DE3783588T2 - Neue verbindungen dc-88a und dc-89a1 und deren herstellungsverfahren. - Google Patents
Neue verbindungen dc-88a und dc-89a1 und deren herstellungsverfahren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Verbindungen DC- 88A und DC-89A1 und ein Verfahren zu deren Herstellung, wobei zur Gattung Streptomyces gehörende Mikroorganismen gezüchtet werden. Diese Verbindungen weisen starke antibakterielle und Anti-Tumor-Wirkungen auf.
- Als Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die antibakterielle und Anti-Tumor-Wirkungen aufweisen und aus Mikroorganismen oder Pflanzen erhalten werden, sind viele Verbindungen, wie Anthracyclin-, Anthrachinon- und Mitomycin-Verbindungen bekannt (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, 1981, CRC Press, U.S.A.).
- Um hochwertige Antibiotika und Anti-Tumor-Verbindungen zu erhalten, nach denen stets Nachfrage besteht, wurden viele Mikroorganismen aus der Natur isoliert und bezuglich ihrer Antibiotika-Erzeugung untersucht. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß neue Antibiotika mit Anti-Tumor-Wirkung durch Züchtung von einem aus der Erde in Sunto-gun, Shizuoka Prefecture (im folgenden als DO-88 Stamm bezeichnet) und einem aus der Erde in Mt. Rokko, Hyogo Prefecture (im folgenden als DO- 89 Stamm bezeichnet) isolierten Mikroorganismus in einem Medium erzeugt werden. Diese Verbindungen wurden mit DC-88A bzw. DC-89A1 bezeichnet.
- Erfindungsgemaß werden die neuen Stoffe DC-88A und/oder DC89- A1 mit antibakterieller und Anti-Tumor-Wirkungen durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces erhalten, die fähig sind, DC-88A und/oder DC-89A1 in einem Medium zu erzeugen. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Stoffe werden nachstehend zusammengefaßt.
- (a) Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub8;
- (b) Massenspektrum:
- SIMS m/z 510 (M+3)&spplus;, 234 (Basispeak) (gemessen mit Glycerin als Matrix); m/z 508 (M+1)&spplus;, 234 (Basispeak) (gemessen mit Sulfolan als Matrix)
- Hochauflösendes EI-MS:
- gefunden: 507,1624
- berechnet für C&sub2;&sub6; H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub8;: 507,1639
- (c) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
- in Fig. 1 abgebildet (gemessen in MeOH)
- (d) Infrarotabsorptionsspektrum:
- in Fig. 2 abgebildet (gemessen in CHCl&sub3;)
- (e) Löslichkeit:
- Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform, Ethylacetat und DMSO; und mäßig löslich in Wasser und Hexan
- (f) ¹H-NMR-Spektrum
- (400 MHz, gemessen in CDCl&sub3;, interner Standard TMS):
- δ(ppm) 9,38 (1H, br, s), 7,17 (1H, s), 6,94 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,78 (1H, s), 6,21 (1H, br, s), 4,43 (2H, AB in ABX, JAB=10,0 Hz), 4,07 (3H, s), 3,94 (3H, s), 3,89 (3H, s), 3,75 (3H, s), 3,06 (1H, m), 2,24 (1H, dd, J=7,6, 3,9 Hz), 1,67 (3H, br, s), ca.1,3 (1H)
- (g) ¹³C-NMR-Spektrum
- (100 MHz, gemessen in CDCl&sub3;, interner Standard TMS):
- δ(ppm) 194,8, 179,8, 167,9, 165,2, 164,4, 161,2, 150,6, 141,3, 138,9, 128,2, 126,6, 123,3, 113,2, 112,0, 108,2, 97,7, 71,3, 61,5, 61,2, 56,3, 55,3, 53,4, 30,7, 22,3, 22,1, 21,1.
- (h) Rf-Wert: 0,46 (Toluol : Aceton = 7:3 V/V, Kieselgel).
- (a) Elementaranalyse: C: 56,5, H: 4,7, N: 7,1
- (b) Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub6;N&sub3;O&sub8;Cl&sub1;
- (c) Molekulargewicht: 543
- (gemessen durch Massenspektroskopie)
- (d) Schmelzpunkt 157,5 - 158,5ºC
- (e) ULtraviolettabsorptionsspektrum:
- in Fig. 3 abgebildet (gemessen in CH&sub3;OH)
- (f) Infrarotabsorptionsspektrum:
- in Fig. 4 abgebildet (gemessen in CHCl&sub3;)
- (g) PMR-Spektrum (in DMSO-d6, interner Standard TMS):
- δ (ppm) 11,54 (1H, breit), 9,88 (1H, s), 7,39 (1H, s), 6,91 (1H, breites s), 6,87 (1H, s), 6,58 (1H, breites d), 4,76 (1H, m), 4,35 (1H, breites dd), 3,96 (1H, breites d), 3,92 (3H, s), 3,777 (3H, s), 3,775 (3H, s), 3,61 (3H, s), 3,53 (1H, breites dd), 3,25 (1H, breites dd), 1,47 (3H, breites s)
- (h) CMR-Spektrum (in CDCl3, interner Standard TMS):
- δ (ppm) 196,6, 171,2, 164,5, 151,6, 150,2, 141,6, 140,8, 138,8, 129,3, 128,8, 125,9, 123,0, 118,1, 117,0, 116,9, 108,2, 97,7, 71,1, 61,5, 61,2, 56,2, 53,6, 53,4, 52,5, 33,2, 21,9.
- (i) Löslichkeit:
- Leicht löslich in Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Aceton, Chloroform und DMSO; und mäßig löslich in Wasser und n-Hexan
- Die mit Dünnschichtchromatographie ermittelten Rf-Werte für DC-89A1 [Kieselgel (Kieselgel 60 Art.5715, E. Merck, Westdeutschland), bei Raumtemperatur eine Stunde entwickelt] sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Entwickler (Volumenverhaltnis) Rf-Wert Toluol n-Hexan Aceton Ethylacetat Essigsäure
- Nach der Entwicklung können die DC-89A1-Flecken durch einen biologischen Test unter Verwendung von Bacillus subtilis, durch eine Farbreaktion unter Verwendung von heißer Schwefelsäure, Jod oder Ehrlich's Reagenz oder unter der Ultraviolett-Lampe nachgewiesen werden.
- Biologische Eigenschaften von DC-88A und DC-89A1 werden nachstehend zusammengefaßt. (A) Minimale Hemmkonzentration gegen verschiedene Mikroorganismen (MHK ug/ml) Tabelle 2 Mikroorganismus Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Shigella sonnei Salmonella typhi
- Die antibakterielle Wirkung wurde mit dem Agar-Verdünnungs- Verfahren gemessen, wobei ein durch Lösen von 3 g Bacto- Trypton (hergestellt von Difco Co., Ltd.), 3 g Fleischextrakt, 1 g Hefeextrakt, 1 g Glucose und 16 g Agar in 1l Wasser hergestelltes Medium (pH 7) verwendet wurde.
- Die Werte für die akute Toxizität (LD&sub5;&sub0;) von DC-88A und DC- 89A1 bei intraperitonealer Verabreichung in Mäuse betrugen etwa 0.94 mg/kg bzw. etwa 1.17 mg/kg.
- Sechs männliche Mäuse des ddY-Stamms mit einem Gewicht von jeweils etwa 20 g wurden für jede Gruppe als Testtiere verwendet und 5 x 10&sup6; Zellen des Sarcom 180 Ascites-Tumor wurden den Tieren subcutan an den Axillen implantiert. 0.2 ml einer mit Phosphat gepufferten, DC-88A oder DC-89A1 in den in Tabelle 3 und 4 angegebenen Konzentrationen enthaltenden, physiologischen Kochsalzlösung (im folgenden als PBS bezeichnet) wurden einmal intraperitoneal 24 Stunden nach der Implantation verabreicht.
- Die Zusammensetzung von PBS bestand aus 0.8 g/dl NaCl, 0.02 g/dl KCl, 1.15 g/dl Na&sub2;HPO&sub4; und 0.02 g/dl KH&sub2;PO&sub4; (pH 7.2).
- Das durchschnittliche Tumorvolumen (mm³) und das T/C-Verhältnis [T: durchschnittliches Tumorvolumen der mit den Testverbindungen behandelten Gruppen (mm³), C: durchschnittliches Tumorvolumen der Kontrollgruppe, der intraperitoneal 0.2 ml PBS-Lösung verabreicht wurde (mm³)] wurde 10 Tage nach der Implantation bestimmt. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt. Tabelle 3 Test-Verbindung Dosierung (mg/kg) Durchschnittliches Tumorvolumen (mm³) Kontrolle Tabelle 4 Test-Verbindung Dosierung (mg/kg) Durchschnittliches Tumorvolumen (mm³) Kontrolle Mitomycin C Toxisch
- Zum Vergleich wurden 0.2 ml Mitomycin C enthaltendes PBS einer Gruppe von Tieren intraperitoneal 24 Stunden nach Tumor- Implantation verabreicht.
- Fünf männliche CDF&sub1;-Mäuse mit einem Gewicht von jeweils 22 g wurden für jede Gruppe als Testtiere verwendet und 1 x 10&sup6; Zellen des Lymphocytenleukämie P388-Tumors wurden intraperitoneal in die Testtiere implantiert. 0.2 ml von DC-88A oder DC- 89A1 enthaltendem PBS wurden einmal intraperitoneal 24 Stunden nach der Implantation verabreicht. Die durchschnittlichen Überlebenstage nach Implantation und erhöhte Lebensdauer (T/C) (T: durchschnittliche Überlebenstage für die behandelten Gruppen, C: durchschnittliche Überlebenstage für die Kontrollgruppe) wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 zusammengefaßt. Tabelle 5 Test-Verbindung Dosierung (mg/kg) Durchschnittliche Überlebenstage Erhöhte Lebensdauer (T/C) Kontrolle * kontinuierliche Verabreichung über fünf Tage Tabelle 6 Test-Verbindung Dosierung (mg/kg) Durchschnittliche Überlebenstage Erhöhte Lebensdauer (T/C) Mitomycin C
- Zum Vergleich wurden einer Gruppe von Tieren 24 Stunden nach der Tumor-Implantation intraperitoneal 0.2 ml einer Mitomycin C enthaltenden PBS-Lösung verabreicht.
- Das Verfahren zur Herstellung von DC-88A und DC-89A1 wird nachstehend beschrieben.
- DC-88A und/oder DC-89A1 können durch Züchtung von zu der Gattung Streptomyces gehörenden, DC-88A und/oder DC-89A1 erzeugenden Stämmen in einem Nährmedium und durch Gewinnen von DC-88A und/oder DC-89A1 aus der Kulturbrühe erhalten werden.
- Als die DC-88A und/oder DC-89A1 produzierenden Stämme können jegliche zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismen verwendet werden solange sie die Fähigkeit besitzen, DC-88A und/oder DC-89A1 zu erzeugen.
- Als typische verwendete Stämme werden die vorstehend beschriebenen Stämme DO-88 und DO-89 erwähnt.
- Die mikrobiologischen Eigenschaften des DO-88 Stamms sind nachstehend zusammengefaßt.
- Luftmycel : Es ist verzweigt aber nicht fragmentiert.
- Substratmycel : Es ist nicht fragmentiert.
- Spore : Lange spiralige Ketten von Sporen werden an den Enden des schwach verzweigten Luftmycels gebildet.
- Oberfläche der Spore : Glatt ("smooth")
- Form und Größe der Spore: Oval, etwa 0.7 x 0.9 um
- Bewegungsfähigkeit der Spore: Negativ
- Es wird keine Bildung von Sclerotium und Sporangium beobachtet.
- Luftmycel : Grau
- Substratmycel : Beige bis braun
- Lösliches Pigment : nicht vorhanden
- Melanoid-ähnliches : nicht vorhanden
- Pigment
- LL-Typ
- In Tabelle 7 sind die Charakteristika zusammengefaßt, die bei Züchtung des DO-88 Stamms auf verschiedenen Agar-Medien über 3 Wochen bei 28ºC beobachtet wurden. Tabelle 7 Medium Charakteristika bei der Züchtung Saccharose-Nitrat-Agar-Medium W : schlecht LM: hell, leicht senfbraun (2ie) SM: leicht senfbraun (2ie) bis beige (3ge) Glucose-Asparagin-Agar-Medium W : gut, verstärkt LM: stark entwickelt, natur (2dc) bis gedeckt braun (2ge) SM: gedeckt braun (2ge) bis natur (2dc) Glycerin-Asparagin-Agar-Medium W : gut, verstärkt LM: stark entwickelt, gedeckt grau (2fe) bis perlmutt (3ba) SM: gedeckt braun (2ge) Stärke-Agar-Medium W : gut, verstarkt LM: stark entwickelt, natur (2dc) bis gedeckt grau (2fe) SM: senfbraun (21g) Tyrosin-Agar-Medium W : mäßig LM: hell, gedeckt braun (2ge) SM: biskuit (2ec) Nähr-Agar-Medium W : mäßig LM: hell, silbergrau (3fe) bis perlmutt (3ba) SM: natur (2dc) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium W : gut, verstärkt LM: stark entwickelt, perlmutt (3ba) bis dunkelbraun (2pn) SM: senfbraun (2pl) Hafermehl-Agar-Medium W : gut, verstärkt LM: stark entwickelt, perlmutt (3ba) bis gedeckt grau (2fe) SM: gedeckt braun (2li) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium W : gut, gekörnt LM: nicht vorhanden SM: honiggold (2ic) Anmerkung 1) Farbangabe: "Color Harmony Manual, Container Corporation of America" Anmerkung 2) W : Wachstum LM: Bildung des Luftmycels und seine Farbe SM: Farbe des Substratmycels Anmerkung 3) Mit keinem der Kulturmedien wurde die Bildung von löslichen Pigmenten und Melanoid-ähnlichen Pigmenten beobachtet.
- Der Wachstumstemperaturbereich wurde nach Züchtung über 2 Tage bestimmt. Nach Züchtung über einen Monat bei 28ºC wurde die Wirkung auf entfettete Milch und Cellulose beobachtet. Die anderen Beobachtungen wurden nach Züchtung über 2 Wochen bei 28ºC gemacht.
- Wachstumstemperaturbereich : 20 - 34ºC
- Temperaturbereich für das Wachstumsoptimum: 26 - 30ºC
- Verflüssigung von Gelatine : Negativ
- Abbau von Cellulose : Leicht positiv
- Koagulation und Peptonisierung von entfetteter Milch: Beide positiv
- Hydrolyse von Stärke : Positiv
- Bildung von Melanin-ähnlichem Pigment : Negativ
- Assimilation von Kohlenstoffquellen :
- D-Glucose +
- L-Arabinose +
- D-Xylose +
- Inosit +
- D-Mannit +
- D-Fructose +
- L-Rhamnose +
- Saccharose +
- Raffinose +
- (+: wird als einzige Kohlenstoffquelle assimiliert)
- Die Zellwand des DO-88-Stamms enthält LL-Diaminopimelinsäure. Gemäß der Klassifizierung nach Lechevalier et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 20 (1970), 435-443) gehört dieser Stamm daher zu der Gruppe mit einer Zellwand des TypI. Morphologische Charakteristika, wie die Bildung von einfach verzweigtem Luftmycel und die Bildung von langen Sporenketten an dessen Enden, zeigt an, daß dieser Stamm zu der Gattung Streptomyces innerhalb der Actinomycetales gehört.
- In den anerkannten Listen der bakteriellen Namen des "International Code of Nomenclature of Bacteria" (International Journal of Systematic Bacteriology 30 (1980), 225-420; ibid. 35 (1985), 382-407) wurde nach einem Stamm mit mikrobiologischen Eigenschaften ähnlich denen des DO-88 Stamms gesucht. Dabei wurde das Suchverfahren nach Nonomura (Journal of Fermentation Technology 52 (1974), 79-92) und die Beschreibung des "International Streptomyces Project" (International Journal of Systematic Bacteriology 18 (1968), 69-189; ibid. 18 (1968), 279-392: ibid. 19 (1962), 391-512; ibid. 22 (1972), 265-394) verwendet.
- Suchschlüssel wie folgt:
- Farbe des Luftmycels : Grau
- Sporophor : Spiralig
- Oberfläche der Spore : Glatt ("smooth")
- Bildung von Melanin-ähnlichem Pigment und löslichen Pigment : nicht vorhanden
- Verwendungsmuster von Kohlenstoffquellen
- Als Ergebnis der Suche wurden Streptomyces parvullus, Streptomyces lydicus, Streptomyces thermovulgaris, Streptomyces misionensis, Streptomyces libani, etc. ausgewählt.
- Ein detaillierterer Vergleich ergab, daß Streptomyces lydicus und Streptomyces libani sich bezüglich der Farbe der Rückseiten der Kolonien, die orange und gelb enthalten, von dem Stamm DO-88 unterscheiden. Außerdem bildet Streptomyces libani geringe Mengen gelblicher, löslicher Pigmente. Ferner hat Streptomyces misionensis, im Gegensatz zu dem Stamm DO- 88, Luftmycelien rötlicher Farbe und Streptomyces thermovulgaris wächst in einem Temperaturbereich von 40-50ºC. Andererseits zeigen die mikrobiologischen Charakteristika von Streptomyces parvullus vergleichbare Ähnlichkeiten mit denen des Stamms DO-88.
- Daher wurde der als Streptomyces parvullus identifizierte Stamm DO-88 Streptomyces parvullus DO-88 genannt und am 24. März 1986 im "Fermentation Research Institute , Agency of Industrial Science and Technology" unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1002 hinterlegt.
- Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms DO-89 sind nachstehend zusammengefaßt.
- Luftmycel : Es ist verzweigt, aber nicht fragmentiert.
- Substratmycel : Es ist nicht fragmentiert.
- Spore : Spiralige Sporenketten werden an den Enden des einfach verzweigten Luftmycels gebildet.
- Oberfläche der Spore : Glatt ("smooth")
- Form und Größe der Spore : Oval, 0.5-0.7 um x 0.8-1.2 um
- Beweglichkeit der Spore : Negativ
- Luftmycel : Grau
- Substratmycel : Grau, beige oder braun
- lösliches Pigment: nicht vorhanden
- Sterische Konfiguration der Diaminopimelinsäure:
- LL-Typ
- Assimilation von Kohlenstoffquellen Kohlenstoffquelle Wachstum D-Glucose L-Arabinose D-Xylose Inosit D-Mannit D-Fructose L-Rhamnose Saccharose Raffinose + : mäßiges Wachstum ++: gutes Wachstum
- Verflüssigung von Gelatine : Negativ
- Hydrolyse von Stärke : Positiv
- Koagulation und Peptonisierung von entfetteter Milch : Beides positiv
- Bildung von Melanin-ähnlichem Pigment : nicht vorhanden
- Abbau von Cellulose : Negativ
- Wachstumstemperaturbereich (Optimum) : 21-37ºC (30-32ºC)
- Der Wachstumstemperaturbereich wurde nach Züchtung über 2 Tage bestimmt. Nach Züchtung über 1 Monat bei 28ºC wurde die Wirkung auf entfettete Milch und Cellulose beobachtet. Die anderen Beobachtungen wurden nach Züchtung über 2 Wochen bei 28ºC gemacht.
- Züchtung : 28ºC, 21 Tage
- Farbangabe : "Color Harmony Manual, Container Corporation of America" Medium Charakteristika bei der Züchtung Saccharose-Nitrat-Agar-Medium W : gut, glatt ("smooth") LM: stark entwickelt, beige-braun (3ig) SM: gedeckt dunkelgrau (2ih) Glucose-Asparagin-Agar-Medium W : schlecht, glatt ("smooth") LM: schwach entwickelt, natur (3dc) SM: silbergrau (3fe) Glycerin-Asparagin-Agar-Medium W : gut, gekörnt LM: stark entwickelt, weiß (a) bis gedeckt grau (2fe) SM: oliv-grau (2ml) Stärke-Agar-Medium W : mäßig, glatt ("smooth") LM: schwach entwickelt, weiß (a) bis gedeckt grau (2fe) SM: oliv-grau (2ml) Tyrosin-Agar-Medium W : mäßig, gekörnt LM: hell, gedeckt dunkelgrau (2ih) SM: beige-braun (3ig) Nähr-Agar-Medium W : mäßig, gekörnt LM: hell, gedeckt grau (2fe) SM: zitronen-grau (1fe) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium W : mäßig, gekörnt LM: stark entwickelt, gedeckt grau (2fe) SM: goldbraun (3pi) Hafermehl-Agar-Medium W : gut, verstärkt LM: stark entwickelt, silbergrau (3fe) SM: elfenbein (1po) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium W : mäßig, glatt ("smooth") LM: nicht vorhanden SM: hell-weizenfarben (2ea) W : Wachstum LM: Bildung des Luftmycels und seine Farbe SM: Farbe des Substratmycels
- Mit keinem der Kulturmedien wurde die Bildung von löslichen Pigmenten beobachtet.
- Als ein Ergebnis der Analyse von Diaminopimelinsäure, einer der in der Zellwand vorkommenden Aminosäuren, wurde LL-2-6- Diaminopimelinsäure jedoch nicht meso-Diaminopimelinsäure nachgewiesen.
- Der Stamm bildet einfach verzweigte Luftmycelien und an den Enden der Mycelien werden lange Sporenketten gebildet. Ferner enthält die Zellwand LL-Diaminopimelinsäure. Deshalb wird dieser Stamm als zu der Gattung Streptomyces innerhalb der Actinomycetales gehörig klassifiziert.
- Ein Stamm mit mikrobiologischen Eigenschaften ähnlich denen des DO-89 Stamms wurde unter den anerkannten mikrobiologischen Arten gesucht.
- Suchschlüssel wie folgt:
- Sporophor : Spiralig
- Oberfläche der Spore : Glatt ("smooth")
- Bildung von Melaninähnlichem Pigment : Nicht vorhanden
- Verwendungsmuster von Kohlenstoffquellen
- Farbe auf den Kulturmedien
- Als Ergebnis der Suche wurden S. parvullus, S. lydicus, S. thermovulgaris, S. misionensis, S. libani, etc. ausgewählt.
- Ein detaillierterer Vergleich ergab Unterschiede zwischen den meisten dieser Stämme und dem DO-89 Stamm. S. parvullus hat grünliche Substratmycelien und der optimale Wachstumstemperaturbereich von S. thermovulgaris liegt bei 40-50ºC. S. misionensis hat rötliche Luftmycelien und S. libani bildet geringe Mengen von löslichen Pigmenten.
- Andererseits zeigt Streptomyces lydicus die größte Ähnlichkeit zu dem Stamm DO-89. Daher wurde der als Streptomyces lydicus identifizierte Stamm DO-89 Streptomyces lydicus DO-89 genannt und am 13. Februar 1986 im "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology" unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-988 hinterlegt.
- Ebenso wie bekannte Stämme der Gattung Streptomyces können die vorstehend erwähnten Mikroorganismen mit künstlichen Mitteln mutiert werden, wie ultraviolette Bestrahlung, Röntgenbestrahlung und die Behandlung mit verschiedenen Mutagenen. Sogar so hergestellte Mutanten können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sie die Fähigkeit haben DC-88A und/oder DC-89A1 herzustellen.
- Als Kulturmedium für die vorliegende Erfindung kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium verwendet werden, solange es geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Stoffe enthält.
- Als Kohlenstoffquelle werden Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Mannose, Fructose, Saccharose, Melasse, Alkohole, wie Methanol und Ethanol, organische Säuren wie Essigsäure, Ameisensäure, Citronensäure und Äpfelsäure, etc. verwendet.
- Als Stickstoffquelle werden Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Casaminosäure, etc. verwendet.
- Als anorganische Stoffe werden Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Eisen(II)sulfat, Zinksulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Nickelsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, etc. verwendet.
- Zusätzlich können die Produktion von DC-88A oder DC-89A1 beschleunigende Stoffe, wie Biotin, Vitamine, etc., dem Medium zugesetzt werden.
- Die Züchtung erfolgt gewöhnlich als Flüssigkultur und besonders bevorzugt als Submersrührkultur. Die Züchtungstemperatur beträgt 25-33ºC, vorzugsweise 28-30ºC. Es ist wünschenswert, den pH-Wert des Mediums während der Züchtung durch Zugabe von wässrigem Ammoniak oder wässrigem Ammoniumcarbonat bei 4-10, vorzugsweise bei 6-8, zu halten.
- Gewöhnlich werden DC-88A und/oder DC-89A1 als Flüssigkultur für 1 bis 7 Tage in der Kulturbrühe produziert und akkumuliert. Vorzugsweise wird die Züchtung nicht fortgesetzt, wenn die Menge der Erzeugnisse in der Kulturbrühe das Maximum erreicht.
- Nach Entfernen der Bakterienzellen durch Filtration wurden DC- 88A und/oder DC-89A1 aus dem Kulturfiltrat isoliert und gereinigt. Falls notwendig, werden die Bakterienzellen mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Aceton, etc., extrahiert, wobei der Extrakt ebenfalls verwendet werden kann.
- Zum Isolieren und Reinigen von DC-88A und/oder DC-89A1 aus dem Kulturfiltrat können gebräuchliche Verfahren zur Isolierung von bakteriellen Stoffwechselprodukten aus der Kulturbrühe verwendet werden.
- Das Kulturfiltrat wird beispielsweise über eine mit einem nicht-ionischen, porösen Harz, wie HP 20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), gepackte Säule gegeben, wobei die aktive Komponente adsorbiert wird. Die adsorbierte aktive Komponente wird dann mit Methanol, Ethylacetat oder Aceton eluiert.
- Das Eluat wird konzentriert und unter Verwendung von Kieselgel (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etc. gereinigt. Das Produkt wird unter Verwendung von Kieselgel (LiChroprep Si60, Merck), etc. und dann unter Verwendung von Phasenumkehr-Kieselgel (Wakogel L.C-ODS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etc. weiter gereinigt. Man erhält DC- 88A und/oder DC-89A1. Das so erhaltene DC-88A kann durch Verfahren wie Umkristallisation, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, etc. weiter gereinigt werden.
- Vor der Kieselgel-Säulenchromatographie können Wasser mit einem PH-Wert von 5-6 und Ethylacetat zu dem Konzentrat gegeben werden. Anschließend wird geschüttelt, wobei die aktive Komponente in die Ethylacetatphase übergeht.
- Die Ethylacetatphase wird zur Trockne konzentriert. Man erhält rohes DC-88A und/oder DC-89A1 in Pulverform. Als Antibiotika und Anti-Tumor-Agentien können DC-88A und/oder DC- 89A1 allein und diese Verbindungen in wirksamen Mengen sowie Trägerstoffe enthaltende Zusammensetzungen verwendet werden. Der Trägerstoff enthält üblicherweise verwendete Verdünnungsmittel, Excipienten, Desintegratoren, Bindemittel, Gleitmittel, Basen, etc.
- Wird die Verbindung beispielsweise in Form einer Injektion verabreicht, so löst man die Verbindung in auf dem pharmazeutischen Gebiet üblicherweise verwendeten Verdünnungsmitteln, wie Ethanol, gegebenenfalls mit einem grenzflächenaktiven und einem solubilisierenden Agens. Nachdem das Ethanol, falls erforderlich, abgesaugt worden ist, wird die Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion, physiologischer Kochsalzlösung oder Glucose, Fructose, Mannit, etc. enthaltendem destilliertem Wasser zur Injektion gemischt.
- Alternativ kann die ethanolische Lösung auch gefriergetrocknet werden oder die Verbindung mit Natriumchlorid gemischt werden. Man erhält so ein Präparat zur Injektion in Pulverform, das vor jeder Verabreichung gelöst wird. Diese Injektionen werden beispielsweise intravenös verabreicht. Intramuskuläre, intraarterielle, intraperitoneale, intrathoracale Verabreichung, etc. sind ebenfalls möglich. Präparate für die orale Verabreichung werden durch Mischen von DC-88A und/oder DC-89A1 mit einem geeigneten Excipienten, Desintegrator, Bindemittel, Gleitmittel, etc. hergestellt, wobei das Gemisch in herkömmlicher Weise in Tabletten-, Granulat- oder Pulverform gebracht wird.
- Obwohl die Dosierungsmenge der Verbindung je nach Verabreichungsverfahren, Alter und Zustand der Patienten etc. variiert, ist bei Säugern, einschließlich Menschen, eine Verabreichung der Verbindung von 0.5 bis 75 mg/60 kg pro Tag geeignet.
- Figur 1 und Figur 3 zeigen die Ultraviolettabsorptionsspektren (in CH&sub3;OH-Lösung) von DC-88A bzw. DC-89A1, wobei 1 oder die durchgezogene Linie die Daten unter neutralen Bedingungen, 2 oder die durchbrochene Linie die Daten unter sauren Bedingungen (0.01 N HCl) und 3 oder die gepunktete und gestrichelte Linie die Daten unter alkalischen Bedingungen (0.01 N NaOH) darstellt.
- Figur 2 und Figur 4 zeigen die Infrarotabsorptionsspektren (in CHCl&sub3;-Lösung) von DC-88A bzw. DC-89A1.
- Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nachstehend gegeben. In den Beispielen wurden DC-88A und DC-89A1 in einem biologischen Test unter Verwendung von Bacillus subtilis Nr. 10707 oder nach Dünnschichtchromatographie unter der Ultraviolett-Lampe nachgewiesen.
- Streptomyces parvullus FERM BP-1002 wurde als Impf-Stamm verwendet. Der Stamm wurde in einem 2 l-Erlenmeyerkolben in 300 ml eines 20 g/l Dextrin, 10 g/l Pepton, 1 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Maisquellwasser, 10 g/l Glucose und 5 g/l Calciumcarbonat enthaltenden Impf-Mediums (pH 7.2, vor der Sterilisation) angeimpft und 48 Stunden bei 30ºC geschüttelt (200 Upm). Die erhaltene Impf-Kultur wurde in einem 30 l-Kolbenfermenter in 15 l Fermentationsmedium der nachstehenden Zusammensetzung angeimpft und bei 30ºC unter Belüftung und Rühren (Rotation: 250 Upm, Belüftung: 15 l/min) gezüchtet.
- Zusammensetzung des Fermentationsmediums:
- 20 g/l lösliche Stärke, 5 g/l Trockenhefe, 0.5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0.5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 5 g/l Calciumcarbonat (pH 7.0, mit NaOH vor der Sterilisation eingestellt)
- Die Züchtung erfolgte über 72 Stunden, während derer der pH- Wert des Mediums mit wäßrigem Ammoniak auf 6.5-7.5 eingestellt wurde.
- Die Bakterienzellen wurden durch Filtration aus der Kulturbrühe abgetrennt, wobei sich 13 l Filtrat ergaben. Die 13 l Filtrat wurden dann über eine mit 2 l nicht-ionischem, porösem Harz HP-20 (Warenzeichen, hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) gefüllte Säule gegeben. Die aktive Komponente wird adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Säule zur Entfernung von Verunreinigungen mit 50% Methanol gewaschen. Nach nochmaligem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit Ethylacetat eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden konzentriert und unter Verwendung von Kieselgel (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Toluol-Aceton entwickelt. Man erhält eine aktive Komponente. Die aktive Komponente wurde dann unter Verwendung von Kieselgel (LiChroprep Si60, Merck) in Toluol-Aceton entwickelt. Man erhält rohes DC-88A. Mit dem Rohprodukt wurde einer Dichtegradienten-Elution mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (Wakogel-L.C-ODS 30k, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) mit 50% bis 100% Methanol durchgeführt. Man erhält 3 mg von DC-88A. Das so erhaltene DC-88A zeigte die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften.
- Die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, außer daß Streptomyces lydicus FERM BP-988 als Impf-Stamm verwendet wurde. Es wurden 1.8 mg DC-88A erhalten.
- Streptomyces lydicus FERM BP-988 wurde als Impf-Stamm verwendet. Der Stamm wurde in einem 2 l-Erlenmeyerkolben in 300 ml eines 5 g/l Bacto-Trypton (hergestellt von Difco Co., Ltd.), 5 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Fleischextrakt, 10 g/l lösliche Stärke, 10g/l Glucose und 5 g/l Calciumcarbonat enthaltenden Impf-Mediums (pH 7.2, vor der Sterilisation) angeimpft und 48 Stunden bei 30ºC geschüttelt (200 Upm). 5 Volumenprozent der erhaltenen Impf-Kultur wurden in einem 30 l-Kolbenfermenter in 15 l eines die vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufweisenden Mediums angeimpft und 24 Stunden bei 28ºC unter Rühren gezüchtet (Rotation: 200 Upm, Belüftung: 15 l/min).
- 10 Volumenprozent der erhaltenen Kultur wurden in einem 200 l Tankfermenter in 150 l Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung angegeimpft und unter Belüftung und Rühren (Rotation: 200 Upm, Belüftung: 15 l/min) bei 28ºC gezüchtet.
- Zusammensetzung des Fermentationsmediums:
- 50 g/l Dextrin, 10 g/l Trockenhefe, 10 g/l NaNH&sub4;HPO&sub4; H&sub2;O, 0.5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0.5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub4;O, 10 g/l Kaliumchlorid, 5 g/l Calciumcarbonat (pH 7.2, vor der Sterilisation mit NaOH eingestellt).
- Die Züchtung erfolgte über 70 Stunden, ohne den pH-Wert des Mediums zu kontrollieren. Die Bakterienzellen und andere gebildete Feststoffe wurden durch Filtration von der Kulturbrühe getrennt. Man erhielt 100 l eines Filtrats.
- 30 l Aceton wurden zu den Bakterienzellen und den anderen Feststoffen gegeben und die Suspension über Nacht stehengelassen. Dann wurde der Acetonextrakt filtriert und das Filtrat (25 l) wurde mit 75 l Wasser verdünnt. Das verdünnte Filtrat und das Kulturfiltrat wurden vereinigt (Gesamtvolumen: 200 l), mit Salzsäure auf pH 5.0 gebracht und dann über eine mit 10 l Diaion HP-20 gefüllte Säule gegeben. Die aktive Komponente wurde adsorbiert. Nachdem die Säule mit Wasser und anschließend mit einer 40 %igen Methanollösung gewaschen worden war, erfolgte die Elution mit Methanol. Die eluierten Fraktionen wurden konzentriert und auf pH 6.0 gebracht. Anschließend wurde mit Ethylacetat extrahiert.
- Der Extrakt wurde konzentriert und der Rückstand wurde mit Kieselgel (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gemischt. Es wurde ein Pulver erhalten. Die pulvrige Probe wurde auf eine mit 1000 ml zuvor in n-Hexan suspendiertem Kieselgel (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gefüllte Säule gegeben. Dann wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan, Ethylacetat und Essigsäure (600:300:4 V/V/V) zum Entfernen von Verunreinigungen über die Säule gegeben. Die Elution erfolgte mit dem vorstehend genannten Lösungsmittelsystem, wobei die Menge an Ethylacetat schrittweise erhöht wurde. Schließlich wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan, Ethylacetat und Essigsäure (225:675:4 V/V/V) über die Säule gegeben. Es wurden aktive Fraktionen erhalten. Die Fraktionen wurden konzentriert und mit Kieselgel (LiChroprep Si60, Merck) gemischt. Es wurde ein Pulver erhalten. Die pulvrige Probe wurde auf eine mit 50 ml zuvor in n-Hexan suspendiertem Kieselgel (LiChroprep Si60, Merck) gefüllte Säule gegeben und ein Lösungsmittelgemisch aus n- Hexan, Ethylacetat und Essigsäure (400:100:2.5 V/V/V) wurde zum Entfernen von Verunreinigungen unter einem Druck von 5 kg/cm² über die Säule gegeben.
- Dann erfolgte eine Elution unter einem Druck von 5 kg/cm² mit dem vorstehend genannten Lösungsmittelsystem, wobei die Menge an Ethylacetat schrittweise erhöht wurde. Schließlich wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan , Ethylacetat und Essigsäure (250:250:2.5 V/V/V) unter einem Druck von 5 kg/cm² über die Säule gegeben. Es wurden aktive Fraktionen eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden bis zur Trockne konzentriert und der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Acetonitril gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit chemisch modifiziertem zuvor in Acetonitril suspendierten Kieselgel (Wakogel LC NH&sub2;- 10H, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gefüllte Säule gegeben. Dann erfolgte eine Dichtegradienten-Elution von 100% Acetonitril zu 90%iger wäßriger Acetonitril-Lösung. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert. Es wurden 10 mg reines DC-89A1 erhalten. Das so erhaltene DC-89A1 zeigte die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften antibakterielle Wirkung und Anti-Tumor-Wirkung.
- Die in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsverfahren wurden wiederholt, außer daß Streptomyces parvullus FERM BP-1002 verwendet wurde und 5 g/l NH&sub4;Cl zu dem Fermentationsmedium gegeben wurden. Dünnschichtchromatographie zeigte, daß hauptsächlich DC-89A1 in der Kulturbrühe erzeugt wurde, während nur geringe Mengen DC-88A akkumulierten.
- Die Reinigung und Isolierung von DC-89A1 aus der Kulturbrühe erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurden 8 mg DC-89A1 erhalten.
- 10 mg des in Beispiel 3 erhaltenen DC-89A1 wurden in 50 ml Ethanol gelöst. Die Lösung wurde gerührt und das Ethanol abgesaugt. Um eine Lösung zur Injektion zu erhalten, wurde der Rückstand in etwa 10 ml sterilisierter, physiologischer Kochsalzlösung gelöst.
Claims (4)
1. DC-88A mit den nachstehenden, physikalisch-chemischen
Eigenschaften:
(a) Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub8;
(b) Massenspektrum:
SIMS m/z 510 (M+3)&spplus;, 234 (Basispeak) (gemessen
mit Glycerin als Matrix); m/z 508 (M+1)&spplus;, 234
(Basispeak) (gemessen mit Sulfolan als Matrix)
Hochauflösendes EI-MS:
gefunden: 507, 1624
berechnet für C&sub2;&sub6; H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub8;: 507,1639
(c) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
in Fig. 1 abgebildet (gemessen in MeOH)
(d) Infrarotabsorptionsspektrum:
in Fig. 2 abgebildet (gemessen in CHCl&sub3;)
(e) Löslichkeit:
Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton,
Chloroform, Ethylacetat und DMSO; und mäßig löslich in
Wasser und Hexan
(f) ¹H-NMR-Spektrum
(400 MHz, gemessen in CDCl&sub3;, interner Standard TMS):
δ(ppm) 9,38 (1H, br, s), 7,17 (1H, s), 6,94 (1H,
d, J=2,4 Hz), 6,78 (1H, s), 6,21 (1H, br,
s), 4,43 (2H, AB in ABX, JAB=10,0 Hz), 4,07
(3H, s), 3,94 (3H, s), 3,89 (3H, s), 3,75
(3H, s), 3,06 (1H, m), 2,24 (1H, dd, J=7,6,
3,9 Hz), 1,67 (3H, br, s), ca.1,3 (1H)
(g) ¹³C-NMR-Spektrum
(100 MHz, gemessen in CDCl&sub3;, interner Standard TMS):
δ(ppm) 194,8, 179,8, 167,9, 165,2, 164,4, 161,2,
150,6, 141,3, 138,9, 128,2, 126,6, 123,3,
113,2, 112,0, 108,2, 97,7, 71,3, 61,5, 61,2,
56,3, 55,3, 53,4, 30,7, 22,3, 22,1, 21,1.
(h) Rf-Wert: 0,46 (Toluol : Aceton = 7:3 V/V,
Kieselgel).
2. DC-89A1 mit nachstehenden, physikalisch-chemischen
Eigenschaften:
(a) Elementaranalyse: C: 56,5, H: 4,7, N: 7,1
(b) Summenformel: C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub6;N&sub3;O&sub8;Cl&sub1;
(c) Molekulargewicht: 543
(gemessen durch Massenspektroskopie)
(d) Schmelzpunkt 157,5 - 158,5ºC
(e) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
in Fig. 3 abgebildet (gemessen in CH&sub3;OH)
(f) Infrarotabsorptionsspektrum:
in Fig. 4 abgebildet (gemessen in CHCl&sub3;)
(g) PMR-Spektrum (in DMSO-d6, interner Standard TMS):
δ (ppm) 11,54 (1H, breit), 9,88 (1H, s), 7,39
(1H, s), 6,91 (1H, breites s), 6,87 (1H, s),
6,58 (1H, breites d), 4,76 (1H, m), 4,35 (1H,
breites dd), 3,96 (1H, breites d), 3,92 (3H, s),
3,777 (3H, s), 3,775 (3H, s), 3,61 (3H, s), 3,53
(1H, breites dd), 3,25 (1H, breites dd), 1,47
(3H, breites s)
(h) CMR-Spektrum (in CDCl&sub3;, interner Standard TMS):
δ (ppm) 196,6, 171,2, 164,5, 151,6, 150,2,
141,6, 140,8, 138,8, 129,3, 128,8, 125,9, 123,0,
118,1, 117,0, 116,9, 108,2, 97,7, 71,1, 61,5,
61,2, 56,2, 53,6, 53,4, 52,5, 33,2, 21,9.
(i) Löslichkeit:
Leicht löslich in Methanol, Ethanol,
Ethylacetat, Aceton, Chloroform und DMSO; und mäßig
löslich in Wasser und n-Hexan
3. Verfahren zur Herstellung von DC-88A nach Anspruch 1
und/oder DC-89A1 nach Anspruch 2, umfassend die Züchtung
eines Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces
gehört und die Fähigkeit zur Herstellung von DC-88A
und/oder DC-89A1 aufweist, in einem Medium, die
Anreicherung
von DC-88A und/oder DC-89A1 in der Kulturbrühe
und die Gewinnung von DC-88A und/oder DC-89A1 davon.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus
Streptomyces lydicus FERM BP-988 oder Streptomyces
parvullus FERM BP-1002 ist.
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