KR20160067177A - 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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유씨엘 비즈니스 피엘씨
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Abstract

본 발명은 하기를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다: (i) 증식 유도 리간드(APRIL)의 적어도 일부를 포함하는 B 세포 성숙 항원(BCMA) 결합 도메인; (ii) 스페이서 도메인; (iii) 막관통 도메인; 및 (iv) 세포내 T 세포 신호전달 도메인. 본 발명은 또한 혈장-세포 매개 질환, 예컨대 다발성 골수종의 치료에 있어 이러한 CAR을 발현하는 그러한 T-세포의 용도를 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체{CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR}
본 발명은 B 세포 성숙 항원(BCMA)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 이러한 CAR을 발현하는 T 세포는 혈장 세포 질환 예컨대 다발성 골수종의 치료에 유용하다.
다발성 골수종
다발성 골수종(골수종)은 혈장 세포의 골수 악성 종양이다. 비정상적인 혈장 세포의 무리가 골수에 축적되고, 여기서 이들은 정상적인 혈액 세포의 생성을 방해한다. 골수종은 미국에서 (비호지킨 림프종 다음) 두번째로 가장 흔한 혈액학상 악성 종양이며, 혈액학상 악성 종양의 13% 그리고 모든 종양의 1%를 차지한다. 이 질환은 병적 골절, 감염에 대한 감응성, 사망 전 신장 및 이후 골수 부전을 야기하기 때문에 의료 비용뿐만 아니라 고통의 측면에서 부담스럽다.
다수의 림프종과 달리, 골수종은 현재 불치병이다. 림프종에 사용되는 표준 화학요법제는 대체로 골수종에 효과가 없다. 게다가, CD20 발현이 혈장 세포에서 상실되기 때문에, 리툭시맙이 이 질환에 사용될 수 없다. 새로운 제제 예컨대 보르테조밉 및 레날리도마이드가 부분적으로 효과적이지만, 오래 지속되는 차도(remission)를 제공하지는 못한다.
이에, 증가된 효율 및 개선된 장기간 효과를 갖는 골수종의 치료를 위한 대체 제제에 대한 필요성이 존재한다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체는, 이들의 일반 포맷에서, T-세포의 이펙터 기능에 단일클론 항체(mAb)의 특이성을 접목한 단백질이다. 이들의 일반 형태는 항원 인식 아미노 말단, 스페이서, 막관통 도메인이 모두 T-세포 생존 및 활성화 신호를 전송하는 복합 엔도도메인에 연결된 타입 I 막관통 도메인 단백질이다 (도 3 참조).
이들 분자의 가장 흔한 형태는 표적 항원을 인식하는 단일클론 항체에서 유래하는 단일쇄 가변 단편(scFv)을 사용한다. scFv는 스페이서 및 막관통 도메인을 통해 신호전달 엔도도메인에 융합된다. 이러한 분자들은 이의 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 T-세포의 활성화를 유도한다. T 세포는 이러한 CAR을 발현하면, 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하여 사멸시킨다. 몇몇 CAR이 종양 관련 항원에 대항해 개발되었으며, 이러한 CAR-발현 T 세포를 이용하는 입양 전달 접근 방법이 현재 다양한 암의 치료를 위한 임상 시험 중에 있다. Carpenter 등(2013, Clin Cancer Res 19(8) 2048-60)은 B-세포 성숙 항원(BCMA)에 대한 scFv를 도입하는 CAR을 기재한다.
BCMA는 성숙 림프구, 즉 기억 B 세포, 형질아세포 및 골수 혈장 세포에서 선호적으로 발현되는 막관통 단백질이다. BCMA는 또한 다발성 골수종 세포 상에서 발현된다.
Carpenter 등은 항-BCMA CAR을 발현하도록 형질도입된 T 세포가 골수종 환자의 형질세포종으로부터 골수종 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있음을 입증한다.
비록 항-BCMA 항체를 이용하는 CAR 접근 방법은 전망이 있지만, 이러한 항원을 표적화할 때 특히 고려할 점은 예컨대 림프종 세포 상의 CD19와 비교하여 골수종 세포 상에서 BCMA의 특히 낮은 밀도이다. 이에, 항-BCMA CAR T 세포의 표적 세포 인식의 감도를 증가시킬 필요가 있다.
도 1 - APRIL 및 BAFF의 리간드 특이성 및 기능 지정
B-세포-활성화 인자(BAFF, TNFSF13B)는 BAFF-수용체(BAFF-R, TNFRSF13C), B-세포막 항원(BCMA, TNFRSF17) 및 막관통 활성제 및 칼슘 조절제 및 시클로필린 리간드 상호작용자(TACI, TNFRSF13B)와 상호작용하는 반면에, 증식 유도 리간드(APRIL, TNFSF13)는 BCMA, TACI 및 프로테오글리칸과 상호작용한다. BAFF-R 활성화는 말초 B-세포 생존에 영향을 미치지만, BCMA는 혈장 세포 생존에 영향을 미칠 수 있다. 프로테오글리칸과 APRIL 상호작용은 APRIL의 아미노-말단을 함유하는 산성의 설페이트화된 글리콜-사미노글리칸 측쇄를 수반한다.
도 2 - 골수종 상에서 BCMA의 발현 데이터
39명의 다발성 골수종 환자로부터의 골수 샘플의 골수종 세포를 CD138+ 자기 비드 선택에 의해 단리했다. 이들 세포를 PE와 접합된 항-BCMA 단일클론 항체 J6MO(GSK)로 염색(stain)했다. 항원 카피 수를 PE Quantibrite 비드(Becton Dickenson)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 정량했다. 항원 카피 수의 상자-수염 그림이 범위, 사분범위 및 중앙 값의 작도와 함께 제시된다. 본 출원인은 평균 1181 및 중앙값 1084.9와 함께 범위가 세포 당 348.7-4268.4 BCMA 카피임을 밝혀내었다.
도 3 - 키메라 항원 수용체의 표준 디자인
키메라 항원 수용체의 전형적인 포맷이 도시된다. 이들은 타입 I 막관통 단백질이다. 엑토도메인이 항원을 인식한다. 이는 스페이서 도메인에 부착되는 항체 유래 단일쇄 가변 단편(scFv)으로 구성된다. 이는 결국 막에 분자를 고정시키는 역할을 하는 막관통 도메인에 연결된다. 마지막으로, 이는 세포내 신호를 세포에 전달하는 역할을 하는 엔도도메인에 연결된다. 이는 하나 이상의 신호전달 도메인으로 구성된다.
도 4 - 생성되는 다양한 APRIL -계 CAR의 디자인.
도 3에 도시된 CAR 디자인을 변형시켜, scFv가 APRIL의 변형된 형태로 교체되어 항원 결합 도메인으로서 작용하도록 하고: APRIL이 프로테오글리칸 결합 아미노-말단이 부재하도록 절두되었다. 이후, 단백질을 세포 표면으로 보내기 위해 신호 펩티드를 절두된 APRIL 아미노-말단에 부착시켰다. 3종의 CAR이 이러한 APRIL계 결합 도메인을 사용하여 생성되었다: A. 제1 CAR에서는, 인간 CD8 줄기 도메인이 스페이서 도메인으로서 사용되었다. B. 제2 CAR에서는, IgG1의 힌지가 스페이서 도메인으로서 사용되었다. C. 제3 CAR에서는, Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 Hombach 등(2010 Gene Ther. 17:1206-1213)에 의해 기재된 pva/a 돌연변이로 변형된 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인이 스페이서로서 사용되었다(이하 Fc-pvaa로 지칭됨). 모든 CAR에서, 이들 스페이서는 CD28 막관통 도메인에 그리고 이후에 CD28, OX40 및 CD3-제타 엔도도메인의 융합을 함유하는 3분할(tripartite) 엔도도메인에 연결되었다(Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volume 12; Issue 5; Pages 933-41).
도 5 - 상기 3종의 APRIL -CAR의 주석이 달린 아미노산 서열
A: CD8 줄기 APRIL CAR의 주석이 달린 아미노산 서열을 도시하고; B: APRIL IgG1 힌지계 CAR의 주석이 달린 아미노산 서열을 도시하고; C: APRIL Fc-pvaa계 CAR의 주석이 달린 아미노산 서열을 도시한다.
도 6- 상이한 APRIL계 CAR의 발현 및 리간드 결합
A. 수용체를 레트로바이러스 유전자 벡터에서 마커 유전자 절두된 CD34와 공발현시켰다. 형질도입된 세포 상에서 마커 유전자의 발현은 형질도입의 입증을 인정한다. B. T-세포에 CD8 줄기 스페이서, IgG1 힌지 또는 Fc 스페이서를 가진 APRIL계 CAR로 형질도입시켰다. 이들 수용체가 세포 표면 상에서 안정적으로 발현될 수 있는 지를 시험하기 위해, T-세포를 항-APRIL-비오틴/스트렙타비딘 APC 및 항-CD34로 염색하였다. 유세포 분석을 실시하였다. APRIL이 3종의 CAR에서 세포 표면 상에서 동등하게 검출되었는데 이는 이들이 대등하게 안정적으로 발현됨을 시사한다. C. 다음, TACI 및 BCMA를 인식하는 CAR의 능력을 확인했다. 형질도입된 T-세포를 항-마우스 이차 및 항-CD34와 함께 재조합 BCMA 또는 TACI 융합된 마우스 IgG2a Fc 융합체로 염색했다. 3종의 수용체 포맷 모두 BCMA 및 TACI 둘다에 대한 결합을 보여주었다. 놀라운 발견은 BCMA에 대한 결합이 TACI에 대한 것보다 더 크다는 것이었다. 추가의 놀라운 발견은 비록 3종의 CAR 모두가 대등하게 발현되었더라도, CD8 줄기 및 IgG1 힌지 CAR은 Fc 스페이서를 이용한 것보다 BCMA 및 TACI를 인식함에 있어 더 우수한 것으로 나타났다는 점이다.
도 7 - 상이한 CAR 구축물의 기능.
3종의 상이한 APRIL계 CAR에 대한 기능 분석을 실시했다. 정상적인 공여자 말초 혈액 T-세포가 형질도입되지 않거나(NT), 또는 상이한 CAR을 발현하도록 형질도입되어졌다. 형질도입은 대등한 역가 상청액을 사용하여 실시되었다. 이들 T-세포는 이후 비특이적 NK 활성을 제거하기 위해 CD56이 결핍되었고 이펙터로서 사용되었다. 형질도입되지 않거나(NT), 또는 BCMA 또는 TACI를 발현하도록 형질도입된 SupT1 세포가 표적으로서 사용되었다. 도시된 데이터는 5가지의 독립된 실험의 평균 및 표준편차이다. A. BCMA 및 TACI 발현 T-세포의 특이적 사멸은 크롬 방출을 이용하여 확인되었다. B. 인터페론-γ 방출이 또한 확인되었다. 표적 및 이펙터는 1:1의 비로 공배양되었다. 24시간 후, 상청액 내의 인터페론-γ를 ELISA로 분석했다. C. CAR T-세포의 증식 / 생존이 또한 추가 6일간 인큐베이트된 동일한 공배양물 중의 CAR T-세포의 수를 카운팅함으로써 확인되었다. 3종의 CAR 모두 BCMA 및 TACI 발현 표적에 대해 반응을 유도한다. BCMA에 대한 반응은 TACI에 대한 것보다 더 컸다.
도 8 - APRIL CAR T-세포에 의한 원발성 골수종 세포의 사멸
대부분의 원발성 골수종 세포는 자신의 표면 상에서 적은 수의 BCMA 분자를 발현하기 때문에, 저밀도 발현에도 불구하고 원발성 골수종 세포의 사멸이 일어나는 지를 조사했다. 도 2에 기재된 BCMA 발현의 범위를 나타낸 3개의 케이스를 선택했다: 첫번째 케이스는 흐린(dim) 발현(평균 미만)을 가졌으며; 두번째 케이스는 중간 발현(대략 평균 발현)을 가졌고 세번째 케이스는 선명한(bright) 발현(평균 발현 초과)을 가졌다. 세가지 케이스 모두에 대한 이소타입 대조군에 대한 BCMA 염색의 히스토그램이 좌측에 도시된다. 이 분석에서는, 오직 CD8 줄기 및 힌지 APRIL CAR 만이 시험되었다. 좌측에서, 골수종 세포와 CAR T-세포의 1:1 공배양 후 3일째 및 6일째에 출발 수치와 비교한 골수종 세포의 생존이 도시되어 있다. 6일째에, 흐린 BCMA 발현을 가진 것들을 포함하여 골수종 세포의 >95%가 제거되었다.
도 9 - APRIL계 CAR을 절두된 CD34와 공발현하는 벡터
스크리닝에 사용되는 벡터를 발현하는 세포주를 BCMA-Fc 또는 TACI-Fc와 인큐베이트하고 항-CD34 및 항-인간-Fc PE 및 FITC 접합된 mAb 둘다로 염색했다. 이후, 세포를 유세포 분석으로 검사했다. 이는 마커 유전자 CD34에 관한 BCMA 및 TACI의 결합의 전형적인 패턴을 보여준다.
도 10A - 전형적인 CAR을 도시하는 개략적인 모식도
B: 생성되는 상이한 APRIL -계 CAR의 디자인.
신호 펩티드가 절두된 APRIL 아미노-말단에 부착된다. 이는 하기의 상이한 스페이서에 융합되었다: Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 Hombach 등(2010 Gene Ther. 17:1206-1213)에 의해 기재된 pvaa 돌연변이로 변형된 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인; 인간 CD8α의 줄기; 및 IgG1의 힌지. 이들 스페이서는 CD28 막관통 도메인, OX40 엔도도메인 및 CD3-제타 엔도도메인을 함유하는 3분할 엔도도메인에 연결된다.
도 11 - 상이한 CAR의 발현
수용체는 IRES 시퀀스를 이용하여 증강된 청색 형광 단백질 2(eBFP2)와 공발현되었다. 원발성 인간 T-세포가 형질도입되고 항-APRIL-비오틴/스트렙타비딘 APC로 염색되었다. 유세포 분석이 실시되었다. eBFP2 신호가 APRIL 검출에 대해 도시된다. 3종류 CAR 모두가 안정적으로 발현된다 (3가지 상이한 정상 공여자 T-세포를 사용하여 실시된 3종류의 독립적인 실험들의 대표적인 실험).
도 12 - 크롬 방출 분석
이펙터로서, 형질되입되지 않거나(NT) 또는 상이한 스페이서 CAR을 발현하기 위해 형질도입된 정상 공여자 말초 혈액 T-세포를 이용하고, 표적으로서, 형질도입되지 않거나(NT), 또는 BCMA 또는 TACI를 발현하도록 형질도입된 SupT1 세포를 이용한다. T-세포는 NK 활성을 감소시키기 위해 CD56 결핍되어졌다. 이는 세가지 독립적인 실험들의 대표격이며 실시예로서 도시된다. 누적 사멸 데이터가 도 7A에 도시된다. BCMA 및 TACI 발현 T-세포의 특이적 사멸은 네거티브 표적 세포에 대한 무 활성으로 확인된다.
도 13 - 인터페론-감마 방출
이펙터와 표적의 1:1 공배양물로부터 ELISA로 측정된다. CD8 줄기 구축물은 최상의 특이성을 갖는 것으로 보이지만 대부분의 인터페론 방출에 있어 힌지 구축물 결과는 약간의 비특이적 활성을 보여준다. 이는 3가지 독립적인 실험들의 대표격이며 실시예로서 도시된다. 누적 인터페론-감마 방출 데이터가 도 7B에 도시된다.
도 14 - 원발성 골수종 상에서의 BCMA 발현의 예
래트 항-인간 BCMA mAb Vicky1로 염색된 골수종 샘플의 4가지 예들이 도시된다. 제1 패널은 혈장 세포 백혈병을 가진 환자(골수종의 비정상, 진행형 및 급속 진행형)에서 선명한 BCMA 염색을 보여준다. 나머지 세가지 케이스는 임상적으로 그리고 형태학적으로 전형적인 골수종이다. 이들은 전형적으로 확인되는 중간 또는 흐린 염색을 보여준다. 이소타입 대조군을 이용한 염색(회색)이 슈퍼임포징된다. 이들은 도 2에 도시된 누적 BCMA 발현 데이터의 예들이다.
도 15 - V5 에피토프 태그를 가진 APRIL -CAR의 아미노산 서열.
A: dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ
B: dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ
C: dAPRIL-HNG-CD28OXZ
이 도면에서의 서열은 도 5에서의 것과 상이하며 상이한 신호 펩티드를 가지고 V5 태그가 없다.
도 16 - APRIL CAR T-세포의 생체내 기능의 입증
3개월 된 6마리의 암컷 NSG 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 1x107 MM1.s.FLuc 세포를 제공했다. 마우스를 8일째 및 13일째에 생물발광으로 이미지화했다. 13일째 이미지화 후, 4마리의 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 5x106 APRIL CAR T-세포를 제공했다. 마우스를 13일째 및 18일째에 이미지화했다. CAR T-세포를 제공받은 마우스는 (*)로 표시된다. 처리된 모든 마우스에 대해 18일째까지 골수종의 차도가 관찰될 수 있었지만, 비처리 마우스에서 질환은 진행되고 있었다.
발명의 양태들의 요약
B-세포막 항원(BCMA)은 거의 모든 다발성 골수종(MM) 상에서 발현되는 표면 단백질이다. BCMA는 단지 다르게는 혈장 세포 상에서 발현되며 이에 이러한 항원의 표적화는 골수종의 효과적인 치료를 입증할 수 있다. 그러나, BCMA의 낮은 수준의 발현(도 2 참조)이 이러한 항원을 표적화함에 있어 고려사항이다.
본 발명자들은 놀랍게도, 결합 도메인이 CAR-타입 분자에서 BCMA 결합 항체보다 증식 유도 리간드(APRIL: a proliferation-inducing ligand)에 기초하여 사용된다면, 이러한 CAR을 발현하는 T 세포가 비록 낮은 수준의 발현을 보이기는 하나 BCMA-발현 표적 세포의 매우 효율적인 사멸을 야기한다는 것을 밝혀내었다.
이론에 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 이것이 BCMA와 APRIL의 결합에서 고유한 3회 대칭(three-fold symmetry) 때문인 것으로 예측한다. 이는 CAR과 BCMA 간의 모든 상호작용이 3개의 CAR을 수반하고, 3개의 엔도도메인을 T-세포 표면 상에 근접시킬 것임을 의미한다. T-세포 활성화는 면역학상 시냅스에서 신호전달 엔도도메인의 근접화에 의해 촉진되기 때문에, 본 발명의 CAR 디자인은 고 감응성이고 특이적이다. BCMA는 원발성 골수종 세포 상에서 매우 낮은 밀도로 발현되기 때문에 (도 2 및 7 참조), 이 수용체 디자인은 이 표적에 특히 적합하다.
이에, 제1 양태에서 본 발명은 하기를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다:
(i) 증식 유도 리간드(APRIL)의 적어도 일부를 포함하는 B 세포 성숙 항원(BCMA) 결합 도메인;
(ii) 스페이서 도메인;
(iii) 막관통 도메인; 및
(iv) 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
BCMA 결합 도메인은, BCMA 결합 부위를 포함하지만 프로테오글리칸 결합을 담당하는 APRIL의 아미노 말단 부분이 결여된 절두된 APRIL을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 서열 번호 14에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. 대안으로 이 분자는 BCMA에 결합하는 상기 서열의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
막관통 및 세포내 T-세포 신호전달 도메인은 서열 번호 7에 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
BCMA 결합 도메인 및 막관통 도메인은 스페이서에 의해 연결될 수 있다. 스페이서는 하기 중 하나를 포함할 수 있다: 인간 IgG1 스페이서; IgG1 힌지; 또는 CD8 줄기.
본 발명의 제1 양태의 CAR은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가지면서 i) BCMA에 결합하고 ii) T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유하는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 CAR은 삼합체로서 BCMA에 결합할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 임의 앞서 청구된 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
핵산 서열은 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19 또는 20에 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포 또는 NK 세포의 제조 방법으로서, 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산을 T 세포 또는 NK 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포/NK 세포를 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 혈장 세포 장애의 치료 방법으로서, 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포/NK 세포를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
혈장 세포 장애는 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, 다발성 골수종, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성 골형질세포종, 골수외 형질세포종, 골경화성 골수종, 중쇄병, 의미불명의 단일클론성 감마병증 및 무증상 다발성 골수종에서 선택될 수 있다.
혈장 세포 장애는 다발성 골수종일 수 있다.
제8 양태에서, 본 발명은 혈장 세포 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포/NK 세포를 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 혈장 세포 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포/NK 세포의 용도를 제공한다.
상세한 설명
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체(CAR)는 키메라 T 세포 수용체, 인공 T 세포 수용체 및 키메라 면역수용체로도 알려져 있으며, 면역성 이펙터 세포 상에 임의의 특이성을 접목시킨 조작된 수용체이다. 전통적인 CAR에서는 (도 3), 단일클론 항체의 특이성이 T 세포 또는 NK 세포 상에 접목된다. CAR-코딩 핵산이 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 또는 NK 세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 다수의 암 특이적 T 세포 또는 NK 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 이러한 접근 방식의 초기 임상 연구는 주로 B-세포 악성 종양을 치료하기 위해 pan-B-세포 항원 CD19를 표적화하는 경우에 일부 암에서 효능을 나타내어왔다.
CAR의 표적-항원 결합 도메인은 흔히 스페이서 및 막관통 도메인을 통해 신호전달 엔도도메인에 융합된다. CAR이 표적-항원에 결합하면, 이는 이것이 발현되는 T-세포로 활성화 신호의 전달을 일으킨다.
본 발명의 CAR은 하기를 포함한다:
(i) 증식 유도 리간드(APRIL)의 적어도 일부를 포함하는 B 세포 성숙 항원(BCMA) 결합 도메인, 이는 이하에서 보다 상세히 논의됨;
(ii) 스페이서;
(iii) 막관통 도메인; 및
(iv) 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
본 발명의 CAR은 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 분자는 변이체 서열이 본 발명의 제1 양태에서 정의된 바와 같은 분자, 즉 하기 (i) ~ (iv)를 포함하는 CAR임을 조건으로 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나타낸 서열의 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다:
(i) BCMA 결합 도메인;
(ii) 스페이서 도메인;
(iii) 막관통 도메인; 및
(iv) 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
두 폴리펩티드 서열 간의 %동일성은 프로그램 예컨대 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 무료로 입수가능한 BLAST에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
막관통 도메인
막관통 도메인은 막에 걸쳐있는 CAR의 서열이다. 이는 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CD28에서 유래할 수 있으며, 이는 우수한 수용체 안정성을 제공한다. 막관통 도메인은 임의의 타입 I 막관통 단백질에서 유래할 수 있다. 막관통 도메인은 소수성 나선을 형성하는 것으로 예측되는 합성 서열일 수 있다.
세포내 T 세포 신호전달 도메인(엔도도메인)
엔도도메인은 CAR의 신호-전달 부분이다. 항원 인식 후, 수용체가 밀집되고 신호가 세포로 전달된다. 가장 흔히 사용되는 엔도도메인 성분은 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타의 것이다. 이는 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전히 적격인 활성화 신호를 제공할 수는 없으며 추가의 공-자극성 신호전달이 요구될 수 있다. 예를 들면, 키메라 CD28 및 OX40이 CD3-제타와 함께 사용되어 증식 / 생존 신호를 전달할 수 있거나, 또는 3가지 모두가 함께 사용될 수 있다 (Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volume 12; Issue 5; Pages 933-41). CAR 엔도도메인은 또한, CAR이 효과적인 CAR 치료를 위해 적합한 신호를 전달하도록 자연에서 발견되는 신호전달 단백질 또는 당업자에 의해 구축되는 인공적인 신호전달 단백질에서 유래하는 다른 신호전달 도메인 개개로부터 또는 조합으로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 CAR의 엔도도메인은 CD28 엔도도메인 및 OX40 및 CD3-제타 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 막관통 및 세포내 T-세포 신호전달 도메인(엔도도메인)은 서열 번호 7에 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00003
변이체 서열은, 그 서열이 효과적인 막관통 도메인 및 효과적인 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 제공한다면, 서열 번호 7에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
신호 펩티드
본 발명의 CAR은 신호 펩티드를 포함할 수 있으며 이에 CAR이 세포, 예컨대 T-세포 내에서 발현되면, 초기 단백질이 소포체로 그리고 그 후에 이것이 발현되는 세포 표면으로 유도된다.
신호 펩티드의 코어는 단일 알파 나선을 형성하는 성향을 가진 소수성 아미노산의 긴 스트레치를 함유할 수 있다. 신호 펩티드는 아미노산의 짧은, 양으로 하전된 스트레치로 시작할 수 있으며, 이는 전좌(translocation) 동안 폴리펩티드의 적절한 토폴로지를 강요하는 것을 돕는다. 신호 펩티드의 단부에는 전형적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되어 절단되는 아미노산의 스트레치가 존재한다. 신호 펩티다제는 전좌 동안 또는 이의 완료 후에 절단하여 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 유리 신호 펩티드는 이후에 특이적인 프로테아제에 의해 분해된다.
신호 펩티드는 분자의 아미노 말단에 존재할 수 있다.
본 발명의 CAR은 하기 일반식을 가질 수 있다:
신호 펩티드 - BCMA 결합 도메인 - 스페이서 도메인 - 막관통 도메인 - 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
신호 펩티드는 신호 펩티드가 CAR의 세포 표면 발현을 유도하도록 여전히 기능한다면, 서열 번호 8 또는 9 또는 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이(삽입, 치환 또는 첨가)를 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00004
서열 번호 8 및 서열 번호 9의 신호 펩티드는 소형(compact)이고 매우 효율적이다. 이는 말단 글리신 이후에 약 95% 절단을 제공하여, 신호 펩티다제에 의한 효율적인 제거를 제공하는 것으로 예측된다.
스페이서
본 발명의 CAR은 BCMA 결합 도메인을 막관통 도메인과 연결하고 엔도도메인으로부터 BCMA 결합 도메인을 공간적으로 분리하기 위해 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 유연성 스페이서는 BCMA 결합을 가능하게 하기 위해 BCMA 결합 도메인이 다양한 방향으로 배향되도록 한다.
스페이서 서열은 예를 들면, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기를 포함할 수 있다. 링커는 대안으로 IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기와 유사한 길이 및/또는 도메인 스페이싱 성질을 가진 대체 링커 서열을 포함할 수 있다.
스페이서는 짧은 스페이서, 예를 들면 100개 미만, 80개 미만, 60개 미만 또는 45개 미만의 아미노산을 포함하는 스페이서일 수 있다. 스페이서는 IgG1 힌지 또는 CD8 줄기 또는 이의 변형된 버젼이거나 이를 포함할 수 있다.
인간 IgG1 스페이서는 Fc 결합 모티프를 제거하도록 변경될 수 있다.
이들 스페이서의 아미노산 서열의 예가 이하에 제공된다:
Figure pct00005
B-세포막 항원(BCMA)
본 발명의 제1 양태의 CAR은 BCMA에 결합하는 도메인을 포함한다.
BCMA는 TNFRSF17로도 알려져 있으며, B-계통 조혈 세포 또는 수지상 세포 상에서 배타적으로 발현되는 혈장 세포 특이적 표면 항원이다. 이는 TNF 수용체 패밀리의 멤버이다. BCMA는 나이브 B 세포 상에서 발현되지 않지만 형질아세포로의 B-세포 분화 동안 상향 조절되며, 기억 B 세포, 형질아세포 및 골수 혈장 세포 상에서 강렬하게 발현된다. BCMA는 또한 대부분의 원발성 골수종 세포 상에서 발현된다. 다른 CAR 표적 예컨대 CD19와 달리, BCMA는 저 밀도로 발현된다 (도 2).
BCMA는 상호연결된 리간드와 수용체의 네트웍 내에서 기능하며 이는 도 1에 개략적으로 도시된다. 2개의 다른 TNF 수용체가 리간드 APRIL 및 BAFF를 BCMA - TACI(TNFRSF13B)와 공유하며, 이는 활성화된 T-세포 및 모든 B-세포 및 BAFF-R(TNFRSF13C)(주로 B-림프구 상에서 발현됨) 상에서 확인된다. 다발성 골수종 세포는 일부 경우에 TACI를 발현하고 대부분의 경우에 BCMA를 발현하지만, BAFF-R을 발현하지 않는다.
APRIL
본 발명의 CAR의 BCMA 결합 도메인은 증식 유도 리간드(APRIL)의 적어도 일부를 포함한다. APRIL은 TNFSF13으로도 알려져 있다.
APRIL의 야생형 서열은 UNIPROT /O75888에서 입수가능하며 이하에 도시된다(서열 번호 13). 이는 신호 펩티드를 가지지 않는다는 점에서 전형적인 분비 단백질은 아니다. 이는 퓨린(furin) 절단 부위 "KQKKQK"(서열 번호 13에서 밑줄쳐 있음)를 가진다. 아미노 말단이 프로테오글리칸 결합에 수반된다.
BCMA 결합 도메인은 APRIL의 BCMA 결합 부위를 포함할 수 있다. BCMA 결합 도메인은 BCMA 결합 부위를 포함하는 APRIL의 단편을 포함할 수 있다.
BCMA 결합 도메인은 분자의 아미노 말단이 결여된 절두된 APRIL을 포함할 수 있다. 절두된 APRIL은 BCMA 및 TACI 결합을 보유할 수 있지만 프로테오글리칸 결합을 상실한다. 절두된 APRIL은 퓨린 절단 부위에서 또는 직후에 절단될 수 있다. 절두된 APRIL은 서열 번호 13에 나타낸 야생형 APRIL 분자로부터 아미노 말단 116개 아미노산이 결여될 수 있다. 절두된 APRIL은 서열 번호 14에 나타낸 서열(볼드체로 나타낸 서열 번호 13의 부분에 해당함) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이는 BCMA 및 TACI 결합에 필요한 분자의 부분에 해당한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명의 CAR은 서열 번호 14에 나타낸 절두된 APRIL 분자의 변이체로서, 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 가지고 동일하거나 개선된 BCMA 결합 능력을 가진 변이체를 포함할 수 있다. 변이체 서열은 서열 번호 14에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
핵산 서열
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태의 CAR을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
핵산 서열은 하기 서열들 중 하나이거나 이를 포함할 수 있다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
핵산 서열은 서열 번호 15, 16, 17, 18 19 또는 20에 의해 코딩되는 것과 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 핵산 서열은 본 발명의 제1 양태에서 정의된 바와 같은 CAR을 코딩한다면, 서열 번호 15, 16, 17, 18 19 또는 20에 나타낸 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 핵산 서열을 숙주 세포 내에 도입하여 본 발명의 제1 양태에 따른 분자를 발현하고 생성하기 위해 사용될 수 있다.
벡터는 예를 들면, 플라스미드 또는 합성 mRNA 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
벡터는 이펙터 세포를 형질감염시키거나 형질도입할 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 발현할 수 있다.
숙주 세포는 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 CAR을 발현할 수 있는 T-세포는 T 세포에 CAR-코딩 핵산을 형질도입하거나 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다.
T-세포는 생체외 T 세포일 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플로부터의 것일 수 있다. T 세포는 CAR-코딩 핵산으로 형질도입되기 이전에, 예를 들면 항-CD3 단일클론 항체로 처리함으로써 활성화되고/거나 증식될 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 벡터 또는 CAR 발현 T 세포를 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 경우에 따라 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 제제는 예를 들면, 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
치료 방법
본 발명의 CAR 분자를 발현하는 T 세포는 암 세포, 예컨대 다발성 골수종 세포를 사멸시킬 수 있다. CAR-발현 T 세포는 환자 자신의 말초 혈액으로부터(제1자(party)), 또는 공여자 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포 이식체의 셋팅에서(제2자), 또는 관계없는 공여자로부터의 말초 혈액으로부터(제3자) 생체외 생성될 수 있다. 대안으로, CAR T-세포는 유도성 전구체 세포 또는 배아 전구체 세포의 T-세포로의 생체외 분화로부터 유래할 수 있다. 이들 경우에, CAR T-세포는 바이러스 벡터를 이용한 형질도입, DNA 또는 RNA를 이용한 형질감염을 포함한 다수의 수단들 중 하나에 의해 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입함으로써 생성된다.
본 발명의 CAR 분자를 발현하는 T 세포는 암성 질환, 특히 증진된 BCMA 발현과 관련된 혈장 세포 장애 또는 B 세포 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다.
혈장 세포 장애는 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, 다발성 골수종, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성 골형질세포종, 골수외 형질세포종, 골경화성 골수종(POEMS 증후군) 및 중쇄병뿐만 아니라 임상적으로 명확하지 않은 의미불명의 단일클론성 감마병증/무증상 다발성 골수종을 포함한다.
질환은 다발성 골수종일 수 있다.
상승된 BCMA 발현 수준과 관련된 B 세포 장애의 예는 CLL(만성 림프구성 백혈병) 및 비호지킨 림프종(NHL)이다. 본 발명의 이특이적 결합제는 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS) 및 류마티스 관절염(RA)과 같은 자가면역성 질환의 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 암성 질환, 특히 상승된 BCMA 발현과 관련된 혈장 세포 장애 또는 B 세포 장애를 치료하기 위한 것일 수 있다.
질환 치료 방법은 본 발명의 벡터 또는 T 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 이와 관련해서, 벡터 또는 T 세포는 기존 질환 또는 병태를 가진 피험체에 투여되어 해당 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 완화, 감소 또는 개선하고/거나 해당 질환의 진행을 둔화, 감소 또는 차단할 수 있다. 본 발명의 방법은 BCMA-발현 세포, 예컨대 혈장 세포의 T-세포 매개 사멸을 일으키거나 촉진할 수 있다.
본 발명은 지금부터 실시예에 의해 더욱 상세히 기재될 것이며, 이는 본 발명을 실시함에 있어 당업자를 보조하는 역할이며 본 발명의 범위를 어떠한 형태로든 제한하고자 하는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1 - 골수종에 대한 표적으로서 BCMA의 특징규명
원발성 골수종 세포를, 프랭크 질환을 앓는 것으로 알려진 다발성 골수종 환자로부터의 새로운 골수 샘플 상에서 CD138 면역자기 선별을 실시함으로써 단리했다. 이들 세포를 PE에 접합된 BCMA 특이적 J6MO mAb(GSK)로 염색했다. 동시에, 알려진 수의 결합 부위를 가진 비드의 표준을 PE Quantibrite 비드 키트(Becton Dickenson)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 생성했다. 골수종 세포 상의 BCMA 카피 수는 골수종 세포로부터의 평균-형광 세기를 비드에서 유래한 표준 곡선과 관련시킴으로써 유도될 수 있었다. 골수종 세포 표면 상의 BCMA 카피 수의 범위는 낮은 것으로 확인되었다: 세포 당 348.7-4268.4 BCMA 카피로서, 평균 1181 및 중앙값 1084.9 (도 2). 이는 CAR에 대한 전형적인 표적 예를 들어 CD19 및 GD2보다 상당히 더 낮다. 원발성 골수종 세포 상에서 BCMA 발현의 존재는 또한 Vicky-1 항체(Abcam Ab17323)를 사용하여 확인되었으며, 이의 예가 도 14에 도시되어 있다.
실시예 2 - APRIL계 CAR의 디자인 및 구축.
천연 형태의 APRIL은 분비형 타입 II 단백질이다. CAR에 대한 BCMA 결합 도메인으로서 APRIL의 사용은 이러한 타입 II 분비 단백질의 타입 I 막 결합된 단백질로의 전환을 요구하고 이 단백질이 이 형태에서 안정하고 BCMA로의 결합을 유지할 것을 요구한다. 후보 분자를 생성하기 위해, APRIL의 최첨단 아미노-말단을 결실시켜 프로테오글리칸에 대한 결합을 배제했다. 다음, 신호 펩티드를 첨가하여 초기 단백질을 소포체로 그리고 결과적으로 세포 표면으로 유도했다. 또한, 사용되는 스페이서의 성질이 CAR의 기능을 변경할 수 있기 때문에, 세가지 상이한 스페이서 도메인을 시험했다: (i) Fc 결합 모티프를 제거하기 위해 변경된 인간 IgG1 스페이서; (ii) CD8 줄기; 및 (iii) IgG1 힌지 단독을 포함하는 APRIL계 CAR을 생성했다 (도 4에서의 밑그림 및 도 5에서의 아미노산 서열, 및 또한 도 19에서의 아미노산 서열, 이는 상이한 신호 펩티드 및 V5 에피토프 태그를 가짐으로써 도 5에서의 서열과 상이함). 이들 CAR은 비시스트로닉 레트로바이러스 벡터에서 발현되었으며(도 6A) 이에 마커 단백질 - 절두된 CD34가 편리한 마커 유전자로서 공발현될 수 있었다.
실시예 3 - APRIL계 CAR의 발현 및 기능.
본 연구의 목적은 구축된 APRIL계 CAR이 세포 표면 상에서 발현되었는지 그리고 APRIL이 폴딩되어 천연 단백질을 형성했는지를 시험하는 것이었다. T-세포에 이들 상이한 CAR 구축물을 형질도입하고 마커 유전자를 위한 염색과 함께 상업적으로 입수가능한 항-APRIL mAb를 사용하여 염색하고, 유세포 분석을 실시했다. 이 실험의 결과가 도 6B에 도시되며 여기서 APRIL 결합은 마커 유전자 형광에 대해 작도되고 있다. 이들 데이터는 이러한 포맷에서, APRIL계 CAR이 세포 표면 상에서 발현되고 APRIL이 충분히 폴딩되어 항-APRIL mAb에 의해 인식됨을 보여준다.
다음, 이러한 포맷의 APRIL이 BCMA 및 TACI를 인식할 수 있는 지를 확인했다. 재조합 BCMA 및 TACI를 마우스 IgG2a-Fc와의 융합체로서 생성했다. 이들 재조합 단백질을 형질도입된 T-세포와 함께 인큐베이트했다. 이후, 세포를 세척하고 항-마우스 형광단 접합된 항체 및 상이한 형광단에 접합된 마커 유전자를 검출하기 위한 항체로 염색했다. 세포를 유세포 분석으로 분석하고 결과를 도 6C에 제시한다. 상이한 CAR은 BCMA 및 TACI 둘다에 결합할 수 있었다. 놀랍게도, CAR은 TACI보다 BCMA에 더 잘 결합할 수 있었다. 또한, 놀랍게도 CD8 줄기 또는 IgG1 힌지 스페이서를 가진 CAR은 Fc 스페이서를 가진 CAR보다 BCMA 및 TACI에 더 잘 결합할 수 있었다.
실시예 4 - APRIL계 키메라 항원 수용체는 BCMA 발현 세포에 대해 활성이다
정상 공여자로부터의 T-세포에 상이한 APRIL CAR을 형질도입하고 야생형, 또는 BCMA 및 TACI를 발현하도록 조작된 SupT1 세포에 대해 시험했다. 몇몇 다양한 분석을 이용하여 기능을 확인했다. 전형적인 크롬 방출 분석을 실시했다. 여기서, 표적 세포(SupT1 세포)를 51Cr로 표시하고 이펙터(형질도입된 T-세포)와 다양한 비로 혼합했다. 표적 세포의 용해는 공배양 상청액에서 51Cr을 카운팅함으로써 확인되었다 (도 6A는 누적 데이터를 도시하며, 다양한 이펙터:표적 비를 이용한 단일 분석으로부터의 실시예 데이터가 도 12에 도시됨).
나아가, SupT1 세포와 1:1로 배양된 T-세포로부터의 상청액은 인터페론-감마에 대해 ELISA로 분석되었다 (도 6B는 누적 데이터를 도시하며, 단일 분석에서의 실시예 데이터가 도 13에 도시됨). SupT1 세포와 공배양 1주일 후 T-세포 증식의 측정이 또한 실시되었다 (도 6C). T-세포는 비드 카운팅으로 보정된 유세포 분석에 의해 카운팅되었다. 이들 실험 데이터는 APRIL계 CAR이 BCMA 발현 표적을 사멸할 수 있음을 보여준다. 나아가, 이들 데이터는 CD8 줄기 또는 IgG1 힌지에 기초한 CAR이 Fc-pvaa계 CAR보다 더 잘 시행되었음을 보여준다.
실시예 5 - APRIL계 CAR은 원발성 골수종 세포를 사멸시킬 수 있다
상기 데이터는 원칙적으로, APRIL계 CAR을 제조할 수 있음을 입증하기 때문에 고무적이다. 그러나, 대부분의 원발성 골수종 세포는 자신의 표면 상에서 낮은 수의 BCMA 분자를 발현하기 때문에, 이러한 APRIL계 CAR이 특히 저밀도 발현의 경우에 원발성 골수종 세포의 사멸을 야기하는 지를 조사했다. 도 2에 기재된 BCMA 발현의 범위를 나타낸 세 가지 케이스를 선별했다: 제1 케이스는 흐린 발현을 가졌으며 (평균보다 더 낮음); 제2 케이스는 중간 발현을 가졌고 (대략 평균 발현) 제3케이스는 선명한 발현을 가졌다 (평균 발현 초과). 도 8은 BCMA 발현을 설명하기 위해 좌측에서 세 가지 케이스 모두에 대해 이소타입 대조군에 대한 BCMA 염색의 히스토그램을 도시한다. 상이한 스페이서를 가진 APRIL계 CAR을 비교했을 때 CD8 줄기 스페이서 및 IgG1 힌지 스페이서를 가진 CAR이 Fc-pvaa 스페이서를 가진 CAR보다 더 잘 시행되었음을 확인했기 때문에, 본 분석에서는, CD8 줄기 및 힌지 APRIL CAR만을 시험했다. 좌측에서는, 골수종 세포와 CAR T-세포의 1:1 공배양 후 3일째 및 6일째에 출발 수치와 비교해서 골수종 세포의 생존을 도시한다. 6일째에, 흐린 BCMA 발현을 갖는 것을 포함하여 골수종 세포의 >95%가 제거되었다. 흐린 BCMA 발현 골수종 세포는 보다 높은 발현자보다 더 느린 사멸의 템포를 가지지만 APRIL CAR에 의해 표적화될 수 있다.
실시예 6 - Fc 스페이서에 융합된 분비형 및 절두형 APRIL은 BCMA 및 TACI를 인식한다
CAR 포맷(즉 막관통 도메인에 융합되고 세포막에 고정됨)에서 절두된 APRIL이 BCMA 및 TACI에 결합할 수 있는 지를 조사하기 위해, 베이직 CAR에 대해, 편리한 마커 유전자로서 절두된 CD34를 갖는 자가-절개 발 및 입 질환 2A 펩티드를 사용하여 프레임 내에서 조작했다. 이 구축물을 발현하는 안정한 SUPT1 세포주를 확립했다. 인간 (및 다른 종, 미도시) Ig Fc 도메인에 융합된 분비형 절두된 BCMA 및 TACI를 또한 생성하고 재조합 단백질을 제조했다. BCMA-Fc 및 TACI-Fc 둘 다 조작된 SUPT1 세포주에 결합하는 것으로 나타났다. CD34 마커 유전자를 발현하는 세포만이 BCMA-Fc 및 TACI-Fc에 결합하는 것으로 확인되었다 (도 9).
실시예 7 - APRIL계 키메라 항원 수용체는 T-세포의 표면 상에서 안정적으로 발현된다
CAR 스페이서 도메인은 감응성 및 특이성을 변경할 수 있다. 3가지 스페이서 도메인: (i) Fc 결합 모티프를 제거하기 위해 변경된 인간 IgG1 스페이서; (ii) CD8 줄기; 및 (iii) IgG1 힌지 단독을 갖는 APRIL-계 CAR의 3가지 버젼을 생성했다 (도 10B). 원발성 인간 T-세포를 이러한 상이한 CAR로 형질도입하고 상업적으로 입수가능한 항-APRIL mAb를 사용하여 염색했다 (도 11).
실시예 8 - APRIL계 키메라 항원 수용체는 동계(cognate) 표적 발현 세포에 대해 활성이다
정상 공여자로부터의 T-세포를 상이한 APRIL CAR들로 형질도입하고 야생형, 또는 BCMA 및 TACI를 발현하도록 조작된 SupT1 세포에 대해 시험했다. 몇가지 상이한 분석을 실시하여 기능을 확인했다. 전형적인 크롬 방출 분석을 실시했다. 여기서, 표적 세포(SupT1 세포)를 51Cr로 표시하고 이펙터(형질도입된 T-세포)와 다양한 비로 혼합했다. 공배양 상청액에서의 51Cr을 카운팅함으로써 표적 세포의 용해를 확인했다 (도 12).
나아가, SupT1 세포와 1:1 배양된 T-세포의 상청액을 인터페론-감마에 대해 ELISA로 분석했다 (도 13).
SupT1 세포와의 공배양 1주일 후 T-세포 증식의 측정을 또한 실시했다. T-세포는 비드 카운팅으로 보정된 유세포 분석에 의해 카운팅되었다. 초기 데이터(미도시)는 CD8 줄기계 구축물이 다른 구축물보다 더 많은 T-세포 증식을 유도했음을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 9 - APRIL CAR T-세포의 생체내 기능의 입증
생체내에서 APRIL CAR T-세포 기능을 입증하기 위해, APRIL CAR T-세포를 인간 / 마우스 키메라 모델에서 시험했다. MM1.s (ATCC CRL-2974)는 중간 수준의 BCMA를 발현하는 인간 골수종 세포주이다. 본 발명자들은 이 세포주가 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하도록 조작하여 세포주 MM1.s.FLuc를 유도했다.
NOD scid 감마 (NSG: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ) 마우스는 몇몇 인간 세포주 및 인간 말초 혈액 림프구를 이식할 수 있는 완전히 면역억제된 마우스이다. 3개월된 암컷 NSG 마우스에 임의의 예비적인 치료없이 꼬리-정맥 주사를 통해 1x107 MM1.s.FLuc 세포를 제공했다. 일련의 생물발광 이미지화에 의해 이식을 확인했다 (도 16). 모든 마우스에서 강하면서 증가형의 골수내 이식이 관찰되었다. 13일째, 5x106 APRIL-HNG-CD28OXZ CAR T-세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여했다. 일련의 생물발광을 실시했으며 이는 처리된 모든 마우스에서 MM1.s의 부담에 있어 빠른 감소 (도 16) 내지 완치를 보여주었다. CAR 요법에 대한 이러한 반응은 유세포 분석 및 면역조직화학에 의해 확인되었다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공보는 본원에서 참고적으로 포함된다. 본 발명의 범위 및 취지에서 벗어남이 없이 기재된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 수정이 당업자에게 자명할 것이다. 비록 본 발명이 구체적인 바람직한 실시양태들과 함께 기재되어 있으나, 청구된 발명은 이러한 구체적인 실시양태들로 부당하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야에서의 숙련인에게 자명한 본 발명을 실시하기 위해 기재된 방식에 대한 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCL Business PLC <120> Chimeric antigen receptor <130> P103292PCT <140> PCT/GB2014/053058 <141> 2014-10-10 <150> GB 1317929.6 <151> 2013-10-10 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 614 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric antigen receptor (CAR) dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser 20 25 30 Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg 35 40 45 Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp 50 55 60 Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr 65 70 75 80 Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala 100 105 110 Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp 115 120 125 Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser 130 135 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cggcgtgaga 240 atccaggacg ctggcgtgta cctgctgtac tcccaggtgc tgttccagga cgtgaccttc 300 acaatgggcc aggtggtgag ccgggagggc cagggcagac aggagaccct gttccggtgc 360 atccggagca tgcccagcca ccccgacaga gcctacaaca gctgctacag cgctggcgtg 420 tttcacctgc accagggcga catcctgagc gtgatcatcc ccagagccag agccaagctg 480 aacctgtccc cccacggcac ctttctgggc ttcgtgaagc tgtctggagg cggctcggat 540 cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctccc 600 gtggccggcc cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatcgcc 660 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 720 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 780 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 840 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 900 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 960 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1020 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcaaccgg agaacaacta caagaccacg 1080 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1140 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1200 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaaa aagatcccaa attttgggtg 1260 ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 1320 attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 1380 ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 1440 gcagcctatc gctccaggga ccagaggctg ccccccgatg cccacaagcc ccctggggga 1500 ggcagtttcc ggacccccat ccaagaggag caggccgacg cccactccac cctggccaag 1560 atcagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1620 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1680 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1740 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1800 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1860 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg cctcctcgct aa 1902 <210> 19 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequences coding for a CAR (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ) <400> 19 atgggcacct ccctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggagccga ccacgccgac 60 ggcaagccca ttcccaaccc cctgctgggc ctggactcca cctctggcgg aggcggcagc 120 gtgctgcacc tggtgcccat caacgccacc agcaaggacg actctgatgt gaccgaggtg 180 atgtggcagc cagccctgag acggggcaga ggcctgcagg cccagggcta cggcgtgaga 240 atccaggacg ctggcgtgta cctgctgtac tcccaggtgc tgttccagga cgtgaccttc 300 acaatgggcc aggtggtgag ccgggagggc cagggcagac aggagaccct gttccggtgc 360 atccggagca tgcccagcca ccccgacaga gcctacaaca gctgctacag cgctggcgtg 420 tttcacctgc accagggcga catcctgagc gtgatcatcc ccagagccag agccaagctg 480 aacctgtccc cccacggcac ctttctgggc ttcgtgaagc tgtctggagg cggctcggat 540 cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 600 ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 660 ctggacttcg cctgtgatat cttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 720 tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 780 ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 840 taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccaggga ccagaggctg 900 ccccccgatg cccacaagcc ccctggggga ggcagtttcc ggacccccat ccaagaggag 960 caggccgacg cccactccac cctggccaag atcagagtga agttcagcag gagcgcagac 1020 gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1080 gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1140 agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1200 gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1260 taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1320 cctcctcgct aa 1332 <210> 20 <211> 1254 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequences coding for a CAR (dAPRIL-HNG-CD28OXZ) <400> 20 atgggcacct ccctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggagccga ccacgccgac 60 ggcaagccca ttcccaaccc cctgctgggc ctggactcca cctctggcgg aggcggcagc 120 gtgctgcacc tggtgcccat caacgccacc agcaaggacg actctgatgt gaccgaggtg 180 atgtggcagc cagccctgag acggggcaga ggcctgcagg cccagggcta cggcgtgaga 240 atccaggacg ctggcgtgta cctgctgtac tcccaggtgc tgttccagga cgtgaccttc 300 acaatgggcc aggtggtgag ccgggagggc cagggcagac aggagaccct gttccggtgc 360 atccggagca tgcccagcca ccccgacaga gcctacaaca gctgctacag cgctggcgtg 420 tttcacctgc accagggcga catcctgagc gtgatcatcc ccagagccag agccaagctg 480 aacctgtccc cccacggcac ctttctgggc ttcgtgaagc tgtctggagg cggctcggat 540 cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc aaaagatccc 600 aaattttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 660 gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 720 atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 780 ccacgcgact tcgcagccta tcgctccagg gaccagaggc tgccccccga tgcccacaag 840 ccccctgggg gaggcagttt ccggaccccc atccaagagg agcaggccga cgcccactcc 900 accctggcca agatcagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 960 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1020 gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1080 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1140 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1200 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgcctcctcg ctaa 1254 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 21 Lys Gln Lys Lys Gln Lys 1 5

Claims (18)

  1. (i) 증식 유도 리간드(APRIL: a proliferation-inducing ligand)의 적어도 일부를 포함하는 B 세포 성숙 항원(BCMA: B cell maturation antigen) 결합 도메인;
    (ii) 스페이서 도메인; 및
    (ii) 막관통 도메인; 및
    (iii) 세포내 T 세포 신호전달 도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor).
  2. 제1항에 있어서, BCMA 결합 도메인은, BCMA 결합 부위를 포함하지만 프로테오글리칸 결합을 담당하는 APRIL의 아미노 말단 부분을 결여하는 절두된(truncated) APRIL을 포함하는 것인 CAR.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 14에 나타낸 서열 또는 BCMA와 결합하는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CAR.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열 번호 7에 나타낸 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것인 CAR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서는 이하: 인간 IgG1 스페이서; IgG1 힌지; 또는 CD8 줄기(stalk) 중 하나를 포함하는 것인 CAR.
  6. 제5항에 있어서, 스페이서는 CD8 줄기를 포함하는 것인 CAR.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나타낸 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 가지면서 i) BCMA에 결합하고 ii) T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유하는 이의 변이체를 포함하는 CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 코딩하는 핵산 서열.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19 또는 20에 나타낸 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 핵산 서열.
  10. 제8항 또는 제9항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포.
  12. 제11항에 따른 T 세포 또는 NK 세포의 제조 방법으로서, 제8항 또는 제9항에 따른 핵산을 T 세포 또는 NK 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  13. 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 T 세포/NK 세포를 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물.
  14. 혈장 세포 장애의 치료 방법으로서, 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 T 세포/NK 세포를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 혈장 세포 장애는 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, 다발성 골수종, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성 골형질세포종, 골수외 형질세포종, 골경화성 골수종, 중쇄병, 의미불명의 단일클론성 감마병증 및 무증상 다발성 골수종에서 선택되는 것인 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 혈장 세포 장애는 다발성 골수종인 치료 방법.
  17. 혈장 세포 장애의 치료에 사용하기 위한 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 T 세포/NK 세포.
  18. 혈장 세포 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 T 세포/NK 세포의 용도.
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