BRPI0617546A2 - conjugado de fÁrmaco-anticorpo, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula de tumor, mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de um tumor em um sujeito mamÍfero e composto - Google Patents

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Kilian Horgan
Bilal Sufi
Haichun Huang
David John King
Chin Pan
Josephine M Cardarelli
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Abstract

CONJUGADO DE FÁRMACO-ANTICORPO, FORMULAÇAO FARMACEUTICA, MÉTODO PARA MATAR UMA CELULA DE TUMOR, MÉTODO PARA RETARDAR OU INTERROMPER O CRESCIMENTO DE UM TUMOR EM UM SUJEITO MAMÍFERO E COMPOSTO A presente divulgação provê conjugados de anticorpo- fármaco que são citotoxinas potentes, sendo que o fármaco é ligado ao anticorpo através de um ligante. A divulgação também é dirigida a composições contendo os conjugados de anticorpo-fármaco, e a métodos de tratamento usando-as.

Description

"CONJUGADO DE FÁRMACO-ANTICORPO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA,MÉTODO PARA MATAR UMA CÉLULA DE TUMOR, MÉTODO PARARETARDAR OU INTERROMPER O CRESCIMENTO DE UM TUMOR EM UMSUJEITO MAMÍFERO E COMPOSTO".
Campo da invenção
A presente invenção provê conjugados de fármaco-anticorpoque são clivados in vivo. Os conjugados de fármaco-anticorpo podem formar pró-fármacos e conjugados decitotoxinas.
Antecedentes da invenção
Muitos agentes terapêuticos, particularmente aqueles quesão especialmente eficientes em quimioterapia de câncer,freqüentemente exibem toxicidade aguda in vivo,especialmente toxicidade para a medula óssea e mucosal,bem como toxicidade cardíaca e neurológica crônica. Talalta toxicidade pode limitar suas aplicações. Odesenvolvimento de mais agentes terapêuticos e agentesterapêuticos mais seguros, particularmente agentes anti-tumor, é desejável para maior eficácia contra célulastumorais e uma diminuição no número e gravidade dosefeitos laterais destes produtos (toxicidade, destruiçãode células não tumorais, etc.). Uma outra dificuldade comalguns agentes terapêuticos existentes é sua estabilidademenor que ótima em plasma. A adição de grupos funcionaispara estabilizar estes compostos resultou em uma reduçãosignificativa da atividade. Conseqüentemente, é desejávelidentificar modos para estabilizar compostos enquantomantendo níveis aceitáveis de atividade terapêutica.
A procura por agentes citotóxicos mais seletivos temestado extremamente ativa por muitas décadas, atoxicidade limitando a dose (isto é, a atividadeindesejada das citotoxinas em tecidos normais) sendo umadas principais causas de falhas em terapia de câncer. Porexemplo, CC-1065 e as duocarmicinas são conhecidas porserem citotoxinas extremamente potentes.
CC-1065 foi primeiro isolado a partir de Streptomyceszelensis em 1981 pela Upjohn Company (Hanka e outros, J.Antibiot. 31:1211 (1978); Martin e outros, J. Antibiot.33: 902 (1980); Martin e outros, J. Antibiot. 34: 1119(1981)) e foi descoberto a ter potente atividadeantitumoral e antimicrobiana tanto in vitro quanto emanimais experimentais (Li e outros, Câncer Res. 42: 999(1982). CC -1065 se liga a B-DNA de fita dupla dentro daranhura menor (Swenson e outros, Câncer Res. 42: 2821(1982)) com a preferência de seqüência de 5'-d(A/GNTTA)-3' e 5'-d (AAAAA)-3' e alquilatos e a posição N3 da 3'-adenina por sua unidade de mão esquerda CPI presente namolécula (Hurley e outros, Science 226: 843 (1984)). Adespeito de sua potente e ampla atividade antitumoral,CC-10 65 não pode ser usado em humanos porque ele provocaa morte retardada em animais experimentais.
Muitos análogos e derivados de CC-1065 e dasduocarmicinas são conhecidos na técnica. A pesquisa naestrutura, síntese e propriedades de muitos dos compostostem sido revista. Veja, por exemplo, Boger e outros,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); e Boger eoutros, Chem. Rev. 97: 787 (1997).
Um grupo em Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd. preparou umnúmero de derivados de CC-1065. Veja, por exemplo, aspatentes U.S. nos 5.101.038; 5.641.780; 5.187.186;5.070.092; 5.703.080; 5.070.092; 5.641.780; 5.101.038; e5.084.468; e o pedido de patente PCT publicado WO96/10405 e pedido de patente européia 0 537 575 Al.A Upjohn Company (Pharmacia Upjohn) também esteve ativapreparando derivados de CC-1065. Veja, por exemplo, aspatentes U.S. nos 5.739.350; 4.978.757, 5.332.837 e4.912.227.
A pesquisa também se focou no desenvolvimento de novosagentes terapêuticos que estão na forma de pró-fármacos,compostos que são capazes de serem convertidos parafármacos (compostos terapêuticos ativos) in vivo porcertas modificações químicas ou enzimáticas de suaestrutura. Com propósitos de reduzir toxicidade, estaconversão é preferivelmente confinada ao sítio de ação outecido alvo ao invés do sistema circulatório ou tecidonão-alvo. Entretanto, mesmo pró-fármacos sãoproblemáticos uma vez que muitos são caracterizados poruma baixa estabilidade no sangue e soro, devido àpresença de enzimas que degradam ou ativam os pró-fármacos antes que os pró-fármacos alcancem os sítiosdesejados dentro do corpo do paciente.
A Bristol-Myers Squibb descreveu particulares conjugadosde fármaco antitumor clivável por enzima lisossomal.Veja, por exemplo, a patente U.S. n° 6.214.345. Estapatente provê um aminobenzil oxicarbonila.A Seattle Genetics publicou o pedido de patente U.S.2003/0096743 e o pedido de patente U.S. 2003/0130189, quedescrevem p-aminobenziléteres em agentes de liberação defármaco. Os ligantes descritos nestes pedidos de patentesão limitados a composições de aminobenzil éter.
Outros grupos também descreveram ligantes. Veja porexemplo de Groot e outros, J. Med. Chem. 42, 5277 (1999);de Groot e outros, J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); deGroot e outros, J. Med. Chem. 66, 8815, (2001) ; WO02/083180; Carl e outros, J. Med. Chem. Lett. 24, 479,(1981); Dubowchik e outros, Bioorg & Med. Chem. Lett. 8,3347 (1998). Estes ligantes incluem espaçador deaminobenzil éter, sistemas espaçadores eletrônicosalongados em cascata e de ciclização, espaçadores deeliminação de ciclização, tais com w-aminocarbonilas, eum ligante ρ aminobenzi oxicarbonila.
A estabilidade de fármacos de citotoxinas, incluindoestabilidade in vivo, ainda é um item importante quenecessita ser resolvido. Em adição, a toxicidade demuitos compostos os torna menos úteis, então composiçõesque reduzirão a toxicidade do fármaco, tal como aformação de um pró-fármaco clivável, são necessárias.
Portanto, a despeito dos avanços na técnica, continua aexistir uma necessidade do desenvolvimento de agentesterapêuticos melhorados para o tratamento de mamíferos, ehumanos em particular, mais especificamente citotoxinasque exibam alta especificidade de ação, toxicidadereduzida, e estabilidade melhorada no sangue em relação acompostos conhecidos de estrutura similar. A presenteinvenção encaminha estas necessidades.
Sumário da invenção
A presente invenção relaciona-se com conjugados defármaco-anticorpo onde o fármaco e anticorpo são ligadosatravés de um ligante, tal como um ligante de peptidila,hidrazina, ou dissulfeto. Estes conjugados sãocitotoxinas potentes que podem ser seletivamenteliberadas para um sítio de ação de interesse em uma formaativa e então clivadas para liberar o fármaco ativo. Osbraços de ligante da invenção podem ser clivados a partirdos fármacos citotóxicos por, por exemplo, meiosenzimáticos ou redutivos in vivo, liberando uma parcelaativa de fármaco a partir do derivado de pró-fármaco.Uma configuração é um conjugado de fármaco-anticorpo queinclui um anticorpo tendo especificidade para pelo menosum tipo de tumor; um fármaco; e um ligante acoplando ofármaco ao anticorpo. 0 ligante é clivável na presença dotumor. O conjugado fármaco-anticorpo retarda ouinterrompe o crescimento do tumor quando administrado emuma quantidade correspondente a uma dosagem diária de 1μπιοΐ/kg ou menor. Preferivelmente, o conjugado fármaco-anticorpo retarda o crescimento do tumor quandoadministrado em uma quantidade correspondente a umadosagem diária de 1 μτηοΐ/kg ou menor (referente a mols dofármaco) durante um período de pelo menos cinco dias. Empelo menos algumas configurações, o tumor é um tumor tipohumano em um camundongo SCID. Como um exemplo, ocamundongo SCID pode ser um camundongo CBl7.SCID(disponível de Taconic, Germantown, NY) .
A invenção também se relaciona com grupos úteis paraestabilizar agentes terapêuticos e marcadores. Os gruposestabilizantes são selecionados, por exemplo, paralimitar a liberação e metabolismo do agente terapêuticoou marcador por enzimas que podem estar presentes nosangue ou tecido não alvo. Os grupos estabilizantes podemservir para bloquear a degradação do agente ou marcador etambém pode atuar no provimento de outras característicasfísicas do agente ou marcador, por exemplo para aumentara solubilidade do composto ou para diminuir aspropriedades de agregação do composto. O grupoestabilizante também pode melhorar a estabilidade doagente ou marcador durante a armazenagem em uma formaformulada ou não formulada.
Em um outro aspecto, a invenção provê um compostoligante-fármaco citotóxico tendo uma estrutura de acordocom qualquer das Fórmulas 1-3:
<formula>formula see original document page 6</formula>
onde o símbolo D é uma parcela de fármaco tendo pendenteà cadeia principal do mesmo um grupo funcionalquimicamente reativo, o citado grupo funcionalselecionado do grupo consistindo de uma amina primária ousecundária, hidroxila, sulfidrila, carboxila, aldeído, euma cetona.
O símbolo L1 representa um espaçador de auto-sacrifícioonde m é um número inteiro deO, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
O símbolo X4 representa um membro selecionado do grupoconsistindo de grupos funcionais reativos protegidos,grupos funcionais reativos não protegidos, rótulosdetectáveis, e agentes direcionadores.
O símbolo L4 representa um membro ligante, e ρ é 0 ou 1.L4 é uma parcela que impõe propriedades de solubilidadeaumentada ou agregação reduzidas aos conjugados. Exemplosde parcelas L4 incluem alquila substituído, alquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroalquila substituído, ou heteroalquila nãosubstituído, qualquer um dos quais pode ser reto,ramificado, ou cíclico, um polímero de aminoácidocarregado positivamente ou negativamente, tal comopolilisina ou poliargenina, ou outros polímeros tais comopolietileno glicol.
Os símbolos F, H, e J representam ligantes, comodescritos adicionalmente aqui.
Em uma configuração, a invenção refere-se a conjugado deligante de peptídeo da estrutura:
<formula>formula see original document page 7</formula>
onde,
D é uma parcela de fármaco tendo pendente à cadeiaprincipal do mesmo um grupo funcional quimicamentereativo, o citado grupo funcional selecionado do grupoconsistindo de uma amina primária ou secundária,hidroxila, tiol, carboxila, aldeído, e uma cetona;
L1 é um ligante de auto-sacrifício;
m é um número inteiro 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6;
F é um ligante compreendendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 7</formula>
ou
onde,
AA1 são um ou mais membros selecionados independentementedo grupo consistindo de aminoácidos naturais e a-aminoácidos não naturais;
c é um número inteiro de 1 a 20;
L2 é um ligante de auto-sacrifício;
L3 é um grupo espaçador compreendendo uma amina primáriaou secundária ou um grupo com funcionalidade decarboxila; onde se L3 está presente, m é O e ou a aminade L3 forma uma ligação de amida com um grupo pendentecom funcionalidade de carboxila de D ou a carboxila de L3forma uma ligação de amida com um grupo pendente comfuncionalidade de amina de D;o é O ou 1;
L4 é um membro ligante, onde L4 não compreende um grupoacil carboxílico diretamente ligado ao término N de(AA1)c;
ρ é 0 ou 1; e
X4 é um membro selecionado do grupo consistindo de gruposfuncionais reativos protegidos, grupos funcionaisreativos não protegidos, rótulos detectáveis, e agentesdirecionadores.
Em uma configuração, o conjugado ligante-peptídeocompreende a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 8</formula>
Em uma outra configuração, o conjugado ligante-peptídeocompreende a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 8</formula>
Em uma configuração preferida, L3 compreende um grupoaromático. Por exemplo, L3 pode compreender um grupoácido benzóico, um grupo anilina, ou um grupo indolina.Exemplos não limitantes de -L3-NH- incluem as estruturasselecionadas do seguinte grupo:<formula>formula see original document page 9</formula>
onde Z é um membro selecionado de O, Se NRonde R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, e acila.
Em configurações preferidas do ligante peptídeo, (AA1)c éuma seqüência de peptídeo clivável por uma proteaseexpressa em tecido tumoral. Uma protease preferida é umaprotease lisossomal. Em configurações preferidas, c é umnúmero inteiro de 2 a 6, ou c é 2, 3, ou 4. Em certasconfigurações, o aminoácido em (AA1)c localizado o maispróximo da parcela de fármaco é selecionado do grupoconsistindo de: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly,lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, e Vai.
Em configurações preferidas, (AA1)c é uma seqüência depeptídeo selecionado do grupo consistindo de Val-Cit,Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit,Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (IDSEQ n° 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (ID SEQ n° 2) e Gly-Phe-Leu-Gly (ID SEQ n° 3). Em configurações particularmentepreferidas, (AA1)c é Val-Cit ou Val-Lys.
Em algumas configurações preferidas, o ligante depepetídeo, F, compreende a estrutura:<formula>formula see original document page 10</formula>
onde
R24 é selecionado do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, heteroalquilasubstituído, e heteroalquila não substituído;
Cada K é um membro independentemente selecionado do grupoconsistindo de alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalquila nãosubstituído, halogênio, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22,OCOR21, e OR21
onde
R21 e R22 são independentemente selecionados do grupoconsistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalquila nãosubstituído; e
a é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, ou 4.
Em outras configurações preferidas, -F-(L1)m compreende aestrutura:
<formula>formula see original document page 10</formula>onde
cada R24 é um membro independentemente selecionado dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a conjugados deligante-hidrazina da estrutura:
<formula>formula see original document page 11</formula>
onde
D é uma parcela de fármaco tendo pendente à cadeiaprincipal do mesmo um grupo funcional quimicamentereativo, o citado grupo de função selecionado do grupoconsistindo de uma amina primária ou secundária,hidroxila, tiol, carboxila, aldeído, e uma cetona;
L1 é um ligante de auto-sacrifício;
m é um número inteiro selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6;
X4 é um membro selecionado do grupo consistindo de gruposfuncionais reativos protegidos, grupos funcionaisreativos não protegidos, rótulos detectáveis, e agentesdirecionadores.
L4 é um membro ligante;
ρ é 0 ou 1;
H é um ligante compreendendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 11</formula>
onde
nx é um número inteiro de 1-10;
n2 é 0, 1, ou 2 ;
cada R24 é um membro independentemente selecionado dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído; eI é ou uma ligação ou:
<formula>formula see original document page 12</formula>
onde n3 é O ou 1 com a ressalva que guando n3 for O, n2não sej a O; e
n4 é 1, 2 , ou 3,
sendo que quando I for uma ligação, nx for 3 e n2 for 1,
D não pode ser
onde R é Me ou CH2-CH2NMe2.
Em algumas configurações preferidas, a substituição noanel fenila é uma pára-substituição. Em algumasconfigurações preferidas, ηχ é 2, 3 ou 4 ou ni é 3 ou n2 é 1.
Em certas configurações, I é uma ligação. Em outrasconfigurações, n3 é 0 e n4 é 2.
Em vários aspectos, a invenção provê ligantes dehidrazina, H, que podem formar um ligante de auto-sacrifício de 6 membros mediante clivagem, ou doisligantes de auto-sacrifício de 5 membros medianteclivagem, ou um único ligante de auto-sacrifício de 5membros mediante clivagem, ou um único ligante de auto-sacrifício de 7 membros mediante a clivagem, ou umligante de auto-sacrifício de 5 membros e um ligante deauto-sacrifício de 6 membros mediante clivagem.Em uma configuração preferida, H compreende umasubstituição com dimetila geminal.
Em uma configuração preferida, H compreende a estrutura:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Preferivelmente, nx é 2, 3, ou 4, mais pref erivelmente Ti1é 3. Preferivelmente, cada R24 é independentementeselecionado de CH3 e H. Em certas configuraçõespreferidas, cada R24 é H.
Em uma outra configuração preferida, H compreende aestrutura:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Preferivelmente, ni é
<formula>formula see original document page 13</formula>
3. Pref erivelmente, cada R24 éindependentemente selecionado de CH3 e H.
Em ainda outras configurações preferidas, H compreende aestrutura:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Preferivelmente, cada R24 é independentemente um H ou umalquila substituído ou não substituído.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a conjugados dehidrazina-ligante da estrutura:
<formula>formula see original document page 13</formula>
onde
D é uma parcela de fármaco tendo pendente à cadeiaprincipal do mesmo um grupo funcional quimicamentereativo, o citado grupo de função selecionado do grupoconsistindo de uma amina primária ou secundária,hidroxila, tiol, carboxila, aldeído, e uma cetona;
L1 é um ligante de auto-sacrifício;
m é um número inteiro selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6;
X4 é um membro selecionado do grupo consistindo de gruposfuncionais reativos protegidos, grupos funcionaisreativos não protegidos, rótulos detectáveis, e agentesdirecionadores;
L4 é um membro ligante;
ρ é 0 ou 1; e
H compreende a estrutura:
onde q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; e
cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído.
Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se aconjugados de dissulfeto-ligante da estrutura:
X4— [— (L4) ρ - H— (L1) m—] —D
onde
D é uma parcela de fármaco tendo pendente à cadeiaprincipal do mesmo um grupo funcional quimicamentereativo, o citado grupo de função selecionado do grupoconsistindo de uma amina primária ou secundária,hidroxila, tiol, carboxila, aldeído, e uma cetona;
L1 é um ligante de auto-sacrifício;m é um número inteiro selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6;
X4 é um membro selecionado do grupo consistindo de gruposfuncionais reativos protegidos, grupos funcionaisreativos não protegidos, rótulos detectáveis, e agentesdirecionadores;
L4 é um membro ligante;
P é 0 ou 1;
J é um ligante compreendendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 15</formula>
onde
cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído;
cada K é um membro selecionado independentemente do grupoconsistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalquila nãosubstituído, halogênio, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22,OCOR21, e OC21
onde
R21 e R22 são independentemente selecionados do grupoconsistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, e heterocicloalquila nãosubstituído;a é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, ou 4; ed é um número inteiro deO, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
Em várias configurações, J pode compreender uma dasseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 16</formula>
onde d é 1 ou 2;
<formula>formula see original document page 16</formula>
Em todos os conjugados de ligantes anteriores, Dpreferivelmente é um fármaco citotóxico. Em configuraçõespreferidas, D tem um grupo de função quimicamente reativoselecionado do grupo consistindo de uma amina primária ousecundária, hidroxila, sulfidrila e carboxila. Exemplosnão limitantes de fármacos preferidos, D, incluemduocarmicinas e análogos e derivados de duocarmicinas,CC-1065, análogos de duocarmicina baseados em CBI,análogos de duocarmicina baseados em MCBI, análogos deduocarmicina baseados em CCBI, doxorubicina, conjugadosde doxorubicina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatinas, dolastatina-10 ,combretastatina, caliqueamicina, maitansina, análogos demaitansina, DM-1, auristatina E, auristatina EB (AEB) ,auristatina EFP (AEFP) , monometil auristatina E (MMAE) ,5-ácido benzoilvalérico-AE éster (AEVB), tubulisinas["tubulysins"], disorazol, epotilonas, Paclitaxel,docetaxel, SN-38, Topotecan, rizoxina, colquicina,vinblastina, vindesina, estramustina, cemadotina,eleuterobina, metotrexato, metopterina,diclorometotrexato, 5-fluoroacila, 6-mercaptopurina,citosina-arabinosídeo, melfalan, leurosina, leurosideína,actinomicina, daunorubicina, conjugados de daunorubicina,mitomicina C, mitomicina A, carminomicina, aminopterina,talisomicina, podofilotoxina, derivados depodofilotoxina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo,vincristina, taxol, ácido retinóico taxotere, ácidobutírico, N8-acetil espermidina e canfotecina.
Em uma configuração preferida, D é um análogo ou derivadode duocarmicina que compreende a estrutura:
<formula>formula see original document page 17</formula>
onde o sistema de anel A é um membro selecionado degrupos arila substituído ou não substituído, heteroarilasubstituído ou não substituído e heterocicloalquilasubstituído ou não substituído;
EeG são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, um heteroátomo, umaligação simples, ou E e G são unidos para formar umsistema de anel selecionado de arila substituído ou nãosubstituído, heteroarila substituído ou não substituído eheterocicloalquila substituído ou não substituído;X é um membro selecionado de 0, Se NR23;
R23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalqula substituído ou nãosubstituído, e acila;
R3 é um membro selecionado do grupo consistindo de (=0) ,SR11, NHR11 e OR11,
onde
R11 é um membro selecionado do grupo consistindo de H,alquila substituído, alquila não substituído,heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído,difosfatos, trifosfatos, acila, C(O)R12R13, C(O)OR12,C(O)NR12R13, P(O) (OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 E SiR12R13R14,no qual
R12, R13, e R14 são membros selecionados independentementede H, alquila substituído ou não substituído,heteroalquila substituído ou não substituído e arilasubstituído ou não substituído, sendo que R12 e R13 juntoscom o átomo de nitrogênio ou carbono ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistemade heterocicloalquila substituído ou não substituídotendo de 4 a 6 membros, opcionalmente contendo dois oumais heteroátomos;
R4, R4', R5 e R5' são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15,C(O)R15, SR15, OR15i CR15=NR16, e O(CH2)nN(CH3)2onde
η é um número inteiro de 1 a 20;
R15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroarila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído, epeptidila substituído ou não substituído, sendo que R15 eR16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistemade anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, contendoopcionalmente dois ou mais heteroátomos;
R6 é uma ligação simples que está ou presente ou ausentee quando presente R6 e R7 são unidos para formar um anelde ciclopropila; e
R7 é CH2-X1 ou -CH2- unido no citado anel de ciclopropilacom R6, onde
X1 é um grupo partindo,
sendo que pelo menos um de R11, R12, R13, R15 ou R16 liga ocitado fármaco a L1, se presente, ou a F, H, ou J.
Em uma configuração preferida, D tem a estrutura:
onde
Z é um membro selecionado de O, Se NR23sendo que R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, e acila;
R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8, sendo que R8 é um membro selecionado dogrupo consistindo de um alquila substituído, alquila nãosubstituído, NR9R10, NR9NHR10, e OR9
no qual
R9 e R10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;e
R2 é H, alquila substituído ou alquila inferior nãosubstituído;
sendo que pelo menos um de R11, R12, R13, R15 ou R16 liga ocitado fármaco a L1, se presente, ou a F, H, ou J.
Em uma configuração preferida do acima, R2 é um alquilainferior não substituído.
Em uma outra configuração preferida, D tem a estrutura:
<formula>formula see original document page 20</formula>
onde
Z é um membro selecionado de 0, Se NR23sendo que
R23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila;
R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8, sendo que R8 é um membro selecionado deNR9R10 e OR9,
no qual
R9 e R10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;
R1' é H, alquila inferior substituído ou não substituído,ou C(O)R8, sendo que R8 é um membro selecionado de NR9R10e OR9,
no qual
R9 e R10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;
R2 é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila ou ciano ou alcoxi nãosubstituído; e
R2' é H, alquila inferior substituído ou não substituídoou heteroalquila não substituído,
sendo que pelo menos um de R11, R12, R13, R15 ou R16 liga ocitado fármaco a L1, se presente, ou F, H, ou J.
Em todas as estruturas de conjugado de liganteanteriores, L4 preferivelmente compreende uma parcela nãocíclica. L4 preferivelmente aumenta a solubilidade docomposto se comparado com o composto sem L4 e/ou L4diminui a agregação do composto se comparado com ocomposto sem L4. Em uma configuração preferida, L4compreende uma parcela de polietileno glicol. A parcelade polietileno glicol pode conter, por exemplo, 3-12unidades repetidas, ou 2-6 unidades repetidas ou, maispreferivelmente, 4 unidades repetidas.
Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um compostoligante-fármaco citotóxico tendo uma estrutura de acordocom a seguinte fórmula:
<formula>formula see original document page 21</formula>
onde o símbolo L1 representa um espaçador de auto-sacrifício onde m é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, 4,5, ou 6.
O símbolo X4 representa um membro selecionado do grupoconsistindo de grupos funcionais reativos protegidos,grupos funcionais reativos não protegidos, rótulosdetectáveis, e agentes direcionadores.
0 símbolo L4 representa um membro ligante, e ρ é 0 ou 1.L4 é uma parcela que impõe propriedades de solubilidadecrescente ou agregação reduzida aos conjugados. Exemplosde parcelas L4 incluem alquila substituído, alquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroalquila substituído, ou heteroalquila nãosubstituído, qualquer dos quais pode ser reto,ramificado, ou cíclico, um polímero de aminoácidocarregado positivamente ou negativamente, tal comopolilisina ou poliargenina, ou outros polímeros tais comopolietileno glicol.
0 símbolo Q representa qualquer ligante clivávelincluindo, mas não limitado a, qualquer dos ligantes depeptidila, hidrozona, e dissulfeto descritos aqui.Ligantes cliváveis incluem aqueles que podem serseletivamente clivados por um processo químico oubiológico e com a clivagem separam o fármaco, D1, de X4.
O símbolo D1 representa um fármaco tendo a seguintefórmula:
<formula>formula see original document page 22</formula>
onde X e Z sao membros selecionados indepedentemente deO, Se NR23;
R23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila;R1 é Η, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8,
R1' é H, alquila inferior substituído ou não substituído,ou C(O)R8,
sendo que R8 é um membro selecionado de NR9R10 e OR9 e R9 eR10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;
R2 é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila ou ciano ou alcóxi nãosubstituído;
R2' é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila não substituído,R3 é um membro selecionado do grupo consistindo de SR11,NHR11 e OR11, sendo que R11 é um membro selecionado dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, difosfatos, trifosfatos, acila, C(O)R12R137C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O) (OR12)2,' C(O)CHR12R13, SR12 eSiR12R13R14, no qual R12, R13 e R14 são membros selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou não substituídoe arila substituído ou não substituído, sendo que R12 eR13 juntos com o átomo de nitrogênio ou carbono ao qualeles estão ligados são opcionalmente unidos para formarum sistema de anel heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo 4 a 6 membros, opcionalmente contendodois ou mais heteroátomos;
sendo que pelo menos um de R11, R12, e R13 liga o citadofármaco a L1, se presente, ou a Q,
R6 é uma ligação simples que está ou presente ou ausentee quando presente R6 e R7 são unidos para formar um anelde ciclopropila; e
R7 é CH2-X1 ou -CH2- unido no citado anel de ciclopropilacom R6, sendo que
X1 é um grupo partindo,
R4, R4', R5 e R5' são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC (O) NR15R16, OC(O)OR15,C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, e O(CH2)nNR24R25 onde η é umnúmero inteiro de 1 a 20.
R15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído, epeptidila substituído ou não substituído, sendo que R15 eR16 juntos como o átomo de nitrogênio ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistemade anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos;
e R24 e R25 são selecionados independentemente de alquilanão substituído, e
sendo que pelo menos um de R4, R4', R5 e R5' é0 (CH2) nNR24R25 .
Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se aformulações farmacêuticas. Tais formulações tipicamentecompreendem um composto conjugado da invenção e umportador farmaceuticamente aceitável.
Em ainda um aspecto adicional, a invenção refere-se amétodos para usar os compostos conjugados da invenção.
Por exemplo, a invenção provê um método para matar umacélula, onde o composto conjugado da invenção éadministrado à célula em uma quantidade suficiente paramatar a célula. Em uma configuração preferida, a célula éuma célula tumoral. Em uma outra configuração, a invençãoprovê um método para retardar ou interromper ocrescimento de um tumor em um sujeito mamífero, onde umcomposto conjugado da invenção é administrado ao sujeitoem uma quantidade suficiente para retardar ou interrompero crescimento do tumor.
Outros aspectos, vantagens e objetivos da invenção serãoaparentes a partir do exame da descrição detalhadaabaixo.
Descrição resumida dos desenhos
Configurações não limitantes e não exaustivas da presenteinvenção são descritas com referência aos desenhosseguintes. Para uma melhor compreensão da presenteinvenção, referência será feita à seguinte DescriçãoDetalhada, a qual deve ser lida em associação com osdesenhos anexos, onde:
A fig. 1 é um gráfico de mudanças em volume tumoral com otempo para camundongos dosados com um conjugado deanticorpo-fármaco de controle de isotipo, um conjugado defármaco-anticorpo aPSMA, ou um tamponador de conjugaçãosozinho (veículo);
A fig. 2 é um gráfico de mudanças em volume tumoral com otempo para camundongos dosados com várias quantidades deconjutado fármaco-anticorpo aPSMA ou um tamponador deconjugação sozinho (veículo);
A fig. 3 é um gráfico de mudanças em volume tumoral com otempo para camundongos dosados com várias quantidades deum conjugado de fármaco-anticorpo de controle de isotipoou um tamponador de conjugação sozinho (veículo);
A fig. 4 é um gráfico de mudança de peso corporal com otempo para camundongos dosados com várias quantidades deum conjugado de fármaco-anticorpo de controle de isotipoou um tamponador de conjugação sozinho (veículo);
A fig. 5 é um gráfico de mudança de peso corporal com otempo para camundongos dosados com várias quantidades deconjugado de fármaco-anticorpo aPSMA ou um tamponador deconjugação sozinho (veículo);
A fig. 6 é um gráfico de mudanças em volume tumoral com otempo, para tumores tendo um volume tumoral médio de 24 0mm3, para camundongos dosados com um conjugado defármaco-anticorpo de controle de isotipo, um conjugado defármaco-anticorpo aPSMA, ou um tamponador de conjugaçãosozinho (veículo);
A fig. 7 é um gráfico de mudanças em volume tumoral com otempo, para tumores tendo um volume tumoral médio inicialde 43 0 mm3, para camundongos dosados com um conjugado defármaco-anticorpo aPSMA ou um tamponador de conjugaçãosozinho (veículo);
A fig. 8 é um gráfico comparando mudanças em volumetumoral com o tempo para camundongos dosados com umcontrole de isotipo e conjugados de toxina-anticorpo; e
A fig. 9 é um gráfico comparando mudanças em pesocorporal com o tempo para camundongos dosados com umcontrole de isotipo e conjugados de toxina-anticorpo
Descrição detalhada da invenção
Abreviações
Como usado aqui, "Ala", se refere a alanina."Boc" se refere a t-butiloxicarbonila."CPI" se refere a ciclopropapirroloindol."Cbz" é carbobenzoxi.
Como usado aqui, "DCM" se refere a diclorometano."DDQ" se refere a 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4 -benzoquinona.
DIPEA é diisopropiletalamina"DMDA" é N,N'-dimetiletileno diamina
"RBF" é um frasco de fundo redondo"DMF" é N,B-dimetilformamida
"HATU" é hexafluorofosfato de N-óxido de N-[[(dimetilamino)-1H-1,2,3 -triazolo[4,5-b]piridin-1-iljmetileno]-N-metilmetanamínio
Como usado aqui, o símbolo "E" representa um grupoenzimaticamente clivável.
"EDCI" é 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida.Como usado aqui, "FM0C" refere-se a 9-fluorenilmetiloxicarbonila.
"FMOC refere-se a 9-fluorenilmetoxicarbonila."HOAt" é 7-Aza-l-hidroxibenzotriazol."Leu" é leucina."PABA" refere-se a ácido para-aminobenzóico.PEG refere-se a polietileno glicol"PMB" refere-se a para-metoxibenzila."TBAF refere-se a fluoreto de tetrabutilamônio.
A abreviação "TBSO" refere-se a t-butildimetilsilil éter.
Como usado aqui, "TEA" refere-se a trietilamina."TFA" refere-se a ácido trifluoroacético.
O símbolo "Q" refere-se a um agente terapêutico, agentede diagnóstico ou rótulo detectável.
Definições
A menos que definido ao contrário, todos os termostécnicos e científicos usados aqui geralmente têm o mesmosignificado como comumente entendido por alguém deexperiência ordinária na técnica à qual esta invençãopertence. Geralmente, a nomenclatura usada aqui e osprocedimentos de laboratório em cultura de células,genética molecular, química orgânica e química de ácidonucléico e hibridização descritos abaixo são aqueles bemconhecidos e comumente empregados na técnica. Técnicasstandard são usadas para a síntese de ácido nucléico epeptídeos. Geralmente, reações enzimáticas e etapas depurificação são executadas de acordo com asespecificações do fabricante. As técnicas e procedimentossão geralmente executadas de acordo com métodosconvencionais na arte e várias referências gerais (vejageralmente, Sambrook e outros, MOLECULAR CLONING: ALABORATORY MANUAL [Clonagem Molecular: Um manual delaboratório], 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., que é incorporado aquipor referência) , os quais são providos através de todoeste documento. A nomenclatura usada aqui e osprocedimentos de laboratório de química analítica, esintética orgânica abaixo são aqueles bem conhecidos ecomumente empregados na técnica. Técnicas standard, oumodificações das mesmas, são usadas para síntesesquímicas e análises químicas.
O termo "agente terapêutico" é intencionado a significarum composto que, quando presente em uma quantidadeterapeuticamente efetiva, produz um efeito terapêuticodesejado em um mamífero. Para tratar carcinomas, édesejável que o agente terapêutico também seja capaz deentrar na célula alvo.
O termo "citotoxina" é intencionado a significar umagente terapêutico tendo o efeito desejado de sercitotóxico para células de câncer. Citotóxico significaque o agente interrompe o crescimento de, ou mata ascélulas. Citotoxinas exemplares incluem, por meio deexemplo e não limitação, combretastainas, duocarmicinas,os antibióticos antitumorais CC-1065, antraciclinas, ecompostos relacionados. Outras citotoxinas incluemmicotoxinas, ricina e seus análogos, caliqueamicinas,doxirubicina e maitansinóides.
O termo "pró-fármaco" e o termo "conjugado de fármaco"são usados aqui intercambiavelmente. Ambos se referem aum composto que é relativamente inócuo a células enquantoainda na forma de conjugado, mas que é seletivamentedegradado para uma forma farmacologicamente ativa porcondições, p.ex., enzimas, localizadas dentro ou naproximidade de células alvo.
O termo "marcador" é intencionado a significar umcomposto útil na caracterização de tumores ou outracondição médica, por exemplo, diagnose, progressão de umtumor, e ensaio de fatores segregados por célulastumorais. Os marcadores são considerados um subconjuntode "agentes de diagnóstico".
O termo "seletivo" como usado em conexão com clivagemenzimática significa que a taxa de clivagem da parcela deligante é maior do que a taxa de clivagem de um peptídeotendo uma seqüência randômica de aminoácidos.Os termos "grupo direcionador" e "agente direcionador"são intencionados a significar uma parcela que é (1)capaz de direcionar a entidade à qual ela está ligada(p.ex., agente terapêutico ou marcador) a uma célulaalvo, por exemplo a um tipo específico de célula tumoralou (2) é preferencialmente ativada em um tecido alvo, porexemplo um tumor. O grupo direcionador ou agentedirecionador pode ser uma molécula pequena, a qual éintencionada a incluir tanto não peptídeos quantopeptídeos. O grupo direcionador também pode ser umamacromolécula, que inclui sacarídeos, Iectinas,receptores, ligantes para receptores, proteínas tais comoBSA, anticorpos, e assim por diante. Em uma configuraçãopreferida da corrente invenção, o grupo direcionador é umanticorpo ou um fragmento de anticorpo, maispreferivelmente um anticorpo monoclonal ou fragmento deanticorpo monoclonal.
O termo "espaçador de auto-sacrifício" refere-se a umaparcela química bifuncional que é capaz de covalentementeligar duas parcelas químicas em uma molécula tripartitenormalmente estável. 0 espaçador de auto-sacrifício écapaz de espontaneamente se separar da segunda parcela sea ligação com a primeira parcela for clivada.
O termo "rótulo detectável" é intencionado a significaruma parcela tendo uma propriedade física ou química.
O termo "grupo clivável" é intencionado a significar umaparcela que é instável in vivo. Preferivelmente o "grupoclivável" permite a ativação do marcador ou agenteterapêutico clivando o marcado ou agente do resto doconjugado. Operativamente definido, o ligante épreferivelmente clivado in vivo pelo ambiente biológico.A clivagem pode vir de qualquer processo sem limitações,p.ex., enzimática, redutiva, pH, etc. Preferivelmente, ogrupo clivável é selecionado tal que a ativação ocorra nosítio desejado de ação, o qual pode ser um sítio em oupróximo das células (p.ex,. células de carcinoma) outecidos alvo tais como no sítio de ação terapêutica ou deatividade de marcador. Tal clivagem pode ser enzimática egrupos enzimaticamente cliváveis exemplares incluemaminoácidos naturais ou seqüências de peptídeos queterminam com um aminoácido natural, e são ligados em seutérmino carboxila ao ligante. Embora o grau de taxa deintensificação de taxa de clivagem não seja crítico paraa invenção, exemplos preferidos de ligantes cliváveis sãoaqueles nos quais pelo menos cerca de 10% dos gruposcliváveis são clivados na corrente sangüínea dentro de 24 horas a partir da administração, o mais preferivelmentepelo menos cerca de 35%.
O termo "ligante" significa qualquer molécula queespecificamente se liga ou reativamente se associa ou secomplexa com um receptor, substrato, determinanteantigênico, ou outro sítio de ligação em uma célula outecido alvo. Exemplos de ligantes incluem anticorpos efragmentos dos mesmos (p.ex., um anticorpo monoclonal oufragmento do mesmo), enzimas (p.ex., enzimasfibrionolíticas), modificadores de resposta biológica(p.ex., interleucinas, interferons, eritropoetina, oufatores estimuladores de colônia), hormônios depeptídeos, e fragmentos de ligação de antígeno dosmesmos.
Os termos "ligante de hidrazina" e "ligante de hidrazinade auto-ciclização" são usados intercambiavelmente aqui.Estes termos se referem a uma parcela de ligante que, comuma mudança de condições, tal como um deslocamento de pH,passará por uma reação de ciclização e formará um ou maisanéis. A parcela de hidrazina é convertida para umahidrazona quando ligada. Esta ligação pode ocorrer, porexemplo, através de uma reação com um grupo cetona naparcela L4. Portanto, o termo ligante de hidrazona tambémpode ser usado para descrever o ligante da presenteinvenção por causa desta conversão para uma hidrazona coma ligação.
O termo "ligante de hidrazina de cinco membros" ou"ligante de hidrazina de 5 membros" se refere a parcelasmoleculares contendo hidrazina que, com uma mudança decondição, tal como um deslocamento de pH, passará por umareação de ciclização e formará um ou mais anéis de 5membros. Alternativamente, este ligante de cinco membrospode similarmente ser descrito como um ligante dehidrazona de cinco membros ou um ligante de hidrazona de5 membros.
O termo "ligante de hidrazina de seis membros" ou"ligante de hidrazina de 6 membros" se refere a parcelasmoleculares contendo hidrazina que, com uma mudança decondição tal como um deslocamento de pH, passará por umareação de ciclização e formará um ou mais anéis de 6membros. Este ligante de seis membros pode similarmenteser descrito como um ligante de hidrazona de seis membrosou um ligante de hidrazona de 6 membros.
O termo "reação de ciclização", quando se referindo àciclização de um peptídeo, hidrazina, ou ligante dedissulfeto, indica a ciclização daquele ligante em umanel e inicia a separação do complexo de fármaco-ligante.
Esta taxa pode ser medida ex situ, e está terminadaquando pelo menos 90%, 95%, ou 100% do produto estãoformados.
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" sãousados intercambiavelmente aqui para se referir a umpolímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicama polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduosde aminoácido é um mimético químico artificial de umcorrespondente aminoácido de ocorrência natural, bem comopolímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímerode aminoácido de ocorrência não natural. Estes termostambém abrangem o termo "anticorpo".
O termo "aminoácido" refere-se aminoácidos de ocorrêncianatural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos emiméticos de aminoácidos que funcionem de maneira similara aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos deocorrência natural são aqueles codificados pelo códigogenético, bem como aqueles aminoácidos que sãomodificados depois, p.ex., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidose referem a compostos que têm a mesma estrutura químicabásica que um aminoácido de ocorrência natural, isto é,um carbono a que está ligado a um hidrogênio, um grupocarboxila, um grupo amino, e um grupo R, p.ex.,homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metioninametil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados(p.ex., norleucina) ou cadeias principais de peptídeomodificado, mas retêm a mesma estrutura química básicaque um aminoácido de ocorrência natural. Um aminoácidoque pode ser usado em particular é citrulina, que é umprecursor para arginina e está envolvido na formação deuréia no fígado. Miméticos de aminoácidos se referem acompostos químicos que têm funções de uma maneira similara um aminoácido de ocorrência natural. 0 termo"aminoácido não natural" é intencionado a representar aforma estéreo-química D dos vinte aminoácidos deocorrência natural descritos acima. É adicionalmenteentendido que o termo aminoácido não natural incluihomólogos dos aminoácidos naturais, e formas modificadassinteticamente dos aminoácidos naturais. As formassinteticamente modificadas incluem, mas não estãolimitadas a, aminoácidos tendo cadeias de alquilenoencurtadas ou prolongadas em até dois átomos de carbono,aminoácidos compreendendo grupos arila opcionalmentesubstituídos, e grupos halogenados compreendidos deaminoácidos, preferivelmente grupos alquila e arilahalogenados. Quando ligado a um ligante ou conjugado dainvenção, o aminoácido está na forma de uma "cadeialateral de aminoácido", onde o grupo de ácido carboxílicodo aminoácido foi substituído com um grupo ceto ((C(O)).
Assim, por exemplo, a cadeia lateral de alanina é -C(O)-CH(NH2)-CH3, e assim por diante.
Os aminoácidos e peptídeos podem ser protegidos porgrupos bloqueadores. Um grupo bloqueador é um átomo ouparcela química que protege o término N de um aminoácidoou um peptídeo de reações indesejadas e pode ser usadodurante a síntese de um conjugado de fármaco-ligante. Eledeve permanecer ligado ao término N através de toda asíntese, e pode ser removido após o término da síntese doconjugado de fármaco por condições químicas ou outras queseletivamente consigam sua remoção. Grupos blogueadoresadequados para proteção do término N são bem conhecidosna técnica de química de peptídeos. Grupos bloqueadoresexemplares incluem, mas não estão limtados a, hidrogênio,aminoácido-D, e cloreto de carbobenzoxi (Cbz).
"Ácido nucleico" se refere a deoxiribonucleotídeos ouribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de fitasimples ou de fita dupla. 0 termo abrange ácidosnucléicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ouresíduos ou ligações de cadeia principal modificada, quesão sintéticos, de ocorrência natural, e de ocorrêncianão natural, que têm propriedades de ligação similares aoácido nucléico de referência, e que são metabolizados demaneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplosde tais análogos incluem, sem limitações, tioatos defósforo, amidatos de fósforo, fosfonatos de metila,fosfonatos de metila quirais, 2-0-metil ribonucleotídeos,ácidos peptídeo-nucléicos (PNAs).
A menos que indicado ao contrário, uma particularseqüência de ácido nucléico também implicitamente abrangevariantes conservativamente modificadas da mesma (p.ex.,substituições de codão degenerado) e seqüênciascomplementares, bem como a seqüência explicitamenteindicada. Especificamente, substituições de codãodegenerado podem ser conseguidas gerando seqüências nasquais a terceira posição de um ou mais codãosselecionados (ou todos) é substituída com resíduos debase mista e/ou de deoxinosina (Batzer e outros, NucleicAcid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka e outros, J. Biol.Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini e outros, Mol.Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 0 termo ácido nucléico éusado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNa,oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.
0 símbolo ---, seja utilizado como uma ligação ou exibidoperpendicular a uma ligação indica o ponto no qual aparcela exibida está ligada ao restante da molécula,suporte sólido, etc.O termo "alquila", por si próprio ou como parte de umoutro substituinte, significa, a menos que registrado deoutra forma, uma cadeia reta ou ramificada, ou radical dehidrocarboneto cíclico, ou combinação dos mesmos, quepode ser totalmente saturado, mono- ou poli-insaturado epode incluir radicais di- e multivalente, tendo o númerode átomos de carbono designado (isto é C1-C10 significa uma dez carbonos). Exemplos de radicais de hidrocarbonetosaturado incluem, mas não estão limitados a, grupos taiscomo metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclohexila,(ciclohexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos eisômeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila,n-octila, e similares. Um grupo alquila não saturado é umtendo uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas.Exemplos de grupos alquila não saturados incluem, mas nãoestão limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentila, 2 -(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, eos homólogos e isômeros superiores. 0 termo "alquila" amenos que anotado ao contrário, também é pretendido aincluir aqueles derivados de alquila definidos em maisdetalhes abaixo, tais como "heteroalquila". Gruposalquila, que são limitados a grupos hidrocarboneto sãodenominados "homoalquila".
O termo "alquileno" por si próprio ou como parte de umoutro substituinte significa um radical divalentederivado de um alcano, como exemplificado, mas nãolimitado, por -CH2CH2CH2CH2-, e adicionalmente incluiaqueles grupos descritos abaixo como "heteroalquileno" .Tipicamente, um grupo alquila (ou alquileno) terá de 1 a24 átomos de carbono, com aqueles grupos tendo 10 oumenos átomos de carbono sendo preferidos na presenteinvenção. Um "alquila inferior" ou "alquileno inferior" éum grupo alquila ou alquileno de cadeia mais curta,geralmente tendo oito ou menos átomos de carbono.O termo "heteroalquila", por si próprio ou em combinaçãocom um outro termo, significa, a menos que registrado deoutra forma, uma radical hidrocarboneto de cadeia reta ouramificada, ou cíclico, estável, ou combinações dosmesmos, consistindo do número declarado de átomos decarbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupoconsistindo de O, N, Si e S, e sendo que os átomos denitrogênio, carbono e enxofre podem ser opcionalmenteoxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode seropcionalmente quaternizado. 0(s) heteroátomo(s) 0, N e Se Si pode ser colocado em qualquer posição anterior dogrupo heteroalquila ou na posição na qual o grupo alquilaestá ligado ao restante da molécula. Exemplos incluem,mas não estão limitados a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3,-CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3,CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH=CH=-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3,e -CH=CH-N(CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem serconsecutivos, tais como, por exemplo -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-Si(CH3)3. Similarmente, o termo "heteroalquileno" porsi próprio ou como parte de um outro substituintesignifica um radical divalente derivado de heteroalquila,como exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2 e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno,os heteroátomos também podem ocupar qualquer ou ambos ostérminos de cadeia (p.ex., alquilenooxi, alquilenodioxi,alquilenoamino, alquilenodiamino, e similares). Os termos"heteroalquila" e "heteroalquileno" abrangem poli(etilenoglicol) e seus derivados (veja, por exemplo, ShearwaterPolyroers Catalog, 2001). Ainda adicionalmente, paragrupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhumaorientação do grupo de ligação é sugerida pela direção naqual a fórmula do grupo de ligação está escrita. Porexemplo, a fórmula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'-quanto -RÇ(0)2.
0 termo "inferior" em combinação com os termos "alquila"ou "heteroalquila" refere-se a uma parcela tendo de 1 a 6átomos de carbono.
Os termos "alcoxi", "alquilamino", "alquilsulfonila", e"alquiltio" (ou tioalcoxi) são usados em seu sentidoconvencional, e se referem àqueles grupos alquila ligadosao restante da molécula via um átomo de oxigênio, umgrupo aminio, um grupo SO2 ou um átomo de enxofre,respectivamente. 0 termo "arilsulfonila" refere-se a umgrupo arila ligado ao restante da molécula via um grupoSO2, e o termo "sulfidrila" refere-se a um grupo SH.Em geral, um "substituinte acila" também é selecionado dogrupo registrado acima. Como usado aqui, o termo"substituinte acila" refere-se a grupos ligados a, ecompletando a valência de um carbono de carbonila queestá diretamente ou indiretamente ligado ao núcleopolicíclico dos compostos da presente invenção.Os termos "cicloalquila" e "heterocicloalquila", por si próprios ou em combinação com outros termos, representam,a menos que registrado de outra forma, versões cíclicasde "alquila" substituído ou não substituído e"heteroalquila" substituído ou não substituído.
Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo está ligadoao restante da molécula. Exemplos de cicloalquilaincluem, mas não estão limitados a, ciclopentila,ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3-ciclohexenila,cicloheptila, e similares. Exemplos de heterocicloalquila incluem, mas não estão limitados a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila,tetrahidrofuran-2-ila, tetrahidrofuran-3 -ila,tetrahidrotien-2-ila, tetrahidrotien-3-ila, 1- piperazinila, 2-piperazinila, e similares. Osheteroátomos e átomos de carbono das estruturas cíclicassão opcionalmente oxidados.
Os termos "halo" ou "halogênio", por si próprios ou comoparte de um outro substituinte, significam, a menos queregistrado de outra forma, um átomo de flúor, cloro,bromo, ou iodo. Adicionalmente, termos tais como"haloalquila", são pretendidos a incluir monohaloalquilae polihaloalquila. Por exemplo, o termo "haloalquila (C1-C4)" é pretendido a incluir, mas não estar limitado a,trifluorometila, 2,2,2-trifluoroetila, 4-clorobutila, 3-bromopropila, e similares.
O termo "arila" significa, a menos que registrado deoutra forma, um substituinte de hidrocarboneto,aromático, poli-insaturado, substituído ou nãosubstituído, que pode ser um anel único ou múltiplosanéis (preferivelmente de 1 a 3 anéis) que são fundidosentre si ou ligados covalentemente. 0 termo "heteroarila"refere-se a grupos (ou anéis) arila que contêm de um aquatro heteroátomos selecionados de N, O, e S, sendo queos átomos de nitrogênio, carbono e enxofre sãoopcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s) de nitrogênioé(são) opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarilapode ser ligado ao restante da molécula através de umheteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos arila eheteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirrazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolila,3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila,4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila,3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, pirinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 30-quinolila, e 6-quinolila. Substituintes para cada um dosacima anotados sistemas de anel de arila e heteroarilasão selecionados do grupo de substituintes aceitáveisdescritos abaixo. "Arila" e "heteroarila" também abrangemsistemas de anel nos quais um ou mais sistemas de anéisnão aromáticos são fundidos, ou de outra forma ligados, aum sistema arila ou heteroarila.
Para brevidade, o termo "arila" quando usado emcombinação com outros termos (p.ex., ariloxi, ariltioxi,arilalquila) inclui anéis tanto arila quanto heteroarilacomo definidos acima. Assim, o termo "arilalquila" épretendido a incluir aqueles radicais nos quais um grupoarila está ligado a um grupo alquila (p.ex., benzila,fenetila, piridimetila e similares) incluindo aquelesgrupos alquila nos quais um átomo de carbono (p.ex., umgrupo metileno) foi substituído por, por exemplo, umátomo de oxigênio (p.ex., fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1-naftiloxi)propila, e similares).Cada um dos termos acima (p.ex., "alquila", "heteroalquila", "arila" e "heteroarila") inclui asformas tanto substituída quanto não substituída doradical indicado. Substituintes preferidos para cada tipode radical são fornecidos abaixo.
Os substituintes para os radicais alquila, e heteroalquila (incluindo aqueles grupos freqüentementereferidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno,heteroalquenila, alquinila, cicloalquila,heterocicloalquila, cicloalquenila, eheterocicloalquenila) são geralmente referidos como "substituintes alquila" e "substituintes heteroalquila",respectivamente, e eles podem ser um ou mais de umavariedade de grupos selecionados de, mas não limitados a:-OR', =0, =NR-OR', -NR1R", -SR', -halogênio, -SiR'R"R", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR1R", NR11C(O)R', -NR'-C (O)NRnR'" , -NR11C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR1R")=NR'" , -S(O)R', -S(O)2R', -S (O)2NRiR", -NRSO2R', -CN e -NO2 em um número variando dezero a (2m'+l), onde m' é o número total de átomos decarbono em tal radical. Cada um de R', R", R'" e R"" preferivelmente se refere independentemente a hidrogênio,grupos heteroalquila substituído ou não substituído,arila substituído ou não substituído, p.ex., arilasubstituído com 1-3 halogênios, alquila, alcoxi outioalcoxi substituído ou não substituído, ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui maisque um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R éindependentemente selecionado como o são cada um dosgrupos R', R", R'" e R"" quando mais que um destes gruposestá presente. Quando R' e R" estão ligados ao mesmoátomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com oátomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7membros. Por exemplo, -NR1R" é pretendido a incluir, masnão estar limitado a, 1-pirrolinila e 4-morfolinila. Apartir da discussão acima de substituintes, alguém deexperiência na técnica entenderá que o termo "alquila" épretendido a incluir grupos incluindo átomos de carbonoligados a grupos outros que grupos de hidrogênio, taiscomo haloalquila (p.ex., -CF3 e -CH2CF3) e acila (p.ex., -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 e similares).
Similar aos substituintes descritos acima para o radicalalquila, os substituintes arila e substituintesheteroarila são geralmente referidos como "substituintesarila" e substituintes heteroarila", respectivamente esão variados e selecionados de, por exemplo: halogênio, -OR', =0, =NR1, =N-OR', -NR'R", -SR', -halogênio,SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R",OC(O)NR1R", -NRnC(O)R', -NR'-C(0)NR"R"' , -NRnC(O)2R', -NR-C (NR'R" ) =NR' " , -S(O)R', -S(O)2R', -S (0)2NR'R",NRSO2R', -CN e -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro alcoxi(Ci-C4), e fluoro alquila (Ci-C4), em um número variandode zero até o número total de valências abertas nosistema de anel aromático; e onde R', R", R'" e R"" sãopreferivelmente selecionados independentemente dehidrogênio, alquila e heteroalquila(C1-C8), arila eheteroarila não substituído, (arila não substituído)-alquila(Ci-C4), e (arila não substituído)oxi-alquila(Ci-C4). Quando um composto da invenção inclui mais que umgrupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionadoindependentemente como o são cada um dos grupos R', R",R'" e R"" quando mais que um destes grupos estãopresentes.
Dois dos substituintes arila em átomos adjacentes do anelarila ou heteroarila podem ser opcionalmente substituídoscom um substituinte da fórmula -T-C (0) - (CRR') q-U-, onde Te U são independentemente -NR, -0-, -CRR'- ou uma ligaçãosimples, e q é um número inteiro de 0 a 3.Alternativamente, dois dos substituintes em átomosadjacentes do anel arila ou heteroarila podemopcionalmente ser substituídos com um substituinte dafórmula -A-(CH2)r-B-, onde AeB são independentemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O2)-, S(O)2NR'- ou umaligação dupla, e r é um número inteiro de 1 a 4. Uma dasligações simples do novo anel assim formado podeopcionalmente ser substituída com uma ligação dupla.
Alternativamente, dois dos substituintes em átomosadjacentes do anel arila ou heteroarila podemopcionalmente ser substituídos com um substituinte dafórmula -(CRRf)s-X-(CRwRiw)d-, onde s e d sãoindependentemente números inteiros de 0 a 3, e X é -0-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, ou -S(O)2NR'. Ossubstituintes R, R', R" e R'" são pref erivelmenteselecionados independentemente de hidrogênio ou alquila(C1-C6) substituído ou não substituído.
Como usado aqui, o termo "difosfato" inclui mas não estálimitado a um éster de ácido fosfórico contendo doisgrupos fosfato. 0 termo "trifosfato" inclui mas não estálimitado a um éster de ácido fosfórico contendo trêsgrupos fosfato. Por exemplo, particulares fármacos tendoum difosfato ou um trifosfato incluem:
di:trifosfato
Como usado aqui, o termo "heteroátomo" inclui oxigênio(O) , nitrogênio (N) , enxofre (S) e silício (Si) .O símbolo "R" é uma abreviação geral que representa umgrupo substituinte que é selecionado de grupos alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído, eheterociclila substituído ou não substituído.
O termo "portador farmaceuticamente aceitável", comousado aqui significa um material, composição ou veículofarmaceuticamente aceitável, tal como um carga, diluente,excipiente, solvente ou material encapsulador líquido ousólido, envolvido em carregar ou transportar um agentequímico. Portadores farmaceuticamente aceitáveis incluemsais farmaceuticamente aceitáveis, onde o termo "saisfarmaceuticamente aceitáveis" inclui sais dos compostosativos que são preparados com ácidos ou basesrelativamente não tóxicos, dependendo dos particularessubstituintes encontrados nos compostos descritos aqui.Quando compostos da presente invenção contêmfuncionalidades relativamente ácidas, sais de adição debase podem ser obtidos contatando a forma neutra de taiscompostos com uma quantidade suficiente da base desejada,seja pura ou em um solvente inerte adequado. Exemplos desais de adição de base farmaceuticamente aceitáveisincluem sais de sódio, potássio, cálcio, amônio, aminoorgânico, ou de magnésio, ou um sal similar. Quando oscompostos da presente invenção contêm funcionalidadesrelativamente básicas, sais de adição de ácido podem serobtidos contatando a forma neutra de tais compostos comuma quantidade suficiente do ácido desejado, seja puro emum solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adiçãode ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem aquelesderivados de ácidos inorgânicos como ácidos clorídrico,brômico, nítricô, carbônico, monohidrogencarbônico,fosfórico, monohidrogenfosfórico, dihidrogenfosfórico,sulfúrico, monohidrogensulfúrico, hidriodico, oufosforoso e similares, bem como os sais derivados deácidos orgânicos relativamente não tóxicos como acético,propiônico, isobutírico, maleico, malônico, benzóico,succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico,ftálico, benzenosulfônico, p-tolilsulfônico, cítrico,tartárico, matanosulfônico, e similares. Também estãoincluídos os sais de aminoácidos tais como arginato esimilares, e sais de ácidos orgânicos com ácidosglucurônico e galacturônico e similares (veja, porexemplo, Berge e outros, "Pharmaceutical Salts" [Saisfarmacêuticos], Journal of Pharmaceutical Science, 1977,66, 1-19). Certos compostos específicos da presenteinvenção contêm funcionalidades tanto básicas quantoácidas que permitem os compostos serem convertidos emsais de adição de base ou ácido.
As formas neutras dos compostos são preferivelmenteregeneradas contatando o sal com uma base ou ácido eisolando o composto fonte da maneira convencional. Aforma original do composto difere das várias formas desais em certas propriedades físicas, tais comosolubilidade em solventes polares, mas de outra forma ossais são equivalentes à forma fonte do composto para ospropósitos da presente invenção.
Em adição às formas de sal, a presente invenção provêcompostos, os quais estão em uma forma de pró-fármaco.
Pró-fármacos dos compostos descritos aqui são aquelescompostos que prontamente passam por mudanças químicassob condições fisiológicas para fornecer os compostos dapresente invenção. Adicionalmente, pró-fármacos podem serconvertidos para os compostos da presente invenção pormétodos químicos ou bioquímicos em um ambiente ex vivo.Por exemplo, pró-fármacos podem ser lentamenteconvertidos para os compostos da presente invenção quandocolocados em um reservatório de emplastro transdérmicocom uma enzima ou reagente químico adequado.Certos compostos da presente invenção podem existir emformas não solvatadas bem como formas solvatadas,incluindo formas hidratadas. Em geral, as formassolvatadas são equivalentes a formas não solvatadas eestão abrangidas dentro do escopo da presente invenção.Certos compostos da presente invenção podem existir emmúltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todasas formas físicas são equivalentes para os usoscontemplados pela presente invenção e são intencionadas aestar dentro do escopo da presente invenção.Certos compostos da presente invenção possuem átomos decarbono assimétricos (centros ópticos) ou ligaçõesduplas; os racematos, diastereômeros, isômerosgeométricos e isômeros individuais estão abrangidosdentro do escopo da presente invenção.
Os compostos da presente invenção também podem conterproporções não naturais de isótopos atômicos em um oumais dos átomos que constituem tais compostos. Porexemplo, os compostos podem ser rádio-rotulados comisótopos radioativos, tal como por exemplo, trítio (3H) ,iodo-125 (125I) ou carbono 14 (14C) . Todas as variaçõesisotópicas dos compostos da presente invenção, sejamradioativas ou não, são intencionadas a estar abrangidasdentro do escopo da presente invenção.
O termo "parcela de ligação" ou "parcela para ligar umgrupo direcionador" refere-se a uma parcela que permite aligação de um grupo direcionador ao ligante. Grupos deligação típicos incluem, para fins de ilustração e nãolimitação, alquila, aminoalquila, aminocarbonilalquila,carboxialquila, hidroxialquila, alquil-maleimida, alquil-N-hidroxilsuccinimida, poli(etileno glicol)-maleimida epoli(etileno glicol)-N-hidroxilsuccinimida, todos osquais podem ser adicionalmente substituídos. 0 ligantetambém pode ter a parcela de ligação realmente anexada aogrupo direcionador.
Como usado aqui, o termo "grupo partindo" refere-se a umaporção de um substrato que é clivada do substrato em umareação.
0 termo "anticorpo" como referido aqui inclui todos osanticorpos e qualquer fragmento de ligação de antígeno(isto é, "porção de ligação de antígeno") ou cadeiassimples dos mesmos. Um "anticorpo" se refere a umaglicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeiaspesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas porligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação deantígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendidapor uma região variável de cadeia pesada (Vh) e umaregião constante de cadeia pesada. A região constante decadeia pesada é compreendida de três domínios, CHi, CH2 eCH3, e pode ser do isotipo um, delta, gama, alfa ouepsilon. Cada cadeia leve é compreendida de uma regiãovariável de cadeia leve (Vl) e uma região constante decadeia leve. A região constante de cadeia leve écompreendida de um domínio, CL, que pode ser do isotipokappa ou lambda. As regiões Vh e Vl podem seradicionalmente subdivididas em regiões dehipervariabilidade, denominadas regiões determinantes decomplementariedade (CDR), intercaladas com regiões quesão mais conservadas, denominadas regiões de estrutura detrabalho (FR). Cada Vh e Vl é composto de três CDRs equatro FRs, arranjadas a partir do término amino para otérmino carboxi na seguinte ordem:
FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiõesvariáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domíniode ligação que interage com um antígeno. As regiõesconstantes dos anticorpos podem mediar a ligação daimunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros,incluindo várias células do sistema imune (p.ex., célulasefetoras) e do primeiro componente (Clq) do sistema decomplemento clássico.
Os termos "fragmento de anticorpo" ou "porção de ligaçãode antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção deanticorpo"), como usados aqui, referem-se a um ou maisfragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade deespecificamente se ligar a um antígeno. Foi mostrado quea função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimentototal. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidosdentro do termo "fragmento de anticorpo" ou "porção deligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) umfragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, Cl e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2, umfragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fabligados por uma ponte de dissulfeto na região dearticulação; (iii) um fragmento Fd consistindo dosdomínios Vh e CHi; (iv) um fragmento Fv consistindo dosdomínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo, (v)um fragmento dAb (Ward e outros, (1989) Nature 341:544-546) , que consiste de um domínio VH; e (vi) uma regiãodeterminante de complementariedade (CDR). Adicionalmente,embora os dois domínios do fragmento FV/ ^l e Vjj sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos,usando métodos recombinantes, por um ligante sintéticoque os permita serem produzidos como uma cadeia deproteína simples na qual as regiões Vl e Vh se emparelhampara formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv decadeia simples (scFv); veja, p.ex., Bird e outros (1988)Science 242:423-426; e Huston e outros (1988) Proc. Natl.Acad. Sei. EUA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeiasimples também são intencionados a estarem abrangidosdentro do termo "porção de ligação de antígeno" de umanticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidosusando técnicas convencionais conhecidas por aquelesexperientes na técnica, e os fragmentos são selecionadosquanto à utilidade da mesma maneira que são os anticorposintactos.
O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se referea uma preparação de moléculas de anticorpo de composiçãomolecular única. Uma composição de anticorpo monoclonalexibe uma especificidade e afinidade de ligação únicaspara um particular epitopo.
Para a preparação de anticorpos monoclonais oupoliclonais, qualquer técnica conhecida na arte pode serusada (veja, p.ex., Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975) ; Kozbor e outros, Immunology Today [Imunologiahoje] 4:72 (1983); Cole e outros, págs. 77-96 emMONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY [Anticorposmonoclonais de terapia de câncer], Alan R. Liss, Inc.(1985)).
Métodos de produção de anticorpos policlonais sãoconhecidos por aqueles experientes na técnica. Uma cepacosangüínea de camundongos (p.ex., camundongos BALB/C) oucoelhos é imunizada com a proteína usando um adjuvantestandard, tal como um adjuvante de Freund, e um protocolostandard de imunização. A resposta imune do animal àspreparações de imunogeno é monitorada tomando sangrias deteste e determinando a titulação da reatividade àssubunidades beta. Quando titulações apropriadamente altasde anticorpo para o imunogeno são obtidas, sangue écoletado do animal e anti-soros são preparados. Ofracionamento adicional do anti-soro para enriquecer paraanticorpos reativos à proteína pode ser feito sedesejado.
Anticorpos monoclonais podem ser obtidos por váriastécnicas familiares àqueles experientes na arte.Resumidamente, células de baço de um animal imunizado comum antígeno desejado são imortalizadas, comumente porfusão com uma célula de mieloma (veja Kohler & Milstein,Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)). Métodos alternativosde imortalização incluem a transformação com VírusEpstein Barr, oncogenos, ou retrovírus, ou outros métodosbem conhecidos na técnica.
Em uma configuração preferida, o anticorpo é um anticorpoquimérico ou humanizado. Os anticorpos quiméricos ouhumanizados da presente invenção podem ser preparadosbaseados na seqüência de anticorpo monoclonal murino. 0DNA codificando as imunoglobulinas de cadeia pesada eleve pode ser obtido a partir do hibridoma murino deinteresse e engenheirado para conter seqüências deimunoglobulina não murina (p.ex., humana) usando técnicas standard de biologia molecular. Por exemplo, para criarum anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinaspodem ser ligadas a regiões constantes humanas usandométodos conhecidos na técnica (veja p.ex., a patente U.S.n° 4.816.567 para Cabilly e outros). Para criar umanticorpo humanizado, as regiões de CDR murino podem serinseridas em uma estrutura de trabalho humana usandométodos conhecidos na técnica (veja p.ex., a patente U.S.n° 5.225.539 para Winter, e as patentes U.S. nos5.530.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e outros). Em uma outra configuração preferida, o anticorpo é umanticorpo humano. Tais anticorpos humanos podem sergerados imunizando camundongos transgênicos outranscromossômicos nos quais os genes de imunoglobulinade camundongo endogenosa foram inativados e genes de imunoglobulina humana exógena foram introduzidos. Taiscamundongos são conhecidos na técnica (veja p.ex., aspatentes U.S. nos 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318;5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay,· as patentes U.S. nos 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598;6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati e outros; epublicação PCT WO 02/43478 para Ishida e outros). Osanticorpos humanos também podem ser preparados usandométodos de exibição de fago para selecionar bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos deexibição de fato para isolar anticorpos humanos tambémsão conhecidos na técnica (veja, p.ex., as patentes U.S.nos 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner eoutros; patentes U.S. nos 5.427.908 e 5.580.717 paraDower e outros; patentes U.S. nos 5.969.108 e 6.172.197para McCafferty e outros; e patentes U.S. nos 5.885.793;6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081para Griffiths e outros).
"Suporte sólido" como usado aqui se refere a um materialque é substancialmente insolúvel em um selecionadosistema solvente, ou que pode ser prontamente separado(p.ex., por precipitação) a partir de um selecionadosistema solvente no qual ele é solúvel. Suportes sólidosúteis para praticar a presente invenção podem incluirgrupos que são ativados ou capazes de ativação parapermitir espécies selecionadas serem ligadas ao suportesólido. Um suporte sólido também pode ser um substrato,por exemplo, uma fatia, folhado ou poço, no qual umcomposto individual, ou mais do que um composto, dainvenção é ligado.
"Grupo funcional reativo" como usado aqui se refere agrupos incluindo, mas não limitados a, olefinas,acetilenos, álcoois, fenóis, éteres, óxidos, haletos,aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas,cianatos, isocianatos, tiocianatos, isotiocianatos,aminas, hidrazinas, hidrazonas, hidrazidas, diazo,diazônio, nitro, nitrilas, mercaptanas, sulfetos,dissulfetos, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfônicos,ácidos sulfínicos, acetais, cetais, anidridos, sulfatos,ácidos sulfênicos, isonitrilas, amidinas, imidas,imidatos, nitronas, hidroxilaminas, oximas, ácidoshidroxâmicos, alenos, orto ésteres, sulfitos, enaminas,inaminas, uréias, pseudouréias, semicarbazidas,carbodiimidas, carbamatos, iminas, azidas, e compostosazo, compostos azoxi, e compostos nitroso. Os gruposfuncionais reativos também incluem aqueles usados parapreparar bioconjugados, p.ex., N-hidroxisuccinimidaésteres, maleimidas e similares (veja, por exemplo,Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES [Técnicas debioconjugados], Academic press, San Diego, 1996). Osmétodos para preparar estes grupos funcionais são bemconhecidos na arte e sua aplicação a ou modificação paraum particular propósito está dentro da capacidade dealguém experiente na técnica (veja, por exemplo, Sandlere Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS[Preparações de grupo funcional orgânico], AcademicPress, San Diego, 1989). Os grupos funcionais reativospodem ser protegidos ou não protegidos.
Os compostos da invenção são preparados como um isômerosimples (p.ex., enantiômero, cis-trans, posicionai,diastereômero) ou como uma mistura de isômeros. Em umaconfiguração preferida, os compostos são preparados comosubstancialmente um isômero simples. Os métodos parapreparar compostos substancialmente isomericamente purossão conhecidos na técnica. Por exemplo, misturasenantiomericamente enriquecidas e compostosenantioméricos puros podem ser preparados usandointermediários sintéticos que sejam enantiomericamentepuros em combinação com reações que deixem aestequiometria em um centro quiral inalterada ou resultemem sua completa inversão. Alternativamente, o produtofinal ou intermediários ao longo da rota sintética podemser resolvidos em um estereoisômero simples. As técnicaspara inverter ou deixar inalterado um particular centroestéreo, e aquelas para resolver misturas deestereoisômeros são bem conhecidas na arte e estão bemdentro da capacidade de alguém de experiência na arte deescolher e método apropriadado para uma particularsituação. Veja, geralmente, Furniss e outros (eds.),V0GEL'S ENCYCL0PEDIA OF PRACTICAL ORGANICA CHEMISTRY[Enciclopédia de química orgânica prática de Vogel] 5aEd., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991,págs. 809-816; e Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990).
LIGANTES
A presente invenção prove conjugados de fármaco-liganteonde o fármaco está ligado ao ligante através de umligante químico incluindo, mas não limitado a, aquelesdivulgados no pedido de patente U.S. série n° 11/134.826e pedidos de patentes U.S. provisórias de séries nos60/572.667 e 60/661.174, todos os quais são aquiincorporados por referência. 0 ligante é ou um ligante depeptidila, hidrazina, ou dissulfeto, e é representadoaqui como (L4)p-F-(L1)m, (L4)p-H-(L1)m, ou (L4)p-T-(L1)m,respectivamente. Em adição aos ligantes como sendoligados ao fármaco, a presente invenção também provêbraços de ligantes cliváveis que são apropriados paraligação a essencialmente quaisquer espécies moleculares.
O aspecto de braço de ligante da invenção é exemplificadoaqui por referência à sua ligação a uma parcelaterapêutica. Será, entretanto, prontamente aparenteàqueles experientes na técnica que os ligantes podem serligados a diversas espécies incluindo, mas não limitadasa, agentes de diagnóstico, agentes analíticos,biomoléculas, agentes direcionadores, rótulos detectáveise similares.
Em um aspecto, a presente invenção relaciona-se comligantes que são úteis para ligar grupos direcionadores aagentes terapêuticos e marcadores. Em um outro aspecto, ainvenção provê ligantes que impõem estabilidade acompostos, reduzem sua toxicidade in vivo, ou de outraforma afetam favoravelmente sua farmacocinética,biodisponibilidade e/ou farmacodinâmica. É geralmentepreferido que em tais configurações o ligante sejaclivado, liberando o fármaco ativo, uma vez que o fármacoé entregue a seu sítio de ação. Assim, em umaconfiguração da invenção, os ligantes da invenção são semtraço, tal que uma vez removidos do agente terapêutico oumarcador (tal como durante a ativação), nenhum traço dapresença dos ligantes permanece.
Em uma outra configuração da invenção, os ligantes sãocaracterizados por sua capacidade para serem clivados emum sítio nas ou próximo das células alvo tal como o sítiode ação terapêutica ou atividade de marcador. Talclivagem pode ser de natureza enzimática. Estacaracterística auxilia a reduzir a ativação sintética doagente terapêutico ou marcador, reduzindo a toxicidade eefeitos laterais sistêmicos. Grupos cliváveis preferidospara a clivagem enzimática incluem ligações peptídicas,ligações éster, e ligações de dissulfeto. Em outrasconfigurações, os ligantes são sensíveis ao pH e sãoclivados por mudanças de pH.
Um aspecto importante da presente invenção é a capacidadepara controlar a velocidade com a qual os ligantes seclivam. Por exemplo, os ligantes de hidrazina descritosaqui são particularmente úteis porque, dependendo de qualparticular estrutura é usada, pode-se variar a velocidadena qual o ligante cicliza e dessa forma cliva o fármacodo ligante. O WO 02/096910 fornece vários complexosespecíficos ligante-fármaco tendo um ligante dehidrazina. Entretanto, não existe modo para "ajustar" acomposição do ligante dependendo da taxa de ciclizaçãorequerida, e os particulares compostos descritos clivam oligante do fármaco em uma taxa mais lenta do que épreferido para muitos conjugados de fármaco-ligante. Emcontraste, os ligantes de hidrazina da presente invençãofornecem uma faixa de taxas de ciclização, a partir demuito rápica até muito lenta, permitindo assim a seleçãode um particular ligante de hidrazina baseado na desejadataxa de ciclização. Por exemplo, ciclização muito rápidapode ser conseguida com ligantes de hidrazina queproduzam um anel de 5 membros com a clivagem. As taxaspreferidas de ciclização para fornecimento direcionado deum agente citotóxico a células são conseguidas usandoligantes de hidrazina que produzam, com a clivagem, doisanéis de 5 membros ou um anel único de 6 membrosresultantes de um ligante tendo dois metilas na posiçãogeminal. O efeito gem-dimetila foi mostrado a acelerar ataxa da reação de ciclização se comparado com um anelúnico de 6 membros sem os dois metilas na posiçãogeminal. Isto resulta da cepa ser aliviada no anel.Algumas vezes, entretanto, os substituintes podem reduzira velocidade da reação ao invés de torná-la mais rápida.Freqüentemente as razões para o retardamento podem sertraçadas quanto ao impedimento estérico. Como mostrado noExmeplo 2.4, a substituição com gem dimetila permite umareação de ciclização muito mais rápida ocorrer secomparada com quando o carbono geminal é um CH2.É importante notar, entretanto, que em algumasconfigurações, um ligante que cliva mais lentamente podeser preferido. Por exemplo, em uma formulação deliberação sustentada ou em uma formulação com umcomponente de tanto liberação rápida quanto um deliberação lenta, pode ser útil prover um ligante queclive mais lentamente. Em certas configurações, uma taxalenta de ciclização é conseguida usando um ligante dehidrazina que produza, com a clivagem, ou um anel únicode 6 membros, sem a substituição gem-dimetila, ou um anelúnico de 7 membros.
Os ligantes também servem para estabilizar o agenteterapêutico ou marcador contra a degradação enquanto emcirculação. Esta característica provê um benefíciosignificativo uma vez que tal estabilização resulta emprolongar a meia-vida de circulação do agente ou marcadorligado. O ligante também serve para atenuar a atividadedo agente ou marcador ligado tal que o conjugado sejarelativamente benigno enquanto em circulação e tenha oefeito desejado, por exemplo seja tóxico, após ativaçãono sítio desejado de ação. Para conjugados de agenteterapêutico, esta característica do ligante serve paramelhorar o índice terapêutico do agente.
Os grupos estabilizantes são preferivelmente selecionadospara limitar a liberação e metabolismo do agenteterapêutico ou marcador por enzimas que podem estarpresentes no sangue ou tecido não alvo e sãoadicionalmente selecionados para limitar o transporte doagente ou marcador para dentro das células. Os gruposestabilizantes servem para bloquear a degradação doagente ou marcador e também podem atuar para proveroutras características físicas do agente ou marcador. 0grupo estabilizante também pode melhorar a estabilidadedo agente ou marcador durante a estocagem em uma formaformulada ou não formulada.
Idealmente, o grupo estabilizante é útil para estabilizarum agente terapêutico ou marcador se ele servir paraproteger o agente ou marcador de degradação quantotestado quanto à estocagem do agente ou marcador nosangue humano por 370C por 2 horas e resultar em menosque 20%, preferivelmente menos que 10%, maispref erivelmente menos que 5% e ainda mais preferivelmentemenos que 2%, de clivagem do agente ou marcador pelasenzimas presentes no sangue humano sob as dadas condiçõesde ensaio.
A presente invenção também se relaciona com conjugadoscontendo estes ligantes. Mais particularmente, a invençãose relaciona com pró-fármacos que podem ser usados para otratamento de doença, especialmente para quimioterapia decâncer. Especificamente, o uso dos ligantes descritosaqui fornece pró-fármacos que exibem uma altaespecificidade de ação, uma toxicidade reduzida, e umaestabilidade melhorada em sangue em relação a pró-fármacos de estrutura similar.
Os ligantes da presente invenção como descritos aquipodem estar presentes em qualquer posição dentro doconjugado citotóxico.
Assim, é provido um ligante que pode conter qualquer deuma variedade de grupos como parte de sua cadeia que seclivarão in vivo, p.ex., na corrente sangüínea em umataxa que é intensificada em relação àquela de construçõesque carecem de tais grupos. Também são providosconjugados dos braços de ligantes com agentesterapêuticos e de diagnóstico. Os ligantes são úteis paraformar análogos de pró-fármacos de agentes terapêuticos epara reversivelmente ligar um agente terapêutico ou dediagnóstico a um agente direcionador, um rótulodetectável, ou um suporte sólido. Os ligantes podem serincorporados em complexos que incluem as citotoxinas dainvenção.
Em adição ao grupo de peptídeo, hidrazina, ou dissulfetoclivável, um ou mais grupos de ligante de auto-sacrifícioL1 são opcionalmente introduzidos entre a citotoxina e oagente direcionador. Estes grupos ligantes também podemser descritos como grupos espaçadores e contêm pelo menosdois grupos funcionais reativos. Tipicamente, umafuncionalidade química do grupo espaçador se liga a umafuncionalidade química do agente terapêutico, p.ex.,citotoxina, enquanto a outra funcionalidade química dogrupo espaçador é usada para se ligar a umafuncionalidade química do agente direcionador ou liganteclivável. Exemplos de funcionalidades químicas de gruposespaçadores incluem grupos hidróxi, mercapto, carbonila,carboxi, amino, cetona, e mercapto.
Os ligantes de auto-sacrifício, representados por L1 sãogeralmente alquila substituído ou não substituído, arilasubstituído ou não substituído, heteroarila substituídoou não substituído ou um grupo heteroalquila substituídoou não substituído. Em uma configuração, os gruposalquila ou arila podem compreender entre 1 e 20 átomos decarbono. Eles também podem compreender uma parcela depolietileno glicol.
Grupos espaçadores exemplares incluem, por exemplo, 6-aminohexanol, 6-mercaptohexanol, ácido 10-hidroxidecanóico, glicina e outros aminoácidos, 1,6-hexanodiol, β-alanina, 2-aminoetanol, cisteamina(e-aminoetanotiol) , ácido 5-aminopentanóico, ácido 6-aminohexanóico, ácido 3-maleimidobenzóico, ftaleto,ftaletos α-substituídos, o grupo carbonila, aminalésteres, ácidos nucléicos, peptídeos e similares.O espaçador pode servir para introduzir massa molecularadicional e funcionalidade química no complexo decitotoxina-agente direcionador. Geralmente, a massa efuncionalidade adicionais afetarão a meia-vida do soro eoutras propriedades do complexo. Portanto, mediantecuidadosa seleção de grupos espaçadores, complexos decitotoxina com uma faixa de meias-vidas do soro podem serproduzidos.
0(s) espaçador(es) localizado(s) diretamente adjacente àparcela de fármaco também é denotado como (L1)m, onde m éum número inteiro selecionado deO, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
Quando múltiplos espaçadores L1 estão presentes,espaçadores idênticos ou diferentes podem ser usados. L1pode ser qualquer grupo de auto-sacrif ício. Em umaconfiguração, L1 é preferivelmente um alquilasubstituído, alquila não substituído, heteroalquilasubstituído, e heteroalquila nsv, heterocicloalquila nãosubstituído, e heterocicloalquila substituído. Quando oconjugado de fármaco-ligante compreende um ligante dehidrazina, L1 não compreende uma ligação de dissulfeto.L4 é uma parcela de ligante que impõe propriedades desolubilidade aumentada ou agregação reduzida a conjugadosutilizando um ligante que contém a parcela. 0 ligante L4não tem que ser de auto-sacrif ício. Em uma configuração,a parcela L4 é alquila substituído, alquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroalquila substituído, ou heteroalquila nãosubstituído, qualquer um dos quais pode ser reto,ramificado ou cíclico. As substituições podem ser, porexemplo, um alquila, alcoxi, alquiltio, alquilamino, oudialquilamino inferior (C1-C6). Em certas configurações,L4 compreende uma parcela não cíclica. Em uma outraconfiguração, L4 compreende qualquer polímero deaminoácido carregado positivamente ou negativamente, talcomo pollilisina ou poliargenina. L4 pode compreender umpolímero tal como uma parcela de polietileno glicol.
Adicionalmente o ligante L4 compreende, por exemplo,tanto um componente polimérico quanto uma parcela químicapequena.
Em uma configuração preferida, L4 compreende uma parcelade polietileno glicol (PEG). A porção PEG de L4 pode terentre 1 e 50 unidades de comprimento. Preferivelmente, oPEG terá 1-12 unidades repetidas, mais preferivelmente 3-12 unidades repetidas, mais preferivelmente 2-6 unidadesrepetidas, ou até mesmo mais preferivelmente 3-5 unidadesrepetidas e o mais preferivelmente 4 unidades repetidas.L4 pode consistir unicamente da parcela EG, ou ele tambémpode conter um adicional alquila ou heteroalquilasubstituído ou não substituído. É útil combinar PEG comoparte da parcela L4 para intensificar a solubilidade emágua do complexo. Adicionalmente, a parcela PEG reduz ograu de agregação que pode ocorrer durante a conjugaçãodo fármaco com o anticorpo.(1) Ligantes de peptídeo (F)
Como discutido acima, os ligantes de peptidila dainvenção podem ser representados pela fórmula geral:(L4)p—F—(L1)m, onde F representa a porção ligantecompreendendo a parcela de peptidila. Em umaconfiguração, a porção F compreende um(ns) ligante(s) deauto-sacrifício adicional(is) opcional(is) , L2f e umgrupo carbonila. Em uma outra configuração, a porção Fcompreende um grupo amino e um(ns) grupo(s) espaçador(es)opcional(is) , L3 .
Conseqüentemente, em uma configuração, o conjugadocompreendendo o ligante de peptidila compreende umaestrutura da Fórmula 4:
<formula>formula see original document page 56</formula>
Nesta configuração, L1 é um ligante de auto-sacrif ício,como descrito acima, e L4 é uma parcela que impõepropriedades de solubilidade aumentada, ou de agregaçãoreduzida, como descrito acima. L2 representa um(ns)ligante (s) de auto-sacrif ício. m é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou6; o e ρ são independentemente 0 ou 1. Em umaconfiguração, m é 3, 4, 5, ou 6. AA1 representa um oumais aminoácidos naturais, e/ou α-aminoácidos nãonaturais; c é um número inteiro entre 1 e 20.
Nos ligantes de peptídeo da invenção da Fórmula 4 acima,AA1 é ligado, em seu término amino, diretamente a L4 ou,quando L4 está ausente, diretamente ao grupo X4 (isto é,o agente direcionador, rótulo detectável, grupo funcionalreativo protegido ou grupo funcional reativo nãoprotegido). Em algumas configurações, quando L4 estápresente, L4 não compreende um grupo acil carboxílicoligado diretamente ao término N de (AA1)c. Portanto, nãoé necessário nestas configurações existir uma unidadeacil carboxílica diretamente entre L4 ou X4 e AA1, como énecessário nos ligantes peptídicos da patente U.S. n°6.214.345.
Em uma outra configuração, o conjugado compreendendo oligante de peptidila compreende uma estrutura da Fórmula 5 :
<formula>formula see original document page 57</formula>
Nesta configuração, L4 é uma parcela que impõepropriedades de solubilidade aumentada, ou agregaçãoreduzida, como descrito acima; L3 é um grupo espaçadorcompreendendo uma amina primária ou secundária ou umgrupo com funcionalidade de carboxila, e ou a amina de L3forma uma ligação amida com um grupo com funcionalidadede carboxila pendente de D ou a carboxila de L3 forma umaligação amida com um grupo com funcionalidade de aminapendente de D; e o e ρ são independentemente 0 ou 1. AA1representa um ou mais aminoácidos naturais, e/ou a-aminoácidos não naturais; c é um número inteiro entre 1 e20. Nesta configuração, L1 está ausente (isto é, m é 0 nafórmula geral).
Nos ligantes de peptídeo da invenção da Fórmula 5 acima,AA1 é ligado em seu término amino, ou diretamente a L4ou, quando L4 está ausente, diretamente ao grupo X4 (istoé, o agente direcionador, rótulo detectável, grupofuncional reativo protegido ou grupo funcional reativonão protegido). Em algumas configurações, quando L4 estápresente, L4 não compreende um grupo acil carboxílicoligado diretamente ao término N de (AA1)c. Portanto, nãoé necessário nestas configurações existir uma unidadeacil carboxílica entre ou L4 ou X4 e AA1, como énecessário nos ligantes de peptídeo da patente U.S. n°6 .214 . 345 .
O ligante de auto-sacrifício L2
O ligante de auto-sacrifício L2 é uma parcela químicabifuncional que é capaz de covalentemente ligar juntasduas parcelas químicas espaçadas em uma moléculatripartite normalmente estável, liberando uma das citadasparcelas químicas da molécula tripartite por meio declivagem enzimática do restante da molécula para liberara outra das citadas parcelas químicas espaçadas. Deacordo com a presente invenção, o espaçador de auto-sacrifício é covalentemente ligado em uma de suasextremidades à parcela de peptídeo e covalentementeligado em sua outra extremidade ao sítio reativo químicoda parcela de fármaco cuja derivação inibe a atividadefarmacológica, de modo a espaçar e covalentemente ligar aparcela de peptídeo e a parcela de fármaco em umamolécula tripartite que seja estável e farmacologicamenteinativa na ausência da enzima alvo, mas que sejaenzimaticamente clivável por tal enzima alvo na ligaçãocovalentemente ligando a parcela de espaçador e a parcelade peptídeo para desse modo efetuar a liberação daparcela de peptídeo da molécula tripartite. Tal clivagemenzimática, por sua vez, ativará o caráter de auto-sacrifício da parcela de espaçador e iniciará a clivagemespontânea da ligação covalentemente ligando a parcela deespaçador à parcela de fármaco, para dessa forma efetuara liberação do fármaco em forma farmacologicamente ativa.
O ligante de auto-sacrifíco L2 pode ser qualquer grupo deauto-sacrifício. Preferivelmente L2 é um alquilasubstituído, alquila não substituído, heteroalquilasubstituído, heteroalquila não substituído,heterocicloalquila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, arila substituído e não substituído, eheteroarila substituído e não substituído.
Um espaçador de auto-sacrifício particularmente preferidoL2 pode ser representado pela fórmula 6:
<formula>formula see original document page 59</formula>
0 anel aromático do grupo aminobenzila pode sersubstituído com um ou mais grupos "K". Um grupo "K" é umsubstituinte no anel aromático que substitui umhidrogênio de outra forma ligado a um dos quatro carbonosnão substituídos que são parte da estrutura do anel. 0grupo "K" pode ser um átomo único, tal como um halogênio,ou pode ser um grupo multiátomo, tal como alquila,heteroalquila, amino, nitro, hidróxi, alcoxi,haloalquila, e ciano. Cada K e independentementeselecionado do grupo consistindo de alquila substituído,alquila não substituído, heteroalquila substituído,heteroalquila não substituído, arila substituído, arilanão substituído, heteroarila substituído, heteroarila nãosubstituído, heterocicloalquila substituído,hetrocicloalquila não substituído, halogênio, NO2,NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, 0C0R21, e OR21, onde R21 e R22são selecionados independentemente do grupo consistindode H, alquila substituído, alquila não substituído,heteroalquila substituído, heteroalquila não substituído,arila substituído, arila não substituído, heteroarilasubstituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído e hetrocicloalquila nãosubstituído. Substituintes K exemplares incluem, mas nãoestão limitados a, F, Cl, Br, I, NO2, 0H, OCH3, NHCOCH3,N(CH3)2, NHCOCF3 e metila. Para "Ka" , a é um númerointeiro de 0, 1, 2, 3, ou 4. Em uma configuraçãopreferida, a é 0.
O átomo de oxigênio de éter da estrutura mostrada acimaestá conectado a um grupo carbonila. A linha dafuncionalidade NR24 no anel aromático indica que afuncionalidade amina pode ser ligada a qualquer dos cincocarbonos que tanto formam o anel quanto não sãosubstituídos pelo grupo -CH2-O-. Preferivelmente, afuncionalidade de NR24 de X está covalentemente ligada aoanel aromático na posição para em relação ao grupo -CH2-O- . R24 é um membro selecionado do grupo consistindo deH, alquila substituído, alquila não substituído,heteroalquila substituído, e heteroalquila nãosubstituído. Em uma configuração específica, R24 éhidrogênio.
Em uma configuração preferida, a invenção provê umligante de peptídeo de fórmula (4) acima, onde Fcompreende a estrutura:
<formula>formula see original document page 60</formula>
onde
R24 é selecionado do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, heteroalquilasubstituído, e heteroalquila não substituído;Cada K é um membro independentemente selecionado do grupoconsistindo de alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalquila nãosubstituído, halogênio, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22,<formula>formula see original document page 61</formula>
sendo que
R21 e R22 são selecionados independentemente do grupoconsistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalquila nãosubstituído; e
a é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, ou 4.
Em uma outra configuração, o ligante de pepetídeo defórmula (4) acima compreende um -F-(L1)m- que compreendea estrutura:
<formula>formula see original document page 61</formula>
onde
cada R24 é um membro independentemente selecionado dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído.
O grupo espaçador L3
O grupo espaçador L3 é caracterizado pelo fato delecompreender uma amina primária ou secundária ou um grupocom funcionalidade de carboxila, e ou a amina do grupo L3forma uma ligação amida com um grupo com funcionalidadede carboxila pendente de D ou o carboxila de L3 forma umaligação amida com um grupo com funcionalidade de amina deD. L3 pode ser selecionado do grupo consistindo de umalquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, arila substituído ou nãosubstituído, heteroarila substituído ou não substituído,ou heterocicloalquila substituído ou não substituído. Emuma configuração preferida, L3 compreende um grupoaromático. Mais preferivelmente, L3 compreende um grupode ácido benzóico, um grupo de anilina ou grupo de indol.
Exemplos não limitantes de estruturas que podem servircomo um espaçador -L3-NH- incluem as seguintesestruturas:
onde Z é um membro selecionado de O, S, NR23, eonde R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila esubstituído ou não substituído, e acila.
Com a clivagem do ligante da invenção contendo L37 aparcela L3 permanece ligada ao fármaco D.Conseqüentemente, a parcela L3 é escolhida tal que suapresença ligada a D não altere significativamente aatividade de D. Em uma outra configuração, uma porção dopróprio fármaco D funciona como o espaçador L3. Porexemplo, em uma configuração, o fármaco, D, é um derivadode duocarmicina no qual uma porção do fármaco funcionacomo o espaçador L3. Exemplos não limitantes de taisconfigurações incluem aqueles nos quais NH2- (L3)-D temuma estrutura selecionada do grupo consistindo de:
<formula>formula see original document page 63</formula>
onde Z é um membro selecionado de 0, Se NR23,onde R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, e acila; e
onde o grupo NH2 em cada estrutura reage com (AA1)c paraformar -(AA1)c para formar -(AA1)-NH-
A seqüência de peptídeos AA1
0 grupo AA1 representa um único aminoácido ou umapluralidade de aminoácidos que são unidos entre si porligações amida. Os aminoácidos podem ser aminoácidosnaturais e/ou α-aminoácidos não naturais.
A seqüência de peptídeos (AA1)c é funcionalmente oresíduo da amidificação de um único aminoácido (onde c =1) ou de uma pluralidade de aminoácidos unidos entre sipor ligações amida. O peptídeo da presente invenção éselecionado para direcionar a clivagem catalisada porenzima do peptídeo por uma enzima em um local deinteresse em um sistema biológico. Por exemplo, paraconjugados que são direcionados a uma célula usando umagente direcionador, e então tomados pela célula, umpeptídeo é escolhido o qual é clivado por uma ou maisproteases lisossomais tal que o peptídeo seja clivadointracelularmente dentro do lisossomo. 0 número deaminoácidos dentro do peptídeo pode variar de 1 a 20; masmais preferivelmente existirão 2-8 aminoácidos, 2-6aminoácidos ou 2, 3 ou 4 aminoácidos compreendendo(AA1)c. As seqüências de peptídeos que são suscetíveis aclivagem por enzimas ou classes de enzimas específicassão bem conhecidas na técnica.
Muitas seqüências de peptídeos que são clivadas porenzimas no soro, fígado, intestinos, etc. são conhecidasna técnica. Uma seqüência de peptídeo exemplar dainvenção inclui uma seqüência de peptídeo que é clivadapor uma protease. 0 foco da discussão que segue sobre ouso de uma seqüência sensível à protease é para clarezade ilustração e não serve para limitar o escopo dapresente invenção.
Quando a enzima que cliva o peptídeo é uma protease, oligante geralmente inclui um peptídeo contendo umaseqüência de reconhecimento de clivagem para a protease.Uma seqüência de reconhecimento de clivagem para umaprotease é uma seqüência de aminoácido específicareconhecida pela protease durante a clivagemproteolítica. Muitos sítios de clivagem por protease sãoconhecidos na técnica, e estes e outros sítios declivagem podem ser incluídos na parcela de ligante. Veja,p.ex., Matayoshi e outros Science 247:954 (1990); Dunn eoutros Meth Enzymol. 241:254 (1994); Seidah e outrosMeth. Enzymol. 244:175 (1994); Thomberry, Meth Enzymol.244:615 (1994); Weber e outros Meth. Enzimol. 244:595(1994); Smith e outros Meth. Enzymol. 244:4121 (1994);Bouvier e outros Meth. Enzymol. 248:614 (1995), Hardy eoutros, em AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT.AGING, AND ALZHEIMERrS DISEASE [Precursor de proteínaamilóide no desenvolvimento, envelhecimento, e doença deAlzheimer], ed. Master e outros, págs. 190-198 (1994).
Os aminoácidos da seqüência de peptídeos (AA1)c sãoescolhidos baseados em sua adequabilidade para a clivagemenzimática seletiva por moléculas particulares tais comoprotease associada a tumor. Os aminoácidos usados podemser aminoácidos naturais ou não naturais. Eles podemestar na configuração L ou D. Em uma configuração, pelomenos três diferentes aminoácidos são usados. Em umaoutra configuração, somente dois aminoácidos são usados.
Em uma configuração preferida, a seqüência de peptídeo(AA1)c é escolhida baseada em sua capacidade para serclivada por uma protease lisossomal, exemplos nãolimitantes da qual incluem catepsinas B, C, D, H, L e S.
Preferivelmente, a seqüência de peptídeo (AA1)c é capazde ser clivada por catepsina B in vivo, o que pode sertestado usando ensaios de clivagem por protease in vitroconhecidos na técnica.
Em uma outra configuração, a seqüência de peptídeo (AA1)cé escolhida baseada em sua capacidade para ser clivadapor uma protease associada a tumor, tal como uma proteaseque é encontrada extracelularmente na vizinhança decélulas tumorais, exemplos não limitantes das quaisincluem timet oligopeptidase (TOP) e CDlO. A capacidadede um peptídeo para se clivado por TOP ou CDlO pode sertestada usando ensaios de clivagem por protease in vitroconhecidos na técnica.
Exemplos adequados, mas não limitantes, de seqüências depeptídeos adequadas para uso nos conjugados da invençãoincluem Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-ARg, Phe-Phe-Lyx, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (ID SEQ n° 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (ID SEQ n° 2) eGly-Phe-Leu-Gly (ID SEQ n° 3) . As seqüências de peptídeopreferidas são Val-Cit e Val-Lys.
Em uma outra configuração, o aminoácido localizado o maispróximo à parcela de fármaco é selecionado a partir dogrupo consistindo de: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu,Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, eVai. Em ainda uma outra configuração, o aminoácidolocalizado o mais próximo da parcela de fármaco éselecionado do grupo consistindo de: Ala, Asn, Asp, Cys,Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, e Val.
Proteases têm estado implicadas em metástases de câncer.
A síntese aumentada de uroquinase protease foicorrelacionada com uma capacidade aumentada parametastatizar em muitos cânceres. A uroquinase ativa oplasmin do plaminógeno, o qual está onipresentementelocalizado no espaço extracelular e sua ativação podeprovocar a degradação das proteínas na matrizextracelular através da qual as células de tumormetastatizantes invadem. Plasmin também pode ativar ascolagenases promovendo assim a degradação do colágeno namembrana basal circundando as capilaridades e sistemalinfático permitindo assim células tumorais invadirem ostecidos alvo (Dano e outros, Adv. Câncer. Res., 44:139(1985)). Portanto, está dentro do escopo da presenteinvenção utilizar como um ligante uma seqüência depeptídeo que seja clivada por uroquinase.
A invenção também provê o uso de seqüências de peptídeoque são sensíveis a clivagem por triptases. Mastócitoshumanos expressam pelo menos quatro triptases distintas,designadas α, βI, βΙΙ, e βΙΙΙ. Estas enzimas não sãocontroladas por inibidores de proteinase do plasma dosangue e somente clivam uns poucos substratosfisiológicos in vitro. A família de triptase de proteasesde serina esteve implicada em uma variedade de doençasalérgicas e inflamatórias envolvendo mastócitos por causados elevados níveis de triptase encontrados em fluidosbiológicos de pacientes com estes distúrbios. Entretanto,o papel exato de triptase na patofisiologia de doençaainda deve ser delineado. 0 escopo de funções biológicase conseqüências biológicas correspondentes de triptasesão substancialmente definidos por sua especificidade desubstrato.
Triptase é uma potente ativadora de ativador deplasminógeno pró-uroquinase (uPA), a forma zimogena deuma protease associada com metástase e invasão tumoral. Aativação de cascata de plasminogenos, resultando nadestruição de matriz extracelular para o extravasamento emigração, pode ser uma função de ativação de triptase deativador de plasminógeno pró-uroquinase na seqüência P4-Pl de Pro-Arg-Phe-Lys (ID SEQ n° 4) (Stack e outros,Journal of Biological Chemistry [Revista de químicabiológica] 269:9416-9419 (1994)). Peptídeo intestinalvasoativo, um neuropeptídeo que está implicado naregulação de permeabilidade vascular, também é clivadopor triptase, primariamente na seqüência Thr-Arg-Leu-Arg(ID SEQ n° 5) (Tam e outros, Am. J. Respir. Cell Mol.Biol. 3: 27-32 (1990)). 0 receptor PAR-2 acoplado àproteína G pode ser clivado e ativado por triptase naseqüência Ser-Lys-Gly-Arg (ID SEQ n° 6) para acionar aproliferação de fibroblastos, enquanto o receptor PAR-Iativado por trombina é inativado por triptase naseqüência Pro-Asn-Asp-Lys (ID SEQ n° 7) (Molino e outros,Journal of Biological Chemistry 272(7): 4043-4049(1997)). Tomada junta, esta evidência sugere um papelcentral para triptase em remodelagem de tecido como umaconseqüência de doença. Isto é consistente com asprofundas mudanças observadas em vários distúrbiosmediados por mastócitos. Um marco de asma crônica eoutras doenças respiratórias de longo prazo é fibrose eespessamento dos tecidos subjacentes que poderia ser oresultado da ativação de triptase de seus alvosfisiológicos. Similarmente, uma série de relatórios têmmostrado a angiogenes a estar associada com densidade demastócitos, atividade de triptase e prognose fraca em umavariedade de cânceres (Coussens e outros, Genes andDevelopment [Genes e desenvolvimento] 13(11): 1382-97(1999)); Takanami e outros, Câncer 88 (12): 2686-92(2 000); Toth-Jakatics e outros, Human Pathology[Patologia humana] 31(8): 955-960 (2000); Ribatti eoutros, International Journal of Câncer [Revistainternacional de câncer] 85(2): 171-5 (2000)).
Métodos são conhecidos na técnica para avaliar se umaparticular protease cliva uma seqüência de pepetídeoselecionada. Por exemplo, o uso de substratos de peptídeofluorogênico de 7-amino-4-metil cumarina (AMC) é ummétodo bem estabelecido para a determinação deespecificidade de protease (Zimmerman, M, e outros (1977)Analytical Biochemistry [Bioquímica analítica] 78:47-51).A clivagem específica da ligação anilida libera o grupopartindo de AMC fluorogênico permitindo a determinaçãosimples de taxas de clivagem para substratos individuais.Mais recentemente, séries (Lee, D. e outros (1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters [Cartas dequímica bioorgânica e medicinal] 9:1667-72) e bibliotecasde varredura posicionai (Rano, T.A. e outros (1997)Chemistry and Biology [Química e biologia] 4:149-55) debibliotecas de substrato de peptídeo AMC foram empregadaspara rapidamente perfilar a especificidade do terminal Nde proteases por amostragem de uma ampla faixa desubstratos em um experimento único. Portanto, alguémexperiente na técnica pode prontamente avaliar uma sériede seqüências de peptídeo para determinar sua utilidadena presente invenção sem recorrer à experimentaçãoindevida.
(2) Ligantes de hidrazina (H)Em uma segunda configuração, o conjugado da invençãocompreende um ligante de auto-sacrifício de hidrazina,onde o conjugado tem a estrutura:
<formula>formula see original document page 69</formula>
onde D, L1, L4, e X4 são como definidos acima e descritosadicionalmente aqui,estrutura:
<formula>formula see original document page 69</formula>
onde
ni é um número inteiro de 1-10;Tl2 é 0, 1, OU 2 ;
cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído; e
I é ou uma ligação (isto é, a ligação entre o carbono dacadeia principal e o nitrogênio adajcente) ou :
<formula>formula see original document page 69</formula>
onde n3 é 0 ou 1, com a ressalva que quando n3 for 0, n2não seja 0; e
n4 é 1, 2, ou 3,
sendo que quando I for uma ligação, ni é 3 e n2 é 1, Dnão pode seronde R é Me ou CH2-CH2-NMe2.
Em uma configuração, a substituição no anel fenila é umapara substituição. Em configurações preferidas, n1 é 2,3, ou 4 ou ni é 3. Em configurações preferidas, n2 é 1.
Em configurações preferidas, I é uma ligação (isto é, aligação entre o carbono da cadeia principal e onitrogênio adjacente). Em um aspecto, o ligante dehidrazina, H, pode formar um ligante de auto-sacrifíciode 6 membros com a clivagem, por exemplo, quando n3 for Oe n4 for 2. Em um outro aspecto, o ligante de hidrazina,H, pode formar dois ligantes de auto-sacrifício de 5membros com a clivagem. Em ainda outros aspectos, H formaum ligante de auto-sacrif ício de 5 membros, H forma umligante de auto-sacrifício de 7 membros, ou H forma umligante de auto-sacrifício de 5 membros e um ligante deauto-sacrif ício de 6 membros, com a clivagem. A taxa declivagem é afetada pelo tamanho do anel formado durante aclivagem. Assim, dependendo da taxa de clivagem desejada,um anel de tamanho apropriado a ser formado com aclivagem pode ser selecionado.
Ligantes de hidrazina de cinco membros
Em uma configuração, o ligante de hidrazina compreende umligante de hidrazina de 5 membros, onde H compreende aestrutura:<formula>formula see original document page 71</formula>
Em uma configuração preferida, n1 é 2, 3, ou 4. Em umaoutra configuração preferida, ni é 3. Na estrutura acima,cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído. Em uma configuração, cada R24 éindependentemente H ou um alquila C1-C6. Em uma outraconfiguração, cada R24 é indendentemente H ou um alquilaC1-C6, mais pref erivelmente H ou CH3. Em uma outraconfiguração, pelo menos um R24 é um grupo metila. Em umaoutra configuração, cada R24 ê H. Cada R24 é selecionadopara modelar os efeitos estéricos dos compostos e paraalterar a solubilidade.
Os ligantes de hidrazina de 5 membros podem passar poruma ou mais reações de ciclização que separam o fármacodo ligante, e podem ser descritos, por exemplo, por:
<formula>formula see original document page 71</formula>
Uma rota sintética exemplar para preparar um ligante decinco membros da invenção é:<formula>formula see original document page 72</formula>
O DMDA protegido por Cbz b é reagido com ácido 2,2-dimetil-malônico a em uma solução com cloreto de tionilapara formar um ácido Cbz-DMDA-2,2-dimetilmalônico c. 0composto c é reagido com Boc-N-metil hidrazina d napresença de hidrogênio para formar DMDA-2,2-dimetilmalônico-Boc-N-metilhidrazina e.
Ligantes de hidrazina de seis membros
Em uma outra configuração, o ligante de hidrazinacompreende um ligante de hidrazina de 6 membros, onde Hcompreende a estrutura:
<formula>formula see original document page 72</formula>
Em uma configuração preferida, ηχ é 3. Na estruturaacima, cada R24 é um membro selecionado independentementedo grupo consistindo de H, alquila substituído, alquilanão substituído, heteroalquila substituído, eheteroalquila não substituído. Em uma configuração, cadaR24 é independentemente H ou um alquila C1-C6. Em umaoutra configuração, cada R24 é independentemente H ou umalquila C1-C3, mais preferivelmente H ou CH3. Em uma outraconfiguração, pelo menos um R24 é um grupo metila. Em uma24 é Η. Cada R24 é selecionado
outra configuração, cada Rpara preparar os efeitos estéricos dos compostos e paraalterar solubilidade. Em uma configuração preferida, Hcompreende a estrutura:
<formula>formula see original document page 73</formula>
Em uma configuração, H compreende uma substituição dedimetila geminal. Em uma configuração da estrutura acima,cada R24 é independentemente um H ou um alquilasubstituído ou não substituído.
Os ligantes de hidrazina de 6 membros passarão por umareação de ciclização que separa o fármaco do ligante, epode ser descrita como:
<formula>formula see original document page 73</formula>
Uma rota sintética exemplar para preparar um ligante deseis membros da invenção é:
<formula>formula see original document page 73</formula>
A dimetil alanina a protegida com Cbz em solução comdiclorometano, foi reagida com HOAt, e CPI para formaruma dimetilalanina hidrazina b protegida com Cbz. Ahidrazina b é desprotegida pela ação de metanol, formandoo composto c.
Outros ligantes de hidrazina
É contemplado que a invenção compreenda um ligante tendosete membros. Este ligante provavelmente não ciclizariatão rapidamente quanto os ligantes de cinco ou seismembros, mas isto pode ser preferido para algunsconjugados de fármaco-ligante. Similarmente, o ligante dehidrazina pode compreender dois anéis de seis membros ouum ligante de hidrazina tendo um produto de ciclização deseis membros e um de cinco. Um ligante de cinco e setemembros bem como um ligante de seis e sete membros tambémsão contemplados.
Uma outra estrutura de hidrazina, H tem a fórmula:
<formula>formula see original document page 74</formula>
onde q e O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; e
cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído. Esta estrutura de hidrazina também podeformar anéis de cinco, seis, ou sete membros ecomponentes adicionais podem ser adicionais para formarmúltiplos anéis.
(3) Ligantes de dissulfeto (J)
Em ainda uma outra configuração, o ligante compreende umgrupo dissulfeto clivável enzimaticamente. Em umaconfiguração, a invenção prove um composto citotóxico defármaco-ligante tendo uma estrutura de acordo com aFórmula 3:
<formula>formula see original document page 74</formula>
onde D, L1, L4, e X4 são como definidos acima e descritosadicionalmente aqui, e J é um ligante de dissulfetocompreendendo um grupo tendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 75</formula>
onde
cada R24 é um membro selecionado independentemente dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, e heteroalquilanão substituído;
cada K é um membro selecionado independentemente do grupoconsistindo de alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído, heterocicloalqiula nãosubstituído, halogênio, NO2, NR21R22, NR21COR23, OCONR21R22,OCOR21, e OR21
onde
R21 e R22 são selecionados independentemente do grupoconsistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,hetroarila substituído, heteroarila não substituído,heterocicloalquila substituído e heterocicloalquila nãosubstituído;
a é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, ou 4; ed é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
O anel aromático do ligante de dissulfeto pode sersubstituído com um ou mais grupos "K". Um grupo "K" é umsubstituinte no anel aromático que substitui umhidrogênio de outra forma ligado a um dos quatro carbonosnão substituídos que são parte da estrutura do anel.Ogrupo "K" pode ser um único átomo, tal como um halogênio,ou pode ser um grupo multiátomo, tal como alquila,heteroalquila, amino, nitro, hidróxi, alcoxi,haloalquila, e ciano. Substituintes K exemplares incluemindependentemente, mas não estão limitados a, F, Cl, Br,I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 e metila. Para"Ka", a é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, ou 4. Em umaconfiguração específica, a é 0.
Em uma configuração preferida, o ligante compreende umgrupo de dissulfeto clivável enzimaticamente da seguintefórmula:
<formula>formula see original document page 76</formula>
Nesta configuração, as identidades de L4, X4, p, e R24 saocomo descritas acima, e d é 0, 1, 2, 3uma particular configuração, d é 1 ou 2.
Um ligante de dissulfeto mais específico é mostrado nafórmula abaixo:
<formula>formula see original document page 76</formula>
Um exemplo específico desta configuração é como segue:
<formula>formula see original document page 76</formula>
Preferivelmente, d é 1 ou 2.Um outro ligante de dissulfeto é mostrado na fórmulaabaixo:
<formula>formula see original document page 77</formula>
Um exemplo específico desta configuração é como segue:
<formula>formula see original document page 77</formula>
Preferivelmente7 d é 1 ou 2.
Em várias configurações, os dissulfetos são orto emrelação à amina. Em uma outra configuração específica, aé 0. Em configurações preferidas, R24 é independentementeselecionado de H e CH3.
Uma rota sintética exemplar para preparar um ligante dedissulfeto da invenção é como segue:
<formula>formula see original document page 77</formula>Uma solução de ácido 3-mercaptopropiônico a é reagida comaldritiol-2 para formar iodeto de 3-metil benzotiazoliob. lodeto de 3-metilbenzotiazolio c é reagido comhidróxido de sódio para formar o composto d. Uma soluçãode composto d com metanol é adicionalmente reagida comcomposto b para formar composto e. 0 composto edesprotegido pela ação de cloreto de acetila e metanolformando o composto f.
o conjugado de fármaco-ligante da presente invenção podeopcionalmente conter dois ou mais ligantes. Estesligantes podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, umligante de peptidila pode ser usado para conectar ofármaco ao ligante e um segundo ligante de peptidila podeligar um agente de diagnóstico ao complexo.Alternativamente, qualquer de um ligante de peptidila,hidrazina, ou dissulfeto pode conectar o complexo defármaco e ligante e qualquer de um ligante de peptidila,hidrazina, ou dissulfeto pode ligar um agente dediagnóstico ao complexo. Outros usos para ligantesadicionais incluem agentes analíticos de ligação,biomoléculas, agentes direcionadores, e rótulosdetectáveis para o complexo de fármaco-ligante.Também dentro do escopo da presente invenção estãocompostos da invenção que são espécies poli oumultivalente, incluindo, por exemplo, espécies que sãodímeros, trimeros, tetrâmeros e homólogos superiores doscompostos da invenção ou análogos reativos dos mesmos. Asespécies poli ou multivalente podem ser montadas a partirde espécie única ou mais que uma espécie da invenção. Porexemplo, uma construção dimérica pode ser "homo-dimérica"ou "heterodimérica". Além disso, construções poli emultivalente nas quais um composto da invenção ou umanálogo reativo da mesma, é ligado a uma estrutura detrabalho oligomérica ou polimérica (p.ex., polilisina,dextrano, hidroxietil amido e similares) estão dentro doescopo da presente invenção. A estrutura de trabalho épreferivelmente polifuncional (isto é, tendo um arranjode sítios reativos para ligar compostos da invenção).Além disso, a estrutura de trabalho pode ser derivada comuma espécie única da invenção ou mais que uma espécie dainvenção.
Além do mais, a presente invenção inclui compostos quesão funcionalizados para permitir compostos tendosolubilidade em água que seja intensificada em relação acompostos análogos que não são similarmentefuncionalizados. Portanto, qualquer dos substituintesregistrados aqui pode ser substituído com radicaisanálogos que tenham solubilidade em água intensificada.
Por exemplo, está dentro do escopo da invenção, porexemplo, substituir um grupo hidroxila com um diol, ouuma amina com uma amina quaternária, hidróxi amina ousimilar mais parcela solúvel em água. Em uma configuraçãopreferida, a solubilidade em água adicional é imposta porsubstituição em um sítio não essencial para a atividadeem relação ao canal de íons dos compostos registradosaqui com uma parcela que intensifique a solubilidade emágua dos compostos de origem. Métodos para intensificar asolubilidade em água de compostos orgânicos sãoconhecidos na técnica. Tais métodos incluem, mas nãoestão limitados a, funcionalizar um núcleo orgânico comuma parcela carregada permanentemente, p.ex., amônioquaternário, ou um grupo que é carregado em um pHfisiologicamente relevante, p.ex., ácido carboxílico,amina. Outros métodos incluem, ajuntar ao núcleo orgânicogrupos contendo hidroxila ou amina, p.ex., álcoois,polióis, poliéteres, e similares. Exemplosrepresentativos incluem, mas não estão limitados a,polilisina, polietilenimina, poli(etilenoglicol) epoli(propilenoglicol). Químicas e estratégias defuncionalização adequadas para estes compostos sãoconhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Dunn, R.L. eoutros, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS[Fármacos poliméricos e sistemas de liberação defármacos] , ACS Symposium Series Vol. 469, AmericanChemical Society, Washington, D.C., 1991).
FÁRMACOS
Fármacos, representados como "D" aqui, são providos nacorrente invenção como parte de um conjugado de fármaco-ligante onde o fármaco está ligado através de um ligantede peptidila, ou hidrazina, ou dissulfeto. 0 fármaco devepossuir uma atividade biológica desejada e contém umgrupo funcional reativo para se ligar ao ligante. Aatividade biológica desejada inclui o diagnóstico, cura,abrandamento, tratamento, ou prevenção de doença em umanimal tal como um humano. Portanto, desde que ele tenhao grupo funcional reativo necessário, o termo "fármaco"se refere a produtos químicos reconhecidos como fármacosna Farmacopéia dos Estados Unidos oficial, FarmacopéiaHomeopática dos Estados Unidos oficial, ou ReceituárioNacional oficial, ou qualquer suplemento dos mesmos.Fármacos exemplares estão registrados no Physician's DeskReference [Referência de mesa do médico] (PDR) e noOrange Book [Livro Laranja] mantido pela Administração deAlimentos e Drogas dos E.U. (FDA). Novos fármacos estãosendo continuamente descobertos e desenvolvidos, e apresente invenção prove que estes novos fármacos tambémpossam ser incorporados no complexo de fármaco-ligante dapresente invenção.
Grupos funcionais preferidos incluem aminas primárias ousecundárias, hidroxilas, sulfidrilas, carboxilas,aldeídos, e cetonas. Os grupos funcionais mais preferidosincluem hidroxilas, aminas primárias ou secundárias,sulfidrilas e grupos com funcionalidade de ácidocarboxílico. Grupos funcionais ainda mais preferidosincluem hidroxilas, aminas primárias e secundárias, egrupos com funcionalidade de ácido carboxílico. 0 fármacodeve ter pelo menos um, mas pode ter 2, 3, 4, 5, 6 oumais grupos funcionais reativos. Adicionalmente, umespaçador de auto-sacrifício, L1, pode ser incorporadoentre o grupo funcional reativo do fármaco e o ligante depeptídeo, hidrazina ou dissulfeto.O conjugado de fármaco-ligante é efetivo para ospropósitos usuais para os quais fármacos correspondentessão efetivos, mas tem eficácia superior por causa dacapacidade, inerente no ligante, de transportar o fármacoaté a célula desejada onde ela é de particular benefício.Fármacos exemplares incluem proteínas, peptídeos, efármacos de molécula pequena tendo um grupo funcionalpara ligação ao ligante. Mais especificamente, estesfármacos incluem, por exemplo, os inibidores de enzimatais como inibidores de dihidrofolato reductase, einibidores de timidilato sintase, intercaladores de DNA,clivadores de DNA, inibidores de topoisomerase, a famíliade antraciclina de fármacos, os fármacos vinca, asmitomicinas, as bleomicinas, os nucleosídeos citotóxicos,a família de pteridina de fármacos, diinenos, aspodofilotoxinas, indutores de diferenciação, e taxóis.
Os fármacos preferidos da presente invenção incluemfármacos citotóxicos úteis em terapia de câncer e outrasmoléculas pequenas, proteínas ou polipeptídeos comatividade biológica desejada, tal como uma toxina. 0fármaco pode ser selecionado para ser ativado em célulastumorais por conjugação com um ligante específico para otumor. Estes conjugados de fármaco-ligante específicospara tumor têm especificidade tumoral surgindo daespecificidade do ligante. Exemplos disto são conjugadosde fármaco-ligante que são substratos altamente seletivospara enzimas específicas para tumor, onde estas enzimasestão presentes na proximidade do tumor em quantidadessuficientes para gerar níveis citotóxicos de fármacolivre na vizinhança do tumor. Uma vantagem destescomplexos de fármaco-ligante específicos para tumor é queeles são estáveis para proteases casuais no soro humano.
Uma outra vantagem dos complexos de fármaco-ligante é queeles são menos tóxicos que o correspondente fármacolivre; adicionalmente, a especificidade do complexo podepermitir concentrações globais mais baixas serem usadasem relação ao fármaco livre uma vez que a especificidadeaumentada resultará em uma porcentagem mais alta docomplexo estar presente no sítio tumoral.
Citotoxinas
Fármacos citotóxicos úteis na presente invenção incluem, por exemplo, duocarmicinas e CC-1065, e análogos dosmesmos, incluindo análogos baseados em CBI(1,2,9,9a-tetrahidrociclopropa [c]benz [e]indol-4-ona), análogosbaseados em MCBI(7-metoxi-l,2,9,9a-tetra-hidrociclopropa[c]benz[e]indol-4-ona) e análogos baseados em CCBI(7-ciano-1,2,9,9a-tetra-hidrociclo-propa [c]benz[e]-indol-4-ona) das duocarmicinas e CC-1065,doxorubicina e conjugados de doxorubicina tais comomorfolino-doxorubicina e cianomorfolino-doxorubicina,dolastatinas tais como dolastatina-10, combretastatina, caliqueamicina, maitansina, análogos de maitansina, DM-I,auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP(AEFP), monometil auristatina E (MMAE), ácido 5-benzoilvalérico-AE éster (AEVB) , tubulisinas, disorazol,epotilonas, Paclitaxel, docetaxel, SN-38, Topotecan, rizoxina, equinomicina, cemadotina, eleuterobina,metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracila, 6-mercaptopurina, citosina arabinosídeo,melfalan, leurosina, leurosideina, actinomicina,daunorubicina e conjugados de daunorubicina, mitomicina C, mitomicina A, carminomicina, aminopterina,talisomicina, podofilotoxina e derivados depodofilotoxina tais como etoposídeo ou fosfato deetoposídeo, vincristina, taxol, ácido retinóico taxotere,ácido butírico, N8-acetil espermidina, campotecina, e seus análogos. Outros fármacos conhecidos podem sermodificados para prover um grupo funcional paraconjugação com o ligante descrito aqui. Tal modificaçãoquímica é conhecida na técnica.
Citotoxinas preferidas para uso na presente invençãoincluem: duocarmicinas e CC-1065, e análogos baseados emCCBI e baseados em MCBI dos mesmos, morf olino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatina-10, combretastatina, caliqueamicina, maitansina, DM-I,auristatina Ε, AEB, AEFP, MMAE, Tubulisina Α, Disorazol,epotilona A e epotilona Β.
Citotoxinas particularmente preferidas da presenteinvenção são derivados de duocarmicina potentes, ativos eCC-1065. Os agentes de origem são anticorpos antitumorexcepcionalmente potentes que derivam seus efeitosbiológicos através da alquilação seletiva de seqüênciaesteroeletronicamente controlada, reversível, de DNA(Boger e outros, J. Org., Chem. 55: 4499 (1990)); Boger eoutros J. Am. Chem. Soe. 112: 8961 (1990); Boger eoutros, J. Am. Chem. Soe. 113: 6645 (1991); Boger eoutros J. Am. Chem. Soe. 115: 9872 (1993); Boger eoutros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 759 (1992)).Subseqüente ã divulgação inicial das duocarmicinas,esforços extensivos têm sido devotados a elucidar aseletividade de alquilação de DNA da duocarmicina e suaorigem estrutural.
Um aspecto particularmente preferido da presente invençãoprove um composto citotóxico tendo uma estrutura deacordo com a Fórmula 7:
na qual o sistema de anel A é um membro selecionado degrupos arila substituído ou não substituído, heteroarilasubstituído ou não substituído e heterocicloalquilasubstituído ou não substituído. Sistemas de anéisexemplares incluem fenila e pirrol.
Os símbolos EeG são selecionados independentemente deH, alquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, um heteroátomo, umaligação simples ou E e G são opcionalmente unidos paraformar um sistema de anel selecionado de arilasubstancialmente ou não substituído, heteroarilasubstituído ou não substituído, e heterocicloalquilasubstituído ou não substituído.
0 símbolo X representa um membro selecionado de O, SeNR23. R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, e acila.
0 símbolo R3 representa um membro selecionado de (=0),SR11, NHR11 e OR11, no qual R11 é H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, difosfatos, trifosfatos, acila, C(O)R12R13,C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O) (OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 ouSiR12R13R14. Os símbolos R12, R13, e R14 representamindependentemente H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou não substituídoe arila substituído ou não substituído, sendo que R12 eR13 juntos com o átomo de nitrogênio ou carbono ao qualeles estão ligados são opcionalmente unidos para formarum sistema de anel de heterocicloalquila substituído ounão substituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos. Um ou mais de R12,R13, ou R14 pode incluir um grupo clivável dentro de suaestrutura.
R4, R4', R5, e R5' são membros selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15,C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, e O(CH2)nN(CH3)2, onde η é umnúmero inteiro de 1 a 20. R15 e R16 representamindependentemente H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído epeptidila substituído ou não substituído, sendo que R15 eR16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistema de anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos. Uma estruturaexemplar é anilina.
R4, R4', R5, R5', R11, R12, R13i R15 e R16 opcionalmente contêm um ou mais grupos cliváveis dentro de suasestruturas. Grupos cliváveis exemplares incluem, mas nãoestão limitados a peptídeos, aminoácidos, hidrazinas, edissulfetos.
Pelo menos um de R11, R12, R13, R15 e R16 é usado para uniro fármaco a um ligante da presente invenção, comodescrito aqui, por exemplo a L1, se presente ou a F, H,ou J.
Em ainda uma configuração exemplar adicional, pelo menosum de R4, R4', R5, R5', R11, R12, R13, R15 e R16 suporta um grupo reativo apropriado para conjugar o composto. Em umaconfiguração exemplar adicional, R47 R4', R5, R5', R11, R12,R13, R15 e R16 são independentemente selecionados de H,alquila substituído e heteroalquila substituído e têm umgrupo funcional reativo no término livre da parcela alquila ou heteroalquila. Um ou mais de R4, R4, R5, R5',R11, R12, R13, R15 e R16 podem ser conjugados a uma outraespécie, p.ex., agente direcionador, rótulo detectável,suporte sólido, etc.
Como será aparente a partir da discussão aqui, quandopelo menos um de R15 e R16 compreende um grupo funcionalreativo, aquele grupo pode ser um componente de umaligação entre o fármaco e uma outra molécula. Em umaconfiguração exemplar na qual pelo menos um de R15 e R16compreende uma ligação entre o fármaco e uma outraespécie, pelo menos um de R15 e R16 é uma parcela que éclivada por uma enzima.
Em uma configuração exemplar adicional, pelo menos um deR4, R4', R5, e R5' é:
Na Fórmula 8, os símbolos X2 e Z1 representam membrosselecionados independentemente de 0, Se NR23. Os gruposR17 e R18 são selecionados independentemente de O, SeNR23. Os grupos R17 e R18 são selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, arila substituído ou não substituído,hetroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído,halogênio, NO2, NR19R20, NC(O)R19, OC(O)NR19, C(O)R19, SR19ou OR19, com a ressalva que pelo menos um de R12, R13, R19,ou R20 compreenda um ligante da presente invenção, comodivulgado aqui.
Os símbolos R19 e R20 representam independentementealquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, arila substituído ou nãosubstituído, ou heteroarila substituído ou nãosubstituído, heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído, peptidila substituído ou não substituído,sendo que R19 e R20 juntos com o átomo de nitrogênio aoqual eles estão ligados são opcionalmente unidos paraformar um sistema de anel de heterocicloalquilasubstituído ou não substituído tendo de 4 a 6 membros,contendo opcionalmente dois ou mais heteroátomos, com aressalva que quando Z1 for NH; tanto R17 quanto R18 nãosejam H, e R17 não seja NH2. Através de toda a presenteespecificação, os símbolos R19 e R20 também abrangem osgrupos registrados para R4 e R5. Portanto, por exemplo,está dentro do escopo da presente invenção provercompostos tendo dois ou mais dos sistemas de anéisfenila-heterocíclico fundidos registrados imediatamenteacima ligados em série, ou um anel fundido em combinaçãocom um ligante. Além disso, naquelas configurações nasquais um ligante está presente, o ligante pode estarpresente como um substituinte R4, R4', R5i ou R5' ou comoum substituinte R17 ou R18.
R6 é uma ligação simples que está ou presente ou ausente.Quando R6 está presente, R6 e R7 são unidos para formar umanel de ciclopropila. R7 é CH2-X1 ou -CH2-. Quando R7 é -CH2- ele é um componente do anel de ciclopropano. Osímbolo X1 representa um grupo partindo tal como umhalogênio, por exemplo Cl, Br ou F. As combinações de R6e R7 são interpretadas de uma maneira que não viole osprincípios de valência química.
A linha curva dentro do anel de seis membros indica que oanel pode ter um ou mais graus de insaturação, e ele podeser aromático. Assim, estruturas de anéis tais comoaquelas registradas abaixo, e estruturas relacionadas,estão dentro do escopo da Fórmula (9):
<formula>formula see original document page 87</formula>
Em uma configuração exmeplar, o sistema de anel A é umanel de fenila substituído ou não substituído. O sistemade anel A é preferivelmente substituído com um ou maissubstituintes de grupo arila como registrado na seção dedefinições aqui. Em uma configuração preferida, o anelfenila é substituído com uma parcela CN ou metóxi.
Em uma outra configuração exemplar, a invenção prove umcomposto tendo uma estrutura de acordo com a Fórmula 10:Nesta configuração, as identidades dos radicais R3, R4,R4', R5, R5', R6, R7 e X são substancialmente comodescritas acima. O símbolo Z é um membro selecionado independentemente de O, Se NR23. O símbolo R23 representaum membro selecionado de H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila. Cada R e selecionadoindependentemente. O símbolo R1 representa H, alquila inferior substituído ou não substituído, ou C(O)R8 ouCO2R8. R8 -e um membro selecionado de alquila substituído,alquila não substituído, NR9R10, NR9NHR10 e OR9. R9 e R10são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído e heteroalquila substituído ou não substituído. 0 radical R2 é H, oualquila inferior substituído ou não substituído. Égeralmente preferido que quando R2 for alquilasubstituído, ele seja outro que um perfluoroalquila,p.ex., CF3. Em uma configuração, R2 é um alquila substituído sendo que a substituição não é um halogênio.Em uma outra configuração, R2 é um alquila nãosubstituído.
Como discutido acima, X1 pode ser um grupo partindo.Grupos partindo úteis incluem, mas não estão limitados a,halogênios, azidas, ésteres sulfônicos (p.ex.,alquilsulfonila, arilsulfonila), íons de oxônio,percloratos de alquila, amonioalcanosulfanto ésteres,alquilfluorosulfonatos e compostos fluorados (p.ex.,triflatos, nonaflatos, tresilatos) e similares.Halogênios particulares úteis como grupos partindo são F,Cl, e Br. A escolha destes e outros grupos partindoapropriados para um particular conjunto de condições dereação está dentro das habilidades daqueles experientesna técnica (veja, por exemplo, March J. ADVANCED ORGANICCHEMISTRY [Química orgânica avançada], 2 a Edição, JohnWiley and Sons, 1992; Sandler SR, Karo W, ORGANICFUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS [Preparações de gruposfuncionais orgânicos], 2a Edição, Academic Press, Inc.,1983; e Wade LG, COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS[Compêndio de métodos sintéticos orgânicos], John Wileyand Sons, 1980).
Em uma configuração exemplar R1 é uma parcela de éster,tal como CO2CH3. Em uma configuração exemplar adicional,R2 é um grupo alquila inferior, o qual pode sersubstituído ou não substituído. Um grupo alquila inferiorpresentemente preferido é CH3. Em uma configuração aindaadicional, R1 é CO2CH3, e R2 é CH3.
Em ainda uma outra configuração exemplar, R4, R4', R5, eR5' são membros selecionados independentemente de H,halogênio, NH2, OMe, O(CH2)2N(Me)2 e NO2.
Em uma configuração, o fármaco é selecionado tal que ogrupo partindo X1 seja um membro selecionado do grupoconsistindo de halogênio, alquilsulfonila, arilsulfonila,e azida. Em uma outra conf iguração, Z é 0. Em certasconfigurações, R1 pode ser CO2CH3 ou R2 pode ser CH3;adicionalmente, R1 pode ser CO2CH3, e R2 pode ser CH3. Umde R4, R4', R5, ou R5' pode ser C(O)R15 e os outros três deR4, R4', R5, e R5' são H. Adicionalmente, pelo menos um deR4, R4', R5, e R5' pode ser outro que um membro selecionadode H e OCH3. Em uma configuração, R4, R4', R5, e R5' sãomembros selecionados independentemente de H, halogênio,NH2, O(CH2)2N(Me)2 e NO2-
Em uma configuração preferida, um de R4, R4', R5, e R5' éO(CH2)2N(Me)2 e os outros de R4, R4', R5, e R5' são H. Emuma outra configuração, R7 é CH2-X1 onde X1 é F, Cl ou Bre R6 está ausente.
Em ainda uma outra configuração exemplar, a invençãoprovê compostos tendo uma estrutura de acordo com asFórmulas 11 e 12:
<formula>formula see original document page 90</formula>
Em uma configuração das Fórmulas acima, X épreferivelmente O; e Z é preferivelmente 0. Em uma outraconfiguração, Z é NR23 ou O. Alternativamente, um de R4,R4', R5, e R5' pode ser O(CH2)2N(Me)2 enquanto os outrostrês de R4, R4', R5, e R5' são H. Em uma configuração, R4,R4', R5, e R5' podem ser selecionados do grupo consistindode R29, COOR29, C(O)NR29, e C(O)NNR29, sendo que R29 éselecionado do grupo consistindo de Η, 0H, alquilasubstituído, alquila não substituído, cicloalquilasubstituído, cicloalquila não substituído, heteroalquilasubstituído, heteroalquila não substituído,cicloheteroalquila substituído, cicloheteroalquila nãosubstituído, heteroarila substituído, e heteroarila nãosubstituído.
Em uma outra configuração das Fórmulas acima X épreferivelmente 0, Z é preferivelmente 0, R1 épref erivelmente CO2CH3, R7 é pref erivelmente CH2-Cl, R2 épreferivelmente CH3, R3 é preferivelmente 0H.
Alternativamente, um de R4, R4', R5, e R5' pode serNHC(O) (C6H4)NH2 enquanto os outros três de R4, R4', R5, eR5' são H.
Em uma configuração, R29 pode ser selecionado do grupoconsistindo de:<formula>formula see original document page 91</formula>
Em ainda uma outra configuração do fármaco, um membroselecionado de R4 e R5 é:
<formula>formula see original document page 91</formula>
onde X2 e Z1 são. membros selecionados independentementede O, Se NR23; R17 e R18 são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído,halogênio, NO2, NR19R20, NC(O)R19, OC(O)NR19, OC(O)OR19,C(O)R19, OR19, e O(CH2)nN(CH3)2- Nesta configuração, η é umnúmero inteiro de 1 a 20; R19 e R20 são selecionadosindependentemente de alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído, eheterocicloalquila substituído ou não substituído, sendoque R19 e R20 juntos com o átomo de nitrogênio ao qualeles estão ligados são opcionalmente unidos para formarum sistema de anel de heterocicloalquila substituído ounão substituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos, sendo que um de R11,R12, R13, R15, R16, R19, ou R20 liga o citado fármaco a L1,se presente, ou a F. Em uma configuração preferida, X2 é0 e Z1 é 0 ou NR23.
Uma outra estrutura preferida do análogo de duocarmicinade Fórmula 7 é uma estrutura na qual o sistema de anel Aé um anel fenila não substituído ou substituído. Ossubstituintes preferidos na molécula de fármaco descritaaqui acima para a estrutura de Fórmula 7 quando o sistemade anel A é um pirrol também são substituintes preferidosquando o sistema de anel A é um anel fenila nãosubstituído ou substituído.
Por exemplo, em uma configuração preferida, o fármaco (D)compreende uma estrutura:
Nesta estrutura, R3, R6, R7, X são como descritos acimapara a Fórmula 7. Adicionalmente, Z é um membroselecionado de O, Se NR23, sendo que R23 é um membroselecionado de H7 alquila substituído ou não substituído,heteroalquila substituído ou não substituído, e acila;R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8, sendo que R8 é um membro selecionado deNR9R10 e OR9, no qual R9 e R10 são membros selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído e heteroalquila substituído ou nãosubstituído;
R1' é H, alquila inferior substituído ou não substituído,ou C(O)R8, sendo que R8 é um membro selecionado de NR9r10e OR9, no qual R9 e R10 são membros selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído e heteroalquila substituído ou nãosubstituído;
R2 é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila ou ciano ou alcoxi nãosubstituído; e R2' é H, ou alquila inferior substituído ounão substituído ou heteroalquila não substituído.
Pelo menos um de R11f R12f R13, R15 ou Rie liga o fármaco aL1, se presente, ou a F, H, ou J.
Em uma configuração preferida, um de R4, R4', R5, e R5' é O(CH2)2N(Me)2 e os outros de R4, R4', R5, e R5' são H. Emuma outra configuração, R7 é CH2-X1 onde X1 é F, Cl ou Bre R6 está ausente.
Em uma configuração, a invenção provê um compostocitotóxico de fármaco-ligante tendo uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
<formula>formula see original document page 93</formula>
onde o símbolo L1 representa um espaçador de auto-sacrifício onde m é um número inteiro de 0, 1, 2, 3, 4,5, ou 6.
0 símbolo X4 representa um membro selecionado do grupoconsistindo de grupos funcionais reativos protegidos,grupos funcionais reativos não protegidos, rótulosdetectáveis, e agentes direcionadores.
0 símbolo L4 representa um membro ligante, e ρ é 0 ou 1.
L4 é uma parcela que impõe propriedades de solubilidadeaumentada ou agregação reduzida aos conjugados. Exemplosde parcelas L4 incluem alquila substituído, alquila nãosubstituído, arila substituído, arila não substituído,heteroalquila substituído, ou heteroalquila nãosubstituído, qualquer dos quais pode ser reto,ramificado, ou cíclico, um polímero de aminoácidocarregado positivamente ou negativamente, tal como umapolilisina ou poliargenina, ou outros polímeros tais comopolietileno glicol.
0 símbolo Q representa qualquer ligante clivávelincluindo, mas não limitado a, qualquer dos ligantes depeptidila, hidrozona, e dissulfeto descritos aqui. Outrosligantes adequados incluem, mas não estão limitados a,aqueles descritos na patente U.S. n° 6.214.345; publicações de pedidos de patentes U.S. nos 2003/0096743,2003/0130189, e 2004/121940; publicações de pedidos depatentes PCT nos WO 03/026577 e WO 04/043493; epublicações de pedidos de patentes européias nos EP1243276 e EP1370298, todas as quais são incorporadas aquipor referência. Ligantes cliváveis incluem aqueles quepodem ser seletivamente clivados por um processo químicoou biológico e com a clivagem separam o fármaco, D1, deX4. A clivagem pode ocorrer em qualquer lugar ao longo daextensão do ligante ou em qualquer término do ligante.
O símbolo D1 representa um fármaco tendo a seguintefórmula:
<formula>formula see original document page 94</formula>
onde X e Z são membros selecionados independentemente deO, Se NR23,
R23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila;
R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8,
R1' é H, alquila inferior substituído ou não substituído,ou C(O)R8,
sendo que R8 é um membro selecionado de NR9R10 e OR9 e R9 eR10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;
R2 é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila ou ciano ou alcoxi nãosubstituído;
R2' é H, ou alquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila não substituído,
R3 é um membro selecionado do grupo consistindo de SR11,NHR11 e OR11, sendo que R11 é um membro selecionado dogrupo consistindo de H, alquila substituído, alquila nãosubstituído, heteroalquila substituído, heteroalquila nãosubstituído, difosfatos, trifosfatos, acila, C(O)R12R13,C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O) (OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 eSiR12R13R14, no qual R12, R13, e R14 são membros selecionadosindependentemente de H, alquila substituído ou nãosubstituído, heteroalquila substituído ou não substituídoe arila substituído ou não substituído, sendo que R12 eR13 juntos com o átomo de nitrogênio ou carbono ao qualeles estão ligados são opcionalmente unidos para formarum sistema de anel de heterocicloalquila substituído ounão substituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos;
sendo que pelo menos um de R11, R12, e R13 liga o citadofármaco a L1, se presente, ou a Q,
R6 é uma ligação dupla que está ou presente ou ausente equando presente R6 e R7 são unidos para formar um anel deciclopropila; e
R7 é CH2-X1 ou -CH2- unidos no citado anel de ciclopropilacom R6, sendo que
X1 é um grupo partindo,
R4, R4', R5, e R5' são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15,C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, e O(CH2)nNR24R25 sendo que η éum número inteiro de 1 a 20;
R15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,hetrocicloalquila substituído ou não substituído, epeptidila substituído ou não substituído, sendo que R15 eR16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistemade anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos;e R24 e R25 são selecionados independentemente de alquilanão substituído e
sendo que pelo menos um de R4, R4', R5, e R5' é0 (CH2)nNR24R25.
Em algumas configurações, η é 2. Em algumasconfigurações, R24 e R25 são metila. Em algumasconfigurações, R4 é O(CH2)11NR24R25 e R4', R5, e R5' são H. Emalgumas configurações, R4 é O(CH2)nN(CH3)2 e R4, , R5, e R5'são H. Em algumas configurações, Q é um liganteselecionado de F, H, e J, como descrito acima. Em algumasconfigurações, R1, R1', R2, e R2' são H.
Uma outra configuração de fármaco D1 é a seguinte:são as seguintes:<formula>formula see original document page 97</formula>
Em uma outra configuração exemplar da presente invenção,o fármaco citotóxido pode ser um análogo de tubulisina oucomposto relacionado, tal como os compostos descritospela estrutura de acordo com a Fórmula 13:
<formula>formula see original document page 97</formula>
onde R1 e R2 são H ou um alquila inferior, ou são maisparticularmente isobutila, etila, propila, ou t-butila eR3 é H ou OH. Tubulisina e seu uso no tratamento decâncer foi descrito em, por exemplo, as publicações PCTWO 2004/005327 e WO 2004/005326. A produção de compostosde tubulisina é descrita em DE10008089. Métodos que podemser usados para ligar a tubulisina a vários ligantes dapresente invenção são providos nos exemplos. Análogos detubulisina preferidos são Tubulisina A-F.
Conjugados de duocarmicina e CBI preferidos
Os ligantes de peptídeo, hidrazina ou dissulfeto dainvenção podem ser usados em conjugados contendo análogosde duocarmicina ou CBI como agentes citotóxicos.Conjugados preferidos da invenção são descritos emdetalhes adicionais abaixo. A menos que indicado de outraforma, os substituintes são definidos como registradoacima nas seções com relação a citotoxinas, ligantes depeptídeo, ligantes de hidrazina e ligantes de dissulfeto.
A. Conjugados de ligante de peptídeo
Em uma configuração preferida, invenção prove umconjugado de ligante de peptídeo tendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 98</formula>
onde X1 é um halogênio;
X é um membro selecionado de 0, Se NR23;
R23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila; e
R4, R4', R5, e R5' são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15,C(O)Rlb, ORlb, e O(CH2)nN(CH3)2
sendo que
η é um número inteiro de 1 a 20; eR15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído, e substituídoou não substituído, sendo que R15 e R16 juntos com o átomode nitrogênio ao qual eles estão ligados sãoopcionalmente unidos para formar um sistema de anel deheterocicloalquila substituído ou não substituído tendode 4 a 6 membros, opcionalmente contendo dois ou maisheteroátomos.
Exemplos não limitantes de tais conjugados incluem asseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 99</formula><formula>formula see original document page 100</formula>
onde X1 é Cl ou Br;
e sendo que Ab é um anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em uma outra configuração preferida, a invenção prove uconjugado tendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 100</formula>onde X1 é um grupo partindo;
Z e X são membros selecionados independentemente de 0, Se NR23,
sendo que R23 é um membro selecionado de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, e acila; e
R3 é selecionado do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15Ris, OC(O)OR15,C(O)R15, OR15, e O(CH2)nN(CH3)2sendo que
η é um número inteiro de 1 a 20;
R15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído, e substituídoe não substituído, sendo que R15 e R16 juntos com o átomode nitrogênio ao qual eles estão ligados sãoopcionalmente unidos para formar um sistema de anel deheterocicloalquila substituído ou não substituído tendode 4 a 6 membros, opcionalmente contendo dois ou maisheteroátomos.
Exemplos não limitantes de tais conjugados incluem asseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 101</formula><formula>formula see original document page 102</formula>
onde cada b é independentemente um número inteiro de 0 a20, e Ab é um anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em ainda outras configurações preferidas, a invençãoprovê um conjugado de ligante de peptídeo selecionado dasseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 102</formula><formula>formula see original document page 103</formula>
onde X1 é Cl ou Br, e Ab é um anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em ainda outras configurações, a invenção provê umconjugado de ligante de peptídeo selecionado a partir dasseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 103</formula><formula>formula see original document page 104</formula><formula>formula see original document page 105</formula><formula>formula see original document page 106</formula>
onde r é um número inteiro na faixa de 0 a 24. Em umaconfiguração, r é 4.
B. Conjugados de ligante de hidrazina
Em uma configuração preferida, a invenção provê umconjugado de ligante de hidrazina tendo a estrutura:
<formula>formula see original document page 106</formula>
Em uma outra configuração preferida, a invenção provê umconjugado de ligante de hidrazina tendo a estrutura:<formula>formula see original document page 107</formula>
Em ainda outras configurações preferidas, a invençãoprovê um conjugado de ligante de hidrazina tendoestrutura selecionada de:
<formula>formula see original document page 107</formula>
onde PEG é uma parcela de polietileno glicol e X1 é Cl ouBr.Em ainda outras configurações preferidas, a invençãoprove um conjugado de ligante de hidrazina selecionadodas seguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 108</formula>
onde X1 é Cl ou Br, e Ab é um anticorpo, ou fragmento do mesmo.
Em ainda uma outra configuração preferida, existe umconjugado de ligante de hidrazina selecionado a partirdas seguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 108</formula><table>table see original document page 109</column></row><table>
C. Conjugados de ligante de dissulfeto
Em uma configuração preferida, a invenção prove umconjugado de ligante de dissulfeto tendo a estrutura:
<table>table see original document page 109</column></row><table><formula>formula see original document page 110</formula>
Exemplos não limitantes de tais estruturas incluem osseguintes :
<formula>formula see original document page 110</formula><formula>formula see original document page 111</formula>
onde X1 é Cl ou Br, e Ab é um anticorpo, ou fragmento do mesmo.
LIGANTES
Os ligantes da presente invenção são representados como"X4". Nesta invenção, X4 representa um membro selecionadodo grupo consistindo de grupos funcionais reativosprotegidos, grupos funcionais reativos não protegidos,rótulos detectáveis, e agentes direcionadores. Osligantes preferidos são agentes direcionadores, tais comoanticorpos e fragmentos dos mesmos.
Em uma configuração preferida, o grupo X4 pode serdescrito como um membro selecionado de R29, COOR29,C(O)NR29, e C(O)NNR29 sendo que R29 é um membro selecionadode alquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, ou heteroarilasubstituído ou não substituído. Em ainda outraconfiguração exemplar, R29 é um membro selecionado de H;OH; NHNH2;
onde R30 representa alquila substituído ou nãosubstituído terminado com um grupo funcional reativo,heteroarila substituído ou não substituído terminado comum grupo funcional. As estruturas acima atuam como gruposprotetores reativos que podem ser reagidos com, porexemplo, uma cadeia lateral de um aminoácido de um agentedirecionador, tal como um anticorpo, para dessa formaligar o agente direcionador à parcela ligante-fármaco.
Agentes direcionadores
Os braços de ligante e citotoxinas da invenção podem serligados a agentes direcionadores que seletivamentefornecem uma carga útil a uma célula, órgão ou região docorpo. Agentes direcionadores exemplares tais comoanticorpos (p.ex., quiméricos, humanizados e humanos),ligantes para receptores, Iectinas, sacarídeos,anticorpos, e similares são reconhecidos na técnica e sãoúteis sem limitações na prática da presente invenção.Outros agentes direcionadores incluem uma classe decompostos que não incluem motivos de reconhecimentomolecular específicos incluem macromoléculas tais comopoli(etileno glicol), polisacarídeo, poliaminoácidos esimilares, que adicionam massa molecular à citotoxina.Esta massa molecular adicional afeta a farmacocinética dacitotoxina, p.ex., meia vida do soro.
Em uma configuração exemplar, a invenção provê umacitotoxina, ligante ou conjugado de citotoxina-ligantecom um agente direcionador que é uma biomolécula, p.ex,.um anticorpo, receptor, peptídeo, lectina, sacarídeo,ácido nucléico ou uma combinação dos mesmos. Rotas paraos conjugados exemplares da invenção estão registradasnos Esquemas acima.
As biomoléculas úteis na prática da presente invençãopodem ser derivadas de qualquer fonte. As biomoléculaspodem ser isoladas de fontes naturais ou podem serproduzidas por métodos sintéticos. As proteínas podem serproteínas naturais ou proteínas mutadas. As mutaçõespodem ser efetuadas por mutagenese química, mutagenesedirigida a sítio ou outros meios para induzir mutações conhecidos por aqueles experientes, na técnica. Asproteínas úteis na prática da presente invenção incluem,por exemplo, enzimas, antígenos, anticorpos e receptores.Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, mas omais preferivelmente são monoclonais. Peptídeos e ácidos nucléicos podem ser isolados a partir de fontes naturaisou podem ser de origem totalmente ou parcialmentesintética.
Em uma configuração preferida, o agente direcionador é umanticorpo, ou fragmento de anticorpo, que é selecionado baseado em sua especificidade para um antígeno expressoem uma célula alvo, ou em um sítio alvo, de interesse.Uma ampla variedade de antígenos específicos para tumorou específicos para outra doença foram identificados eanticorpos para aqueles antígenos foram usados ou propostos para uso no tratamento de tais tumores ououtras doenças. Os anticorpos que são conhecidos natécnica podem ser usados nos conjugados da invenção, emparticular para o tratamento da doença com a qual oantígeno alvo está associado. Exemplos não limitantes de antígenos alvo (e suas doenças associadas) aos quais umconjugado de anticorpo-ligante-fármaco da invenção podeser direcionado incluem: Her2 (câncer de mama) , CD20(Iinfomas), EGFR (tumores sólidos), CD22 (linfomas,incluindo Iinfoma não de Hodgkin), CD52 (leucemia linfocítica crônica), CD33 (leucemia mielogena aguda),CD4 (linfomas, doenças autoimunes, incluindo artritereumatóide), CD30 (linfomas, incluindo linfoma não deHodgkin) , Mucl8 (melanoma) , integrinas (tumores sólidos) ,PSMA (câncer de próstata, hiperplasia prostáticabenigna), CEA (câncer colorretal), CDlla (psoriase), CD80(psoriase), CD23 (asma), CD4 0L (púrpura trombocitopênicaimune), CTLA4 (linfomas de células T) e BLys (doençasautoimune, incluindo lupus eritomatoso sistêmico).Naquelas configurações onde a parcela de reconhecimento éuma proteína ou anticorpo, a proteína pode ser presa auma superfície ou um componente de monocamada auto-montado (SAM) ou conectada através de um braço deespaçador por qualquer resíduo de peptídeo reativodisponível na superfície da proteína. Em configuraçõespreferidas, os grupos reativos são aminas oucarboxilatos. Em configurações particularmentepreferidas, os grupos reativos são os grupos ε-amina deresíduos de lisina. Adicionalmente, estas moléculas podemser adsorvidas sobre a superfície do substrato ou SAM porinterações não específicas (p.ex., quimiossorção,fisissorção).
As parcelas de reconhecimento que são anticorpos podemser usadas para reconhecer analitos que são proteínas,peptídeos, ácidos nucléicos, sacarídeos ou moléculaspequenas tais como fármacos, herbicidas, pesticidas,produtos químicos industriais, e agentes de guerra. Osmétodos para criar anticorpos para moléculas específicassão bem conhecidos por aqueles experientes na técnica.Veja, as patentes dos Estados Unidos n° . 5.147.786,emitida para Feng e outros em 15 de setembro de 1992; n°5/334.528, emitida para Stanker e outros, em 2 de agostode 1994; n° 5/686.237, emitida para Al-Bayati, M.A.S. em11 de novembro de 1997; e n° 5/573.922, emitida paraHoess e outros em 12 de novembro de 1996. Os métodos paraligar anticorpos a superfícies também são bem conhecidos.Veja, Delamarche e outros Langmuir 12:1944-1946 (1996).Agentes direcionadores podem ser ligados aos ligantes dainvenção por qualquer grupo reativo disponível. Porexemplo, peptídeos podem ser ligados através de um grupoamina, carboxila, sulfidrila, ou hidroxila. Tal grupopode residir em um término de peptideo ou em um sítiointerno à cadeia do peptideo. Ácidos nucléicos podem serligados através de um grupo reativo em uma base (p.ex., amina exocíclica) ou um grupo hidroxila disponível em umaparcela de açúcar (p.ex., 3'- ou 5'-hidroxila). Ascadeias de peptideo e ácido nucléico podem seradicionalmente derivadas em um ou mais sítios parapermitir a ligação de grupos reativos apropriados na cadeia. Veja, Chrisey e outros, Nucleic Acids Res.24:3031-3039 (1996).
Quando o peptideo ou ácido nucléico é uma moléculatotalmente ou parcialmente sintética, um grupo reativo ougrupo reativo mascarado pode ser incorporado durante o processo da síntese. Muitos monômeros derivadosapropriados para incorporação de grupo reativo em tantopeptídeos quanto ácidos nucléicos são conhecidos poraqueles experientes na técnica. Veja, por exemplo, THEPEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY [Os peptídeos: análise, síntese, biologia], Vol. 2: "Special Methods inPeptide Synthesis" [Métodos especiais em síntese depeptídeos], Gross, E. e Melenhofer, J., Eds., AcademicPress, Nova York (1980) . Muitos monômeros úteis sãocomercialmente disponíveis (Bachem, Sigma, etc.). Estegrupo mascarado pode então ser desmascarado seguindo asíntese, em cujo momento ele se torna disponível para areação com um componente de um composto da invenção.Agentes direcionadores de ácido nucléico exemplaresincluem aptâmeros, compostos anti-sentido, e ácidos nucléicos que formam hélices triplas. Tipicamente, umgrupo hidroxila de um resíduo de açúcar, um grupo aminode um resíduo de base, ou um oxigênio de fosfato donucleotídeo é utilizado como a funcionalidade químicanecessária para acoplar o agente direcionador baseado em nucleotídeo à citotoxina. Entretanto, alguém experientena técnica prontamente apreciará que outrasfuncionalidades reativas "não naturais" podem serajuntadas a um ácido nucléico por técnicas convencionais.
Por exemplo, o grupo hidroxila do resíduo de açúcar podeser convertido para um grupo mercapto ou amino usandotécnicas bem conhecidas na arte.
Aptâmeros (ou anticorpo de ácido nucléico) são moléculasde DNA de fita simples ou dupla ou moléculas de RNA defita simples que se ligam a alvos molecularesespecíficos. Geralmente, os aptâmeros funcionam inibindoas ações do alvo molecular, p.ex., proteínas, se ligandoao reservatório do alvo circulando no sangue. Osaptâmeros possuem funcionalidade química e portanto,podem se ligar covalentemente a citotoxinas, comodescrito aqui.
Embora uma ampla variedade de alvos moleculares sejamcapazes de formar associações não covalentes masespecíficas com aptâmeros, incluindo fármacos demoléculas pequenas, metabolitos, cofatores, toxinas,fármacos baseados em sacarídeo, fármacos baseados emnucleotídeos, glicoproteínas, e similares, geralmente oalvo molecular compreenderá uma proteína ou peptídeo,incluindo proteínas do soro, quininas, eicosanóides,moléculas da superfície de célula, e similares. Exemplosde aptâmeros incluem inibidor de antitrombina de GileadGS 522 e seus derivados (Gilead Science, Foster City,Califórnia). Veja também, Macaya e outros Proc. Natl.Acad. Sei. EUS 90:3745-9 (1993); Bocke e outros, Nature(Londres) 355:564-566 (1992) e Wang e outros Biochem.32:1899-904 (1993).
Aptâmeros específicos para uma dada biomolécula podem seridentificados usando técnicas conhecidas na arte. Veja,p.ex., Toole e outros (1992) Publicação de PCT n° WO92/14843; Tuerk e Gold (1991) Publicação de PCT n° WO91/19813; Weintraub e Hutchinson (1992) Publicação de PCTn° 92/05285; e Ellington e Szostak, Nature 346:818(1990). Resumidamente, estas técnicas tipicamenteenvolvem a complexação do alvo molecular com uma misturarandômica de oligonucleotídeos. 0 complexo alvomolecular-aptâmero é separado dos oligonucleotídeos nãocomplexados. 0 aptâmero é recuperado do complexo separadoe amplificado. Este ciclo é repetido para identificaraquelas seqüências de aptâmero com a mais alta afinidadepara o alvo molecular.
Para doenças que resultam da expressão inapropriada degenes, a prevenção ou redução específica da expressão detais genes representa uma terapia ideal. Em principio, aprodução de um particular produto de gene pode ser iniciada, reduzida ou cortada por hibridização de umdoxinucleotídeo ou ribodeoxinucleotídeo de fita simplescomplementar a uma seqüência acessível no mRNA, ou umaseqüência dentro da transcrição que seja essencial paraprocessamento de pré-mRNA, ou a uma seqüência dentro do próprio gene. Este paradigma para controle genético éfreqüentemente referido como inibição anti-sentido ouantigene. Eficácia adicional é imposta pela conjugaçãocom o ácido nucléico de um agente alquilante, tal comoaqueles da presente invenção.
Compostos anti-sentido são ácidos nucléicos projetadospara se ligar e desabilitar ou impedir a produção do mRNAresponsável por gerar uma particular proteína. Oscompostos anti-sentido incluem RNA ou DNA anti-sentido,oligonucleotídeos de fita simples ou dupla, ou seusanálogos, os quais podem se hibridizar para espécies demRNA individuais e impedir a transcrição e/ouprocessamento de RNA das espécies de mRNA e/ou translaçãodo polipeptídeo codificado e dessa forma afetar umaredução na quantidade do respectivo polipeptídeocodificado. Ching e outros Proc. Natl. Acad. Sei. EUA86:10006-10010 (1989); Broder e outros Ann. Int. Med.113:604-618 (1990); Loreau e outros, FEBS Letters 274:53-56 (1990) ; Holcenber e outros WO 91/11535; WO91/09865; WO 91/04753; WO 90/13641; WO 91/13080; WO91/06629, e EP 386563) . Devido a sua sensibilidade eseletividade seletas ao alvo, oligonucleotídeos anti-sentido são úteis para liberar agentes terapêuticos, taiscomo as citotoxinas da invenção para um alvo moleculardesej ado.
Outros relataram que ácidos nucléicos podem se ligar aDNA duplex via a formação de hélice tripla e inibir a transcrição e/ou síntese de DNA. Compostos de hélicetripla (também referidos como fármacos de fita tripla)são oligonucleotídeos que se ligam a seqüências de DNA defita dupla e são intencionados a inibir seletivamente atranscrição de genes causadores de doença, tais comogenes virais, p.ex., vírus simplex de HIV e herpes, eoncogenes, isto é, eles interrompem a produção deproteína no núcleo da célula. Estes fármacos se ligamdiretamente ao DNA de fita dupla no genoma da célula paraformar uma hélice tripla e impedir a célula de produzir uma proteína alvo. Veja, p.ex., as publicações de PCT nosWO 92/10590, WO 92/09705, WO 91/06626, e patente U.S. n°5.176.996. Portanto, as citotoxinas da presente invençãotambém são conjugadas com seqüências de ácido nucléicoque formam hélices triplas.
A especificidade de sítio de ácidos nucléicos (p.ex.,compostos anti-sentido e fármacos de hélice tripla) não ésignificativamente afetada pela modificação da ligação defosfodiéster ou por modificação química do término dooligonucleotídeo. Conseqüentemente, estes ácidosnucléicos podem ser modificados quimicamente ;
intensificando a estabilidade global de ligação,aumentando a estabilidade com relação à degradaçãoquímica, aumentando a taxa na qual os oligonucleotídeossão transportados para dentro das células, e conferindo reatividade química para as moléculas. A solução geralpara construir vários ácidos nucléicos úteis em terapiaanti-sentido tem sido examinada por Van der Krol eoutros, Biotechniques [Biotécnicas] 6:958-976 (1988) eStein e outros, Câncer Res. 48:2659-2668 (1988).
Portanto, em uma configuração exemplar, as citotoxinas dainvenção são conjugadas com um ácido nucléico pormodificação da ligação de fosfodiéster.Além disso, aptâmeros, compostos anti-sentido e fármacosde hélice tripla suportando as citotoxinas da invençãotambém podem incluir substituições, adições, eliminaçõesou transposições de nucleotídeos, desde que ahibridização específica para ou associação com arelevante seqüência alvo seja retida como uma propriedadefuncional do oligonucleotídeo. Por exemplo, algumasconfigurações empregarão análogos de fosforotioato quesão mais resistentes à degradação por nucleases do quesuas contrapartes de fosfato diéter de ocorrência naturale são portanto esperadas a ter uma persistência mais altain vivo e uma maior potência (veja, p.ex., Campbell eoutros, J. Biochem. Biophys. Methods 20:259-267 (1990)).Derivados de fosforamidato de oligonucleotídeos tambémsão conhecidos a se ligar a polinucleotídeoscomplementares e de ter a capacidade adicional deacomodar espécies de ligantes ligados covalentemente eserem amigáveis com os métodos da presente invenção.Veja, por exemplo, Froehler e outros, Nucleic Acids Res.16 (11) :4831 (1988) .
Em algumas configurações os aptâmeros, compostos anti-sentido e fármacos de hélice tripla compreenderão 0-metilribonucleotídeos (Publicação EP n° 360609).Oligonucleotídeos quiméricos também podem ser usados(Dagle e outros, Nucleic Acids Res. 18:4751 (1990). Paraalgumas aplicações, oligonucleotídeos anti-sentido ehélice tripla podem compreender ácidos nucléicos depoliamida (Nielsen e outros, Science 254:1497 (1991) epublicação PCT n° WO 90/15065) ou outros derivadoscatiônicos (Letsinger e outros, J. Am. Chem. Soe.110:4470-4471 (1988)). Outras aplicações podem utilizaroligonucleotídeos onde uma ou mais das ligações defosfodiéster foram substituídas com um grupo isostérico,tal como uma ligação de internucleosídeo de 2-4 átomos decomprimento como descrito nas publicações PCT nos WO92/05186 e 91/06556, ou um grupo formacetal (Matteucci eoutros, J. Am. Chem. Soe. 113:7767-7768 (1991) ou umgrupo amida (Nielsen e outros, Science 254: 1497-1500(1991)).
Em adição, análogos de nucleotídeos, por exemplo onde oaçúcar ou base é quimicamente modificado, podem serempregados na presente invenção. Formas "análogas" depurinas e pirimidinas são aquelas geralmente conhecidasna técnica, muitas das quais são usadas como agentesquimioterapêuticos. Uma lista exemplar mas não exaustivainclui 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracila,5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2 -tiouracila, 5 -carboximetilaminometiluracila, dihidrouracila, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracila,1-metilguanina, 1-metillinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-meti laminometiluraci la, 5-metoxiaminometila-2 - tiouracila,β-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-met iltio-N6-isopenteiladenina, ácidouracil-5-oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético(ν), wibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, ácido N-uracil-5-oxiacético,ácido uracil-5-oxiacético (ν) , pseudouracila, queosina,2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina. Em adição, as basesconvencionais por bases halogenadas. Adicionalmente, aposição 2'-furanose na base pode ter uma substituição degrupo predominante não carregado. Exemplos de grupospredominantes não carregados incluem alquilasramificados, açúcares e açúcares ramificados.
Modificação de terminal também provê um procedimento útilpara conjugar as citotoxinas ao ácido nucléico, modificarespecificidade do tipo de célula, farmacocinéticas,permeabilidade nuclear, e taxa de admissão absoluta decélulas para agentes farmacêuticos de oligonucleotídeo.
Por exemplo, uma série de substituições nas extremidades5' e 3' para incluir grupos reativos são conhecidas, asquais permitem a ligação covalente das citotoxinas. Veja,p.ex., OLIGODEOXYNUCLEOTIDES: ANTISENSE INHIBITORS OFGENE EXPRESSION [Oligodeoxinucleotídeos: inibidores anti-sentido de expressão de gene], (1989) Cohen, Ed., CRC Press; PROSPECTS FOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICSFOR CÂNCER AND AIDS [Prospectos para terapêuticos deácido nucléico anti-sentido para câncer e aids] (1991),Wickstrom, Ed., Wiley-Liss; GENE REGULATION: BIOLOGY OFANTISENSE RNA AND DNA [Regulação de genes: biologia de RNA e DNA anti-sentido] (1992) Erickson e Izant, Eds.,Raven Press; e ANTISENSE RNA AND DNA [RNA e DNAantisentido] (1992) . Murray, Ed. Wiley Liss. Para métodosgerais relacionados com compostos anti-sentido, vejaANTISENSE RNA AND DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Rótulos detectáveis
0 particular rótulo ou grupo detectável usado emconjunção com os compostos e métodos da invenção não égeralmente um aspecto crítico da invenção, desde que elenão interfira significativamente com a atividade ouutilidade do composto da invenção. 0 grupo detectávelpode ser qualquer material tendo uma propriedade físicaou química detectável. Tais rótulos detectáveis têm sidobem desenvolvidos no campo de imunoensaios e, em geral, quase todos os rótulos úteis em tais métodos podem seraplicados à presente invenção. Assim, um rótulo équalquer composição detectável por meiosespectroscópicos, fotoquímicos , bioquímicos,imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Rótulosúteis na presente invenção incluem glóbulos magnéticos(p.ex., DYNABEADS®), corantes fluorescentes (p.ex.,isotiocianato de fluorescina, vermelho Texas, rodamina, esimilares), rádio-rótulos (p.ex., 3H, 125I, 14C, ou 32P),enzimas (p.ex., peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e outras comumente usadas em um ELISA), erótulos colorimétricos tais como ouro coloidal ou vidrocolorido ou glóbulos plásticos (p.ex., poliestireno,polipropileno, látex, etc.).
o rótulo pode ser acoplado diretamente ou indiretamente aum composto da invenção de acordo com métodos bemconhecidos na técnica. Como indicado acima, uma amplavariedade de rótulos podem ser usados, com a escolha dorótulo dependendo da sensibilidade requerida, facilidadede conjugação com o composto, requisitos de estabilidade,instrumentação disponível, e previsões de descarte.Quando o composto da invenção é conjugado com um rótulodetectável, o rótulo é preferivelmente um membroselecionado do grupo consistindo de isótopos radioativos,agentes fluorescentes, precursores de agentesfluorescentes, cromóforos, enzimas e combinações dosmesmos. Os métodos para conjugar vários grupos comanticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, umrótulo detectável que é freqüentemente conjugado com umanticorpo é uma enzima, tal como peroxidase de rábanosilvestre fosfatase alcalina, β-galactosidase, e glucoseoxidase.
Rótulos não radioativos são freqüentemente ligados pormeios indiretos. Geralmente, uma molécula de ligante(p.ex., biotina) é covalentemente ligada a um componentedo conjugado. 0 ligante então se liga a uma outramolécula (p.ex., estreptavidina), que seja inerentementedetectável ou covalentemente ligada a um sistema desinal, tal como uma enzima detectável, um compostofluorescente, ou um composto quimioluminescente.Os componentes dos conjugados da invenção também podemser conjugados diretamente com compostos geradores desinal, p.ex., por conjugação com uma enzima oufluoroforo. As enzimas de interesse como rótulos serãoprimariamente hidrolases, particularmente fosfatases,esterases e glicosidases, ou oxidotases, particularmenteperoxidases. Os compostos fluorescentes incluemfluoresceina e seus derivados, rodamina e seus derivados,dansila, umbeliferona, etc. Os compostosquimioluminescentes incluem luciferina e 2,3-dihidroftalazinedionas, p.ex., luminol. Para um exame devários sistemas de rotulação ou produtores de sinal quepodem ser usados, veja a patente U.S. n° 4.391.904.Meios para detectar rótulos são bem conhecidos poraqueles experientes na técnica. Portanto, por exemplo,onde o rótulo é um rótulo radioativo, os meios paradetecção incluem um contador de cintilação ou películafotográfica como em autoradiografia. Onde o rótulo é umrótulo fluorescente, ele pode ser detectado excitando o fluorocromo com o comprimento de onda apropriado de luz edetectando a fluorescência resultante. A fluorescênciapode ser detectada visualmente, por meio de películafotográfica, pelo uso de detectores eletrônicos tais comodispositivos acoplados por carga (CCDs) ou fotomultiplicadores e similares. Similarmente, rótulosenzimáticos podem ser detectados provendo os substratosapropriados para a enzima e detectando o produto dareação resultante. Finalmente, rótulos colorimétricossimples podem ser detectados simplesmente observando acor associada com o rótulo. Assim, em vários ensaios devareta, ouro conjugado freqüentemente aparece pink,enquanto vários glóbulos conjugados parecem da cor doglóbulo.
Rótulos fluorescentes são presentemente preferidos umavez que eles têm a vantagem de requerer poucas precauçõesde manuseio, e são amigáveis a técnicas de visualizaçãode alta produção (análise óptica incluindo adigitalização da imagem para análise em um sistemaintegrado compreendendo um computador) . Os rótulospreferidos são tipicamente caracterizados por um ou maisdos seguintes: alta sensibilidade, alta estabilidade,baixo fundo, baixa sensibilidade ambiental e altaespecificidade na rotulação. Muitos rótulos fluorescentessão comercialmente disponíveis de SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Piscataway, NJ),CLONTEHC Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA), Chem GenesCorp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), GlenResearch, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Giathersburg, MD) , Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça), e Applied Biosystems(Foster City, CA) , bem como muitas outras fontescomerciais conhecidas por alguém de experiência.Adicionalmente, aqueles de experiência na técnicareconhecerão como selecionar um fluoroforo apropriadopara uma particular aplicação e, se ele não estiverprontamente disponível comercialmente, será capaz de sintetizar o fluoroforo necessário de novo ou modificarsinteticamente compostos fluorescentes comercialmentedisponíveis para chegar ao rótulo fluorescente desejado.Em adição a fluoroforos de moléculas pequenas, proteínasfluorescentes de ocorrência natural e análogos engenheirados de tais proteínas são úteis na presenteinvenção. Tais proteínas incluem, por exemplo, proteínasfluorescentes verdes de cnidarianas (Ward e outros,Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine e outros,Comp. Biochem. Physiol. 72B:77-85 (1982 )) , proteína fluorescente amarela de cepa Vibrio fischeri (Baldwin eoutros, Biochemistry [Bioquímica] 29:5509-15 (1990)),Peridinin-clorofila de dinoflagelato Symbiodinium sp.(Morris e outros, Plant Molecular Biology [Biologiamolecular de plantas] 24:673-77 (1994)),ficobiliproteínas de cianobacteria marinha, tal comSynechoccus, p.ex., ficoeritrina e ficocianina (Wilbankse outros, J. Biol. Chem. 268:1226-35 (1993)), esimilares.
Geralmente, antes de formar a ligação entre a citotoxinae o agente direcionador (ou outro), e opcionalmente, ogrupo espaçador, pelo menos uma das funcionalidadesquímicas será ativada. Alguém de experiência na técnicaapreciará que uma variedade de funcionalidades químicas,incluindo grupos hidróxi, amino, e carboxi, podem ser ativadas usando uma variedade de métodos e condiçõesstandard. Por exemplo, um grupo hidroxila da citotoxinaou agente direcionador pode ser ativado por tratamentocom um fosgeno para formar o correspondente cloroformato,ou p-nitrofenilcloroformato para formar o correspondentecarbonato.
Em uma configuração exemplar, a invenção faz uso de umagente direcionador que inclui uma funcionalidadecarboxila. Grupos carboxila podem ser ativados por, porexemplo, a conversão para o correspondente haleto deacila ou éster ativo. Esta reação pode ser executada sobuma variedade de condições como ilustrado em March7 suprapágs. 388-89. Em uma configuração exemplar, o haleto deacila é preparado pela reação do grupo contendo carboxilacom cloreto de oxalila. 0 agente ativado é reagido comuma citotoxina ou combinação de citotoxina-braço deligante para formar um conjugado da invenção. Aqueles deexperiência na técnica apreciarão que o uso de agentesdirecionadores contendo carboxila é meramenteilustrativo, e que agentes tendo muitos outros gruposfuncionais podem ser conjugados aos ligantes da invenção.
Grupos funcionais reativos
Para clareza de ilustração a discussão que segue sefocaliza na conjugação de uma citotoxina da invenção comum agente direcionador. 0 foco exemplifica umaconfiguração da invenção a partir da qual outras sãoprontamente inferidas por alguém experiente na técnica.
Nenhuma limitação da invenção é implicada, focalizando adiscussão em uma única configuração.
Compostos exemplares da invenção suportam um grupofuncional reativo, o qual está geralmente localizado emuma cadeia de alquila ou heteroalquila substituído ou nãosubstituído, permitindo sua fácil ligação a uma outraespécie. Um local conveniente para o grupo reativo é aposição terminal da cadeia.
Grupos reativos e reações úteis na prática da presenteinvenção são geralmente aqueles que são bem conhecidos natécnica de química de bioconjugado. 0 grupo funcionalreativo pode ser protegido ou não protegido, e a naturezaprotegida do grupo pode ser modificada por métodosconhecidos na técnca de síntese orgânica. Classescorrentemente favorecidas de reações disponíveis comanálogos de citotoxina reativos são aquelas queprosseguem sob condições relativamente suaves. Estesincluem, mas não estão limitados a substituiçõesnucleofílicas (p.ex., reações de aminas e álcoois comhaletos de acila, ésteres ativos), substituiçõeseletrofílicas (p.ex. reações de enamina) e adições aligações múltiplas de carbono-carbono e carbono-heteroátomo (p.ex., reação de Michael, adição de Diels-Alder). Estas e outras reações úteis são discutidas em,por exemplo, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY [Químicaorgânica avançada], 3a Ed., John Wiley & Sons, Nova York,1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES [Técnicas debioconjugados], Academic Press, San Diego, 1996; e Feeneye outros, MODIFICATION OF PROTEINS [Modificação deproteínas]; Advances in Chemistry Series [Série deavanços em química], Vol. 198, American Chemical Society,Washington, D.C., 1982.
Tipos de reações exemplares incluem a reação de gruposcarboxila e vários derivados dos mesmos incluindo, masnão limitados a, N-hidroxisuccinimida ésteres, N-hidroxibenzitriazol ésteres, haletos de ácido, acilimidazóis, tioésteres, p-nitrofenil ésteres, ésteres dealquila, alquenila, alquinila e aromáticos. Os gruposhidroxila podem ser convertidos para ésteres, éteres,aldeídos, etc. Os grupos haloalquila são convertidos paranovas espécies por reação com, por exemplo, uma amina, umânion de carboxilato, ânion de tiol, carbanion, ou um íonde alcóxido. Grupos dienófilos (p.ex., maleimida)participam em Diels-Alder. Grupos aldeído ou cetona podemser convertidos para iminas, hidrazonas, semicarbazonasou oximas, ou via tais mecanismos com adição de Grignardou adição de alquillítio. Haletos de sulfonila reagemprontamente com aminas, por exemplo, para formarsulfonamidas. Grupos amina ou sulfidrila são, porexemplo, acilados, alquilados ou oxidados. Alquenos podemser convertidos para uma série de novas espécies usandocicloadições, acilação, adição de Michael, etc. Epóxidosreagem prontamente com aminas e compostos hidroxila.Alguém experiente na técnica prontamente apreciará que muitas destas ligações podem ser produzidas em umavariedade de modos e usando uma variedade de condições.Para a preparação de ésteres, veja, p.ex., March supra em1157; para tioésteres, veja, March, supra em 362-363,491, 720-722, 829, 941, e 1172; para carbonatos, veja, March, supra em 346-347; para carbamatos, veja, March,supra em 1156-57; para amidas, veja, March supra em 1152;para uréias e tiouréias, veja, March supra em 1174; paraacetais e cetais, veja, Greene e outros, supra 178-210 eMarch supra em 1146; para derivados de aciloxialquila,veja PRODRUGS: TOPICAL AND OCULAR DRUG DELIVERY [Pró-fármacos: Liberação de fármaco tópico e ocular], Κ. B.Sloan, ed. Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1992; paraenol ésteres, veja, March supra em 1160; para N-sulfonilimidatos, veja, Bundgaard e outros, J. Med. Chem., 31:2066 (1988); para anidridos, veja, March supraem 355-56, 636-37, 990-91, e 1154; para N-acilamidas,veja, March supra em 379; para bases de N-Mannich, veja,March supra em 800-02, e 828; para hidroximetil cetonaésteres, veja, Petracek e outros, Annals NY Acad. Sci., 507:353-54 (1987); para dissulfetos, veja March supra em1160; e para fosfonato ésteres e fosfonamidatos.Os grupos funcionais reativos podem ser protegidos eescolhidos tal que eles não participem em, ou interfiramcom, as reações. Alternativamente, um grupo funcional reativo pode ser protegido de participar na reação pelapresença de um grupo protetor. Aqueles experientes natécnica entenderão como proteger um particular grupofuncional de interferir com um conjunto escolhido decondições de reação. Para exemplos de grupos protetores úteis, veja Greene e outros, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS [Grupos protetores em síntese orgânica], JohnWiley & Sons, Nova York, 1991.Tipicamente, o agente direcionador é ligadocovalentemente a uma citotoxina usando técnicas químicasstandard através de suas respectivas funcionalidadesquímicas. Opcionalmente, o ligante ou agente é acopladoao agente através de um ou mais grupos espaçadores. Osgrupos espaçadores podem ser equivalentes ou diferentesquando usados em combinação.
Geralmente, antes de formar a ligação entre a citotoxinae o grupo funcional reativo, e opcionalmente, o grupoespaçador, pelo menos uma das funcionalidades químicasserá ativada. Alguém experiente na técnica apreciará queuma variedade de funcionaldades químicas, incluindogrupos hidróxi, amino, e carboxi, podem ser ativadasusando uma variedade de métodos e condições standard. Emuma configuração exemplar, a invenção compreende umafuncionalidade carboxila como um grupo funcional reativo.Grupos carboxila podem ser ativados como descrito aquiacima.
FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO
Em uma outra configuração preferida, a presente invençãoprovê uma formulação farmacêutica compreendendo umcomposto da invenção e um portador farmaceuticamenteaceitável.
Os compostos descritos aqui ncluindo portadoresfarmaceuticamente aceitáveis tais como sais de adição ouhidratos dos mesmos, podem ser fornecidos a um pacienteusando uma ampla variedade de rotas ou modos deadministração. Rotas de administração adequadas incluem,mas não estão limitadas a, administração por inalação,transdérmica, oral, retal, transmucosal, intestinal eparenteral, incluindo injeções intramusculares,subcutâneas e intravenosas. Preferivelmente, osconjugados da invenção compreendendo um anticorpo oufragmento de anticorpo como a parcela direcionadora sãoadministrados parenteralmente, mais preferivelmenteintravenosamente.
Como usado aqui, os termos "administrar" ou"administração" são intencionados a abranger todos osmeios para diretamente e indiretamente liberar umcomposto a seu sítio pretendido de ação.
Os compostos descritos aqui, ou sais e/ou hidratosfarmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem seradministrados separadamente, em combinação com outroscompostos da invenção, e/ou em coquetéis combinados comoutros agentes terapêuticos. Claro, a escolha dos agentesterapêuticos que podem ser co-adminsitrados com oscompostos da invenção dependerá, em parte, da condiçãosendo tratada.
Por exemplo, quando administrados a pacientes sofrendo deum estado de doença causado por um organismo que dependede um autoindutor, os compostos da invenção podem seradministrados em coquetéis contendo agentes usados paratratar a dor, infecção e outros sintomas e efeitoslaterais comumente associados com a doença. Tais agentesincluem, p.ex., analgésicos, antibióticos, etc.
Quando administrados a um paciente passando portratamento de câncer, os compostos podem seradministrados em coquetéis contendo agentes anticâncere/ou agentes potencializadores suplementares. Oscompostos também podem ser administrados em coquetéiscontendo agentes que tratam os efeitos laterais deterapia por radiação, tal como antieméticos, protetoresde radiação, etc.
Agentes potencializadores suplementares que podem ser co-administrados com os compostos da invenção incluem,p.ex., fármacos tricíclicos e antidepressivos (p.ex.,imipramina, desipramina, amitriptilina, clomipramina,trimipramina, doxepina, nortriptilina, protriptilina,amoxapina e maprotilina); fármacos não tricíclicos eantidepressivos (p.ex., sertralina, trazodona ecitalopram); antagonistas de Ca+2 (p.ex., verapamil,nifedipina, nitrendipina e caroverina); anfotericina;análogos de triparanol (p.ex., tamoxifeno); fármacosantiarrítmicos (p.ex., quinidina); fármacos anti-hipertensivos (p.ex., reserpina); esgotadores de tiolp.ex., butionina e sulfoximina); e leucovorin cálcio.0(s) composto(s) ativo(s) da invenção é(são)administrado (s) per se ou na forma de uma composição farmacêutica onde o(s) composto(s) ativo(s) está(ão)misturado(s) com um ou mais portadores, excipientes oudiluentes farmaceuticamente aceitáveis. As composiçõesfarmacêuticas para uso de acordo com a presente invençãosão tipicamente formuladas de uma maneira convencional usando um ou mais portadores fisiologicamente aceitáveiscompreendendo excipientes e auxiliares, o que facilita oprocessamento dos compostos ativos em preparações asquais podem ser usadas farmaceuticamente. A formulaçãocorreta é dependente da rota de admnistração escolhida. Para administração transmucosal, penetrantes apropriadospara a barreira a ser permeada são usados na formulação.Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.Para administração oral, os compostos podem serformulados prontamente combinando o(s) composto(s) ativo(s) com portadores farmaceuticamente aceitáveis bemconhecidos na técnica. Tais portadores permitem oscompostos da invenção serem formulados como comprimidos,pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes,pastas, suspensões e similares, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas parauso oral podem ser excipientes sólidos obtidos,opcionalmente moendo uma mistura resultante, eprocessando a mistura de grânulos, após adicionarauxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são, emparticular, cargas tais como açúcares, incluindo lactose,sucrose, manitol ou sorbitol; preparações de celulosetais como, por exemplo, amido de milho, amido de aveia,amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose,sódio carboximetilcelulose, e/ou polivinilpirrolidona(PVP) . Se desejado, agentes desintegradores podem seradicionados, tais como a polivinil pirrolidonareticulada, Ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmotal como alginato de sódio.
Núcleos de drágeas são providos com revestimentosadequados. Para este propósito, soluções de açúcarconcentradas podem ser usadas, as quais podemopcionalmente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, e/oudióxido de titânio, soluções de laca, e solventesorgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes oupigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ourevestimentos de drágeas para identificação ou paracaracterizar diferentes combinações de doses de compostoativo.
As preparações farmacêuticas que podem ser usadasoralmente incluem cápsulas de empurrar-encaixarproduzidas de gelatina, bem como cápsulas seladas,macias, produzidas de gelatina e um plastificante, talcomo glicerol ou sorbitol. As cápsulas de empurrar-encaixar podem conter os ingredientes ativos em misturacom carga tal como lactose, ligantes tais como amidos,e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato demagnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulasmacias, os compostos ativos podem ser dissolvidos oususpensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos,parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Emadição, estabilizantes podem ser adicionados. Todas asformulações para administração oral devem ser em dosagensadequadas para tal administração.
Para administração bucal, as composições podem assumir aforma de comprimidos ou losangos formulados de maneiraconvencional.
Para administração por inalação, os compostos de acordocom a presente invenção são convenientemente fornecidosna forma de uma apresentação de spray de aerosol a partirde pacotes pressurizados ou um nebulizador, com o uso deum propelente adequado, p.ex., diclorodifluorometano,triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxidode carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerosolpressurizado a unidade de dosagem pode ser determinadaprovendo uma válvula para fornecer uma quantidadeaferida. Cápsulas e cartuchos de p.ex., gelatina para usoem um inalador ou insuflador podem ser formuladascontendo uma mistura em pó do composto e uma base em póadequada tal como lactose ou amido.
Os compostos podem ser formulados para administraçãoparenteral por injeção, p.ex., por injeção de bolus ouinfusão continua. Injeção é um método preferido deadministração para as composições da presente invenção.
As formulações para injeção podem ser apresentadas emforma de dosagem unitária, p.ex., em ampolas ou emrecipientes multidose, com um preservante adicionado. Ascomposições podem assumir tais formas como suspensões,soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, epodem conter agentes formulatórios tais como suspensores,estabilizantes e/ou agentes dispersantes podem seradicionados, tal como a polivinil pirrolidona reticulada,Ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo tal comoalginato de sódio.
As formulações farmacêuticas para administraçãoparenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativosem forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões doscompostos ativos podem ser preparadas como suspensões deinjeção oleosas apropriadas. Solventes ou veículosliofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleode gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, taiscomo oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomos. Assuspensões de injeção aquosas podem conter substâncias,as quais aumentam a viscosidade da suspensão, tal comosódio carboximetil celulose, sorbitol ou dextrano.
Opcionalmente, a suspensão também pode conterestabilizantes ou agentes adequados, que aumentem asolubilidade dos compostos para permitir a preparação desoluções altamente concentradas. Para injeção, os agentesda invenção podem ser formulados em soluções aguosas,preferivelmente em tamponadores fisiologicamentecompatíveis tais como solução de Hankj solução de Ringer,ou tamponador salino fisiológico.
Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na formade pó para constituição com um veículo adequado, p.ex.,água livre de pirógeno estéril, antes de usar.Os compostos também podem ser formulados em composiçõesretais tais como supositórios ou enemas de retenção,p.ex., contendo bases de supositório convencionais taiscom manteiga de cacau ou outros glicerídeos.Em adição às formulações descritas anteriormente, oscompostos também podem ser formulados como uma preparaçãode depósito. Tais formulações de longa atuação podem seradministradas por implantação ou liberação transcutânea(p.ex., subcutaneamente ou intramuscularmente) , injeçãointramuscular ou emplastro transdérmico. Assim, porexemplo, o composto pode ser formulado com materiaispoliméricos ou hidrofóbicos adequados (p.ex., como umaemulsão em um óleo aceitável) ou resinas de trocas deíons, ou como derivados solúveis frugalmente, porexemplo, como um sal solúvel frugalmente.
As composições farmacêuticas também podem compreenderportadores ou excipientes de fase sólida ou gel adequados. Exemplos de tais portadores ou excipientesincluem mas não estão limitados a carbonato de cálcio,fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados decelulose, gelatina, e polímeros tais como polietilenoglicóis.
Uma composição farmacêutica preferida é uma composiçãoformulada para injeção tal como uma injeção intravenosa einclui cerca de 0,01% a cerca de 100% em peso doconjugado fármaco-ligante, baseado em 100% de peso dacomposição farmacêutica total. 0 conjugado de fármaco- ligante pode ser um conjugado de anticorpo-citotoxinaonde o anticorpo foi selecionado para alvejar umparticular câncer.BIBLIOTECAS
Também dentro do escopo da presente invenção estãobibliotecas da citotoxina, conjugados citotoxina-ligantee agente-ligante das citotoxinas e ligantes da invenção.As bibliotecas exemplares incluem pelo menos 10compostos, mais preferivelmente pelo menos 100 compostos,ainda mais preferivelmente pelo menos 1.000 compostos eainda mais preferivelmente pelo menos 100.000 compostos.As bibliotecas em uma forma que sejam prontamentepesquisadas quanto a uma particular propriedade, p.ex.,citotoxicidade, clivagem de um ligante por uma enzima, ououtro reagente de clivagem. As formas exemplares incluemformatos de fatias, micro-arranjos, e similares.Paralela ou combinatorial, a síntese tem como seuobjetivo primário a geração de uma biblioteca de diversasmoléculas as quais todas compartilham uma característicacomum, referida através de toda esta descrição como umesqueleto. Substituindo diferentes parcelas em cada umadas partes variáveis da molécula esqueleto, a quantidadede espaço explorável em uma biblioteca cresce. Teorias ea química medicinal moderna advogam o conceito de espaçoocupado como um fator-chave para determinar a eficácia deum dado composto contra um dado alvo biológico. Criandouma biblioteca diversa de moléculas, que explore umagrande porcentagem do espaço alvejado, a diferença emdesenvolver um composto guia altamente eficaz aumentadramaticamente.
A síntese paralela é geralmente conduzida em um suportede fase sólida, tal como uma resina polimérica. 0esqueleto, ou outro intermediário adequado éclivavelmente ajuntado à resina por um ligante químico.As reações são executadas para modificar o esqueletoenquanto ligado à partícula. Variações em reagentes e/oucondições de reação produzem a diversidade estrutural, aqual é a marca de qualidade de cada biblioteca.
A síntese paralela de moléculas "pequenas" (não-oligômeros com um peso molecular de 200-1.000) foiraramente tentada antes de 1990. Veja7 por exemplo, Campse outros, Annaks de Quíica, 70:848 (1990). Recentemente,Ellmann divulgou a síntese paralela suportada em fasesólida (também referida como "combinatorial") de onzeanálogos benzodiazepina junto com algumas prostaglandinase miméticos de curva beta. Estas divulgações sãoexemplificadas na patente U.S. n° 5.288.514. Uma outradivulgação relevante de síntese paralela de moléculaspequenas pode ser encontrada na patente U.S. n°5.324.483. Esta patente divulga a síntese paralela entre4 e 40 compostos em cada um dos dezesseis esqueletosdiferentes. Chen e outros também aplicaram estratégias desíntese orgânica para desenvolver bibliotecas de nãopeptídeos sintetizados usando processos multietapa em umsuporte polimérico. (Chen e outros, J. Am. Chem. Soc.,116 : 2661-2662 (1994) ).
Uma vez que uma biblioteca de compostos únicos épreparada, a preparação de uma biblioteca deimunoconjugados, ou anticorpos pode ser preparada usandoa biblioteca de autoindutores como um ponto de partida eusando os métodos descritos aqui.
KITS
Em um aspecto, a presente invenção provê kits contendo umou mais dos compostos ou composições da invenção edireções para usar o composto ou composição. Em umaconfiguração exemplar, a invenção provê um kit paraconjugar um braço de ligante da invenção a uma outramolécula. 0 kit inclui o ligante, e direções para ligar oligante a um particular grupo funcional. 0 kit tambémpode incluir um ou mais de um fármaco citotóxico, umagente direcionador, um rótulo detectável, saisfarmacêuticos ou tamponadores. 0 kit também pode incluirum recipiente e opcionalmente uma ou mais garrafinhas,tubos de ensaio, frascos, garrafas ou seringas. Outrosformatos para kits serão aparentes àqueles experientes natécnica e estão dentro do escopo da presente invenção.
PURIFICAÇÃOEm uma outra configuração exemplar, a presente invençãoprovê um método para isolar um alvo molecular para umligante-citotoxina da invenção, que se liga ao liganteX4. o método preferivelmente compreende contatar uma5 preparação celular que inclui o alvo com um compostoimobilizado, formando dessa forma um complexo entre oreceptor e o composto imobilizado.
A citotoxina da invenção pode ser imobilizada em umsuporte de afinidade por qualquer meio reconhecido natécnica. Alternativamente, a citotoxina pode serimobilizada usando um ou mais dos ligantes da invenção.Em ainda uma outra configuração exemplar, a invençãoprovê uma matriz de purificação de afinidade que incluium ligante da invenção.
O método da invenção para isolar um alvo utilizarátipicamente uma ou mais técnicas de cromatograf ia deafinidade. A cromatografia de afinidade permite aisolação eficiente de espécies tais como moléculasbiológicas ou biopolímeros utilizando seus sítios dereconhecimento para certas estruturas químicas suportadascom um alto grau de seletividade. A literatura estárepleta de arigos, monografias, e livros sobre o assuntode cromatografia de afinidade, incluindo tais tópicoscomo suportes de cromatografia de afinidade, membros dereticulação, ligantes e sua preparação e uso. Umaamostragem daquelas referências inclui: Ostrove, MethodsEnzymol. 182:357-71 (1990); Ferment, Bioeng. 70:199-209(1990). Huang e outros, J. Chromatogr. 492:431-69 (1989);"Purification of enzymes by heparin-Sepharose affinitychromatografphy" [Purificação de enzimas porcromatografia de afinidade de heparina-sefarose] , J.Chromatogr., 184:335-45 (1980); Farooqi, Enzyme Eng.,4:441-2 (1978); Nishikawa, Chem. Technol., 5(9):564-71(1975) ; Guilford e outros, em PRACT. HIGH PERFORM. LIQ.CHROMATOGR., Simpson (ed.), 193-206 (1976); Nishikawa,Proc. Int. Workshop Technol. Protein Sep. Improv. BloodPlasma Fractionation, Sandberg (ed.), 422-35; (1977)"Affinity chromatography of enzymes" [Cromatografia deafinidade de enzimas], Affinity Chromatorgr., Proc. Int.Symp. 25-38, (1977) (pub. 1978); e AFFINITYCHROMATOGRAPHY: A PRACTICAL APPROACH [Cromatografia de afinidade: uma solução prática], Dean e outros (ed.), IRLPress Limited, Oxford, Inglaterra (1985) . Aquelesexperientes na técnica têm ampla orientação paradesenvolver particulares métodos de cromatografia deafinidade utilizando os materiais da invenção. No presente método, os meios cromatográficos de afinidadede estruturas químicas variadas podem ser usados comosuportes. Por exemplo, géis de agarose e géis de agarosereticulados são úteis como materiais-suporte, porque suahidrofilicidade os torna relativamente livres de ligaçõesnão específicas. Outros suportes úteis incluem, porexemplo, glóbulos de vidro de poros controlados (CPG),partículas de celulose, glóbulos de gel de poliacrilamidae glóbulos de gel Sephadex® feitos de dextrano eepiclohidrina.
MÉTODOS DE USO DE CONJUGADO DE FÁRMACO-LIGANTE
Em adição às composições e construções descritas acima, apresente invenção também provê um número de métodos quepodem ser praticados utilizando os compostos e conjugadosda invenção. Os métodos para usar o conjugado de fármaco- ligadnte da presente invenção incluem: matar ou inibir ocrescimento ou replicação de uma célula tumoral ou célulade câncer, tratar câncer, tratar uma condição pré-cancerosa, matar ou inibir o crescimento ou replicação deuma célula que expresse um anticorpo autoimune, tratar uma doença autoimune, tratar uma doença infecciosa,impedir a multiplicação de uma célula tumoral ou célulade câncer, evitar câncer, evitar a multiplicação de umacélula que expresse um anticorpo autoimune, evitar umadoença auto-imune, e impedir uma doença infecciosa. Estes métodos de uso compreendem administrar a um animal talcomo um mamífero ou um humano necessitando o mesmo umaquantidade efetiva de um conjugado fármaco-ligante. Osligantes preferidos para muitos dos métodos de usodescritos aqui incluem anticorpos e fragmentos deanticorpos que alvejam a particular célula tumoral,célula de câncer, ou outra área alvo.
0 complexo de fármaco-ligante da presente invenção é útilpara tratar câncer, doença auto-imune e doença infecciosaem um animal. Composições e métodos para tratar tumoresprovendo a um sujeito a composição de uma maneirafarmaceuticamente aceitável, com uma quantidadefarmaceuticamente efetiva de uma composição da presenteinvenção são providos.
A presente invenção é particularmente útil para otratamento de câncer e para a inibição da multiplicaçãode duma célula tumoral ou célula de câncer em um animal.
Câncer, ou uma condição pré-cancerosa, inclui, mas nãoestá limitado a, um tumor, metástase, ou qualquer doençaou distúrbio caracterizado por crescimento descontroladode células, pode ser tratado ou evitado pelaadministração do complexo fármaco-ligante da presenteinvenção. O complexo libera o fármaco para uma célulatumoral ou célula de câncer. Em uma configuração, oligante especificamente se liga a ou se associa com umacélula de câncer ou um antígeno associado com célulatumora. Por causa de sua vizinhança próxima ao ligante, ofármaco pode ser assumido dentro de uma célula tumoral oucélula de câncer através de, por exemplo, endocitosemediada por receptor. O antígeno pode ser ligado a umacélula tumoral ou célula de câncer ou pode ser umaproteína de matriz extracelular associada com a célulatumoral ou célula de câncer. Uma vez dentro da célula, oligante é hidroliticamente clivado por proteasesesassociadas com uma célula tumoral ou célula de câncer,liberando assim o fármaco. O fármaco liberado está entãolivre para se difundir e induzir atividades citotóxicas.
Em uma configuração alternativa, o fármaco é clivado apartir do complexo fármaco-ligante para fora da célulatumora ou célula de câncer, e o fármaco subseqüentementepentra na célula.
O ligante pode se ligar a, por exemplo, uma célulatumoral ou célula de câncer, um antígeno de célulatumoral ou célula de câncer que esteja sobre a superfícieda célula tumoral ou célula de câncer, ou um antígeno decélula tumoral ou célula de câncer que seja uma proteínade matriz extracelular associada com a célula tumoral oucélula de câncer. O ligante pode ser projetadoespecificamente para um particular tipo de célula tumoralou célula de câncer. Portanto, o tipo de tumores oucânceres que podem ser efetivamente tratados pode seralterado pela escolha do ligante.
Exemplos representativos de condições pré-cancerosas quepodem ser alvejadas pelo conjugado de fármaco-ligante,incluem, mas não estão limitados a: metaplasia,hiperplasia, displasia, pólipos colorretais, cetatoseactínica, quelite actínica, papilomavírus humano,leucoplaquia, lychen planus e doença de Bowen.Exemplos representativos de cânceres ou tumores que podemser alvejados pelo conjugado de fármaco-ligante incluem,mas não estão limitados a: câncer de pulmão, câncer docólon, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama,câncer de ovário, câncer testicular, câncer CNS, câncerrenal, câncer do rim, câncer pancreático, câncer doestômago, câncer oral, câncer nasal, câncer cervical eleucemias. Será prontamente aparente ao técnicoordinariamente experiente que o particular ligantedirecionador usado no conjugado pode ser escolhido talque ele alveje o fármaco para o tecido tumoral a sertratado com o fármcao (isto é, um agente direcionadorespecífico para um antígeno específico para o tumor éescolhido). Exemplos de tais ligantes direcionadores sãobem conhecidos na técnica, exemplos não limitantes dosquais incluem anti-Her2 para tratamento de câncer demama, anti-CD20 para tratamento de linfoma, anti-PSMApara tratamento de câncer de próstata e anti-CD3 0 paratratamento de linfomas, incluindo linfoma não de Hodgkin.Em uma configuração, a presente invenção provê um métodopara matar uma célula. 0 método inclui administrar àcélula uma quantidade de um composto da invençãosuificiente para matar a citada célula. Em umaconfiguração exemplar, o composto é administrado a umsujeito suportando a célula. Em uma configuraçãoadicionalmente exemplar, a administração serve pararetardar ou interromper o crescimento de um tumor queinclui a célula (p.ex., a célula pode ser uma célulatumoral). Para a administração para retardar ocrescimento, a taxa de crescimento da célula deve serpelo menos 10% menor que a taxa de crescimento antes daadministração. Preferivelmente, a taxa de crescimentoserá retardada pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 90%, ou completamente interrompida.
Dosagens efetivas
As composições farmacêuticas adequadas para uso com apresente invenção incluem composições onde o ingredienteativo está contido em uma quantidade terapeuticamenteefetiva, isto é, uma quantidade efetiva para conseguirseu propósito intencionado. A quantidade real efetivapara uma particular aplicação dependerá, inter alia, dacondição sendo tratada. A determinação de uma quantidadeefetiva está bem dentro das capacidades daquelesexperientes na técnica, especialmente à luz da divulgaçãodetalhada aqui.
Para qualquer composto descrito aqui, a quantidadeterapeuticamente efetiva pode ser inicialmentedeterminada a partir de ensaios de cultura de células.
Concentrações alvo do plasma serão aquelas concentraçõesde composto(s) ativo(s) que sejam capazes de inibição decrescimento ou divisão de células. Em configuraçõespreferidas, a atividade celular é pelo menos 25% inibida.As concentrações alvo do plasma de composto(s) ativo(s)que são capazes de induzir pelo menos cerca de 50%, 75%,ou até mesmo 90% ou inibição mais alta de atividadecelular são presentemente preferidas. A porcentagem deinibição de atividade celular no paciente pode sermonitorada para avaliar a adequabilidade da concentraçãode fármaco no plasma alcançada, e a dosagem pode serajustada para cima ou para baixo para alcançar a porcentagem desejada de inibição.
Como é bem sabido na técnica, quantidadesterapeuticamente efetivas para uso em humanos tambémpodem ser determinadas a partir de modelos animais. Porexemplo, uma dose para humanos pode ser formulada para alcançar uma concentração circultante que tenha sidodescoberta a ser efetiva em animais. A dosagem em humanospode ser ajustada monitorando a inibição celular eajustando a dosagem para cima ou para baixo, comodescrito acima.
Uma dose terapeuticamente efetiva também pode serdeterminada a partir de dados humanos para compostos quesão sabidos a exibir atividades farmacológicas similares.A dose aplicada pode ser ajustada baseada nabiodisponibilidade relativa e potência do compostoadministrado como comparado com o composto conhecido.
Ajustar a dose para alcançar máxima eficácia em humanosbaseado nos métodos descritos acima e outros métodos sãobem conhecidos na técnica e estão bem dentro dascapacidades do técnico ordinariamente experiente.
No caso de administração local, a concentração circulantesistêmica do composto administrado não será de particularimportância. Em tais instâncias, o composto éadministrado de modo a alcançar uma concentração na árealocal efetiva para conseguir o resultado pretendido.
Para uso na profilaxia e/ou tratamento de doençasrelacionadas com proliferação celular anormal, umaconcentração circulante de composto administrado de cercade 0,001 μΜ a 2 0 μΜ é preferida, com cerca de 0,01 μΜ a 5μΜ sendo preferido.
Doses de paciente para a administração oral dos compostosdescritos aqui, tipicamente variam de cerca de 1 mg/diaaté cerca de 10.000 mg/dia, mais tipicamente de cerca de10 mg/dia a cerca de 1.000 mg/dia, e o mais tipicamentede cerca de 50 mg/dia a cerca de 500 mg/dia. Registradoem termos de peso corporal do paciente, as dosagenstípicas variam de cerca de 0,01 a cerca de 150 mg/dia,mais tipicamente de cerca de 0,1 a cerca de 15 mg/dia, eo mais tipicamente de cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg/dia,por exemplo 5 mg/kg/dia ou 3 mg/kg/dia.
Em pelo menos algumas configurações, doses de pacienteque retardam ou inibem o crescimento do tumor podem ser 1μmol/kg/dia ou menores. Por exemplo, as doses de pacientepodem ser 0,9, 0,6, 0,5, 0,45, 0,3, 0,2, 0,15, ou 0,1μmol/kg/dia ou menores (referindo-se a mols do fármaco) .
Preferivelmente, o conjugado anticorpo-fármaco retarda ocrescimento do tumor quando administrado na quantidade dedosagem diária durante um período de pelo menos cincodias. Em algumas configurações, o tumor é um tumor tipohumano em um camundongo SCID. Como um exemplo, ocamundongo SCID pode ser um camundongo CB17.SID(disponível de Taconic, Germantown, NY) .
Para outros modos de administração, a quantidade eintervalo de dosagens podem ser ajustados individualmentepara prover níveis do plasma do composto administradoefetivos para a particular indicação clínica sendotratada. Por exmeplo, em uma configuração, um composto deacordo com a invenção pode ser administrado emconcentrações relativamente altas múltiplas vezes pordia. Alternativamente, pode ser mais desejáveladministrar um composto da invenção em concentraçõesefetivas mínimas e usar um regime de administração menosfreqüente. Isto proverá um regime terapêutico que écomensurado com a gravidade da doença do indivíduo.Utilizando as técnicas fornecidas aqui, um regime detratamento terapêutico efetivo pode ser planejado o qualnão provoque substancial toxicidade e ainda sejatotalmente efetivo para tratar os sintomas clínicosdemonstrados pelo particular paciente. Este planejamentodeve envolver a escolha cuidadosa de composto ativoconsiderando fatores tais como potência do composto,biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente,presença e gravidade de efeitos laterais adversos, modopreferido de administração e o perfil de toxicidade doagente selecionado.
Os compostos, composições e métodos da presente invençãosão adicionalmente ilustrados pelos exemplos que seguem.Estes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas nãolimitar a invenção reivindicada.
EXEMPLOS
Materiais e métodos
Nos exemplos abaixo, a menos que declarado de outraforma, as temperaturas são dadas em graus Celsius (°C);as operações foram executadas a temperatura ambiente(tipicamente uma faixa de cerca de 18-25°C); a evaporaçãode solvente foi executada usando um evaporador rotativosob pressão reduzida (tipicamente, 4,5-30 mm de Hg) comuma temperatura de banho de até 60°C; o curso das reaçõesfoi tipicamente seguido por TLC e os tempos das reaçõessão providos para ilustração somente; os pontos de fusãonão foram corrigidos; os produtos exibiram RMN-1H e/oudados microanalíticos satisfatórios; os rendimentos sãofornecidos para ilustração somente; e as seguintesabreviações convencionais também são usadas: mp (ponto de fusão), 1 (litro(s)), ml (mililitros), mmol (milimols), g(gramas), mg (miligramas), min (minutos), LC-MS(cromatografia líquida-espectrometria de massa) e h(horas).
Os espectros de RMN-1H foram medidos em um espectômetroVarian Mercury 300 MHz e foram consistentes com asestruturas atribuídas. Os deslocamentos químicos foramrelatados em partes por milhão (ppm) campo abaixo apartir de tetrametilsilano. Os espectros de massa deeletro-spray foram registrados em um espectômetro de massa Perkin Elmer Sciex API 365. As análises elementaresforam executadas por Robertson Microlit Laboratories,Madison, NJ. A sílica gel para flash cromatografia foigrau Ε.Merck (230-400 mesh) . HPLC analítica de fasereversa foi executada em um instrumento HP 1100 ou VarianProStar 210 com uma coluna Phenomenex Luna 5 μm C-18(2)150 mm χ 4,6 mm ou uma coluna Varian Microsorb-MV 0,1 μπιC-18 150 mm χ 4,6 mm. Uma taxa de fluxo de 1 ml/min foigradiente de 0% a 50% de tamponador B durante 15 minutosou 10% a 100% de tamponador B durante 10 minutos comdetecção por UV a 2 54 nm. 0 tamponador A, formato deamônio 20 mM + acetonitrila a 20% ou ácidotrifluoroacético a 0,1% em acetonitrila; tamponador B,formato de amônio 20 mM + acetonitrila a 80% ou ácidotrifluoroacético aquoso a 0,1%. HPLC preparatória de fasereversa foi executada em um instrumento Varian ProStar215 com uma coluna Waters Delta Pak 15 μπι C-18 300 mm χ7,8 mm.
EXEMPLO 1: Síntese de conjugados de peptídeo-ligante1.1a Metodologia da síntese
Esquema 1
<formula>formula see original document page 144</formula><formula> formula see orginal document page 145</formula>Esquema 4
<formula>formula see original document page 146</formula>Esquema 5
<formula>formula see original document page 147</formula><formula>formula see original document page 148</formula>
1. Ib Síntese de Composto 1: N-[2'-(N'-ter-butoxicarbonil-amino)-etil]-valina ter-butil éster. A uma solução debrometo de 2-(N-ter-butoxicarbonil-amino)-etila (1 g, 4,5mmol) e valina ter-butil éster (0,936 g, 4,5 mmol) em DMF(10 ml) foi adicionado carbonato de potássio (1,85 g,13,5 mmols). A mistura assim obtida foi agitada a IOO0Cdurante a noite. A mistura da reação foi concentrada e oresíduo foi purificado por flash cromatografia em sílicagel com acetato de etila/hexanos (3/7) como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo (0,16 g,12%) . RMN 1H (CDCl3) δ 0.94 (ft, 6H) , 1.44 (s, 9H) , 1.473e 1.475 (2s, 9H) , 1.88 (m, 1H) , 2.51 (m, 1H) , 2.78 (m,2H) , 3.11 (m, 1H) , 3.22 (m, 1H) , 3.39 e 4.13 (2bt, 1H) ,5.00 (bs, 1H) ppm; LC-MS (ESI) 205 (M+H+-112), 261 (M+H+-Bu) , 317 (M+H+) .
1.1c Síntese de composto 2j_ N- (2-aminoetil) -valina. 0composto 1 (13 7 mg, 0,43 mmol) foi dissolvido em umasolução de TFA/diclorometano (2 ml, l/l) a temperaturaambiente. A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente por 3 0 min. A mistura da reação foiconcentrada até a secura para proporcionar o composto dotítulo como um óleo (0,18 g, 95%). RMN 1H (CD3OD) δ 1.07 e1.16 (2d, 6H) , 2.35 (m, 1H) , 3.2 (m, 1H) , 3.38 (m, 4H)ppm; LC-MS (ESI) 217 (M+H+) .
1. Id Síntese de Composto 3. A uma solução de maleamida-dPEG4-NHS éster (61 mg, 0,16 mmol) em diclorometano (2ml) foi adicionado por gotejamento o composto 2 (80,7 mg,0,16 mmol) e diisopropiletilamina (55,5 μΐ, 0,32 mmol) emdiclorometano (1 ml) . A mistura assim obtida foi agitadadurante a noite. O solvente foi removido no rotovap[evaporador rotativo], e o resíduo foi purificado porflash cromatografia em sílica gel com diclorometano,seguido por 5% de metanol em diclorometano e finalmente100% de metanol como eluente para proporcionar o compostodo título como óleo incolor. (87 mg, 97%) . RMN 1H (CDCl3)δ 1.08 (dd, 6H) , 2.25 (m, 1H) , 2.49 (t, 2H) , 2.52 (t,2H) , 3.10-3.79 (m, 25H) , 6.82 (s, 2H) ppm; LC-MS (ESI)559 (M+H+)
1.1e Síntese de Composto 4: Fmoc-Cit-PABOH. A uma soluçãode Fmoc-Cit-OH (1,0 g, 2,52 mmols) e álcool 4-aminobenzíIico (341 mg, 2,77 mmols) em diclorometano (10ml) e metanol (5 ml) foi adicionado 2-etoxi-l-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina [EEDQ] (1,24 g, 5,04mmols) em uma porção. A mistura foi agitada no escuro por16 horas. Os solvente foram removidos no rotovap, e osólido branco foi triturado com éter (100 ml) . Asuspensão resultante foi sonificada por 5 min e entãodeixada a ficar por 30 min. 0 sólido branco foi coletadopor filtração, lavado com éter e secado em vácuo (1,23 g,97%). RMN 1H (DMSO) δ 1.32 a 1.52 (m, 2H), 1.52 a 1.74(dm, 2H), 2.86 a 3.06 (dm, 2H), 4.1 (Μ, 1H), 4.42 (d,2H), 5.07 (t, 1H), 5.40 (bs, 2H), 5.97 (t, 1H), 7.19 a7.95 (m, 12H), 8.10 (d, 1H), 9.97 (s, 1H) ppm; LC-MS(ESI) 503.1 (M+H+).
l.lf Síntese de Composto 5: Fmoc-Cit-PABC-PNP. A umasolução de Composto 4 (309 mg, 0,62 mmol) e cloroformatode p-nitrofenila (372 mg, 1,85 mmol) em tetrahidrofurano(30 ml) e 1-metil-2-pirrolidina (1 ml) foi adicionadapiridina (100 μl, 1,23 mmol) em uma porção. A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente por 30minutos. Os solventes foram removidos no rotovap, e oresíduo foi purificado por flash cromatografia em sílicagel com diclorometano, seguido por 3% de metanol emdiclorometano e finalmente 10% de metanol emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um sólido branco (97,9 mg, 70%). LC-MS(ESI) 668 (M+H+).
1. Ig Síntese de Composto 6: Fmoc-Lys(Boc) -PABOH. 0Composto 6 foi preparado como descrito acima para oComposto 4 em rendimento de 98%. RMN 1H (DMSO) δ 1.40 (s,9H), 1.38 (m, 2H), 1.50 a 1.74 (dm, 2H), 3.04 (t, 2H),3.30 (q, 3H), 4.19 a 4.31 (m, 2H), 4.41 (d, 2H), 4.55(s, 2H), 7.28 a 7.68 (m, 12H), 8.00 (d, 1H) ppm; LC-MS(ESI) 574 (M+H+)
1.Ih Síntese de Composto 7: Fmoc-Lys(Boc)-PABC-PNP. 0Composto 7 foi preparado como descrito acima para oComposto 5 em rendimento de 70%. RMN 1H (CD3Cl) δ 1.44 (s,9H), 1.49-1.60 (m, 6H), 1.73 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 3.11(m, 1H), 3.20 (bs, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.46 (bs, 2H), 4.67(bs, 1H), 5.56 (bs, 1H), 7.28 (m, 2H), 7.36-7.41 (m, 6H),7.59 (m, 4H), 7.76 (d, 2H), 8.26 (dd, 2H), 8.45 (bs, 1H)ppm; LC-MS (ESI) 639 (M+H+-Boc), 684 (M+H+-Bu), 739(M+H+), 778 (M+K+).1.1i Síntese de Composto 8: Boc-Val-Cit-OH. A uma soluçãode Citrulina (2,54 g, 14,50 mmols) e bicarbonato de sódio(1,28 g) em água (40 ml) foi adicionado Boc-Val-OSu (4,34g, 13,81 mmols) dissolvido em dimetoxietano (DME). Paraauxiliar a solubilidade da mistura tetrahidrofurano (10ml) foi adicionado. A mistura assim obtida foi deixada aagitar durante a noite a temperatura ambiente. Ácidocítrico aquoso (15%, 75 ml) foi adicionado e a misturafoi extraída com 2-propanol/acetato de etila a 10% (2 χ10 0 ml) . A camada orgânica foi lavada com salmoura (2 χ150 ml) e os solventes foram removidos no rotovap. osólido branco resultante foi secado em vácuo por 5 horase então tratado com éter (100 ml). Após breve sonificaçãoe trituração, o produto sólido branco foi coletado porfiltração (1,39 g, 27%). RMN 1H (CD30D)ô 0.91 (dd, 3H) ,0.98 (dd, 3H) , 1.44 (s, 9H) , 1.70 (m, 2H) , 1.87 (m, 2H) ,2.02 (m, 2H) , 3.11 (t, 2H) , 3.89 (t, 1H) , 4.39 (q, 1H) ,8.22 (d, 1H) ppm; LC-MS (ESI) 375 (M+H+) .
1.1i Síntese de Composto 9: Boc-Val-Cit-PABOH. 0 Composto9 foi preparado como descrito acima para o Composto 4 em
rendimento de 71%. RMN 1H (CD3OD) δ 0.93 e 0.97 (2d, 6H) ,1.44 (s, 9H) , 1.58 (m, 2H) , 1.75 (m, 1H) , 1.90 (m, 1H) ,2.05 (m, 1H) , 3.10 (m, 1H) , 3.19 (m, 1H) , 3.91 (d, 1H) ,4.52 (m, 1H) , 5.25 (s, 2H) , 7.40 (d, 2H) , 7.45 (dd, 2H) ,7.64 (d, 4H) , 8.29 (dd, 2H) ppm; LC-MS (ESI) 480 (M+H+) .
1.1k Síntese de Composto 10: Boc-Val-Cit-PABC-PNP. Umasolução de Boc-Val-Cit-PABOH (178 mg, 0,370 mmol) em THF(8 ml) em CH2Cl2 (4 ml) foi agitada a temperaturaambiente com cloroformato de PNP (160 mg, 0,80 mmol) epiridina (65 μl, 0,80 mmol) por 3 h. Acetato de etila(100 ml) e ácido cítrico aquoso a 10% (50 ml) foramadicionados ã mistura da reação e a camada orgânica foilavada com salmoura, secada e concentrada e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel com 5%de metanol como um eluente para proporcionar o compostodo título como um sólido branco (165 mg, 70%) . RMN 1H(CD3OD) δ 0.93 (dd, 3H) , 0.97 (dd, 3H) , 1.44 (s, 9H) ,1.58 (m, 2Η), 1.75 (m, 1Η), 1.89 (m, 1Η), 2.05 (m, 1Η),3.10 (m, 1Η), 3.20 (m, 1Η), 3.90 (d, 1Η), 4.51 (m, 1Η),4.55 (s, 2Η), 7.29 (d, 2Η), 7.55 (d, 2Η) ppm; LC-MS (ESI)545 (Μ + H+ - Boc), 645 (Μ + H+), 667 (Μ + Na+), 683 (Μ + K+).
1.11 Síntese de Composto 12a. A uma suspensão de Composto11 (20 mg, 0,078 mmol) em acetato de etila (5 ml) foiborbulhado gás HCl por 2 0 min (com o tempo, a suspensãose tornou uma solução límpida). A mistura da reação foiagitada por adicionais 5 min e então a mistura foiconcentrada até a secura para proporcionar o composto dotítulo como um sólido amarelo (26 mg, 100%) que foi usadona etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS (ESI)260 (M + H+ - Cl), 295 (M + H+).
1.Im Síntese de Composto 12b. A uma suspensão de Composto11 (20 mg, 0,0978 mmol) em acetato de etila (5 ml) foiborbulhado gás HBr por 20 min (com o tempo, a suspensãose tornou uma solução límpida). A mistura da reação foiagitada por adicionais 5 min e então a mistura foiconcentrada até a secura para proporcionar o composto dotítulo como um sólido amarelo (33 mg, 100%) que foi usadona etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS (ESI)260 (M + H+ - Br), 339 (M + H+), 341 (M + H+ + 2).
1. In Síntese de Composto 13b. A uma solução de Composto12a (26 mg, 0,078 mmol) em DMF (2 ml) foram adicionadosácido 5(2-dimetilamino-etoxi)-benzofuran-2-carboxíIico(44 mg, 0,155 mmol) e EDC (30 mg, 0,155 mmol). A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente por 2 h.
A mistura foi concentrada e o resíduo foi dissolvido emH20/CH3CN/TFA (4/1,5/0,5, 6 ml) e ele foi colocado em umfreezer por 3 h. Um sólido amarelo foi coletado porfiltração (35 mg, 85%). RMN 1H (CD3OD) δ 2.67 (s, 3H),3.01 (s, 6H), 3.34 (m, 2H), 3.63 (ft, 1H), 3.89 (s, 3H),3.91 (m, 1H), 4.41 (m, 3H), 4.54 (m, 1H), 4.65 (m, 1H),7.20 (dd, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.59 (d, 1H),7.73 (bs, 1H), 11.75 (s, 1H) ppm; LC-MS (ESI) 490 (M + H+- Cl), 526 (M + H+)1.1o Síntese de Composto 13c. A uma solução de Composto12b (19 mg, 0,0387 mmol) em DMF (2 ml) foram adicionadosácido 5-(2-dimetilamino-etoxi)-benzofuran-2-carbox£lico,sal de HBr (25 mg, 0,0775 mmol) e OS-carbodiimida (82 mg,mmmol/g: 0,94, 0,0775 mmol). A mistura da reação foiagitada a temperatura ambiente por 24 h. Após filtração ofiltrado foi concentrado e o resíduo foi dissolvido emH20/CH3CN/RFA (2/0,75/0,25,3 ml) e ele foi colocado nofreezer por 3 h. O sólido amarelo foi coletado porfiltração e secado para proporcionar o composto do título(18 mg, 82%). LC-MS (ESI) 490 (M + H+ - Br), 570 (M +H+) , 572 (M + H+ + 2)
1.Ip Síntese de Composto 14a. A uma suspensão de Composto13a (48 mg, 0,10 mmol) em diclorometano (4 ml) foramadicionados cloroformato de p-nitrofenila (80 mg, 0,40mmol) e trietilamina (56 μΐ, 0,40 mmol) a -78°C. Amistura foi aquecida para temperatura ambiente lentamentee a agitação foi continuada por adicionais 30 min. Àmistura da reação foi adicionado o composto N-Boc-N,N'-dimetiletilenodiamina (166 mg, 0,80 mmol) e agitadodurante a noite. A mistura foi concentrada e o resíduofoi purificado por flash cromatografia em sílica gel commetanol a 1,25% em diclorometano como eluente paraproporcionar o composto do título como um sólido branco(71 mg, 100%). RMN 1H δ 1.45-1.47 (m, 9H), 2.69 (s, 3H),2.97 (s, 3H) , 3.14-3.34 (m, 4H) , 3.81-3.92 (m, 8H) , 4.38-4.47 (m, 3H) , 4.70 (d, 1H) , 7.05 (dd, 1H) , 7.11 (d, 1H) ,7.45 (s, 1H) , 7.48 (d, 1H) , 7.99 (s, 1H) , 10. 43 (s, 1H)ppm. LC-MS (ESI) 710 (M-H+)
1. Iq Síntese de Composto 14b. A uma suspensão de Composto13b (48 mg, 0,075 mmmol) em diclorometano (2 ml) foramadicionados cloroformato de 4-nitrofenila (80 mg, 0,4mmol) e trietilamina (40 mg, 0,4 mmol, 56 μl) a 0°C. Amistura foi aquecida até temperatura ambiente e aagitação foi continuada por adicionais 6 h. O solventefoi evaporado e o resíduo foi lavado com éter paraproporcionar o intermediário. O intermediário foidissolvido em diclorometano (2 ml) e à solução da reaçãofoi adicionado N-Boc-N,N'-dimetiletilenodiamina (44 mg,0,2 mmol) e trietilamina (20 mg, 0,2 mmol, 28 μΐ) . Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientedurante a noite. A mistura foi concentrada e o resíduofoi purificado por HPLC em coluna C-18 com formato deamônio (20 mM, pH 7,0) e acetonitrila como eluente paraproporcionar o composto do título como sólido branco (31mg, 54%) . LC-MS (ESI) 755 (M+H+)1.1r Síntese de Composto 14c. A uma suspensão de Composto13c (24 mg, 0,04 mmol) em CH2Cl2 (2 ml) foram adicionadoscloroformato de p-nitrofenila (64 mg, 0,32 mmol) etrietilamina (22 μΐ, 0,16 mmol) a 0°C. A mistura dareação assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 18 h. À mistura da reação foi adicionado N-Boc-NiN'-diemetiletilenodiamina (94 mg, 0,50 mmol) e a agitaçãofoi continuada por adicionais 50 min. A mistura da reaçãofoi concentrada e o resíduo foi purificado por flashcromatograf ia em sílica gel com metanol a 5% emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um sólido branco (28 mg, 83%) . LC-MS (ESI)490, 570, 684 (M + H+ - Boc) , 784 (M + H+), 805 (M + Na+),722 (M + K+)
1.1s Síntese de Composto 15a. Composto 14a (70 mg, 0,10mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (5 ml) e amistura foi agitada a temperatura ambiente por 30 min econcentrada até secura e o produto (72 mg, 100%) foiusado na etapa seguinte sem purificação adicional. HPLCmostrou ele ser >95% puro. RMN 1H δ 2.64 (s, 3H) , 2.9330 (s, 3H) , 3.19 (s, 3H) , 3.30 (t, 1H) , 3.79 (s, 3H) , 3.85(s, 3H) , 3.81-3.85 (m, 1H) , 4.27-4.49 (m, 3H) , 4.59 (d,1H) , 4.68 (d, 1H) , 6.97 (dd, 1H) , 7.03 (d, 1H) , 7.38 (s,1H) , 7.41 (d, 1H) , 8.00 (br s, 1H) , 10.61 (br s, 1H) ppm.LC-MS (ESI) 612 (M+H+) , 634 (M+Na+)
3 5 1. It Síntese de Composto 15b. 0 Composto 15b foi
preparado como descrito acima para o Composto 15a em umrendimento de 100%. RMN 1H (CD3OD) δ 2.69 (s, 3H) , 2.76(S, 3Η), 2.83 (bs, 1Η), 3.01 (s, 6Η), 3.08 (bs, 1Η), 3.24(bs, 2Η) , 3.42 (m, 2Η) , 3.63 (bs, 3Η) , 3.74 (bs, 1Η) ,3.91 (S, 3Η) , 3.92 (m, 1Η) , 4.40 (bs, 2Η) , 4.57 (bs, 2Η) ,4.71 (bs, 1Η) , 7.22 (bd, 1Η) , 7.36 (s, 1Η) , 7.56 (s, 1Η) ,7.59 (d, 1Η) , 8.04 (bs, 1Η) ppm; LC-MS (ESI) 490, 526,640 (Μ+Η+) , 678 (Μ+Κ+) .
1.Iu Síntese de Composto 15c. O Composto 15c foipreparado como descrito acima para o Composto 15a emrendimento de 100%. LC-MS (ESI) 490, 570, 684 (M + H+),722 (M + K+)
1.Iv Síntese de Composto 16a. A uma solução de Composto 5(12,5 mg, 0,019 mmol) e Composto 15a (10 mg, 0,014) emdimetilformamida (200 μΐ) foi adicionada trietilamina (6μl, 0,044 mmol) . A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente durante a noite. Éter (5 ml) foiadicionado à mistura e um sólido branco se precipitou dasolução. O sólido foi filtrado e purificado por flashcromatografia em sílica gel com diclorometano, seguidopor metanol a 1% em diclorometano, metanol a 2% emdiclorometano, metanol a 3% em diclorometano e finalmentemetanol a 4% em diclorometano como eluente paraproporcionar o composto do título como um sólido branco(8,7 mg, 56%). LC-MS (ESI) 470, 1112 (M+H+) , 1134 (M +Na+) , 1150 (M + K+)
1. Iw Síntese de Composto 16b: A uma solução de Composto15b (5 mg, 0,0056 mmol) em DMF (0,35 ml) foramadicionados Composto 5 (3,8 mg, 0,0056 mmol) e DIEA (2μl, 0,011 mmol) . A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente por 5 h. A mistura foi concentrada eo resíduo foi purificado por flash cromatografia emsílica gel com metanol a 10% em diclorometano comoeluente para proporcionar o composto do título como umsólido (3 mg, 45%). LC-MS (ESI) 490, 526, 1169 (M + H+),1208 (M + K+)
1. Ix Síntese de Composto 16c. O Composto 16c foipreparado como descrito acima para o Composto 16b emrendimento de 50%. LC-MS (ESI) 490, 570, 1212 (M + H+),1250 (Μ + K+)
1. Iy Síntese de Composto 17a. A uma solução de Composto16a (8,7 mg, 0,008 mmol) em dimetilformamida (500 μΐ) foiadicionada piperidina (100 μΐ) em uma porção. A misturaassim obtida foi agitada por 20 minutos a temperaturaambiente. O solvente foi removido no rotovap, e colocadoem alto vácuo por 1,5 h. 0 resíduo foi coletado naquantidade mínima de diclorometano (100 μΐ) e hexano (3ml) foi adicionado à solução, um sólido branco surgiu dasolução o qual foi filtrado e secado (6,7 mg, 96,7%). MS(ES) 470, 890.1 (M+H+) , 912 (M + Na+), 928 (M + K+).
l.lz Síntese de Composto 17b. 0 Composto 17b foipreparado como descrito acima para o Composto 17a emrendimento de 95%. LC-MS (ESI) 947 (M + H+)
1. Iaa Síntese de Composto 17c. O Composto 17c foipreparado como descrito acima para o Composto 17a emrendimento de 95%. LC-MS (ESI) 1015 (M + H+)
1. Ibb Síntese de Composto 18a. A uma solução de Composto17a (4,2 mg, 0,005 mmol) e Composto 3 (2,64 mg, 0,005mmoml) em diclorometano (1 ml) foi adicionado em umaporção PyBOP (3,7 mg, 0,0 07 mmol) seguido pordiisopropiletilamina (1 μl). A mistura assim obtida foiagitada durante a noite a temperatura ambiente. Ossolventes foram removidos no rotovap. O resíduo foipurificado por HPLC Prep para produzir um sóligo bege(2,6 mg, 38,7%). MS (ES) 470, 1431 (M + H+), 1453 (M +Na+), 1469 (M + K+)
1. Icc Síntese de Composto 18b. A uma solução de Composto17b (2,2 mg, 0,0025 mmol) e Composto 3 em metanol a 5% emdiclorometano (400 μl) foram adicionados HBTU (9 mg,0,0046 mmol) e DIEA (1,4 μl, 0,0046 mmol). A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente durante anoite. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado em HPLC semi-preparativa com formato de amônio10 mM e acetonitrila como eluente para proporcionar ocomposto do título como um óleo (1,1 mg, 30%). LC-MS(ESI) 490, 526, 1488 (M + H+), 1527 (M + K+)1. Idd Síntese de Composto 18c. A uma solução de Composto17c (6,5 mg, 0,0065 mmol) e o Composto 3 (5,5 mg, 0,0097mmmol) em metanol a 5% em diclorometano (0,5 ml) foramadicionados HBTU (3,7 mg, 0,0097 mmol) e DIEA (3,4 μΐ,0,0194 mmol). A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente durante a noite. O solvente foievaporado e o resíduo foi purificado por flashcromatografia em sílica gel com metanol a 30% emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um óleo (4 mg, 30%) . LC-MS (ESI) 1532(M+H+) , 1554 (M+Na+) , 1570 (M+K+) .
1.2 Metodologia da síntese para ligante de peptídeocontendo duocarmicina sem espaçador de auto-sacrifício
<formula>formula see original document page 157</formula>
1.2a Reação A: A uma suspensão de núcleo alquilante de 7mg em 2 ml de Acetato de Etila foi passada uma correntelenta de gás HBr seco até que uma solução límpida fosseformada o que levou aproximadamente 15 minutos. A misturada reação foi concentrada e secada durante a noite sobalto vácuo.
1.2b Reação Β: A uma suspensão do composto bromo metilseco preparado na etapa A em DMF foi adicionado EDC (10mg, 0,054 mmol) e ácido 5-nitro benzofuran carboxílico(12 mg, 0,054 mmol) e deixada a agitar por 6 horas. Aesta mistura da reação foi então adicionado acetado deetila e salmoura. As camadas orgânicas combinadas foramconcentradas após três extrações com acetato de etila. Efiltrado sobre sílica gel usando MeOH/DCM com quantidadescrescentes de MeOH. 0 produto foi confirmado por Espec.de Massa, M+l = 530.
1.2c Reação C: O 4'-OH foi desprotegido usando cloreto demetil piperazina carbonila (11 mg, 0,054 mmol) em 2 ml deDCM, 200 μΐ de álcool alílico e piridina (21 μΐ) por 2horas. O produto foi purificado por cromatografia decoluna de sílica gel e identificado por Espec. de Massa,MS+1 = 654.
1.2d Reação D: A redução do grupo Nitro foi feita porhidrogenólise sobre Pd/C em DCM/MeOH (2:1) sob 40 PSI por45 minutos. O produto foi filtrado e o filtradoconcentrado e secado sob alto vácuo. 0 produto foiconfirmado por análise de espec. de massa MS + 1 = ecarregado para a etapa seguinte sem purificaçãoadicional.
1.2e Reação Ε: A uma solução do composto acima (18 mg,0,024 mmol) em MeOH/DCM (2:1, 3 ml) foi adicionado Fmoc-Val-Citrulina (29 mg, 0,06 mmol) a mistura resultante foiagitada por 10 minutos até que todo ácido se dissolvesse.15 mg, 0,06 mmol de EEDQ foram adicionados e a mistura dareação foi agitada no escuro durante a noite. A misturada reação foi então concentrada, lavada com dietil éter eo resíduo foi purificado por HPLC Prep de fase reversapara proporcionar o produto que foi identificado porEspec. de Massa M+l = 1103.
1.2f Reação F: A desproteção do grupo protetor Fmoc foifeita usando piperidina a 5% em 1 ml de DMF por 10minutos. A concentração da mistura da reação foiacompanhada lavando o resíduo sólido com dietil éter. 0produto foi confirmado por Espec. de Massa, MS + 1 = 880e M + K = 919.
1.2g Reação G: A uma solução da amina livre em DMF (1,5ml) preparada na etapa F foi adicionado Mal-(PEG)4-NHS-éster (20 mg) e a mistura da reação agitada por 1 h. Aconcentração seguida por HPLC Prep de fase reversa depurificação proporcionou 2,8 mg de (rendimento global de11%, começando a partir do núcleo alquilante) que foiconfirmado por espec. de massa MS+1 = 2178, M+Na=1300 eM+K=1316.
1.3 Síntese de ligante de peptídeo conjugado comTubulsina A
<formula>formula see original document page 159</formula>
0 ligante pode ser ligado a PEG e o peptídeo ligante pelasíntese mostrada.<formula>formula see original document page 160</formula>
A síntese de intermediários e conjugado de ligante-fármaco tendo um ligante de peptídeo onde o fármaco éTubulsina A é mostrada aqui acima. Este método básicopode ser usado com outros fármacos.1.4a Síntese de conjugado de peptídeo-ligante 111
<formula> formula see orginal document page 161</formula>1.4b Síntese de conjugado de peptídeo-ligante 112
<formula>formula see original document page 162</formula>1.4c Síntese de conjugado de peptídeo-ligante 113
<formula>formula see original document page 163</formula>
EXEMPLO 2 : Síntese de conjugados de ligante de hidrazinade 6 membros
2.1 Síntese de um conjugado de ligante de gem-dimetilhidrazina de 6 membros com uma citotoxina derivada deduocarmicina
2.1a Esquema da síntese para o Composto 109
<formula>formula see original document page 163</formula><formula>formula see original document page 164</formula>
2.1b Síntese do Composto 110
A uma suspensão de Cbz-dimetil alanina (1 g, 3,98 mmols)em 30 ml de DCM em temperatura de banho de gelo foramadicionados HOAT (catalítico, 0,25 equivalente), DIPEA(2,8 ml, 16 mmols) seguido por hexafluorofosfato de 2-cloro-1, 3-dimetilimidazolidínio (CIP) (1,2 g, 4,4 mmols).A esta mistura da reação foi então adicionado Boc-NN(Me)(643 mols, 4,4 mmols). A mistura da reação foi deixada aagitar durante a noite a temperatura ambiente. À misturada reação é adicionada uma solução de ácido cítrico a 10%(100 ml) e extraída com DCM. A fase orgânica foi lavadacom água e então com uma solução saturada de bicarbonatode sódio seguida por água novamente. A fase orgânica foientão concentrada e purificada em uma coluna de sílicagel com polaridade crescente de acetato de etila emhexanos para proporcionar 860 mg, 57% de rendimento de107 que foi identificado por espec. de massa M+l = 380 eM+NH4+ = 3 97.
O grupo protetor Cbz foi removido por hidrogenaçãocatalítica usando Pd/C em MeOH para proporcionar ocomposto 108 que foi confirmado por Esp. de Massa.
A uma solução de PNPC-1918 (10 mg, 0,1 mmol) em 2 ml deDCM foi adicionada por gotejamento uma solução deComposto 108 (60 mg, 0,25 mmol) em 8 ml de DCM e amistura da reação foi deixada a agitar por 2 dias até quetodo o material de partida tivesse desaparecido. Amistura da reação foi filtrada através de um enchimento["pad"] de sílica gel e então concentrada e purificadapor HPLC Prep. de fase reversa para proporcionar 4,2 mgde Composto 109. Este foi identificado por Espec. deMassa M+l = 740. A desproteção de Boc do Composto 109 foifeita com TFA puro por 20 minutos para proporcionar oComposto 110. O produto foi identificado por Espec. deMassa, M+l = 640.
<formula>formula see original document page 165</formula>
2.1c Síntese do Composto 111
A Mal-PEG4-Acetofenona e Composto 110 (3 mg, 0,005 mmol)foram combinados, concentrados e secados durante a noitesob alto vácuo. A esta mistura foi adicionada uma soluçãode 1 ml de ácido acético a 5% preparada um dia antes esecada sobre peneiras moleculares. A formação dehidrazona estava completa em menos que uma hora. Depoisdo que a mistura da reação foi concentrada e purificadapor HPLC Prep de fase reversa (formato de amônio pH = 7)para proporcionar 2,8 mg de Composto 111 (rendimento de60%) . O produto foi identificado por Espec. de Massa,
MS+1 = 1129, M+NH4=1146 e M+K = 1168.
2.2 Síntese de um ligante de hidrazina de 6 membros degem-dimetila conjugado com uma citotoxina de tubulisina
<formula>formula see original document page 166</formula>
Metodologia similar à mostrada no Exemplo 2.1 pode seraplicada para a síntese de um ligante de hidrazina de 6membros de dimetila geminal complexado com um fármaco talcomo tugulisina A é mostrada.2.3 Síntese de um ligante de hidrazina conjugado com umanálogo de duocarmicina
<formula>formula see original document page 167</formula>
A uma solução do composto brorao metil seco (0,074 mmol)em 3 ml de DMF foram adicionados o 2-carboxilato de 5-actil indol (30 mg, 0,15 mmol) e EDC (28 mg, 0,15 mmol) ea mistura resultante foi agitada durante a noite. Amistura da reação foi concentrada e purificada porcromatografia de sílica gel usando MeOH a 5% em DCM Ttproporcionou 29 mg (rendimento de 74%) de produto que foiconfirmado por espec. de massa M+l = 523.
A uma solução do composto sintetizado na etapa C em 5 mlde DCM e 300 μΐ de álcool alílico foram adicionadoscloreto de metil piperazina carbonila (22 mg, 0,11 mmol)e piridina 44 μΐ. A mistura da reação foi agitada atemperatura ambiente por 5 horas. A concentração seguidapor purificação por cromatografia de sílica gel usandoMeOH/DCM a 5% como eluente proporcionou 4 8 mg do produtodesejado (rendimento de 73%). 0 produto foi confirmadopor Espec. de Massa M+l = 650.
Uma solução do composto acima (8,2 mg, 0,012 mmol) e Mal-PEG4-hidrazina em ácido acético a 5% em DCM anidro foiagitada a temperatura ambiente por 2 0 minutos seguida porevaporação de solventes e HPLC Prep. de fase reversausando fase aquosa tamponada de acetonitrila e formato deamônio proporcionou 2,5 mg do produto final desejado quefoi confirmado por Espec. de Massa, M+l = 1063.
2.4a Taxa de ciclização de um ligante de hidrazina de 6membros de dimetila
Um análogo de duocarmicina conjugado com um ligante dehidrazina de 6 membros de dimetila foi incubado emtamponador a pH 7,4 por 24 horas e a geração de produtociclizado resultando da ciclização do ligante dehidrazina, liberando assim análogo de duocarmicina livre,foi avaliada com o tempo.
Quantidades mínimas de produto ciclizado foram detectadasdurante 24 horas a pH = 7,4, indicando que esta forma deligante de hidrazina de 6 membros exibe uma taxarelativamente lenta de ciclização.
2.4b Taxa de ciclização de ligante de hidrazina de 6membmros de gem-dimetila
Um análogo de duocarmicina conjugado com um ligante dehidrazina de 6 membros de gem-dimetila foi incubado emtamponador a pH 7,4 e a geração de produto ciclizadoresultando da ciclização do ligante de hidrazina,liberando assim análogo de duocarmicina livre, foiavaliada com o tempo.
Com o ligante de gem-dimetila de 6 membros, a reação deciclização foi bem rápida prosseguindo até o términodentro de poucos minutos. Assim, a taxa de ciclizaçãopara ligante de hidrazina de 6 membros de gem-dimetilaprosseguiu em uma taxa muito mais rápida do que aquela doligante de 6 membros que não continha a parcela de gem-dimetila .
EXEMPLO 3 : Síntese de conjugados de ligante de hidrazinade 5 membros
3.1 Metodologia de síntese para o Composto 4
<formula>formula see original document page 169</formula>
Ácido Cbz-DMDA-2,2-dimetilmalônico (1)
A uma solução de ácido 2,2-dimetil-malônico (2,0 g, 0,0151 mmol), cloreto de tionila (1,35 ml, 0,0182 mmol)em THF (15 ml) em um frasco de 2 5 ml equipado com umabarra de agitação, sonda de temperatura, e condensador derefluxo foi adicionada uma gota de DMF e a mistura dareação foi aquecida para refluxo por 2 h e entãoresfriada para temperatura ambiente. Esta mistura dareação foi transferida por gotejamento para uma soluçãode Cbz-DMDA (4 g, 0,0182 mmol) e trietilamina (4 ml,0,02 8 7 mol) em THF (5 ml) a O0C e foi agitada por 3 0 mina esta temperatura. 0 solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido em HCl IN (50 ml) e extraído com DCM(2 χ 2 5 ml). As camadas orgânicas combinadas foramextraídas com NaOH IN (2 χ 25 ml) e a camada aquosacombinada foi acidificada (pH <1) com HCl concentrado eextraída com EtOAc (2 χ 25 ml) , secada sobre MgSO4,filtrada e concentrada em vácuo para um sólido pegajosoesbranquiçado, 3,44 g, rendimento de 68%. 0 Composto 1foi confirmado por espec. de massa: m/ζ 337,0 [M+l]+Tempo de retenção de HPLC: 3,77 min (espec. de massa)Cbz-DMDA-2,2-Dimetilmaônico-Boc-N'-metilhidrazina (2)A uma solução de Composto 1 (3,0 g, 0,0089 mol) , cloretode tionila (0,78 ml, 0,0107 mol) em THF (25 ml) em um RBFde 50 ml 3N [de 3 gargalos] equipado com uma barra deagitação, sonda de temperatura, e condensador de refluxofoi adicionada uma gota de DMF e a mistura da reação foirefluxada por 2 h e então resfriada para temperaturaambiente. Esta mistura da reação foi então adicionada porgotejamento uma solução de Boc-N-metil hidrazina (1,33 g,0,091 mmol) e trietilamina (3 ml, 0,0215 mol) em THF (25ml) a 0°C e agitada por 3 0 min. 0 solvente foi removidoem vácuo e o resíduo dissolvido em EtOAc (50 ml) , secadosobre MgSO4, filtrado e concentrado em vácuo para um óleomarrom.O óleo foi dissolvido em EtOAc epurifiçado porcromatografia de coluna (EtOAc a 100%) resultando em 3,45g, rendimento de 83% de um óleo claro. 0 Composto 2 foiconfirmado por espec. de massa: m/ζ 465,2 [M+a]
Tempo de retenção de HPLC: 3,97 min (espec. de massa)DMDA-2 , 2 -dimetilmalônico-Boc-N' -metilhidrazina (3 )A uma solução de Composto 2 (0,5 g, 0,0011 mmol) em MeOH(30 ml) foi adicionado Pd/C a 10% (15 mg) e a reaçãocolocada em um hidrogerador Parr por 3 0 minutos. 0catalisador foi filtrado e o filtrado concentrado emvácuo para um óleo límpido para produzir o Composto 3(0,38 g) . O produto foi confirmado por RMN (1H, CDCl3): δ1.45 (s, 15H) 2.45 (s, 3H) 2.85 (s, 6H) , 3.16 (s, 3H)4.64 (m, 1H) 10.6 (bs, 1H) ; RMN (13C, CDCl3) D.24.1,28.57, 35.15, 35.58, 36.66, 47.01, 48.51, 81.11, 155.17,173.56, 176.24Síntese de Composto 4
A um RBF de 15 ml com uma barra de agitação, foicombinado Composto 3 (50 mg, 0,1513 mmol), PNPC-1918 (20mg, 0,0315 mmol) e DCM (5 ml). A solução foi agitada por30 minutos, então trietilamina (25 μl, 0,1794 mmol) foiadicionada e a solução amarela clara foi agitada por 1 h.
A solução foi concentrada em vácuo para um óleo amarelo epurificada por cromatografia de coluna (DCM a 100% paraEtOAc/DCM a 1:1) para produzir o Composto 4 como umsólido esbranquiçado, 22 mg (84%). 0 produto foiconfirmado por espec. de massa: m/ζ 825,7 [M+l]+Tempo de retenção de HPLC: 7,65 min (espec. de massa)3.2 Síntese de um conjugado de anticorpo-fármaco tendo umligante de hidrazina de 5 membros
<formula>formula see original document page 171</formula>
Este esquema demonstra a conjugação de um anticorpo a umcomplexo de 1igante-fármaco. Estas metodologias são bemconhecidas na técnica farmacêutica. Exemplos de outrossítios reativos incluem maleimidas, haloacetamidas comtióis em um ligante, tióis que reagem com dissulfetos emum ligante, hidrazidas que reagem com aldeídos e cetonasem um ligante, e hidroxisuccinimidas, isocianatos,isotiocianatos, e anidrido que reage com grupo amino emum ligante.
EXEMPLO 4 : Síntese de conjugados de ligante de membrosdissulfeto
<formula>formula see original document page 172</formula>
Esquema 1
<formula>formula see original document page 172</formula>Esquema 2
<formula>formula see original document page 173</formula><formula>formula see original document page 174</formula>
Esquema 3
4.1a Síntese de Composto 1: A um frasco contendo PEG4(3,88 g, 20 mmols) foi adicionado triton B (solução a 40%em metanol, 1,08 ml, 0,25 mmol) e acrilato de ter-butila(3,62 ml, 24 mmols) seguido após 15 min. A mistura foiagitada a temperatura ambiente durante a noite. A misturafoi concentrada em vácuo e o resíduo foi purificado porflash cromatografia em sílica gel com metanol a 1% emdiclormetano como eluente para proporcionar o composto dotítulo como um óleo incolor (2,35 g, 36%). RMN 1H δ 1.45(s, 9H), 2.5 (t, 2H), 3.65 (m, 18H).
4.1b Síntese de Composto 2. A uma solução de Composto 1(1,17 g, 3,6 mmols) em diclorometano (10 ml) foramadicionados trietilamina (532 μΐ, 4 mmols) e cloreto demetanosulfonila (309 μΐ, 4 mmols). A mistura assim obtidafoi agitada a temperatura ambiente durante a noite. 0solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado porflash cromatograf ia em sílica gel com metanol a 1% emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um óleo amarelo (1,3 g, 89%). RMN 1H δ1.43 (s, 9H) , 2.48 (t, 2H) , 3.07 (s, 3H) , 3.62-3.70 (m,14H), 3.76 (m, 2H), 4.37 (m, 2H).
4.1c Síntese de Composto 3. A uma solução de Composto 2(1,3 g, 3,2 5 mmols) em etanol (10 ml) foi adicionadasódio azida (423 mg, 6,5 mmols). A mistura assim obtidafoi refluxada durante a noite. O solvente foi evaporado eo resíduo foi purificado por flash cromatografia emsílica gel com metanol a 1% em diclorometano como eluentepara proporcionar o composto do título como um óleoamarelo (1,01 g, 90%). RMN 1H δ 1.45 (s, 9H) , 2.50 (t,2H), 3.40 (t, 2H), 3.62-3.73 (m, 16H).
4. Id Síntese de Composto 4. A uma solução de Composto 3(4 70 mg, 1,3 5 mmol) em éter (5 ml) contendo H2O (25 μΐ)foi adicionado trifenilfosfino (391 mg, 1,48 mmol). Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientedurante a noite. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel commetanol a 1% em diclorometano como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo amarelo(325 mg, 75%). RMN 1H δ 1.45 (s, 9H), 2.24 (bs, 2H), 2.51(t, 2H) , 2.91 (t, 2H) , 3.56 (m, 2H) , 3.63-3.66 (m, 12H)3.72 (m, 2H).
4. Le Síntese de Composto 5. A uma solução de ácido 3-mercaptopropiônico (1,22 g, 11,5 mmols) em metanol (10ml) foi adicionado aldritiol-2 (3,78 g, 17,25 mmols). Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 3 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel comacetato de etila a 3 0% em hexanos como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo (2,44 g,98%). RMN 1H δ 2.8 (t, 2H) , 3.05 (t, 2H) , 7.14 (m, 1H) ,7.67 (m, 2H), 8.48 (m, 1H).
Composto 5b: RMN 1H δ 1.43 (d, 3H) , 2.61 (m, 1H) ,2.76 (m, 1H) , 3.40 (m, 1H) , 7.17 (m, 1H) , 7.66 (m, 2H) ,8.45 (m, 1H).4.1 Síntese de Composto 6. Iodeto de 3-metilbenzotiazol(1 g, 3,6 mmols) foi dissolvido em solução aquosa dehidróxido de sódio 2 N (10 ml) e a mistura foi agitadapor 6 horas a IOO0C então acidifiçada com solução aquosade ácido clorídrico 6 N para pH 4 e extraída com dietiléter. A camada orgânica foi secada sobre Na2SO4,evaporada rotativamente em vácuo e o resíduo foidissolvido em metanol (10 ml) e Composto 5 a (776 mg, 3,6mmols) foi adicionado. A mistura foi agitada atemperatura ambiente por 1 hora. A mistura foiconcentrada até a secura e o resíduo foi purificado porflash cromatografia em sílica gel com metanol a 1% emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um óleo amarelo (482 mg, 55%) . RMN 1Hδ.2.85 (m, 2H) , 2.95 (m, 5H) , 6.64 (m, 2H) , 7.3 (m, 1H) ,7.4 (dd, 1H) ; MS (ES) 244 (M+H+) , 487 (2M+H+) .
Composto 6b: RMN 1H δ 1.35 (d, 3H) , 2.48 (m,1H) , 2.92 (s, 3H) , 3.02 (m, 1H) , 3.34 (m, 1H) , 6.62 (m,2H) , 7.28 (m, 1H) , 7.44 (m, 1H) ; MS (ES) 258 (M+H+) .
Composto 6c: RMN 1H δ 1.45 (s, 6H) , 2.70 (s,2H) , 2.93 (s, 3H) , 6.62 (m, 2H) , 7.24 (m, 1H) , 7.51 (m,1H) ; MS (ES) 272 (M+H+) , 294 (M+Na+) , 310 (M+K+) .
4.Ig Síntese de Composto 7. A uma solução de Composto 6a(2 8 mg, 0,115 mmol) em metanol anidro (1 ml) foiadicionado cloreto de acetila (13 μΐ, 0,173 mmol). Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientedurante a noite. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel comacetato de etila a 10% em hexanos como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo (24 mg,83%) . RMN 1H δ 2.08 (m, 2H) , 2.93 (s, 3H) , 2.95 (m, 2H) ,3.70 (s, 3H), 6.63 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.40 (m, 2H) ;MS (ES) 258 (M+H+) , 280 (M+Na+) , 296 (M+K+) .
Composto 7b: RMN 1H δ 1.32 (d, 3H) , 2.45 (m,1H) , 2.92 (s, 3H) , 2.93 (m, 1H) , 3.35 (m, 1H) , 3.67 (s,3H) , 6.62 (m, 2H) , 7.26 (m, 1H) , 7.44 (m, 1H) ; MS (ES)272 (M+H+) .
Composto 7c: RMN 1H δ 1.42 (s, 6H) , 2.66 (s,2H) , 2.93 (s, 3H) , 3.62 (s, 3H) , 6.62 (m, 2H) , 7.24 (m,1H) , 7.51 (m, 1H) ; MS (ES) 286 (M+H+) , 308 (M+Na+) , 324(M+K+) .
4.Ih Síntese de Composto 8. A uma solução de Composto 7a(24 mg, 0,0 93 mmol) em diclorometano (1 ml) foramadicionados trifosgeno (28 mg, 0,093 mmol) e trietilamina(37 μL, 0,28 mmol) a 0°C. A mistura foi agitada por 1hora. A mistura foi concentrada até a secura e o resíduofoi usado na etapa seguinte sem purificação adicional.O material bruto foi dissolvido em diclorometano (1 ml) eo Composto 8a (35 mg, 0,074 mmol) , e DMAP (23 mg, 0,190mmol) foram adicionados. A mistura assim obtida foiagitada a temperatura ambiente durante a noite. 0solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado porflash cromatografia em sílica gel com metanol a 1% emdiclorometano como eluente para proporcionar o compostodo título como um óleo amarelo (53 mg, 76%) . RMN 1H δ2.70 (s, 3H) , 2.74 (m, 2H) , 3.06 (m, 2H) , 3.34 (m, 1H) ,3.35 e 3.36 (2s, 3H) , 3.63 e 3.64 (2s, 3H) , 3.86 (m, 1H) ,3.88 (s, 3H) , 3.93 e 3.94 (2s, 3H) , 4.48 (m, 1H) , 4.55(m, 1H) , 4.79 (m, 1H) , 7.05 (m, 1H) , 7.11 (m, 1H) , 7.26-7.52 (m, 5H) , 7.85 (d, 1H) , 8.1 (bs, 1H) , 8.98 e 9.08(2s, 1H) ; MS (ES) 753 (M+H+) .
Composto 8b: RMN 1H δ 1.38 (m, 3H) , 2.52 (m,1H) , 2.69 (m, 3H) , 2.79 (m, 1H) , 3.33 (m, 1H) , 3.37 (2s,3H) , 3.64 (m, 3H) , 3.88 (s, 3H) , 3.84-3.90 (m, 1H) , 3.93(2s, 3H) , 4.48 (m, 1H) , 4.57 (m, 1H) , 4.78 (m, 1H) , 7.06(m, 1H) , 7.12 (m, 1H) , 7.26-7.43 (m, 3H) , 7.50 (m, 2H) ,7.86 (m, 1H) , 8.1 (bs, 1H) , 8.99, 9.08, 9.13 e 9.22 (4s,1H) ; MS (ES) 767 (M+H+) .
Composto 8c: RMN 1H δ 1.44 (m, 6H) , 2.63 (d,2H) , 2.70 (s, 3H) , 3.35 (m, 1H) , 3.38 e 3.39 (2s, 3H) ,3.63 e 3.64 (2s, 3H) , 3.87 (m, 1H) , 3.88 (s, 3H) , 3.93 e3.94 (2s, 3H) , 4.48 (m, 1H) , 4.55 (m, 1H) , 4.79 (m, 1H) ,7.05 (m, 1H) , 7.12 (m, 1H) , 7.31-7.39 (m, 3H), 7.49 (m,2H) , 7.89 (d, 1H) , 8.1 (bs, 1H) , 9.12 e 9.23 (2s, 1H) ;MS (ES) 781 (M+H+) .
4. Li Síntese dos Compostos 9 e 10. A uma solução deComposto 8a (0,1 mg) em solução de tamponador PBS (pH7,2)/metanol (3 00 μΐ, 2/1) foi adicionada uma solução 2 0mM de DTT (100 μΐ, 15 equivalentes) e monitorado oprogresso da reação por HPLC. A reação correu muitorápida para detectar, após poucos segundos a reaçãoestava terminada para já proporcionar o produto Composto10 quantitativamente. O Composto 9 intermediário dareação não foi detectado.4.1j Síntese de Composto 11. A uma solução de Composto 6a(66 mg, 0,2 mmol) em diclorometano (1 ml) foramadicionados DCC (47 mg, 0,22 mmol), HOBt (31 mg, 0,22mmol) e o composto 4 (50 mg, 0,2 mmol) . A mistura assimobtida foi agitada a temperatura ambiente durante anoite. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel commetanol a 1% em diclorometano como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo amarelo(70 mg, 62%). RMN 1H δ 1.44 (s, 9H) , 2.51 (t, 1H) , 2.63(t, 2H) , 2.93 (d, 3H) , 3.01 (t, 2H) , 3.45 (m, 2H) , 3.55(m, 2H) , 3.64 (m, 12H) , 3.71 (t, 2H) , 5.01 (bs, 1H) , 6.38(bt, 1H) , 6.62 (m, 2H) , 7.27 (m, 1H) , 7.43 (dd, 1H) . MS(ES) 491 (M-56+H+) , 513 (M-56+Na+) , 547 (M+H+) , 569(M+Na+)
Composto 11b: RMN 1H δ 1.34 (d, 3H) , 1.45 (s,9H) , 2.30 (m, 1H) , 2.5 (t, 2H) , 2.69 (m, 1H) , 2.93 (d,3H), 3.37-3.55 (m, 5H), 3.63 (m, 12H), 3.71 (t, 2H), 4.99(bs, 1H) , 6.13 (bt, 1H) , 6.62 (m, 2H) , 7.25 (m, 1H) , 7.48(dd, 1H) . MS (ES) 505 (M-56+H+) , 527 (M-56+Na+) , 543 (M-56+K+) , 561 (M+H+) , 583 (M+Na+) .
Composto Ilc: 1.43 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 2.46(s, 2H) , 2.5 (t, 2H) , 2.92 e 2.94 (2s, 3H) , 3.33 (m, 2H) ,3.47 (t, 2H) , 3.63 (m, 12H) , 3.70 (t, 2H) , 6.06 (bt, 1H) ,6.63 (m, 2H) , 7.25 (m, 1H) , 7.54 (d, 1H) ; MS (ES) 519(Μ-56+H+) , 541 (M-56+Na+) , 575 (M+H+) , 597 (M+Na+) .4.Ik Síntese de Composto 12c: A uma suspensão de Compostolia (20 mg, 0,037 mmol) em diclorometano (1 ml) foramadicionados trietilamina (15 μΐ, 0,11 mmol) e uma soluçãode fosgeno 2 N em tolueno (55 μΐ, 0,11 mmol) a 0°C. Amistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. Amistura foi concentrada e o resíduo foi dissolvido emdiclorometano (1 ml) e o composto 10 (14 mg, 0,03 0 mmol)e DMAP (9 mg, 0,076 mmol) foi adicionado. A mistura assimobtida foi agitada a temperatura ambiente durante anoite. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado por flash cromatografia em sílica gel commetanol a 1% e diclorometano como eluente paraproporcionar o composto do título como um óleo amarelo(23 mg, 74%). RMN 1H δ 1.44 (s, 9H) , 2.49 (t, 2H) , 2.67(m, 2H) , 2.65 e 2.67 (2s, 3H) , 3.07 (m, 2H) , 3.33 (s,3H) , 3.40 (m, 3H) , 3.51 (m, 2H) , 3.60 (m, 12H) , 3.69 (m,2H) , 3.87 (s, 3H) , 3.92 (s, 3H) , 3.93 (m, 1H) , 4.52 (m,2H) , 4.78 (m, 1H) , 6.65, 6.74 e 6.97 (3bt, 1H) , 7.06 (d,1H) , 7.12 (s, 1H) , 7.29-7.42 (m, 3H) , 7.50 (m, 2H) , 7.87(d, 1H), 8.10 e 8.15 (2bs, 1H), 9.79 e 9.58 (2s, 1H) ; MS(ES) 986 (M+H+-56) , 1042 (M+H+) .
Composto 12b: RMN 1H δ 1.32 (m, 3H) , 1.44 (s,9H) , 2.39 (m, 1H) , 2.48 (m, 2H) , 2.60 (m, 1H) , 2.67 e2.69 (2s, 3H), 3.32 e 3.35 (2s, 3H), 3.38-3.72 (m, 20H),3.88 (s, 3H) , 3.93 (s, 3H) , 3.94 (ra, 1H) , 4.52 (m, 2H) ,4.77 (m, 1H) , 6.53, 6.67 e 6.72 (3bt, 1H) , 7.06 (d, 1H) ,7.12 (s, 1H) , 7.29-7.39 (m, 3H) , 7.49 (m, 2H) , 7.88 (d,1H) , 8.12 e 8.25 (2bs, 1H) , 9.13, 9.36, 10.08 e 10.21(4s, 1H) ; MS (ES) 1000 (M+H+-56), 1056 (M+H+) , 1078(M+Na+) , 1084 (M+K+) .
Composto 12c: RMN 1H δ 1.30-1.42 (m, 3H) , 1.44(s, 9H), 2.45-2.52 (m, 4H), 2.69 e 2.72 (2s, 3H), 3.34 e3.35 (2s, 3H) , 3.39-3.72 (m, 19H) , 3.88 (s, 3H) , 3.925 e3.93 (2s, 3H) , 3.94 (m, 1H) , 4.53 (m, 2H) , 4.80 (m, 1H) ,6.63 (m, 1H), 7.06 (dd, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.25-7.39 (m,3H) , 7.50 (m, 2H) , 7.89 (d, 1H) , 8.10 e 8.27 (2bs, 1H) ,9.99 e 10.191 (2s, 1H) ; MS (ES) 1014 (M+H+-56) , 1070(M+H+) , 1108 (M+K+) .
4.11 Síntese de Composto 13. Composto 12a (23 mg, 0,022mmol) foi dissolvido na solução de ácido trifluoroacéticoe diclorometano (1 ml, l/l) e a mistura foi agitada atemperatura ambiente por 3 0 min e concentrada paraproporcionar o produto (21 mg, 100%). RMN 1H δ 2.60 (t,2H) , 2.67 e 2.68 (2s, 3H) , 2.75 (m, 2H) , 3.07 (m, 2H) ,3.34 (s, 3H), 3.38-3.64 (m, 21H), 3.76 (t, 2H), 3.88 (s,3H) , 3.92 (s, 3H) , 3.93 (m, 1H) , 4.53 (m, 2H) , 4.78 (m,1H) , 7.06 (d, 1H) , 7.13 (s, 1H) , 7.31-7.43 (m, 3H) , 7.49(m, 2H) , 7.87 (d, 1H) , 8.10 e 8.15 (2bs, 1H) , 9.44 e 9.65(2s, 1H) ; MS (ES) 986 (M+H+), 1008 (M+Na+), 1024 (M+K+).
Composto 13b: RMN 1H δ 1.34 (m, 3H), 2.56 (m,1H), 2.62 (m, 2H), 2.68 (m, 3H), 2.8 (m, 1H), 3.35-3.36(2s, 3H), 3.40-3.70 (mf 18H), 3.77 (tf 2H), 3.88 (s, 3H),3.93 e 3.95 (2s, 3H), 3.94 (m, 1H), 4.54 (m, 2H), 4.79(m, 1H), 7.07 (d, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.30-7.42 (m, 3H),7.49 (m, 2H), 7.88 (d, 1H), 8.11 e 8.25 (2bs, 1H), 9.22,9.37,9.80 e 9.92 (4s, 1H) ; MS (ES) 1000 (M+H+), 1022(M+Na+), 1038 (M+K+).
Composto 13c: RMN 1H δ 1.30-1.45 (m, 6H), 2.54(m, 2H), 2.61 (m, 2H), 2.68 e 2.69 (2s, 3H), 3.35-3.36(2s, 3H), 3.40-3.70 (m, 17H), 3.77 (t, 2H), 3.88 (s, 3H),3.92 e 3.93 (2s, 3H), 3.94 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 4.80(m, 1H), 7.08 (m, 2H), 7.12 (d, 1H), 7.29-7.39 (m, 3H),7.49 (m, 2H), 7.89 (m, 1H), 8.10 e 8.25 (2bs, 1H), 9.88 e10.04 (2s, 1H) ; MS (ES) 1014 (M+H+), 1036 (M+Na+), 1054(M+K+).
4. Im Síntese de Composto 14a. A uma solução de Composto13a (5,4 mg, 0, 0054 mmol) em diclorometano (1 ml) foramadicionados OS-carbodiimida (11,5 mg, 0,94 mmol/g, 0,0108mmol), e PS-DMAP (7,2 mg, 1,49 mmol/g, 0,0108 mmol). Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientedurante a noite, filtrada e concentrada para proporcionaro produto. MS(ES) 1082 (M+H+).
4.2 Síntese de ligante de dissulfeto conjugado comTubulisina A
<formula>formula see original document page 180</formula><formula>formula see original document page 181</formula>
0 fármaco Tubulisina A pode ser conjugado com o ligantede dissulfeto da presente invenção usando o mecanismomostrado aqui acima. Outros fármacos e outros ligantes dapresente invenção podem ser sintetizados usando esquemassimilares de reação.4.3 Taxa de ciclização de um ligante de dissulfeto
<formula>formula see original document page 182</formula>
A uma solução de Composto 8a (0,1 mg) em solução detamponador de PBS (pH 7,2)/metanol (3 00 μL, 2/1) foiadicionada uma solução 2 0 mM de DDT (100 μL, 15equivalentes) e o progresso da reação foi monitorado porHPLC. A reação passou por rápida ciclização, com a reaçãoestando terminada dentro de poucos segundos paraproporcionar o produto 10 quantativamente. Ointermediário 9 da reação não foi detectado.
EXEMPLO 5
<formula>formula see original document page 182</formula><formula>formula see original document page 183</formula>Síntese de Composto 32. A uma solução de Composto 30 (120mg, 0,28 mmol) em acetato de etila (10 ml) foi borbulhadogás HCl por 5 min. A mistura da reação foi agitada atemperatura ambiente por outros 30 min e então a misturafoi concentrada. Éter foi adicionado à mistura da reaçãoe o precipitado branco foi coletado em um funil-filtro. Osólido foi secado durante a noite sob vácuo paraproporcionar 100 mg do produto desejado o que foiconfirmado por LC-MS (ESI) 324 (M+H+) e usado na etapaseguinte sem purificação adicional. A uma solução destecomposto (100 mg, 0,2 6 mmol) em DMF (5 ml) foramadicionados Composto 31 (65 mg, 0,26 mmol), HATU (100 mg,0,26 mmol) e TEA (91 μL 0,52 mmol). A mistura assimobtida foi agitada a temperatura ambiente por 3 h. Osolvente foi evaporado e o resíduo foi purificado em HPLCsemi-preparativa com TFA a 0,1% em água e acetonitrilacomo eluente para proporcionar o composto 32 como um óleo(110 mg, 80%). O produto desejado foi confirmado por LC-MS (ESI) 555 (M+H+)
Síntese de Composto 33. Uma solução de Composto 32 (110mg, 0,2 mmol) e paládio sobre carvão (20 mg) em DCM (10ml) e metanol (5 ml) foi agitada sob pressão atmosféricade hidrogênio a temperatura ambiente por 12 h. 0 paládiofoi filtrado e a mistura da reação foi concentrada e oresíduo foi purificado em HPLS semi-preparativa com TFA a0,1% em água e acetonitrila como eluente paraproporcionar o composto desejado como um óleo (80 mg,78%) LC-MS (ESI) 465 (M+H+) . A uma solução do resíduo (80mg, 0,17 mmol) em diclorometano (10 ml) e THF (5 ml) foiadicionado PNPCl (cloroformato de 4-nitrofenila) (137 mg,0,68 mmol) e trietil amina (144 μΐ, 1,02 mmol) a 0°C. Amistura assim obtida foi agitada por 30 min a 0°C e entãoa temperatura ambiente por 12 h. A mistura da reação foiconcentrada sob vácuo, e o resíduo foi precipitado usandoéter etílico (100 ml) para proporcionar o Composto 33como um sólido amarelo (90 mg, 82%) o qual foi secado sobvácuo e confirmado por LC-MS (ESI) 631 (M+H+) .Síntese de Composto 34: A uma solução de brometo de 2-bromoetilamina (5 g, 24,4 mmols) em DMF (50 ml) foiadicionada diisopropiletilamina (8,5 ml, 48,8 mmols) ecloroformato de benzila (3,48 ml, 24,4 mmols). A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente por 2horas. A mistura da reação foi concentrada e o resíduofoi purificado por flash cromatografia em sílica gel comacetato de etila/hexanos(3/7)como eluente paraproporcionar o desejado Composto 34 como um óleo. RMN 1H(CDCl3) δ 3.54 (bs, 2H),3.61 (bs, 2H),5.12 (s, 2H),7.36 (m, 5H).
Síntese de Composto 35: A uma solução de Composto 34(3,34 g, 12,99 mmols) e valina ter-butil éster (3,27 g,15,59 mmols) em DMF (50 ml) foi adicionado carbonato depotássio (5,39 g, 38,97 mmols) e iodeto de potássio (2,59g, 15,59 mmols). A mistura assim obtida foi agitada a100°C durante a noite. A mistura da reação foiconcentrada e o resíduo foi purificado por flashcromatografia em sílica gel com acetato de etila/hexanos(2/8) como eluente para proporcionar o desejado Composto35 como um óleo (3,12 g, 69%). RMN 1H (CDCl3) δ 0.92 (m,6H) , 1.46 (s, 9H) , 1.86 (m, 1H) , 2.53 (m, 1H) , 2.80 (m,2H) , 3.18 (m, 1H) , 3.31 (m, 1H) , 5.10 (s, 2H) , 5.25 (bs,1H) , 7.36 (m, 5H) ; LC-MS (ESI) 296 (M+H- tbutyl + ) , 352(M+H+) .
Síntese de Composto 36. A solução de Composto 35 (3,4 g,9,72 mmols) e paládio sobre carvão (200 mg) em metanol(30 ml) foi colocada sob pressão atmosférica dehidrogênio a temperatura ambiente. A mistura assim obtidafoi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. 0 paládiofoi filtrado e a mistura da reação foi concentrada até asecura para proporcionar o desejado Composto 35 como umóleo (2,1 g, 98%).
Síntese de Composto 37. A uma solução de Composto 36 (2,135 g, 9,72 mmols) em diclorometano (30 ml) foi adicionadoFmocOSu (9-fluroenilmetoxicarbonil-N-hidroxisuccinimidaéster) (3,28 g, 9,72 mmols) a 0°C. A mistura assim obtidafoi agitada por 2 horas a 0°C. O solvente foi removido norotovap, e o resíduo foi purificado por flashcromatografia em sílica gel com diclorometano, seguidapor metanol a 0,5% em diclorometano e finalmente metanola 1% em diclorometano como eluente para proporcionar odesejado Composto 37 como um óleo incolor (2,55 g, 60%).RMN 1H (CDCl3) δ 0.95 (ft, 6H), 1.48 (s, 9H), 1.90 (m,1H), 2.55 (m, 1H), 2.82 (m, 2H), 3.18 (m, 1H), 3.32 (m,1H), 4.24 (m, 1H), 4.37 (m, 2H), 5.40 (bs, 1H), 7.30 (m,2H), 7.39 (m, 2H), 7.60 (d, 2H), 7.75 (d, 2H) ppm; LC-MS(ESI) 383 (M+H-tbutyl + ), 440 (M+H+), 462 (M+Na+), 478(M+K+).
Síntese de Composto 38. A uma solução de Composto 37 (177mg, 0,4 mmol) em tetrahidrofurano-água (3/1, 8 ml) foiborbulhado gás HCl por 5 min. A mistura da reação foiagitada a 370C durante a noite e então a mistura foiconcentrada até a secura para proporcionar o desejadoComposto 38 como um sólido (168 mg, 98%) que foiconfirmado por LC-MS (ESI) 383 (M+H+), 405 (M+Na+) eusado na etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS(ESI) 383 (M+H+), 405 (M+Na+).
Síntese de Composto 39. A uma solução de Composto 5 (525mg, 0,79 mmol) em DMF (5 ml) foi adicionado N-Boc-NiN'-dimetiletilenodiamina (177 mg, 0,94 mmol). A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente por 30min. 0 solvente foi removido e o resíduo foi purificadopor flash cromatografia em sílica gel com diclorometano,seguida por metanol a 2% em diclorometano e finalmentemetanol a 5% em diclorometano como eluente paraproporcionar o desejado Composto 39 como um óleo incolor(364 mg, 65%). RMN 1H (CD3OD) δ 1.39 (s, 9H), 1.56 (m,2H), 1.70 (m, 1H), 1.82 (m , 1H), 2.70 e 2.82 (2s, 3H),2.90 (s, 3H), 3.09 (m, 1H), 3.17 (m, 1H), 3.30 a 3.37 (m,4H), 4.16 (t, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.33 (d, 2H), 5.02 (bs,2H), 7.24 a 7.36 (m, 6H), 7.51 a 7.65 (m, 4H), 7.74 (d,2H) ppm; LC-MS (ESI) 618 (M+H-Boc+), 662 (M+H-tbutyl + ),718 (M+H+), 740 (M+Na+), 1435 (2M+H+).Síntese de Composto 40. O Composto 4 0 foi preparado comodescrito acima para o Composto 17a em rendimento de 98%.LC-MS (ESI) 396 (M+H-Boc+) , 496 (M+H+) , 517 (M+Na+) , 533(M+K+) , 992 (2M+H+).
Síntese de composto 41. A uma solução de Composto 4 0 (13 8mg, 0,28 mmol) em DMF (4 ml) foram adicionados o Composto38 (110 mg, 0,28 mmol), HOBt (36 mg, 0,28 mmol) e EDChidrocloreto de (1-(3-dimetilaminopropil)-3 -etilcarbodiimida (50 mg, 0,28 mmol). A mistura assimobtida foi agitada a temperatura ambiente durante anoite. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado em HPLC semi-preparativa com TFA a 0,1% emágua e acetonitrila como eluente para proporcionar odesejado Composto 41 como um óleo (178 mg, 70%) . RMN 1H(CD3OD) δ 1.04 e 1.11 (2d, 6H), 1.40 (s, 9H), 1.58 (m,2H), 1.77 (m, 1H) , 1.88 (m,1H), 2.24 (m, 1H), 2.72 e2.84 (2s, 3H), 2.92 (s, 3H), 3.10 a 3.18 (m, 4H), 3.35 a3.46 (m, 6H), 3.82 (d, 1H), 4.22 (t, 1H) , 4.41 (m, 2H),4.59 (m, 1H), 5.04 (bs, 2H), 7.28 a 7.40 (m, 6H), 7.55(m, 2H), 7.63 (m, 2H), 7.78 (d, 2H) ppm; LC-MS (ESI) 760(Mh-H-Boc+), 804 (M+H-tbutyl + ), 860 (M+H+), 882 (M+Na+),899 (M+K+).
Síntese de Composto 42. O Composto 42 foi preparado comodescrito acima para o Composto 17a em rendimento de 98%.LC-MS (ESI) 538 (M+H-Boc+), 582 (M+H-tbutyl + ), 638 (M+H+) ,660 (M+Na+).
Síntese de Composto 43. A uma solução de Composto 42 (23mg, 0,03 6 mmol) em diclorometano (1 ml) foram adicionadosGMBS (N-(maleimidobutiriloxi)succinimida éster) (14 mg,0,05 mmol) e diisopropiletilamina (8,4 μL 0,05 mmol) a0°C. A mistura foi aquecida para temperatura ambientelentamente e a agitação foi continuada por adicionais 30min. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificadoem HPLC semi-preparativa com TFA a 0,1% em água eacetonitrila como eluente para proporcionar o desejadoComposto 43 como um óleo (26 mg, 79%). RMN 1H (CD3OD) δ1.06 e 1.12 (2d, 6H) , 1.41 (s, 9H) , 1.59 (m, 2H) , 1.78(m, 1Η), 1.86 a 1.93 (m , 3H) , 2.24 (m, 3Η), 2.74 e 2.84(2s, 3H, 2.93 (bs, 3Η, 3.13 a 3.22 (m, 4H, 3.40 a 3.60(m, 8H), 3.82 (d, 1H), 4.60 (m, 1H), 5.05 (bs, 2H), 6.80(s, 2H), 7.32 (m, 2H), 7.57 (d, 2H), 8.78 (d, 1H) ppm;
LC-MS (ESI) 703 (MfH-Boc+), 747 (M+H-tbutyl + ), 803 (M+H+),825 (M+Na+), 841 (M+K+) .
Síntese de Composto 44. 0 Composto 44 foi preparado comodescrito acima para o Composto 15a em rendimento de 98%.LC-MS (ESI) 703 (M+H+), 725 (M+Na+) .
Síntese de Composto 45. A uma solução de Composto 44 (15mg, 0,016 mmol) e Composto 33 (10 mg, 0,016 mmol) em DMF(0,8 ml) foi adicionado diisopropiletilamina (5,5 μΐ,0,032 mmol) a temperatura ambiente. A mistura assimobtida foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi evaporado e o resíduo foipurificado em HPLC semi-preparativa com RFA a 0,1% emágua e acetonitrila como eluente para proporcionar odesejado Composto 45 como um óleo (10 mg, 45%) . RMN 1H(CD3OD) δ 1.02 a 1.13 (m, 6H) , 1.55 (m, 2H) , 1.74 (m,1H) , 1.84 a 1.92 (m , 3H) , 2.20 a 2.27 (m, 3H) , 2.95 a3.14 (m, 16H), 3.47 a 3.84 (m, 12H), 3.98 (m, 1H), 4.2 a4.34 (m, 3H), 4.57 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 5.07 a 5.17 (m,2H) , 6.78 (s, 2H) , 7.16 a 7.23 (m, 3H) , 7.30 (m, 1H) ,7.38 a 7.47 (m, 3H) , 7.52 a 7.58 (m, 3H) , 7.81 a 7.92 (m, 2H) , 8.25 (bs, 1H) ppm; LC-MS (ESI) 1194 (M+H+) , 1215(M+Na+) , 1233 (Mh-K+) .
Exemplo 6
<formula>formula see original document page 188</formula><formula>formula see original document page 189</formula>
Síntese de Composto (2) . Uma solução de 1 (100 mg, 0,24mmol) e Pd-C a 10% (35 mg) em MeOH/CH2Cl2 (1/2, 10 ml)foi desgaseif içada em vácuo por 40 s. A misturaresultante foi colcoada sob uma atmosfera de hidrogênio eagitada a 250C por 7 h. A mistura da reação foi filtradaatravés de Celit (lavagem de CH2Cl2) . 0 solvente foiremovido em vácuo. Cromatografia em sílica gel eluída comEtOAc/Hex (2/8) proporcionou 2 (77 mg, 98%) . RMN 1H DMSO-d6) δ 10.36 (s, 1H), 8.04 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.72 (d, 1H,J=8 .2 Hz), 7.61 (br s, 1H) , 7.45 (t, 1H, J=8.4 Hz), 7.261(t, 1H, J=8 .4 Hz), 4.06 (m, 4H) , 3.73 (m, 1H) , 1.52 (s,9H) .
Síntese de Composto (4) . Uma solução de 2 (35 mg, 0,1mmol) em HCl-EtOAc 4 M (5 ml) foi agitada a 2 5°C sob Arpor 3 0 min. 0 solvente foi removido em vácuo. Ao resíduofoi adicionado ácido 5-acetilindona-2-carboxílico (24,4mg, 0,12 mmol). Uma solução de EDC (22,9 mg, 0,12 mmol)em DMF (3 ml) foi adicionada e a mistura da reação foiagitada a 25°C por 5 h. O solvente foi removido. Oproduto bruto foi cromatografado em sílica gel eluída comMeOH a 10% em CH2Cl2 para proporcionar 4 (40,7 mg, 93%).RMN 1H (DMS0-d6) 612.13 (s, 1H) , 10.47 (s, 1H) , 8.45 (s,1H) , 8.10 (d, 1H, J=8 .4 Hz), 7.96 (br s, 1H) , 7.85 (d,2H, J=8.4 Hz), 7.54 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.51 (t, 1H, J=8.2Hz), 7.36 (t, 1Η, J=I. 6), 7.35 (s, 1Η), 4.81 (t, 1Η, 11.2Hz), 4.54 (dd, 1Η, 8.8 Hz), 4.23 (m, 1Η), 4.01 (dd, 1Η,J=IO.2 Hz), 3.86 (dd, 1Η, J=IO.7 Hz), 2.61 (s, 3Η).
Síntese de Composto (5). Hidrocloreto de 4-metil-l-piperazinacarbonil cloreto (19,9 mg, 0,1 mmol) foiadicionado a uma solução de 4 (20 mg, 0,05 mmol) epiridina anidra (25 μuml, 0,3 mmol) em álcool alílico a 3%em cloreto de metileno seco (4 ml) e a mistura foiagitada por 16 h. A purificação do produto bruto emsílica gel produziu 5 (23,6 mg, 91%). RMN 1H (DMS0-d6) δ12.03 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.01 (d, 1H,J=8 .4 Hz), 7.88 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.82 (dd, 1H, J=8.4Hz), 7.58 (t, 1H, J=8.1 Hz), 7.51 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.46(t, 1H, J=7.6 Hz), 7.37 (s, 1H), 4.86 (t, 1H, J=10.8 Hz),4.57 (dd, 1H, J=10.8 Hz), 4.38 (m, 1H), 4.06 (dd, 1H,J=10.8 Hz), 3.86 (dd, 1H, J=Il Hz), 3.41 (br, 4H), 3.29(br, 4H), 2.82 (s, 3H), 2.57 (s, 3H).
Síntese de Composto (7) . Uma solução de 5 (13 mg, 24mmols) e ligante 6 (16,9 mg, 31 mmols) em ácido acético a5% em cloreto de metileno seco (1 ml) foi agitada por 30min a 25°C. 0 solvente foi completamente removido emvácuo e purificado por HPLC (SymmetriPrep Ci8, 7μm,coluna de 19 χ 150 mm) para proporcionar 7 (18,5 mg,81%). Ms: calculado para C48H57ClN8On (M+H) m/z 958.38,encontrado 958.10.
EXEMPLO 7
<formula>formula see original document page 190</formula><formula>formula see original document page 191</formula>
Síntese de Composto 1
A uma solução de brometo de 1-bromoetilamina (5 g, 24,4mmols) em DMF (50 ml) foram adicionadasdiisopropiletilamina (8,5 ml, 48,8 mmols) e cloroformatode benzila (3,48 ml, 24,4 mmols). A mistura assim obtidafoi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. A misturada reação foi concentrada e o resíduo foi purificado porflash cromatografia em sílica gel com acetato deetila/hexanos (3/7) como gradiente para proporcionar oComposto 1 como um óleo (4 g, 64%). RMN 1H (CDCl3) δ 3.54(bs, 2H) , 3.61 (bs, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.36 (m, 5H).Síntese de Composto 2
A uma solução de Composto 1 (3,34 g, 12,99 mmols) evalina ter-butil éster (3,27 g, 15,59 mmols) em DMF (50ml) foram adicionados carbonato de potássio (5,39 g,38,97 mmols) e iodeto de potássio (2,59 g, 15,59 mmols).
A mistura assim obtida foi agitada a 100°C durante anoite. A mistura da reação foi concentrada e o resíduofoi purificado por flash cromatografia em sílica gel comacetato de etila/hexanos (2/8) como gradiente paraproporcionar o Composto 2 como um óleo (3,12 g, 69%). RMN1H (CDCl3) δ 0.92 (m, 6H) , 1.46 (s, 9H) , 1.86 (m, 1H) ,2.53 (m, 1H) , 2.80 (m, 2H) , 3.18 (m, 1H) , 3.31 (m, 1H) ,5.10 (s, 2H) , 5.25 (bs, 1H) , 7.36 (m, 5H) ; LC-MS (ESI)296 (M+H-tbutyl + ) , 352 (M+H+) .
Síntese de Composto 3
Uma solução de Composto 2 (3,4 g, 9,72 mmols) e paládiosobre carvão (200 mg) em metanol (30 ml) foi colocada sobpressão atmosférica de hidrogênio a temperatura ambiente.A mistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 2 horas. O paládio foi filtrado e a mistura da reaçãofoi concentrada até a secura para proporcionar o Composto3 como um óleo (2,1 g, 98%). RMN 1H (CD3OD) δ 0.94 (m,6H) , 1.47 (s, 9H) , 1.63 (bs, 2H) , 1.90 (m, 1H) , 2.47 (m,1H), 2.73 (m, 2H).
Síntese de Composto 4
A uma solução de Composto 3 (2,1 g, 9,72 mmols) emdiclorometano (30 ml) foi adicionado FmocOSu (N-(9-Fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida (3,28 g, 9,72mmols) a 0°C. A mistura assim obtida foi agitada por 2horas a 9°C. A mistura foi concentrada até a secura eentão o resíduo foi purificado por flash cromatografia emsílica gel com diclorometano a 100%, seguida por metanola 0,5% em diclorometano e finalmente metanol a 1% emdiclorometano como gradiente para proporcionar o Composto4 como um óleo incolor (2,55 g, 60%). RMN 1H (CDCl3) δ1.03 (d, 3H) , 1.14 (d, 3H) , 1.52 (s, 9H) , 2.28 (m, 1H) ,3.14 (m, 2H) , 3.46 (m , 2H)., 3.89 (d, 1H) , 4.24 (m, 1H) ,4.44 (m, 2H) , 7.29 (m, 2H) , 7.40 (m, 2H) , 7.64 (m, 2H) ,7.80 (d, 2H) ; LC-MS (ESI) 383 (M+H-tbutyl + ) , 440 (M+H+) ,462 (M+Na+) , 478 (M+K+) .
Síntese de Composto 5
A uma solução de Composto 4 (177 mg, 0,4 mmol) emtetrahidrofurano-água (3/1, 8 ml) foi borbulhado gás HClpor 5 min. A mistura da reação foi agitada a 370C durante a noite e então a mistura foi concentrada até a securapara proporcionar o Composto 5 como um sólido (168 mg,98%) que foi usado na etapa seguinte sem purificaçãoadicional. RMN 1H (CDCl3) δ 1.04 (d, 3H) , 1.14 (d, 3H) ,2.32 (m, 1H) , 3.18 (m, 2H) , 3.46 (m , 2H) , 3.95 (d, 1H) ,4.22 (m, 1H) , 4.42 (m, 2H) , 7.29 (m, 2H) , 7.39 (m, 2H) ,7.64 (m, 2H) , 7.79 (d, 2H) ; LC-MS (ESI) 383 (M+H+) , 405(M+Na+)
Síntese de Composto 23
Uma solução de 2-carboxilato de etil-5-nitroindol (2 g, 8,5 mmol) e paládio sobre carvão (2 00 mg) em metanol a50% em diclorometano (100 ml) foi colocada sob pressãoatmosférica de hidrogênio a temperatura ambiente. Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 2 horas. 0 paládio foi filtrado e a mistura da reaçãofoi concentrada até a secura para proporcionar o Composto23 como um óleo incolor (1,68 g, 97%). RMN 1H (CD30D)ô1.38 (t, 3H) , 4.34 (q, 2H) , 6.86 (dd, 1H) , 6.95 (d, 1H) ,6.98 (d, 1H), 7.25 (d, 1H).
Síntese de Composto 24
A uma solução de Composto 23 (300 mg, 1,47 mmol) emdiclorometano (5 ml) foi adicionado Boc2O (385 mg, 1,76mmol) . A mistura assim obtida foi agitada a temperaturaambiente por 2 horas. A mistura da reação foi concentradae o resíduo foi purificado por flash cromatografia em sílica gel com acetato de etila a 10% em hexanos comogradiente para proporcionar o Composto 24 como um sólidobranco (272 mg, 61%). RMN 1H (CD3OD)ô 1.39 (t, 3H) , 1.52(s, 9Η) , 4.37 (q, 2Η) , 7.07 (s, 1Η) , 7.23 (dd, 1Η) , 7.34(d, 1H), 7.68 (bs, 1H).
Síntese de Composto 2 5
Uma solução de Composto 24 (100 mg, 0,33 mmol) em etanol(3 ml) foi adicionada a uma solução de LiOH (12 mg, 0,49mmol) em água (1 ml) . A mistura assim obtida foi agitadaa temperatura ambiente por 2 horas a 50°C. A mistura dareação foi concentrada até a secura para proporcionar umóleo. O resíduo foi dissolvido em água e acidifiçado parapH 3 com HCl a 10%, seguido por extração com EtOAc. Asolução orgânica foi secada sobre Na2SO4, filtrada econcentrada até a secura para proporcionar o Composto 2 5como óleo incolor (85 mg, 92%). RMN 1H (CD30D)ô 1.51 (s,9H) , 7.07 (d, 1H) , 7.23 (dd, 1H) , 7.33 (d, 1H) , 7.68 (bs,1H) .
Síntese de Composto 26
A uma solução de Fmoc-Cit-OH (2 06 mg, 0,52 mmol) emsolução em DMF a 3 0% em diclorometano (3 ml) foramadicionados EDC (120 mg, 0,62 mmol), HOBt (84 mg, 0,62mmol) e benzoato de ter-butil-4-amino (120 mg, 0,62 mmol)a temperatura ambiente. A mistura assim obtida foiagitada por 10 minutos então cloreto de cobre (84 mg,0,62 mmol) foi adicionado à mistura. A mistura foiagitada durante a noite. A mistura foi concentrada até asecura e então o resíduo foi purificado por flashcromatograf ia em sílica gel com metanol a 5% emdiclorometano como gradiente para proporcionar Composto26 como óleo incolor (184 mg, 62%). RMN 1H (CD30D)ô 1.53-1.58 (m, 2H) , 1.57 (s, 9H) , 1.71 (m, 1H) , 1.82 (m, 1H) ,3.08 (m, 1H) , 3.19 (m, 1H) , 4.21 (m, 1H) , 4.28 (m, 1H) ,4.38 (m, 2H) , 7.28-7.39 (m, 3H) , 7.49 (m, 2H) , 7.56-7.86(m, 5H) , 7.89 (m, 2H) ; LC-MS (ESI), 573 (M+H+) , 595(M+Na+) , 611 (M+K+) .
Síntese de Composto 27
A uma solução de Composto 2 6 (1 g, 1,75 mmol) em DMF (18ml) foi adicionada piperidina (2 ml) a temperaturaambiente. A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente por 1 hora. A mistura foiconcentrada até a secura e então o resíduo foi purificadopor flash cromatografia com diclorometano a 100%, seguidopor metanol a 5% em diclorometano e finalmente metanol a2 0% em diclorometano como gradiente para proporcionar umóleo incolor (561 mg, 92%).
A uma solução do óleo (561 mg, 1,6 mmol) em DMF (10 ml)foram adicionados diisopropiletilamina (679 μΐ, 3,9mmols), o composto 5 (509 mg, 1,3 mmol) (veja o Exemplo 1para a preparação) e HATU (4 94 mg, 1,3 mmol) atemperatura ambiente. A mistura assim obtida foi agitadaa temperatura ambiente por 3 horas. A mistura foiconcentrada até a secura e então o resíduo foi purificadopor flash cromatografia em sílica gel com metanol a 5% em diclorometano como gradiente para proporcionar o Composto27 como óleo incolor (691 mg, 65%) . RMN 1H (CD3OD) δ 1.36(dd, 6H) , 1.58-1.62 (m, 2H) , 1.6 (s, 9H) , 1.71 (m, 1H) ,1.82 (m, 1H) , 2.00 (m, 1H) , 2.65 (m, 2H) , 3.2-3.3 (m,4H) , 3.70 (m, 1H) , 4.21 (m, 1H) , 4.28 (m, 2H) , 4.38 (m, 2H) , 4.60 (m, 1H) , 7.28-7.39 (m, 4H) , 7.60-7.70 (m, 4H) ,7.8 (d, 2H) , 7.89 (d, 2H) ; LC-MS (ESI), 716 (M+H+) , 737(M+Na+) , 753 (M+K+) .Síntese de Composto 28
A uma solução de Composto 27 (300 mg, 0,45 mmol) em DMF(9 ml) foi adicionada piperidina (1 ml) a temperaturaambiente. A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente por 1 hora. Então a mistura foiconcentrada até a secura para proporcionar um óleo quefoi esmagado em éter (2 0 ml) . 0 material foi filtradopara proporcionar um sólido branco (186 mg, 84%) .
A uma solução da amina livre (32 mg, 0,065 mmol) emdiclorometano (1 ml) foi adicionado MAL-PEG4-NH éster (50mg, 0,097 mmol). A mistura assim obtida foi agitada atemperatura ambiente por 4 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por HPLC semi-preparativa para proporcionar o Composto 28 como um óleo(47 mg, 95%). RMN 1H (CD3OD) δ 1.10 e 1.15 (2d, 6H) , 1.58-1.62 (m, 2Η) , 1.6 (s, 9Η) , 1.75 (m, 1Η) , 1.90 (m, 1Η) ,2.25 (m, 1Η) , 2.45 (t, 2Η) , 2.5 (t, 2Η) , 3.10-3.25 (m,4Η) , 3.30 (m, 2Η) , 3.45-3.65 (m, 16Η) , 3.75 (m, 4Η), 3.85(d, 1Η) , 4.65 (m, 1Η) , 6.80 (s, 2Η) , 7.67 (d, 2Η) , 7.90(d, 2Η) , 8.80 (d, 1Η) , 10.20 (s, 1Η) ; LC-MS (ESI), 891(Μ+Η+) , 913 (M+Na+) , 929 (Μ+Κ+) .
Síntese de Composto 2 9
A uma solução de Composto 28 (47 mg, 0,062 mmol) emdiclorometano (0,5 ml) foi adicionado ácidotrifluoroacético (0,5 ml) a temperatura ambiente. Amistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 30 minuros. Então a mistura foi concentrada até asecura para proporcionar o Composto 2 9 como um óleo quefoi usado na etapa seguinte sem purificação adicional (40mg, 92%). RMN 1H (CD30D)ô 1.10 e 1.15 (2d, 6H) , 1.60 (m,2H) , 1.80 (m, 1H) , 1.90 (m, 1H) , 2.25 (m, 1H) , 2.45 (t,2H) , 2.5 (t, 2H) , 3.10-3.25 (m, 4H) , 3.30 (m, 2H) , 3.45-3.65 (m, 16H) , 3.75 (m, 4H) , 3.85 (d, 1H) , 4.65 (m, 1H) ,6.80 (s, 2H) , 7.67 (d, 2H) , 7.95 (d, 2H) , 8.80 (d, 1H) ;LC-MS (ESI), 836 (M+H+) , 858 (M+Na+) , 874 (M+K+) .
Síntese de Composto 31
A uma solução de 30 (100 mg, 0,2 mmol) em EtOAc (2 ml)foi adicionada uma solução de HBr concentrada em EtOAc (3ml) a temperatura ambiente. A desproteção de Boc foicompletada após 1 hora. O material precipitado foifiltrado (rendimento quantitativo). Então a amina salgadade TFA foi dissolvida em DMF (3 ml). A esta solução foiadicionado o Composto 25 (55 mg, 0,2 mmol),diisopropiletilamina (173 μL 1 mmol) e HATU (79 mg, 0,2mmol). A mistura assim obtida foi agitada a temperaturaambiente por 3 horas. O solvente foi evaporado e oresíduo foi purificado por HPLC semi-preparativa paraproporcionar o Composto 31 como um sólido branco (86 mg,57%). RMN 1H (CD30D)ô 1.54 (s, 9H) , 2.91 (s, 3H) , 3.10-3.60 (m, 8H) , 3.72 (m, 1H) , 3.97 (m, 1H) , 4.30-4.60 (m,3H) , 6.94 (bs, 1H) , 7.05 (m, 1H) , 7.12 (d, 1H) , 7.45 (m,2H) , 7.68 (d, 1H) , 7.75 (bs, 1H) , 7.86 (d, 1H) , 8.23 (bs,1Η) ; LC-MS (ESI), 562 (M+H-100 + ), 606 (M+H-56+), 662(M+H+), 685 (M+Na+), 701 (M+K+).Síntese de Composto 32
A uma solução de Composto 31 (30 mg, 0,039 mmol) emdiclorometano (0,5 ml) foram adicionados anisol (100 μl)e ácido trifluoroacético (0,4 ml) a temperatura ambiente.
A mistura assim obtida foi agitada a temperatura ambientepor 30 minutos. Então a mistura foi concentrada até asecura para proporcionar um óleo que foi usado na etapaseguinte sem purificação adicional.
A uma solução do óleo em DMF (1 ml) foram adicionados oComposto 29 (36 mg, 0,039 mmol), diisopropiletilamina (40μl, 0,23 mmol) e HATU (15 mg, 0,039 mmol). A misturaassim obtida foi agitada a temperatura ambiente por 1hora. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificadopor HPLC semi-preparativa para proporcionar o Composto 32como um óleo (36 mg, 60%). RMN 1H (CD30D)ô 1.09 e 1.15(2d, 6H), 1.62 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 2.27(m, 1H), 2.45 (t, 2H), 2.51 (t, 2H), 2.98 (s, .3H), 3.13-3.25 (m, 4H), 3.47-3.62 (m, 24H), 3.76 (m, 4H), 3.82 (m,1H), 3.85 (d, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.55-4.70 (m, 4H) , 6.79(s, 2H), 7.06 (s, 1H), 7.36 (bs, 1H), 7.43-7.54 (m, 2H),7.72-7.81 (m, 3H), 7.91 (m, 3H), 8.05 (s, 1H), 8.25 (bs,1H) , 8.82 (d, 1H), 10.25 (s, 1H) ; LC-MS (ESI), 691(M+2H+) /2, 1381 (M+H+), 1419 (M+K+).
EXEMPLO 8: Ensaios de proliferação
A atividade biológica dos compostos citotóxicos dainvenção pode ser ensaiada usando o bem estabelecidoensaio de proliferação de 3H-timidina. Este é um métodoconveniente para quantificar a proliferação celular, umavez que ele avalia a síntese de DNA medindo aincorporação de 3H-timidina rádio-rotulada exógena. Esteensaio é altamente reproduzivel e pode acomodar grandesnúmeros de compostos.
Para executar o ensaio, células de leucemiapromielocítica, HL-60, são culturadas em meio RPMIcontendo soro de bezerro fetal (FCS) inativado aquecido a10%. No dia do estudo, as células são coletadas, lavadase re-suspensas em uma concentração de 0,5 χ IO6células/ml em RPMI contendo FCS a 10%. 100 μΐ desuspensão de células são adicionados a placas de 96poços. Diluições seriais (incrementos de 3 vezes) dedexorubicina (como um controle positivo) ou compostos deteste são produzidas e 100 μΐ de compostos sãoadicionados por poço. Finalmente 10 μΐ de 100 μ(Γί/ιτι13Η-timidina são adicionados por poço e as placas sãoincubadas por 24 horas. As placas são colhidas usando umaHarvester [Colhedeira] de 96 poços (Packard Instruments)e contadas em um contador Packar Top Count. Quatro curvaslogísticas de parâmetros são ajustadas para aincorporação de 3H-timidina como uma função de molaridade do fármaco usando software Prism para determinar osvalores IC50.
Os compostos da invenção geralmente têm um valor de IC50no ensaio acima de cerca de 1 pM a cerca de 100 nM,preferivelmente de cerca de 10 pM a cerca de 10 nM.
EXEMPLO 9: Conjugação de moléculas de fármaco-ligante comanticorpos
Este exemplo descreve as condições de reação emetodologias para conjugar uma molécula de fármaco-ligante da invenção (opcionalmente incluindo outrosgrupos, tais como espaçadores, grupos funcionais reativose similares) a um anticorpo como um agente direcionador,X4. As condições e metodologias são intencionadas a seremexemplares somente e não limitantes. Outras soluções paraconjugar moléculas de fármaco-ligante a anticorpos são conhecidas na técnica.
0 método de conjugação descrito aqui é baseado naintrodução de grupos tióis livres ao anticorpo através dareação de lisinas do anticorpo com 2-iminotiolano,seguida por reação da molécula de fármaco-ligante com um grupo maleimida ativo. Inicialmente o anticorpo a serconjugado foi trocado em tamponador de fosfato 0,1 M depH 8,0 contendo NaCl 50 mM, DTPA 2 mM, pH 8,0 econcentrado para 5-10 mg/ml. A tiolação foi conseguidapor adição de 2-iminotiolano ao anticorpo. A quantidadede 2-iminotiolano a ser adicionado foi determinada emexperimentos preliminares e varia de anticorpo paraanticorpo. Nos experimentos preliminares, uma titulaçãode quantidades crescentes de 2 -iminotiolano foiadicionada ao anticorpo, e seguindo a incubação com oanticorpo por uma hora a temperatura ambiente, oanticorpo foi dessalgado em tamponador HEPES 50 mM pH 6,0usando uma coluna Sephadex G-2 5 e o número de grupostióis introduzidos determinado rapidamente por reação comditiodipiridina (DTDP). A reação de grupos tióis com DTDPresulta na liberação de tiopiridina que é monitorada em324 nm. Amostras em uma concentração de proteína de 0,5-1,0 mg/ml foram usadas. A absorvência em 280 nm foi usadapara determinar precisamente a concentração de proteínanas amostras, e então uma alíquota de cada amostra (0,9ml) foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de matéria-prima 5 mM em etanol) por 10 minutos a temperaturaambiente. Amostras de material de tamponador sozinho maisDTDP também foram incubadas paralelamente. Após 10minutos, a absorvência a 324 nm foi medida e o número detióis presentes quantificado usando um coeficiente deextinção para tiopiridina de 19800M"1.
Tipicamente um nível de tiolação de três grupos tióis poranticorpo é desejado. Por exemplo, com um particularanticorpo isto foi conseguido adicionando um excessomolar de 15 vezes de 2-iminotiolano seguido por incubaçãoa temperatura ambiente por 1 hora. 0 anticorpo a sercojugado foi portanto incubado com 2-iminotiolano narazão molar desejada e então dessalgado no tamponador deconjugação (tamponador HEPES 50 mM pH 6,0 contendoGlicina 5 mM, Glicerol a 3% e DTPA 2 mM) . 0 materialtiolado foi mantido em gelo enquanto o número de tióisintroduzidos foi quantificado como descrito acima.
Após a verificação do número de tióis introduzidos, amolécula fármaco-ligante contendo um grupo maleimidaativo foi adicionada em um excesso molar de 3 vezes portiol. A reação de conjugação foi executada em tamponadorde conjugação também contendo uma concentração final deetileno glicol dimetil éter a 5% (ou um solventealternativo adequado) . Comumente, a solução de matéria-prima de fármaco-ligante foi dissolvida em etileno glicoldimetil éter a 90%, sulfóxido de dimetila a 10%. Paraadição a anticorpo, a solução de matéria-prima pode seradicionada diretamente ao anticorpo tiolado, o qual temsuficiente etileno glicol dimetil éter adicionado paratrazer a concentração final para 5%, ou pré-diluído emtamponador de conjugação contendo uma concentração finalde etileno glicol dimetil éter de 10%, seguido por adiçãoem um volume igual de anticorpo tiolado.
A reação de conjugação foi incubada a temperaturaambiente por 2 horas com agitação. Seguindo a incubaçãoda mistura da reação foi centrifugada a 14.000 rpm por 15minutos e o pH foi ajustado para 7,2 se a purificação nãofoi imediata. A purificação de conjugado foi conseguidapor cromatografia usando um número de métodos. Oconjugado pode ser purificado usando cromatografia deexclusão de tamanho em uma coluna Sephacryl S2 00 pré-equilibrada com tamponador HEPES 50 mM pH 7,2 contendoglicina 5 mM, NaCl 50 mM e glicerol a 3%. A cromatografiafoi executada em uma taxa de fluxo linear de 2 8 cm/h. Asfrações contendo conjugado foram coletadas, reunidas econcentradas. Alternativamente a purificação pode serconseguida por cromatografia de troca de ions. Ascondições variam de anticorpo para anticorpo e necessitamser otimizadas em cada caso. Por exemplo, mistura dereação de conjugado de anticorpo-fármaco foi aplicada auma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em HEPES 50 mM,Glicina 5 mM, glicerol a 3%, pH 6,0. O conjugado deanticorpo foi eluído usando um gradiente de NaCl 0-1 M emtamponador de equilíbrio. As frações contendo o conjugadoforam reunidas, o pH foi ajustado para 7,2 e a amostraconcentrada como requerido.EXEMPLO 10: Estudos in vivo
A. Tratamento de xenoenxertos de tumor in vivo
Anti-PSMA (2A10, veja o pedido de patente U.S. co-possuído de número de série 60/654.125, depositado em 18de fevereiro de 2005, incorporado aqui por referência) eanticorpo de controle de isotipo (anti-CD70 IGGl clone2H5, (veja o pedido de patente U.S. co-possuído de númerode série 60/720.600, incorporado aqui por referência)foram cada um trocados com tamponador em tamponador defosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM, econcentrado para 6 mg/ml. Ambos anticorpos foram entãotiolados por incubação com um excesso molar de 25 vezesde 2 -iminotiolano por uma hora a temperatura ambiente,seguido por dessalgamento em tamponador de fosfato 0,1 MpH 6,0 contendo NaCl 50 mM e tamponador DTPA 2 mM usandouma coluna Sephadex G-25. Os anticorpos tiolados foramentão mantidos em gelo, enquanto o número de grupos tióisintroduzidos foi determinado. Isto foi conseguido porreação de uma amostra de anticorpo tiolado comditiodipiridina (DTDP). A absorvência a 280 nm foi medidapara determinar a concentração de proteína nas amostras,e então uma alíquota de cada amostra (0,9 ml) foiincubada com 0,1 ml de DTDP (solução de matéria-prima 5mM em etanol) por 10 minutos a temperatura ambiente.
Amostras de material de tamponador sozinho mais DTDPforam incubadas paralelamente. A absorvência em 324 nmfoi medida e o número de tióis presentes por anticorpoquantificado usando· um coeficiente de extinção paratiopiridina de 19800M"1. No caso de anti-PSMA 5,3 tióispor anticorpo foram introduzidos, e no caso de controlede isotipo 6,0.
Os anticorpos tiolados foram então incubados com umexcesso molar de 3 vezes de Composto A em relação àconcentração molar de grupos tiol.<formula>formula see original document page 202</formula>
Composto A
Solução de matéria-prima 5 mM em DMSO de Composto A foiadicionada aos anticorpos tiolados junto com suficienteDMSO para trazer a concentração final de DMSO para 10%(v/v) . Após a incubação a temperatura ambiente por 3horas o pH da mistura da incubação foi elevado para 7,0usando trietanolamina. Os conjugados anticorpo-Composto Aforam então purificados por cromatografia de exclusão detamanho em uma coluna Sephacril S2 00 pré-equilibrada com tamponador de fosfato 0,1 M (pH 7,2) contendo NaCl 50 mMe DMSO a 5% (v/v) . As frações contendo conjugadomonomérico foram coletadas e reunidas. Os conjugadospurificados resultantes foram então concentrados em umacélula agitada sob nitrogênio, usando uma membrana decorte de IOkDa. As concentrações e razões de substituição(número de moléculas de fármaco ligadas por molécula deanticorpo) dos conjugados foram determinadas usandoabsorvência em 280 nm e 340 nm, por referência aoscoeficientes de extinção de tanto anticorpo quanto Composto A em cada comprimento de onda como medidoanteriormente.
A eficácia anti-tumor de anti-PSMA (clone 2A10) conjugadocom Composto A foi testada em LNCaP, que são xenoenxertosde carcinoma de próstata humano, desenvolvidos em camundongos macho CB17.SCID (disponíveis de Taconic,Germantown, NY) . As células de câncer de próstata LNCaPexpressando altos níveis de PSMA foram obtidas de ATCC(Cat# CRL-1740) e expandidas in vitro seguindo asinstruções da ATCC. Camundongos macho CB17.SCID de 8semanas de idade de Taconic foram implantadossubcutâneamente no flanço direito com 2,5 χ 10^6 célulasLNCaP em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por camundongo. Oscamundongos foram pesados e medidos quanto ao tumortridimensionalmente usando um calibrador eletrônico duasvezes por semana começando três semanas pós-implantação.
O volume tumoral individual foi calculado como altura χlargura χ comprimento. Os camundongos com tumoresvascularizados (determinados pela aparência dos tumores)de tamanhos apropriados foram randomizados em grupos detratamento e foram dosados por peso corporal individualno Dia 0 Os camundongos foram monitorados quanto aocrescimento do tumor 60 dias pós-dosagem e terminados nofim do estudo. Os camundongos foram eutanasiados quandoos tumores alcançaram ponto final tumoral (1.500 mm3) .
Tabela 1. Sumário de estudo de xenoenxerto de LNCaP
<table>table see original document page 203</column></row><table>
Composto A
Como mostrado na fig. 1, 0,3 μΓηοΙ/kg (referindo-se aosmols do Composto A de citotoxina) do conjugado 2A10-Composto A induziram regressão completa de todos os trêstumores de LNCaP pequenos estabelecidos.
B. Estudo dose-resposta
Anti-PSMA (2A10) foi trocado com tamponador em tamponadorde fosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM,e concentrado para 5,6 mg/ml. O anticorpo foi entãotiolado por incubação com um excesso molar de 7,5 vezesde 2 - iminot iolano por uma hora a temperatura ambiente,seguido por dessalgamento em tamponador HEPES 50 mM pH6,0 contendo glicina 5 mM, DTPA 2 mM e glicerol a 3%(v/v) usando uma coluna Sephadex G-25. 0 anticorpotiolado foi mantido em gelo, enquanto o número de grupostióis introduzidos foi determinado. Isto foi conseguidopor reação de uma amostra de anticorpo tiolado comditiodipiridina (DTDP) . A absorvência em 280 nm foimedida para determinar a concentração de proteína nasamostras, e então uma alíquota de cada amostra (0,9 ml)foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de matéria-prima5 mM em etanol) por 10 minutos a temperatura ambiente.Amostras de material de tamponador sozinho mais DTDPforam incubadas paralelamente. A absorvência em 324 nmfoi medida e o número de tióis presente por anticorpoquantificado usando um coeficiente de extinção paratiopiridina de 19800 M"1.
O anticorpo tiolado foi então incubado com um excessomolar de 2 vezes de Composto A em relação à concentraçãomolar de grupos tióis. O Composto A, solução de matéria-prima em 10% (v/v) de DMSO 5 mM/90% (v/v) de etilenoglicol dimetil éter, foi adicionado ao anticorpo tioladojunto com suficiente etileno glicol dimetil éter paratrazer a concentração final para 5% (v/v). Após incubaçãoa temperatura ambiente por 2 horas o conjugado anticorpo-Composto A foi purificado por cromatografia de troca deíons. A mistura da reação foi aplicada a uma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em tamponador A (HEPES 50 mM,glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 6,0). A coluna foilavada com tamponador A, então com 95% de tamponador A,5% de tamponador B (HEPES 50 mM, NaCl 1 M, glicina 5 mM,glicerol a 3% (v/v) , pH 7,2) e então o conjugadoanticorpo-Composto A foi eluído com 10% de tamponador B,90% de tamponador A. As frações contendo conjugadomonomérico foram coletadas e reunidas e o pH ajustadopara 7,2 por adição de monoetanolamina. 0 conjugadopurificado resultante foi então dialisado em HEPES 50 mM,NaCl 100 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 7,2 eentão concentrado em uma célula agitada sob nitrogênio,usando uma membrana de corte de IOkDa. As concentrações erazões de substituição (número de moléculas de fármacoligadas por molécula de anticorpo) do conjugado foramdeterminadas usando absorvência em 280 nm e 340 nm, porreferência aos coeficientes de extinção de tantoanticorpo quanto Composto A em cada comprimento de ondamedido previamente. O conjugado de controle de isotipo(anti-CD70 2H5) foi preparado usando o mesmo métodoexceto que a eluição do conjugado a partir da coluna detroca de íons foi conseguido com 15% de tamponador B, 85%de tamponador A.
A eficácia e seletividade dos conjugados foi determinadausando xenoenxertos de carcinoma de próstata humanosdesenvolvidos em camundongo CB17.SCID como descritoacima. 0 design deste estudo de xenoenxerto está resumidona tabela 2.
Tabela 2. Sumário de estudo de xenoenxerto de LNCaP
<table>table see original document page 205</column></row><table>
Como mostrado na Tabela 2 e figs. 2-3, 0,15 μmol/kg deanti-PSMA-Composto A (fig. 2) teve melhor eficácia anti-tumor do que 0,90 μmol/kg de controle de isotipo-CompostoA, indicando seletividade pelo menos >6x (fig. 3). 0,90μmol/kg de anti-PSMA-Composto A somente mostraramtoxicidade transiente (fig. 5) e estava abaixo da dosetolerada máxima. Portanto, um índice terapêutico de 6vezes foi identificado para anti-PSMA-Composto A emcamundongo tendo tumor LNCaP.
C. Eficácia em tumores grandes
Anti-PSMA (2A10) foi trocado com tamponador em tamponadorde fosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM,e concentrado para 5,6 mg/ml. 0 anticorpo foi entãotiolado por incubação com um excesso molar de 9 vezes de2-iminotiolano por uma hora a temperatura ambiente,seguido por dessalgamento em tamponador HEPES 50 mM pH6,0 contendo glicina 5 mM, DTPA 2 mM e glicerol a 3%(v/v) usando uma coluna Sephadex G-25. 0 anticorpotiolado foi mantido em gelo, enquanto o número de grupostióis introduzidos foi determinado. Isto foi conseguidopor reação de uma amostra de anticorpo tiolado comditiodipiridina (DTDP) . A absorvência em 280 nm foimedida para determinar a concentração de proteína nasamostras, e então uma alíquota de cada amostra (0,9 ml)foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de matéria-prima5 mM em etanol) por 10 minutos a temperatura ambiente.Amostras de material de tamponador sozinho mais DTDPforam incubadas paralelamente. A absorvência em 324 nmfoi medida e o número de tióis presentes por anticorpoquantificado usando um coeficiente de extinção paratiopiridina de 19800M"1.
O anticorpo tiolado foi então incubado com um excessomolar de 2 vezes de Composto A em relação à concentraçãomolar de grupos tióis. Composto A, solução de matéria-prima 5 mM em 10% (v/v) de DMSO/90% (v/v) etileno glicoldimetil éter, foi adicionado ao anticorpo tiolado juntocom suficiente etileno glicol dimetil éter para trazer aconcentração final para 5% (v/v). Após incubação atemperatura ambiente por 2 horas o conjugado anticorpo-Composto A foi purificado por cromatografia de troca deíons. A mistura da reação foi aplicada a uma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em HEPES 50 mM, glicina 5 mM,glicerol a 3% (v/v), pH 6,0 (tamponador A) . A coluna foilavada com tamponador A, então com 95% de tamponador A,5% de tamponador B (HEPES 50 mM, NaCl 1 M, glicina 5 mM,glicerol a 3% (v/v), pH 7,2) e então o conjugadoanticorpo-Composto A foi eluído com 10% de tamponador B,90% de tamponador A. As frações contendo conjugadomonomérico foram coletadas e reunidas e o pH ajustadopara 7,2 por adição de monoetanolamina. O conjugadopurificado resultante foi então dialisado em HEPES 50 ttiM,NaCl 100 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 7,2 eentão concentrado em uma célula agitada sob nitrogêniousando uma membrana de corte de 10 kDa. As concentraçõese razões de substituição (número de moléculas de fármacoligadas por molécula de anticorpo) do conjugado foramdeterminadas usando absorvência em 280 nm e 340 nm, porreferência aos coeficientes de extinção de tantoanticorpo quanto Composto A em cada comprimento de ondacomo medido anteriormente. O conjugado de controle deisotipo (anti-CD70 2H5) foi preparado usando o mesmométodo exceto que a eluição de conjugado a partir dacoluna de troca de ions foi conseguida com 15% detamponador B, 85% de tamponador A.
A eficácia e seletividade dos conjugados foramdeterminadas usando xenoenxertos de carcinoma de próstatahumano desenvolvidos em camundongos macho CB17.SCID comodescrito acima. O design destes estudos de xenoenxertoestá resumido nas tabelas 3 e 4.
Tabela 3. Sumário de estudo de xenoenxerto de LNCaP
<table>table see original document page 207</column></row><table>
Como mostrado na Tabela 3 e fig. 6, uma única dose baixade 0,15 μmol/kg de anti-PSMA-Composto A inibiugrandemente o crescimento de tumores LNCaP grandesestabelecidos de tamanhos médios de 240 mm3. Emcontraste, 0,15 μmol/kg de controle de isotipo-Composto Ativeram uma eficácia mínima anti-tumor. Como mostrado naTabela 4 e fig. 7, uma dose única de 0,3 0 μmol/kg deanti-PSMA-Composto A induziu a regressão e inibiu ocrescimento de tumores LNCaP muito grandes de tamanhosmédios de 430 mm3.
Tabela 4. Sumário de estudo de xenoenxerto de LNCaP
<table>table see original document page 208</column></row><table>
Exemplo 11: Estudos in vivo
As amostras seguintes foram preparadas de acordo geralcom os exemplos fornecidos acima.
<table>table see original document page 208</column></row><table>
Toxina 1<formula>formula see original document page 209</formula>
Cinco (5) amostras de camadas tamponadas coletadasrecentemente de doadores voluntários saudáveis foramobtidas. As células mononucleares de sangue periférico(PBMC) foram purificadas usando centrifugação emgradiente de acordo com o procedimento Ficoll-Paque® plus(REf. -7907, StemCell Technologies, Meylan, France) . Aviabilidade de células PBMC foram avaliadas por exclusãode azul tripano a 0,25% antes de análises dee FACS bemcomo antes de injeção in vivo.
Os cinco marcadores CERCA DE listados na tabela seguinteforam analisados:
<table>table see original document page 209</column></row><table>
Duas amostras diferentes de PBMC foram usadas, umaprimeira para os Grupos 1 a 3 (estudo de anticorpos nus)e uma segunda para os Grupos 4 e 6 (estudo de anticorposconjugados com toxina). Os critérios para seleção foram onúmero total de células, a porcentagem mais alta de CD56,e viabilidade de células.
Tumores foram induzidos subcutaneamente injetando 5 χ 10"6células 786-0 em 200 μl de RPMI 1640 no flanco direito de78 camundongos NOD-SCID. Estas células 786-0 se mostrarama expressar o antígeno alvo CD70 por FACS usando o mesmoanticorpo que o usado nestes experimentos in vivo. 0tratamento começou quando o volume de tumor médioalcançou 80 mm3 (cerca de 15 dias). Antes do início dotratamento, 48 camundongos com tumor de 78 enxertadosforam randomizados em 6 grupos de 8 animais. O volume detumor médio de cada grupo foi comparável e nãoestatisticamente diferente dos outros grupos (análise devariânça). Os 48 camundongos randomizados receberam umaúnica injeção IP de amostra de PBMC humano, com 3,6 χ IO7células por camundongo (correspondentes a 4,81 χ IO6células positivas de CD56 por camundongo) para os gruposIa3e4,5x IO7 células por camundongo (correspondentesa 4,79 χ IO6 células positivas de CD56 por camundongo)para os grupos 4 e 6.
0 programa de tratamento foi como segue:
<table>table see original document page 210</column></row><table>
• Os camundongos do grupo 1 receberam injeções IP repetidasde controle de isotipo IgGl em 15 mg/kg/inj seguindo oprograma Q4Dx,
• Os camundongos do grupo 2 receberam injeções IP repetidasde anticorpo anti-CD70 em 15 mg/kg/inj seguindo oprograma Q4Dx,
• Os camundongos do grupo 3 receberam injeções IP repetidasde anticorpo defucosilado anti-CD70 em 15 mg/kg/injseguindo o programa Q4Dx,
Os camundongos do grupo 4 receberam duas injeções IV deanticorpo anti-CD70 conjugado com toxina 1 seguindo oprograma Q14Dx2
Os camundongos do grupo 5 receberam duas injeções IV deanticorpo defucosilado anti-CD70 conjugado com toxina 1seguindo o programa Q14Dx2,
Os camundongos do grupo 6 receberam uma única injeção IVde anticorpo anti-CD70 conjugado com toxina 2.
A fig. 8 ilustra o tamanho do tumor durante o curso doestudo. Cada uma das toxinas conjugadas com anticorporesultaou em tamanho de tumor diminuído, particularmentequando comparado com o crescimento sem qualquer toxina. Afig. 9 ilustra o peso corporadl durante o curso doestudo.
Cada um dos pedidos de patentes, patentes, publicações, eoutros documentos publicados mencionados ou referidosnesta especificação é aqui incorporado por referência emsua totalidade, na mesma extensão como se cada individualpedido de patente, patente, publicação e outro documentopublicado fosse especificamente e individualmenteindicado para ser incorporado por referência.
Embora a presente invenção tenha sido descrita comreferência a configurações específicas da mesma, deve serentendido por aqueles experientes na técnica que váriasmudanças podem ser feitas e equivalentes podem sersubstituídos sem se desviar do verdadeiro espírito eescopo da invenção e das reivindicações anexas. Emadição, muitas modificações podem ser feitas para adaptaruma particular situação, material, composição de matéria,processo, etapa ou etapas de processo, ao objetivo, aoobjetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todastais modificações são intencionadas a estar dentro doescopo das reivindicações aqui anexas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Medarex, Inc
Boyd, Sharon ElaineChen, LiangGangwar, SanjeevGuerlavais, VincentHorgan, Killian
<120> Sufi, Bilal
"CONJUGADO DE FÁRMACO-ANTICORPO, FORMULAÇÃOFARMACÊUTICA, MÉTODO PARA MATAR UMA CÉLULA DETUMOR, MÉTODO PARA RETARDAR OU INTERROMPER OCRESCIMENTO DE UM TUMOR EM UM SUJEITO MAMÍFERO E
<130> COMPOSTO".
<150> 2203448-woO
<151>
60/720,499<160> 2005-09-26
<170> 7
PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Seqência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<400> 1Ala Leu Ala Leu1
<210><211><212 ><213 >Seqência Artificial
<220><223>Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<220>
<221> M0D_RES<222 > (1)<223> Beta-Ala
<400> 2Ala Leu Ala Leu1
<210 > 3
<211> 4
<212 > PRT
<213> Seqência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<4 0 0 > 3Gly Phe Leu Gly1
<210 > 4
<211> 4
<212 > PRT
<213> Seqência Artificial<22 0 >
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<400> 4Pro Arg Phe Lys1
<210 > 5
<211> 4
<212 > PRT
<213> Seqência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<4 0 0 > 5Thr Arg Leu Arg1
<210> 6
<211> 4
<212 > PRT
<213> Seqência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético<400> 6
Ser Lys Gly Arg1
<210> 7
<211> 4
<212 > PRT
<213> Seqência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético
<400> 7
Pro Asn Asp Lys1

Claims (24)

1. Conjugado de anticorpo-fármaco, caracterizado pelofato de compreender:um anticorpo tendo especificidade para pelo menos um tipode tumor;um fármaco; eum ligante acoplando o fármaco ao anticorpo, sendo que oligante é clivável na presença do tumor,sendo que o conjugado anticorpo-fármaco retarda ocrescimento do tumor quando administrado em umaquantidade correspondendo a uma dosagem diária de 1μmol/kg ou menor.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de retardar o crescimento dotumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 1 μmol/kg ou menordurante um período de pelo menos cinco dias.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o tumor ser um tomor do tipohumano em um camundongo SCID.
4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de retardar o crescimento dotumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,6 μmol/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de retardar o crescimento dotumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,3 μmol/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de retardar o crescimento detumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,15 μmol/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de interromper o crescimento detumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 1 μτηοΐ/kg ou menordurante um período de pelo menos cinco dias.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de interromper o crescimento detumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,6 μΓηοΙ/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de interromper o crescimento detumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,3 μπιοΐ/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de interromper o crescimento detumor quando administrado em uma quantidadecorrespondendo a uma dosagem diária de 0,15 μτηοΐ/kg oumenor durante um período de pelo menos cinco dias.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o ligante compreender umaparcela de hidrazina clivável na presença do tumor.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o ligante compreender umpolipeptídeo clivável na presença do tumor.
13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o tumor ser um tumorcarcinoma.
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o tumor ser tumor carcinoma depróstata.
15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o fármaco ser selecionado dogrupo consistindo de: duocarmicinas, CC-1065, análogos deduocarmicina baseados em CBI, análogos de duocarmicinabaseados em MCBI, análogos de duocarmicina baseados emCCBI, dolastatinas, dolastatina-10, combretastatina,caliqueamicina, maitansina, análogos de maitansina, DM-1,auristatina Ε, auristatina EB (AEB), auristatina EFP(AEFP), monometil auristatina E (MMAE), tubulisinas,disorazol, epotilonas, Paclitaxel, docetaxel, Topotecan,equinomicina, estramustina, cemadotina, eleuterobina,metopterina, actinomicina, daunorubicina, conjugados dedaunorubicina, mitomicina C, mitomicina A1 vincristina,taxol, ácido retinóico taxotere e camptotecina.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o fármaco ter uma estrutura:<formula>formula see original document page 217</formula>onde o sistema de anel A é um membro selecionado degrupos arila substituído ou não substituído, heteroarilasubstituído ou não substituído e heterocicloalquilasubstituído ou não substituído;E e G são memros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído ou não substituído, um heteroátomo, umaligação simiples, ou EeG são unidos para formar umsistema de anel selecionado de arila substituído ou nãosubstituído, heteroarila substituído ou não substituído eheterocicloalquila substituído ou não substituído;X é um membro selecionado de 0, Se NR23; R23 é um membroselecionado de H, alquila substituído ou não substituído,heteroalquila substituído ou não substituído, e acila;R3 é um membro selecionado do grupo consistindo de (=0),SR11, NHR11 e OR11,sendo que,R11 é um membro selecionado do grupo consistindo de H,alquila substituído ou não substituído, heteroalquilasubstituído, heteroalquila não substituído, difosfatos,trifosfatos, acila, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13,P(O) (OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 e SiR12R13R14,nos quaisR12, R13, e R14 são membros selecionados independentementede H, alquila substituído ou não substituído,heteroalquila substituído ou não substituído e arilasubstituído ou não substituído, sendo que R12 e R13 juntoscom o átomo de nitrogênio ou carbono ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formra um sistemade anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos;R4, R4', R5, e R5' são membros selecionadosindependentemente do grupo consistindo de H, alquilasubstituído, alquila não substituído, arila substituído,arila não substituído, heteroarila substituído,heteroarila não substituído, heterocicloalquilasubstituído, heterocicloalquila não substituído,halogênio, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15,C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, e O(CH2)nN(CH3)2ondeη é um número inteiro de 1 a 20;R15 e R16 são selecionados independentemente de H, alquilasubstituído ou não substituído, heteroalquila substituídoou não substituído, arila substituído ou não substituído,heteroarila substituído ou não substituído,heterocicloalquila substituído ou não substituído, epeptidila substituído ou não substituído, sendo que R15 eR16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estãoligados são opcionalmente unidos para formar um sistemade anel de heterocicloalquila substituído ou nãosubstituído tendo de 4 a 6 membros, opcionalmentecontendo dois ou mais heteroátomos;Rs é uma ligação simples que está ou presente ou ausentee quando presente R6 e R7 são unidos para formar um anelde ciclopropila; eR7 é CH2-X1 ou -CH2- unido no citado anel de ciclopropilacom R67 ondefarmaceuticamente aceitável do mesmo.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de o fármaco ter a estrutura:ondeZ é um membro selecionado de O, Se NR23sendo queR23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila;R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8, onde R8 é um membro selecionado de NR9R10e OR9,no qualR9 e R10 são membros independentemente selecionados de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído;R1' é H, alquila inferior substituído ou não substituído,ou C(O)R8, onde R8 é um membro selecionado de NR9R10 e OR9,no qualR9 e R10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído ou heteroalquilasubstituído ou não substituído;X1 é um grupo partindo,sendo que pelo menos um de R11, R12, R13, R15 ou R16 éacoplado ao ligante, ou o fármaco é um salR2 é Η, alquila inferior substituído ou não substituídoou heteroalquila ou ciano ou alcoxi não substituído; eR2' é H, oualquila inferior substituído ou nãosubstituído ou heteroalquila não substituído, sendo que pelo menos um de R11i R12, R13, R15 ou R16 éacoplado ao ligante, ou o fármaco é um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de o fármaco ter a estrutura:<formula>formula see original document page 220</formula>onde Z e um membro selecianado de O, S e NR23sendo queR23 é um membro selecionado de H, alquila substituído ounão substituído, heteroalquila substituído ou nãosubstituído, e acila;R1 é H, alquila inferior substituído ou não substituído,C(O)R8, ou CO2R8, onde R8 é um membro selecionado do grupoconsistindo de alquila substituído, alquila nãosubstituído, NR9R10, NR9NHR10, e OR9no qualR9 e R10 são membros selecionados independentemente de H,alquila substituído ou não substituído e heteroalquilasubstituído ou não substituído; eR2 é H, alquila substituído ou alquila inferior nãosubstituído; sendo que pelo menos um de R11, R12, R13, R15 ou R16 éacoplado ao ligante, ou o fármaco é um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
19. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser selecionado de<formula>formula see original document page 221</formula><formula>formula see original document page 222</formula><formula>formula see original document page 223</formula><formula>formula see original document page 224</formula>e<formula>formula see original document page 224</formula>onde Ab e o anticorpo, X1 e Cl ou Br, e PEG e uma parcelade polietileno glicol.
20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser selecionado de<formula>formula see original document page 225</formula>
21. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um conjugado de anticorpo-fármaco conformedefinido na reivindicação 1, e um portadorfarmaceuticamente aceitável.
22. Método para matar uma célula de tumor, caracterizadopelo fato de compreender administrar à citada célula detumor uma quantidade de um conjugado de anticorpo-fármacoconforme definido na reivindicação 1 suficiente paramatar a citada célula.
23. Método para retardar ou interromper o crescimento deum tumor em um sujeito mamífero, caracterizado pelo fatode compreender administrar ao citado sujeito umaquantidade de um conjugado de anticorpo-fármaco conformedefinido na reivindicação 1, suficiente para retardar ouinterromper o crescimento.
24. Composto, caracterizado pelo fato de ser selecionadode:<formula>formula see original document page 226</formula><formula>formula see original document page 227</formula><formula>formula see original document page 228</formula>onde r é um número inteiro na faixa de 0 a 24.
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