CN107922489B - κ骨髓瘤抗原嵌合性抗原受体和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于治疗KMA表达恶性病的组合物和方法，其包括嵌合性抗原受体(CAR)和含有CAR的T细胞(CAR T细胞)。本发明还提供包含共同表达包括细胞因子和抗体在内的其它抗肿瘤剂的CAR T细胞的方法和组合物。
Description
美国非临时申请的交叉引用
本申请要求2015年4月23日提交的美国临时申请系列号62/151,968和2015年5月7日提交的美国临时申请系列号62/158,407的优先权，其中每一个针对全部目的以全文引用的方式并入本文中。
关于序列表的陈述
以文本格式代替纸本拷贝提供与本申请相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是HMLX_002_02WO_SeqList_ST25.txt。文本文件是约63KB，创建于2016年4月22日，并且经EFS-Web用电子方式提交。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种骨髓浆细胞的恶性病，尽管其疗法最近有进展，但仍不可治愈。其临床病程的特征在于最初对疗法有反应，随后在最终对全部治疗形式都产生耐受性之后，反复复发。其还与高发病率和残疾有关，这都是由疾病本身和来自可用治疗的毒性引起。
多发性骨髓瘤的特征在于恶性浆细胞，其分泌κ或λ轻链限制单克隆病变蛋白。κ限制发生于60％骨髓瘤患者中并且κ骨髓瘤抗原(KMA)的表达高度限于多发性骨髓瘤和B细胞恶性病。κMab是KMA特异性单克隆抗体，其在I期和II期临床试验中证实了安全性和功效。
用单独单克隆抗体治疗不具有治愈性，其不完全根除肿瘤导致最终复发。这可能由于抗体向肿瘤中的不充分渗透(经被动扩散)、肿瘤细胞上抗原表达的不均匀性或肿瘤细胞对抗体相关细胞毒性的机制的耐受性。因此，需要具有低毒性并且可以提供长期疾病治愈的有效疗法。
携带嵌合性抗原受体的T细胞(CAR T细胞)代表这种问题的可能解决方案。CAR T细胞结合单克隆抗体的抗原结合结构域与T细胞的一个或多个胞内信号传导结构域产生局部肿瘤特异性免疫反应。CAR T细胞具有优于单克隆抗体的几个优势：它们主动迁移到肿瘤中，回应于抗原携带肿瘤细胞增殖、分泌募集其它免疫反应组的因子并且可以长期存活以持续免于复发。CAR-T细胞优于治疗性靶向相同抗原的抗体的另一益处在于CAR T细胞还可以进一步经修饰来提高安全性和功能。举例来说，T细胞可以经修饰以包括归巢受体的表达，这提高T细胞特异性和T细胞浸润癌细胞或肿瘤的能力，或它们可以包括可以用于在产生毒性时消除细胞的“切断”。另外，并且对于多发性骨髓瘤和其相关病症的治疗重要的是，T细胞可以修饰成表达可以提高抗肿瘤反应的额外生物活性或药学活性分子，如肿瘤抑制细胞因子。如本文所述，本发明人已经设计出新颖CAR构筑体，其能够特异性结合于仅表达于MM细胞上的特定构形KMA表位，并且使经工程改造的CAR T细胞表达对这种表位和单独或与表达其它抗肿瘤免疫介体组合的胞内T细胞信号传导结构域具有特异性的胞外抗原结合结构域。
发明内容
本发明针对对κ骨髓瘤抗原(KMA)具有特异性但含有能够触发抗KMAT细胞响应的胞内信号传导结构域的嵌合性抗原受体(CAR)，含有这类CAR的T细胞以及通过给予表达KMA特异性CAR的T细胞治疗多发性骨髓瘤和相关病症的方法。所得CAR T细胞能够介导针对癌细胞的靶向免疫反应，同时避免与全身传递单克隆抗体和/或抗肿瘤细胞因子有关的非所需副作用。
在一个实施例中，本发明的嵌合性抗原受体(CAR)包含一个或多个胞内信号传导结构域和一个特异性识别κ骨髓瘤抗原(KMA)的胞外抗原结合结构域。在一个实施例中，胞内信号传导结构域是一个或多个共刺激胞内域。在另一实施例中，一个或多个共刺激结构域是CD28结构域、CD3ζ结构域、4-1BB结构域或OX-40结构域或其组合中的一个或多个。在一个实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和CD28结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、4-1BB结构域和OX-40结构域。
在一个实施例中，胞外结合结构域包含特异性识别KMA的单链可变片段(scFv)。在另一实施例中，scFv包含来源于κMab的互补决定区(CDR)。在另一实施例中，scFv包含SEQID NO:6-8的VL CDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:21的VL区。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:3-5的VH CDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:22的VH区。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:6-8的VL CDR和SEQ ID NO:3-5的VH CDR。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:21的VL区和SEQ ID NO:22的VH区。在一个实施例中，SEQ ID NO:2的轻链和SEQ ID NO:1的重链结构域经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在一个实施例中，SEQID NO:21的VL区和SEQ ID NO:22的VH区经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在另一个实施例中，连接子是(Gly4Ser)x，其中X是1-5。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。在一个实施例中，scFv用间隔子附接到一个或多个胞内信号传导结构域。在另一实施例中，scFv经包含免疫球蛋白恒定区的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG铰链、IgG CH2和IgG CH3结构域中的一个或多个。在一个具体实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白铰链结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白CH3结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG CH2结构域。在另一实施例中，scFv经包含CD8α结构域的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，间隔子经甘氨酸-丝氨酸连接子附接到scFV。在另一个实施例中，连接子是(Gly4Ser)x，其中X是1-5。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。
在一个实施例中，本发明提供包含嵌合性抗原受体的T细胞(CAR T细胞)。在一个实施例中，CAR T细胞包含具有一个或多个胞内信号传导结构域和一个胞外结合结构域的CAR。在一个具体实施例中，胞外结合结构域特异性识别κ骨髓瘤抗原。在一个实施例中，CART细胞进一步经工程改造以表达一种或多种额外生物分子。在一个实施例中，额外一种或多种分子包含IL-12和/或SANT7和/或半乳糖凝集素-3C(GAL3C)。在一个实施例中，CAR T细胞表达包含经柔性连接子接合的一个IL-12p35子单元和一个IL-12p40子单元的单链多肽。在一个实施例中，IL-12p35和IL-12p40经(G4S)3连接子接合。在一个实施例中，单链IL-12多肽形成生物活性IL-12p70杂二聚体。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12和可选标记物。在一个实施例中，一个或多个生物分子是SANT7。在一个实施例中，CAR T细胞表达GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达SANT7和GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达SANT7、GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CART细胞表达IL-12和GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达SANT7和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12和SANT7。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、SANT7和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、SANT7和GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、SANT7、GAL3C和可选标记物。
在一个实施例中，本发明的CAR T细胞还表达肝细胞生长因子(HGF)结合蛋白，其能够抑制HGF信号传导和效应功能。一方面，HGF结合蛋白是抗体或其片段。
一方面，本发明提供一种制造经遗传修饰的T细胞的方法，其包含向T细胞中引入编码包含一个或多个胞内信号传导结构域和胞外抗原结合结构域的CAR的表达载体。在一个具体实施例中，胞外抗原结合结构域特异性识别KMA。在一个实施例中，表达载体是转座载体表达系统。在某些实施例中，表达载体是PiggyBac转座子表达载体。在另一实施例中，表达载体是病毒载体。在一个实施例中，病毒载体是慢病毒载体或反转录病毒载体。在一个实施例中，表达载体通过电穿孔引入到细胞中。在一个实施例中，CAR中的一个或多个胞内信号传导结构域是一个或多个共刺激胞内域。在另一实施例中，一个或多个共刺激结构域是CD28结构域、CD3ζ结构域、4-1BB结构域或OX-40结构域或其组合中的一个或多个。在一个实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和CD28结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、4-1BB结构域和OX-40结构域。在一个实施例中，胞外结合结构域包含特异性识别KMA的单链可变片段(scFv)。在另一实施例中，scFv包含来源于κMab的互补决定区(CDR)。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:6-8的VLCDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:21的VL区。在另一实施例中，scFv包含SEQ IDNO:3-5的VH CDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:22的VH区。在另一个实施例中，scFv包含SEQ ID NO:6-8的VL CDR和SEQ ID NO:3-5的VH CDR。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:21的VL区和SEQ ID NO:22的VH区。在一个实施例中，SEQ ID NO:2的轻链和SEQID NO:1的重链经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在一个实施例中，SEQ ID NO:21的VL区和SEQID NO:22的VH区经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。在一个实施例中，scFv用间隔子附接到一个或多个胞内信号传导结构域。在另一实施例中，scFv经包含免疫球蛋白恒定区的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG铰链、IgG CH2和IgG CH3结构域中的一个或多个。在一个具体实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白铰链结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白CH3结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG CH2结构域。在另一实施例中，scFv经包含CD8α结构域的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，间隔子经甘氨酸-丝氨酸连接子附接到scFV。在另一个实施例中，连接子是(Gly4Ser)x，其中X是1-5。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。在一个实施例中，所述方法另外包含引入一种或多种经工程改造以表达一种或多种额外生物分子的额外表达载体。在一个实施例中，额外一种或多种分子包含IL-12和/或SANT7和/或GAL3C。在一个实施例中，一种或多种额外表达载体包含编码单链多肽的序列，所述单链多肽包含经柔性连接子接合的一个IL-12p35子单元和一个IL-12p40子单元。在一个实施例中，IL-12p35和IL-12p40经(G4S)3连接子接合。在一个实施例中，编码单链IL-12多肽的序列编码生物活性IL-12p70杂二聚体。在一个实施例中，表达一种或多种生物活性剂的表达载体还包含可选标记物。在一个实施例中，表达载体包含编码包含用柔性连接子接合的IL-12p35和IL-12p40的单链IL-12多肽和用2A核糖体跳跃接合到单链IL-12的可选标记物的序列。在一个实施例中，一个或多个生物分子是SANT7。在一个实施例中，表达一种或多种生物活性剂的表达载体包含SANT7和可选标记物。在一个实施例中，编码SANT7的序列和可选标记物经2A核糖体跳跃序列接合。在一个实施例中，表达一种或多种生物活性剂的表达载体包含GAL3c和可选标记物。在一个实施例中，编码GAL3C的序列和可选标记物经核糖体跳跃序列接合。在一个实施例中，CAR T细胞包含IL-12、SANT7和可选标记物。在一个实施例中，编码IL-12的序列经2A核糖体跳跃连接到可选标记物并且编码SANT7的序列经额外2A核糖体跳跃连接到编码IL-12的序列。在一个实施例中，CAR T细胞包含GAL3C、SANT7和可选标记物。在一个实施例中，编码GAL3C的序列经2A核糖体跳跃连接到可选标记物并且编码SANT7的序列经额外2A核糖体跳跃连接到编码GAL3C的序列。在一个实施例中，CAR T细胞包含IL-12、GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，编码IL-12的序列经2A核糖体跳跃连接到可选标记物并且编码GAL3C的序列经额外2A核糖体跳跃连接到编码IL-12的序列。在一个实施例中，CAR T细胞包含GAL3C、SANT7、IL-12和可选标记物。在一个实施例中，编码GAL3C、SANT7、IL-12和可选标记物中的每一个的序列经2A核糖体跳跃序列连接。
在一个实施例中，提供治疗KMA表达恶性病的方法。在一个实施例中，KMA表达恶性病是B细胞恶性病。在另一实施例中，B细胞恶性病是多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstroms macroglobulinemia)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或淀粉样变性。在一个具体实施例中，所述方法包括向患有多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、淀粉样变性或表达KMA的另一B细胞恶性病的个体给予经遗传修饰的T细胞，所述经遗传修饰的T细胞经工程改造以表达一个或多个胞内信号传导结构域和特异性识别KMA的胞外抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR中的一个或多个胞内信号传导结构域是一个或多个共刺激胞内域。在另一实施例中，一个或多个共刺激结构域是CD28结构域、CD3ζ结构域、4-1BB结构域或OX-40结构域或其组合中的一个或多个。在一个实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和CD28结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和OX-40结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、CD28结构域和4-1BB结构域。在另一实施例中，CAR的一个或多个共刺激胞内域包含CD3ζ结构域、4-1BB结构域和OX-40结构域。在一个实施例中，胞外结合结构域包含特异性识别KMA的单链可变片段(scFv)。在另一实施例中，scFv包含来源于κMab的互补决定区(CDR)。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:6-8的VL CDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:21的VL区。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:3-5的VHCDR。在另一实施例中，scFV包含SEQ ID NO:22的VH区。在另一个实施例中，scFv包含SEQ IDNO:6-8的VL CDR和SEQ ID NO:3-5的VH CDR。在另一实施例中，scFv包含SEQ ID NO:21的VL区和SEQ ID NO:22的VH区。在一个实施例中，SEQ ID NO:2的轻链和SEQ ID NO:1的重链经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在一个实施例中，SEQ ID NO:21的VL区和SEQ ID NO:22的VH区经甘氨酸-丝氨酸连接子附接。在另一个实施例中，连接子是(Gly4Ser)x，其中X是1-5。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。在一个实施例中，scFv用间隔子附接到一个或多个胞内信号传导结构域。在另一实施例中，scFv经包含免疫球蛋白恒定区的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG铰链、IgG CH2和IgG CH3结构域中的一个或多个。在一个具体实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白铰链结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白CH3结构域。在另一实施例中，免疫球蛋白恒定区包含IgG CH2结构域。在另一实施例中，scFv经包含CD8α结构域的间隔子附接到一个或多个胞内结构域。在一个实施例中，间隔子经甘氨酸-丝氨酸连接子附接到scFV。在另一个实施例中，连接子是(Gly4Ser)x，其中X是1-5。在另一实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子是15-20个氨基酸的连接子。在另一实施例中，连接子是15个氨基酸的甘氨酸丝氨酸连接子并且包含(Gly4Ser)3。在一个实施例中，(Gly4Ser)3连接子是SEQ ID NO:23。在另一实施例中，所述经遗传修饰的T细胞进一步经工程改造以表达一种或多种额外生物分子。在一个实施例中，额外一种或多种分子包含IL-12和/或SANT7和或GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达包含经柔性连接子接合的一个IL-12p35子单元和一个IL-12p40子单元的单链多肽。在一个实施例中，IL-12p35和IL-12p40经(G4S)3连接子接合。在一个实施例中，单链IL-12多肽形成生物活性IL-12p70杂二聚体。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12和可选标记物。在一个实施例中，一个或多个生物分子是SANT7。在一个实施例中，CAR T细胞表达SANT7和可选标记物。在一个实施例中，可选标记物是GAL3C。在一个实施例中，CAR T细胞表达GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、SANT7和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达SANT7、GAL3C和可选标记物。在一个实施例中，CAR T细胞表达IL-12、SANT7、GAL3C和可选标记物。
在另一实施例中，所述方法包括进一步向患有多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、淀粉样变性或表达KMA的另一B细胞恶性病的患者给予HGF结合蛋白。在一个实施例中，HGF结合蛋白是抗体或其片段。在一个实施例中，包含HGF结合蛋白的表达载体用编码CAR构筑体的表达载体共转染到T细胞中，使得所得CAR T细胞还表达HGF结合蛋白。
在另一实施例中，所述方法包括给予一种或多种额外生物或药物活性剂。在一个实施例中，所述一种或多种额外药学活性剂是化学治疗剂。在另一实施例中，一种或多种药学活性剂是免疫调节药物。在一个具体实施例中，免疫调节药物是撒利多胺(thalidomide)或其类似物。在另一实施例中，撒利多胺类似物是阿克替米(actimid)、来那度胺(lenalidomide)或泊马度胺(pomalidomide)。在另一实施例中，额外药学活性剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。在另一实施例中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是帕比司他(panobinostat)、伏立诺他(vorinostat)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、缩酚酸肽、苯丁酸酯、丙戊酸、贝林诺他(belinostat)、LAQ824、恩替诺特(entinostat)、CI944或莫塞诺他(mocetinostat)。在另一实施例中，一种或多种额外生物或药物活性剂在用所述经遗传修饰的T细胞治疗之前、期间或之后给予。在另一实施例中，经遗传修饰的T细胞静脉内给予。在另一实施例中，一般修饰的T细胞来源于所述患者。在另一实施例中，经遗传修饰T细胞不来源于所述患者。
在一个实施例中，本发明的CAR T细胞在同种异体干细胞移植之前、期间或之后给予。在另一实施例中，本发明的CAR T细胞在同种异体干细胞移植之前、期间或之后给予。
本发明的这些上文表征的方面以及其它方面在许多绘示的实施方式和应用中示范，其中一些在图式中显示并且在随附的权利要求书部分中特征化。然而，上文的发明内容并不打算描述本发明的每个绘示的实施例或每一种实施方案。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。参考阐述其中利用本发明原理的说明性实施例和其附图的以下详细描述来获得对本发明特征和优势的更好理解：
图1A-1B示出了CAR与免疫球蛋白(IgG)和T细胞受体(TCR)的结构关联。图1A示出了单链可变片段(scFv)，其由经多肽连接子接合到重链可变区(VH)的亲本抗体的轻链可变区(VL)组成，赋予CAR抗原特异性。柔性铰链将scFv连接到如CD28、4-1BB或OX-40等共刺激分子的跨膜和胞内信号传导结构域，随后CD3ζ。图1B示出了用CAR转导的T细胞在遇到携带目标抗原(Ag)的肿瘤细胞时活化，导致肿瘤细胞溶解。
图2示出了嵌合性抗原受体功能的结构决定因素。
图3示出了原发性骨髓瘤细胞上的KMA表达。
图4A-4C示出了KMA.CAR-28z功能。图4A是多种细胞株上KMA表达的流式细胞测量术分析；图4B是KMA.CAR-28z转导(上部曲线图)和未转导(下部曲线图)CD8+T细胞的干扰素-γ(IFNγ)表达。图4C示出了KMA.CAR-28z转导T细胞对KMA阳性和阴性细胞株的特异性溶解。
图5A示出了用5×105-5×106个骨髓瘤细胞注射的RPMI-Rag小鼠；图5B示出了骨髓和脾脏被CD138+RPMI9226细胞的浸润；图5C示出了进行性疾病的升高水平的血清人类λ轻链；图5D示出了骨髓中的CD138+/细胞质λ轻链阳性细胞；图5E示出了作为治疗性模型的RPMI-Rag小鼠。
图6A-6C示出了KMA.CAR的优化；图6A示出了初始KMA.CAR-28z构筑体；图6B示出了具有Ig重链铰链和CH3或单独铰链的构筑体；图6C示出了组合最优铰链区(opti)与多种共刺激分子胞内域和CD3ζ的组合的构筑体。
图7示出了IL-12和SANT7载体。
图8A-8B示出了使用实例3中所述的构筑体的KM.CAR T细胞扩增和CAR表达。图8A示出了添加(左)和不添加(右)KMA表达JJN3细胞株的CAR T细胞培养物中全部细胞的扩增。图8B如通过具有(顶部曲线图)和不具有(底部曲线图)KMA表达JJN3细胞株的培养物中的GFP所测量的CAR表达。hCH2CH3＝KM.CAR_hCH2CH3_28zT-细胞；hCH2CH3mut＝KM.CARhCH2CH3mut_28TM_41BBz T细胞；h＝KM.CAR_h_28TM_41BBz T细胞；CD8a＝KM.CAR_8a_28TM_41BBz T细胞。
图9示出了活化诱导型转座子卡匣的结构。IR＝反向重复序列；Ins＝侧接基因插入物的两个末端的隔离子；NFATpro＝活化诱导型启动子；BGHpA＝牛生长激素多腺苷酸化信号；EF1α＝人类延伸因子-1α启动子；RQR8＝标记物；SV40＝猿猴病毒晚期多腺苷酸化信号。
图10示出了活化诱导的启动子控制下eGFP的表达。评定用PMA和伊屋诺霉素刺激的经转导PBMC(右部曲线图)的RQR8(x轴)和eGFP(y轴)的共表达并且与未刺激的对照组(左部曲线图)比较。经转导的细胞在无刺激存在的情况下不表达eGFP。50％经转导的细胞在刺激下表达eGFP。
图11示出了具有CAR和生物学的活化诱导型转座子卡匣的结构。IR＝反向重复序列；Ins＝侧接基因插入物的两个末端的隔离子；NFATpro＝活化诱导型启动子；BGHpA＝牛生长激素多腺苷酸化信号；EF1α＝人类延伸因子-1α启动子；SV40＝猿猴病毒晚期多腺苷酸化信号。
图12A-12B示出了KMA特异性干扰素-γ制造和使用KMA+和KMA-细胞株的KM.CAR_hCH2CH3_28z T细胞(图12A)或KM.CAR_h_28TM_41BBz T细胞(图12B)标准铬释放分析法的细胞毒性。所用的KMA阳性细胞株包括JJN3、Pfeiffer、NCI-H929，而KMA阴性细胞株包括Nalm-6和Molt。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术与科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然可以在本发明的测试实践中使用类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但本文描述优选的方法和材料。在描述和要求本发明时，将使用以下定义。还应理解本文所使用的术语不打算作为限制，而是出于描述具体实施例的目的用于本文中。
本文所用的冠词“一”指的是冠词的一个或超过一个(即至少一个或一个或多个)语法对象。
如本文所用的术语“表达载体”指的是包含重组核酸序列的载体，所述重组核酸序列包含至少一个可操作地连接于打算表达的核酸序列的表达控制序列。表达载体包含表达所需的全部必要顺式作用元件。表达载体的实例包括(但不限于)质体、粘粒和编码打算表达的重组性多核苷酸的病毒。在一些实施例中，表达载体包含能够整合到基因组中的转座元件，例如PiggyBac表达系统。在一些实施例中，表达载体是允许将表达载体内容物整合到主体基因组中的病毒载体，例如反转录病毒和慢病毒载体。
“嵌合性抗原受体”或“CAR”意思是包括胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域的经工程改造的受体。尽管最常见类型的CAR包含与T细胞辅助受体的跨膜和胞内结构域，如CD3ζ链，融合的来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，但本文所述的本发明不限于这些结构域。实际上，如本文所用，“嵌合性抗原受体”或“CAR”指的是经工程改造以表达的任何受体和融合或连接到任何胞内信号传导分子的胞外抗原结合结构域。
如本文所用，术语“CAR-T细胞”指的是已经基因工程改造成表达CAR的T淋巴细胞。CAR T细胞的定义涵盖T淋巴细胞的全部类别和子类，包括CD4+、CD8+T细胞以及效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞等。经遗传修饰的T淋巴细胞可以“来源于”或“获自”将接收使用一般修饰的T细胞治疗的受试者或它们可以“来源于”或“获自”不同受试者。
“胞内信号传导结构域”意思是存在于T细胞内部或经工程改造以存在于T细胞内部的CAR的部分。“胞内信号传导结构域”可以还含有或不含有将CAR锚定于T细胞的质膜中的“跨膜结构域”。在一个实施例中，“跨膜结构域”和“胞内信号传导结构域”来源于相同蛋白质(例如CD3ζ)；在其它实施例中，胞内信号传导结构域和跨膜结构域来源于不同蛋白质(例如CD3ζ的跨膜结构域和CD28分子的胞内信号传导结构域，或反过来也如此)。
“共刺激胞内域”意思是来源于T细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域或其片段。T细胞共刺激分子的非限制性列表包括CD3、CD28、OX-40、4-1BB、CD27、CD270、CD30和ICOS。共刺激胞内域可以包含或可以不包含来自相同或不同共刺激胞内域的跨膜结构域。
“胞外抗原结合结构域”意思是特异性识别并且结合于所关注抗原的CAR的部分。“胞外结合结构域”可以来源于单克隆抗体。举例来说，“胞外结合结构域”可以包括来自单克隆抗体的全部或部分Fab结构域。在某些实施例中，“胞外结合结构域”包括特定单克隆抗体的互补决定区。在另一实施例中，“胞外结合结构域”是单链可变片段(scFv)。
“单链可变片段”或“scFv”意思是VL和VH之间具有肽连接子的抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)链的融合蛋白。连接子长度和组成视使用的抗体部分而变化，但一般介于约10个氨基酸和约25个氨基酸长度之间。在一些实施例中，肽连接子富含甘氨酸以提供柔韧性。在一些实施例中，连接子还包括丝氨酸和/或苏氨酸，其可以不受理论束缚有助于溶解度。在一些实施例中，连接子是具有SEQ ID NO:23的氨基酸。scFv设计成保留其可变链所来源的亲本抗体的抗原结合特异性，即使不具有免疫球蛋白重链。在一些实施例中，scFV中仅使用来自VH和VL的互补决定区(CDR)。在一些实施例中，使用全部VL和VH链。
如本文所用的术语“抗体”指的是特异性结合于抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人类化抗体(哈洛(Harlow)等人,1999,《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),纽约州(NY)；哈洛(Harlow)等人,1989,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约州(N.Y.)；休斯顿(Houston)等人,1988,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883；伯德(Bird)等人,1988,《科学(Science)》242:423-426)。如本文所用，术语“抗体”还涵盖抗体片段。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分并且指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段、线性抗体、scFv抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的“抗体重链”指的是天然存在的构形的全部抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较大的那一个。
如本文所用的“抗体轻链”指的是天然存在的构形的全部抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较小的那一个κ和λ轻链指的是两种主要抗体轻链同型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”指的是识别并且结合于特定抗原的抗体的两个可变链(重链和轻链)的部分。CDR是可变链的最可变部分并且向抗体提供其特异性。可变重(VH)和可变轻(VL)链中的每一个上存在三个CDR并且因此每个抗体分子存在总共六个CDR。
“κMab”意思是此前称为IST-1097或MDX-1097的单克隆抗体。另外，如本文所用，κMab可以指κMab抗体的完整抗体序列(参看例如美国专利第7,344,715号和第7,556,803号，其中的每一个通过引用以其全文结合在此。)另外，如本文所用的术语“κMab”用于涵盖含有SEQ ID NO:3-8的CDR序列和/或SEQ ID NO:2的轻链序列和SEQ ID NO:1的重链序列的任何多肽。如本文所用的术语“κMab”可以涵盖含有SEQ ID NO:21的VL序列和SEQ ID NO:22的VH序列的任何多肽。在本发明的组合物和方法中，κMab可以包括完整单克隆抗体或包括Fab和scFv的其任何抗原结合片段。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”定义为免疫细胞受体(例如T细胞受体、B细胞受体/免疫球蛋白)识别的分子。在一些实施例中，抗原是引发免疫反应的分子。这种免疫反应可以涉及抗体制造，或特定免疫胜任细胞的活化、细胞毒性介体或免疫刺激或调节细胞因子的释放。所属领域的技术人员将理解包括实际上全部蛋白质或肽的任何大分子可以用作抗原。
如本文所用，如结合抗体、抗体片段或CAR使用的术语“特异性结合”或“特异性识别”指的是识别特异性抗原但不大体上识别或结合样品中的其它分子的抗体、抗体片段或CAR。
“核糖体跳跃”意思是特异性肽防止细胞的核糖体共价连接新插入氨基酸并且反而允许其继续转译因此导致聚合蛋白质共转译裂解的替代转译机制。这一过程由“2A核糖体跳跃”元件或顺式作用水解酶元件(例如CHYSEL序列)诱发。在一些实施例中，这一序列包含具有强α-螺旋倾向的非保守氨基酸序列，后面是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。G和P之间发生明显裂解。在一些实施例中，核糖体跳跃元件是2A核糖体跳跃元件。2A核糖体跳跃元件可以是5'T2A核糖体跳跃元件。
如本文所用，“免疫调节药物”或“IMiD”是一类构成撒利多胺和其类似物的药物。撒利多胺类似物包括来那度胺、泊马度胺和阿普司特。
如本文所用，术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”或“HDI”指的是干扰组蛋白脱乙酰基酶功能的一类化合物。HDI的实例包括(但不限于)肟酸，包括例如曲古抑菌素A(trichostatin A)、伏立诺他(vorinostat，SAHA)、贝林诺他(belinostat，PXD101)、LAQ824、帕比司他(panobinostat，LBH589)；环状三肽，包括例如缩酚酸肽和塔普辛B(tapoxin B)；苯甲酰胺，包含例如恩替诺特(entinostat，MS-275)、CI994以及莫塞诺他(mocetinostat，MGCD0103)；亲电子酮；以及脂肪族化合物，例如苯丁酸酯和丙戊酸。
κ骨髓瘤抗原和抗体
κ骨髓瘤抗原或KMA是骨髓瘤细胞的表面上存在的细胞膜抗原。具体来说，KMA由与细胞膜上的肌动蛋白非共价关联表达的游离κ轻链组成(葛德奈(Goodnow)等人.(1985)《免疫学杂志(J.Immunol.)》135:1276)。尽管可以根据本发明使用特异性结合到KMA的任何抗体，在一个优选实施例中，κMab单克隆抗体将用作本发明的CAR的胞外抗原结合结构域的基础。命名为κMab的单克隆抗体(正式命名为IST-1097，也称为MDX-1097)结合于人类κ游离轻链的开关区中的构形抗原决定基，其仅在κ链不与含有IgG、IgM、IgE或IgA的重链关联并且因此不结合于完整κ链时可用(哈金森(Hutchinson)等人.(2011)《分子免疫学(Mol.Immunol.)》)。来源于患者骨髓生物检体的原发性骨髓瘤细胞上KMA的典型表达由图3中的κMab结合显示。κMab抗体可以包含SEQ ID NO:1的VH链和SEQ ID NO:2的VL链。更具体来说，κMab VH链可以包含SEQ ID NO:3-5的CDR和SEQ ID NO:6-8的VL CDR。另外，κMab可以包含SEQ ID NO:22的VH区和SEQ ID NO:21的VL区。
嵌合性抗原受体
嵌合性抗原受体(CAR)是由经一系列连接子和间隔子保持在一起的单个多肽链中的单克隆抗体的肿瘤抗原结合区和T细胞受体复合物的胞内活化部分组成的人造受体(图1A-1B)。最通常，CAR是融合到CD3ζ跨膜结构域的单链可变片段(ScFv)的融合蛋白。然而，如CD28、41-BB和Ox40的其它胞内信号传导结构域可以多种组合用于产生所需胞内信号。在一些实施例中，本文提供的CAR包含Ig重链前导肽。前导肽可以是SEQ ID NO:20。
I.胞外抗原结合结构域
在一个实施例中，本发明的CAR包含来自对MM细胞上表达的一个或多个KMA表位具有特异性的单克隆抗体的胞外抗原结合结构域。在一个实施例中，本发明的CAR包含来自κMab的胞外抗原结合结构域。在一个实施例中，胞外结合结构域包含SEQ ID NO:6-8的VLCDR和SEQ ID NO:3-5的VH CDR。在一个具体实施例中，胞外结合结构域是包含κMab的VL(SEQ ID NO:2)和VH(SEQ ID NO:1)结构域的scFv。在另一实施例中，胞外结合结构域是包含κMab的VL(SEQ ID NO:21)和VH(SEQ ID NO:22)结构域的scFv。
II.介于κMab scFv的VL和VH结构域之间的连接子
在另一实施例中，κMab VL经柔性连接子连接到κMab VH。具体来说，柔性连接子是约10-30个氨基酸(例如30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸)的甘氨酸/丝氨酸连接子并且包含结构(Gly4Ser)3。在一个具体实施例中，连接子的长度是15个氨基酸。连接子长度是CAR的重要决定因素。不受理论束缚，较短连接子可以提高亲和力但还可以导致胞内多聚体形成，因此削弱CAR的表达，而较长连接子倾向于通过使VL和VH CDR空间上变远而降低抗原亲和力。
III.胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域之间的间隔子
胞外抗原结合结构域(例如κMab scFv)通过使用“间隔子”连接到胞内信号传导结构域。间隔子设计成足够柔性以允许用促进抗原识别和结合的方式定向抗原结合结构域。间隔子可以来源于免疫球蛋白本身并且可以包括IgG的IgG1铰链区或CH2和/或CH3区域。或者，铰链可以包含全部或部分CD8α链。间隔子的长度和柔性取决于抗原识别域以及胞内结合区，以及对于一个CAR构筑体有作用和/或最优而对另一CAR并非如此的要素。在某种情形中，间隔子在本文中可以命名为“opti”(参看图6A-6C)以象征最优间隔子身份和长度视所用的胞外结合部分和所选的胞内信号传导结构域而变化。在某一实施例中，使用单独的IgG铰链。在其它实施例中，IgG铰链与全部或部分IgG CH2结构域一起使用。在其它实施例中，IgG铰链与全部或部分IgG CH3结构域一起使用。在其它实施例中，IgG铰链与IgG CH2和CH3结构域的全部或部分一起使用。在其它实施例中，使用全部或部分IgG CH2结构域。在其它实施例中，使用全部或部分IgG CH3结构域。在其它实施例中，使用IgG CH2和CH3结构域的全部或部分。在一个实施例中，本文提供的任何构筑体中所用的铰链CH2和CH3结构域包含Uniprot P01857的氨基酸位置103处铰链区中的C到P突变。在一个实施例中，本文提供的任何构筑体中所用的铰链CH2和CH3结构域是SEQ ID NO:24。在另一实施例中，铰链与IgG CH2和CH3结构域的全部或部分一起使用，其中在对CH2与Fc受体相互作用重要的氨基酸处引入突变。这些突变可以通过降低Fc与本文提供的CAR T细胞的相互作用介导改良的输注后存活率。这些突变的实例可见于如本文所提供的实例3中所示的KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz构筑体中。在另一实施例中，使用CD8α多肽。在另一实施例中，间隔子(例如来源于如本文所述的免疫球蛋白结构域)可以经柔性连接子附接到scFV。具体来说，柔性连接子是约10-30个氨基酸(例如30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸)的甘氨酸/丝氨酸连接子并且包含结构(Gly4Ser)3，其中X是1-5。在其它实施例中，甘氨酸/丝氨酸连接子包含(Gly4Ser)3。
IV.胞内信号传导结构域
胞内信号传导结构域包含全部或部分CD3ζ链。CD3ζ也称为CD247，与CD4或CD8T细胞辅助受体中的任一个一起负责将胞外抗原识别偶合到胞内信号级联。在一个实施例中，本文提供的任何构筑体中所用的CD3ζ是SEQ ID NO:26。
除了包括CD3ζ信号传导结构域之外，包括共刺激分子已经显示提高鼠类模型和临床试验中的CAR T细胞活性。已经对几种进行了研究，包括CD28、4-1BB、ICOS、CD27、CD270、CD30和OX-40。除了包括κMab scFv、柔性连接子、最优铰链和CD3ζ链之外，本发明的CAR还包括来自例如CD28、4-1BB、ICOS、CD27、CD270、CD30和/或OX-40的一种或多种额外共刺激结构域。这些共刺激结构域基于所得CAR T细胞的所要功能性选择。示范性组合显示于例如图6A-6C中。除了改变胞外铰链的长度之外，包括共刺激结构域(例如CD28、OX-40、4-1BB)的特定组合还提高CAR T细胞的体内增殖和存活率。在一个实施例中，本文提供的任何构筑体中所用的CD28结构域是SEQ ID NO:25。
生物活性分子的共表达
本发明的CAR T细胞与使用单独κMAb相比具有额外益处，进一步可修饰以含有额外生物活性分子来提高组合物的抗肿瘤功能和/或安全性。在一个实施例中，CAR T细胞可以进一步经遗传修饰产生抗肿瘤细胞因子，其允许集中传递到肿瘤微环境/癌细胞，同时避免全身性毒性。可以提高本发明的CART细胞的抗肿瘤反应的额外生物活性分子的实例包括但不限于IL-12、碳水化合物结合蛋白半乳糖凝集素-3(GAL3)或其截短形式、GAL3C以及细胞因子受体超拮抗剂SANT7。在另一实施例中，本发明的CAR T细胞还可以用表达肝细胞生长因子(HGF)结合蛋白的质体共同转导。在一个实施例中，肝细胞生长因子蛋白质是能够结合和抑制HGF功能的抗体或其片段。
IL-12是一种强效肿瘤抑制剂细胞因子，降低肿瘤生长和血管生成并且提高肿瘤特异性免疫反应。多发性骨髓瘤细胞保留IL-12受体的表达并且向骨髓瘤荷瘤小鼠给予作为单个药剂的IL-12会降低肿瘤进展并且与蛋白酶体抑制剂硼替佐米协同作用(艾洛狄(Airoldi)等人,(2008)《血液(Blood)》,112(3):750-759；王(Wang)等人,(2014)《抗癌药物(Anticancer Drugs)》,25(3):282-288)。CAR T细胞表达IL-12显著提高其根除实体肿瘤的能力，但这种方法尚未在多发性骨髓瘤中进行研究(佩格勒姆(Pegram),(2012)《血液(Blood)》,119(180:4133-4141和张(Zhang)等人,(2011)《分子疗法(Mol.Ther.)》19(4):751-759)。
SANT7是细胞因子受体超拮抗剂。IL-6的类似物已经遗传修饰使其与IL-6受体α子单元的结合提高70倍，实际上不与gp130信号传导子单元相互作用。SANT7体外诱发IL-6相关性骨髓瘤细胞株的细胞凋亡，体外和在鼠类模型中并且与NFκB抑制剂组合克服对地塞米松的基质介导的耐受性，完全克服对细胞凋亡的耐受性。IL-6是在多种肿瘤的生长和存活中起作用的细胞因子，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、结肠直肠癌、乳癌等。IL-6与其受体结合活化JAK-STAT路径，STAT3的随后磷酸化调节如BCL-XL和p53的细胞凋亡相关基因的表达，引起对细胞凋亡的耐受性。IL-6还有助于下调骨髓瘤细胞上的IL-12受体，降低IL-12的肿瘤抑制特性。(艾洛狄(Airoldi)等人,(2008)《血液(Blood)》,112(3):750-759)。骨髓瘤中的IL-6受体上调并且IL-6的全身水平升高与较差的预后有关。(罗斯特洛恩(Rawstron)等人,(2000)《血液(Blood)》96(12)3880-3886；路德维格(Ludwig)等人,(1991)《血液(Blood)》,77(12):2794-2795)。已经针对临床用途开发了IL-6的单克隆抗体，然而，尽管骨髓瘤中的早期临床试验显示可测量的生物学作用，但抗体看起来与循环IL-6形成络合物，导致清除率降低并且潜在地限制其功效。(巴塔耶(Bataille)等人,(1995)《血液(Blood)》,86(2):685-691)。最近，嵌合IL-6特异性单克隆抗体思图昔单抗(Siltuximab)已经在复发和难治愈性多发性骨髓瘤中在I期和II期临床试验中评定。对单独思图昔单抗无反应，但血液学毒性是常见的，其中有一半经历疗法相关感染。
半乳糖凝集素-3是可以在肿瘤粘连和侵犯中起作用的碳水化合物结合蛋白。截短形式的半乳糖凝集素-3Gal3C用作显性阴性形式并且可以抑制骨髓瘤细胞生长和侵犯。活化诱发型分泌的Gal3C构筑体基于约翰(John)等人,(2003)《临床癌症研究(Clin CancerRes.)》,9(6):2374-83和米兰多拉(Mirandola)等人.(2011)《公共科学图书馆·综合(PLoSOne)》,6(7):e21811设计。这由143个氨基酸羧基末端组成，这保留其碳水化合物结合特性，但缺乏配位体交联所需的N末端氨基酸。构筑体还含有引导分泌的CD8-α前导肽和用于检测的6xHis标签。
在某些实施例中，除了含有上文所述的CAR构筑体的表达载体之外，T细胞用包含IL-12、SANT7和/或GAL3C的一种或多种表达载体进一步修饰。具体来说，表达单链IL-12并且包含连接到IL-12p40子单元的IL-12p35子单元的表达构筑体尤其适用，因为所得蛋白质是完全生物活性IL-12p70杂二聚体，然而，表达成单个多肽。在一个实施例中，使用称为Flexi-12的单链IL-12构筑体，其描述于例如安德森(Anderson)等人,(1997)《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》8(9):1125-35中。IL-12单链构筑体可以在相同表达载体中表达成CAR构筑体或其可以在单独表达载体中表达并且共转导到T细胞中。类似地，用上文所述的CAR构筑体转导的T细胞可以用包含SANT7和/或GAL3C的额外表达载体共转导，或者，一个表达载体可以用于用单独或与上文所述的CAR构筑体组合的SANT7和GAL3C两个来转导T细胞。在另一实施例中，可以使用三个表达载体，一个表达CAR构筑体，一个表达单链IL-12构筑体并且一个表达SANT7构筑体。一种类似策略可以用于共表达GAL3C与IL-12和/或SANT7。或者，IL-12、GAL3C和/或SANT7构筑体可以经单个表达载体表达，而CAR构筑体经其自身的表达载体表达。所属领域的技术人员应了解在相同T细胞中表达这些分子的不同组合和可能性。
HGF结合蛋白
肝细胞生长因子(HGF)和其受体MET已经牵涉于癌症产生和进展中，具体来说牵涉于肿瘤侵犯和进展成转移性疾病中。多发性骨髓瘤细胞表达HGF和MET两个，因此形成自分泌和旁分泌回路，而正常浆细胞不表达HGF(詹(Zhan)等人,(2002)；博赛特(Borset)等人,(1996)。另外，HGF浓度在多发性骨髓瘤患者的血液血浆和骨髓中显著增加且高血清HGF水平与晚期疾病和大规模骨骼损伤有关(赛德尔(Seidel)等人.(1998)；瓦德尔(Wader)等人,(2008)；亚历山大基斯(Alexandrakis)等人,(2003)。另外，使用κMab的I期试验中患者的血清生物标记物分析显示用κMab治疗之后与对照组相比统计学上显著的血清HGF中剂量相关降低。为了提高血清HGF中的这一降低，在某些实施例中，HGF结合蛋白将在本发明的CAR T细胞中表达。在一个具体实施例中，表达的HGF结合蛋白是抗体或其片段。在一个具体实施例中，抗HGF结合蛋白是抗体、双功能抗体、scFv或Fab。在一个实施例中，HGF结合蛋白与CAR构筑体在相同表达载体中表达。在另一实施例中，HGF结合蛋白在单独表达载体中表达，但与CAR构筑体共转导。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白和IL-12。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白和SANT7。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白和GAL3C。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白和IL-12和GAL3C。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白和SANT7和GAL3C。在另一实施例中，CAR-T细胞表达CAR、抗HGF结合蛋白、IL-12和SANT7。在另一个实施例中，CAR-T细胞表达CAR、HGF结合蛋白、IL-12、SANT7和GAL3C。
制造本发明的CAR
T细胞的方法
一方面，提供产生CAR T细胞的方法，所述细胞表达本文所述的CAR和任选地一种或多种抗肿瘤细胞因子(例如IL-12和/或SANT7)和/或一种或多种HGF结合蛋白。所属领域的技术人员将容易理解尽管本文中描述了建构含有本发明的CAR和抗肿瘤细胞因子/抗体的表达载体的优选方法，但可以使用能够转导T细胞以表达这些组分的任何方法。
在一个实施例中，通过静脉穿孔、抽吸骨髓、稳态白细胞去除术或细胞因子预致敏白细胞去除术并且随后使用密度梯度分离来分离包括T细胞的周边血液单核细胞，从受试者的血液获得T细胞。在某些实施例中，在溶解红细胞之后，通过流式细胞测量术分选T细胞并且使用在T细胞上表达的抗原的抗体和磁珠纯化获得纯T细胞群体。在一个具体实施例中，基于T细胞的CD3表达分选T细胞获得完全T细胞部分。在另一实施例中，基于T细胞的CD4或CD8表达分选T细胞获得CD4+T细胞或CD8+T细胞群体。在一个具体实施例中，从需要CAR T细胞疗法的受试者获得T细胞。在另一实施例中，从并非CAR T细胞疗法的目标接收者的供体受试者获得T细胞。
在一个实施例中，分离的T细胞在适于其存活的条件下体内培养并且用含有表达本文所述的的CAR和/或IL-12、SANT7、GAL3C和/或HGF结合蛋白必需的序列的表达载体转导。在一个实施例中，表达载体是转座载体表达系统。在一个具体实施例中，表达载体是PiggyBac转座子表达质粒或病毒载体(例如反转录病毒载体或慢病毒载体)。在一个实施例中，PiggyBac转座子表达质粒是诱导型的，如本文提供的实例中所述的PiggyBac转座子质体。在一个实施例中，PiggyBac转座子表达质粒包含组成性活性启动子和/或活化诱导型启动子。组成性活性启动子可以是延伸因子1α(EF1α)启动子。活化诱导型启动子可以是(NFATpro)启动子。一方面，使用PiggyBac表达质粒并且通过将CAR、IL-12、SANT-7、GAL3C和/或HGF结合蛋白编码序列剪切和粘合到T细胞的基因组中来产生CAR的永久性整合。在一个具体实施例中，本发明的表达载体另外包含允许鉴别已经用一种或多种表达载体成功转导的T细胞的可检测标记物。在一个实施例中，可检测标记物选自由以下组成的组：细胞表面标记物，如CD34或CD20或另一表面蛋白质，荧光团，如异硫氰酸荧光素或当包括通过激光激发到较高能态时发射光的任何其它荧光染料，以及抗生素耐药性卡匣，如卡那霉素耐药性、安比西林耐药性或赋予针对打算培养经转导的T细胞的培养基中所含的抗生素物质的耐药性的任何其它卡匣。在一个实施例中，可检测标记物是绿色荧光蛋白质(GFP)。GFP可以是增强的GFP，如本文提供的实例中所示的构筑体。在一个具体实施例中，所用的各表达载体(例如包含CAR的一个表达载体，和包含IL-12、GAL3C和/或SANT-7的一个表达载体以及包含HGF结合蛋白的一个表达载体)包含独特可检测标记物。在一个实施例中，通过适于所选表达载体的方法将表达载体转导到T细胞中。在一个实施例中，PiggyBac表达载体通过电穿孔转导到T细胞中。
引入适当表达载体之后，可以通过与自体性周边血液单核细胞(PBMC)和适当生长因子共培养来体外培养和扩展T细胞并且针对一种或多种可检测标记的存在进一步筛选。表达所选表达载体的适当可检测标记的T细胞可以接着分选和纯化用于本发明的方法中。
治疗KMA-表达恶性病的方法
一方面，提供用本文提供的CAR T细胞治疗有需要的受试者的方法。在一个特定方面，有需要的受试者是已经诊断患有或疑似患有表达KMA的恶性病，例如表达KMA的B细胞恶性病的人类受试者。在某些实施例中，患者患有或疑似患有多发性骨髓瘤(MM)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或淀粉样变性。诊断表达KMA的B细胞恶性病，例如多发性骨髓瘤(MM)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)以及淀粉样变性的方法在所属领域中已知，并且因此在本文中不加以详细描述。CAR T细胞可以单独或与其它治疗有效试剂组合用于治疗多发性骨髓瘤(MM)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、淀粉样变性或另一表达KMA的B细胞恶性病。在某些方面，本发明的CAR T细胞在适于静脉内传递的药物调配物中给予。
在某些方面，本发明的CAR T细胞在一种或多种免疫调节药物之前、期间或之后给予。在一个特定方面，一种或多种免疫调节药物是撒利多胺或撒利多胺类似物，如来那度胺或泊马度胺。
在本发明的某些方面，本发明的CAR T细胞在与一种或多种免疫调节药物一起给予时协同作用。
在另一实施例中，本发明的CAR T细胞在用一种或多种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂治疗之前、期间或之后给予，所述抑制剂如帕比司他、伏立诺他、曲古抑菌素A、缩酚酸肽、苯丁酸酯、丙戊酸、贝林诺他、LAQ824、恩替诺特、CI944或莫塞诺他。
在本发明的某些方面，本发明的CAR T细胞在与一种或多种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂组合投予时协同作用。
在本发明的某些方面，本发明的CAR T细胞在与中等剂量或大剂量化学疗法组合投予时或在给予自体性或同种异体人类血液干细胞之后协同作用。
在一个实施例中，本发明的CAR T细胞在同种异体干细胞移植之前、期间或之后给予。在另一实施例中，本发明的CAR T细胞在同种异体干细胞移植之前、期间或之后给予。不受理论束缚，本发明的CAR T细胞在与自体性或同种异体干细胞移植组合投予时防止出现微小残留疾病，所述疾病可能通过在干细胞移植之前没有完全消融骨髓或通过再度出现表达KMA的恶性B细胞克隆株而发生。
所引用的所有专利、专利申请和公开案都出于所有目的以全文引用的方式明确并入本文中。
实例
参考以下实验实例来进一步详细描述本发明。除非另外说明，否则提供这些实例仅出于说明的目的并且不打算进行限制。因此，本发明决不应以任何方式解释为限于以下实例，而是应解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得显而易知的任何和所有变化形式。
无需进一步描述，相信所属领域的普通技术人员可以使用前述描述和以下实例制造和利用本发明的化合物且实践所要求的方法。因此，以下工作实例专门指出本发明的优选实施例并且不打算解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实例1：产生KMA.CAR-28z
基于编码κMab的可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:9和10)，scFv设计和克隆至含有免疫球蛋白重链铰链、CD28共刺激结构域和CD3-ζ胞内域的CAR构筑体中(图6A)。使用Haemalogix Pty Ltd提供的抗体可变区的基因序列在Clone Manage 9(Sci-Ed软件)中设计构筑体。这一构筑体的5'到3'部分的氨基酸序列(即KM.CAR-hCH2CH3-28z；图6A)如下：
Ig重链前导肽(Uniprot P01764)是MEFGLSWLFLVAILKGVQCSR(SEQ ID NO:20)。
κMab抗体轻链可变区是
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:21)。
重链可变区是
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATIIADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVYHDYDGDYWGQGTTLTVSSYVTVSS(SEQ ID NO:22)。
(G4S)3柔性连接子是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。
在氨基酸位置103(Uniprot P01857)处的铰链区中具有C>P突变的IgG1恒定区的铰链CH2和CH3结构域是
YVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK(SEQ ID NO:24)。
CD28的跨膜和胞内结构域(Uniprot P10747)是
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:25)。
人类CD3ζ的胞内结构域(Uniprot P20693)是
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:26)。
如下全长氨基酸序列是
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATIIADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVYHDYDGDYWGQGTTLTVSSYVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:27)。
这种氨基酸序列(SEQ ID NO:27)由以下DNA序列编码：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCTACGTCACCGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:28)。
在这种构筑体的建构方面，由5'EcoRI限制酶位点、5'Kozak序列、前导肽、单链可变片段和并入AleI限制酶位点的IgG1恒定区的一部分组成的基因序列通过GeneArt(赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))合成，检验序列并且接着克隆到pIRII-CAR.CD19-28z PiggyBac转座子表达质粒中。接着通过与PiggyBac转座酶质体共同电穿孔将其引入到来自2个正常供体的供体T细胞中来介导稳定整合。PiggyBac转座子/转座酶系统通过将所关注基因剪切和粘合到目标细胞基因组中产生CAR的永久性整合。选择PiggyBac表达系统，因为其能够以反转录病毒载体的部分成本产生高水平的永久性基因修饰。然而，所属领域的技术人员应理解包括反转录病毒载体的其它表达系统也可以根据本发明使用。
表达T细胞的KM.CAR-hCH2CH3-28z根据我们的优化方案，通过与补充有介白素-15(IL-15)10ng/ml的自体性外周血液单核(PBMC)饲养细胞共培养来扩展。在用PBMC替代物以每周为基础培养3周并且每周补充IL-15两次到三次之后，采集T细胞并且通过流式细胞测量术评定表现型和CAR表达、在用KMA+和KMA-细胞株刺激时通过干扰素γ胞内细胞因子流式细胞测量术评定KMA特异性功能(图4A)并且通过铬释放分析法评定相同细胞株的细胞毒性。
在3周结束时，培养物主要是CAR表达CD3+T细胞(55％和70％活细胞)、回应于KMA+骨髓瘤和B细胞株表达干扰素γ(图4B)并且证实KMA-特异性细胞毒性(图4C)。
实例2：建立人类骨髓瘤异种移植鼠类模型.
建立人类骨髓瘤到多发性骨髓瘤小鼠异种移植模型。将RPMI8226或替代骨髓瘤细胞株静脉内接种到Rag2-/-γc-/-(BALB/c)小鼠中，形成Rag MM模型(图5A-5D)。Rag2-/-γc-/-(BALB/c)小鼠不具有小鼠淋巴细胞(T、B和NK细胞)并且接收用于人类异种移植研究的主体。这种模型已经成功用于测试新颖疗法，如硼替佐米与新颖抗体的组合(图5E)。我们将使用这种MM模型来测试并且进一步优化KMA.CAR T细胞。
实例3：优化的KMA.CAR构筑体
基于实例1中所述的构筑体，建构6个CAR构筑体，其含有实例1中所述的具有可变长度间隔区的KM scFv和具有CD3ζ胞内域的共刺激胞内域(例如CD28或4-1BB(CD137-Uniport Q07011))(图2和图6)。间隔子长度变化会改变T细胞和目标细胞之间的距离，较短的间隔子潜在地提高目标细胞溶解。在所有构筑体中，使用CD28跨膜结构域确保KMA.CAR的稳定T细胞表面表达。在使用IgG1重链恒定区的组分作为间隔子的所有情况中，在scFv与间隔区之间放置第二(G4S)3柔性连接子。这些CAR由金斯瑞(genscript)商业合成并且克隆到pVAX1PB PiggyBac转座子质体中用于进一步测试。
6个KM.CAR构筑体中的3个含有aCD28共刺激胞内域并且如下：
这个组的第一构筑体是KM.CAR_hCH3_28z构筑体，其仅含有IgG1重链恒定区的铰链和CH3结构域作为间隔子并且其核酸序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGT TCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCA GGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGC CGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATA AGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCA GGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:29)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:29)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S)3连接 子、κMab重链可变区、第二(G4S)3连接子、IgG1铰链和CH3恒定区结构域、CD28跨膜和胞内结构域，以及CD3ζ胞内结构域。图6B中显示这种构筑体的简图。
这一组的第二构筑体是KM.CAR_h_28z构筑体，其仅含有IgG1重链恒定区的铰链结构域作为间隔子，并且其核酸序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGT TCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCT ATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGG GGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCA CCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:30)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:30)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S)3连接 子、κMab重链可变区、第二(G4S)3连接子、IgG1铰链恒定区结构域、CD28跨膜和胞内结构域，以及CD3ζ胞内结构域。图6B中显示这种构筑体的简图。
这个组的第三构筑体是KM.CAR_CD8a_28z构筑体，其含有CD8α柄(UniprotP01732，氨基酸138-182)作为间隔子，并且其核序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACC ATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGA AGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACG AAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAAC CCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCG AGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCT TCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:31)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:31)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S) 3连接 子、κMab重链可变区、CD8α柄、CD28跨膜和胞内结构域，以及CD3ζ胞内结构域。
这个实例中描述的6个KM.CAR构筑体的其余3个构筑体含有4-1BB(CD137)共刺激胞内域并且如下：
这个组的第一构筑体是KM.CAR_h_28TM_41BBz，其仅含有IgG1重链恒定区的铰链结构域作为间隔子并且用4-1BB共刺激分子的胞内结构域置换CD28的胞内结构域，并且其核酸序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGT TCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATT CAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAA GAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGC TCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGAT GGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCC TACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAG CCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:32)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:32)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S)3连接子、κMab重链可变区、第二(G4S)3连接子、IgG铰链恒定区结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域以及CD3ζ胞内结构域。
这个组的第二构筑体是KM.CAR_8a_28TM_41BBz，其含有CD8α柄(Uniprot P01732，氨基酸138-182)作为间隔子并且用4-1BB共刺激分子的胞内结构域置换CD28的胞内结构域，并且其核序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACC ATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCA GTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAG TGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGG ACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAG GCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:33)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:33)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S)3连接 子、κMab重链可变区、CD8α柄、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域以及CD3ζ胞内结构域。
这个组的第三构筑体是KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz，其含有IgG1重链恒定区的铰链、CH2和CH3结构域作为间隔子，在对与Fc-受体(3-6)进行CH2相互作用重要的氨基酸处引入，这可以通过清除网状内皮系统中的CAR T细胞来介导体内降低的CAR T细胞存活率(3、6、7)。核酸序列如下：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGT TCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCAGTCGCGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAACGT GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACA AACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAG TTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAA GAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCC TCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAG CGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTC ACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:34)。
从5'到3'，这个构筑体(SEQ ID NO:34)具有前导肽、κMab轻链可变区、(G4S)3连接 子、κMab重链可变区、第二(G4S)3连接子、突变IgG1铰链、CH2和CH3恒定区结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域以及CD3ζ胞内结构域。突变IgG1铰链结构域从5'到3'具有E233P、L234V、L235A、G236-、S254A、D265N以及N297A突变，在这个构筑体(SEQ ID NO:34)的阴影框内突出显示。这些位点(E233P、L234V、L235A、G236-、S254A、D265N、N297A)处的突变可以降低与CAR T细胞的Fc相互作用，使输注后存活率提高。
向KM.CAR添加2A核糖体跳跃元件和eGFP
为了容易检测上文所述的CAR中的每一个的T细胞表达，使用CAR-CD3ζ胞内域和质体主链合成具有5'T2A核糖体跳跃元件并且具有重叠序列的eGFP。接着通过限制酶消化和接合到含有pVAX1 PB转座子质体的CAR中对其进行克隆，形成以下-
含有28z内功能域_2A_GFP的构筑体：
1.pVAX1PB KM.CAR_hCH2CH3_28z_2A_GFP
2.pVAX1PB KM.CAR_hCH3_28z_2A_GFP
3.pVAX1PB KM.CAR_h_28z_2A_GFP
4.pVAX1PB KM.CAR_8a_28z_2A_GFP
含有41BBz内功能域_2A_GFP的构筑体：
1.pVAX1PB KM.CAR_h_28TM_41BBz_2A_GFP
2.pVAX1PB KM.CAR_8a_28TM_41BBz_2A_GFP
3.pVAX1PB KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz_2A_GFP
产生具有4-1BB共刺激域的KM.CAR
T细胞
对初级KM.CAR_hCH2CH3_28z和含有4-1BB的CAR进行比较。使用如本文和所属领域中先前描述的PiggyBac系统(2)通过电穿孔产生KM.CAR T细胞。在5μg PiggyBac转座酶和PiggyBac转座子质体中的每一个存在下，将来自健康供体的四百万周边血液单核细胞(PBMC)在2400V下用氖气电穿孔系统电穿孔20ms，单次脉冲。测试的KMA.CAR构筑体包括KM.CAR_hCH2CH3_28z_2A_GFP；KM.CAR_h_28TM_41BBz_2A_GFP；KM.CAR_8a_28TM_41BBz_2A_GFP；或KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz_2A_GFP。
将电穿孔PBMC(CAR-PBMC)在具有10胎牛血清的AIMV(AIM-V CM)中静置过夜，采集，洗涤并且以1×106个/ml再悬浮于AIM-V CM中。在具有或不具有经照射的KMA表达JJN3细胞的情况下，在5:1的CAR-PBMC:JJN3比率下，将CAR-PBMC与自体性经照射的PBMC饲养细胞一起共同培养。每3天添加10ng/ml介白素-15(IL-15)。通过锥虫蓝排除列举细胞并且每7天添加新鲜照射的刺激/饲养细胞。
评定KM.CAR表达
在培养开始(第1天)、第15天和第21天通过流式细胞测量术评定KM.CAR表达(图8A-8B)。KM.CAR T细胞培养物用抗人类CD3抗体表面染色并且通过GFP表达评定CAR表达。
KM.CAR
T细胞需要κ骨髓瘤抗原来体外保持
含有KMA表达JJN3细胞株的培养物与具有单独PBMC的培养物相比显示更大的总扩增、提高的KM.CAR表达或它们两个(图8A-8B)。与IgG恒定区-CH2结构域和Fc受体的已知相互作用相符，KM.CAR_hCH2CH3_28z表达T细胞在单独PBMC存在下增浓(28％CD3+T细胞)，但添加JJN3细胞显示更大的扩增和增浓(38％CAR表达的15倍扩增相比于29％CAR表达的6倍扩增)。
使用单独PBMC的KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz表达T细胞与使用JJN3共培养(26％CAR表达和17倍扩增)相比仅显示低水平的CAR表达(6％)和扩增(6倍)。含有仅IgG1铰链间隔子的KM.CAR T细胞具有类似扩增(具有JJN3，5倍；不具有JJN3，6倍)，但CAR表达提高(具有JJN3，17％；不具有JJN3，9％)。仅含有CD8α链间隔子的KM.CAR T细胞在JJN3细胞存在下不显示任何增强的扩增或增浓(在JJN3存在下8倍扩增和5％CAR表达相比于不具有JJN3时5倍扩增和5％CAR表达)。
KM.CAR
T细胞的功能评定
使用本文先前所述的方案(2)，使用KMA+和KMA-细胞株，通过胞内细胞因子流式细胞测量术和标准铬释放分析法评定KMA特异性干扰素-γ产量和KM.CAR T细胞的细胞毒性。所用的KMA阳性细胞株包括JJN3、Pfeiffer、NCI-H929。KMA阴性细胞株包括Nalm-6和Molt(图12A-12B)。
对于细胞因子流式细胞测量术，2×105个KM.CAR T细胞用目标细胞以1:1比率刺激5小时。在1小时之后添加莫能菌素(2μM)(BD Biosciences)和布雷菲德菌素A(BrefeldinA)(1μM)(BD Biosciences)。CAR T细胞用50ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA:Sigma-Aldrich)和1μg/ml伊屋诺霉素(Sigma-Aldrich)非特异性活化并且未经刺激的细胞用作阳性对照和阴性对照。接着采集CAR T细胞，洗涤，针对CD3、CD4和CD8表面染色。将CAR T细胞固定并且用cytofix和perm/洗涤缓冲液(BD Biosciences)渗透，并且用抗干扰素γ抗体(BD Biosciences)染色，随后用perm/洗涤缓冲液进一步洗涤。染色的细胞使用FACSCantoTMII流式细胞仪用至少30,000事件的获取分析。
使用标准铬(51Cr)释放分析法评定KMA特异性细胞毒性。目标细胞用铬酸钠(Na2 51CrO4)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的派金-埃尔默(Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA))标记。KM.CAR T细胞用K562细胞株以1:1比率预培育来吸收NK细胞活性。将铬标记的目标细胞以40:1到1.25:1范围内的效应子:目标比率一式三份添加到KM.CAR T细胞并且在37℃，5％CO2下培育4小时。一式三份目标用10％十二烷基硫酸钠溶解来测定最大释放，并且使用一式三份不具有效应子的目标评定自发释放。抽吸上清液并且使用MicroBeta2板计数器(珀金埃尔默(PerkinElmer))读数。使用标准式-特异性溶解％＝(测试释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100]来计算特异性溶解百分比
实例4：使用活化诱导型启动子产生PiggyBac转座子质体
设计和克隆含有组成性活性启动子(EF1alpha)和活化诱导型启动子(NFATpro)的单个转座子卡匣。基于菲尔林(Fiering)等人(8)通过使用Clone Manage 9(Sci-Ed软件)设计NFATpro来制造活化诱导型基因表达卡匣。这包括经活化T细胞的核因子(NFAT-RE)-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(SEQ ID NO:35)，随后染色体4(NCBI参考序列：NG_016779.1)上存在的最小IL-2启动子-ACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTG(SEQ IDNO:36)结合的30个碱基对DNA序列(反应元件-RE)的6个拷贝。
为了实现活化诱导基因表达的检测，在NFATpro的3'放置增强的绿色荧光蛋白(eGFP)DNA序列随后牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号(9-11)。这一基因卡匣的DNA序列如下-
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTGTCCCATCGAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAG AAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGG CGTCAATTGTCCCGGGACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGAACTCCATGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTTGAAGAAAACCCCGGTCCTATTTAAATCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCC TTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGT AGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATG CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC(SEQ ID NO:37)。
从5'到3'，这一构筑体含有NFAT-RE、IL-2最小启动子、eGFP以及BGH多腺苷酸化信 号。
这种卡匣由金斯瑞(Genscript)商业合成并且克隆到5'cHS4隔离子(基因库：U78775.2)(12)与人类延伸因子1启动子之间的pVAX1PB转座子质体中。为了在初始实验中鉴别转导的T细胞，将由QBEnd10单克隆抗体识别的CD34的表位和CD20特异性单克隆抗体利妥昔单抗的模拟表位组成的嵌合RQR8标记物(13)克隆到转座子多克隆位点产生图9中所示的转座子基因插入物(pVAX1PB NFATGFP-RQR8质体)。含有pVAX1PB NFATGFP-RQR8转座子质体和pVAX1 PBase转座酶质体的活化诱导型基因卡匣的共电穿孔导致图9中可见的NFATGFP-RQR8基因插入物的永久性整合。
含有转座子的活化诱导型基因的功能的论证
为了证明来自实例4的pVAX1PB NFATGFP-RQR8转座子的功能(参看图9)，4×106个PBMC在5μg转座子和转座酶质体中的每一个存在下电穿孔。将电穿孔的细胞静置24小时，并且接着用50ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA：Sigma-Aldrich)和1μg/ml伊屋诺霉素(Sigma-Aldrich)非特异性刺激过夜并且与未经刺激的对照组进行比较。经转导的细胞通过针对RQR8标记物表达的QBEnd10染色鉴别并且在19小时评定活化诱导基因表达(eGFP)。在所述时间点，发现50％经转导的细胞表达eGFP(图10)。
实例5：KM.CAR控制的生物学疗法的设计
还建构含有IL-12和/或介白素-6受体拮抗剂SANT7并且还含有IL-12和/或SANT7的表达在活化诱导型启动子控制下(霍基伯格(Hooijberg)等人,2000)的优化的嵌合性抗原受体的表达质体。SANT-7序列由Prof Rocco Savino提供并且是基于使根据赛维诺(Savino)等人1994和思博伦诺(Sporeno)等人1996(14-17)提供的野生型IL-6基因序列(NCBI参考序列：NM_000600.4)突变。将序列引入到Clone Manage 9(Sci-Ed软件)并且添加6xHis标签来通过ELISA检测上清液。
SANT-7的核苷酸序列具有突出显示、加下划线的氨基酸取代并且列于下文中：
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEADAFWNLNLPKMAEKDGCFYKGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMRTKDLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLIRSLRALRAMHHHHHH(SEQ ID NO:38)。核苷酸取代对应于Y31D、G35F、L57D、E59F、N60W、Q75Y、S76K、S118R、V121D。所提供的序列还含有公开的序列中没有列出的Q211A取代。
对应于氨基酸序列(即SEQ ID NO:38)的DNA序列如下：
ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTACCCCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGCCACTCACGAGCTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGGACATCCTCGACTTTATCTCAGCCTTAAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAGAGCTCCAAAGAGGCAGACGCATTCTGGAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCTACAAAGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTCTCGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGCGCACAAAAGACCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGAGATCTTTTAAGGAGTTCCTGATCCGTAGCCTGAGGGCTCTTCGGGCTATGCATCATCACCATCACCACT(SEQ ID NO:39)。
类似于张(Zhang)等人和卿纳萨姆(Chinnasamy)等人(18，19)通过将IL-12p40和p35子单元(Uniprot P29459和P29460)与柔性(G4S)3连接子接合来设计单链介白素-12(Flexi-IL-12)构筑体，这允许使用表达成容易形成生物活性p70杂二聚体的单个肽链的两个子单元。合成Flexi-IL-12构筑体并且将含有IL-12和SANT7的构筑体克隆到本文所述并且图11中所示的活化诱导型转座子卡匣。
另外，可以合成Flexi-IL-12构筑体并且含有由2A核糖体跳跃元件分隔开的IL-12和SANT7的构筑体可以克隆到本文所述并且图7中所示的PiggyBac质体中。
Flexi-IL-12的氨基酸序列如下：
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:40)。
从5'到3'，Flexi-IL-12构筑体含有前导肽、IL-12p40子单元、(G4S) 3连接子和IL-12p35子单元。
对应于上文氨基酸序列(即SEQ ID NO:40)的DNA序列如下：
ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCC(SEQ ID NO:41)。
另外，还建构含有截短的显性阴性形式的半乳糖凝集素-3的表达质体GAL3C。构筑体含有引导分泌的CD8-α前导肽以及用于检测的6xHis标签。GAL3C的氨基酸序列在本文中列出：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRHHHHHHGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI(SEQ ID NO:42)
GAL 3C构筑体的相应DNA序列在本文中提供：
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGACATCATCACCATCACCACGGCGCCCCTGCTGGGCCACTGATTGTGCCTTATAACCTGCCTTTGCCTGGGGGAGTGGTGCCTCGCATGCTGATAACAATTCTGGGCACGGTGAAGCCCAATGCAAACAGAATTGCTTTAGATTTCCAAAGAGGGAATGATGTTGCCTTCCACTTTAACCCACGCTTCAATGAGAACAACAGGAGAGTCATTGTTTGCAATACAAAGCTGGATAATAACTGGGGAAGGGAAGAAAGACAGTCGGTTTTCCCATTTGAAAGTGGGAAACCATTCAAAATACAAGTACTGGTTGAACCTGACCACTTCAAGGTTGCAGTGAATGATGCTCACTTGTTGCAGTACAATCATCGGGTTAAAAAACTCAATGAAATCAGCAAACTGGGAATTTCTGGTGACATAGACCTCACCAGTGCTTCATATACCATGATA(SEQ ID NO:43)
CAR和‘生物学’转座子质体将核染产生表达单独IL-12、单独SANT7、单独GAL3C中任一个或IL-12和SANT7两个或IL12和GAL3C两个或SANT7和GAL3C两个或IL-12 SANT7和GAL3C全部三个的CAR T细胞。用‘生物学’构筑体成功转染的细胞可以通过可选标记物表达，例如通过流式细胞测量术来鉴别。IL-12、SANT7.和或GAL3C的含量将通过细胞因子流式细胞测量术细胞内测量并且在CAR T细胞培养物的上清液中通过ELISA使用商业试剂盒和试剂测量并且与表达单独CAR的对照T细胞比较。将通过如上所述的细胞因子流式细胞测量术和细胞毒性分析以及使用骨髓瘤细胞株评定肿瘤生长抑制的共培养分析法来评定CAR T细胞的功能。实验将一式三份地进行并且将选择2个鉴别为最优的CAR构筑体在具有和不具有IL-12、GAL3C和/或SANT7表达的鼠类模型中评定。
基于先前形成的RPMI-Rag人类骨髓瘤鼠类异种移植模型，将开发出RPMI-Rag-Luc(KMA-)和JJN3-Rag-Luc(KMA+)模型来体内评定我们的CAR T细胞的功能。JJN3和RPMI8226细胞将用Luc-1转染，接着静脉内接种到Rag2-/-γc-/-(BALB/c)小鼠中形成JJN3-Rag-Luc和RPMI-Rag-Luc MM模型。移植和疾病水平将通过在IP注射荧光素之后光学成像来监测并且与血清人类κ(JJN3)和λ(RPMI)轻链的水平相关联。用候选CAR T细胞接种的最优时间将使用光学成像在形成后肢麻痹之前确定，通常是第5周-第8周。6只JJN3-Rag-Luc和RPMI-Rag-Luc小鼠的组将用增加剂量的CAR T细胞(具有和不具有IL-12/SANT7表达)静脉内接种来确定以1×106个总细胞开始的治疗剂量。小鼠将在第0天、第+1天、第+3天、第+8天并且此后每周成像直到产生后肢麻痹、无血清轻链(SFLC)增加或其它公共机构的指导原则确定发生疾病进展。将收集骨髓和髓外肿瘤并且用组织学方法检验MM细胞和CAR T细胞的分布。将通过与对照组相比的成像反应和存活率来测定功效。
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Claims (17)
1.一种嵌合性抗原受体(CAR)，其包含一个或多个胞内信号传导结构域和胞外抗原结合结构域，其中所述胞外抗原结合结构域特异性结合κ骨髓瘤抗原(KMA)并且不结合与Ig重链关联的Igκ轻链，并且其中所述胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含来自κMab的VL链和VH链，其中所述VL链包含SEQ ID NO:21并且所述VH链包含SEQID NO:22，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激胞内域，其中所述一个或多个共刺激胞内域是CD28结构域、CD3ζ结构域、4-1BB结构域和OX-40结构域中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中来自κMab的所述VL链和VH链经甘氨酸-丝氨酸连接子附接，并且其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子是包含(Gly4Ser)3的15-20个氨基酸的连接子。
3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述scFv经间隔子附接到所述一个或多个胞内信号传导结构域，并且其中所述间隔子是免疫球蛋白恒定区或CD8α链。
4.根据权利要求3所述的CAR，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG铰链结构域、IgGCH2结构域和IgG CH3结构域中的一个或多个。
5.根据权利要求3所述的CAR，其中所述间隔子经甘氨酸-丝氨酸连接子附接到所述scFv，其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子是包含(Gly4Ser)3的15个氨基酸的连接子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包含跨膜结构域。
7.根据权利要求6所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。
8.一种经遗传修饰的T细胞，其经工程改造以表达根据权利要求1到7中任一项所述的CAR。
9.根据权利要求8所述的经遗传修饰的T细胞，其中所述经遗传修饰的T细胞进一步经工程改造以表达一种或多种额外生物分子。
10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的T细胞，其中所述经遗传修饰的T细胞进一步经工程改造以表达一种或多种额外生物分子，其包含IL-12、肝细胞生长因子(HGF)结合蛋白、半乳糖凝集素-3C(GAL3C)或SANT7中的一个或多个。
11.根据权利要求9所述的经遗传修饰的T细胞，其中所述一种或多种额外生物分子是IL-12并且所述IL-12由包含经柔性连接子接合的一个IL-12p35子单元和一个IL-12p40子单元的单链多肽表达。
12.一种用于制造权利要求8至11中任一项所述的经遗传修饰的T细胞的体外方法，所述方法包含向T细胞中引入表达载体，其中所述表达载体编码包含一个或多个胞内信号传导结构域和胞外抗原结合结构域的CAR，其中所述胞外抗原结合结构域特异性结合κ骨髓瘤抗原(KMA)并且不结合与免疫球蛋白(Ig)重链相关的Igκ轻链。
13.经工程改造以表达一个或多个胞内信号传导结构域和胞外抗原结合结构域的经遗传修饰的T细胞在制备用于治疗有需要的受试者中KMA表达恶性病的药物中的用途，其中所述胞外抗原结合结构域特异性结合κ骨髓瘤抗原(KMA)并且不结合与Ig重链关联的Igκ轻链，并且其中所述胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含来自κMab的VL链和VH链，其中所述VL链包含SEQ ID NO:21并且所述VH链包含SEQ ID NO:22，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激胞内域，其中所述一个或多个共刺激胞内域是CD28结构域、CD3ζ结构域、4-1BB结构域和OX-40结构域中的一个或多个。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述KMA表达恶性病是多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstroms macroglobulinemia)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或淀粉样变性。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其进一步包含给予一种或多种额外生物或药物活性剂，其中所述额外药物活性剂包含化学治疗剂、免疫调节药物或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂中的一种或多种。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物中经遗传修饰的T细胞来源于患者。
17.嵌合性抗原受体(CAR)，其包含一个或多个胞内信号传导结构域和胞外抗原结合结构域，其中所述胞外抗原结合结构域特异性结合κ骨髓瘤抗原(KMA)并且不结合与免疫球蛋白(Ig)重链关联的Igκ轻链，其中所述胞外抗原结合结构域包含特异性识别KMA的单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含来自κMab的VL链和VH链，其中所述VL链包含SEQ ID NO:21并且所述VH链包含SEQ ID NO:22，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包含4-1BB共刺激胞内域与CD3ζ共刺激胞内域，并且其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。
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