JP2009509977A - 抗体−薬剤コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

抗体−薬剤コンジュゲート及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳類又は人間の治療のための、改良された治療薬の提供。より詳しくは、特に、高い活性特異性を呈し、毒性が減少され、周知の類似した構造の化合物と比較して血液中での安定性が改善された、サイトトキシンの提供。
【解決手段】薬剤と抗体がリンカー（例えばペプチジル、ヒドラジン又はジスルフィドリンカー）で結合された抗体−薬剤コンジュゲート。これらのコンジュゲートは有力な細胞毒素であって、活性型の形態で標的作用部位に選択的に輸送することが可能で、更にそこで切断を受けて活性の薬剤を放出することができる。当該リンカーのアームは、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの酵素的若しくは還元的手段によって切断されて活性の薬剤部分がプロドラッグ誘導体から遊離することにより、細胞障害性の薬剤を放出させることができる。【選択図】図８

Description

（関連出願）本特許出願は、２００５年９月２６日に出願の米国仮特許出願第６０／７２０４９９号の優先権（３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく最先の出願日の利益）を主張し、全開示内容を本願明細書に援用する。
（技術分野）本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断される抗体−薬剤コンジュゲートの提供に関する。当該抗体−薬剤コンジュゲートを用いてプロドラッグと細胞毒素のコンジュゲートを形成できる。
多くの治療薬、特に癌化学療法に効果的な治療薬は、しばしばｉｎ ｖｉｖｏの急性毒性、特に骨髄及び粘膜毒性、あるいは慢性の心臓又は神経毒性を呈する。このような高い毒性の存在により、それらの使用は制限されかねない。ゆえに、より多くのより安全な特異的治療薬（特に制癌剤）の開発を行い、これらの製品の使用による副作用（毒性、非腫瘍細胞の傷害、その他）の頻度、及び腫瘍細胞の症状の軽減を効果的に行うことが望ましい。また、既存の治療薬が有する他の問題点は、血漿中において、最適な場合よりも安定性が低いことである。ただし、これらの化合物を安定化させる目的で官能基を付加した場合、活性が顕著に低下してしまう。したがって、治療における活性のレベルを維持しつつ、化合物を安定化する方法の開発が求められている。
細胞障害性を有し、より特異性の高い薬剤がここ数十年の間極めて活発に検索されたが、服用を制限する要因となる毒性（すなわち通常の組織に作用する望ましくないサイトトキシン活性）が、これまで癌治療を阻害する主な原因となっていた。例えば、ＣＣ−１０６５及びデュオカルマイシンは、極めて強力なサイトトキシンであることが公知である。
ＣＣ−１０６５は、アップジョン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ）社によって１９８１のストレプトマイセス・ゼレンシスから最初に分離され（非特許文献１、２、３）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び実験動物における抗腫瘍及活性及び抗菌活性を有することが明らかにされた（非特許文献４）。ＣＣ−１０６５は、５’−ｄ（Ａ／ＧＮＴＴＡ）−３’及び５’−ｄ（ＡＡＡＡＡ）−３’の配列選択性により、副溝中で二本鎖Ｂ−ＤＮＡに結合し（非特許文献５）、その分子中に存在するＣＰＩ左側部分によって３’−アデニンのＮ３位置をアルキル化する（非特許文献６）。ＣＣ−１０６５は、その強力かつ広範な抗腫瘍活性にもかかわらず、それが実験動物の遅延死を引き起こすため、人間に対する使用を不可能にしている。
ＣＣ−１０６５及びデュオカルマイシンの多くのアナログ及び誘導体が現在公知である。その構造式、合成及び化合物の特性の多くが、これまで研究されている。非特許文献７及び８を参照のこと。
協和醗酵工業社のグループは、多くのＣＣ−１０６５誘導体を調製している。例えば、特許文献１から１１を参照のこと。
また、アップジョン社はＣＣ−１０６５の誘導体を多種にわたり調製している。例えば、特許文献１２から１５を参照のこと。
やがて、研究開発の矛先は、プロドラッグ（それらの構造がｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の化学的又は酵素的改変を受けることにより、薬剤（活性な治療化合物）に変換されることができる化合物）と称される、新しいタイプの治療薬に集中した。この変換が、循環器又は対象外の組織よりもむしろ、活性を発揮する部位又は標的組織において選択的に行われるため、毒性が減少する。しかしながら、それらの多くのものは、血液及び血清において安定性が低いという問題を孕んでいる。なぜなら、プロドラッグが患者の体内の所望の部位に到達する前に、酵素により分解され、又は活性化されてしまうからである。
ブリストル‐マイヤーズスクイブ社は、特定のリソソームの酵素により分解可能な抗腫瘍薬剤コンジュゲートを開示している。特許文献１６を参照のこと。なお、この特許は、アミノベンジルオキシカルボニル化合物に関するものである。
シアトルジェネティクス社は、特許文献１７及び１８を開示しており、それらは、ｐ−アミノベンジルエーテルを薬剤輸送担体に使用することに関するものである。但し、これらの特許文献に記載されているリンカーは、アミノベンジルエーテル組成物に限定されている。
他のグループもまた、リンカーに関して開示している。例えば非特許文献９から１３、特許文献１９を参照のこと。これらのリンカーには、アミノベンジルエーテルスペーサー、細長い電子カスケード及び環化スペーサーシステム、例えばｗ−アミノ アミノカルボニルのような環化除去スペーサー、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーが含まれる。
米国特許第５１０１０３８号 米国特許第５６４１７８０号 米国特許第５１８７１８６号 米国特許第５０７００９２号 米国特許第５７０３０８０号 米国特許第５０７００９２号 米国特許第５６４１７８０号 米国特許第５１０１０３８号 米国特許第５０８４４６８号 国際公開第９６／１０４０５号 欧州特許出願公開第０５３７５７５号 米国特許第５７３９３５０号 米国特許第４９７８７５７号 米国特許第５３３２８３７号 米国特許第４９１２２２７号 米国特許第６２１４３４５号 米国特許出願公開第２００３／００９６７４３号 米国特許出願公開第２００３／０１３０１８９号 国際特許出願公開第０２／０８３１８０号 Ｈａｎｋａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１：１２１１（１９７８） Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３３：９０２（１９８０） Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３４：１１１９（１９８１） Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：９９９（１９８２） Ｓｗｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：２８２１（１９８２） Ｈｕｒｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：８４３（１９８４） Ｂｏｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１４３８（１９９６） Ｂｏｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：７８７（１９９７） ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，５２７７（１９９９） ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３，３０９３（２０００） ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６６，８８１５，（２００１） Ｃａｒｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４，４７９，（１９８１） Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３４７（１９９８）
ｉｎ ｖｉｖｏ安定性をはじめとするサイトトキシン薬剤の安定性に関しては、未だ解決すべき重要な問題が残されている。加えて、多くの化合物がその毒性により使用不可能なものとなるため、薬剤毒性が減少した組成物（例えば分解可能なプロドラッグ）の開発が求められている。したがって、従来技術において見られる技術の進歩にもかかわらず、哺乳類又は人間の治療のための、改良された治療薬開発の必要性が今なお残されている。より詳しくは、特に、高い活性特異性を呈し、毒性が減少され、周知の類似した構造の化合物と比較して血液中での安定性が改善された、サイトトキシンの開発が求められている。本発明において、それらの必要性について開示する。
本発明は、薬剤と抗体がリンカー（例えばペプチジル、ヒドラジン又はジスルフィドリンカー）で結合された抗体−薬剤コンジュゲートの提供に関する。これらのコンジュゲートは有力な細胞毒素であって、活性型の形態で標的作用部位に選択的に輸送することが可能で、更にそこで切断を受けて活性の薬剤を放出することができる。本発明のリンカーアームは、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの酵素的若しくは還元的手段によって切断されて活性の薬剤部分がプロドラッグ誘導体から遊離することにより、細胞障害性の薬剤を放出させることができる。
一実施形態では、少なくとも１つの腫瘍のタイプに対する特異性を有する抗体、薬剤、及び薬剤を抗体と結合させるリンカーを有する抗体−薬剤コンジュゲートである。当該リンカーは、腫瘍の存在により切断されることができる。１μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で投与されると、抗体−薬剤コンジュゲートは腫瘍の増殖を遅延させるか又は抑制する。好ましくは、１μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量（薬剤のモル数を指す）で少なくとも５日間にわたって投与されると、抗体−薬剤コンジュゲートは腫瘍の成長を遅延させる。少なくとも若干の実施態様では、当該腫瘍はＳＣＩＤマウスのヒト型腫瘍である。例えばＳＣＩＤマウスはＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスであってもよい（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから市販）。
本発明はまた、治療薬及び標識の安定化に有用な基にも関する。安定化基は例えば、血液又は標的外の組織に存在しうる酵素による、治療薬又は標識のクリアランス及び代謝が防止されるものが選択される。例えば化合物の可溶性を増加させるか又は化合物の凝集特性を減少させるための安定化基は、薬剤又は標識の性能低下の防止にも有用であり、薬剤又は標識の他の生理学的な特性を発揮させることも可能となる。安定化基はまた、薬剤又は標識が処方された形態であってもそうでなくとも、貯蔵安定性を向上させることができる。
第一の実施形態では、本発明は、下記の一般式（１）から（３）のいずれかに記載の構造を有する細胞障害性薬剤−リガンド化合物を提供する。
式中、記号Ｄは、その基本骨格に対するペンダント基としての、化学的に反応性の官能基を有する薬剤部分であり、上記官能基は第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、カルボキシル、アルデヒド及びケトンからなる群から選択される。
記号Ｌ１は、自己犠牲スペーサーを表し、ｍは０、１、２、３、４、５又は６の整数である。
記号Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素を表す。
記号Ｌ４はリンカーを表し、ｐは０又は１である。Ｌ４は、増加した溶解性又は減少した凝集性をコンジュゲートに付与する部分である。Ｌ４部分の例としては、置換アルキル、非置換アルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアルキル又は、非置換ヘテロアルキル基（それらは直鎖状、分岐状又は環状であってもよい）、正電荷又は負電荷に荷電したアミノ酸高分子（例えばポリリジン又はポリアルギニン）又は他のポリマー（例えばポリエチレングリコール）が挙げられる。
以下の本願明細書における記号Ｆ、Ｈ及びＪは、リンカーを表す。１つの実施形態では、本発明は、以下に記載の構造を有するペプチドリンカーコンジュゲートに関する。
式中、Ｄはその基本骨格に対するペンダント基としての、化学的に反応性の官能基を有する薬剤部分であり、上記官能基は第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、カルボキシル、アルデヒド及びケトンからなる群から選択され、
Ｌ１は自己犠牲リンカーであり、
ｍは０、１、２、３、４、５又は６の整数であり、
Ｆは以下に示す構造を有するリンカーであり、
式中、ＡＡ１は、天然アミノ酸及び合成αアミノ酸からなる群から独立に選択される１つ以上の要素であり、
ｃは１から２０までのいずれかの整数であり、
Ｌ２は自己犠牲リンカーであり、
Ｌ３は、第一級又は第二級アミン又はカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、式中、Ｌ３が存在する場合、ｍが０であり、Ｌ３のアミン基がＤのペンダント基のカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、又はＬ３のカルボキシル基がＤのペンダント基のアミン官能基とアミド結合を形成し、
ｏは０又は１であり、
Ｌ４はリンカー要素であり、式中、Ｌ４は直接（ＡＡ１）ｃのＮ末端と結合するカルボキシルアシル基を含まず、
ｐは０又は１であり、並びに、
Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素である。
１つの実施形態では、上記ペプチドリンカーコンジュゲートは、以下に記載の構造を有する。
他の実施形態では、上記ペプチドリンカーコンジュゲートは、以下に記載の構造を有する。
望ましい実施形態では、上記Ｌ３は芳香族の基を含む。例えば、Ｌ３は安息香酸、アニリン又はインドール基を含むことができる。非限定的な例として、上記−Ｌ３−ＮＨ−は、以下に記載の群から選択される構造を有する。
式中、Ｚは酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３から選択される要素であり、
Ｒ２３は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及びアシル基から選択される要素である。
上記ペプチドリンカーの望ましい実施形態では、（ＡＡ１）ｃは、腫瘍組織において発現されるプロテアーゼによって切断可能なペプチド配列である。望ましいプロテアーゼは、リソソーム由来プロテアーゼである。望ましい実施形態では、ｃは２から６のいずれかの整数、又は、ｃは２、３若しくは４である。特定の実施形態では、薬剤部分の最も近くに位置する（ＡＡ１）ｃ中のアミノ酸は、以下の群から選択される：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌ。望ましい実施形態では、ペプチド配列は以下の群から選択される：Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）。特に望ましい実施形態では、（ＡＡ１）ｃは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ又はＶａｌ−Ｌｙｓである。
若干の望ましい実施形態では、上記ペプチドリンカー（Ｆ）は、以下に記載の構造を有する。
式中、Ｒ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキル基からなる群から選択され；
Ｋは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１及びＯＲ２１、からなる群から選択される要素であり、
式中、Ｒ２１及びＲ２２は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル又は非置換ヘテロシクロアルキル基、からなる群から独立に選択され；
ａは０、１、２、３又は４のいずれかの整数である。
他の好ましい実施形態では、以下の構造が挙げられる。
式中、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキル基からなる群から独立に選択される要素である。
別の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造を有するヒドラジンリンカーコンジュゲートに関する。
式中、Ｄは、その基本骨格に対するペンダント基としての、化学的に反応性の官能基を有する薬剤部分であり、上記官能基は第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、カルボキシル、アルデヒド及びケトンからなる群から選択され、
Ｌ１は自己犠牲リンカーであり、
ｍは０、１、２、３、４、５又は６の整数であり；
Ｘ４は保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素であり；
Ｌ４はリンカーの要素であり；
ｐは０又は１であり；
Ｈは以下に記載の構造、すなわち
を有するリンカーであり、
式中、ｎ１は１から１０のいずれかの整数であり；
ｎ２は０、１又は２であり；
各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキル基からなる群から独立に選択される要素であり；
Ｉは、結合又は以下の化合物、すなわち
であり、式中、ｎ３が０又は１であり、但しｎ３が０であるときｎ２は０でなく；
ｎ４は１、２又は３であり、
式中、Ｉが結合であるとき、ｎ１が３で、ｎ２が１で、Ｄが以下の化合物、すなわち、
ではなく、ここでＲがＭｅ又はＣＨ２−ＣＨ２−ＮＭｅ２である。
幾つかの望ましい実施形態では、フェニル環上の置換はパラ位での置換である、幾つかの望ましい実施形態では、ｎ１は２、３若しくは４、又はｎ１は３、又はｎ２は１である。
特定の実施形態では、Ｉは結合である。他の実施形態では、ｎ３は０であり、ｎ４は２である。
様々な実施形態では、本発明は、開裂により６員環を形成する自己犠牲リンカー、開裂により２つの５員環を形成する自己犠牲リンカー、単一の５員環を形成する自己犠牲リンカー、単一の７員環を形成する自己犠牲リンカー、又は５員環及び６員環を形成する自己犠牲リンカーである、ヒドラジンリンカー（Ｈ）を提供する。
望ましい実施形態では、Ｈはジェミナル構造のジメチル置換を含む。
望ましい実施形態では、Ｈは以下に記載の構造を有する。
望ましくは、ｎ１は２、３又は４であり、より望ましくはｎ１は３である。望ましくは、各々のＲ２４はＣＨ３又は水素原子から独立に選択される。特定の望ましい実施形態では、各々のＲ２４は水素原子である。
他の望ましい実施形態では、Ｈは以下に記載の構造を有する。
望ましくは、ｎ１は３である。望ましくは、Ｒ２４は各々ＣＨ３及び水素原子から独立に選択される。
また、他の望ましい実施形態では、Ｈは以下に記載の構造を有する。
好ましくは、各Ｈは独立にＲ２４又は置換若しくは非置換アルキル基である。
別の実施形態では、本発明は以下に記載の構造を有するヒドラジンリンカーコンジュゲートに関する。
式中、Ｄは、その基本骨格に対するペンダント基としての、化学的に反応性の官能基を有する薬剤部分であり、第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒド、及びケトンからなる群から選択され；
Ｌ１は自己犠牲リンカーであり；
ｍは０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数であり；
Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素であり；
Ｌ４はリンカーであり；
ｐは０又は１であり；
Ｈは以下に記載の構造、すなわち、
を含むリンカーであり；
式中、ｑは０、１、２、３、４、５又は６であり；
式中、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキル基からなる群から独立に選択される要素である。
更に他の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造を有するジスルフィドリンカーコンジュゲートに関する。
式中、Ｄは、その基本骨格に対するペンダント基としての、化学的に反応性の官能基を有する薬剤部分であり、その官能基が第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒド、及びケトンからなる群から選択され；
Ｌ１は自己犠牲リンカーであり；
ｍは０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数であり；
Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素であり；
Ｌ４はリンカーであり；
ｐは０又は１であり；
Ｊは、以下に記載の構造、すなわち、
式中、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキル基からなる群から独立に選択される要素であり；
各々のＫは、以下からなる群、すなわち、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１及びＯＲ２１、から独立に選択される要素であり、
式中、Ｒ２１及びＲ２２は、以下からなる群、すなわち、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル及び非置換ヘテロシクロアルキル基、から独立に選択され；
ａは０、１、２、３又は４のいずれかの整数であり；
ｄは０、１、２、３、４、５又は６のいずれかの整数である。
様々な実施形態では、Ｊは、以下に記載の構造のうちの１つを有する。
（式中、ｄは、１又は２である。）
前述のリンカーコンジュゲートの全てにおいて、Ｄは、望ましくは細胞障害性薬剤である。望ましい実施形態では、Ｄは、第一級又は第二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル及びカルボキシル基からなる群から選択される化学的に反応性の官能基を有する。望ましい薬剤（Ｄ）の非限定的な例としては、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアミシン、マイタンシン、マイタンシンアナログ、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシンが挙げられる。
望ましい実施形態では、Ｄは以下に記載の構造を有するデュオカルマイシンアナログ又は誘導体である。
式中、環状部Ａは、飽和又は不飽和アリール、飽和又は不飽和ヘテロアリール及び飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル基から選択される要素であり；
Ｅ及びＧは、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立に選択される要素であるか、又は、Ｅ及びＧが結合して飽和又は不飽和アリール、飽和又は不飽和ヘテロアリール及び飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル基から選択される環状部を形成し；
Ｘは酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３から選択される要素であり；
Ｒ２３は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及びアシル基から選択される要素であり；
Ｒ３は、（＝Ｏ）ＳＲ１１、ＮＨＲ１１、及びＯＲ１１からなる群から選択される要素であり、
式中、Ｒ１１は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル基、二リン酸塩、三リン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２及びＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択される要素であり、
Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及び飽和又は不飽和アリールから独立に選択される要素であり、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、それらが結合する窒素原子又は炭素原子と共に任意に結合して４員環から６員環を有する飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル環を形成し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含み；
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’が以下の群、すなわち、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から独立に選択される要素であり、
ｎは１から２０のいずれかの整数であり；
Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル、飽和又は不飽和アリール、飽和又は不飽和ヘテロアリール、飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル及び飽和又は不飽和ペプチジル基から独立に選択され、式中、Ｒ１５及びＲ１６は、それらが結合する窒素原子と共に任意に結合して４員環から６員環を有する飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル環を形成し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含み；
Ｒ６は、存在するか又は存在しない単結合であり、存在するときはＲ６及びＲ７が接続してシクロプロピル環を形成し；
Ｒ７は、ＣＨ２−Ｘ１又はＲ６と上記シクロプロピル環において連結する−ＣＨ２−であり、ここでＸ１は脱離基であり、
ここでＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６の少なくとも１つは、上記薬剤を、もし存在するときはＬ１と、又はＦ、Ｈ若しくはＪと結合させる。
好ましい実施形態では、Ｄは、構造を有する：
式中、Ｚは酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３から選択される要素であり、式中、Ｒ２３は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及びアシル基から選択される要素であり；
Ｒ１は、水素原子、飽和又は不飽和低級アルキル基、Ｃ（Ｏ）Ｒ８又はＣＯ２Ｒ８であり、式中、Ｒ８は、置換アルキル、非置換アルキル基、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０及びＯＲ９からなる群から選択される要素であり、
式中、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル及び飽和又は不飽和ヘテロアルキル基から独立に選択される要素であり；
Ｒ２は、水素原子、置換アルキル又は置換されない低級アルキル基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６のうち少なくとも１つは、上記薬剤を、存在するときはＬ１に、又はＦ、Ｈ若しくはＪに結合させる。
上記の好ましい実施形態では、Ｒ２は非置換低級アルキルである。他の好ましい例として、Ｄは以下の構造を有する。
式中、Ｚは酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３から選択される要素であり、
式中、Ｒ２３は水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及びアシル基から選択される要素であり；
Ｒ１は、水素原子、飽和又は不飽和低級アルキル基、Ｃ（Ｏ）Ｒ８又はＣＯ２Ｒ８であり、式中、Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９から選択される要素であり、
式中、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル及び飽和又は不飽和ヘテロアルキル基から独立に選択される要素であり；
Ｒ１’は、水素原子、飽和又は不飽和低級アルキル基又はＣ（Ｏ）Ｒ８であり、式中、Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９から選択される要素であり、
式中、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル及び飽和又は不飽和ヘテロアルキル基から独立に選択される要素であり；
Ｒ２は、水素原子、飽和若しくは不飽和低級アルキル、非置換ヘテロアルキル、シアノ基又はアルコキシル基であり；
Ｒ２’は、水素原子、飽和若しくは不飽和低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル基であり、
式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６のうち少なくとも１つは、上記薬剤を、存在するときはＬ１に、又はＦ、Ｈ若しくはＪに結合させる。
前述のリンカーコンジュゲートの構造式の全てにおいて、Ｌ４は望ましくは環状部分を含まない。Ｌ４は、Ｌ４を欠く化合物と比較し、化合物の溶解性を増加させ、及び／又は化合物の凝集を減少させるため、望ましい。望ましい実施形態では、Ｌ４はポリエチレングリコール部分を含む。ポリエチレングリコール部分には、例えば３から１２の繰り返し単位若しくは２から６の繰り返し単位、より望ましくは４つの繰り返し単位を含めることができる。
更に他の実施形態では、本発明は、以下に記載の一般式で表される構造を有する、細胞障害性薬剤−リガンド化合物を提供する。
式中、Ｌ１は自己犠牲リンカーであり、ｍは整数０、１、２、３、４、５又は６である。記号Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されない反応性官能基、検出可能なラベル及びターゲティング試薬からなる群から選択される要素を表す。
記号Ｌ４は、リンカー要素を表し、ｐは０又は１である。Ｌ４は、コンジュゲートの溶解性を増加させ、又は凝集を減少させる部分である。Ｌ４部分の例としては、置換アルキル、非置換アルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル基（直鎖状、分岐状又は環状でもよい）、陽電荷又は負電荷に荷電したアミノ酸高分子（例えばポリリジン又はポリアルギニン）又は他のポリマー（例えばポリエチレングリコール）が挙げられる。
本願明細書において記号Ｑは、以下、ペプチドリンカー、ヒドラジンリンカー又はジスルフィドリンカーのいずれかを含むが、これに限定されない、あらゆる切断可能なリンカーを表す。切断可能なリンカーには、化学的又は生物学的プロセスにより選択的に切断されるものが含まれ、切断により薬剤（Ｄ１）をＸ４から遊離させる。
記号Ｄ１は、以下に記載の一般式で表される構造を有する薬剤を表す。
式中、Ｘ及びＺは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３から独立に選択される要素であり；
Ｒ２３は水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及びアシル基から選択される要素であり；
Ｒ１は水素原子、飽和又は不飽和低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８又はＣＯ２Ｒ８であり、
Ｒ１’は水素原子、飽和又は不飽和低級アルキル又はＣ（Ｏ）Ｒ８であり、
式中、Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９から選択される要素であり、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル及び飽和又は不飽和ヘテロアルキル基から独立に選択される要素であり；
Ｒ２は水素原子、飽和若しくは不飽和低級アルキル、非置換ヘテロアルキル、シアノ基又はアルコキシル基であり；
Ｒ２’は水素原子又は飽和又は不飽和低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル基であり、
Ｒ３はＳＲ１１、ＮＨＲ１１及びＯＲ１１からなる群から選択される要素であり、式中、Ｒ１１は水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル基、二リン酸塩、三リン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２及びＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択される要素であり、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル及び飽和又は不飽和アリールから独立に選択される要素であり、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、それらが結合する窒素原子又は炭素原子と共に任意に結合して４員環から６員環を有する飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル環を形成し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含み；
Ｒ６は、存在するか又は存在しない単結合であり、存在するときはＲ６及びＲ７が結合してシクロプロピル環を形成し；
Ｒ７は、ＣＨ２−Ｘ１又は上記シクロプロピル環でＲ６と結び付いた−ＣＨ２−であり、式中、Ｘ１は脱離基であり、
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換されたアリール、置換されないアリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６及びＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２４Ｒ２５からなる群から独立に選択される要素であり、ここでｎは１から２０のいずれかの整数であり；
式中、Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、飽和又は不飽和アルキル、飽和又は不飽和ヘテロアルキル、飽和又は不飽和アリール、飽和又は不飽和ヘテロアリール、飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル及び飽和又は不飽和ペプチジル基から独立に選択され、式中、Ｒ１５及びＲ１６は、それらが結合する窒素原子と任意に結合して４員環から６員環を有する飽和又は不飽和ヘテロシクロアルキル環状を形成し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含み；
Ｒ２４及びＲ２５は、非置換アルキルから独立に選択され、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’のうち少なくとも１つはＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２４Ｒ２５である。
更に他の態様では、本発明は医薬組成物の提供に関する。かかる組成物は典型的には本発明のコンジュゲート化合物と薬学的に許容できる担体を含んでなる。
更に別の態様では、本発明は本発明のコンジュゲート化合物を使用する方法の提供に関する。例えば本発明は、細胞の殺傷に有効な量の本発明のコンジュゲート化合物を当該細胞に投与することを特徴とする、細胞の殺傷方法の提供に関する。好ましい実施形態では、当該細胞は腫瘍細胞である。他の実施形態では、本発明は、腫瘍の成長を遅延若しくは停止させるのに有効な量の本発明のコンジュゲート化合物を、患者に投与することを特徴とする、哺乳類の患者の腫瘍の成長の遅延若しくは停止方法の提供に関する。
本発明の他の態様、効果及び目的は、下記の詳細な説明を参照することにより明らかとなる。
本発明の非限定的な及び非網羅的な実施形態を、添付の図面を参照しながら記載する。本発明のより詳細な理解のため、以下の詳細な説明において、添付の図面を参照しながら説明する
略語
本発明において、「Ａｌａ」はアラニンを指す。「Ｂｏｃ」はｔ−ブチルオキシカルボニルを指す。「ＣＰＩ」はシクロプロパピロロインドールを指す。「Ｃｂｚ」はカルボベンゾキシを指す。「ＤＣＭ」は本発明ではジクロロメタンを指す。「ＤＤＱ」は２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを指す。「ＤＩＰＥＡ」はジイソプロピルエタラミンを指す。「ＤＭＤＡ」はＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを指す。「ＲＢＦ」は丸底フラスコを指す。「ＤＭＦ」はＮ，Ｂ−ジメチルホルムアミドを指す。「ＨＡＴＵ」はＮ−［［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イル］メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシドを指す。記号「Ｅ」は酵素による切断可能な基を指す。「ＥＤＣＩ」は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを指す。本発明において、「ＦＭＯＣ」は９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを指す。「ＦＭＯＣ」は９−フルオレニルメトキシカルボニルを指す。「ＨＯＡｔ」は７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを指す。「Ｌｅｕ」はロイシンを指す。「ＰＡＢＡ」はパラ−アミノ安息香酸を指す。「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールを指す。「ＰＭＢ」はパラ−メトキシベンジルを指す。「ＴＢＡＦ」はフッ化テトラブチルアンモニウムを指す。「ＴＢＳＯ」の略語はｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを指す。本発明において、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指す。「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指す。「Ｑ」の符号は治療薬、診断薬又は検出可能な標識を指す。
定義
別途定義する場合を除き、本発明において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における通常の技術を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味で用いられる。本発明において使用する分類、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学における解析及び下記のハイブリダイゼーションの手順は、当該技術分野において良く知られ、一般に用いられているものを意味する。核酸及びペプチド合成には、標準的な技術が使用される。酵素反応及び精製工程は、業者によるプロトコルにしたがって実施される。技術及び手順は、当該技術分野の従来法、及び様々な一般的文献（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。なお、この文献は引用により本発明において援用する。）にしたがって実施され、本願明細書全体において参照される。本発明において使用する命名、及び分析における解析手順、並びに下記の有機合成は、当該技術分野において公知で、一般に用いられているものを意味する。化学合成及び化学分析においては、標準的技術又はその変法が用いられる。
「治療薬」の用語は、治療上有効な量が存在する場合に、哺乳動物に所望の治療効果をもたらす化合物を意味する。腫瘍を処置するためには、治療薬が標的細胞に取り込まれるのが望ましい。
「サイトトキシン」の用語は、癌細胞に対して毒性となる効果を有する治療薬を意味する。細胞に対する毒性とは、薬剤が細胞の成長を停止又は細胞を死滅させることを意味する。サイトトキシンの例として、コンブレタスタチン類、デュオカルマイシン類、ＣＣ−１０６５抗腫瘍性抗生物質、アントラサイクリン類及び関連化合物が挙げられるが、これらは単なる例示であってこれらに限定されない。他のサイトトキシンとして、マイコトキシン類、リシン及びそのアナログ、カリケアマイシン類、ドキシルビシン並びにメイタンシノイド類が挙げられる。
「プロドラッグ」の用語及び「薬剤コンジュゲート」の用語は、本発明において互換的に使用する。双方とも、コンジュゲートの形態をとる間は未だ細胞に対して比較的無害な化合物であるが、一定条件（例えば、標的細胞内又はその近傍に位置する酵素の存在）において選択的に分解され、薬理学的に活性な形態となるものを意味する。
「マーカー（標識）」の用語は、例えば腫瘍の診断や他の医学的症状の進行、又は腫瘍細胞によって分泌される因子のアッセイに有用な化合物を意味する。マーカーは、「診断薬」の一部分と解される。
酵素的切断に関して、「選択的」の用語は、リンカー部の切断の速度が、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドの切断の速度よりも高いことを意味する。
「ターゲッティング基」及び「ターゲッティング試薬」の用語は、（１）そこに付着する物質（例えば、治療薬又はマーカー）を、標的細胞、例えば特定の型の腫瘍細胞に仕向けることができる部分、又は（２）標的組織、例えば腫瘍、で優先的に活性化される部分のことを意味する。ターゲッティング基又はターゲッティング試薬は小分子が望ましく、非ペプチド及びペプチドの双方を含むものとする。ターゲッティング基は、マクロ分子であるのが望ましく、糖類、レクチン類、受容体、受容体に対するリガンド、ＢＳＡなどの蛋白質、抗体等が挙げられる。本願発明の望ましい実施形態において、ターゲッティング基は抗体又は抗体断片であり、更に望ましくはモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片である。
「自己犠牲スペーサー」の用語は、二つの化学的部分と共有結合し、通常安定な三成分分子を形成することのできる二官能性の化学的部分をいう。自己犠牲スペーサーは、第一部分への結合が切断されれば第二部分から自然に分離することができる。
「検出可能な標識」の用語は、検出可能な物理的又は化学的性質を有する部分を意味する。
「切断可能な基」の用語は、ｉｎ ｖｉｖｏで不安定な部分を意味する。望ましくは、「切断可能な基」は、コンジュゲートの残部からマーカー又は薬剤を切断することによって、マーカー又は治療薬の活性化を可能とするものである。操作上の定義によれば、リンカーは、望ましくは生物学的環境によってｉｎ ｖｉｖｏで切断される。切断は例えば酵素的、還元的、ｐＨによるもの等、いかなるプロセスによって行われてもよく、限定されない。望ましくは、切断可能な基は、治療作用又はマーカー活性の部位など、標的細胞（例えば、癌腫細胞）若しくは組織の中又はその近傍の部位、など所望の作用部位で活性化が起こるように選択される。かかる切断は酵素的なものであり、酵素的に切断可能な基の例としては、天然アミノ酸のペプチド配列、又は天然アミノ酸で終結しリンカーにそれらのカルボキシル末端で付着するペプチド配列が挙げられる。切断速度の増加の程度は、本発明にとって決定的なものではないが、切断可能なリンカーの望ましい例は、切断可能な基の少なくとも約１０％、最も望ましくは少なくとも約３５％が投与後２４時間以内に血中で切断されるものである。
「リガンド」の用語は、標的細胞又は組織上の受容体、基質、抗原決定基、又はその他の結合部位と特異的に結合するか、又は反応性をもって会合若しくは複合する分子を意味する。リガンドの例として、抗体及びその断片（例えば、モノクローナル抗体又はその断片）、酵素（例えば、線維素溶解酵素）、生物学的反応変性剤（例えば、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン又はコロニー刺激因子）、ペプチドホルモン並びにその抗原結合性断片が挙げられる。
用語「ヒドラジンリンカー」及び「自己環化ヒドラジンリンカー」は同義的に本願明細書で使用される。これらの用語は、条件の変化（例えばｐＨの変動）に応じて環化反応し、１つ以上の環を形成するリンカー部分のことを指す。結合の際、ヒドラジン部分はヒドラゾンに変化する。この結合は例えば、Ｌ４部分へのケトン基による反応によって生じる。したがって、結合によりヒドラゾンへ転換されることから、用語「ヒドラゾンリンカー」は本発明のリンカーを示すためにも使用できる。
「５員のヒドラジンリンカー」又は「５員のヒドラジンリンカー」という用語は、条件の変化（例えばｐＨの変動）に応じて環化反応し、１つ以上の５員環を形成するヒドラジン含有分子部分を意味する。あるいは、この５員のリンカーを「５員のヒドラゾンリンカー」又は「５員ヒドラゾンリンカー」と称することもある。
「６員のヒドラジンリンカー」又は「６員のヒドラジンリンカー」という用語は、条件の変化（例えばｐＨの変動）に応じて環化反応し、１つ以上の５員環を形成するヒドラジン含有分子部分を意味する。あるいは、この６員のリンカーを「６員のヒドラゾンリンカー」又は「６員ヒドラゾンリンカー」と称することもある。
ペプチド、ヒドラジン又はジスルフィドリンカーの環化を指すとき、用語「環化反応」とは、リンカーが環化し、薬−リガンドコンジュゲートの分離が開始されることを指す。この速度ｅｘ ｓｉｔｕで測定でき、生成物の少なくとも９０％、９５％又は１００％が形成されるときに終了する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」の用語は、本発明において、アミノ酸のポリマーを言うのに互換的に使用される。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似物であるアミノ酸ポリマーや、天然のアミノ酸ポリマー及び人工のアミノ酸ポリマーにも適用される。またこれらの用語は、「抗体」の用語も包含する。
「アミノ酸」の用語は、天然及び合成アミノ酸や、天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物をいう。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるものや、事後的に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンをいう。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアミン酸アナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。特に使用しても良い１つのアミノ酸はシトルリンであって、これはアルギニンの前駆体であり、肝臓における尿素の形成に関与する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学的化合物をいう。「非天然アミノ酸」の用語は、上記の２０の天然アミノ酸の「Ｄ」型立体構造を有するものを表す。非天然アミノ酸の用語には、天然アミノ酸の相同体、及び天然アミノ酸の合成的に修飾された型が含まれることが更に理解される。合成的に修飾された型には、上限２つの炭素原子にまで短縮又は延長されたアルキレン鎖を有するアミノ酸、任意に置換されたアリール基を含むアミノ酸、及びハロゲン化基、望ましくはハロゲン化アルキル及びアリール基を含むアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。本発明のリンカー又はコンジュゲートに付着すると、アミノ酸は、アミノ酸のカルボン酸基がケト（Ｃ（Ｏ））基に置換されている「アミノ酸側鎖」の形態となる。例えば、アラニン側鎖は−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ３等である。
アミノ酸及びペプチドは、保護基によって保護されてもよい。保護基は、アミノ酸又はペプチドのＮ−末端を望ましくない反応から保護する原子又は化学的部分であり、薬剤−リガンドコンジュゲートの合成の際に使用することができる。これは、合成中はＮ−末端に付着した状態が望ましく、薬剤コンジュゲートの合成の完了後に、その除去を選択的に行う化学的条件又はその他の条件によって除去するのがよい。Ｎ−末端保護に望ましい保護基は、ペプチド化学の技術において公知である。保護基の例として、水素、Ｄ−アミノ酸、及びカルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）クロライドが挙げられるが、これらに限定されない。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそのポリマーで一本鎖又は二本鎖のいずれかの型のものをいう。この用語には、既知のヌクレオチドアナログ又は修飾された骨格塩基若しくは連鎖を含んでいる核酸で、合成のもの、天然及び非天然のもの、対照の核酸と同様の結合性を有するもの、並びに対照のヌクレオチドと同様に代謝されるものが包含される。このようなアナログの例として、ホスホロチオエート類、ホスホルアミデート類、メチルホスホネート類、キラルなメチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド類、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、限定されない。
別途に示す場合を除いて、特定の核酸配列には、開示された配列のほか、保存的に変更されたその変異体（例えば、縮重コドン置換体）、及び相補的配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（又はすべての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより得られる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。核酸の用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドで、互換的に使用される。
以下の符号
は、表示された部分が分子の残部や固体支持体等に付着する点を示し、結合部として使用され、あるいは結合に対して垂直に表示されることもある。
「アルキル」の用語は、それ自体又は別の置換基の一部として別途記載されない限り、直鎖状若しくは分枝状鎖、若しくは環状の炭化水素基又はそれらの組み合わせであって、完全に飽和されたもの、一箇所若しくは複数箇所で飽和されているものでもよく、また、示された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は１〜１０の炭素を意味する）、二価及び多価の基を意味する。飽和炭化水素基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、等の相同体及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例として、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、並びに高相同体及び同位体が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル」の用語は、別途に述べない限り、「ヘテロアルキル」など、以下に更に詳しく定義するアルキルの誘導体も含むものを意味する。アルキル基で炭化水素基に限られるものは、「ホモアルキル」と命名されている。
「アルキレン」の用語は、それ自体、又は別の置換基の一部として、アルカンに由来する二価の基を意味し、その例としては−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられるが、これに限定されることはなく、更に「ヘテロアルキレン」として以下に記載する基が含まれる。望ましくは、アルキル（又はアルキレン）基は、１〜２４の炭素原子を有するものであり、１０以下の炭素原子を有するそれらの基が、本発明では望ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、短鎖のアルキル又はアルキレン基であり、概して８以下の炭素原子を有している。
「ヘテロアルキル」の用語は、それ自体、又は別の用語との組み合わせにおいて、別途記載しない限り、安定な直鎖状若しくは分枝状鎖、若しくは環状炭化水素基、又はそれらの組み合わせを意味し、記載した数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなり、ここで窒素、炭素及びイオウ原子は任意に酸化されてもよく、また窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。ヘテロ原子（単数又は複数）Ｏ、Ｎ及びＳ、並びにＳｉは、ヘテロアルキル基の内部位置のどこにでも、又はアルキル基が分子の残部に付着する位置に配置されうる。その例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２つまでのヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」の用語は、それ自体、又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキルより由来する二価の基を意味しており、その例としては−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は鎖の末端の片方又は両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。「ヘテロアルキル」及び「ヘテロアルキレン」の用語には、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｃａｔａｌｏｇ、２００１を参照されたい）が包含される。更にまた、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基については、かかる連結基の一般式で記載されている方向によって連結基の配向が規定されるものではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−との両方を表す。
「低級」の用語は、「アルキル」又は「ヘテロアルキル」の用語と組み合わせて、１〜６の炭素原子を有する部分をいう。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」、及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）の用語は、それらの慣例的な意味で使用され、酸素原子、アミノ基、ＳＯ２基又は硫黄原子を介してそれぞれ分子の残部に付着されたそれらアルキル基をいう。「アリールスルホニル」の用語は、ＳＯ２基を介して分子の残部に付着されるアリール基をいい、そして「スルフヒドリル」の用語はＳＨ基のことである。
一般的に、「アシル置換基」も以上に記載の群から選択される。本発明において、「アシル置換基」の用語は、本発明の化合物の多環式核に直接又は間接的に付着したカルボニル炭素に付着して、その原子価を満たす基をいう。
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」の用語は、それら自体、又は他の用語との組み合わせにおいて、別途に述べない限り、置換又は非置換「アルキル」、及び置換又は非置換「ヘテロアルキル」の環状体をそれぞれ表す。また、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、分子の残部にヘテロ環が付着する位置を占めることができる。シクロアルキルの例として、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例として、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル基等が挙げられるが、これらに限定されない。環状構造のヘテロ原子及び炭素原子は、任意に酸化される。
「ハロ」又は「ハロゲン」の用語は、それら自体、又は別の置換基の一部として、別途に述べない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。更に、「ハロアルキル」などの用語にはモノハロアルキル及びポリハロアルキルが含まれるものとする。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」の用語には、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等が含まれるが、これらに限定されない。
「アリール」の用語は、別途断りのない限り、置換又は非置換の、多価不飽和、芳香族及び炭化水素の置換基であり、単環又は多環（望ましくは１環から３環）状に融合若しくは共有結合するものを意味する。「ヘテロアリール」の用語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４のヘテロ原子を含むアリール基（又は環）をいい、ここで窒素、炭素及びイオウ原子は任意に酸化され、窒素原子（単数又は複数）は任意に四級化されうる。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着できる。アリール及びヘテロアリール基の例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルが挙げられるが、それに限定されない。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下の許容される置換基の群から選択される。「アリール」及び「ヘテロアリール」もまた、１以上の非芳香族環系がアリール又はヘテロアリール系に融合、又は結合した環系を包含する。
略して、「アリール」の用語には、他の用語と組み合わせて使用する場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記定義のアリール及びヘテロアリール環の双方が含まれる。よって「アリールアルキル」の用語は、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば、酸素原子で置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等が挙げられる）を含め、アルキル基にアリール基が付着した基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等が挙げられる）を指す。
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）の各々には、示した基の置換及び非置換型の双方が含まれる。基の各々の型に望ましい置換基は、以下に示すとおりである。
アルキル、及びヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されることが多い基を含む）に対する置換基は概して、「アルキル置換基」、及び「ヘテロアルキル置換基」とそれぞれ称され、それらは０から（２ｍ’＋１）（ｍ’は、かかる基の炭素原子の総数である）までの範囲の数で、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２より選択される様々の基の１以上でありうるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立して、水素、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば、１〜３のハロゲンで置換されたアリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基から選択されるのが望ましい。本発明の化合物が１以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々は、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基の１以上が存在する場合のこれらの各々の基のように、独立して選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に付着する場合、それらは窒素原子と共に結合して５員環、６員環又は７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとするが、これらに限定されない。以上の置換基に関する記載から、当業者であれば、「アルキル」の用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）並びにアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）などの、水素以外の基と結合した炭素原子を含む基を含むと理解するであろう。
アルキル基に関して記載した置換基と同様に、アリール置換基及びヘテロアリール置換基は、概してそれぞれ「アリール置換基」及び「ヘテロアリール置換基」と称され、多種多様なものであり、０から芳香族環系の開放原子価の総数までの範囲の数で、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルより選択され；Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール及びヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、並びに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルより独立して選択されるのが望ましい。本発明の化合物が１以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々は、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基の１以上が存在する場合のこれらの各々の基のように、独立に選択される。
アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上のアリール置換基の２つは、一般式：−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、Ｔ及びＵは独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−又は単結合であり、ｑは０から３の整数）の置換基で任意に置換されてよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、一般式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、Ａ及びＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−又は単結合であり、ｒは１から４の整数）の置換基で任意に置換されてよい。このようにして形成された新しい環の単結合の１つは、二重結合で任意に置換されてよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、一般式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓ及びｄは、独立して０から３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、又は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で任意に置換されてよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、水素、又は置換若しくは非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルより独立して選択されるのが望ましい。
本発明において、「ジホスフェート（二リン酸塩）」の用語には、２つのリン酸基を含むリン酸のエステルが含まれるが、これらに限定されない。「トリホスフェート（三リン酸塩）」の用語には、３つのリン酸基を含むリン酸のエステルが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ジホスフェート又はトリホスフェートを有する特定の薬剤として、以下のものが挙げられる。
本発明において、「ヘテロ原子」の用語には、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）及びケイ素（Ｓｉ）が含まれる。
「Ｒ」の符号は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクリル基より選択される置換基を表す一般略記である。
「医薬的に許容される担体」の用語は、本発明において、化学物質の運搬又は輸送に関与する、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入材料などの、医薬的に許容される材料、組成物又は溶剤を意味する。医薬的に許容される担体には医薬的に許容される塩が含まれ、ここで「医薬的に許容される塩」の用語には、本願明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じ、比較的無毒の酸又は塩基を用いて調製される活性化合物の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、このような化合物の中性型を充分量の所望の塩基と、そのままか又は望ましい不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。医薬的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、若しくはマグネシウム塩、又は類似の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は、このような化合物の中性型を充分量の所望の酸と、そのままか又は望ましい不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。医薬的に許容される酸付加塩の例として、塩化水素酸、塩化臭素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又はリン酸等のような無機酸に由来するものや、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的無毒の有機酸に由来する塩が挙げられる。更に挙げられるのは、アルギン酸塩などの、アミノ酸の塩等、及びグルクロン酸又はガラクツロン酸のような有機酸の塩等である（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７、６６、１−１９を参照）。本発明の特異的な所定の化合物は、その化合物を塩基又は酸付加塩のいずれかに変換させる、塩基性及び酸性官能基の双方を含む。
天然型化合物は、望ましくは、上記の塩を塩基又は酸に接触させ、従来法にて中性構造の化合物を単離することによって得られる。化合物の原型は、極性溶媒中での溶解性など特定の物理的特性ではそれらの様々な塩と異なるが、その他の点では、それらの塩は本発明の目的とする化合物の中性構造と同等である。
塩の型に加えて、本発明はプロドラッグ型の化合物を提供する。本願明細書に記載の化合物のプロドラッグとは、生理的条件下で化学的変化を容易に起こして本発明の化合物を提供する化合物である。加えて、プロドラッグは、ｅｘ ｖｉｖｏの環境において化学的又は生化学的方法によって本発明の化合物に変換されうる。例えば、プロドラッグは、望ましい酵素又は化学試薬と共に経皮リザーバーパッチに添加した場合、本発明の化合物に徐々に変換されうる。
本発明の特定の化合物は、非溶媒和物や、水和物を含めた溶媒和物の形態にて存在しうる。一般的に、溶媒和物は非溶媒和物と同等であり、本発明の範囲に包含されるものである。
本発明の特定の化合物は、多結晶又は非晶形にて存在することもある。一般的に、すべての物理的な型が本発明により企図される用途において同等であり、本発明の範囲に含まれる。本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学的中心）又は二重結合を有しており、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、及び個々の異性体が、本発明の範囲に包含される。
本発明の化合物はまた、かかる化合物を構成する１つ以上の原子において、非天然の割合で原子同位体も含みうる。化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）又は炭素１４（１４Ｃ）などの放射活性同位体で放射標識されていてもよい。本発明の化合物の同位体のすべてが、放射性の有無に関わらず、本発明の範囲に包含される。
「結合部分」又は「ターゲッティング基の結合部分」という用語は、リンカーへのターゲッティング基の取付けを可能にする部分のことを意味する。典型的は結合基としては、限定されないが、アルキル、アミノアルキル、アミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキル−マレイミド、アルキル−Ｎ−ヒドロキシルスクシニミド、ポリ（エチレングリコール）−マレイミド、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（いずれも更に置換されてもよい）。リンカーに結合部分を付与し、実質的にターゲッティング基に付与してもよい。
本発明において、「脱離基」の用語は、反応において基質から切断される、基質の部分をいう。
「抗体」の用語は、本発明においては全抗体、及び抗原結合断片のいずれか（すなわち、「抗原結合部分」）、又はその一本鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互連結する、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む糖蛋白質、又はその抗原結合部分をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域を備えるものである。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を備えており、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）又はイプシロン（ε）アイソタイプであってよい。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を備えるものである。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬを備えており、カッパ（κ）又はラムダ（λ）アイソタイプであってよい。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域であってフレームワーク領域と命名された領域が介在する、高頻度可変性の領域であって相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された領域に、更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つの及びＦＲとを備え、以下の順にアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、宿主組織、又は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む因子への、免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
抗体の「抗体断片」又は「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）の用語は、本発明において、抗原への特異的な結合能を保持する、抗体の１以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって行えることが示されている。抗体の「抗体断片」又は「抗原結合部分」の用語に包含される結合性断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成している蛋白質一本鎖としてそれらが作製されることを可能とする合成リンカー（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）によって、組換え法を使用してそれらを繋げることができる。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られた従来の技術を用いて得られ、それら断片は通常の抗体と同様に、その用途に基づきスクリーニングされる。
「モノクローナル抗体」の用語は、本発明において、単一の分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を呈する。
モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製には、当該技術分野で公知のいかなる技術も使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）の７７−９６頁を参照されたい）。
ポリクローナル抗体の製造方法は、当業者に公知である。近交系のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）又はウサギを、フロイントのアジュバントなどの完全アジュバントと、標準的な免疫プロトコルを用いて蛋白質で免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、検査用血液を採取してβサブユニットに対する反応性の力価を定量することによってモニターする。免疫原に対して適切な高さの力価の抗体が得られたとき、動物から採血し抗血清を調製する。所望の場合、蛋白質に対して反応性を有する抗体を濃縮し、更に分画を行うことができる。
モノクローナル抗体は、当業者が熟知している様々な技術により得られる。簡潔には、所望の抗原で免疫した動物の脾臓細胞を、一般には骨髄腫細胞との融合によって株化する（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照されたい）。免疫化の代替方法としては、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、若しくはレトロウイルスを用いた形質転換、又は当該技術分野でよく知られた他の方法が挙げられる。
望ましい実施形態において、抗体はキメラ抗体又はヒト化抗体である。本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学の技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように調製される。例えば、キメラ抗体を作るには、当該技術分野で知られた方法を使用して、マウスの可変領域をヒト定常領域と結合することができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を作るには、当該技術分野で知られた方法を使用して、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、並びにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
別の望ましい実施形態において、抗体はヒト抗体である。かかるヒト抗体は、内在性のマウス免疫グロブリン遺伝子が不活性化され、外来性のヒト免疫グロブリン遺伝子が導入された、遺伝子導入又は染色体導入マウスを免疫することによって得られる。このようなマウスは、当該技術分野で公知である（例えば、すべてＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号及び第５，７７０，４２９号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号及び第６，１６２，９６３号、並びにＩｓｈｉｄａらの国際公開第０２／４３４７８号を参照されたい）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するための、かかるファージディスプレイ法も当該技術分野で公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９、第５，４０３，４８４号及び第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号及び第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号及び第６，１７２，１９７号、並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号及び第６，５９３，０８１号を参照されたい）。
「固体支持体」は、本発明において、選択した溶媒系において実質的に不溶性の材料、又は、選択した溶媒系（その中では当該支持体は可溶性である）から容易に分離（例えば、沈殿による）することができる材料をいう。本発明を実施するのに有用な固体支持体は、選択された種がその固体支持体に結合させられるように活性化されているか、又は活性化することのできる基を含むことができる。固体支持体はまた、例えば、チップ、ウエハー又はウェルなどといった基材で、その上に個々の、又は１以上の本発明の化合物が結合されるものでもよい。
本発明において「反応性官能基」とは、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ、アゾキシ及びニトロソ基を含む基をいうが、これらに限定されない。反応性官能基としては、バイオコンジュゲート類を調製するために使用されるもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、マレイミド類等も挙げられる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６を参照）。これらの官能基の各々を調製する方法は、当該技術分野においてよく知られており、特定の目的のためのそれらの応用又は変更は、当業者がなしうる範囲にある（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ、編、ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９８９を参照）。反応性官能基は、保護されてもされなくてもよい。
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、エナンチオマー、シス−トランス異性体、ジアステレオマー）として、又は異性体の混合物として調製される。望ましい実施形態において、化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体として純粋な化合物を調製する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、エナンチオマーとして濃縮された混合物、及び純粋なエナンチオマー化合物は、エナンチオマーとして純粋なエナンチオマーの合成中間体を、キラル中心での立体化学を不変のままにするか又はその完全な反転を引き起こす反応と組み合わせて使用することにより、調製することができる。あるいは、最終産物又はその合成経路での中間体は、単一の立体異性体に分割することができる。特定の立体中心を反転するか又は不変のままにするための技術、及び立体異性体の混合物を分離するための技術は、当該技術分野においてよく知られており、特定の状況に対して方法を選択及び充当することは、当業者が充分になしうる範囲にある。概略は、Ｆｕｒｎｉｓｓら、（編）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ 第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｔｄ．Ｅｓｓｅｘ、１９９１、８０９−８１６頁；及びＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照されたい
リンカー
本発明は、薬剤が化学リンカーを介してリガンドに連結されている、薬剤−リガンドコンジュゲートを提供する。このリンカーは、ペプチジル、ヒドラジン、又はジスルフィドリンカーのいずれかであり、本願明細書においてそれぞれ
（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍ、
（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍ、又は
（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍ
として示される。薬剤に付着されているリンカーに加えて、本発明は、基本的にいずれの分子種への付着にも適切な、切断可能なリンカーアームも提供する。本発明のリンカーアームの特徴は、本願明細書において治療部位へのそれらの付着について記載することにより例証される。しかしながら、当業者であれば、診断薬、分析薬、生体分子、ターゲッティング試薬、検出可能な標識等を含む（これらに限定されない）多様な分子種にリンカーが付着できることは容易に理解できるであろう。
１つの実施形態では、本発明はターゲッティング基を治療薬及びマーカーに付着するのに有用なリンカーに関する。別の特徴において、本発明は化合物に安定性を与え、それらのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を減じ、また他には、それらの薬物動態、生物学的利用能及び／又は薬力学に良好な影響を及ぼすリンカーを提供する。かかる実施形態において、概して、薬剤がひとたび作用部位に輸送されればリンカーが切断され、活性な薬剤を放出することが望ましい。よって本発明の一実施形態では、本発明のリンカーは、治療薬又はマーカーから（例えば活性化の際）取り除かれると、リンカーの存在の痕跡が残らないものが望ましい。
本発明の別の実施形態において、リンカーは、治療作用又はマーカー活性の部位など、標的細胞内又はその近傍部位でのそれらが切断されることを特徴とする。このような切断は、本質的には酵素的なものである。この特徴は、治療薬又はマーカーの身体全体での活性化を防止し、毒性及び全身性の副作用を防止するのに有用である。酵素的切断のための望ましい切断可能な基としては、ペプチド結合、エステル結合、及びジスルフィド結合が挙げられる。他の実施形態において、リンカーはｐＨ感受性を有し、ｐＨの変化によって切断される。
本願発明の重要な特徴は、リンカーを切断する速度の制御能である。例えば、本願明細書に記載のヒドラジンリンカーは、採用する特定構造により、リンカーが環化（リガンドから薬剤を切断）する速度を変化させることができ、特に有用である。ＷＯ０２／０９６９１０は、ヒドラジンリンカーを有するいくつかの特異的リガンド−薬剤コンジュゲートを提供している。しかしながら、必要とされる環化の速度に応じたリンカー組成物を「調整」する方法は記載されておらず、また記載された特定の化合物は、多くの薬剤−リンカーコンジュゲートにとって望ましい速度よりも低速で、薬剤からリガンドを切り離す。これに対し、本願発明のヒドラジンリンカーは、非常に高速から非常に低速までの様々な環化速度を可能にし、これにより所望の環化速度に基づき特定のヒドラジンリンカーを選択することが可能となる。例えば、切断に伴い単一の５員環を産生するヒドラジンリンカーで、非常に速い環化が行われる。細胞への細胞毒性薬の標的化輸送に望ましい環化速度は、２つの５員環、又はジェミナル位置に２つのメチルを有するリンカーから得られる単一の６員環のいずれかを切断することに伴って産生するヒドラジンリンカーを使用して行われる。ｇｅｍ−ジメチル効果は、ジェミナル位置に２つのメチルを有しない単一の６員環と比較して、環化反応の速度を高めることが示されている。これは、環において歪みが軽減されることに起因するものである。しかしながら、置換基が反応を速めずに減速するような場合もある。多くの場合、遅延の原因は立体障害にある。実施例２．４に示すとおり、ｇｅｍジメチル置換によって、ジェミナル炭素がＣＨ２である場合に比較して、より速い環化反応を起こすことが可能となる。
しかしながら、実施形態によっては、切断速度がより低いリンカーが望ましい場合の存在を認めることも重要である。例えば、徐放性製剤、又は即放性及び徐放性成分の双方を含む製剤においては、切断速度がより低いリンカーを提供するのが有用と考えられる。特定の実施形態において、切断に伴って単一の６員環、又は単一の７員環のいずれかを生成する、ｇｅｍ−ジメチル置換のないヒドラジンリンカーを使用することで、低い環化速度が得られる。
リンカーは、循環中の分解から、治療薬又はマーカーを安定に維持するのにも有用である。付着した薬剤又はマーカーの循環中の半減期の延長が、このような安定化の結果として生じるので、この特徴により多大な利点がもたらされる。循環中はコンジュゲートが比較的良性で、一方標的の作用部位での活性化後には、例えば毒性など所望の効果を有するように、付着した薬剤又はマーカーの活性を弱めるのにリンカーの存在が有用である。治療薬コンジュゲートにおいて、リンカーのこの特徴は、薬剤の治療効率を向上させるのに有用である。
安定化基は、望ましくは血液又は非標的組織中に存在しうる酵素により、治療薬又はマーカーのクリアランス及び代謝を制限するように選択され、更に細胞内への薬剤又はマーカーの輸送を限定するように選択される。安定化基は、薬剤又はマーカーの分解を阻止するのに有用で、また薬剤又はマーカーに他の物理的特性をもたらす効果も有する。安定化基はまた、製剤化又は非製剤化のいずれかの形態での保存の間の薬剤又はマーカーの安定性も改善しうる。
理想的には、安定化基は、ヒト血液中の薬剤又はマーカーを３７℃で２時間保存することにより解析した場合に、薬剤又はマーカーを分解から保護し、所定のアッセイ条件下において、ヒト血液中に存在する酵素による薬剤又はマーカーの切断が２０％未満、望ましくは１０％未満、より望ましくは５％未満、更に望ましくは２％未満であれば、治療薬又はマーカーを安定化するのに有用である。
本発明はまた、これらのリンカーを含むコンジュゲートにも関する。更に詳細には、本発明は疾病の処置、特に癌の化学療法に使用されうるプロドラッグに関する。具体的には、本願明細書に記載のリンカーの使用により、類似の構造のプロドラッグと比べて作用の特異性が高く、毒性が低く、血液中での安定性が向上したプロドラッグが提供される。
本願明細書に記載の本発明のリンカーは、サイトトキシンのコンジュゲート内のいかなる部位に存在してもよい。
よって、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば血液中において、そのような基を持たない構築体の速度に比較して高い速度で切断されるリンカーであり、鎖の一部に様々な基を含みうるものが提供される。更に提供されるのは、治療及び診断薬とのリンカーアームのコンジュゲートである。リンカーは、治療薬のプロドラッグアナログを形成し、ターゲッティング試薬、検出可能な標識又は固体支持体に、治療又は診断薬を可逆的に連結させるのに有用である。リンカーは、本発明のサイトトキシンを含むコンジュゲートに組み込まれてもよい。
切断可能なペプチド、ヒドラジン又はジスルフィド基に加えて、１以上の自己犠牲リンカー基Ｌ１は、サイトトキシンとターゲッティング試薬との間に任意に導入される。これらリンカー基は、スペーサー基ともいい、少なくとも２つの反応性官能基を含んでいる。望ましくは、スペーサー基の１つの化学官能基が、例えば、サイトトキシンなどの治療薬の化学官能基に結合し、スペーサー基の他の化学官能基がターゲッティング試薬又は切断可能なリンカーの化学官能基に結合する。スペーサー基の化学官能基の例として、ヒドロキシ、メルカプト、カルボニル、カルボキシ、アミノ、ケトン、及びメルカプト基が挙げられる。
Ｌ１で表される自己犠牲リンカーは、概して置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアルキル基である。一実施形態では、アルキル又はアリール基は１から２０までの炭素原子を含みうる。それらはまた、ポリエチレングリコール部分も含みうる。
スペーサー基の例としては、例えば、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０−ヒドロキシデカン酸、グリシン及び他のアミノ酸類、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド、カルボニル基、アミナールエステル、核酸、ペプチド等が挙げられる。
スペーサーは、追加の分子量及び化学官能基をサイトトキシン−ターゲッティング試薬コンジュゲートに導入するのに有用である。概して、追加の質量及び官能基は、コンジュゲートの血清半減期及びその他の性質に影響を及ぼすと考えられる。よって、スペーサー基を注意深く選択することで、様々な血清半減期を有するサイトトキシンコンジュゲートを作製することができる。
薬剤部分に直接隣接するように配置されるスペーサー（単数又は複数）は、（Ｌ１）ｍとも示され、ここでｍは０、１、２、３、４、５、又は６から選択される整数である。複数のＬ１スペーサーが存在する場合、同一又は異なるスペーサーを使用しうる。Ｌ１は、自己犠牲基であってよい。一実施形態では、Ｌ１は、望ましくは置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル又は置換ヘテロシクロアルキル基である。薬剤−リガンドコンジュゲートがヒドラジンリンカーを含む場合、Ｌ１はジスルフィド結合を含まない。
Ｌ４は、リンカー部分であり、これはかかる部分を含むリンカーを利用しているコンジュゲートに、溶解性の増大又は凝集性の減少をもたらすものである。Ｌ４リンカーが自己犠牲的である必要はない。一実施形態では、Ｌ４部分は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアルキル、又は非置換ヘテロアルキル基であり、これらはいずれも直鎖状、分枝状、又は環状でありうる。置換基は、例えば、低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、又はジアルキルアミノ基であってよい。特定の実施形態において、Ｌ４は、非環状部分を含んでいる。別の実施形態において、Ｌ４は、ポリリジン又はポリアルギニンなどの、正又は負のいずれかに荷電したアミノ酸ポリマーのいずれかを含む。Ｌ４は、ポリエチレングリコール部分などのポリマーを含むことができる。更に、Ｌ４リンカーは、例えば、ポリマー成分及び小分子の双方を含む。
望ましい実施形態において、Ｌ４はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。Ｌ４のＰＥＧ部分は、１から５０単位長までであってよい。望ましくは、ＰＥＧは１〜１２反復単位、更に望ましくは３〜１２反復単位、更に望ましくは２〜６反復単位、又は更に一層望ましくは３〜５反復単位、最も望ましくは４反復単位を有する。Ｌ４は、ＰＥＧ部分のみで構成されてもよく、又は更なる置換若しくは非置換アルキル又はヘテロアルキル基も含んでいてよい。コンジュゲートの水溶性を高めるため、Ｌ４部分の一部としてＰＥＧを組み合わせることが有用である。加えてＰＥＧ部分は、薬剤を抗体にコンジュゲートする際に起こりうる凝集の程度を低下させる。
（１）ペプチドリンカー（Ｆ）
上記のとおり、本発明のペプチジルリンカーは、一般式：（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍ（式中、Ｆはペプチジル部分を含むリンカー部を表す）によって表すことができる。一実施形態では、Ｆ部は、任意の更なる自己犠牲リンカー（単数又は複数）、Ｌ２、及びカルボニル基を含む。別の実施形態において、Ｆ部は、アミノ基及び任意のスペーサー基（単数又は複数）、Ｌ３を含む。
したがって、一実施形態では、ペプチジルリンカーを含むコンジュゲートは、式４の構造式で示される。
本実施形態において、Ｌ１は、上記のような自己犠牲リンカーであり、Ｌ４は上記のとおり、溶解性の増大又は凝集性の減少をもたらす部分である。Ｌ２は、自己犠牲リンカー（単数又は複数）を表す。ｍは０、１、２、３、４、５、又は６であり；ｏ及びｐは独立して０又は１である。一実施形態では、ｍは３、４、５又は６である。ＡＡ１は、１以上の天然アミノ酸、及び／又は非天然α−アミノ酸を表し；ｃは１から２０までの整数である。
上記一般式にて表される本発明のペプチドリンカーにおいて、ＡＡ１はそのアミノ末端で、Ｌ４に直接か、又は、Ｌ４が存在しない場合はＸ４基（すなわち、ターゲッティング試薬、検出可能な標識、保護された反応性官能基、又は保護されていない反応性官能基）に直接連結される。実施形態によっては、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は、（ＡＡ１）ｃのＮ−末端に直接付着したカルボン酸アシル基を含まない。このため、これらの実施形態では、米国特許第６，２１４，３４５号のペプチドのリンカーで必要とされるように、Ｌ４又はＸ４のいずれかとＡＡ１との間に直接的に、カルボン酸アシル単位が存在する必要はない。
他の実施形態では、ペプチジルリンカーを含むコンジュゲートは、式５の構造式で表される。
本実施形態において、Ｌ４は上記のとおり、溶解性の増大又は凝集性の減少をもたらす部分であり；Ｌ３は、一級若しくは二級アミン又はカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、Ｌ３のアミンがＤのペンダント基であるカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、又はＬ３のカルボキシルがＤのペンダント基であるアミン官能基とアミド結合を形成するか、のいずれかであり；そしてｏ及びｐは独立して０又は１である。ＡＡ１は、１以上の天然アミノ酸、及び／又は非天然α−アミノ酸を表し；ｃは１から２０までの整数である。この実施形態では、Ｌ１は存在しない（すなわち、一般式においてｍは０である）。
上記の式５の本発明のペプチドリンカーにおいて、ＡＡ１はそのアミノ末端で、Ｌ４に直接か、又は、Ｌ４が存在しない場合はＸ４基（すなわち、ターゲッティング試薬、検出可能な標識、保護された反応性官能基、又は保護されていない反応性官能基）に直接連結される。実施形態によっては、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は、（ＡＡ１）ｃのＮ−末端に直接付着するカルボン酸アシル基を含まない。このため、これらの実施形態では、米国特許第６，２１４，３４５号のペプチドのリンカーで必要とされるように、Ｌ４又はＸ４のいずれかとＡＡ１との間に直接的に、カルボン酸アシル単位が存在する必要はない。
自己犠牲リンカーＬ ２
自己犠牲リンカーＬ２は、２つの離間した化学基部分を通常は安定な三成分分子へと共有結合させ、当該離間した化学基部分のうちの１つを酵素的切断によって上記三成分分子から遊離させ；上記酵素的切断の後、その残りの分子からもう一方の上記化学基部分を切り離し遊離することのできる、二官能基性の化学基部分である。本発明において、自己犠牲スペーサーはその端部の一方でペプチド部分に共有結合しており、かつその他方の端部で薬剤部分（その誘導体化は薬理学的活性を阻害する）の化学的活性部位に共有結合しており、これはペプチド部分と薬剤部分とを、三成分分子になるよう離間させかつ共有結合させ、この三成分分子は、それを標的とする酵素がなければ安定かつ薬理学上不活性であるが、スペーサー部分とペプチド部分との共有結合部分においてその酵素により切断されると、その結果、当該三成分分子からペプチド部分を遊離させることができるものである。かかる酵素的切断は順次、スペーサー部分の自己犠牲的な特性を活性化し、スペーサー部分と薬剤部分とを共有結合させている結合の自発的な切断を促進し、その結果、薬理学上活性な型で薬剤を遊離させることができる。
自己犠牲リンカーＬ２は、いかなる自己犠牲基でもよい。望ましくは、Ｌ２は置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換及び非置換アリール、又は置換及び非置換ヘテロアリール基である。
１つの特に望ましい自己犠牲スペーサーＬ２は、以下の式６で表される。
アミノベンジル基の芳香族環は、１以上の「Ｋ」基で置換されていてよい。「Ｋ」基は、環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つ、そうでなければ付着する水素と置き換わる、芳香族環の置換基である。「Ｋ」基は、ハロゲンなどの単一の分子でもよく、又はアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、及びシアノ基などの複数原子基でもよい。各々のＫは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、及びＯＲ２１、からなる群より独立して選択され、ここでＲ２１及びＲ２２は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、及び非置換ヘテロシクロアルキル基からなる群より独立して選択される。Ｋ置換基の例としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３及びメチル基が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｋａ」については、ａは０、１、２、３、又は４の整数である。望ましい一実施形態では、ａは０である。
前掲の構造のエーテル酸素原子は、カルボニル基に結合される。ＮＲ２４官能基から芳香族環内への線は、アミン官能基が５つの炭素のいずれと結合してもよく、双方が環を形成して−ＣＨ２−Ｏ−基で置換されていないことを示している。望ましくは、ＸのＮＲ２４官能基は、−ＣＨ２−Ｏ−基に対してパラ位で芳香族環と共有結合する。Ｒ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より選択される要素である。特定の実施形態において、Ｒ２４は水素である。
望ましい実施形態において、本発明は上記一般式のペプチドリンカーを提供し、式中、Ｆは以下の構造を有する。

式中、Ｒ２４は水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より選択され；
各々のＫは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、及びＯＲ２１からなる群より独立して選択され、式中、
Ｒ２１及びＲ２２は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基からなる群より独立して選択され；
ａは０、１、２、３、又は４の整数である。
別の実施形態において、上記一般式（４）のペプチドリンカーは、以下の構造を有する−Ｆ−（Ｌ１）ｍ−を含む。
式中、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より独立して選択される要素である。
スペーサー基Ｌ ３
スペーサー基Ｌ３は、第一級若しくは第二級アミン、又はカルボキシル官能基を含み、Ｌ３基のアミンがＤのペンダント基であるカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、又はＬ３のカルボキシルがＤのペンダント基であるアミン官能基とアミド結合を形成するか、のいずれかである。Ｌ３は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群より選択することができる。望ましい実施形態において、Ｌ３は芳香族基を含む。更に望ましくは、Ｌ３は安息香酸基、アニリン基又はインドール基を含む。Ｌ３−ＮＨ−スペーサーとしての機能を果たすことができる構造の例として以下の構造が挙げられるが、これらの例に限定されない。

式中、Ｚは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ２３より選択される要素であり、式中、Ｒ２３は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル又はアシル基より選択される要素である。
Ｌ３を含む本発明のリンカーを切断しても、Ｌ３部分は薬剤Ｄに付着したままである。したがって、Ｄに付着したＬ３部分の存在がＤの活性を大幅に変えることのないように、Ｌ３部分を選択する。別の実施形態において、薬剤Ｄ自体の一部分は、Ｌ３スペーサーとして機能する。例えば、一実施形態では、薬剤Ｄはデュオカルマイシン誘導体であり、この薬剤の一部分がＬ３スペーサーとして機能するのである。このような実施形態の例として、ＮＨ２−（Ｌ３）−Ｄが以下に示す群より選択される構造を有するものが挙げられるが、これらの例に限定されない。
式中、Ｚは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ２３、より選択される要素であり、
Ｒ２３は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル又はアシル基より選択される要素であり；
各構造でのＮＨ２基は（ＡＡ１）ｃと反応して−（ＡＡ１）ｃ−ＮＨ−を形成する。
ペプチド配列ＡＡ １
基ＡＡ１は、単一のアミノ酸、又はアミド結合によって結合される複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は、天然アミノ酸及び／又は非天然α−アミノ酸であってよい。
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、単一のアミノ酸（ｃ＝１の場合）の、又はアミド結合によって結合される複数のアミノ酸の、アミド化残基である。本願発明のペプチドは、生体中の標的部位に存在する酵素によるペプチドの切断に適するように選択される。例えば、ターゲッティング試薬を用いて細胞にターゲッティングされ、次いで細胞によって取り込まれたとき、リソソーム内で１以上のリソソームのプロテアーゼによってペプチドが細胞内切断されるように選択される。ペプチド内のアミノ酸の数は１〜２０の範囲であるが、更に望ましくは（ＡＡ１）ｃを含め、２〜８アミノ酸、２〜６アミノ酸、又は２、３若しくは４アミノ酸である。特異的な酵素、又は酵素のクラスによる切断に感受性のペプチド配列は、当該技術分野において公知である。
血清、肝臓、腸等の中の酵素によって切断される多くのペプチド配列が、当該技術分野において知られている。本発明のペプチド配列の例として挙げられるのは、プロテアーゼによって切断されるペプチド配列である。プロテアーゼ感受性配列の使用に続く議論は、飽くまで例示を明らかにすることのみが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。
ペプチドを切断する酵素がプロテアーゼである場合、リンカーは一般に、そのプロテアーゼに対する切断認識配列を含むペプチドを包含する。プロテアーゼに対する切断認識配列は、蛋白分解的切断の際にプロテアーゼによって認識される特異的アミノ酸配列である。多くのプロテアーゼ切断部位が、当該技術分野において知られており、これら切断部位やその他の切断部位を、リンカー部に含めることができる。例えば、Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：９５４（１９９０）；Ｄｕｎｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：２５４（１９９４）；Ｓｅｉｄａｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１７５（１９９４）；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６１５（１９９４）；Ｗｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：５９５（１９９４）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：４１２（１９９４）；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：６１４（１９９５）、Ｈａｒｄｙら、ＡＭＹＬＯＩＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＩＮ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，ＡＧＩＮＧ， ＡＮＤ ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ ＤＩＳＥＡＳＥ、編、Ｍａｓｔｅｒｓら、１９０〜１９８頁（１９９４）を参照されたい。
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃのアミノ酸は、腫瘍関連プロテアーゼなど、特定の分子による選択的な酵素的切断に対する適性に基づいて選択される。使用されるアミノ酸は、天然又は非天然アミノ酸であってよい。それらは、Ｌ又はＤ型の立体構造でありうる。一実施形態では、少なくとも３つの異なるアミノ酸が使用される。別の実施形態においては、２つのアミノ酸のみが使用される。
望ましい実施形態において、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、それがリソソームのプロテアーゼによって切断される適性に基づいて選択され、そのプロテアーゼの例としてはカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｌ及びＳが挙げられるが、これらに限定されない。望ましくは、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、インビトロでカテプシンＢによって切断されることができ、これは、当該技術分野において知られているインビトロプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験することができる。
別の実施形態において、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、腫瘍細胞の近傍で細胞外に認められるプロテアーゼなどの、腫瘍関連プロテアーゼ（その例として挙げられるのはチメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）及びＣＤ１０であり、これらの例は限定的なものではない）による切断適性に基づいて選択される。ＴＯＰ又はＣＤ１０によるペプチドの切断可能性は、当該技術分野において知られているインビトロのプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験することができる。
本発明のコンジュゲートにおける使用に望ましい、限定的でないペプチド配列の望ましい例として、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）が挙げられる。望ましいペプチド配列は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ及びＶａｌ−Ｌｙｓである。
別の実施形態において、薬剤部分の最も近傍に配置されるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択される。更に別の実施形態において、薬剤部分の最も近くに配置されるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択される。
プロテアーゼは、癌転移に関与している。プロテアーゼであるウロキナーゼの合成の増大は、多くの癌における転移能の増大と相関している。ウロキナーゼはプラスミノーゲンからプラスミンを活性化させ、これは細胞外マトリックスに遍在的に位置しておりその活性化は、細胞外マトリックスにおける蛋白質の分解を引き起こすことができ、それを通じて転移腫瘍細胞が浸潤するのである。プラスミンは、コラゲナーゼを活性化させることもでき、こうして毛細血管及びリンパ系を取り巻く基底膜のコラーゲンの分解を促進し、それによって標的組織へ腫瘍細胞が浸潤するのを可能とする（Ｄａｎｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、４４：１３９（１９８５））。よって、ウロキナーゼによって切断されるペプチド配列をリンカーとして利用することも、本発明の範囲に含まれる。
本発明はまた、トリプターゼによる切断に感受性のペプチド配列の使用も提供する。ヒト肥満細胞は、α、βＩ、βＩＩ、及びβＩＩＩと命名されている少なくとも４つの別異のトリプターゼを発現している。これらの酵素は、血漿プロテアーゼ阻害剤によって制御されず、インビトロで少数の生理的基質を切断するにすぎない。セリンプロテアーゼのトリプターゼファミリーは、肥満細胞に関わる種々のアレルギー性及び炎症性疾患の患者からの生物学的流体中でトリプターゼレベルの上昇が認められるため、これらの障害への関与が示されている。しかしながら、疾病の病態生理学におけるトリプターゼの正確な役割は未だ知られていない。トリプターゼの生物学的機能の範囲及び対応する生理学的作用は、それらの基質特異性によって実質的に定義される。
トリプターゼは、プロ−ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、腫瘍転移及び浸潤に関わるプロテアーゼのチモーゲン型の強力な活性化剤である。プラスミノーゲンカスケードの活性化は結果的に、細胞性血管外遊出及び遊走のために細胞外マトリックスの破壊を引き起こすもので、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号４）のＰ４−Ｐ１配列でのプロ−ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤のトリプターゼ活性化の作用になりうる（Ｓｔａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（１３）：９４１６−９４１９（１９９４））。血管透過性の調節に関与する血管作用性腸管ペプチド、神経ペプチドもまた、主にＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号５）配列でトリプターゼにより切断される（Ｔａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２７−３２（１９９０））。Ｇ−蛋白質共役受容体ＰＡＲ−２は、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号６）配列でトリプターゼにより切断及び活性化されて線維芽細胞の増殖を駆動することができ、トロンビン活性化受容体ＰＡＲ−１は、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号７）配列でトリプターゼにより不活性化される（Ｍｏｌｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０４３−４０４９（１９９７））。以上より、疾病の結果としての組織リモデリングにおけるトリプターゼに対する中心的な役割が、この証拠によって示唆される。これは、数種の肥満細胞媒介障害において観察される根本的な変化と一致している。慢性喘息及び他の長期呼吸器疾患の１つの特徴は、その生理的標的のトリプターゼ活性化の結果と考えられる根底組織の線維形成及び肥厚である。同様に一連の報告によって、血管形成が種々の癌における肥満細胞密度、トリプターゼ活性及び予後不良に関わっていることが示されている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３（１１）：１３８２−９７（１９９９））；Ｔａｋａｎａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ ８８（１２）：２６８６−９２（２０００）；Ｔｏｔｈ−Ｊａｋａｔｉｃｓら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３１（８）：９５５−９６０（２０００）；Ｒｉｂａｔｔｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８５（２）：１７１−５（２０００））。
特定のプロテアーゼが、選択されたペプチド配列を切断するか否かを評価するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光原ペプチド基質の使用が、プロテアーゼ特異性の判定のための、確立された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｍ．ら、（１９７７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７８：４７−５１）。アニリド結合の特異的切断で蛍光原ＡＭＣ脱離基が遊離し、個々の基質に対する切断速度の簡易な定量が可能となる。更に最近になって、幅広い基質をサンプリングすることにより、単独の実験にてプロテアーゼのＮ−末端特異性を迅速にプロファイリングするための、ＡＭＣペプチド基質ライブラリーのアレイ（Ｌｅｅ、Ｄ．ら、（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９：１６６７−７２）及びポジショナル走査ライブラリー（Ｒａｎｏ、Ｔ．Ａ．ら、（１９９７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１４９−５５）が開発されている。よって、当業者は、余分な実験に頼らずとも、本発明での有用性を判定すべく、ペプチド配列をアレイにより容易に評価することができる。
（２）ヒドラジンリンカー（Ｈ）
第二の実施形態において、本発明のコンジュゲートはヒドラジン自己犠牲リンカーを含み、ここで当該コンジュゲートは以下の構造を有する。
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、及びＸ４は、上記の定義と更に本願明細書に記載したとおりであって、Ｈは以下の構造を有するリンカーであり；

式中、ｎ１は１〜１０の整数であり；
ｎ２は０、１、又は２であり；
各々のＲ２４は水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より独立して選択される要素であり；
Ｉは結合（すなわち、骨格の炭素と、隣接する窒素との間の結合）、又は以下の構造：
であり、式中、ｎ３は０又は１であるが、但し、ｎ３が０である場合、ｎ２は０ではなく；かつｎ４は１、２又は３であり、
式中、Ｉが結合である場合、ｎ１は３でｎ２は１であり、Ｄが
（式中、ＲはＭｅ又はＣＨ２−ＣＨ２−ＮＭｅ２）でない。
一実施形態では、フェニル環の置換は、パラ置換である。望ましい実施形態において、ｎ１は２、３若しくは４であり、又はｎ１は３である。望ましい実施形態において、ｎ２は１である。望ましい実施形態において、Ｉは結合（すなわち、骨格の炭素と、隣接する窒素との間の結合）である。１つの特徴では、ヒドラジンリンカーであるＨは、切断に伴い６員自己犠牲リンカーを形成することができ、例えば、ｎ３は０でｎ４は２である。別の特徴では、ヒドラジンリンカーＨは、切断に伴い二つの５員自己犠牲リンカーを形成することができる。更に他の特徴では、切断に伴いＨは５員自己犠牲リンカーを形成し、Ｈは７員自己犠牲リンカーを形成し、又はＨは５員自己犠牲リンカー及び６員自己犠牲リンカーを形成する。切断の速度は、切断に伴い形成される環のサイズによる影響を受ける。よって、所望される切断の速度によって、切断に伴い形成すべき適切なサイズの環を選択することができる。
５員ヒドラジンリンカー
一実施形態では、ヒドラジンリンカーは５員ヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは以下の構造を有する。
望ましい実施形態において、ｎ１は２、３又は４である。別の望ましい実施形態において、ｎ１は３である。上記構造において、各々のＲ２４は水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より独立して選択される要素である。一実施形態では、各々のＲ２４は独立して、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の実施形態において、各々のＲ２４は独立して、水素原子又はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、更に望ましくは水素原子又はＣＨ３である。別の実施形態において、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の実施形態において、各々のＲ２４は水素原子である。各々のＲ２４は、化合物の立体効果を調整し、かつ溶解性を変えるべく選択される。
５員ヒドラジンリンカーは、リンカーから薬剤を分離する１以上の環化反応をすることができ、この反応は、例えば以下のように示すことができる。
本発明の５員リンカーを調製するための合成経路の例は、以下のとおりである。
Ｃｂｚで保護されたＤＭＤＡ（ｂ）は、塩化チオニル溶液中で２，２−ジメチル−マロン酸ａと反応してＣｂｚ−ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン酸ｃを形成する。化合物ｃは、水素の存在下にＢｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｄと反応してＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｅを形成する。
６員ヒドラジンリンカー
別の実施形態において、ヒドラジンリンカーは６員ヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは以下の構造を有する。
望ましい実施形態において、ｎ１は３である。上記の構造において、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択される要素である。一実施形態では、各々のＲ２４は独立して、水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の実施形態において、各々のＲ２４は独立して、水素原子又はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、更に望ましくは水素原子又はＣＨ３である。別の実施形態において、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の実施形態において、各々のＲ２４は水素原子である。各々のＲ２４は、化合物の立体効果を調整し、かつ溶解性を変えるべく選択される。望ましい実施形態において、Ｈは以下の構造を有する。
一実施形態では、Ｈはジェミナルのジメチル置換基を含む。上記構造の一実施形態では、各々のＲ２４は独立して、水素原子又は置換若しくは非置換アルキル基である。
６員ヒドラジンリンカーは、リンカーから薬剤を分離する環化反応を進行させ、この反応は例えば以下のように示すことができる。
本発明の６員リンカーを調製する合成経路の例は、以下のとおりである。
ジクロロメタン溶液中、Ｃｂｚで保護されたジメチルアラニンａをＨＯＡｔ及びＣＰＩと反応させ、Ｃｂｚで保護されたジメチルアラニンヒドラジンｂを形成させる。ヒドラジンｂは、メタノールの作用によって脱保護され、化合物ｃを形成させる。
他のヒドラジンリンカー
本発明では、７員を有するリンカーを包含することを企図している。このリンカーは、５員又は６員リンカーほど迅速に環化しないが、薬剤−リガンドコンジュゲートによっては望ましい場合がある。同様に、ヒドラジンリンカーは２つの６員環、又は１つの６員及び１つの５員環化産物を有するヒドラジンリンカーを含んでもよい。５５員及び７員リンカーや、６員及び７員リンカーもまた企図される。
他のヒドラジン構造であるＨは、以下の構造を有する。
式中、ｑは０、１，２、３、４、５、又は６であり；
各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より独立して選択される要素である。このヒドラジン構造は、５員環、６員環又は７員環を形成することもでき、また複数環を形成するために追加の成分を添加することができる。
（３）ジスルフィドリンカー（Ｊ）
更に別の実施形態において、リンカーは酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。一実施形態では、本発明は以下の一般式の構造を有する細胞毒性薬剤−リガンド化合物を提供する。
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、及びＸ４は、上記の定義と更に本願明細書に記載したとおりであって、Ｊは以下の構造を有する基を含むジスルフィドリンカーであり；

式中、各々のＲ２４は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、及び非置換ヘテロアルキル基からなる群より独立して選択でされる要素であり；
各々のＫは、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、及びＯＲ２１、からなる群より独立して選択される要素であり、
ここでＲ２１及びＲ２２は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、及び非置換ヘテロシクロアルキル基からなる群より独立して選択され；
ａは０、１、２、３、又は４の整数であって；
ｄは０、１、２、３、４、５、又は６の整数である。
ジスルフィドリンカーの芳香族環は、１以上の「Ｋ」基で置換されていてもよい。「Ｋ」基は、環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つ、あるいは付着する水素と置き換わる、芳香族環の置換基である。「Ｋ」基は、ハロゲンなどの単一原子でもよく、又はアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、及びシアノ基などの複数原子基でもよい。Ｋ置換基の例としては、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３及びメチルが挙げられるが、これらに限定されない。「Ｋａ」については、ａは０、１、２、３、又は４の整数である。特定の実施形態において、ａは０である。
望ましい実施形態において、リンカーは以下の一般式の、酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。

本実施形態においてＬ４、Ｘ４、ｐ、及びＲ２４は上記のとおりであり、ｄは０、１、２、３、４、５、又は６である。特定の実施形態において、ｄは１又は２である。
更に具体的なジスルフィドリンカーを、以下の一般式に示す。
本実施形態の具体的な例は以下のとおりである。
式中、望ましくは、ｄは１又は２である。
他のジスルフィドリンカーを、以下の一般式に示す。
この実施態様の具体例は、以下の通りである：
好ましくは、ｄは１又は２である。
種々の実施形態において、ジスルフィド基はアミンに対してオルト位置にある。別の特定の実施形態において、ａは０である。望ましい実施形態において、Ｒ２４は、水素原子及びＣＨ３から独立して選択される。
本発明のジスルフィドリンカーを調製する合成経路の例は、以下のとおりである。
３−メルカプトプロピオン酸ａの溶液を、アルドリチオール−２と反応させヨウ化３−メチルベンゾチアゾリウムｂを形成させる。ヨウ化３−メチルベンゾチアゾリウムｃを水酸化ナトリウムと反応させ化合物ｄを形成させる。化合物ｄのメタノール溶液を更に化合物ｂと反応させ化合物ｅを形成させる。塩化アセチル及びメタノールの作用によって化合物ｅを脱保護し、化合物ｆが形成される。
本願発明の薬剤−リガンドコンジュゲートは、２以上のリンカーを任意に含みうる。これらのリンカーは同じものでも異なるものでもよい。例えば、薬剤をリガンドに連結するためにペプチジルリンカーを使用し、第二のペプチジルリンカーが診断薬をそのコンジュゲートに付着させてもよい。あるいは、ペプチジル、ヒドラジン又はジスルフィドリンカーのいずれかが薬剤とリガンドコンジュゲートとを連結し、ペプチジル、ヒドラジン又はジスルフィドリンカーのいずれかが診断薬をそのコンジュゲートに付着させてもよい。更なるリンカーの他の用途として挙げられるのは、分析薬、生体分子、ターゲッティング試薬、及び検出可能な標識を、薬剤−リガンドコンジュゲートに結合させることである。
更にまた本発明の範囲に含まれるのは、例えば、本発明の化合物又はその反応性アナログのダイマー、トリマー、テトラマー及び高相同物などの種を含む、ポリ−又は多価種である本発明の化合物である。ポリ−及び多価種は、本発明の単一種又は複数種から構築することができる。例えば、ダイマーの構築体は、「ホモダイマー性」又は「ヘテロダイマー性」でありうる。更に、本発明の化合物又はその反応性アナログがオリゴマー又はポリマーのフレームワーク（例えば、ポリリジン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン等）に付着されたポリ−及び多価構築体が、本発明の範囲に含まれる。フレームワークは、望ましくは多官能性である（すなわち、本発明の化合物を付着するための反応性部位（複数）のアレイを有している）。更に、フレームワークは本発明の単一種、又は本発明の複数種に由来するものであってよい。
更に、本発明には、水溶性の化合物を得るために官能基が付与されている化合物が包含され、この水溶性は、官能基が付与されていない類似の化合物と比較して高められている。このように、本願明細書で述べた置換基のいずれも、水溶性を高めるような基と置換することができる。例えば、ヒドロキシル基をジオールに、又はアミンを四級アミン、ヒドロキシアミン若しくは更に水溶性が高い類似の基に置き換えることも本発明の範囲に含まれる。望ましい実施形態において、本願明細書に記載の化合物のイオンチャンネルに対する活性に必須ではない部位にて、原型の化合物の水溶性を高める部分で置換することによって、更なる水溶性が付与される。有機化合物の水溶性を高める方法は、当該技術分野において知られている。かかる方法として、永久的に荷電した部分、例えば四級アンモニウムや、生理的に適切なｐＨで荷電する基、例えばカルボン酸、アミンなどを有機核に付与することが挙げられるが、これらに限定されない。他の方法としては有機核にヒドロキシル又はアミン含有基、例えば、アルコール類、ポリオール類、ポリエーテル類等を付加することが挙げられる。代表的な例として、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物に対する望ましい官能基の付与方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｄｕｎｎ、Ｒ．Ｌ．ら、編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。
薬剤
本願明細書において「Ｄ」と表記する薬剤は、本願発明ではペプチジル、ヒドラジン、又はジスルフィドリンカーのいずれかを介して薬剤がリガンドに連結されている、薬剤−リガンドコンジュゲートの一部として提供される。薬剤は、所望の生物学的活性を保有し、かつリガンドに連結するための反応性官能基を含んでいなければならない。所望の生物学的活性として、ヒトなどの動物における疾病の診断、治療、緩和、処置、又は予防が挙げられる。よって、必要とされる反応性官能基をそれが有する限り、「薬剤」の用語は、公的な米国薬局方、米国ホメオパシー薬局方、若しくは国民医薬剤集又はそれらいずれかの追補版において薬剤として認定されている化学薬剤をいう。薬剤の例は、食品医薬品局（ＦＤＡ）により作成されているオレンジブック及び米国医師用卓上参考書（ＰＤＲ）に示されている。新しい薬剤が絶えず発見及び開発されており、本発明はこれらの新しい薬剤も、本願発明の薬剤−リガンドコンジュゲートに含まれてよい。
望ましい官能基として、第一級又は二級アミン類、ヒドロキシル類、スルフヒドリル類、カルボキシル類、アルデヒド類、及びケトン類が挙げられる。より望ましい官能基として挙げられるのは、ヒドロキシル類、第一級又は二級アミン類、スルフヒドリル類、及びカルボン酸官能基である。より一層望ましい官能基として挙げられるのは、ヒドロキシル類、第一級及び二級アミン類、及びカルボン酸官能基である。薬剤は、少なくとも１つの反応性官能基を有していなければならないが、２、３、４、５、６又はそれ以上の反応性官能基を有してもよい。更には、自己犠牲スペーサー、Ｌ１は、薬剤の反応性官能基と、ペプチド、ヒドラジン又はジスルフィドリンカーとの間に組み込まれてもよい。
薬剤−リガンドコンジュゲートが通常の目的において有効であるということは、対応する薬剤が有効であるために他ならないが、標的細胞の所望の場所にその薬剤を輸送するという、リガンドに固有の能力のため、コンジュゲートの調製は更に有効である。
薬剤の例として、蛋白質、ペプチド、及びリガンドへの連結のための官能基を含む小分子の薬剤が挙げられる。更に具体的には、これらの薬剤には、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤及びチミジル酸合成酵素阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ分解剤、トポイソメラーゼ阻害剤、薬剤のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬剤、マイトマイシン類、ブレオマイシン類、細胞毒性ヌクレオシド、薬剤のプテリジンファミリー、ディネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）類、ポドフィロトキシン類、分化誘導剤、及びタキソール類が包含される。
本願発明の望ましい薬剤としては、癌治療に有用である細胞毒性薬剤、及びトキシンなどの所望の生物学的活性を備えた他の小分子、蛋白質又はポリペプチドが挙げられる。薬剤は、腫瘍特異的リガンドとのコンジュゲーションによって腫瘍細胞で活性化されるものが選択される。これらの腫瘍特異的薬剤−リガンドコンジュゲートは、リガンドの特異性から生じる腫瘍特異性を有している。この例として挙げられるのは、腫瘍特異的酵素に対して選択性の高い基質である薬剤−リガンドコンジュゲートであり、この場合これらの酵素は、腫瘍の近傍に細胞毒性レベルの遊離薬剤を生成させるのに充分な量で、腫瘍の近くに存在している。これらの腫瘍特異的薬剤−リガンドコンジュゲートの１つの利点は、それらがヒト血清中の偶発的なプロテアーゼに対して安定なことにある。薬剤−リガンドコンジュゲートの別の利点は、それらは対応する遊離の薬剤よりも毒性が低い点；更に、コンジュゲートの特異性により、遊離薬剤に比べて全体の使用濃度を低くできる点；である。これは、特異性が高い結果、腫瘍部位において存在すべきコンジュゲートのパーセンテージが高くなることによる。
サイトトキシン
本願発明において有用な細胞毒性薬剤として、例えば、デュオカルマイシン類及びＣＣ−１０６５の、ＣＢＩ（１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オン）系アナログ、ＭＣＢＩ（７−メトキシ−１，２，９，９ａ−テトラ−ヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オン）系アナログ及びＣＣＢＩ（７−シアノ−１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］−インドール−４−オン）系アナログ系を含めた、デュオカルマイシン類及びＣＣ−１０６５、並びにそれらのアナログ、モルホリノ−ドキソルビシン及びシアノモルホリノ−ドキソルビシンなどのドキソルビシン及びドキソルビシンコンジュゲート、ドラスタチン−１０などのドラスタチン類、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタシン、メイタシンアナログ、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン類、ディスオラゾール、エポチロン類、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エレウテロビン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン及びダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、エトポシド又はエトポシドホスフェートなどのポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトセシン、及びそれらのアナログが挙げられる。本願明細書に記載のリンカーにコンジュゲーション用の官能基を提供するために、他の既知の薬剤を修飾してもよい。このような化学的修飾は、当該技術分野において公知である。
本願明細書において使用するための望ましいサイトトキシンとして、デュオカルマイシン類及びＣＣ−１０６５、並びにそのＣＣＢＩ系及びＭＣＢＩ系アナログ、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥ、チューブリシンＡ、ディスオラゾール、エポチロンＡ及びエポチロンＢが挙げられる。
特に望ましい本発明のサイトトキシンは、活性型の、強力なデュオカルマイシン誘導体及びＣＣ−１０６５である。原型の薬剤は、可逆的であり、立体電子的に制御されたＤＮＡの配列選択的アルキル化によってそれらの生物学的効果を引き出す、並外れて強力な抗腫瘍性の抗生物質である（Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４４９９（１９９０）；Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８９６１（１９９０）；Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６６４５（１９９１）；Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９８７２（１９９３）；Ｂｏｇｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２：７５９（１９９２））。デュオカルマイシン類が最初に開示されて以降、デュオカルマイシン類のＤＮＡアルキル化選択性、及びその構造を解明するのに、広範な研究がなされている。
本願発明の特に望ましい態様では、以下の一般式の構造を有する細胞毒性化合物が提供される。
式中、環状体Ａは置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基より選択される要素である。環状体の例として、フェニル基及びピロール基が挙げられる。
符号Ｅ及びＧは、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル基、ヘテロ原子、単結合より独立して選択されるか、又はＥとＧとが任意に結合し、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基より選択される環系を形成する。
符号Ｘは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より選択される要素を表す。Ｒ２３は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素である。
符号Ｒ３は、（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１及びＯＲ１１より選択される要素を表し、ここでＲ１１は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル基、ジホスフェート類、トリホスフェート類、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２又はＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４より選択される要素を表す。符号Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は独立して、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及び置換又は非置換アリール基を表し、ここでＲ１２及びＲ１３は、それらが付着する窒素又は炭素原子と共に任意に結合して、４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する。Ｒ１２、Ｒ１３、又はＲ１４のうち少なくとも１つは、その構造内に切断可能な基を含みうる。
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２、より独立して選択される要素であり、ここでｎは１から２０の整数である。Ｒ１５及びＲ１６は独立して、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、及び置換又は非置換ペプチジル基を表し、ここでＲ１５及びＲ１６は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して、４員環から６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する。構造の一例として挙げられるのはアニリンである。
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５及びＲ１６は、それらの構造内に任意に１以上の切断可能な基を含む。切断可能な基の例として挙げられるのはペプチド、アミノ酸、ヒドラジン類及びジスルフィド類であるが、これらに限定されない。
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５及びＲ１６の少なくとも１つは、本願明細書に記載のとおり、薬剤を本発明のリンカーに、例えば、存在するならばＬ１に、又はＦ、Ｈ、若しくはＪに連結させるのに使用される。
更に望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５及びＲ１６の少なくとも１つは、化合物をコンジュゲートするのに適切な反応性基を有している。更に望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、置換アルキル及び置換ヘテロアルキル基より独立して選択され、アルキル又はヘテロアルキル部分の自由端で反応性官能基部分を有する。Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５及びＲ１６の１以上は、別の種、例えばターゲッティング試薬、検出可能な標識、固体支持体等とコンジュゲートされてもよい。
以上の主旨より明らかなように、Ｒ１５及びＲ１６の少なくとも１つが反応性官能基部分を備えている場合、その部分は、薬剤と別の分子とが結合するための成分となりうる。Ｒ１５及びＲ１６の少なくとも１つが薬剤と別の種との間の連結を含む望ましい実施形態において、Ｒ１５及びＲ１６の少なくとも１つは、酵素によって切断可能な部分である。
更に望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’の少なくとも１つは、以下に示されるとおりである。
式８において、符号Ｘ２及びＺ１は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ２３より独立して選択される要素を表す。基Ｒ１７及びＲ１８は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１９Ｒ２０、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１９、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１９、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ１９、ＳＲ１９又はＯＲ１９、より独立して選択され、但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、又はＲ２０の少なくとも１つは、本願明細書で開示される本発明のリンカーを含んでいる。
符号Ｒ１９及びＲ２０は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１９及びＲ２０は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して、４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成するものである。但し、Ｚ１がＮＨで、Ｒ１７及びＲ１８の双方が水素原子でなく、かつＲ１７がＮＨ２でない場合に限られる。本願明細書全体を通して、符号Ｒ１９及びＲ２０もまた、Ｒ４及びＲ５について述べた基を包含する。よって、例えば、上記融合フェニル−複素環系の２以上を連結して有する化合物、又はリンカーと組み合わせて融合環を有する化合物を提供することは、本発明の範囲に含まれる。更に、リンカーが存在するそれらの実施形態において、リンカーはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、若しくはＲ５’置換基として、又はＲ１７若しくはＲ１８置換基として存在しうる。
Ｒ６は、存在するか、又は存在しない単結合である。Ｒ６が存在する場合、Ｒ６とＲ７とは連結してシクロプロピル環を形成する。Ｒ７は、ＣＨ２−Ｘ１又は−ＣＨ２−である。Ｒ７が−ＣＨ２−である場合、それはシクロプロパン環の成分である。符号Ｘ１は、ハロゲン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＦなどの脱離基を表す。Ｒ６とＲ７との組み合わせは、化学的比重を基本的に乱さないと考えられる。
６員環内の曲線は、環が１以上の不飽和度を有しうるもので、それは芳香族であってよいことを示している。よって、以下の式（９）に示すような環構造及び関連する構造が挙げられる。
望ましい実施形態において、環Ａは置換又は非置換のフェニル環である。環Ａは、本願明細書における定義欄で述べたように１以上のアリール基置換基で置換されていることが望ましい。望ましい一実施形態では、フェニル環は置換ＣＮ又はメトキシ基で置換されている。
他の望ましい実施形態において、本発明は、以下の一般式の構造を有する化合物を提供する。
本実施形態において、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７及びＸは、実質的に上記のとおりである。符号Ｚは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より独立して選択される要素である。各々の符号Ｒ２３は独立して、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素から選択される。符号Ｒ１は、水素原子、置換若しくは非置換低級アルキル基、又はＣ（Ｏ）Ｒ８若しくはＣＯ２Ｒ８を表す。Ｒ８は、置換アルキル、非置換アルキル基、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０及びＯＲ９より選択される要素である。Ｒ９、及びＲ１０は、水素原子、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より独立して選択される。基Ｒ２は、水素原子、又は置換若しくは非置換低級アルキル基である。概して、Ｒ２が置換アルキル基である場合、それがパーフルオロアルキル基、例えば、ＣＦ３以外であるのが望ましい。一実施形態では、Ｒ２は、置換アルキル基であり、その置換基はハロゲンではない。別の実施形態において、Ｒ２は、非置換アルキル基である。
上記のとおり、Ｘ１は脱離基であるのが望ましい。有用な脱離基として、ハロゲン、アジド類、スルホン酸エステル類（例えば、アルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン、過塩素酸アルキル、アンモニオアルカンスルホネートエステル類、アルキルフルオロスルホネート類及びフッ化合物（例えば、トリフレート類、ノナフレート類、トレシレート類）等が挙げられるが、これらに限定されない。脱離基として有用な具体的なハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ及びＢｒである。具体的な反応条件の組み合わせに適切な、これらの脱離基やその他の脱離基の選択は、当業者であれば容易になしうる（例えば、Ｍａｒｃｈ Ｊ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９２；Ｓａｎｄｌｅｒ ＳＲ、Ｋａｒｏ Ｗ、ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８３；及びＷａｄｅ ＬＧ、ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８０を参照）。
望ましい実施形態において、Ｒ１は、ＣＯ２ＣＨ３などのエステル部分である。更に望ましい実施形態において、Ｒ２は低級アルキル基であり、これは置換されていても、又は置換されていなくてもよい。現在のところ望ましい低級アルキル基はＣＨ３である。更なる実施形態において、Ｒ１はＣＯ２ＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ３である。
別の望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、及びＲ５’は、水素原子、ハロゲン、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２及びＮＯ２より独立して選択される要素である。
一実施形態では、薬剤は、脱離基Ｘ１がハロゲン、アルキルスルホニル、アリールスルホニル基、及びアジドからなる群より選択される要素となるように選択される。別の実施形態において、Ｚは酸素原子である。特定の実施形態において、Ｒ１がＣＯ２ＣＨ３、又はＲ２がＣＨ３であるのが望ましく；更にＲ１がＣＯ２ＣＨ３で、かつＲ２がＣＨ３であるのが望ましい。Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の１つがＣ（Ｏ）Ｒ１５であってよく、かつＲ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’のその他３つは水素原子である。また、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’の少なくとも１つは、水素原子及びＯＣＨ３より選択される要素以外であるのがよい。一実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は、水素原子、ハロゲン、ＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２及びＮＯ２より独立して選択される要素である。
望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の１つはＯ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２であり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’の残りのものは水素原子である。更に別の実施形態において、Ｒ７は、ＣＨ２−Ｘ１（Ｘ１は、Ｆ、Ｃｌ又はＢｒである）であって、かつＲ６は存在しない。
更に別の例示的実施形態では、本発明は式１１及び１２で表される構造を有する化合物の提供に関する。
上記一般式の一実施形態では、Ｘは望ましくは酸素原子であり；Ｚは望ましくは酸素原子である。別の実施形態において、ＺはＮＲ２３又は酸素原子である。あるいは、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の１つはＯ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２であってよく、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の残りの３つは水素原子である。一実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’はＲ２９、ＣＯＯＲ２９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２９、及びＣ（Ｏ）ＮＮＲ２９、からなる群より選択されるとよく、ここでＲ２９は、水素原子、ＯＨ基、置換アルキル、非置換アルキル、置換シクロアルキル、非置換シクロアルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、非置換シクロヘテロアルキル、置換ヘテロアリール、及び非置換ヘテロアリール基からなる群より選択される。
上記一般式の別の実施形態において、Ｘは望ましくは酸素原子であり、Ｚは望ましくは酸素原子であり、Ｒ１は望ましくはＣＯ２ＣＨ３であり、Ｒ７は望ましくはＣＨ２−Ｃｌであり、Ｒ２は望ましくはＣＨ３であり、Ｒ３は望ましくはＯＨである。あるいは、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の１つはＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ６Ｈ４）ＮＨ２であってよく、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の残りの３つは水素原子である。
一実施形態では、Ｒ２９は以下の群から選択されてよい。
薬剤の、更に別の実施形態において、Ｒ４及びＲ５より選択される１つの要素は、
であり、ここでＸ２及びＺ１は、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より独立して選択される要素であり；Ｒ１７及びＲ１８は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１９Ｒ２０、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１９、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１９、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ１９、ＯＲ１９、及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択される要素である。本実施形態において、ｎは１から２０の整数であり；Ｒ１９及びＲ２０は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基より独立して選択され、ここでＲ１９及びＲ２０は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成するものであって、ここでＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、又はＲ２０の１つが、上記の薬剤を、存在するならばＬ１に、又はＦに連結させる。望ましい一実施形態では、Ｘ２は酸素原子であり、Ｚ１は、酸素原子又はＮＲ２３である。
式７のデュオカルマイシン類似体の他の望ましい構造は、環Ａが非置換又は置換フェニル環である構造である。環Ａがピロールである場合の、上記の構造に対して上記の薬剤分子での望ましい置換基もまた、環Ａが非置換又は置換フェニル環である場合の望ましい置換基と同様である。
例えば、望ましい実施形態において、薬剤（Ｄ）は以下の構造を有する。
この構造において、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは、上記の一般式について上記したものと同様である。更に、Ｚは酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より選択される要素であり、ここでＲ２３は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素であり；
Ｒ１は、水素原子、置換若しくは非置換低級アルキル基、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、又はＣＯ２Ｒ８であり、ここでＲ８は、ＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９より選択される要素であり、この場合Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、置換又は非置換アルキル、及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より独立して選択される要素であり；
Ｒ１’は、水素原子、置換若しくは非置換低級アルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ８であって、ここでＲ８は、ＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９より選択される要素であり、この場合Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、置換又は非置換アルキル、及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より独立して選択される要素であり；
Ｒ２は、水素原子、又は置換若しくは非置換低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル、又はシアノ若しくはアルコキシ基であり；Ｒ２’は、水素原子、又は置換若しくは非置換低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル基である。
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６の少なくとも１つは、薬剤を、存在するならばＬ１に、又はＦ、Ｈ、若しくはＪに連結させる。
望ましい実施形態において、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５又はＲ５’の１つは、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２であり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’の残りのものは水素原子である。別の実施形態において、Ｒ７は、ＣＨ２−Ｘ１であり、ここでＸ１は、Ｆ、Ｃｌ又はＢｒであってＲ６は存在しない。
一実施形態では、本発明は、以下の一般式の構造を有する細胞毒性薬剤−リガンド化合物を提供する。
式中、符号Ｌ１は自己犠牲スペーサーを表し、ｍは０、１、２、３、４、５、又は６の整数である。
符号Ｘ４は、保護された反応性官能基、保護されていない反応性官能基、検出可能な標識、及びターゲッティング試薬からなる群より選択される要素を表す。
符号Ｌ４は、リンカーの要素を表し、ｐは０又は１である。Ｌ４は、コンジュゲートに溶解性の増大又は凝集性の減少をもたらす部分である。Ｌ４部分の例として置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアルキル、又は非置換ヘテロアルキル基が挙げられ、これらはいずれも直鎖状、分枝状、又は環状の、正又は負のいずれかに荷電した、ポリリジン若しくはポリアルギニンなどのアミノ酸ポリマーか、又はポリエチレングリコールなどのその他のポリマーが適用可能である。
符号Ｑは、本願明細書に記載のペプチド、ヒドラジン、及びジスルフィドリンカーのいずれをも含め（これらに限定されない）切断可能なリンカーを表す。他の望ましいリンカーとして、米国特許第６，２１４，３４５号；米国特許出願公開第２００３／００９６７４３、２００３／０１３０１８９、及び２００４／１２１９４０号；ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ０３／０２６５７７及びＷＯ０４／０４３４９３号；並びに欧州特許出願公開第ＥＰ１２４３２７６及びＥＰ１３７０２９８号（これらすべてを、引用することにより本発明において援用する）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。切断可能なリンカーとして挙げられるのは、化学的又は生物学的プロセスによって選択的に切断されうるものであり、そして切断に際してＸ４から薬剤Ｄ１を分離する。切断は、リンカーの全部又はリンカーの末端のいずれの部位でも生じうる。
上記符号Ｄ１は、以下の一般式を有する薬剤を表す。
式中、Ｘ及びＺは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より独立して選択される要素であり；
Ｒ２３は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素であり；
Ｒ１は、水素原子、置換若しくは非置換低級アルキル基、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、又はＣＯ２Ｒ８であり、
Ｒ１’は、水素原子、置換若しくは非置換低級アルキル基、又はＣ（Ｏ）Ｒ８であり、
ここでＲ８は、ＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９より選択される要素であり、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より独立して選択される要素であり；
Ｒ２は、水素原子、又は置換若しくは非置換低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル、又はシアノ若しくはアルコキシ基であり；
Ｒ２’は、水素原子、又は置換若しくは非置換低級アルキル又は非置換ヘテロアルキル基であり、
Ｒ３は、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１及びＯＲ１１からなる群より選択される要素であり、ここでＲ１１は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、ジホスフェート類、トリホスフェート類、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２及びＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択される要素であり、この場合Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及び置換又は非置換アリールより独立して選択される要素であり、ここでＲ１２及びＲ１３は、それらが付着する窒素又は炭素原子と共に任意に結合して、４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成し、
ここでＲ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の少なくとも１つは、上記薬剤を、存在するならばＬ１に、又はＱに連結させ、
Ｒ６は、存在するか、又は存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６とＲ７とは連結してシクロプロピル環を形成し；
Ｒ７は、上記シクロプロピル環においてＲ６と連結するＣＨ２−Ｘ１又は−ＣＨ２−であり、
ここでＸ１は、脱離基であり、
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、及びＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２４Ｒ２５からなる群より独立して選択される要素であり、ここでｎは１から２０の整数であり；
Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、及び置換又は非置換ペプチジル基より独立して選択され、ここでＲ１５及びＲ１６は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して、４員環から６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成し；
Ｒ２４及びＲ２５は、非置換アルキル基より独立して選択され、ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’の少なくとも１つはＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２４Ｒ２５である。
実施形態によっては、ｎは２である。実施形態によっては、Ｒ２４及びＲ２５はメチルである。実施形態によっては、Ｒ４は、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ２４Ｒ２５であり、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は水素原子である。実施形態によっては、Ｒ４は、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は水素原子である。実施形態によっては、Ｑは上記のように、Ｆ、Ｈ、及びＪより選択されるリンカーである。実施形態によっては、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、及びＲ２’は水素原子である。
薬剤Ｄ１の望ましい一般式は以下のとおりである。
薬剤Ｄ１の他の望ましい実施形態は、以下のとおりである。
薬剤Ｄ１の更なる望ましい実施形態は、以下のとおりである。
本願発明の別の望ましい実施形態において、細胞毒性薬剤は、以下の一般式の構造によって示される化合物などの、チューブリシンアナログ又は関連化合物であってよい。
式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、若しくは低級アルキルであり、又は更に詳細にはイソブチル、エチル、プロピル、若しくはｔ−ブチルであり、かつＲ３は、水素原子又はＯＨである。チューブリシン及び癌の処置におけるその使用は、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００４／００５３２７及びＷＯ２００４／００５３２６号公報に記載されている。チューブリシン化合物の製造はＤＥ１０００８０８９号公報に記載されている。チューブリシンを本願発明の様々なリンカーに連結するのに使用しうる方法は、その実施例に示されている。望ましいチューブリシンアナログは、チューブリシンＡ−Ｆである。
望ましいデュオカルマイシン及びＣＢＩコンジュゲート
本発明のペプチド、ヒドラジン又はジスルフィドリンカーは、細胞毒性薬剤としてデュオカルマイシン又はＣＢＩアナログを含むコンジュゲートにおいて使用することができる。本発明の望ましいコンジュゲートを以下に更に詳細に記載する。別途に示さない限り、置換基はサイトトキシン、ペプチドリンカー、ヒドラジンリンカー及びジスルフィドリンカーに関する欄で上記したとおりに定義される。
Ａ．ペプチドリンカーコンジュゲート
望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するペプチドリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１は、ハロゲンであり；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より選択される要素であり；
Ｒ２３は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素であり；
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＲ１５、及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択される要素であり、
ここでｎは１から２０の整数であり；
Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール基、及び置換又は非置換より独立して選択され、ここでＲ１５及びＲ１６は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して、４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する。
かかるコンジュゲートの非限定的な例として、以下の構造のものが挙げられる。
式中、Ｘ１は、Ｃｌ又はＢｒであり；ここでＡｂは抗体、又はその断片である。
別の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１は、脱離基であり；
Ｚ及びＸは、酸素原子、硫黄原子及びＮＲ２３より独立して選択される要素であり、
ここでＲ２３は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、及びアシル基より選択される要素であり；
Ｒ３は、水素原子、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＲ１５、及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、ここで
ｎは１から２０の整数であり；
Ｒ１５及びＲ１６は、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール基、及び置換又は非置換より独立して選択される要素であり、ここでＲ１５及びＲ１６は、それらが付着する窒素原子と共に任意に結合して、４員環〜６員環を有し、任意に２以上のヘテロ原子を含む、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する。
かかるコンジュゲートの限定的でない例として、以下の構造のものが挙げられる。
式中、各々のｂは独立して０から２０の整数であり、Ａｂは抗体、又はその断片である。
更に他の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造より選択されるペプチドリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１はＣｌ又はＢｒであり、Ａｂは抗体、又はその断片である。
更なる他の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造より選択されるペプチドリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１はＣｌ又はＢｒであり、Ａｂは抗体、又はその断片である。
更なる他の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するペプチドリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１はＣｌ又はＢｒ、Ａｂは抗体、又はその断片である。
他の化合物として以下のものが挙げられ、それらは例えば抗体又はその断片とコンジュゲートさせてもよい
式中、ｒは０から２４の整数である。一実施形態ではｒは４である。
Ｂ．ヒドラジンリンカーコンジュゲート
望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するヒドラジンリンカーコンジュゲートを提供する。
別の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するヒドラジンリンカーコンジュゲートを提供する。
更に他の望ましい実施形態において、本発明は、以下より選択される構造を有するヒドラジンリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部分であり、Ｘ１は、Ｃｌ又はＢｒである。
更なる他の望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造より選択されるヒドラジンリンカーコンジュゲートを提供する。
式中、Ｘ１はＣｌ又はＢｒであり、Ａｂは抗体、又はその断片である。
更に別の望ましい実施形態において、以下の構造より選択されるヒドラジンリンカーコンジュゲートが挙げられる。
Ｃ．ジスルフィドリンカーコンジュゲート
望ましい実施形態において、本発明は、以下の構造を有するジスルフィドリンカーコンジュゲートを提供する。
かかる構造の非限定的な例として、以下のものが挙げられる。
式中、Ｘ１は、Ｃｌ又はＢｒであり、Ａｂは、抗体、又はその断片である。
リガンド
本願発明のリガンドは、「Ｘ４」として表現される。本発明において、Ｘ４は保護された反応性官能基、保護されていない反応性官能基、検出可能な標識、及びターゲッティング試薬からなる群より選択される要素を表す。望ましいリガンドは、抗体及びその断片などのターゲッティング試薬である。
望ましい実施形態において、基Ｘ４は、Ｒ２９、ＣＯＯＲ２９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２９、及びＣ（Ｏ）ＮＮＲ２９より選択される要素として示すことができ、ここでＲ２９は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル及び置換又は非置換ヘテロアリールより選択される要素である。更に別の望ましい実施形態において、Ｒ２９は、水素原子；ＯＨ；ＮＨＮＨ２；並びに、
より選択される要素であり、
式中、Ｒ３０は、反応性官能基が終端となっている置換又は非置換アルキル基、官能基が終端となっている置換又は非置換ヘテロアリール基を表す。上記構造は、例えば、抗体など、ターゲッティング試薬のアミノ酸の残基と反応する反応性保護基として作用し、これによりターゲッティング試薬をリンカー−薬剤部分に連結させることができる。
ターゲッティング試薬
本発明のリンカーアーム及びサイトトキシンは、ペイロードを身体の細胞、臓器又は領域に選択的に輸送するターゲッティング試薬に連結することができる。抗体（例えば、キメラ、ヒト化及びヒト）、受容体に対するリガンド、レクチン類、糖類、抗体、等の典型的なターゲッティング試薬は当該技術分野において公知であり、限定されず、本発明を実施するのに有用なものである。他のターゲッティング試薬として、サイトトキシン分子に重量を追加する、ポリ（エチレングリコール）、多糖、ポリアミノ酸等のマクロ分子を含む、特異的分子認識モチーフを備えていないある種の化合物が挙げられる。追加の分子重量は、例えば、血清における半減期など、サイトトキシンの薬物動態に影響を及ぼす。
望ましい実施形態において、本発明は、例えば、抗体、受容体、ペプチド、レクチン、糖、核酸又はその組み合わせなどの生体分子であるターゲッティング試薬と、サイトトキシン、リンカー又はサイトトキシン−リンカーとのコンジュゲートを提供する。典型的な本発明のコンジュゲーションの経路は、上記のスキームに記載のとおりである。
本発明を実施するのに有用な生体分子は、いかなる供給源からも由来しうる。生体分子は、天然の供給源から単離することができ、又は合成することもできる。蛋白質は天然型又は変異型蛋白質でありうる。変異は、化学的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又は当業者に知られている他の変異誘発の手段によって行うことができる。本発明を実施するのに有用な蛋白質として、例えば、酵素、抗原、抗体及び受容体が挙げられる。抗体は、多クローン性又は単クローン性のいずれかでありうるが、最も望ましくは単クローン性である。ペプチド及び核酸は、天然の供給源から単離することができ、又は起源が全体的若しくは部分的に合成したものでもよい。
望ましい実施形態において、ターゲッティング試薬は、対象の標的細胞上、又は標的部位で発現されている抗原に対する特異性に基づいて選択される、抗体又は抗体断片である。多種多様の腫瘍特異性又は他の疾病特異性抗原が同定されており、それらの抗原に対する抗体が使用され、又は腫瘍やその他の疾患の処置におけるその使用が提案されている。当該技術分野において知られている抗体を、特にその標的抗原に関わる疾病の処置のために、本発明のコンジュゲートに使用することができる。本発明の抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートを標的化することのできる標的抗原（及びそれらの関連疾患）の限定的でない例として、：Ｈｅｒ２（乳癌）、ＣＤ２０（リンパ腫）、ＥＧＦＲ（固体腫瘍）、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫）、ＣＤ５２（慢性リンパ球性白血病）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病）、ＣＤ４（リンパ腫、リウマチ様関節炎を含む自己免疫疾患）、ＣＤ３０（非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫）、Ｍｕｃ１８（黒色腫）、インテグリン（固体腫瘍）、ＰＳＭＡ（前立腺癌、良性前立腺過形成）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ＣＤ１１ａ（乾癬）、ＣＤ８０（乾癬）、ＣＤ２３（喘息）、ＣＤ４０Ｌ（免疫血小板減少性紫斑病）、ＣＴＬＡ４（Ｔ細胞リンパ腫）及びＢＬｙｓ（全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患）が挙げられる。
それらの実施形態において、認識部分が蛋白質又は抗体である場合、蛋白質の表面上で利用できるいずれかの反応性ペプチド残基によって、蛋白質を表面若しくは自己組織化単層膜（ＳＡＭ）成分に繋留するか、又はスペーサーアームを介して結合させることができる。望ましい実施形態において、反応性基は、アミン類又はカルボン酸塩類である。特に望ましい実施形態において、反応性基は、リジン残基のε−アミン基である。更に、これらの分子は、非特異的相互作用（例えば、化学吸着、物理吸着）によって、基質又はＳＡＭの表面に吸着させることができる。
抗体である認識部分は、蛋白質、ペプチド、核酸、糖類、又は薬物、除草剤、殺虫剤、工業用化学薬剤及び化学兵器などの小分子である分析物を認識するのに使用することができる。特異分子に対する抗体を産生させる方法は、当業者に公知である。米国特許第５／１４７，７８６号（１９９２年９月１５日にＦｅｎｇらに付与）；第５／３３４，５２８号（１９９４年８月２日にＳｔａｎｋｅｒらに付与）；第５／６８６，２３７号（１９９７年１１月１１日にＡｌ−Ｂａｙａｔｉ、Ｍ．Ａ．Ｓ．に付与）；及び第５／５７３，９２２号（１９９６年１１月１２日にＨｏｅｓｓらに付与）を参照されたい。表面に抗体を付着するための方法もまた、当該技術分野において知られている。Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１２：１９４４−１９４６（１９９６）を参照されたい。
ターゲッティング試薬は、利用できるいずれかの反応性基によって、本発明のリンカーに付着させることができる。例えば、ペプチドは、アミン、カルボキシル、スルフヒドリル又はヒドロキシル基を介して付着させることができる。このような基は、ペプチド末端に、又はペプチド鎖の内部の部位に存在しうるものである。核酸は、塩基上の反応性基（例えば、環外アミン）、又は糖部上の利用できるヒドロキシル基（例えば、３’−又は５’−ヒドロキシル）を介して付着させることができる。ペプチド及び核酸鎖は、その鎖上への適切な反応性基の付着を可能とする１以上の部位で、更に誘導体化することができる。Ｃｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３０３１−３０３９（１９９６）を参照されたい。
ペプチド又は核酸が完全又は部分的に合成分子である場合、反応性基又はマスクされた反応性基を、合成のプロセスの際に組み込むことができる。ペプチド及び核酸の双方に反応性基を組み込むのに適切な、多くの誘導体化されたモノマーが当業者に知られている。例えば、ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ，合成，ＢＩＯＬＯＧＹ、２巻：「ペプチド合成の特別法」、Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｌｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい。多くの有用なモノマーが市販されている（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ等）。このマスクされた基は、合成後に除去することができ、その時点で本発明の化合物の成分との反応に利用可能になる。
核酸ターゲッティング試薬の例として挙げられるのは、アプタマー、アンチセンス化合物、及び三重らせん体を形成する核酸である。望ましくは糖残基のヒドロキシル基、塩基由来のアミノ基、又はヌクレオチドのリン酸の酸素原子が、ヌクレオチド系ターゲッティング試薬をサイトトキシンにカップリングさせるのに必要な化学官能基として利用される。しかしながら、当業者であれば、他の「非天然」反応性官能基を従来の技術によって核酸に付加できることを容易に理解するであろう。例えば、糖部分のヒドロキシル基を、当該技術分野において公知である技術を用いてメルカプト又はアミノ基に変換することができる。
アプタマー（すなわち核酸抗体）は、特異的な分子標的に結合する、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡ分子である。概してアプタマーは、血液中を循環している標的のプールへの結合により、分子標的、例えば蛋白質の作用を阻害することによって機能する。アプタマーは化学官能基を保有しており、そのため本願明細書に記載のようにサイトトキシンに共有結合できる。
小分子薬剤、代謝物、補因子、毒素、糖系薬剤、ヌクレオチド系薬剤、糖蛋白質等を含む多種多様な分子標的とアプタマーとが、非共有的であるが特異的な会合をすることができるが、分子標的としては、血清蛋白質、キニン類、エイコサノイド類、細胞表面分子等を含め、蛋白質又はペプチドを含んでいるのが望ましい。アプタマーの例として、ギレアデ抗トロンビンインヒビターＧＳ５２２及びその誘導体（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。Ｍａｃａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７４５−９（１９９３）；Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５５：５６４−５６６（１９９２）及びＷａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１８９９−９０４（１９９３）も参照されたい。
所定の生体分子に対して特異的なアプタマーは、当該技術分野において知られている技術を用いて同定することができる。例えば、Ｔｏｏｌｅら、（１９９２）ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１４８４３号；Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ（１９９１）ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１９８１３号；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（１９９２）ＰＣＴ国際公開第９２／０５２８５号；並びにＥｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０）を参照されたい。手短に説明すると、これらの技術には、望ましくは、分子標的とオリゴヌクレオチドの無作為な混合物とのコンジュゲート生成が含まれ；アプタマー−分子標的コンジュゲートを、非複合オリゴヌクレオチドから分離し；アプタマーを分離したコンジュゲートから回収して増幅させ；このサイクルを繰り返し、分子標的に対する親和性が最も高いアプタマー配列を同定する。
遺伝子の不適当な発現に起因する疾患に対して、このような遺伝子の発現の特異的な阻止又は低減が、理想的な治療を具現する。原則的には、特定の遺伝子産物の生産を、ｍＲＮＡの利用しやすい配列、若しくはプレｍＲＮＡプロセッシングに必須の転写物内の配列に相補的な、又はその遺伝子自体に含まれる配列に相補的な一本鎖デオキシヌクレオチド又はリボデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、阻害、低減、又は遮断するとよい。遺伝子制御のためのこのパラダイムは、アンチセンス又はアンチジーン阻害と称されることが多い。本発明のようなアルキル化剤の核酸へのコンジュゲーションによって、更なる有効性が付与される。
アンチセンス化合物は、特定の蛋白質の産生を引き起こすｍＲＮＡに結合及び不活性化するか、又はその生産を防ぐように設計された核酸である。アンチセンス化合物として、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチド、又はそれらのアナログで、個々のｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズすることができ、そしてそのｍＲＮＡ種の転写及び／若しくはＲＮＡプロセッシング並びに／又はコードされたポリペプチドの翻訳を防ぎ、それによりコードされたそれぞれのポリペプチドの量の低減をもたらすものが挙げられる。Ｃｈｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１０００６−１００１０（１９８９）；Ｂｒｏｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１８（１９９０）；Ｌｏｒｅａｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６（１９９０）；Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇら、ＷＯ９１／１１５３５；ＷＯ９１／０９８６５；ＷＯ９１／０４７５３；ＷＯ９０／１３６４１；ＷＯ９１／１３０８０、ＷＯ９１／０６６２９、及びＥＰ３８６５６３を参照。それらの優れた標的特異性及び選択性のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のサイトトキシンなどの治療薬を所望の分子標的に輸送するのに有用である。
他にも、核酸が、三重らせん形成を介して二重鎖ＤＮＡに結合し、転写及び／又はＤＮＡ合成を阻害できることが報告されている。三重らせん化合物（三本鎖薬剤とも称する）は、二本鎖ＤＮＡの配列に結合するオリゴヌクレオチドで、例えば、ＨＩＶ及び単純ヘルペスウイルスなどのウイルス遺伝子、並びに癌遺伝子などの病原遺伝子の転写を選択的に阻害することが意図されているものであり、すなわち、それらは細胞核にて蛋白質の生産を停止させる。これらの薬剤は、細胞のゲノム内の二本鎖ＤＮＡに直接結合し、三重らせんを形成して細胞が標的蛋白質を作るのを妨げる。例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１０５９０、ＷＯ９２／０９７０５、ＷＯ９１／０６６２６号、及び米国特許第５，１７６，９９６号を参照されたい。このように、本発明のサイトトキシンは、三重らせん体を形成する核酸配列とコンジュゲートされうる。
核酸（例えば、アンチセンス化合物及び三重らせん薬剤）の部位特異性は、ホスホジエステル結合の修飾、又はオリゴヌクレオチド末端の化学的修飾によって著しく影響を受けるものではない。このため、これらの核酸を化学的に修飾して、全体としての結合安定性を増強し、化学的分解に対する安定性を増大し、オリゴヌクレオチドが細胞内に輸送される速度を高めて、分子に化学的反応性を与えることができる。アンチセンス療法において有用な種々の核酸を構築する一般的な方法が、ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６（１９８８）、及びＳｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９−２６６８（１９８８）によって総説されている。したがって、望ましい実施形態において、本発明のサイトトキシンは、ホスホジエステル結合の修飾によって核酸とコンジュゲートされる。
更に、本発明のサイトトキシンを担持するアプタマー、アンチセンス化合物及び三重らせん薬剤は、関連標的配列への特異的ハイブリダイゼーション又は会合が、そのオリゴヌクレオチドの機能が保持される限りにおいて、ヌクレオチドの置換、付加、削除、又は転位も含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、それらの天然型ホスフェートジエステル対応物よりも、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性が高く、またこのためｉｎ ｖｉｖｏでの持続性が高くて有効性にすぐれていることが期待されるホスホロチオエートアナログが用いることも可能である（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：２５９−２６７（１９９０）を参照されたい）。オリゴヌクレオチドのホスホルアミデート誘導体もまた、相補的ポリヌクレオチドに結合して、共有結合により付着したリガンド種を適合させるという更なる能力を有することが知られており、これも本発明の方法に適すると考えられる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１１）：４８３１（１９８８）を参照されたい。
実施形態によっては、アプタマー、アンチセンス化合物及び三重らせん薬剤は、Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むものとされる（欧州特許出願公開第３６０６０９号）。またキメラオリゴヌクレオチドも使用してよい（Ｄａｇｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４７５１（１９９０））。用途によっては、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び三重らせんはポリアミド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１５０６５号）又は他のカチオン誘導体（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０−４４７１（１９８８））を含んでいてもよい。他の用途では、１以上のホスホジエステル結合が、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０５１８６及び９１／０６５５６号に記載されているような２〜４原子長のヌクレオシド間結合などの等配電子基、又はホルムアセタール基（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：７７６７−７７６８（１９９１））若しくはアミド基（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１））で置換されたオリゴヌクレオチドを利用してもよい。
更に、ヌクレオチドアナログ、例えば、糖又は塩基が化学的に修飾されているものを本発明で用いることもできる。プリン及びピリミジンの「類似」型は、概して当該技術分野において知られているものであり、その多くが化学療法剤として使用される。例示的であるが包括的ではないアナログとして挙げられるのは、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンである。更に挙げられるのは、ハロゲン化塩基による従来の塩基である。また、塩基の２’−フラノース位は、荷電していない大型基の置換基を有しうる。荷電していない大型基の例として、分枝状アルキル、糖類及び分枝状糖類が挙げられる。
末端修飾でも、サイトトキシンを核酸にコンジュゲートして、細胞型特異性、薬物動態、核透過性、及びオリゴヌクレオチド医薬に対する絶対的細胞取り込み速度を調整する、有用な手順が提供される。例えば、サイトトキシンの共有結合による付着を可能とする、５’及び３’端にて反応性基を付加させる置換基のアレイが知られている。例えば、ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ：ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ ＯＦ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、（１９８９）Ｃｏｈｅｎ、編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ＰＲＯＳＰＥＣＴＳ ＦＯＲ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＦＯＲ ＣＡＮＣＥＲ ＡＮＤ ＡＩＤＳ、（１９９１）、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ、編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；ＧＥＮＥ ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ：ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＮＡ ＡＮＤ ＤＮＡ、（１９９２）Ｅｒｉｃｋｓｏｎ及びＩｚａｎｔ、編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＮＡ ＡＮＤ ＤＮＡ、（１９９２）、Ｍｕｒｒａｙ、編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓを参照されたい。アンチセンス化合物に関連する一般的な方法については、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＮＡ ＡＮＤ ＤＮＡ、（１９８８）、Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ、編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
検出可能な標識
本発明の化合物及び方法に関連して使用される特定の標識又は検出可能な基は、本発明の化合物の活性又は有用性を大幅に妨げない限り、本発明にとって重要ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的性質を有するいずれのものでもよい。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野で充分に開発されており、一般的に、このような方法で、有用なほとんどの標識はいずれも本発明に適用することができる。ゆえに標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な組成物のいずれでもよい。本発明において有用な標識として、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアン酸塩、テキサスレッド、ローダミン等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びその他のＥＬＩＳＡで一般に使用されるもの）、並びに金コロイド又は着色ガラス若しくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）などの比色標識が挙げられる。
標識は、当該技術分野において公知である方法に従って、本発明の化合物に直接又は間接的にカップリングさせればよい。前述のとおり、多種多様な標識が使用可能であり、その標識の選択は、必要とされる感度、化合物とのコンジュゲーションの容易性、安定性、利用可能な器具及び廃棄の規定に従い行われる。
本発明の化合物が検出可能な標識にコンジュゲートされる場合、標識は、望ましくは放射活性同位体、蛍光剤、蛍光剤前駆物質、発色団、酵素及びその組み合わせからなる群より選択される要素である。抗体に様々な基をコンジュゲートするための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、抗体にコンジュゲートされることが多い検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼなどの酵素である。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。概して、リガンド分子（例えば、ビオチン）がコンジュゲートの成分に共有結合される。リガンドは次いで、例えば、ストレプトアビジンで固有に検出可能な分子、又は検出可能な酵素、蛍光化合物、若しくは化学発光化合物など、シグナリング系のいずれかの分子に共有結合により結合する。
本発明のコンジュゲートの成分を、例えば酵素又はフルオロフォアとのコンジュゲーションよってシグナルを発生する化合物に直接コンジュゲートすることもできる。標識として対象となる酵素は、主にヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドレダクターゼ、とりわけペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノールが挙げられる。使用しうる種々の標識化又はシグナル発生システムの総括については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
標識を検出する手段は、当業者に公知である。よって、例えば標識が放射性標識である場合、検出のための手段として、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーのような写真用フィルムが挙げられる。標識が蛍光剤標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、その結果生じた蛍光を検出することで検出を行うとよい。蛍光は、目視、写真用フィルム、電荷結合素子（ＣＣＤ）などの電子的検出器の使用、又は光電子増倍管等により検出するとよい。同様に、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果生じる反応産物を検出することによって、酵素標識を検出してもよい。最後に、単純な比色標識を用い、標識に由来する色を観察することによって簡単に検出してもよい。このような種々のディップスティックアッセイでは、コンジュゲートされた金は淡紅色に見え、一方コンジュゲートされた様々なビーズはそのビーズの色に見える。
蛍光剤標識は、取り扱い上必要とされる注意事項がほとんどなく、かつ高効率可視化技術（コンピュータを含む集積システムにおける解析用の画像のデジタル化を含めた光学的解析）に適応するという利点を有するため、現在はこの方法が望ましい。望ましい標識は、望ましくは、高感度、高安定性、低バックグラウンド、低環境感度、及び標識化における高特異性、の１つ以上の特徴を有するのが望ましい。多くの蛍光剤標識が、ＳＩＧＭＡ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、更には当業者に公知の他の業者から市販されている。更に、当業者であれば特定の用途に適切なフルオロフォアをどのように選択するかを考察するはずであり、それが商業的に容易に入手できない場合は、必要なそのフルオロフォアをデノボ合成、又は市販の蛍光化合物を合成的に修飾して所望の蛍光剤標識を調製するであろう。
本発明では、小分子フルオロフォアに加え、天然の蛍光蛋白質、及びかかる蛋白質の修飾アナログが有用である。このような蛋白質として、例えば刺胞動物の緑色蛍光蛋白質（Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３−８０８（１９８２）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、７２Ｂ：７７−８５（１９８２））、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｓｃｈｅｒｉ株由来の黄色蛍光蛋白質（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：５５０９−１５（１９９０））、渦鞭毛藻類Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のペリジニン−クロロフィル（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：６７３：７７（１９９４））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどの海生シアノバクテリア由来のフィコビリン蛋白質、例えば、フィコエリトリン及びフィコシアニン（Ｗｉｌｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６−３５（１９９３））等が挙げられる。
概して、サイトトキシンとターゲッティング（又はその他）薬剤と、任意にスペーサー基との結合を形成する前に、化学官能基の少なくとも１つが活性化されると考えられる。当業者であれば、ヒドロキシ、アミノ、及びカルボキシ基を含む種々の官能基を、種々の標準法及び条件を用いて活性化できることを想定するであろう。例えば、サイトトキシン又はターゲッティング試薬のヒドロキシル基をホスゲンで処置して対応するクロロホルメートを形成するか、又はｐ−ニトロフェニルクロロホルメートで対応する炭酸塩を形成することで活性化できる。
望ましい実施形態において、本発明は、カルボキシル官能基を有するターゲッティング試薬を活用する。カルボキシル基は、例えば対応するハロゲン化アシル又は活性エステルへの変換によって活性化されうる。この反応は、Ｍａｒｃｈ、前出、３８８〜８９頁に例示された種々の条件下にて実施するとよい。望ましい実施形態において、ハロゲン化アシルは、カルボキシルを含む基と塩化オキサリルとの反応で調製される。活性化された薬剤を、サイトトキシン又はサイトトキシン−リンカーアームの組み合わせと反応させて、本発明のコンジュゲートを形成させる。当業者であれば、カルボキシルを含むターゲッティング試薬の使用は単なる例示にすぎず、多くの他の官能基を有する薬剤を本発明のリンカーにコンジュゲートできることに想到するであろう。
反応性官能基
例示を明瞭にするため、以下では本発明のサイトトキシンのターゲッティング試薬へのコンジュゲーションに焦点を絞る。その焦点は、本発明の実施形態の１つを例証するものであり、その他の形態は当業者によって容易に想到されると考えられる。なお、単一の実施形態に議論の焦点を絞ることにより、本発明がいささかも限定されるものではない。
望ましい本発明の化合物は、反応性官能基を担持し、これは概して置換若しくは非置換アルキル又はヘテロアルキル鎖上に位置しており、それらが別の分子種への付着を容易にする。反応性部分に対する好都合な位置は、鎖の末端である。
本発明を実施する上で有用な反応性官能基及び反応区分は、バイオコンジュゲートの分野において公知のものである。反応性官能基は保護されても保護されなくてもよく、その部分の保護特性は有機合成の技術分野において公知の方法により変化させてもよい。反応性サイトトキシンアナログと共に得られる、望ましい反応の区分は、比較的穏やかな条件下にて進行するものである。これらには、求核置換（例えば、アミン類及びアルコール類と、アシルハロゲン化物、活性エステル類との反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、並びに炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子多価結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールズ・アルダー付加）の反応が挙げられるが、これらに限定されない。これら又は他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６；及びＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２に報告されている。
反応型の例として、カルボキシル基及びその様々な誘導体の反応型が挙げられ、その例としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール類、チオエステル類、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルが挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロキシル基は、エステル、エーテル、アルデヒド等に変換することができる。ハロアルキル基は例えば、アミン、カルボキシルアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、又はアルコキシドイオンとの反応によって新しい種へと変換される。ジエノフィル（例えば、マレイミド）基は、ディールズ・アルダー反応に関与する。アルデヒド又はケトン基は、イミン類、ヒドラゾン類、セミカルバゾン類若しくはオキシム類に、又はグリニヤール付加若しくはアルキルリチウム付加などの機構を介して変換することができる。スルホニルハロゲン化物は、容易にアミンと反応して、例えばスルホアミドを形成する。アミン又はスルフヒドリル基は、例えば、アシル化、アルキル化、又は酸化される。アルケン類は、環化付加、アシル化、マイケル付加等を使用して、新しい種のアレイに変換することができる。エポキシド類は、アミン類及びヒドロキシル化合物と容易に反応する。
当業者であれば、これらの多くの結合が、種々の方法及び条件を使用して形成させうることを容易に理解するであろう。エステルの調製については、例えば、Ｍａｒｃｈ、前出、１１５７を参照；チオエステルについては、Ｍａｒｃｈ、前出、３６２−３６３、４９１、７２０−７２２、８２９、９４１、及び１１７２を参照；炭酸塩については、Ｍａｒｃｈ、前出、３４６−３４７を参照；カルバミン酸塩については、Ｍａｒｃｈ、前出、１１５６−５７を参照；アミドについては、Ｍａｒｃｈ、前出、１１５２を参照；尿素及びチオ尿素については、Ｍａｒｃｈ、前出、１１７４を参照；アセタール及びケタールについては、Ｇｒｅｅｎｅら、前出、１７８−２１０及びＭａｒｃｈ、前出、１１４６を参照；アシルオキシアルキル誘導体については、ＰＲＯＤＲＵＧＳ：ＴＯＰＩＣＡＬ ＡＮＤ ＯＣＵＬＡＲ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ、Ｋ．Ｂ．Ｓｌｏａｎ、編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２を参照；エノールエステルについては、Ｍａｒｃｈ、前出、１１６０を参照；Ｎ−スルホニルイミド酸塩については、Ｂｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１：２０６６（１９８８）を参照；無水物については、Ｍａｒｃｈ、前出、３５５−５６、６３６−３７、９９０−９１、及び１１５４を参照；Ｎ−アシルアミドについては、Ｍａｒｃｈ、前出、３７９を参照；Ｎ−マンニッヒ塩基については、Ｍａｒｃｈ、前出、８００−０２、及び８２８を参照；ヒドロキシメチルケトンエステルについては、Ｐｅｔｒａｃｅｋら、Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５０７：３５３−５４（１９８７）を参照；ジスルフィドについては、Ｍａｒｃｈ、前出、１１６０を参照；ホスホネートエステル及びホスホンアミデート類。
反応性官能基は、それらが反応に関与又は干渉することのないように、脱保護又は選択されることができる。あるいは、反応性官能基は保護基の存在によって、反応への関与から保護されうる。当業者であれば、選択した反応条件で特定の官能基を干渉からどのように保護するかを理解するであろう。有用な保護基の例については、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ 合成、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい。
望ましくは、標準的な化学技術を用い、それらのそれぞれの化学官能基を介してターゲッティング試薬をサイトトキシンに共有結合させる。任意に、リンカー又は薬剤は１以上のスペーサー基を介して薬剤にカップリングされる。スペーサー基は、組み合わせて使用する場合、同じか又は異なるものが使用可能である。
概して、サイトトキシンと反応性官能基とを連結させる前に、化学官能基、及び任意にスペーサー基、の少なくとも１つが活性化される。当業者であれば、ヒドロキシ、アミノ、及びカルボキシ基を含めた様々の化学官能基が、種々の標準法及び条件を用いて活性化できることを理解するであろう。望ましい実施形態において、本発明は、反応性官能基としてカルボキシル官能基を含む。カルボキシル基は、以上に記載のとおり活性化するとよい。
医薬組成物及び投与
別の望ましい実施形態において、本発明は、本発明の化合物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
付加塩又はその水和物などの医薬的に許容される担体を含む、本願明細書に記載の化合物は、多種多様な投与の経路又は態様を使用して患者に投与することができる。望ましい投与の経路として、吸入、経皮、経口、直腸内、経粘膜、経腸及び非経口投与、更に筋肉内、皮下及び静脈内注射が挙げられるが、これらに限定されない。望ましくは、標的部分として抗体又は抗体断片を含んでいる本発明のコンジュゲートは、非経口的に投与され、更に望ましくは静脈内に投与される。
本発明において、「投与する」又は「投与」の用語は、化合物を、その意図する作用部位に直接及び間接的に輸送するためのあらゆる手段を包含することが意図される。
本願明細書に記載の化合物、又は医薬的に許容される塩、及び／若しくはその水和物は、単体で、本発明の他の化合物と組み合わせて、及び／又は他の治療薬と組み合わせたカクテルにて投与してもよい。当然、本発明の化合物と共に投与できる治療薬の選択は、部分的に、処理される条件に依存する。
例えば、オートインデューサーに依存する生物によって引き起こされる症状を呈する患者に投与する場合、本発明の化合物は、一般的にその疾病に伴う疼痛、感染及び他の症状及び副作用を処置するのに使用される薬剤を含有する混合液にて投与することができる。このような薬剤として、例えば、鎮痛薬、抗生物質等が挙げられる
癌治療を受けている患者に投与する場合、化合物は、抗癌剤及び／又は捕捉の増強剤を含有するカクテルにて投与するとよい。また、化合物は、制吐剤、放射性防護剤等の放射線療法の副作用を処置する薬剤を含有するカクテルにて投与してもよい
本発明の化合物と一緒に投与することのできる増強剤として、例えば、三環系抗うつ剤（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドキセピン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキサピン及びマプロチリン）；非環系抗うつ剤（例えば、セルトラリン、トラゾドン及びシタロプラム）、Ｃａ２＋拮抗剤（例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ニトレンジピン及びカロベリン）、アンホテリシン、トリパラノールアナログ（例えば、タモキシフェン）、抗不整脈剤（例えば、キニジン）、降圧剤（例えば、レセルピン）、チオール枯渇剤（例えば、ブチオニン及びスルホキミン）、並びにカルシウムロイコボリンが挙げられる。
本発明の活性化合物（単数又は複数種）は、それ自体で、又は活性化合物（単数又は複数種）を１以上の医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と混和している医薬組成物の形態で投与される。本発明により使用する医薬組成物は、望ましくは、賦形剤及び助剤であって、医薬上使用することのできる組成物への活性化合物の加工を円滑にするものを含む、１以上の生理的に許容される担体を使用して従来の方法で製剤化する。適切な剤形は、選択した投与の経路に依存する。
経粘膜投与の場合、浸透すべきバリアに適合した浸透剤が組成物に使用される。このような浸透剤は、概して、当該技術分野において公知である。
経口投与の場合、活性化合物（単数又は複数種）を、当該技術分野において公知の医薬的に許容される担体と組み合わせることによって、化合物を容易に製剤化することができる。このような担体を用い、患者による経口摂取用に、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤化することが可能となる。固体賦形剤を用い、得られる混合物を任意に粉砕し、必要に応じて望ましい助剤を添加した後に、顆粒の混合物を処理することによって錠剤又は糖衣錠コアを得て、経口用の医薬調製物を得ることができる。望ましい賦形剤は、具体的には、乳糖、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。必要に応じ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩等といった崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには、望ましいコーティングが施される。この目的のためには、濃縮糖溶液を用いるとよく、これは任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び望ましい有機溶媒又は溶媒混合液を含有しうる。識別のため、又は活性化合物の用量の異なる組み合わせの特徴を示すために、錠剤又は糖衣錠コーティングに染料又は色素を添加してもよい。
経口的に使用することのできる医薬調製物として、ゼラチンで作ったプッシュフィット式カプセル剤や、ゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作った密封軟カプセル剤が挙げられる。プッシュフィット式のカプセル剤は、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに、任意に安定化剤と混和している有効成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの望ましい液剤中に溶解又は懸濁するとよい。更に、安定化剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は、このような投与に望ましい薬用量とされるべきである。
口腔内投与の場合、組成物は従来法にて製剤化される錠剤又はロゼンジ剤の形態を取るとよい。
吸入による投与の場合、本発明に使用する化合物は、エアロゾルスプレー付与の形態で、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の望ましいガスなどの望ましい噴霧剤を共に使用して圧縮パック又は噴霧器から輸送するのが便宜的である。加圧エアロゾルの場合、単位用量を輸送するバルブを設けることにより、薬用量単位を決定することができる。吸入器又は通気器に用いる例えばゼラチン製のカプセル剤及び薬包は、化合物と、望ましい粉末基剤、例えば乳糖又はデンプンとを粉体混合物として含む製剤とするとよい。
化合物は、例えば大量瞬時投与又は持続注入によるなど、注射による非経口的投与用に製剤化してもよい。注射が、本願発明の組成物にとって望ましい投与の方法である。注射用製剤は、単位剤形にて、例えば、保存剤を添加して多服用量容器中に、又はアンプル中に提供されるとよい。組成物は、油性又は水性溶剤の懸濁剤、溶液剤、又は乳化剤などの形態を取ってもよく、懸濁、安定化などの製剤用薬剤を含んでもよく、及び／又は架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩、などといった分散剤を添加してもよい。
非経口的投与用の医薬組成物として、可溶型の活性化合物の水溶液が挙げられる。また、活性化合物の懸濁剤を、適当な油性注射用懸濁剤として調製してもよい。望ましい親油性溶媒又は溶剤として、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有してもよい。懸濁剤は、望ましい安定化剤、又は化合物の溶解性を高めて高濃縮溶液の調製を可能とする薬剤も任意に含有してよい。注射用には、水溶液中、望ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの、生理的に適合性の緩衝液中で、本発明の薬剤を製剤化するとよい。
あるいは、有効成分は、使用前に望ましい溶剤、例えば、滅菌発熱性物質除去水で構成するための粉末形態としてもよい。
化合物は更に、例えば従来から用いられているココアバター又はその他のグリセリド類などの座剤の基剤を含有させて、座剤又は滞留浣腸剤などの直腸内投与剤にも製剤化しうる。
以上に記載の製剤に加えて、化合物はデポ製剤として製剤化してもよい。このような長時間作用型の製剤は、埋没又は経皮的輸送（例えば、経皮的、若しくは筋肉内）、筋肉内注射又は経皮パッチ剤によって投与しうる。このようにして、例えば、望ましいポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容されるオイルの乳剤として）又はイオン交換樹脂で、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、化合物を製剤化しうる。
医薬組成物は、適切な固体又はゲル状担体又は賦形剤を含んでもよい。このような担体又は賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
望ましい医薬組成物は、静脈内注射などの注射用に製剤化された組成物であり、医薬組成物の総重量１００重量％に対して約０．０１％〜約１００重量％の薬剤−リガンドコンジュゲートを含む。薬剤−リガンドコンジュゲートは、抗体−サイトトキシンコンジュゲートであってよく、この抗体は、特定の癌に標的化するように選択されている。
ライブラリー
更に本発明の範囲に包含されるのは、サイトトキシン、サイトトキシン−リンカー及びサイトトキシンの薬剤−リンカーコンジュゲート、並びに本発明のリンカーのライブラリーである。典型的なライブラリーには、少なくとも１０の化合物、より望ましくは少なくとも１００の化合物、更に一層望ましくは少なくとも１０００の化合物、及び更になお望ましくは少なくとも１００，０００の化合物が含まれている。ライブラリーは、例えば細胞毒性、酵素、又は他の切断試薬によるリンカーの切断などといった特定の性質につき容易に解析される形態にある。形態の例としては、チップ形式、マイクロアレイ等が挙げられる。
平行であるか、又は組合せで、合成はその原発性の目的としてすべて一般の特徴を共有する多様な分子のライブラリの生成を有する。足場としてこの説明の全体にわたって指される。足場分子の可変的な部分の各々で異なる部分を置換することによって、ライブラリでｅｘｐｌｏｒａｂｌｅな空間の量は、増大する。理論及び現代の医薬品化学は、提供された生物学的目標に対して提供された化合物の有効性を決定する際の鍵となる因子として、占有された空間の概念を主唱する。分子（大部分の目標とされた空間を調査する）の多様なライブラリを作成することによって、非常に有効な鉛化合物を開発するオッズは、劇的に増加する。
平行合成は通常、ポリマー樹脂などの固相支持体上で行う。足場、すなわち他の望ましい中間体は、化学リンカーによって切断可能に樹脂に係留される。粒子に係留された状態で、足場を修飾する反応を行う。試薬及び／又は反応条件の変更によって、各々のライブラリーの特徴となる構造上の多様性が生じる。
「小」分子（２００〜１０００の分子量の非オリゴマー）の平行合成は、１９９０年より前にはほとんど試みられていなかった。例えば、Ｃａｍｐｓら、Ａｎｎａｋｓ ｄｅ Ｑｕｉｍｉｃａ、７０：８４８（１９９０）を参照されたい。近年、Ｅｌｌｍａｎｎは、いくつかのプロスタグランジンとβターン模倣物と共に、１１のベンゾジアゼピンアナログを固相支持で平行（「コンビナトリアル」とも称される）合成することを開示した。これらの開示は、米国特許第５，２８８，５１４号に例証されている。小分子の平行合成の、関連する別の開示は、米国特許第５，３２４，４８３号にも認められる。この特許は、各々１６の異なる足場にある４〜４０の化合物の平行合成を開示している。Ｃｈｅｎらも、有機合成ストラテジーを応用し、ポリマー支持体上の多工程プロセスを使用して合成した非ペプチドライブラリーを開発している（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１６：２６６１−２６６２（１９９４））。
一旦、特有の化合物のライブラリーが調製されれば、出発点として自己誘導物質のライブラリーを使用し、本願明細書に記載の方法を用いて免疫コンジュゲート又は抗体のライブラリーを調製することができる。
キット
別の特徴において、本発明は、本発明の化合物又は組成物の１以上と、その化合物又は組成物を使用するための注意表示を含むキットを提供する。望ましい実施形態において、本発明は、本発明のリンカーアームを別の分子にコンジュゲートするためのキットを提供する。キットは、リンカー及びリンカーを特定の官能基に付着させるための注意表示を備えている。キットはまた、細胞毒性薬剤、ターゲッティング試薬、検出可能な標識、医薬用の塩、又は緩衝液の１つ以上を備えていてもよい。キットは更に、容器、１つ以上のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、又はシリンジを任意に備えていてもよい。キットに関する他の様式は当業者にとって明らかであり、本発明の範囲に含まれる。
精製
別の望ましい実施形態において、本発明は、リガンドＸ２に結合する、本発明のリガンド−サイトトキシンに対する分子標的を単離するための方法を提供する。その方法は、望ましくは、標的を含む細胞性製剤を固定化化合物に接触させ、これによって受容体と固定化化合物との間でコンジュゲートを形成することを含む。
本発明のサイトトキシンは、当該技術分野で公知のいずれかの手段によって、アフィニティ支持体上に固定化することができる。あるいは、本発明のリンカーの１つ以上を使用してサイトトキシンを固定化することができる。
更に別の望ましい実施形態において、本発明は、本発明のリンカーを含む、アフィニティ精製マトリックスを提供する。
標的を単離する本発明の方法は、望ましくは、１つ以上のアフィニティクロマトグラフィー技術を利用するものである。アフィニティクロマトグラフィーで、生物学的分子又はバイオポリマーなどの種の、特定の支持構造体の認識部位に対する特異性の高い結合能を利用することにより、効率よく単離することが可能になる。アフィニティクロマトグラフィー支持体、架橋材料、リガンド、並びにそれらの製剤及び用途などのこのような話題を含め、アフィニティクロマトグラフィーの主題についての記事、モノグラフ及び本などの文献が多く存在する。列挙すべきそれらの参照文献として：Ｏｓｔｒｏｖｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：３５７−７１（１９９０）；Ｆｅｒｍｅｎｔ，Ｂｉｏｅｎｇ．７０：１９９−２０９（１９９０）、Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４９２：４３１−６９（１９８９）；「ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィーによる酵素の精製」Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１８４：３３５−４５（１９８０）；Ｆａｒｏｏｑｉ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇ．、４：４４１−２（１９７８）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ、５（９）：５６４−７１（１９７５）；Ｇｕｉｌｆｏｒｄら、ＰＲＡＣＴ．ＨｌＧＨ ＰＥＲＦＯＲＭ． ＬｌＱ．ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ（編）、１９３−２０６（１９７６）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐ．Ｉｍｐｒｏｖ．Ｂｌｏｏｄ Ｐｌａｓｍａ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、Ｓａｎｄｂｅｒｇ（編）、４２２−３５；（１９７７）「酵素のアフィニティクロマトグラフィー」、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．２５−３８，（１９７７）（出版１９７８）；及びＡＦＦＩＮＩＴＹ クロマトグラフィー： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｄｅａｎら、（編）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５）が挙げられる。当業者は、本発明の材料を利用して特定のアフィニティクロマトグラフィー法を開発する際の指針とすることができる。
本発明の方法において、様々な化学構造のアフィニティクロマトグラフィー媒体を支持体として使用することができる。例えば、アガロースゲル及び架橋アガロースゲルは、それらの親水性により非特異的結合が比較的防止できるため、支持材料として有用である。他の有用な支持体として、例えば、微細孔性ガラス（ＣＰＧ）ビーズ、セルロース粒子、ポリアクリルアミドゲルビーズ、並びにデキストラン及びエピクロロヒドリンから作製されたセファデックス（登録商標）ゲルビーズが挙げられる。
薬剤−リガンドのコンジュゲート方法及び使用
上記の組成物及び構成物に加えて、本発明はまた、本発明の化合物及びコンジュゲートを利用して実施することができる数多くの方法も提供する。本願発明の薬剤−リガンドコンジュゲートを使用する方法として挙げられるのは、腫瘍細胞又は癌細胞の成長又は複製の停止又は阻止、癌の処置、前癌状態の処置、自己免疫抗体を発現する細胞の成長又は複製の停止又は阻止、自己免疫疾患の処置、感染症の処置、腫瘍細胞又は癌細胞の増殖の予防、癌の予防、自己免疫抗体を発現する細胞の増殖の予防、自己免疫疾患の予防、及び感染症の予防等が挙げられる。これらの使用方法には、哺乳動物又はヒトなどの患者動物に、有効量の薬剤−リガンドコンジュゲートを投与することが含まれる。本願明細書に記載の使用方法の多くにおいて望ましいリガンドとして、特定の腫瘍細胞、癌細胞、又は他の標的領域を標的化する抗体及び抗体断片が挙げられる。
本願発明の薬剤−リガンドコンジュゲートは、動物の癌、自己免疫疾患及び感染症を処置するのに有用である。医薬的に有効な量の本発明の組成物を用い、医薬的に許容されるように患者にその組成物を提供することによる、腫瘍を処置するための組成物及び方法が提供される。
本願発明は、癌の処置ため、及び動物での腫瘍細胞又は癌細胞の増殖の阻害のために特に有用である。癌、又は前癌状態として、腫瘍、転移、又は無秩序な細胞成長によって特徴付けられるいずれの疾病若しくは障害（これらに限定されない）が挙げられ、これを本願発明の薬剤−リガンドコンジュゲートの投与によって処置又は予防することができる。コンジュゲートは、薬剤を腫瘍細胞又は癌細胞に輸送する。一実施形態では、リガンドは、癌細胞又は腫瘍細胞関連抗原に特異的に結合又は会合する。リガンドの近傍に位置するため、例えば薬剤は、受容体媒介エンドサイトーシスにより、腫瘍細胞又は癌細胞内部に取り込まれうる。抗原は、腫瘍細胞若しくは癌細胞、又は腫瘍細胞若しくは癌細胞に関連した細胞外マトリックスタンパク質に結合することができる。一旦細胞内に入れば、リンカーは、腫瘍細胞又は癌細胞関連プロテアーゼによって加水分解的に切断され、これにより薬剤を放出する。放出された薬剤は、その後は自由に拡散し、細胞毒性活性を発揮する。他の実施形態では、薬剤は腫瘍細胞又は癌細胞の外側で薬剤−リガンドコンジュゲートから遊離する。その後が細胞を透過する。
当該リガンドは例えば、腫瘍細胞若しくは癌細胞、腫瘍細胞若しくは癌細胞の表面に存在する腫瘍細胞若しくは癌細胞の抗原、又は、腫瘍細胞若しくは癌細胞に関連する、細胞外マトリックスタンパク質である腫瘍細胞若しくは癌細胞の抗原と結合できる。当該リガンドは、特に特定の腫瘍細胞又は癌細胞タイプに合わせて設計できる。したがって、治療しようとする腫瘍又は癌のタイプに合わせて、リガンドを適宜選択することができる。
薬剤−リガンドコンジュゲートにより標的化されうる前癌状態の代表的な例として、化生、過形成、異形成、結腸直腸ポリープ、光線性角化症、光線性口唇炎、ヒトパピローマウイルス症、白斑症、扁平苔癬及びボーエン病が挙げられるが、これらに限定されない。
薬剤−リガンドコンジュゲートによって標識化されうる癌又は腫瘍の代表的な例として、肺癌、大腸癌、前立腺癌、リンパ腫、黒色腫、乳癌、卵巣癌、睾丸癌、ＣＮＳ癌、腎癌、腎癌、膵臓癌、胃癌、口腔癌、鼻腔癌、子宮頚癌及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。当業者には、薬剤で処置すべき腫瘍組織にその薬剤を標的化させるように、コンジュゲートで使用する特定の標的リガンドを選択できる（すなわち、腫瘍特異性抗原に対して特異的なターゲッティング試薬を選択する）ことが容易に明らかになるであろう。このような標的リガンドの例は、当該技術分野においてよく知られており、限定的でないその例として、乳癌の処置には抗Ｈｅｒ２、リンパ腫の処置には抗ＣＤ２０、前立腺癌の処置には抗ＰＳＭＡ、及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫に対して抗ＣＤ３０が挙げられる。
実施形態において、本発明は、細胞を死滅させる方法を提供する。この方法は、細胞に本発明の化合物の当該細胞を死滅させるのに充分な量を投与することを含む。望ましい実施形態において、化合物は、その細胞を担持している患者に投与される。更なる望ましい実施形態において、投与は、その細胞（例えば、細胞は腫瘍細胞でありうる）を含む腫瘍の成長を遅延又は停止させるのに有用である。成長を遅延させるための投与について、細胞の成長速度は、投与前の成長速度の少なくとも１０％は低くなるのが望ましい。更には、成長速度は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％遅延され、又は完全に停止するのが望ましい。
有効な投与量
本発明で使用するのに望ましい医薬組成物として、治療上有効な量、すなわち、意図した目的を成し遂げるのに有効な量の有効成分を含有している組成物が挙げられる。特定の用途に有効な実際の量はとりわけ、処置すべき状態に依存するものである。有効量の決定は、特に本願明細書の詳細な開示に鑑み、当業者が充分なしうる。
本願明細書に記載のいずれの化合物についても、治療上有効な量を最初に細胞培養アッセイにより調べることができる。標的血漿濃度は、細胞成長又は分裂を阻害することができる活性化合物（単数又は複数）の濃度となる。望ましい実施形態において、細胞活性は少なくとも２５％阻害される。又は、少なくとも約５０％、７５％、更には９０％以上の細胞活性の阻害を誘発できる活性化合物（単数又は複数）の標的血漿濃度が、現在のところ望ましい。患者における細胞活性の阻害の割合をモニターし、達成される血漿薬剤濃度の適切さを評価でき、所望の阻害割合が得られるように増減して薬用量を調整することができる。
当該技術分野において公知であるように、ヒトで使用するのに治療上有効な量は動物モデルから決定することもできる。例えば、ヒト用の投薬量は、動物で有効であると見出されている循環濃度を得るように製剤化できる。ヒトでの薬用量は、細胞阻害をモニターし、上記のように薬用量を増減して調整することができる。
治療上有効な投薬量は、類似の薬理学的活性を呈することが知られている化合物に対するヒトのデータから決定することもできる。適用される薬用量は、相対的な生物学的利用能、及び投与化合物の既知化合物と比較した作用強度に基づいて調整することができる。
上記の方法、及び当該技術分野において公知である他の方法に基づき、ヒトで最高の効能を達成する薬用量を調整することは、当業者が充分なしうる範囲内にある。
局所投与の場合、投与化合物の全身循環濃度は、特別に重要ではない。このような場合、意図した結果を得るのに有効な局部領域での濃度となるように、化合物を投与する。
異常な細胞性増殖に関わる疾病の予防及び／又は処置における使用のため、約０．００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の循環濃度が好ましく、更に約０．０１μＭ〜５μＭが望ましい。
本願明細書に記載の化合物の経口投与に対する患者の薬用量は、望ましくは約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より望ましくは約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、最も望ましくは約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲にある。患者の体重に換算すると、典型的な薬用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、更に望ましくは約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、最も望ましくは約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、例えば、５ｍｇ／ｋｇ／日、又は３ｍｇ／ｋｇ／日である。
少なくとも幾つかの実施態様では、患者の腫瘍成長を遅延又は阻害するのに必要な投与量は１μｍｏｌ／ｋｇ／日又はそれ以下であってもよい。例えば、患者への投与量は、薬剤又は薬剤コンジュゲート（例えば抗体−薬物コンジュゲート）で０．９、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５若しくは０．１μｍｏｌ／ｋｇ／日であるか、又はそれ以下の薬剤のモル数であってもよい。好ましくは、薬剤又は薬剤コンジュゲートを少なくとも５日間にわたり連日投与することにより、腫瘍の成長を抑止する。少なくとも幾つかの実施態様では、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスは、ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスであってもよい（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから市販）。
投与のその他の態様については、用量及び間隔を、処置すべき特定の臨床適応症に対して有効な投与化合物の血漿レベルをもたらすように、個々に調整することができる。例えば、一実施形態では、本発明による化合物は、１日に何度も、比較的高濃度で投与される。あるいは、本発明の化合物を最低有効量投与し、より頻度の少ない投与計画を用いることがより望ましい。これにより、個々の疾病の重症度に見合う治療計画が提供されることになる。
本願明細書における開示を応用して、実質的な毒性を引き起こさず、しかも特定の患者によって示される臨床的症状を処置するのに完全に有効な、治療法を計画することができる。この計画には、化合物の作用強度、相対的生物学的利用能、患者の体重、望まない副作用の存在及び重度、望ましい投与の形態及び選択薬剤の毒性プロファイルなどの因子を考慮することにより、活性化合物を注意深く選択することが含まれる。
本発明の化合物、組成物及び方法は、以下の実施例によって更に例証される。なお、これらの実施例は例示のために提供するものであり、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではない。
材料及び方法
以下の実施例においては、特に明記しない限り、温度は摂氏（℃）温度である。反応は室温又は常温で行われ（概して約１８〜２５℃の範囲）；溶媒の蒸発は６０℃までの浴槽温度において減圧（概して、４．５〜３０ｍｍＨｇ）下で回転蒸発器を使用して行い；反応後にＴＬＣを行い反応時間は例示目的のために提供され；融点は訂正せず；精製物は良好な１Ｈ−ＮＭＲ及び／又は微量分析データを示し；収率は例示目的のために提供され；以下の一般的な略記が使用される：ｍｐ（融点）、Ｌ（リットル）、ｍＬ（ミリリットル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｉｎ（分）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析）及びｈ（時間）。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ ３００ＭＨｚ分光計にて測定され、推定された構造式と一致した。化学シフトは、テトラメチルシランから１００万分率（ｐｐｍ）において表示された。電子スプレー質量スペクトルは、パーキン・エルマーＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ３６５質量分析計に記録された。基本的な分析は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＮＪによって行われた。フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルは、Ｅ．メルク等級（２３０−４００のメッシュ）を使用した。逆相ＨＰＬＣは、ＨＰ １１００又はバリアンＰｒｏＳｔａｒ ２１０において、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａの５μｍ Ｃ−１８（２）１５０ｍｍ×４．６ｍｍのカラム又はＶａｒｉａｎ Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ−ＭＶ ０．１μｍ Ｃ−１８ １５０ｍｍ×４．６ｍｍのカラムを用いて行われた。１ｍＬ／分の流速で、２５４ｎｍのＵＶで１５分にわたる０％〜５０％の緩衝液Ｂの勾配又は１０分にわたる１０％〜１００％の緩衝液Ｂの勾配によって検出した。なお、緩衝液Ａは２０ｍＭギ酸アンモニウム塩＋２０％アセトニトリル又は０．１％のトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液であり；緩衝液Ｂは２０ｍＭのギ酸アンモニウム塩＋８０％アセトニトリル又は０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液である。逆相ＨＰＬＣは、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ２１５計測器で、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ １５μｍ Ｃ−１８ ３００ｍｍ×７．８ｍｍカラムを用いて行った。
＜実施例１＞
１．１ａ 合成方法
方式２
方式３
方式４
方式５
方式６
１．１ｂ 化合物１の合成：Ｎ−［２’−（Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ）−エチル］−バリン ｔｅｒｔ−ブチルエステル
２（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ）エチルブロミド（１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）及びバリン ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．９３６ｇ、４．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１．８５ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を、一晩１００℃で撹拌した。反応混合液を濃縮し、残った物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィにより、酢酸エチル／ヘキサン（３／７）を用いて溶出し、油状物質（０．１６ｇ、１２％）として表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．９４（ｆｔ，６Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．４７３及び１．４７５（２ｓ，９Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），２．５１（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２２（ｍ，１Ｈ），３．３９及び４．１３（２ｂｔ，１Ｈ），５．００（ｂｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）２０５（Ｍ＋Ｈ＋−１１２），２６１（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｕ），３１７（Ｍ＋Ｈ＋）。
１．１ｃ 化合物２の合成：Ｎ−（２−アミノエチル）バリン
化合物１（１３７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を室温で、ＴＦＡ／ジクロロメタン（２ｍＬ、１／１）溶液に溶解した。得られた混合液を３０分間室温で撹拌した。上記反応溶液を乾燥して濃縮し、油状の標題の化合物（０．１８ｇ、９５％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．０７及び１．１６（２ｄ，６Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），３．２（ｍ，１Ｈ），３．３８（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）２１７（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｄ 化合物３の合成
マレイミド−ｄＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（６１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）に、化合物２（８０．７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（５５．５μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液を液滴により添加した。得られた混合溶液を一晩撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去し、残りの物質をジクロロメタンを有するシリカゲル上にてフラッシュクロマトグラフィにより洗浄した。その後、５％メタノールのジクロロメタン溶液から１００％メタノールにより溶出し、無色の油状物（８７ｍｇ、９７％）として表題の化合物を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．０８（ｄｄ，６Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．４９（ｔ，２Ｈ），２．５２（ｔ，２Ｈ），３．１０−３．７９（ｍ，２５Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）５５９（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｅ 化合物４の合成：Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ（１．０ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）及び４−アミノベンジルアルコール（３４１ｍｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）に溶解した溶液に、一盛の２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン［ＥＥＤＱ］（１．２４ｇ、５．０４ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を暗所で１６時間撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去し、白色固体の粉末のエーテル（１００ｍＬ）懸濁液を得た。得られた懸濁液を５分間超音波破壊し、３０分間静置し、白色固体を濾過により回収し、エーテルにより洗浄の後、真空乾燥した（１．２３ｇ、９７％）。分析の結果、１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１．３２から１．５２（ｍ，２Ｈ），１．５２から１．７４（ｄｍ，２Ｈ），２．８６から３．０６（ｄｍ，２Ｈ），４．１（Ｍ，１Ｈ），４．４２（ｄ，２Ｈ），５．０７（ｔ，１Ｈ），５．４０（ｂｓ，２Ｈ），５．９７（ｔ，１Ｈ），７．１９から７．９５（ｍ，１２Ｈ），８．１０（ｄ，１Ｈ），９．９７（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）５０３．１（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｆ 化合物５の合成：Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
化合物４（３０９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロフェニルクロロギ酸塩（３７２ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）及び１−メチル２−ピロリジン（１ｍＬ）に溶解した溶液に、一盛のピリジン（１００μＬ、１．２３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を、３０分間室温にて撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去し、残りの物質をジクロロメタンを有するシリカゲル上にてフラッシュクロマトグラフィにより洗浄した。更に３％メタノールから最終１０％メタノールのジクロロメタン溶液により溶出し、白色固体（９７．９ｍｇ、７０％）として表題の化合物を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）６６８（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
１．１ｇ 化合物６の合成：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＰＡＢＯＨ
化合物６を上記化合物４と同様に調製し、９８％の収率にて得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１．４０（ｓ，９Ｈ），１．３８（ｍ，２Ｈ），１．５０から１．７４（ｄｍ，２Ｈ），３．０４（ｔ，２Ｈ），３．３０（ｑ，３Ｈ），４．１９から４．３１（ｍ，２Ｈ），４．４１（ｄ，２Ｈ），４．５５（ｓ，２Ｈ），７．２８から７．６８（ｍ，１２Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）５７４（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｈ 化合物７の合成：Ｆｍｏｃ−ＬｙｓｆＢｏｃ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
化合物７を上記化合物５と同様に調製し、７０％の収率にて得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３Ｃｌ）δ１．４４（ｓ，９Ｈ），１．４９−１．６０（ｍ，６Ｈ），１．７３（ｍ，１Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｂｓ，１Ｈ），４．２３（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｂｓ，２Ｈ），４．６７（ｂｓ，１Ｈ），５．５６（ｂｓ，１Ｈ），７．２８（ｍ，２Ｈ），７．３６−７．４１（ｍ，６Ｈ），７．５９（ｍ，４Ｈ），７．７６（ｄ，２Ｈ），８．２６（ｄｄ，２Ｈ），８．４５（ｂｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）６３９（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｏｃ），６８４（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｕ），７３９（Ｍ＋Ｈ＋），７７８（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
１．１ｉ 化合物８の合成：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨ
シトルリン（２．５４ｇ、１４．５０ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１．２８ｇ）の水溶液（４０ｍＬ）に、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（４．３４ｇ、１３．８１ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン（ＤＭＥ）溶液を添加した。混合液の溶解を促進するため、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を添加した。得られた混合液を室温にて一晩撹拌した。クエン酸水溶液（１５％、７５ｍＬ）を添加し、混合液を１０％ ２−プロパノール／酢酸エチル（２×１００ｍＬ）により抽出した。有機層を塩水（２×１５０ｍＬ）により洗浄し、溶媒を遠心乾燥により除去した。得られた白色固体を５時間、真空乾燥し、その後エーテル（１００ｍＬ）により処理した。短い超音波処理及び粉砕の後、白い固体生成物を濾過により回収した（１．３９ｇ、２７％）。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ０．９１（ｄｄ，３Ｈ），０．９８（ｄｄ，３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．７０（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），２．０２（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｔ，２Ｈ），３．８９（ｔ，１Ｈ），４．３９（ｑ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）３７５（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｊ 化合物９の合成：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ
化合物９を上記化合物４と同様に調製し、７１％の収率にて得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ０．９３及び０．９７（２ｄ，６Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ），３．１９（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄ，１Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ），７．４５（ｄｄ，２Ｈ），７．６４（ｄ，４Ｈ），８．２９（ｄｄ，２Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４８０（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｋ 化合物１０の合成：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
Ｂｏｃ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１７８ｍｇ、０．３７０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液に、ＰＮＰクロロギ酸塩（１６０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）及びピリジン（６５μＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）及び１０％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）を反応混合液に添加し、有機層を塩水により洗浄し、乾燥濃縮した。残りの物質をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにて、５％のメタノールにより溶出し、白色固体（１６５ｍｇ、７０％）として表題の化合物を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ０．９３（ｄｄ，３Ｈ），０．９７（ｄｄ，３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ）３．２０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｄ，１Ｈ），４．５１（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｓ，２Ｈ），７．２９（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）５４５（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｏｃ），６４５（Ｍ＋Ｈ＋），６６７（Ｍ＋Ｎａ＋），６８３（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
１．１ｌ 化合物１２ａの合成
化合物１１（２０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（５ｍＬ）懸濁液を２０分間、ＨＣｌガスによりバブリングした（最終的にその懸濁液は透明な溶液になった）。反応混合液を更に５分間撹拌し、更に乾燥濃縮し、黄色の固体（２６ｍｇ、１００％）として表題の化合物を得た。その化合物を更に洗浄せず、次の工程での使用に供した。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）２６０（Ｍ＋Ｈ＋−Ｃｌ），２９５（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
化合物１１（２０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（５ｍＬ）懸濁液を２０分間、ＨＢｒガスによりバブリングした（最終的にその懸濁液は透明な溶液になった）。反応混合液を更に５分間撹拌し、更に乾燥濃縮し、黄色の固体（３３ｍｇ、１００％）として表題の化合物を得た。その化合物を更に洗浄せず、次の工程での使用に供した。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）２６０（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｒ），３３９（Ｍ＋Ｈ＋），３４１（Ｍ＋Ｈ＋＋２）；であった。
１．１ｎ 化合物 １３ｂの合成
化合物１２ａ（２６ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に、５（２−ジメチルアミノエトキシ）−ベンゾフラン−２−カルボキシル酸（４４ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（３０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を、室温にて２時間撹拌した。混合液を濃縮し、残りの物質をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（４／１．５／０．５、６ｍＬ）溶液に溶解し、フリーザーにて３時間保存した。その後、黄色の固体を濾過（３５ｍｇ、８５％）により回収した。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ２．６７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｆｔ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｍ，３Ｈ），４．５４（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｄｄ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ），７．７３（ｂｓ，１Ｈ），１１．７５（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０（Ｍ＋Ｈ＋−Ｃｌ），５２６（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
１．１ｏ 化合物１３ｃの合成
化合物１２ｂ（１９ｍｇ、０．０３８７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に、５（２−ジメチルアミノエトキシ）−ベンゾフラン−２−カルボキシル酸の臭化水素塩（２５ｍｇ、０．０７７５ｍｍｏｌ）及びＰＳ−カルボジイミド（８２ｍｇ、ｍｍｏｌ／ｇ：０．９４、０．０７７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を室温で２４時間撹拌した。濾過の後、濾液を濃縮し、残りの物質をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ（２／０．７５／０．２５、３ｍＬ）に溶解し、フリーザーにて３時間保存した。その後、黄色の固体を濾過により回収し、乾燥し、表題の化合物（１８ｍｇ、８２％）を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｒ），５７０（Ｍ＋Ｈ＋），５７２（Ｍ＋Ｈ＋＋２）；であった。
１．１ｐ 化合物１４ａの合成
化合物１３ａ（４８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４ｍＬ）懸濁液を、−７８℃にてｐ−ニトロフェニルクロロギ酸塩（８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５６μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を徐々に室温に加温し、更に撹拌を３０分間継続した。反応混合液に化合物Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（１６６ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。混合液を濃縮し、残りの物質をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにて、１．２５％メタノールのジクロロメタン溶液にて溶出し、白色固体（７１ｍｇ、１００％）として表題の化合物を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ δ１．４５−１．４７（ｍ，９Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．９７（ｓ，３Ｈ），３．１４−３．３４（ｍ，４Ｈ），３．８１−３．９２（ｍ，８Ｈ），４．３８−４．４７（ｍ，３Ｈ），４．７０（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，１Ｈ），７．１１（ｄ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），１０．４３（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）７１０（Ｍ−Ｈ＋）；であった。
１．１ｑ 化合物１４ｂの合成
化合物１３ｂ（４８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２ｍＬ）懸濁液に、０℃にて４−ニトロフェニルクロロギ酸塩（８０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、５６μＬ）を添加した。その後混合液を室温まで徐々に加温し、更に６時間撹拌を継続した。溶媒を蒸発させ、残りの物質をエーテルによって洗浄し、中間体を得た。中間体をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、その反応溶液にＮ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（４４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びトリメチルアミン（２０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、２８μＬ）を添加した。得られた混合液を、室温で一晩撹拌した。混合液を濃縮し、残りの物質をＣ−１８カラムを用いたＨＰＬＣにて、アンモニウムギ酸塩（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）及びアセトニトリルにより溶出し、白色固体（３１ｍｇ、５４％）として表題の化合物を精製した。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）７５５（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
１．１ｒ 化合物１４ｃの合成
化合物１３ｃ（２４ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）懸濁液を、０℃にてｐ−ニトロフェニルクロロギ酸塩（６４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２２μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を、室温にて１８時間撹拌した。反応混合液にＮ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（９４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加し、更に５０分間撹拌した。更に反応混合液を濃縮し、残りの物質をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにて、５％のメタノールのジクロロメタン溶液にて精製し、白色固体（２８ｍｇ、８３％）として表題の化合物を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０，５７０，６８４（Ｍ＋Ｈ＋−Ｂｏｃ），７８４（Ｍ＋Ｈ＋），８０５（Ｍ＋Ｎａ＋），７２２（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
１．１ｓ 化合物１５ａの合成
化合物１４ａ（７０ｍｇ、０．１０ｍのモグラ）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解し、混合液を３０分間室温にて撹拌し、乾燥濃縮し、製品（７２ｍｇ、１００％）を得た。更なる浄化を行わずに次の工程に用いた。ＨＰＬＣ分析の結果、９５％以上の純度であった。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ δ２．６４（ｓ，３Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．３０（ｔ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８１−３．８５（ｍ，１Ｈ），４．２７−４．４９（ｍ，３Ｈ），４．５９（ｄ，１Ｈ），４．６８（ｄ，１Ｈ），６．９７（ｄｄ，１Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ），８．００（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１０．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）６１２（Ｍ＋Ｈ＋），６３４（Ｍ＋Ｎａ＋）；であった。
１．１ｔ 化合物１５ｂの合成
化合物１５ｂを化合物１５ａと同様に調製し、１００％の収率にて得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ２．６９（ｓ，３Ｈ），２．７６（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｂｓ，１Ｈ），３．０１（ｓ，６Ｈ），３．０８（ｂｓ，１Ｈ），３．２４（ｂｓ，２Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，３Ｈ），３．７４（ｂｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｂｓ，２Ｈ），４．５７（ｂｓ，２Ｈ），４．７１（ｂｓ，１Ｈ），７．２２（ｂｄ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ），８．０４（ｂｓ，１Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０，５２６，６４０（Ｍ＋Ｈ＋），６７８（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
１．１ｕ 化合物１５ｃの合成
化合物１５ｃを化合物１５ａと同様に調製し、１００％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０，５７０，６８４（Ｍ＋Ｈ＋），７２２（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｖ 化合物１６ａの合成
化合物５（１２．５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）及び化合物１５ａ（１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２００μＬ）溶液に、トリエチルアミン（６μＬ、０．０４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を室温で一晩撹拌した。エーテル（５ｍＬ）を混合液に添加し、白色固体を溶液から沈殿により回収した。固体をフィルターにかけ、ジクロロメタンを有するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって精製し、その後１％メタノールのジクロロメタン溶液、２％メタノールのジクロロメタン溶液、３％メタノールのジクロロメタン溶液及び最後に４％メタノールのジクロロメタン溶液により溶出し、白色固体（８．７ｍｇ、５６％）として表題の化合物を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４７０，１１１２（Ｍ＋Ｈ＋），１１３４（Ｍ＋Ｎａ＋），１１５０（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｗ 化合物１６ｂの合成
化合物１５ｂ（５ｍｇ、０．００５６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．３５ｍＬ）溶液に、化合物５（３．８ｍｇ、０．００５６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２μＬ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合を室温で５時間撹拌した。混合液を濃縮し、残りの物質を、１０％メタノールのジクロロメタン溶液を有するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより溶出し、固体（３ｍｇ、４５％）として表題の化合物を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０、５２６、１１６９（Ｍ＋Ｈ＋）、１２０８（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
１．１ｘ 化合物１６ｃの合成
化合物１６ｃを上記化合物１６ｂと同様に調製し、５０％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０，５７０，１２１２（Ｍ＋Ｈ＋），１２５０（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｖ 化合物１７ａの合成
化合物１６ａ（８．７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（５００μＬ）に、一盛のピペリジン（１００μＬ）を添加した。得られた混合を室温で２０分間撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去し、高い真空状態にて１．５時間静置した。残りの物質を最小量のジクロロメタン（１００μＬ）に取り込ませ、ヘキサン（３ｍＬ）をその溶液に添加し、生じた白色固体（６．７ｍｇ、９６．７％）を濾過して除去し、乾燥させた。分析の結果、ＭＳ（ＥＳ）４７０，８９０．１（Ｍ＋Ｈ＋），９１２（Ｍ＋Ｎａ＋），９２８（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｚ 化合物１７ｂの合成
化合物１７ｂを上記化合物１７ａと同様に調製し、９５％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）９４７（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
１．１ａａ 化合物１７ｃの合成
化合物１７ｃを上記化合物１７ａと同様に調製し、９５％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）１０１５（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
１．１ｂｂ 化合物１８ａの合成
化合物１７ａ（４．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）及び化合物３（２．６４ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、一盛のＰｙＢＯＰ（３．７ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、続いてジイソプロピルエチルアミン（１μＬ）を添加した。得られた混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去した。残りの物質をプレパックＨＰＬＣにより精製し、ベージュの固体（２．６ｍｇ、３８．７％）を得た。分析の結果、ＭＳ（ＥＳ）４７０，１４３１（Ｍ＋Ｈ＋），１４５３（Ｍ＋Ｎａ＋），１４６９（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｃｃ 化合物１８ｂの合成
化合物１７ｂ（２．２ｍｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）及び化合物３の５％メタノールのジクロロメタン溶液（４００μＬ）に、ＨＢＴＵ（９ｍｇ、０．００４６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．４μＬ、０．００４６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を、半調製済みＨＰＬＣにて、１０ｍＭのアンモニウムギ酸塩及びアセトニトリルにより溶出し、油状の表題の化合物（１．１ｍｇ、３０％）を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４９０，５２６，１４８８（Ｍ＋Ｈ＋），１５２７（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．１ｄｄ 化合物１８ｃの合成
化合物１７ｃ（６．５ｍｇ、０．００６５ｍｍｏｌ）及び化合物３（５．５ｍｇ、０．００９７ｍｍｏｌ）の５％メタノールのジクロロメタン溶液（０．５ｍＬ）に、ＨＢＴＵ（３．７ｍｇ、０．００９７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．４μＬ、０．０１９４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を３０％メタノールのジクロロメタン溶液を有するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって溶出し、油状の表題の化合物（４ｍｇ、３０％）を得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）１５３２（Ｍ＋Ｈ＋），１５５４（Ｍ＋Ｎａ＋），１５７０（Ｍ＋Ｋ＋）であった。
１．２ 自己犠牲スペーサーを含まないデュオカルマイシン含有ペプチドリンカーの合成方法
１．２ａ 反応Ａ：
アルキル化の核７ｍｇの２ｍＬ酢酸エチル懸濁液に、ＨＢｒガスを緩やかに供給し、約１５分後に透明な溶液が形成された。反応混合を濃縮し、高い真空条件下で一晩乾燥させた。
１．２ｂ 反応Ｂ：
ステップＡにおいて調製されたブロモメチルｓｅｃｏ化合物のＤＭＦ懸濁液に、ＥＤＣ（１０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）及び５−ニトロベンゾフランカルボキシル酸（１２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を添加し、６時間撹拌した。その後、この反応混合物に酢酸エチル及び塩水を添加した。複合有機層を酢酸エチルにより３回抽出し、濃縮した。更にシリカゲルを用い、ＭｅＯＨ／ＤＣＭのＭｅＯＨの量を増加させて抽出した。得られた物質の質量分析の結果は、Ｍ＋１＝５３０であった。
１．２ｃ 反応Ｃ：
４’−ＯＨを、メチルピペラジンカルボニル塩化物（１１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の２ｍＬのＤＣＭ溶液、２００μＬのアリルアルコール及びピリジン（２１μＬ）を用いて２時間反応させ、保護した。得られた反応産物をシリカゲルカラムクロマトグラフイにより精製し、質量分析を行った結果、ＭＳ＋１＝６５４であった。
１．２ｄ 反応Ｄ：
ニトロ基の除去は、Ｐｄ／Ｃを用い、４０ＰＳＩ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（２：１）の条件で４５分間加水分解することにより行った。反応産物を濾過し、濾液を濃縮し、高い真空条件下で乾燥させた。反応産物を質量分析によりＭＳ＋１＝を算出し、更なる浄化を行わずに次の工程に用いた。
１．２ｅ 反応Ｅ：
上記の化合物（１８ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＣＭ溶液（２：１、３ｍＬ）に、Ｆｍｏｃ−バリン−シトルリン（２９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌し、全ての酸を溶解させた。１５ｍｇ、０．０６ｍｏｌのＥＥＤＱを添加し、反応混合液を暗所で一晩撹拌した。混合液を濃縮し、ジエチルエーテルによって洗浄し、逆相ＨＰＬＣ（調製済）によって精製し、得られた物質を質量分析した結果、Ｍ＋１＝１１０３であった。
１．２ｆ 反応Ｆ：
Ｆｍｏｃにより保護された基の脱保護は、５％ピペリジンの１ｍＬのＤＭＦ溶液を用い、１０分間反応させて行った。反応混合物の濃縮後、固体残留物をジエチルエーテルで洗浄した。得られた物質を質量分析した結果、ＭＳ＋１＝８８０及びＭ＋Ｋ＝９１９であった。
１．２ｇ 反応Ｇ：
上記反応Ｆにおいて調製されたＤＭＦフリーなアミン溶液（１．５ｍＬ）に、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−ＮＨＳ−エステル（２０ｍｇ）を添加した。濃縮の後、調製済の逆相ＨＰＬＣによる精製を行い、２．８ｍｇの物質（初発のアルキル化の核に対して１１％）を得、続いて１時間撹拌した。質量分析の結果、ＭＳ＋１＝２１７８、Ｍ＋Ｎａ＝１３００及びＭ＋Ｋ＝１３１６であった。
１．３ チューブリシンＡとコンジュゲートしたペプチドリンカーの合成
上記の合成方法により、上記リガンドをＰＥＧ及びペプチドリンカーに結合させることができる。
薬剤がチューブリシンＡである、ペプチドリンカーを有するリガンド−薬剤コンジュゲート及びその中間体の合成方法を上記に示す。この基本的な方法は他の薬剤に対しても適用可能である。
１．４ａ ペプチド−リンカーコンジュゲート１１１の合成
１．４ｂ ペプチド−リンカーコンジュゲート１１２の合成
１．４ｃ ペプチド−リンカーコンジュゲート１１３の合成
＜実施例２＞６員環ヒドラジンリンカーコンジュゲートの合成
２．１ デュオカルマイシン派生サイトトキシンとコンジュゲートした６員環ｇｅｍ−ジメチルヒドラジンリンカーの合成
２．１ａ 化合物１０９の合成反応式
２．１ｂ 化合物１１０の合成
アイスバス中で氷冷したＣｂｚ−ジメチルアラニン（１ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の３０ｍＬのＤＣＭ懸濁液に、ＨＯＡＴ（触媒、０．２５当量）及びＤＩＰＥＡ（２．８ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を添加し、その後２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾールインジニウムヘキサフルオロリン酸（ＣＩＰ）（１．２ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液に更にＢｏｃ−ＮＮ（Ｍｅ）（６４３モル、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。上記反応溶液を室温で一晩撹拌した。上記反応溶液に１０％のクエン酸溶液（１００ｍＬ）を添加し、ＤＣＭにより抽出した。有機相は、水、重炭酸ナトリウムの飽和溶液、再度水により洗浄した。有機相を濃縮し、酢酸エチルのヘキサン溶液を用いて極性を増加させたシリカゲルカラムにより精製し、８６０ｍｇの化合物（化合物１０７に対し５７％の収率）を得た。質量分析の結果、Ｍ＋１＝３８０及びＭ＋ＮＨ４＋＝３９７であった。
Ｃｂｚ保護基を、ＭｅＯＨにおいてＰｄ／Ｃを使用して触媒水素化処理により除去し、化合物１０８を得、ＭＳによって解析した。
ＰＮＰＣ−１９１８（１０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の２ｍＬのＤＣＭ溶液に、化合物１０８（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液８ｍＬを液滴により添加し、上記反応溶液を、全ての出発原料が溶解するまで、２日間にわたり撹拌した。上記反応溶液を短い二酸化ケイ素ゲルパッドにて濾過し、濃縮し、調製済みの逆相ＨＰＬＣにより精製し、４．２ｍｇの化合物１０９を得た。質量分析の結果、Ｍ＋１＝７４０であった。化合物１０９を、純粋なＴＦＡにより２０分間反応させＢｏｃ脱保護し、化合物１１０を得た。得られた産物の質量分析の結果、Ｍ＋１＝６４０であった。
２．１ｃ 化合物１１１の合成
上記Ｍａｌ−ＰＥＧ４−アセトフェノン及び化合物１１０（３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を結合し、濃縮し、高い真空条件下で一晩乾燥した。この混合液に、１日早く調製された５％の酢酸溶液の１ｍＬを添加し、分子篩を通した後乾燥させた。ヒドラゾンの形成は、１時間以内に終了した。その後、上記反応溶液を濃縮し、調製済みＨＰＬＣ（アンモニウムギ酸塩、Ｐｈ＝７）により精製し、２．８ｍｇの化合物１１１（収率６０％）得た。得られた物質の質量分析の結果、ＭＳ＋１＝１１２９、Ｍ＋ＮＨ４＝１１４６及びＭ＋Ｋ＝１１６８であった。
２．２ チューブリシンサイトトキシンとコンジュゲートしたｇｅｍ−ジメチル６員環ヒドラジンリンカーの合成
上記実施例２．１と同様の方法が、チューブリシンＡなどの薬剤と複合したジミナルなジメチル６員環ヒドラジンリンカーの合成に適用可能であることを示す。
２．３ デュオカルマイシンアナログとコンジュゲートしたヒドラジンリンカーの合成
ブロモメチルｓｅｃｏ化合物（０．０７４ｍｍｏｌ）の３ｍＬのＤＭＦ溶液に、５−アセチルインドール−２−カルボキシル酸（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合液を一晩撹拌した。上記反応溶液を濃縮し、５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を使用したシリカゲルクロマトグラフィにより精製し、２９ｍｇ（７４％の収率）を得、質量分析の結果、Ｍ＋１＝５２３であった。
５ｍＬのＤＣＭ及び３００μＬのアリルアルコールに、工程Ｃにおいて合成された化合物を溶解させた溶液に、メチルピペラジンカルボニルクロライド（２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）及びピリジン４４μＬを添加した。上記反応溶液を室温で５時間撹拌した。５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いたシリカゲルクロマトグラフィによって精製し、目的の物質（収率７３％）４８ｍｇを得た。質量分析の結果、Ｍ＋１＝６５０であった。
上記の化合物（８．２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＭａｌ−ＰＥＧ４−ヒドラジンを、５％酢酸の無水ＤＣＭ溶液に溶解した溶液を、２０分間の室温で撹拌し、溶媒を蒸発させ、更にアセトニトリル及びアンモニウムギ酸塩のバッファーを使用した調製済みの逆相ＨＰＬＣにより精製し、最終目的物質２．５ｍｇを得た。質量分析の結果、Ｍ＋１＝１０６３であった。
２．４ａ ジメチル６員環を有するヒドラジンリンカーの環化速度
ジメチル６員環ヒドラジンリンカーにコンジュゲートしたデュオカルマイシンアナログを、ｐＨ７．４にて２４時間バッファー中でインキュベートし、ヒドラジンリンカーの環化により生じた環状物の生成、またそれによるデュオカルマイシンアナログの遊離を時間を追って解析した。
ｐＨ＝７．４にて２４時間以上反応させ、検出した結果、環化された物質の量が最小であった。すなわち、６員環を有するヒドラジンリンカーのこの形状では環化反応が比較的遅いことを示す。
２．４ｂ ｇｅｍ−ジメチル６員環ヒドラジンリンカーの環化速度
ｇｅｍ−ジメチル６員環ヒドラジンリンカーにコンジュゲートしたデュオカルマイシンアナログを、ｐＨ７．４にてバッファー中でインキュベートし、ヒドラジンリンカーの環化により生じた環状物の生成、またそれによるデュオカルマイシンアナログの遊離を時間を追って解析した。
６員環ｇｅｍ−ジメチルリンカーにおいては、環化反応は非常に急速であり、２、３分以内で反応が完了した。すなわち、６員環ｇｅｍ−ジメチルヒドラジンリンカーの環化は、ｇｅｍ−ジメチル部分を含まない６員環リンカーの場合と比較し、非常に速い速度で進行した。
＜実施例３＞５員環ヒドラジンリンカーコンジュゲートの合成
３．１ 化合物４の合成方法
Ｃｂｚ−ＤＭＤＡ−２．２−ジメチルマロン酸（１）
２，２−ジメチルマロン酸（２．０ｍｇ、０．０１５１ｍｏｌ）及び塩化チオニル（１．３５ｍｌ、０．０１８２ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）を含む、撹拌棒、温度計、還流コンデンサーを備えた２５ｍＬのフラスコに、ＤＭＦを液滴により添加し、その反応溶液を還流のために２時間加熱し、その後室温に冷却した。この反応混合液を液滴により、０℃にてＣｂｚ−ＤＭＤＡ（４ｍｇ、０．０１８２モル）及びトリエチルアミン（４ｍｌ、０．０２８７ｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液に添加し、この温度で３０分間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、残りの物質を１Ｎ 塩酸（５０ｍｌ）に溶解し、ＤＣＭ（２×２５ｍｌ）により抽出した。複合有機層を１Ｎ ＮａＯＨ（２×２５ｍｌ）により抽出し、複合水層を濃塩酸により酸性化し（ｐＨ＜１）、酢酸エチル（２×２５ｍｌ）により抽出し、ＭｇＳＯ４を通して乾燥させ、フィルター濾過、真空濃縮の後、オフホワイトの粘着性の固体（３．４４ｇｍ）を得た。収率は６８％であった。化合物１は、質量分析の結果、ｍ／ｚ ３３７．０［Ｍ＋１］＋、ＨＰＬＣ保持時間：３．７７分であった。
Ｃｂｚ−ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン−Ｂｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（２）
化合物１（３．０ｍｇ、０．００８９ｍｏｌ）及び塩化チオニル（０．７８ｍｌ、０．０１０７ｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液を、撹拌棒、温度計及び還流コンデンサーを備えている５０ｍｌ容の３首ＲＢＦに、ＤＭＦを液滴により添加し、上記反応溶液を２時間還流し、室温に冷却した。この反応混合をその後、Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジン（１．３３ｍｇ、０．０９１ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３ｍｌ、０．０２１５ｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液に０℃にて液滴により添加し、３０分間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、残りの物質を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し、ＭｇＳＯ４を通じて乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮して茶色の油状物を得た。上記油状物を酢酸エチルに溶解し、カラムクロマトグラフィー（１００％のＥｔＯＡｃ）により精製し、３．４５ｇｍの澄んだ油状物（８３％の収率）を得た。化合物２の質量分析の結果、ｍ／ｚ４６５．２［Ｍ＋１］、ＨＰＬＣ保持時間：３．９７分であった。
ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン−Ｂｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（３）
化合物２（０．５ｇｍ、０．００１１ｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍｌ）溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（１５ｍｇ）を添加し、３０分間パール水素化装置にて反応させた。触媒を濾過により除去し、濾液を真空内で濃縮し、澄んだ油状の化合物３（０．３８ｇｍ）を得た。分析の結果、ＮＭＲ（１Ｈ、ＣＤＣｌ３）δ１．４５（ｓ、１５Ｈ）２．４５（ｓ、３Ｈ）２．８５（ｓ、６Ｈ）、３．１６（ｓ、３Ｈ）４．６４（ｍ、１Ｈ）１０．６（ｂｓ、１Ｈ）；ΝＭＲ（１３Ｃ、ＣＤＣｌ３）δ２４．１、２８．５７、３５．１５、３５．５８、３６．６６、４７．０１、４８．５１、８１．１１、１５５．１７、１７３．５６、１７６．２４；であった。
化合物４の合成
撹拌棒を備えた１５ｍｌのＲＢＦに、化合物３（５０ｍｇ、０．１５１３ｍｍｏｌｓ）、ＰＮＰＣ−１９１８（２０ｍｇ、０．０３１５ｍｍｏｌ）及びＤＣＭ（５ｍｌ）を充填した。溶液を３０分間撹拌し、トリエチルアミン（２５μＬ、０．１７９４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた明るい黄色の溶液を１時間撹拌した。黄色の油状の溶液を真空内で濃縮し、カラムクロマトグラフイ（１００％ＤＣＭからＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ（１：１）の勾配）により精製し、オフホワイトの固体（２２ｍｇ）として化合物４（収率８４％）を得た。質量分析の結果、ｍ／ｚ８２５．７［Ｍ＋１］＋、ＨＰＬＣ保持時間：７．６５分であった。
３．２ ５員環ヒドラジンリンカーを有する抗体−薬剤コンジュゲートの合成
この反応式は、抗体のリンカー-薬剤コンジュゲートとのコンジュゲーションを示す。これらの方法は、製薬技術として公知である。他の反応性サイトの例としては、リガンド上でチオールと反応するマレイミド、ハロアセトアミド、リガンド上のジスルフィドと反応するチオール、リガンド上のアルデヒド及びケトンと反応するヒドラジド、並びにリガンド上のアミノ基と反応するヒドロキシスクシニイミド、イソシネート、イソチオシアン酸塩及び無水物、が挙げられる。
＜実施例４＞ジスルフィド含有リンカーコンジュゲートの合成
Ｓｃｈｅｍｅ１
Ｓｃｈｅｍｅ２
Ｓｃｈｅｍｅ３
４．１ａ 化合物１の合成
ＰＥＧ４（３．８８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、トリトンＢ（４０％メタノール溶液、１．０８ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）及びその１５分後にｆｅｒｔ−ブチルアクリレート（３．６２ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合液を室温にて一晩撹拌した。上記混合液を真空乾燥し、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として表題の化合物（２．３５ｇ、３６％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４５（ｓ、９Ｈ）、２．５（ｔ、２Ｈ）、３．６５（ｍ、１８Ｈ）であった。
４．１ｂ 化合物２の合成
化合物１（１．１７ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（５３２μＬ、４ｍｍｏｌ）及びメタンスルフォニルクロライド（３０９μＬ、４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（１．３ｇ、８９％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４３（ｓ、９Ｈ）、２．４８（ｔ、２Ｈ）、３．０７（ｓ、３Ｈ）、３．６２〜３．７０（ｍ、１４Ｈ）、３．７６（ｍ、２Ｈ）、４．３７（ｍ、２Ｈ）であった。
４．１ｃ 化合物３の合成
化合物２（１．３ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）エタノール（１０ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（４２３ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を一晩還流した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（１．０１ｇ、９０％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４５（ｓ、９Ｈ）、２．５０（ｔ、２Ｈ）、３．４０（ｔ、２Ｈ）、３．６２−３．７３（ｍ、１６Ｈ）であった。
４．１ｄ 化合物４の合成
化合物３（４７０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２５μＬ）を含むエーテル（５ｍＬ）溶液に、トリフェニルフォスフィン（３９１ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（３２５ｍｇ、７５％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４５（ｓ、９Ｈ）、２．２４（ｂｓ、２Ｈ）、２．５１（ｔ、２Ｈ）、２．９１（ｔ、２Ｈ）、３．５６（ｍ、２Ｈ）、３．６３〜３．６６（ｍ、１２Ｈ）、３．７２（ｍ、２Ｈ）であった。
４．１ｅ 化合物５の合成
３−メルカプトプロピオン酸（１．２２ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液に、アルドリチオール−２（３．７８ｇ、１７．２５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を３時間室温にて撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を３０％の酢酸エチルのヘキサン溶液を有するシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、油状物として表題の化合物（２．４４ｇ、９８％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ２．８（ｔ、２Ｈ）、３．０５（ｔ、２Ｈ）、７．１４（ｍ、１Ｈ）、７．６７（ｍ、２Ｈ）、８．４８（ｍ、１Ｈ）；
化合物５ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．４３（ｄ、３Ｈ）、２．６１（ｍ、１Ｈ）、２．７６（ｍ、１Ｈ）、３．４０（ｍ、１Ｈ）、７．１７（ｍ、１Ｈ）、７．６６（ｍ、２Ｈ）、８．４５（ｍ、１Ｈ）；であった。
４．１ｆ 化合物６の合成
３−メチルベンゾチアゾリウムヨウ化物（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、１００℃で６時間撹拌し、その後上記混合液を６Ｎ塩酸水溶液によってｐＨ４に調製し、ジエチルエーテルによって抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４を通じて乾燥し、真空内で遠心乾燥させ、残りの物質をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、化合物５ａ（７７６ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合液を室温にて１時間撹拌した。上記混合液を濃縮乾燥し、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物質として表題の化合物（４８２ｍｇ、５５％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ２．８５（ｍ、２Ｈ）、２．９５（ｍ、５Ｈ）、６．６４（ｍ、２Ｈ）、７．３（ｍ、１Ｈ）、７．４（ｄｄ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２４４（Ｍ＋Ｈ＋）（４８７（２Ｍ＋Ｈ＋））；
化合物６ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３５（ｄ、３Ｈ）、２．４８（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、３Ｈ）、３．０２（ｍ、１Ｈ））、３．３４（ｍ、１Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２８（ｍ、１Ｈ）、７．４４（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２５８（Ｍ＋Ｈ+）；
化合物６ｃ：１Ｈ ＮＭＲδ１．４５（ｓ、６Ｈ）、２．７０（ｓ、２Ｈ）、２．９３（ｓ、３Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２４（ｍ、１Ｈ）、７．５１（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２７２（Ｍ＋Ｈ＋）、２９４（Ｍ＋Ｎａ＋）、３１０（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
４．１ｇ 化合物７の合成
化合物６ａ（２８ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１ｍＬ）溶液に、塩化アセチル（１３μＬ、０．１７３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１０％の酢酸エチルのヘキサン溶液を有するシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、油状物として表題の化合物（２４ｍｇ、８３％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ２．０８（ｍ、２Ｈ）、２．９３（ｓ、３Ｈ）、２．９５（ｍ、２Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）、６．６３（ｍ、２Ｈ）、７．２８（ｍ、２Ｈ）、７．４０（ｍ、２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２５８（Ｍ＋Ｈ＋）、２８０（Ｍ＋Ｎａ＋）、２９６（Ｍ＋Ｋ＋）；
化合物７ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３２（ｄ、３Ｈ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、３Ｈ）、２．９３（ｍ、１Ｈ）、３．３５（ｍ、１Ｈ）、３．６７（ｓ、３Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２６（ｍ、１Ｈ）、７．４４（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２７２（Ｍ＋Ｈ＋）；
化合物７ｃ：１Ｈ ＮＭＲδ１．４２（ｓ、６Ｈ）、２．６６（ｓ、２Ｈ）、２．９３（ｓ、３Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２４（ｍ、１Ｈ）、７．５１（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）２８６（Ｍ＋Ｈ＋）、３０８（Ｍ＋Ｎａ＋）、３２４（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
４．１ｈ 化合物８の合成
化合物７ａ（２４ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、０℃にてトリホスゲン（２８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３７μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合液を１時間撹拌した。上記混合液を濃縮乾燥し、残りの物質を更に精製せずに次の工程で使用した。粗精製物をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、化合物８ａ（３５ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（５３ｍｇ、７６％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ２．７０（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｍ，１Ｈ），３．３５及び３．３６（２ｓ，３Ｈ），３．６３及び３．６４（２ｓ，３Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．９３及び３．９４（２ｓ，３Ｈ），４．４８（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｍ，１Ｈ），７．２６−７．５２（ｍ，５Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ），８．１（ｂｓ，１Ｈ），８．９８及び９．０８（２ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）７５３（Ｍ＋Ｈ＋）；
化合物８ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３８（ｍ，３Ｈ），２．５２（ｍ，１Ｈ），２．６９（ｍ，３Ｈ），２．７９（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｍ，１Ｈ），３．３７（２ｓ，３Ｈ），３．６４（ｍ，３Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．８４−３．９０（ｍ，１Ｈ），３．９３（２ｓ，３Ｈ），４．４８（ｍ，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），４．７８（ｍ，１Ｈ），７．０６（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．２６−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．５０（ｍ，２Ｈ），７．８６（ｍ，１Ｈ），８．１（ｂｓ，１Ｈ），８．９９，９．０８，９．１３及び９．２２（４ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）７６７（Ｍ＋Ｈ＋）；
化合物８ｃ：１Ｈ ＮＭＲδ１．４４（ｍ，６Ｈ），２．６３（ｄ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），３．３８及び３．３９（２ｓ，３Ｈ），３．６３及び３．６４（２ｓ，３Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．９３及び３．９４（２ｓ，３Ｈ），４．４８（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．３１−７．３９（ｍ，３Ｈ），７．４９（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ），８．１（ｂｓ，１Ｈ），９．１２及び９．２３（２ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）７８１（Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
４．１ｉ 化合物９及び１０の合成
化合物８ａ（０．１ｍｇ）のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）／メタノール（３００μＬ、２／１）溶液に２０ｍＭ ＤＴＴ溶液（１００μＬ（１５等量））を添加し、ＨＰＬＣにより反応の経過をモニターした。反応があまりに急速であったため検出することができず、数秒で反応が完了し、化合物１０を得た。反応中間体である化合物９は検出されなかった。
４．１ｊ 化合物１１の合成
化合物６ａ（６６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、ＤＣＣ（４７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及び化合物４（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（７０ｍｇ、６２％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４４（ｓ、９Ｈ）、２．５１（ｔ、１Ｈ）、２．６３（ｔ、２Ｈ）、２．９３（ｄ、３Ｈ）、３．０１（ｔ、２Ｈ）、３．４５（ｍ、２Ｈ）、３．５５（ｍ、２Ｈ）、３．６４（ｍ、１２Ｈ）、３．７１（ｔ、２Ｈ）、５．０１（ｂｓ、１Ｈ）、６．３８（ｂｔ、１Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）、７．２７（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｄｄ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）４９１（Ｍ−５６＋Ｈ＋）、５１３（Ｍ−５６＋Ｎａ＋）、５４７（Ｍ＋Ｈ＋）、５６９（Ｍ＋Ｎａ＋）；
化合物１１ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３４（ｄ、３Ｈ）、１．４５（ｓ、９Ｈ）、２．３０（ｍ、１Ｈ）、２．５（ｔ、２Ｈ）、２．６９（ｍ、１Ｈ）、２．９３（ｄ、３Ｈ）、３．３７−３．５５（ｍ、５Ｈ）、３．６３（ｍ、１２Ｈ）、３．７１（ｔ、２Ｈ）、４．９９（ｂｓ、１Ｈ）、６．１３（ｂｔ、１Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）５７．２５（ｍ、１Ｈ）、７．４８（ｄｄ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）５０５（Ｍ−５６＋Ｈ＋）、５２７（Ｍ−５６＋Ｎａ＋）、５４３（Ｍ−５６＋Ｋ＋）、５６１（Ｍ＋Ｈ＋）５８３（Ｍ＋Ｎａ＋）；
化合物１１ｃ：１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．４５（ｓ、９Ｈ）、２．４６（ｓ、２Ｈ）、２．５（ｔ、２Ｈ）、２．９２及び２．９４（２ｓ、３Ｈ）、３．３３（ｍ、２Ｈ）、３．４７（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｍ、１２Ｈ）、３．７０（ｔ、２Ｈ）、６．０６（ｂｔ、１Ｈ）、６．６３（ｍ、２Ｈ）、７．２５（ｍ、１Ｈ）、７．５４（ｄ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）５１９（Ｍ−５６＋Ｈ＋）、５４１（Ｍ−５６＋Ｎａ＋）、５７５（Ｍ＋Ｈ＋）、５９７（Ｍ＋Ｎａ＋）；であった。
４．１ｋ 化合物１２の合成
化合物１１ａ（２０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）懸濁液に、０℃にてトリエチルアミン（１５μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）及び２Ｎホスゲンのトルエン溶液（５５μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合液を室温にて１時間撹拌した。上記混合液を濃縮し、残りの物質をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、その後化合物１０（１４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を１％のメタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色の油状物として表題の化合物（２３ｍｇ、７４％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ１．４４（ｓ、９Ｈ）、２．４９（ｔ、２Ｈ）、２．６７（ｍ、２Ｈ）、２．６５及び２．６７（２ｓ、３Ｈ）、３．０７（ｍ、２Ｈ）、３．３３（ｓ、３Ｈ）、３．４０（ｍ、３Ｈ）、３．５１（ｍ、２Ｈ）、３．６０（ｍ、１２Ｈ）、３．６９（ｍ、２Ｈ）、３．８７（ｓ、３Ｈ）、３．９２（ｓ、３Ｈ）、３．９３（ｍ、１Ｈ）、４．５２（ｍ、２Ｈ）、４．７８（ｍ、１Ｈ）、６．６５、６．７４及び６．９７（３ｂｔ、１Ｈ）、７．０６（ｄ、１Ｈ）、７．１２（ｓ、１Ｈ）、７．２９−７．４２（ｍ、３Ｈ）、７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．８７（ｄ、１Ｈ）、８．１０及び８．１５（２ｂｓ、１Ｈ）、９．７９及び９．５８（２ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）９８６（Ｍ＋Ｈ＋−５６）、１０４２（Ｍ＋Ｈ＋）；
化合物１２ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３２（ｍ、３Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）、２．３９（ｍ、１Ｈ）、２．４８（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｍ、１Ｈ）、２．６７及び２．６９（２ｓ、３Ｈ）、３．３２及び３．３５（２ｓ、３Ｈ）、３．３８−３．７２（ｍ、２０Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９３（ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｍ、１Ｈ）、４．５２（ｍ、２Ｈ）、４．７７（ｍ、１Ｈ）、６．５３、６．６７及び６．７２（３ｂｔ、１Ｈ）、７．０６（ｄ、１Ｈ）、７．１２（ｓ、１Ｈ）、７．２９−７．３９（ｍ、３Ｈ）、７．４９（ｍ、２Ｈ）、７．８８（ｄ、１Ｈ）、８．１２及び８．２５（２ｂｓ、１Ｈ）、９．１３、９．３６、１０．０８及び１０．２１（４ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）１０００（Ｍ＋Ｈ＋−５６）、１０５６（Ｍ＋Ｈ＋）、１０７８（Ｍ＋Ｎａ＋）、１０８４（Ｍ＋Ｋ＋）；
化合物１２ｃ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３０−１．４２（ｍ、３Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）、２．４５−２．５２（ｍ、４Ｈ）、２．６９及び２．７２（２ｓ、３Ｈ）、３．３４及び３．３５（２ｓ、３Ｈ）、３．３９−３．７２（ｍ、１９Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９２５及び３．９３（２ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｍ、１Ｈ）、４．５３（ｍ、２Ｈ）、４．８０（ｍ、１Ｈ）、６．６３（ｍ、１Ｈ）、７．０６（ｄｄ、１Ｈ）、７．１３（ｄ、１Ｈ）、７．２５−７．３９（ｍ、３Ｈ）、７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．８９（ｄ、１Ｈ）、８．１０及び８．２７（２ｂｓ、１Ｈ）、９．９９及び１０．１９１（２ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）１０１４（Ｍ＋Ｈ＋−５６）、１０７０（Ｍ＋Ｈ＋）、１１０８（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
４．１ｌ 化合物１３の合成
化合物１２ａ（２３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸及びジクロロメタン（１ｍＬ、１／１）溶液に溶解し、上記混合液を３０分間室温にて撹拌の後、濃縮し、生成物（２１ｍｇ、１００％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲδ２．６０（ｔ、２Ｈ）、２．６７及び２．６８（２ｓ、３Ｈ）、２．７５（ｍ、２Ｈ）、３．０７（ｍ、２Ｈ）、３．３４（ｓ、３Ｈ）、３．３８−３．６４（ｍ、２１Ｈ）、３．７６（ｔ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９２（ｓ、３Ｈ）、３．９３（ｍ、１Ｈ）、４．５３（ｍ、２Ｈ）、４．７８（ｍ、１Ｈ）、７．０６（ｄ、１Ｈ）、７．１３（ｓ、１Ｈ）、７．３１−７．４３（ｍ、３Ｈ）、７．４９（ｍ、２Ｈ）、７．８７（ｄ、１Ｈ）、８．１０及び８．１５（２ｂｓ、１Ｈ）、９．４４及び９．６５（２ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）９８６（Ｍ＋Ｈ＋）、１００８（Ｍ＋Ｎａ＋）、１０２４（Ｍ＋Ｋ＋）；
化合物１３ｂ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３４（ｍ、３Ｈ）、２．５６（ｍ、１Ｈ）、２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．６８（ｍ、３Ｈ）、２．８（ｍ、１Ｈ）、３．３５−３．３６（２ｓ、３Ｈ）、３．４０−３．７０（ｍ、１８Ｈ）、３．７７（ｔ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９３及び３．９５（２ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｍ、１Ｈ）、４．５４（ｍ、２Ｈ）、４．７９（ｍ、１Ｈ）、７．０７（ｄ、２Ｈ）、７．１３（ｓ、１Ｈ）、７．３０−７．４２（ｍ、３Ｈ）、７．４９（ｍ、２Ｈ）、７．８８（ｄ、１Ｈ）、８．１１及び８．２５（２ｂｓ、１Ｈ）、９．２２、９．３７，９．８０及び９．９２（４ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）１０００（Ｍ＋Ｈ＋）、１０２２（Ｍ＋Ｎａ＋）、１０３８（Ｍ＋Ｋ＋）；
化合物１３ｃ：１Ｈ ＮＭＲδ１．３０−１．４５（ｍ、６Ｈ）、２．５４（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｍ、２Ｈ）、２．６８及び２．６９（２ｓ、３Ｈ）、３．３５−３．３６（２ｓ、３Ｈ）、３．４０−３．７０（ｍ、１７Ｈ）、３．７７（ｔ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、３Ｈ）、３．９２及び３．９３（２ｓ、３Ｈ）、３．９４（ｍ、１Ｈ）、４．５０（ｍ、２Ｈ）、４．８０（ｍ、１Ｈ）、７．０８（ｍ、２Ｈ）、７．１２（ｄ、１Ｈ）、７．２９−７．３９（ｍ、３Ｈ）、７．４９（ｍ、２Ｈ）、７．８９（ｍ、１Ｈ）、８．１０及び８．２５（２ｂｓ、１Ｈ）、９．８８及び１０．０４（２ｓ、１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）１０１４（Ｍ＋Ｈ＋）、１０３６（Ｍ＋Ｎａ＋）、１０５４（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
４．１ｍ 化合物１４ａの合成
化合物１３ａ（５．４ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、ＰＳ−カルボジイミド（１１．５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ／ｇ、０．０１０８ｍｍｏｌ）及びＰＳ−ＤＭＡＰ（７．２ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ／ｇ、０．０１０８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌し、濾過の後濃縮し、標題の化合物を得た。分析の結果、ＭＳ（ＥＳ）１０８２（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
４．２ チューブリシンＡとコンジュゲートしたジスルフィドリンカーの合成
薬剤チューブリシンＡは、上記の反応機構により、本発明のジスルフィドリンカーにコンジュゲートさせることができる。本発明の他の薬剤及び他のリンカーも、同様の反応様式で合成することができる。
４．３ ジスルフィドリンカーの環化速度
化合物８ａの（０．１ｍｇ）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）／メタノール（３００μＬ、２／１）溶液に、２０ｍＭ ＤＴＴ（１００μＬ（１５等量））を添加し、反応の経過をＨＰＬＣによりモニターした。反応があまりに急速であったため検出することができず、数秒で反応が完了し、化合物１０を得た。反応中間体である化合物９は検出されなかった。
＜実施例５＞
化合物３２の合成
化合物３０（１２０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１０ｍＬ）溶液に、ＨＣｌガスを５分間バブリングした。上記反応溶液を更に３０分間室温で撹拌し、上記混合液を濃縮した。エーテルを上記反応溶液に添加し、白い沈殿物をフィルターにて回収した。固体を減圧下で一晩乾燥させ、目的の化合物１００ｍｇを得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）による分析の結果、３２４（Ｍ＋Ｈ＋）であり、更に浄化せずに次の工程に使用した。この化合物（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、化合物３１（６５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（９１μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を０．１％のＴＦＡの水及びアセトニトリル溶液を用い、半調製済みのＨＰＬＣにより精製し、油状物として化合物３２（１１０ｍｇ、８０％）を得た。目的の化合物をＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）により分析した結果、５５５（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
化合物３３の合成
化合物３２（１１０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びパラジウム炭（２０ｍｇ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）溶液を、水素雰囲気下、通常圧・室温にて１２時間撹拌した。パラジウムを濾過し、上記反応溶液を濃縮し、残りの物質を０．１％ＴＦＡの水及びアセトニトリル溶液を用い、半調製済みのＨＰＬＣにより精製し、油状物として目的化合物（８０ｍｇ、７８％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）による分析の結果、４６５（Ｍ＋Ｈ＋）であった。残りの物質（８０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）及びＴＨＦ（５ｍＬ）の溶液に、０℃にてＰＮＰＣｌ（４−ニトロフェニルクロロギ酸塩）（１３７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１４４μＬ、１．０２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を、０℃にて１２時間、その後室温にて３０分間撹拌した。反応混合液を真空下で濃縮し、残りの物質を真空乾燥し、エチルエーテル（１００ｍＬ）により沈殿させ、黄色の固体として化合物３３（９０ｍｇ、８２％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）による分析の結果、６３１（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
化合物３４の合成
２−ブロモエチルアミンブロミド（５ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（８．５ｍＬ、４８．８ｍｍｏｌ）及びベンジルクロロギ酸塩（３．４８ｍＬ、２４．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて２時間撹拌した。上記反応溶液を濃縮し、残りの物質を、溶出液として酢酸エチル／ヘキサン（３／７）を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、油状物（４ｇ、６４％）として目的の化合物３４を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．５４（ｂｓ、２Ｈ）、３．６１（ｂｓ、２Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、７．３６（ｍ、５Ｈ）であった。
化合物３５の合成
化合物３４（３．３４ｇ、１２．９９ｍｍｏｌ）及びバリンｔｅｒｔ−ブチルエステル（３．２７ｇ、１５．５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（５．３９ｇ、３８．９７ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．５９ｇ、１５．５９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を１００℃にて一晩撹拌した。上記反応溶液を濃縮し、残りの物質を、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（２／８）を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、油状物として所望の化合物３５（３．１２ｇ、６９％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．９２（ｍ、６Ｈ）、１．４６（ｓ、９Ｈ）、１．８６（ｍ、１Ｈ）、２．５３（ｍ、１Ｈ）、２．８０（ｍ、２Ｈ）、３．１８（ｍ、１Ｈ）、３．３１（ｍ、１Ｈ）、５．１０（ｓ、２Ｈ）、５．２５（ｂｓ、１Ｈ）、７．３６（ｍ、５Ｈ）；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）２９６（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋）、３５２（Ｍ＋Ｈ＋）であった。
化合物３６の合成
化合物３５（３．４ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）及びパラジウム炭（２００ｍｇ）のメタノール（３０ｍＬ）溶液を、水素雰囲気下、通常圧・室温にて静置した。得られた上記混合液を２時間室温にて撹拌した。パラジウムを濾過し、上記反応溶液を濃縮乾燥し、油状物として目的の化合物３６（２．１ｇ、９８％）を得た。
化合物３７の合成
化合物３６（２．１ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液に、０℃にてＦｍｏｃＯＳｕ（９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）（３．２８ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を０℃で２時間撹拌した。溶媒を遠心乾燥により除去し、残りの物質を、溶離剤としてジクロロメタン、０．５％メタノールのジクロロメタン溶液、及び最後に１％メタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。無色の油状物として目的の化合物３７（２．５５ｇ、６０％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．９５（ｆｔ、６Ｈ）、１．４８（ｓ、９Ｈ）、１．９０（ｍ、１Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、２．８２（ｍ、２Ｈ）、３．１８（ｍ、１Ｈ）、３．３２（ｍ、１Ｈ）、４．２４（ｍ、１Ｈ）、４．３７（ｍ、２Ｈ）、５．４０（ｂｓ、１Ｈ）、７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．３９（ｍ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、２Ｈ）、７．７５（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）３８３（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋）、４４０（Ｍ＋Ｈ＋）、４６２（Ｍ＋Ｎａ＋）、４７８（Ｍ＋Ｋ＋）；であった。
化合物３８の合成
化合物３７（１７７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン／水（３／１、８ｍＬ）溶液に、ＨＣｌガスを５分間バブリングした。上記反応溶液を３７℃にて一晩で撹拌し、上記混合液を濃縮乾燥し、固形物として目的の化合物３８（１６８ｍｇ、９８％）を得た。ＬＣ−ＭＳによる分析の結果、（ＥＳＩ）３８３（Ｍ＋Ｈ＋）、４０５（Ｍ＋Ｎａ＋）であり、更に浄化せずに次の工程に使用した。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）３８３（Ｍ＋Ｈ＋）、４０５（Ｍ＋Ｎａ＋）であった。
化合物３９の合成
化合物５（５２５ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（１７７ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて３０分撹拌した。溶媒を除去し、残りの物質を、溶離剤としてジクロロメタン、２％のメタノールのジクロロメタン溶液、及び最後に５％のメタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として目的の化合物３９（３６４ｍｇ、６５％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３９（ｓ、９Ｈ）、１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．７０（ｍ、１Ｈ）、１．８２（ｍ、１Ｈ）、２．７０及び２．８２（２ｓ、３Ｈ）、２．９０（ｓ、３Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）、３．３０〜３．３７（ｍ、４Ｈ）、４．１６（ｔ、１Ｈ）、４．２７（ｍ、１Ｈ）、４．３３（ｄ、２Ｈ）、５．０２（ｂｓ、２Ｈ）、７．２４〜７．３６（ｍ、６Ｈ）、７．５１〜７．６５（ｍ、４Ｈ）、７．７４（ｄ、２Ｈ）ｐｐｍ；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）６１８（Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ＋）、６６２（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋）、７１８（Ｍ＋Ｈ＋）、７４０（Ｍ＋Ｎａ＋）、１４３５（２Ｍ＋Ｈ＋）；であった。
化合物４０の合成
化合物４０を上記化合物１７ａと同様に調製し、９８％収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）３９６（Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ＋），４９６（Ｍ＋Ｈ＋），５１７（Ｍ＋Ｎａ＋），５３３（Ｍ＋Ｋ＋），９９２（２Ｍ＋Ｈ＋）であった。
化合物４１の合成
化合物４０（１３８ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液に、化合物３８（１１０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３６ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１，３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を、溶離剤として０．１％ＴＦＡの水及びアセトニトリル溶液を用い、半調製のＨＰＬＣにより精製し、油状物として目的の化合物４１（１７８ｍｇ、７０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）７６０（Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ＋）、８０４（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋）、８６０（Ｍ＋Ｈ＋）、８８２（Ｍ＋Ｎａ＋）、８９９（Ｍ＋Ｋ＋）。
化合物４２を上記化合物１７ａと同様に調製し、９８％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）５３８（Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ＋），５８２（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋），６３８（Ｍ＋Ｈ＋），６６０（Ｍ＋Ｎａ＋）であった。
化合物４２（２３ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、０℃にてＧＭＢＳ（Ｎ（マレイミドブチリルオキシ）スクシニミドエステル）（１４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（８．４μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合液を徐々に室温に加温し、更に３０分間撹拌を続けた。溶媒を蒸発させ、残りの物質を、溶離剤として０．１％ＴＦＡの水及びアセトニトリル溶液を用い、半調製済みのＨＰＬＣにより精製し、油状物として所望の化合物４３（２６ｍｇ、７９％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）７０３（Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ＋）、７４７（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ｂｕｔｙｌ＋）、８０３（Ｍ＋Ｈ＋）、８２５（Ｍ＋Ｎａ＋）、８４１（Ｍ＋Ｋ＋）。
化合物４４の合成
化合物４４を、上記の化合物１５ａと同様に調製し、９８％の収率にて得た。分析の結果、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）７０３（Ｍ＋Ｈ＋）、７２５（Ｍ＋Ｎａ＋）であった。
化合物４５の合成
化合物４４（１５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）及び化合物３３（１０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．８ｍＬ）溶液に、室温にてジイソプロピルエチルアミン（５．５μＬ、０．０３２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた上記混合液を室温にて一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残りの物質を、溶離剤として０．１％のＴＦＡの水及びアセトニトリル溶液を用い、半調製済みのＨＰＬＣにより精製し、油状物として目的の化合物４５（１０ｍｇ、４５％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）１１９４（Ｍ＋Ｈ＋）、１２１５（Ｍ＋Ｎａ＋）、１２３３（Ｍ＋Ｋ＋）。
＜実施例６＞
化合物（２）の合成
化合物１（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及び１０％のＰｄ−Ｃ（３５ｍｇ）のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／２、１０ｍｌ）溶液を、４０秒間真空下において脱気した。得られた混合液を、水素雰囲気下に静置し、２５℃にて７時間撹拌した。上記反応溶液をセライト（ＣＨ２Ｃｌ２、ウォッシュ）にて濾過した。溶媒を真空下にて除去した。ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２／８）を溶出液として用いたシリカゲル上のクロマトグラフィーにより、化合物２（７７ｍｇ、９８％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．３６（ｓ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．７２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．６１（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、７．４５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．２６１（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）４．０６（ｍ、４Ｈ）、３．７３（ｍ、１Ｈ）、１．５２（ｓ、９Ｈ）；であった。
化合物（４）の合成
化合物２（３５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の４Ｍ ＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（５ｍｌ）溶液を、３０分間Ａｒガスの雰囲気下、２５℃にて撹拌した。溶媒を真空内で除去した。残りの物質に、５−アセチルインドン−２−カルボキシル酸（２４．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。ＥＤＣ（２２．９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液を添加し、上記反応溶液を２５℃で５時間撹拌した。溶媒を除去し。粗精製物を、１０％ＭｅＯＨのＣＨ２Ｃｌ２溶液を溶出液として用いてシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（４０．７ｍｇ、９３％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）５１２．１３（ｓ、１Ｈ）、１０．４７（ｓ、１Ｈ）、８．４５（ｓ、１Ｈ）、８．１０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．９６（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５１（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．３６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．６）、７．３５（ｓ、１Ｈ）、４．８１（ｔ、１Ｈ、１１．２Ｈｚ）、４．５４（ｄｄ、１Ｈ、８．８Ｈｚ）、４．２３（ｍ、１Ｈ）、４．０１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．２Ｈｚ）、３．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．７Ｈｚ）、２．６１（ｓ、３Ｈ）；であった。
化合物（５）の合成
４−メチル−１−ピペラジンカルボニルクロライド塩酸（１９．９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、化合物４（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（２５μｍｌ、０．３ｍｍｏｌ）を含む、３％アリルアルコールの無水メチレンクロライド（４ｍｌ）溶液に添加し、上記混合液を１６時間撹拌した。上記粗生成物をシリカゲルにより精製し、化合物５（２３．６ｍｇ、９１％）を得た。分析の結果、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０３（ｓ、１Ｈ）、８．４１（ｓ、１Ｈ）、８．２１（ｓ、１Ｈ）、８．０１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．８２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５８（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．４６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．３７（ｓ、１Ｈ）、４．８６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、４．５７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、４．３８（ｍ、１Ｈ）、４．０６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、３．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１Ｈｚ）、３．４１（ｂｒ、４Ｈ）、３．２９（ｂｒ、４Ｈ）、２．８２（ｓ、３Ｈ）、２．５７（ｓ、３Ｈ）；であった。
化合物（７）の合成
化合物５（１３ｍｇ、２４μｍｏｌ）及びリンカー６（１６．９ｍｇ、３１μｍｏｌ）を、５％の酢酸の無水メチレンクロライド（１ｍｌ）溶液に溶解し、２５℃で３０分間撹拌した。溶媒を完全に真空内で除去し、ＨＰＬＣ（ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７μｍ、１９×１５０ｍｍのカラム）により精製し、化合物７（１８．５ｍｇ、８１％）を得た。ＭＳ分析の結果、Ｃ４８Ｈ５７ＣｌＮ８Ｏ１１（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ９５８．３８，ｆｏｕｎｄ：９５８．１０と算出された。
＜実施例７＞
化合物１の合成
２−ブロモエチルアミン臭化物（５ｇ、２４．４ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）中溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（８．５ｍＬ、４８．８ｍｍｏｌｅ）及びベンジルクロロホルメート（３．４８ｍＬ、２４．４ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残余物を酢酸エチル／ヘキサン（３／７）勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、油状物（４ｇ、６４％）として化合物１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．５４（ｂｓ、２Ｈ）３．６１（ｂｓ、２Ｈ）５．１２（ｓ、２Ｈ）７．３６（ｍ、５Ｈ）。
化合物２の合成
化合物１（３．３４ｇ、１２．９９ｍｍｏｌｅ）及びバリンｔｅｒｔ−ブチルエステル（３．２７ｇ、１５．５９ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）中の溶液に、炭酸カリウム（５．３９ｇ、３８．９７ｍｍｏｌｅ）及びヨウ化カリウム（２．５９ｇ、１５．５９ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を１００℃で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、残余物を酢酸エチル／ヘキサン（２／８）勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、油状物（３．１２ｇ、６９％）として化合物２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．９２（ｍ，６Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．８６（ｍ，１Ｈ），２．５３（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｍ，１Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），５．２５（ｂｓ，１Ｈ），７．３６（ｍ，５Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ） ２９６（Ｍ＋Ｈ−ｂｕｔｙｌ＋），３５２（Ｍ＋Ｈ＋）．
化合物３の合成
化合物２（３．４ｇ、９．７２ｍｍｏｌｅ）及びパラジウム／炭素（２００ｍｇ）上のメタノール（３０ｍＬ）中溶液を、室温で、水素雰囲気下に置いた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。パラジウムを濾過し、反応混合物を乾燥させて濃縮し、油状物（２．１ｇ、９８％）として化合物３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ０．９４（ｍ，６Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．６３（ｂｓ，２Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ）．
化合物４の合成
化合物３（２．１ｇ、９．７２ｍｍｏｌｅ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の溶液に、０℃でＦｍｏｃＯＳｕ（Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（３．２８ｇ、９．７２ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を０℃で２時間撹拌した。混合物を乾燥させ、更に残余物を、１００％のジクロロメタン、０．５％のジクロロメタン（／メタノール）、最後に１％のジクロロメタン（／メタノール）勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、濃縮し、無色の油状物（２．５５ｇ、６０％）として化合物４を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．０３（ｄ，３Ｈ），１．１４（ｄ，３Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），２．２８（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｄ，１Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄ，２Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ） ３８３（Ｍ＋Ｈ−ｔｂｕｔｙｌ＋），４４０（Ｍ＋Ｈ＋），４６２（Ｍ＋Ｎａ＋），４７８（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物５の合成
化合物４（１７７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌｅ）のテトラヒドロフラン−水（３／１、８ｍＬ）中の溶液に、ＨＣｌガスを供給して５分間バブリングした。反応混合物を一晩３７℃で撹拌し、乾燥させて濃縮し、固体（１６８ｍｇ、９８％）として化合物５を得た。混合物を更に精製せずに次の工程に用いた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．０４（ｄ，３Ｈ），１．１４（ｄ，３Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｄ，１Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，２Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．７９（ｄ，２Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）３８３（Ｍ＋Ｈ＋），４０５（Ｍ＋Ｎａ＋）．
化合物２３の合成
エチル−５−ニトロインドール−２カルボネート（２ｇ、８．５ｍｍｏｌｅ）及びパラジウム／炭素（２００ｍｇ）の５０％メタノール／ジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液を、室温で水素雰囲気下に置いた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。パラジウムを濾過し、反応混合物を乾燥して濃縮し、無色油状物（１．６８ｇ、９７％）として化合物２３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３８（ｔ，３Ｈ），４．３４（ｑ，２Ｈ），６．８６（ｄｄ，１Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｄ，１Ｈ）．
化合物２４の合成
化合物２３（３００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌｅ）のジクロロメタン（５ｍＬ）中の溶液に、Ｂｏｃ２Ｏ（３８５ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残余物を１０％の酢酸エチル／ヘキサンの勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、白色固体（２７２ｍｇ、６１％）として化合物２４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３９（ｔ，３Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），４．３７（ｑ，２Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｄｄ，１Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ），７．６８（ｂｓ，１Ｈ）．
化合物２５の合成
化合物２４（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌｅ）のエタノール（３ｍＬ）中の溶液に、ＬｉＯＨ（１２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌｅ）の水（１ｍＬ）中の溶液を添加した。得られた混合物を５０℃で室温で２時間撹拌した。反応混合物を乾燥させて濃縮し、油状物を得た。残余物を水に溶解させ、１０％のＨＣｌでｐＨ３に酸性化した。更にＥｔＯＡｃで抽出した。有機溶液をＮａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、濾過し、乾燥させて濃縮し、無色の油状物（８５ｍｇ、９２％）として化合物２５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．５１（ｓ，９Ｈ），７．０７（ｄ，１Ｈ），７．２３（ｄｄ，１Ｈ），７．３３（ｄ，１Ｈ），７．６８（ｂｓ，１Ｈ）．
化合物２６の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ（２０６ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌｅ）の３０％ＤＭＦ／ジクロロメタン（３ｍＬ）中溶液に、室温でＥＤＣ（１２０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌｅ）、ＨＯＢｔ（８４ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌｅ）及びｔｅｒｔ−ブチル−４アミノベンゾアート（１２０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を１０分間撹拌し、塩化銅（８４ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌｅ）を混合物に添加した。混合物を一晩撹拌した。混合物を乾燥させ、濃縮し、残余物を５％のメタノール／ジクロロメタンの勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、無色の油状物（１８４ｍｇ、６２％）として化合物２６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．５３−１．５８（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｓ，９Ｈ），１．７１（ｍ，１Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｍ，１Ｈ），３．１９（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．３９（ｍ，３Ｈ），７．４９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．８６（ｍ，５Ｈ），７．８９（ｍ，２Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），５７３（Ｍ＋Ｈ＋），５９５（Ｍ＋Ｎａ＋），６１１（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物２７の合成
化合物２６（１ｇ、１．７５ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（１８ｍＬ）中の溶液に、室温でピペリジン（２ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を乾燥させ、濃縮し、残余物を１００％のジクロロメタン、５％メタノール／ジクロロメタン及び最後に２０％メタノール／ジクロロメタンの勾配でフラッシュクロマトグラフィで精製し、無色の油状物（５６１ｍｇ、９２％）を得た。
油状物（５６１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（６７９μＬ、３．９ｍｍｏｌｅ）、化合物５（５０９ｍｇ、１．３ｍｍｏｌｅ）（調製については実施例１を参照）及びＨＡＴＵ（４９４ｍｇ、１．３ｍｍｏｌｅ）を室温で添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を乾燥させ、濃縮し、残余物を５％のメタノール／ジクロロメタンの勾配でシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、無色の油状物（６９１ｍｇ、６５％）として化合物２７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３６（ｄｄ，６Ｈ），１．５８−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．６（ｓ，９Ｈ），１．７１（ｍ，１Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），３．２−３．３（ｍ，４Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，２Ｈ），４．３８（ｍ，２Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．６０−７．７０（ｍ，４Ｈ），７．８（ｄ，２Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），７１６（Ｍ＋Ｈ＋），７３７（Ｍ＋Ｎａ＋），７５３（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物２８の合成
化合物２７（３００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（９ｍＬ）中の溶液に、室温でピペリジン（１ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。次に混合物を乾燥させて濃縮し、油状物を得、エーテル（２０ｍＬ）中に分散させた。物質を濾過し、白色固体（１８６ｍｇ、８４％）を得た。
遊離アミン（３２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌｅ）のジクロロメタン（１ｍＬ）中の溶液に、ＭＡＬ−ＰＥＧ４−ＮＨエステル（５０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残余物を半調製的ＨＰＬＣで精製し、油状物（４７ｍｇ、９５％）として化合物２８を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．１０及び１．１５（２ｄ，６Ｈ），１．５８−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．６（ｓ，９Ｈ），１．７５（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｔ，２Ｈ），２．５（ｔ，２Ｈ），３．１０−３．２５（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｍ，２Ｈ），３．４５−３．６５（ｍ，１６Ｈ），３．７５（ｍ，４Ｈ），３．８５（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｓ，２Ｈ）５ ７．６７（ｄ，２Ｈ），７．９０（ｄ，２Ｈ），８．８０（ｄ，１Ｈ），１０．２０（ｓ，１Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），８９１（Ｍ＋Ｈ＋），９１３（Ｍ＋Ｎａ＋），９２９（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物２９の合成
化合物２８（４７ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌｅ）のジクロロメタン（０．５ｍＬ）中の溶液に、室温でトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで混合物を乾燥させて濃縮し、油状物（４０ｍｇ、９２％）として化合物２９を得た。更に精製せずに次の処理に用いた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．１０及び１．１５（２ｄ，６Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｔ，２Ｈ），２．５（ｔ，２Ｈ），３．１０−３．２５（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｍ，２Ｈ），３．４５−３．６５（ｍ，１６Ｈ），３．７５（ｍ，４Ｈ），３．８５（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｓ，２Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ），７．９５（ｄ，２Ｈ），８．８０（ｄ，１Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），８３６（Ｍ＋Ｈ＋），８５８（Ｍ＋Ｎａ＋），８７４（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物３１の合成
化合物３０（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌｅ）のＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）中の溶液に、濃ＨＢｒ／ＥｔＯＡｃ（３ｍＬ）溶液を室温で添加した。１時間後にＢｏｃ脱保護が終了した。沈殿物を濾過した（多量）。次にＴＦＡ加塩されたアミンをＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解させた。この溶液に化合物２５（５５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌｅ）、ジイソプロピルエチルアミン（１７３μＬ、１ｍｍｏｌｅ）及びＨＡＴＵ（７９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残余物を半調製的ＨＰＬＣで精製し、白色固体（８６ｍｇ、５７％）として化合物３１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．５４（ｓ，９Ｈ），２．９１（ｓ，３Ｈ），３．１０−３．６０（ｍ，８Ｈ），３．７２（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．６０（ｍ，３Ｈ），６．９４（ｂｓ，１Ｈ），７．０５（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，１Ｈ），７．４５（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ），７．７５（ｂｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，１Ｈ），８．２３（ｂｓ，１Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），５６２（Ｍ＋Ｈ−１００＋），６０６（Ｍ＋Ｈ−５６＋），６６２（Ｍ＋Ｈ＋），６８５（Ｍ＋Ｎａ＋），７０１（Ｍ＋Ｋ＋）．
化合物３２の合成
化合物３１（３０ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌｅ）のジクロロメタン（０．５ｍＬ）中の溶液に、室温でアニソール（１００μＬ）及びトリフルオロ酢酸（０．４ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。次に混合物を乾燥させて濃縮し、油状物を得た。これを更に精製せずに次の処理に用いた。
当該油状物のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液に、化合物２９（３６ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌｅ）、ジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ、０．２３ｍｍｏｌｅ）及びＨＡＴＵ（１５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌｅ）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残余物を半調製的ＨＰＬＣで精製し、油状物（３６ｍｇ、６０％）として化合物３２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．０９及び１．１５（２ｄ，６Ｈ），１．６２（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｍ，１Ｈ），１．９３（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｔ，２Ｈ），２．５１（ｔ，２Ｈ），２．９８（ｓ，．３Ｈ），３．１３−３．２５（ｍ，４Ｈ），３．４７−３．６２（ｍ，２４Ｈ），３．７６（ｍ，４Ｈ），３．８２（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｄ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．７０（ｍ，４Ｈ），６．７９（ｓ，２Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｂｓ，１Ｈ），７．４３−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．８１（ｍ，３Ｈ），７．９１（ｍ，３Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｂｓ，１Ｈ），８．８２（ｄ，１Ｈ），１０．２５（ｓ，１Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ），６９１（Ｍ＋２Ｈ＋）／２，１３８１（Ｍ＋Ｈ＋），１４１９（Ｍ＋Ｋ＋）．
＜実施例８＞：増殖アッセイ
本発明の細胞障害性化合物の生物学的活性は、確立した３Ｈチミジン増殖アッセイにより解析することができる。これは放射性同位元素で識別された３Ｈチミジンの外部からの取り込みを測定することによりＤＮＡ合成を解析する方法であり、細胞増殖を数量化する簡便な方法である。この分析は、非常に再現性が高く、多数の化合物に適用することができる。
解析にあたり、前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）を、熱不活性化した１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地で培養した。解析を行う日に細胞を回収し、洗浄の後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩを０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液を１００μｌずつ、９６ウェルプレートに分注した。ドキソルビシン（陽性コントロール）又は試験化合物の連続希釈（３倍増）系列を調製し、化合物を１００μｌずつ添加した。最後に、ウェル当たり１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈチミジンを１０μｌ添加し、プレートを２４時間インキュベートした。９６ウェルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用してプレートから細胞を回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔカウンターにより計測した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用しＩＣ５０値を決定した結果、３Ｈチミジン編入と薬剤モル濃度の関数が、４パラメータの対数曲線として表された。
本発明の化合物は一般に、上記の解析において約１ｐＭから約１００ｎＭ（望ましくは約１０ｐＭから約１０ｎＭ）のＩＣ５０値を有する。
＜実施例９＞：抗体に対する薬剤−リンカー分子のコンジュゲート
この実施例は、ターゲティング薬品（Ｘ４）などの抗体に、本発明の薬剤−リンカー分子（任意に、例えばスペーサー、反応性官能基など他の基を含む）を接合する反応条件及び方法に関する。その反応及び方法は単なる例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。抗体に薬剤−リンカー分子を接合する他の方法は当業者に公知である。
本願明細書において記載されているコンジュゲート方法は、抗体のリジン残基と２−イミノチオランとの反応による、抗体へのフリーなチオール基の導入、及びそれに続く薬剤−リンカー分子と活性マレイミド基との反応に基づく。最初に、コンジュゲートされた抗体を、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＰＡ（ｐＨ８．０）を含む０．１Ｍリン酸塩バッファー（ｐＨ８．０）によりバッファー交換し、５〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。上記抗体に２−イミノチオランを付加し、チオール化した。添加した２−イミノチオランの量は予備実験において決定され、抗体毎に随時変化させる。予備実験において、抗体に２−イミノチオランを滴定してタイトレーションし、室温にて１時間抗体をインキュベートし、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ６．０）を使用し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにより抗体を脱塩し、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）と反応させて導入されたチオール基の数を迅速に測定した。ＤＴＤＰのチオール基との反応は、チオピリジンの遊離を３２４ｎｍでモニターすることにより行った。０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の試料を用いた。２８０ｎｍの吸光度により、サンプル中のタンパク質濃度を測定し、各サンプルを０．９ｍｌずつ調製し、０．１ｍｌのＤＴＤＰ（５ｍＭ、エタノール溶液）を添加し、１０分間室温にてインキュベートした。バッファ単独、及びＤＴＤＰを含まないサンプルも同様にインキュベートした。１０分後、３２４ｎｍの吸光度を測定し、存在するチオール基の数を、チオピリジンの減衰係数１９８００Ｍ−１を使用して定量化した。
抗体当たり３つのチオール基によるチオール化レベルが望ましい。これは、例えば１つの特定の抗体に対して１５倍のモル数の２−イミノチオランを添加し、１時間の室温にてインキュベートすることにより行われる。コンジュゲートされた抗体は、その後適切なモル比率で２−イミノチオランとインキュベートされ、更に活性化バッファー（５ｍＭグリシン、３％グリセロール及び２ｍＭのＤＴＰＡを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ６．０））により脱塩される。チオール化されたサンプルを氷上で保存し、導入されたチオール基の数を上記の通りに測定する。
導入されたチオール基の数の測定後、活性化マレイミド基を含む薬剤−リンカー分子を、チオール基に対して３倍のモル数で添加したコンジュゲート反応は、更に最終濃度５％のエチレングリコールジメチルエーテル（又は他の適切な溶媒）を含むコンジュゲーションバッファーにて行った。通常、薬剤−リンカーのストック溶液は、９０％エチレングリコールジメチルエーテル／１０％ジメチルスルホキシド溶液に溶解した。抗体への付加において、チオール化抗体にストック溶液を直接添加することが可能で、それによりエチレングリコールジメチルエーテルが最終濃度５％となるのに十分となる。又は、最終濃度１０％のエチレングリコールジメチルエーテルを含むようにコンジュゲーションバッファーを前希釈し、その後等量のチオール化抗体溶液を添加してもよい。
コンジュゲート反応は、室温にて２時間、撹拌しながらインキュベートして行われた。インキュベート後、反応混合液を１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、すぐに精製しない場合はｐＨを７．２に調整した。コンジュゲートの精製は、多くの方法を組み合わせたクロマトグラフィーにより行った。コンジュゲートは、５ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び３％グリセロールを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）によって予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラムを用い、限外濾過クロマトグラフィーにより精製することができる。クロマトグラフィーを２８ｃｍ／時間の線形流速により行った。コンジュゲートを含むフラクションを回収し、プールし、濃縮した。あるいは、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することも可能である。精製条件を抗体毎に変化させ、いずれの場合においても最適化が必要となる。例えば、抗体−薬剤コンジュゲート反応混合液を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグリシン、３％グリセロール（ｐＨ６．０）溶液により予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにアプライして行った。上記抗体コンジュゲートを、平衡化バッファーにおける０〜１ＭのＮａＣｌ濃度勾配により溶出した。上記コンジュゲートを含むフラクションをプールし、ｐＨ７．２に調整し、必要に応じてサンプルを濃縮した。
＜実施例１０＞：ｉｎ Ｖｉｖｏ試験
Ａ．ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍異種移植片の処理
抗ＰＳＭＡ抗体（２Ａ１０、２００５年２月１８日に共同出願した米国特許出願第６０／６５４１２５号に記載、本発明に援用）、及びアイソタイプコントロール抗体（抗ＣＤ７０ ＩｇＧ１クローン２Ｈ５、共同出願した米国特許出願第６０／７２０６００号に記載、本発明に援用）を各々バッファ交換（５０ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＤＴＰＡを含有する０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８．０））し、６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。両方の抗体を更に１時間室温で２−イミノチオレーンの２５倍のモル過剰でインキュベートしてチオール化し、５０ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＤＴＰＡを含有する０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ６．０）で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いて脱塩した。導入されるチオール基の数を測定する間、チオール化抗体を氷上で保存した。この測定はジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）でチオール化抗体試料を反応させることにより実施した。２８０ｎｍの吸収度を正確に測定してサンプル中のタンパク質の濃度を測定し、更に各サンプル（０．９ｍｌ）のアリコートを、室温で１０分間、０．１ｍｌのＤＴＤＰ（エタノール中の５ｍＭストック液を使用）とインキュベートした。ＤＴＤＰバッファのみのブランクサンプルも同時にインキュベートした。３２４ｎｍの吸収度を測定し、抗体あたりのチオールの数を、１９８００Ｍ−１のチオピリジンの減衰係数を使用して算出した。抗体あたり、抗ＰＳＭＡ抗体の場合に５．３個のチオール、アイソタイプコントロールの場合に６．０個のチオールが導入された。
チオール化抗体を更に、チオール基のモル濃度に対する３倍モル過剰の化合物Ａでインキュベートした。
化合物Ａ
化合物ＡのＤＭＳＯ中の５ｍＭストック液を充分なＤＭＳＯと共にチオール化抗体に添加し、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの最終濃度とした。室温で３時間インキュベートした後、トリエタノールアミンを使用してインキュベート混合物のｐＨを７．０に上昇させた。抗体−化合物Ａコンジュゲートを更に、０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．２）（５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含有）で予め平衡化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム上の限外除去クロマトグラフィで精製した。モノマーコンジュゲートを含有するフラクションを回収してプールした。得られる精製コンジュゲートを更に１０ｋＤａ分画膜を使用して窒素下で撹拌し、濃縮した。コンジュゲートの濃度及び変換比率（抗体分子当たり結合した分子の数）を、２８０ｎｍ及び３４０ｎｍの吸光度と、各波長について予め測定した抗体及び化合物Ａの減衰係数を参照することにより測定した。
化合物Ａにコンジュケートした抗ＰＳＭＡ（２Ａ１０クローン）抗体の抗腫瘍活性を、オスのＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ社製、ＮＹ）で増殖させたＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌の異種移植片）で試験した。ＰＳＭＡを高レベルで発現するＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞をＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃ ＣＲＬ−１７４０）から得、ＡＴＣＣの指示に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。８週齢のオスＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社製）を、マウス当たり０．２ｍｌＰＢＳ／マトリゲル（１：１）中の２．５×１０６ＬＮＣａＰ細胞で、右側腹部に皮下注射した。マウスは、移植後３週目から、毎週２回、電子ノギスで腫瘍サイズを３次元的に測定した。個々の腫瘍体積は、高さ×幅×長さとして算出した。適当なサイズの血管新生した腫瘍（腫瘍の外見により判断）を有するマウスを無作為に治療群として分け、０日目において個々の体重に対応する量で投薬した。マウスを投薬後約６０日において腫瘍成長をモニターし、試験終了時に終了させた。腫瘍が腫瘍エンドポイント（１５００のｍｍ３）に達したときにマウスを安楽死させた。
表１：ＬＮＣａＰ異種移植試験の結果
図１に示すように、２Ａ１０−化合物Ａコンジュゲートの０．３μｍｏｌｅ／ｋｇ（細胞毒素化合物Ａのモル数を指す）の添加により、３つの確立した小さいＬＮＣａＰ腫瘍全ての完全な後退が誘発された。
Ｂ．用量応答試験
抗ＰＳＭＡ抗体（２Ａ１０）を５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＰＡを含有する０．１Ｍのリン酸塩バッファ（ｐＨ８．０）でバッファ交換し、５．６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。更に抗体を、室温で１時間、７．５倍のモル過剰の２−イミノチオレーンを用いてインキュベートしてチオール化し、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して、５ｍＭのグリシン、２ｍＭのＤＴＰＡ及び３％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ６．０）で脱塩した。導入されるチオール基の数を測定する間、チオール化抗体を氷上で保存した。この測定はジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）でチオール化抗体試料を反応させることにより実施した。２８０ｎｍの吸収度を正確に測定してサンプル中のタンパク質の濃度を測定し、更に各サンプル（０．９ｍｌ）のアリコートを、室温で１０分間、０．１ｍｌのＤＴＤＰ（エタノール中の５ｍＭストック液を使用）とインキュベートした。ＤＴＤＰバッファのみのブランクサンプルも同時にインキュベートした。３２４ｎｍの吸収度を測定し、抗体あたりのチオールの数を、１９８００Ｍ−１のチオピリジンの減衰係数を使用して算出した。
次にチオール化抗体を、チオール基のモル濃度に対して２倍モル過剰の化合物Ａとインキュベートした。化合物Ａの５ｍＭストック液（１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ／９０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールジメチルエーテル中の）を、充分なエチレングリコールジメチルエーテルと共にチオール化抗体に添加し、５％（ｖ／ｖ）に最終濃度とした。室温で２時間のインキュベートした後、化合物Ａが結合した抗体をイオン交換クロマトグラフィで精製した。反応混合物を、バッファＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ６．０）で、事前に平衡化したＳＰ−セファロースカラムにアプライした。カラムをバッファＡで洗浄し、次に９５％のバッファＡ、５％のバッファＢ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．２）で洗浄し、更に抗体−化合物Ａコンジュゲートを、１０％のバッファＢ（９０％のバッファＡ）で溶出した。モノマーコンジュゲートを含有するフラクションを回収し、プールし、モノエタノールアミンを添加してｐＨを７．２に調整した。得られる精製されたコンジュゲートを更に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．２で透析し、更に１０ｋＤａ分画膜を使用して窒素下で撹拌し、濃縮した。コンジュゲートの濃度及び変換比率（抗体分子当たり結合した分子の数）を、２８０ｎｍ及び３４０ｎｍの吸光度と、各波長について予め測定した抗体及び化合物Ａの減衰係数を参照することにより測定した。イオン交換カラムからのコンジュゲートの溶出を１５％のバッファＢ（８５％のバッファＡ）により実施したことを除き、アイソタイプコントロール（抗ＣＤ７０ ２Ｈ５）コンジュゲートを同様の方法を使用して調製した。
上記の通りに雄のＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスで増殖させたＬＮＣａＰヒト前立腺癌の異種移植片を使用して、コンジュゲートの有効性及び選択性を解析した。この異種移植片検討のデザインを、表２に示す。
表２：ＬＮＣａＰ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ試験のまとめ
表２及び図２−３に示すように、０．１５μｍｏｌｅ／ｋｇの抗ＰＳＭＡ−化合物Ａ（図２）は、０．９０μｍｏｌｅ／ｋｇのアイソタイプコントロール−化合物Ａよりも良好な抗腫瘍有効性を示した。少なくとも＞６倍の選択性指を示した（図３）。０．９０μｍｏｌｅ／ｋｇの抗ＰＳＭＡ−化合物Ａは一時的な毒性（図５）を示したが、許容上限量以下であった。以上より、ＬＮＣａＰ−腫瘍を有するマウスにおいて、抗ＰＳＭＡ−化合物Ａでは６倍以上の治療指数が確認された。
Ｃ．大型腫瘍に対する効果
抗ＰＳＭＡ抗体（２Ａ１０）を５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＰＡを含有する０．１Ｍのリン酸塩バッファ（ｐＨ８．０）でバッファ交換し、５．６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。更に抗体を、室温で１時間、９倍のモル過剰の２−イミノチオレーンを用いてインキュベートしてチオール化し、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して、５ｍＭのグリシン、２ｍＭのＤＴＰＡ及び３％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ６．０）で脱塩した。導入されるチオール基の数を測定する間、チオール化抗体を氷上で保存した。この測定はジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）でチオール化抗体試料を反応させることにより実施した。２８０ｎｍの吸収度を正確に測定してサンプル中のタンパク質の濃度を測定し、更に各サンプル（０．９ｍｌ）のアリコートを、室温で１０分間、０．１ｍｌのＤＴＤＰ（エタノール中の５ｍＭストック液を使用）とインキュベートした。ＤＴＤＰバッファのみのブランクサンプルも同時にインキュベートした。３２４ｎｍの吸収度を測定し、抗体あたりのチオールの数を、１９８００Ｍ−１のチオピリジンの減衰係数を使用して算出した。
次にチオール化抗体を、チオール基のモル濃度に対して２倍モル過剰の化合物Ａとインキュベートした。化合物Ａの５ｍＭストック液（１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ／９０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールジメチルエーテル中の）を、充分なエチレングリコールジメチルエーテルと共にチオール化抗体に添加し、５％（ｖ／ｖ）に最終濃度とした。室温で２時間のインキュベートした後、化合物Ａが結合した抗体をイオン交換クロマトグラフィで精製した。反応混合物を、バッファＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ６．０）で、事前に平衡化したＳＰ−セファロースカラムにアプライした。カラムをバッファＡで洗浄し、次に９５％のバッファＡ、５％のバッファＢ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．２）で洗浄し、更に抗体−化合物Ａコンジュゲートを、１０％のバッファＢ（９０％のバッファＡ）で溶出した。モノマーコンジュゲートを含有するフラクションを回収し、プールし、モノエタノールアミンを添加してｐＨを７．２に調整した。得られる精製されたコンジュゲートを更に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグリシン、３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．２で透析し、更に１０ｋＤａ分画膜を使用して窒素下で撹拌し、濃縮した。コンジュゲートの濃度及び変換比率（抗体分子当たり結合した分子の数）を、２８０ｎｍ及び３４０ｎｍの吸光度と、各波長について予め測定した抗体及び化合物Ａの減衰係数を参照することにより測定した。イオン交換カラムからのコンジュゲートの溶出を１５％のバッファＢ（８５％のバッファＡ）により実施したことを除き、アイソタイプコントロール（抗ＣＤ７０ ２Ｈ５）コンジュゲートを同様の方法を使用して調製した。
コンジュゲートの有効性及び選択性を、上記のオスのＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスで増殖させたＬＮＣａＰヒト前立腺癌の異種移植片を使用して解析した。これらの異種移植片試験のデザインを表３及び４に示す。
表３：ＬＮＣａＰ異種移植片試験のまとめ
表３及び図６に示すように、抗ＰＳＭＡ−化合物Ａの低用量単回投与（０．１５μｍｏｌｅ／ｋｇ）により、２４０ｍｍ３の平均サイズの確立した大型ＬＮＣａＰ腫瘍の増殖を良好に阻害した。対照的に、アイソタイプコントロール−化合物Ａ（０．１５μｍｏｌｅ／ｋｇ）は軽微な抗腫瘍有効性を示した。表４及び図７に示すように、抗ＰＳＭＡ−化合物Ａの０．３０μｍｏｌｅ／ｋｇの単回投与により、退縮の誘導、４３０ｍｍ３の平均サイズの非常に大型のＬＮＣａＰ腫瘍の増殖阻害が示された。
表４：ＬＮＣａＰ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ試験のまとめ
＜実施例１１＞ｉｎ Ｖｉｖｏ試験
以下のサンプルを、上記と同様の手順に従い調製した。
毒素１
毒素２
健常なボランティアドナーから収集した５つの軟膜サンプルを得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ｐｌｕｓ法（Ｒｅｆ ０７９０７、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メラン、フランス）に従って勾配遠心分離を使用して精製した。ｉｎ ｖｉｖｏ注入の前、並びにＦＡＣＳ分析の前に、ＰＢＭＣ細胞の生存度を０．２５％のトリパンブルー染色により解析した。
以下の表に示す５つのＣＤ標識を解析した：
２つのＰＢＭＣサンプル（群１〜３（裸の抗体の試験用）及び群４〜６（毒素共役抗体の試験用））を用いた。選択の基準を全細胞数、最高ＣＤ５６％及び細胞生存度とした。
７８匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右側腹部に、５×１０６７８６−Ｏ細胞のＲＰＭＩ１６４０培地中懸濁液２００μｌを注入して腫瘍を皮下に誘導した。これらの７８６−Ｏ細胞は、これらのｉｎ ｖｉｖｏ実験で用いたのと同じ抗体を使用したＦＡＣＳ実験において、標的抗原ＣＤ７０を発現することが示された。平均腫瘍体積が８０ｍｍ３（約１５日）に到達したときに処理を開始した。処理開始前に、移植した７８匹のうち、腫瘍を有する４８匹のマウスをランダムに６つの８匹の動物群に分けた。各群の平均腫瘍量はほぼ同じであり、他の群（分散分析）と統計学的に異ならなかった。４８匹のランダム化されたマウスに対して、ヒトＰＢＭＣサンプルを、群１〜３のマウス（マウスにつき４．８１×１０６ＣＤ５６陽性の細胞に対応する）に３．６×１０７細胞、及び群４〜６のマウス（マウスにつき４．７９×１０６ＣＤ５６陽性の細胞に対応する）に４．５×１０７細胞を単回ＩＰ注射した。
治療計画を以下のように設定した。
投与群１のマウスは、計画Ｑ４Ｄｘに従い１５ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊでのＩｇＧ１アイソタイプコントロールのＩＰ注入を繰り返した。
投与群２のマウスは、計画Ｑ４Ｄｘに従い１５ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊでの抗ＣＤ７０抗体のＩＰ注入を繰り返した。
投与群３のマウスは、計画Ｑ４Ｄｘに続いて、１５ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊでの抗ＣＤ７０非フコシル化抗体のＩＰ注入を繰り返した。
投与群４のマウスは、計画Ｑ１４Ｄｘ２に続いて毒素１−抗ＣＤ７０抗体コンジュゲートのＩＶ注入を２回行った。
投与群５のマウスは、計画Ｑ１４Ｄｘ２に続いて毒素１−抗ＣＤ７０非フコシル化抗体コンジュゲートのＩＶ注入を２回行った。
投与群６のマウスは、毒素２−抗ＣＤ７０抗体コンジュゲートの単回ＩＶ注入を行った。
図８は、試験期間にわたる腫瘍サイズ変化を示す。毒素も含まない場合の成長と比較し、いずれの抗体−毒素コンジュゲートでも腫瘍サイズの減少がもたらされた。図９は、試験期間にわたる体重変化を示す。
本発明の明細書にて言及又は参照された全ての特許出願、特許、刊行物並びにその他の刊行された文書は、それらの内容を本発明において援用する旨の明確な記載が存在するのと同程度の意味合いにて、それらの内容が本発明において援用される。
本発明において幾つかの具体的な態様を示しつつ記載したが、当業者であれば、本発明の技術的範囲及び添付された特許請求の範囲から逸脱することなく種々の変更、また均等物への置換を容易に想到しうると考えられる。更に、本発明の課題、技術的思想及び技術的範囲に適応する態様にて、特定の条件、原料、物質の組成、プロセス、プロセス中の工程に多様な工夫を加えることが可能である。それらの全ての工夫は、本願にて添付された特許請求の範囲内に含まれると解釈すべきである。
アイソタイプコントロール抗体−薬剤コンジュゲート、αＰＳＭＡ抗体−薬剤コンジュゲート、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウス間での、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 αＰＳＭＡ抗体−薬剤コンジュゲートの量を変化させて投与した、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 アイソタイプコントロール抗体−薬剤コンジュゲートの量を変化させて投与した、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 アイソタイプコントロール抗体−薬剤コンジュゲートの量を変化させて投与した、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する体重の変化を示すグラフ。 αＰＳＭＡ抗体−薬剤コンジュゲートの量を変化させて投与した、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 ２４０ｍｍ３の初期平均腫瘍体積を有する腫瘍を用い、アイソタイプコントロール抗体−薬剤コンジュゲート、αＰＳＭＡ抗体−薬剤コンジュゲート、又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 ４３０ｍｍ３の初期平均腫瘍体積を有する腫瘍を用い、αＰＳＭＡ抗体−薬剤コンジュゲート又はコンジュゲートバッファのみ（担体）を投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 アイソタイプコントロール、及び毒素−抗体コンジュゲートを投与したマウスでの、時間経過に対する腫瘍体積の変化を示すグラフ。 アイソタイプコントロール、及び毒素−抗体コンジュゲートを投与したマウスでの、時間経過に対する体重の変化を示すグラフ。

Claims (24)

  1. 抗体−薬剤コンジュゲートであって、少なくとも１つのタイプの腫瘍に対する選択性を有する抗体と、薬剤と、薬剤を抗体に結合させるリンカーを含んでなり、前記リンカーが腫瘍の存在下で切断可能であり、１μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で投与することにより、腫瘍の成長が遅延する、前記抗体−薬剤コンジュゲート。
  2. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを１μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が遅延する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  3. 前記腫瘍がＳＣＩＤマウスのヒト型腫瘍である、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  4. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．６μｍｏｌｅ／ｋｇ／日の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が遅延する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  5. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．３μｍｏｌｅ／ｋｇ／日の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が遅延する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  6. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．１５μｍｏｌｅ／ｋｇ／日の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が遅延する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  7. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを１μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が抑制される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  8. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．６μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が抑制される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  9. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．３μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が抑制される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  10. 前記抗体−薬剤コンジュゲートを０．１５μｍｏｌｅ／ｋｇ／日以下の投与量で、少なくとも５日間にわたり投与することにより、腫瘍の成長が抑制される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  11. 前記リンカーが、腫瘍の存在下で切断可能なヒドラジン部分を有する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  12. 前記リンカーが、腫瘍の存在下で切断可能なポリペプチドを有する、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  13. 前記腫瘍が癌腫瘍である、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  14. 前記腫瘍が前立腺癌腫瘍である、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  15. 前記薬剤が、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩベースのデュオカルマイシン類似体、ＭＣＢＩベースのデュオカルマイシン類似体、ＣＣＢＩベースのデュオカルマイシン類似体、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、マイタンシン、マイタンシン類似体、ＤＭ−Ｉ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポチロン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、エキノマイシン、エストラムスチン、セマドチン、エロイテロビン、メトプテリン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ビンクリスチン、タキソール、タキソテレレチノイン酸及びカンプトセシンからなる群から選択される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  16. 前記薬剤が以下の構造式
    （式中、環系Ａは置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール及び置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり、Ｅ及びＧは独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から選択されるメンバーであるか、又は、Ｅ及びＧは結合して置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール及び置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル基から選択される環系を形成し、ＸはＯ、Ｓ及びＮＲ２３から選択されるメンバーであって、Ｒ２３は水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル及びアシル基から選択されるメンバーであり、Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１及びＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであって、式中、Ｒ１１は水素、置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、二リン酸塩、三リン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２及びＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであって、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル及び置換若しくは非置換アリールから選択されるメンバーであって、Ｒ１２及びＲ１３は、それらが結合する窒素又は炭素原子と共に任意に結合し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含有する４〜６員の置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５’は独立に水素、置換アルキル、非置換アルキル、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６及びＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から選択されるメンバーであって、式中、ｎは１から２０の整数であり、Ｒ１５及びＲ１６は水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル及び置換若しくは非置換ペプチジル基から独立に選択されて、Ｒ１５及びＲ１６は、それらが結合する窒素又は炭素原子と共に任意に結合し、任意に２つ以上のヘテロ原子を含有する４〜６員の置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｒ６は単結合であるか存在せず、存在する場合にはＲ６及びＲ７が結合してシクロプロピル環を形成し、Ｒ７はＣＨ２−Ｘ１であるか、又は前記シクロプロピル環中で−Ｒ６と結合する−ＣＨ２−であって、式中、Ｘ１は離脱基であり、式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６の少なくとも１つはリンカーと結合する）、を有する薬剤であるか、又は前記薬剤がその薬学的に許容できる塩である、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  17. 前記薬剤が、以下の構造式
    （式中、ＺはＯ、Ｓ及びＮＲ２３から選択されるメンバーであって、式中、Ｒ２３は水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル及びアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は水素、置換若しくは非置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８又はＣＯ２Ｒ８であって、式中、Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９から選択されるメンバーであって、Ｒ９及びＲ１０は水素、置換若しくは非置換アルキル及び置換若しくは非置換ヘテロアルキルから独立に選択されるメンバーであり、Ｒ１’は水素、置換若しくは非置換低級アルキル又はＣ（Ｏ）Ｒ８であって、Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０及びＯＲ９から選択されるメンバーであって、Ｒ９及びＲ１０は水素、置換若しくは非置換アルキル及び置換若しくは非置換ヘテロアルキルから独立に選択されるメンバーであり、Ｒ２は水素、置換若しくは置換低級アルキル、非置換ヘテロアルキル、シアノ又はアルコキシル基であり、Ｒ２’は水素又は置換若しくは非置換低級アルキル、非置換ヘテロアルキル基であり、式中、少なくとも１つのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６はリンカーと結合する）で表される化合物であるか、又は前記薬剤がその薬学的に許容できる塩である、請求項１６記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  18. 前記薬剤が、以下の構造式
    （式中、ＺはＯ、Ｓ及びＮＲ２３から選択されるメンバーであって、式中、Ｒ２３は水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル及びアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は水素、置換若しくは非置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８又はＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ８は置換アルキル、非置換アルキル、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０及びＯＲ９からなる群から選択されるメンバーであって、Ｒ９及びＲ１０が水素、置換若しくは非置換アルキル及び置換若しくは非置換ヘテロアルキルから独立に選択されるメンバーであり、Ｒ２は水素、置換アルキル又は非置換低級アルキルであり、式中、少なくとも１つのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５又はＲ１６はリンカーに結合する）で表される化合物であるか、又は前記薬剤がその薬学的に許容できる塩である、請求項１６記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  19. 前記抗体−薬剤コンジュゲートが、
    から選択され、式中、Ａｂは抗体であり、Ｘ１はＣｌ又はＢｒであり、ＰＥＧはポリエチレングリコール部分である、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  20. 前記抗体−薬剤コンジュゲートが
    から選択される、請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
  21. 請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲートと、薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬製剤。
  22. 腫瘍細胞の死滅方法であって、前記腫瘍細胞に、その死滅に十分な量の請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲートを投与することを含んでなる方法。
  23. 哺乳類の患者の腫瘍の成長を遅延若しくは停止させる方法であって、前記患者に、成長を遅延若しくは停止させるのに十分な量の請求項１記載の抗体−薬剤コンジュゲートを投与することを含んでなる方法。
  24. 以下から選択される化合物。
    及び

    （式中、ｒは０から２４の整数である。）
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