ES2877129T3 - Sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) - Google Patents

Sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) Download PDF

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Abstract

Un ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende; (i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión al inductor químico de dimerización (CID) intracelular (CBD1); y (ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio unión al CID (CBD2); en donde el ácido nucleico codifica tanto el componente receptor como el componente de señalización del sistema de señalización del CAR; en donde CBD1 y CBD2 son capaces de unirse simultáneamente a un CID; y en donde, en ausencia de CID, la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado la señalización a través del dominio de señalización; si bien, en presencia de CID, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado la señalización a través del dominio de señalización.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR)
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de receptores de antígenos.
Antecedentes de la invención
Tradicionalmente, los linfocitos T específicos de antígeno se han generado por expansión selectiva de linfocitos T de sangre periférica específicos de forma nativa para el antígeno diana. Sin embargo, es difícil y a menudo imposible seleccionar y expandir grandes cantidades de linfocitos T específicos para la mayoría de los antígenos de cáncer. La terapia génica con vectores de integración brinda una solución a este problema, ya que la expresión transgénica del receptor de antígeno quimérico (CAR; del inglés, Chimeric Antigen Receptor) permite la generación de grandes cantidades de linfocitos T específicos para cualquier antígeno de superficie mediante transducción de vectores víricos ex vivo de una población masiva de linfocitos T de sangre periférica.
Los receptores de antígeno quiméricos son proteínas que injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) con la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un extremo amino terminal que reconoce el antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, todo ello conectado a un endodominio compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de linfocitos T (véase la Figura 1a).
La forma más común de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) procedentes de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y destruyen las células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados a tumores y las estrategias de transferencia adoptiva usando tales linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.
Se han notificado diversas toxicidades de los estudios con CAR y existen toxicidades teóricas adicionales. Tales toxicidades incluyen toxicidad inmunológica causada por la activación intensa sostenida de los linfocitos T CAR que da como resultado un síndrome de activación de macrófagos (MAS; del inglés, macrophage activation syndrome) y toxicidad "en la diana fuera del tumor" (en inglés, "On-target off-tumour"), es decir, reconocimiento del antígeno diana en tejidos normales.
Se presume que MAS está causado por la activación impulsada por antígenos persistente y la proliferación de linfocitos T que a su vez liberan abundantes citocinas inflamatorias conduciendo a la hiperactivación de macrófagos y un ciclo de avance de la activación inmunitaria. Es característico un gran pico en la IL-6 sérica y el síndrome puede dar como resultado una enfermedad sistémica grave requiriendo el ingreso en UCI.
La toxicidad en la diana fuera del tumor se ha notificado con otros CAR, por ejemplo, un grupo de pacientes tratados con un CAR contra el antígeno del carcinoma de células renales CAIX desarrolló una toxicidad biliar inesperada y limitante del tratamiento. Se han notificado dos muertes con los estudios de CAR: un paciente murió de un síndrome de dificultad respiratoria que se manifestó inmediatamente después de la infusión de una dosis grande de linfocitos T CAR anti-ERBB2 de 3a generación; un paciente adicional murió en un estudio diferente tras una posible tormenta de citocinas tras el tratamiento de LLC (en inglés, CLL) con un CAR anti-CD19 de segunda generación.
Estas toxicidades son muy difíciles de predecir, incluso con los estudios detallados de animales o el trabajo de primates no humanos. Esencialmente, a diferencia de las moléculas pequeñas y los productos biológicos, los linfocitos T CAR no tienen una semivida y no se puede cesar la administración y esperar a que el agente se degrade/se excrete. Los linfocitos T CAR son autónomos y pueden injertar y proliferar. Por tanto, la toxicidad puede ser progresiva y fulminante. Los genes suicidas son elementos expresados genéticamente que condicionalmente pueden destruir las células que los expresan. Entre los ejemplos se incluyen la timidina quinasa del virus del herpes simple, que hace a las células susceptibles a Ganciclovir; la Caspasa 9 inducible, que hace a las células susceptibles de un homodimerizador molecular pequeño y CD20 y RQR8, que hace a las células susceptibles a Rituximab.
Esta tecnología añade una cierta cantidad de seguridad a la terapia con linfocitos T CAR, aunque hay limitaciones. En primer lugar, es un enfoque binario en donde todos los linfocitos T CAR se destruyen tras la adición de la entidad suicida. Además, las terapias medicinales a menudo tienen una ventana terapéutica. Con un gen suicida la potencia del producto no puede ajustarse, de modo que pueda lograrse eficacia con una toxicidad tolerable. En segundo lugar, no está claro si un gen suicida ayudaría con alguna de las toxicidades inmunitarias descritas anteriormente: por ejemplo, para cuando se ha desencadenado un síndrome de activación de macrófagos, es posible que ya no necesiten los linfocitos T CAR para perpetuarse y que el gen suicida ya no sea útil. Los síndromes de liberación de citocinas más agudos probablemente sucedan demasiado deprisa como para que el gen suicida trabaje. Por último, los genes suicidas no son "infalibles", es decir, el estado por defecto para los linfocitos T CAR es estar activos.
Por tanto, hay una necesidad de métodos alternativos para controlar los linfocitos T CAR que no estén asociados con las desventajas y problemas mencionados anteriormente.
Descripción de las figuras
Figura 1 -(a) Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales ITAM en solitario a través del endodominio FceR I-y o CD3Z, mientras que los diseños posteriores transmitían (c) una o (d) dos señales coestimuladoras adicionales en el mismo endodominio compuesto.
Figura 2 - Estructuras de análogos de rapamicina.
Figura 3 - Ilustración de un ejemplo de un sistema de señalización de CAR inducible en su versión más simple. (a) Componente receptor que comprende un scFv extracelular, un espaciador, un dominio transmembrana y un FKBP12 intracelular. (b) Componente de señalización: fusión intracelular entre el fragmento FRB de mTOR y los endodominios de CD28, de OX40 y CD3 Zeta. (c) Un inductor químico de dimerización (CID; del inglés, chemical inducer of dimerization), en este caso es rapamicina o un análogo. (d) Componente receptor. En presencia de CID, el componente receptor y los componentes de señalización se dimerizan, permitiendo la señalización en la presencia del antígeno afín.
Figura 4 - Función de un sistema de CAR inducible. Los linfocitos T se transdujeron con un sistema de CAR como se ha ilustrado en la Figura 3 y con la SEQ ID NO: 19. Este CAR reconoce CD19. Los linfocitos T que expresan CAR se desafiaron con dianas CD19+ en relaciones de efector y diana de 1:1 y 2:1 en presencia de una concentración creciente de CID. Los linfocitos T responden a células diana solo en presencia de CID. También se muestra la estimulación con PMA/Ionomicina. Se muestra también la respuesta a dianas de CD19+ de linfocitos T que expresan un CAR convencional de CD19 (MP15577) en diferentes relaciones de efector y diana.
Figura 5 - Ilustración de un sistema de CAR inducible con dos componentes receptores. (a) Dos componentes receptores se coexpresan junto con un solo componente de señalización. Los dos componentes receptores tienen cada uno una cadena única distinta que reconoce una diana diferente. Los componentes receptores tienen endodominios compuestos del fragmento FRB de mTOR. Un componente de señalización único comprende FKBP12 y una fusión de los endodominios de CD28, OX40 y CD3 Zeta. En (a), las secuencias de FRB son idénticas y este CAR señalizará igualmente en respuesta a cualquier diana. En (b), las secuencias de FRB difieren de modo que cada una tiene una afinidad diferente por el CID. Con esta implementación, el CAR señalizará con diferente fuerza en respuesta a cada antígeno afín en presencia de CID.
Figura 6 - Ilustración de un ejemplo de un componente receptor de dominio de receptor transmembrana múltiple para usar en un sistema de señalización de CAR inducible. El componente receptor es una quimera de un CAR de tipo I ligado a la proteína multicapa. Un scFv está conectado con un dominio espaciador Fc y un dominio TM. A su vez, esto está conectado con la molécula CD20 con extremos amino y carboxi truncados. Cada entrada intracelular está unida con un dominio de FRB. El componente de señalización comprende FKBP12 y una fusión de endodominios de CD28, OX40 y CD3 Zeta. La adición de CID permite la ligadura estocástica de múltiples dominios de señalización a múltiples endodominios que reconocen un componente receptor de antígenos único, dando como resultado una señalización amplificada en respuesta al antígeno.
Figura 7 - Ilustración de un sistema de CAR inducible con CAR inducible de componente de señalización múltiple. Este sistema CAR tiene un componente receptor único que comprende un scFv, un espaciador Fc, un dominio TM y un endodominio de FKBP12. Los tres dominios de señalización diferentes comprenden una fusión entre el fragmento FRB de mTOR y el endodominio de CD28, una fusión entre el fragmento FRB de mTOR y el endodominio de 41BB y una fusión entre el fragmento FRB de mTOR y el endodominio de CD3 Zeta. En (a), los dominios de FRB son idénticos para que cada componente de señalización se reclute por igual para el componente receptor y el CAR transmite una señal igual de CD28, 41BB y CD3 Zeta en presencia de CID y tras el reconocimiento del antígeno afín. En (b), los dominios de FRB son diferentes para que cada componente de señalización pueda reclutarse de forma diferente para el componente receptor, de modo que el CAR transmite más o menos de las señales de CD28, 41BB y CD3 Zeta dependiendo del óptimo necesario para la aplicación.
Figura 8 - Ilustración de un CAR inducible con componente de señalización que comprende dos dominios de unión al CID. En este ejemplo, hay un componente receptor que comprende un scFv y espaciador Fc, un dominio transmembrana y un endodominio FKBP12. El dominio de señalización comprende el dominio de FRB de mTOR, una fusión de endodominios de CD28, OX40 y Zeta y un dominio FKBP12. En presencia de CID, los componentes de señalización se multimerizan entre sí y con el componente receptor. Tras el reconocimiento del antígeno, se transmite una señal equivalente a la suma del multímero del componente de señalización.
Figura 9 - Estructura química de RSL1, la diacilhidrazina sintética (N-(2-etil-3-metoxibenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N-terc-butilhidrazina. RSL1 es una de una familia de compuestos que se ha encontrado que actúan como agonistas de ecdisona no esteroidea y pueden funcionar como inductores génicos.
Figura 10 - CAR inducible de RSL1 (a) un CAR inducible de RSL1 se construyó utilizando dominios de receptores de ácido retinoico y dominios de receptores de ecdisona para constituir los motivos de heterodimerización para el componente de reconocimiento de antígenos y el componente de señalización respectivamente. El componente de reconocimiento de antígenos reconoce CD19. (b) Los linfocitos T que expresan este CAR junto con linfocitos T no transducidos se tiñeron con anti-Fc que reconoce el espaciador de CAR. Los linfocitos T transducidos expresaron el CAR bien. (c) Los linfocitos T transducidos se desafiaron a continuación con concentración creciente de RSL1 y se desafiaron con células diana negativas para CD19 o positivas para CD19. Los linfocitos T desafiados con dianas positivas para CD19 solo señalizaron en presencia de RSL1.
Figura 11 - CAR inducible homodimerizador AP1903. (a) El CAR inducible homodimerizador AP1903 se construyó utilizando dominios FKBP12 modificados para constituir los motivos de heterodimerización para tanto el componente de reconocimiento de antígenos como el componente de señalización. El componente de reconocimiento de antígenos reconoce CD19. (b) Los linfocitos T que expresan este CAR junto con linfocitos T no transducidos se tiñeron con anti-Fc que reconoce el espaciador de CAR. Los linfocitos T transducidos expresaron el CAR bien. (c) Los linfocitos T transducidos se desafiaron a continuación con concentración creciente de dimerizador CID AP1903 y se desafiaron con células diana negativas para CD19 o positivas para CD19. Los linfocitos T desafiados con dianas positivas para CD19 señalizan solo en presencia de CID. En concentraciones altas de CID, la señalización se reduce probablemente a una saturación de los dominios de heterodimerización con un exceso de CID que reduce la formación de heterodímeros.
Sumario de aspectos de la invención
Los presentes inventores han encontrado que es posible separar los componentes de reconocimiento de antígenos y de señalización de un CAR para producir un sistema inducible, en donde la señalización solo tiene lugar en presencia de un agente tal como una molécula pequeña que puede inducir la dimerización (en adelante, denominada inductor químico de dimerización o CID).
El CID se une a dos dominios de proteína simultáneamente. Al incorporar un dominio de unión a CID a cada una de las dos mitades no funcionales de un CAR, la presencia de CID reunirá las mitades constituyendo un conjunto funcional.
La señalización funcional por el CAR depende por tanto de la presencia del CID. Esto proporciona un mecanismo para controlar el linfocito T CAR después de que se administre a un paciente: El linfocito T c A r puede activarse de forma remota administrando el CID al paciente y en caso de toxicidad desactivarlo al no administrar más CID. Si la actividad del CAR es proporcional a la concentración local del agente (por ejemplo, cuando la concentración de CID no está saturada), la actividad de los linfocitos T CAR puede "ajustarse" alterando la dosis de CID administrada al paciente. En el presente documento se describe un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende dos componentes proteicos separados:
(i) Un componente receptor transmembrana que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión al CID intracelular (en adelante, referido como CBD1); y
(ii) Un componente de señalización intracelular que comprende como mínimo un dominio de señalización y un segundo dominio de unión al CID (en adelante, denominada CBD2);
en donde CBD1 y CBD2 son capaces de unirse simultánea y específicamente al CID.
El alcance de la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;
(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión al inductor químico de dimerización (CID) intracelular (CBD1); y
(ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio unión al CID (CBD2);
en donde el ácido nucleico codifica tanto el componente receptor como el componente de señalización del sistema de señalización del CAR;
en donde CBD1 y CBD2 son capaces de unirse simultáneamente a un CID; y en donde, en ausencia de CID, la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado la señalización a través del dominio de señalización; si bien, en presencia de
CID, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado la señalización a través del dominio de señalización.
CBD1 y CBD2 del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden comprender diferentes dominios de unión al CID y el CID puede comprender dos fracciones de unión diferentes.
CDB1 puede comprender el dominio de unión a rapamicina de la proteína de unión a FK 12 (FKBP12), CDB2 puede comprender el dominio de unión a FKBP12-rapamicina (FRB) de mTOR o viceversa. En este caso, el CID puede comprender rapamicina o un derivado de la misma que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
CBD1 puede comprender el dominio de unión a FK506 (Tacrolimus) de la proteína de unión a FK 12 (FKBP12), CBD2 puede comprender el dominio de unión a ciclosporina de la ciclosporina A (o viceversa). En este caso, el CID puede comprender una FK506/proteína de fusión de ciclosporina o un derivado de las misma que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
CBD1 puede comprender un dominio de unión a estrógenos (EBD), CBD2 puede comprender un dominio de unión a estreptavidina o viceversa. En este caso, el CID puede comprender una estrona/proteína de fusión de biotina o un derivado de la misma que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
CBD1 puede comprender un dominio de unión a glucocorticoides (GBD), CBD2 puede comprender un dominio de unión a dihidrofolato reductasa (DHFR) o viceversa. En este caso, el CID puede comprender una dexametasona/molécula de fusión de metotrexato o un derivado de la misma que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
CBD1 puede comprender un dominio de unión a O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (AGT), CBD2 puede comprender un dominio de unión a dihidrofolato reductasa (DHFR) o viceversa. En este caso, el CID puede comprender un derivado de O6-bencilguanina/molécula de fusión de metotrexato o un derivado del mismo que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen. CBD1 puede comprender un dominio de receptor de ácido retinoico, CBD2 puede comprender un dominio de unión a ecdisona o viceversa. En este caso, el CID puede comprender RSL1 o un derivado de la misma que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
CBD1 y CBD2 del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden comprender el mismo dominio de unión al CID y el CID puede comprender dos fracciones de unión idénticas.
CBD1 y CBD2 del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden comprender los dominios de unión a la proteína de unión a FK506 (FKBP12) que comprende una mutación F36V y el CID puede comprender AP1903 o un derivado del mismo que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen. El CAR puede comprender un componente receptor que cruza la membrana múltiples veces con cada porción intracelular que constituye un CBD1. Por tanto, un componente receptor único puede reclutar múltiples componentes de señalización amplificando así la señal.
El CAR puede también comprender un conjunto de componentes receptores separados cada uno con un CBD1 intracelular, de modo que en presencia de CID, los componentes de señalización conectan con cada componente de la proteína receptora, para que el CAR pueda señalizar en respuesta a múltiples antígenos afines.
Los dominios de unión al CID pueden alterarse, de modo que la afinidad al CID difiere. Por ejemplo, la alteración de aminoácidos en las posiciones 2095, 2098 y 2101 de la FRB puede alterar la unión a rapamicina: KTW tiene alta, KHF intermedia y PLW es baja (Bayle et al., Chemistry and Biology 13, 99-107, enero de 2006).
El CAR puede comprender múltiples componentes receptores, de modo que cada uno tiene un dominio de CBD1 de afinidad diferente hacia el CID. De esta manera, en presencia de CID, los componentes de las proteínas de señalización conectan con cada componente de la proteína receptora diferencialmente y así la señal del CAR se fortalece diferencialmente en respuesta a cada antígeno afín.
El dominio de señalización del componente de la proteína de señalización puede comprender un endodominio único seleccionado de la activación o coestimulación del receptor de señalización de linfocitos T, tal como CD3 zeta, CD28, 41BB u OX40.
El dominio de señalización del componente de la proteína de señalización puede comprender múltiples endodominios seleccionados de la activación y coestimulación del receptor de señalización de linfocitos T, tal como CD3 zeta, CD28, 41BB y OX40.
Si se desea un CAR inhibidor, el dominio de señalización de la proteína de señalización puede comprender el endodominio de un receptor de señalización de linfocitos T inhibidores o una fosfatasa.
El componente de señalización puede comprender una pluralidad de componentes de señalización, cada uno comprendiendo un dominio de señalización diferente y un CBD2 similar, en donde cada uno de los dominios de unión al agente CID puede reconocer el mismo CID, pero los dominios de señalización comprenden diferentes endodominios. De esta manera, el CAR puede transmitir múltiples señales, pero los componentes de señalización que están en trans en vez de cis están estéricamente libres de las otras moléculas de transmisión de señalización, a diferencia de un componente de señalización único que contiene múltiples endodominios.
El CBD2 de los dominios de señalización múltiples en el aspecto descrito anteriormente puede unirse a la molécula CID con diferentes afinidades de modo que puede ajustarse la contribución relativa de cada componente de señalización. Por tanto, el CAR puede transmitir una señal más compleja, en vez de la estequiometría fija de un componente de señalización único que contiene múltiples endodominios.
Los sistemas CAR descritos anteriormente pueden comprender dominios de señalización que contienen un CBD1, endodominios simples o múltiples, así como CBD2. Por tanto, en presencia de CID, concatenación de múltiples dominios de señalización juntos para amplificar señales.
También se describe un componente receptor adecuado para usar en el sistema de señalización CAR descrito anteriormente que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de unión a CID.
En el presente documento se describe un componente de señalización adecuado para usar en el sistema de señalización CAR descrito anteriormente que comprende un dominio de señalización y un dominio de unión a CID. La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el componente receptor descrito en el presente documento.
La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el componente de señalización descrito en el presente documento.
La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica el componente receptor descrito en el presente documento y el componente de señalización descrito en el presente documento, en donde la molécula expresada es un péptido autoescindible que se escinde entre el componente receptor y el componente de señalización. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector retrovírico o un vector lentivírico o un transposón que comprende un vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
En el presente documento se describe un linfocito T o un linfocito NK que expresa un componente receptor descrito anteriormente y al menos un componente de señalización descrito anteriormente.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un linfocito T o un linfocito NK que comprende el ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención o el vector de acuerdo con los aspectos segundo o tercero de la invención.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de linfocitos T o linfocitos NK de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la invención para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la invención a un sujeto.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con el sexto aspecto de la invención puede comprender las siguientes etapas:
(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T o NK de un sujeto;
(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o NK con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto o un vector de acuerdo con los aspectos segundo o tercero; y
(iii) administrar las células de (ii) al sujeto.
La composición farmacéutica para usar de acuerdo con el sexto aspecto de la invención puede también comprender la etapa de administrar un CID adecuado para usar en el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
La presente divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad en un sujeto, el cual comprende linfocitos T de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, cuyo método comprende la etapa de administrar al sujeto un CIFD adecuado para usar en el sistema de señalización de CAR descrito anteriormente. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con el sexto aspecto de la invención puede implicar controlar la progresión de la enfermedad y/o controlar la actividad tóxica en el sujeto y ajustar la dosis del CID para proporcionar niveles aceptables de progresión de la enfermedad y/o actividad tóxica.
La enfermedad a prevenir y/o tratar de acuerdo con el sexto aspecto de la invención puede ser cáncer.
La presente divulgación proporciona el uso de una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La presente divulgación proporciona un kit que comprende un ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención o un vector de acuerdo con los aspectos segundo o tercero de la invención.
El kit puede comprender también un CID adecuado para usar en el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
La presente divulgación proporciona un kit que comprende un linfocito T o un linfocito NK de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención y un CID adecuado para usar en el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para fabricar un linfocito T o linfocito NK de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir: una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención o un vector de acuerdo con los aspectos segundo o tercero de la invención, en un linfocito T o NK.
El linfocito T o NK puede ser de una muestra aislada de un sujeto.
La presente divulgación proporciona un método para activar el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en un sujeto, el cual comprende un linfocito T de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, el cual comprende la etapa de administrar el CID al sujeto.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la actividad del sistema de señalización de CAR en un sujeto que comprende un linfocito T o linfocito Nk de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, cuyo método comprende reducir o detener la administración del CID al sujeto.
La presente divulgación proporciona un método para activar la señalización en el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en un linfocito T o linfocito NK de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención en cultivo, el cual comprende la etapa de introducir el agente CID en el cultivo de linfocitos T o NK.
La presente divulgación proporciona un método para reducir o detener la señalización a través del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en un linfocito T o NK de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención en cultivo, el cual comprende la etapa de eliminar el CID del cultivo de linfocitos T o NK.
En el presente documento se describe un método para inducir dimerización in vivo entre el componente receptor descrito en el presente documento y un componente de señalización descrito en el presente documento, que comprende la etapa de administrar un inductor químico de dimerización (CID) a un sujeto que comprende una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
También se describe un medio para ajustar la actividad de CAR a la presencia de un agente, tal como una molécula pequeña. Esto permite que la potencia de las células CAR se controle farmacológicamente y se ajusten a un equilibrio aceptable mientras se consigue el efecto terapéutico deseado, al tiempo que se evitan las toxicidades asociadas con CAR.
Descripción detallada
RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS (CAR)
Los CAR clásicos, que se muestran esquemáticamente en la Figura 1, son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (ligante) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El ligante es típicamente un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo. Puede ser necesario un dominio espaciador para aislar el ligante de la membrana y permitir una orientación adecuada. Un dominio espaciador común utilizado es el Fc de IgG1. Los espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el pedúnculo de CD8a e incluso solo la bisagra de IgG1 en solitario, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio.
Los primeros diseños de CAR tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FceRI o CD3Z. Por consiguiente, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, el cual fue suficiente para desencadenar la destrucción de linfocitos T de las células diana relacionadas, pero no pudo activar completamente al linfocito T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de linfocitos T con la de CD3Z da como resultado, receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento de antígeno. El dominio coestimulador más utilizado es el de CD28. Este suministra la señal coestimuladora más potente, es decir, la señal inmunológica 2 concretamente, que desencadena la proliferación de linfocitos T. También se han descrito algunos receptores que incluyen los endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como los OX40 y 41BB estrechamente relacionados que transmiten señales de supervivencia. Incluso se han descrito ahora CAR más potentes de tercera generación que tienen endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.
Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos de antígeno para transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa. Por tanto, el CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad del linfocito T hacia las células que expresan el antígeno diana.
La presente divulgación se refiere a un sistema de señalización de CAR en el que el dominio de unión al reconocedor de antígeno/de unión a antígeno y el dominio transmembrana se proporcionan en una primera molécula (denominada en el presente documento "componente receptor'), que se localiza en la membrana celular. El dominio de señalización intracelular se proporciona en una segunda molécula intracelular (denominada en el presente documento "componente de señalización"). Se han descrito ciertas moléculas pequeñas que se unen simultáneamente a dos dominios de proteína. Tales moléculas pequeñas pueden actuar por tanto para dimerizar proteínas (denominadas en el presente documento "inductor químico de dimerización" o "CID"). Tanto el componente receptor como los componentes de señalización comprenden un dominio de unión al CID (denominado en el presente documento "dominio de unión al CID 1" o "CBD1" y "dominio de unión al CID 2" o "CBD2" respectivamente) que permite a cada componente receptor y componente de señalización unirse simultáneamente a la misma molécula de CID (Figura 3).
Cuando el antígeno se une al dominio de unión a antígeno del componente receptor en ausencia del CID, no hay señalización a través del componente de señalización. Cuando el CID está presente, la unión del receptor de antígeno al dominio de unión a antígeno del componente receptor da como resultado la señalización a través del componente de señalización.
Específicamente, en ausencia de CID, el componente receptor y el componente de señalización se localizan de una forma dispersa estocásticamente y la unión del antígeno por el dominio de unión a antígeno del componente receptor no da como resultado la señalización a través de componente de señalización. En presencia del CID, tanto el componente receptor como el de señalización del CAR se unen al CID a través de sus dominios de unión al CID, dando como resultado la colocalización del componente receptor y los componentes de señalización (heterodimerización). Esta colocalización permite la señalización a través del dominio de señalización del componente de señalización cuando el antígeno se une mediante el dominio de unión a antígeno del componente receptor.
En el presente documento la "colocalización" o "heterodimerización" de los componentes receptor y de señalización es análoga a la ligadura/reclutamiento del componente de señalización para el componente receptor a través del agente CID.
La unión del antígeno por el componente receptor en ausencia del CID puede denominarse como resultado de la señalización "no productiva" a través del componente de señalización. Tal señalización no da como resultado la activación celular, por ejemplo, la activación de linfocitos T. La unión del antígeno por el componente receptor en presencia de CID puede denominarse como resultado de la señalización "productiva" a través del componente de señalización. Esta señalización da como resultado la activación de linfocitos T, desencadenando, por ejemplo, la destrucción de células diana y la activación de linfocitos T.
La unión del antígeno por el componente receptor en presencia de CID puede dar como resultado una señalización a través del componente de señalización, que es 2, 5, 10, 50, 100, 1.000 o 10.000 veces mayor que la señalización que ocurre cuando el antígeno se une por el dominio receptor en ausencia de CID.
La señalización a través del componente de señalización puede determinarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen ensayar la transducción de señales, por ejemplo, ensayar niveles de proteínas tirosina quinasas (PTK) específicas, degradación de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), activación de proteína quinasa C (PKC) y elevación de la concentración intracelular del ion calcio. Las lecturas funcionales, tales como la expansión clonal de linfocitos T, regulación positiva de marcadores de activación en la superficie celular, diferenciación en células efectoras e inducción de citotoxicidad o secreción de citocinas, también pueden utilizarse. Como ilustración, en los presentes ejemplos los inventores determinaron niveles de interleucina-2 (IL-2) producida por linfocitos T que expresan un componente receptor y un componente de señalización del sistema de señalización de CAR de acuerdo con la presente divulgación tras la unión de antígeno al componente receptor en presencia de diversas concentraciones de CID.
INDUCTOR QUÍMICO DE DIMERIZACIÓN Y DOMINIOS DE UNIÓN
El CID y los dominios de unión al CID del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden ser cualquier combinación de moléculas/péptidos/dominios que permita la colocalización selectiva y dimerización del componente receptor y el componente de señalización en presencia del CID.
Como tal, el agente CID es una molécula que es capaz de unirse simultáneamente al componente receptor y al componente de señalización. El agente CID por tanto, comprende al menos dos fracciones de unión.
El CID puede ser cualquier molécula farmacéuticamente aceptable que pueda unirse simultáneamente por al menos dos dominios de unión.
El CID es capaz de poderse suministrar en el citoplasma de una célula diana y de estar disponible para la unión intracelular.
Los sistemas de dimerización de moléculas pequeñas para facilitar la colocalización de péptidos son conocidos en la técnica (Corson et al.; 2008; ACS Chemical Biology; 3(11); 667).
Las fracciones de unión del CID pueden interaccionar con dominios de unión idénticos presentes en el componente receptor y el componente de señalización. Es decir, el CID puede comprender dos fracciones de unión idénticas, de modo que pueden interaccionar simultáneamente con un dominio de unión en el componente receptor y un dominio de unión idéntico en el componente de señalización.
El CID y los dominios de unión al CID pueden ser el sistema de dimerización del ligando de proteína de unión a FK506 (FKBP) descrito por Clackson et al. (PNAS; 1998; 95; 10437-10442). Este sistema de dimerización comprende dos dominios de unión de tipo FKBP con una mutación F36V en el dominio de unión a FKBP y un agente de dimerización (AP1903) con sustituciones de aminoácidos complementarios. La exposición de células modificadas por ingeniería genética para expresar proteínas de fusión de dominios de unión de tipo FKBP a AP103 da como resultado la dimerización de las proteínas que comprenden los dominios de unión de tipo FKBP pero no interacciones que implican FKBP endógenas.
El sistema de dimerización descrito por Farrar et al., que utiliza dominios de unión a ADN girasa B (GyrB) bacteriana y el antibiótico coumermicina como CID, puede utilizarse también en el sistema de señalización descrito en el presente documento (Methods Enzymol; 2000; 327; 421-419 y Nature; 1996; 383; 178-181).
Las fracciones de unión del CID pueden interaccionar con dominios de unión diferentes en el componente receptor y el componente de señalización. Es decir, el CID puede comprender dos fracciones de unión diferentes que pueden interaccionar simultáneamente con un dominio de unión en el componente receptor y un dominio de unión diferente en el componente de señalización.
El CID y los dominios de unión al CID pueden comprender el sistema de dimerización descrito por Belshaw et al. (Nature; 1996; 93; 4604-4607), que utiliza una FK506 (Tacrolimus)/molécula de fusión de ciclosporina como el agente CID con la proteína de unión a FK 12 (FKBP12) y cilcofilina A como los dominios de unión.
El CID/dominio de unión al CID puede ser también la rapamicina y FKBP12/dominio de unión a FKBP12-rapamicina (FRB) del sistema mTOR descrito por Rivera et al. (Nature Med; 1996; 2; 1028-1032) o los análogos de rapamicina no inmunosupresores (rapálogos) y FKBP12/sistema FRB descrito por Bayle et al. (Chem Bio; 2006; 13; 99-107). Por ejemplo, el CID puede ser C-20-metalilrapamicina (MaRap) o C16(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BS-Rap), como se describe por Bayle et al. e ilustra en la Figura 2 junto con los correspondientes dominios de unión. El CID puede ser C16-(S)-3-metilindolerapamicina (C16-iRap) o C16-(S)-7-metilindolerapamicina (AP21976/C16-AiRap) como se describe por Bayle et al., junto con los dominios de unión complementarios respectivos para cada uno.
Otros sistemas de dimerización adecuados para usar en el sistema de señalización descrito en el presente documento incluyen un CID de estrona/biotina junto con un dominio de unión a estrógenos (EBD) y un dominio de unión a estreptavidina (Muddana y Peterson; Org. Lett; 2004; 6; 1409-1412; Hussey et al.; J. Am. Chem. Soc.; 125; 3692­ 3693); un CID de dexametasona/metotrexato junto con un dominio de unión a glucocorticoides (GBD) y un dominio de unión a dihidrofolato reductasa (DHFR) (Lin et al.; J. Am. Chem. Soc.; 2000; 122; 4247-4248); un sistema similar en el que la porción de metotrexato del CID se reemplaza con el inhibidor de DHFR específico bacteriano (Gallagher et al.; Anal. Biochem.; 2007; 363; 160-162) y un CID de derivado de O6-bencilguanina/metotrexato junto con un dominio de unión a O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (AGT) y un dominio de unión a DHFR (Gendreizig et al.; J. Am. Chem. Soc.; 125; 14970-14971).
RSL1 es un análogo no esteroideo sintético de 20-hidroxiecdisona (véase la Figura 9). Es un miembro de una clase de insecticidas conocida como diacilhidrazinas y puede funcionar para actuar como un agonista de ecdisona no esteroideo. Estas moléculas inducen la muda prematura y la muerte de larvas, pero se toleran bien en vertebrados. RSL1 se ha utilizado en cambios transcripcionales artificiales en los que se utiliza un cambio transcripcional de dos proteínas, que consiste en una fusión entre el receptor de ecdisona (EcR) y GAL4 y el receptor de retinoide X (RXR) y VP16. En tales sistemas, EcR se modifica para interaccionar específicamente con RSL13 y RXR es quimérico que comprende las hélices 1-8 reemplazadas con las hélices 1-8 de PXPp humano y las hélices 9-12 de RXR de Locusta migratoria. El sistema de señalización descrito en el presente documento puede utilizar dominios de EcR y RXR para la heterodimerización en presencia de RSL1 un derivado del mismo.
Por ejemplo, los dominios de unión a CID pueden ser o comprender las secuencias mostradas como la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 25 o 26.
SEQ ID NO: 1 - Dominio de FKBP12 MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQE VIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTiSPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQ ID NO: 2 - Segmento FRB de tipo silvestre de mTOR MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKLES
SEQ ID NO: 3 - FRB con sustitución de T a L en 2098 que permite la unión a AP21967 MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLES
SEQ ID NO: 4 - segmento de FRB de mTOR con sustitución de T a H en 2098 y a W en F en el resto 2101 del mTOR completo que une a rapamicina con afinidad reducida al tipo silvestre MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLHQAFDLYYHVFRRISKLES
SEQ ID NO: 5 - segmento de FRB de mTOR con sustitución de K a P en el resto 2095 del mTOR completo que une a rapamicina con afinidad reducida MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFN QAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVPDLTQAWDLYYHVFRRISKLES
SEQ ID NO: 25-EcR MPVDRILEAELAVEQKSDQGVEGPGGTGGSGSSPNDPVTNICQAADKQLFTLVEW AKRIPHFSSLPLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIDVRDGILLATGLHVHRNSAHSAG VGAIFDRVLTELVSKMRDMRMDKTELGCLRAIILFNPEVRGLKSAQEVELLREKVYAA LEEYTRTTHPDEPGRFAKLLLRLPSLRSIGLKCLEHLFFFRLIGDVPIDTFLMEMLESP SDS
SEQ ID NO: 26-RXR
RPECVVPETQCAMKRKEKKAQKEKDKLPVSTTTVDDHMPPIMQCEPPPPEAARIHE
VVPRFLSDKLLETNRQKNIPQLTANQQFLIARLIWYQDGYEQPSDEDLKRITQTWQQ
ADDENEESDTPFRQITEMTILTVQLIVEFAKGLPGFAKISQPDQITLLKACSSEVMMLR
VARRYDAASDSILFANNQAYTRDNYRKAGMAEVIEDLLHFCRCMYSMALDNIHYALL
TAVVIFSDRPGLEQPQLVEEIQRYYLNTLRIYILNQLSGSARSSVIYGKILSILSELRTLG
MQNSNMCISLKLKNRKLPPFLEEIWDVADMSHTQPPPILESPTNL
Las secuencias variantes pueden tener al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 a 5, 25 o 26, dado que las secuencias proporcionan un sistema de dimerización eficaz. Es decir, dado que las secuencias facilitan suficiente colocalización de los componentes de unión a antígeno y de señalización intracelular, en presencia del CID, para que se produzca una señalización satisfactoria tras la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno.
El sistema de señalización descrito en el presente documento no está limitado por la disposición de un sistema de dimerización específico. El componente receptor puede comprender el dominio de unión de un sistema de dimerización dado siempre que el componente de señalización comprenda el dominio de unión complementario correspondiente que permite al componente receptor y componente de señalización colocalizar en presencia del CID.
La presente divulgación se refiere también a un método para activar el sistema de señalización de CAR del primer aspecto que comprende la etapa de administrar el CID. Como se ha descrito anteriormente, la administración del CID da como resultado la colocalización del componente receptor y el componente de señalización, de modo que la señalización a través del dominio de señalización ocurre tras la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno. El CID y los dominios de unión al CID pueden facilitar la señalización a través del sistema de señalización de CAR que es proporcional a la concentración de CID presente.
La presente divulgación proporciona adicionalmente un método para reducir la actividad del sistema de CAR descrito en el presente documento que comprende reducir o detener la administración del CID. La reducción del nivel del CID da como resultado menos receptores: el componente de señalización se dimeriza y por tanto, el nivel total de señalización a través del sistema de señalización de CAR disminuye en presencia del antígeno. La detención de la administración del CID da como resultado en ausencia del receptor: el componente de señalización se dimeriza y terminación de señalización a pesar de la presencia de unión de antígeno al dominio de unión a antígeno.
Otra posibilidad de este sistema es "ajustar" la fuerza de señal que el receptor transmite. Si la afinidad entre uno o ambos de los dominios de unión al CID disminuye, estarán activos menos sistemas de CAR y por tanto, la propagación de señal tras la unión a antígeno disminuye. Esto puede evitar la toxicidad.
COMPONENTE RECEPTOR
La presente divulgación proporciona un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio espaciador opcional, un dominio transmembrana y un dominio de unión al CID (CBD1). Cuando se expresa en una célula, el componente receptor se localiza en la membrana celular. En este caso, el dominio de unión a antígeno de la molécula se orienta sobre la cara extracelular de la membrana y el CBD se localiza en la cara intracelular de la membrana.
El componente receptor por tanto proporciona la función de unión a antígeno del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO
El dominio de unión a antígeno es la porción de un CAR clásico que reconoce el antígeno. En el sistema de señalización descrito en el presente documento la unión al antígeno se localiza dentro del componente receptor. Se conocen numerosos dominios de unión a antígeno en la técnica, incluidos los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpos y receptores de linfocitos T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal; un ligando natural del antígeno diana; un péptido con suficiente afinidad por la diana; un ligante de dominio único tal como uno de camélido; un ligante artificial solo, como un Darpin; o una cadena sencilla derivada de un receptor de linfocitos T.
Se conocen diversos antígenos asociados a tumor (AAT; en inglés, TAA), como se muestra a continuación en la Tabla 1. El dominio de unión a antígeno utilizado en la presente invención puede ser un dominio que sea capaz de unirse a un AAT como se indica en la misma.
Tabla 1
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DOMINIO TRANSMEMBRANA
El dominio transmembrana es la secuencia de un CAR clásico que se extiende por la membrana. En el sistema de señalización de la presente divulgación el dominio transmembrana se localiza en el componente receptor. Puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembrana puede obtenerse de CD28, que da una buena estabilidad de receptor. El dominio transmembrana puede ser de CD148, como se muestra en la SEQ ID NO: 23. PÉPTIDO SEÑAL
El componente receptor del sistema de señalización de CAR de la presente invención puede comprender un péptido señal, para que cuando el componente receptor se expresa en una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirige al retículo endoplasmático y posteriormente a la superficie celular, donde se muestra.
El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, que ayuda a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido de señal normalmente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la translocación, para generar un péptido de señal libre y una proteína madura. Después, los péptidos de señal libres se digieren por proteasas específicas.
El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.
El péptido señal puede comprender la SEQ ID NO: 6, 7 u 8 o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutación(ones) de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) con la condición de que el péptido señal aún funcione para causar la expresión del CAR en la superficie celular.
SEQ ID NO: 6: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
El péptido señal de la SEQ ID NO: 6 es compacto y altamente eficaz. Se predice que proporcione aproximadamente un 95 % de escisión después de la glicina terminal, dando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.
SEQ ID NO: 7: MSLPVTALLLPLALLLHAARP
El péptido señal de la SEQ ID NO: 7 se deriva de la IgG1.
SEQ ID NO: 8: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
El péptido señal de la SEQ ID NO: 8 se deriva de la CD8.
DOMINIO ESPACIADOR
El sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento puede comprender una secuencia espadadora para conectar el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembrana en el componente receptor. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión.
La secuencia espaciadora puede, por ejemplo, comprender una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8 humana o el pedúnculo de CD8 de ratón. El espaciador puede comprender, como alternativa, una secuencia enlazadora alternativa que tiene una longitud y/o propiedades espaciadoras de dominio similares como una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:
SEQ ID NO: 9 (bisagra-CH2CH3 de lgG1 humana)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKKD
SEQ ID NO: 10 (pedúnculo de CD8 humana):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID NO: 11 (bisagra de lgG1 humana):
SEQ ID NO: 12 (ectodominio de CD2) KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKD TYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINT TLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSV EPVSCPEKGLD
SEQ ID NO: 13 (ectodominio de CD34) SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITE TTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDL STTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQN KTSSCAEFKKD RGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMK KHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
COMPONENTE RECEPTOR QUE COMPRENDE MÚLTIPLES DOMINIOS TRANSMEMBRANA
El componente receptor puede comprender un número adecuado de dominios transmembrana, de modo que cada dominio de unión al CID se orienta sobre la cara intracelular de la membrana celular (Figura 6). Por ejemplo, el componente receptor puede comprender 3, 5, 7, 9, 11 o más dominios transmembrana. De esta manera, un componente receptor único puede reclutar múltiples componentes de señalización que amplifican la señalización en respuesta al antígeno. El sistema de señalización codificado por la SEQ ID NO: 22 es un receptor multicapa con 3 dominios de FRB.
COMPONENTES RECEPTORES MÚLTIPLES
En otra realización de la divulgación, el sistema de señalización de CAR puede comprender dos o más componentes receptores, cada uno reconociendo diferentes antígenos, pero formando parte del mismo dominio de unión al CID intracelular. Tal sistema de CAR sería capaz de reconocer múltiples antígenos (Figura 5a). Esto podría ser útil, por ejemplo, para evitar un escape tumoral. En un aspecto relacionado adicional de la divulgación, el CBD1 de los componentes receptores difiere en restos que dictan su afinidad hacia el CID. De esta manera, un sistema de CAR puede ajustarse de modo que la señalización en respuesta a un antígeno es mayor o menor que la respuesta a otro (Figura 5b). Esto podría ser útil, por ejemplo, cuando se actúa sobre dos antígenos tumorales simultáneamente pero uno se expresa en una densidad mayor que el otro. La respuesta a este antígeno podría ajustarse a la baja para evitar la toxicidad causada por sobreestimulación.
Los métodos adecuados para alterar los restos de aminoácidos del dominio de unión al CID de modo que se altere su afinidad de unión por el CID, son conocidos en la técnica e incluyen sustitución, adición y eliminación de aminoácidos utilizando mutagénesis tanto dirigida como aleatoria. Por ejemplo, en el caso del CID que se une a FRB, se ha publicado un conjunto de mutaciones con una gama de afinidad (Bayle et al., Chemistry & Biology 13, 99-107, enero de 2006). Los métodos para determinar la afinidad de un CID por el dominio de unión al CID son también bien conocidos en la técnica e incluyen la predicción bioinformática de las interacciones proteína-proteína, electroforesis de afinidad, resonancia del plasmón superficial, interferometría de biocapa, interferometría de polarización dual, dispersión de luz estática y dispersión de luz dinámica.
El sistema de señalización codificado por la SEQ ID NO: 20 comprende dos componentes receptores y un componente de señalización.
COMPONENTE DE SEÑALIZACIÓN
La presente descripción también proporciona un componente de señalización que comprende un dominio de señalización y un dominio de unión al CID (CBD2). El componente de señalización es una molécula soluble y por tanto, se localiza en el citoplasma cuando se expresa en una célula, por ejemplo, un linfocito T.
No se produce señalización a través del dominio de señalización del componente de señalización a menos que esté colocalizado con el componente receptor proporcionado por la presente divulgación. Tal colocalización ocurre solo en presencia del CID, como se ha descrito anteriormente.
DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR
El dominio de señalización intracelular es la porción de transmisión de señales de un CAR clásico. En el sistema de señalización descrito en el presente documento el dominio de señalización intracelular (dominio de señalización) se localiza en el componente de señalización. En presencia del CID, el componente receptor unido a la membrana y el componente de señalización intracelular se acercan. Después del reconocimiento del antígeno, el grupo de receptores, CD45 y CD148 nativos se excluyen de la sinapsis y se transmite una señal a la célula.
Como tal, el dominio de señalización del componente de señalización es análogo al endodominio de una molécula de CAR clásica.
El componente del dominio de señalización utilizado de forma más habitual es el del endodominio de CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y podría ser necesaria una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden utilizarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia o pueden utilizarse los tres juntos (ilustrado en la Figura 1b).
El componente de señalización descrito en el presente documento comprende un dominio de señalización, puede comprender el endodominio de CD3-Zeta en solitario, el endodominio de CD3-Zeta con el de CD28 u OX40 o el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y de CD3-Zeta (Figura 3a).
El componente de señalización de un sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 14, 15 o 16 o una variante de las mismas.
SEQ ID NO: 14 - Endodominio de CD3 Z
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL
SEQ ID NO: 15 - Endodominios de CD28 y CD3 Zeta
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQ
GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 16 - Endodominios de CD28, 0X40 y CD3 Zeta.
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPG GGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG LYQG LST AT KDTYDA LH MQA LP PR
Una secuencia variante puede tener al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14, 15 o 16, siempre que la secuencia proporcione un dominio de señalización intracelular eficaz.
COMPONENTES DE SEÑALIZACIÓN MÚLTIPLES
El sistema de señalización descrito en el presente documento puede comprender una pluralidad de componentes de señalización, cada uno comprendiendo un dominio de señalización y un CIDB2, en donde cada dominio de señalización está unido por el mismo CID pero los dominios de señalización comprenden diferentes endodominios (Figura 7a). De esta manera, pueden activarse múltiples endodominios distintos de forma simultánea. Esto es ventajoso con respecto a un dominio de señalización compuesto, ya que cada dominio de señalización permanece sin que otros dominios de señalización lo estorben.
Si cada componente de señalización comprende unos dominios CBD2 que difieren en restos que alteran su afinidad hacia CID, el CID permite a los componentes de señalización que comprenden diferentes dominios de señalización ligarse al CID con diferentes cinéticas (Figura 7b). Esto permite un mayor control sobre la señalización en respuesta a la unión a antígeno por el componente receptor según se reclutan diferentes componentes de señalización para el componente receptor en diversas cinéticas/dinámicas. Esto es ventajoso dado que, en vez de una proporción igual fija de señal transmitida por un endodominio compuesto, una señal de activación de linfocitos T puede requerir diferentes proporciones de distintas señales inmunológicas.
El sistema de señalización codificado por la SEQ ID NO: 21 tiene un componente receptor y tres componentes de señalización.
COMPONENTES DE SEÑALIZACIÓN CON UN DOMINIO DE UNIÓN A CID ADICIONAL
En el caso de una densidad de expresión muy baja de antígeno diana, la fuerza de señalización tendría que amplificarse. Tomar, por ejemplo, el receptor de linfocitos T nativo que está asociado con múltiples ITAM que contienen componentes de CD3. En tales circunstancias, los componentes de señalización pueden modificarse para contener CBD2, un dominio de señalización y también un CBD1 (Figura 8). De esta manera, la adición de CID conduciría a la concatenación de múltiples componentes de señalización. El tamaño promedio de la concatenación podría ajustarse variando la cantidad de componentes de señalización que tienen un CBD2. En el caso de reconocimiento de antígenos y en presencia de CID, la señalización a través de la concatenación de múltiples componentes de señalización sería más potente que a través de componentes de señalización individuales.
ÁCIDO NUCLEICO
Este primer aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el componente receptor y un ácido nucleico que codifica un componente de señalización.
Las secuencias de ácido nucleico específicas que codifican cuatro CAR inducibles se proporcionan más adelante en la descripción, tras la sección de Ejemplos.
Como se utilizan en el presente documento, las expresiones "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimas entre sí.
Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos distintos pueden codificar el mismo polipéptido, como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que las personas expertas pueden, utilizando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos descritos en este caso, para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedador particular en el que se han de expresar los polipéptidos.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Además, pueden ser polinucleótidos que incluyan dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos distintos de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso como se describe en el presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar in vivo la actividad o vida útil de polinucleótidos de interés.
Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleótidos incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de un (o más) ácido nucleico de o en la secuencia.
El ácido nucleico descrito en el presente documento puede ser un ácido nucleico que codifique tanto el componente receptor como el componente de señalización.
El ácido nucleico puede producir un polipéptido que comprende el componente receptor y el componente de señalización unidos por un sitio de escisión. El sitio de escisión puede ser autoescindible, de modo que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el componente receptor y el componente de señalización sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.
Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluido el péptido de autoescisión del virus de la fiebre aftosa (FMDV) 2a, que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 18:
SEQ ID NO: 17
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP. o
SEQ ID NO: 18
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
Cuando el sistema de señalización comprende una pluralidad de componentes de señalización, cada uno comprendiendo un dominio de señalización y un CIDB2, el ácido nucleico puede tener la fórmula general:
RC-coexpr1-SC1-coexpr2-SC2
en donde:
RC es una secuencia de ácido nucleico que codifica el componente receptor;
Coexpr1 y coexpr2, que pueden ser iguales o diferentes, son secuencias de ácidos nucleicos que permiten la coexpresión de los dos polipéptidos flanqueantes (por ejemplo, una secuencia que codifica un sitio de escisión) SC1 y SC2 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican componentes de señalización.
Los componentes de señalización codificados por SC1 y SC2 pueden unirse al mismo CID, pero tienen diferentes endodominios. La construcción de ácido nucleico puede comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican más de dos componentes de señalización, por ejemplo, SC3, SC4... hasta SCx, cada uno separado por una secuencia de coexpresión, coexpr3, coexpr4... hasta coexprX.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cada componente pueden estar en cualquier orden, por ejemplo: RC-coexpr1-SC1-coexpr2-SC2; SC1-coexpr1-SC2-coexpr2-RC; o SC1-coexpr1-RC-coexpr2-SC2.
Cuando el sistema de señalización comprende una pluralidad de componentes receptores, el ácido nucleico puede tener la fórmula general:
RC1-coexpr1-RC2-coexpr2-SC
en donde:
RC1 y RC2 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican componentes receptores;
Coexpr1 y coexpr2, que pueden ser iguales o diferentes, son secuencias de ácidos nucleicos que permiten la coexpresión de los dos polipéptidos flanqueantes (por ejemplo, una secuencia que codifica un sitio de escisión) SC es una secuencia de ácido nucleico que codifica el componente de señalización.
Los componentes receptores pueden unirse a diferentes antígenos, pero al mismo CID. Pueden tener el mismo CIDB1. La construcción de ácido nucleico puede comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican más de dos componentes receptores, por ejemplo, RC3, RC4... hasta RCx, cada uno separado por una secuencia de coexpresión, coexpr3, coexpr4... hasta coexprX.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cada componente pueden estar en cualquier orden, por ejemplo: RC1-coexpr1-RC2-coexpr2-SC; RC1-coexpr1-SC-coexpr2-RC2; o SC-coexpr1-RC1-coexpr2-RC2.
La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia de entrada interna al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.
También se describe un kit que comprende un ácido nucleico que codifica el componente receptor del segundo aspecto y/o un ácido nucleico que codifica un componente de señalización del tercer aspecto. El kit puede comprender también un agente de heterodimerización que es adecuado para usar en el sistema de señalización del primer aspecto. VECTOR
La presente descripción también proporciona un vector o kit o vectores que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico que codifica(n) un componente receptor de los descritos en el presente documento y/o componente de señalización descritos en el presente documento. Tal vector puede utilizarse para introducir la(s) secuencia(s) de ácido nucleico en una célula hospedadora para que exprese el componente receptor y el componente de señalización del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento. El kit puede comprender también un CID que sea adecuado para usar en el sistema de señalización descrito en el presente documento.
El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retrovírico o un vector lentivírico o un vector basado en transposón o ARNm sintético.
El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir un linfocito T.
CÉLULA INMUNITARIA CITOLÍTICA
La presente divulgación también se refiere a una célula inmunitaria que comprende el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
Las células inmunitarias citolíticas pueden ser células T o linfocitos T que son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR; del inglés, T-cell receptor) en la superficie celular. Hay diversos tipos de linfocitos T, tal como se resume a continuación.
Los linfocitos T auxiliares (linfocitos TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Los linfocitos TH expresan CD4 en su superficie. Los linfocitos TH se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC; del inglés, antigen presenting cells). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.
Los linfocitos T citolíticos (linfocitos TC o CTL) destruyen las células infectadas por virus y células tumorales y también están implicados en el rechazo de trasplantes. Los CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.
Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno relacionado, proporcionando así al sistema inmune "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos T de memoria comprenden tres subtipos: linfocitos T de memoria central (linfocitos TCM) y dos tipos de linfocitos T efectores de memoria (linfocitos TEM y linfocitos TEMRA). Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.
Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocido como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo.
Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+: los linfocitos Treg naturales y los linfocitos Treg adaptativos.
Los linfocitos Treg de origen natural (también conocidos como linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre los linfocitos T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Los linfocitos Treg de origen natural se pueden distinguir de otros linfocitos T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de linfocitos T reguladores, causando la enfermedad autoinmunitaria letal IPEX.
Los linfocitos Treg adaptativos (también conocidos como linfocitos Tr1 o linfocitos Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.
Los linfocitos citolíticos naturales (o linfocitos NK) son un tipo linfocitos citolíticos que forman parte del sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del MHC.
Los linfocitos NK (que pertenecen al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T. Se sabe que los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglio linfático, bazo, amígdalas y timo, donde a continuación, entran en la circulación.
Las células CAR descritas en el presente documento pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente.
Los linfocitos T o NK que expresan las moléculas del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden crearse ex vivo de la propia sangre periférica del paciente (1a parte) o en el escenario de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte) o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte).
Como alternativa, Los linfocitos T o NK que expresan las moléculas del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a linfocitos T. Como alternativa, se puede usar una línea de linfocitos T inmortalizada que conserva su función lítica y pueda actuar como un agente terapéutico.
En todas estas realizaciones, las células CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica el componente receptor y el componente de señalización por uno de muchos medios, incluyendo la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN.
La célula CAR descrita en el presente documento puede ser un linfocito T o NK ex vivo de un sujeto. El linfocito T o NK puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Los linfocitos T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de su transducción con el ácido nucleico que codifica las moléculas que proporcionan el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.
El linfocito T o NK descrito en el presente documento puede fabricarse mediante:
(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T o NK procedente de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y
(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o NK con una o más secuencias de ácido nucleico que codifica(n) el componente receptor y/o componente de señalización del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento.
A continuación, los linfocitos T o NK pueden purificarse, por ejemplo, seleccionarse basándose en la expresión del dominio de unión a antígeno del polipéptido de unión a antígeno.
La presente divulgación también proporciona un kit que comprende un linfocito T o NK que comprende el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento y un agente de heterodimerización adecuado para usar en el sistema de señalización.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células inmunitarias citolíticas que expresan las moléculas del sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.
MÉTODOS
La presente divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad que comprende la etapa de administrar las células inmunitarias citolíticas descritas en el presente documento (por ejemplo, en una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente) y/o un CID adecuado para usar en un sistema de señalización descrito en el presente documento.
Un método para tratar una enfermedad se refiere al uso terapéutico de las células inmunitarias citolíticas descritas en el presente documento. En el presente documento, las células se pueden administrar a un sujeto que tenga una enfermedad o afección existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para frenar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.
El método para prevenir una enfermedad se refiere al uso profiláctico de las células inmunitarias citolíticas descritas en el presente documento. En el presente documento, tales células se pueden administrar a un sujeto que aún no ha contraído la enfermedad y/o que no muestra ningún síntoma de la enfermedad, para prevenir o afectar a la causa de la enfermedad o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un síntoma asociado con la enfermedad. El sujeto puede tener una predisposición o puede creerse que está en riesgo de desarrollar la enfermedad.
El método puede implicar las etapas de:
(i) aislar una muestra que contiene linfocitos T o NK de un sujeto;
(ii) transducir o transfectar tales células con una secuencia de ácidos nucleicos o vector proporcionados por la presente invención;
(iii) administrar las células de (ii) al sujeto.
Los métodos para tratar una enfermedad pueden comprender adicionalmente la etapa de administrar un CID adecuado para usar en el sistema de señalización descrito en el presente documento al sujeto.
La presente divulgación proporciona también un método para tratar y/o prevenir una enfermedad en un sujeto, el cual comprende células de la invención, cuyo método comprende la etapa de administrar un agente CID adecuado para usar en el sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento. Como tal, este método implica administrar un agente CID adecuado a un sujeto que ya comprende las células CAR descritas en el presente documento.
El CID puede administrarse en forma de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.
Los métodos para tratar una enfermedad proporcionados por la presente divulgación pueden implicar el control de la progresión de la enfermedad y controlar cualquier actividad tóxica y ajustar la dosis del CID administrado al sujeto para proporcionar niveles aceptables de la progresión de la enfermedad y actividad tóxica.
El control de la progresión de la enfermedad significa evaluar los síntomas asociados con la enfermedad a lo largo del tiempo para determinar si están reduciéndose/mejorando o aumentando/empeorando.
Las actividades tóxicas se relacionan con efectos adversos causados por las células CAR descritas en el presente documento tras su administración a un sujeto. Las actividades tóxicas pueden incluir, por ejemplo, toxicidad inmunológica, toxicidad biliar y síndrome de dificultad respiratoria.
El nivel de señalización a través del sistema de señalización descrito en el presente documento y por tanto, el nivel de células CAR de activación que expresan el sistema de señalización, puede ajustarse alterando la cantidad de CID presente. En el presente método el nivel de activación de células CAR puede incrementarse aumentando la dosis de CID administrada al sujeto. En cambio, el nivel de activación de células CAR puede reducirse disminuyendo la dosis de CID administrada al sujeto.
Los niveles elevados de activación de células CAR se asocian probablemente con una progresión de la enfermedad reducida pero actividades tóxicas aumentadas, si bien, los niveles más bajos de activación de células CAR se asocian probablemente con una progresión de la enfermedad aumentada pero actividades tóxicas reducidas.
Como tal, la dosis de CID administrada a un sujeto puede alterarse con el fin de proporcionar un nivel aceptable tanto de progresión de la enfermedad como de actividad tóxica. El nivel específico de progresión de la enfermedad y de actividades tóxicas determinado para ser "aceptable" variará de acuerdo con las circunstancias específicas y debe evaluarse sobre esa base. La presente divulgación proporciona un método para alterar el nivel de activación de las células CAR, con el fin de lograr este nivel adecuado.
La presente divulgación proporciona una célula CAR descrita en el presente documento para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La divulgación también se refiere al uso de una célula CAR descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La presente divulgación proporciona también un agente CID adecuado para activar un sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La presente divulgación proporciona también un agente CID para usar en la activación de un sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en una célula CAR.
La divulgación también se proporciona el uso de un CID adecuado para activar un sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
La divulgación también proporciona el uso de un CID en la fabricación de un medicamento para activar un sistema de señalización de CAR descrito en el presente documento en una célula CAR.
La enfermedad a tratar y/o prevenir mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser una infección, tal como una infección viral.
Los métodos descritos en el presente documento pueden ser también para el control de respuestas inmunitarias patológicas, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias, alergias y rechazo de injerto contra huésped.
Los métodos pueden ser para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.
Las células CAR de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas. La célula diana puede ser reconocible por la expresión de un AAT, por ejemplo, la expresión de un AAT proporcionado anteriormente en la Tabla 1.
Las células CAR y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden ser para utilizarse en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades descritas anteriormente.
Las células CAR y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden ser para utilizarse en cualquiera de los métodos descritos anteriormente.
La presente divulgación proporciona también un método de administración de una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención a un sujeto que necesita la misma.
La presente divulgación proporciona también un método para administrar un CID como se define en el presente documento a un sujeto, el cual comprende una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
La invención se describirá ahora con más detalle mediante Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a llevar a cabo la invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Un sistema de CAR inducible por rapamicina
Se transdujeron linfocitos T con un vector retrovírico que codifica un CAR inducible detallado en la Figura 3 y cuya secuencia se muestra como la SEQ ID NO: 19. Este CAR inducible tiene un componente receptor único y un componente de señalización único. El componente receptor comprende un scFv anti-CD19, un dominio espaciador derivado de IgG1 humana, un dominio transmembrana derivado de CD28 y FKBP12 como endodominio. El componente de señalización comprende el dominio de FRB de mTOR y un dominio de señalización derivado de endodominios de CD28, OX40 y CD3-Zeta. La expresión del CAR se determinó mediante la tinción de las células transducidas con un anticuerpo conjugado que reconoce el dominio espaciador y mediante análisis por citometría de flujo. Los linfocitos T se incubaron con células diana que expresan la diana afín CD19 en la proporción 2:1, 1:1 y 0:1 (diana:efector) en ausencia de rapamicina o en concentraciones crecientes. La señalización solo sucedió en presencia tanto del antígeno afín como de la rapamicina. Se observó una dosis de respuesta a la rapamicina y al antígeno diana.
Ejemplo 2 - Un sistema de CAR inducible por RSL1
RSL1 es un análogo no esteroideo sintético de 20-hidroxiecdisona (Figura 9). Es un miembro de una clase de insecticidas conocida como diacilhidrazinas y puede funcionar para actuar como un agonista de ecdisona no esteroideo. Estas moléculas inducen la muda prematura y la muerte de larvas, pero se toleran bien en vertebrados (Dhadialla et al. (1998) Annu. Rev. Entomol. 43, 545-569). RSL1 se ha utilizado en cambios transcripcionales artificiales (Lessard et al. (2007) The Prostate 67, 808-819) de modo que una transcripción de dos proteínas cambia, consistiendo en una fusión entre el receptor de ecdisona (EcR) y GAL4 y el receptor de retinoide X (RXR) y VP16. En tales sistemas, EcR se modifica para interaccionar específicamente con RSL1 (Kumar et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 27211-27218) y RXR es quimérico, comprendiendo las hélices 1-8 reemplazadas con las hélices 1-8 de PXPp humano y las hélices 9-12 de RXR de Locusta migratoria.
Los presentes inventores han construido un CAR de CD19 fraccionado basado en el sistema de CD19 descrito en el Ejemplo 1, con el motivo de heterodimerización sobre el componente de reconocimiento de antígenos y los componentes de señalización que son EcR y RXR respectivamente (Figura 10a y SEQ ID NO: 23). Este CAR se transdujo en linfocitos T y se encontró que se expresa bien (Figura 10b). Estos linfocitos T se desafiaron con dianas que fueron negativas para CD19 y positivas para CD19. Solo los linfocitos T CAR desafiados con dianas SupT1 en presencia de RSL1 liberaron IL-2 (Figura 10c).
Ejemplo 3 - Un sistema de CAR inducible por AP1903
AP1903 es un inductor químico de dimerización sintético que se une a dos dominios de FKB12 mutados (Clackson et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 95, 10437-10442). Se desarrolló un CAR inducible basado en este sistema, utilizando los dominios de FKBP12 modificados para constituir el dominio de heterodimerización tanto del componente de reconocimiento de antígeno como del componente de señalización en el marco como se describe en el Ejemplo 1 con el dominio de reconocimiento de antígeno y el dominio de señalización coexpresados con una secuencia del tipo de FMD-2A (Figura 11a y SEQ ID NO: 24). Los dominios de FKBP12 fueron oscilantes para los codones para prevenir la recombinación homóloga. Los linfocitos T se transdujeron con esta construcción y se desafiaron con células diana que fueron positivas o negativas para CD19.
Los linfocitos T reaccionaron solo a las dianas positivas para CD19 en presencia de AP1903 (Figura 11b). A una concentración muy alta de dimerizador, la señalización se inhibió probablemente debido a las condiciones de saturación en donde la estequiometría favorece un FKBP12 que se une a una molécula dimerizadora única en vez de una molécula dimerizadora que se une a dos dominios FKBP12 (Figura 11c).
SECUENCIAS QUE CODIFICAN CAR INDUCIBLES ESPECÍFICOS SEQ ID NO: 19. CAR inducible simple que comprende un componente receptor y un componente de señalización. El componente receptor comprende un péptido de señal, un scFv anti-CD19, un espaciador del dominio Fc de IgG1 humana, un dominio transmembrana de CD28 y FKB12 como endodominio. Un péptido FMD-2A separa este componente receptor del componente de señalización. El componente de señalización comprende FRB y un compuesto de endodominios de CD28, OX40 y CD3-Zeta.
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SEQ ID NO: 20. CAR inducible que comprende dos componentes receptores y un componente de señalización. El primer componente receptor comprende un péptido de señal, un scFv anti-CD19, un espaciador de la región del pedúnculo de CD8, un dominio transmembrana de CD28 y FKB12 como un endodominio. El segundo componente de señalización comprende un scFv anti-CD29, espaciador derivado del dominio Fc de IgG1 humana, un dominio transmembrana de CD28 y FKB12 como endodominio. El componente de señalización comprende FRB y un compuesto de endodominios de CD28, OX40 y CD3-Zeta. Un péptido 2A de la fiebre aftosa separa los componentes.
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801 cgtgagctca gatcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc >....>>
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881 tgcgcccaga ggcqtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatcttttgg
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1041 gcaggtggaa accatctccc caggagacgg gcgcaccttc cccaagcgcg gccagacctg cgtggtgcac tacaccggga
>.........................................FKBP12..........................................>
1121 tgcttgaaga tggaaagaaa ttcgattcct cccgggacag aaacaagccc tttaagttta tgctaggcaa gcaggaggtg
>.........................................FKBP12..........................................>
1201 atccgaggct gggaagaagg ggttgcccag atgagtgtgg gtcagagagc caaactgact atatctccag attatgccta
1281 tggtgccact gggcacccag gcatcatccc accacatgcc actctcgtct tcgatgtgga gcttctaaaa ctggaacgag
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1361 ccgagggcag gggaagtctt ctaacatgcg gggacgtgga ggaaaatccc gggcccatgg agaccgacac cctgctgctg >.............................2A............................. »
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Ib21 cgccagcgtg aagatgagct gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct acaacatgca ctcggtgaag cagacccccg >......... .............................aCD20 scFv........................................>
1601 gccggggcct. ggagt.ggatc ggogcoatct. accccggcaa oggogacace agctacaacc agaagttcaa gggcaaggoc >.......................................aCD20 scFv........................................>
1681 accctgaccg ccgacaagag cagcagcacc gcctacatgc agctgagcag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta >.......................................aCD20 scFv........................................>
1761 ctgcgcccgg agcacctact acggcggcga ctggtacttc aacgtgtggg gcgccggcac caccgtgacc gtgagcggag >.......................................aCD20 scFv........................................>
1841 gcggcggcag cggaggaggc: ggctctgggg gaggcggatc tcagatcgtg ctgagccaga gccccgccat cctgagcgcc >......... .............................aCD20 scFv........................................>
1921 agccccggcg agaaggtgac catgacctgc cgggccagca gcagcgtgag ctacatccac tggttccagc agaagcccgg >......... .............................aCD20 scFv........................................>
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2001 cagcagcccc aagccctgga tctacgccac cagcaacctg gccagcggcg tgcccgtgcg gttcagcggc agcggcagcg >.......................................aCD20 scFv........................................>
2081 gcaccagcta cagcctgacc atcagccggg tggaggccga ggacgccgcc acctactact gccagcagtg gaccagcaac >......... .............................aCD20 scFv.......................................>
BamHI
2161 ccacccacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagc ggtcggatcc cgccgagccc aaatctcctg acaaaactca » .....HCH2CE3pvaa'.......> Fsel
2241 cacflf.gr.cca ccgt.gcccag car.ctcccgt ggccggccog tr.agtcttcn tcttor.cccc aaaaccnaag gacaccctca s ,....HCH2CH3pvaa'......................................> 2321 tgatcgcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac .....HCM2CH3pvaa‘......................................> SacjII
24C1 gr.ggaoggcg t.ggaggt.gra t.aaterraag araaagrego gggaggagoa gr.acaar.agc acgtaoogtg tggt.oagcgt >................................ ,....HCE2CH3pvaa'......................................> 2481 cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca acgtctccaa caaagccctc ccagccccca >................................ ____HCE2CH3pvaa'......................................> 2561 Lecagaaaac caLcLccaaa gccaaagggc ayccccgaga accacaygLy LacacccLyc ccccaLcccg ggaLgagcLg >....................................HCH2CH3pvaa'......................................> 2641 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaacgct tctatcccag ccacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg >................................ ____IICI:2CIl3pvaa ..............................>
2721 goaaeoggag aacaactaca agaccac.gcc t.mr.gt.gct.g gactcc.gacg gct.cct1.ctt ccf.ct.acagc aagr.tr.accg ____HCH2CH3pvaa'......................................>
Ppul07
Nsil
BfrBl
28C1 tggacaagag caggtggcag caggcgaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggccc tgcacaatca ctatacccag >................................,....HCH2CE3pvaa’......................................> 2881 aaatctctga gtctgagccc aggcaagaag gaccccaagt tctgggtcct ggtggtggtg ggaggcgtgc tggcctgtta >......HCE2CH3pvaa'.......»
» ..................CD28tm..................> 2961 ctctctcctg gtgaccgtgg ccttcatcat cttctgggtg ggagtgcagg tggaaaccat ctccccagga gacgggcgca >.................CD28tm.................>>
>>.................FKBP12.................> 3041 ccttccccaa gcgcggccag acctgcgtgg tgcactacac cgggatgctt gaagatggaa agaaattcga ttcctcccgg
>.......................................FKBP12.........................................>
3121 gacagaaaca agccctttaa gtttatgcta ggcaagcagg aggtgatccg acgctgggaa gaaggggttg cccagatgag
. . . .......FKBP12......................................... >
.3201 t.ghgggt.c.ag agagccasflc hgflr.hñt.ahc t.cr.agat.tflt. gc.et.at.ggt.g cr.ar.tgggra r.rraggrat.r at.r.ccar.r.flc.
>.......................................FKBPl2.........................................> 3281 atgccactct cgtcttcgat gtggagcttc taaaactgga acgcgcagag ggccggggct cattgctgac ctgtggagat >..................FKBP12.................>>
» ..................2A...................> 3361 gtcgaggaaa atcccggccc aatggcttct agaatcctct gqcatgagat gtggcatgaa ggcctggaaq aggcatctcq >........2A.........»
>>......................FRB.......................>
Sphl
3441 t.ttgt.aottt ggggaaagga aogt.gaaagg oatgt.ttgag gt.got.ggago cc.t.t.gr.ar.gr.t.atgatggaa r.ggggrrrrr.
>... ........FRB..........................................>
3521 agacLeLyaa ggaaacaLcc LLLaaLcayy (jrLaLgyLcg agaLLLaaLg gaggcccaay ayLyyLgcag yaayLacaLy
>.........................................FRB..........................................>
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>................................ ....FRB......................................>>
>> 3681 tagcggcggc ggcagcagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc >--.-linker...->>
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3761 ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gggaccagag gctgcccccc
>............................................CD280XZ.............................................>
3841 gatgcccaca agccccctgg gggaggcagt ttccggaccc ccatccaaga ggagcaggcc gacgcccact ccaccctggc
>............................................CD280XZ.............................................>
3921 caagatcaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca
>............................................CD280XZ.............................................>
4001 atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg
>............................................CD280XZ.............................................>
4081 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg
>............................................CD280XZ.............................................>
4161 cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc
>............................................CD280XZ.............................................>
4241 acatgcaggc cctgcctcct cgctaa
>.........CD280XZ..........»
SEQ ID NO: 21. CAR inducible que comprende un componente receptor y tres componentes de señalización. El componente receptor comprende un péptido de señal, un scFv anti-CD19, un espaciador derivado del dominio Fc de IgG1 humana, un dominio transmembrana de CD28 y FKB12 como endodominio. El primer componente de señalización comprende FRB y endodominio de CD3 Zeta, el segundo comprende FRB y endodominio de CD28, el tercero FRB y endodominio 41BB. Un péptido 2A de la fiebre aftosa separa los componentes.
SgrAI
1 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg cagcaccggc gacatccaga tgacccagac
>>.....................signal peptide..................... >>
>>.......scFv anti-CDl9........>
81 caccagcagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc aagtacctga
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
161 actggtacca gcagaagccc gacggcaccg tgaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
Xcml
241 cggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac tacagcctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ccacctactt
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
321 ctgccagcag ggcaacaccc tgccctacac cttcggaggc ggcaccaagc tggagatcac caaggccgga ggcggaggct
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
401 ctggcggagg cggctctggc ggaggcggct ctggcggagg cggcagcgag gtgaagctgc aggagtctgg cccaggcctg
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
481 gtggccccaa gccagagcct gagcgtgacc tgcaccgtga gcggcgtgag cctgcccgac tacggcgtga gctggatcag
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
561 gcagccccca cggaagggcc tggagtggct gggcgtgatc tggggcagcg agaccaccta ctacaacagc gccctgaaga >....................
641 qccqccLqac caLc:aLcaaq qacaacaqca aqaqccaqqL qLLccLqaaq alqaacaqcc Lqcaqaccqa cqacaccqcc >................................... scFv anti-CDl9......................................> 721 atctactact gcgccaagca ctactactat ggcggcagct acgctatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgaccgt >................................... scfc'vanti-CUl9......................................> BamHT FseT 801 gagctcggat cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctccc ctggccggcc >.>>
>>.............................HCH2CE3pvaa.............................>
881 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatcgcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg >......................................IICH2CIl3pvaa...............-......................> 961 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc >......................................HCH2CH3pvaa.......................................> SacII
1041 gcggcaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg >......................................HCH2CH3pvaa.......................................> 1121 agtacaactg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccca >......................................HCH2CH3pvaa.......................................> 1201 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg >......................................IICIl2CIl3pvaa.......................................>
1281 cttctatccc agccacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcaaccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc >......................................HCH2CH3pvaa.......................................> 1361 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca >......................................HCH2CH3pvaa.......................................> PpulOl
Nsil
BírBI
1441 tgctccgtga tgcatgaggc cctgcacaat cactataccc agaaatctct gagtctgagc ccaggcaaga aggaccccaa >..............................HCH2CH3pvaa................................>>
1521 gttctgggtc ctggtggtgg tgggaggcgt gctggcctgt tactctctcc tggtgaccgt ggccttcatc atcttctggg >>.......................................r.n28r.m.........................................> 1601 tgggagtgca ggtcgaaacc atctccccag gagacgggcg caccttcccc aagcgcggcc agacctgcgt ggtgcactac >>
>>.......................................FKRP12........................................>
1G81 accgggatgc ttgaagatgg aaagaaattc gattcctccc gggacagaaa caagcccttt aagtttatge taggcaagca ...................FKBP12..........................................> 1761 ggaggtgatc cgacgctcgg aagaaggggt tgcccagatg agtgtgggtc agagagccaa actgactata tctccagatt
>..................... ..................FKBP12..........................................>
1841 atgcctatgg tqccactggq cacccaggca tcatcccacc acatgccact ctcgtcttcg atgtggagct tctaaaactg >........................................FKBPl2..........................................> 1921 gaacccgcag aggcccgggg ctcattgctg acctgtggag atgtcgagga aaatcccggc ccaatggctt ctagaatcct >>>
>>............................FMD-2A.............................>>
2001 ctggcatcag atgtggcatg aaggcctgga agaggcatct cgtttgtact ttggggaaag gaacgtgaaa ggcatgtttg
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2081 aggtgctgga gcccttgcat gctatgatgg aacggggccc ccagactctg aaggaaacat cctttaatca ggcctatggt
>............................................FRD............................................>
2161 cgagatttaa tggaggccca agagtggtgc aggaagtaca tgaaatcagg gaatgtcaag gacctcctcc aagcctggga
>............................................FRB............................................>
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2241 cctctattat catgtgttcc gacgaatctc aaagctcgag agtggcggag gaggcagttc aaggtccgcc gacgcgcctg >...............FRB.................»
>>....1inker....>>
>>.....CD3-Zeta.......>
2321 cataccagca ggggcagaat cagctgtaca acgagctcaa cctcggtagg cgcgaggaat acgatgtgct cgataagaga >........................................CD3-Zeta..........................................> Nrul
2401 agaggtcgcg atcccgagat gggaggaaaa cctcagcgcc gcaagaaccc tcaggagggg ctgtataacg aactgcagaa
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2481 ggataagatg gcaqaggcct actccgagat tggcatgaag ggtgagagga gaagaggtaa aggccatgac ggcctctacc
2561 aaggcctctc taccgcaacg aaagacactt atgacgctct gcatatgcag gctctccccc ctaggcagtg cactaattac >.................................CD3-Zeta.................................>>
». .FMD-2A..>
2641 gcccttctga aacttgccgg cgatgtggag tctaaccctg gccctatcct gtggcacgag atgtggcatg agggtctgga >.....................FMD-2A.....................>>
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2721 agaggccagc cggctgtact tcggagacag aaatgttaag ggtatgttcg aggtgctgga gccgcttcac gctatgatgg
>............................................FRB...................... .....................>
2801 agaggggccc ccagaccctc aaagaaacca gcttcaatca agcctacggg agggatctta tggaggcaca ggaatggtgt
>............................................FRB............................................>
2881 cggaagtaca tgaagagcgg gaacgtcaag gacctgctcc aggcttggga tttgtattat cacgtcttta ggcggatcag
>............................................FRB............................................>
2961 caagtctgga ggcggaggaa gtctgcacag cgattacatg aacatgaccc cccgaaggcc cggacccaca cgcaaacact >.>>
» ....1inker.....»
» ............................. CD28..............................>
3041 atcaacccta tgctccccca cgcgacttcg ccgcctaccg gtcacgcgcc gaggggcgcg gctctttgtt gacttgcggg >>...............FMD-2A................>
3121 gacgttgaag agaatcctgg ccccatcctt tggcacgaga tgtggcacga gggcctggag gaagcctccc ggctgtattt >........FMD-2A.........»
» ............................FRB..............................>
3201 cggagagcgc aacctcaaag gaatgtttga ggtgctggag cctctccatg caatgatgga gagggggcct cagactctta
>............................................FRB...................... .....................>
3281 aagaaacat.c ct.ttaatcag gcttacggt.a gagatttgat. ggaggctcaa gaatggt.gcc ggaaat.acat gaagagt.gga
>............................................FRB...................... .....................>
3361 aacgttaaag acctgctgca ggcatgggac ctgtactatc acgtattcag acggatctca aagtcagggg gcggtggctc
>.................................FRB................................. .>>
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3441 cctttatatc ttcaagcagc ctttcatgag gccggtgcag accacacaag aagaggatgg gtgctcttgc cggttccccg >
>>......................................... 41BB...........................................>
3521 aggaggagga gggcggatgc gagctctga
SEQ ID NO: 22. CAR inducible con componente receptor multicapa. El componente receptor comprende un péptido de señal, un scFv anti-CD19, un espaciador del dominio Fc de IgG1 humana, un dominio transmembrana de CD28, un primer FRB, a continuación, el primer bucle extracelular menor transmembrana y el segundo dominio transmembrana de CD20, a continuación, un segundo FRB, a continuación, el tercer dominio transmembrana, el bucle extracelular principal y el cuarto dominio transmembrana de CD20 y un tercer FRB. El componente de señalización comprende FRB y un compuesto de endodominios de CD28, OX40 y CD3-Zeta. Un péptido 2A de la fiebre aftosa separa los dos componentes.
SgrAl
1 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg cagcaccggc gacatccaga tgacccagac
>>.....................signal peptide..................... >>
>>.......scFv anti-CDl9....... >
81 caccagcagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc atcagctgca gagccagcca ggacatcagc aagtacctga
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
161 actggtacca gcagaagccc gacggcaccg tgaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
Xcml
241 cggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac tacagcctga ccatcagcaa cctggagcag gaggacatcg ccacctactt
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
321 ctgccagcag ggcaacaccc tgccctacac cttcggaggc ggcaccaagc tggagatcac caaggccgga ggcggaggct
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
Stul
401 ctggcggagg cggctctggc ggaggcggct ctggcggagg cggcagcgag gtgaagctgc aggagtctgg cccaggcctg
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
481 gtggccccaa gccagagcct gagcgtgacc tgcaccgtga gcggcgtgag cctgcccgac tacggcgtga gctggatcag
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
561 gcagccccca cggaagggcc tggagtggct gggcgtgatc tggggcagcg agaccaccta ctacaacagc gccctgaaga
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
641 gccggctgac catcatcaag gacaacagca agagccaggt gttcctgaag atgaacagcc tgcagaccga cgacaccgcc
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................>
721 atctactact gcgccaagca ctactactat ggcggcagct acgctatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgaccgt
>....................................... scFv anti-CDl9.........................................> BamHI Fsel
801 gagctcggat cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctccc gtggccggcc
>.»
>>...............................HCH2CH3pvaa................................> 81 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatcgcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg >........................................HCH2CH3pvaa........................................>
961 gac.gtgagc. acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agac.aia.agcc .............................HCH2CH3pvaa........................................>
1041 gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg >........................................HCH2CH3pvaa.........................................>
1121 agtacaagtg caacgtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga >........................................HCH2CH3pvaa........................................>
1201 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg >........................................HCH2CH.3pvaa........................................>
1281 cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcaaccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc >........................................HCH2CH3pvaa........................................>
1361 tggactccga cggctccttc t~cctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaqgtggc agcaggggaa cgtcttctca >........................................HCH2CH3pvaa........................................> PpulOl
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1441 tgctccgtga tgcatgaggc cctgcacaat cactataccc agaaatctct gagtctgagc ccaggcaaga aggaccccaa >................................HCH2CH3pvaa..................................»
1321 gtt.otgggtc r.tgctggt.gg tgggaggcgt. gr.t.ggcr.tgf. tar.tcf.r.tcc tggt".G'ar.r.gt. ggccf.tcat.c. at.ct.t.ct.ggg >>.................................................CD28tni...................................................> St.uT
1601 tgatcctctg gcatgagatg tggcatgaag gcctggaaga ggcatctcgt ttgtactttg gggaaaggaa cgtgaaaggc »
» ..........................................FRB............................................>
Stul 1681 aLyLLLyagg LgcLggagcc c„LgcaLgt:L aLgaLggaac ggggccccca yacLcLyaag gaaacaLccL LLaaLcagyc
>............................................ FRB.............................................>
1761 ctatggtcga gatttaatgg aggcccaaga gtggtgcagg aagtacatga aatcagggaa tgtcaaggac ctcctccaag
>............................................ FRB.............................................>
1841 cctgggacct ctattatcat g~gttccgac gaatctcaaa gagcagcctg gtgggaccca cccagagctt cttcatgcgg >....................FRB......................»
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1921 gagagcaaga ccctgggagc cgtgcagatc atgaacggcc tgttccacat cgccctggga ggcctgctga tgatccctgc
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2001 cggcatctac gccccaatct gcgtgaccgt gtggtaccca ctgtggggag gcatcatgta catcatcagc ggcagcctgc
>...........................................CD20.............................................>
2081 tggccgccac cgagaagaac agcggagggg gaagcatcct gtggcacgag atgtggcatg agggtctgga agaggccagc >.......CD20.......>>
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>>......................FRB........................> 2161 cggctgtact tcgcagagag aaatgttaag ggtatgttcg aggtgctgga gccgcttcac gctatgatgg agaggggccc
>............................................FRB............................................>
2241 ccagaccctc aaagaaacca gcttcaatca agcctacggg agggatctta tggaggcaca ggaatggtgt cggaagtaca
>.......................-...................FRB............................................>
2321 tgaagagcgg gaacgtcaag gacctgctcc aggcttggga tttgtattat cacgtcttta ggcggatcag caagtctgga
>........................................FRB.........................................>>
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2401 ggcggaggaa gtcggaagtg cctggtgaag ggcaagatga tcatgaacag cctgagcctg ttcgccgcca tcagcggcat >..lir.ker-->>
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2481 gatcctgagc atcatggaca tcctgaacat caagatcagc cacttcctga agatggagag cctgaacttc atccgggccc
>...........................................CD20............................................ >
2561 acaccccata catcaacatc tacaactgcg agectgccaa ccccagcgag aagaacagcc ccagcaccca gtactgctae
>...........................................CD20............................................ >
2641 agcatccaga gcctgttcct gggcatcctg agcgtgatgc tgatettege cttcttccag gagctggtga tcgccggcat
>...........................................CD20............................................ >
2721 cgtggagaac gagtggaagc ggacctgcag ccggcccaag agcatcctgt ggcacgagat gtggcatgag ggtctggaag >....................CD20.....................»
» ..................FRB..................>
2801 aggccagccg gctctacttc ggagagagaa atgttaaggg tatgttcgag gtgctggagc cgcttcacgc tatgatggag
>........................................ .FRB............................................>
2881 aggggccccc agacccteaa agaaaccagc tteaatcaag cctacgggag ggatcttatg gaggcacagg aatggtgtcg
>............................................FRB............................................>
2961 gaagtacatg aagagcggga acgtcaagga cctgctccag gcttgggatt tgtattatca cgtctttagg cggatcagca
>............................................FRB............................................>
3041 agcgcgcaga gggccggggc tcattgctga cctgtggaga tgtcgaggaa aatcccggcc caggagtgca ggtggaaacc >>>
>>.............................FMD-2A..............................»
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3121 atctccccag gagacgggcg caccttcccc aagcgcggcc agacctgcgt ggtgcactac accgggatgc ttgaagatgg
>..........................................FKBP12...........................................>
3201 aaagaaattc gattcctccc gggacagaaa caagcccttt aagtttatgc taggcaagca ggaggtgatc cgaggctggg >.........................................FKBPl2...........................................>
3281 aagaaggggt tgcccagatg agtgtgggtc agagagccaa actgactata tctccagatt atgcctatgg tgccactggg
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3361 cacccaggca tcatcccacc acatgccact ctcgtcttcg atgtggagct tctaaaactg gaaaggagta agaggagcag >................................FKBPl2................................»
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3441 gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac
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3601 cggaccccca tccaagagga gcaggccgac gcccactcca ccctggccaa gatcagagtg aagttcagca ggagcgcaga
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3681 cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg
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3761 acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg
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3841 cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct
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3921 ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gcctcctcgc tga
>......................................280XZ.......................................»
SEQ ID NO: 23. CAR inducible simple que comprende un componente receptor y un componente de señalización. El componente de señalización comprende un receptor de ecdisona y el endodominio de CD3-Zeta (cursiva). Un péptido FMD-2A (mostrado en negrita) separa este componente de señalización del componente receptor. El componente receptor comprende un scFv anti-CD19, un espaciador HCH2CH3 (subrayado), un dominio transmembrana de CD148 (destacado en gris) y el receptor de retinoide X como endodominio.
SEQ ID NO: 23
MPVDRILEAELAVEQKSDQGVEGPGGTGGSGSSPNDPVTNICQAADKQLFTLVEWAKRIP
HFSSLPLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIDVRDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFD
RVLTELVSKMRDMRMDKTELGCLRAIILFNPEVRGLKSAQEVELLREKVYAALEEYTRTT
HPDEPGRFAKLLLRLPSLRSIGLKCLEHLFFFRLIGDVPIDTFLMEMLESPSDSSGGGSA
DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA
EAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKD TYDALHMQALPPRRAEGRGSIj'LTCGDVEE
NPGPMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWY
QQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPY
TFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGV
SLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQT
DDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSV
FLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRR
RQAERMAQIKRWSEKKTAQAPHRFQKTCSPISGGGGSRPECVVPETQCAMKRKEKKAQK
EKDKLPVSTTTVDDHMPPIMQCEPPPPEAARIHEVVPRFLSDKLLETNRQKNIPQLTANQ
QFLIARLIWYQDGYEQPSDEDLKRITQTWQQADDENEESDTPFRQITEMTILTVQLIVEF
AKGLPGFAKISQPDQITLLKACSSEVMMLRVARRYDAASDSILFANNQAYTRDNYRKAGM
AEVIEDLLHFCRCMYSMALDNIHYALLTAWIFSDRPGLEQPQLVEEIQRYYLNTLRIYI
LNQLSGSARSSVIYGKILSILSELRTLGMQNSNMCISLKLKNRKLPPFLEEIWDVADMSH
TQPPPILESPTNL

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende; (i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión al inductor químico de dimerización (CID) intracelular (CBD1); y
(ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio unión al CID (CBD2);
en donde el ácido nucleico codifica tanto el componente receptor como el componente de señalización del sistema de señalización del CAR;
en donde CBD1 y CBD2 son capaces de unirse simultáneamente a un CID; y
en donde, en ausencia de CID, la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado la señalización a través del dominio de señalización; si bien, en presencia de CID, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado la señalización a través del dominio de señalización.
2. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que produce un polipéptido que comprende el componente receptor y el componente de señalización unidos por un sitio de escisión.
3. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el sitio de escisión es autoescindible.
4. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el sitio de escisión comprende un péptido de autoescisión del virus de la fiebre aftosa (FMDV) 2a.
5. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(i) CBD1 comprende el dominio de unión a rapamicina de la proteína de unión a FK 12 (FKBP12) y CBD2 comprende el dominio de unión a FKBP12-rapamicina (FRB) de mTOR; o
(ii) CBD2 comprende el dominio de unión a rapamicina de la proteína de unión a FK 12 (FKBP12) y CBD1 comprende el dominio de unión a FKBP12-rapamicina (FRB) de mTOR; y
en donde el CID es rapamicina o un derivado de la misma, que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
6. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde CBD1 y CBD2 comprenden los dominios de unión a la proteína de unión a FK506 (FKBP) que comprende una mutación F36V, en donde el CID es AP1903 o un derivado del mismo que es capaz de causar que el componente receptor y el componente de señalización se heterodimericen.
7. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 el cual es un vector retrovírico o un vector lentivírico o un transposón.
9. Un linfocito T o linfocito NK que comprende el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de linfocitos T o linfocitos NK de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para usar en el tratamiento de una enfermedad.
12. Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el tratamiento comprende las siguientes etapas:
(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T o linfocitos NK de un sujeto;
(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o NK con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8; y
(iii) administración de los linfocitos T o linfocitos NK de (ii) al sujeto.
13. Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el tratamiento además comprende la etapa de administrar un CID para usar en el sistema de señalización de CAR al sujeto.
14. Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 13, que implica controlar la progresión de la enfermedad y/o controlar la actividad tóxica en el sujeto y ajustar la dosis del CID para proporcionar niveles aceptables de progresión de la enfermedad y/o actividad tóxica.
15. Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde la enfermedad es un cáncer.
16. Un método para fabricar un linfocito T o NK de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la etapa de introducir: un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en un linfocito T ex vivo.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el linfocito T o NK es de una muestra aislada de un sujeto.
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