EA028336B1 - Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1 - Google Patents

Abstract

Данное изобретение обеспечивает изолированные моноклональные антитела, особенно человеческие моноклональные антитела, в частности сконструированные антитела, которые приводят к получению улучшенного связывания с Fc рецепторами и/или повышенной эффективности ADCC, или иммуноконъюгаты, которые специфически связываются с CADM1 с высокой аффинностью. Также обеспечиваются молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют CADM1 антитела, экспрессионные векторы, хозяйские клетки и способы для экспрессии CADM1 антитела. Также обеспечиваются биспецифические молекулы и фармацевтические композиции, которые включают CADM1 антитела. Раскрываются способы определения CADM1, а также способы лечения различных видов рака, включая рак легких и рак поджелудочной железы.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 61/209471, поданной 5 марта 2009 года, и временной заявки США № 61/209390, поданной 5 марта 2009 года, которые включены в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности.

Область изобретения

Данное изобретение относится к иммунологии и молекулярной биологии. В частности, в данной заявке описано получение антител, а именно модифицированных антител, которые лучше связываются с Рс рецепторами и/или обладают повышенной АИСС, и иммуноконъюгатов и других терапевтических белков, направленных против подобной иммуноглобулину адгезивной молекулы САИМ1, нуклеиновых кислот, которые кодируют такие антитела, и терапевтических белков, раскрыты способы получения оригинальных моноклональных антител и других терапевтических белков, а также способы лечения заболеваний, таких как различные виды рака, опосредованные экспрессией/активностью САИМ1, и/или ассоциированные с патологической экспрессией/активностью ее лигандов.

Предпосылки создания изобретения

Молекулы клеточной адгезии в общем случае идентифицируются как кадгерины, интегрины, селектины или как члены супер семейства иммуноглобулинов (1д). Молекулы суперсемейства иммуноглобулинов включают рецепторы антигенов поверхности клетки, корецепторы и костимуляторные молекулы иммунной системы, молекулы, которые принимают участие в антигенной презентации лимфоцитами, молекулы клеточной адгезии и рецепторы некоторых цитокинов. Молекулы клеточной адгезии суперсемейства 1д насчитывают более 100 молекул у позвоночных и включают ИСАМ (адгезивные молекулы невральных клеток), Ь1 семейство САМ, 1САМ8 (молекулы межклеточной адгезии), УСАМ8 (молекулы адгезии васкулярных клеток), §ЮЬЕС (подобные 1д лектины, которые связывают сиаловую кислоту, включая СИ22 и СИ83), нектины, СИ2, СИ48.

Молекула суперсемейства иммуноглобулинов САИМ1 сначала была охарактеризована многими исследовательскими группами; в результате этого данная молекула была идентифицирована под разными названиями в научной литературе, включая молекулу клеточной адгезии 1, синаптическую молекулу клеточной адгезии (купСАМ), сперматогенную молекулу суперсемейства иммуноглобулина (кд1С8Р), 1С8Р4, ВЬ2, 8Т17, ИЕСЬ2, КА175 и САИМ1 А. Ранее сообщалось, что она действует как супрессор опухолей, поэтому она также является известной как Т8ЬС1 (Мигакаш1 и др., ИаШге Сепейск 27(4): 427 (2001)).

В отличие от кадгеринов и интегринов, которые для адгезивной активности требуют двухвалентных катионов, таких как Са'² или Мд'², молекулы суперсемейства 1д типично являются независимыми от Са'² или Мд⁺². Структура САИМ1 характеризуется тем, что она имеет внеклеточный домен с тремя подобными иммуноглобулину мотивами, одну гидрофобную а спираль, которая размещается на мембране, внутриклеточный домен, который связывает актиновые волокна с помощью ПАЬ-1, и короткий Стерминальный цитоплазматический конец, который содержит мотив, связывающий ΡΌΖ. Известны две изоформы САИМ1, ИМ_014333 и ИМ_001098517, последняя имеет делецию 27 аминокислот. Анализ свидетельствует о том, что аминокислотные последовательности, которые соответствуют цитоплазматическому домену САИМ1, являются идентичными у пяти млекопитающих и высоко консервативными у позвоночных животных, что дает возможность предположить важную роль САИМ1 в нормальном взаимодействии клетка-клетка. Мышиный ортолог САИМ1 (ААЦ023810) демонстрирует 97% идентичность с человеческим САИМ1 (Рикаш1 и др., Сепе 295: 7-12 (2002)).

САИМ1 экспрессируется в нервных и тучных клетках (Ио и др. 1 Рйагтасо1 8ск; 102(1): 1-5 (2006)), клетках легочных альвеол (Ио и др., Ηίκΐοΐ ΗίκΙοραίΠοΙ. 18(4): 1321-9 (2003)), клетках поджелудочной железы (8Ыпда1 и др. 1 Вю1 СЬет.; 278(37): 35421-7 (2003)), (^акауата и др., В1оой; 101(7): 2601-8 (2003)). Он также ассоциирован с злокачественной гепатомой (НСС). САИМ1, как оказывается, экспрессируется в клетках желчных протоков плода и у взрослых людей с циррозом печени, однако отсутствует в желчных протоках взрослых людей, которые не больны циррозом (Йо и др., Нера1о1оду; 45(3): 684-94 (2007)). Также сообщалось о том, что он ассоциирован с глиобластомами и раком легких.

Было идентифицировано два механизма, которые приводят к инактивации САИМ1: в результате метилирования промотора и в результате потери гетерозиготности в локусе гена. В соответствии с имеющейся информацией метилирование САИМ1 промотора, приводит к устранению экспрессии САИМ1 в опухолях, включая различные виды рака легких, желудка, поджелудочной железы, молочной железы и предстательной железы, особенно в опухолях с агрессивным поведением. (Мигакат1 и др., Мо1 Сапсег. 4:28 (2005)).

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение направлено на обеспечение потребности в антителах, в частности, в модифицированных антителах, для которых характерно более эффективное связывание с Рс рецепторами и/или повышенная АИСС, и в иммуноконъюгатах, которые направлены против САИМ1, в нуклеиновых кислотах, которые кодируют такие антитела, в терапевтических белках, в способах получения анти-САИМ1 моноклональных антител и других терапевтических белков и в способах лечения заболеваний, таких как опосредованные САИМ1 расстройства, например различные виды рака человека, включая мелкоклеточ- 1 028336 ный рак легких, лейкемию Т-клеток у взрослых, немелкоклеточный рак легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), меланому, рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак яичника, рак предстательной железы, различные нейроэндокринные виды рака, включая такие легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулиномы и глюкагономы), глиобластомы и карциноидные опухоли, включая опухоли поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек.

Таким образом, данное изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности, мышиным, химерным, гуманизированным и полностью человеческим моноклональным антителам, которые связываются с одним или более костным морфогенетическим белком и его рецепторами, которые демонстрируют одно или более желательных функциональных свойств. Такие свойства включают, например, специфическое связывание с высокой аффинностью с человеческой САЭМ1. Оно также раскрывает способ лечения различных опосредованных САЭМ1 заболеваний с использованием антител, белков и композиций в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, фрагменту антитела, или миметику антитела, который связывается с эпитопом человеческой СЛЭМ1. который узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 19, 20 или 21, и вариабельный участок легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0: 22, 23 или 24. В некоторых воплощениях выделенное антитело представляет собой антитело полной длины 1дО1, 1дО2, 1§03 или 1§04 изотипа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело выбирается из группы, которая состоит из полноразмерного антитела, фрагмента антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, иммуноконъюгата, модифицированного антитела, которое лучше связывается с Те рецепторами и/или обладает повышенной АЭСС, и биспецифического антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой иммуноконъюгат или модифицированное антитело, которое лучше связывается с Те рецепторами и/или обладает повышенной АЭСС. Фрагмент антитела может быть выбран из группы, которая состоит из унитела, доменного антитела и нанотела. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгаты включают терапевтический агент. В другом аспекте изобретения терапевтический агент представляет собой цитотоксин или радиоактивный изотоп. В некоторых воплощениях изобретения антитело выбирается из группы, которая состоит из аффитела, ΌΑΚΡίη, антикалина, авимера, версатела и дуокалина.

Причем некоторые антитела согласно изобретению связываются с человеческой САЭМ1 с ЕС₅₀ < 50 нМ, < 10 нМ или < 1 нМ.

В альтернативных вариантах осуществления изобретения композиции включают выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

В других случаях антитело согласно изобретению представляет собой композицию, которая включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретение включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую или легкую цепь выделенного антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого САЭМ1. Другие варианты в соответствии с изобретением включают экспрессионные векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяева, которые содержат такие векторы.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения анти-САОМ1 антитела, при этом указанный способ включает этапы: получения клетки-хозяина, которая содержит одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело в соответствии с данным изобретением; культивирования этой клетки в культуральной среде; обеспечения таких условий культивирования культуры клетки-хозяина, при которых экспрессируется одна или более молекул нуклеиновой кислоты; и получения антитела из клетки-хозяина или из культуры этих клеток. В других воплощениях изобретение направлено на способ лечения или предотвращения заболевания, ассоциированного с целевыми клетками, которые экспрессируют САПМ1, при этом указанный способ включает этап введения субъекту антиСАЭМ1 антитела или его антигенсвязывающих фрагментов в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания. В некоторых вариантах заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, выбирается из группы, которая состоит из различных видов рака человека. В некоторых воплощениях заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью антитела согласно данному изобретению, представляет собой рак, выбранный из группы, которая состоит из мелкоклеточного рака легких, лейкемии Т-клеток у взрослых, немелкоклеточного рака легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), меланомы, рака молочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, различных нейроэндокринных видов рака, включая такие легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулино- 2 028336 мы и глюкагономы), глиобластомы и карциноидных опухолей, включая такие поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек.

В других вариантах изобретение направлено на анти-С.'АОМ1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент на применение в лечении или предотвращении заболевания, ассоциированного с целевыми клетками, которые экспрессируют САЭМ1. В некоторых аспектах заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно данному изобретению, представляет собой рак человека. В других вариантах заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью антитела согласно данному изобретению, представляет собой рак, выбранный из группы, которая состоит из мелкоклеточного рака легких, лейкемии Т-клеток у взрослых, немелкоклеточного рака легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), меланомы, рака молочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, различных нейроэндокринных видов рака, включая такие легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулиномы и глюкагономы), глиобластомы и карциноидных опухолей, включая такие поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек.

В других воплощениях изобретение направлено на применение анти-САЭМ1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания, ассоциированного с целевыми клетками, которые экспрессируют САЭМ1. В некоторых аспектах изобретения заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью лекарственного средства согласно данному изобретению, представляет собой рак человека. В некоторых вариантах заболевание, которое лечится или предотвращается с помощью лекарственного средства согласно изобретению, представляет собой рак, выбранный из группы, которая состоит из мелкоклеточного рака легких, лейкемии Т-клеток у взрослых, немелкоклеточного рака легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), меланомы, рака молочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, различных нейроэндокринных видов рака, включая такие легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулиномы и глюкагономы), глиобластомы и карциноидных опухолей, включая такие поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек. В других воплощениях данное изобретение представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент антитела или миметик антитела, связывающийся с эпитопом человеческого САЭМ1, который узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в 5>ЕО ГО N0: 19, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в 5>Е0 ГО N0: 22; аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в 5>Е0 ГО N0: 20, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в 5>Е0 ГО N0: 23; аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в 5>Е0 ГО N0: 21, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в 5>Е0 ГО N0: 24. В дополнительных вариантах антитело является выбранным из группы, которая состоит из цельного антитела, фрагмента антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, иммуноконъюгата, модифицированного антитела, которое характеризуется улучшенным связыванием с Рс рецепторами и/или повышенной АЭСС, и биспецифического антитела. В преимущественном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой иммуноконъюгат или модифицированное антитело, которое лучше связывается с Рс рецепторами и/или обладает повышенной АЭСС. В дополнительных аспектах данного изобретения фрагмент антитела выбран из группы. которая состоит из унитела, доменного антитела и нанотела. В некоторых воплощениях миметик антитела выбран из группы, которая состоит из аффитела, ΌΑΚΡίη, антикалина, авимера, версатела и дуокалина. В дополнительных вариантах композиция включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах данное изобретение представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую или легкую цепь выделенного антитела или антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с данным изобретением, а в дополнительных аспектах может включать экспрессионный вектор, включающий такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяина, которые включают такие экспрессионные векторы.

Другое воплощение данного изобретения относится к гибридоме, которая экспрессирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент любого из антител согласно данному изобретению.

Другими объектами изобретения являются способы получения заявленного антитела, которые включают этапы иммунизации с помощью САЭМ1 пептида трансгенного животного, имеющего гены человеческого иммуноглобулина; получения В-клеток из указанного трансгенного животного; создания гибридом с использованием указанных В-клеток; отбора гибридом, которые экспрессируют антитела, связывающие САЭМ1; и выделения указанного антитела, которое связывается с САЭМ1, из указанных отобранных гибридом.

- 3 028336

В других воплощениях способ получения анти-САЭМ1 антитела включает этапы иммунизации трансгенного животного, которое включает гены человеческого иммуноглобулина, с помощью САЭМ1 пептида;

выделения иРНК из В-клеток указанного трансгенного животного; превращения указанной иРНК в кДНК;

экспрессии указанной кДНК в фагах, так, что анти-СЛОМ1 антитела, которые кодируются указанной кДНК, презентируются на поверхности указанных фагов;

отбора фагов, которые презентируют анти-САЭМ1 антитела;

выделения молекулы нуклеиновой кислоты из указанных отобранных фагов, которые кодируют указанный анти-САЭМ1 иммуноглобулин;

экспрессии указанной выделенной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине и выделения антитела, которое связывается с СЛОМЕ из указанной хозяйской клетки.

В некоторых аспектах изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом на СЛЭМ1 полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N08: 43 или 44, которая узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N08: 19, 20 или 21, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N08: 22, 23 или 24.

Другие признаки и преимущества данного изобретения будут понятными из следующего подробного описания и примеров, которые не должны трактоваться как такие, которые ограничивают его. Все ссылки, ссылки на ОеиЬаик, патенты и опубликованные патентные заявки приведены в данной заявке только в качестве ссылок.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1А демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 25) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 19) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А1. С1Ж1 (8ЕО ГО N0: 1), С1Ж2 (8ЕО ГО N0: 4) и СОЮ ₍8ЕЕ) ГО N0: 7) участки обозначены, указаны V, Ό и 1 - источники эмбриональных линий.

Фиг. 1В демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 28) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 22) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А1. С1Ж1 (8ЕЕ) ГО N0: 10), С1Ж2 (8ЕЕ) ГО N0: 13) и СОЮ ₍8ЕЕ) ГО N0: 16) участки обозначены, указаны V, Ό и 1 - источники эмбриональных линий.

Фиг. 2А демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 26) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 20) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А2. С1Ж1 (8ЕС) ГО N0: 2), С1Ж2 (8ЕЕ) ГО N0: 5) и СОЮ (8ЕС) ГО N0: 8) участки обозначены, указаны V и I - источники эмбриональных линий.

Фиг. 2В демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 29) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 23) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А2. С1Ж1 (8ЕЕ) ГО N0: 11), С1Ж2 (8ЕЕ) ГО N0: 14) и СОЮ (8ЕС) ГО N0: 17) участки обозначены, указаны V и I - источники эмбриональных линий.

Фиг. 3А демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 27) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 21) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А3. С1Ж1 (8ЕС) ГО N0: 3), С1Ж2 (8ЕЕ) ГО N0: 6) и СОЮ (8ЕС) ГО N0: 9) участки обозначены, указаны V, Ό и 1 - источники эмбриональных линий.

Фиг. 3В демонстрирует нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0: 30) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО N0: 24) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела РТА021_А3. С1Ж1 (8ЕЕ) ГО N0: 12), С1Ж2 (8ЕС) ГО N0: 15) и С1Ж3 (8ЕС) ГО N0: 18) обозначены, указаны V и 1 - источники эмбриональных линий.

Фиг. 4 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021_А1 (8Е0 ГО N0: 19) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 2-05 (8Е0 ГО N0: 31) и аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 1_Н 1Н5Ь (8Е0 ГО N0: 37).

Фиг. 5 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021_А2 (8Е0 ГО N0: 20) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 2-05 (8Е0 ГО N0: 32) и аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 1_Н 5Ь (8Е0 ГО N0: 38).

Фиг. 6 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021_А3 (8Е0 ГО N0: 21) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 2-05 (8Е0 ГО N0: 33) и аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии 1_Н 5Ь (8Е0 ГО N0: 39).

Фиг. 7 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021_А1 (8Е0 ГО N0: 22) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии Е15 (8Е0 ГО N0: 34) и аминокислотной последовательностью человеческой эм- 4 028336 бриональной линии £< 4 (8ЕС ГО N0: 40).

Фиг. 8 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021_А2 (АЕО ГО N0: 23) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии У_к Ь15 (АЕО ГО N0: 35) и аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии £< 4 (АЕО ГО N0: 41).

Фиг. 9 демонстрирует выравнивание аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021_А3 (АЕО ГО N0: 24) с аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии У_к Ь15 (АЕО ГО N0: 36) и аминокислотной последовательностью человеческой эмбриональной линии £< 4 (АЕО ГО N0: 42).

Фиг. 10 демонстрирует результаты БАСА анализа РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 на клетках мелкоклеточного рака легких N01-469.

Фиг. 11А и 11В демонстрируют результаты БАСА анализа РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 на клетках мелкоклеточного рака легких N01-469 и ΌΜ879 соответственно.

Фиг. 12 демонстрирует результаты БАСА анализа РТА021_А3 на клетках рака яичника 5>1<0У3.

Фиг. 13 демонстрирует результаты БАСА анализа РТА021_А3 на клетках немелкоклеточного рака легких А549.

Фиг. 14 демонстрирует результаты БАСА анализа РТА021_А3 на клетках ренальной карциномы786О и клетках меланомы 8кМе128.

Фиг. 15 демонстрирует результаты БАСА анализа РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РТА021_А3 (и£) на клетках мелкоклеточного рака легких N01-469 и ΌΜ879.

Фиг. 16А и 16В демонстрируют зависимую от антитела клеточную цитотоксичность (ΛΌΟΟ), опосредованную РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3, при использовании линий клеток ΌΜ879 и N01Н69 соответственно.

Фиг. 17А и 17В демонстрируют результаты Нит^АР анализов РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 на клетках в ΌΜ879 и N04-469 соответственно.

Фиг. 18 представляет график, который показывает влияние обработки фукозилированным или нефукозилированным РТА021_А3 антителом на размер опухоли НерО2 на ксенографтной модели мышей.

Фиг. 19 представляет график, который показывает влияние обработки конъюгатом РТА021_А3Формула М на размер опухоли НерО2 на ксенографтной модели мышей.

Фиг. 20А представляют график, который показывает влияние обработки конъюгатом РТА021_А3Формула М в дозировке 0,3 мкмоль/кг на размер опухоли ΌΜ879 на ксенографтной модели мышей.

Фиг. 20В представляет график, который показывает влияние обработки конъюгатом РТА021_А3Формула М в дозировке 0,1 и 0,03 мкмоль/кг на размер опухоли ΌΜ879 на ксенографтной модели мышей. Исследование заканчивали на 60 день.

Фиг. 21, 22 и 23 представляют графики, которые показывает АИСС активность РТА021_А3 и нефукозилированного РТА021_А3 в отношении НерО2, 786-0 и ΌΜ879 клеток соответственно.

Фиг. 24 представляет график, который показывает влияние обработки РТА021_А3 антителом, взятым самостоятельно или в комбинации с цисплатином, на размер опухоли ΌΜ879 на ксенографтной модели мышей.

Фиг. 25 А и 25В показывают данные относительно веса тела самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 26А и 26В показывают данные, относящиеся к уровню глюкозы, у самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 27А и 27В показывают данные, касающиеся аланинтрансаминазы, для самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 28А и 28В показывают данные, касающиеся аспартаттрансаминазы, для самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 29А и 29В показывают данные, касающиеся щелочной фосфатазы, для самцов обезьян и самок обезьян соответственно, в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 30А и 30В показывают данные, касающиеся лактатдегидрогеназы, для самцов обезьян и самок обезьян соответственно, в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 31А и 31В показывают ВВС данные (количество эритроцитов) для самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РΤΛ021_Λ3(NБ) у макак циномолгус.

Фиг. 32А и 32В показывают АВС данные (количество лейкоцитов) для самцов обезьян и самок обезьян соответственно в диагностическом токсикологическом исследовании с использованием РТА021_А3

- 5 028336 и нефукозилированного варианта ΡΤΑ021_Α3(ΝΡ) у макак циномолгус.

Подробное описание данного изобретения

Данное изобретение относится к выделенным моноклональным антител, особенно к человеческим моноклональным антителам, в частности, иммуноконъюгатам и модифицированным антителам, которые лучше связываются с Рс рецепторами и/или обладают повышенной АИСС, которые специфически связываются с САИМ1 с высокой аффинностью. В некоторых воплощениях антитела согласно изобретению происходят от определенных последовательностей тяжелой и легкой цепей эмбриональной линии и/или имеют определенные структурные характеристики такие как СИР участки, которые включают определенные аминокислотные последовательности. Изобретение относится к выделенным антителам и модифицированным антителам, которые лучше связываются с Рс рецепторами и/или обладают повышенной АИСС, иммуноконъюгатам, биспецифичным молекулам, аффителам, доменным антителам, нанотелам и унителам, способам получения указанных молекул и фармацевтическим композиции, которые включают указанные молекулы и фармацевтический носитель. Изобретение также относится к способам применения этих молекул, таким, как для определения САИМ1, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией САИМ1, таких как те, при которых САИМ1 экспрессируется в опухолях, включая опухоли мелкоклеточного рака легких и нейроэндокринный рак, рак поджелудочной железы, легочные карциноиды и желудочно-кишечные карциноиды.

Для того чтобы данное изобретение было понятным, прежде всего, необходимо определить некоторые термины. Дополнительные определения представлены при подробном описании изобретения.

Термины САИМ1, Ю8Р4, суперсемейство иммуноглобулинов член 4И, молекула клеточной адгезии 1, опухолевый супрессор рака легких 1, Т§ЬС1, ВЬ2, 8Т17, молекула синаптической клеточной адгезии, синкам 1, подобный нектину белок 2 и ΝΕΟΡ2 используются поочередно и включают варианты, изоформы и видовые гомологи человеческой САИМ1, включая САИМ1 изоформу 1 (номер доступа СеиЬаик NМ_014333), и 2 (номер доступа СеиЬаик N^001098517). Две изоформы были также идентифицированы как ОСТА025а и ОСТА025Ь в публикации РСТ (ОВТ номер дела ОСЬР121РСТ), которая введена в данную заявку в качестве ссылки. Человеческие антитела в соответствии изобретением могут в некоторых случаях перекрестно реагировать с САИМ1 видов, отличных от человека. В некоторых воплощениях антитела могут быть полностью специфическими к одной или более человеческих САИМ1 и не демонстрируют видовой или других типов перекрестной реактивности. Полная аминокислотная последовательность типичной человеческой САИМ1 имеет номер доступа СеиЬаик NМ_014333. Термин иммунный ответ относится к действию, например, лимфоцитов, презентирующих антиген клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, которые продуцируются указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), что приводит к селективному повреждению, разрушению или удалению из человеческого организма инвазивных агентов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

Путь сигнальной трансдукции относится к биохимической связи между различными молекулами сигнальной трансдукции, которые играют определенную роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Как используется в данной заявке, фраза рецептор поверхности клеток включает, например, молекулы и комплексы молекул, которые способны к получению сигнала и передачи такого сигнала через плазматическую мембрану клетки. Пример рецептора поверхности клеток в соответствии с данным изобретением представляет собой рецептор САИМ1. Термин антитело, как используется в данной заявке, включает полноразмерное антитело и любой антигенсвязывающий фрагмент или одну из его цепей. Антитело относится к гликопротеину, который может включать по крайней мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, которые являются взаимосвязанными с помощью дисульфидных связей, или его антигенсвязывающего фрагмента. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в данной заявке обозначается как Ун) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в данной заявке обозначается как У_ъ или У_к) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, С_ъ, У_н и У_ъ/У_к участки могут дополнительно разделяться на участки гипервариабельности, которые определяют комплементарность (СИР), и которые встроены между участками, являющимися более консервативными, и называются каркасными участками (РР).

Каждая из У_н и У_ъ/У_к состоит из трех СИР и четырех РР, которые размещаются от аминотерминального конца к карбокситерминальному концу в следующем порядке: РР1, СИР1, РР2, СИР2, РР3, СИР3, РР4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулина с хозяйскими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ц) классической системы комплемента.

Термин антигенсвязывающий фрагмент антитела, как используется в данной заявке, относится к одному или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, САИМ1). Было продемонстрировано, что функция связывания антигена может

- 6 028336 осуществляться с помощью фрагментов антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, которые охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела, включают (ί) РаЬ фрагмент, моновалентный фрагмент, который состоит из V,/У_к. ν_Η, С_ь и СН1 доменов; (ίί) Р(аЬ')₂ фрагмент, бивалентный фрагмент, который включает два РаЬ фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирном участке; (ίίί) РаЬ' фрагмент, который, по существу, представляет собой РаЬ с частью шарнирного участка (см. ΡυΝΌΑΜΕΝΤΑΒ ΙΜΜϋΝΘΕΟΟΥ (Раи1 ред., 3-е издание, 1993); (ίν) Ρά фрагмент, который состоит из ν_Η и СН1 доменов; (ν) Ρν фрагмент, который состоит из ν₂ и ν_Η доменов одного плеча антитела, (νί) άаЬ фрагмент (^агП и др., (1989) №Чиге 341: 544-546), который состоит из ν_Η домена; (νίί) выделенный участок, который определяет комплементарность (СОК); и (νίίί) нанотела, вариабельный участок тяжелой цепи, которая содержит один вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, несмотря на то, что домены Ρν фрагмента, У/νκ и ν_Η, кодируются отдельными генами, они могут объединяться при использовании рекомбинантных способов, с помощью синтетического линкера, что позволяет им образовывать одну белковую цепь, в которой ν₂/ν_κ и ν_Η участки попарно образуют моновалентные молекулы (известны, как одна цепь Ρν (δεΑν); см., например, Βίτά и др. (1988) 5аенсе 242: 423426; и ΗιΐδΙοη и др. (1988) Ргос. Ν;·ι11. Αсаά. δα. υδΑ 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. Эти фрагменты антитела получают при использовании традиционных методик, известных специалисту в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на полезность так же, как интактные антитела.

Термин выделенное антитело, как используется в данной заявке, предназначен для обозначения антитела, которое является, по существу, не содержит от других антител, которые другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с СЛОМ1, по существу, не содержит антител, специфически связывающихся с антигенами, отличными от ί'.ΆΟΜ1). Выделенное антитело, которое специфически связывается с С^ЭМИ однако, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими, как СЛ^Μ1 молекулы из других видов. Кроме того, выделенное антитело может, по существу, не содержать другого клеточного материала и/или химических реагентов.

Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела, как используется в данной заявке, относятся к препарату молекулы антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела демонстрирует одну связывающую специфичность и аффинность для конкретного эпитопа. Термин человеческое антитело, как используется в данной заявке, является антителом, имеющим вариабельные участки, в которых как каркасные участки, так и участки СЭК, имеют происхождение от последовательности иммуноглобулина эмбриональной линии человека. Кроме того, если антитело содержит константный участок, то константный участок также имеет происхождение от последовательности иммуноглобулина эмбриональной линии человека. Человеческие антитела в соответствии с изобретением могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются последовательностями иммуноглобулина эмбриональной линии человека (например, мутации, которые введены с помощью случайного или сайт-направленного мутагенеза ίη νίίτο или путем соматической мутации ίη νίνο). Однако термин человеческое антитело, как используется в данной заявке, не включает антитела, в которых СЭК последовательности происходят от эмбриональной линии человека или других видов млекопитающих, таких как мышь, но были привиты на последовательности человеческого каркасного участка.

Термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, которые демонстрируют одну связывающую специфичность и которые имеют вариабельные участки, в которых как каркасный участок, так и участки СЭК, имеют происхождение от последовательностей иммуноглобулина эмбриональной линии человека. В одном из вариантов человеческие моноклональные антитела получают при использовании гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенных мышей, которые имеют геном, включающий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген тяжелой цепи, слитый с иммортализованной клеткой.

Термин рекомбинантное человеческое антитело, как используется в данной заявке, включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов человеческого иммуноглобулина, или полученные из гибридомы, полученной из таких животных (см. ниже), (Ь) антитела, выделенные из клеткихозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (ά) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других способов, которые предусматривают сплайсинг генной последовательности человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные участки, в которых каркасный участок и СЭК участок происходят из последовательностей иммуноглобулина эмбриональной линии человека. Однако в некоторых воплощениях такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться ίη νίίτο мутагенезу (или когда используется животное для последовательности человеческого 1д, то соматическому мутагенезу, ίη νίνο) и, таким образом, аминокислотные последовательности ν_Η и ν₂/ν_κ участков рекомбинантного антитела представляют собой после- 7 028336 довательности, которые хотя и происходят от и являются родственными последовательностям Ун и У_Ъ/У_К человеческой эмбриональной линии, могут не существовать в природе в совокупности антител эмбриональной линии человека ίη νινο.

Как используется в данной заявке, термин изотип относится к классу антител (например, 1§М или 1дО1), который кодируется генами константного участка тяжелой цепи.

Фразы антиген, который узнается антителом и антитело, специфическое для антигена используются поочередно в данной заявке с терминами антитело, которое специфически связывается с антигеном.

Термин производная человеческого антитела относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например, конъюгату антитела и другого агента или антитела.

Термин гуманизированное антитело предназначено для обозначения антитела, в котором СЭР последовательности, которые происходят от эмбриональной линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека. Дополнительные модификации каркасного участка могут быть сделаны в каркасных последовательностях человека. Термин химерное антитело предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельного участка происходят от одного вида, а последовательности константного участка происходят от других видов, таких как антитела, в которых последовательности вариабельного участка происходят от мышиного антитела, а последовательности константного участка происходят от человеческого антитела.

Как используется в данной заявке, антитело, которое специфически связывается с человеческой САЭМ1, предназначено для обозначения антитела, которое связывается с человеческой САЭМ1 со значением ЕС₅₀ 50 нМ или меньше, 10 нМ или меньше или преимущественно 1 нМ или меньше.

Термин по существу, не связывается с белком или клетками, как используется в данной заявке, означает не связывается совсем или не связывается с высокой аффинностью с белком или клетками, то есть связывается с белком или клетками со значением КО 1 х 10^-6 М или более, более желательно 1 х 10^-5 М или более, более желательно 1х 10^-4 М или более, более желательно 1х 10^-3 М или более, даже более желательно 1х 10^-2 М или более.

Термин ЕС₅о, как используется в данной заявке, предназначен для обозначения эффективности соединения в результате количественной оценки концентрации, которая приводит к получению 50% максимального ответа/эффекта. Термин К_асоц или К_а, как используется в данной заявке, предназначен для обозначения скорости ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, в то время, как термин К_дис или К₄, как используется в данной заявке, предназначен для обозначения скорости диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген. Термин К, как используется в данной заявке, предназначен для обозначения константы диссоциации, которую получают из соотношения К,| к К_а (то есть К_а/К_а) и выражают как молярную концентрацию (М). К_с значения для антитела могут быть определены при использовании способов, хорошо известных в области техники. Желательный способ для определения К_с антитела является таким при использовании поверхностного плазмонного резонанса, желательно при использовании биосенсорной системы, такой как В1асоге® система.

Как используется в данной заявке, термин высокая аффинность для 1§О антитела относится к антителу, которое имеет значение К_с, которое составляет 1 χ 10^-7 М или меньше, более желательно 5х10^-8 М или меньше, даже более желательно 1х 10^-8 М или меньше, даже более желательно 5х10^-9 М или меньше и даже более желательно 1х10^-9 М или меньше для целевого антигена. Однако высокая аффинность связывание может варьировать для разных изотипов антитела. Например, высокая аффинность связывание для 1§М изотипа относится к антителу, которое имеет значение К_с 10^-6 М или меньше, более желательно 10^-7 М или меньше, даже более желательно 10^-8 М или меньше.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на антигене, с которым иммуноглобулин или антитело специфически связывается. Эпитопы могут образовываться как из последовательных аминокислот, так и непоследовательных аминокислот, соединенных в третичной структуре белка. Эпитопы, образованные из последовательных аминокислот, типично сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные третичной структурой, обычно утрачиваются при действии денатурирующих агентов. Эпитоп типично включает по крайней мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конфирмации эпитопов включают методики, известные в области техники, и такие, которые описанные в данной заявке, например, рентгеновскую кристаллографию и двухмерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Ерйоре Маррщд РгоЮсоЕ ίη Ме11юЙ5 ίη Мо1еси1аг Βίо1оду, том 66, О.Е. Мотз, ред. (1996)). В соответствии с этим данное изобретение также охватывает антитела, которые связываются с (то есть узнают) тем же эпитопом, что и антитела, описанные в данной заявке (то есть РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3). Антитела, которые связываются с (то есть узнают) тем же эпитопом, могут быть идентифицированы по их способности перекрестно конкурировать с (то есть конкурентно ингибировать связывание) референтного антитела с целевым антигеном статистически значимым образом. Конкурентное ингибирование может возникать тогда, например, когда антитело связывается с идентичными или структурно подобными эпитопами (например, эпитопами, которые

- 8 028336 перекрываются), или с пространственно близкими эпитопами, которые при связывании блокируют связывание других антител.

Конкурентное ингибирование может определяться при использовании обычных анализов, в которых иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референтного антитела с обычным антигеном. Известны несколько типов анализов конкурентного связывания, например: непосредственный или опосредованный твердофазный иммуноанализ (ΡΙΑ). непосредственный или опосредованный твердофазный ферментный иммуноанализ (ΕΙΑ), сэндвич анализ конкуренции (см. §1аЬй и др., МеЮойз ίη Епζνιηοίοβγ 9: 242 (1983)); непосредственный твердофазный биотин-авидин ΕΙΑ (см. КиЫапй и др., 1. 1ттипо1. 137: 3614 (1986)); непосредственный твердофазный анализ с меткой, непосредственный твердофазный сэндвич анализ с меткой (см. Наг1о\г и Ьапе, АпйЪоФез: Α ЬаЪогаЮгу Мапиа1, СоИ §рйпд НагЬог Ргезз (1988)); непосредственный твердофазный ΚΙΑ с меткой при использовании метки Ι-125 (см. Моге1 и др., Мо1. 1ттипо1. 25(1): 7 (1988)); непосредственный твердофазный биотин-авидин ΕΙΑ (СЬеипд и др., У1го1о§у 176: 546 (1990)); и непосредственный ΚΙΑ с меткой (МоМепЬаиег и др., §еапй. 1. Iттиηο1. 32:77 (1990)). Типично, такой анализ предполагает применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, которые несут антиген, немеченый исследуемый иммуноглобулин и меченный референтный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряется путем определения количества метки, которая связалась с твердой поверхностью или клетками в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. В том случае, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референтного антитела с обычным антигеном по крайней мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 7075% или более.

Другие методики включают, например, способы картирования эпитопов, такие как рентгеноструктурные анализы кристаллов комплексов антиген:антитело, которые выявление эпитопа на атомном ровне. Другие методы мониторинга связывания антитела с фрагментами антигена или мутированными вариантами антигена, например, когда потеря способности к связыванию происходит благодаря аминокислотным остаткам в пределах последовательности антигена, часто рассматриваются как показательные для компонента эпитопа. Кроме того, также могут использоваться вычислительные комбинаторные методы для картирования эпитопов. Эти способы основываются на способности антитела, которое представляет интерес, к аффинному выделению специфических коротких пептидов из комбинаторных пептидных библиотек фагового дисплея. Потом предполагается, что такие пептиды обеспечивают выявление эпитопа, который соответствует антителу, используемому для скрининга пептидной библиотеки. Для картирования эпитопов могут также были разработаны компьютерные алгоритмы, которые картируют конформационно беспрерывные эпитопы.

Как используется в данной заявке, термин субъект включает любого человека или животное, отличное от человека. Термин животное, отличное от человека включает всех позвоночных, например, млекопитающих, и животных, отличных от млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, коты, кони, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.п.

Разные аспекты изобретения более подробно описываются далее в следующих подразделах.

Анти-САПМ1 антитела

Антитела в соответствии с изобретением характеризуются определенными функциональными признаками или свойствами антитела. Например, антитела специфически связываются с человеческой САИМ1. Желательно, чтобы антитело в соответствии с изобретением связывалось с САИМ1 с высокой аффинностью, например, со значением К_с 8 χ 10^-7 М или менее, даже более типично 1х10^-8 М или менее. Анти-САПМ1 антитела в соответствии с изобретением как правило демонстрируют одну или более из следующих характеристик:

связываются с человеческой САИМ1 со значением ЕС₅₀ 50 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, или более желательно 1 нМ или меньше;

связываются с человеческими клетками, которые экспрессируют САИМ1.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитела преимущественно связываются с антигенным эпитопом, который присутствует в САИМ1, где этот эпитоп не присутствует в других белках. Антитела типично связываются с САИМ1, но не связываются с другими белками, или связывается с ними с низкой аффинностью, такой как со значением К 1 χ 10^-6 М или более, более желательно 1х10^-5 М или более, более желательно 1 χ 10^-4 М или более, более желательно 1 χ 10^-3 М или более, даже более желательно 1х10^-2 М или более. Преимущественно антитела не связываются с родственными белками, например, антитела, по существу, не связываются с ГСАМ, УСАМ или другими молекулами клеточной адгезии. В одном воплощении антитело может быть интернализированным в клетке, которая экспрессирует САИМ1.

Стандартные анализы для оценки интернализации антитела являются известными в данной области техники, включая, например, Нит2ар анализ интернализации. Стандартные анализы для оценки способности антитела к связыванию с САИМ1 известны в области техники, включая, например, ЕЬРЗА, Вестерн-блоттинг анализы, К1А и анализ проточной цитометрии. Приемлемые анализы подробно описаны в

- 9 028336 примерах. Кинетики связывания (например, связывающая аффинность) антитела также могут быть оценены с помощью стандартных анализов, известных в области техники, таких как Ыасоге® системный анализ. Для оценки связывания с Вар или ЭаиЙ1 В опухолевыми В-клетками, Вар (обозначение АТСС ССЬ-86) или ЭаиЙ1 (обозначение АТСС ССЬ-213) клетки могут быть получены из общедоступных источников, таких как Американская коллекция типовых культур, и используются в стандартных анализах, таких как анализ проточной цитометрии. Моноклональные антитела РТА021_А1, РТА021_А2, РТА021_А3 Предпочтительные антитела в соответствии с изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3, выделенные и структурно охарактеризованные так, как описано в Примерах 1, 2 и 3. ν_Η аминокислотные последовательности РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8Е0 ГО N0: 19, 20 и 21 соответственно. Ук аминокислотные последовательности РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8Е0 ГО N0: 22, 23 и 24 соответственно.

Учитывая тот факт, что каждое из этих антител может связываться с САЭМ1, ν_Η и ν_κ последовательности могут быть смешаны и подобраны для создания других анти-САЭМ1 связывающих молекул в соответствии с данным изобретением. САЭМ1, которая связывается с такими смешанными и подобранными антителами, может анализироваться с помощью анализов связывания, которые описаны выше и в Примерах (например, ЕЬ18А). Желательно, чтобы при смешивании и подборе ν_Η и ν_κ цепи ν_Η последовательность из определенной ν_Η/ν_κ пары заменялась структурно подобной ν_Η последовательностью. Кроме того, желательно, чтобы У₃ последовательность из конкретной ν_Η/ν_κ пары заменялась структурно подобной ν_κ последовательностью.

В соответствии с этим в одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕС ГО N0: 19, 20 и 21; и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕС ГО N0: 22, 23 и 24; где антитело специфически связывается с САЭМ1, преимущественно человеческой САЭМ1.

Преимущественные комбинации тяжелой и легкой цепей включают: вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 19; и вариабельный участок легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 22; или вариабельный участок тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 20; и вариабельный участок легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 23, или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 21; и вариабельный участок легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 24.

В другом аспекте изобретение относится к антителам, которые включают СЭР1, СЭР2 и СГОВ3 тяжелой и легкой цепей для РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 или их комбинации. Аминокислотные последовательности ν_Η СГОВ1 для РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 1, 2 и 3. Аминокислотные последовательности ν_Η СЭР2 для РТА021_А1, РтА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 4, 5 и 6. Аминокислотные последовательности ν_Η СЭР3 РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 7, 8, и 9. Аминокислотные последовательности ν_κ СЭР1 для РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 10, 11 и 12. Аминокислотные последовательности ν_κ СГОВ2 для РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 13, 14 и 15. Аминокислотные последовательности ν_κ СЭР3 для РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 представлены в 8ЕС ГО N0: 16, 17 и 18. СОК участки изображены при использовании системы Кабат (С’аЬа1. Е. А., и др. (1991) Зедиеисев оГ РгоЮнъ оГ 1ттиио1одса1 1п1егев1. 5-е издание, 8. Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, N14 публикация № 91-3242). Принимая во внимание, что каждое из этих антител может связываться с САЭМ1 и что антигенсвязывающая специфичность обеспечивается прежде всего с помощью участков СЭР1, СГОВ2 и СЭР3, можно сказать, что последовательности СОРТ, СГОВ2 и СЭР3 ν_Η и последовательности СЭР1, СЭР2 и СГОВ3 ν_κ могут смешиваться и подбираться (то есть СЭР из различных антител могут смешиваться и подбираться, однако при этом каждое антитело должно содержать СОР1, СЭР2 и СГОВ3 ν_Η и СОР1, СЭР2 и СГОВ3 ν_κ) для создания других анти-СА0М1 связывающих молекул в соответствии с данным изобретением. Связывание САЭМ1 такими смешанными и подобранными антителами можно анализировать с помощью анализов связывания, описанных выше и в Примерах (например, ЕЬ18А, В1асоге® анализ). Также желательно, при смешивании и подборе ν_Η СЭР последовательности, чтобы СЭР1, СГОВ2 и/или СЭР3 из определенной ν_Η последовательности заменялись структурно подобной(ыми) СЭР последовательностью(ями). Кроме того, когда ν_κ СЭР последовательности смешивают и подбирают, то СЭР1, СЭР2 и/или СЭР3 последовательности их конкретной ν_κ последовательности преимущественно заменяют структурно подобной(ыми) СЭР последовательностью (ями). При этом специалисту в данной области техники понятно, что новые νΗ и νκ последовательности могут быть созданы путем замены одной или

- 10 028336 более последовательностей У_н и/или У₂/У_К СОР участками, структурно подобными последовательностям с СОК последовательностями, раскрытыми в данной заявке для моноклональных антител РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3.

В соответствии с этим в другом аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который включает вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1. включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕφ ГО N0: 1, 2 и 3;

вариабельный участок тяжелой цепи С'.ОР2, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕφ ГО N0: 4, 5 и 6;

вариабельный участок тяжелой цепи С'.ОР3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕΟ ГО N0: 7, 8 и 9;

вариабельный участок легкой цепи СГОКЕ включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕΟ ГО N0: 10, 11 и 12;

вариабельный участок легкой цепи С0К2, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕΟ ГО N0: 13, 14 и 15; и вариабельный участок легкой цепи СОКЗ, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из δΕΟ ГО N0: 16, 17 и 18;

где антитело специфически связывается с САТОМ1, преимущественно с человеческой СЛОМЕ

В предпочтительном варианте антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 1; вариабельный участок тяжелой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 4; вариабельный участок тяжелой цепи СОКЗ, включающий δΕΟ ГО N0: 7; вариабельный участок легкой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 10; вариабельный участок легкой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 13; и вариабельный участок легкой цепи С0К3, включающий δΕΟ ГО N0: 16.

В другом предпочтительном варианте антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 2; вариабельный участок тяжелой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 5; вариабельный участок тяжелой цепи С0К3, включающий δΕΟ ГО N0: 8; вариабельный участок легкой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 11; вариабельный участок легкой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 14; и вариабельный участок легкой цепи С0К3, включающий δΕΟ ГО N0: 17.

В другом предпочтительном варианте антитело включает:

вариабельный участок тяжелой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 3; вариабельный участок тяжелой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 6; вариабельный участок тяжелой цепи С0К3, что включает δΕΟ ГО N0: 9; вариабельный участок легкой цепи С0К1, включающий δΕΟ ГО N0: 12; вариабельный участок легкой цепи С0К2, включающий δΕΟ ГО N0: 15; и вариабельный участок легкой цепи С0К3, включающий δΕΟ ГО N0: 18.

В этой области техники хорошо известно, что С0К3 домен, независимо от С0К1 и/или С0К2 домена(ов), самостоятельно может определять связывающую специфичность антитела для родственного антигена, и что множество антител, которые имеют такую же связывающую специфичность, могут быть с уверенностью получены, базируясь на общей последовательности С0К3. См., например, КЬтка и др., ВтШкЬ 1. οί Сапсег 83(2): 252-260 (2000) (описывает получение гуманизированного анти-СО30 антитела при использовании только вариабельного домена тяжелой цепи мышиного анти-СО30 антитела Κί-4); ВеШоет и др., ί. Μοί. ΒίοΙ. 296: 833-849 (2000) (описывает получение рекомбинантного антитела к эпителиальному гликопротеину-2 (ЕСР-2) при использовании только С0К3 последовательности тяжелой цепи исходного мышиного МОС-31 анти-ЕСР-2 антитела); Кабег и др., Ргос. №б. Асаб. 8сС υ.δ.Α 95: 89108915 (1998) (описывает ряд гуманизированных анти-интегриновых ανβ₃ антител при использовании вариабельного С0К3 домена тяжелой и легкой цепей мышиного анти-интегринового ανβ₃ антитела ЬМ609, где каждое антитело включает отличную последовательность за пределами С0К3 домена и способно к связыванию с тем же эпитопом, что и исходное мышиное антитело, с аффинностями, которые являются такими же высокими или выше, чем для исходного мышиного антитела); ВатЬак и др., ί. Ат. СЬет. 5ос. 116: 2161-2162 (1994) (этот источник раскрывает тот факт, что С0К3 домен обеспечивает самый важный вклад в связывание антигена); ВагЬак и др., Ргос. №ц1. Асаб. δα. υ.δ.Α 92: 2529-2533 (1995) (описывает прививку С0К3 последовательности тяжелой цепи для трех РаЬ (δΙ-1, δΙ-40 и δΙ-32) против человеческой плацентарной ДНК на тяжелую цепь РаЬ, направленного против токсоида столбняка, что обеспечивает замену существующего С0К3 тяжелой цепи и демонстрирует, что С0К3 домен, взятый самостоятельно, обеспечивает связывающую специфичность); и 0Нхе1 и др., ί. 1ттипо1. 157: 739749 (1996) (описывает исследование по прививке, где перенос только С0К3 тяжелой цепи исходного полиспецифического РаЬ ЕУА3 на тяжелую цепь моноспецифического РаЬ р313 1дС антитела, которое свя- 11 028336 зывает токсоид столбняка, было достаточным для сохранения связывающей специфичности исходного РаЬ). Каждый из этих источников введен в данную заявку в качестве ссылки.

В соответствии с этим данное изобретение относится к моноклональным антителам, которые включают один или более СГОРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела, которые имеют происхождение от человека или животного, отличного от человека, где моноклональное антитело способно к специфическому связыванию с САЭМ1. В некоторых аспектах данное изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые включают один или более СГОРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела, происходящего от вида, отличного от человека, такого, как мышиное или крысиное антитело, где моноклональное антитело способно к специфическому связыванию с САЭМ1. В некоторых воплощениях такие оригинальные антитела, происходящего от вида, отличного от человека, которые включают один или более СЭРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела, (а) способны конкурировать за связывания; (Ь) сохранять функциональные характеристики; (с) связываться с тем же эпитопом; и/или (ά) иметь связывающую аффинность подобную антителу, происходящему от вида, отличного от человека

В других аспектах данное изобретение охватывает моноклональные антитела, которые включают один или более СЭРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из человеческого антитела, такого, как, например, человеческое антитело, полученное от животного, отличного от человека, где человеческое антитело способно к специфическому связыванию с САЭМ1. В других аспектах данное изобретение относится к моноклональным антителам, которые включают один или более СЭРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого, как, например, человеческое антитело, полученное от животного, отличного от человека, где первое человеческое антитело является способным к специфическому связыванию с САЭМ1 и где СЭРЗ домен из первого человеческого антитела заменяет СГОРЗ домен в человеческом антителе, которое не имеет связывающей специфичности в отношении САЭМ1, для получения второго человеческого антитела, которое является способным к специфическому связыванию с САЭМ1. В некоторых воплощениях такие оригинальные антитела, которые включают один или более СГОРЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела (а) способны конкурировать за связывание; (Ь) сохранять функциональные характеристики; (с) связываться с тем же эпитопом; и/или (ά) обладать связывающей аффинностью подобной соответствующим исходным первым человеческим антителам. В предпочтительных воплощениях первое человеческое антитело представляет собой РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_АЗ.

Антитела, которые имеют определенные последовательности эмбриональной линии В некоторых воплощениях антитело в соответствии с изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи из гена тяжелой цепи иммуноглобулина конкретной эмбриональной линии и/или вариабельный участок легкой цепи из гена легкой цепи иммуноглобулина конкретной эмбриональной линии. Например, в предпочтительном воплощении изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт или имеет происхождение от человеческого Ун 2-05 гена, где антитело специфически связывается с САЭМ1. Еще в одном предпочтительном воплощении изобретение охватывает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт или имеет происхождение от человеческого У_к Ь15 гена, где антитело специфически связывается с САЭМ1. Еще в другом предпочтительном воплощении изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или имеет происхождение от человеческого У_н 2-05 гена (эти гены кодируют аминокислотные последовательности, представленные в ЗЕО ГО N0: З1, З2 или ЗЗ соответственно); включает вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или имеет происхождение от человеческого У_к Ь15 гена (эти гены кодируют аминокислотные последовательности, представленные в ЗЕО ГО N0: З4, З5 или З6 соответственно); специфически связывается с САЭМ1, преимущественно человеческой САЭМ1. Примеры антител, которые имеют У_н и У_к, которые представляют собой У_н 2-05 и У_к Ь15 соответственно, представлены РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_АЗ. Как используется в данной заявке, человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, то есть представляет собой продукт или происходит от конкретной последовательности эмбриональной линии, если вариабельные участки антитела получают из системы, которая использует человеческие гены иммуноглобулина эмбриональной линии. Такие системы включают иммунизацию трансгенных мышей, которые несут гены человеческого иммуноглобулина, с помощью антигена, который представляет интерес, или скрининг библиотеки генов человеческого иммуноглобулина на фаговом дисплее при использовании антигена, который представляет интерес. Человеческое антитело, которое представляет собой продукт или происходит от последовательности иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии, может быть идентифицировано как такое путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов человеческой эмбриональной линии и отбор такой последовательности иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии, которая является ближайшей последовательностью (то есть имеет самый большой % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является продуктом или происходит

- 12 028336 от определенной последовательности иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии, может содержать аминокислотные отличия по сравнению с последовательностью эмбриональной линии, благодаря, например, возникающим в природе мутациям или намеренному введению сайт-направленной мутации. Однако отобранное человеческое антитело типично является по крайней мере на 90% идентичным аминокислотной последовательности, которая кодируется геном иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии и содержит аминокислотные остатки, которые характерны для человеческого антитела, которое является человеческим при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина эмбриональной линии других видов (например, с последовательностями мышиной эмбриональной линии). В некоторых случаях человеческое антитело может быть по крайней мере на 95% или даже по крайней мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентичным аминокислотной последовательности, которая кодируется геном иммуноглобулина эмбриональной линии. Типично, человеческое антитело, которое происходит от определенной последовательности человеческой эмбриональной линии, будет демонстрировать не больше чем 10 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, которая кодируется геном иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии. В некоторых случаях человеческое антитело может демонстрировать не больше чем 5 или даже не больше чем 4, 3, 2 или 1 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, которая кодируется геном иммуноглобулина человеческой эмбриональной линии.

Г омологичные антитела

Еще в одном воплощении антитело в соответствии с изобретением включает вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, которые включают аминокислотные последовательности, являющиеся гомологичными аминокислотным последовательностям нужного антитела, описанного в данной заявке, и где антитело сохраняет необходимые функциональные свойства анти-САЭМ1 антитела в соответствии с данным изобретением.

Например, изобретение раскрывает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который включает вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, где вариабельный участок тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из 8Еф ГО N0: 19, 20 и 21;

вариабельный участок легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из 8Еф ГО N0 : 22, 23 и 24; и антитело связывается с человеческой САЭМ1 со значением ЕС₅₀ 10 нМ или меньше.

Антитело также связывается с СНО клетками, трансфицированными с помощью человеческой САЭМ1.

В различных вариантах антитело может быть, например, человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом.

В других воплощениях ν_Η и/или ν_κ аминокислотные последовательности могут быть на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичными последовательности, как представлено выше. Антитело, которое содержит ν_Η и ν_κ участки, имеющие (то есть 80% или большую) гомологию с ν_Η и ν_κ участками последовательности, как представлено, может быть получено с помощью мутагенеза (например, сайтнаправленного мутагенеза или опосредованного ПЦР мутагенеза) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует 8Е0 ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 и 30, после чего осуществляют анализ измененного антитела на сохраненную функцию с помощью функциональных анализов, описанных в данной заявке.

Как используется в данной заявке, процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями является эквивалентным проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений, которые присущи этими последовательностями (то есть % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положений х 100), принимая во внимание количество пробелов и длину каждого пробела, который должен быть введен для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено при использовании математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах, приведенных ниже.

Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Е. Меуегк и А. МШег (Сотри!. Арр1. Вю8С1., 4: 11-17 (1988), который введен в программу ΑΣΣΟΝ (версия 2.0), при использовании РАМ120 таблицы значения остатка, штрафа за длину пробела 12 и штрафа за пробел 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма №е61етап и Аип8сЬ (Т Мо1. Βίο1. 48: 444-453 (1970)), который введен в программу ΟΑΡ в ОСО пакете программного обеспечения (является доступным на ЬИр://№№№.дсд.сот), при использовании или В1о88ит 62 матрицы, или РАМ250 матрицы и значения пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и значения длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности в соответствии с данным изобре- 13 028336 тением могут использоваться как поисковые последовательности для осуществления поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такие поиски могут быть проведены при использовании ХВЬАЗТ программы (версия 2.0) АШсНик и др. (1990) 1. Μοί. ΒίοΙ. 215: 403-10. ВЬЛ§Т белковые поиски могут быть проведены при использовании ХВЬАЗТ программы, счет =50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле антитела в соответствии с данным изобретением. Для получения выравниваний, которые содержат пробелы, с целью сравнения, Саррей ВЬЛ§Т может использоваться так, как описано у Л115с1ш1 и др., (1997) Ыис1ею Ас1Й Кек. 25(17): 3389-3402. При использовании ВЬА§Т и Саррей ВЬА§Т программ могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬАЗТ и НВЬАЗТ). См. 1Шр://\у\у\у.псЬкп1ттй11.8ОУ.

Антитела с консервативными модификациями

В некоторых воплощениях антитело в соответствии с изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит последовательности СОК1, СЭК2 и СЭК3, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит последовательности СОК1, СЭК2 и СЭК3, где одна или более таких СОК последовательностей включают указанные аминокислотные последовательности, которые базируются на предпочтительных антителах, описанных в данной заявке (например, РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_АЗ), или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют необходимые функциональные свойства анти-САОМ1 антитела в соответствии с данным изобретением. В соответствии с этим изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающем фрагменту, который включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий последовательности СЭК.1, СОК2 и СОК3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий последовательности СОК1, СОК2 и СОК3, где: последовательность СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 7, 8 и 9 и их консервативных модификаций; последовательность С'.ОК3 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 16, 17 и 18 и их консервативных модификаций; и антитело связывается с человеческим САОМ1 со значением ЕС₅₀ 1 нМ или меньше.

Антитело также связывается с СНО клетками, трансфицированными с помощью человеческой САОМ1.

В предпочтительном воплощении последовательность С'.ОК2 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6 и их консервативных модификаций; а последовательность СОК2 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 13, 14 и 15 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном воплощении последовательность СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2 и 3 и их консервативных модификаций; а последовательность С'.ОК2 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 10, 1 и 12 и их консервативных модификаций.

В различных воплощениях антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела. Как используется в данной заявке, термин консервативные модификации последовательности предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые значительным образом не влияют или не меняют связывающих характеристик антитела, которое содержит такую аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, вставки или делеции. Модификации могут быть введены в антитело в соответствии с изобретением с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены являются такими, при которых аминокислотный остаток заменяют с помощью аминокислотного остатка, который имеет подобную боковую цепь. Семьи аминокислотных остатков, которые имеют подобные боковые цепи, известны в данной области техники. Такие семьи включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в СОК участках антитела в соответствии с изобретением могут быть заменены другими аминокислотными остатками из той же семьи боковых цепей, и измененное антитело анализируется на сохраненную функцию при использовании функциональных анализов, описанных в данной заявке.

- 14 028336

Последовательность СГОР1 тяжелой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 1, 2 или 3, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций; последовательность СГОР1 легкой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 10, 11 или 12, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций; последовательность СГОР2 тяжелой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 4, 5 или 6, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций; последовательность СГОР2 легкой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 13, 14 или 15, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций; последовательность СОКЗ тяжелой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 7, 8 или 9, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций; и/или последовательность СОКЗ легкой цепи, представленная в 8ЕС ГО N0: 16, 17 или 18, может включать одну или более консервативных модификаций последовательности, таких как одна, две, три, четыре пять или более аминокислотных замен, инсерций или делеций.

Антитела, которые связываются с теми же эпитопами, что и анти-САЭМ1 антитела в соответствии с данным изобретением

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, которые связываются с тем же эпитопом на человеческой САЭМ1, что и любые САЭМ1 моноклональные антитела в соответствии с изобретением (то есть антитела, которые имеют способность к перекрестному конкурированию за связывания с САЭМ1 с любыми моноклональными антителами в соответствии с данным изобретением). В предпочтительных воплощениях референтное антитело для исследований на перекрестное конкурирование за связывания может представлять собой моноклональное антитело РТА021_А1 (которое имеет Ун и Ук последовательности, как показано в 8ЕС ГО N0: 19 и 22 соответственно), моноклональное антитело РТА021А2 (которое имеет У_н и У_к последовательности, как показано в 8ЕС ГО N0: 20 и 23 соответственно), или моноклональное антитело РТА021_А3 (которое имеет У_н и У_к последовательности, как показано в 8ЕС ГО N0: 21 и 24 соответственно). Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности к перекрестной конкуренции с РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3 в стандартных анализах связывания САЭМ1. Например, Шасоге анализ, ЕЫЗА анализы или проточная цитометрия могут использоваться для демонстрации перекрестного конкурирования за связывания с антителами в соответствии с данным изобретением. Способность исследуемого антитела ингибировать связывание, например, РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, с человеческой молекулой САЭМ1 демонстрирует, что исследуемое антитело может конкурировать с РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3 за связывания с человеческой САЭМ1 и, таким образом, связывается с тем же эпитопом на человеческой САБМ1, что и РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3. В предпочтительном воплощении антитело, которое связывается с тем же эпитопом на человеческой САРМ1, что и РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены так, как описано в примерах.

Модифицированные антитела

Антитело в соответствии с изобретением дополнительно может быть получено при использовании антитела, которое имеет одну или более из последовательностей У_н и/или У_ъ, раскрытых в данной заявке, которые могут использоваться как исходный материал для конструирования модифицированного антитела, где модифицированное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело может быть сконструировано путем модификации одной или более аминокислот в пределах одного или обоих вариабельных участков (то есть У_н и/или У_ь), например, в пределах одного или более СЭР участков и/или в пределах одного или более каркасных участков. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в пределах константного(ых) участка(ов), например, для изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела. В некоторых вариантах прививка СЭР может использоваться для конструирования вариабельных участков антитела. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами, главным способом, с помощью аминокислотных остатков, которые являются размещенными в шести участках, определяющих комплементарность, тяжелой и легкой цепей (СЭР). По этой причине аминокислотные последовательности в пределах СЭР являются более разнообразными у индивидуальных антител, чем последовательности за пределами СЭР. Поскольку СЭР последовательности являются ответственными за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые маскируют свойства специфических существующих в природе антител путем конструирования экспрессионных векторов, которые включают СЭР последовательности из специфического существующего в природе антитела, привитого на каркасные последовательности отличного антитела с отличными свойствами (см., например, РзесЬтапп, Ь. и др. (1998) №1иге 332: 323-327; 1опе8, Р. и др. (1986) №Лиге 321: 522-525; Спеем, С. и др. (1989) Ргос. №л1. Асаб. 8ее. И.8.А 86: 10029-10033; патент США № 5225539, который относится к Аш!ег, и патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, которые относятся к Снееп и др.)

- 15 028336

В соответствии с этим другое воплощение изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащей СГОРЕ СИК2 и СИР3 последовательности, включающие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2 и 3, 8ЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6 и 8ЕЦ ГО N0: 7, 8 и 9 соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, который включает СГОРЕ СГОР2 и СГОР3 последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12, 8ЕЦ ГО N0: 13, 14 и 15, и 8ЕЦ ГО N0: 16, 17 и 18 соответственно. Таким образом, такие антитела включают последовательности СИР ν_Η и ν_κ моноклонального антитела РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, а также могут включать различные каркасные последовательности этих антител.

Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных ДНК баз данных, опубликованных ссылок, которые включают генные последовательности человеческого антитела эмбрионального типа. Например, ДНК последовательности генов вариабельного участка тяжелой и легкой цепей человеческих антител эмбрионального типа могут быть найденные в Маке базе данных человеческих последовательностей эмбрионального типа (являются доступными на Интернет-сайте те^^.тгссре.сат.ас.ик/уЬаке), а также у Кабат Е.А., и др. (1991) 8ециепсек оГ РгоЮтк оГ 1ттипо1одюа1 ЬИегекЕ пятое издание, министерство здравоохранения и социального обеспечения США, №Н публикация № 913242; ТотПпкоп, I. М., и др. (1992) ТЬе Ререгй1ге оГ Нитап СегтЪпе νΗ 8ециепсек Реуеа1к аЬоп! РШу Сгоирк оГ νΗ 8едтеп1к \\ЬП ЭГГегеШ НурегуапаЫе Ьоорк I. Мо1. Вю1. 227: 776-798; и Сох, I. Р. Ь. и др. (1994) А ЭиесЮгу оГ Интап Сегт-Ьпе νΗ 8едтеп1к Реуеа1к а 81гопд В1ак ш 1Ье1г икаде Еиг. ΐ. 1ттипо1. 24: 827-836; содержание каждого из которых приведено в данной заявке только в качестве ссылки. Как другой пример можно заметить, что человеческие эмбриональные генные ДНК последовательности вариабельного участка тяжелой и легкой цепей могут быть найдены в базе данных СепЬапк. Например, следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи, которые выявлены в моноклональном антителе НСо7 ΗиМАЬ мыши, доступны под депозитными номерами СепЬапк: 1-69 ЩС_0010109, N>024637 и ВС070333), 3-33 (N>0010109 и N>024637) и 3-7 (N>0010109 и N>024637). Как другой пример, следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи, которые выявлены в моноклональном антителе НСо7 ЕиМЛЬ мыши, доступны под депозитными номерами СепЬапк: 1-69 (N>0010109, N>024637 и ВС070333), 5-51 (N>0010109 и ЭТ 024637), 4-34 (N>0010109 и N>024637), 3-30.3 (СА1556644) и 3-23 (А1406678). Белковые последовательности антитела сравнивают с компилированной базой данных белковых последовательностей при использовании одного из способов исследования сходства последовательностей, который имеет название Саррей ВЬА8Т (АЬксЬи1 и др. (1997) №.1с1ею АсПк РекеагсЬ 25: 3389-3402), и хорошо известен специалисту в данной области техники. ВЬА8Т представляет собой эвристический алгоритм, поскольку значимое выравнивание между последовательностью антитела и последовательностью базы данных, вероятно, содержит пары сегментов с высоким баллом (Η8Ρ) выравниваемых слов. Пары сегментов, баллы которых не могут быть улучшены путем удлинения или укорачивания, называются хитом. Таким образом, нуклеотидные последовательности, которые имеют происхождение от УВА8Е (Ьйр://уЬаке.тгс-сре.сат.ас.ик/уЬаке1/Ьк12.рЬр), подвергаются трансляции, а участок между и включая фрагмент от РР1 к РР3 каркасного участка сохраняется. Последовательности базы данных имеют среднюю длину 98 остатков. Двойные последовательности, которые точно совпадают по всей длине белка, удаляются. ВЬА8Т поиск на белки при использовании программы Ь1ак1р с параметрами по умолчанию, стандартными параметрами за исключением низкой эффективности фильтра, который выключается, и матрицы замещения ВЕ08ИМ62, фильтра для верхних 5 хитов, обеспечивают подгонку последовательности. Нуклеотидные последовательности подвергаются трансляции во всех шести рамках, и рамка, которая не содержит стоп-кодонов в согласованном сегменте последовательности базы данных, считается потенциальным хитом. Это, в свою очередь, подтверждается при использовании ВЬА8Т программы 1Ь1ак1х, которая транслирует последовательность антитела во всех шести рамках и сравнивает эти трансляции с УВА8Е нуклеотидными последовательностями, динамично транслированными во всех шести рамках.

Идентичность представляет собой точное совпадение аминокислот между последовательностью антитела и белком базы данных по всей длине последовательности. Позитивы (идентичность + совместимые замены) не являются идентичными, однако аминокислотные замены формируются в соответствии с ВЬ08ИМ62 матриксом замен. Если последовательность антитела совпадает с двумя последовательностями базы данных с той же идентичностью, то хит с самым большим количеством позитивов будет предполагаться как хит совпадающей последовательности.

Желательные каркасные последовательности для применения в антителе в соответствии с изобретением представляют собой такие, которые являются структурно подобными каркасной последовательности, используемой отобранным антителом в соответствии с данным изобретением, например, подобный ν_Η 2-05 каркасной последовательности (8ЕЦ ГО N0: 31) и/или ν_κ Ь15 каркасной последовательности (8ЕЦ ГО N0: 34), присущей предпочтительным мноклональными антителами в соответствии с данным изобретением. СГОРЕ СГОР2 и СГОР3 последовательности ν_Η, а также СГОРЕ СГОР2 и СГОР3 последовательности ν_κ могут быть привиты на каркасные участки, которые имеют идентичную последователь- 16 028336 ность с такой, которая выявлена в гене иммуноглобулина эмбрионального типа, из которого происходит каркасная последовательность, или СОВ последовательности могут быть привиты на каркасные участки, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностью эмбрионального типа. Например, было выявлено, что в некоторых случаях является желательным подвергать остатки мутациям в пределах каркасных участков для поддержания или улучшения антигенсвязывающей способности антитела (см. например, патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, которые относятся к Циееп и др.).

Другой тип модификаций вариабельного участка состоит в мутации аминокислотных остатков в пределах СЭВ1, СЭВ2 и/или СЭВ3 участков У_Н и/или У_к для улучшения одного или более связывающих свойств (например, аффинности) антител, которые представляет интерес. Сайт-направленный мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез может быть проведен для введения мутации(ий) и влияния на связывающие свойства антитела или на другое функциональное свойство, которое представляет интерес, такое влияние можно оценить в анализах ίη νίίτο или ίη νίνο, как описывается в данной заявке и подкрепляется Примерами. Преимущественно вводят консервативные модификации (как обсуждается выше). Мутации могут быть аминокислотными заменами, удлинениями или делециями, однако преимущественно представляют собой замены. Кроме того, типично подвергают изменениям не больше одной, двух, трех, четырех или пяти остатков в пределах СЭВ участков.

В соответствии с этим в другом воплощении данное изобретение относится к выделенным антиί'.ΆΌΜ1 моноклональным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые включают вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: (а) СЭВ1 участок У_Н, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2 и 3, или аминокислотную последовательность, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 1, 2 и 3; (Ь) СЭВ2 участок У_Н, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6, или аминокислотной последовательности, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6; (с) СЭВ3 участок У_Н, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 7, 8 и 9, или аминокислотную последовательность, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 7, 8 и 9; (ά) СЭВ1 участок У_к, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12, или аминокислотную последовательность, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 10, 11 и 12; (е) СЭВ2 участок У_к, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 13, 14 и 15, или аминокислотную последовательность, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 13, 14 и 15; и (£) СЭВ3 участок У_к, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0: 16, 17 и 18, или аминокислотную последовательность, которая имеет одну, две, три, четыре, пять или более аминокислотных замен, делеций или удлинений по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 16, 17 и 18. Модифицированные антитела в соответствии с изобретением включают те, в которых модификации были внесены в каркасные остатки в пределах У_Н и/или У_к, например, для улучшения свойств антитела. Типично, такие каркасные модификации осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например, один подход состоит во внесении обратной мутации одного или более каркасных остатков в соответствующую эмбриональную последовательность. В частности, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от эмбриональной последовательности, из которой происходит это антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасной последовательности антитела с эмбриональной последовательностью, из которой происходит это антитело. Например, для РТА021А1 при использовании системы нумерации Кабат аминокислотный остаток #30 (в пределах БВ3) У_Н представляет собой аспарагин (8ЕЦ ГО N0: 19), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_Н 2-05 представляет собой серии (8ЕЦ ГО N0: 31). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации соматические мутации подвергались обратной мутации до эмбриональной последовательности путем, например, сайтнаправленного мутагенеза или опосредованного ПНР мутагенеза (например, остаток #30 У_Н для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагина на серии).

Как другой пример, для РТА021_А1 аминокислотный остаток #54 У_Н представляет собой аспарагиновую кислоту (8ЕЦ ГО N0: 19), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_Н 2-05 представляет собой аспарагин (8ЕЦ ГО N0: 31). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #54 У_Н для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагиновой кислоты на аспарагин. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как другой пример, для РТА021_А1 аминокислотный остаток #50 У_к представляет собой глицин (8ЕЦ ГО N0: 22), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_к

- 17 028336

Ь15 представляет собой аланин (8Е0 ГО N0: 34). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #50 У_к для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из глицина на аланин. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как другой пример, для РТА021_А1 аминокислотный остаток #77 У_к представляет собой аспарагин (8Е0 ГО N0: 22), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_к Ь15 представляет собой серии (8Е0 ГО N0: 34). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #77 У_к для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагина на серии. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как другой пример, для РТА021_А2 аминокислотный остаток #54 У_н представляет собой аспарагиновую кислоту (8Е0 ГО N0: 20), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_н 2-05 представляет собой аспарагин (8Е0 ГО N0: 32). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #54 У_н для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагиновой кислоты на аспарагин. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как дополнительный пример, для РТА021_А2 аминокислотный остаток #89 У_н представляет собой изолейцин (8Е0 ГО N0: 20), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_н 2-05 представляет собой треонин (8Е0 ГО N0: 32). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #89 в пределах РР1 У_н для РТА021_А2 может подвергаться обратной мутации из изолейцина на треонин. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как другой пример, для РТА021_А3 аминокислотный остаток #54 Ун представляет собой аспарагиновую кислоту (8Е0 ГО N0: 21), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_н 2-05 представляет собой аспарагин (8Е0 ГО N0: 33). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #54 У_н для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагиновой кислоты на аспарагин. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Как другой пример, для РТА021_А3 аминокислотный остаток #77 У_к представляет собой аспарагин (8Е0 ГО N0: 24), в то время как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности У_к Ь15 представляет собой серии (8Е0 ГО N0: 36). Для возвращения каркасного участка последовательности к ее эмбриональной конфигурации, например, остаток #77 Ук для РТА021_А1 может подвергаться обратной мутации из аспарагина на серии. Такие подвергнутые обратной мутации антитела также охватываются данным изобретением.

Другой тип каркасной модификации охватывает мутацию одного или более остатков в пределах каркасного участка, или даже в пределах одного или более СИР участков, для удаления Т-клеточных эпитопов, что обеспечивает, таким образом, снижение потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход также называется деиммунизацией и более подробно описан в публикации патентной заявки США № 20030153043, которая относится к Сагг и др.

Дополнительно или альтернативно к модификациям, которые осуществляют в пределах каркасного участка или СИР участка, антитела в соответствии с изобретением могут быть сконструированы посредством включения модификаций в пределах Рс участка, что типично для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полувыведения из сыворотки, фиксация комплемента, Рс рецепторное связывание и/или зависимая от антигена клеточная токсичность. Кроме того, антитело в соответствии с изобретением может быть химически модифицированным (например, одна или более химических групп могут быть присоединены к антителу) или модифицированным для изменения его гликозилирования с целью изменения одного или более функциональных свойств антитела.

Каждое из этих воплощений описывается более подробно ниже. Нумерация остатков в Рс участке соответствует ЕЙ индексу Кабат.

В одном воплощении шарнирный участок СН1 подвергается модификации так, что количество остатков цистеина в шарнирном участке изменяется, например, увеличивается или уменьшается. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 5677425, который относится к Вобтег и др. Количество остатков цистеина в шарнирном участке СН1 изменяется, например, для улучшения сборки легкой и тяжелой цепей, или для увеличения, или уменьшения стабильности антитела. В другом воплощении Рс шарнирный участок антитела подвергают мутации для уменьшения периода биологического полувыведения антитела. В частности, одну или более аминокислотных мутаций вводят в СН2-СН3 домен участка границы Рс-шарнирный фрагмент, так, что антитело характеризуется нарушенным связыванием стафилококкового белка А (§ра) по сравнению со связыванием §ра с помощью нативного комплекса Рсшарнирный домен. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 6165745, который относится к \Уаг0 и др.

В другом воплощении антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полувыведения. При этом возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или более из

- 18 028336 следующих мутаций: Т252Ь, Τ254δ, Τ256Ρ, как описывается в патенте США № 6277375, который относится к \νηΓά. Альтернативно, для увеличения биологического периода полувыведения антитело может изменяться в пределах СН1 или СЬ участка так, чтобы оно содержало эпитоп для связывания резервного рецептора, взятого из двух петель СН2 домена Рс участка 1§О, как описывается в патентах США № 5869046 и 6121022, которые относятся к Рге51а и др.

В другом воплощении антитело производится в виде унитела, как описывается в публикации νΟ/2007/059782, которая введена в данную заявку в качестве ссылки В других воплощениях Рс участок изменяют путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела. Например, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, могут быть заменены другим аминокислотным остатком, так, что антитело имеет измененную аффинность для эффекторного лиганда, однако сохраняет способность к связыванию антигена исходного антитела. Эффекторный лиганд в отношении которого изменяется аффинность, может представлять собой, например, Рс рецептор или С1 компонент комплемента. Этот подход описывается более подробно в патентах США № 5624821 и 5648260, которые оба относятся к νίηίΌΤ и др.

В другом примере одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, могут быть заменены отличным аминокислотным остатком, так, что антитело имеет измененное С1с| связывание и/или сниженную или устраненную зависимую от комплемента цитотоксичность (СЭС). Этот подход описывается более подробно в патенте США № 6194551, который относится к Ιάιΐδο^ и др.

В другом примере один или более аминокислотных остатков в положениях аминокислот 231 и 239 изменяют, чтобы изменить способность антитела к фиксации комплемента. Этот подход дополнительно описан в публикации РСТ νΟ 94/29351, которая относится к ΒοάιικΓ и др.

Еще в одном примере Рс участок подвергают модификации для повышения способности антитела опосредовать зависимую от антитела цитотоксичность (N0^'.') и/или повышать аффинность антитела для Рсу рецептора путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот подход дополнительно описан в публикации РСТ νΟ 00/42072, которая относится к Рге51а. Кроме того, связывание сайтов на человеческом 1§О1 для РсуК1, РсуКЛ, РсуКШ та РсКп было картировано, и были описаны варианты с улучшенным связыванием (см. 8ЫеМ5, К.Ь. и др. (2001) ί. ΒίοΙ. Сйет. 276: 6591-6604). Специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 были продемонстрированные как такие, которые улучшают связывание с РсуКШ. Кроме того, следующие комбинации мутантов были продемонстрированные как такие, которые улучшают связывание с РсуКШ: Τ256Α/δ298Α, δ298Α/Ε333Α, δ298Α/Κ224Α и δ298Α/Ε333Α/Κ334Α.

Еще в одном воплощении модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено агликозилированное антитело (то есть антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменить, например, для повышения аффинности антитела для антигена. Такие углеводные модификации могут быть проведены с помощью, например, изменения одного или более сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, могут быть проведены одна или более аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельного участка для того, чтобы устранить, таким образом, гликозилирование в этом сайте. Такое гликозилирование может повышать аффинность антитела для антигена. Этот подход описывается более подробно в патентах США № 5714350 и 6350861, которые относятся к Со и др.

Дополнительно или альтернативно, антитело может быть создано так, что имеет измененный тип гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело, которое содержит уменьшенное количество остатков фукозила, или антитело, которое имеет повышенное количество бисекторных С1с№с структур. Такие модели измененного гликозилирования были продемонстрированы для повышения Α^СС способности антитела. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем экспрессии антитела в клетке хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в области техники и могут использоваться как клетки хозяева, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела в соответствии с изобретением, с помощью чего получают антитело с измененным гликозилированием. Например, клеточные линии Μδ704, Μδ705 и Μδ709 не имеют гена фукозилтрансферазы, РОТ8 (альфа (1,6) фукозилтрансфераза), так, что антитела, которые экспрессируются в клеточных линиях Μδ704, Μδ705 и Μδ709 не имеют фукозы на своих углеводах. Клеточные линии Μδ704, Μδ705 и Μδ709 ΕυΤ8^-'^- были созданы путем нацеленного разрушения РОТ8 гена в СΗΟ/^С44 клетках при использовании двух векторов для замещения (см. патентную публикацию США № 20040110704, которая относится к Υатаηе и др. и Υатаηе-ΟЬηик^ и др. (2004) Вю1ес1ию1 Вюенд 87: 614-22). Как другой пример, патент ЕР 1176195, который относится к Иаши и др., описывает клеточную линию с функционально нарушенным геном ΡυΤ8, который кодирует фукозил- 19 028336 трансферазу, так, что антитела, которые экспрессируются в такой клеточной линии, демонстрируют гипофукозилирование путем уменьшения или устранения фермента, связанного с альфа 1,6-связью. Напа1 и др. также описывает клеточные линии, которые имеют низкую ферментативную активность в отношении присоединения фукозы к Ν-ацетилглюкозамину, который связывается с Рс участком антитела, или не имеет ферментативной активности, например, линию клеток меланомы крыс ΥΒ2/0 (АТСС СКЬ 1662). Публикация РСТ \УО 03/035835, которая относится к Ргс51а, описывает вариант клеточной линии СНО, Ьес 13 клетки со сниженной способностью присоединения фукозы к связанным с Азп(297) углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антитела, которое экспрессируется в клетке хозяине (см. также 8Ые1Й8, К.Ь. и др. (2002) 1. Вю1. СЬет. 277: 26733-26740). Публикация РСТ \УО 99/54342, которая относится к Итапа и др., описывает линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-П-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (ОпТШ)) таких, что антитела, которые экспрессируются в этих линиях клеток, демонстрируют повышенное количество бисекционных С1сИас структур, что приводит к повышенной АЭСС активности антител (см. также Итапа и др. (1999) ΝηΙ. Вю1есЬ. 17: 176-180). Альтернативно, остатки фукозы антител могут быть отщеплены при использовании фермента фукозидазы. Например, фукозидаза, такая, как альфа-1фукозидаза, удаляет остатки фукозила из антител (ТагепИпо, А.И и др. (1975) ВюсЬет. 14: 5516-23).

Другая модификация антител, которая предполагается данным изобретением, представляет собой ПЭГилирование. Антитело может быть ПЭГилированным, например, для повышения биологического периода полувыведения (например, из сыворотки) антител. Для ПЭГилирования антител, антитело или его фрагмент обычно подвергают реакции с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким, как реактивный эфир или альдегидная производная ПЭГ, при условиях, при которых одна или более групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Преимущественно ПЭГилирование осуществляют с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой ПЭГ (или аналогичным реактивным водорастворимым полимером). Как используется в данной заявке, термин и полиэтиленгликоль охватывает любые формы ПЭГ, которые используются для дериватизации других белков, такие как моно (С1С10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль малеимид. В некоторых воплощениях антитело, которое подвергается ПЭГилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы ПЭГилирования белков известны в данной области техники и могут применяться к антителу согласно данному изобретению. См., например, патент ЕР 0154316, который относится к ΝίδΙιίιηιΐΗΐ и др. и ЕР 0401384, который относится к ЫЫк-пуа и др.

Физические свойства антитела

Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть дополнительно охарактеризованные с помощью различных физических свойств анти-САЭМ1 антитела. Разные анализы могут использоваться для определения и/или дифференциации различных классов антител на основе их физических свойств. В некоторых воплощениях антитела в соответствии с данным изобретением могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке или легкой, или тяжелой цепи. Присутствие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке может приводить к повышенной иммуногенности антитела, или к изменению рК антитела благодаря измененному связыванию антигена (МагзЬаИ и др. (1972) Аппи Кеу ВюсЬет 41: 673-702; Оа1а Р.А. и Мотзоп 8.И (2004) I 1ттипо1 172: 5489-94; ^а1Ьск и др. (1988) I Ехр Мей 168: 1099-109; 8р1го К.О. (2002) О1усоЬю1оду 12: 43К-56К; РагекЬ и др. (1985) №Циге 316: 452-7; Мшига и др. (2000) Мо1 1ттипо1 37: 697-706). Известно гликозилирование как такое, которое происходит в мотивах, содержащих Ν-Χ-δ/Т последовательность. Гликозилирование вариабельного участка можно анализировать при использовании 01усоЬ1о1 анализа, который расщепляет антитело с образованием РаЬ, после чего осуществляют анализы на гликозилирование при использовании анализа, который измеряет окисление перйодата и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельного участка можно анализировать при использовании Июпех световой хроматографии (Июпех-1с) при расщеплении сахаридов из РаЬ до моносахаридов с последующим определением содержания индивидуальных сахаридов. В некоторых случаях предпочтительно иметь анти-САОМ1 антитело без гликозилирования вариабельного участка. Этого можно достичь либо с помощью селекции антитела, которое не содержит мотива гликозилирования в вариабельном участке, либо путем мутации остатков в пределах мотива гликозилирования при использовании стандартных методик, хорошо известных в данной области техники.

В качестве примера гликозилирования, для РТА021А1, при использовании системы нумерации Кабат, аминокислотный остаток #30 (в пределах РК3) У_н представляет собой аспарагин (8ЕО ГО ΝΟ: 19). Он является потенциальным сайтом гликозилирования, и этот остаток может быть заменен глутамином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела не содержат сайтов изомерии аспарагина. Дезаминирование или эффект аспарагиновой кислоты может возникать на Ν-0 или Ό-0 последовательности соответственно. Дезаминирование или эффект аспарагиновой кислоты приводят к образованию изоаспарагиновой кислоты, которая снижает стабильность антитела в результате образования выгнутой структуры за пределами боковой цепи карбокситерминального конца, что предпочтительнее, чем в основной цепи. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть обнаружено при использовании изоквантового анализа, который использует ВЭЖХ с обратной фазой для анализа на аспарагиновую ки- 20 028336 слоту. Каждое антитело обладает уникальной изоэлектрической точкой (ρΐ), однако в общем случае ρΐ антител будут попадать в интервал рН от 6 до 9,5. ρΐ для 1дС1 антител типично лежит в интервале рН 79,5 а ρΐ для 1дС4 антитела типично лежит в интервале рН 6-8. Антитела могут иметь значение ρΐ, которое выходит за пределы этого интервала. Несмотря на то, что эти эффекты неизвестны, существует гипотеза, что антитела со значением ρΐ за пределами нормального интервала, могут подвергаться раскручиванию структуры и быть нестабильными в условиях ίη νίνο. Изоэлектрические точки можно анализировать при использовании анализа капиллярного изоэлектрического фокусирования, который создает градиент рН, также может использовать лазерное фокусирование для повышенной точности (.Ташт и др. (2002) Е1есίτορΕοΓΟδίδ 23: 1605-11; Ма и др. (2001) СЬ^οтаΐοд^аρЬ^а 53: §75-89; Ний и др. (1998) I СНготаЮдг А800: 355-67). В некоторых случаях предпочтительно иметь анти-САЭМ1 антитело, которое имеет ρΐ значение, которое входит в нормальный интервал. Этого можно достичь либо путем отбора антитела с ρΐ в нормальном интервале, либо путем мутации заряженных поверхностных остатков при использовании стандартных методик, хорошо известных в данной области техники.

Каждое антитело имеет температуру плавления, которая является показательной для его термостабильности (КгкИпатиННу К. и Мапшпд М.С. (2002) Сигг РЬагт Вю1ес1ито1 3: 361-71). Более высокая термостабильность свидетельствует о большей общей стабильности антитела ίη νίνο. Точка плавления антитела может измеряться при использовании методик, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (СЬеп и др. (2003) РЬагт Рек 20: 1952-60; ΟΙιπΕιηύο и др. (1999) ΐттиηο1 Ьей 68: 47-52). ТМ! показывает температуру начального раскручивания антитела. ТМ₂ показывает температуру полного раскручивания антитела. В общем случае предпочтительно, чтобы ТМ! антитела в соответствии с данным изобретением было больше 60°С, преимущественно больше 65°С, более предпочтительно больше 70°С. Альтернативно термостабильность антитела может измеряться при использовании циркулярного дихроизма (Миггау и др. (2002) I. СЬготаЮдг §С1 40: 343-9).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения отбирают антитела, которые не деградируют быстро. Фрагментация анти-САЭМ1 антитела может измеряться при использовании капиллярного электрофореза (СЕ) и МАБЭ1-М§. что хорошо известно в данной области техники (А1ехап4ег А.) и НидЬек ЭЕ (1995) Апа1 СЬет 67: 3626-32).

В другом предпочтительном варианте отбирают антитела, которые имеют минимальные эффекты агрегации. Агрегация может приводить к стимуляции нежелательного иммунного ответа и/или к измененным или неблагоприятным фармакокинетическим характеристикам. В общем случае приемлемы антитела с агрегацией, которая составляет 25% или меньше, преимущественно 20% или меньше, даже более предпочтительны 15% или меньше, наиболее предпочтительны 10% или меньше и еще более предпочтительны 5% или меньше. Агрегация может измеряться с помощью нескольких методик, которые хорошо известны в данной области техники, включая гель-фильтрационную колонку (§ЕС), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЕРХ), и рассеяние света для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.

Способы конструирования антител

Как обсуждалось выше, анти-САОМ1 антитела, которые имеют ν_Η и ν_κ последовательности, раскрытые в данной заявке, могут использоваться для создания новых анти-САЭМ1 антител путем модификации ν_Η и/или ν_κ последовательности, или константного(ых) участка(участков), которые присоединяются к ним. Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные признаки анти-САЭМ1 антитела в соответствии с данным изобретением, например, РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, используются для создания структурно родственных анти-САОМ1 антител, которые сохраняют по крайней мере одно функциональное свойство антитела в соответствии с данным изобретением, такое, как связывание с человеческим САОМ1. Например, один или более СОР участков РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, или их мутантные формы, могут объединяться рекомбинантно с известными каркасными участками и/или другими СЭР для создания дополнительных, рекомбинантно сконструированных антиСАОМ1 антител в соответствии с данным изобретением, как обсуждается выше. Другие типы модификаций включают те, которые описаны в предыдущем разделе. Исходный материал для способа конструирования представляет собой одну или более ν_Η и/или ν_κ последовательностей, которые раскрыты в данной заявке, или один или более их СЭР участков. Для получения сконструированного антитела нет необходимости получать (то есть экспрессировать белок) антитело, которое имеет одну или более ν_Η и/или ν_κ последовательностей, которые раскрыты в данной заявке, или один или более их СЭР участков. Вместо этого, информация, которая содержится в этой(этих) последовательности(ях), используется как исходный материал для создания второго поколения последовательности(ей), которая(ые) имеет(ют) происхождение от оригинальной(ых) последовательности(ей), затем получают и экспрессируют белковую(ые) последовательность(последовательности) второго поколения. В соответствии с этим в другом воплощении изобретение относится к способу получения анти-САОМ1 антител, который включает получение: (ί) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, включающего СЭР1 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из §ЕС Ш N0: 1, 2 и 3, СЭР2 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из §ЕС ΐΌ N0: 4, 5 и 6, и/или СЭР3 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из §ЕС ΐΌ N0: 7, 8 и 9; и/или (ίί) последовательности вариабель- 21 028336 ного участка легкой цепи антитела, которая включает СЭЕ1 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 5>Еф ΙΌ N0: 10, 11 и 12, СЭЕ2 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 5>Еф ГО N0: 13, 14 и 15, и/или СГОЕ3 последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 5>Еф ГО N0: 16, 17 и 18; изменение по крайней мере одного аминокислотного остатка в пределах последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела для создания по крайней мере одной измененной последовательности антитела; и экспрессию измененной последовательности антитела как белка.

Стандартные методики молекулярной биологии могут использоваться для получения и экспрессии измененной последовательности антитела.

Предпочтительно в том случае, когда антитело, которое кодируется измененной(ыми) последовательностью(последовательностями) антитела, чтобы оно сохраняло одну, несколько или все функциональные свойства анти-САОМ1 антитела, описанного в данной заявке, где функциональные свойства включают, но не ограниченны связыванием с человеческим САЭМ1 со значением К_с 1х10^-7 М или меньше; связыванием с человеческими клетками СНО, трансфицированными с помощью САЭМ1.

Функциональные свойства измененного антитела могут оцениваться при использовании стандартных анализов, доступных в данной области техники и/или описанных в данной заявке, таких как те, что описаны в Примерах (например, проточная цитометрия, анализы связывания).

В некоторых способах конструирования антител в соответствии с данным изобретением мутации могут быть введенные случайно или селективно во всю или в часть кодирующей последовательности анти-САОМ1 антитела, а полученное модифицированное анти-САОМ1 антитело может подвергаться скринингу на связывающую активность и/или другие функциональные свойства так, как описывается в данной заявке. Способы получения мутаций описаны в данной области техники. Например, публикация РСТ А0 02/092780, которая относится к 5>1юг1. описывает способы создания и скрининга мутаций антитела при использовании насыщающего мутагенеза, объединение с помощью искусственного лигирования или их комбинирования. Альтернативно, публикация РСТ А0 03/074679, которая относится к Еа/аг и др., описывает способы использования методов компьютерного скрининга для оптимизации физикохимических свойств антитела.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела в соответствии с данным изобретением

Другой аспект данного изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитела в соответствии с данным изобретением. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток или в частично очищенной или существенно чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или является, по существу, чистой, когда очищается от других клеточных компонентов или других загрязняющих веществ, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, включая щелочную/δΌδ обработку, наслаивание СкС1, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методы, которые хорошо известны в данной области техники. См., Р. Аи8иЬе1 и др., ред. (1987) СиггеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬИкШпд и Айеу ШегкШепсе, №ν Уогк. Нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или может не содержать интронные последовательности. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.

Нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением могут быть получены при использовании стандартных методик молекулярной биологии. Для антител, которые экспрессируются гибридомами, (например, гибридомами, полученными из трансгенной мыши, которые несут гены человеческого иммуноглобулина, как описывается), кДНК, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР амплификации или методик клонирования кДНК. Для антител, полученных из генной библиотеки иммуноглобулина (например, при использовании методики фагового дисплея), нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитело, могут быть извлечены из такой библиотеки.

Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением являются такими, которые кодируют ν_Η и V,, последовательности РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3 моноклонального антитела. ДНК последовательности, которые кодируют ν_Η последовательности РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3, представлены в 5>Еф ГО N0: 25, 26 и 27 соответственно. ДНК последовательности, которые кодируют ν_κ последовательности РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3, представлены в 5>Еф ГО N0: 28, 29 и 30 соответственно.

Другие предпочтительные нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением представляют собой нуклеиновые кислоты, которые по крайней мере на 80% идентичны, по крайней мере на 85%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95%, по крайней мере на 98% или по крайней мере на 99% идентичны одной из последовательностей, представленных в 5>Еф ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 и 30, нуклеиновые кислоты которых кодируют антитело в соответствии с данным изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент.

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты представляет со- 22 028336 бой количество положений в последовательности, в которых нуклеотиды являются идентичными, принимая во внимание количество пробелов и длину каждого пробела, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть проведено при использовании математического алгоритма, такого как алгоритм Меуегз и МШег или программа ХВЬА8Т от АНзсНик которая описана выше.

Кроме того, предпочтительные нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением включают одну или больше частей последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют СГОК, представленные в 8ЕЦ ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 и 30. В этих воплощениях нуклеиновая кислота может кодировать последовательность СГОКЕ СГОК2 и/или СГОК3 тяжелой цепи РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3, или последовательность СЭК.1, СГОК2 и/или СГОК3 легкой цепи РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3.

Нуклеиновые кислоты, которые имеют по крайней мере 80%, например по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98% или по крайней мере 99% идентичность последовательности, которая кодирует участки СГОК последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 или 30 (последовательности У_Н и У_К), являются также предпочтительными нуклеиновыми кислотами в соответствии с данным изобретением. Такие нуклеиновые кислоты могут отличаться от соответствующей части 8ЕЦ ГО N0: 25, 26, 27, 28, 29 или 30 в участке, отличном от того, который кодирует СГОК, и/или в участке, который кодирует СГОК. Если отличие состоит в участке, который кодирует СГОК, то участок СГОК, который кодируется этой нуклеиновой кислотой, типично включает одну или более модификаций консервативной последовательности, как определено в данной заявке, по сравнению с соответствующей последовательностью СГОК РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021_А3.

Если получены ДНК фрагменты, которые кодируют УН и УК, то эти ДНК фрагменты могут дополнительно обрабатываться при использовании стандартных ДНК методик, например, для преобразования генов вариабельных участков на гены полноразмерного антитела, на гены РаЬ фрагмента или на зсРу ген. При этих манипуляциях ДНК фрагменты, которые кодируют У_К или У_Н, функционально связаны с другим ДНК фрагментом, который кодирует другой белок, такой как константный участок антитела или гибкий линкер. Термин функционально связаны, как используется в этом контексте, означает, что два ДНК фрагмента соединены так, что аминокислотные последовательности, которые кодируются двумя ДНК фрагментами, остаются в рамке считывания.

Выделенные ДНК, которые кодируют У_Н участок, могут быть преобразованы в ген полноразмерной тяжелой цепи с помощью функционального связывания ДНК, которая кодирует УН, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константного участка тяжелой цепи человека известны в области техники (см., например, Кабат, Е. А., и др. (1991) Зециепсез оГ Ргокешз оГ Iттиηο1ο§^са1 Шегезк, 5-е издание, министерство здравоохранения и социального обеспечения США, №Н номер публикации 91-3242), а ДНК фрагменты, которые охватывают эти участки, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР амплификации. Константный участок тяжелой цепи может представлять собой константный участок Ι§01, Ι§02, ΙβΟ3, ΙβΟ4, Ι§Ε, Ι§Τ, ЦМ или ΙβΌ, однако наиболее предпочтительно представляет собой константный участок Ι§01 или Ι§04. Для гена РаЪ фрагмента тяжелой цепи ДНК, которая кодирует У_Н, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, которая кодирует только константный участок СН1 тяжелой цепи.

Выделенные ДНК, которые кодируют У_Ъ/У_К участки, могут быть преобразованы в полноразмерный ген легкой цепи (а также ген РаЪ легкой цепи) с помощью функционального связывания ДНК, которая кодирует У_ъ, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константный участок легкой цепи, СЬ. Последовательности генов константного участка легкой цепи человека известны в данной области техники (см., например, СаЪак, Е.А., и др. (1991) Зециепсез оГ Ргокешз оГ Iттиηο1οд^са1 Щегезк, 5-е издание, министерство здравоохранения и социального обеспечения США, №Н номер публикации 91-3242), а ДНК фрагменты, которые охватывают эти участки, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР амплификации. В предпочтительных вариантах константный участок легкой цепи может быть константным участком каппа или лямбда.

Для создания зсРу гена ДНК фрагменты, которые кодируют У_Н и У_Ъ/У_К, функционально связаны с другим фрагментом, который кодирует гибкий линкер, например, такой, который кодирует аминокислотную последовательность (С1у₄-8ег)₃, так, что У_Н и У_Ъ/У_К последовательности экспрессироваться в виде одноцепочечного белка с УЦУ_К и У_Н участками, которые соединены гибким линкером (см., например, Βίτά и др. (1988) 8аепсе 242: 423-426; Низкоп и др. (1988) Ргос. Ν;·ι11. Асай. δα. И8А 85: 5879-5883; МссаГГегку и др., (1990) №-Циге 348: 552-554).

Получение моноклонального антитела

Моноклональное антитела (монАт) в соответствии с данным изобретением может быть получено с помощью различных методик, включая традиционную методику моноклонального антитела, например, с помощью стандартной методики гибридизации соматических клеток КоЫег и МПзкеш (1975) №-Циге 256: 495. Несмотря на то, что процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, могут использоваться другие методики получения моноклонального антитела, например, вирусная или

- 23 028336 онкогенная трансформация В-лимфоцитов.

Предпочтительная система для получения гибридом представляет собой мышиную систему. Получение гибридом мышей является хорошо известной процедурой. Прописи иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области техники. Партнеры слияния (например, мышиные миеломные клетки) и процедуры слияния хорошо известны.

Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены на основе последовательности нечеловеческого моноклонального антитела, полученной так, как описано выше. ДНК, которая кодирует тяжелую и легкую цепи иммуноглобулинов, может быть получена из нечеловеческой гибридомы, которая содержит немышиные (например, человеческие) последовательности иммуноглобулина, при использовании стандартных методик молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные участки могут быть соединены с человеческими константными участками при использовании способов, известных в области техники (см. например, патент США № 4816567, который относится к СаЬШу и др.). Для создания гуманизированного антитела мышиные СОК участки могут быть встроены в человеческий каркасный участок при использовании способов, известных в области техники (см. например, патент США № 52255З9, который относится к Шш!ег, и патенты США № 55З0101; 5585089; 569З762 и 6180З70, которые относятся к Оиееп и др.).

В предпочтительном варианте антитела в соответствии с изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против САЭМ1, могут быть получены при использовании трансгенных или трансхромосомных мышей, которые несут части иммунной системы человека вместо мышиной системы. Такие трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, которые упоминаются в данной заявке как линии нитАЬ Мойке® и КМ Мойке® соответственно, и вообще упоминаются в данной заявке как мыши с человеческим 1д.

Линия нитАЬ Мойке® (Мейагех®, 1пс.) содержит минилокус человеческого гена иммуноглобулина, который кодирует неперегруппированные последовательности тяжелой (μ и γ) и κ легкой цепи человеческого иммуноглобулина вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и κ цепей (см., например, ЬопЬегд, и др. (1994) №1иге З68 (6474): 856-859). В соответствии с этим мыши демонстрируют сниженную экспрессию мышиного 1дМ или к, и в ответ на иммунизацию введенные в них трансгены человеческих тяжелой и легкой цепей подвергаются соматическим мутациям для получения человеческого 1§Ок моноклонального антитела с высокой аффинностью (ЬопЬегд, N. и др. (1994), выше; рассматривается у ЬопЬегд, N. (1994) напйЬоок о£ Е.хрептеп1а1 РНагтасо1оду 11З: 49-101; ЬопЬегд, N. и Иик/аг, Ό. (1995) 1п!ет. Кеу. 1ттипо1. 1З: 65-9З, и нагйшд, Р. и ЬопЬегд, N. (1995) Апп. КУ. Асай. Зс1. 764: 5З6-546). Получение и использование нитАЬ Мойке® и геномных модификаций, которые несут эти мыши, дополнительно описано у Тау1ог, Ь. и др. (1992) ШсШс Аай КекеагсЬ 20: 62876295; СНеп, I и др. (199З) 1п!егпа!юпа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп и др. (199З) Ргос. №И. Асай. Зск ИЗА90: З720-З724; СНо1 и др. (199З) ХаПие Оепейск 4: 117-12З; СНеп, I и др. (199З) ЕМВ0 I. 12: 821-8З0; ТиаШоп и др. (1994) I 1ттипо1. 152: 2912-2920; Тау1ог, Ь. и др. (1994) 1п!ета!юпа1 1ттипо1оду 6: 579591; и РвЬтоМ, Ό. и др. (1996) К-Ииге Вю!есНпо1оду 14: 845-851, содержание которых является специфически введенным в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности. См. также патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 56ЗЗ425; 5789650; 5877З97; 5661016; 5814З18; 5874299 и 5770429; которые все относятся к ЬопЬегд и Кау; патент США № 5545807, который относится к Зигаш и др.; публикации РСТ Ш0 92/0З918, Ш0 9З/12227, Ш0 94/25585, Ш0 97/1З852, Ш0 98/24884 и Ш0 99/45962, которые все относятся к ЬопЬегд и Кау; и публикацию РСТ Ш0 01/14424, которая относится к Когтап и др.

В другом воплощении человеческие антитела в соответствии с изобретением могут быть получены при использовании мыши, которая несет последовательности человеческого иммуноглобулина на трансгенах и трансхромосомах, такой как мышь, которая несет трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такая мышь упоминается в данной заявке как линия КМ мыши® и является описанной более подробно в публикации РСТ Ш0 02/4З478, которая относится к 1кЫйа и др.

Кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, которые экспрессируют гены человеческого иммуноглобулина, являются доступными в области техники и могут использоваться для получения аюги-САОМ1 антитела в соответствии с данным изобретением. Например, может использоваться альтернативная трансгенная система, которая называется Ксеномаус (Атдеп, 1пс.); такие мыши являются описанными, например, в патентах США № 59З9598; 6075181; 6114598; 6150584 и 616296З, которые относятся к КисНеНарай и др. Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, которые экспрессируют гены человеческого иммуноглобулина, являются доступными в области техники и могут использоваться для получения анти-САОМ1 антитела в соответствии с данным изобретением. Например, могут использоваться мыши, которые несут как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, они называются как ТС мыши; такие мыши описаны Тот1/ика и др. (2000) Ргос. №И. Асай. Зск ИЗА 97: 722-727. Кроме того, коровы, которые несут трансхромосомы человеческих тяжелой и легкой цепей, были описаны в данной области техники (Кигогта и др. (2002) №11иге Вю!есНпо1оду 20: 889-894) и заявке РСТ Ш0/2002/092812, они могут использоваться для

- 24 028336 получения анти-САЭМ1 антитела в соответствии с данным изобретением. Человеческие моноклональные антитела в соответствии с изобретением могут быть также получены при использовании методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческого иммуноглобулина. Такие способы фагового дисплея для выделения человеческих антител общепризнаны в данной области техники. См., например: патенты США № 5223409; 5403484 и 5571698, которые относятся к Ьабиег и др.; патенты США № 5427908 и 5580717, которые относятся к Эо\уег и др.; патенты США № 5969108 и 6172197, которые относятся к Мссайейу и др.; и патенты США № 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, которые относятся к Огйй1Й8 и др.

Человеческие моноклональные антитела в соответствии с изобретением могут также быть получены при использовании 8СГО мышей, у которых человеческие иммунные клетки были реконструированы так, что при иммунизации может быть получен ответ в виде человеческого антитела. Такие мыши описаны, например, в патентах США № 5476996 и 5698767, которые относятся к Αίίδοη и др.

Иммунизация мышей с человеческим 1д

Когда используются мыши с человеческим 1д для того, что вызвать образование человеческих антител в соответствии с данным изобретением, то такие мыши могут быть иммунизированы при помощи очищенного или обогащенного препарата САЭМ1 антигена и/или рекомбинантного САЭМ1, или клеток, которые экспрессируют САЭМ1, или САЭМ1 слитого белка, как описано ЬопЬетд, N. и др. (1994) №Циге 368 (6474): 856-859; ΡίδΓΜΙά, Ό. и др. (1996) №Циге Вю1ес1ию1оду 14: 845-851; и в публикациях РСТ А0 98/24884 и А0 01/14424. Преимущественно мыши являются такими в возрасте 6-16 недель перед первой иммунизацией. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) САЭМ1 антигена можно использовать для интраперитонеальной иммунизации мышей с человеческим 1д. Подробные процедуры для получения полного человеческого моноклонального антитела к САЭМ1 раскрыты в примере 1, который приведен ниже. Кумулятивный опыт с разными антигенами показал, что трансгенные мыши являются чувствительными, когда сначала их подвергают интраперитонеальной иммунизации (ΙΡ) при использовании антигена в полном адъюванте Фрейнда, после этого через каждую последующую неделю проводят ΙΡ иммунизации (до 6 недель) с помощью антигена в неполном адъюванте Фрейнда. Однако адъюванты, отличные от адъюванта Фрейнда, также могут быть эффективными. Кроме того, цельные клетки при отсутствии адъюванта также тоже являются высоко иммуногенные. Иммунный ответ может подвергаться мониторингу на протяжении всего курса прописи иммунизации при использовании образцов плазмы крови, полученных путем ретроорбитальных заборов крови. Плазму подвергали скринингу с помощью ЕЫ8Л (так, как описано ниже), и мышей с достаточными титрами анти-САЭМ1 человеческого иммуноглобулина использовали для слияния. Мышей подвергали бустинг-инъекции внутривенно с помощью антигена за 3 дня перед забиванием и удаляли селезенку. Предполагается, что необходимо осуществить 2-3 слияние для каждой иммунизации. Типично от 6 до 24 мышей иммунизируют для каждого антигена. В одном из вариантов могут использоваться мышиные линии, которые несут Нсо7, Нсо12 или Нсо17 трансген человеческой тяжелой цепи. Альтернативно или дополнительно, может использоваться линия КМ Мойке®. Кроме того, две или более из этих линий могут скрещиваться с получением одной мыши, которая имеет множество различных трансгенов человеческой тяжелой цепи.

Получение гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела

Для получения гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов от иммунизированных мышей выделяли и сливали с приемлемой иммортализированной линией клеток, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы могут подвергаться скринингу для получения специфического для антигена антитела. Например, суспензия единичных клеток лимфоцитов селезенки, полученная от иммунизированных мышей, может сливаться с одной шестой по количеству Р3Х63-Ад8.653 несекретирующих клеток мышиной миеломы (АТСС, СКВ 1580) с 50% ПЭГ. Альтернативно, суспензия единичных клеток лимфоцитов селезенки, полученная от иммунизированных мышей, может сливаться при использовании электрического поля на базе способа электрослияния с помощью СуЮриИе большой камеры электропоратора для слияния клеток (СуЮриРе 8с1епсе§, 1пс., 01еп Витте Мату1апб). Клетки с титром 2х10⁵ высаживали в микротитровальный планшет с ячейками с плоским дном, после инкубации на протяжении 2 недель в селективной среде, которая содержит 20% фетальной клоновой сыворотки, 18% 653 кондиционной среды, 5% ориген (ЮЕИ), 4 мМ Ь-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ НЕРЕ8, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1Χ НАТ (8|дта; НАТ прибавляли через 24 ч после слияния). Через приблизительно 2 недели клетки можно культивировать в среде, в которой НАТ является замененным на НТ. Индивидуальные ячейки потом подвергали скринингу с помощью ЕЫ8А на человеческие моноклональные 1дМ и 1дС антитела. После начала экстенсивного роста гибридомы через 10-14 дней среду обычно подвергали исследованию. Гибридомы, которые секретируют антитело, можно повторно высаживать, снова подвергать скринингу, и если они все еще являются положительными на человеческий 1дС. то моноклональные антитела можно субклонировать по крайней мере дважды путем предельного разведения. Стабильные субклоны можно потом субклонировать ш νίίτο для получения небольших количеств антитела в среде для

- 25 028336 культуры тканей.

Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых колбах, которые вращаются, для очистки моноклонального антитела. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед проведением аффинной хроматографии с использованием белка А-сефарозы (РЬатташа, Р1кса1атау, Ν.Τ). Элюированный 1дО можно проверять с помощью гельэлектрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для гарантирования чистоты. Буферный раствор можно заменять на РВ8, при этом его концентрация может быть определена с помощью ΘΌ280 при использовании коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и хранятся при -80°С.

Получение трансфектом, которые вырабатывают моноклональные антитела

Антитела в соответствии с изобретением также могут вырабатываться в клетке хозяине трансфектомы при использовании, например, комбинации методик рекомбинантной ДНК, методов генной трансфекции, что хорошо известно в данной области техники (например, Моткой, 8. (1985) 8с1епсе 229: 1202).

Например, для экспрессии антитела или фрагментов такого антитела ДНК, которые кодируют часть или полноразмерные тяжелые цепи, могут быть получены с помощью стандартных методик молекулярной биологии (например, ПНР амплификации или клонирования кДНК при использовании гибридомы, которая экспрессирует антитело, которое представляет интерес), потом эти ДНК встраивают в экспрессионные векторы, так, что эти гены функционально связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. В этом контексте термин функционально связаны предназначен для понимания того, что ген антитела встраивают в вектор так, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, служат для предусмотренной регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и экспрессионные контролирующие последовательности выбирают так, чтобы они были совместимыми с экспрессией в используемой клетке хозяине. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встраивать в отдельный вектор или, более типично, оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных сайтов рестрикции во фрагменте гена антитела и вектора, или лигирования по тупым концам, если нет сайтов рестрикции). Вариабельные участки легкой и тяжелой цепей антитела, описанные в данной заявке, могут использоваться для создания генов полноразмерного антитела любого изотипа путем встраивания их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные участки тяжелой цепи и легкой цепи антитела нужного изотипа, так, что ν_Η сегмент функционально связан с СН сегментом(ами) в векторе, а ν_κ сегмент функционально связан с СЬ сегментом в векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который содействует секреции цепи антитела из клетки хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор так, что сигнальный пептид связан в рамке считывания с аминотерминальным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологический сигнальный пептид (то есть сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).

В дополнение к генам цепи антитела, рекомбинантные экспрессионные векторы в соответствии с изобретением несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке хозяине. Термин регуляторная последовательность относится к промоторам, энхансерам и другим элементам контроля экспрессии (например, сигналам полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, у Сое44е1 (Оеие Ехргеккюп Тесйпо1оду. МеИобк ίη Еп/уто1оду 185, Асайетю Ргекк, 8ап Э1едо, СА (1990)). Специалисту в данной области техники понятно, что конструирование экспрессионного вектора, включая отбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которая трансформируется, уровня экспрессии необходимого белка, и т.п. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках млекопитающих включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии белка в клетках хозяевах, такие как промоторы и/или энхансеры, которые имеют происхождение от цитомегаловируса (СМУ), вируса обезьян 40 (8ν40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса) (А4т1р)) и полиомы. Альтернативно, могут также использоваться невирусные регуляторные последовательности, такие как убиквитиновый промотор или промотор β-глобина. Кроме того, регуляторные элементы, могут состоять из последовательностей, полученных из различных источников, таких как система 8Κα промотора, которая содержит последовательности из раннего промотора 8ν40 и длинного терминального повтора вируса человеческой лейкемии типа 1 (ТакеЬе, Υ. и др. (1988) Мо1. Се11. Вю1. 8: 466472). В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям, рекомбинантные экспрессионные векторы в соответствии с изобретением могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в хозяйских клетках (например, источник репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген содействует селекции клеток хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и

- 26 028336

5179017, которые все относятся к Ахе1 и др.). Например, типично ген селективного маркера обеспечивает устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат, клетки хозяина, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены селективного маркера включают ген дегидрофолатредуктазы (ИнРР) (для применения в бИт клетках хозяина с селекцией/амплификацией при использовании метотрексата) и ген пео (для С418 селекции).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионный(ые) вектор(ы), который(ые) кодирует(ют) тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку хозяина с помощью стандартных методик. Разные формы термина трансфекция охватывают широкое разнообразие методик, которые обычно используются для введения экзогенной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, например, путем электропорации, осаждения с помощью фосфата кальция, Иеае-декстран трансфекции и подобных им. Несмотря на то, что теоретически возможно экспрессировать антитела в соответствии с изобретением либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках, экспрессия антитела в эукариотических клетках, а именно в клетках млекопитающих она предпочтительно, поскольку такие эукариотические клетки, и, в частности, клетки млекопитающих, вероятнее, чем прокариотические клетки, собирают и секретируют правильно собранное и иммунологически активное антитело. Прокариотическая экспрессия генов антитела неэффективна для получения больших выходов активного антитела (Во88, М.А. и \Уооб, С.Р. (1985) 1ттипо1оду Тобау 6: 12-13).

Предпочтительные для экспрессии рекомбинантного антитела в соответствии с изобретением клетки млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО клетки) (включая бЫг^- СНО клетки, описанные у Иг1аиЬ и Сйа8ш, (1980) Ргос. №-Н1. Асаб. δα. ЛА 77: 4216-4220, которые используются с ИнРР селективным маркером, например, как описывается у Р. 1. ЕаиГтап и Р.А. Бйагр (1982) 1. Мо1. Вю1. 159: 601-621), Л0 клетки миеломы, СОδ клетки и δΡ2 клетки. В частности, для применения в случае N50 клеток меланомы предпочтительна другая экспрессионная система, которая представляет собой Сδ систему генной экспрессии, раскрытую в публикации \У0 87/04462 которая относится к \УП8оп), \У0 89/01036 (которая относится к ВеЬЬш§1оп) и ЕР 338841 (относится к ВеЬЬшдГоп). Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, которые кодируют гены антитела, вводят в клетки млекопитающих, антитела получают путем культивирования клеток хозяев на протяжении периода времени, достаточного для того, чтобы осуществить экспрессию антитела в них или, более преимущественно, секрецию антитела в культуральную среду, в которой эти клетки выращивают. Антитела могут быть выделены из культуральной среды при использовании стандартных способов очистки белка.

Характеристика связывания антитела с антигеном

Антитела в соответствии с изобретением могут подвергаться анализу на связывание с САИМ1 при использовании, например, стандартного ЕЬ1БА. Кратко, микротитровальные планшеты покрывали с помощью очищенного САИМ1 при концентрации 0,25 мкг/мл в ΡВδ и потом блокировали при использовании 5% бычьего сывороточного альбумина в ΡВδ. Разведение антитела (например, разведение плазмы крови иммунизированных с помощью САИМ1 мышей) прибавляли к каждой ячейке и инкубировали на протяжении 1-2 ч при 37°С. Планшеты промывали с помощью смеси ΡВδ/Твин и потом инкубировали со вторичным реагентом (например, для человеческого антитела это козий специфический для Рс античеловеческий 1§С поликлональний реагент), конъюгированным с щелочной фосфатазой, на протяжении 1 ч при 37°С. После промывания планшеты проявляли при использовании р№Р субстрата (1 мг/мл) и анализировали при 0Ό 405-650. Преимущественно мышей, которые имели наивысший титр, использовались для слияния. Анализ ЕЬ1БА, как описано выше, также может использоваться для скрининга гибридом, которые демонстрируют наивысшую положительную реактивность с САИМ1 иммуногеном. Гибридомы, которые связываются с высокой авидностью с САИМ1, субклонировали и подвергали дальнейшей характеристике. Один клон из каждой гибридомы, который сохраняет реактивность исходных клеток (с помощью ЕЫБА), может быть выбран для создания 5-10 пробирок клеточного банка, который хранится при -140°С, и для очистки антитела.

Для очистки анти-САИМ1 антитела отобранные гибридомы могут выращиваться в пробирках на два литра, которые вращаются. Супернатанты подвергали фильтрации и концентрированию перед осуществлением аффинной хроматографии при использовании белка А-сефарозы (Рйагтааа, Р18са1а\уау, N1). Элюированный 1§С проверяли с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для гарантии чистоты. Буферный раствор можно заменять на ΡВδ, и концентрация может определяться с помощью 0Ό280 при использовании коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и хранятся при -80°С.

Для определения, связываются ли отобранные анти-САИМ1 моноклональные антитела с уникальными эпитопами, каждое антитело можно подвергать биотинилизации при использовании коммерчески доступных реагентов (Р1егсе, РоскГогб, 1Ь). Исследование на конкуренцию за связывания с антителом в соответствии с изобретением при использовании немеченых моноклональных антител и биотинилированного моноклонального антитела можно осуществлять при использовании покрытых САИМ1 планшетов ЕЫБА, как описано выше. Связывание биотинилированного моноклонального антитела может определяться с помощью зонда на основе стрептомицина-авидина-щелочной фосфатазы.

- 27 028336

Для определения изотипа очищенного антитела может осуществляться изотипический ΕΜδΛ при использовании реагентов, специфических для антитела определенного изотипа. Например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела микротитровальные планшеты покрывали 1 мкг/мл анти-человеческого иммуноглобулина на протяжении ночи при 4°С. После блокирования с помощью 1% ΒδΑ планшеты подвергали реакции с 1 мкг/мл или менее исследуемого моноклонального антитела или очищенных контролей изотипа при комнатной температуре на протяжении от одного до двух часов. Потом ячейки подвергали реакции либо с человеческим 1дС1, либо со специфическими для человеческого 1дМ зондами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Реакцию в планшетах осуществляли и анализировали так, как описано выше.

Анти-САОМ1 человеческие 1дС могут подвергаться дополнительному анализу на реактивность с САЭМ1 антигеном при использовании Вестерн-блоттинга. САЭМ1 может быть получена путем обработки при использовании электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза выделенные антигены переносятся на нитроцеллюлозные фильтры, блокируются при использовании 10% фетальной сыворотки теленка и подвергаются зондированию при использовании исследуемого моноклонального антитела. Связывание человеческого 1дС может определяться при использовании анти-человеческого 1дС щелочной фосфатазы и выявляться при использовании ВСГР/ХВТ субстратных таблеток (δί§ιη;·ι СЬет. Со., δΐ. Ьошз, Мо.).

Связывающую специфичность антитела в соответствии с изобретением можно также определять с помощью мониторинга связывания антитела с клетками, которые экспрессируют САЭМ1, например, путем проточной цитометрии. Типично, клеточная линия, такая как линия клеток СНО, может быть трансфицирована экспрессионным вектором, который кодирует трансмембранную форму САЭМ1. В некоторых воплощениях молекула САЭМ1 полной длины с аминотерминальной НА меткой (δΕΟ ΙΌ N0: 43) экспрессируется на клеточной поверхности линии СНО. Трансфицированный белок может включать метку, такую, как тус-метка, преимущественно на ^терминальном конце, при этом для определения используют антитело, связанное с меткой. Связывание антитела в соответствии с изобретением с САЭМ1 может быть определено путем инкубации трансфицированной клетки с антителом и выявления связанного антитела. Связывание антитела с меткой на трансфицированном белке может использоваться как положительный контроль. Специфичность антитела в соответствии с изобретением для САЭМ1 может дополнительно анализироваться путем определения, будет ли антитело связываться с другими белками, такими, как Тδ^^2/СΑ^Μ1С или другими членами суперсемейства иммуноглобулинов при использовании тех же методов, с помощью которых определяют связывание с САОМ1.

Конъюгаты антитело-молекула-партнер

Предпочтительный вариант осуществления относится к конъюгату, который включает антиСАОМ1 антитело в соответствии с данным изобретением и молекулу-партнер, при этом конъюгат имеет формулу (а) /|(.\Ί_:(·(.\ ) (а), где Ζ представляет собой антитело в соответствии с данным изобретением; Ό представляет собой молекулу партнера; а (Х%С(Х^с)Ь вместе называются линкерным остатком или линкером, поскольку они связывают первые два элемента. В линкере С представляет собой способную к отщеплению группу, предназначенную для отщепления в сайте биологического действия молекулы-партнера Ό; ΧΖ и ΧΌ называют спейсерными остатками (или спейсерами), поскольку они размещены на расстоянии от Ζ и С, С и Ό соответственно; нижние индексы а и Ь независимо равен 0 или 1 (то есть присутствие ΧΖ и/или ΧΌ является необязательным); а нижний индекс т равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (преимущественно 1, 2, 3 или 4). Каждый из приведенных выше терминов более полно определен в данной заявке ниже. Антитело Ζ представляет собой нацеливающую функцию: путем связывания с целевой тканью или клеткой, где находится его антиген, оно направляет туда конъюгат. Преимущественно целевая ткань или клетка представляет собой опухолевую или раковую клетку, а антиген является ассоциированным с опухолью или специфическим для опухоли антигеном. Отщепление группы С в целевой ткани или клетке высвобождает молекулу партнера Ό для осуществления ее биологической функции. В некоторых случаях конъюгат является интернализированным в целевой клетке путем эндоцитоза, и отщепление происходит внутри целевой клетки. Таким образом, достигают точной доставки молекулы-партнера Ό в сайт действия, снижая, таким образом, необходимую дозу. Кроме того, молекула-партнер Ό в норме является биологически неактивной (или значительно менее активной) в своем конъюгированном состоянии, снижая, таким образом, нежелательную токсичность для нецелевой ткани или клетки. Противораковые лечебные средства часто представляют собой высокотоксичные соединения с низким терапевтическим индексом, что является важным фактором.

Как следует из нижнего индекса т, каждая молекула антитела Ζ может конъюгировать больше чем с одной молекулой-партнером Ό, в зависимости от количества сайтов первой, которые являются доступными для конъюгации, и используемых условий эксперимента. Специалист в данной области техники сможет оценить, что если каждая молекула антитела Ζ конъюгирована с целым числом молекулпартнеров Ό, полученный конъюгат может анализироваться на соотношение, отличное от целого числа молекулы-партнера Ό с антителом Ζ, отображая статистические среднее значение.

- 28 028336

Антитело Ζ

Любая одна из нескольких различных реактивных групп на антителе Ζ может использоваться как сайт конъюгации, включая ε-аминогруппы в остатках лизина, выступающие углеводные остатки, группы карбоновых кислот, дисульфидные группы и группы тиола. Каждый тип реактивных групп приводит к изменению одного показателя за счет другого, что имеет некоторые преимущества, но и приводит к ограничениям, которые уравновешиваются. Для обзора реактивных групп антитела, приемлемых для конъюгации, см., например, СатеИ, Λάν. Эгид ОеПуегу Реу. 53 (2001), 171-216 и ОиЪо\ус1йк и Аа1кег, Ркагтасо1оду & Ткегареийск 83 (1999), 67-123, раскрытие которых введено в данную заявку в качестве ссылки. В одном воплощении антитело Ζ конъюгировано с помощью ε-аминогруппы лизина. Большинство антител содержат многочисленные, расположенные на поверхности ε-аминогруппы лизина, которые могут быть конъюгированы через амидные, мочевинные, тиомочевинные или карбаматные связи при использовании методик, которые известны в данной области техники, включая модификацию с помощью гетеробифункционального агента (как дополнительно описано в данной заявке ниже). Однако сложно контролировать, какие и сколько ε-аминогрупп подвергаются реакции, которая приводит к потенциальной вариабельности в зависимости от партии при получении препарата. Кроме того, конъюгация может послужить причиной нейтрализации протежированных ε-аминогрупп, что важно для поддержания нативной конформации антитела, или же она может происходить при остатке лизина вблизи или в сайте связывания антигена, ни один из этих случаев не является желательным событием.

В другом воплощении антитело Ζ может быть конъюгированным с помощью углеводной боковой цепи, поскольку многие антитела являются гликозилированными. Углеводная боковая цепь может быть окислена с помощью перйодата с получением альдегидных групп, которые, в свою очередь, могут реагировать с аминами с образованием группы имина, такой как в семикарбазоне, оксиме или же если это желательно, то группа имина может быть восстановлена при использовании цианоборогидрида натрия с получением более стабильной связи. Для дополнительного раскрытия конъюгации при использовании углеводных боковых цепей, см., например, Рой\уе11 и др., Ргос. N£1 Асаб. ЗсЕ ИЗА 83, 2632-2636 (1986); раскрытие которого введено в данную заявку в качестве ссылки. Как и в случае ε-аминогрупп лизина, существуют проблемы в связи с размещением сайта конъюгации и стехиометрией. Еще в одном варианте антитело Ζ может конъюгировано через группу карбоновой кислоты. В одном воплощении терминальная группа карбоновой кислоты функционализирована с получением карбогидразида, который потом подвергают реакции с остатком конъюгации, который несет альдегид. Див. Ейск и др., Вюсои)ида1е Скетййу 1992, 3, 147-153.

Еще в одном воплощении антитело Ζ может быть конъюгировано путем образования мостиков дисульфидных групп серы в остатке цистеина на антителе Ζ и серы на другой части конъюгата. Некоторые антитела (такие как изотипа 1дС) не содержат свободных групп тиола, однако содержат дисульфидные группы, например, в шарнирном участке. В таком случае свободные группы тиола могут быть получены путем восстановления нативных дисульфидных групп. Группы тиола, полученные таким образом, могут потом использоваться для конъюгации. См., например, Раскагй и др., Вюскетййу 1986, 25, 3548-3552; Ктд и др., Сапсег Рек. 54, 6176-6185 (1994); и Поготпа и др., №Циге Вю!ескпо1. 21(7), 778-784 (2003); раскрытие которых введено в данную заявку в качестве ссылки. В этом случае также существуют проблемы, связанные с размещением сайта конъюгации и стехиометрией, а также возможным разрушением нативной конформации антитела.

Еще в одном предпочтительном варианте воплощения антитело Ζ конъюгировано с помощью нуклеофильного продукта присоединения группы тиола к акцепторному остатку Желательный акцепторный остаток представляет собой малеимидную группу, реакция которой с группой тиола антитела иллюстрируется ниже о о

Ζ-8Η ' А Λ 2-5

Н-(Х²)_аС(Х%0 -►

Был разработан ряд способов введения свободных групп тиола в антитела без нарушения нативных дисульфидных связей, эти способы используются в случае антитела Ζ в соответствии с данным изобретением. В зависимости от используемого способа возможно вводить предусмотренное количество свободных сульфгидрильных групп в специфическом расположении. В одном из случаев получают мутированные антитела, в которых цистеин заменен на другую аминокислоту. См., например, Е1депЪго! и др., ИЗ 2007/0092940 А1; Скйкой и др., ВюсопщдаЮ Скет. 1994, 5, 504-507; итоук/ и др., ИЗ 4698420 (1987); Зйтте1 и др., I. Вю1. Скет., 275 (39), 30445-30450 (2000); Ват и др., ИЗ 7311902 В2 (2007); Киап и др., I. Вю1. Скет., 269 (10), 7610-7618 (1994); Рооп и др., I. Вю1. Скет., 270 (15), 8571-8577 (1995). При другом подходе дополнительный цистеин прибавляют к С-терминальному концу. См., например, СитЪег и др., I. 1ттипо1, 149, 120-126 (1992); Ктд и др., Сапсег Рек., 54, 6176-6185 (1994); Ы и др., ВюсопщдаЮ Скет., 13, 985-995 (2002); Уапд и др., Рго!ет Епдтееппд, 16, 761-770 (2003); и 01а£коп и др., Рго!еш Епдшеегшд Эек1дп & Зе1есйоп, 17, 21-27 (2004). Предпочтительный способ введения свободных остатков '^м-(х^г)_ас(х%о

- 29 028336 цистеинов описывается Κίη§ во временной патентной заявке США № 60/957271, поданной 22 августа 2007, где аминокислотную последовательность, которая несет цистеин, присоединяют к Стерминальному концу тяжелой цепи антитела. Этот способ вводит известное количество остатков цистеина (один на тяжелую цепь) в известном расположении, отдаленном от сайта связывания антигена. Раскрытие этих документов, цитированных в данном абзаце, введено в данную заявку в качестве ссылки. Еще в одном воплощении ε-аминогруппы лизина могут быть модифицированы с помощью гетеробифункциональных реагентов, таких как 2-иминотиолан или Шсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ), превращая таким образом ε-аминогруппу в группу тиола или дисульфида - как будто создавая суррогатную группу цистеина. Однако этот способ обладает ограничениями, связанными с размещением сайтов конъюгации и стехиометрией, ассоциированных с собственно ε-аминогруппами.

Молекула-партнер Ό

Молекула-партнер Ό может представлять собой терапевтический агент или маркер. В случае первого это может быть, например, цитотоксин или нецитотоксичное лекарственное средство (например, иммуносупрессант), радиоактивный агент, другое антитело, фермент или его активный фрагмент, такой как абрицин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин, белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон-γ; или модификатор биологического ответа, такой как например лимфокины, интерлейкин-1 (1Ь-1), интерлейкин-2 (1Ь-2), интерлейкин-6 (1Ь-6), фактор стимуляции колоний гранулоцитов и макрофагов (ОМ-С8Р), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (О-С8Р), или другие ростовые факторы. В последнем случае он может представлять собой любой остаток, который генерирует способный к определению сигнал, такой как радиоактивная метка, флуоресцентная метка или фермент, который катализирует способную к определению модификацию субстрата. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированными с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, но без ограничения иод¹³¹, индий¹¹¹, иттрий и лютеций. Способы получения радиоиммуноконъюгатов хорошо известны в данной области техники. Примеры радиоиммуноконъюгатов коммерчески доступны, включая Зевалин® (ГОЕС РЬагтасеийса1в) и Веххаг® (Сопха РЬагтасеийсак), подобные способы могут использоваться для получения радиоиммуноконъюгатов при использовании антител в соответствии с изобретением.

Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который разрушителен для клеток, например, уничтожает клетки. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, митрамицин, 1-дегидротестостерон, глюкортикоиды, прокаин, тетракаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Когда молекулапартнер Ό представляет собой терапевтический агент, приемлемые классы терапевтических агентов включают антиметаболиты, алкилирующие агенты, связывающие агенты для малой бороздки ДНК, ДНК интеркаляторы, агенты, которые способны к поперечному связыванию ДНК, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы ядерного импорта, протеосомальные ингибиторы, ингибиторы топоизомеразы I или II, ингибиторы белков теплового шока, ингибиторы тирозинкиназы, антибиотики и антимитотические агенты. Примеры приемлемых терапевтических агентов включают актиномицин Ό, антрациклин, антрамицин (АМС), ауристатин, блеомицин, бусульфан, калихимицин, камптотецин, кармустин, хлорамбуцил, цисдихлордиамин платины (II) (ΌΌΡ), цисплатин, колхицин, циклофосфамид, цитарабин, цитохалазин В, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, 1-дегидротестостерон, диброманитол, дигидрокси антрациндион, доксорубицин, эметин, эпотилон, бромид этидия, этопозид, 5-фторурацил, гемцитабин, глюкортикоиды, грамицидин Ό, иматиниб, иринотекан, β-лапакон, лидокаин, ломустин, майтасин, мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митрамицин, митомицин С, митоксантрон, паклитаксел, прокаин, пропранолол, пуромицин, рицин, стрептозотоцин, субероиланилид гидроксамовую кислоту (8ΑΗΑ), таллисомицин, тенопозид, тетракаин, тиотепа, 6-тиогуанин, тубулизин, винкристин, винбластин, а также их аналоги или гомологи.

Предпочтительно, чтобы молекула-партнер Ό представляла собой цитотоксин, выбранный с группы, которая состоит из ауристатинов (в частности, ММАЕ и ММАР), энедеиновых антибиотиков (в частности, калихимицина и СаПсЮМИ), доксорубицина, майтансиноидов (в частности, ЭМ1 и ЭМ4), экзотоксина А Рвеийотопав (в частности, его укороченной формы), алкилирующих агентов для малой бороздки ДНК (в частности, СС-1065 и аналоги даукармицина) их аналогов или производных. Пример конъюгата калихимицина и антитела коммерчески доступен (Му1о!а㧮; Атепсап Чоте Ргойис!в). Специалисты в данной области техники понимают, что приведенные выше цитотоксины являются преимущественно естественными продуктами и что некоторые их модификации (дериватизация) могут быть предпочтительными или необходимыми для конъюгации.

Предпочтительный алкилирующий агент для малой бороздки ДНК представляет собой аналог или производную СС-1065 и структурно связанные с ними дуокармицины, приемлемые примеры которых раскрыты у N5 и др., патент США № 7087600 В2 (2006); N5 и др., патент США № 6989452 В2 (2006); N5 и др., патент США № 7129261 В2 (2006); Ыд и др., А0 02/096910 А1 (2002); Воуй и др., заявка США № 2006/0024317 А1 (2006); Сйеп и др., заявка США № 2006/0004081 А1 (2006); Оапд^аг и др., заявка США

- 30 028336 № 2006/0247295 А1 (2006); Воуй и др., А0 2007/038658 А2 (2007); Сапдгат и др., А0 2007/051081 А1 (2007); Сапдгат и др., А0 2007/059404 А2 (2007); 8ий и др., А0 2008/083312 А2 (2008); и СБеп и др., заявка РСТ/υδ 2008/054362, поданная 20 февраля 2008 года; раскрытие которых введено в данную заявку в качестве ссылки. Такие предпочтительные молекулы-партнеры Ό имеют формулу (Ь)

где кольцевая система А представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную группу, такую, как фенил или пиррол; Е и С независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, гетероатом или одинарную связь, или Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;

X представляет собой О, δ или ПК²³, где К²³ представляет собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил или ацил; К³ представляет собой (=0) или ОН;

К⁴, К⁴, К⁵ и К⁵ независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, галоген, N0^ NК¹⁵К¹⁶, NС(0)К¹⁵, 0С(=0)NК¹⁵К¹⁶, 0С(=0)0К¹⁵, С(=0)К¹⁵, δΡ¹⁵, 0К¹⁵, СК¹⁵=NК¹⁶ или О(СН₂)_пп(СН₃)₂, где п представляет собой целое число от 1 до 20, или любая соседняя пара с К⁴, К⁴, К⁵ и К⁵, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединяются с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, которая содержит от 4 до 6 членов; К¹⁵ и К¹⁶ независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил или замещенный, или незамещенный пептидил, где К¹⁵ и К¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединяются с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, которая содержит от 4 до 6 членов, необязательно, такой, которая содержит два или более гетероатома;

К⁶ представляет собой одинарную связь, которая является либо присутствующей, либо отсутствующей;

К⁷ представляет собой СН2- X¹ или -СН2-, при условии, что когда К⁶ присутствует, К⁶ и К⁷ соединены с образованием циклопропильного кольца; и

X^I представляет собой группу, такую как С1, Вг, Р, мезилат или тозилат.

Молекула-партнер формулы (Ь) может быть конъюгирована с помощью одного из К³, К⁴, К⁴, К⁵ и К⁵, предпочтительно с помощью К³ (когда К³ представляет собой ОН) или К⁴, более предпочтительно с помощью К⁴. Кроме того, К³ может нести пролекарственный остаток, как обсуждается в данной заявке ниже.

Предпочтительная молекула-партнер формулы (Ь) имеет формулу (с)

К⁵ где

К³, К⁴, К⁴, К⁵, К⁵, К⁶ и К⁷ являются такими, как определено в данной заявке выше;

Ζ представляет собой О, НН или N (низший алкил); и

К¹, К¹, К² и К² независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил, циано, алкокси, галоген, С(=0)К⁸ или С0₂К⁸, где К⁸ представляет собой NК⁹К¹⁰ или 0К⁹, где К⁹ и К¹⁰ независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, или замещенный или незамещенный гетероалкил.

Более предпочтительным вариантом представлен в формуле (й)

- 31 028336 где X является таким, как определено ранее, а X² представляет собой

Когда молекула-партнер Ό представляет собой цитотоксин, она может быть переведена в неактивную форму, то есть имеет присоединенный к ней пролекарственный остаток, удаление которого является необходимым для ее активации. Предпочтительно пролекарственная группа (1) удаляется с помощью реакции, отличной от отщепления цитотоксина от конъюгата, (2) не удаляется или удаляется только очень медленно, в то время когда конъюгат находится в системе кровообращения, но (3) эффективно удаляется в целевой ткани или клетке. В соответствии с этим, если конъюгат случайным образом расщепляется перед достижением целевой ткани или клетки, то цитотоксин высвобождается в своей все еще неактивной форме, устраняя или снижая цитотоксичность по отношению к нецелевым тканям или клеткам. Таким образом, требование наличия второго отщепления для активации цитотоксина обеспечивает фактор безопасности. В случае цитотоксина в соответствии с формулами (Ь), (с), (ά) или (е) предпочтительный сайт присоединения пролекарственной группы находится в положении, которое обозначено как 4. Для повышения фактора безопасности, в случае когда как отщепление группы С, так и удаление пролекарственного остатка опосредствуются ферментами, желательно использовать разные ферменты. Неограничивающие примеры пролекарственных групп включают эфиры, карбаматы, фосфаты и гликозиды. Для иллюстрации, 4-положение гидроксила в цитотоксинах формул ((Ь)-(е) может обеспечивать получение пролекарственной формы при использовании следующих остатков:

Молекул-партнер Ό может также представлять собой маркер. Маркер может быть любой меткой, которая генерирует способный к определению сигнал, такой как радиометка, флуоресцентная метка, или фермент, который катализирует способную к определению модификацию субстрата. Маркеры (которые также называются репортерными группами или способными к определению метками) хорошо известны в области иммуноанализов, биомедицинских исследований и медицинской диагностики и могут определяться с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунологических, электрических, оптических или химических средств. Маркер предпочтительно представляет собой радиоактивный изотоп, флуоресцентный или хемилюминесцентный агент или их предшественник, хромофор, фермент или их комбинацию. Примеры приемлемых ферментов представляют собой пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу и глюкозаоксидазу. Флуоресцентные агенты включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбелиферон и т.п. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, такие как люминол.

Линкер -(Х²)_ас(Х^с)ьКак указано выше, линкерная часть конъюгата в соответствии с изобретением включает вплоть до трех элементов: способную к отщеплению группу С и необязательные спейсеры Χ^ζ и X^е.

Способную к отщеплению группу С выбирают так, чтобы она была относительно стабильной, в то время как конъюгат находится в общей системе циркуляции плазмы крови, но легко отщеплялась как только конъюгат достигает сайта, предназначенного для действия. Предпочтительно конъюгат является интернализированным с помощью эндоцитоза целевыми клетками при связывании антитела ζ с антиге- 32 028336 ном, который находится на поверхности целевой клетки. В соответствии с этим отщепление группы С происходит в везикулярной структуре целевой клетки (ранняя эндосома, поздняя эндосома или, в частности, лизосома).

В одном из воплощений группа С представляет собой чувствительную к рН группу. рН в плазме крови является немного более высоким, чем нейтральное, в то время как рН в лизосоме является кислым и составляет приблизительно 5. Таким образом, группа С, отщепление которой катализируется кислотой, будет отщепляться в лизосоме при скорости на несколько порядков более высокой, чем скорость расщепления в плазме крови. Примеры приемлемых, чувствительных к действию кислоты групп, включают цис-аконитил амиды и гидразоны, как описывается у δ^η и др., патент США № 4631190 (1986); δίκη и др., патент США № 5144011 (1992); δ^η и др., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Сοттиη. 102, 1048-1054 (1981) и Υ3η§ и др., Ргос. №ί1 Αсаά. δα (υδΑ), 85, 1189-1193 (1988); раскрытие которых введено в данную заявку в качестве ссылки. В другом воплощении группа С представляет собой дисульфид. Дисульфиды могут отщепляться с помощью обменного механизма тиол-дисульфид, при скорости, которая зависит от концентрации тиола в окружающей среде. Поскольку внутриклеточная концентрация глутатиона и других тионов является более высокой, чем их концентрация в крови, скорость отщепления дисульфида будет более высокой внутри клетки. Кроме того, скорость обмена тиол-дисульфид может модулироваться путем доведения стерических и электронных характеристик дисульфида (например, алкил-арил-дисульфид против алкил-алкил-дисульфида; замен на кольце арила и т.п.), что позволяет конструировать дисульфидные связи, которые имеют улучшенную стабильность в сыворотке крови или определенную скорость отщепления. Для дополнительного раскрытия, которое относится к способным к отщеплению дисульфидным группам в конъюгатах, см., например, Пюгре и др., Сапсег Кек. 48, 6396-6403 (1988); δηηΐί и др., υδ 2005/0287155 Α1 (2005); Ν§ и др., патент США № 6989452 В2 (2006); Ν§ и др., νΟ 2002/096910 А1 (2002); Βοуά и др., заявка США 2006/0024317 А1 (2006); и διιΐί и др., νΟ 2008/083312 А2 (2008); раскрытие которых введено в данную заявку в качестве ссылки.

Предпочтительная группа С включает пептидную связь, которая преимущественно расщепляется протеазой в предназначенном сайте действия, в отличие от протеазы, которая содержится в сыворотке. Типично, группа С включает от 1 до 20 аминокислот, преимущественно от 1 до 6 аминокислот, более преимущественно от 1 до 3 аминокислот. Аминокислота(ы) может(ут) быть природной(ыми) и/или неприродной(ыми) а-аминокислотой(ами). Природные аминокислоты являются теми, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислотами, которые происходят от них, например, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат, цитрулин и О-фосфосерин. Термин аминокислота также включает аналоги аминокислот и миметики. Аналоги представляют собой соединения, которые имеют общую структуру Η₂N(К)СΗСΟ₂Η природной аминокислоты, за исключением того, что К группа не обнаруживается среди природных аминокислот. Примеры аналогов включают гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид и метионин метилсульфоний. Аминокислотный миметик представляет собой соединение, которое имеет структуру, отличную от общей химической структуры α-аминокислоты, однако функционирует подобным образом. Термин неприродная аминокислота предназначен для Ό стереохимической формы, при этом естественные аминокислоты находятся в Ь. Предпочтительно, чтобы группа С содержала аминокислотную последовательность, которая представляет собой последовательность для расщепления протеазою. В области техники известно много последовательностей для расщепления. См., например, Μаίауοкй^ и др. δ^ι^ 247: 954 (1990); Όυηη и др. Μеίй. Εηζутο1. 241: 254 (1994); δе^άай и др. Μеίй. Εηζутο1. 244: 175 (1994); ЛютЬеггу, Μеίй. Εηζутο1. 244: 615 (1994); VеЬе^ и др. Μеίй. Εηζутο1. 244: 595 (1994); διηΠΗ и др. Μеίй. Εηζутο1. 244: 412 (1994); и Βοиν^е^ и др. Μеίй. Εηζутο1. 248: 614 (1995); раскрытие которых приведено в данной заявке в качестве ссылки.

Для конъюгатов, которые не предназначены для интерализации в клетке, группа С может быть выбрана таким образом, что она расщепляется протеазами, присутствующими в экстрацеллюлярном матриксе вблизи целевой ткани, например, протеазой, которая высвобождается вблизи умирающих клеток, или ассоциированной с опухолью протеазой. Примеры внеклеточных ассоциированных с опухолью протеаз представляют собой олигопептидазу (ТОР) и СЭ10.

Для конъюгатов, которые предназначены для интернализации в клетке, группа С преимущественно включает аминокислотную последовательность, выбранную для расщепления эндосомальными или лизосомальными протеазами, особенно последней. Примеры таких протеаз включают катепсины В, С, Ό, Η, Ь и δ, в частности катепсин В. Катепсин В преимущественно расщепляет пептиды в сайте последовательности -АА²-АА^!-, где АА¹ представляет собой основную аминокислоту или аминокислоту с большим количеством водородных связей (такую как лизин, аргинин или цитрулин), а АА представляет собой гидрофобную аминокислоту (такую как фенилаланин, валин, аланин, лейцин или изолейцин), например, Vа1-С^ί (где С11 обозначает цитрулин) или ν3ΐ-Ρ\·κ (в данной заявке аминокислотная последовательность записывается в направлении от Ν- до -С, как, например, Η2N-ЛЛ²-ЛЛ¹-СΟ2Η, если в контексте не указано иное.). Для дополнительной информации относительно групп, которые расщепляются катепсином, см. Οιιόο\\Όΐιί1< и др., Βίοτ§. Μеά. Сйет. Ьей. 8, 3341-3346 (1998); Οιιόο\\Όΐιί1< и др., Βίοοτ§. Μеά. Сйет. Ьей., 8 3347-3352 (1998); и ΟιΛολνΟιίΚ и др., Β^οсοη^идаίе Сйет. 13, 855-869 (2002); раскрытие которых приведе- 33 028336 но в данной заявке в качестве ссылки.

В одном из воплощении группа С представляет собой пептид, который включает последовательность, которая состоит из двух аминокислот -АА²-АА¹ -, где АА¹ представляет собой лизин, аргинин или цитрулин, а АА² представляет собой фенилаланин, валин, аланин, лейцин, изолейцин. В другом воплощении С состоит из последовательности, которая содержит от одной до пяти аминокислот, выбранных из группы, которая состоит из νη1-ΟίΙ, А1аАа1, Vа1-Л1а-Vа1, Ьук-Ьук, РгоАа1-С1уАа1Аа1 (8ЕЦ ГО N0: 45), А1а-АкпАа1, νηΝΕ^ιι- Ьук, СЬ-СЬ, Vа1-^ук, Ьук, СЬ, 8ег и С1и. Получение и конструирование способных к расщеплению групп С, которые включают одну аминокислоту, дополнительно обсуждается у СЬеп и др., заявка РСТ/И8 2008/054362, поданная 20 февраля 2008 г., раскрытие которой приведено в данной заявке в качестве ссылки.

Группа С также может быть фотоотщепляемой, например, может представлять собой нитробензиловый эфир, который отщепляется при действия света. Группа С может быть непосредственно связана с антителом Ζ или молекулой-партнером Ό; то есть тогда спейсеры Χ^Ζ и X^е могут отсутствовать. Например, если группа С представляет собой дисульфид, то один или два атома серы могут быть остатком цистеина или его суррогатом на антителе Ζ. Или группа С может представлять собой гидразон, связанный с альдегидом на углеводной боковой цепи. Или группа С может представлять собой пептидную связь, образованную ε-аминогруппой лизина антитела Ζ.

В случае присутствия, спейсер X обеспечивает пространственное разделение между группой С и антителом Ζ, для того, чтобы предотвратить стерические взаимодействия первого со связыванием антигена последним, или стерические взаимодействия последнего с отщеплением первого. Кроме того, спейсер Χ^Ζ может использоваться для придания свойств повышенной растворимости или сниженной способности к агрегации конъюгатам. Спейсер Χ^Ζ может включать один или более модулярных сегментов, которые могут объединяться в любом количестве комбинаций. Примеры приемлемых сегментов для спейсера Χ^Ζ представляют собой г Η Н _{г г} θ г _г Н г

- Ν—(СН₂)₂₄₅-Ν— {СН₂)_М-С—| (СН₂)_м-М-1 » ί » и

где нижний индекс г равен от 1 до 24, преимущественно составляет 2-4. Эти сегменты могут объединяться с образованием спейсеров Χ^Ζ, таких как , °н °н н , _а °н н , (СН₂)з—С-Ν—(СН₂СН₂О)4—СН₂СН₂—С-Ν—(ΟΗ₂)₂-Ν—1 §—(ΟΗ₂)3-Ο-Ν-(ΟΗ₂)₂-Ν-1

Спейсер Χ^ϋ, в случае присутствия, обеспечивает пространственное разделение между группой С и молекулой-партнером Ό, чтобы предотвратить стерическое или электронное взаимодействие последнего с отщеплением первого. Спейсер Χ^ϋ также служит для введения дополнительной молекулярной массы и химической функциональности в конъюгат. В общем случае дополнительная масса и функциональность будут влиять на период полувыведения из сыворотки и другие свойства конъюгата. Таким образом, с помощью правильного подбора спейсерных групп можно модулировать период полувыведения конъюгата из сыворотки. Спейсер Χ^ϋ также может быть объединен с модулярными сегментами, как описано выше в контексте спейсера Χ^Ζ.

Или спейсер Χ^Ζ, или Χ^ϋ, или оба могут включать остаток, который самоуничтожается. Кратко, остаток, который самоуничтожается, представляет собой остаток, который (1) связан с группой С и/или антителом Ζ, или молекулой-партнером Ό, и (2) имеет структуру, такую, что отщепление группы С инициирует последовательность реакций, которые приводят в случае самоуничтожения к самостоятельному разрыву связи с антителом Ζ или молекулой-партнером Ό, исходя из конкретной ситуации. Другими словами реакция в сайте, отдаленном от антитела Ζ или молекулы партнера Ό (отщепление группы С), вызывает также разрушение связи Χ^Ζ-Ζ или связи Χ^ϋ-Ό. Присутствие остатка, который самоуничтожается, предпочтительно в случае спейсера Χ^ϋ, поскольку, если после расщепления конъюгата спейсер Χ^ϋ или его часть присоединены к молекуле-партнеру Ό, биологическая активность последнего может активироваться. Применение остатка, который самоуничтожается, особенно предпочтительно тогда, когда способная к отщеплению группа С представляет собой полипептид.

Примеры остатков, которые самоуничтожаются (ί)-(ν) и связаны с группой гидроксила или аминогруппой на молекуле партнера Ό, представлены ниже

- 34 028336

В каждом случае остаток, который самоуничтожается, представляет собой структуру между пунктирными линиями а и Ь, с соседними структурными характеристиками. Остатки, которые самоуничтожаются (ί) и (ν), связаны с молекулой-партнером О-НН₂ (то есть молекула партнера Ό конъюгирована с помощью аминогруппы), в то время как остатки, которые самоуничтожаются (ίί), (ίίί) и (ίν), связаны с молекулой партнера Э-0Н (то есть молекула партнера конъюгирована через группу гидроксила) Отщепление амидной связи по пунктирной линии Ь (то есть группа С представляет собой пептид) высвобождает амидный азот как аминный азот, инициируя последовательность реакций, которая приводит к расщеплению связи по пунктирной линии и последовательному высвобождению молекулы партнера Э-0Н или О-№Н₂ соответственно Для дополнительного раскрытия информации относительно остатков, которые самоуничтожаются, см., Саг1 и др., 1. Μеά. СЬет., 24 (3), 479-480 (1981); Саг1 и др., А0 81/01145 (1981); ЭиЬо^сЫк и др., РЬагтасо1оду & ТЬегареиЬск, 83, 67-123 (1999); РпекЮпе и др., патент США № 6,214,345 В1 (2001), Ток! и др., 1. 0г§. СЬет. 67, 1866-1872 (2002); Поготпа и др., №Чиге Вю1есЬпо1оду 21 (7), 778-784 (2003) (стр. 941), ВоуЬ и др., А0 2005/112919 (2005); ВоуЬ и др., А0 2007/038658 (2007); §ий и др., А0 2008/083312 А2 (2008), Бену. патент США № 7375078 В2 (2008), и 8еШег и др., И8 2003/0096743 А1 (2003); раскрытие которых приведено в данной заявке в качестве ссылки.

Примеры конъюгатов

Примеры конъюгатов, полученных при использовании антитела Ζ^Πγ в соответствии с данным изобретением (где т равняется 1, 2, 3, 4 или 5), представлены ниже. Конъюгаты от А-1 до А-6 и от А-8 до А-15 представляют собой конъюгаты, в которых группа С, которая отщепляется, включает пептидную связь. Конъюгаты А-7 и А-16 являются конъюгатами, в которых группа С, которая отщепляется, представляет собой гидразон. Конъюгаты А-17 и А-18 представляют собой конъюгаты, в которых группа С, которая отщепляется, представляет собой дисульфид. В конъюгатах от А-1 до А-2, от А-5 до А-9, от А-11 до А-14 и А-16 молекула-партнер Ό представляет собой цитотоксин, который имеет присоединенный пролекарственный остаток. Конъюгаты А-10, А-11, А 14 и А-15 являются конъюгатами, которые имеют остаток, который самоуничтожается (два в случае конъюгата А-10). Конъюгаты от А-1 к А-8 и от А-10 к А-18 иллюстрируют применение спейсеров, которые содержат модулярные сегменты.

- 35 028336

- 36 028336

- 37 028336

В случае наличия в этих формулах, На1 представляет собой С1 или Вг, а К³⁰ представляет собой расщепляемую с помощью карбоксиэстеразы карбаматную пролекарственную группу, которая представлена ниже

Получение конъюгатов

Конъюгаты в соответствии с данным изобретением преимущественно получают путем первого соу Т~\ у Т~\ единения молекулы партнера Ό и линкера (X )_ас(Х )Ь с образованием остатка Ό-(Χ )_ас(Х )_Ь-К , где К представляет собой функциональную группу, приемлемую для взаимодействия с функциональной группой на антителе Ζ, с образованием конъюгата. Примеры приемлемых групп К²¹ включают о

А⁸³ о , где К³² представляет собой С1, Вг, Р, мезилат или тозилат, а К³³ представляет собой С1, Вг, I, Р, ОН, -0->сукцинимидил, -О-(4-нитрофенил), -О-пентафторфенил или -О-тетрафторфенил. Получение приемлемых остатков П-(ХЭаС(Х^с)Ь,-К³¹ раскрыто у N3 и др., патент США № 7087600 В2 (2006); N3 и др., патент США № 6989452 В2 (2006); N3 и др., патент США № 7129261 В2 (2006); N3 и др., А0 02/096910 А1 (2002); Воуб и др., заявка США 2006/0024317 А1 (2006); С1еп и др., заявка США 2006/0004081 А1 (2006); Оапдгат и др., заявка США 2006/0247295 А1 (2006); Воуб и др., А0 2007/038658 А2 (2007); Оапдгат и др., А0 2007/051081 А1 (2007); Оапд^ат и др., А0 2007/059404 А2 (2007); 8ий и др., А0 2008/083312 А2 (2008); и С1еп и др., заявка РСТ/ϋδ 2008/054362, поданная 20 февраля 2008 г.; раскрытие которых приведено в данной заявке в качестве ссылки.

В случае предпочтительного воплощения (формула М) К³¹ представляет собой группу малеимида, а функциональная группа на антителе Ζ является группой тиола, как иллюстрируется ниже, при использовании конъюгата А-2, в котором На1 представляет собой С1, а антитело представляет собой Ζ(δΗ)_ΗΙ

- 38 028336

Приведенное ниже относится к процедуре, которая базируется на введении свободных групп тиола в антитело путем взаимодействия его ε-аминогруппы лизина с 2-иминотооланом, после чего осуществляют взаимодействие с остатком лекарственное средство-линкер О-(Х2)ас(ХО)ь,-К³¹, где К³¹ представляет собой малеимид. Сначала антитело путем замены буфера переносят в 0,1 М фосфатный буфер (рН 8,0), который содержит 50 мМ №С1 и 2 мМ ΏΤΡΆ и концентрируют до получения концентрации 5-10 мг/мл. Тиолирования достигают путем присоединения 2-иминотиолана к антителу. Количество прибавляемого 2-иминотиолана может определяться при помощи предыдущего эксперимента и варьирует в зависимости от антитела. В предыдущем эксперименте по титрованию количества 2-иминотиолана, которое увеличивается, к антителу прибавляли 2-иминотиолана и после этого антитела инкубировали на протяжении 1 ч при комнатной температуре, антитело обессоливали в 50 мМ рН 6,0 ΗΕΡΕ8 буфере при использовании Сефадекс 0-25 колонки и быстро определяли количество групп тиола, которые вводятся, с помощью взаимодействия с дитиопиридином (ΏΤΏΡ). Взаимодействие тиоловых групп из ΏΤΏΡ приводит к высвобождению тиопиридина, количество которого подвергали мониторингу при использовании спектроскопии при 324 нм. Типично использовали способы при концентрации белка 0,5-1,0 мг/мл. Оптическое поглощение при длине волны 280 нм может использоваться для точного определения концентрации белка в способах, а потом аликвоту каждого образца (0,9 мл) инкубировали с 0,1 мл ΏΤΏΡ (5 мМ маточный раствор в этаноле) на протяжении 10 мин при комнатной температуре. Чистые образцы, которые содержат только буфер плюс ΏΤΏΡ, также инкубировали параллельно. Через 10 мин измеряли поглощение при длине волны 324 нм и определяли количество групп тиола при использовании коэффициента экстинкции для тиопиридина 19,800 М-1.

Типично, уровень тиолана трех групп тиола на антителе является предпочтительным в этой процедуре. Например, с некоторыми антителами этого можно достичь путем придания 15-кратного молярного излишка 2-иминотиолану, после чего осуществляют инкубацию при комнатной температуре на протяжении 1 ч. Потом антитело инкубируют с 2-иминотиоланом при необходимом молярном соотношении и обессоливают в буфере для конъюгации (50 мм рН 60 ΗΕΡΕ8 буфер, который содержит 5 мМ глицина и 2 мМ ΏΤΡ^. Тиолированный материал выдерживают на льду во время количественной оценки введенных групп тиола, как описано выше. После проверки количества введенного тиола, остаток лекарственное средство-линкер О-(Х2)ас(ХО)Ь-К³¹ прибавляют в 3-кратном молярном избытке на тиол. Также осуществляют реакцию конъюгации в буфере для конъюгации, который содержит заключительную концентрацию 5% диметилсульфоксида (ДМСО), или в подобном альтернативном растворителе. В общем случае маточный раствор лекарственное средство-линкер разводят в 100% ДМСО. Маточный раствор непосредственно прибавляют к антителу, к которому также прибавляют достаточное количество ДМСО для того, чтобы довести заключительную концентрацию до 10%, или предварительно разводят в буфере для конъюгации, которая содержит заключительную концентрацию ДМСО, составляющую 10%, после чего прибавляют равное количество тиолированного антитела.

Реакционную смесь для конъюгации инкубируют при комнатной температуре на протяжении 2 ч при перемешивании. После конъюгации реакционную смесь для конъюгации центрифугируют и фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Очистка конъюгата может быть проведена с помощью хроматографии при использовании ряда способов. В одном способе конъюгат очищают при использовании эксклюзионной хроматографии на колонке Сефакрил 8200, которая была предварительно уравновешена с помощью 50 мМ рН 7,2 ΗΕΡΕ8 буфера, содержащего 5 мМ глицина и 50 мМ №С1. Хроматографию осуществляют при скорости линейного потока 28 см/ч. Собирают фракции, которые содержат конъюгат, объединяют пулы и концентрируют. В альтернативном способе очистку можно проводить с помощью ионообменной хроматографии. Условия которой варьируют в зависимости от антитела и могут быть оптимизированны- 39 028336 ми в каждом случае. Например, реакционную смесь конъюгата антитело-лекарственное средство помещают в колонку δΡ-Сефароза, которая была предварительно уравновешена в 50 мМ рН 5,5 ΗΕΡΕδ, содержащего 5 мМ глицина. Конъюгат антитела вымывают при использовании градиента 0-1 М №С1 в буфере для уравновешивания при рН 5,5. Релевантные фракции, которые содержат конъюгат, объединяют и подвергают диализу против буфера для рецептирования (50 мМ рН 7,2 ΗΕΡΕδ буфер, который содержит 5 мМ глицина и 100 мМ №С1).

Специалисту в данной области техники понятно, что описанные выше условия и методика приведены в качестве примера и не являются ограничивающими, а также то, что в данной области техники известны другие подходы для конъюгации антитела, и они могут использоваться в данном изобретении.

АОЕРТ

В другом варианте осуществления изобретения антитело конъюгировано с ферментом для применения в антитело-направленной ферментативной пролекарственной терапии (АОЕРТ). При АОЕРТ фермент направляется к опухолевому сайту при использовании антитела, с которым он связан. Таким образом, фермент действует на пролекарственное средство, которое вводится последовательно, для локального высвобождения соответствующего активного лекарственного средства. См., например, МеЙоп и др., ί. №ι11 Сапсег 1пкГ 88(3/4), 153-165 (1996). Примеры ферментов, которые могут быть конъюгированы для применения в АОЕРТ, включают карбоксипептидазу А и С2, щелочную фосфатазу, β-глюкуронидазу, βлактамазу, β-глюкозидазу, пеницилинамидазу, аминопептидазу, цитозиндезаминазу и нитроредуктазу. Поскольку АОЕРТ не требует высвобождения фермента из антитела, присутствие расщепляемой группы между антителом и ферментом не является обязательным. Таким образом, АОЕРТ конъюгат может быть представлен формулой (£)

Ζ-Χ-Ι) (ί), где Ζ представляет собой антитело в соответствии с изобретением; О представляет собой фермент, а X является линкером, который соединяет Ζ и О.

Иммуноконъюгаты

Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называются иммунотоксинами.

Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителом в соответствии с изобретением при использовании линкерной технологии, которая доступна в данной области техники. Примеры типов линкеров, которые используются для конъюгации цитотоксина с антителом, включают (но не ограничены ими) гидразоны, тиоэфиры, эфиры и линкеры, которые содержат дисульфиды и пептиды. Линкер выбран, например, так, что он является чувствительным к расщеплению с помощью низкого значения рН в лизосомальном компартменте, или является чувствительным к расщеплению протеазами, такими, как протеазы, которые преимущественно экспрессируются в опухолевой ткани, такие как катепсины (например, катепсины В, С, О).

Биспецифические молекулы

В другом аспекте данное изобретение характеризует биспецифические молекулы, которые включают анти-САОМ1 антитело или его фрагмент в соответствии с данным изобретением. Антитело в соответствии с данным изобретением или его антигенсвязывающие части могут быть дериватизованы или связаны с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора) с получением биспецифической молекулы, которая связывается по крайней мере с двумя различными связывающими сайтами или целевой молекулой. Антитело в соответствии с изобретением может фактически подвергаться дериватизации или связываться более, чем с одной функциональной молекулой с получением мультиспецифической молекулы, которая связывается больше, чем с двумя разными сайтами связывания и/или целевыми молекулами; такие мультиспецифические молекулы также охватываются термином биспецифическая молекула, как используется в данной заявке. Для создания биспецифической молекулы в соответствии с данным изобретением антитело в соответствии с изобретением может быть функционально связанно с (например, с помощью химической конденсации, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным способом) с одной или более другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, так, что образуется биспецифическая молекула.

В соответствии с этим данное изобретение включает биспецифические молекулы, которые содержат по крайней мере одну первую связывающую специфичность для САОМ1 и другую связывающую специфичность для второго целевого эпитопа. В конкретном воплощении в соответствии с данным изобретением второй целевой эпитоп представляет собой Рс рецептор, например, человеческий РсуЫ (СО64) или человеческий Рса рецептор (СО89). Таким образом, изобретение включает биспецифические молекулы, которые способны к связыванию как с РсуК или РсаК, которые экспрессируются эффекторными клетками (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (РМ№)), так и с целевыми клетками, которые экспрессируют САОМ1. Такие биспецифические молекулы нацелены на САОМ1, которая экспрессируется клетками, на эффекторную клетку и переключают активности эффекторной клетки, опосредованные Рс рецепторами, такие как фагоцитоз САОМ1, которая экспресси- 40 028336 руется клетками, зависимая от антитела, опосредованная клетками цитотоксичность (АОСС), высвобождение цитокина, или образование аниона супероксида.

В одном из вариантов воплощения изобретения биспецифическая молекула является мультиспецифической, т.е. молекула может дополнительно включать третью связывающую специфичность, в дополнение к анти-Рс связывающей специфичности и анти-САОМ1 связывающей специфичности. В одном из воплощений третья связывающая специфичность представляет собой часть, направленную против фактора усиления (ЕР), например, молекулы, которая связывается с поверхностным белком, втянутым в цитотоксическую активность и, таким образом, повышает иммунный ответ целевой клетки. Часть, направленная против фактора усиления может представлять собой антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например, антигеном или рецептором, и, таким образом, приводить к улучшению эффекта связывающих детерминант для Рс рецептора или антигена целевой клетки. Часть, направленная против фактора усиления может связываться с Рс рецептором или антигеном целевой клетки. Альтернативно, часть, направленная против фактора усиления, может связываться с остатком, который отличается от остатка, с которым связываются первая и вторая связывающие специфичности. Например, часть, направленная против фактора усиления, может связываться с цитотоксической Т-клеткой (например, с помощью СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, 1САМ-1 или другой иммунной клетки, которая приводит к повышенному иммунному ответу).

В одном из воплощений биспецифические молекулы в соответствии с изобретением включают как связывающую специфичность по крайней мере одно антитело или его фрагмент, включая, например, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ρν, Ρά, ЙАЬ или одноцепочечный Ρν. Антитело может также представлять собой димер легкой или тяжелой цепи или любой их минимальный фрагмент, такой как Ρν или одноцепочечную конструкцию, как описывается в патенте США № 4946778, который относится к Ьайпег и др., содержание которого приведено в данной заявке в качестве ссылки. В одном из вариантов связывающая специфичность для Рсу рецептора обеспечивается с помощью моноклонального антитела, связывание с которым не блокируется с помощью человеческого иммуноглобулина С (ΐ§0). Как используется в данной заявке, термин ΐ§Ο рецептор относится к кому-либо из восьми генов γ-цепи, которые размещаются на хромосоме 1. Эти гены кодируют вообще двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые группируются в три класса Ρсγ рецептора: Ρсγ Ρΐ (СЭ64), Ρсγ РИ(СЭ32 и Ρсγ Ρΐΐΐ (СЭ16). В одном из предпочтительных вариантов воплощения Ρсγ рецептор представляет собой человеческий ΡсγΡΐ с высокой аффинностью. Человеческий ΡсγΡΐ представляет собой молекулу весом 72 кДа, которая демонстрирует высокую аффинность в отношении мономерного ΐ§Ο (10⁸-10⁹ М^-1).

Получение и характеристика некоторых предпочтительных анти-Р^ моноклональных антител описывается в публикации РСТ \У0 88/00052 и в патенте США № 4954617, который относится к Рапдег и др., раскрытие которых приведено в данной заявке в качестве ссылки. Эти антитела связываются с эпитопом ΡсγΡI, ΡсγΡΐΐ или ΡсγΡШ в сайте, который отличается от сайта связывания Ρсγ рецептора и, таким образом, их связывание, по существу, не блокируется с помощью физиологических уровней ΐ§Ο. Специфические анти-ΡсγΡΐ антитела, используемые в данном изобретении, представляют собой тАЬ 22, тАЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. Гибридома, которая продуцирует тАЬ 32, доступна из Американской коллекции типичных культур, депозитный номер АТСС НВ9469. В других воплощениях антитело против Ρсγ рецептора является гуманизированной формой моноклонального антитела 22 (Н22). Получение и характеристика Н22 антитела описывается в Οπι/ίππο, Р.Р. и др. (1995) I. ΐттиηο1 155 (10): 4996-5002 и в публикации РСТ \У0 94/10332, которая относится к Тетρе5ΐ и др. Клеточная линия, которая продуцирует Н22 антитело, была задепонирована в Американской коллекции типичных культур под обозначением НА022СШ, и она имеет номер доступа СРЬ 11177.

В других предпочтительных воплощениях связывающая специфичность для Рс рецептора обеспечивается антителом, которое связывается с человеческим 1§А рецептором, например, Рс-альфа рецептором (РсоР1 (СЭ89)), связывание с которым преимущественно не блокируется с помощью человеческого иммуноглобулина А (1§А). Термин ЧдА рецептор относится к продукту одного α-гена (РсзР1). который размещается в хромосоме 19. Этот ген кодирует альтернативно сплайсированные трансмембранные изоформы 55-110 кДа. РсоР1 (СЭ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяции эффекторных клеток. РсоР1 имеет среднюю аффинность («5 х 10⁷ М^-1) как для так и для 1§А2, которая повышается под влиянием цитокинов, таких как С-ѧРили СМ-С8Р (Мο^ιοπ. Н.С. и др. (1996) СгШса1 Ре\зе\У5 ш ΐттиηο1ο§у 16: 423-440). Были описаны четыре специфических для РсоР1 моноклональных антитела, идентифицированные как А3, А59, А62 и А77, которые связываются с РсоР1 за пределами связывающего домена 1§А лиганда (Мοηΐе^^ο, Р.С. и др. (1992) I. ΐттиηο1. 148: 1764).

Рса Ρΐ и Ρсγ Ρΐ являются предпочтительными пусковыми рецепторами для применения в биспецифических молекулах в соответствии с изобретением, поскольку они (1) экспрессируются, главным образом, на иммунных эффекторных клетках, например моноцитах, полиморфоядерных нейтрофилах, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются на высоком уровне (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических видов активности (например, АОСС, фагоцитоз); и (4)

- 41 028336 опосредствуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая нацеленные на них собственные антигены.

В то время как человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые могут использоваться в биспецифических молекулах в соответствии с изобретением, представляют собой мышиное, химерное и гуманизированное моноклональные антитела.

Биспецифические молекулы в соответствии с данным изобретением могут быть получены путем конъюгации составляющих связывающей специфичности, например, анти-Рсг и анти-САЭМ1 связывающих специфичностей при использовании способов, известных в данной области техники. Например, каждая связывающая специфичность биспецифической молекулы может быть получена отдельно и конъюгирована с другими. Тогда, когда связывающие специфичности представляют собой белки или пептиды, различные конденсирующие и перекрестно связывающие агенты могут использоваться для ковалентной конъюгации. Примеры перекрестно связывающих агентов включают белок А, карбодиимид, 8-ацетилтиоацетат (8АТА), 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) (ΌΤΝΒ), о-фенилендималеимид (оРЭМ), №сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидил 4-(№малеимидоэтил) циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см. например, Кагроукку и др. (1984) 1. Ехр. Мей. 160: 1686; Ьш, МА и др. (1985) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. 8сг И8А 82: 8648). Другие способы включают те, которые описаны у Раи1ик (1985) ВеЬбпд 1пк. МШ. №. 78, 118-132; Вгеппап и др. (1985) 8с1епсе 229: 81-83, и О1епте и др. (1987) 1. 1ттипо1. 139: 2367-2375). Предпочтительные агенты для конъюгации представляют собой 8АТА и сульфо-8МСС, оба являются доступными от Р1егсе СЬетюа1 Со. (КоскРогй, 1Ь). Когда связывающие специфичности представляют собой антитела, они могут быть конъюгированы через сульфгидрильную связь С-терминального шарнирного участка двух тяжелых цепей. В наиболее предпочтительном варианте воплощения шарнирный участок является модифицированным для введения непарного количества сульфгидрильных остатков, преимущественно одного, перед конъюгацией. Альтернативно, обе связывающие специфичности могут кодироваться в одном и том же векторе и экспрессироваться и объединяться в этой клетке хозяине. Этот способ является особенно полезно тогда, когда биспецифическая молекула представляет собой тАЬ х тАЬ, тАЬ х РаЬ, РаЬ х Р(аЬ')₂ или лиганд х РаЬ слитого белка. Биспецифическая молекула в соответствии с изобретением может представлять собой одноцепочечную молекулу, которая включает одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, которая включает две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут включать по крайней мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патентах США № 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858, которые приведены в данной заявке в качестве ссылки.

Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями может быть подтверждено с помощью, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А), радиоиммуноанализа (ΡΙΛ), РАС8 анализа, биоанализа (например, ингибирование роста) или Вестерн-блоттинг анализа. Каждый из этих анализов в общем случае выявляет присутствие комплексов белок-антитело, которые представляют особый интерес, при использовании меченого реагента (например, антитела), специфического для комплекса, который представляет интерес. Например, комплексы Рсг-антитело могут быть определены при использовании, например, связанного с ферментом антитела или фрагмента антитела, который узнает и специфически связывается с комплексами антитело-Рсг. Альтернативно, комплексы могут определяться при использовании любого другого иммуноанализа. Например, антитело может быть радиоактивно меченным и использоваться в радиоиммуноанализе (К1А) (см., например, УешбаиЬ, В., Ргтар1ек о£ Кайю1ттипоаккаук, 8еуеп1Ь Тгаштд Соигке оп КайюЬдапй Аккау ТесЬтдиек, ТЬе Епйосппе 8ос1е1у, МагсЬ, 1986, этот источник приведен в данной заявке в качестве ссылки). Радиоактивный изотоп может определяться такими средствами, как использование у счетчика или сцинтиляционного счетчика, или с помощью ауторадиографии.

Фрагменты антитела и миметики антитела

Данное изобретение не ограничивается традиционными антителами и может реализовываться при использовании фрагментов антитела и миметиков антитела. Как описывается ниже, на сегодняшний день было разработано и широко известны в данной области техники разнообразные методики на основе использования фрагментов антитела и миметиков антитела. В то время как ряд таких методик, таких как доменные антитела, нанотела и унитела, применяют фрагменты антител или другие их модификации, традиционные структуры антител также представляют собой альтернативные методики, такие как аффитела, ПАКРтк, антикалины, авимеры и версатела, которые используют связывающие структуры, имитирующие связывание традиционного антитела, из которого они происходят, и функционируют с помощью отличных механизмов.

Доменные антитела (йАЬ) представляют собой наименьшие функциональные связывающие единицы антитела, которые соответствуют вариабельным участкам либо тяжелой (ν_Η), либо легкой (У) цепи человеческого антитела. Доменные антитела имеют молекулярный вес приблизительно 13 кДа. Доменные антитела имеют разработанную серию больших и высоко функциональных библиотек полноразмерных человеческих ν_Η и У₂ доменных антител (больше десяти миллиардов различных последовательно- 42 028336 стей в каждой библиотеке), и эти библиотеки используются для селекции, которая является специфической для терапевтических мишеней. В противоположность многим традиционным антителам доменные антитела хорошо экспрессируются в системах на основе бактерий, дрожжей и клеток млекопитающих. Дополнительные детали относительно доменных антител и способов их получения раскрыты в патентах США № 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; 6696245; патентной заявке США с серийным номером 2004/0110941; европейской патентной заявке № 1433846 и европейских патентах № 0368684 и № 0616640; АО 05/035572, АО 04/101790, АО 04/081026, АО 04/058821, АО 04/003019 и АО 03/002609, каждый из указанных источников приведен в данной заявке в качестве ссылки. Нанотела представляют собой терапевтические белки, которые имеют происхождение от антитела и имеют уникальные структурное и функциональное свойства существующих в природе тяжелых цепей антитела. Эти антитела на основе тяжелой цепи содержат один вариабельный домен (УНН) и два константных домена (СН2 и СН3). Важно, что клонированный и выделенный УНН домен представляет собой стабильный полипептид, который имеет полную антигенсвязывающую активность исходной тяжелой цепи антитела. Нанотела имеют высокую гомологию с УН доменами человеческого антитела и могут быть дополнительно гуманизированы без потери активности. Нанотела имеют низкий иммуногенный потенциал, что было подтверждено в исследованиях на приматах при использовании основных соединений нанотел.

Нанотела обладают преимуществами традиционных антител с характеристиками лекарственных средств на основе малых молекул. Подобно традиционным антителам, нанотела демонстрируют высокую целевую специфичность, высокую аффинность в отношении мишеней и низкую естественную токсичность. Однако подобно лечебным средствам на основе малых молекул, они могут ингибировать ферменты и легко достигать рецепторных щелей. Кроме того, нанотела являются очень стабильными, могут вводиться методами, отличными от инъекции (см., например, АО 04/041867, которая приведена в данной заявке в качестве ссылки) и просты для производства. Другие преимущества нанотел включают распознание скрытых эпитопов, что является результатом их небольшого размера, связывание в полостях или активных сайтах белковых мишеней с высокой аффинностью и селективностью благодаря своей уникальной 3-мерной гибкости, индивидуальную адаптацию периода полувыведения, а также легкость и скорость поиска новых лечебных средств.

Нанотела кодируются единичными генами и эффективно продуцируются почти во всех прокариотических и эукариотических клетках хозяевах, например, Е. сой (см., например, υδ 6765087, который приведен в данной заявке), плесневелых грибах (например, АзрегдШиз или ТпсНойегта) и дрожжах (например, δассЬа^οтусе5, К1иууеготусез, Напзепи1а или РюЫа) (см., например, патент США № 6838254, который является приведен в данной заявке). Процесс их получения можно масштабировать, при этом могут быть получены многокилограммовые количества нанотел. Поскольку нанотела демонстрируют чрезвычайную стабильность по сравнению с традиционными антителами, они имеют более продолжительный период хранения, в виде готового к применению раствора.

Способ наноклон (см. например, публикацию АО 06/079372, которая приведена в данной заявке в качестве ссылки) представляет собой запатентованный способ получения нанотел. Были получены нанотела против желательной мишени на основе автоматизированной высокоэффективной селекции Вклеток, такие нанотела могут использоваться в контексте данного изобретения.

Унитела представляют собой другие фрагменты антитела; технология их получения базируется на удалении шарнирного участка ЦС4 антитела. Удаление шарнирного участка приводит к получению молекулы, которая имеет размер, который, по существу, составляет половину размера традиционного ЦС4 антитела и имеет унивалентный связывающей участок вместо бивалентного связывающего участка Ι§Ο4 антитела. Хорошо известно, что ЦС4 антитела являются инертными и, таким образом, не взаимодействуют с иммунной системой, что составляет преимущество при лечении заболеваний, при которых иммунный ответ не является желательным, это преимущество обеспечивается унителам. Например, унитела могут ингибировать или стимулировать молчание, но без уничтожения, клеток, с которыми они связываются. Дополнительно, унитела, связываясь с раковыми клетками, не стимулируют их к пролиферации. Кроме того, поскольку унитела составляют приблизительно половину размера традиционного ЦС4 антитела, они могут лучшее распределяться в пределах больших солидных опухолей, а значит обладают потенциальным преимуществом в отношении эффективности. Унитела выводятся из организма с той же скоростью, что и цельные Ι§Ο4 антитела, и способны связываться с такой же аффинностью со своими антигенами, что и цельные антитела. Дополнительные детали относительно унител могут быть получены из публикации АО 2007/059782, которая приведена в данной заявке в качестве ссылки.

Молекулы аффител представляют новый класс аффинных белков, которые базируются на белковом домене, состоящем из 58-аминокислотных остатков, которые происходят от одного из ^О-связывающих доменов стафилококкового белка А. Этот домен, который состоит из трех спиралей, образующих узел, был использован как каркас для конструирования комбинаторных фагмидных библиотек, из которых могут быть отобраны варианты аффител использовании методики фагового дисплея Аогй К., Оиппегшззоп Е., КищйаЫ ί., δκιΐιΐ δ., ИЫеп М., Ждгеп Р.А., ВшФпд ргоШпз зе1ескей Ггот сотЬтаЮпа1 НЬгапез оГ ап а-НеПса1 Ъас1епа1 гесерког йотат, №ιΙ Вю1ес1то1 1997; 15: 112-1. Коптагк ί., Огоп1ипй Н., ИЫеп М., Ждгеп Р.А., Нитап 1ттипод1оЪи1т А ДдАЦзресШс йдапйз Ггот сотЫпа1опа1 епдтеегшд оГ ргокеш А,

- 43 028336

Еиг 1 ВюсЬет 2002; 269: 2647-55). Простая, активная структура молекулы аффитела в комбинации с его низким молекулярным весом (6 кДа) делают его приемлемым для разнообразного применения, например, в качестве диагностических агентов (Воптагк ί.. Напзкоп Μ., Ндиуеп Тта др., СопЫгисПоп апй сЬагасЮп/аПоп оГ аГПЬойу-Гс сЫтегак ргойисей т ЕксЬепсЫа сок, 1 1ттипо1 ΜеΐЬοЙ5 2002; 261: 199-211) и агентов для ингибирования рецепторных взаимодействий (АапйЧогт к., Хи Ζ., РогкЬегд О., Ждгеп Р.А., [пЫЫПоп оГ 1Ье СЭ28-СЭ80 со-кЬти1аЬоп 51§па1 Ьу а СЭ28-Ьшйтд АГПЬойу Ьдапй йеνе1οрей Ьу сотЫпаЮпа1рго1ет епдшееппд, Рго1еш Епд 2003; 16: 691-7). Дополнительные детали относительно Аффител и способов их получения раскрыты в патенте США № 5831012, который приведен в данной заявке в качестве ссылки.

Меченные аффитела пригодны для получения избытка изоформы. ЭАРРт (сконструированные белки с анкириновым повтором) представляют собой пример миметика антитела ОВР (сконструированного повторяемого белка), которые были разработаны для использования способности этих полипептидов, отличных от антител к связыванию. Повторяемые белки, такие как белки, обогащенные анкириновыми и лейциновыми повторами, представляют собой распространенные связывающие молекулы, которые образуются, в отличие от антител, в клетке и вне ее границ. Их уникальная агрегированная архитектура характеризуется повторяемыми структурными единицами (повторами), которые складываются вместе с образованием повторяемых доменов, демонстрирующих вариабельные и агрегированные поверхности для связывания с мишенью. Базируясь на такой агрегированности, могут быть созданы комбинаторные библиотеки полипептидов с высоко диверсифицированными связывающими специфичностями. Такая стратегия включает консенсусное конструирование самосовместимых повторов, которые демонстрируют остатки вариабельной поверхности и их объединение случайным образом с образованием повторяемых доменов.

ЭАРРт могут быть получены с очень высоким выходом в системах бактериальной экспрессии, кроме того, они принадлежат к наиболее стабильным известным белкам. Были отобраны высоко специфические ОАРРт с высокой аффинностью к широкому спектру целевых белков, включая человеческие рецепторы, цитокины, киназы, человеческие протеазы, вирусы и мембранные белки. Могут быть полученные □АВРю, которые обладают аффинностью от наномолярного до пикомолярного интервала. ЭАВРш имеют широкий спектр применений, включая ЕБАА, сэндвич ЕБАА, проточный цитометрический анализ (РАСЗ), иммуногистохимию (1НС), применение чипов, аффинную очистку или Вестерн-блоттинг. ОАВРи! также продемонстрировали высокую активность во внутриклеточном компартменте, как внутриклеточные маркерные белки, слитые с зеленым флуоресцентным белком (ОРР). ОАВРи! также используются для ингибирования поступления вируса в клетку с 1С₅₀ в пределах пМ интервала. ОАВРю являются не только идеальными для блокирования белок-белковых взаимодействий, но также ингибируют ферменты. Успешно ингибируются протеазы, киназы и транспортеры, наиболее часто имеет место аллостерическое ингибирование. Очень быстрое и специфическое обогащение опухолей и чрезвычайно благоприятное соотношение опухоль/кровь делает ОАВРю приемлемыми для диагностики ш νί\Ό или терапевтических подходов.

Дополнительная информация относительно ЭАРРт и других ОВР технологий может быть найдена в публикации патентной заявки США № 2004/0132028 и публикации международной патентной заявки А0 02/20565, обе приведены в данной заявке в качестве ссылки.

Антикалины представляют собой миметики антител, однако в этом случае связывающая специфичность происходит от липокалинов, семейства белков с низким молекулярным весом, которые естественным образом и в излишке экспрессируются в человеческих тканях и жидкостях организма. Липокалины участвуют в осуществлении ряда функций ш νί\Ό, связанных с физиологическим транспортом и хранением химически чувствительных и нерастворимых соединений. Липокалины имеют жесткую внутреннюю структуру, которая включает высоко консервативные β-цилиндры, которые поддерживают четыре петли на одном терминальном конце белка. Эти петли образуют вход в связывающий карман. Конформационное разнообразие в этой части молекулы объясняет вариации в связывающей специфичности индивидуальных липокалинов.

В то время как гипервариабельная структура петель поддерживается консервативными β-слоями, каркасный участок напоминает иммуноглобулины, липокалины значительным образом отличаются от антител по размерам, в том, что они состоят из одной полипептидной цепи длиной 160-180 аминокислот, что является в некоторой степени больше, чем единичный домен иммуноглобулина.

Для того чтобы создать антикалины, липокалины клонируют, а их петли подвергают инжинирингу. Была получена библиотека структурно различных антикалинов. Антикалиновый дисплей позволяет проводить селекцию и скрининг на связывающую активность, после чего осуществляют экспрессию и получение растворимого белка для дальнейшего анализа в прокариотических или эукариотических системах. Исследования успешно продемонстрировали, что могут быть разработаны и выделены антикалины, которые являются специфическими практически к любому целевому белку человека, и могут быть получены связывающие аффинности в наномолярном или более высоком диапазоне.

Антикалины могут подвергаться форматированию как двойные нацеливающие белки, так называе- 44 028336 мые дуокалины. Дуокалины связываются с двумя отдельными терапевтическими мишенями в одном мономерном белке, который может быть легко получен при использовании стандартных способов получения, в то время как сохраняет целевую специфичность и аффинность, несмотря на свою структурную ориентацию и свои связывающие домены.

Регуляция множественных мишеней с помощью одной молекулы является особенно предпочтительной при заболеваниях, которые охватывают более чем один этиологический фактор. Кроме того, форматы би- или мультивалентного связывания, такие как дуокалины, имеют значительный потенциал в результате связывания и кластеризации рецепторов клеточной поверхности при нацеливании на молекулы клеточной поверхности при заболеваниях, опосредованных агонистическим влиянием на пути сигнальной трансдукции или индукции эффектов усиленной интернализации. Кроме того, высокая внутренняя стабильность дуокалинов сравнима с такой для мономерных антикалинов, что обеспечивает гибкий подбор составляющих и потенциал доставки для дуокалинов.

Дополнительная информация относительно антикалинов может быть найдена в патенте США № 7250297 и в публикации международной патентной заявки \У0 99/16873, оба источника приведены в данной заявке в качестве ссылки. Другая миметики антитела, полезные в случае данного изобретения, представляют собой авимеры. Авимеры происходят от большого семейства внеклеточных рецепторных доменов человека, которые получены путем перестановки ίη νίίΐΌ экзонов и фагового дисплея, в результате чего получают мультидоменные белки со связывающими и ингибирующими свойствами. Связывание ими множества независимых связывающих доменов было продемонстрировано как такое, оно создает авидность и приводит к улучшенной аффинности и специфичности по сравнению с традиционными связывающими белками, которые содержат один эпитоп. Другие потенциальные их преимущества включают простое и эффективное получение специфических молекул в ЕксЬепсЫа сой, которые направлены на несколько мишеней, улучшенную термостабильность и резистентность к действию протеаз. Авимеры с субнаномолярными аффиностями были получены против различных мишеней. Дополнительная информация относительно авимеров может быть найдена в патентных заявках США № 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, которые приведены в данной заявке в качестве ссылки. Версатела представляют собой другие миметики антител, которые могут использоваться в контексте данного изобретения. Версатела являются очень мелкими белками, которые имеют вес 3-5 кДа, с >15% цистеинов, которые образуют каркас с высокой плотностью дисульфидных связей, заменяя гидрофобное ядро типичных белков. Замена большого количества гидрофобных аминокислот, которые входят в состав гидрофобного ядра, небольшим количеством дисульфидов, приводит к получению белка, который является меньшим, более гидрофильным (меньшая агрегация и неспецифическое связывание), более стойким к действию протеаз и тепловой обработке, с низкой плотностью Т-клеточных эпитопов, поскольку остатки, которые осуществляют свой вклад в большинство МНС презентаций, являются гидрофобными. Все эти четыре свойства хорошо известны, они влияют на иммуногенность, и вместе они, как предполагается, будут вызывать снижение иммуногенности.

Стимуляция версател происходит от естественных биофармацевтических средств, которые вводятся путем инъекции и продуцируются пиявками, змеями, пауками, скорпионами, улитками и анемоной, которые демонстрируют неожиданно низкую иммуногенность. Выбранное семейство природных белков путем конструирования и скрининга размеров и гидрофобности, протеолитической обработки антигена и плотности эпитопа минимизируют до уровней, значительно более низких, чем средние для природных белков, которые вводятся путем инъекции.

Принимая во внимание структуру версател, эти миметики антитела обладают гибким форматом, который включает мультивалентность, мультиспецифичность, разнообразие механизмов полувыведения, различные возможности нацеливания на ткани и отсутствие Рс участков антитела. Кроме того, версатела производятся в Е. сой с высоким выходом, являются высокорастворимыми и могут быть получены в высоких концентрациях. Версатела являются исключительно термостабильными (они могут подвергаться кипячению) и обладают удлиненным периодом полувыведения. Дополнительная информация относительно версател может быть найдена в патентной заявке США № 2007/0191272, которая приведена в данной заявке в качестве ссылки. Подробное описание методик на основе фрагментов антител и миметиков антител приведено выше и не является исчерпывающим списком методик, которые могут использоваться в контексте данного описания. В качестве примера, но не с целью ограничения, возможно использование разных дополнительных методик, включая альтернативные методики, которые базируются на полипептидах, таких как слияние участков, определяющих комплементарность, как определено у Ош и др., №1иге Вю1есЬпо1о§у, 25(8) 921-929 (2007), этот источник приведен в данной заявке в качестве ссылки, а также методики, которые базируются на нуклеиновых кислотах, таких как методика аптамеров РНК, которая описана в патентах США № 5789157, 5864026, 5712375, 5763566, 6013443, 6376474, 6613526, 6114120, 6261774 и 6387620, которые приведены в данной заявке в качестве ссылки.

Фармацевтические композиции

В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, например, к фармацевтической композиции, которая содержит одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязы- 45 028336 вающих фрагментов в соответствии с данным изобретением, объединенные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию (например, два или более различных) антител, или иммуноконъюгатов, или биспецифических молекул в соответствии с данным изобретением. Например, фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут включать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул), которые связываются с различными эпитопами на целевом антигене, или таких, которые имеют комплементарную активность.

Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением также могут использоваться при комбинированной терапии, то есть вместе с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать анти-САЭМ1 антитело в соответствии с данным изобретением в сочетании по крайней мере с одним другим противовоспалительным агентом или иммуносупрессивным агентом. Примеры терапевтических агентов, которые могут использоваться в комбинированной терапии, более подробно описаны ниже в разделе, который касается применения антител в соответствии с данным изобретением.

Как используется в данной заявке, фармацевтически приемлемый носитель включает любой или все растворители, дисперсионную среду, покрытие, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, которые задерживают абсорбцию, и подобные им, которые являются физиологически совместными. Преимущественно, носитель является приемлемым для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, то есть антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула может покрываться материалом для защиты от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать ее. Фармацевтические соединения в соответствии с изобретением могут включать одну или более фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет необходимую биологическую активность исходного соединения и не проявляет нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Вегде, 8.М., и др. (1977) I. РЬагт. §ск 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают те, которые происходят от нетоксичных неорганических солей, таких как хлористо-водородная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, иодисто-водородная, фосфорная и подобные им, а также от нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алканоевые кислоты, гидроксиалканоевые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и подобные им. Соли присоединения основания включают те, которые имеют происхождение от щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций, и т.п., а также от нетоксичных органических аминов, таких как >№-дибензилетилендиамин, Шметилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и подобные им.

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может также включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и подобные им; (2) растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбил пальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и подобные им; и (3) хелатирующие металл агенты, такие как лимонная кислота, этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и подобные им.

Примеры приемлемых водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях в соответствии с изобретением, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и подобные им) и их приемлемые смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Собственная текучесть может поддерживаться, например, при использовании материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания желательного размера частиц в случае дисперсий и при использовании поверхностно-активных соединений.

Эти композиции могут также содержать вспомогательные агенты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может обеспечиваться как путем процедур стерилизации, которые описаны выше, так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и подобных им. Предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и подобный им компонент. Кроме того, пролонгированная абсорбция фармацевтической формы может быть осуществлена путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, например, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для приготовленных непосредственно перед применением стерильных растворов для введения или дисперсий. Применение такой среды и агентов для фармацевтически активных соединений известно в данной области техники. За исключением тех случаев, когда традиционная среда или агент являются несовместимы с активным соединением, их применение в фармацевтической компо- 46 028336 зиции в соответствии с изобретением предполагается. Дополнительные активные соединения могут также вводиться в композиции.

Терапевтические композиции типично должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, приемлемой для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, которая содержит, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль, и подобные им) и их приемлемые смеси. Собственная текучесть может поддерживаться, например, при использовании материалов для покрытия, таких как лецитин, в результате сохраняется необходимый размер частиц в случае дисперсий, и при использовании поверхностно-активных соединений. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия, в композицию. Пролонгированная абсорбция композиции для инъекции может быть достигнута путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем введения необходимого количества активного соединения в приемлемый растворитель с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, после чего осуществляют стерилизацию путем микрофильтрации. В общем случае, дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов осуществляют сушку в вакууме, а также замораживанием (лиофилизация), что обеспечивает получение порошка активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из предварительно приготовленного стерильного отфильтрованного раствора.

Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя с получением единичной дозированной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, которого подвергают лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя с получением единичной дозированной формы, в общем случае будет представлять собой такое количество, которое обеспечивает терапевтический эффект. В общем случае, в расчете на 100 процентов это количество будет колебаться от приблизительно 0,01 процента до приблизительно 99 процентов активного ингредиента, преимущественно от приблизительно 0,1 процента до приблизительно 70 процентов, наиболее предпочтительно от приблизительно 1 процента до приблизительно 30 процентов активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Режимы дозирования корректируют для обеспечения оптимального ответа (например, терапевтического ответа). Например, может вводиться единичный болюс, несколько разделенных доз могут вводиться на протяжении определенного промежутка времени или доза может пропорционально снижаться или повышаться в соответствии с терапевтической ситуацией. Наиболее предпочтительна парентеральная композиция в форме единичной дозы для облегчения введения и однородности дозирования. Единичная дозированная форма, как используется в данной заявке, относится к физически дискретным единицам, приемлемым в качестве однократных доз для субъектов, которые лечатся; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, подсчитанное для получения необходимого терапевтического эффекта в ассоциации с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для единичных дозированных форм в соответствии с изобретением продиктована и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который достигается, и (Ь) характерных ограничений, которые существуют в области техники для активного соединения.

Для введения антитела интервалы доз составляют от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, и обычно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 0,3 мг/кг веса тела, 1 мг/кг веса тела, 3 мг/кг веса тела, 5 мг/кг веса тела или 10 мг/кг веса тела или в пределах интервала 1-10 мг/кг. Типичный режим лечения предусматривает введение один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в 3 месяца или один раз каждые 3-6 месяцев. Предпочтительные дозировки для анти-САЭМ1 антитела в соответствии с изобретением включают 1 мг/кг веса тела или 3 мг/кг веса тела путем внутривенного введения, с антителом, которое назначают при использовании одного из следующих режимов дозирования: (ί) шесть доз каждые четыре недели, потом - каждые три месяца; (ίί) каждые три недели; (ίίί) 3 мг/кг веса тела один раз, после чего 1 мг/кг веса тела каждые три недели.

В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными связывающими специфичностями вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого антитела подпадает под границы указанных интервалов. Антитело обычно вводят многократно. Интервалы между введением единичных доз могут составлять, например, неделю, месяц, каждые три месяца или ежегодно. Интервалы также могут быть нерегулярными и определяться на основе измерения уровней антитела к целевому антигену в крови пациента. В некоторых способах дозу доводят до концентрации антитела в крови в пределах 11000 мкг/мл, а в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл.

- 47 028336

Альтернативно, антитело может вводиться как композиция пролонгированного высвобождения, в этом случае необходима меньшая частота введений. Дозирование и частота введения могут варьировать в зависимости от периода полувыведения антитела у пациента. В общем случае человеческие антитела демонстрируют более длинный период полувыведения по сравнению с гуманизированными антителами, химерными антителами и антителами, которые не происходят от человека. Дозирование и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактических применениях относительно низкая доза вводится с относительно короткими интервалами на протяжении длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение на протяжении всей оставшейся жизни. При терапевтических применениях относительно высокая доза с относительно длинными интервалами необходима для введения, чтобы уменьшить интенсивность заболевания или вылечить заболевание, преимущественно до частичного или полного ослабления симптомов заболевания. После этого может применяться профилактический режим.

Актуальные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях в соответствии с данным изобретением могут изменяться так, чтобы количество активных ингредиентов являлось эффективным для достижения необходимого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, при отсутствии токсичности для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность используемого конкретного соединения в соответствии с данным изобретением или его эфир, соли или амида, способ введения, время введения, скорость выведения конкретного соединения, которое используется, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, которые используются в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предыдущую медицинскую историю пациента, которого лечат, и подобные факторы, которые известны в данной области техники.

Терапевтически эффективная доза анти-СА0М1 антитела в соответствии с изобретением преимущественно приводит к снижению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов без заболевания, или предотвращение повреждения или нетрудоспособности по причине заболевания. Например, для лечения СА0М1+ опухолей терапевтически эффективная доза преимущественно ингибирует рост клеток или рост опухоли по крайней мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно на 40%, наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно на 60%, и еще более предпочтительно по крайней мере приблизительно на 80% по сравнению с субъектами, которых не подвергали лечению. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена в системе животной модели, которая является прогностической в отношении эффективности лечения человеческих опухолях. Альтернативно, это свойство композиции может быть оценено с помощью анализа способности соединения ингибировать рост клеток, такое ингибирование может измеряться ш У11го с помощью анализов, известных специалисту. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может снижать размер опухоли, или иным способом облегчать симптомы у субъекта. Средний специалист в данной области техники будет способным определить такие количества на основе таких факторов, как вес тела субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения.

Композиция в соответствии с данным изобретением может вводиться с помощью одного или более путей введения при использовании одного или более различных способов, известных в области техники. Как будет оценено квалифицированным специалистом, путь и/или способ введения будут варьировать в зависимости от необходимых результатов. Предпочтительные пути введения для антител в соответствии с изобретением включают внутривенный, внутримышечный, интрадермальный, интраперитонеальный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. Фраза парентеральное введение, как используется в данной заявке, означает способы введения, отличные от энтерального и местного введений, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию или инфузию. Альтернативно, антитело в соответствии с изобретением может вводиться с помощью непарентерального пути, такого как местный, эпидермальный или мукозальный путь введения, например, интраназальный, оральный, вагинальный, ректальный, сублингвальный или местный путь введения.

Активные соединения могут быть получены с носителями, которые будут защищать соединения от быстрого высвобождения, например композиция контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы для доставки. Могут использоваться способные к биоразложению, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэстеры и полимолочная кислота. Множество способов для получения таких композиций запатентованы и известны квалифицированному специалисту в данной области техники. См., например, Зик1ашеб апб Соп1го11ей Ре1еаке Эгид Эекуегау Зук1етк, ГР. РоЫпкоп, ред., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\у Уогк, 1978.

- 48 028336

Терапевтические композиции могут вводиться с помощью устройств, известных в области техники. Например, в предпочтительном воплощении терапевтическая композиция в соответствии с изобретением может вводиться с помощью безигольных устройств для подкожной инъекции, таких как устройства, которые раскрыты в патентах США № 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, полезных для данного изобретения, включают: патент США № 4487603, который раскрывает способный к имплантации микроинфузионный насос для доставки лекарственного средства при контролируемой скорости; патент США № 4486194, который раскрывает терапевтическое устройство для введения лечебных средств через кожу; патент США № 4447233, который раскрывает насос для инфузии лекарственного средства для доставки его при точно установленной скорости инфузии; патент США № 4447224, который раскрывает способный к имплантации аппарат для инфузии с вариабельным потоком для беспрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, который раскрывает осмотическую систему для доставки лекарственного средства, которая имеет многокамерные компартменты; и патент США № 4475196, который раскрывает осмотическую систему для доставки лекарственного средства. Эти патенты являются приведены в данной заявке в качестве ссылки. Множество других таких имплантатов, систем доставки и модулей хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области техники.

В некоторых воплощениях человеческие моноклональные антитела в соответствии с изобретением могут быть включены в состав композиции собственно для распределения ш У1уо. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) задерживает много высоко гидрофильных соединений. Для обеспечения того, чтобы соединения в соответствии с изобретением пересекали ГЭБ (если это необходимо), они должны быть включены, например в липосомы. Способы получения липосом раскрыт, например в патентах США № 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут включать один или более остатков, которые селективно осуществляют транспорт в специфические клетки или органы, обеспечивая, таким образом, улучшенную целевую доставку лекарственного средства (см., например, У.У. Рапабе (1989) 1. СПп. РЬагтасо1. 29: 685). Примеры нацеливающих остатков включают фолат или биотин (см., например, патент США № 5,416,016, который относится к Ьоте и др.); манозиды Ште/а\уа и др., (1988) ВюсЬет. ВюрЬу8. Ре8. Согитип. 153: 1038); антитела (Р.С. В1оетап и др. (1995) РЕВБ Ьей. 357: 140; М. 0\\<П8 и др. (1995) АпЬтюгоЬ. Адей8 СЬетоШег. 39: 180); рецептор поверхностно-активного белка А (Вп8сое и др. (1995) Ат. 1. РЬу8ю1. 1233: 134); р120 (БсЬгаег и др. (1994) 1. Вю1. СЬет. 269: 9090); см. также к. кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994) РЕВБ Ьей. 346: 123; 1.1. кШюп; 1.1. Р1б1ег (1994) 1ттипоте1Ьоб8 4: 273.

Применение и способы

Антитела, в частности человеческие антитела, композиции антител и способы в соответствии с данным изобретением характеризуются многочисленными диагностическими и терапевтическими применениями ш уйго и ш У1уо, которые предусматривают диагностику и лечение опосредованных САИМ1 расстройств. Например, эти молекулы могут вводиться в культуры клеток ш уйго или ех У1уо, или человеческим субъектам, например, ш У1уо, для лечения, профилактики, диагностики различных заболеваний. Как используется в данной заявке, термин субъект охватывает животных, которые представляют собой людей, и животных, отличных от людей. Отличные от людей животные включают всех позвоночных, например, млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овец, собак, котов, коров, коней, кур, амфибий и рептилий. Предпочтительными субъектами являются пациенты, которые представляют собой людей, которые имеют расстройства, опосредованные активностью САИМ1. Эти способы особенно приемлемы для лечения пациентов-людей, которые имеют расстройство, ассоциированное с патологической экспрессией САИМ1. Когда антитела к САИМ1 вводятся вместе с другим агентом, они могут вводиться один за другим или одновременно.

Принимая во внимание специфическое связывание антител в соответствии с изобретением с САИМ1, антитела в соответствии с изобретением могут использоваться для специфического определения экспрессии САИМ1 на поверхности клетки и, кроме того, могут использоваться для очистки САИМ1 с помощью иммуноафинной очистки. Кроме того, принимая во внимание экспрессию САИМ1 на различных опухолевых клетках, человеческие антитела, композиции антител и способы в соответствии с данным изобретением могут использоваться для лечения субъекта с онкогенным расстройством, например, расстройством, которое характеризуется присутствием опухолевых клеток, которые экспрессируют САИМ1, включая, например, мелкоклеточный рак легких, лейкемию Т-клеток у взрослых, различные нейроэндокринные виды рака, включая такие как рак легких, надпочечников, гипофиза, желудочнокишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулиномы и глюкагономы), глиобластомы и карциноидные опухоли, включая такие как опухоли поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек.

В одном из вариантов воплощения изобретения антитела (например, человеческие моноклональные антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и композиции) могут использоваться для определения уровней САИМ1 или уровней клеток, которые содержат САИМ1 на своей мембранной поверхности, где эта информация связана с определенными симптомами заболевания. Альтернативно, антитела могут использоваться для ингибирования или блокирования функции САИМ1, что, в свою очередь, может быть связано с подавлением проявления или облегчением определенных симптомов заболе- 49 028336 вания, используя, таким образом, САЭМ1 как медиатор заболевания. Этого можно достичь путем контакирования образца и контрольного образца с анти-САЭМ1 антителом при условиях, которые позволяют осуществлять образование комплекса между антителом и САЭМ1. Любые комплексы, которые образовываются между антителом и САЭМ1, обнаруживаются и сравниваются у образца и в контроле.

В другом варианте антитела (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и композиции) в соответствии с изобретением могут сначала анализируются на связывающую активность, связанную с терапевтическим или диагностическим применениям ίη νίΙΐΌ. Например, композиции в соответствии с изобретением могут анализироваться с помощью проточной цитометрии, которая описана в разделе примеры.

Антитела (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы, иммуноконъюгаты и композиции) в соответствии с изобретением дополнительно могут применяться в терапии и диагностике связанных с САЭМ1 заболеваний. Например, человеческие моноклональные антитела, мультиспецифические или биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты могут использоваться для стимуляции ίη νί\Ό или ίη νίίΐΌ одной или более из следующих биологических активностей: для ингибирование роста и/или уничтожения клеток, которые экспрессируют САЭМ1; для опосредования фагоцитоза или АЭСС клеток, которые экспрессируют САЭМ1 в присутствии человеческих эффекторных клеток, или блокировать связывание САЭМ1 с лигандом САЭМ1. В конкретном воплощении антитела (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и композиции) используются для лечения ίη νί\Ό, профилактики или диагностики различных заболеваний, связанных с САЭМ1. Примеры заболеваний, связанных с САЭМ1, включают, среди прочих, человеческий рак, который представляет собой мелкоклеточный рак легких, нейроэндокринные виды рака поджелудочной железы, рак печени, легочные карциноиды и карциноиды желудочно-кишечного тракта. Приемлемые пути введения ίη νί\Ό и ίη νίΙΐΌ композиции антител (например, человеческих моноклональных антител, мультиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов) в соответствии с изобретением известны в данной области техники и могут быть выбраны обычным путем. Например, композиции антител могут вводиться путем инъекции (например, внутривенной или подкожной).

Приемлемые дозировки используемых молекул будут зависеть от возраста и веса тела субъекта и концентрации и/или рецептуры композиции антител. Как было описано ранее, человеческие антиСАЭМ1 антитела в соответствии с изобретением могут вводиться вместе с одним или более терапевтическими агентами, например, цитотоксическим агентом, радиотоксическим агентом или иммуносупрессивным агентом. Антитело может быть связано с этим агентом (в виде иммунного комплекса) или может вводиться отдельно от него. В последнем случае (раздельное введение) антитело может вводиться перед, после или вместе с агентом или может использоваться вмести с другими известными способами терапии, например, противораковой терапией, например, облучением. Такие терапевтические агенты включают, среди других, антинеопластические агенты, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, блеомицин сульфат, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамид мочевину, которые сами по себе являются эффективными только при уровнях, которые являются токсичными или субтоксичными для пациента. Цисплатин вводится внутривенно при дозе 100 мг/кг один раз в четыре недели, адриамицин вводится внутривенно при дозе 60-75 мг/мл один раз через 21 день. Совместное введение человеческого анти-САЭМ1 антитела или его связывающих фрагментов в соответствии с данным изобретением с химиотерапевтическими агентами обеспечивает два противораковых агента, которые действуют с помощью отличных механизмов, что оказывает цитотоксическое влияние на опухолевые клетки человека. Такое совместное введение может также решать проблемы, которые возникают благодаря развитию стойкости к лекарственным средствам или изменению антигенности опухолевых клеток, что обеспечивает отсутствие реактивности в отношении антитела. Специфические для мишени эффекторные клетки, например, эффекторные клетки, связанные с композициями (например, человеческие антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы) в соответствии с изобретением, могут также использоваться как терапевтические агенты. Эффекторные клетки для нацеливания могут представлять собой человеческие лейкоциты, такие как макрофаги, нейтрофилы или моноциты. Другие клетки включают эозинофилы, клетки естественных киллеров и другие клетки, которые несут ^О- или ^А-рецептор. Если это необходимо, то эффекторные клетки могут быть получены от субъекта, которого лечат. Специфические для мишени эффекторные клетки могут вводиться как суспензия клеток в физиологически приемлемом растворе. Количество клеток, которые вводится, может составлять 10⁸-10⁹, однако будет зависеть от терапевтической цели. В общем случае их количество должно быть достаточным для обеспечения локализации в целевой клетке, например, в опухолевых клетках, которые экспрессируют САЭМ1, для того чтобы вызвать их уничтожение с помощью, например, фагоцитоза. Пути введения также могут варьировать.

Терапия при использовании специфических для мишени эффекторных клеток может быть проведена в сочетании с другими методиками подавления целевых клеток. Например, противоопухолевая терапия при использовании композиций (например, человеческих антител, мультиспецифических и биспецифических молекул) в соответствии с изобретением и/или эффекторных клеток, которая осуществляется с помощью этих композиций, может использоваться в сочетании с химиотерапией. Кроме того, комбинированная иммунотерапия может заключаться в использовании двух различных популяций цитоток- 50 028336 сических эффекторных клеток для удаления опухолевых клеток. Например, анти-САОМ1 антитела, связанные с анти-Рс-гамма К1 или анти-СПЗ, могут использоваться в сочетании со связывающими агентами, специфическими для 1§О- или 1§А-рецепторов.

Биспецифические и мультиспецифические молекулы в соответствии с изобретением могут также использоваться для модуляции уровней Рсуг или Рсуг эффекторных клетках, например, путем кеппирования или устранения рецепторов на поверхности клеток. Смеси анти-Рс рецепторов могут также использоваться с этой целью. Композиции (например, человеческих, гуманизированных или химерных антител, мультиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов) в соответствии с изобретением, которые имеют сайты связывания комплемента, такие как фрагменты 1дО1, -2 или -З или 1дМ, которые связывают комплемент, также могут использоваться. В одном из воплощений обработка ех У1уо популяции клеток, которые включают целевые клетки, с помощью связывающего агента в соответствии с изобретением и приемлемых эффекторных клеток может дополняться добавлением комплемента или сыворотки, которая содержит комплемент. Фагоцитоз целевых клеток, покрытых связывающим агентом в соответствии с изобретением, может быть улучшен путем связывания белков комплемента. В другом воплощении целевые клетки, покрытые при использовании композиции (например, человеческих антител, мультиспецифических и биспецифических молекул) в соответствии с изобретением, могут также лизировать с помощью комплемента. Еще в одном воплощении композиции в соответствии с изобретением не инактивируют комплемент.

Композиции (например, человеческих, гуманизированных или химерных антител, мультиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов) в соответствии с изобретением могут также вводиться вместе с комплементом. Некоторых варианты осуществления изобретения охватывают композиции, которые включают человеческие антитела, мультиспецифические или биспецифические молекулы и сыворотку или комплемент. Эти композиции предпочтительны, когда комплемент размещается в непосредственной близости к человеческим антителам, мультиспецифическим или биспецифическим молекулам. Альтернативно, человеческие антитела, мультиспецифические или биспецифические молекулы в соответствии с изобретением и комплемент или сыворотка могут вводиться отдельно. Наборы, которые также входят в объем данного изобретения, включают композиции антител в соответствии с изобретением (например, человеческие антитела, биспецифические или мультиспецифические молекулы или иммуноконъюгаты) и инструкции по их применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммуносупрессивный реагент, цитотоксический агент или радиотоксический агент, или одно или более дополнительных человеческих антител в соответствии с изобретением (например, человеческое антитело, которое имеет комплементарную активность, которое связывается с эпитопом в САЭМ1 антигене, отличное от первого человеческого антитела).

В соответствии с этим пациентам, которые лечатся при использовании композиции антитела в соответствии с изобретением, могут дополнительно вводиться (перед, одновременно с или после введения человеческого антитела в соответствии с данным изобретением) другие терапевтические агенты, такие как цитотоксический или радиотоксический агент, который улучшает или расширяет терапевтический эффект человеческого антитела.

В других воплощениях субъект может подвергаться дополнительному лечению при использовании агента, который модулирует, например, улучшает или ингибирует экспрессию или активность Рсγ или Рсγ рецепторов, путем, например, лечения субъекта при использовании цитокина. Предпочтительные цитокины для введения во время лечения с помощью мультиспецифических молекул включают колониестимулирующий фактор гранулоцитов (О-СЗР), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (ОМ-СЗР), интерферон-γ (ΣΤΉ-γ) и фактор некроза опухолей (ТКР).

Композиции (например, человеческих антител, мультиспецифических и биспецифических молекул) в соответствии с изобретением могут также использоваться для нацеливания на клетки, которые экспрессируют РсγК или САЭМ1, например, для мечения таких клеток. Для такого применения связывающей агент может связываться с молекулой, которая затем обнаруживается. Таким образом, изобретение относится к способам определения местонахождения ех У1уо или ш уйго клеток, которые экспрессируют Рс рецепторы, такие как РсγК или САЭМ1. Способная к обнаружению метка может представлять собой, например, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. В другом варианте воплощения изобретение относится к способам определения присутствия САЭМ1 антигена в образце или измерению количества САЭМ1 антигена, который включает контактирование образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с САЭМ1, в условиях, которые приводят к образованию комплекса между антителом или его фрагментом и САЭМ1. Потом выявляют комплекс, где отличие в образовании комплекса между образцом по сравнению с контрольным образцом указывает на присутствие САЭМ1 антигена в образце. В других воплощениях изобретение относится к способам лечения опосредованного САЭМ1 расстройства у субъекта, например, различных видов рака человека, включая мелкоклеточный рак легких, различные нейроэндокринные виды рака, включая такие как рак легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени, поджелудочной железы (включая инсулиномы и

- 51 028336 глюкагономы), и карциноидные опухоли, включая такие как опухоли поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени или почек.

Еще в одном воплощении иммуноконъюгаты в соответствии с изобретением могут использоваться для доставки соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуносупрессантов и т.п.) на клетки, которые имеют САЭМ1 рецептор на поверхности клеток, путем связывания таких соединений с антителом. Например, анти-САОМ1 антитело может быть конъюгировано с любым соединением токсина, описанным в патентах США № 6281354 и 6548530, патентных публикациях США 20030050331, 20030064984, 20030073852 и 20040087497 или в публикации №О 03/022806. Таким образом, изобретение также относится к способам определения местонахождения ех утуо или ш утуо клеток, которые экспрессируют САОМ1 (например, с помощью, радиоизотопа, флуоресцентного соединения, фермента или кофактора фермента). Альтернативно, иммуноконъюгаты могут использоваться для уничтожения клеток, которые имеют САОМ1 рецепторы на поверхности клеток, путем нацеливания цитотоксинов или радиотоксинов на САОМ1. Данное изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не должны ограничивать изобретение. Содержание всех фигур и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, которые приводятся в этом описании, введено в данную заявку в только качестве ссылки.

Примеры

Пример 1. Получение человеческих моноклональных антител против САОМ1 антигена

Рекомбинантный слитый белок, который состоит из внеклеточного домена САОМ1 (САОМ1 ЕСЭ), связанного с полипептидом, отличным от САОМ1 (Ыз белок) (8ЕО ГО ΝΟ: 44) получали с помощью стандартных рекомбинантных способов и использовали как антиген для иммунизации (см. ниже).

Трансгенные мышиные линии НитАЬ Моизе® и КМ Моизе®

Полноразмерные человеческие моноклональные антитела к САОМ1 получали при использовании Нсо7 и Нсо27 трансгенных линий НитАЬ Моизе® и КМ трансгенных трансхромосомных мышей, каждая с которых экспрессирует гены человеческого антитела. В каждой из этих линий мышей эндогенный ген мышиной легкой цепи каппа был гомологично нарушен так, как описано у СЬеп и др. (1993) ЕМВО I. 12: 811-820, а ген мышиной тяжелой цепи был гомологично нарушен так, как описано в Примере 1 публикации РСТ \УО 01/09187. Каждая из этих мышиных линий несет трансген человеческой цепи каппа, Ксо5, как описано у Р1зЬМ1й и др. (1996) №1иге Вю!есЬпо1оду 14: 845-851. Линия Нсо7 несет Нсо7 трансген человеческой тяжелой цепи, как описывается в патентах США № 5545806; 5625825 и 5545807. Линия Нсо27 несет Нсо27 трансген человеческой тяжелой цепи, как описывается в публикации РСТ \УО 01/09187. Линия КМ Моизе® содержит 8С20 трансхромосому, как описывается в публикации РСТ \УО 02/43478.

НитАЬ и КМ иммунизации

Для получения полноразмерного человеческого моноклонального антитела к САОМ1, НитАЬ мышей линий Нсо7, Нсо27 и КМ Моизе подвергали иммунизации с помощью очищенного рекомбинантного САОМ1-Есй-Ыз белка. Общие схемы иммунизации этих мышей являются описанными у ЬопЬегд, Ν. и др. (1994) №1иге 368 (6474): 856-859; ПзЬ^Пй, Ό. и др. (1996) №Циге Вю!есЬпо1оду 14: 845-851 и публикации РСТ \УО 98/24884. Мыши были в возрасте 6-16 недель при первой иммунизации антигеном. Очищенный рекомбинантный препарат (5-50 мкг) САОМ1-Есй-Ыз белка использовали для иммунизации линий НитАЬ и КМ тоизе®.

Трансгенных мышей иммунизировали при использовании антигена в КЫ адъюванте или интраперитонеально (ΙΡ), или подкожно (8с), или в подушечку стопы (ΡΡ) с 3-21 дневными интервалами (в общем количестве вплоть до 9 иммунизации). Осуществляли мониторинг иммунного ответа путем ретроорбитальных заборов крови. Плазму крови подвергали скринингу при использовании ЕЫ8А (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами анти-САОМ1 человеческого иммуноглобулина использовали для вливаний. Мышей подвергали внутривенной стимуляции с помощью антигена за 3 и 2 дня перед забиванием и удаляли селезенку. Типично, осуществляли 10-20 вливаний для каждого антигена. Несколько сотен мышей иммунизировали с помощью каждого антигена.

Селекция НитАЬ Моизе® или КМ Моизе® животных, которые продуцируют анти-САОМ1 антитела

Для отбора НитАЬ Моизе® или КМ Моизе® животных, которые продуцируют антитела, связывающие САОМ1, сыворотку от иммунизированных мышей анализировали при использовании ЕЫ8А, как описано Р1зЬМ1й, Ό. и др. (1996) (выше). Кратко, микротитровальные планшеты покрывали очищенным рекомбинантным САОМ1 в концентрации 1-2 мкг/мл в ΡΒ8, 50 мкл/ячейка инкубировали при 4°С на протяжении ночи, а потом блокировали при использовании 200 мкл/ячейка 5% куриной сывороткой в ΡΒ8/Твин (0,05%). Разведения плазмы крови, полученной от иммунизированных САОМ1 животных, прибавляли к каждой ячейке и инкубировали на протяжении 1-2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали смесью ΡΒ8/Твин и потом инкубировали с козьим античеловеческим 1§0Рс поликлональным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (НКЛ), на протяжении 1 ч при комнатной температуре. После промывания планшеты проявляли при использовании АВТ8 субстрата (Мозз 1пс., про- 52 028336 дукт: ΑΒΤδ-1000) и анализировали спектрофотометрически при ΟΌ 415-495 нм. Мышей, которые имели наивысшие титры анти-СΑ^Μ1 антитела, использовали для вливаний. Вливание проводили так, как описано ниже, и гибридомные супернатанты анализировали на анти-СΑ^Μ1 активность при использовании ΕΜδΑ и ΡЛСδ.

Получение гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела к СЛ^Μ1

Мышиные спленоциты, выделенные из ΗитЛЬ тοи5е® и/или ΚΜ тοи5е®, сливали с клетками мышиной миеломной линии при использовании электрослияния в электрическом поле с помощью нестандартного электропоратора для слияния СуГО Ри1ке с большой камерой (СуГО Ри1ке δ^ιη^κ, 1пс., С1ег1 Βηγι^, ΜΌ). Кратко, суспензии единичных клеток лимфоцитов селезенки, полученные от иммунизированных мышей, сливали с равным количеством δρ2/0 несекретирующих клеток мышиной миеломы (АТСС, СКЬ 1581). Клетки высаживали при плотности приблизительно 2х10⁴/ячейка в микротитровальные планшеты с плоским дном, которые потом инкубировали в селективной среде, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 10% Р388Э1 (АТСС, СКЬ ΤΙΒ-63) кондиционной среды, 3-5% оригена (ΙΟΕΝ) в ДМЕМ (Μеά^аίесй, СКЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия) плюс 5 мМ ΗΕРΕδ, 0, 055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мг/мл гентамицина и 1х ΗΑΤ (δίβΐη;·!, СКЬ Р7185). Через 1-2 недели клетки переносили для культивирования в среду, в которой ΗΑΤ был заменен на НТ. Приблизительно через 10-14 дней после посева клеточные супернатанты из индивидуальных ячеек подвергали скринингу на содержание человеческого д, к антитела. Супернатанты, которые оказались положительными в отношении человеческого д, к, потом последовательно подвергали скринингу с помощью ΕΟδΑ и ΡЛСδ (описывается выше) на человеческие анти-СΑ^Μ1 моноклональные 1дО антитела. Гибридомы, которые секретируют антитело, переносили в планшеты с 24 ячейками, снова подвергали скринингу, и все еще положительные на человеческие анти-СΑ^Μ1 1дО моноклональные антитела, субклонировали по крайней мере дважды путем предельного разведения. Стабильные субклоны потом культивировали ίη νίίτο для получения небольших количеств антитела в среде для культуры тканей для дальнейшего исследования. Гибридомные клоны РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3, полученные из ΚΜ Μοи5е®, отбирали для дальнейшего анализа.

Пример 2. Структурная характеристика человеческих моноклональных антител РТА021_А1, РТА021_А2 или РТА021^3

Получали последовательности кДНК, которые кодируют вариабельные участки тяжелой и легкой цепей РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 моноклональных антител из РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 гибридом соответственно, при использовании стандартных методик ПЦР и секвенировали при использовании стандартных методик секвенирования ДНК.

Последовательности антител могут изменяться для возвращения к эмбриональным остаткам в одном или более положениях. Например, РТА021_А1 вариабельный участок тяжелой цепи может изменяться для соответствия эмбриональной последовательности в специфических сайтах (например, остаток 30) и для удаления сайтов гликозилирования (например, Ν30Ο мутации).

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021А1 представлены на фиг. 1А и в последовательностях δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 19 и 25 соответственно.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021А1 представлены на фиг. 1В и в последовательностях δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 28 и 22 соответственно.

Сравнение последовательности РТА021_А1 тяжелой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой тяжелой цепи эмбрионального иммуноглобулина показывает, что тяжелая цепь РТА021_А1 содержит ν_Η сегмент из человеческого эмбрионального ν_Η 2-05, Ό сегмент из человеческого эмбрионального 6-6 и Ш сегмент из человеческого эмбрионального Ш 5Ь. Выравнивание РТА021А1 ν_Η последовательности с эмбриональной ν_Η 2-05 последовательностью представлено на фиг. 4. Дополнительный анализ СОК участков РТА021А1 νΗ последовательности при использовании Кабат системы позволил установить границы СЭКЕ СЭР2 и С.Н3 участков тяжелой цепи, как показано в фиг. 1А и 4 и в последовательностях δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, 4 и 7 соответственно.

Сравнение последовательности РТА021_А1 легкой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой легкой цепи эмбрионального иммуноглобулина показывает, что легкая цепь РТА021_А1 содержит ν_κ сегмент из человеческого эмбрионального ν_κ Ь15 и Ж сегмент из человеческого эмбрионального Ж 4. Выравнивание РТА021А1 ν_κ последовательности с эмбриональной ν_κ Ь15 последовательностью представлено на фиг. 7. Дополнительный анализ СОК участков РТА021_А1 ν_κ последовательности при использовании Кабат системы позволил установить границы СОК1, СЭР2 и СЭ3 участков легкой цепи, как показано на фиг. 1В и 7 и в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 10, 13 и 16 соответственно.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021_А2 представлены на фиг. 2А и в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 26 и 20 соответственно.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021_А2 представлены на фиг. 2В и в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 29 и 23 соответственно. Сравнение последовательности РТА021_А2 тяжелой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой тяжелой цепи эмбрионального иммуноглобулина показало, что тяжелая цепь РТА021_А2 содержит νΗ

- 53 028336 сегмент из человеческого эмбрионального ν_Η 2-05, Ό сегмент из человеческого эмбрионального 6-6 и ΤΗ сегмент с человеческого эмбрионального ΤΗ 5Ь. Выравнивание РТА021_А2 νΗ последовательности с эмбриональной ν_Η 2-05 последовательностью представлено на фиг. 5. Дополнительный анализ СОК участков РТА021_А2 νΗ последовательности при использовании Кабат системы позволил установить границы СОК1, СОК2 и СО3 участков тяжелой цепи, как показано в фиг. 2А и 5 и в последовательностях δΕρ ГО N0: 2, 5 и 8 соответственно.

Сравнение последовательности РТА021_А2 легкой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой легкой цепи эмбрионального иммуноглобулина демонстрирует, что легкая цепь РТА021_А2 содержит ν_κ сегмент человеческого эмбрионального ν_κ Ь15 и ДК сегмент человеческого эмбрионального ТК 4. Выравнивание РТА021_А2 ν_κ последовательности с эмбриональной ν_κ Ь15 последовательностью представлено на фиг. 8. Дополнительный анализ СОК участков РТА021_А2 ν_κ последовательности при использовании Кабат системы позволяет установить границы СОК1, СОК2 и СО3 участков легкой цепи, как показано на фиг. 2В и 8 и в δΕρ ГО N0: 11, 14 и 17 соответственно.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка тяжелой цепи РТА021_А3 представлены на фиг. 3А и в δΕρ ГО N0: 27 и 21 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного участка легкой цепи РТА021_А3 представлены на фиг. 3В и в δΕρ ГО N0: 30 и 24 соответственно. Сравнение последовательности РТА021_А3 тяжелой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой тяжелой цепи эмбрионального иммуноглобулина показывает, что тяжелая цепь РТА021_А3 содержит ν_Η сегмент человеческого эмбрионального ν_Η 2-05, О сегмент человеческого эмбрионального 6-6 и ΤΗ сегмент человеческого эмбрионального ΤΗ 5Ь. Выравнивание РТА021_А3 ν_Η последовательности с эмбриональной ν_Η 2-05 последовательностью представлено на фиг. 6. Дополнительный анализ СОК участков РТА021_А3 ν_Η последовательности при использовании Кабат системы позволяет установить границы СОК1, СОК2 и СО3 участков тяжелой цепи, как показано в фиг. 3А и 6 и на последовательностях δΕρ ГО N0: 3, 6 и 9 соответственно.

Сравнение последовательности РТА021_А3 легкой цепи иммуноглобулина с известными последовательностями человеческой легкой цепи эмбрионального иммуноглобулина показывает, что легкая цепь РТА021_А3 содержит ν_κ сегмент человеческого эмбрионального ν_κ Ь15 и ТК сегмент человеческого эмбрионального ТК 4. Выравнивание РТА021_А3 ν_κ последовательности с эмбриональной ν_κ Ь15 последовательностью представлено на фиг. 9. Дополнительный анализ СОК участков РТА021_А3 ν_κ последовательности при использовании Кабат системы позволяет установить границы СОК1, СОК2 и С03 участков легкой цепи, как показано на фиг. 3В и 9 и в δΕρ ГО N0: 12, 15 и 18 соответственно.

Пример 3. Характеристика связывающих свойств САОМ1 моноклональных антител

Исследование с помощью проточной цитометрии

В этом примере связывание с САОМ1 моноклональных антител РТА021_А1, РТА021_А2, РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РТА021_А3 (ИР), которая находится на поверхности клеток, исследовали с помощью проточной цитометрии. Для исследования способности антител связываться с белком САОМ1 поверхности клеток, антитела инкубировали с разными клетками, которые экспрессируют САОМ1: N0^69 (обозначение АТСС НТВ-119™), клеточной линией человеческого мелкоклеточного рака легких; ^Μδ79 (обозначение АТСС СКР-2049™), клеточной линией человеческого мелкоклеточного рака легких; δΚ0ν3 (обозначение АТСС НТВ-77™), клеточной линией человеческого рака яичника А549 (обозначение АТСС ССЬ-185™), клеточной линией человеческого немелкоклеточного рака легких; δкΜе128 (обозначение АТСС НТВ-72™), клеточной линией людской меланомы и 786-0 (обозначение АТСС СКР-1932™), клеточной линией человеческой ренальной карциномы. Для исследований на основе проточной цитометрии РТА021 А1, РТА021_А2, РТА021_А3 и РТА021_А3 (ЫР) моноклональные антитела разводили с помощью холодного 1 х ΡΒδ + 0,1% ΒδА в концентрации 40 мкг/мл. Для реакции связывания 50 мкл разбавленного раствора антитела прибавляли к 50 мкл клеточной суспензии, которая содержит 4х10⁵ клеток, и смесь инкубировали на льду на протяжении 30-60 мин. Потом клетки трижды промывали 1 х ΡΒδ + 0,1% ΒδА. Добавляли разведённый 1:50 меченный К-фикоэритрином козьий античеловеческий 1дС Ру Р(аЬ)₂ фрагмент (Тасккоп 1ттипоге8еагск ЬаЬк, кат. номер 109-116-098), и смесь инкубировали на льду на протяжении 1 ч, после этого клетки дважды промывали холодной смесью 1 х ΡΒδ + 0,1% ΒδА. После заключительного промывания прибавляли 200 мкл холодной смеси 1 х ΡΒδ + 0,1% ΒδА к каждому раствору и анализ связывания антитела проводили с помощью РАСδ.

Фиг. 10 и табл. 1, которая приведена ниже, показывают результаты анализа при использовании проточной цитометрии и значение ЕС₅₀ при связывании с клеточной линией N01-469. Результаты демонстрируют, что все три моноклональных антитела эффективно связываются с САОМ1 человека, которая находится на поверхности клеток.

- 54 028336

Таблица 1. Связывание анти-САОМ! антител с клетками, которые экспрессируют человеческую СА0М1

Антитело	ΝΟΙ-Η69 клетки ЕС50 (нМ)
РТА021 А1	0,588
РТА021 А2	0,667
РТА021 АЗ	0,6742

На фиг. 11А и 11В приведены результаты анализа N0^69 и ИМ879 клеточных линиях мелкоклеточного рака легких с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 12 демонстрирует результаты анализа антител РТА021_А3 и 8Κ0ν3 клеточной линии рака яичника с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 13 демонстрирует результаты анализа антител РТА021_А3 и А549 клеточной линии немелкоклеточного рака легких с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 14 демонстрирует результаты анализа антител РТА021_А3 и 786-0 клеточных линий ренальной карциномы и 8кМе128 меланомы с помощью проточной цитометрии. Результаты фиг. 11-14 демонстрируют, что РТА021_А3 эффективно связывается с человеческой САЭМ1 на поверхности клеток в различных клетках, которые экспрессируют СА0М1.

Фиг. 15 демонстрирует результаты анализа нефукозилированного варианта РТА021_А3 (ЫР) и клеточных линий N0^69 и ИМ879 мелкоклеточного рака легких на основе проточной цитометрии. Эти результаты демонстрируют, что отсутствие фукозилирования не влияет на связывание РТА021_А3 с СА0М1 человека, которая находится на поверхности клеток.

Пример 4. Зависимая от антител клеточная цитотоксичность, опосредованная анти-СЛ^М1 моноклональными антителами

Для определения способности анти-СЛ^М1 моноклональных антител уничтожать клетки, которые экспрессируют САИМС в присутствии эффекторных клеток с помощью зависимой от антител клеточной цитотоксичности (АЭСС), в качестве целевых клеток использовали две клеточные линии, N0^69 и ИМ879. Человеческие эффекторные клетки получали из цельной крови так, как описано ниже. Мононуклеарные клетки периферической крови человека очищали из цельной гепаринизированной крови путем стандартного выделения при использовании фикол-пака. Клетки ресуспендировали в РРМ11640 среде, которая содержит 10% РВ8 (инактивированной прогреванием) и 200 ед./мл человеческого 1Ь-2 и инкубировали на протяжении ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и четыре раза промывали в культуральной среде и ресуспендировали в концентрации 1х10⁷ клеток/мл. Целевые клетки получали путем инкубации с ВАТИА реагентом (Регкш Е1тег, Ме11ек1еу, МА) при концентрации 2,5 мкл ВАТИА на 1 х 10⁶ целевых клеток/мл на протяжении 20 мин при 37°С. Целевые клетки четыре раза промывали, центрифугировали и доводили до получения заключительного объема 1 х 10⁵ клеток/мл.

Целевые клетки подвергали анализу на специфическую для антитела АЭСС человеческого антиСАЭМ1 моноклонального антитела при использовании Эе1Па флуоресцентного излучения так, как описано ниже. N0^69 или ИМ879 клетки (100 мкл меченных целевых клеток, 104 клеток/ячейка) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток (106 клеток/ячейка) и 50 мкл антитела (заключительная концентрация 10 мкг/мл). В экспериментах использовали соотношение целевых и эффекторных клеток, которое составляет 1:25. Во всех исследованиях контроль человеческого 1дС1 изотипа использовали как негативный контроль. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин и инкубировали на протяжении одного часа при 37°С. Потом собирали супернатанты, подвергали их центрифугированию и 20 мкл супернатанта переносили в планшет с плоским дном, к которому прибавляли 180 мкл раствора Ей (Регкш Е1тег, \Уе11ек1еу, МА) и считывали в устройстве для считывания РнЬукйг (ВМС ЬаЫесЬ). Процент лизиса подсчитывали так, как описано ниже: (высвобождение образца - спонтанное высвобождение х 100) / (максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение представляет собой флуоресценцию из ячеек, которые содержат целевые клетки плюс эффекторные клетки, а максимальное высвобождение представляет собой флуоресценцию из ячеек, которые содержат целевые клетки и были обработаны при использовании 2% Тритона-Х.

Результаты подытожены в табл. 2 и фиг. 16А и 16В, которые демонстрируют, что РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 способны специфически индуцировать АИСС в отношении САИМС которая экспрессируется раковыми линиями клеток.

Таблица 2. Зависимая от антитела клеточная цитотоксичность, опосредованная РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 антителами

Антитело	% специфического лизиса: ΝΟΙ-Η69	% специфического лизиса: ΌΜ879
РТА021 А1	24.6 +/- 4.5	37,76 +/-7,8
РТА021 А2	15,9+/- 1,9	34,66+/-3,1
РТА021 АЗ	29,8+/- 1,6	61,0+/-1,5
Контроль изотипа	3.3+/- 4.6	2.96+/-1,9

Пример 5. Интернализация САЭМ1 антитела

Моноклональные антитела РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 подвергаются интернализации

- 55 028336

КС1-Н69 и ЭМ879 клетками при связывании с клетками с использованием Нит-Ζηρ анализа. Нит^ар анализ показал интернализацию анти-САОМ1 моноклональных антител путем связывания античеловеческого 1д0 вторичного антитела, конъюгированного с токсином сапорином. (ЛЖапсеб Тагдебпд 8у5ίет, 8ап О|едо, СА, 1Т-22-100). Сначала РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 связывали с поверхностью КС1-Н69 или ЭМ879 клеток. Потом Нит^ар антитела связывали с первичными антителами. Потом комплекс первичное антитело/Нит^ар подвергали интернализации клетками. Поступление сапорина в клетки приводило к ингибированию синтеза белка и, в результате этого, к гибели клеток. Нит^ар анализ проводили так, как описано ниже. Каждую из линий клеток высевали при плотности 3х10³ на ячейку. Анти-САОМ1 моноклональные антитела или изотипический контроль человеческого 1д0 серийно разводили и потом прибавляли к клеткам. Потом прибавляли Нит^ар при концентрации 2 мкг/мл и планшеты оставляли для инкубации на протяжении 96 ч. Жизнеспособность клеток в планшете определяли с помощью набора для люминесцентного анализа на жизнеспособность клеток Се11Шег-01о®® Ьит1пексеШ (Рготеда, 07571), и планшеты считывали при 490 нм с помощью устройства ПиптотПог (Типег ВюкукЮтк, 8ипп^а1е, СА). Данные анализировали с помощью программы Рпкт (ОгарЬРаб). Гибель клеток была пропорциональна концентрации РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 моноклональных антител.

Фиг. 17А и 17В демонстрируют, что анти-САПМ1 моноклональные антитела соответственно эффективно интернализировались ЭМ879 и КС1-Н69 клетками по сравнению с Ы§01 изотипическим контрольным антителом.

Пример 6. САОМ1 локализуется вместе с ЬАМР1

Моноклональное антитело РТА021_А3 локализуется вместе с ЬАМР1 и, таким образом, интернализируется. РТА021 А3 антитело, которое связывается с КС1-Н69 клетками, промывали и инкубировали при 37°С на протяжении 45 мин. РТА021_А3 антитело отслеживали с помощью меченного Р1ТС античеловеческого антитела. Некоторые клетки были пермибиализированными и окрашивались с помощью античеловеческого ЬАМР1, что определяется с помощью меченного ТК1ТС вторичного антитела.

Результаты показывают, что РТА021_А3 и ЬАМР1 локализуются вместе в эндосомах.

Пример 7. Анти-САПМ1 антитела связываются с раковыми клетками

Анти-САПМ1 моноклональные антитела РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 связываются с человеческими раковыми тканями, включая ткани, которые представляют мелкоклеточный рак легких, нейроэндокринные формы рака поджелудочной железы, рак печени, легочные карциноиды и желудочнокишечные карциноиды. Получали биопсии от раковых пациентов, и антитела использовали для иммуногистохимического окрашивания (СуЮтух, МА). Использовали срезы размером 5 мкм. После высушивания на протяжении 30 мин на препаратах срезы ткани фиксировали при использовании ацетона при комнатной температуре на протяжении 5 мин. Срезы промывали в РВ8 и потом блокировали с помощью свободного от сыворотки белка и пероксидазного блокатора (Эако 82001, СО) и далее инкубировали с комплексом первичного антитела при концентрации 5 мкг/мл на протяжении 45 мин при комнатной температуре. Потом срезы промывали и инкубировали на протяжении 30 мин при использовании конъюгированного с Р1ТС вторичного антитела (1асккоп 1ттипогекеагсЬ ЬаЬ, 109-097-003) и снова промывали с помощью РВ8 и инкубировали с полимерными НКР конъюгатами (Рако, С0, К4063) на протяжении 20 мин. Хромоген (Эако К3464) использовали как субстрат, это приводило к получению коричневой окраски. Срезы помещали в среду Рагатоий Ациеоик Моипйпд (Эако, 83025). РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 продемонстрировали специфическое связывание с опухолевыми клетками всех типов, приведенных выше. При окрашивании с помощью этих моноклональных антител другие органы демонстрируют негативное или неспецифическое окрашивание, включая матку, легкие, печень, почки, толстый кишечник, шейку матки, молочные железы, костный мозг, мозжечок, головной мозг, пищевод, сердце, предстательную железу, плаценту, гипофиз, матку, яичник, мезотелий, миндалевидные железы, кожу, тонкий кишечник, скелетную мускулатуру, желудок, селезенку, тимус и щитовидную железу. Эти данные демонстрируют, что анти-САОМ1 моноклональные антитела РТА021_А1, РТА021_А2 и РТА021_А3 узнают САПМ1, который экспрессируется на опухолях, включая опухоли мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), различные виды нейроэндокринного рака (включая такие поджелудочной железы, легких и желудочно-кишечного тракта), рак печени, легочные карциноиды, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак предстательной железы, рак яичника, почечный и желудочно-кишечные карциноиды. Иммуногистохимия антитела РТА021_А3 в образцах ткани мелкоклеточного рака легких показала 75% преобладание высокого уровня (+++) мембранного окрашивания для всех опухолевых клеток. Иммуногистохимия антитела РТА021_А3 в образцах рака печени показала окрашивание в 75-95% образцов с 45% опухолей, которые продемонстрировали высокий уровень (+++) мембранного окрашивания для всех опухолевых клеток. Дополнительные исследования на РТА021_А3 были выполнены на меньших наборах образцов немелкоклеточного рака легких, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака яичника и карциномы почечных клеток. Преобладание положительного окрашивания в немелкоклеточной карциноме легких, карциноме молочной железы и светлоклеточной почечной карцино- 56 028336 ме составляло ~66%; в карциноме предстательной железы и карциноме яичника преобладание составляло 100%, а колоректальная аденокарцинома показала положительное окрашивание в 17% образцов. Нейроэндокринные опухоли легких, поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта также анализировали при использовании образцов легочных карциноидов и образцов нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, которые продемонстрировали 75% преобладание на нейроэндокринных опухолях желудочно-кишечного тракта, которые показали положительное окрашивание в 65% образцов.

Пример 8. Влияние фукозилированного и нефукозилированного анти-САЭМ1 антитела на опухолевый рост рака печени на мышиной ксенографтной модели

Анализировали влияние РТА021_А3 и нефукозилированного варианта РТА021_А3 (N1) на рост рака печени, который происходит от НерО2 клеток, на мышиной ксенографтной модели. На этой модели 8СГО мышам (СВ17, полученные от СЬаг1е8 КАег ЬаЬога1опе8, НоШ81ег, СА) вводили 2,5 х 10⁶ НерО2 клеток/мышь, и НерО2 клетки выращивали на протяжении приблизительно 30 дней. Потом мышей распределяли произвольным образом и интраперитонеально лечили так, как описано ниже в табл. 3.

Таблица 3. Пропись иммунизации для ксенографтной модели НЕРО2 опухоли

	Доза (антитело мг/кг)	Суточная доза
Носитель		День 0
Изотип ΐ£θ1	10	День 0, 4, 7, 11
Изотип нефукоз. Ι&Ο1	10	День 0, 4, 7, 11
САОМ1 РТА021_А исх. 1<ι(-ΐ 1	10.3	День 0, 4, 7, 11
САОМ1 РТА021_АЗ нефукоз- 1цО1	10,3	День 0, 4, 7, 11
Нексавар Сорафениб	20 (один раз в сутки х 3), 10 перорально	Один раз в сутки х 8, День 0-7

Нексавар Сорафениб, химический множественный ингибитор киназ, который используется для лечения карциномы ренальных клеток и рака, применяли как контроль для целевой терапии.

Как видно из фиг. 18, лечение с помощью РТА021_А3 и РТА021_А3 ОТ¹ антител значительно снижает скорость опухолевого роста, при этом нефукозилированное РТА021_А3 ОТ¹ антитело является наиболее эффективным.

Пример 9. Конъюгат анти-САОМ1 антитело-лекарственное средство ингибирует рост НерО2 клеток на мышиной ксенографтной модели

Исследовали влияние РТА021 А3 конъюгата в соответствии с Формулой М (в данной заявке упоминается как РТА021_А3-формула А конъюгат или РТА021_А3-формула М) на рост карциномы печеночных клеток, которая имеет происхождение от НерО2 клеток, на мышиной ксенографтной модели. На этой модели 8СГО мышам (СВ17, полученные от СЬаг1е8 Кщег ЬаЬога1ог1е8, НоШ81ег, СА) вводили 2,5 х 10⁶ НерО2 клеток/мышь, и НерО2 клетки выращивали в течение приблизительно 30 дней. Потом мышей распределяли произвольным образом и интраперитонеально обрабатывали с помощью конъюгата РТА021_А3-формула М (0,1 или 0,03 мкмоль/кг). ΌΤ и антитело против дифтерийного токсина использовали как контроль несвязанного изотипа. Нексавар Сорафениб, химический множественный ингибитор киназ, который используется для лечения карциномы ренальных клеток и рака, применяли как контроль для целевой терапии.

Как видно из фиг. 19, лечение с помощью конъюгата РТА021_А3-формула М значительно ингибирует скорость опухолевого роста зависимым от дозы образом.

Пример 10. Конъюгат анти-САЭМ1 антитело-лекарственное средство ингибирует рост ИМ§79 клеток на мышиной ксенографтной модели

Исследовали влияние РТА021_А3-формула М на рост мелкоклеточного рака легких, который имеет происхождение от ИМ§79 клеток, на мышиной ксенографтной модели. В этой модели 8СГО мышам (СВ17, полученные от СЬаг1е8 Кщег ЬаЬога1ог1е8, НоШ81ег, СА) вводили 5 х 10⁶ ИМ§79 клеток/мышь, и ИМ§79 клетки выращивали до тех пор, пока средний размер опухоли не достигал значения приблизительно 200 мм³. Потом мышей распределяли произвольным образом и подвергали интраперитонеальной обработке с помощью конъюгата РТА021_А3-формула М в двух исследованиях. Как видно из фиг. 20А, лечение с помощью конъюгата РТА021_А3-формула М при дозе 0,3 мкмоль/кг способствовало полной регрессии опухоли у всех мышей в процессе исследования (День 88). Как видно из фиг. 20В, лечение с помощью конъюгата РТА021_А3-формула М при дозе 0,1 мкмоль/кг привело к регрессии опухоли в процессе исследования, которое заканчивали на 60 день. Более низкая доза 0,03 мкмоль/кг значительно задерживала роста опухоли.

Пример 11. Зависимая от антитела клеточная токсичность, опосредованная РТА021_А3 инефукозилированным РТА021_А3

Флуоресцентный анализ цитотоксичности использовали для определения способности нефукозилированного РТА021_А3 анти-моноклонального антитела уничтожать клетки, которые экспрессируют САЭМ1, в присутствии эффекторных клеток путем зависимой от антитела клеточной токсичности

- 57 028336 (АЭСС при использовании НерС2, 786-0 и ^Μδ79 клеток).

Человеческие эффекторные клетки получали из цельной крови так, как описано ниже. Мононуклеарные клетки периферической крови человека очищали из гепаринизированной цельной крови с помощью стандартного фиколл-пак разделения. Клетки ресуспендировали в среде КРМ11640, которая содержит 10% ΡΒδ (инактивированная прогреванием) и 200 ед./мл человеческого 1Ь-2 и инкубировали на протяжении ночи при 37°С. На следующий день собирали клетки и четыре раза промывали в культуральной среде, и ресуспендировали при плотности 2χ10⁷ клеток/мл. Клетки СНО-мезотелин получали путем инкубации с ВАТЭА реагентом (Регкш Е1тег, ^е11е§1еу, МА) - 2,5 мкл ВАТЭА на 1 χ 10⁶ целевых клеток/мл на протяжении 20 мин при 37°С. Целевые клетки четыре раза промывали, центрифугировали и переносили в заключительный объем 1 χ 10⁵ клеток/мл. НерС2, 786-0 и ^Μδ79 клетки подвергали анализу на специфическую для антитела АЭСС относительно человеческого анти-САОМ1 РТА021 А3 моноклонального антитела и нефукозилированного препарата РТА021_А3 при использовании Эе1Па анализа излучения флуоресценции так, как описано ниже. НерС2, 786-0 или ^Μδ79 (100 мкл меченных целевых клеток, 10⁴ клеток/ячейка) инкубировали с 5 мкл эффекторных клеток (10⁶ клеток/ячейка) и 5 мкл антитела (10 мкг/мл заключительной концентрации). Во время эксперимента использовали соотношение целевых к эффекторным клеткам 1:100. Во всех исследованиях контроль человеческого 1дС1 изотипа использовали как негативный контроль. Клетки центрифугировали при 2000 об./мин. и инкубировали на протяжении 1 ч при 37°С. Потом собирали супернатанты, подвергали их центрифугированию и 20 мкл супернатанта переносили в планшет с ячейками с плоским дном, к которым прибавляли 18 мкл Ей раствора (Регкш Е1тег, ^е11е§1еу, МА), подвергали считыванию при использовании устройства для считывания КиЬ\Я1аг (ВМС ЬаМесЬ). % лизиса подсчитывали так, как описано ниже: (высвобождение образца - спонтанное выделение χ 100) / (максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение представляет собой флуоресценцию из ячеек, которые содержат целевые клетки плюс эффекторные клетки, а максимальное высвобождение представляет собой флуоресценцию из ячеек, которые содержат целевые клетки и были обработаны при использовании 2% Тритона-Х.

Фиг. 21, 22 и 23 показывают, что как РТА021_А3, так и нефукозилированный РТА021 А3, способны вызвать АЭСС на НерС2, 786-0 и ^Μδ79 клетках и что нефукозилированный РТА021 А3 представляет собой более мощное антитело. Такой же эффект можно наблюдать на клеточных линиях, которые экспрессируют САЭМ1, таких как δΟΈΟ’ линия N0-469.

Пример 12. Анти-САОМ1 антитело/цисплатин ингибирует рост ^Μδ79 клеток на ксенографтной модели мышей

Исследовали влияние РТА021_А3, взятого отдельно, и в комбинации с цисплатином на рост ^Μδ79 клеток, которые имеют происхождение от δΟΈΤ.', на ксенографтной модели мышей. В этой модели δΟΙΌ мышам (СВ17, от СЬаг1е8 КНег ЬаЬогаЮпек, НоШЦег, СА) имплантировали 5 χ 10⁶ ^Μδ79 клеток/мышь и выращивали ^Μδ79 клетки до тех пор, пока опухоль не достигала среднего размера 200 мм³. Потом мышей произвольным образом разделяли на группы и интраперитонеально обрабатывали, как показано на диаграммах, которые отражают объем опухоли. Как видно из фиг. 24, лечение с помощью РТА021_А3, взятого отдельно, задерживает рост опухоли, а в комбинации с цисплатином демонстрирует значимую и синергетическую противоопухолевую активность

Пример 13. Оценка токсичности РТА021_А3ХР, РТА021_А3 и РТА021_А3-формула М

Профиль токсичности анти-САОМ1 антитела, включая нефукозилированные антитела и конъюгаты антитело-лекарственное средство, исследовали на макаках циномолгус при использовании, например, РТА021_А3 и его производных. Результаты ГНС анализа показали, что обезьяны циномолгус и люди обладают подобными моделями экспрессии САЭМ1, когда подвергаются !НС при использовании РТА021_А3. Кроме того, САЭМ1 белок обладает большой идентичностью у обезьян циномолгус и у людей. Использовали множественные внутривенные дозы, например, от 0,1 и 100 мг/кг для определения максимально переносимой дозы с целью выявления доз, приемлемых для клинических опытов у людей.

Экспериментальное токсикологическое исследование проводили на РТА021_А3 и нефукозилированном варианте РТА021_А3(ХР) у макак циномолгус. 8 обезьян циномолгус в возрасте четырех лет, которых раньше лечили (не лечили с помощью биологического средства, однако такие, которых раньше лечили в фармакокинетическом исследовании при использовании малых молекул), использовали для оценки двух самцов и двух самок в каждой группе. Животных группы 1 лечили одной внутривенной (в.в.) дозой 1 мг/кг нефукозилированного РТА021_А3 (ХР) антитела. Животных группы 2 лечили одной внутривенной (в.в.) дозой 1 мг/кг РТА021_А3 антитела.

Проводили клинические наблюдения и дважды в сутки и оценивали смертность/заболеваемость утром и вечером. Анализировали вес тела, гематологические и биохимические показатели крови в дни 11, 0, 1,3,8, 15 и 22. Гематологические анализы включали КВС, НСВ, НСТ, РЬТ, МСН, МСУ, ретикулоциты, \УВС и определение лейкоцитарной формулы. Оценка биохимических показателей крови включала ΑδТ, АЬТ, АЬР, СКЕ, Вин сьи, СН0, ТР, АЬВ, ТВГО, ЬОН, ТС, Са, Р, А/С, К, № и С1.

В результате не было выявлено значимых очевидных изменений (например, относительно пищевого поведения) во время исследования. Не наблюдали видимых эффектов на нейроэндокринные ткани

- 58 028336 (например, гормональных изменений, которые могли бы приводить к изменениям поведения, и признаков расстройств). Не было также выявлено никаких фактов, относящихся к боли и тремору.

Фиг. 25-32 показывают, что все проведенные анализы находились в пределах нормальных ожидаемых значений.

Фиг. 25А и 25В показывают данные веса тела для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 26А и 26В показывают данные, относящиеся к содержанию глюкозы для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 27А и 27В показывают данные, относящиеся каланинтрансаминазе для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 28А и 28В показывают данные, относящиеся к аспартаттрансаминазе для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 29А и 29В показывают данные, относящиеся к щелочной фосфатазе для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 30А и 30В показывают данные, относящиеся к лактатдегидрогеназе для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 31А и 31В показывают данные, относящиеся к содержимому эритроцитов для самцов и самок обезьян соответственно.

Фиг. 32А и 32В показывают данные, касающиеся относительного содержания лейкоцитов для самцов и самок обезьян соответственно.

Пример 14. Оценка эффективности РТА021_А3№', РТА021_А3 и РТА021_А3-формула М

СА0М1 экспрессируется при раке различных типов, что было продемонстрировано с помощью анализа ШС при использовании РТА021_А3 гуманизированного антитела. Линии клеток, которые представляют собой модели раковой опухоли, использовали для демонстрации эффективности для лечения различных видов рака чистого и конъюгированного с токсином анти-СΛ^М1 антитела. Например, РТА021_А3 и его производные использовали самостоятельно или в комбинации со стандартами на моделях эффективности для почечного рака (786-0 клетки), меланомы (§кМе128 клетки) и мелкоклеточного рака легких (ЭМ879 клетки), в которых экспрессируется САОМ1. РТА021_А3 и другие анти-САЭМ1 антитела могут применяться на ксенографтных моделях животных при использовании линий клеток, которые экспрессируют САПМ/ и представляют собой различные виды рака, такие как различные нейроэндокринные виды рака, рак кишечника, рак молочной железы, рак яичника и рак предстательной железы.

Все ссылки, которые упоминаются в данном описании, включая без ограничения все публикации, патенты, патентные заявки, презентации, тексты, рукописи, брошюры, книги, интернет-рассылки, журнальные статьи, периодические издания, информационные листки на продукты и подобные им, приведены в данной заявке в качестве ссылки. Обсуждение ссылок в данной заявке предназначено только для того, чтобы подытожить утверждения, сделанные их авторами. При этом заявители сохраняют за собой право подвергать сомнению точность упомянутых ссылок. Несмотря на то что представленное выше изобретение для ясности и понимания было подробно описано путем иллюстрации, а также с помощью примеров, специалисту в данной области техники понятно в свете приведенного раскрытия изобретения, что могут быть сделаны определенные его изменения и модификации без изменения его сути или объема притязаний.

- 59 028336

Резюме списка последовательностей

$Εςΐϋ N0:	ПОСЛЕДОВА- ТЕЛЬНОСТЬ	5Е<2 ГО ΝΟ:	ПОСЛЕДОВА- ТЕЛЬНОСТЬ
1	νΗ0ϋΚ1 аминокислотная РТА021 А1	23	νκ аминокислотная РТА021 А2
2	νΗ СИП аминокислотная РТА021 А2	24	νκ аминокислотная РТА021 АЗ
3	νΗ СШ11 аминокислотная РТА021 АЗ	25	νΗ нуклеотидная РТА021 А1
4	νΗ С0К2 аминокислотная РТА021 А1	26	νΗ нуклеотидная РТА021_А2
5	νΗ С0К2 аминокислотная РТА021 А2	27	νΗ нуклеотидная РТА021.АЗ
6	УНСОК2 аминокислотная РТАО21 АЗ	28	νκ нуклеотидная РТА021 _А1
7	νΗ СОРЗ аминокислотная РТА021 А1	29	νκ нуклеотидная РТА021_А2
8	νΗ С1ЖЗ аминокислотная РТА021 А2	30	νκ нуклеотидная РТА021.АЗ
9	νΗ СОКЗ аминокислотная РТАО21 АЗ	31	νΗ 2-05 эмбриональная аминокислотная
10	УкСОК1 аминокислотная РТА021 А1	32	νΗ 2-05 эмбриональная аминокислотная
11	УкСОК1 аминокислотная РТА021 А2	33	νΗ 2-05 эмбриональная аминокислотная
12	УкСОК1 аминокислотная РТАО21 АЗ	34	νκί15 эмбриональная аминокислотная
13	νκ СВР 2 аминокислотная РТА021 А1	35	УКЬ15 эмбриональная аминокислотная
14	νκ С0Р2 аминокислотная РТА021 А2	36	νκί15 эмбриональная аминокислотная
15	νκ С0К2 аминокислотная РТА021 АЗ	37	Ун1Н5Ь эмбриональная аминокислотная

16	УкСОКЗ аминокислотная РТА021 А1	38	УНЖ5Ь эмбриональная аминокислотная
17	УкСОРЗ аминокислотная РТА021 А2	39	νΗ ДН5Ъ эмбриональная аминокислотная
18	УкСЦКЗ аминокислотная РТА021 АЗ	40	Ж4 эмбриональная а м инокисл отная
19	νΗ аминокислотная РТА021 А1	41	Ж4 эмбриональная а м инокисл отная
20	νΗ аминокислотная РТА021 А2	42	Ж4 эмбриональная аминокислотная
21	ν„ аминокислотная РТА021 АЗ	43	САЭМ1 конструкция
22	Ук аминокислотная РТА021.А1	44	САОМ1 ЕСЭ6ΗΙ5
		45	Пептидний конъюгат

- 60 028336

Перечень последовательностей

- 61 028336 <210> 11 <211> 11 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <400> 11

Агд А1а Зег 61п 61у Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а 15 10 <210> 12 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 12

Агд А1а Зег 61п 61у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а 15 10 <210> 13 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 13

С1у А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 14

А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 15

А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 16

С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи ТЬг <210> 17 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 17

31п С51п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи ТЬг 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 18

61п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи ТЬг 1 5 <210> 19 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 19

С1п 11е ТЬг Ьеи Ьуз 61и Зег 61у Рго ТЬг Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТЬг 61п

ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег С1у РЬе Зег Ьеи Азп ТЬг Зег 20 25 30

61у Уа1 31у Уа1 61у Тгр 11е Агд 61п Рго Рго 61у Ьуз А1а Ьеи 61и 35 40 45

Тгр Ьеи А1а Ьеи 11е Туг Тгр Аар Аар Аар Ьуз Агд Туг Зег Рго Зег 50 55 60

Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТЬг 11е ТЬг Ьуз Азр ТЬг Зег Ьуз Азп 61п Уа1

Уа1 Ьеи ТЬг МеГ ТЬг Азп МеГ Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг

С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи

ТЬг РЬе С1у С1у <31у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз 100 105 <210> 25 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 25 садаРсассР РдааддадРс РддРссРасд сРддРдааас ссасасадас ссРсасдсРд 60 ассРдсассР РсРсРдддРР сРсасРсааР асРадРддад РдддРдРддд сРддаРссдР 120 садсссссад даааддсссР ддадРддсРР дсасРсаРРР аРРдддасда РдаРаадсдс 180

РасадсссаР сРсРдаадад саддсРсасс аРсассаадд асассРссаа ааассаддРд 240 дРссРРасаа РдассаасаР ддасссрдрд дасасадсса саРаРРасРд Рдсасасадд 300 ададРРдааР дддРсдсссР ддсадддаас РддРРсдасс ссРддддсса дддаасссРд 360 дРсассдРсР ссРса 375 <210> 26 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 26

садаРсассР	РдааддадРс	РддРссРасд	сРддРдааас	ссасасадас	ссРсасдсРд	60
ассРдсассР	РсРсРдддРР	сРсасРсадс	асРадРддад	РдддРдРддд	сРддаРссдР	120
садсссссад	даааддсссР	ддадРддсРР	дсасРсаРРР	аРРдддаРда	РдаРаадсдс	180
РасадсссаР	сРсРдаадад	саддсРсасс	аРсассаадд	асассРссаа	ааассаддРд	240
дРссРРасаа	РдассаасаР	ддасссрдрд	дасасадсса	РаРаРРасРд	Рдсдсасадд	300
ададРРдадР	ддРРсдсссР	ддсадддаас	РддРРсдасс	ссРддддсса	дддаРсссРд	360
дРсассдРсР	ссРса					375

<210> 27 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 27 садаРсассР РдааддадРс РддРссРасд сРддРдааас ссасасадас ссРсасдсРд ассРдсассР РсРсРдддРР сРсасРсадР асРадРддад РдддРдРддд сРддаРссдР садсссссад даааддсссР ддадРддсРР дсасРсаРРР аРРдддасда РдаРаадсдс

120

180

- 64 028336

ЕасадсссаЕ сЕсЕдаадад саддсЕсасс аЕсассаадд асассЕссаа ааассаддЕд дЕссЕЕасаа ЕдассаасаЕ ддасссЕдЕд дасасадсса саЕаЕЕасЕд Едсасасадд ададЕЕдадЕ дддЕсасссЕ ддсадддаас ЕддЕЕсдасс ссЕддддсса дддаасссЕд дЕсассдЕсЕ ссЕса <210> 28 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зарйепз <400> 28 дасаЕссада ЕдасссадЕс ЕссаЕссЕса сЕдЕсЕдсаЕ сЕдЕаддада сададЕсасс аЕсасЕЕдЕс дддсдадЕса дддЕаЕЕадс адсЕддЕЕад ссЕддЕаЕса дсадааасса дадааадссс сЕаадЕсссЕ даЕсЕаЕддЕ дсаЕссадЕЕ ЕдсааадЕдд ддЕсссаЕса аддЕЕсадсд дсадЕддаЕс ЕдддасадаЕ ЕЕсасЕсЕса ссаЕсадсаа ссЕдсадссЕ даадаЕЕЕЕд саасЕЕаЕЕа сЕдссаасад ЕаЕааЕадЕЕ асссЕсЕсас ЕЕЕсддсдда дддассаадд ЕддадаЕсаа а <210> 29 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 29 дасаЕссада ЕдасссадЕс ЕссаЕссЕса сЕдЕсЕдсаЕ сЕдЕаддада сададЕсасс аЕсасЕЕдЕс дддсдадЕса дддЕаЕЕадс адсЕддЕЕад ссЕддЕаЕса дсадааасса дадааадссс сЕаадЕсссЕ даСсЕаЕдсЕ дсаЕссадЕЕ ЕдсааадЕдд ддЕсссаЕса аддЕЕсадсд дсадЕддаЕс ЕдддасадаЕ ЕЕсасЕсЕса ссаЕсадсад ссЕдсадссЕ даадаЕЕЕЕд саасЕЕаЕЕа сЕдссаасад ЕаЕааЕадЕЕ асссЕсЕсас ЕЕЕсддсдда дддассаадд ЕддадаЕсаа а <210> 30 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 30 дасаЕссада ЕдасссадЕс ЕссаЕссЕса сЕдЕсЕдсаЕ сЕдЕаддада сададЕсасс аЕсасЕЕдЕс дддсдадЕса дддЕаЕЕадс адсЕддЕЕад ссЕддЕаЕса дсадааасса дадааадссс сЕаадЕсссЕ даЕсЕаЕдсЕ дсаЕссадЕЕ ЕдсааадЕдд ддЕсссаЕса аддЕЕсадсд дсадЕддаЕс ЕдддасадаЕ ЕЕсасЕсЕса ссаЕсадсаа ссЕдсадссЕ даадаЕЕЕЕд саасЕЕаЕЕа сЕдссаасад ЕаЕааЕадЕЕ асссЕсЕсас ЕЕЕсддсдда дддассаадд ЕддадаЕсаа а <210> 31 <211> 100 <212> РКТ <213> Ното зартепз

240

300

360

375

120

180

240

300

321

120

180

240

300

321

120

180

240

300

321

С1п Не ТЬг Деи Дуз С1и Зег С1у Рго ТЬг Деи Уа1 Дуз Рго ТЬг С1п

ТЬг Деи ТЬг Деи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег С1у РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Зег

С1у Уа1 С1у Уа1 С1у Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз А1а Ьеи С1и

Тгр Деи А1а Деи 11е Туг Тгр Азп Азр Азр Дуг Агд Туг Зег Рго Зег

Деи Дуз Зег Агд Ьеи ТЬг 11е ТЬг Ьуз Азр ТЬг Зег Ьуз Азп 31п Уа1

Уа1 Деи ТЬг МеЕ ТЬг Азп МеЕ Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг

Суз А1а Нтз Агд 100 <212> РРТ <213> Ното зартепг <400> 32

С1п 11е ТЬг Деи Дуз С1и Зег С1у Рго ТЬг Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1п

ТЬг Деи ТЬг Деи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег С1у РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Зег

С1у Уа1 С1у Уа1 С1у Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз А1а Ьеи С1и

Тгр Деи А1а Деи 11е Туг Тгр Азп Азр Азр Дуз Агд Туг Зег Рго Зег

Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТЬг Не ТЬг Ьуз Азр ТЬг Зег Ьуз Азп С1п Уа1

Уа1 Ьеи ТЬг МеЕ ТЬг Азп МеЕ Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг

Суз А1а ΗΪ5 Агд 100 <210> 33 <211> 100 <212> РРТ <213> Ното зартепз <400> 33

С1п 11е ТЬг Ьеи Ьуз С1и Зег С1у Рго ТЬг Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1п

ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг Суз ТЬг РЬе Зег С1у РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Зег

С1у Уа1 С1у Уа1 С1у Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз А1а Ьеи С1и

Тгр Ьеи А1а Ьеи 11е Туг Тгр Азп Азр Азр Ьуз Агд Туг Зег Рго Зег

Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТЬг 11е ТЬг Ьуз Азр ТЬг Зег Ьуз Азп С1п Уа1

Уа1 Ьеи ТЬг МеЕ ТЬг Азп МеЕ Азр Рго Уа1 Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг

Суз А1а ΗΪ5 Агд 100 <210> 34 <211> 95 <212> РРТ <213> Ното зартепз <400> 34

Азр 11е С1п МеЕ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр

Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у

Зег 31 у Зег 31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 31п Рго

31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго <210> 35 <211> 95 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 35

Азр 11е 31п МеЕ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр

Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 31 у

Зег 31у Зег 31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 31п Рго

31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 31п 31п Туг Азп Зег Туг Рго <210> 36 <211> 95 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 36

Азр 11е 31п МеЕ ТЬг 31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 31у

Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег (31п (31у 11е Зег Зег Тгр

20

25

30

Ьеи А1а

Тгр

Туг (31 п

(31 п

Ьуз

Рго

<31и

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Зег

Ьеи

11е

35

40

45

Туг А1а

А1а

Зег Зег

Ьеи

<31п

Зег

(31 у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

<31 у

50

55

60

Зег <31 у

Зег

<31у ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

<31 п

Рго

65

70

75

80

<31и Авр

РЬе

А1а ТЬг

Туг

Туг

Суз

<31 п

<31 п

Туг

Азп

Зег

Туг

Рго

85

90

95

<210>

37

<211>

16

<212>

РРТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

37

Азп Тгр

РЬе

Азр Рго

Тгр

<31 у

<31 п

<31 у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

1

5

10

15

<210>

38

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

заргепз

<400>

38

Авп Тгр

РЬе

Азр Рго

Тгр

<31 у

<31 п

<31 у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

1

5

10

15

<210>

39

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

39

Азп Тгр

РЬе

Азр Рго

Тгр

<31 у

<31 п

<31 у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

1

5

10

15

<210>

40

<211>

12

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

40

Ьеи ТЬг

' РЬе

(31у <31у

<31 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

<31 и

11е

Ьуз

1

5

10

<210>

41

<211>

12

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

41

Ьеи ТЬг

• РЬе

<31у <31у

<31 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

<31 и

11е

Ьуз

1

5

10

<210>

42

<211>

12

<212>

РКТ

<213>

Ното

заргепз

<400>

42

Ьеи ТЬг

• РЬе

<31у <31у

<31 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

(31 и

11е

Ьуз

1

5

10

<210>

43

<211>

387

<212>

РРТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

43

МеС Агд

• А1а

Тгр 11е

РЬе

РЬе

Ьеи

Ьеи

Суз

Ьеи

А1а

<31 у

Агд А1а Ьеи

1

5

10

15

А1а <31п Авп

Ьеи РЬе

ТЬг

Ьуз

Азр

Уа1

ТЬг

Уа1

11е

(31 и

<31у <31и Уа1

20

25

30

А1а ТЬг

• 11е

Зег Суз

<31п

Уа1

Азп

Ьуз

Зег

Азр

Азр

Зег

Уа1

11е <31п

35

40

45

Ьеи Ьеи

. Азп

Рго Азп

Агд

<31 п

ТЬг

11е

Туг

РЬе

Агд

Авр

РЬе

! Агд Рго

50

55

60

Ьеи Ьуз

Авр

Зег Агд

РЬе

<31п

Ьеи

Ьеи

Азп

РЬе

Зег

Зег

Зег

• <31 и Ьеи

65

70

75

80

Ьуз Уа1

Зег

Ьеи ТЬг

Азп

Уа1

Зег

11е

Зег

Авр

<31и

<31 у

Агд Туг РЬе

85

90

95

Сув <31п Ьеи

Туг ТЬг

Азр

Рго

Рго

<31 п

<31 и

Зег

Туг

ТЬг

ТЬг 11е ТЬг

100

105

110

- 68 028336

С1п Ьеи МеЕ Ьеи Ьуз Уа1 Ηίε Ьуз С1и Азр Азр С1у Уа1 Рго Уа1 Не

180 185 190

Суз О1п Уа1 С1и Низ Рго А1а Уа1 ТЬг С1у Азп Ьеи С1п ТЬг С1п Агд 195 200 205

Туг Ьеи С1и Уа1 С1п Туг Ьуз Рго С1п Уа1 Ηίε Не С1п Меб ТЬг Туг

210 215 220

Рго Ьеи С1п С1у Ьеи ТЬг Агд С1и С1у Азр А1а Ьеи С1и Ьеи ТЬг Суз 225 230 235 240

С1и А1а 11е С1у Ьуз Рго С1п Рго Уа1 Меб Уа1 ТЬг Тгр Уа1 Агд Уа1

245 250 255

Азр Азр С1и Меб Рго С1п ΗΪ3 А1а Уа1 Ьеи 5ег <31 у Рго Азп Ьеи РЬе 260 265 270

11е Азп Азп Ьеи Азп Ьуз ТЬг Азр Азп <31 у ТЬг Туг Агд Суз <31и А1< 275 280 285

Зег Азп 11е Уа1 <31у Ьуз А1а Ηίε Зег Азр Туг Меб Ьеи Туг Уа1 Туг

290 295 300

Азр Зег Агд А1а <31у <31и <31и <31у Зег 11е Агд А1а Уа1 Азр А1а Зег 305 310 315 320

ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3

325 <210> 45 <211> 5 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептидный конъюгат <400> 45

Рго Уа1 С1у Уа1 Уа1

Claims (32)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, фрагмент антитела или миметик антитела, которые связываются с эпитопом человеческой САИМ1, которая узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, представленную в δΙίφ II) N0: 19, 20 или 21, и вариабельный участок легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, представленную в δΙ ί(_ν) ΙΌ N0: 22, 23 или 24.
2. 2. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, фрагмент антитела или миметик антитела, которые связываются с эпитопом человеческой САБМ1, которая узнается антителом, включающим СИР, как определено на фиг. 1-3, включая изменения ДНК и аминокислотные изменения, которые поддерживают 90% связывания с исходной последовательностью человеческой САБМ1 независимо от каркаса, на котором размещаются эти СИР.
3. 3. Антитело в соответствии с п.1 или 2, где указанное антитело представляет собой антитело полной длины 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 изотипа.
4. 4. Антитело в соответствии с п.1 или 2, где указанное антитело является выбранным из группы, которая состоит из цельного антитела, фрагмента антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела, одноцепочечного антитела, сконструированного антитела, которое приводит к улучшенному связыванию с Рс рецепторами и/или повышенной эффективности АБСС, и биспецифического антитела.
5. 5. Фрагмент антитела в соответствии с п.1 или 2, где фрагмент является выбранным из группы, которая состоит из унитела, доменного антитела и нанотела.
6. 6. Миметик антитела в соответствии с п.1 или 2, где миметик является выбранным из группы, которая состоит из аффитела, ОАРРт, антикалина, авимера, версатела и дуокалина.
7. 7. Антитело в соответствии с п.1 или 2, которое является конъюгированным с терапевтическим агентом.
8. 8. Антитело в соответствии с п.7, в котором терапевтический агент представляет собой цитотоксин или радиоактивный изотоп.
9. 9. Изолированное антитело в соответствии с п.1 или 2, где указанное антитело связывается с человеческой СА1)М1 со значением ЕС₅₀ в интервале < 50 нМ.
10. 10. Изолированное антитело в соответствии с п.1 или 2, где указанное антитело связывается с человеческой СА1)М1 со значением ЕС₅₀ в интервале < 10 нМ.
11. 11. Изолированное антитело в соответствии с п.1 или 2, где указанное антитело связывается с человеческой СА1)М1 со значением ЕС₅₀ в интервале < 1 нМ.
12. 12. Композиция, которая включает изолированное антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с п.1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.
13. 13. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающую часть в соответствии с п.1 или 2.

    - 69 028336
14. 14. Экспрессионный вектор, который включает молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с

    п.13.
15. 15. Хозяйская клетка, которая включает экспрессионный вектор в соответствии с п.14.
16. 16. Способ получения анти-СА0М1 антитела, при этом указанный способ включает этапы получения хозяйской клетки, которая содержит одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело в соответствии с п.1 или 2;

    культивирования хозяйской клетки в культуре хозяйских клеток;

    обеспечения условий культивирования хозяйской клетки, при которых экспрессируется одна или более молекул нуклеиновой кислоты; и извлечения антитела из хозяйской клетки или из культуры хозяйских клеток.
17. 17. Способ лечения или предотвращения заболевания, ассоциированного с целевыми клетками, которые экспрессируют САОМЕ где указанный способ включает этап введения субъекту анти-СА0М1 антитела или его антигенсвязывающей части в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания.
18. 18. Способ в соответствии с п. 17, где указанное заболевание представляет собой рак человека.
19. 19. Способ в соответствии с п.18, где указанный рак человека является выбранным из группы, которая состоит из мелкоклеточного рака легких, лейкемии Т-клеток у взрослых, немелкоклеточного рака легких (включая карциному чешуйчатых клеток и аденокарциномы), меланомы, рака молочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, нейроэндокринных видов рака, включая такие, как рак легких, надпочечников, гипофиза, желудочно-кишечного тракта, почек, печени (включая злокачественную гепатому), поджелудочной железы (включая инсулиномы и глюкагономы), глиобластомы, и карциноидных опухолей, включая такие, как опухоли поджелудочной железы, легких, желудочно-кишечного тракта, печени и почек.
20. 20. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, фрагмент антитела или миметик антитела, которые связываются с эпитопом человеческой САПМ/ которая узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, выбранные из группы, которая состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в §Е0 ГО N0: 19, и вариабельного участка легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в §Е0 ГО N0: 22;

    аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в §Е0 ГО N0: 20, и вариабельного участка легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в §ЕО ГО N0: 23;

    аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в §Е0 ГО N0: 21, и вариабельного участка легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в §ЕО ГО N0: 24.
21. 21. Изолированное антитело в соответствии с п.20, где указанное антитело является выбранным из группы, которая состоит из цельного антитела, фрагмента антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела, одноцепочечного антитела, сконструированного антитела, которое приводит к улучшенному связыванию с Рс рецепторами и/или повышенной эффективности АОСС, и биспецифического антитела.
22. 22. Фрагмент антитела в соответствии с п.20, где фрагмент является выбранным из группы, которая состоит из унитела, доменного антитела и нанотела.
23. 23. Миметик антитела в соответствии с п.20, где миметик является выбранным из группы, которая состоит из аффитела, ОАРРгп, антикалина, авимера, версатела и дуокалина.
24. 24. Композиция, которая включает изолированное антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с п.20 и фармацевтически приемлемый носитель.
25. 25. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую или легкую цепь изолированного антитела или его антигенсвязывающую часть в соответствии с п.20.
26. 26. Экспрессионный вектор, который включает молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с

    п.25.
27. 27. Хозяйская клетка, которая включает экспрессионный вектор в соответствии с п.26.
28. 28. Гибридома, которая экспрессирует антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с любым из пп.1, 2 или 20.
29. 29. Способ получения антитела в соответствии с любым из пп.1, 2 или 20, который включает этапы иммунизации трансгенного животного, включающего гены человеческого иммуноглобулина, с помощью 0^01^1 пептида;

    извлечения В-клеток из указанного трансгенного животного; создания гибридом из указанных В-клеток;

    отбора гибридом, которые экспрессируют антитела, которые связываются с САЭМ1; и извлечения указанного антитела, которое связывается с СА0М1, из указанных отобранных гибридом.

    - 70 028336
30. 30. Способ получения 3^4^^0141 антитела, который включает этапы иммунизации трансгенного животного, включающего гены человеческого иммуноглобулина, с помощью 0ΑΌΜ1 пептида;

    извлечения иРНК из В-клеток указанного трансгенного животного; преобразования указанной иРНК в кДНК;

    экспрессии указанной кДНК в фагах, так, что анти-СЛ^Μ1 антитела, которые кодируются указанной кДНК, презентируются на поверхности указанных фагов;

    отбора фагов, которые презентируют анти-СЛ^Μ1 антитела;

    извлечения из указанных отобранных фагов молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанные анти-СЛ^Μ1 иммуноглобулины;

    экспрессии указанной извлеченной молекулы нуклеиновой кислоты в хозяйской клетке и извлечения из указанной хозяйской клетки антитела, которое связывается с 0ΑΌΜ1.
31. 31. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которая связывается с эпитопом на полипептиде, который имеет аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 43 или 44, которая узнается антителом, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 19, 20 или 21, и вариабельный участок легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 22, 23 или 24.
32. 32. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с эпитопом на полипептиде, который имеет аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 43 или 44, которая узнается антителом, включающим ΟΌΕ, как определено на фиг. 1-3, включая изменения ДНК и аминокислотные изменения, которые поддерживают 90% связывания с человеческой 0ΑΌΜ1 исходной последовательности, независимо от каркаса, на котором размещаются эти СЭК.