KR20230062691A - Cadm1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

Cadm1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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전태훈
양준
이창희
이나영
박인병
강석진
박시원
이현정
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Abstract

본 발명은 CADM1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR); 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포(Natural killer cell, NK cell) 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 CADM1에 특이적으로 결합하는 CRTAM의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 CADM1을 발현하는 암종에 특이적으로 세포독성을 갖게되므로 암 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

CADM1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도{Chimeric antigen receptor specifically binding to CADM1 and use thereof}
본 발명은 CADM1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR); 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포(Natural killer cell, NK cell) 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Cell adhesion molecule 1 (CADM1)은 Necl2, TSLC1, IGSF4, RA175, 또는 SynCam이라고도 불리우며, 면역 글로불린(Ig) 수퍼 패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다(Kuramochi et al., 2001; Murakami, 2005; Takai et al., 2008). CADM1은 다양한 세포에서 관찰되며, 세포와 세포 간의 부착에 관여하여 여러가지 생명 현상을 조절할 수 있다고 알려져 있다(Murakami, 2005). CADM1은 비소세포 폐암(non-small lung cancer cell, NSCLC)에서 처음으로 발견되었고, 다양한 상피조직 유래 암종에서 발현되며, 몇몇 암종에서는 발현이 증가되어 암종의 분자 표지 또는 치료용 타겟으로 사용된다(Kuramochi et al., 2001; Murakami, 2005; Takai et al., 2008). 지금까지 보고된 CADM1을 발현하는 암종은 비소세포 폐암(non-small lung cancer cell, NSCLC)(Kuramochi et al., 2001), 폐 선암종(lung adenocarcinoma)(Murakami, 2005), 사람T세포림프친화바이러스 1형에 감염된 T 세포 백혈병 (HTLV-1-infected T cell leukemia)(Nakahata et al., 2012), 성인T세포백혈병(adult T cell leukemia)(Nakahata et al., 2021), 난소암(ovarian cancer)(Si et al., 2020), 유방암(breast cancer)(Takahashi et al., 2012), 자궁경부암(cervical cancer)(Steenbergen et al., 2004), 전립선암(prostate cancer)(Fukuhara et al., 2002), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma)(Hui et al., 2003), 위암(stomach cancer)(Honda et al., 2002), 췌장암(pancreatic cancer)(Jansen et al., 2002) 으로 알려져있다.
효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)와 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)가 중요하다는 사실이 보고되어왔다. 지금까지 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자 유래 특정 암 항원을 환자의 세포독성 T 세포에 전달하여 활성을 유발하거나, 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)을 유발하고자 하였다(Galluzzi et al., 2018; Lu et al., 2020). 하지만, 최근에는 세포독성 T 세포와 자연살생세포를 이용한 새로운 항암 치료 방법이 도입되었다. 즉, 항원을 인식하는 항체의 단일사슬 Fv 단편(single-chain variable fragment, scFv) 부분을 CD3 제타(zeta) 또는 다른 단백질의 세포질내 신호전달 도메인(cytoplasmic signaling domain)에 접목시킨 도메인에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. 키메릭 항원 수용체를 T 세포 또는 자연살생세포에 접목시키면 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 단일사슬 Fv 단편의 특정 항원 인지만으로 T 세포 또는 자연살생세포의 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 많은 사람들이 보편적으로 사용할 수 있는 보다 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 실제로, 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포나 자연살생세포는 여러 암에서 효능을 보이고 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020).
한편, class-I MHC-restricted T cell associated molecule (CRTAM)은 내재성 막 단백질(integral membrane protein)로, 활성화된 림프구에서 발현되며(Kennedy et al., 2000), 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)나 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)가 표적세포의 세포자살을 유도할 때, 표적세포에 좀 더 잘 부착되게 하는 역할을 한다(Boles et al., 2005; Takeuchi et al., 2009). 또한 보조 T 림프구(helper T cell)의 IFN-η와 IL-22 분비량을 촉진시킨다(Yeh et al., 2008).
현재, 항-CADM1 항체를 이용한 항체-약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)(한국공개특허 제10-2011-0126739호)나 CADM1의 특정 부분인 v9을 인식하는 항-CADM1 항체(미국공개특허 제2021-0079092호)는 공개되어 있으나, CADM1이 발현되는 암세포에 대한 결합 특이성을 갖는 CRTAM 세포외 도메인(extracellular domain)을 항원 결합 도메인의 구성으로 한 키메릭 항원 수용체를 면역 항암 치료제로서 이용하는 발명에 대해서는 기재된 바 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 다양한 암세포에서의 CADM1 발현이 확인 또는 유도된다는 점과, 상기 CADM1과 CRTAM이 높은 친화도로 결합 가능하다는 점을 이용하여 CRTAM의 세포외 도메인을 사용한 CADM1을 발현하는 암 특이적 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포와 자연살생세포를 제작하고, 상기 T 세포 또는 자연살생세포가 CADM1을 발현하는 세포에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 실험을 통해 확인하였다. 이 때, CRTAM의 세포외 도메인 각각을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결하는 융합 단백질을 만들어 신호 전달 강도를 증폭하였다. 즉, 기존의 키메릭 항원 수용체는 단일사슬 Fv 단편에 의해 항원을 인식하는 부위가 하나인 반면에, 본 발명자들이 고안한 키메릭 항원 수용체는 CRTAM의 세포외 도메인 각각을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결시켜, 키메릭 항원 수용체 하나당 2개의 CRTAM의 세포외 도메인이 CADM1 항원을 인식하게 하여, 신호 전달 강도를 증폭하고자 하였다.
한국공개특허 제10-2011-0126739호 (2011. 11. 23) 미국공개특허 제2021-0079092호 (2021.03.18)
따라서 본 발명의 목적은 CADM1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 CADM1을 발현하는 암세포를 사멸시키는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항원 결합 부위인 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 CADM1에 특이적으로 결합하는 CRTAM(class-I MHC-restricted T cell associated molecule)의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 CADM1을 발현하는 암세포를 사멸시키는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 CADM1에 특이적으로 결합하는 CRTAM의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 CADM1을 발현하는 암종에 특이적으로 세포독성을 갖게 되므로 암 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터의 모식도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 레트로바이럴 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체의 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 CADM1을 발현하는 암세포(A549 세포주)에서 CADM1의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRTAM이 CADM1을 인식하는지를 측정하기 위해 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질을 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRTAM이 CADM1을 인식하는지를 측정하기 위해 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터(레트로바이럴 벡터)의 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRTAM이 CADM1을 인식하는지를 측정하기 위해 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질의 모식도이다.
도 8a는 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질을 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 발현시킨 후, protein A column을 이용한 친화크로마토그래피(affinity chromatography)로 정제한 결과를 나타낸 도이다.
도 8b는 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질을 인간 IgG 중쇄의 불변 영역을 인식하는 항체(항 인간 IgG 중쇄 불변영역 항체, anti-human IgG Fc region antibody)를 이용한 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8c는 제조한 재조합 CRTAM 융합 단백질이 타겟인 CADM1을 발현하는 암세포(A549 세포주)를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(CRTAM CAR-T cell)에서의 GFP의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(CRTAM CAR-NK cell)에서의 CRTAM의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포(CRTAM CAR-T cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock T cell)를 작동 세포(effector cell)로 하여 CADM1을 발현하는 암세포(A549 세포주)에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 자연살생세포(CRTAM CAR-NK cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 자연살생세포(Mock NK cell)를 작동 세포(effector cell)로 하여 CADM1을 발현하는 암세포(A549 세포주)에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명은 하나의 양태로서, 항원 결합 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 CADM1에 특이적으로 결합하는 CRTAM의 세포외 도메인을 포함하는, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 자연적으로 T 세포 또는 자연살생세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)나 항체의 매개 없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포 또는 자연살생세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미한다. 즉, T 세포 또는 자연살생세포에 발현 시 항원에 결합하여 이들 세포들의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질은 기능적 동등물을 포함할 수 있다. '기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성’이란 CADM1에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.
본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 '단편', '유도체' 및 '유사체'는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져있다.
CRTAM(class-I MHC-restricted T cell associated molecule)은 내재성 막 단백질(integral membrane protein)로, 활성화된 림프구에서 발현되며, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)나 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)가 표적세포의 세포자살을 유도할 때, 표적세포에 좀 더 잘 부착되게 하는 역할을 한다. 또한, 보조 T 림프구(helper T cell)의 IFN-η와 IL-22 분비량을 촉진시킨다.
상기 항원 결합 도메인은 신호전달을 증폭하기 위해 CRTAM의 세포외 도메인 한 쌍을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 각각 연결시킨 이합체(dimer) 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CRTAM의 세포외 도메인은 서열번호 1 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)은 서열번호 2 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "CADM1"은 다양한 상피 조직과 면역세포에서 발현하는 것으로 알려져 있으며, 몇몇 암종에서는 발현이 증가되어 암종의 분자 표지 또는 치료용 타겟으로 사용된다. 지금까지 알려진 CADM1을 발현하는 암종은 비소세포 폐암(non-small lung cancer cell, NSCLC), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 사람T세포림프친화바이러스 1형에 감염된 T 세포 백혈병(HTLV-1-infected T cell leukemia), 성인T세포백혈병(adult T cell leukemia), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 전립선암(prostate cancer), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma), 위암(stomach cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer) 등이 있다.
본 발명에서, "막관통 도메인(Transmembrane domain)"은 CRTAM의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.
일 실시예에서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 상기 CD8은 CD8α 또는 CD8β일 수 있으며, 바람직하게는 CD8α의 막관통 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "세포내 신호전달 도메인"은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 일 실시예에서, 상기 세포내 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인으로 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta)를 이용함으로써 높은 활성으로 암 세포, 특히 CADM1을 발현하는 암세포에 대한 사멸 효과를 나타낼 수 있다.
상기 CD28은 서열번호 4 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 4-1BB(CD137)은 서열번호 5 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, CD3 제타(zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 6 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 CD8α 신호 펩타이드는 서열번호 7 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 다른 하나의 양태로서, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 또 다른 하나의 양태로서 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서는 바람직한 일 실시예로서, 렌티-바이러스용 벡터 또는 레트로-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터(렌티-바이러스용 벡터)와 pLNCX2(레트로-바이러스용 벡터)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 일시예에서, CADM1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환 시킬 수 있다. 상기 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, 자연살생세포, 또는 NKT 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)또는 자연살생세포 일 수 있다. 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있으며, 세포는 인간 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 CADM1을 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 가진다.
본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, 이하 간략하게 'CAR-T 세포'라 약칭함)" 또는 "키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포(chimeric antigen receptor NK cell, 이하 간략하게 'CAR-NK 세포'라 약칭함)"란 정상의 T 세포 또는 자연살생세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 T 세포 수용체 또는 NK cell 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포 또는 NK cell을 의미한다. 이 수용체를 갖는 T 세포 또는 NK 세포는 표적세포(target cell)의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 특히 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell) 또는 NK cell에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 CADM1을 발현하는 암세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.
따라서 본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 세포를 포함하는 세포 치료제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 CADM1을 발현하는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 개체란, CADM1을 발현하는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한 없이 포함된다.
본 발명에 있어 치료 대상이 되는 CADM1을 발현하는 암의 종류로는 비소세포 폐암(non-small lung cancer cell, NSCLC), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 사람T세포림프친화바이러스 1형에 감염된 T 세포 백혈병 (HTLV-1-infected T cell leukemia), 성인T세포백혈병(adult T cell leukemia), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 전립선암(prostate cancer), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma), 위암(stomach cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer) 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유전자 합성 방법에 의한 키메릭 항원 수용체 유전자의 클로닝
본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 CRTAM의 세포외 도메인 한 쌍을 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결시킨 항원 인식 부위와 CD8α의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 각각의 세포내 도메인 부분의 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다.
그 후 상기 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 상기 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 키메릭 항원 수용체 단백질 발현 플라스미드 제조
CADM1을 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 재조합 단백질을 세포독성 T 세포와 자연살생세포에 발현시키기 위해, 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences) 또는 레트로바이러스 유래 발현벡터인 pLNCX2(Addgene)에 클로닝하였다.
먼저, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 XbaI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 XbaI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 XbaI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
다음, pLNCX2 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 Bgl II의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 BglII를 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 BglII와 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
그 결과, CADM1을 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 단백질(도 3 참조)을 발현하는 재조합 벡터 CRTAM.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 및 CRTAM.CAR-NK.pLNCX2를 완성하였다(도 2a 및 도 2b 참조).
실시예 3. CADM1을 발현하는 사람 세포주 screening
CADM1을 세포 표면에 발현하는 사람 세포주를 screening하기 위해서, 폐 선암종(lung adenocarcinoma) 유래 세포주인 A549 (ATCC)에서 CADM1의 발현을 확인하였다. 발현 확인을 위해 형광단백질이 부착된 CADM1과 결합이 가능한 항체(Biobyt)를 상기 세포주들에 처리한 후, 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 이용하였다. 분석결과, A549 세포주에서 CADM1을 발현하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
상기 결과를 근거로 CADM1을 발현하는 A549 세포주를 CRTAM.CAR-T 세포 또는 CRTAM.CAR-NK 세포의 타겟 세포로 사용하였다.
실시예 4. 유전자 합성 방법에 의한 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질 유전자의 클로닝
CRTAM이 CADM1에 결합하는 것을 확인하기 위해 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질을 제조하였다. 우선 CRTAM의 세포외 도메인(extracellular domain) 각각을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결시킨 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다. 그리고 상기 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 상기 재조합 단백질을 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도를 도 5에 나타내었다.
실시예 5. 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질 발현 플라스미드 제조
실시예 4의 인간 CADM1을 인식하는 도메인과 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역을 융합시킨 재조합 CRTAM 융합 단백질을 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현시키기 위해, 해당 유전자를 레트로바이러스 유래 발현벡터인 pLNCX2(Addgene)에 클로닝하였다.
먼저, pLNCX2 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 XhoI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 XhoI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 xhoI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
그 결과, 인간 CADM1을 인식하는 CRTAM의 세포외 도메인과 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역을 융합시킨 단백질(도 7 참조)을 발현하는 재조합 벡터 CRTAM-IgG.pLNCX2를 완성하였다(도 6 참조).
실시예 6. 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질과 CADM1을 발현하는 사람 세포주의 친화도 측정
실시예 5의 제작한 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질이 CADM1을 발현하는 사람 세포주와 친화도가 있는지 확인하기 위하여, 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질을 CHO 세포에서 발현시킨 후, protein A column을 이용하여 친화크로마토그래피(affinity chromatography) (GE healthcare)로 정제하였다(도 8a 참조).
또한, 정제한 수용성 키메릭 항원 수용체를 인간 IgG 중쇄의 불변 영역을 인식하는 항체(항 인간 IgG 중쇄 불변영역 항체, anti-human IgG Fc region antibody, abcam)를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 확인하였다(도 8b 참조).
그 후, 상기 정제한 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질을 CADM1을 발현하는 세포주(A549 세포주)에 처리하여 수용성 재조합 CRTAM 융합 단백질이 해당 세포와 결합이 가능한지 유세포 분석을 통하여 확인한 결과를 도 8c에 나타내었다.
도 8c에 나타난 바와 같이, CADM1을 발현하는 A549 세포는 control Ig (isotype control)과 결합하지 않았으나, 수용성 CRTAM 융합 단백질(CRTAM-Ig)과는 결합하는 것을 확인하였다.
상기 결과에서 확인된 바와 같이, 제작한 수용성 CRTAM 융합 단백질이 CADM1을 발현하는 사람 세포주와 친화도가 높음을 확인하였고, 이는 CADM1을 발현하는 A549 세포를, 제작한 CADM1을 인식하고 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 재조합 단백질을 발현시킨 세포독성 T 세포(CRTAM.CAR-T 세포) 또는 자연살생세포(CRTAM.CAR-NK 세포)에, CADM1 단백질 특이적 세포독성 검증을 위해 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 7. 세포독성 T 세포 분리 및 활성화
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제작하기 위해 먼저 세포 독성 T 세포를 사람의 말초 혈액 단핵세포에서 분리하였다. 사람의 말초 혈액 단핵세포(메디랩 코리아)를 구입한 후, 세포독성 T 세포를 분리하기 위해서 자력이용 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting)을 이용하였다. 말초 혈액 단핵세포들을 세포독성 T 세포를 제외한 다른 면역세포들과 결합 가능한 항체(CD8+ T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec)와 결합시킨 다음, 상기 항체들을 다시 자성을 가진 마이크로비드(anti-biotin microbead)(Miltenyi Biotec)와 결합시켰다. 상기 마이크로비드와 그에 붙은 항체, 세포들을 자기장 분리 칼럼(magnetic seperation column) (Miltenyi Biotec)에 통과시켜 그 중 항체로 표지되지 않은 세포독성 T 세포를 얻었다. 분리한 세포독성 T 세포의 순도를 확인하기 위하여 세포독성 T 세포의 세포표면 인자인 CD8과 CD3ε을 이용한 유세포 분석을 실시하였고 그 결과 95% 이상의 순도를 보였다.
분리한 세포독성 T 세포의 활성화를 위해 1Х106개/ml의 사람 CD3와 CD28 항체가 코팅된 자석비드(Thermo Fisher Scientific), 그리고 100 U/μl recombinant human IL-2가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 RPMI (Welgene)에 1.5Х106개/ml의 밀도로 세포를 재구성하여 24 웰(well) 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다.
실시예 8. 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 세포독성 T 세포에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific)를 사용한 렌티바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5Х106 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 20μg의 CRTAM.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터 DNA를 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터를 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 렌티바이러스를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21,000rpm으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 4μg/ml과 혼합하여 활성화시킨 세포독성 T 세포의 배양액에 추가한 후 원심분리기를 이용해 1,800g로 75분 동안 원심분리하여 형질도입을 진행하였다. 원심 분리를 마친 세포독성 T 세포는 4시간 동안 추가 배양 후 10% 송아지 혈청 함유 RPMI 배양액으로 교체하였으며 48시간 후에는 형질도입한 세포독성 T 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 형질도입 효율은 세포 내부의 GFP 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정했으며 형질도입된 세포독성 T 세포(CRTAM CAR-T cell)를 공벡터로 제작한 바이러스를 형질도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-T cell)의 형질도입 비율을 비교하였다(도 9a 참조).
실시예 9. 키메릭 항원 수용체 발현 자연살해세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 NK 세포에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293GPG 세포 3Х106개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(CRTAM.CAR-NK.pLNCX2 벡터) 20μg을 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다.
상기 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 Myelocult H5100 배양액(STEMCELL)에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 NK92MI 세포(American type culture collection, ATCC)에 형질도입하기 위해 NK92MI 세포를 24 well 세포 배양 접시에 5Х105/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 8ug/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 NK92MI세포의 배양액에 추가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제(600μg/ml)가 첨가된 Myelocult H5100 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 NK92MI세포를 배양하였다. 14일 간의 neomycin 선별과정을 마친 NK92MI 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다.
증식 후 유세포 분석을 이용해 CRTAM.CAR-NK.pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(CRTAM CAR-NK cell)와 공벡터인 pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(Mock CAR-NK cell)의 CRTAM 발현량을 유세포분석기를 이용하여 비교하였다(도 9b 참조). 이때 1차 항체(primary antibody)로는 항 인간 CRTAM 항체(rat IgG, abcam, #ab17318)를 사용하였고, 2차 항체(secondary antibody)로는 항 rat IgG-Alexa Fluor 488 (goat anti-rat IgG, thermofisher, #a11006)을 사용하였다.
실시예 10. CAR-T 세포의 CADM1 + cell 특이적 세포독성 검증
제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 CADM1을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 3에서 선정한 표적세포인 A549 세포(CADM1 positive cell)를 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(CRTAM CAR-T cell) 혹은 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-T cell)와 6시간 동안 공배양하였다. 공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 세포독성 T 세포의 표적세포(target cell)에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 세포독성 T 세포(1x105 cell)와 표적세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g 조건에서 4분 동안 원심분리하여 세포 간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 세포독성 T 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 10a에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(CRTAM CAR-T cell)는 CADM1을 발현하는 A549 세포주에 39% 이상의 높은 독성을 보인 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-T cell)의 경우 A549 세포주에 3%의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 CRTAM 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 세포독성 T 세포가 CADM1 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-T 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 11. CAR- NK 세포의 CADM1 + cell 특이적 세포독성 검증
제작한 키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포가 CADM1을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 3에서 선정한 표적세포인 A549 세포(CADM1 positive cell)를 키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포(CRTAM CAR-NK cell) 혹은 공벡터를 도입한 NK 세포(Mock CAR-NK cell)와 공배양하였다.
공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 NK 세포의 표적세포에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 자연살해세포(1x105 cell)와 표적세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g의 조건에서 4분 동안 원심분리하여 세포간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 진행 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 NK 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 10b에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 자연살해세포(CRTAM CAR-NK cell)는 CADM1을 발현하는 A549 세포주에 27% 이상의 높은 독성을 보인 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 자연살해세포(Mock CAR-NK cell)의 경우 A549 세포주에 -2% 이하의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 CRTAM 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 NK 세포가 CADM1 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-NK 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> IMMUNOLOGICAL DESIGNINGLAB CO., LTD <120> Chimeric antigen receptor specifically binding to CADM1 and use thereof <130> KP21-0048-ILDL <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRTAM Extracellular domain <400> 1 Ser Leu Thr Asn His Thr Glu Thr Ile Thr Val Glu Glu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Lys Cys Val Thr Ser Leu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Gln 20 25 30 Trp Leu Thr Pro Ser Gly Phe Thr Ile Phe Leu Asn Glu Tyr Pro Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Ser Lys Tyr Gln Leu Leu His His Ser Ala Asn Gln Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Val Pro Asn Val Thr Leu Gln Asp Glu Gly Val Tyr Lys 65 70 75 80 Cys Leu His Tyr Ser Asp Ser Val Ser Thr Lys Glu Val Lys Val Ile 85 90 95 Val Leu Ala Thr Pro Phe Lys Pro Ile Leu Glu Ala Ser Val Ile Arg 100 105 110 Lys Gln Asn Gly Glu Glu His Val Val Leu Met Cys Ser Thr Met Arg 115 120 125 Ser Lys Pro Pro Pro Gln Ile Thr Trp Leu Leu Gly Asn Ser Met Glu 130 135 140 Val Ser Gly Gly Thr Leu His Glu Phe Glu Thr Asp Gly Lys Lys Cys 145 150 155 160 Asn Thr Thr Ser Thr Leu Ile Ile His Thr Tyr Gly Lys Asn Ser Thr 165 170 175 Val Asp Cys Ile Ile Arg His Arg Gly Leu Gln Gly Arg Lys Leu Val 180 185 190 Ala Pro Phe Arg Phe Glu Asp Leu Val Thr Asp Glu Glu Thr Ala Ser 195 200 205 Asp Ala Leu Glu Arg Asn Ser Leu Ser Ser Gln Asp Pro Gln Gln Pro 210 215 220 Thr Ser Thr Val Ser Val Thr Glu Asp Ser Ser Thr Ser Glu Ile Asp 225 230 235 240 Lys Glu Glu Lys Glu Gln Thr Thr Gln Asp Pro Asp Leu Thr Thr Glu 245 250 255 Ala Asn Pro Gln Tyr Leu Gly Leu Ala Arg Lys Lys Ser Gly 260 265 270 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 2 Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8-alpha transmembrane domain <400> 3 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD28 Cytoplasmic domain <400> 4 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD137 Cytoplasmic domain <400> 5 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3z Cytoplasmic domain <400> 6 Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp 1 5 10 15 Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro 100 105 110 Arg <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8-alpha Signal peptide <400> 7 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 8 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRTAM Extracellular domain <400> 8 tctctgacta accacacaga aaccatcacc gtggaggaag gccagacgct cactctaaag 60 tgtgtcactt ctctgaggaa gaactcctcc ctccagtggc tgaccccctc agggttcacc 120 atttttttaa atgagtatcc tgctttaaaa aattccaaat accagcttct tcatcactcg 180 gccaatcagc tctccatcac tgtgcctaac gtaaccctgc aagatgaagg cgtgtacaag 240 tgcttacatt acagcgactc tgtaagcaca aaggaagtga aagtgattgt gctggcaact 300 cctttcaagc caatcctgga agcttcagtt atcagaaagc aaaatggaga agaacatgtt 360 gtactcatgt gctccaccat gagaagcaag ccccctccgc agataacctg gctacttggg 420 aatagcatgg aagtgtccgg tggaacgctc catgaatttg aaactgatgg gaagaaatgt 480 aatactacca gcactctcat aatccacact tatggcaaaa attcaacggt ggactgcatt 540 atccgacaca gaggcctgca agggagaaaa ctagtagcac ccttccggtt tgaagatttg 600 gttactgatg aagagacagc ttcagatgct ctggagagaa actctctatc ctctcaagac 660 ccacagcagc ccaccagtac tgtctcagta acggaagatt ctagtacatc ggagattgac 720 aaggaagaga aagaacaaac cactcaagat cctgacttga ccaccgaagc aaatcctcag 780 tatttaggac tggcaagaaa gaaaagtggc 810 <210> 9 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 9 ggatccgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420 tcacgagatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 702 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8-alpha transmembrane domain <400> 10 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 acc 63 <210> 11 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD28 Cytoplasmic domain <400> 11 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 12 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD137 Cytoplasmic domain <400> 12 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 13 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3z Cytoplasmic domain <400> 13 agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 60 tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 120 cgggatccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 180 aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 240 aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 300 acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gcccctcgct aa 342 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8-alpha Signal peptide <400> 14 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63

Claims (15)

  1. 항원 결합 도메인;
    막관통 도메인; 및
    세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 CADM1(Cell adhesion molecule 1)에 특이적으로 결합하는 CRTAM(class-I MHC-restricted T cell associated molecule)의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 CRTAM의 세포외 도메인 한 쌍이 이합체(dimer)의 형태로 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결된 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CRTAM의 세포외 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  4. 제2항에 있어서,
    인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역부위(human IgG1 heavy chain constant region)는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어진 것 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 CD28은 서열번호 4; 4-1BB은 서열번호 5; 및 CD3-zeta은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함하며, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터로 형질전환된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 세포독성 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제12항의 세포를 유효성분으로 포함하는 CADM1을 발현하는 암의 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 CADM1을 발현하는 암은 비소세포 폐암(non-small lung cancer cell, NSCLC), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 사람T세포림프친화바이러스 1형에 감염된 T 세포 백혈병 (HTLV-1-infected T cell leukemia), 성인T세포백혈병(adult T cell leukemia), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 전립선암(prostate cancer), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma), 위암(stomach cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항의 세포를 포함하는 세포 치료제.
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