CN102341412B - 特异于cadm1 的全人抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了分离的单克隆抗体、特别是人单克隆抗体、更特别地是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体或者免疫缀合物，所述抗体或免疫缀合物以高亲和力特异性结合CADM1。还提供了编码CADM1抗体的核酸分子、用于表达CADM1抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含所述CADM1抗体的双特异性分子和药物组合物。公开了用于检测CADM1的方法，以及用于治疗各种癌症、包括肺癌和胰腺癌的方法。

Description

特异于CADM1的全人抗体
相关申请
本申请要求2009年3月5日递交的美国临时申请号61/209471和2009年3月5日递交的美国临时申请号61/209390的优先权，二者通过引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明一般性地涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本文提供了抗体(特别是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体)和免疫缀合物，以及其它治疗性蛋白，所述抗体、免疫缀合物和治疗性蛋白针对免疫球蛋白样粘附分子CADM1；编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸；用于制备本发明的单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法；以及用于治疗疾病(例如由CADM1的表达/活性介导的癌症和/或与其配体的异常表达/活性相关的癌症)的方法。
背景技术
细胞粘附分子一般被鉴定为钙粘着蛋白、整合素、选择素或被鉴定为为免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。免疫球蛋白超家族分子包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共同受体和共刺激分子，参与向淋巴细胞的抗原呈递的分子，细胞粘附分子和一些细胞因子受体。Ig超家族细胞粘附分子构成脊椎动物中超过100种分子，包括NCAM(神经细胞粘附分子)、L1家族CAM、ICAM(细胞内细胞粘附分子)、VCAM(血管细胞粘附分子)、SIGLEC(唾液酸结合性Ig样凝集素，包括CD22和CD83)、结合素(nectin)、CD2、CD48。
免疫球蛋白超家族分子CADM1最初是由多个研究小组表征的；因此，该分子在科学文献中通过许多名称而被鉴别，所述名称包括细胞粘附分子1、突触细胞粘附分子(synCAM)、精子发生免疫球蛋白超家族分子(sgIGSF)、IGSF4、BL2、ST17、NECL2、RA175和CADM1A。其最初还被报道作为肿瘤抑制因子，也已知为TSLC1(Murakami et al.，NatureGenetics 27(4)：427(2001))。
钙粘着蛋白和整合素需要二价阳离子(例如Ca+2或Mg+2)用于粘附活性，与之不同，Ig超家族分子通常是不依赖于Ca+2或Mg+2的。CADM1的结构被表征为具有含有3个免疫球蛋白样基序的细胞外结构域、单一的疏水性跨膜α螺旋和通过DAL-1与肌动蛋白纤维结合的细胞内结构域，以及含有PDZ结合性基序的短的C末端细胞质尾巴。已知两种CADM1同种型：NM_014333和NM_001098517，后者具有27个氨基酸的缺失。分析表明：相应于CADM1的细胞质结构域的氨基酸序列在5种哺乳动物中是相同的，并且在脊椎动物中是高度保守的，暗示着CADM1在正常的细胞-细胞相互作用中的重要作用。小鼠CADM1直系同源物(AAQ 023810)显示出与人类CADM1的97％的同一性(Fukami et al.，Gene 295：7-12(2002))。
CADM1在神经和肥大细胞(Ito et al.J Pharmacol Sci.；102(1)：1-5(2006))，肺泡细胞(Ito et al.Histol Histopathol.18(4)：1321-9(2003))，胰腺分泌细胞(Shingaiet al.J Biol Chem.；278(37)：35421-7(2003))，(Wakayama et al.，Blood；101(7)：2601-8(2003))中表达。其还与肝细胞癌(HCC)相关。CADM1似乎在胚胎和肝硬化成人胆管细胞中表达，但不存在于无病的成人胆管中(Ito et al.，Hepatology，45(3)：684-94(2007))。还有报道称其与成胶质细胞瘤和肺癌相关。
已经鉴定了导致CADM1失活的两种机制：通过启动子甲基化和通过在基因座丧失杂合性(heterozygosity)。据报道：CADM1启动子的甲基化导致在肿瘤(包括肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌)、特别是具有攻击性行为的肿瘤中丧失CADM1的表达(Murakamiet al.，Mol Cancer.4：28(2005))。
发明内容
本发明通过下述解决了这些和其它相关的需要：提供了针对CADM1的抗体(尤其是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体)和免疫缀合物；编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸；用于制备抗-CADM1单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法；和用于治疗疾病的方法，所述疾病为例如CADM1介导的病症，例如人类的癌症，包括小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
因此，本发明提供了分离的单克隆抗体，尤其是鼠的、嵌合的、人源化的和全人单克隆抗体，所述单克隆抗体与一种或多种骨形态发生蛋白及其受体结合并且显示出一种或多种所需的功能特性。此类特性包括例如，与人类CADM1的高亲和力特异性结合。还提供了使用本发明的抗体、蛋白和组合物治疗多种由CADM1介导的疾病的方法。
本发明提供了结合人CADM1上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，所述表位被含有包含SEQ ID NO：19，20或21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：22，23或24所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。在一些实施方式中，所述分离的抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。在优选的实施方式中，本发明的抗体是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物或工程化抗体。抗体片段可以选自：UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方式中，本发明的免疫缀合物包含治疗剂。在本发明的另一个方面，治疗剂是细胞毒素或放射性的同位素。
在一些实施方式中，本发明的抗体选自：Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。
在本发明的一些方面，抗体以小于50Nm、小于10Nm或小于1Nm的EC50与人类CADM1结合。
在备选实施方式中，本发明的组合物包含分离的抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体。
在其它方面，本发明的抗体是包含权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的组合物。
在一些实施方式中，本发明包括编码结合人类CADM1上的表位的分离的抗体或抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸。本发明的其它方面包括包含此类核酸分子的表达载体和包含其的宿主细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了用于制备抗-CADM1的方法，所述方法包括步骤：获得包含编码本发明的抗体的一个或多个核酸分子的宿主细胞；使所述宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；为宿主细胞培养物提供所述一个或多个核酸分子被表达的条件；和从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收抗体。
在其它实施方式中，本发明涉及用于治疗或预防与表达CADM1的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用有效治疗或预防该疾病的量的抗-CADM1抗体或其抗原结合部分。在一些方面，通过本发明的抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病选自人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的抗体治疗或预防的疾病是选自下组的癌症：小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
在其它实施方式中，本发明涉及用于治疗或预防与表达CADM1的靶细胞相关的疾病的抗-CADM1抗体或其抗原结合部分。在一些方面，通过本发明的抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病是人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的抗体治疗或预防的疾病是选自下组的癌症：小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
在其它实施方式中，本发明涉及抗-CADM1抗体或其抗原结合部分用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防与表达CADM1的靶细胞相关的疾病。在一些方面，通过本发明的药物治疗或预防的疾病是人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的药物治疗或预防的疾病是选自下组的癌症：小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
在其它实施方式中，本发明是结合人类CADM1上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，所述表位被含有重链可变区和轻链可变区的抗体识别，所述重链可变区和轻链可变区选自：SEQ ID NO：19所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：22所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO：20所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：23所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO：21所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：24所示的轻链可变区氨基酸序列。在进一步的方面，抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。在优选的方面，抗体是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物或工程化抗体。在本发明的进一步的方面，抗体片段选自：UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方式中，抗体模拟物选自Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。在进一步的实施方式中，组合物包含分离的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本发明是编码本发明的分离的抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子；在进一步的方面，可以包括包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个实施方式是表达本发明的任一抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
本发明的其它方面涉及制备本发明的抗体的方法，包括步骤：使用CADM1肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物；从所述转基因动物回收B-细胞；从所述B-细胞制备杂交瘤；选择表达结合CADM1的抗体的杂交瘤；和从所述选择的杂交瘤回收所述结合CADM1的抗体。
在其它实施方式中，制备抗-CADM1抗体的方法包括步骤：
使用CADM1肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物；
从所述转基因动物的B-细胞回收mRNA；
将所述mRNA转变为cDNA；
在噬菌体中表达所述cDNA，从而由所述cDNA编码的抗-CADM1抗体被呈递在所述噬菌体的表面；
选择呈递抗-CADM1抗体的噬菌体；
从所述选择的噬菌体回收编码所述抗-CADM1免疫球蛋白的核酸分子；
在宿主细胞中表达所述回收的核酸分子；和
从所述宿主细胞回收结合CADM1的抗体。
在本发明的一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合具有SEQ ID NO：43或44的氨基酸序列的CADM1多肽上的表位，所述表位被含有包含SEQ ID NO：19，20或21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：22，23或24所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。
本发明的其它特征和优点将通过以下不应被解释为限制性的详细描述和实施例而是显然的。本申请各处所引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容明确地通过引用方式并入本文。
附图说明
图1A显示了PTA021_A1人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)和氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：1)，CDR2(SEQ ID NO：4)和CDR3(SEQ ID NO：7)区，并注明了V、D和J种系衍生。
图1B显示了PTA021_A1人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：10)，CDR2(SEQ ID NO：13)和CDR3(SEQ ID NO：16)区，并注明了V和J种系衍生。
图2A显示了PTA021_A2人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)和氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：2)，CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：8)区，并注明了V和J种系衍生。
图2B显示了PTA021_A2人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)和氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：11)，CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO：17)区，并注明了V和J种系衍生。
图3A显示了PTA021_A3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)和氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：3)，CDR2(SEQ ID NO：6)和CDR3(SEQ ID NO：9)区，并注明了V、D和J种系衍生。
图3B显示了PTA021_A3人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)和氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。标示出了CDR1(SEQ IDNO：12)，CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：18)区，并注明了V和J种系衍生。
图4显示了PTA021_A1的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)与人种系VH2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：31)以及人种系JHJH5b氨基酸序列(SEQ ID NO：37)的比对。
图5显示了PTA021_A2的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)与人种系VH2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：32)以及人种系JH5b氨基酸序列(SEQ ID NO：38)的比对。
图6显示了PTA021_A3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)与人种系VH2-05氨基酸序列(SEQ ID NO：33)以及人种系JH5b氨基酸序列(SEQ ID NO：39)的比对。
图7显示了PTA021_A1的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)与人种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO：34)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO：40)的比对。
图8显示了PTA021_A2的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)与人种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO：35)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO：41)的比对。
图9显示了PTA021_A3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)与人种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO：36)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO：42)的比对。
图10显示了在NCI-H69小细胞肺癌细胞中对PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3进行的FACS分析的结果。
图11A和11B分别显示了在NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞中对PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3进行的FACS分析的结果。
图12显示了在SKOV 3卵巢癌细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。
图13显示了在A549非小细胞肺癌细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。
图14显示了在786-O肾细胞癌细胞和SkMel28黑素瘤细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。
图15显示了在NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞中对PTA021_A3和非岩藻糖化(nonfucosylated)形式的PTA021_A3(nf)进行的FACS分析的结果。
图16A和16B分别显示了DMS79和NC1-H69细胞系中由PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3介导的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。
图17A和17B分别显示了在DMS79和NCI-H69细胞中对PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3进行的Hum-ZAP测试的结果。
图18的图显示了使用岩藻糖化或非岩藻糖化的PTA021_A3抗体对于小鼠异种移植模型中HepG2肿瘤大小的治疗效果。
图19的图显示了使用PTA021_A3-式M缀合物对于小鼠异种移植模型中HepG2肿瘤大小的治疗效果。
图20A的图显示了使用剂量为0.3umol/kg的PTA021_A3-式M缀合物对于小鼠异种移植模型中DMS79肿瘤大小的治疗效果。图20B的图显示了使用剂量为0.1和0.03umol/kg的PTA021_A3-式M缀合物对于小鼠异种移植模型中DMS79肿瘤大小的治疗效果。该研究完成于第60天。
图21、22和23的图分别显示了PTA021_A3和非岩藻糖化的PTA021_A3对于HepG2、786-O和DMS79细胞的ADCC活性。
图24的图显示了单独使用或与顺铂联合使用PTA021_A3抗体对于小鼠异种移植中DMS79肿瘤大小的治疗效果。
图25A和25B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的体重数据。
图26A和26B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的葡萄糖数据。
图27A和27B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的丙氨酸转氨酶数据。
图28A和28B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的天冬氨酸转氨酶数据。
图29A和29B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的碱性磷酸酶数据。
图30A和30B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的乳酸脱氢酶数据。
图31A和31B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的RBC数据。
图32A和32B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的WBC数据。
具体实施方式
本发明涉及以高亲和力特异性结合CADM1的分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，更特别地是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物和工程化抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体源自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，免疫缀合物，双特异性分子，affibodies，结构域抗体，纳米抗体和unibodies，制备所述分子的方法，和包含所述分子与药学载体的药物组合物。本发明还涉及使用所述分子的方法，例如用来检测CADM1，以及用来治疗与CADM1的表达(例如CADM1在肿瘤上的表达)相关的疾病，所述肿瘤包括下列的肿瘤：小细胞肺癌和神经内分泌胰腺癌，肺的类癌和胃肠的类癌。
为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其它的定义贯穿于详细描述中而给出。
术语“CADM1″，″IGSF4″，“免疫球蛋白超家族成员4D”，“细胞粘附分子1”，“肺癌中的肿瘤抑制因子1”，“TSLC1”，“BL2”，“ST17”，“突触细胞粘附分子”，“syncam1”，“结合素样蛋白2”和“NECL2”可互换地使用，并且包括人类CADM1的变体、同种型和物种同源物，包括CADM1同种型1(Genbank登记号NM_014333)和同种型2(Genbank登记号NM_001098517)。在PCT申请(OBT案卷号：OGL-P121PCT)中，这两个同种型还被鉴定为OGTA025a和OGTA025b，该申请通过引用方式全文并入本文。在一些情况下，该公开中的人类抗体可以与来自人类以外的其它物种的CADM1交叉反应。在一些实施方式中，抗体可以是完全特异于一种或多种人类CADM1的，并且可以不显示出物种或其它类型的非人类交叉反应活性。示例性的人类CADM1的完整氨基酸序列具有Genbank登记号NM_014333。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用引起对于入侵的病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性细胞或正常人类细胞或组织(在自身免疫或病理性炎症的情况下)的选择性损伤、对它们的破坏，以及从人体清除它们。
“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分传送至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。如本文所使用的，用语“细胞表面受体”包括例如能够接收信号并将此信号跨越细胞的质膜传送的分子和分子的复合物。本发明的“细胞表面受体”的实例是CADM1受体。
本文所称的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指可包含由二硫键互连的至少2个重链(H)和2个轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1，CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL或VK)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL/VK区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，其散布在更为保守的被称作框架区(FR)的区域内。每个VH和VL/VK由3个CDR和4个FR构成，按照下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保持与抗原(例如CADM1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL/VK，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其实质上是具有部分铰链区的Fab(见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.，3.sup.rd ed.1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体：包含单一可变域和2个恒定域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL/VK和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成的连接子将它们连接起来，所述连接子使其成为单一的蛋白链，其中VL/VK和VH区配对以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；见例如Bird et al.(1988)Science242：423-426；和Huston etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也意在被涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，按照与完整抗体相同的方式就功用来筛选片段。
如本文中所使用的，“分离的抗体”意指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合CADM1的分离的抗体是实质上不含特异性结合除了CADM1之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CADM1的分离的抗体可以具有与其它抗原(例如来自其它物种的CADM1分子)的交叉反应活性。此外，分离的抗体可以实质上不含其它细胞物质和/或化学物质。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体成分显示出对于特定表位的单一的结合特异性和亲和力。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意在包括具有这样的可变区的抗体：其中框架区和CDR区都源自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定域也源自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变导入的突变)。然而，如本文中所使用的，术语“人抗体”不意欲包括这样的抗体：其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。
术语“人类单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有这样的可变区：其中框架区和CDR区都源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，通过包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞的杂交瘤产生人类单克隆抗体，所述转基因非人动物具有融合至永生细胞的、包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文中所使用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从就人类免疫球蛋白基因而言为转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备而来的杂交瘤(下文进一步描述)分离的抗体；(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞分离的抗体，例如来自转染瘤；(c)分离自重组的、组合人类抗体文库的抗体；和(d)通过涉及人类免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列的剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有这样的可变区：其中框架区和CDR区源自人类种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方式中，此类重组人类抗体可以经历体外诱变(或，当使用就人类Ig序列而言为转基因的动物时，可以经历体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL/VK区的氨基酸序列是这样的序列：虽然源自并相关于人类种系VH和VL/VK序列，但是可能不天然地在体内存在于人类抗体种系库内。
如本文中所使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
用语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换地使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”意指这样的抗体：其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指这样的抗体：其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一物种，例如这样的抗体：其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。
如本文中所使用的，“特异性结合人类CADM1的抗体”意指以50Nm或更低，10Nm或更低，或更优选以1Nm或更低的EC50与人类CADM1结合的抗体。
如本文中所使用的，术语“不与蛋白或细胞实质性结合”的意思是：不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与蛋白或细胞结合，即，以1x10-6M或更高，更优选1x10-5M或更高，更优选1x10-4M或更高，更优选1x10-3M或更高，甚至更优选1x10-2M或更高的KD与蛋白或细胞结合。
如本文中所使用的，术语“EC50”意指通过定量引起50％的最大应答/效应的浓度而得的化合物效力。
如本文中所使用的，术语″Kassoc″或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文中所使用的，术语″Kdis″或“Kd，”意指特定的抗原-抗体相互作用的解离速率。如本文中所使用的，术语“KD”意指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并且被表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域已确立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的优选方法是使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统例如系统。
如本文中所使用的，术语对I gG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原的KD为1x10-7M或更低，更优选5x10-8M或更低，更优选1x10-8M或更低，更优选5x10-9M或更低，更优选1x10-9M或更低的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它的抗体同种型可变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10-6M或更低，更优选10-7M或更低，更优选10-8M或更低的KD的抗体。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或者由通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常仍然会保留，而通过三级折叠形成的表位在经变性溶剂处理后通常会丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文中描述的技术，例如x射线结晶和二维核磁共振(见，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。
因此，本发明中还包括与本文描述的抗体(即PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3)结合(即识别)相同的表位的抗体。可以通过以统计学上显著的方式与针对靶抗原的参考抗体的交叉竞争(即竞争性抑制其结合)的能力来鉴定结合相同表位的抗体。例如，如果抗体结合相同或结构相似的表位(例如重叠表位)，或空间上邻近的表位(当结合时引起抗体之间的空间位阻)，则可以发生竞争性抑制。
可以使用常规测定法来确定竞争性抑制，其中待测免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。有多种类型的竞争性结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心式竞争测定(见Stahli et al.，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见Kirklandet al.，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心式测定(见Harlow and Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(见Morel et al.，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung et al.，Virology176：546(1990))和直接标记RIA(Moldenhauer et al.，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。通常，此类测定法包括使用结合于固体表面的纯化的抗原或携带这些的任一的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在存在测试免疫球蛋白的情况下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将以至少50％-55％，55％-60％，60％-65％，65％-70％，70％-75％或更多来抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。
其它技术包括例如，表位定位法，例如抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率。其它的方法监控抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合，其中，由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合的丧失通常被认为是表位组分的指征。此外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。然后所述肽被认为是用于定义对应于用于筛选肽文库的抗体的表位的引导(lead)。对于表位定位，还开发了计算算法，已经表明其定位构象型不连续表位。
如本文中所使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖类、爬行类等。
在以下部分中进一步详细描述了本发明的各个方面。
抗CADM1抗体
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体特异性结合人CADM1。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合CADM1，例如以8x10-7M或更低，更通常为1x10-8M或更低的KD结合。本发明的抗-CADM1抗体优选显示出一个或多个下列特征：
以50Nm或更低，10Nm或更低，或更优选1Nm或更低的EC50结合人CADM1；
结合表达CADM1的人类细胞。
在一个实施方式中，抗体优选结合存在于CADM1中的抗原性表位，所述表位不存在于其它蛋白中。抗体通常结合CADM1但不结合其它蛋白，或者，以低亲和力例如1x10-6M或更高，更优选1x10-5M或更高，更优选1x10-4M或更高，更优选1x10-3M或更高，更优选1x10-2M或更高的KD与蛋白结合。优选地，抗体不与相关蛋白结合，例如，抗体实质上不与ICAM、VCAM或其它细胞粘附分子结合。在一个实施方式中，抗体可以内化进入表达CADM1的细胞。用于评价抗体内化的标准测定法是本领域已知的，包括例如HumZap内化测定法。
用于评价抗体与CADM1的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如，ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。在实施例中详细描述了适宜的测定法。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，例如通过系统分析。为了评估与Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞的结合，可以从公众可获得的来源例如美国典型培养物保藏中心获得Raji(ATCC Deposit No.CCL-86)或Daudi(ATCC Deposit No.CCL-213)细胞，并用于标准测定法(例如流式细胞术分析)中。
单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2，PTA021_A3
本发明的优选抗体是人单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3，如实施例1、2和3中所描述进行分离和结构表征。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VH氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：19，20和21中。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VK氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：22，23和24中。
鉴于这些抗体中的每一个都能结合CADM1，可以“混合并匹配”所述VH和VK序列以产生本发明的其它抗-CADM1结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CADM1的结合。优选地，当混合并匹配VH和VK链时，来自特定VH/VK对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。类似地，优选地，来自特定VH/VK对的VL序列被替换为结构上相似的VK序列。
因此，在一个方面，本发明提供了包含下列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分：
含有选自SEQ ID NO：19，20和21的氨基酸序列的重链可变区；和
含有选自SEQ ID NO：22，23和24的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体特异性结合CADM1，优选人CADM1。
优选的重链和轻链的组合包括：包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了包含PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的重链和轻链CDR1，CDR2和CDR3或其组合的抗体。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A 3的VHCDR1的氨基酸序列显示于SEQID NO：1，2和3中。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VHCDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4，5和6中。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A 3的VHCDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：7，8和9中。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VKCDR1的氨基酸序列显示于SEQID NO：10，11和12中。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VKCDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：13，14和15。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VKCDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16，17和18中。使用Kabat系统(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health和Human Services，NIH Publication No.91-3242)标示CDR区。
鉴于这些抗体中的每一个都能结合CADM1并且抗原结合特异性主要由CDR1，CDR2和CDR3区提供，所以可以“混合并匹配”VHCDR1，CDR2和CDR3序列和VKCDR1，CDR2和CDR3序列(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，虽然每一个抗体必须包含VHCDR1，CDR2和CDR3和VKCDR1，CDR2和CDR3)以产生本发明的其它抗-CADM1结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA、分析)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CADM1的结合。优选地，当混合并匹配VHCDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。类似地，当混合并匹配VKCDR序列时，来自特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域普通技术人员而言将为很显然的是：可以通过将一个或多个VH和/或VL/VKCDR区序列替换为来自如本文中公开的单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的CDR序列的结构上相似的序列来产生新的VH和VK序列。
因此，在另一个方面，本发明提供了包含下列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分：
包含选自SEQ ID NO：1，2和3的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
包含选自SEQ ID NO：4，5和6的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
包含选自SEQ ID NO：7，8和9的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
包含选自SEQ ID NO：10，11和12的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
包含选自SEQ ID NO：13，14和15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
包含选自SEQ ID NO：16，17和18的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体特异性结合CADM1，优选人CADM1。
在优选的实施方式中，抗体包含：
含有SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：4的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO：7的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO：10的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：13的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO：16的轻链可变区CDR3。
在另一个优选的实施方式中，抗体包含：
含有SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：5的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO：8的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO：11的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：14的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO：17的轻链可变区CDR3。
在另一个优选的实施方式中，抗体包含：
含有SEQ ID NO：3的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：6的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO：9的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO：15的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR3。
本领域公知的是：不依赖于CDR1和/或CDR2域，CDR3域能够单独地决定抗体对于关联抗原(cognate antigen)的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可预测性地产生具有相同结合特异性的多个抗体。见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(其描述了仅使用鼠抗-CD30抗体Ki-4的重链可变区CDR3域来产生人源化抗-CD30抗体)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(其描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(其描述了使用鼠抗-整合素αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3域的一组人源化抗-整合素αvβ3抗体，其中每个抗体成员在CDR3域之外包含不同的序列并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力等于或高于亲本鼠抗体)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(其公开了CDR3域提供了对与抗原结合的最显著的贡献)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(其描述了将针对人胎盘DNA的3个Fab(SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列移植到抗-破伤风类毒素Fab的重链上，从而替换已有的重链CDR 3，并且证明了CDR 3域单独地赋予结合特异性)；和Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)(其描述了移植研究，其中仅将亲本多特异性Fab LNA3的重链CDR3转移至单特异性IgG破伤风类毒素-结合性Fab p313抗体的重链上就足以保留亲本Fab的结合特异性)。这些参考文献中的每一篇通过引用方式全文并入本文。
因此，本发明提供了包含来自源于人或非人动物的抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性地结合CADM1。在一些方面，本发明提供了包含来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合CADM1。在一些实施方式中，包含来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本非人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在其它方面，本发明提供了包含来自人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述人类抗体能够特异性结合CADM1。在其它方面，本发明提供了包含来自第一人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述第一人类抗体能够特异性结合CADM1并且其中来自所述第一人类抗体的CDR3域替换缺乏对于CADM1的结合特异性的人类抗体的CDR3域，以产生能够特异性结合CADM1的第二人类抗体。在一些实施方式中，包含来自第一人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本第一人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。在优选实施方式中，第一人类抗体是PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3。
具有特定种系序列的抗体
在一些实施方式中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在优选的实施方式中，本发明提供了包含重链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区是人VH2-05基因的产物或源自人VH2-05基因，其中所述抗体特异性结合CADM1。在另一个优选实施方式中，本发明提供了包含轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区是人VKL15基因的产物或源自人VKL15基因，其中所述抗体特异性结合CADM1。在另一个优选实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
包含是人VH2-05基因的产物或源自人VH2-05基因(该基因分别编码如SEQ ID NO：31，32或33所示的氨基酸序列)的重链可变区；
包含是人VKL15基因的产物或源自人VKL15基因(该基因分别编码如SEQ ID NO：34，35或36所示的氨基酸序列)的轻链可变区；并且
特异性结合CADM1，优选人CADM1。具有VH2-05和VKL15的VH和VK的抗体的实例分别为PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3。
如本文中所使用的，如果抗体的可变区获自使用人类种系免疫球蛋白基因的系统，则人类抗体包含“是特定种系序列的产物”或“源自特定种系序列”的重链或轻链可变区。此类系统包括使用目的抗原免疫携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或使用目的抗原筛选展示于噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库。可以通过将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并选择在序列上与人类抗体的序列最接近(即具有最大的％同一性)的人类种系免疫球蛋白序列来鉴定“是人类种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自人类种系免疫球蛋白序列”的人类抗体。“是特定的人类种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自特定的人类种系免疫球蛋白序列”的人类抗体可以包含相比于种系序列的氨基酸差异，所述差异是由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，所选择的人类抗体在氨基酸序列上通常与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％同一，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠的种系序列)相比时，包含那些将人类抗体鉴定为是人类的氨基酸残基。在一些情况下，人类抗体在氨基酸序列上可以与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％或至少96％，97％，98％或99％同一。通常，相对于人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，源于特定人类种系序列的人类抗体将显示出不超过10个氨基酸差异。在一些情况下，相对于种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人类抗体可以显示出不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源抗体
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含含有同源于本文描述的优选抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的重链和轻链可变区，并且其中所述抗体保留本发明的抗-CADM1抗体的所需功能特性。
例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO：19，20和21的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：22，23和24的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且
所述抗体以10Nm或更低的EC50结合人CADM1。
抗体还可以结合经过人CADM1转染的CHO细胞。
在多个实施方式中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方式中，VH和/或VK氨基酸序列可以与上文给出的序列85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源。含有与上文给出的序列的VH和VK区具有高度同源性(即80％或更高)的VH和VK区的抗体可以这样获得：使编码SEQ ID NO：25，26，27，28，29和30的核酸分子发生诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)，然后使用本文描述的功能测定法就保留的功能测试所编码的经改变的抗体。
如本文中所使用的，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于这两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性取决于这两个序列共有的相同位置的数目(即％同源性＝相同位置的数目/总位置数目x100)，这考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对。可以使用数学算法(例如以下非限制性实施例中描述的)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。
可以使用并入到ALI GN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用并入到GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16，14，12，10，8，6或4，长度权重为1，2，3，4，5或6。
另外或备选地，本发明的蛋白序列还可以被用作“查询序列”以针对公共的数据库进行搜索，以便例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。可以使用XBLAST程序、得分＝50、词长＝3来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口化比对，可以使用如Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体
在一些实施方式中，本发明的抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR 3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文描述的优选抗体(例如PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3)的指定氨基酸序列或其保守性修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗-CADM1抗体的所需功能特性。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：7，8和9的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；
轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：16，17和18的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且
所述抗体以1nM或更低的EC50结合人CADM1。
抗体还可以结合经过人CADM1转染的CHO细胞。
在优选的实施方式中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：4，5和6的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：13，14和15的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方式中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：1，2和3的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：10，11和12的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。
在多个实施方式中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文中所使用的，术语“保守性序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰导入本发明的抗体中。保守性氨基酸置换是这样的置换：其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能测定法就保留的功能来检测经改变的抗体。
SEQ ID NO：1，2或3的重链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQID NO：10，11或12的轻链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ IDNO：4，5或6中显示的重链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO：13，14或15中显示的轻链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO：7，8或9中显示的重链CDR3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；和/或SEQ ID NO：16，17或18中显示的轻链CDR3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失。
与本发明的抗-CADM1抗体结合相同表位的抗体
在另一个实施方式中，本发明提供了与本发明的任意CADM1单克隆抗体结合人CADM1上的相同表位的抗体(即，具有与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合CADM1的能力的抗体)。在优选的实施方式中，用于研究结合的交叉竞争的参考抗体可以是单克隆抗体PTA021_A1(其具有分别如SEQ ID NO：19和22所示的VH和VK序列)，单克隆抗体PTA021_A2(其具有分别如SEQ ID NO：20和23所示的VH和VK序列)，或单克隆抗体PTA021_A3(其具有分别如SEQ ID NO：21和24所示的VH和VK序列)。可以在标准的CADM1结合测定中基于它们与PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3交叉竞争的能力来鉴定此类交叉竞争性抗体。例如，可以使用BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞术来证明与本发明的抗体就结合的交叉竞争。测试抗体抑制例如PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3与人CADM1结合的能力证明该测试抗体能够竞争PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3与人CADM1的结合，因此与PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3结合人CADM1上的相同表位。在优选的实施方式中，与PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3结合人CADM1上的相同表位的抗体是人单克隆抗体。可以按照实施例中的描述制备并分离此类人单克隆抗体。
工程化和修饰的抗体
还可以使用具有本文公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程化修饰的抗体，从而制备本发明的抗体，所述修饰的抗体与所述起始抗体相比可具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个氨基酸来工程化抗体。另外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如，为了改变抗体的效应子功能。
在一些实施方式中，可以使用CDR移植来工程化抗体的可变区。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，相对于CDR外的序列而言，CDR内的氨基酸序列在各抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟特定的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自所述特定的天然存在的抗体的CDR序列(见，例如Riechmann，L.et al.(1998)Nature332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature321：522-525；Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO：1，2和3；SEQID NO：4，5和6；和SEQ ID NO：7，8和9的氨基酸序列的CDR1；CDR2和CDR3序列；所述轻链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO：10，11和12；SEQ I D NO：13，14和15；和SEQID NO：16，17和18的氨基酸序列的CDR1；CDR2和CDR3序列。因此，此类抗体包含单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3的VH和VKCDR序列，但可以包含来自这些抗体的不同框架序列。
此类框架序列可以获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的文献。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在下列中找到：″VBase″人类种系序列数据库(在网址www.mrc-Cpe.cam.ac.uk/vbase可获得)，以及Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，et al.(1992)″The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different Hypervariable Loops″J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.et al.(1994)″A Directory of Human Germ-line VH SegmentsReveals a Strong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24：827-836；其中每一个的内容均明确地通过引用方式并入本文。作为另一个实例，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在Genbank数据库中找到。例如，以随附的Genbank登记号可获得在HCo7HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)，3-33(NG_0010109和NT_024637)，以及3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个实例，以随附的Genbank登记号可获得在HCo12HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)，5-51(NG_0010109和NT_024637)，4-34(NG_0010109和NT_024637)，3-30.3(CAJ556644)，以及3-23(AJ406678)。
使用本领域技术人员熟知的被称作Gapped BLAST(Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)的一种序列相似性搜索方法针对汇编的蛋白质序列数据库来比较抗体蛋白序列。BLAST是启发式的算法，因为抗体序列与数据库序列之间的统计学上显著的比对可能包含所比对单词的高得分区段配对(high-scoring segmentpairs，HSP)。其得分不能通过延伸或截短被改善的区段配对被称作命中。简要地，VBASE来源(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)的核苷酸序列被翻译，FR1至FR3框架区之间并包括FR1和FR3的区域被保留。数据库序列具有98个残基的平均长度。去除那些在蛋白的整个长度上精确匹配的重复序列。BLAST蛋白质搜索以默认的标准参数(除了被关闭的低复杂性过滤外)使用blastp程序以及BLOSUM62的置换矩阵)，过滤产生序列匹配的最高的5个命中。以所有6个框翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配区段中不含终止密码子的框被认为是潜在的命中。继而使用BLAST程序tblastx(其以所有6个框翻译抗体序列)进行确认，并将这些翻译与以所有6个框动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。
同一(identity)是抗体序列与蛋白质数据库在序列全长上的精确的氨基酸匹配。正数(同一+置换匹配)是不相同的，而是由BLOSUM62置换矩阵引导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性与数据库序列中的两个匹配，则具有最多正数的命中将被确定为匹配序列命中。
用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明所选择的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些，例如，与本发明优选的单克隆抗体所使用的VH2-05框架序列(SEQ ID NO：31)和/或VKL15框架序列(SEQ ID NO：34)相似。可以将VHCDR1，CDR2和CDR3序列和VKCDR1，CDR2和CDR3序列移植到与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中所发现的那些序列具有相同序列的框架区上；或者，可以将CDR序列移植到相比于种系序列包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在一些情况下，使框架区内的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VKCDR1，CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以导入突变，并且可以在如本文描述和实施例中提供的体外或体内测定法中评价对于抗体结合或其它感兴趣的功能特性的影响。优选地，导入保守性修饰(如上文所讨论)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选为置换。此外，通常改变CDR区内的不多于1个、2个、3个、4个或5个残基。
因此，在另一个实施方式中，本公开提供了分离的抗-CADM1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述抗体或其抗原结合部分包含：(a)VHCDR1区，其包含选自SEQ ID NO：1，2和3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1，2和3相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其包含选自SEQ ID NO：4，5和6的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4，5和6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：7，8和9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7，8和9相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDR1区，其包含选自SEQ ID NO：10，11和12的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10，11和12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2区，其包含选自SEQ ID NO：13，14和15的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13，14和15具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：16，17和18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16，17和18相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括这样的抗体：其中对VH和/或VK内的框架残基进行了修饰，例如以便改善抗体的特性。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方式是使一个或多个框架残基“回复突变”至对应的种系序列。更特别地，经历了体细胞突变的抗体可以包含不同于抗体所衍生自的种系序列的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体所衍生自的种系序列进行比较来鉴定此类残基。例如，对于PTA021_A1，使用Kabat编号系统，VH的氨基酸残基#30(FR3内)是天冬酰胺(SEQ ID NO：19)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQ ID NO：31)。为了使框架区序列回复至其种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变使体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，PTA021_A1的VH的残基#30可以从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸)。
作为另一个实例，对于PTA021_A1，VH的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO：19)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQ ID NO：31)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的VH的残基#54从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A1，VK的氨基酸残基#50是甘氨酸(SEQ ID NO：22)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丙氨酸(SEQID NO：34)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的VK的残基#50从甘氨酸“回复突变”为丙氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A1，VK的氨基酸残基#77是天冬酰胺(SEQ ID NO：22)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQ ID NO：34)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的VK的残基#77从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A2，VH的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO：20)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQ ID NO：32)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A2的VH的残基#54从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A2，VH的氨基酸残基#89是异亮氨酸(SEQ ID NO：20)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是苏氨酸(SEQ ID NO：32)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A2的VH的FR1中的残基#89从异亮氨酸“回复突变”为苏氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A3，VH的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO：21)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQ ID NO：33)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A3的VH的残基#54从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
作为另一个实例，对于PTA021_A3，VK的氨基酸残基#77是天冬酰胺(SEQ ID NO：24)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQID NO：36)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的VK的残基#77从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内、甚至是一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也被称作“去免疫”，在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。
除了框架或CDR区内的修饰之外或作为其备选，可以对本发明的抗体进行工程化以使其包括Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体连接一个或多个化学部分)或进行修饰以改变其糖基化，这也是为了改变抗体的一种或多种功能特性。这些实施方式中的每一个在下文有更详细的描述。Fc区内的残基的编号是Kabat的EU索引中的编号。
在一个实施方式中，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如增大或减少)铰链区内的半胱氨酸残基数目。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中有更详细的描述。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目被改变是为了例如促进轻链和重链的组合，或为了增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，使抗体的Fc铰链区突变以减小抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而抗体相对于天然Fc铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，具有受损的SpA结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中有更详细的描述。
在另一个实施方式中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。有多种方法是可能的。例如，可以导入一种或多种下列突变：T252L，T254S，T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所描述的。备选地，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以使其包含获自IgG的Fc区的CH2结构域的2个环的清道夫受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另一个实施方式中，按照WO/2007/059782中的描述以UniBody的形式产生抗体，该文献通过引用方式全文并入本文。
在其它实施方式中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234，235，236，237，297，318，320和322的一个或多个氨基酸可以被替换为不同的氨基酸残基，从而抗体对于效应子配体具有改变的亲和力，但保持亲本抗体的抗原结合能力。针对其的亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。
在另一个实例中，可以将选自氨基酸残基329，331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的Clq结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中有更详细的描述。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中有更详细的描述。
在另一个实例中，通过修饰下列位置上的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体的介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对于Fcγ受体的亲和力：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公开WO 00/42072中有更详细的描述。此外，已经定位了人IgG1上的对于FcγR1，FcγRII，FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。显示了在位置256，290，298，333，334和339上的特定突变会改善与FcγRIII的结合。另外，显示了以下组合突变会改善FcγRIII结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一个实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，以便例如增加抗体对于抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。该方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中有更详细的描述。
另外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的数量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式会增加抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化装置(machinery)的宿主细胞中表达抗体来进行此类碳水化合物修饰。本领域中已经描述了具有改变的糖基化装置的细胞，并且可被用作宿主细胞而在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704，Ms705和Ms709缺少岩藻糖转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖转移酶)，从而在Ms704，Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。通过使用2个替换载体(见Yamane等人的美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng87：614-22)靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而创建Ms704，Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能受损的FUT8基因(其编码岩藻糖转移酶)的细胞系，从而在此细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖化(通过减少或消除α1，6键-相关的酶)。Hanai等人还描述了具有低的或不具有将岩藻糖添加至结合抗体的Fc区的N-乙酰葡萄糖胺的酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有减小的将岩藻糖附加至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(同样见Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了被工程化为表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(e.g.，beta(1，4)-N-acetylglucosaminyltransferase III(GnTIII))的细胞系，从而在所述经工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，这产生抗体的增加的ADCC活性(同样见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。备选地，可以使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖残基(Tarentino，A.L.et al.(1975)Biochem.14：5516-23)。
本发明涉及的本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇，以便例如增加该抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的有反应活性酯或醛)在使一个或多个PEG基团附加至所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，通过与有反应活性的PEG分子(或类似的有反应活性的水溶性聚合物)发生酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文中所使用的，术语“聚乙二醇”意在涵盖任意形式的已经被用于衍生其它蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方式中，将被聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可被应用于本发明的抗体。见，例如，Nishimura等人的EP0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401384。
抗体的物理性质
可以通过抗-CADM1抗体的各种物理性质进一步表征本发明的抗体。可以使用多种测定法基于这些物理性质来检测和/或区分不同类别的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。一个或多个糖基化位点在可变区中的存在可以导致由于改变的抗原结合而产生的增加的抗体免疫原性或抗体pK的改变(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA and Morrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh etal(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。可以使用Glycoblot测定法来测试可变区的糖基化，该测定法切割抗体以产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和Schiff碱形成的测定法检测糖基化。备选地，可以使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)来检测可变区糖基化，其从Fab上将糖切割为单糖，并分析单一糖的含量。在一些情况下，优选制备不含可变区糖基化的抗-CADM1抗体。这可以如下实现：通过选择在可变区内不含糖基化基序的抗体，或者使用本领域熟知的标准技术使糖基化基序内的残基突变。
作为糖基化的实例，对于PTA021_A1，使用Kaba t编号系统，VH的氨基酸残基#30(在FR3内)是天冬酰胺(SEQ ID NO：19)。这是潜在的糖基化位点，可以使该残基突变为谷氨酰胺。
在优选的实施方式中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构位点。在N-G或D-G序列可能分别发生脱酰胺或异天冬氨酸效应。脱酰胺或异天冬氨酸效应导致产生异天冬氨酸，其通过形成脱离侧链羧基末端(而非主链)的纽结的结构而降低抗体的稳定性。可以使用等量(iso-quant)测定法来测量异天冬氨酸的产生，其使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。
每一种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是一般地，抗体将落在6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7至9.5的pH范围内。IgG4抗体的pI通常落在6至8的pH范围内。抗体可具有该范围之外的pI。虽然效应一般是未知的，但是存在以下推测：具有处于正常范围之外的pI的抗体在体内条件下可能具有某些解折叠和不稳定性。可以使用毛细等电聚焦测定法来测试等电点，其产生pH梯度并且可以使用激光聚焦用于增加的精确性(Janini etal(2002)Electrophoresis23：1605-11；Ma et al.(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt etal(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。在一些情况下，优选的是含有落在正常范围内的pI值的抗-CADM1抗体。这可以如下实现：通过选择具有在正常范围内的pI的抗体，或通过使用本领域熟知的标准技术使带电的表面残基突变。
每种抗体都将具有指示热稳定性的熔化温度(Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表示更大的总体上体内抗体稳定性。可以使用技术(例如差别扫描量热法(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68：47-52))来测量抗体的熔点。TM1表示抗体的最初解折叠的温度。TM2表示抗体的完全解折叠的温度。一般地，优选的是，本发明的抗体的TM1大于60℃，优选大于65℃，更优选大于70℃。备选地，可以使用圆二色谱法测量抗体的热稳定性(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
在优选的实施方式中，选择不迅速降解的抗体。可以使用如本领域熟知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)来测量抗-CADM1抗体的片段化。
在另一个优选实施方式中，选择具有最小的聚集效应的抗体。聚集可以导致引发不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。一般地，具有25％或更低，优选20％或更低，更优选15％或更低，更优选10％或更低，更优选5％或更低的聚集的抗体是可以接受的。可以通过数种本领域熟知的技术(包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色谱(HPLC)和光散射)来测量聚集，以鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。
工程化抗体的方法
如上文所讨论的，可以通过修饰VH和/或VK序列或与其相连的恒定区，使用具有本文公开的VH和VK序列的抗-CADM1抗体来产生新的抗-CADM1抗体。因此，在本发明的另一个方面，利用本发明的抗-CADM1抗体(例如PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3)的结构特征来产生结构上相关的保持本发明的抗体的至少一种功能特性(例如结合人CADM1)的抗-CADM1抗体。例如，可以将PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3或其突变的一个或多个CDR区与已知的框架区和/或其它CDR重组地组合，以产生另外的、重组工程化的、如上文讨论的本发明的抗-CADM1抗体。其它类型的修饰包括之前的部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，无需实际上制备出(即表达为蛋白)具有本文提供的一个或多个VH和/或VK序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，使用序列内包含的信息作为起始材料来产生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列并表达为蛋白。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备抗-CADM1抗体的方法，包括：
提供：(i)包含选自SEQ ID NO：1，2和3的CDR1序列、选自SEQ IDNO：4，5和6的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：7，8和9的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和/或(ii)包含选自SEQ ID NO：10，11和12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13，14和15的CDR2序列和/或选自SEQIDNO：16，17和18的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；
改变所述重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和
将所述改变的抗体的序列表达为蛋白。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达所述改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体是这样的抗体：其保留本文描述的抗-CADM1抗体的一种、一些或全部功能特性，所述功能特性包括但不限于：以1x10-7M或更低的KD结合人CADM1；结合经CADM1转染的人CHO细胞。
可以使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定法(例如实施例中给出的那些(例如流式细胞术，结合测定法))来评估经改变的抗体的功能特性。
在本发明的工程化抗体的方法的一些实施方式中，可以在抗-CADM1抗体编码序列的全长或部分上随机或选择性地导入突变，并且可以就结合活性和/或如本文描述的其它功能特性筛选所产生的经修饰的抗-CADM1抗体。本领域中已经描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选法来优化抗体的生理化学特性的方法。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或以部分纯化的或实质上纯的形式存在。当使用标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带(banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术)从其它细胞成分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”。见F.Ausubel，et al.，ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或不含内含子序列。在优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤(例如按照下文描述从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于获自人免疫球蛋白基因文库的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从该文库回收编码抗体的核酸。
本发明的优选的核酸分子是编码PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VH序列的DNA序列分别如SEQ ID NO：25，26和27所示。编码PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的VK序列的DNA序列分别如SEQ ID NO：28，29和30所示。
本发明的其它优选核酸是与SEQ ID NO：25，26，27，28，29和30所示的序列之一具有至少80％序列同一性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％序列同一性的核酸，所述核酸编码本发明的抗体，或其抗原结合部分。
两个核酸序列之间的百分比同一性是序列中核苷酸相同的位置的数目，考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对的需要。可以使用数学算法(例如上文描述的Meyers和Miller的算法或Altschul的XBLAST程序)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。
另外，本发明的优选核酸包含SEQ ID NO：25，26，27，28，29和30所示的核酸序列的一个或多个CDR编码部分。在该实施方式中，核酸可以编码PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3的重链CDR1，CDR2和/或CDR3序列或PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3的轻链CDR1，CDR2和/或CDR 3序列。
与SEQ ID NO：25，26，27，28，29或30(VH和VK序列)的CDR编码部分具有至少80％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％序列同一性的核酸也是本发明的优选核酸。此类核酸与SEQID NO：25，26，27，28，29或30的对应部分可在非CDR编码区和/或CDR编码区中相区别。当所述区别在CDR编码区中时，核酸编码的核酸CDR区与PTA021_A1，PTA021_A2或PTA 021_A3的对应的CDR序列相比通常包含一个或多个如本文定义的保守性序列修饰。
一旦获得编码VH和VK区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以便将可变区基因转变为全长抗体链基因，转变为Fab片段基因，或转变为scFv基因。在这些操作中，编码VK或VH的DNA片段可操作地与另一个编码另一蛋白(例如抗体恒定区或灵活的连接子)的DNA片段连接。如本文的情境中所使用的，术语“可操作地连接”意指两个DNA片段被连接在一起，从而由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持是符合读框的。
可以通过将编码VH的DNA可操作地与编码重链恒定区(CH1，CH2和CH 3)的另一DNA分子连接而将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH公开号No.91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
可以通过将编码VL的DNA可操作地与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子连接而将编码VL/VK区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHumanServices，NIH公开号No.91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL/VK的DNA片段可操作地与编码灵活连接子(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的)另一片段连接，从而VH和VL/VK序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL/VK和VH区通过所述灵活连接子被连接(见，例如Bird et al.(1988)Science242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature 348：552-554)。
单克隆抗体的产生
可以通过各种技术产生本发明的单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256：495的标准体细胞杂交技术。虽然体细胞杂交程序是优选的，但是原则上可以采用其它的用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是被良好建立了的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
可以基于如上文的描述而制备的非人单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可以从非人目标杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA并使用标准的分子生物学技术进行工程化以使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)将鼠可变区连接至人恒定区。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)将鼠CDR区插入至人框架中。
在优选的实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对CADM1的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称作HuMAb和KM 株的小鼠，并且在本文中联合被称作“人Ig小鼠”。
HuMAb株(Inc.)含有人免疫球蛋白基因微小基因座，其编码非重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向的突变(见，例如Lonberg，et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示出减少的小鼠IgM或κ的表达，并且，响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因发生类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，见上文；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101中；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb 的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.et al.(1992)Nucleic Acids Research20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.(1994)InternationalImmunology6：579-591；和Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些文献的内容通过引用方式以其全文被特别并入本文。另外见Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公开WO 92/03918，WO93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开WO 01/14424。
在另一个实施方式中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)来产生本发明的人类抗体。这种小鼠在本文中被称作“KM ”株的小鼠，在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中有详细描述。
另外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统，可用于产生本发明的抗-CADM1抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse(Amgen，Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠被描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中。
此外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统，可用于产生本发明的抗-CADM1抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；此类小鼠被描述于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的母牛(Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology 20：889-894和PCT申请WO/2002/092812)，并且可被用于产生本发明的抗-CADM1抗体。
还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人单克隆抗体。本领域建立了此类用于分离人类抗体的噬菌体展示方法。见，例如，Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；Gr iffi ths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
还可以使用这样的SCID小鼠来制备本发明的人单克隆抗体：向其中重构了人免疫细胞，从而可以在免疫后产生人类抗体应答。此类小鼠被描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
人Ig小鼠的免疫
当使用人Ig小鼠来产生本发明的人类抗体时，可以使用CADM1抗原和/或重组CADM1的纯化的或富集的制备物或表达CADM1的细胞或CADM1融合蛋白来免疫此类小鼠，如Lonberg，N.et al.(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)NatureBiotechnology 14：845-851；和PCT公开WO 98/24884和WO 01/14424中所描述的。优选地，小鼠在第一次输注时是6-16周龄。例如，可以使用CADM1抗原的纯化的或重组的制备物(5-50μg)腹膜内地免疫人Ig小鼠。
用于产生针对CADM1的全人单克隆抗体的详细程序描述于下文的实施例1中。以多种抗原获得的累积的经验已经表明：当以完全弗氏佐剂中的抗原通过腹膜内(IP)方式进行最初免疫、然后以不完全弗氏佐剂中的抗原隔周IP免疫时(总共6周)，转基因小鼠有应答。然而，发现除了弗氏佐剂以外的其它佐剂也是有效的。另外发现：在不存在佐剂的情况下，完整细胞是高度免疫原性的。可以通过眶后取血获得的血浆样品在免疫程序的过程中监控免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆(如下文描述)，具有足够的抗CADM1人免疫球蛋白滴度的小鼠可被用于融合。可以在处死前3天使用抗原通过静脉内方式对小鼠加强免疫，并取出脾脏。预期对于每个免疫可能需要进行2-3次融合。通常，对于每种抗原进行6-24只小鼠的免疫。在一个实施方式中，可以使用携带HCo7，HCo12或HCol7人重链转基因株的小鼠株。备选地或另外，可以使用KM株。另外，可以将这些株中的两种或更多种共同繁育为含有多个不同人重链转基因的单一小鼠。
制备产生人单克隆抗体的杂交瘤
为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并与适宜的永生化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可以就抗原特异性抗体的产生来筛选所产生的杂交瘤。例如，可以使来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与含有50％PEG的1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。备选地，可以使用CytoPulse大室细胞融合电穿孔器(CytoPulseSciences，Inc.，Glen Burnie Maryland)，利用基于电场的电融合方法，使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合。将细胞以大约2x105铺板于平底的微量滴定板中，然后在含有20％牛克隆血清，18％″653″条件化培养基，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育2周。在大约2周后，可以在将HAT替换为HT的培养基中培养细胞。然后，可以通过ELISA就人单克隆IgM和IgG抗体筛选单个孔。一旦发生大量的杂交瘤生长，通常可以在10-14天后可观察培养基。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且，如果仍然是人IgG阳性的，可以通过有限稀释法将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，可以使所选择的杂交瘤在2升的旋转瓶中生长用于单克隆抗体的纯化。可以过滤上清液并浓缩，然后以蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和色谱。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查所洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液更换为PBS，可以使用1.43的消光系数通过OD280测定浓度。可以将单克隆抗体等份分装并储存于-80℃。
制备产生单克隆抗体的转染瘤
也可以使用例如本领域熟知的重组DNA技术与基因转染方法的组合(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达目的抗体的杂交瘤进行cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将该DNA插入至表达载体，从而基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在此情境中，术语“可操作地连接的”意指抗体基因被连接到载体中，从而该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。将表达载体和表达控制序列选择为与所用的表达宿主细胞相容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至单独的载体，或者更通常地，将这两个基因插入至同一表达载体。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补性限制性位点的连接，或者，如果不存在限制性位点，则进行平末端连接)将抗体基因插入至表达载体。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：通过将所述轻链和重链可变区插入至已经编码所需的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，从而VH区段可操作地连接于该载体内的CH区段，并且VK区段可操作地连接于该载体内的CL区段。另外或备选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，从而信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞内表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷化信号)，它们控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列被描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将理解，表达载体的设计、包括调节序列的选择可取决于如下因素，例如，待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如源自下列病毒的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)，猴病毒40(SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤。备选地，可以使用非病毒的调节序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。另外，调节序列包括来自不同来源的序列，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的序列(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起始点)和可选择的标志物基因。所述可选择的标志物基因促进其中导入了载体的宿主细胞的选择(见，例如Axel等人的美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择的标志物基因赋予其中导入了载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的可选择标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中以氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意在涵盖通常用于将异源DNA导入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更易于组装和分泌正确折叠且免疫上有活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达对于高产率产生活性抗体是无效的(Boss，M.A.andWood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，与DHFR可选择标志物一起使用，例如描述于R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是公开于WO 87/04462(Wilson的)，WO89/01036(Bebbington的)和EP 338,841(Bebbington的)中的GS基因表达系统。当把编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间而产生抗体，所述时间足以允许抗体在该宿主细胞中表达或更优选地，允许抗体被分泌到该宿主细胞所生长的培养基中。可以使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
抗体与抗原结合的表征
可以通过例如标准的ELISA就与CADM1的结合来检测本发明的抗体。简要地，以PBS中的0.25μg/ml的纯化的CADM1包被微量滴定板，然后以PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向每个孔中加入抗体的稀释物(例如来自经CADM1免疫的小鼠的血浆稀释物)并在37℃温育1-2小时。以PBS/Tween洗涤平板，然后以缀合于碱性磷酸酶的二级试剂(例如，对于人类抗体，使用山羊-抗-人IgG Fc-特异性多克隆试剂)在37℃温育1小时。洗涤之后，以pNPP底物(1mg/ml)使平板显色，并在405-650的OD进行分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将被用于融合。
也可以使用如上所述的ELISA测定法来筛选显示出与CADM1免疫原有阳性反应活性的杂交瘤。亚克隆并进一步表征那些以高亲和力与CADM1结合的杂交瘤。可以从每个保留亲本细胞的反应活性(通过ELISA测定)的杂交瘤中选择1个克隆，用于制成5-10瓶细胞库，贮存于-140℃，并用于抗体纯化。
为了纯化抗-CADM1抗体，可以使所选择的杂交瘤在2升的旋转瓶中生长以进行单克隆抗体的纯化。可以过滤上清液并浓缩，然后以蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和色谱。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查所洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液更换为PBS，可以使用1.43的消光系数通过OD280测定浓度。可以将单克隆抗体等份分装并储存于-80℃。
为了测定所选择的抗-CADM1单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用商业上可获得的试剂(Pierce，Rockford，IL)将每个抗体生物素化。可以按照上文的描述，使用CADM1包被的ELISA平板，使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体，进行与本发明的抗体的竞争性结合的研究。可以使用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合。
为了测定纯化的抗体的同种型，可以使用特异于特定同种型的抗体的试剂进行同种型ELISA。例如，为了测定人单克隆抗体的同种型，可以使用1μg/ml的抗-人免疫球蛋白在4℃过夜包被微量滴定板的孔。以1％BSA封闭后，使平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在室温反应1至2小时。然后可以使孔与人IgG1或人IgM特异性的经碱性磷酸酶缀合的探针反应。按照上文描述使平板显色并进行分析。
可以通过Western印迹就与CADM1抗原的反应活性进一步测试抗-CADM1人IgG。简要地，可以制备CADM1并使其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，以10％的胎牛血清封闭，并用待测的单克隆抗体进行探测。可以使用抗-人IgG碱性磷酸酶检测人的IgG结合并以BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。
还可以通过例如流式细胞术通过监控抗体与表达CADM1的细胞的结合来测定本发明的抗体结合特异性。通常，可以使用编码CADM1的跨膜形式的表达载体来转染细胞系(例如CHO细胞系)。在一些实施方式中，在CHO细胞系的细胞表面上表达具有氨基末端HA标签的全长CADM1分子(SEQ ID NO：43)。转染的蛋白可以包含标签，例如myc标签，优选在N末端，以便使用针对该标签的抗体进行检测。可以通过将经转染的细胞与抗体一起温育并检测所结合的抗体来测定本发明的抗体与CADM1的结合。抗体与转染的蛋白上的标签的结合可被用作阳性对照。
还可以使用相同的方法(测定与CADM1的结合的方法)通过测定抗体是否与其它蛋白(例如TSLL2/CADM1C或免疫球蛋白超家族的其它成员)结合来进一步研究本发明的抗体对于CADM1的特异性。
抗体-伴侣分子缀合物
在优选的方面，提供了包含根据本发明的抗-CADM1抗体和伴侣分子的缀合物，所述缀合物由式(a)表示
Z[(XZ)aC(XD)bD]m (a)
其中Z是根据本发明的抗体；D是伴侣分子；(XZ)aC(XD)b合起来被称作“连接子部分”或“连接子”，因为它们连接前2个元件。在连接子内，C是可切割基团，其被设计为在伴侣分子D的预期的生物学作用的位点处被切割；XZ和XD被称作间隔子部分(或“间隔子”)，因为它们分别将Z和C以及C和D间隔开；下标a和b独立地是0或1(即，XZ和/或XD的存在是任选的)；下标m是1，2，3，4，5，6，7，8，9或10(优选为1，2，3或4)。下文更详细地定义了上述各项。
抗体Z发挥靶向功能：通过结合其抗原所位于的靶组织或细胞，其将缀合物指引至那里。优选地，靶组织或细胞是肿瘤或癌细胞，并且抗原是肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。在靶组织或细胞处，基团C的切割会释放伴侣分子D，以执行其预期的生物学功能。在一些情况下，缀合物通过胞吞作用而被内化到靶细胞中，并且切割发生于靶细胞内。通过这种方式，在作用位点处实现伴侣分子D的精确递送，减少了所需的剂量。另外，伴侣分子D在其缀合态时通常是无生物学活性的(或活性显著较低)，从而减少了针对非靶组织或细胞的不希望的毒性。由于抗癌药物通常是具有低治疗指数的高度毒性化合物，所以这是一项重要的考虑。
如下标m所反映的，抗体Z的每个分子可以与多于一个伴侣分子D缀合，这取决于前者所具有的可用于缀合的位点的数目以及所采用的实验条件。本领域技术人员将理解，虽然抗体Z的每个分子与整数数目的伴侣分子D缀合，但是缀合物的制备物可分析为伴侣分子D与抗体Z的非整数比率，这反映了统计学上的平均数。
抗体Z
抗体Z上的数个不同反应活性基团中的任一个可被用作缀合位点，包括赖氨酸残基中的ε-氨基，悬垂的碳水化合物部分，羧酸基团，二硫基以及巯基。每种类型的反应活性基团代表一种权衡，具有一些优点但也具有一些抵消性的局限。关于适合于缀合的抗体反应活性基团的综述，见例如Garnett，Adv.Drug Delivery Rev.53(2001)，171-216和Dubowchik and Walker，Pharmacology & Therapeutics 83(1999)，67-123，其公开内容通过引用方式并入本文。
在一个实施方式中，抗体Z通过赖氨酸ε-氨基缀合。多数抗体具有多个暴露的赖氨酸ε-氨基，可以使用本领域已知的技术(包括使用异双官能试剂修饰)(如下文进一步描述的)通过酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯键缀合。然而，控制哪些和多少ε-氨基发生反应是困难的，这导致缀合物制备物中潜在的批与批之间的差异。另外，缀合可引起中和对于维持抗体的天然构象而言是重要的质子化的ε-氨基，或者缀合可能发生在接近抗原结合位点的地方或发生于抗原结合位点，这两种情况都不是希望发生的。
在另一个实施方式中，抗体Z可以通过碳水化合物侧链缀合，因为很多抗体是糖基化的。可以使用高碘酸盐氧化碳水化合物侧链以产生醛基，醛基继而可以与胺反应以形成亚胺基团，例如在缩氨基脲、肟或腙中。如果需要，可用氰基硼氢化钠还原亚胺基团以产生更稳定的键。关于通过碳水化合物侧链进行缀合的其它公开物，见例如Rodwell et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83，2632-2636(1986)；其公开内容通过引用方式并入本文。如同使用赖氨酸ε-氨基一样，存在关于缀合位点的位置和化学计算学的担忧。
在另一个实施方式中，抗体Z可以通过羧酸基团缀合。在一个实施方式中，使末端羧酸基团官能化以产生碳酰肼，然后碳酰肼与携带醛的缀合部分反应。见Fisch et al.，Bioconjugate Chemistry 1992，3，147-153。
在另一个实施方式中，抗体Z通过桥接抗体Z上的半胱氨酸残基的硫与缀合物的其它部分上的硫的二硫基缀合。一些抗体(例如IgG同种型)缺少游离的巯基但具有(例如在铰链区中)二硫基。在这样的情况中，可以通过还原天然的二硫基产生游离的巯基。然后，如此产生的巯基可被用于缀合。见，例如，Packard et al.，Biochemistry 1986，25，3548-3552；King et al.，Cancer Res.54，6176-6185(1994)；和Doronina et al.，NatureBiotechnol.21(7)，778-784(2003)；其公开内容通过引用方式并入本文。同样地，存在关于缀合位置和化学计算学以及可能破坏抗体的天然构象的担忧。
在另一个优选的实施方式中，抗体Z通过巯基向受体部分的亲核加成产物缀合。优选的受体部分是马来酰亚胺基团，其与抗体巯基的反应示意如下：
已经开发了多种用于将游离巯基导入抗体而不破坏天然二硫基的方法，所述方法可用于本发明的抗体Z。取决于所采用的方法，有可能在特定的位置导入数目可预测的游离巯基。在一种方法中，制备突变的抗体，其中半胱氨酸被另一种氨基酸代替了。见，例如，Eigenbrot等人的US 2007/0092940A1；Chilkoti et al.，Bioconjugate Chem.1994，5，504-507；Urnovitz et al.，US 4,698,420(1987)；Stimmel et al.，J.Biol.Chem.，275(39)，30445-30450(2000)；Bam et al.，US7,311,902B2(2007)；Kuan et al.，J.Biol.Chem.，269(10)，7610-7618(1994)；Poon et al.，J.Biol.Chem.，270(15)，8571-8577(1995)。在另一种方法中，向C末端添加另外的半胱氨酸。见，例如Cumber et al.，J.Immunol.，149，120-126(1992)；King et al，Cancer Res.，54，6176-6185(1994)；Li etal.，Bioconjugate Chem.，13，985-995(2002)；Yang et al.，Protein Engineering，16，761-770(2003)；和Olafson et al.，Protein Engineering Design & Selection，17，21-27(2004)。King在2007年8月22日递交的美国临时申请系列号60/957,271中教导了导入游离半胱氨酸的优选方法，其中，携带半胱氨酸的氨基酸序列被添加到抗体的重链的C-末端。该方法在远离抗原结合位点的已知位置处导入数目已知的半胱氨酸残基(1个半胱氨酸残基/重链)。本段中引用的该文献的公开内容全部通过引用方式并入本文。
在另一个实施方式中，可以使用异双官能试剂(例如2-亚氨基硫杂环戊烷或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP))修饰赖氨酸ε-氨基，将ε-氨基转化为巯基或二硫基--产生半胱氨酸替代品，如其那样。然而，该方法同样具有与ε-氨基相关的缀合位置和化学计算学局限性。
伴侣分子D
伴侣分子D可以是治疗剂或标志物。如果是前者，其可以是例如细胞毒素，非细胞毒性药物(例如免疫抑制剂)，放射活性剂，另一种抗体，或酶或其活性片段，例如相思豆毒素，篦麻毒素A，假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或，生物应答修饰剂，例如，淋巴因子，白介素-1(″IL-1″)，白介素-2(″IL-2″)，白介素-6(″IL-6″)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。如果是后者，其可以是任意的产生可检测信号的部分，例如放射标记物，荧光标记物，或催化底物的可检测修饰的酶。可以与抗体缀合以用于诊断或治疗性应用的放射活性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域已经建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是商业上可获得的，包括(IDECPharmaceuticals)和(CorixaPharmaceuticals)，类似的方法可被用于使用本发明的抗体来制备放射免疫缀合物。
细胞毒素或细胞毒性试剂包括任何对于细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。实例包括紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴乙啶，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，多柔比星，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，1-去氢睾甾酮，糖皮质激素类，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素，及其类似物或同源物。
当伴侣分子D是治疗剂时，治疗剂的适宜的类别包括抗代谢物、烷基化试剂、DNA小沟结合剂、DNA插入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。适宜的治疗剂的实例包括：放线菌素D，蒽环类，安曲霉素(AMC)，auristatin，博来霉素，白消安，加利车霉素，喜树碱，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)，顺铂，秋水仙碱，环磷酰胺，阿糖胞苷，细胞松弛素B，更生霉素，柔红霉素，氨烯咪胺，1-去氢睾甾酮，二溴甘露醇，二羟基炭疽菌素二酮，多柔比星，依米丁，埃博霉素，溴乙啶，依托泊苷，5-氟尿嘧啶，吉西他滨，糖皮质激素类，短杆菌肽D，伊马替尼，伊立替康，β-拉帕醌，利多卡因，洛莫司汀，美坦辛，氮芥，美法仑，6-巯嘌呤，甲氨蝶呤，光神霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，紫杉醇，普鲁卡因，普萘洛尔，嘌罗霉素，蓖麻蛋白，链脲霉素，辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)，他利霉素，替尼泊苷，丁卡因，硫酯，6-硫鸟嘌呤，tubulysin，长春碱，长春新碱，及其类似物、同源物或衍生物。
优选地，伴侣分子D是选自下列的细胞毒素：auristatins(尤其是MMAE和MMAF)，烯二炔类抗生素(尤其是刺孢霉素和CalichDMH)，多柔比星，美登木素(maytansinoid)(尤其是DM1和DM4)，假单胞菌外毒素A(尤其是其截短的形式)，DNA小沟结合烷化剂(尤其是CC-1065和多卡米星类似物)，及其类似物或衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的实例是商业上可获得的(American Home Products)。本领域技术人员将理解前述细胞毒素多数是天然产物，并且它们的一些修饰--即衍生--可能是需要的或必要的，以使它们为缀合而就绪。
优选的DNA小沟结合烷化剂是CC-1065的类似物或衍生物以及结构上相关的多卡米星，其适宜的实例公开于：Ng et al.，US 7,087,600B2(2006)；Ng et al.，US 6,989,452B2(2006)；Ng et al.，US 7,129,261B2(2006)；Ng et al.，WO 02/096910A1(2002)；Boyd et al.，US2006/0024317A1(2006)；Chen et al.，US 2006/0004081A1(2006)；Gangwar et al.，US 2006/0247295A1(2006)；Boyd et al.，WO2007/038658A2(2007)；Gangwar et al.，WO 2007/051081A1(2007)；Gangwar et al.，WO 2007/059404A2(2007)；Sufi et al.，WO2008/083312A2(2008)；和Chen等人的2008年2月20日递交的PCT申请号PCT/US2008/054362中；其公开内容通过引用方式并入本文。此类优选的伴侣分子D可以由式(b)表示：
其中
环系统A是取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，取代的或未取代的杂环烷基，例如苯基或吡咯；
E和G独立地是H，取代的或未取代的烷基，取代的或未取代的杂烷基，杂原子，或单键；或者E和G相联结以形成选自下列的环系统：取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，和取代的或未取代的杂环烷基；
X是O、S或NR23，其中R23是H，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂烷基，或酰基；
R3是(＝O)或OH；
R4，R4’，R5和R5’独立地是H，取代的或未取代的烷基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，取代的或未取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(＝O)NR15R16，OC(＝O)OR15，C(＝O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16或O(CH2)nN(CH3)2，其中n是1至20的整数，或者，R4，R4’，R5和R5’的任意相邻的一对(连同与其相连的碳原子)相联结以形成4至6元的取代的或未取代的环烷基或杂环烷基环系统；
R15和R16独立地是H，取代的或未取代的烷基，取代的或未取代的杂烷基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，取代的或未取代的杂环烷基，或取代的或未取代的肽基，其中R15和R16连同与其相连的氮原子任选地相联结以形成4至6元的取代的或未取代的杂环烷基环系统，其任选含有两个或更多个杂原子；
R6是单键，其存在或不存在；
R7是CH2-X1或-CH2-，条件是当R6存在时，R6和R7相联结以形成环丙基环；并且
X1是离去(leaving)基团，例如Cl，Br，F，甲磺酸盐或甲苯磺酸盐。
式(b)的伴侣分子可以通过R3，R4，R4’，R5和R5’之一缀合，优选通过R3(当R3是OH时)或R4，更优选通过R4。另外，R3可以携带前药化部分，如下文所讨论。
式(b)的优选伴侣分子由式(c)表示：
其中
R3，R4，R4’，R5，R5’，R6和R7如上文所定义；
Z是O，NH或N(低级烷基)；并且
R1，R1’，R2和R2’独立地是H，取代的或未取代的低级烷基，氰基，烷氧基，卤素，C(＝O)R8或CO2R8，其中R8是NR9R10或OR9，其中R9和R10独立地是H，取代的或未取代的烷基，或取代的或未取代的杂烷基。
更优选的实施方式显示于式(d)：
其中X1如上文所定义，并且X2是
具体的伴侣分子D的实例由式(e)表示：
当伴侣分子D是细胞毒素时，其可以是被前药化的，即，前药部分与其结合，需要去除所述前药部分以激活它。优选地，(1)通过不同于从缀合物上切割细胞毒素的反应机理来去除前药基团；(2)不去除前药基团或仅在缀合物在血浆中循环时缓慢去除它，但是(3)在靶组织或细胞处有效去除它。因此，如果缀合物在到达靶组织或细胞之前偶然被切割，则细胞毒素以其仍然无活性的前药形式被释放，这消除或降低了对非靶组织或细胞的细胞毒性。即，“需要第二切割以激活细胞毒素”提供了安全因素。在根据式(b)，(c)，(d)或(e)的细胞毒素的情况下，用于结合前药基团的优选位点是标记为“4”的位置。为了增加基团C的切割和前药部分的去除都由酶介导时的安全因素，优选使用不同的酶。
前药基团的非限制性实例包括酯、氨甲酸酯、磷酸酯和糖苷。为了阐明，可以使用下列前药部分将式(b)-(e)的细胞毒素中的4-位羟基前药化：
伴侣分子D也可以是标志物。标志物可以是任何产生可检测信号的标记物，例如放射标记物，荧光标记物，或催化底物的可检测修饰的酶。标记物(也称作报告基团或可检测标记物)是免疫测定、生物医学研究和医学诊断领域中熟知的，可以通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学方法来检测。标记物优选为放射活性同位素、荧光或化学发光试剂或其前体、生色团、酶或其组合。适宜的酶的实例有：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。荧光试剂包括荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括虫荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。
连接子-(XZ)aC(XD)b-
如上所述，本发明的缀合物的连接子部分包含至多3种元件：可切割的基团C和任选的间隔子XZ和XD。
选择可切割的基团C使得缀合物在血浆中处于一般循环时，所述可切割的基团C是相对稳定的，但是一旦缀合物到达预期的作用位点，则所述可切割的基团C被容易地切割。优选地，在抗体Z与靶细胞表面上展示的抗原结合之后，缀合物通过胞吞作用被靶细胞内化。随后，在靶细胞的囊泡小体(例如早期内体、晚期内体，尤其是溶酶体)中发生基团C的切割。
在一个实施方式中，基团C是pH敏感性基团。血浆中的pH稍高于中性，而溶酶体内的pH是酸性的，大约是5。因此，其切割为酸催化的基团C在溶酶体内的切割速率将比在血浆中的速率快几个数量级。适宜的酸敏感基团的实例包括顺式-乌头酰胺(cis-aconitylamide)和腙，如Shen et al.，US 4,631,190(1986)；Shen et al.，U S 5,144,011(1992)；Shen et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.102，1048-1054(1981)和Yang et al.，Proc.Natl Acad.Sci(USA)，85，1189-1193(1988)中所描述；其公开内容通过引用方式并入本文。
在另一个实施方式中，基团C是二硫化物。二硫化物可以通过硫醇-二硫化物交换机制被切割，切割速率依赖于环境硫醇浓度。由于谷胱甘肽和其它硫醇的细胞内浓度高于它们的血清浓度，所以二硫化物的切割速率在细胞内将会更高。此外，可以通过调节二硫化物的立体和电子特性(例如烷基-芳基二硫化物相对于烷基-烷基二硫化物；芳基环上的取代等)来调节硫醇-二硫化物的交换速率，使得能够设计具有增强的血清稳定性或特定切割速率的二硫键。关于缀合物中二硫化物可切割基团的其它公开物，见例如Thorpe et al.，Cancer Res.48，6396-6403(1988)；Santi et al.，US 2005/0287155A1(2005)；Ng et al.，US6,989,452B2(2006)；Ng et al.，WO 2002/096910A1(2002)；Boyd et al.，US 2006/0024317A1(2006)；和Sufi et al.，WO 2008/083312A2(2008)；其公开内容通过引用方式并入本文。
优选的基团C包含优先被蛋白酶在预期的作用位点处切割的肽键，而非在血清中被蛋白酶切割。通常，基团C包含1至20个氨基酸，优选1至6个氨基酸，更优选1至3个氨基酸。氨基酸可以是天然的和/或非天然的α-氨基酸。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及由其衍生的氨基酸，例如羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，瓜氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语氨基酸还包括氨基酸类似物和模拟物。类似物是具有天然氨基酸的相同的一般性H2N(R)CHCO2H结构的化合物，除了R基团不是存在于天然氨基酸中的之外。类似物的实例包括高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是具有与α-氨基酸的一般化学结构不同的结构但以相似方式发挥功能的化合物。术语“非天然氨基酸”意指代表″D″立体化学形式，天然氨基酸是“L”形式。
优选地，基团C包含作为蛋白酶的切割识别序列的氨基酸序列。很多切割识别序列是本领域已知的。见，例如Matayoshi et al.Science247：954(1990)；Dunn etal.Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah et al.Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber et al.Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith et al.Meth.Enzymol.244：412(1994)；和Bouvier et al.Meth.Enzymol.248：614(1995)；其公开内容通过引用方式并入本文。
对于那些不期望被细胞内化的缀合物，可选择基团C而使得其被存在于靶组织附近的细胞外基质中的蛋白酶切割，例如，由附近正在死亡的细胞释放的蛋白酶或肿瘤相关的蛋白酶。示例性的细胞外肿瘤相关的蛋白酶是甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。
对于被设计为被细胞内化的缀合物，基团C优选包含就被内体或溶酶体蛋白酶(尤其是后者)切割而选择的氨基酸序列。此类蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B，C，D，H，L和S，尤其是组织蛋白酶B。组织蛋白酶B优先在序列-AA2-AA1-处切割肽，其中AA1是碱性或强氢结合氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸)，并且AA2是疏水性氨基酸(例如苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，例如Val-Cit(其中Cit标示瓜氨酸)或Val-Lys。(在本文中，除非情境种另外明确指明，否则氨基酸序列按照N至C方向书写，如在H2N-AA2-AA1-CO2H中的情形。)关于组织蛋白酶可切割的基团的其它信息，见Dubowchik et al.，Biorg.Med.Chem.Lett.8，3341-3346(1998)；Dubowchik et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，83347-3352(1998)；和Dubowchik et al.，Bioconjugate Chem.13，855-869(2002)；其公开内容通过引用方式并入本文。
在一个实施方式中，基团C是包含2个氨基酸的序列-AA2-AA1-的肽，其中AA1是赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸，并且AA2是苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另一个实施方式中，C由1至5个氨基酸的序列组成，其选自：Val-Cit，Ala-Val，Val-Ala-Val，Lys-Lys，Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO：45)，Ala-Asn-Val，Val-Leu-Lys，Cit-Cit，Val-Lys，Lys，Cit，Ser和Glu。
包含单一氨基酸的可切割基团C的制备和设计在2008年2月20日递交的Chen等人的PCT申请号PCT/US2008/054362中有进一步讨论，其公开内容通过引用方式并入本文。
基团C还可以是光可切割的基团，例如，硝基苄醚，其在暴露于光时被切割。
基团C可以与抗体Z或伴侣分子D直接键合；即，间隔子XZ和XD(根据情况而定)可以不存在。例如，如果基团C是二硫化物，则两个硫之一可以是抗体Z上的半胱氨酸残基或其替代物。或者，基团C可以是与碳水化合物侧链上的醛键合的腙。或者，基团C可以是与抗体Z的赖氨酸ε-氨基形成的肽键。
当存在时，间隔子XZ提供基团C与抗体Z之间的空间间隔，以免前者在空间上干扰后者与抗原的结合，或者后者在空间上干扰前者的切割。此外，间隔子XZ可被用于赋予缀合物增加的溶解性或降低的聚集性质。间隔子XZ可以包含一个或多个可以以任意数目的组合组装的模块区段。间隔子XZ的适宜区段的实例是：
其中下标r是1至24，优选2至4。这些区段可以组合以形成间隔子XZ，例如：
如果存在，间隔子XD提供基团C与伴侣分子D之间的空间间隔，以免后者空间地或电子地干扰前者的切割。间隔子XD还能够向缀合物中导入额外的分子量和化学官能。一般地，额外的质量和官能将影响缀合物的血清半衰期和其它性质。因此，通过审慎选择间隔子基团，可以调节缀合物的血清半衰期。间隔子XD也能够由模块区段组装，如上文关于间隔子XZ的情境中所描述的。
间隔子XZ或XD或二者可以包含自我牺牲的部分。简要地，自我牺牲的部分是这样的部分：(1)与基团C以及抗体Z或伴侣分子D键合；并且(2)具有这样的结构：基团C的切割启动反应序列，这导致所述自我牺牲的部分与抗体Z或伴侣分子D解离(根据情况而定)。换言之，远离抗体Z或伴侣分子D的位点处的反应(基团C的切割)也引起XZ-Z或XD-D键的破坏。在间隔子XD的情况下，自我牺牲部分的存在是需要的，因为，如果在缀合物的切割之后，间隔子XD或其部分仍然保持与伴侣分子D结合，则后者的生物学活性将被损害。当可切割基团C是多肽时，使用自我牺牲部分是尤其优选的。
示例性的与伴侣分子D上的羟基或氨基键合的自我牺牲部分(i)-(v)显示如下：
在每种情况下，自我牺牲部分是虚线a和b之间的结构，显示了邻近的结构特征以提供情境。自我牺牲部分(i)和(v)与伴侣分子D-NH2键合(即，伴侣分子D通过氨基缀合)，而自我牺牲部分(ii)，(iii)和(iv)与伴侣分子D-OH键合(即，伴侣分子D通过羟基缀合)。虚线b处的酰胺键的切割(即基团C是肽)释放酰胺氮为胺氮，启动反应序列，这导致虚线a处的键的切割，由此释放伴侣分子D-OH或D-NH2(根据情况而定)。关于自我牺牲部分的其它公开物，见Carl et al.，J.Med.Chem.，24(3)，479-480(1981)；Carl et al.，WO 81/01145(1981)；Dubowchik et al.，Pharmacology & Therapeutics，83，67-123(1999)；Firestoneet al.，US 6,214,345B1(2001)；Toki et al.，J.Org.Chem.67，1866-1872(2002)；Doronina et al.，Nature Biotechnology 21(7)，778-784(2003)(erratum，p.941)；Boydet al.，WO 2005/112919(2005)；Boyd et al.，WO 2007/038658(2007)；Sufi et al.，WO2008/083312A2(2008)；Feng，US 7,375,078B2(2008)；和Senteret al.，US 2003/0096743A1(2003)；其公开内容通过引用方式并入本文。
缀合物的实例
以下显示了使用本发明的抗体Z(SH)m制备的缀合物的实例(其中m是1，2，3，4或5)。缀合物A-1至A-6和A-8至A-15是这样的缀合物：其中可切割基团C包含肽键。缀合物A-7和A-16是这样的缀合物：其中可切割基团C是腙。缀合物A-17和A-18是这样的缀合物：其中可切割基团C是二硫化物。在缀合物A-1至A-2、A-5至A-9、A-11至A-14和A-16中，伴侣分子D是具有与其连接的前药部分的细胞毒素。缀合物A-10，A-11，A-14和A-15是具有自我牺牲部分的缀合物(在缀合物A-10的情形中有两个自我牺牲部分)。缀合物A-1至A-8和A-10至A-18阐明了使用具有模块区段的间隔子。
当存在于前述式中时，Hal是Cl或Br，R30是如下所示的羧酸酯酶可切割的氨基甲酸酯前药基团：
缀合物的制备
优选地，通过首先连接伴侣分子D和连接子(XZ)aC(XD)b以形成D-(XZ)aC(XD)b-R31部分来制备本发明的缀合物，其中R31是适合于与抗体Z上的官能团反应以形成缀合物的官能团。适宜的基团R21的实例包括：
其中R32是Cl，Br，F，甲磺酸盐或甲苯磺酸盐，R33是Cl，Br，I，F，OH，-O-N-琥珀酰亚胺基，-O-(4-硝基苯基)，-O-五氟苯基或-O-四氟苯基。适宜的D-(XZ)aC(XD)b-R31部分的制备公开于Ng et al.，US 7,087,600B2(2006)；Ng et al.，US 6,989,452B2(2006)；Ng etal.，US7,129,261B2(2006)；Ng et al.，WO 02/096910A1(2002)；Boyd et al.，US 2006/0024317A1(2006)；Chen et al.，US 2006/0004081A1(2006)；Gangwar et al.，US 2006/0247295A1(2006)；Boyd et al.，WO 2007/038658A2(2007)；Gangwar et al.，WO 2007/051081A1(2007)；Gangwar et al.，WO 2007/059404A2(2007)；Sufi et al.，WO2008/083312A2(2008)；和2008年2月20日递交的Chen等人的PCT申请号PCT/US2008/054362；其公开内容通过引用方式并入本文。
在优选的实施方式(式M)中，R31是马来酰亚胺基团，并且抗体Z上的官能团是巯基，如下所示，使用缀合物A-2(其中Hal是Cl)和抗体Z(SH)m：
式M
以下是示例性的程序，基于：通过抗体的赖氨酸ε-氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷的反应将游离巯基导入抗体中，然后与药物-连接子部分D-(XZ)aC(XD)b-R31反应，其中R31是马来酰亚胺。最初，抗体被缓冲交换到含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，并被浓缩至5-10mg/mL。通过向抗体中加入2-亚氨基硫杂环戊烷实现硫醇化作用。可以通过预实验确定要加入的2-亚氨基硫杂环戊烷的量，其因抗体而异。在预实验中，向抗体中加入递增量的2-亚氨基硫杂环戊烷的滴定，然后在室温下与抗体温育1小时，使用Sephadex G-25柱使抗体脱盐到50mM pH 6.0HEPES缓冲液中，通过与二硫代二吡啶(DTDP)反应来迅速确定所导入的巯基的数目。巯基与DTDP的反应导致硫代吡啶的释放，可以在324nm通过分光光度法监测。通常使用的样品的蛋白质浓度为0.5-1.0mg/mL。可以使用280nm处的吸光度精确测定样品中的蛋白浓度，然后将每种样品的等份(0.9mL)与0.1mLDTDP(乙醇中的5mM贮液)在室温温育10分钟。仅缓冲液+DTDP的空白样品也一并温育。10分钟后，测定324nm处的吸光度，使用为19,800M-1的硫代吡啶的消光系数来定量巯基的数目。
通常，在该程序中希望有3个巯基/抗体的硫醇化水平。例如，对于某些抗体，这可以通过加入15倍摩尔过量的2-亚氨基硫杂环戊烷然后在室温温育1小时来实现。然后将抗体与2-亚氨基硫杂环戊烷以所需的摩尔比例温育，然后使其脱盐到缀合缓冲液中(含有5mM甘氨酸和2mM DTPA的50mM pH6.0的HEPES缓冲液)。将硫醇化的材料保持于冰上，同时按照上文的描述定量所导入的巯基数目。
在验证了所导入的巯基数目之后，以3倍摩尔过量/巯基加入药物-连接子部分D-(XZ)aC(XD)b-R31。使缀合反应在还含有终浓度为5％的二甲基亚砜(DMSO)或类似的备选溶剂的缀合缓冲液中进行。通常，药物-连接子贮液被溶解于100％DMSO中。将贮液直接加入至硫醇化的抗体中，这使得加入足够的DMSO以使终浓度为10％，或者，在含有终浓度为10％的DMSO的缀合缓冲液中预稀释，然后加入至等体积的硫醇化的抗体中。
将缀合反应混合物在室温温育2小时并伴随搅拌。温育之后，离心缀合反应混合物并使之过滤通过0.2μm的滤器。可以使用多种方法通过色谱法进行缀合物的纯化。在一种方法中，使用尺寸排阻色谱法在经含有5mM甘氨酸和50mM NaCl的50mM pH 7.2HEPES缓冲液的预平衡的Sephacryl S200柱上纯化缀合物。以28cm/h的线性流速实施色谱。收集含有缀合物的级分，汇集并浓缩。在备选的方法中，通过离子交换色谱进行纯化。条件因抗体而异，在每种情况下均应进行优化。例如，将抗体-药物缀合物反应混合物施加至经含有5mM甘氨酸的50mM pH5.5HEPES预平衡的SP-Sepharose柱。使用pH 5.5的平衡缓冲液中的0-1M NaCl梯度来洗脱抗体缀合物。汇集含有缀合物的相关级分并相对于配制缓冲液(含有5mM甘氨酸和100mM NaCl的50mM pH 7.2HEPES缓冲液)进行透析。
本领域技术人员将理解：上述条件和方法是示例性的和非限制性的，并且用于缀合抗体的其它方法是本领域已知的且可用于本发明中。
ADEPT
在另一个实施方式中，根据本发明的抗体缀合于酶，以用于抗体指引的酶前药治疗(ADEPT)。在ADEPT中，抗体将与其缀合的酶引导至肿瘤位点。在那里，酶作用于随后施用的前药以局部释放对应的活性药物。见，例如Melton et al.，J.Natl Cancer Inst.88(3/4)，153-165(1996)。可以缀合以用于ADEPT的示例性的酶包括羧基肽酶A和G2，碱性磷酸酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，β-内酰胺酶，β-葡萄糖苷酶，青霉素酰胺酶，氨基肽酶，胞嘧啶脱氨酶和硝基还原酶。
由于ADEPT无需从抗体释放酶，所以在抗体与酶之间存在可切割的基团不是必须的。因此，ADEPT缀合物可以由式(f)表示：
Z-X-D(f)
其中Z是本发明的抗体；D是酶，X是连接Z和D的连接子。
免疫缀合物
包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称作“免疫毒素”。
可以使用本领域可获得的连接子技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的连接子类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽连接子。可以选择连接子而使得例如，易于被溶酶体区室内的低pH切割，或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))切割。
双特异性分子
在另一个方面，本发明的特征在于包含本发明的抗-CADM1抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如另一抗体或针对受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体事实上可以被衍生或连接至多于一种其它功能分子以产生结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意在被如本文中所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以被官能地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)至一种或多种其它结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一种针对CADM1的第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。在本发明的具体实施方式中，所述第二靶表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够结合表达FcγR或FcαR的效应子细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))、并结合表达CADM1的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子将表达CADM1的细胞靶向效应子细胞并激发Fc受体介导的效应子细胞活性，例如表达CADM1的细胞的吞噬作用，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，细胞因子释放，或产生超氧阴离子。
在本发明的一个实施例中，其中双特异性分子是多特异性的，该分子除了抗-Fc结合特异性和抗-CADM1结合特异性之外，可以进一步包括第三结合特异性。在一个实施方式中，所述第三结合特异性是抗-增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合的分子，从而增加抗靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可以是结合给定分子(例如抗原或受体)的抗体、功能抗体片段或配体，从而导致针对Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效应的增强。“抗增强因子部分”能够结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地，抗增强因子部分能够结合与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分能够结合细胞毒性T-细胞(例如，通过CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它引起抗靶细胞的增强的免疫应答的免疫细胞)。
在一个实施方式中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，包括例如Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，Fd，dAb或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或如Ladner等人的美国专利号4,946,778中描述的单链构建体，其内容明确地通过引用方式并入。
在一个实施方式中，由单克隆抗体提供了对于Fcγ受体的结合特异性，其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文中所使用的，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因中的任一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，其被分组为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD 32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方式中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，其显示出对于单体I gG的高亲和力(108-109M-1)。
某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的产生和表征描述于Fanger等人的PCT公开WO88/00052和美国专利号4,954,617中，其教导通过引用方式完全并入本文。这些抗体结合FcγRI，FcγRII或FcγRIII的表位，其结合位点不同于受体的Fcγ结合位点，因此，它们的结合实质上不被生理水平的IgG阻断。用于本发明的特定的抗-FcγRI抗体是mAb 22，mAb 32，mAb 44，mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可以从美国典型微生物保藏中心ATCC以登记号HB9469获得。在其它实施方式中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征被描述于Graziano，R.F.et al.(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和Tempest等人的PCT公开WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型微生物保藏中心，其被命名为HA022CL1，登记号为CRL 11177。
在其它优选的实施方式中，针对Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体的抗体提供，例如Fc-α受体(Fc αRI(CD89))，其结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语″IgA受体″意在包括位于染色体19上的1个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码数个备选地剪接的跨膜的55至110kDa的同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞上组成型表达，但是在非效应子细胞群体上不表达。FcαRI具有针对I gA1和IgA2的中等亲和力(≈5x107M-1)，在暴露于细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF)时该亲和性增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已经描述了4种Fc αRI-特异性单克隆抗体，称作A3，A59，A62和A77，它们结合IgA配体结合域外的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选的激发受体，因为它们(1)主要表达在免疫效应子细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)上；(2)以高水平表达(例如5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介导剂；和(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
虽然人单克隆抗体是优选的，但是其它可在本发明的双特异性分子中采用的抗体有：鼠的，嵌合的和人源化的单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法通过缀合组成性结合特异性(例如抗-FcR和抗-CADM1结合特异性)来制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别产生双特异性分子的每种结合特异性，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联或交联剂来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)和硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)(见例如Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA etal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括描述于Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan et al.(1985)Science229：81-83和Glennieet al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中的那些。优选的缀合剂是SATA和硫代-SMCC，二者皆可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在特别优选的实施方式中，在缀合之前修饰铰链区以使其包含奇数的巯基残基，优选1个。
备选地，两种结合特异性可在同一载体中被编码，并且在相同的宿主细胞中被表达和组装。当双特异性分子是mAbxmAb，mAbxFab，Fabx F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含1个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含2个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少2种单链分子。用于制备双特异性分子的方法被描述于例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858种，所有这些文献均明确地通过引用方式并入本文。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western印迹测定来确认双特异性分子与它们的特定靶标之间的结合。这些测定法中的每一种一般通过采用特异于目的复合物的经标记的试剂(例如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。备选地，可以使用多种其它免疫测定法中的任一种来检测复合物。例如，可以对抗体进行放射活性标记并用于放射免疫测定(RIA)(见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoas says，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，通过引用方式并入本文)。可以通过例如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影的方法来检测放射活性同位素。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统抗体，可以通过使用抗体片段和抗体模拟物来实施。如下文详述，现在已经开发了多种抗体片段和抗体模拟物技术并且是本领域广泛已知的。虽然多种这些技术(例如结构域抗体、纳米抗体和UniBody)利用传统抗体结构的片段或其它修饰，但也有备选的技术，例如Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody，它们采用这样的结合结构：虽然它们模拟传统抗体结合，但是它们是通过不同的机制产生的并且通过不同的机制发挥作用。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单元，对应于人类抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量。Domantis已经开发了一系列全人VH和VL dAb的大的和高度功能性的文库(每个文库中有超过100亿个不同的序列)，并使用这些文库来选择特异于治疗靶标的dAb。与很多传统抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好地表达。可以通过参考美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684&0616640；WO05/035572，WO04/101790，WO 04/081026，WO 04/058821，WO04/003019和WO03/002609来获得结构域抗体的进一步详细内容及其制备方法，这些文献的每篇皆通过引用方式全文并入本文。
纳米抗体是抗体衍生的治疗蛋白，其包含天然存在的重链抗体的独特的结构和功能特性。这些重链抗体包含单一的可变域(VHH)和2个恒定域(CH2和CH3)。重要地，所克隆和分离的VHH域是非常稳定的多肽，其携带原始重链抗体的完全的抗原结合能力。纳米抗体与人类抗体的VH域具有高度同源性，并且可以进一步被人源化而不丧失任何活性。重要地，纳米抗体具有低免疫原性潜力，已经使用纳米抗体先导化合物在灵长类研究中确认了这一点。
纳米抗体组合了传统抗体的优点与小分子药物的重要特征。像传统抗体一样，纳米抗体显示出针对它们的靶标的高靶标特异性、高亲和性和低内在毒性。然而，像小分子药物一样，它们能够抑制酶并容易地接触受体缝隙。此外，纳米抗体是极度稳定的，可以通过注射之外的方式来施用(见，例如WO 04/041867，通过引用方式全文并入本文)并且易于制造。纳米抗体的其它优点包括识别不常见的或隐藏的表位(由于它们的尺寸小)、以高亲和力和选择性结合到蛋白靶标的腔中或活性位点中(由于它们独特的三维结构)、药物形式的灵活性、半衰期的调节(tailoring)和药物发现的容易性和速度。
纳米抗体由单基因编码，在几乎所有原核和真核宿主中高效产生，所述宿主例如：大肠杆菌(见，例如US 6,765,087，通过引用方式全文并入本文)、霉菌[例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)]和酵母[例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)](见，例如US6,838,254，通过引用方式全文并入本文)。生产过程可以按比例扩大，已经生产了数量为数千克的纳米抗体。由于纳米抗体显示出相对于传统抗体的优越的稳定性，所以它们可以被配制为长保质期、即用型的溶液。
纳米克隆(nanoclone)方法(见例如WO 06/079372，通过引用方式全文并入本文)是用于产生针对需要的靶标的纳米抗体的专利方法，其是基于自动化的高通量选择B细胞，并且可以被用于本发明的情境中。
UniBody是另一种抗体片段技术；然而其是基于去除IgG4抗体的铰链区的。铰链区的缺失产生基本上是传统的IgG4抗体一半大小的分子，并且具有单价结合区，而不是如IgG4抗体的二价结合区。还公知的是：IgG4抗体是惰性的，因此不与免疫系统相互作用，这对于治疗无需免疫应答的疾病是有利的，并且该优点被传递给UniBody。例如，UniBody可以发挥抑制或沉默而不杀死与其结合的细胞的功能。另外，UniBody与癌细胞的结合不刺激它们增殖。此外，由于UniBody是传统IgG4抗体的大约一半大小，所以它们可显示出在较大的实体肿瘤上的更好的分布，具有潜在的有利功效。UniBody以类似于完整IgG4抗体的速率从身体中被清除，并且能够以类似于完整抗体的亲和力结合其抗原。可以通过参考专利WO2007/059782获得关于UniBody的进一步详细内容，该文献通过引用方式全文并入本文。
Affibody分子代表基于58个氨基酸残基的蛋白结构域的一类新的亲和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合性结构域之一。这种三螺旋束结构域已经被用作支架以构建组合型嗜菌粒文库，可以使用噬菌体展示技术从所述文库中选择靶向所需分子的Affibody变体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，Bindingproteins selected from combinatorial libraries of an α-helicalbacterialreceptor domain，Nat Biotechnol 1997；15：772-7.RonmarkJ，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobul in A(IgA)-specific ligands from combinatorialengineering of proteinA，Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。Affibody分子简单、坚实的结构联合其低分子量(6kDa)使其适合于多种应用，例如，作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T，et al，Construction and characterization of affibody-Fcchimeras produced in Escherichiacoli，J Immunol Methods 2002；261：199-211)以及用于抑制受体相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developedby combinatorial protein engineering，Protein Eng 2003；16：691-7)。可以通过参考美国专利号5831012获得关于Affibody的进一步的详细内容及其生产方法，该文献通过引用方式全文并入本文。
经标记的Affibody也可用于测定同种型丰度的成像应用中。
DARP in(设计的锚蛋白重复蛋白)是已经被开发用于利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白)技术的一个实例。重复蛋白(例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白)是普遍存在的结合性分子，与抗体不同，其存在于细胞内和细胞外。它们独特的模块架构的特征在于重复性的结构单元(重复)，这些重复性的结构单元堆积在一起以形成延长的、显示出可变和模块靶标结合表面的重复结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样性的结合特异性的多肽的组合型文库。该策略包括显示可变表面残基的自我相容的重复的共有设计，以及将它们随机组装到重复结构域中。
可以在细菌表达系统中以非常高的产率产生DARPin，它们属于已知的最稳定的蛋白。已经选择了针对多种靶蛋白(包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒和膜蛋白)的高特异性、高亲和力的DARPin。可以获得具有单数位nM至pM范围的亲和力的DARPin。
DARPin已被用于广泛的应用中，包括ELISA、夹心式ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组化(IHC)、芯片应用、亲和纯化或Western印迹。还证明了DARPin在细胞内区室中具有高度活性，例如作为融合至绿色荧光蛋白(GFP)的细胞内标志物蛋白。DARPin还被用于以pM范围内的IC50抑制病毒的进入。DARPin不仅对于阻断蛋白-蛋白相互作用是理想的，而且还抑制酶。已经成功抑制了蛋白酶、激酶和转运蛋白，常常是变构抑制模式。在肿瘤上非常快的和特异性的富集和非常有利的肿瘤与血液的比例使DARPin非常适合于体内诊断或治疗方法。
关于DARPin和其它DRP技术的其它信息可见于美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO 02/20565，二者均通过引用方式全文并入本文。
Anticalin是另一种抗体模拟技术，然而在该情况下，结合特异性源自lipocalin，其是在人组织和体液中天然且丰富表达的低分子量蛋白家族。Lipocalin已经进化为在体内执行多种与化学上敏感的或不可溶的化合物的生理学转运和储存相关的功能。Lipocalin具有坚实的内在结构，包含高度保守的β-桶，其在蛋白的1个末端支持4个环。这些环形成进入结合袋的入口，并且分子的该部分中的构象差异解释了单个的lipocalin之间结合特异性的差异。
虽然由保守的β-片层框架支持的高变环的总体结构暗示其是免疫球蛋白，但是lipocalin与抗体在大小方面具有显著差异：其由160-180个氨基酸的单一多肽链组成，其略微大于单一的免疫球蛋白结构域。
克隆了Lipocalin并使它们的环经历工程化以产生Anticalin。已经产生了结构上多样的Anticalin的文库并且Anticalin展示允许选择和筛选结合功能，然后在原核或真核系统中表达并产生可溶性蛋白用于进一步的分析。研究已经成功地表明了可以开发并分离特异于几乎任意人类靶蛋白的Anticalin，并且可以获得nM或更高范围的结合亲和力。
Anticalin也可以被制为双靶向蛋白的形式，即所谓的Duocalin。Duocalin结合使用标准制造方法容易地产生的一个单体蛋白中的两个单独的治疗靶标，并且保持靶标特异性和亲和性，与其两个结合结构域的结构方向无关。
通过单一分子调整多个靶标在已知涉及多于一个单一诱因的疾病中是特别有利的。此外，双或多价结合形式(例如Duocalin)具有靶向疾病中的细胞表面分子、介导对于信号转导途径的激动效应或诱导增强的内化效应(通过结合并簇集细胞表面受体)的巨大潜力。此外，Duocalin的高内在稳定性与单体Anticalin是相当的，这为Duocalin提供了灵活的配制和递送潜在可能性。
关于Anticalin的其它信息可以见美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO 99/16873，二者均通过引用方式全文并入本文。
用于本发明的情境中的另一种抗体模拟技术是Avimer。Avimer是通过体外外显子改组和噬菌体展示而由人细胞外受体结构域的大家族进化来的，其产生具有结合和抑制特性的多结构域蛋白。已经表明连接多个独立的结合结构域会产生亲和力并产生与常规的单表位结合蛋白相比改进的亲和力和特异性。其它潜在优点包括在大肠杆菌中简单并有效产生多靶标-特异性分子，改进的热稳定性和对于蛋白酶的抗性。已经获得了针对多种靶标的亚nM的亲和力的Avimer。
关于Avimer的其它信息可以见美国专利申请公开号2006/0286603，2006/0234299，2006/0223114，2006/0177831，2006/0008844，2005/0221384，2005/0164301，2005/0089932，2005/0053973，2005/0048512，2004/0175756，这些文献全部通过引用方式全文并入本文。
Versabody是另一种可用于本发明的情境中的抗体模拟技术。Versabody是具有＞15％的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白，其形成高的二硫化物密度支架，替代通常的蛋白质具有的疏水性核心。将大数目的疏水性氨基酸(构成疏水性核心)替换为小数目的二硫化物导致产生更小的、更加亲水的(更少的聚集和非特异性结合)、对于蛋白酶和热的抗性更高并且具有更低密度的T-细胞表位的蛋白，因为对于MHC呈递贡献最大的残基是疏水性的。公知所有这4个特征影响免疫原性，并且预期它们联合起来会引起免疫原性的大幅降低。
Versabody的启迪来源于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和银莲花属(anemone)产生的天然的可注射的生物药物，这些药物已知显示出出人预料的低免疫原性。从所选择的天然蛋白家族出发，通过设计并通过筛选尺寸、疏水性，蛋白水解性抗原加工，而使表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白的平均水平。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了多方面的形式，包括：多价性、多特异性、多种半衰期机制、组织靶向模块以及不存在抗体Fc区。此外，Versabody是在大肠杆菌中以高产率制备的，由于它们的亲水性和小的尺寸，Versabody是高度可溶的并且可以被配制为高浓度。Versabody具有格外的热稳定性(它们可以被煮沸)并且提供延长的保质期。
关于Versabody的其它信息可以见美国专利申请公开号2007/0191272，该文献通过引用方式全文并入本文。
以上提供的关于抗体片段和抗体模拟技术的详细描述不是意在穷举所有的可用于本说明书的情境的技术。例如，并且也不是以限制的方式：有多种其它的技术可被用于本发明的情境中，所述技术包括备选的基于多肽的技术，例如互补决定区的融合，如Qui etal.，Nature Biotechnology，25(8)921-929(2007)(通过引用方式全文并入本文)所概述的；以及基于核酸的技术(例如RNA适体技术，其描述于美国专利号5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774和6,387,620中(全部通过引用方式并入本文))。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。此类组合物可以包括一种或组合的(例如两种或更多种不同的)本发明的抗体或免疫缀合物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性物质)的组合。
本发明的药物组合物还能够以组合治疗(即与其它试剂相组合)的方式被施用。例如，组合治疗可包括本发明的抗-CADM1抗体，其与至少一种其它抗炎或免疫抑制试剂组合。可以用于组合治疗的治疗剂的实例在下文中关于本发明的抗体的用途部分有更详细的描述。
如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被于材料内以保护化合物免受酸和其它可能灭活该化合物的天然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持亲本化合物的所需生物学活性并且不赋予任何不希望的毒理学效应的盐(见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生于非毒性无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些，以及衍生自非毒性的有机酸(例如脂肪族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及衍生自非毒性有机胺(例如N，N′-二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如维生素C棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的药物组合物中的适宜的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物；植物油，例如橄榄油；和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以通过使用包被物质(例如卵磷脂)、通过维持需要的颗粒大小(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持合适的流体性。
这些组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序(见上文)和通过包括多种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要向组合物中加入等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过加入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂在药学活性物质中的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂达到与活性化合物不相容的程度，其在本发明的药物组合物中的使用均被考虑到。也可以向组合物中整合补充性活性化合物。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可以被配制为溶液、微乳液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及适宜的它们的混合物。可以通过使用包被物质(例如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒大小(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持合适的流体性。在很多情况下，优选使组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇)、山梨醇或氯化钠。可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。
无菌可注射溶液可以这样制备：将所需量的活性化合物加入到合适的溶剂与一种或组合的上文所列成分(根据需要)中，然后灭菌微过滤。一般地，通过将活性化合物加入到含有基本分散介质和来自上述的所需其它成分的无菌媒介中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其由之前无菌过滤的溶液产生活性成分的粉末加上任何其它所需的成分。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者和特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效应的组合物的量。一般地，在100％中，此量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
将剂量方案调整为提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单一推注，可以在一定时间内施用数次经划分的剂量，或者可以根据治疗状况的紧急性所显示的而按比例减少或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制为单元剂型以便容易施用和用于剂量的均一性。如本文中所使用的，单元剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单元化剂量的物理上不连续的单元；每个单元包含预定量的活性化合物(计算为产生所需的治疗效应)与所需的药学载体相联合。本发明的单元剂型的规格由下列规定并直接依赖于下列：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效应；和(b)化合物领域中内在的限制，例如用于治疗个体中的敏感性的活性化合物。
对于抗体的施用，剂量范围为大约0.0001至100mg/kg，更通常是0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案使得每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。对于本发明的抗-CADM1抗体，优选的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重(通过静脉内施用)，使用下列给药安排之一给予所述抗体：(i)每4周1次共6剂，然后每3个月1次；(ii)每3周1次；(iii)3mg/kg体重1次，然后1mg/kg体重每3周1次。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量均在所表明的范围内。通常多次地施用抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量针对患者中的靶抗原的抗体的血液水平所指明的。在一些方法中，将剂量调整为达到大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中是大约25-300μg/ml。
备选地，可以以缓释制剂施用抗体，在这种情况下，需要更少频率的施用。剂量和频率根据患者中的抗体的半衰期而变化。一般地，人类抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不经常的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受所述处理。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至减少或终止疾病的进展，优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以按照预防性方案向患者施用。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效达到针对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗性应答而对所述患者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所采用的本发明的特定成分或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定成分组合使用的其它药物、化合物和/或材料，被处理的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前的医疗史，以及医学领域熟知的其它因素。
“治疗上有效剂量”的本发明的抗-CADM1抗体优选引起疾病症状的严重性的降低，无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或防止由于疾病折磨而造成的损害或失能。例如，为了治疗CADM1+肿瘤，“治疗上有效的剂量”优选使细胞生长或肿瘤生长相对于未经治疗的受试者被抑制至少大约20％，更优选至少大约40％，更优选至少大约60％，更优选至少大约80％。可以在预测人类肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。备选地，可以通过测定化合物抑制细胞生长的能力评价组合物的这种性质，此类抑制可以通过本领域技术人员已知的测定法在体外被测量。治疗上有效量的治疗化合物能够减小肿瘤大小，或缓解受试者中的症状。本领域普通技术人员将能够基于例如下列因素来确定所述量：受试者的尺寸(size)、受试者症状的严重性以及特定组合物或所选择的施用途径。
可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据需要的结果而变化。用于本发明的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文中所使用的，短语“肠胃外施用”的意思是除了经肠道和表面施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径而被施用，例如表面，表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内，经口，经阴道，经直肠，舌下或表面。
可以使用将保护化合物不会快速释放的载体来制备活性化合物，例如控释制剂，包括移植物、透皮贴和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的很多方法已经被专利化或者是本领域技术人员通常已知的。见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以使用本领域已知的医疗设备来施用治疗组合物。例如，在优选的实施方式中，可以使用无针头的皮下注射设备来施用本发明的治疗组合物，例如公开于美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中的设备。用于本发明的移植物和模块的熟知的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分散药物的可移植的微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于透过皮肤施用药物的治疗设备；美国专利号4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于持续性药物递送的可变流可移植输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔隔室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。这些专利通过引用方式并入本文。许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在一些实施方式中，可以将本发明的人单克隆抗体配制为确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿越BBB(如果需要)，可以将它们配制于例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种被选择性转运到特定细胞或器官、由此增强靶向的药物递送的部分(见，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括：叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Bris coe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；另外见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
用途和方法
本发明的抗体(尤其是人类抗体)、抗体组合物和方法具有多种体外和体内的诊断性和治疗性用途，所述用途涉及诊断和治疗CADM1介导的病症。例如，可以在体外或离体地向培养物中的细胞施用这些分子，或例如体内向人类受试者施用这些分子，以治疗、预防和诊断多种病症。如本文中所使用的，“受试者”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、母牛、马、鸡、两栖类和爬行类。优选的受试者包括具有由CADM1活性介导的病症的人类患者。所述方法特别适合用于治疗具有与异常的CADM1表达相关的病症的人类患者。当与另一种试剂一起施用针对CADM1的抗体时，可以按照任意顺序或同时施用二者。
鉴于本发明的抗体针对CADM1的特异性结合，本发明的抗体可被用于特异性地检测细胞表面上的CADM1的表达，此外，本发明的抗体可被用于通过免疫亲和纯化法纯化CADM1。
此外，鉴于CADM1在多种肿瘤细胞上表达，本发明的人类抗体、抗体组合物和方法可被用于治疗具有肿瘤形成性病症的受试者，例如其特征在于存在表达CADM1的肿瘤细胞的病症，包括例如，小细胞肺癌、成人T细胞白血病、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
在一个实施方式中，本发明的抗体(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可被用于检测CADM1的水平，或在其膜表面上包含CADM1的细胞的水平，所述水平可以与某些疾病症状相关联。备选地，抗体可被用于抑制或阻断CADM1的功能，继而可以与预防或缓解某些疾病症状相关联，从而暗示CADM1是所述疾病的介导者。这可以如下实现：将样品和对照样品与抗-CADM1抗体在允许在所述抗体与CADM1之间形成复合物的条件下接触。检测在抗体与CADM1之间形成的任何复合物，并在样品和对照中进行比较。
在另一个实施方式中，最初可以就与体外治疗或诊断用途相关的结合活性测试本发明的抗体(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)。例如，可以使用以下实施例中描述的流式细胞术测定法来检测本发明的组合物。
本发明的抗体(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子、免疫缀合物和组合物)在治疗和诊断CADM1相关的疾病中有额外的用处。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫缀合物可被用于在体内或体外引发一种或多种下列生物学活性：抑制表达CADM1的细胞生长和/或杀死表达CADM1的细胞；在存在人效应子细胞的情况下介导表达CADM1的细胞的吞噬或ADCC；或阻断CADM1配体与CADM1的结合。
在具体的实施方式中，所述抗体(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内被用于治疗、预防或诊断多种CADM1相关的疾病。CADM1相关的疾病的实例尤其包括代表小细胞肺癌、神经内分泌胰腺癌、肝癌、肺类癌和胃肠道类癌的人类癌组织。
适合于在体内和体外施用本发明的抗体成分(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的途径是本领域熟知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。例如，可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用抗体成分。所使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和重量以及抗体成分的浓度和/或制剂。
如上文所述，本发明的抗-CADM1抗体可以与一种或多种其它治疗剂(例如细胞毒性试剂、放射毒性试剂或免疫抑制剂)共同施用。抗体可以与试剂(例如免疫复合物)连接或者可以与所述试剂分别施用。在后者的情况下(分别施用)，可以在所述试剂之前、之后或与并行地施用抗体，或者可以与其它已知的治疗(例如抗癌治疗例如放射)共同施用。此类治疗剂尤其包括抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲，它们自身仅在对患者有毒性或亚毒性的水平才有效。以100mg/kg的剂量每4周1次通过静脉内施用顺铂，以60-75mg/ml的剂量每21天通过静脉内施用阿霉素。与化疗剂共同施用本发明的人抗-CADM1抗体或其抗原结合片段提供两种通过不同机制作用的抗癌试剂，这对人肿瘤细胞产生细胞毒性效应。此类共同施用能够解决由于出现药物抗性或肿瘤细胞的抗原性变化(这会使它们对于抗体无反应)而产生的问题。
靶标特异性效应子细胞(例如与本发明的成分(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应子细胞)也可用作治疗剂。用于靶向的效应子细胞可以是人白细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其它的细胞包括嗜酸细胞、天然杀伤细胞和其它携带IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，可以从待治疗的受试者获得效应子细胞。靶标特异性效应子细胞可以作为生理上可接受的溶液中的细胞的悬浮液而被施用。所施用的细胞的数目可以是108-109的数量级，但是将根据治疗目的而变化。一般地，所述量将足以获得在靶细胞(例如表达CADM1的肿瘤细胞)上的定位，并通过例如吞噬影响细胞杀伤。施用途径也可以变化。
使用靶标特异性效应子细胞的治疗可以与用于去除靶细胞的其它技术联合进行。例如，使用本发明的成分(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子)和/或用这些成分装备的效应子细胞的抗肿瘤治疗可与化疗联合使用。另外，组合免疫治疗可被用于将两个不同的细胞毒性效应子群体引向肿瘤细胞排斥。例如，连接于抗-Fc-γRI或抗-CD3的抗-CADM1抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子还可被用于调节效应子细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽和清除它们。抗-Fc受体的混合物也可被用于此目的。
也可以在存在补体的情况下使用具有补体结合位点的本发明的成分(例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体，多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)，所述位点为例如来自IgG1，IgG-2或IgG-3或IgM的结合补体的部分。在一个实施方式中，可以通过加入补体或含补体的血清来补充以本发明的结合剂和合适的效应子细胞对包含靶细胞的细胞群体的离体处理。可以通过补体蛋白的结合来改善使用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬。在另一个实施方式中，也可以通过补体来裂解用本发明的成分(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞。在另一个实施方式中，本发明的成分不激活补体。
本发明的成分(例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体，多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)也可以与补体一起施用。在一些实施方式中，本公开物提供了包含人类抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。当补体位于接近人类抗体、多特异性或双特异性分子的位置时，这些组合物可以是有利的。备选地，本发明的人类抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清可以被单独施用。
在本发明范围内的还有包含本发明的抗体成分(例如人类抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。所述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒性试剂或放射毒性试剂，或一种或多种另外的本发明的人类抗体(例如具有互补活性的、结合CADM1抗原上的与第一人类抗体所结合的表位不同的表位的人类抗体)。
因此，可以向以本发明的抗体成分治疗的患者另外施用(在施用本发明的人类抗体之前、与之同时或之后)增强或增加人类抗体的治疗效应的另一种治疗剂(例如细胞毒性试剂或放射毒性试剂)。
在其它实施方式中，可以另外使用调节(例如增强或抑制)Fc γ或Fc γ受体的表达或活性的试剂来处理受试者，例如用细胞因子处理受试者。用于在使用多特异性分子进行处理的过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的成分(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子)也可被用于靶向表达FcγR或CADM1的细胞，例如用于标记此类细胞。对于此类应用，结合剂可以被连接至可以被检测的分子。因此，本发明提供了用于离体或在体外定位表达Fc受体(例如Fc γR或CADM1)的细胞的方法。可检测的标记物可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在具体的实施方式中，本发明提供了用于检测样品中的CADM1抗原的存在的方法，或测量CADM1抗原的量的方法，所述方法包括：使特异性结合CADM1的人单克隆抗体或其抗原结合部分在允许在抗体或其部分与CADM1之间形成复合物的条件下接触样品和对照样品。然后检测复合物的形成，其中，对照样品与样品相比较，复合物形成的差异表示样品中CADM1抗原的存在。
在其它实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中由CADM1介导的病症的方法，所述病症为例如人类的癌症，包括小细胞肺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。
在另一个实施方式中，本发明的免疫缀合物可以通过将化合物连接至抗体而被用于将所述化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有CADM1细胞表面受体的细胞。例如，抗-CADM1抗体可以被缀合于美国专利号6,281,354和6,548,530，美国专利公开号20030050331、20030064984、20030073852和20040087497，或公开于WO 03/022806中的任意毒素化合物。因此，本发明还提供了用于离体或在体内定位表达CADM1的细胞的方法(例如使用可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。备选地，免疫缀合物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向CADM1而被用于杀死具有CADM1细胞表面受体的细胞。
通过下列实施例进一步阐释了本发明，下列实施例不应被解释为进一步的限制。所有的附图和本申请中引用的所有的参考文献、专利和已公开的专利申请的内容皆明确地通过引用方式并入本文。
实施例
实施例1：抗CADM1抗原的人单克隆抗体的产生
通过标准重组方法产生了由连接于非CADM1多肽(his蛋白)的CADM1的细胞外结构域(CADM1ECD)构成的重组融合蛋白(SEQ IDNO：44)，并将其用作抗原以进行免疫(见下文)。
转基因HuMAb 和KM 株
使用转基因HuMAb的HCo7和HCo27株和转基因转染色体小鼠的KM株来制备针对CADM1的全人单克隆抗体，所述每株都表达人抗体基因。在这些小鼠株的每一个中，已经纯合地破坏了内源的小鼠κ轻链基因，如Chen et al.(1993)EMBO J.12：811-820中所描述的，并且纯合地破坏了内源的小鼠重链基因，如PCT公开WO 01/09187的实施例1中所描述的。这些小鼠株的每一个均携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild et al.(1996)NatureBiotechnology 14：845-851中所描述的。HCo7株携带HCo7人重链转基因，如美国专利号5,545,806；5,625,825和5,545,807中所描述的。HCo27株携带HCo27人重链转基因，如PCT公开WO 01/09187中所描述的。KM株含有SC20转染色体，如PCT公开WO 02/43478中所描述的。
HuMab和KM的免疫
为了产生针对CADM1的全人单克隆抗体，以纯化的重组CADM1-ECD-his蛋白免疫HCo7，HCo27和KM小鼠株。用于这些小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg，N.et al(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和PCT公开WO 98/24884中。在第一次输注抗原时小鼠是6-16周龄。使用CADM1-ECD-his蛋白的纯化的重组制备物(5-50μg)来免疫HuMab和KM
使用Ribi佐剂中的抗原通过腹膜内方式(IP)、皮下方式(Sc)或通过足垫(FP)以3-21天的间隔(至多总共9次免疫)免疫转基因小鼠。通过眶后取血监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，具有足够的抗-CADM1人免疫球蛋白的滴度的小鼠被用于融合。在处死和取出脾脏之前3天和2天，使用抗原静脉内地对小鼠进行加强免疫。通常，对于每种抗原进行10-20例融合。对于每种抗原进行数十只小鼠的免疫。
选择产生抗-CADM1抗体的HuMab 或KM 动物
为了选择产生结合CADM1的抗体的HuMab或KM动物，通过如Fishwild，D.et al.(1996)(见上文)描述的ELISA来测试来自经免疫的小鼠的血清。简要地，用PBS中的1-2μg/ml的纯化的重组CADM1以50μl/孔包被微量滴定板，在4℃过夜温育；然后以PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清以200μl/孔进行封闭。向每个孔中加入来自经CADM1免疫的小鼠的血浆稀释物，并在环境温度下温育1-2小时。以PBS/Tween洗涤平板，然后以缀合于辣根过氧化物酶(HRP)的山羊-抗-人IgG Fc多克隆抗体在室温下温育1小时。洗涤之后，使用ABTS底物(Moss Inc的产品：ABTS-1000)使平板显色并通过分光光度计在OD415-495进行分析。显示出最高的抗-CADM1抗体滴度的小鼠被用于融合。按照下文的描述进行融合，通过ELISA和FACS就抗-CADM1活性测试杂交瘤上清液。
制备产生针对CADM1的人单克隆抗体的杂交瘤
使用Cyto Pulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，GlenBurnie，MD)，例用基于电场的电融合，使分离自HuMab和/或KM的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。简要地，使来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与等数目的Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。以大约2x104/孔的密度将细胞铺板于平底的微量滴定板中，然后在选择性培养基中温育，所述选择性培养基含有：10％胎牛血清，10％P388D1(ATCC，CRLTIB-63)条件化培养基，DMEM(Mediatech，CRL 10013，含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中的3％-5％origen(IGEN)，加上5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50mg/ml庆大霉素和1xHAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，将细胞在如下培养基中培养：所述培养基中的HAT被替换为HT。在细胞铺板后的大约10-14天，首先就是否含有人g，k抗体而筛选来自单个孔的上清液。然后通过ELISA和FACS(如上文所述)就人抗-CADM1单克隆IgG抗体筛选那些对于人g，k评分为阳性的上清液。将分泌抗体的杂交瘤转移至24孔板，再次筛选，如果对于人抗-CADM1IgG单克隆抗体仍然是阳性的，则通过有限稀释法亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于进一步表征。
选择了由KM产生的杂交瘤克隆PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3用于进一步分析。
实施例2：人单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3的结构表征
使用标准的PCR技术分别从PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3杂交瘤获得编码PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的cDNA序列并使用标准的DNA测序技术进行测序。
可以对抗体序列进行诱变以使其在一个或多个残基处回复至种系残基。例如，可以对PTA021_A1重链可变区进行诱变(例如N30Q突变)以在特定位点处(例如残基30)反映种系序列，从而去除糖基化位点。
PTA021_A1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图1A以及分别显示于SEQID NO：19和25中。
PTA021_A1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图1B以及分别显示于SEQID NO：28和22中。
PTA021_A1重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较揭示出：PTA021_A1重链利用了来自人种系VH2-05的VH区段，来自人种系6-6的D区段，和来自人种系JH 5b的JH区段。PTA021_A1VH序列与种系VH2-05序列的比对显示于图4中。使用Kaba t系统的CDR区测定对PTA021_A1VH序列进行的进一步分析得出对重链CDR1、CDR2和CDR3区的标示，如图1A和4中、以及SEQ ID NOs：1，4和7中所分别显示的。
PTA021_A1轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较揭示出：PTA021_A1轻链利用了来自人种系VKL15的VK区段和来自人种系JK 4的JK区段。PTA021_A1VK序列与种系VKL15序列的比对显示于图7中。使用Kabat系统的CDR区测定对PTA021_A1VK序列进行的进一步分析得出对轻链CDR1、CDR2和CDR3区的标示，如图1B和7中，以及SEQ IDNOs：10，13和16中所分别显示的。
PTA021_A2的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图2A以及分别显示于SEQID NO：26和20中。
PTA021_A2的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图2B以及分别显示于SEQID NO：29和23中。
PTA021_A2重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较揭示出：PTA021_A2重链利用了来自人种系VH2-05的VH区段，来自人种系6-6的D区段，和来自人种系JH 5b的JH区段。PTA021_A2VH序列与种系VH2-05序列的比对显示于图5中。使用Kaba t系统的CDR区测定对PTA021_A2VH序列进行的进一步分析得出对重链CDR1、CDR2和CDR3区的表示，如图2A和5中、以及SEQ ID NOs：2，5和8中所分别显示的。
PTA021_A2轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较揭示出：PTA021_A2轻链利用了来自人种系VKL15的VK区段和来自人种系JK 4的JK区段。PTA021_A2VL序列与种系VKL15序列的比对显示于图8中。使用Kabat系统的CDR区测定对PTA021_A2VK序列进行的进一步分析得出对轻链CDR1、CDR2和CDR3区的标示，如图2B和8中，以及SEQ IDNOs：11，14和17中所分别显示的。
PTA021_A3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图3A以及分别显示于SEQID NO：27和21中。
PTA021_A3的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列显示于图3B以及分别显示于SEQID NO：30和24中。
PTA021_A3重链免疫球蛋白序列与已知的人种系人免疫球蛋白重链序列的比较揭示出：PTA021_A3重链利用了来自人种系VH2-05的VH区段，来自人种系6-6的D区段，和来自人种系JH JH5b的JH区段。PTA021_A3VH序列与种系VH2-05序列的比对显示于图6中。使用Kabat系统的CDR区测定对PTA021_A3VH序列进行的进一步分析得出对重链CDR1、CDR2和CDR3区的标示，如图3A和6中、以及SEQ ID NOs：3，6和9中所分别显示的。
PTA021_A3轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系人免疫球蛋白轻链序列的比较揭示出：PTA021_A3轻链利用了来自人种系VKL15的VK区段和来自人种系JK 4的JK区段。PTA021_A3VL序列与种系VKL15序列的比对显示于图9中。使用Kabat系统的CDR区测定对PTA021_A3VL序列进行的进一步分析得出对轻链CDR1、CDR2和CDR 3区的标示，如图3B和9中，以及SEQ ID NOs：12，15和18中所分别显示的。
实施例3：表征CADM1单克隆抗体的结合特性的流式细胞术研究流式细胞术研究
在本实施例中，通过流式细胞术检测了mAb PTA021_A1，PTA021_A2，PTA021_A3及非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)与细胞表面CADM1的结合。
为了测试抗体与细胞表面CADM1蛋白结合的能力，将抗体与下列表达CADM1的不同细胞温育：NCI-H69(ATCC名称为HTB-119TM)，其是人小细胞肺癌细胞系；DMS79(ATCC名称为CRL-2049TM)，其是人小细胞肺癌细胞系；SKOV3(ATCC名称为HTB-77TM)，其是人卵巢癌细胞系；A549(ATCC名称为CCL-185TM)，其是人非小细胞肺癌细胞系；SkMel28(ATCC名称为HTB-72TM)，其是人黑素瘤细胞系；和786-O(ATCC名称为CRL-1932TM)，其是人肾细胞癌细胞系。对于流式细胞术研究，将PTA021_A1，PTA021_A2，PTA021_A3和PTA021_A3(NF)单克隆抗体在冷的1xPBS+0.1％BSA中稀释至40μg/ml。对于结合反应，将50μl稀释的抗体溶液加入至50μl含有4x105个细胞的细胞悬浮液中，并将混合物在冰上温育30-60分钟。然后使用1xPBS+0.1％BSA将细胞洗涤3次。加入1∶50稀释的R-藻红蛋白-标记的山羊抗-人IgG FγF(ab)2片段(Jackson ImmunoResearch Labs，Cat.#109-116-098)，将混合物在冰上温育1小时，然后使用冷的1xPBS+0.1％BSA洗涤两次。在最后一次洗涤之后，向各个溶液中加入200μl冷的1xPBS+0.1％BSA，并通过FACS分析抗体结合。
图10和下表1显示了流式细胞术分析的结果，和与NCI-H69细胞系结合的EC50。结果证明：所有3种单克隆抗体都有效结合细胞表面的人CADM1。
表1：抗-CADM1抗体与表达人CADM1的细胞的结合
抗体 NCI-H69细胞EC50(nM)
PTA021_A1 0.588
PTA021_A2 0.667
PTA021_A3 0.6742
图11A和11B显示了在NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞系中进行的流式细胞术分析的结果。
图12显示了在SKOV3卵巢癌细胞系中对于抗体PTA021_A3的流式细胞术分析的结果。
图13显示了在A549非小细胞肺癌细胞系中对于抗体PTA021_A3的流式细胞术分析的结果。
图14显示了在786-O肾细胞癌和SkMe128黑素瘤细胞系中对于抗体PTA021_A3的流式细胞术分析的结果。
图11-14的结果证明PTA021_A3有效结合不同的表达CADM1的细胞中的细胞表面人CADM1。
图15显示了NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞系中对于非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)的流式细胞术分析的结果。这些结果证明：非岩藻糖化不影响PTA021_A3与细胞表面的人CADM1的结合。
实施例4：由抗-CADM1mAb介导的抗体依赖的细胞性细胞毒性
为了测定抗-CADM1mAb在存在效应子细胞的情况下通过抗体依赖的细胞性细胞毒性(ADCC)杀死表达CADM1的细胞的能力，使用两种细胞系NCI-H69和DMS79作为靶细胞。
如下所述从全血中制备人效应子细胞。通过标准的Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将细胞重悬于含有10％FBS(热灭活的)和200U/ml人IL-2的RPMI 1640培养基中并在37℃温育过夜。次日，收集细胞并在培养基中洗涤4次，并以1x107个细胞/ml重悬。通过以2.5μl BATDA/1x106个靶细胞/mL用BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在37℃温育20分钟来制备靶细胞。将靶细胞洗涤4次，离心下来，并使其终体积为1x105个细胞/ml。
如下所述使用Delfia荧光发射分析测试靶细胞对于人抗-CADM1单克隆抗体的抗体特异性ADCC。将NCI-H69或DMS79细胞(100μl经标记的靶细胞，104个细胞/孔)与50μl效应子细胞(106个细胞/孔)和50μl抗体(10ug/ml终浓度)一起温育。在整个实验过程中使用1∶25的靶标：效应子的比例。在所有的研究中，使用人IgG1同种型对照作为阴性对照。以2000rpm将细胞离心下来并在37℃温育1小时。然后收集上清液，进行离心并将20μl的上清液转移至平底的平板，向其中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并在RubyStar读数器(BMG Labtech)中读数。％裂解如下计算：(样品释放-自发释放*100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自于含有靶细胞+效应子细胞的孔的荧光，最大释放是来自于含有靶细胞并经过2％Triton-X处理的孔的荧光。
结果总结于下表2和图16A和16B中，它们证明PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3能够在表达CADM1的癌细胞系上特异性地诱导ADCC。
表2由PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3抗体介导的抗体依赖的细胞性细胞毒性
抗体 ％特异性裂解：NCI-H69 ％特异性裂解：DMS79
PTA021_A1 24.6+/-4.5 37.76+/-7.8
PTA021_A2 15.9+/-1.9 34.66+/-3.1
PTA021_A3 29.8+/-1.6 61.0+/-1.5
同种型对照 3.3+/-4.6 2.96+/-1.9
实施例5：CADM1抗体的内化
使用Hum-Zap测定法显示了：在与细胞结合之后，单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3被NCI-H69和DMS79细胞内化。Hum-ZAP测定法通过缀合于毒素皂草素(saporin)的抗-人IgG二抗(Advanced Targeting System，San Diego，CA，IT-22-100)的结合显示了抗-CADM1单克隆抗体的内化。首先使PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3结合至NCI-H69或DMS79细胞的表面。然后，使Hum-ZAP抗体结合至一抗。接下来，一抗/Hum-ZAP复合物被细胞内化。皂角素进入细胞导致蛋白合成的抑制并最终导致细胞死亡。
如下进行Hum-ZAP测定。将每种细胞以3x103个细胞/孔的密度接种。连续稀释抗-CADM1单克隆抗体或同种型对照人IgG，然后加入到细胞中。然后以2μg/ml的浓度加入Hum-ZAP，并将平板温育96小时。通过CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega，G7571)检测平板中的细胞存活性，通过Luminomitor(Tuner BioSystems，Sunnyvale，CA)在490nM处读取平板。通过Prism(Graphpad)分析数据。细胞死亡与PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3单克隆抗体成比例。图17A和17B显示：与hIgG1同种型对照抗体相比，抗-CADM1单克隆抗体有效地分别被DMS79和NCI-H69细胞内化。
实施例6：CADM1与LAMP1共定位
显示了单克隆抗体PTA021_A3与LAMP1共定位，并因此被内化。使PTA021_A3结合至NCI-H69细胞，洗涤并在37℃温育45分钟。通过FITC标记的抗人类抗体追踪PTA021_A3抗体。
将一些细胞通透化并以抗-人LAMP1染色，使用TRITC标记的二抗检测。
结果显示：PTA021_A3和LAMP1共定位于内体中。
实施例7：抗-CADM1抗体结合癌症组织
显示了抗-CADM1单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3结合人类癌症组织，所述组织包括代表小细胞肺癌、神经内分泌胰腺癌、肝癌、肺类癌和胃肠类癌的组织。从癌症患者获取生物活组织检查样品并使用抗体进行免疫组化染色(Cytomyx，MA)。使用5μm的组织核心。在载玻片上干燥30分钟之后，使用丙酮将组织切片在室温固定5分钟。在PBS中润洗载玻片，然后使用无血清的蛋白和过氧化物酶封闭剂(DakoS2001，CO)封闭，随后用5μg/ml的一抗复合物在室温温育45分钟。接下来，洗涤载玻片并使用FITC-缀合的二抗(Jackson ImmunoresearchLab，109-097-003)温育30分钟，再次以PBS洗涤并用聚合物HRP缀合物(Dako，CO，K4063)温育20分钟。使用色原体(Dako K3464)作为底物，产生棕色染色。将载玻片在Faramount Aqueous Mounting Media(Dako，S3025)中封片。显示了PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3特异性结合上文所列类型的肿瘤细胞。当使用这些单克隆抗体染色时，其它器官显示出阴性或非特异性染色，所述其它器官包括子宫、肺、肝、肾、结肠、子宫颈、乳腺、骨髓、小脑、大脑、食道、心脏、前列腺、胎盘、垂体、卵巢、间皮、扁桃体、皮肤、小肠、骨骼肌、胃、脾、胸腺和甲状腺。数据证明：抗CADM1HuMab PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3识别肿瘤上表达的CADM1，包括下列的肿瘤：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、神经内分泌癌(包括胰腺、肺和胃肠道的神经内分泌癌)、肝癌、肺的类癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和胃肠的类癌。
对于小细胞肺癌组织样品中的抗体PTA021_A3的免疫组化显示出：所有肿瘤细胞的高水平(+++)膜染色的发生率为75％。对于肝癌组织样品中的抗体PTA021_A3的免疫组化显示出：在75％-95％的样品中有阳性染色，其中45％的肿瘤显示出所有肿瘤细胞的高水平(+++)膜染色。在非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和肾细胞癌的更小的样品组中进行了对PTA021_A3的进一步研究。在非小细胞肺癌、乳腺癌和肾透明细胞癌中阳性染色的发生率是大约66％；在前列腺癌和卵巢癌中，阳性染色的发生率是100％，而结肠直肠腺癌在17％的样品中显示出阳性染色。还测试了肺、前列腺和胃肠道的神经内分泌肿瘤，肺的类癌和神经内分泌胰腺样品显示出75％的染色发生率，胃肠道神经内分泌肿瘤在65％的样品中显示出阳性染色。
实施例8：岩藻糖化和非岩藻糖化的抗-CADM1抗体对于小鼠异种移植模型中的肝 癌肿瘤生长的效应
检测了PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)对于小鼠异种移植模型中的源自肝癌的HepG2细胞的生长的影响。在该异种移植模型中，向SCID小鼠(CB17，来自Charles River Laboratories，Hollister，CA)中植入2.5x106HepG2细胞/小鼠，并允许HepG2细胞生长大约30天。然后将小鼠随机分组并按照下表3通过腹膜内(i.p.)方式进行处理：
表3.用于HEPG2肿瘤异种移植模型的免疫程序
剂量(Ab mg/kg) 给药的天
介质 第0天
同种型IgG1 10 第0，4，7，11天
同种型nf IgG1 10 第0，4，7，11天
CADM1PTA021_A3亲本IgG1 10，3 第0，4，7，11天
CADM1PTA021_A3nf IgG1 10，3 第0，4，7，11天
Nexavar Sorafenib 20(Q1Dx3)，10p.o. Q1Dx8，第0-7天
Nexavar Sorafenib是基于化学物质的用于治疗肾细胞癌和肝癌的多激酶抑制剂，其用作靶向治疗的对照。
如图18所示，使用PTA021_A3和PTA021_A3NF抗体的处理显著降低了肿瘤生长速率，非岩藻糖化的PTA021_A3NF抗体效力更强。
实施例9：抗-CADM1抗体-药物缀合物抑制小鼠异种移植模型中的HepG2细胞生长
检测了根据式M(以下称作“PTA021_A3-式A缀合物”或“PTA021_A3-式M”)的PTA021_A3缀合物对于小鼠异种移植模型中的源自肝细胞癌的HepG2细胞的生长的影响。在该异种移植模型中，向SCID小鼠(CB17，来自Charles River Laboratories，Hollister，CA)中植入2.5x106HepG2细胞/小鼠，并允许HepG2细胞生长大约30天。然后将小鼠随机分组并使用PTA021_A3-式M缀合物(0.1umole/kg或0.03umol/kg)通过腹膜内(i.p.)方式进行处理。DT和抗白喉毒素抗体被用作非结合性同种型对照。Nexavar Sorafenib是基于化学物质的用于治疗肾细胞癌和肝癌的多激酶抑制剂，其被用作靶向治疗的对照。
如图19所示，使用PTA021_A3-式M缀合物进行的处理以剂量依赖性方式显著抑制了肿瘤的生长速率。
实施例10：抗-CADM1抗体-药物缀合物抑制小鼠异种移植模型中的DMS79细胞生长
检测了PTA021_A3-式M对于小鼠异种移植模型中的源自小细胞肺癌的DMS79细胞的生长的影响。在该异种移植模型中，向SCID小鼠(CB17，来自Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)中植入5x106DMS79细胞/小鼠，并允许DMS79细胞生长直至平均肿瘤体积为大约200mm3。然后将小鼠随机分组并使用PTA021_A3-式M缀合物通过腹膜内(i.p.)方式在两个研究中进行处理。
如图20A所示，使用0.3μmole/kg的PTA021_A3-式M缀合物进行的处理在整个研究中引起所有小鼠中完全的肿瘤消退(第88天)。如图20B所示，用PTA021_A3-式M缀合物进行的处理以0.1μmole/kg的剂量在研究中引起肿瘤消退，所述研究完成于第60天。0.03umol/kg的低剂量引起肿瘤生长的显著延迟。
实施例11：由PTA021_A3和非岩藻糖化的PTA021_A3介导的抗体依赖性细胞性细胞 毒性
使用荧光细胞毒性测定法测定了非岩藻糖化的PTA021_A3抗-CADM1mAb在存在效应子细胞的情况下通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(对于HepG2，786-O和DMS79细胞的ADCC)杀死表达CADM1的细胞的能力。
如下从全血中制备人效应子细胞。通过标准的Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将细胞重悬于含有10％FBS(热灭活的)和200U/ml人IL-2的RPMI1640培养基中并在37℃温育过夜。次日，收集细胞并在培养基中洗涤4次，并以2x107个细胞/ml重悬。通过以2.5μl BATDA/1x106个靶细胞/mL用BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在37℃温育20分钟来制备靶CHO-间皮瘤细胞。将靶细胞洗涤4次，离心，并使终体积为1x105个细胞/ml。
如下，使用Delfia荧光发射分析测试HepG2，786-O和DMS79细胞对于人抗-CADM1PTA021_A3单克隆抗体和PTA021_A3的非岩藻糖化制备物的抗体特异性ADCC。将HepG2，786-O或DMS79(100μl经标记的靶细胞，104个细胞/孔)与50μl效应子细胞(106个细胞/孔)和50μl抗体(10ug/ml终浓度)一起温育。在整个实验过程中使用1∶100的靶标：效应子的比例。在所有的研究中，使用人IgG1同种型对照作为阴性对照。以2000rpm将细胞离心下来并在37℃温育1小时。然后收集上清液，进行离心并将20μl的上清液转移至平底的平板，向其中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并在RubyStar读数器(BMGLabtech)中读数。％裂解如下计算：(样品释放-自发释放*100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自于含有靶细胞+效应子细胞的孔的荧光，最大释放是来自于含有靶细胞并经过2％Triton-X处理的孔的荧光。
图21、22和23显示：PTA021_A3和非岩藻糖化的PTA021_A3都能够在HepG2，786-O和DMS79细胞上引发ADCC，并且非岩藻糖化的PTA021_A3是效力更强的抗体。可以在表达CADM1的其它细胞系(例如SCLC系NCI-H69)上观察到相同的效应。
实施例12：抗-CADM1抗体/顺铂抑制小鼠异种移植模型中的DMS79细胞生长
检测了单独的PTA021_A3以及其与顺铂的组合对于小鼠异种移植模型中的源自SCLC的DMS79细胞的生长的影响。在该异种移植模型中，向SCID小鼠(CB17，来自CharlesRiver Laboratories，Hollister，CA)中植入5x106DMS79细胞/小鼠，并允许DMS79细胞生长直至肿瘤达到平均为200mm3。然后将小鼠随机分组并通过腹膜内(i.p.)方式进行处理，如肿瘤体积图中所示。
如图24所示，使用单独的PTA021_A3进行的处理延迟了肿瘤生长，PTA021_A3与顺铂的组合显示出显著并协同的抗肿瘤活性。
实施例13：PTA021_A3NF，PTA021_A3和PTA021_A3-式M的毒性的测评
使用例如PTA021_A3及其衍生物在猕猴中测评了抗-CADM1抗体(包括非岩藻糖化抗体和抗体-药物缀合物)的毒性谱。IHC测定结果已经显示：当经受利用PTA021_A3的IHC时，猕猴和人显示出相似的CADM1表达模式。此外，CADM1蛋白在猕猴和人类中显示出高度同一性。使用例如0.1mg/kg至100mg/kg之间的多个IV剂量来测定最大耐受剂量，以用于鉴定人类中用于临床试验的合适剂量。
在猕猴中对于PTA021_A3和非岩藻糖化形式的PTA021_A3(NF)进行了探究性的毒理学研究。在该研究中使用了8只4岁的非首次试验猕猴(对于生物制剂而言是首次试验，但之前在小分子药物动力学研究中被处理过)，在两组中进行测评，每组中两雄两雌。以非岩藻糖化的PTA021_A3(NF)抗体通过1mg/kg的单一静脉内(IV)剂量处理组1中的动物。用PTA021_A3抗体通过1mg/kg的单一IV剂量处理组2中的动物。
在am和pm每天两次对于临床观察和死亡率/发病率进行评估。在第-11，0，1，3，8，15和22天分析体重、血液学和血液化学。血液学评估包括RBC、HGB、HCT、PLT、MCH、MCV、网状细胞、WBC和分类计数。血液化学评估包括AST、ALT、ALP、CRE、BUN、GLU、CHO、TP、ALB、TBIL、LDH、TG、Ca、P、A/G、K、Na和Cl。
在研究过程中没有显著的公开观察(例如喂饲行为)。没有关于神经内分泌组织的可观测效应(例如激素变化，其将导致行为变化和痛苦迹象)。也没有注意到疼痛或震颤的迹象。图25至32显示：进行的所有分析都在正常预期值内。
图25A和25B分别显示了雄性和雌性猴子的体重数据。
图26A和26B分别显示了雄性和雌性猴子的葡萄糖数据。
图27A和27B分别显示了雄性和雌性猴子的丙氨酸转氨酶数据。
图28A和28B分别显示了雄性和雌性猴子的天冬氨酸转氨酶数据。
图29A和29B分别显示了雄性和雌性猴子的碱性磷酸酶数据。
图30A和30B分别显示了雄性和雌性猴子的乳酸脱氢酶数据。
图31A和31B分别显示了雄性和雌性猴子的RBC数据。
图32A和32B分别显示了雄性和雌性猴子的WBC数据。
实施例14：PTA021_A3NF，PTA021_A3和PTA021_A3-式M的功效的评估
通过利用PTA021_A3HuMAb的IHC显示了CADM1在许多癌症类型中表达。使用代表癌症肿瘤模型的细胞系证明了裸露的和缀合了毒素的抗-CADM1抗体用于治疗多种癌症的功效。例如，单独使用PTA021_A3及其衍生物，或者与肾癌(786-O细胞)、黑素瘤(SkMe128细胞)和小细胞肺癌(DMS 79细胞)(其中表达CADM1)的功效模型中的标准治疗相组合。PTA021-A3和其它抗-CADM1抗体可用于异种移植动物模型中，所述模型使用表达CADM1的细胞系，其代表癌症，例如神经内分泌癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
本说明书中引用的所有参考文献，包括但不限于所有的论文、公开物、专利、专利申请、展示、文本、报告、书稿、宣传册、书、互联网公布、杂志文章、期刊、产品情况说明书等，在此通过引用方式全文并入本说明书。关于本文的参考文献的讨论仅仅意在总结它们的作者所作出的论断，不是承认任何参考文献构成现有技术，申请人保留对所引用的参考文献的精确性和妥当性提出质疑的权利。
虽然已经通过阐释以及为了清楚理解的目的的实施例的方式对前述发明进行了一定的详细描述，但根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以不脱离随附的权利要求的精神或范围对本发明作出一定的改变和修饰。
序列表总结

Claims (22)

1.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类CADM1上的表位，并且其含有由SEQ ID NO:19,20或21所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:22,23或24所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，并且其中所述单克隆抗体或其抗原结合部分与治疗剂缀合。
2.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)由SEQ ID NO:1组成的重链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:4组成的重链可变区CDR2；
由SEQ ID NO:7组成的重链可变区CDR3；
由SEQ ID NO:10组成的轻链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:13组成的轻链可变区CDR2；和
由SEQ ID NO:16组成的轻链可变区CDR3；
或者
(b)由SEQ ID NO:2组成的重链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:5组成的重链可变区CDR2；
由SEQ ID NO:8组成的重链可变区CDR3；
由SEQ ID NO:11组成的轻链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:14组成的轻链可变区CDR2；和
由SEQ ID NO:17组成的轻链可变区CDR3；
或者
(c)由SEQ ID NO:3组成的重链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:6组成的重链可变区CDR2；
由SEQ ID NO:9组成的重链可变区CDR3；
由SEQ ID NO:12组成的轻链可变区CDR1；
由SEQ ID NO:15组成的轻链可变区CDR2；和
由SEQ ID NO:18组成的轻链可变区CDR3；
其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合人类CADM1上的表位，并且与治疗剂缀合。
3.权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG1,IgG2,IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
4.权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、人类抗体、单链抗体、引起对于Fc受体的增加的结合的工程化抗体，和双特异性抗体。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体片段是结构域抗体。
6.权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗剂是细胞毒素或放射活性同位素。
7.权利要求1或权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体以小于50nM范围内的EC50与人类CADM1结合。
8.权利要求1或权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体以小于10nM范围内的EC50与人类CADM1结合。
9.权利要求1或权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体以小于1nM范围内的EC50与人类CADM1结合。
10.组合物，其包含权利要求1或权利要求2的与治疗剂缀合的分离的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
11.权利要求1-9任一项的与治疗剂缀合的抗-CADM1抗体或其抗原结合部分在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与表达CADM1的靶细胞相关的疾病。
12.权利要求11的用途，其中所述疾病是人类癌症。
13.权利要求12的用途，其中所述人类癌症选自：小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤。
14.权利要求13的用途，其中所述非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌和腺癌。
15.权利要求13的用途，其中所述神经内分泌癌选自肺癌、肾上腺癌、垂体癌、胃肠道癌、肾癌、肝癌、胰腺癌。
16.权利要求15的用途，其中所述肝癌是肝细胞癌。
17.权利要求15的用途，其中所述胰腺癌是胰岛素瘤或胰高血糖素瘤。
18.权利要求13的用途，其中所述类癌肿瘤选自胰腺癌、肺癌、胃肠道癌、肝癌和肾癌。
19.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类CADM1上的表位，并且其包含选自下列的重链可变区和轻链可变区：
SEQ ID NO:19所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO:20所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:23所示的轻链可变区氨基酸序列；和
SEQ ID NO:21所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:24所示的轻链可变区氨基酸序列；
其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与治疗剂缀合。
20.权利要求19的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、人类抗体、单链抗体、引起对于Fc受体的增加的结合的工程化抗体，和双特异性抗体。
21.权利要求20的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体片段是结构域抗体。
22.组合物，其包含权利要求19的与治疗剂缀合的分离的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
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