚抗体中，将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个单体多肽中。也就是说，所述单体之一(为了简单起见，在本文中被称为“单体A”)的pI可以被工程化为远离单体B，或单体A和单体B两者均可以随着单体A的pI增加和单体B的pI降低而改变。如下文更全面地概述的，任一个或两个单体的pI变化可以通过以下来完成：去除或添加带电荷的残基(例如，用带正电或带负电的氨基酸残基来代替中性氨基酸，例如甘氨酸到谷氨酸)、将带电荷的残基从带正电或带负电改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电荷的残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。图1和图2中示出了多种这些变体。
因此，在一些实施方案中，主题异二聚抗体包含在恒定区中的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入单体中的一个或两个中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个(如果不是两个)的等电点(pI)以形成“pI抗体”。如本文所示，如果两种单体的pI差别小至0.1pH单位，则可以实现异二聚体与两种同型二聚体的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高都可用于本文所述的抗体中。
如本领域的技术人员将理解的，每个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体的数量将部分地取决于组分的起始pI，例如在1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc形式中，所关注scFv和Fab的起始pI。即，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“方向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算这两种靶抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域已知的，不同的Fv将具有用于本文所述的抗体中的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1log，如本文所概述的优选的是0.2到0.5。
在pI变体用于实现异二聚化的情况下，通过使用一个或多个重链的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化双特异性蛋白质(包含抗体)的更模块化方法。因此，在一些实施方案中，异二聚化变体(包含偏斜和pI异二聚化变体)并不包含在可变区中，使得每个单独的抗体必须工程化。另外，在一些实施方案中，通过导入来自不同IgG同种型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，待解决的另一个问题是阐明具有高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置的非人残基。可替代地或除同种型取代外，通过利用同配取代(例如，Asn至Asp；和Gln至Glu)显著降低了pI变体导致免疫原性的可能性。
如下文所论述，可能与这个pI工程化一起发生的负效应同样是血清半衰期延长和FcRn结合增加。也就是说，如在美国公开申请US2012/0028304(以引用方式整体并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包含在抗体和Fc融合中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了针对纯化的pI变化。
另外，应注意，pI变体给予了双特异性抗体的分析和质量控制过程另外益处，因为在同源二聚存在时消除、最小化和区分的能力是显著的。类似地，可靠地测试异二聚抗体产生的再现性的能力是重要的。
通常，特定用途的实施方案依赖于包含偏斜变体的变体组，相比于同源二聚化形成，所述偏斜变体与pI变体结合促成异二聚化形成，所述pI变体增加两个单体之间的pI差异以促进将异二聚体从同源二聚中纯化出来。
pI变体的示例性组合示出于美国公布申请2016/0355608中的图4和图5以及图30中，该申请通过引用整体并入本文，并且特别是针对pI变体的公开内容并入。图1和图2中示出了pI变体的优选组合。如本文所概述和附图中所示，这些变化相对于IgG1示出，但所有同种型可以这种方式改变，以及同种型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
在一个实施方案中，pI变体的优选组合具有包括208D/295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个单体(负Fab侧)和包括带正电的scFv接头的第二单体(正scFv侧)，包含(GKPGS)4(SEQ ID NO:1)。然而，如本领域的技术人员将理解的，第一单体包含CH1结构域，其包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的抗体)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变异(当相对于人IgG1时，Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
因此，在一些实施方案中，一个单体具有来自图2的一组取代并且另一个单体具有带电接头(呈带电荷的scFv接头的形式，因为所述单体包括如形式所指示的scFv或带电荷的结构域接头，所述带电荷的结构域接头可以选自图5中所描绘的那些)。
在一些实施方案中，在Fc结构域的铰链中进行修饰，包括基于EU编号的位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，可以在位置216-230中的一个或多个中制造pI突变并且特别是取代，其中1个、2个、3个、4个或5个突变是有用的。再次地，考虑了单独的或与其它结构域中的其它pI变体一起的所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的具体取代包括但不限于221位处的缺失、222位处的非天然缬氨酸或苏氨酸、223位处的缺失、224位处的非天然谷氨酸、225位处的缺失、235位处的缺失，以及236位处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其他情况下，这些取代以任何组合添加到其他结构域中的其他pI变体。
在一些实施方案中，可以在CH2区结构域中制造突变，包括基于EU编号的位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应该注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应子功能(以及327A)。同样，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如可包括具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个CH2 pI取代的变体Fc结构域。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯基丙氨酸、位置300处的非天然苯基丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2内和与其他结构域的所有可能的组合。
在此实施方案中，修饰可以独立地并且任选地选自CH3区的位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447(EU编号)。可用于降低CH3结构域的pI的具体取代包括但不限于：位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸，以及位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
通常，如本领域技术人员将了解的，存在两种一般类别的pI变体：增大蛋白质的pI(碱性变化)的变体和减小蛋白质的pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。作为选择，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。
pI变体的优选组合示于图2中。如本文所概述和附图中所示，这些变化相对于IgG1示出，但所有同种型可以这种方式改变，以及同种型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
在一个实施方案中，例如在图36形式中，pI变体的优选组合具有包括208D/295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个单体(负Fab侧)和包括带正电的scFv接头的第二单体(正scFv侧)，包含(GKPGS)4(SEQ ID NO:1)。然而，如本领域的技术人员将理解的，第一单体包含CH1结构域，其包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体(例如，针对不在所述结构域之一上利用CH1结构域的抗体，例如以双scFv形式或“单臂”形式，如图36B、36C或36D所描绘的形式)中，优选的负pI变体Fc组包含295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
因此，在一些实施方案中，一个单体具有来自图4的一组取代并且另一个单体具有带电接头(呈带电荷的scFv接头的形式，因为所述单体包括如形式所指示的scFv或带电荷的结构域接头，所述带电荷的结构域接头可以选自图5中所描绘的那些)。
c.同种型变体
另外，本文所述的抗体的许多实施方案依赖于将来自一种IgG同种型的特定位置的pI氨基酸“引进”另一种IgG同种型中，从而减少或排除变体中引入非所需免疫原性的可能性。许多这些示出在美国公开2014/0370013的图21中，所述美国公开特此以引用方式并入。即，IgG1是治疗性抗体的常见同种型，其原因有多种，包括高效应子功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2的重恒定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1主链中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。例如，IgG1在位置137处具有甘氨酸(pI 5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；导入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所描述的，通常需要多个氨基酸取代来显著影响变体抗体的pI。然而，应该注意，如下文讨论的，即使IgG2分子中的变化也允许增加血清半衰期。
在其他实施方案中，进行非同种型氨基酸变化，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文进一步描述。
另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域两者，可以看到异二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。
d.计算pI
每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包括变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施方案中，使用美国公开2014/0370013的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由Fv和支架区的固有pI来决定。可替代地，可以比较每个单体的pI。
e.还赋予更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体减小单体的pI的情况下，其可以具有提高体内血清固位的附加益处。
虽然仍在审查中，但是据信，Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在核内体中以pH6与FcRn的结合螯合了Fc(Ghetie和Ward,1997《今日免疫学(Immunol Today.)》18(12):592-598，所述文献特此通过引用整体并入)。随后核内体隔室使Fc再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间打开，则约7.4的较高pH诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall'Acqua等人显示了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等人，2002,《免疫学杂志》169:5171-5180，所述文献通过引用整体并入)。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，将增加Fc体内半衰期的Fc突变理想地将增强较低pH下的FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0至7.4的pH范围内，氨基酸组胺酸改变了其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置处找到His残基并不出乎意料。
最近，已经提出，带具有较低等电点的可变区的抗体还可以具有较长的血清半衰期(Igawa等人，2010《蛋白质工程设计与选择(PEDS)》23(5):385-392，所述文献以引用方式整体并入)。然而，对其机制仍知之甚少。而且，可变区因抗体而有所不同。具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体将会提供更具模块化的方法来提高抗体的药代动力学性质，如本文所描述的。
f.用于另外的功能的另外的Fc变体
除了上文所讨论的异二聚化变体之外，存在出于各种原因可以作出的许多有用的Fc氨基酸修饰，包含但不限于更改与一个或多个FcγR受体的结合、更改与FcRn受体的结合等，如以下所讨论的。
因此，本文提供的抗体(异二聚以及同二聚)可以包含具有或不具有本文概述的异二聚化变体(例如，pI变体和空间变体)的此类氨基酸修饰。每组变体可以独立地且任选地包含在内或不包含在任何特定异二聚蛋白中。
(i)FcγR变体
因此，可以制造多个有用的Fc取代来改变与一种或多种FcγR受体的结合。在某些实施方案中，主题抗体包含更改与一种或多种FcγR受体的结合的修饰(即，“FcγR变体”)。引起结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合通常导致增加的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合减少也可能是有利的。可用于本文所述的抗体的氨基酸取代包含在美国专利号8,188,321(具体地图41)和美国专利号8,084,582以及美国公开申请号20060235208和20070148170中所列举的氨基酸取代，所有所述美国专利以引用方式整体明确并入本文，特别是针对其中公开的变体明确并入本文。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D/332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，如通过引用以其全文合并在此的USSN 12/341,769所具体公开的，存在用于增加与FcRn受体的结合以及增加血清半衰期的另外的Fc取代，包括但不限于：434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、428L/434A、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。此类修饰可以包含在主题抗体的一个或两个Fc结构域中。
(ii)消融变体
类似地，另一类功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲出(FcKO或KO)”变体。在这些实施方案中，在一些治疗应用中，期望减少或除去Fc结构域与一种或多种或全部Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免额外作用机制。也就是说，例如，在许多实施方案中，特别是在使用与CD3单价地结合的双特异性抗体中，通常期望的是烧蚀FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。其中Fc结构域中的一者包含一种或多种Fcγ受体消融变体。图3中描绘了这些消融变体，并且各自可以独立且任选地包含在内或不包含在内，优选方面利用了选自由以下组成的组的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应该注意的是，本文提及的消融变体消融FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。
如本领域所已知的，人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体的最高结合，并且因此，在异二聚抗体的主链中的恒定结构域(或Fc结构域)为IgG1时，可以使用消融变体。例如，可替代地或除了IgG1背景下的消融变体之外，糖基化位置297处的突变(通常突变成A或S)可以显著消融与FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4具有与Fcγ受体天然减少的结合，并且因此那些主链可以在有或没有消融变体的情况下使用。
B.异二聚变体和Fc变体的组合
如本领域技术人员将理解的，所有所述异二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体)都可以任选地并且独立地以任何方式组合，只要其保留其“链性”或“单体划分”。在一些实施方案中，本文提供的异二聚抗体包括异二聚化偏斜变体、同配pI取代和FcKO变体的组合，如图4所描绘。另外，所有这些变体可以组合成异二聚化形式中的任一种异二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施方案，但是可以遵循改变两个单体之间的pI差以促进纯化的基本规则，以生成其它组合。
另外，任何异二聚化变体，偏斜和pI，也独立地并且任选地与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合，如本文总体概述的。
包含在异二聚体1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体的一些实施方案中的变体的示例性组合包含在图4中。在某些实施方案中，抗体是异二聚1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗体，如图17A和图17B所示。
C.抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体
在另一方面中，本文提供了抗CLDN6×抗CD3(本文也称为“αCLDN6×αCD3”)双特异性抗体。此类抗体包括至少一个CLDN6结合结构域和至少一个CD3结合结构域。在一些实施方案中，本文提供的双特异性αCLDN6×αCD3在表达CLDN6的肿瘤部位选择性地进行免疫应答。
应注意，除非本文另有说明，否则名称中抗原列表的顺序并不赋予结构；即CLDN6×CD3 1+1Fab-scFv-Fc抗体可以具有与CLDN6或CD3结合的scFv，尽管在一些情况下，该顺序指定了所示的结构。
如本文中更全面地概述的，ABD的这些组合可以呈如下文概述的各种形式，通常是一个ABD呈Fab形式并且另一个呈scFv形式的组合。用于本文提供的双特异性抗体的例示性形式包括1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fv形式(参见例如，图17A和图17B)。其他有用的抗体形式包括但不限于“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心-Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双scFv”和“三叉”形式的抗体，如图36中所描绘和下文更全面地描述。
另外，通常，ABD中的一个ABD包括如本文概述的在从N末端到C末端的取向上为VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的scFv。根据形式，其它ABD中的一个或两个通常是包括一个蛋白质链上的VH结构域(通常作为重链的组分)和另一个蛋白质链上的VL(通常作为轻链的组分)的Fab。
如本领域的技术人员将理解的，任何一组6个CDR或VH和VL结构域可以呈scFv格式或Fab格式，所述格式然后被添加到重恒定结构域和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包括变体(包含在CH1结构域以及Fc结构域内)。序列表中含有的scFv序列利用特定带电荷的接头，而如本文概述的，可以使用不带电荷的或其他带电荷的接头，包含图5中所描述的那些。
另外，如上文所讨论的，序列表中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表2所示的CDR的氨基酸序列。
对于本文所列出的所有可变重链结构域和可变轻链结构域，可以制备另外的变体。如本文概述的，在一些实施方案中，一组6个CDR可以具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代有特定用途)以及可变重链结构域和可变轻链结构域的框架区的变化，只要框架(除CDR之外)保持与选自图1中的美国专利7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性，所述美国专利的附图和图例通过引用整体并入本文。因此，例如，本文所述的相同CDR可以与来自人类生殖系序列的不同框架序列组合，只要框架区保留与选自美国专利第7,657,380号的图1中所列出的序列的人类生殖系序列的至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性。可替代地，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，来自该组的CDR中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(即，可以对CDR进行修饰，只要该组的6个CDR中的改变的总数小于6个氨基酸修饰，其中CDR的任何组合改变；例如，vlCDR1中可以存在一个变化，vhCDR2中可以存在两个变化，vhCDR3中可以不存在变化等))，以及具有框架区变化，只要框架区保持与选自图1中的美国专利号7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％、90％、95％或99％同一性。
如本文所讨论的，主题异二聚抗体包含两个抗原结合结构域(ABD)，每个结合CLDN6或CD3。如本文所概述，这些异二聚抗体可以是双特异性且二价的(例如以图17A中所描绘的形式，每个抗原结合到单个ABD)或双特异性且三价的(例如图17B中所描绘，一个抗原结合到单个ABD并且另一个抗原结合到两个ABD)。
另外，通常，ABD中的一个ABD包括如本文概述的在从N末端到C末端的取向上为VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的scFv。根据形式，其它ABD中的一个或两个通常是包括一个蛋白质链上的VH结构域(通常作为重链的组分)和另一个蛋白质链上的VL(通常作为轻链的组分)的Fab。
本公开提供了如下概述的多个ABD。如本领域的技术人员将理解的，任何一组6个CDR或VH和VL结构域可以呈scFv格式或Fab格式，所述格式然后被添加到重恒定结构域和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包括变体(包含在CH1结构域以及Fc结构域内)。序列表中含有的scFv序列利用特定带电荷的接头，而如本文概述的，可以使用不带电荷的或其他带电荷的接头，包含图5中所描述的那些。
另外，如上文所讨论的，序列表中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表2所示的CDR的氨基酸序列。
对于本文所列出的所有可变重链结构域和可变轻链结构域，可以制备另外的变体。如本文概述的，在一些实施方案中，一组6个CDR可以具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代有特定用途)以及可变重链结构域和可变轻链结构域的框架区的变化，只要框架(除CDR之外)保持与选自图1中的美国专利7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性，所述美国专利的附图和图例通过引用整体并入本文。因此，例如，本文所述的相同CDR可以与来自人类生殖系序列的不同框架序列组合，只要框架区保留与选自美国专利7,657,380的图1中所列出的序列的人类生殖系序列的至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性。可替代地，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，来自该组的CDR中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(即，可以对CDR进行修饰，只要该组的6个CDR中的改变的总数小于6个氨基酸修饰，其中CDR的任何组合改变；例如，VLCDR1中可以存在一个变化，VHCDR2中可以存在两个变化，VHCDR3中可以不存在变化等))，以及具有框架区变化，只要框架区保持与选自图1中的美国专利号7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％、90％、95％或99％同一性。
1.CLDN6抗原结合结构域
本文提供了单克隆和双特异性抗体(例如，本文提供的抗CLDN6×抗CD3抗体)，以及含有结合至人CLDN6的抗原结合结构域的融合蛋白。图13、图14、图15和图18中描绘了6个CDR和/或VH和VL结构域的合适组。在一些实施方案中，异二聚抗体是1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fv形式的抗体(参见例如图17A和图17B)，尽管可以利用下文概述的任何形式。
在一些实施方案中，CLDN6 ABD具有一组选自vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3序列的vhCDR，所述vhCDR来自选自由以下组成的组的VH：H1、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1.6、H1.7、H1.8、H1.9、H1.19、H1.22、H1.24、H2、H2.1、H2.2、H2.3、H2.4、H2.5、H2.6、H2.7、H2.8、H2.9、H2.11、H2.12、H2.71、H2.75、H2.90、H2.91、H2.118和H2.119，参见图14和图15。
在一些实施方案中，CLDN6 ABD的VH结构域选自由以下组成的组：H1、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1.6、H1.7、H1.8、H1.9、H1.19、H1.22、H1.24、H2、H2.1、H2.2、H2.3、H2.4、H2.5、H2.6、H2.7、H2.8、H2.9、H2.11、H2.12、H2.71、H2.75、H2.90、H2.91、H2.118和H2.119，参见图14和图15。
在一些实施方案中，CLDN6 ABD具有一组选自vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列的vlCDR，所述vlCDR来自选自由以下组成的组的VL：L1、L1.1、L1.4、L1.7、L1.16、L1.18、L1.19、L1.21、L1.22、L1.23、L1.27、L1.60、L1.107、L1.114、L1.187、L1.189和L2，参见图14和图15。
在一些实施方案中，CLDN6 ABD的VL选自由以下组成的组：L1、L1.1、L1.4、L1.7、L1.16、L1.7、L1.16、L1.18、L1.19、L1.21、L1.22、L1.23、L1.27、L1.60、L1.107、L1.114、L1.187、L1.189和L2，参见图14和图15。
因此，本文包括具有一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的CLDN6 ABD，所述CDR来自选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
另外，本文包括具有选自由以下组成的组的VH/VL对的CLDN6CBD：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在特定实施方案中，VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187组成的组。
在特定实施方案中，VH/VL对是Fab并且选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187组成的组。
如本领域的技术人员将理解的，合适的CLDN6结合结构域可以包括如在附图中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图13、图14和图15中所描绘的那些序列的VH和VL序列内的其他比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个VH和VL序列。在本文中含有Fv到CLDN6的许多实施方案中，与CLDN6结合的是Fab单体。
除了在附图和序列表中所公开的形成ABD到CLDN6的亲本CDR组之外，本文提供了具有包含本文公开的CLDN6 ABD CDR的至少一个修饰的CDR的变体CLDN6 ABD(例如，图13至图15和图18以及序列表)。在一个实施方案中，与如本文(包括附图和序列表)所述的CLDN6结合结构域VH/VL对的6个CDR相比，本发明异二聚抗体的CLDN6 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在示例性实施方案中，与以下CLDN6结合结构域VH/VL对(H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187)中的一者的6个CDR相比，本发明异二聚抗体的CLDN6 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定和/或流式细胞术中的至少一者测量，本发明抗体的CLDN6 ABD能够结合CLDN6，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CLDN6 ABD能够结合人CLDN6(参见图11)。在一些情况下，每个变体CDR具有不超过1个或2个氨基酸变化，每个CDR不超过1个是特别有用的。
在一些实施方案中，本发明抗体的CLDN6 ABD包含与如本文(包括附图和序列表)所述的CLDN6 ABD的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR。在示例性实施方案中，本发明抗体的CLDN6ABD包含与以下CLDN6结合结构域VH/VL对中的一者的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定和/或流式细胞术中的至少一者测量，本发明抗体的CLDN6ABD能够结合CLDN6，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CLDN6 ABD能够结合人CLDN6抗原(参见图11)。
在另一个示例性实施方案中，本发明抗体的CLDN6 ABD包含本文(包括附图和序列表)所述的CLDN6结合结构域VH/VL对中的任一者的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。
在一些实施方案中，本发明抗体包括CLDN6 ABD，其包括作为本文公开的CLDN6ABD VH和VL结构域的变体的可变重链结构域和/或可变轻链结构域。在一个实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的CLDN6 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与以下CLDN6结合结构域VH/VL对中的一者的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187。在一些实施方案中，该变化在图13至图15和图18中描绘的VH结构域中。在一些实施方案中，该变化在图13至图15和图18中描绘的VL结构域中。在一些实施方案中，该变化在图13至图15和图18中描绘的VH和VL结构域中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸变化在VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸变化在一个或多个CDR中。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定和/或流式细胞术中的至少一者测量，本发明抗体的CLDN6 ABD能够结合CLDN6，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CLDN6 ABD能够结合人CLDN6抗原(参见图11)。
在一个实施方案中，变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所描述的CLDN6 ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在示例性实施方案中，变体VH和/或VL结构域与以下CLDN6结合结构域VH/VL对中的一者的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187。在一些实施方案中，CLDN6 ABD包含与图13至图15和图18中描绘的VH结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VH。在一些实施方案中，CLDN6 ABD包含与图13至图15和图18中描绘的VL结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VL。在一些实施方案中，CLDN6ABD包含与图13至图15和图18中描绘的VH结构域和VL结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VH和VL。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定和/或流式细胞术中的至少一者测量，本发明抗体的CLDN6 ABD能够结合CLDN6，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CLDN6 ABD能够结合人CLDN6抗原(参见图11)。
2.CD3抗原结合结构域
本发明的异二聚双特异性(例如，抗CLDN6×抗CD3抗体)还包含与人εCD3(CD3ε)结合的ABD。
图10中描绘了合适的多组6个CDR和/或VH和VL结构域以及scFv序列。特别使用的CD3结合结构域序列包括但不限于抗CD3H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3L1.47_H1.89、抗CD3 L1.47_H1.90、抗CD3L1.47_H1.33和抗CD3L1.47_H1.31，如图10所描绘。如图10中所示，当抗CD3 ABD是scFv结构域时，VH和VL结构域可以呈任一取向。
如本领域的技术人员将理解的，合适的CD3结合结构域可以包括如在图10中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图10A至图10F中所描绘的那些序列的VH和VL序列内的其他比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个VH和VL序列。在本文中含有Fv到CD3的许多实施方案中，与CD3结合的是scFv单体。
除了在附图和序列表中所公开的形成ABD到CD3的亲本CDR组之外，本文提供了具有包含本文(例如，图10和序列表)公开的CD3 ABDCDR的至少一个修饰的CDR的变体CD3ABDS。在一个实施方案中，与本文(包括附图和序列表)所述的CD3 ABD的6个CDR相比，本发明异二聚抗体(例如，抗CLDN6×抗CD3抗体)的CD3 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在示例性实施方案中，与以下CD3结合结构域中的一者的6个CDR相比，本发明异二聚抗体的CD3 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3L1.47_H1.31(图10)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一者测量，本发明抗体的CD3 ABD能够结合CD3抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD3ABD能够结合人CD3。
在一些实施方案中，本发明抗体的CD3 ABD包含与如本文(包括附图和序列表)所述的CD3 ABD的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR。在示例性实施方案中，本发明抗体的CD3 ABD包含与以下CD3结合结构域中的一者的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31(图10)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一者测量，CD3 ABD能够结合CD3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD3 ABD能够结合人CD3抗原。
在另一个示例性实施方案中，本发明抗体的CD3 ABD包含本文(包括附图和序列表)所述的CD3结合结构域中的任一者的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。
在一些实施方案中，本发明抗体包括CD3 ABD，其包括作为本文公开的CD3 ABD VH和VL结构域的变体的可变重链结构域和/或可变轻链结构域。在一个实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的CD3 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与以下CD3结合结构域中的一者的VH和/或VL结构域具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31(图10)。在一些实施方案中，该变化在图10中描绘的VH结构域中。在一些实施方案中，该变化在图10中描绘的VL结构域中。在一些实施方案中，该变化在图10中描绘的VH和VL结构域中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸变化在VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸变化在一个或多个CDR中。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一者测量，本发明抗体的CD3 ABD能够结合CD3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD3 ABD能够结合人CD3抗原。
在一个实施方案中，变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所述的CD3 ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在示例性实施方案中，变体VH和/或VL结构域与以下CD3结合结构域中的一者的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3L1.47_H1.89、抗CD3 L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3L1.47_H1.31(图10)。在一些实施方案中，CD3 ABD包含与图10中描绘的VH结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VH。在一些实施方案中，CD3 ABD包含与图10中描绘的VL结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VL。在一些实施方案中，CD3 ABD包含与图10中描绘的VH结构域和VL结构域至少90％、95％、97％、98％或99％相同的VH和VL。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一者测量，CD3 ABD能够结合CD3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD3 ABD能够结合人CD3抗原。
除了图10的αCD3 ABD之外，用于本发明的另外的ABD包含在WO2014/145806的图14和图15中描绘的那些，所述文献特此整体明确并入本文(包括其中的附图和图例)。
3.接头
如本文所示，存在可以用于共价附接所列举结构域(例如，scFv、Fab、Fc结构域等)的多个适合的接头(用于用作结构域接头或scFv接头)，包含通过重组技术产生的传统肽键。图6中描绘了使主题抗体的结构域彼此附接的示例性接头。在一些实施方案中，接头肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应当具有足够以确保相对于彼此的正确构象以使得其保留期望活性的方式连接两个分子的长度。在一个实施方案中，接头具有约1个至50个氨基酸的长度，优选约1个至30个氨基酸的长度。在一个实施方案中，可使用长度为1个至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中使用约5个至约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:3)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(SEQ ID NO:4)，其中n是至少一(通常为3至4)的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头，它们中的一些在图5和图6中示出。可替代地，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可以用作接头。
其他接头序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5个-12个氨基酸残基。接头可以来源于免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可以来源于任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可以来源于其他蛋白质，诸如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区来源的序列以及来自其他蛋白质的其他天然序列。
在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。例如，在图17B中，可以存在将Fab的CH1结构域的C末端与scFv的N末端连接的结构域接头，其中另一个任选的结构域接头将scFv的C末端与CH2结构域连接(但是在许多实施方案中，铰链用作此结构域接头)。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方案利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域接头，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:3)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(SEQ ID NO:4)，其中n是至少一(并且通常为3至4至5)的整数以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链性”，如下所概述，可以使用如在scFv接头的一些实施方案中使用的带电荷的结构域接头。图6中描绘了例示性有用的结构域接头。
特别参考用于以“2+1”形式将scFv结构域附接至Fc结构域的结构域接头，有几种具有特殊用途的结构域接头，包括如图6所示的“全铰链C220S变体”、“柔性半铰链”、“带电荷的半铰链1”和“带电荷的半铰链2”。
在一些实施方案中，接头是“scFv接头”，其用于共价附接如本文所讨论的VH和VL结构域。在许多情况下，scFv接头是带电荷的scFv接头，多个所述带电荷的scFv接头示出在图5中。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体还提供带电荷的scFv接头，以促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正电荷或负电荷(或在使用不同单体上的scFv的支架的情况下两者皆有)的带电荷的scFv接头，这允许包括带电荷的接头的单体更改pI而不对Fc结构域做出进一步改变。这些带电荷的接头可以被取代到含有标准接头的任何scFv中。再次，如本领域的技术人员将理解的，根据期望的pI变化，带电荷的scFv接头用在正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论的，为了形成1+1Fab-scFv-Fc形式的异二聚抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区的原始pI，并且一个被选择成形成scFv，并且根据pI，选择正或负接头。
带电荷的结构域接头还可以用于增加本文所述的抗体的单体的pI分离，并且因此图5中所包含的那些在本文中可以用于利用接头的任何实施方案中。
D.本发明的有用形式
如本领域的技术人员将理解的并且如下文更全面地讨论的，本文提供的异二聚双特异性抗体可以采取各种构形，如图17以及图36中总体上描绘的。一些附图描绘了“单端”配置，其中分子的一个“臂”上有一种类型的特异性并且另一个“臂”上有不同的特异性。其它附图描绘了“双端”配置，其中分子的“顶部”有至少一种类型的特异性并且分子的“底部”有一种或多种不同的特异性。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体针对共接合不同的第一和第二抗原的新颖免疫球蛋白组合物。
如本领域的技术人员将理解的，本文所述的异二聚形式可以具有不同的化合价并且可以是双特异性的。也就是说，本文所述的异二聚抗体可以是二价的和双特异性的，其中一个靶肿瘤抗原(例如，CD3)由一个结合结构域结合并且另一个靶肿瘤抗原(例如，CLDN6)由第二结合结构域结合。异二聚抗体还可以是三价的和双特异性的，其中第一抗原由两个结合结构域结合并且第二抗原由第二结合结构域结合。如本文概述的，当CD3是靶抗原之一时，优选的是CD3仅单价地结合，以减少潜在的副作用。
本文所述的抗体利用抗CD3抗原结合结构域与抗CLDN6结合结构域的组合。如本领域的技术人员将理解的，可以使用如本文中所描述以及在任何图中所描绘的抗CD3 CDR、抗CD3可变轻链和可变重链结构域、Fab和scFv的任何集合。类似地，可以使用任何抗CLDN6抗原结合结构域，无论是否可以使用如本文所述且在任何附图中所描绘的CDR、可变轻链结构域和可变重链结构域、Fab和scFv，任选且独立地以任何组合进行组合。
1.1+1Fab-scFv-Fc形式
发现尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚体支架是“1+1Fab-scFv-Fc”或“开瓶器”形式，如图17A所示，具有CD3结合结构域和肿瘤靶抗原(CLDN6)结合结构域的例示性组合。在该实施方案中，抗体的一个重链单体含有单链Fv(“scFv”，如下定义)和Fc结构域。scFv包含可变重链结构域(VH1)和可变轻链结构域(VL1)，其中VH1使用可带电荷的scFv接头附接至VL1(参见例如图5)。scFv使用结构域接头附接至重链(参见例如，图6)。另一个重链单体是“常规”重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)。1+1Fab-scFv-Fc还包含与VH-CH1相互作用形成Fab的轻链。此结构在本文中有时被称为“开瓶器”格式，这是由于与开瓶器具有大致视觉相似度。通过使用恒定区(例如，Fc结构域、CH1结构域和/或铰链区)中的如下文更全面地描述的促进异二聚抗体形成的氨基酸变体(例如，上文所讨论的异二聚化变体)，这两个重链单体被放在一起。
本发明的“1+1Fab-scFv-Fc”形式具有若干个明显优势。如本领域所已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚合问题，在本文所述的抗体中可以通过添加“常规”的重链和轻链配对来缓解所述稳定性和聚合问题。另外，与依赖于两条重链和两条轻链的形式相反，不存在重链和轻链配对不当(例如重链1与轻链2配对等)的问题。
本文概述的许多实施方案通常依赖于包括第一单体的1+1Fab-scFv-Fc或“开瓶器”形式抗体，该第一单体包括scFv，该scFv包括使用scFv接头(在许多但并非所有情况下，带电)进行共价附接的可变重链结构域和可变轻链结构域，其中scFv通常通过结构域接头共价附接至第一Fc结构域的N末端。结构域接头可以是带电荷的或不带电荷的以及外源的或内源的(例如，天然铰链结构域的全部或部分)。可以使用任何合适的接头将scFv附接至第一Fc结构域的N末端。在一些实施方案中，结构域接头选自图6中的结构域接头。1+1Fab-scFv-Fc形式或“开瓶器”形式的第二单体是重链，并且组合物还包含轻链。
通常，在许多优选的实施方案中，scFv是与CD3结合的结构域，并且Fab形成CLDN6结合结构域。在图17A中描绘了1+1Fab-scFv-Fc形式的例示性抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体。图19和图20中描绘了1+1Fab-scFv-Fc形式的示例性抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体。
另外，本文所述抗体的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在某些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc支架形式包含第一单体，所述第一单体包含scFv-结构域接头-CH2-CH3单体；第二单体，所述第二单体包含第一可变重链结构域-CH1-铰链-CH2-CH3单体；以及第三单体，所述第三单体包含第一可变轻链结构域。在一些实施方案中，第一单体的CH2-CH3是第一变体Fc结构域，并且第二单体的CH2-CH3是第二变体Fc结构域。在一些实施方案中，scFv包含形成CD3结合部分的scFv可变重链结构域和scFv可变轻链结构域。在某些实施方案中，scFv可变重链结构域和scFv可变轻链结构域使用scFv接头(带电，在许多但不是所有情况下)进行共价连接。参见，例如，图5)。在一些实施方案中，第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域形成CLDN6结合结构域。
在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括1+1Fab-scFv-Fc形式，其包含：a)第一单体(“scFv单体”)，该第一单体包含带电荷的scFv接头(在一些实施方案中，图5的+H序列是优选的)、偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和与如本文概述的CD3结合的scFv；b)第二单体(“Fab单体”)，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域(VL)和恒定轻链结构域(CL)，其中编号是根据EU编号进行的。可变重链结构域和可变轻链结构域构成CLDN6结合部分。
任何合适的CD3 ABD可包含在1+1Fab-scFv-Fc形式抗体中，包括本文提供的那些。尤其用于这些实施方案中的CD3结合结构域序列包括但不限于H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31或它们的变体，以及在WO2014/145806的图10中描绘的那些以及图14和图15中描绘的那些，所述文献特此通过引用并入(包括图例)。
任何合适的CLDN6 ABD可包含在1+1Fab-scFv-Fc形式抗体中，包括本文提供的那些。在这些实施方案中特别有用的CLDN6 CBD包括但不限于选自具有选自由以下组成的组的VH/VL对的VH结构域和VL结构域：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2或它们的变体。
在特定实施方案中，αCLDN6 ABD VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组。
在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括1+1Fab-scFv-Fc形式，其包含：a)第一单体(“scFv单体”)，该第一单体包含带电荷的scFv接头(在一些实施方案中，图6的+H序列是优选的)、偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和与如本文概述的CD3结合的scFv；b)第二单体(“Fab单体”)，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重链结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域(VL)和恒定轻链结构域(CL)，其中编号是根据EU编号进行的。可变重链结构域和可变轻链结构域构成CLDN6结合结构域。尤其用于这些实施方案中的CD3结合结构域序列包括但不限于H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31或它们的变体，以及如图10中描绘的那些。在这些实施方案中特别有用的CLDN6结合结构域序列包括但不限于选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组的αCLDN6 ABD VH_VL对。
用于与1+1形式抗体一起使用的特别有用的CLDN6和CD3序列组合包括，例如，在图19和图20中公开。
图7A至图7D示出了在1+1Fab-scFv-Fc形式抗体中有用的一些例示性Fc结构域序列。图7A至图7D中描绘的“单体1”序列通常是指“Fab-Fc重链”的Fc结构域，而“单体2”序列是指“scFv-Fc重链”的Fc结构域。此外，图9提供了可以此形式使用的有用CL序列。
在一些实施方案中，本文所描绘的任何VH和VL序列(包含附图和序列表中所描绘的所有VH和VL序列，包含针对CLDN6的序列)可以使用附图和序列表中所示的任何抗CD3scFv序列添加到图7A至图7D的开瓶器主链形式作为“Fab侧”。
对于来自图7A的开瓶器主链1(任选地包含428L/434S变体)，尤其用于这些实施方案中的CD结合结构域序列包含但不限于CD3结合结构域抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，其作为图7中所示的主链的scFv侧连接。
2.mAb-Fv
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是mAb-Fv形式(图36G)。在此实施方案中，所述形式依赖于使用“额外”可变重链结构域与一个单体的C末端连接，以及“额外”可变轻链结构域与另一单体的C末端连接，因此形成第三抗原结合结构域，其中所述两种单体的Fab部分结合CLDN6且“额外”scFv结构域结合CD3。
在这个实施方案中，第一单体包含第一重链，其包含第一可变重链结构域和包括第一Fc结构域的第一重链恒定结构域，其中第一可变轻链结构域使用结构域接头共价附接到第一Fc结构域的C末端(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-VL2)。第二单体包含第二可变重链结构域，其属于包括第二Fc结构域的第二重链恒定结构域，和第三可变重链结构域，其使用结构域接头共价连接到第二Fc结构域的C末端(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-VH2)。两个C末端附接的可变结构域构成与CD3结合的Fv(因为具有二价CD3结合是较不优选的)。这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合CLDN6的两个相同Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供mAb-Fv形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10所示。本文所述的抗体提供mAb-Fv形式或它们的变体，其中CLDN6结合结构域序列如图13、图14和图15所示。
另外，mAb-Fv形式的Fc结构域包含偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，mAb-Fv形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括mAb-Fv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与轻链的第一可变轻链结构域一起构成与CLDN6结合的Fv的第一可变重链结构域，和第二可变重链结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，和与第一可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的第一可变重链结构域，以及与第二可变重链结构域一起形成与CD3结合的Fv(ABD)的第二可变轻链；和c)轻链，该轻链包含第一可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
在一些实施方案中，mAb-Fv形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括mAb-Fv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与轻链的第一可变轻链结构域一起构成与CLDN6结合的Fv的第一可变重链结构域，和第二可变重链结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S，和与第一可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的第一可变重链结构域，以及与第一单体的第二可变重链结构域一起形成结合CD3的Fv(ABD)的第二可变轻链；和c)轻链，该轻链包含第一可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
3.mAb-scFv
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是mAb-scFv形式(图36H)。在此实施方案中，所述形式依赖于使用scFv与单体之一的C末端附接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与CLDN6结合并且“额外”scFv结构域与CD3结合。因此，第一单体包含第一重链(包含可变重链结构域和恒定结构域)，且C末端共价连接scFv，其包括scFv可变轻链结构域、scFv接头以及scFv可变重链结构域，呈任一取向(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选接头]-VH2-scFv接头-VL2或VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选接头]-VL2-scFv接头-VH2)。这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合CLDN6的两个相同Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供mAb-scFv形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10A至图10F所示，并且CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13至图15和图18所示。
另外，mAb-scFv形式的Fc结构域包含偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括mAb-scFv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
在一些实施方案中，mAb-scFv形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括mAb-scFv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
4.2+1Fab2-scFv-Fc形式
发现尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚体支架是“2+1Fab2-scFv-Fc”形式(在之前的相关文件中也被称为“中央-scFv形式”)，如图17B所示，具有CD3结合结构域和两个肿瘤靶抗原(CLDN6)结合结构域的例示性组合。在此实施方案中，所述形式依赖于插入的scFv结构域的使用，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与CLDN6结合，并且“额外的”scFv结构域与CD3结合。scFv结构域被插入Fc结构域与单体之一的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域。例如，具有2+1Fab2-scFv-Fc形式的CLDN6×CD3双特异性抗体在表达低水平的CLDN6的细胞环境中在诱导重定向T细胞细胞毒性方面是有效的。此外，如示例中所示，具有2+1Fab2-scFv-Fc形式的CLDN6×CD3双特异性抗体允许免疫应答的“微调”，因为此类抗体表现出各种各样的不同性质，这取决于所使用的CLDN6和/或CD3结合结构域。例如，此类抗体在对具有不同CLDN6表达的细胞的选择性、对于CLDN6表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性CLDN6的敏感性方面表现出差异。这些CLDN6抗体可用于例如治疗CLDN6相关癌症。
在此实施方案中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重链结构域、CH1结构域(以及任选的铰链)和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻链结构域、scFv接头和scFv可变重链结构域。scFv使用任选的结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C末端与第一Fc结构域的N末端之间(VH1-CH1-[任选的接头]-VH2-scFv接头-VL2-[包括铰链的任选的接头]-CH2-CH3，或scFv的相反取向VH1-CH1-[任选的接头]-VL2-scFv接头-VH2-[包括铰链的任选的接头]-CH2-CH3)。任选的接头可以是任何合适的肽接头，包括例如图6中包括的结构域接头。在一些实施方案中，任选的接头是铰链或其片段。另一个单体是标准Fab侧(即，VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)。这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合CLDN6的两个相同Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
在一个实施方案中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含具有图10中所描绘的CD3结合结构域序列的VH和VL的scFv或它们的变体。在一个实施方案中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含具有如图13至图15和图18中所示的CLDN6结合结构域的VH和VL的两个Fab或它们的变体。
在示例性实施方案中，2+1Fab2-scFv-Fc CLDN6×CD3双特异性抗体的CLDN6结合结构域包括VH和VL。尤其用于这些实施方案中的CD3结合结构域序列包括但不限于H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31或它们的变体，以及在WO2014/145806的图10中描绘的那些以及图14和图15中描绘的那些，所述文献特此通过引用并入(包括图例)。
任何合适的CLDN6 ABD可包含在2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体中，包括本文提供的那些。在这些实施方案中特别有用的CLDN6 CBD包括但不限于选自由以下组成的组的VH和VL结构域：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16_、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
在特定实施方案中，αCLDN6 ABD VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组。
另外，2+1Fab2-scFv-Fc形式的Fc结构域包含偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括2+1Fab2-scFv-Fc形式，其包含：a)第一单体(Fab-scFv-Fc侧)，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体(Fab-Fc侧)，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，αCLDN6 VH_VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组。
在一些实施方案中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括2+1Fab2-scFv-Fc形式，其包含：a)第一单体(Fab-scFv-Fc侧)，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体(Fab-Fc侧)，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，αCLDN6 VH_VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组。尤其用于这些实施方案中的CD3结合结构域序列包括但不限于H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31或它们的变体。
图8A至图8C示出了一些示例性Fc结构域序列，该Fc结构域序列可用于2+1Fab2-scFv-Fc形式。图8A至图8C中描绘的“单体1”序列通常是指“Fab-Fc重链”的Fc结构域，而“单体2”序列是指“Fab-scFv-Fc重链”的Fc结构域。此外，图9提供了可以此形式使用的有用CL序列。
图21、图22、图59和图60中描绘了示例性抗CLDN6×抗CD3 2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体。
5.中心Fv
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是中心-Fv形式(图36I)。在此实施方案中，所述形式依赖于使用插入的Fv结构域(即，中心Fv结构域)，从而形成“额外”第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与CLDN6结合并且“额外”中心Fv结构域与CD3结合。“额外”中心Fv结构域被插入在Fc结构域与单体的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域(即，“额外”中心Fv结构域)，其中每个单体含有“额外”中心Fv结构域的组分(即，一个单体包括可变重链结构域，并且另一个包括“额外”中心Fv结构域的可变轻链结构域)。
在这个实施方案中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重链结构域、CH1结构域以及Fc结构域和额外可变轻链结构域。所述轻链结构域使用结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C末端与第一Fc结构域的N末端之间(VH1-CH1-[任选的接头]-VL2-铰链-CH2-CH3)。另一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变重链结构域(VH1-CH1-[任选的接头]-VH2-铰链-CH2-CH3)。所述轻链结构域使用结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C末端与第一Fc结构域的N末端之间。
这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成各自结合CLDN6的两个相同Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供中心-Fv形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10所示，并且CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13、图14和图15所示。
6.单臂中心-scFv
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是单臂中心-scFv形式(图36C)。在此实施方案中，一种单体仅包括Fc结构域，而另一种单体包含Fab结构域(第一抗原结合结构域)、scFv结构域(第二抗原结合结构域)和Fc结构域，其中scFv结构域被插入在Fc结构域与Fc结构域之间。在此形式下，Fab部分与一个受体靶标结合，并且scFv与另一个受体靶标结合。在此形式下，Fab部分与CLDN6结合并且scFv与CD3结合，或反之亦然。
在此实施方案中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻链结构域、scFv接头和scFv可变重链结构域。scFv使用结构域接头在任一朝向上共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C末端与第一Fc结构域的N末端之间(VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VH2-scFv接头-VL2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VL2-scFv接头-VH2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)。第二单体包含Fc结构域(CH2-CH3)。此实施方案进一步利用了包括可变轻链结构域和恒定轻链结构域的轻链，所述轻链与重链缔合以形成Fab。
就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供中心-Fv形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10所示，并且CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13、图14和图15所示。
另外，单臂中心-scFv形式的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，单臂中心-scFv形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，单臂中心-scFv形式的一些实施方案包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的Fc结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
在一些实施方案中，单臂中心-scFv形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，单臂中心-scFv形式的一些实施方案包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn变体M428L/N434S的Fc结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
7.单臂scFv-mAb
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是单臂scFv-mAb形式(图36D)。在这个实施方案中，一个单体仅包含Fc结构域，而另一个单体使用连接到重链的N末端的scFv结构域，通常通过使用接头：VH-scFv接头-VL-[任选的结构域接头]-CH1-铰链-CH2-CH3或(呈相反取向)VL-scFv接头-VH-[任选的结构域接头]-CH1-铰链-CH2-CH3。以此形式，Fab部分各自CLDN6且scFv结合CD3。这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供单臂scFv-mAb形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10所示，并且其中CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13、图14和图15所示。
另外，单臂scFv-mAb形式的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，单臂scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，单臂scFv-mAb形式的一些实施方案包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的Fc结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
在一些实施方案中，单臂scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案单臂scFv-mAb形式包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn变体M428L/N434S的Fc结构域；和c)轻链，该轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
8.scFv-mAb
尤其用于本文所述的抗体中的一种异二聚支架是mAb-scFv形式(图36E)。在此实施方案中，所述形式依赖于使用scFv与单体之一的N末端附接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与CLDN6结合并且“额外”scFv结构域与CD3结合。
在此实施方案中，第一单体包括第一重链(包括可变重链结构域和恒定结构域)，其中N末端共价连接的scFv包括在任一朝向上的scFv可变轻链结构域、scFv接头和scFv可变重链结构域((VH1-scFv接头-VL1-[任选的结构域接头]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3)或(scFv在相反朝向上)((VL1-scFv接头-VH1-[任选的结构域接头]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3))。这个实施方案进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合CLDN6的两个相同Fab。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
本文所述的抗体提供scFv-mAb形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10所示，并且其中CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13、图14和图15所示。
另外，scFv-mAb形式的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图1所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图3中示出的那些)、任选的带电荷的scFv接头(包括图5中示出的那些)，并且重链包含pI变体(包括图2中示出的那些)。
在一些实施方案中，scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括scFv-mAb形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
在一些实施方案中，scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施方案包括scFv-mAb形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域，和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与共同轻链的可变轻链结构域一起构成与如本文概述的CLDN6结合的Fv的可变重链结构域；和c)共同轻链，该共同轻链包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域。
9.双scFv形式
本文所述的抗体还提供了本领域已知的双scFv形式(图36B)。在这个实施方案中，CLDN6×CD3异二聚双特异性抗体由两个scFv-Fc单体构成(两个单体皆呈(VH-scFv接头-VL-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)形式或(VL-scFv接头-VH-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)形式，或一个单体一种取向且另一个单体另一种取向)。
本文所述的抗体提供双scFv形式或它们的变体，其中CD3结合结构域序列如图10A至图10F所示，并且其中CLDN6结合结构域序列或它们的变体如图13至图15和图18所示。在一些实施方案中，双重scFv形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括双scFv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及结合CD3或CLDN6的第一scFv；和b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体
E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与CD3或CLDN6结合的第二scFv。在一些实施方案中，双重scFv形式包含偏斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。在一些实施方案中，双重scFv形式包含偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括双scFv形式，其包含：a)第一单体，该第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及结合CD3或CLDN6的第一scFv；和b)第二单体，该第二单体包含偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和结合CD3或CLDN6的第二scFv。
10.非异二聚体双特异性抗体
如本领域技术人员将理解的，本文提供的抗CLDN6×抗CD3抗体也可以非异二聚双特异性形式包含在内(参见图36J)。以此形式，抗CLDN6×抗CD3包括：1)包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体；2)包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体；3)包含VL1-CL的第一轻链；和4)包含VL2-CL的第二轻链。在此类实施方案中，VH1和VL1形成第一抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成第二抗原结合结构域。第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的一者结合CLDN6，并且另一抗原结合结构域结合CD3。
任何合适的CLDN6结合结构域和CD3结合结构域可以非异二聚双特异性抗体形式包含在抗CLDN6×抗CD3抗体中，包括本文提供的CLDN6结合结构域和CD3结合结构域以及相关VH和VL或它们的变体中的任一者(参见例如图10、图13至图15和图18)。
11.三叉形式
在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体呈如在WO2015/184203中总体上描述的“三叉”形式，所述文献特此通过引用整体明确并入，特别是针对“异二聚体促进结构域”或“HPD”的附图、图例、定义和的序列(包含“K螺旋”和“E螺旋”序列)而明确并入。三叉依赖于使用两种不同的HPD，该两种不同的HPD缔合以形成异二聚体结构作为结构的组分。在此实施方案中，三叉形式包含“传统的”重链和轻链(例如，VH1-CH1-铰链-CH2-CH3和VL1-CL)、包括第一“双抗体型结合结构域”或VH2-(接头)-VL3-HPD1的第三链以及包括第二/>VH3-(接头)-(接头)-VL2-HPD2的第四链。VH1和VL1形成第一ABD，VH2和VL2形成第二ABD，并且VH3和VL3形成第三ABD。在一些情况下，第二ABD和第三ABD与同一抗原结合，在这种情况下通常是CLDN6，例如二价结合，其中第一ABD单价地结合CD3。
任何合适的CLDN6结合结构域和CD3结合结构域可以三叉双特异性抗体形式包含在抗CLDN6×抗CD3抗体中，包括本文提供的CLDN6结合结构域和CD3结合结构域以及相关VH和VL或它们的变体中的任一者(参见例如图10、图13至图15和图18)。
12.单特异性的单克隆抗体
如本领域的技术人员将理解的，本文概述的新型CLDN6 ABD序列还可以用于单特异性抗体(例如，“传统单克隆抗体”)或非异二聚双特异性格式两者。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体提供了单克隆(单特异性)抗体，所述单克隆抗体包括6个CDR和/或来自附图的vh和vl序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，其中IgG1、IgG2和IgG4(包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区)特别用于一些实施方案。也就是说，本文中的具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人IgG1抗体的恒定区。
任何合适的CLDN6 ABD可包括在单特异性抗体中，包括本文所述的任何CLDN6ABD。在一些实施方案中，单特异性抗体是具有选自由以下组成的组的VH_VL对的CLDN6单特异性抗体：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2或它们的变体。
在特定的单克隆实施方案中，VH_VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187或它们的变体组成的组。
E.本发明的特定实施方案
本发明具体提供了结合CD3和CLDN6的1+1和2+1形式。
1.1+1形式
在特定的1+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.9_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的1+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.24_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的1+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H2.91_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的1+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.9_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
2.2+1形式
在特定的2+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.9_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的2+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.24_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的2+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H2.91_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
在特定的2+1形式实施方案中，αCLDN6 ABD是Fab并具有VH_VL对H1.9_L1.187，并且αCD3 ABD是选自由以下组成的组的scFv：抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47、抗CD3 H1.31_L1.47、抗CD3L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.30、抗CD3 L1.47_H1.32、抗CD3 L1.47_H1.89、抗CD3L1.47_H1.90、抗CD3 L1.47_H1.33和抗CD3 L1.47_H1.31。
V.本发明的核酸
本公开进一步提供了编码本文提供的抗CLDN6抗体的核酸组合物，该抗CLDN6抗体包括但不限于抗CLDN6×抗CD3双特异性抗体和CLDN6单特异性抗体。
如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将依赖于异二聚体蛋白的格式和支架。因此，举例来说，当所述形式需要三种氨基酸序列(如1+1Fab-scFv-Fc形式(例如第一氨基酸单体包含Fc结构域和scFv，第二氨基酸单体包含重链和轻链))时，可以将三种核酸序列并入一种或多种表达载体中供表达。类似地，一些形式(例如，图1中所公开的双scFv形式)仅需要两种核酸；同样，该两种核酸可以放入一个或两个表达载体中。
如所属领域中所知，取决于用于产生本文所述的异二聚抗体的宿主细胞，可以将编码本文所述的抗体的部件的核酸并入如所属领域中已知的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调控元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合的载体。
然后将本文所述的抗体的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞)在许多实施方案中使用。
在一些实施方案中，如果取决于形式适用的话，对每个单体进行编码的核酸和对轻链进行编码的任选核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在尤其用于本文所述的抗体的实施方案中，这两种或三种核酸中的每种包含在不同表达载体上。如本文和62/025,931(特此以引用方式并入)所示，可以利用不同的载体比率驱使异二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，虽然蛋白质包括1:1:2比率的第一单体：第二单体：轻链(在本文中具有包括异二聚抗体的三个多肽的许多实施方案的情况下)，但是这些并非得到最佳结果的比率。
通过培养包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制备本文所述的异二聚抗体。一旦产生，就执行传统抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI，并且异二聚体也具有不同的pI，从而促进“1+1Fab-scFv-Fc”和“2+1”异二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于测定和监测任何污染的双重scFv-Fc和纯化后mAb同源二聚(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。
VI.异二聚双特异性抗体的生物和生物化学功能
通常，向患有癌症的患者施用本文所述的双特异性CLDN6×CD3抗体，并且以本文所述的多种方式对功效进行评估。因此，在可以进行标准功效测定时，如癌症负载、肿瘤大小、对存在或转移程度的评估等，可以也可以基于免疫状态评估来估计免疫肿瘤学治疗。这可以多种方式进行，包括体外和体内测定。
VII.治疗
一旦制备，本文所述的抗体的组合物可用于许多应用。CLDN6在肾细胞癌中高度表达，因此，本文描述的抗体的异二聚组合物可用于治疗此类CLDN6阳性癌症。
VIII.用于体内施用的抗体组合物
通过将具有期望程度的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》，第16版，Osol,A.编辑[1980])来制备根据本文所述的抗体使用的抗体调配物以用于以冻干调配物或水溶液形式储存。
IX.施用方式
本文所述的抗体和化疗剂根据已知的方法，如静脉内施用(作为推注(bolus)或通过在一段时间内连续输注)向受试者施用。
X.治疗方式
在本文所述的方法中，用疗法来提供对疾病或病症的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病症和/或改善与疾病或病症相关联的症状。例如，阳性治疗应答是指该疾病的以下改善中的一者或多者：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡的增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤生长；(6)患者存活率增加；和(7)与疾病或病症相关联的一种或多种症状的一些缓解。
可以通过对那个疾病或病症具有特异性的标准化反应标准来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗反应。可以使用筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变的肿瘤反应。
除了这些阳性治疗反应之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。
根据本公开的治疗包含所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。
治疗有效量可以根据因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重、以及药物在个体中引发希望的反应的能力。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。
肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人肿瘤的功效的动物模型系统中评定化合物抑制癌症的能力。
可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评定。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其它方式减轻受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或所选择的施用途径这种因素确定这种量。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个团注物，或者可以随时间施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文所用，剂量单位形式是指适于作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位；每个单元含有经计算与所需的药物载体联合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。
针对本公开的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。
用于本文所述的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域的技术人员确定。
用于本文所述的抗体中的治疗有效量的双特异性抗体的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献通过引用以其全部内容明确地并入本文。
尽管以上为了说明的目的描述本公开的特定实施方案，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。
实施例
A.实施例1：工程化αCLDN6×αCD3双特异性抗体
具有不同CD3结合亲和力的CD3结合结构域的序列如图10所示。CLDN6结合结构域的序列描述于图14至图15中。设想了αCLDN6×αCD3双特异性抗体(bsAb)的多种形式，其说明性形式在下面和图17中概述。
一种此类形式是1+1Fab-scFv-Fc形式，所述形式包含共价附接至第一异二聚Fc结构域的单链Fv(“scFv”)、共价附接至互补的第二异二聚Fc结构域的重链可变区(VH)，以及轻链(LC)，所述轻链单独地转染，使得Fab结构域与可变重链结构域一起形成。
另一种形式是2+1Fab2-scFv-Fc形式，所述形式包含VH结构域，所述结构域共价附接至CH1结构域，所述CH1结构域共价附接至scFv，所述scFv共价附接至第一异二聚Fc结构域(VH-CH1-scFv-Fc)；VH结构域，所述VH结构域共价附接至互补的第二异二聚Fc结构域；以及LC，所述LC单独地转染，使得Fab结构域与VH结构域一起形成。
通过以下方式生成αCLDN6×αCD3 bsAb的DNA编码链：进行标准基因合成，之后进行等温克隆(Gibson装配)或亚克隆到含有融合配偶体(例如图6中描绘的结构域接头和/或图7至图9中描绘的主链)的pTT5表达载体中。将DNA转染到HEK293E细胞中以进行表达。呈1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab2-scFv-Fc形式的说明性αCLDN6×αCD3 bsAb(基于上文所述的结合结构域)的序列分别描绘在图19至图22中。
B.实施例2：工程化CLDN6结合结构域以提高选择性
蛋白质的密封蛋白家族包括许多其他密封蛋白。如下测定各种密封蛋白序列与CLDN6的Jukes-Cantor距离：CLDN9(0.32)、CLDN4(0.51)、CLDN3(0.52)、CLDN5(0.64)、CLDN8(0.8)和CLDN17(0.82)。与CLDN6相比，CLDN9在健康组织(例如子宫颈和食管)中更高地表达，因此CLDN6治疗剂与CLDN9的交叉反应性可能导致脱靶毒性。然而，除了Jukes-Cantor距离仅相差0.32％和96％同一性之外，CLDN6和CLDN9的胞外环中仅存在3个残基不同(如图12所示)；因此，开发能够相对于CLDN9选择性结合CLDN6的抗体是重大挑战。因此，本部分描述了适用于本发明的αCLDN6×αCD3 bsAb的合适的CLDN6结合结构域(具有最小交叉反应性)的鉴定和工程化。另外，将美国专利10,233,253中描述的现有技术CLDN6结合结构域用作比较物(如XENP26863中的二价mAb形式和如XENP26849中具有CD3高scFv的1+1Fab-scFv-FcbsAb；图18中所描绘的序列)。
用于筛选CLDN6结合结构域的以下实验通常如下进行。HEK293T或HEK293E细胞分别被稳定或瞬时转染以表达CLDN6、CLND9或其他感兴趣的靶标。转染后48小时，收获细胞并与指定测试物的稀释液在4℃处一起温育1小时。接下来，将细胞洗涤并用二抗(通常为抗人Fc AlexaFluor647)在4℃处染色1小时，随后再洗涤两次。然后通过流式细胞术评估结合。
1.鉴定相对于CLDN9对CLDN6具有选择性的CLDN6结合结构域
研究了六种鼠抗CLDN6 mAb与CLDN6和CLDN9以及与同属于密封蛋白家族成员的CLDN3和CLDN4的结合。图23描绘了mAb与转染细胞的结合。通过比较EC50值和AUC(结合曲线下面积)来确定对靶标的特异性。数据显示相对于CLDN9，克隆C6-10、C6-15和C6-21对CLDN6不具有选择性。另外，克隆C6-10甚至显示与CLDN4的一些结合。值得注意的是，克隆C6-11、C6-24和C6-30显示出相对于CLDN9对CLDN6的选择性，并且几乎不与CLDN3和CLDN4结合。
2.CLDN6结合结构域的人源化
将C6-11、C6-24和C6-30的可变区使用串内容优化进行人源化(参见例如，2010年2月2日发布的美国专利7,657,380)。对于每个克隆，将两个人源化可变重链结构域(即H1和H2)和两个人源化可变轻链结构域(即L1和L2)被工程化并配对(即H1L1、H1L2、H2L1、H2L2)。人源化C6-30可变结构域和基于该结构域的二价mAb的序列分别描绘于图14和图16中(如XENP34218、XENP34219、XENP34220和XENP34221)。研究了人源化克隆与CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的结合以确定人源化是否影响它们的结合曲线，并描绘于图24至图26中。克隆C6-30和C6-24的所有人源化变体显示出与它们的鼠前体相同的结合曲线。出乎意料的是，克隆C6-11的所有人源化变体都不利地证明与CLDN4的结合增加。
3.工程化以去除易降解的残基
研究了C6-30的序列的易降解残基。重链CDR2包括D52/P52a作为异构化基序；N54/G55作为脱酰胺基序；和Q64/G75作为脱酰胺基序。因此，制备了在这些残基处具有突变的文库，以研究是否可以在不影响CLDN6结合和选择性的情况下消除该倾向。图27描绘了所研究的变体以及它们与CLDN6和CLDN9的结合，如上文通常描述。数据显示，许多保持选择性的变体降低了与CLDN6的结合。值得注意的是，G55A确实保持了选择性，且对CLDN6结合的损失最小。
4.CLDN6结合结构域在双特异性抗体背景下的交叉反应性的表征
呈1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab2-scFv-Fc形式的原型αCLDN6×αCD3双特异性抗体(bsAb)使用上述人源化CLDN6结合结构域和如实施例1中所述的CD3结合结构域进行工程化和生产(如实施例1中所述)。
为了便于临床开发(例如通过在模型动物中研究治疗剂)，结合结构域对小鼠和/或食蟹猴抗原具有交叉反应是有用的。因此，研究了原型αCLDN6×αCD3 bsAb与人CLDN6、食蟹猴CLDN6和鼠CLDN6的结合。如图28所示，每种原型bsAb能够作用于人、食蟹猴和小鼠CLDN6。
接下来，研究原型bsAb的结合，以确认将CLDN6结合结构域格式化为双特异性抗体不会影响它们相对于CLDN9对CLDN6的选择性。根据CLDN9/CLDN6 EC50比率测定选择性。如图29所示，尽管基于C6-30的抗体更具选择性，但双特异性抗体中的每种抗体保持相对于CLDN9对CLDN6的选择性。值得注意的是，虽然人源化C6-24在1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab2-scFv-Fc形式中显示出相似的选择性，但人源化C6-30变体在2+1Fab2-scFv-Fc形式中显示出进一步增强的选择性。
另外，研究了与CLDN6 I143V同种型的结合，因为在约30％的群体中发现该变体，并且数据显示变体中的每种变体能够结合I143V同种型。
5.增强的CLDN6选择性的工程化
已经显示出良好选择性的人源化C6-30(H1L1和H2L1两者)，特别是在2+1Fab2-scFv-Fc的背景下，被工程化以增强选择性。在第一轮工程化中，将单点突变引入可变重链结构域或可变轻链结构域，产生格式化为二价mAb的约300种变体的文库。筛选每种mAb以30μg/ml的单一浓度与CLDN6和CLDN9(在转染的细胞上)的结合。大部分点突变对CLDN6和CLDN9均具有类似影响(例如，与两者的结合增强或与两者的结合减少)。尽管如此，发现有几个点突变减少与CLDN9的结合，同时保持或甚至改善了与CLDN6的结合(如通过朝向较高的CLDN6 MFI值和较低的CLDN9 MFI值的偏斜所指示；图30中圈出)。在两个单独的实验中以不同浓度重新研究这些变体与CLDN6和CLDN9的结合，描绘EC50和CLDN9/CLDN6 EC50比率的数据描绘于图31中。应当注意，来自实验的结合数据不能直接比较，因为转染细胞上的抗原密度在实验之间有所不同。尽管如此，与亲本人源化克隆(即XENP34218_H1L1和XENP34220_H2L1)相比且与比较物XENP26863相比，几种变体在选择性方面得到增强。虽然一些变体(诸如具有H2_L1.60的XENP35865)与亲本人源化克隆相比是较弱的CLDN6结合物，但它们也是弱得多的CLDN9结合物，从而提供相对于CLDN9对CLDN6的显著增强的选择性。有趣的是，几种变体(诸如分别具有H2.8_L1和H2.9_L1的XENP35101和XENP35102)导致相对于CLDN6对CLDN9的选择性显著增强。
接下来，将来自提供CLDN6选择性的最佳改善的第一轮工程化的偏好的变体重链结构域(H1.9、H1.22、H1.24、H2.3、H2.9、H2.12、H2.90、H2.91和H2.118)和偏好的变体轻链结构域(L1.187和L1.189)组合以创建16个变体的新文库。如上所述研究了这些变体与CLDN6和CLDN9的结合，其数据示于图32中。图33中的数据描绘了每种测试物的EC50和AUC以及作为选择性指标的CLDN9/CLDN6 EC50比率和CLDN6/CLDN9 AUC比率。与亲本人源化克隆相比，16种组合变体中的每一种都在选择性方面增强(例如，与具有H1L1且CLDN9/CLDN6EC50比率为23.03的XENP34218相比，具有H1.22_L1.87且CLDN9/CLDN6 EC50比率为44.94的XENP36956)。值得注意的是，与亲本变体相比，组合偏好的变体重链结构域和偏好的变体轻链结构域并不总是增强选择性(例如，与具有H1_L1.187且CLDN9/CLDN6 EC50比率为52.64的XENP36972相比，具有H1.22_L1.187且CLDN9/CLDN6 EC50比率为44.94的XENP36956)。最后，与基于CLDN9/CLDN6 EC50比率的比较物XENP26863相比，16种组合变体中的10种显示出卓越的选择性；并且基于CLDN6/CLDN9 AUC比率，16/16组合变体显示出优越性。应注意的是，还研究了结合可变重链结构域突变的变体，但是这些变体并不优于每个可变重链结构域仅具有一个突变的克隆。还应注意的是，比率不应是增强选择性的唯一决定因素。例如，尽管具有H1.9_L1.187且CLDN9/CLDN6 EC50为44.94的XENP36956似乎比对照XENP26863选择性略低，但与XENP26863相比，XENP36956对于CLDN9结合具有高得多的EC50(29584ng/ml与2146ng/ml相比)，同时对于CLDN6结合保持合理的EC50。
6.在双特异性抗体的背景下研究工程化的CLDN6结合结构域
最后，将几种优选的组合变体掺入2+1Fab2-scFv-Fc CD3 bsAb中以研究双特异性形式是否影响它们的选择性。令人惊讶地，如图34A所示，许多2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体，包括具有C6-30_H1.24_L1.187的XENP37231、具有C6-30_H1.9_L1.187的XENP37227和具有C6-30_H2.91_L1.187的XENP37233，显示出与具有相同变体CLDN6结合结构域的相应二价mAb相比增强的CLDN6结合；然而，与单特异性二价形式相比，C6-30_H1.22_L1.89变体实际上在双特异性形式中显示出降低的结合，而几种其他变体在双特异性形式和单特异性二价形式中显示出类似的结合。另外令人惊讶的是，如图34B所示，几种2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体(包括包含C6-30_H1.9_L1.187变体的XENP37227和具有C6-30_H1.24_L1.187变体的XENP37231)显示出与具有相同变体CLDN6结合结构域的相应二价mAb相比降低的CLDN9结合。
7.研究另外的脱靶结合
为了确定与密封蛋白家族中其他蛋白质的交叉反应性，如上文一般描述研究了C6-24_H1L1、C6-30_H1L1和C6-30_H2L1与CLDN5、CLDN8和CLDN17的结合。图35中描绘的数据显示，没有一个克隆与所研究的另外的密封蛋白发生交叉反应。另外，针对与CLDN3、CLDN4、CLDN8和CLDN17的结合，将C6-30变体与XENP37217(使用比较物CLDN6结合结构域的CLDN6×CD3双特异性，其序列描绘于图60中)一起筛选。将293细胞用CLDN3、CLDN4、CLDN8或CLDN17瞬时转染。将细胞接种并以100μg/ml剂量将每种测试物添加到每个细胞系中。在4℃处温育1小时后，将细胞洗涤并添加二级AF647抗体。将细胞在4℃处再温育一小时，随后进行另外的洗涤，并然后通过流式细胞术进行分析。对于这些不同的密封蛋白家族成员中的每一个，比较分子XENP37217显示比利用C6-30结合结构域的测试物更高的结合。XENP37217显示出与CLDN8和CLDN17特别强的结合，产生比C6-30变体高一个数量级以上的MFI，如图61所示。这突出了CLDN6结合结构域具有不仅结合CLDN6而且结合其他密封蛋白家族成员的特异性的潜力。
C.实施例3：工程化αCLDN6×αCD3 bsAb以优化重定向T细胞对表达CLDN6的细胞的 细胞毒性
αCLDN6×αCD3 bsAb用各种调整的CLDN6和CD3结合结构域并以不同的双特异性形式进行工程化，并如实施例1中一般描述的那样产生，以优化重定向T细胞细胞毒性(RTCC)、CLDN6选择性和潜在治疗指数。
1.具有二价CLDN6结合的αCLDN6×αCD3 bsAb对CLDN6+细胞的重定向T细胞毒性 (RTCC)得到增强
使用呈1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc形式的C6-24_H1L1、C6-30_H1L1和C6-30_H2L1来工程化αCLDN6×αCD3 bsAb以研究亲合力的影响(即CLDN6抗原的单价结合与二价结合)。将PA-1细胞(CLDN6hi；1.1×106个CLDN6密度)与从人PBMC中分离的T细胞以10:1效应子：靶标比率一起温育48小时。显示RTCC活性的数据(如死细胞百分比和T细胞活化所指示)描绘于图37至图38中。2+1Fab2-scFv-Fc构建体显示出与1+1构建体相比低20-100倍的EC50。另外，与C6-30_H1L1相比，对于C6-30_H2L1而言，2+1与1+1构建体之间的效力变化高出约半对数。总之，数据表明具有二价CLDN6结合的bsAb对CLDN6+靶细胞的RTCC得到增强。
2.具有二价CLDN6结合和较低亲和力CD3结合的αCLDN6×αCD3bsAb相对于CLDN9对 CLDN6的选择性增强
接下来，研究了具有C6-30_H2L1和高亲和力CD3_高或较低亲和力CD3_高-Int编号1以及呈1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc形式的αCLDN6×αCD3 bsAb对CLDN6+靶细胞的选择性。将稳定转染以表达CLDN9的HUTU-80细胞(CLDN6+)或HEK293-TREX细胞与从人PBMC纯化的T细胞以10:1效应子：靶标比率一起温育48小时。还使用了比较物bsAb XENP26849。显示RTCC活性的数据(如死细胞百分比和T细胞活化所指示)描绘于图39至图40中。令人惊讶地的是，具有高亲和力CD3_高的bsAb对HUTU-80细胞的RTCC活性的诱导仅略微不同于具有较低亲和力CD3_高-Int编号1的bsAb。然而，与实施例3A一致，与1+1形式相比，2+1形式能够产生更有效的RTCC活性。值得注意的是，具有较低亲和力CD3_高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc bsAb对脱靶CLDN9+细胞的诱导RTCC的效力低于具有高亲和力CD3_高的2+1bsAb，这表明在2+1Fab2-scFv-Fc形式的背景下使用较低亲和力CD3结合结构域有利于提高相对于CLDN9表达细胞对CLDN6选择性。此外，与比较物bsAb XENP26849相比，基于C6-30的每种bsAb显示出对CLDN9表达细胞弱得多的RTCC诱导。
3.αCLDN6×αCD3 bsAb活性与CLDN6抗原密度和CD3结合亲和力相关
接下来，研究了对具有不同CLDN6密度的细胞系的RTCC活性。将30K PA-1(1.1×106个CLDN6密度)、OV-90(195K个CLDN6密度)、NEC-8(175K个CLDN6密度)和COV-318(11K个CLDN6密度)细胞与从人PBMC纯化的T细胞以10:1E:T比率一起温育48小时。RTCC活性(如死细胞百分比和T细胞活化所指示)描绘于图41至图44中。数据显示细胞杀伤活性和T细胞活化与CLDN6抗原密度和CD3结合结构域的亲和力相关。相对于较低CLDN6抗原密度对较高CLDN6抗原密度的选择性表明，在临床环境中可能减少表达低水平的CLDN6的健康组织的脱靶杀伤并改善治疗指数。
4.调节αCLDN6×αCD3 bsAb活性和选择性
通过将前导选择性调节的CLDN6结合结构域(如实施例2中所述)掺入具有CD3_高-Int编号1的2+1Fab2-scFv-Fc形式中来进一步调节αCLDN6×αCD3 bsAb。
将稳定转染以表达CLDN9的30K HUTU-80(CLDN6+)或HEK293TREX细胞与从人PBMC纯化的T细胞和测试物一起温育48小时。在第一个实验中，使用10:1的效应子：靶标比率，其数据描绘于图45中。在第二个实验中，使用1:1的效应子：靶标比率，其数据描绘于图46中。与实施例2.6中的数据一致，与具有亲本C6-30_H1L1和C6-30_H2L1的bsAb相比，具有选择性工程改造的CLDN6结合结构域的bsAb显示出对CLDN6+细胞的调节活性和/或对CLDN9+细胞的调节活性。在一种情况下，与亲本克隆相比，XENP37233显示出对CLDN9+细胞的类似活性，但对CLDN6+细胞的活性显著增强。在另一种情况下，XENP37227显示出对CLDN9+细胞的活性降低且对CLDN6+细胞的活性增强(与亲本克隆相比)。在另外的情况下，与亲本克隆相比，XENP37231显示出对CLDN9+细胞很少至没有活性，但对CLDN6+细胞活性略有降低。这些bsAb中的每一者都可能是合适的，这取决于临床开发是否有利于增强对CLDN6+细胞的活性、降低对CLDN9+细胞的活性、或优选两者的平衡。另外，在第二个实验中，如图47至图51所示，还测定了由CD69表达、CD107a表达和细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)分泌所指示的T细胞的活化，并且观察结果与细胞杀伤数据一致。
图52另外描绘了对HUTU-80与对表达CLDN9细胞的HEK293TREX的RTCC活性的重叠。数据显示每种bsAb可以以高浓度给药以实现对CLDN6+细胞的有效杀伤，同时避免对CLDN9+细胞的杀伤。
在另一个实验中，将上述bsAb对PA-1细胞的RTCC活性与具有与XENP37227相同的CLDN6结合结构域(即C6-30_H1.9_L1.187)和较低亲和力CD3 scFv(即CD3_高-Int编号2)的XENP37630(其序列描绘于图59中)进行比较。在图53中描绘了细胞杀伤和T活化(如由CD25和CD107a表达所指示的)，并且显示4种bsAb中的每一种在高浓度处实现了有效的靶细胞杀伤，其效力排名为XENP37223(最高效力)>XENP37227>XENP37630>XENP37231(最低效力)。
D.实施例4：本发明的αCLDN6×αCD3 bsAb的进一步表征
基于上述体外实验，选择几种bsAb用于进一步体内分析。这些抗体用Xtend Fc(M428L/N434S)进一步工程化以提高血清半衰期，图22和图59中描绘的说明性序列为XENP37547(XENP37233的Xtend类似物)、XENP37545(XENP37231的Xtend类似物)、XENP37634(XENP37630的Xtend类似物)和XENP37541(XENP37227的Xtend类似物)。
1.αCLDN6×αCD3 bsAb杀伤肿瘤中代表CLDN6的细胞
为了确认αCLDN6×αCD3 bsAb有效靶向表达与肿瘤细胞生物学相关的CLDN6抗原水平的细胞系的能力，对卵巢癌的活检核心进行IHC，并按0-3的等级进行定性评分，其中0表示几乎没有靶抗原表达，并且3表示高靶抗原表达(本文称为IHC评分)。虽然不同类型的卵巢癌之间存在显著差异，但许多卵巢癌的IHC评分在1-2范围内，表示每个细胞约200k个或更少的CLDN6抗原。因此，对PA-1细胞进行基因工程化，以较低范围的密度表达CLDN6。建立了工程化PA-1细胞系以每个细胞大约表达47k个、55k个、77k个、105k个、212k个或228k个CLDN6抗原。进行了细胞结合实验，其中将XENP37541与每种较低密度的PA-1细胞一起培养。然后将细胞系洗涤，用二抗染色并再次洗涤，然后通过流式细胞术测量结合。如图54所示，结合水平取决于CLDN6表达的密度，但XENP37541仍能够结合具有较低CLDN6表达水平的细胞，甚至低至每个细胞47k个CLDN6抗原。
接下来，测试了αCLDN6×αCD3 bsAb XENP37541、XENP37634和XENP37545以及XENP32140(阴性对照RSV×CD3 bsAb)对这些较低CLDN6密度PA-1细胞系诱导RTCC的能力。使用1:1效应子：靶细胞比率，以及图55中所示浓度范围内的测试物。温育72小时后，如图55所示测量结果，并且结果显示XENP37541、XENP37634和XENP37545即使在较低的CLDN6表达水平处也都能够以CLDN6密度依赖性方式有效地诱导RTCC。结果显示，XENP37541在所有CLDN6密度中具有最强的效力和最低EC50值。
2.αCLDN6×αCD3 bsAb增强T细胞体内同种异体抗肿瘤作用
在第-7天，将NOD SCIDγ(NSG)小鼠(n＝10)皮内移植10×106个PA-1细胞(在基底膜中)。在第0天，将小鼠腹膜内移植5×106个人PBMC。然后在第0、7、14和21天用0.3mg/kg、1.0mg/kg或3.0mg/kg的XENP37233、XENP37227、XENP37630或XENP37231或PBS对照处理小鼠。每周通过卡尺测量肿瘤体积三次(其数据如图56所示)并抽血以研究淋巴细胞扩增(数据未显示)。数据显示4种bsAb中的每一种都能够在所有浓度处诱导抗肿瘤效果。到第14天，与PBS对照相比，双特异性抗体中的每种抗体都增强了抗肿瘤活性。值得注意的是，较低效力的分子XENP37630和XENP37231在抗肿瘤活性方面显示出一定的剂量依赖性。
3.αCLDN6×αCD3 bsAb在食蟹猴中具有良好耐受性并显示出良好的药代动力学特 征
动物(n＝1)在第0天按1X、10X、30X和60X剂量给药XENP37547、XENP37545、XENP37634和XENP37541。随时间推移抽取血液以测定随时间推移药物在血清中的浓度，其数据描绘于图57至图58中。数据显示bsAb的体内半衰期为约2周，并且是剂量依赖性的。另外，bsAb通常具有良好耐受性，如通过临床观察结果(例如体重；数据未显示)所示。

Claims (52)

1.一种组合物，所述组合物包含CLDN6抗原结合结构域(ABD)，其中所述CLDN6抗原结合结构域包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的可变重链结构域(VH)/可变轻链结构域(VL)对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、
H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、
H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、
H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、
H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、
H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、
H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、
H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、
H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、
H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述ABD包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、
H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、
H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、
H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、
H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、
H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、
H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9,_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、
H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、
H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、
H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、
H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、
H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、
H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、
H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、
H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、
H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、
H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、
H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物是单克隆抗体。
5.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：
a)第一核酸，所述第一核酸编码VH结构域；和
b)第二核酸，所述第二核酸编码VL结构域；
其中所述VH和所述VL是选自由以下组成的组的一对：
H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、
H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、
H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、
H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、
H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、
H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、
H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、
H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
6.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物分别包含：
a)第一表达载体，所述第一表达载体包含根据权利要求5所述的第一核酸；和
b)第二表达载体，所述第二表达载体包含根据权利要求5所述的第二核酸。
7.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求5所述的第一核酸和第二核酸。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求6所述的表达载体组合物或根据权利要求7所述的表达载体。
9.一种制备CLDN6 ABD的方法，所述方法包括在表达所述ABD的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞，以及回收所述ABD。
10.一种异二聚抗体，所述异二聚抗体包含：
a)第一单体，所述第一单体包含：
i)抗CD3 scFv，所述抗CD3 scFv包含第一可变轻链结构域、scFv接头和第一可变重链结构域；和
ii)第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域接头共价附接至所述第一Fc结构域的N末端；
b)第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重链结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和
c)轻链，所述轻链包含第二可变轻链结构域，
其中所述第二可变重链结构域和所述第二可变轻链结构域形成CLDN6抗原结合结构域(ABD)。
11.根据权利要求10所述的异二聚抗体，其中所述CLDN6结合结构域包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的可变重链结构域/可变轻链结构域对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、
H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、
H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、
H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、
H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、
H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、
H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、
H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、
H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
12.根据权利要求10或11所述的异二聚抗体，其中所述CLDN6结合结构域包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、
H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、
H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、
H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、
H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、
H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、
H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
13.根据权利要求10或11所述的异二聚抗体，其中所述CLDN6结合结构域包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的异二聚抗体，其中所述抗CD3scFv包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
15.根据权利要求10至15中任一项所述的异二聚抗体，其中所述scFv接头是带电荷的scFv接头。
16.根据权利要求10至16中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。
17.根据权利要求16所述的异二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自由图1A至图1E中所描绘的异二聚化变体组成的组的一组异二聚化变体。
18.根据权利要求17所述的异二聚抗体，其中所述一组异二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；
S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
19.根据权利要求17或18所述的异二聚抗体，其中所述第一单体和所述第二单体还包含一种或多种消融变体。
20.根据权利要求19所述的异二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者包含一种或多种pI变体。
22.根据权利要求21所述的异二聚抗体，其中所述一种或多种pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
23.根据权利要求10至22中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一单体包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。
24.根据权利要求23所述的异二聚抗体，其中所述第一单体和所述第二单体各自还包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
25.一种异二聚抗体，所述异二聚抗体包含：
a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含scFv-接头-CH2-CH3，
其中scFv是抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和
c)轻链，所述轻链包含VL-CL；
其中所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，
其中所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，
其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述VH和所述VL形成包含可变重链结构域和可变轻链结构域的CLDN6结合结构域，所述可变重链结构域和可变轻链结构域分别属于选自H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187的CLDN6结合结构域，
其中所述抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31，并且
其中编号是根据EU编号进行的。
26.根据权利要求25所述的异二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
27.一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：
a)第一核酸，所述第一核酸编码根据权利要求10至26中任一项所述的第一单体；
b)第二核酸，所述第二核酸编码根据权利要求10至26中任一项所述的第二单体；和
c)第三核酸，所述第三核酸编码根据权利要求10至26中任一项所述的轻链。
28.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含：
a)第一表达载体，所述第一表达载体包含根据权利要求27所述的第一核酸；
b)第二表达载体，所述第二表达载体包含根据权利要求27所述的第二核酸；和
c)第三表达载体，所述第三表达载体包含根据权利要求27所述的第三核酸。
29.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求28所述的表达载体组合物转化。
30.一种制备异二聚抗体的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求29所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。
31.一种异二聚抗体，所述异二聚抗体包含：
a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-scFv-接头2-CH2-CH3，
其中VH1是第一可变重链结构域，scFv是抗CD3 scFv，接头1和接头2分别是第一结构域接头和第二结构域接头，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和
c)共同轻链，所述共同轻链包含可变轻链结构域；
其中所述第一可变重链结构域和所述可变轻链结构域形成第一CLDN6 ABD，并且所述第二可变重链结构域和所述可变轻链结构域形成第二CLDN6 ABD。
32.根据权利要求31所述的异二聚抗体，其中所述第一CLDN6结合结构域和所述第二CLDN6结合结构域各自包含一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，所述CDR来自选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、
H1.8_L1、H1.9_L1、H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、
H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、
H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、
H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、
H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
33.根据权利要求31或32所述的异二聚抗体，其中所述第一CLDN6结合结构域和所述第二CLDN6结合结构域中的每一者包含选自由以下组成的组的VH/VL对：H1_L1、H1.1_L1、H1.2_L1、H1.3_L1、H1.4_L1、H1.5_L1、H1.6_L1、H1.7_L1、H1.8_L1、H1.9_L1、
H1.19_L1、H1.22_L1、H1.24_L1、H2_L1、H2.1_L1、H2.2_L1、
H2.3_L1、H2.4_L1、H2.5_L1、H2.6_L1、H2.7_L1、H2.8_L1、H2.9_L1、H2.11_L1、H2.12_L1、H2.71_L1、H2.75_L1、H2.90_L1、H2.91_L1、H2.118_L1、H2.119_L1、H1_L1.1、H1.1_L1.1、H1.2_L1.1、H1.3_L1.1、H1.4_L1.1、H1.5_L1.1、H1.6_L1.1、H1.7_L1.1、H1.8_L1.1、H1.9_L1.1、H1.19_L1.1、
H1.22_L1.1、H1.24_L1.1、H2_L1.1、H2.1_L1.1、H2.2_L1.1、
H2.3_L1.1、H2.4_L1.1、H2.5_L1.1、H2.6_L1.1、H2.7_L1.1、H2.8_L1.1、H2.9_L1.1、H2.11_L1.1、H2.12_L1.1、H2.71_L1.1、H2.75_L1.1、H2.90_L1.1、H2.91_L1.1、H2.118_L1.1、H2.119_L1.1、H1_L1.4、H1.1_L1.4、H1.2_L1.4、H1.3_L1.4、H1.4_L1.4、H1.5_L1.4、H1.6_L1.4、H1.7_L1.4、H1.8_L1.4、
H1.9_L1.4、H1.19_L1.4、H1.22_L1.4、H1.24_L1.4、H2_L1.4、
H2.1_L1.4、H2.2_L1.4、H2.3_L1.4、H2.4_L1.4、H2.5_L1.4、H2.6_L1.4、H2.7_L1.4、H2.8_L1.4、H2.9、_L1.4 H2.11_L1.4、H2.12_L1.4、H2.71_L1.4、H2.75_L1.4、H2.90_L1.4、H2.91_L1.4、H2.118_L1.4、H2.119_L1.4、H1_L1.7、H1.1_L1.7、H1.2_L1.7、H1.3_L1.7、H1.4_L1.7、H1.5_L1.7、H1.6_L1.7、H1.7_L1.7、H1.8_L1.7、H1.9_L1.7、H1.19_L1.7、H1.22_L1.7、H1.24_L1.7、H2_L1.7、H2.1_L1.7、H2.2_L1.7、H2.3_L1.7、H2.4_L1.7、H2.5_L1.7、H2.6_L1.7、H2.7_L1.7、H2.8_L1.7、H2.9_L1.7、H2.11_L1.7、H2.12_L1.7、H2.71_L1.7、H2.75_L1.7、H2.90_L1.7、H2.91_L1.7、H2.118_L1.7、H2.119_L1.7、H1_L1.16、H1.1_L1.16、H1.2_L1.16、H1.3_L1.16、H1.4_L1.16、H1.5_L1.16、H1.6_L1.16、H1.7_L1.16、H1.8_L1.16、H1.9_L1.16、H1.19_L1.16、H1.22_L1.16、H1.24_L1.16、H2_L1.16、H2.1_L1.16、H2.2_L1.16、H2.3_L1.16、H2.4_L1.16、H2.5_L1.16、H2.6_L1.16、H2.7_L1.16、H2.8_L1.16、H2.9_L1.16、H2.11_L1.16、H2.12_L1.16、H2.71_L1.16、H2.75_L1.16、H2.90_L1.16、H2.91_L1.16、H2.118_L1.16、H2.119_L1.16、H1_L1.18、H1.1_L1.18、H1.2_L1.18、H1.3_L1.18、H1.4_L1.18、H1.5_L1.18、H1.6_L1.18、H1.7_L1.18、H1.8_L1.18、H1.9_L1.18、H1.19_L1.18、H1.22_L1.18、H1.24_L1.18、H2_L1.18、H2.1_L1.18、H2.2_L1.18、H2.3_L1.18、H2.4_L1.18、H2.5_L1.18、H2.6_L1.18、H2.7_L1.18、H2.8_L1.18、H2.9_L1.18、H2.11_L1.18、H2.12_L1.18、H2.71_L1.18、H2.75_L1.18、H2.90_L1.18、H2.91_L1.18、H2.118_L1.18、H2.119_L1.18、H1_L1.19、H1.1_L1.19、H1.2_L1.19、H1.3_L1.19、H1.4_L1.19、H1.5_L1.19、H1.6_L1.19、H1.7_L1.19、H1.8_L1.19、H1.9_L1.19、H1.19_L1.19、H1.22_L1.19、H1.24_L1.19、H2_L1.19、H2.1_L1.19、H2.2_L1.19、H2.3_L1.19、H2.4_L1.19、H2.5_L1.19、H2.6_L1.19、H2.7_L1.19、H2.8_L1.19、H2.9_L1.19、H2.11_L1.19、H2.12_L1.19、H2.71_L1.19、H2.75_L1.19、H2.90_L1.19、H2.91_L1.19、H2.118_L1.19、H2.119_L1.19、H1_L1.21、H1.1_L1.21、H1.2_L1.21、H1.3_L1.21、H1.4_L1.21、H1.5_L1.21、H1.6_L1.21、H1.7_L1.21、H1.8_L1.21、H1.9_L1.21、H1.19_L1.21、
H1.22_L1.21、H1.24_L1.21、H2_L1.21、H2.1_L1.21、H2.2_L1.21、H2.3_L1.21、H2.4_L1.21、H2.5_L1.21、H2.6_L1.21、H2.7_L1.21、H2.8_L1.21、H2.9_L1.21、H2.11_L1.21、H2.12_L1.21、H2.71_L1.21、H2.75_L1.21、H2.90_L1.21、H2.91_L1.21、H2.118_L1.2、H2.119_L1.21、H1_L1.22、H1.1_L1.22、H1.2_L1.22、H1.3_L1.22、H1.4_L1.22、H1.5_L1.22、H1.6_L1.22、H1.7_L1.22、H1.8_L1.22、H1.9_L1.22、H1.19_L1.22、H1.22_L1.22、H1.24_L1.22、H2_L1.22、H2.1_L1.22、H2.2_L1.22、H2.3_L1.22、H2.4_L1.22、H2.5_L1.22、H2.6_L1.22、H2.7_L1.22、H2.8_L1.22、H2.9_L1.22、H2.11_L1.22、H2.12_L1.22、H2.71_L1.22、H2.75_L1.22、H2.90_L1.22、H2.91_L1.22、H2.118_L1.22、H2.119_L1.22、H1_L1.23、H1.1_L1.23、H1.2_L1.23、H1.3_L1.23、H1.4_L1.23、H1.5_L1.23、H1.6_L1.23、H1.7_L1.23、H1.8_L1.23、H1.9_L1.23、H1.19_L1.23、H1.22_L1.23、H1.24_L1.23、H2_L1.23、H2.1_L1.23、H2.2_L1.23、H2.3_L1.23、H2.4_L1.23、H2.5_L1.23、H2.6_L1.23、H2.7_L1.23、H2.8_L1.23、H2.9_L1.23、H2.11_L1.23、H2.12_L1.23、H2.71_L1.23、H2.75_L1.23、H2.90_L1.23、H2.91_L1.23、H2.118_L1.23、H2.119_L1.23、H1_L1.27、H1.1_L1.27、H1.2_L1.27、H1.3_L1.27、H1.4_L1.27、H1.5_L1.27、H1.6_L1.27、H1.7_L1.27、H1.8_L1.27、H1.9_L1.27、H1.19_L1.27、H1.22_L1.27、H1.24_L1.27、H2_L1.27、H2.1_L1.27、H2.2_L1.27、H2.3_L1.27、H2.4_L1.27、H2.5_L1.27、H2.6_L1.27、H2.7_L1.27、H2.8_L1.27、H2.9_L1.27、H2.11_L1.27、H2.12_L1.27、H2.71_L1.27、H2.75_L1.27、H2.90_L1.27、H2.91_L1.27、H2.118_L1.27、H2.119_L1.27、H1_L1.60、H1.1_L1.60、H1.2_L1.60、H1.3_L1.60、H1.4_L1.60、H1.5_L1.60、H1.6_L1.60、H1.7_L1.60、H1.8_L1.60、H1.9_L1.60、H1.19_L1.60、H1.22_L1.60、H1.24_L1.60、H2_L1.60、H2.1_L1.60、H2.2_L1.60、H2.3_L1.60、H2.4_L1.60、H2.5_L1.60、H2.6_L1.60、H2.7_L1.60、H2.8_L1.60、H2.9_L1.60、H2.11_L1.60、H2.12_L1.60、H2.71_L1.60、H2.75_L1.60、H2.90_L1.60、H2.91_L1.60、H2.118_L1.60、H2.119_L1.60、H1_L1.107、H1.1_L1.107、H1.2_L1.107、H1.3_L1.107、H1.4_L1.107、H1.5_L1.107、H1.6_L1.107、H1.7_L1.107、H1.8_L1.107、H1.9_L1.107、H1.19_L1.107、H1.22_L1.107、H1.24_L1.107、H2_L1.107、H2.1_L1.107、H2.2_L1.107、H2.3_L1.107、H2.4_L1.107、H2.5_L1.107、H2.6_L1.107、H2.7_L1.107、H2.8_L1.107、H2.9_L1.107、H2.11_L1.107、H2.12_L1.107、H2.71_L1.107、H2.75_L1.107、H2.90_L1.107、H2.91_L1.107、H2.118_L1.107、H2.119_L1.107、H1_L1.114、H1.1_L1.114、H1.2_L1.114、H1.3_L1.114、H1.4_L1.114、H1.5_L1.114、H1.6_L1.114、H1.7_L1.114、H1.8_L1.114、H1.9_L1.114、H1.19_L1.114、H1.22_L1.114、H1.24_L1.114、H2_L1.114、H2.1_L1.114、H2.2_L1.114、H2.3_L1.114、H2.4_L1.114、H2.5_L1.114、H2.6_L1.114、H2.7_L1.114、H2.8_L1.114、H2.9_L1.114、H2.11_L1.114、H2.12_L1.114、H2.71_L1.114、H2.75_L1.114、H2.90_L1.114、H2.91_L1.114、H2.118_L1.114、H2.119_L1.114、H1_L1.187、H1.1_L1.187、H1.2_L1.187、H1.3_L1.187、H1.4_L1.187、H1.5_L1.187、H1.6_L1.187、H1.7_L1.187、H1.8_L1.187、H1.9_L1.187、H1.19_L1.187、H1.22_L1.187、H1.24_L1.187、H2_L1.187、H2.1_L1.187、H2.2_L1.187、H2.3_L1.187、H2.4_L1.187、H2.5_L1.187、H2.6_L1.187、H2.7_L1.187、H2.8_L1.187、H2.9_L1.187、H2.11_L1.187、H2.12_L1.187、H2.71_L1.187、H2.75_L1.187、H2.90_L1.187、H2.91_L1.187、H2.118_L1.187、H2.119_L1.187、H1_L1.189、H1.1_L1.189、H1.2_L1.189、H1.3_L1.189、H1.4_L1.189、H1.5_L1.189、H1.6_L1.189、H1.7_L1.189、H1.8_L1.189、H1.9_L1.189、H1.19_L1.189、H1.22_L1.189、H1.24_L1.189、H2_L1.189、H2.1_L1.189、H2.2_L1.189、H2.3_L1.189、H2.4_L1.189、H2.5_L1.189、H2.6_L1.189、H2.7_L1.189、H2.8_L1.189、H2.9_L1.189、H2.11_L1.189、H2.12_L1.189、H2.71_L1.189、H2.75_L1.189、H2.90_L1.189、H2.91_L1.189、H2.118_L1.189、H2.119_L1.189、H1_L2、H1.1_L2、H1.2_L2、H1.3_L2、H1.4_L2、H1.5_L2、H1.6_L2、H1.7_L2、H1.8_L2、H1.9_L2、H1.19_L2、H1.22_L2、H1.24_L2、H2_L2、H2.1_L2、H2.2_L2、H2.3_L2、H2.4_L2、H2.5_L2、H2.6_L2、H2.7_L2、H2.8_L2、H2.9_L2、H2.11_L2、H2.12_L2、H2.71_L2、H2.75_L2、H2.90_L2、H2.91_L2、H2.118_L2和H2.119_L2。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的异二聚抗体，其中所述VH/VL对选自由H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和
H1.9_L1.187组成的组。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的异二聚抗体，其中所述scFv包含具有来自选自由以下组成的组的VH/VL对的一组6个CDR(vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
36.根据权利要求35所述的异二聚抗体，其中所述scFv包含以下CD3结合结构域中的任一者的所述可变重链结构域和所述可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自由图1A至图1E中所描绘的异二聚化变体组成的组的一组异二聚化变体。
39.根据权利要求38所述的异二聚抗体，其中所述一组异二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；
S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一单体和所述第二单体还包含一种或多种消融变体。
41.根据权利要求40所述的异二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含一种或多种pI变体。
43.根据权利要求42所述的异二聚抗体，其中所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。
45.根据权利要求44所述的异二聚抗体，其中所述scFv接头是具有氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO:1)的带电荷的scFv接头。
46.根据权利要求45所述的异二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
47.一种异二聚抗体，所述异二聚抗体包含：
a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-scFv-接头2-CH2-CH3，
其中scFv是抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和
c)共同轻链，所述共同轻链包含VL-CL；
其中所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，
其中所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，
其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述VH和所述VL包含选自以下的CLDN6 ABD的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.9_L1.187、H1.24_L1.187、H2.91_L1.187和H1.9_L1.187；
其中所述抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重链结构域和可变轻链结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47、L1.47_H1.30、L1.47_H1.30、L1.47_H1.32、L1.47_H1.89、L1.47_H1.90、L1.47_H1.33和L1.47_H1.31，并且
其中编号是根据EU编号进行的。
48.根据权利要求47所述的异二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428/434S。
49.一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：
a)第一核酸，所述第一核酸编码根据权利要求31至48中任一项所述的第一单体；
b)第二核酸，所述第二核酸编码根据权利要求31至48中任一项所述的第二单体；和
c)第三核酸，所述第三核酸编码根据权利要求31至48中任一项所述的轻链。
50.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含：
a)第一表达载体，所述第一表达载体包含根据权利要求49所述的第一核酸；
b)第二表达载体，所述第二表达载体包含根据权利要求49所述的第二核酸；和
c)第三表达载体，所述第三表达载体包含根据权利要求49所述的第三核酸。
51.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求50所述的表达载体组合物转化。
52.一种制备异二聚抗体的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求51所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。
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