CN116745313A - 通过靶向整合ζ缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞 - Google Patents

通过靶向整合ζ缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于将CD3ζ缺陷型嵌合抗原受体(CAR)片段靶向并整合至宿主基因组的内源CD3ζ/CD247基因中的核酸构建体。本发明进一步涉及表达编码CD3ζ缺陷型CAR片段的外源核酸序列的基因修饰的人细胞，该外源核酸序列被框内整合至内源CD3ζ/CD247基因中用于基因融合，以形成包含与内源CD3ζ结构域融合的外源CAR片段的功能性CAR。

Description

通过靶向整合ζ缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞
技术领域
本发明涉及治疗性细胞产品的基因修饰领域。本发明涉及用于将CD3ζ缺陷型嵌合抗原受体(CAR)片段(转基因)靶向并整合至内源CD3ζ/CD247基因中用于产生基因融合的核酸构建体，并且因此涉及包含与内源CD3ζ结构域融合的外源CAR片段的功能性CAR。
本发明进一步涉及包含三个核酸序列区的所述构建体，其中第一核酸序列区编码嵌合抗原受体(CAR)片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，第二核酸序列区包含被配置用于将构建体整合在人细胞的内源CD3ζ基因处的靶向序列，以及编码和或包含在第一序列区上游的蛋白分离位点的第三核酸序列区。
在其他些方面，本发明涉及作为框内融合蛋白的CAR多肽，其包含外源CAR片段和具有一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的内源CD3ζ细胞内结构域。本发明进一步涉及基因修饰的人细胞，其表达CAR片段，没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，所述CAR片段被框内整合至内源CD3ζ/CD247基因中，以产生包含具有内源CD3ζ链的外源CAR片段的融合CAR。
本发明进一步涉及用于人疾病的治疗发明的药物组合物，其包含基因修饰的细胞和药学上可接受的载体。本发明进一步涉及在治疗和/或预防医学病症诸如与存在表达癌基因的致病细胞相关的病症中，或用于治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的相应医学用途和治疗方法。
背景技术
迄今为止，最有前景的抗癌免疫治疗策略是基因修饰的T淋巴细胞的过继细胞转移(ACT)。ACT有可能克服许多与基于疫苗的癌症治疗方法相关的缺陷，诸如在体内对肿瘤具有特异性的T细胞的从头激活和扩增，即使在免疫功能低下的患者中亦是如此。ACT使用基因修饰的细胞来识别肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，从而能够根除肿瘤和肿瘤干细胞，并提供治疗已形成的稳健形式的肿瘤的免疫疗法。与传统的化学疗法、放射疗法和手术疗法相比，这种方法有可能预防肿瘤复发。
癌症免疫治疗领域的主要障碍是打破对“自身”抗原的耐受性。根据靶标的类型，肿瘤特异性免疫应答针对“自身”或“外来”抗原。外来抗原可以在病毒诱发的癌症中产生，或可以通过特定肿瘤特有的遗传变异产生，诸如产生由T细胞和B细胞识别的表位的点突变或染色体重排。然而，针对肿瘤相关自体抗原的免疫应答受中枢或外周耐受机制的抑制。主要问题是胸腺消除高亲和力T细胞受体(TCR)，导致与主要的外来抗原相比，TCR对自体抗原的亲和力相对较低。
有许多克服癌症免疫疗法应用中的耐受性问题的方法。一种策略是使用嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行基因重定向和重编程。可以将编码抗原受体的基因引入患者的T细胞，然后这些T细胞迅速扩增，从而衍生出能够在体内稳健增殖和具有强大抗肿瘤活性的记忆和效应淋巴细胞。这些合成受体结合了T淋巴细胞的效应功能和抗体以非MHC限制方式识别具有高特异性的预定义表面抗原的能力。
迄今为止，这项技术在临床上最突出的实例是针对CD19阳性肿瘤的CAR-T细胞疗法。此处，患者的T细胞在洁净室实验室中在体外扩增，并通过逆转录/慢病毒基因转移配备有识别CD19的CAR构建体。输注至患者体内后，基因修饰的CAR-T细胞识别B细胞上和源自B细胞系的癌细胞上的CD19抗原。治疗相应淋巴瘤和白血病的临床成功已导致两种市售CAR-T细胞产品在美国和欧洲获得临床批准(Tisagenlecleucel(Kymriah)，Novartis和Axicabtagen-Ciloleucel(Yescarta)，Kite/Gilead)，其他产品正在进行中。
已知的CAR通常由细胞外抗原结合结构域组成，该结构域通过接头和跨膜结构域连接细胞内的信号分子。CAR构建体在其组成上是可变的。“第一代”CAR具有用于原代T细胞激活的信号转导链，通常是CD3ζ信号转导链；“第二代”CAR使用CD3ζ链连同共刺激单元，优选是CD28或4-1BB，以提供持续的T细胞以实现激活。“第三代”CAR除了CD3ζ之外，还包括多个共刺激信号转导模块，诸如CD28和4-1BB(或其他)。
与靶抗原相互作用之后，受体在膜上聚集并发生构象变化，其通过共刺激结构域促进生长和存活，并通过CD3-ζ链模拟T细胞受体信号。后者激活T细胞的细胞毒性功能，并且还刺激细胞因子的产生和释放。除了抗原结合结构域之外，CAR的所有功能组分均是人细胞基因组的天然部分。
现有技术的主要缺点是CAR-T细胞疗法临床实施的并发症(Elsallab等人.2020)，诸如：
a)产生自体细胞产品的复杂性，尤其是在接受加强预治疗的癌症患者中，
b)用自体细胞产品进行治疗的高昂价格(Kymriah，Novartis＝320,000€)，
c)在应用通用的、因此同种异体的CAR-T细胞产品时，对患者而言至关重要的副作用，
d)由于组成型表达启动子，转基因T细胞产品耗尽，和
e)由于插入的构建体的大小，基因转移和整合的效率低，特别是当基因转移通过非病毒且位点特异性基因插入进行时。
同种异体T细胞产品具有导致通常致命的急性移植物抗宿主(GvHD)反应的高风险，其中由其内源TCR触发的供体的CAR修饰的T细胞将患者的组织识别为“外来的”并对其进行攻击。使用高效且特异性核酸酶，诸如TALEN和CRISPR-Cas9，已经使得特异性地关闭供体的CAR修饰的T细胞的TCR基因成为可能(Gundry等人.2016，Osborn等人.2016)。对同种异体TCR缺失的CAR-T细胞产品的初步研究显示了有前景的结果。然而，尽管TCR缺失，其中一名患者出现轻度GvHD，并且在皮肤中检测到来自供体的T细胞(Quasim等人.2017)。在这项研究中，CAR转基因通过逆转录病毒的方式随机整合至T细胞的基因组中，并且随后在单独的步骤中实现TCR缺失。该技术的缺点是，尽管随后对细胞进行分选，但是最终细胞产品中仍有约0.1％的所有CAR-T细胞继续表达其原始TCR。这可以解释GvHD的发展。
另一种已建立的策略允许将CAR插入和TCR缺失组合。在这种情况下，CAR插入自动导致TCR缺失。为此，CAR转基因通过TRAC敲入策略插入人TRAC基因座中，其编码TCR-α链的一部分(Eyquem等人.2017)。这导致TRAC敲除和TCR-CD3蛋白复合物的表面表达的缺失。在这项研究中，使用CRISPR-Cas9和腺病毒相关病毒(血清型6)启动对TRAC基因的外显子1具有特异性的同源介导的基因转移，以提供DNA修复模板。CAR转基因(包括poly-A终止子序列)的侧翼是TRAC基因同源序列。这些同源区模拟各自DNA部分的姐妹染色体，其携带由插入的核酸酶诱导的双链断裂。因此，T细胞的DNA修复机制将CAR转基因插入TRAC基因座中。这提供了在不存在TCR复合物的情况下T细胞中CAR的TRAC基因座的受控表达。TRAC修饰的CAR-T细胞显示出提高的肿瘤根除潜力(Eyquem等人.2017，MacLeod等人.2017)。该策略的弱点是T细胞亚群能够使用独立于TRAC基因的可选TCR，诸如γδ-T细胞。这些细胞中没有发生TCR敲除，这使得同种异体使用更加困难，并且GvHD的风险仍然存在。这种现有技术也不适合具有强大抗肿瘤功能的免疫细胞，诸如自然杀伤细胞，它们不表达TRAC基因，并且因此不能使用在TRAC基因座处的敲入进行重编程。
据发明人所知，迄今为止描述的所有通用CAR-T细胞产品的目标均为完整的TCR-KO并采用完整的CAR转基因，所述转基因包括其所有细胞内结构域，特别包括CD3-ζ结构域，以重定向其细胞毒活性。现有技术的其他缺点是使用病毒载体和待转移的基因构建体的大小，一方面在GMP条件下生产复杂且是成本密集型(Qasim等人.2017和Eyquem等人.2017)。另一方面，由于转基因的大小，用于位点特异性基因插入的非病毒方法与基因转移效率低有关(Roth等人.2018，Nguyen等人.2020)。
因此，改进CAR免疫疗法需要克服复杂的技术和生物学问题。本发明解决了CAR核酸构建体设计中的四个具有挑战性的领域，诸如提高整合和表达、降低副作用风险、开发TCR复合物缺陷型的表达CAR的治疗性细胞(包括表达CAR的治疗性NK细胞)以及提高治疗性免疫细胞的有效性。
发明内容
本发明通过以下来解决上述挑战：(1)在TCR复合组分启动子和内源3'-UTR(不需要转基因转录终止序列)的内在控制下通过利用细胞内基因调控元件使CAR转基因表达，(2)提供TCR复合物缺陷型治疗性细胞，(3)通过利用免疫细胞中CAR转基因表达的内在控制，确保表达CAR的治疗性细胞的细胞持久性，以及(4)能够高效生产和提供“现成的”治疗性免疫细胞。
鉴于现有技术，本发明的技术问题是提供使用基因工程化的治疗性免疫细胞进行免疫治疗的新策略。特别地，本发明的问题是提供用于在治疗性免疫细胞中进行内在的、对免疫细胞具有特异性的和靶点依赖性的转基因表达，同时避免所述治疗性免疫细胞的耗竭、活性丧失和分化的方法。更具体地，本发明的一个问题是提供用于使CAR片段能够整合至不是T细胞的免疫细胞诸如NK细胞中的CD247基因中，并在内源CD247启动子的调节下表达，同时在这些细胞表面上呈递功能性CAR片段的方法。
本发明的另外问题是提供TCR复合物缺陷型治疗性免疫细胞，诸如同种异体T细胞，用于癌症的免疫治疗，同时避免由同种异体免疫治疗引起的副作用。
本发明的另一个问题是提供用于有效转移和基因组整合转基因，同时避免在GMP条件下复杂且是成本密集型的生产病毒载体的方法。本发明待解决的其他问题是以较低成本提供快速且优化的免疫疗法。
这些问题通过独立权利要求的特征解决。在从属权利要求中提供了本发明的优选实施方式。
因此，本发明涉及一种核酸构建体，包括：
(a)第一核酸序列区，其编码嵌合抗原受体(CAR)片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，
(b)第二核酸序列区，其包含靶向序列，所述靶向序列被配置为用于将构建体整合在人细胞的内源CD3ζ基因处，和
(c)第三核酸序列区，其编码和或包含第一序列区上游的蛋白分离位点。
在一种实施方式中，核酸构建体被配置为用于在单位点处整合构建体(特别是第一和第三核酸序列区)，优选整合至人细胞(优选人体免疫细胞)的基因组中的CD3ζ/CD247基因中。
在一种实施方式中，第一核酸序列直接跟在编码或包含蛋白分离位点的第三核酸序列之后，即与阅读框架相邻且相对于其为下游。
在一种实施方式中，将编码CAR片段的第一核酸区整合至免疫细胞的基因组中，其中所述第一区的整合破坏或减少选自由CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链和CD3ζ链组成的组的蛋白的内源表达。
在一种实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列适合整合至免疫细胞的CD3ζ/CD247基因中，优选地在所述基因的启动子下游，通过利用免疫细胞内所述基因的细胞内基因调控元件，使得所述第一核酸序列的表达受内源启动子并且优选poly-A信号的控制。在一些实施方式中，整合位点是由免疫细胞中的内源启动子表达的内源基因的外显子。
在一种实施方式中，第一区域编码无功能或功能明显降低的CAR片段。例如，CAR片段缺少功能性CAR的功能性细胞内CD3ζ结构域。通常，功能性CAR包含具有至少一个ITAM结构域的TCR复合物组分，其中TCR复合物的CD3链的蛋白包括至少一个ITAM结构域。现有技术的功能性CAR通常包含细胞内CD3ζ链，其在本发明的构建体中是不存在的。本发明的构建体被设计和/或配置为用于在(通过表达)内源CD3ζ启动子和其他内含子或3'-UTR定位的调控元件的调控下，以及随后是在内源聚腺苷酸化信号的调控下，由框内的外源CAR片段与内源CD3ζ编码区的组合靶向内源CD3ζ/CD247基因和功能性CAR的后续表达。
在一种实施方式中，本发明提供了核酸构建体，其导致阻断在工程化的人CAR-T细胞产品的表面处形成TCR-CD3复合物。
在一种实施方式中，本发明涉及包含一个或多个靶向序列的核酸构建体，所述靶向序列被配置为用于将所述第一序列区(或构建体本身)整合至人细胞的内源CD3ζ/CD247基因处。在优选的实施方式中，通过同源介导的DNA修复将不完整且无功能的CAR转基因插入人细胞的内源CD3ζ/CD247基因中，由此待插入的CAR片段转基因既不含有CD3ζ也不含有表达调节组分，例如启动子或poly-A信号，因此比现有技术中待转移的CAR更短(参考实施例1)。
技术人员尚未预期将不完整的非功能性CAR片段转基因整合至CD3ζ/CD247基因中将导致可靠形成功能性CAR转录物，所述转录物包含与内源CD3ζ链互补的外源CAR转基因，其以足以用于治疗应用的水平表达。此外，将CD3ζ缺陷型CAR转基因插入编码细胞内蛋白的CD3ζ/CD247基因的外显子中，也出乎意料地产生TCR阴性CAR-T细胞(如实施例2所示)。本发明的有利且不可预见的方面是提供了包含与内源CD3ζ链互补的外源CAR转基因的功能性的、正确剪接的CAR，其呈递在具有治疗功能的人免疫细胞(例如CAR-T细胞或CAR-NK细胞)的表面上。CAR还在非T细胞的表面有效表达以产生治疗效果，诸如导致肿瘤根除。增强了所述细胞的细胞持久性。此外，副作用诸如快速细胞耗竭和细胞因子风暴被最小化或完全避免。
在一种实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列区被配置成整合至细胞的基因组中，使得CAR由免疫细胞在所述细胞的表面处表达，并且其中所述第一核酸在基因组中的整合破坏或减少功能性TCR复合物(如果有)在细胞表面处的表达。
在一种实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列区被配置成被整合至内源基因的至少一个等位基因(优选所述基因的两个等位基因，优选内源CD3ζ/CD247基因，更多优选CD3ζ/CD247基因的两个等位基因)上的染色体序列中。
使用本文所述的构建体产生的本发明的CAR-T细胞产品在一些实施方式中也是TCR阴性CAR-T细胞产品，所述产品特别适合用作使用同种异体细胞治疗产品的癌症治疗中“现成的”CAR-T细胞产品或用于再生方法中的细胞免疫抑制方法。在表达CAR的T细胞上缺失TCR优选地降低或消除移植物抗宿主病的风险。
在现有技术中，优选将CAR片段引入T细胞中并在这些细胞(尤其是同种异体T细胞)中诱导表达。这有副作用的风险，诸如细胞因子风暴。掺入在CD247基因中的CAR片段在除了T细胞以外的免疫细胞(例如NK细胞)中的表达在现有技术中通过外源启动子解决，其缺点是实现掺入至CD247基因中的CAR片段的人工表达率、CAR片段在细胞表面上的呈递不佳、以及表达CAR的细胞快速耗竭和细胞耐力低下，这可能导致患者复发。例如，整合至CD247基因中并在内源CD247启动子调控下的功能性CAR片段的表达尚未在现有技术中公开。
在一些实施方式中，因此，本发明涉及核酸构建体和表达所述构建体的第一和第三核酸序列区的基因修饰的免疫细胞，优选CAR-T细胞产品或CAR-NK细胞产品，其赋予人T细胞或NK细胞对确定的抗原诸如实体瘤或液体肿瘤的抗原具有高细胞毒活性，同时保留非致病性细胞，例如在被肿瘤包围的组织内，诸如乳腺细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、肺细胞、结肠细胞或肝细胞以及血液细胞。
在优选的实施方式中，基本上所有其他内源T细胞、B细胞、NK细胞同样被保留，因为本发明的CAR-T细胞或CAR-NK细胞产品对这些细胞没有显示或显示可忽略的活性。
本发明能够刺激参与抗肿瘤免疫应答的细胞，并且从而局部激活、支持和/或加强抗肿瘤免疫应答。本发明通过将编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸构建体整合至移植的CAR-T细胞或CAR-NK细胞中的内源基因中，优选CD3ζ编码基因中，实现一种或多种嵌合抗原受体的有效和治疗相关剂量的内源调节，同时避免/抑制TCR表达。同种异体CAR-T细胞中的TCR表达有时与重度副作用(例如GvHD)相关。本发明提供了避免不利的TCR表达，同时破坏功能性TCR复合物形成所必需的CD3ζ表达的策略和方法。在其他方面，本发明提供了用于采用CD3ζ缺陷型CAR转基因的策略和方法，例如，依赖于免疫细胞特异性、位点、表达状态(例如，仅在肿瘤附近表达转基因)或时间(例如在肿瘤细胞干预之前或之后)，其中CAR表达优选地在内源启动子和内源Poly-A信号(优选CD3ζ/CD247基因启动子)的控制下。现有技术中的CAR表达策略通常提供CAR-T细胞，其中CAR表达在外源组成型活性RNA-聚合酶II启动子与其他外源基因调控元件组合的调控下。
在优选的实施方式中，CD3ζ/CD247基因座是构建整合的靶点，由此CAR片段被转移至CD3ζ/CD247基因座，优选地至CD3ζ/CD247启动子的下游。在其他实施方式中，CAR转基因的表达在内源CD3ζ/CD247启动子和poly-A信号的控制下发生，从而CAR转基因优先与内源CD3ζ/CD247形成融合基因。CAR转基因优先整合和融合至内源CD3ζ/CD247基因中，尤其导致内源CD3ζ/CD247基因表达的缺失和天然CD3ζ蛋白的形成。在一种实施方式中，CD3ζ/CD247表达的缺失还导致功能性TCR复合物表达的抑制或缺失，从而产生TCR阴性CAR T细胞。
在一种实施方式中，融合基因由CAR转基因形成，CAR转基因优选地框内整合至CD3ζ/CD247基因的表达模式中，由此在CAR转基因插入位点的下游保持截短的CD3ζ/CD247蛋白(优选具有至少一个细胞内ITAM结构域的截短的CD3ζ/CD247蛋白)的开放阅读框。在一种实施方式中，CAR-CD3ζ融合蛋白在内源CD3ζ启动子的控制下表达，同时内源CD3ζ/CD247表达缺失(参考实施例2和3)。
这是出乎意料的结果，天然免疫应答确实可以被反映或增强，由此通过将CD3ζ缺陷型CAR片段整合至通过本发明的方式产生的CAR-T细胞(参考实施例3或5)或CAR-NK细胞(实施例4)产品中的内源CD3ζ/CD247基因中诱导细胞表面的功能性CAR。
本文所述的截短CAR构建体在内源CD247启动子的调节下在原代和永生化NK细胞中有效表达，并翻译成功能性CAR-CD3ζ融合蛋白。在一种实施方式中，CAR构建体在内源CD247启动子的内在控制下在NK细胞中表达并功能性地呈递在所述NK细胞的细胞表面上。从现有技术来看，预期CAR构建体在除了T细胞以外的免疫细胞(特别是NK细胞)中的内源表达不足以识别和靶向肿瘤细胞并介导肿瘤根除。出乎意料的是，人工CAR片段完全表达功能性内含子切除元件和蛋白切割位点，导致包含CAR片段和CD3ζ元件的完整和功能性融合蛋白的翻译。
CAR-CD3ζ融合蛋白被特别有利地转运至细胞表面并通过膜内的跨膜结构域被锚定，其中包含抗体结构的CAR部分也在非T细胞的免疫细胞(优选NK细胞)中在细胞表面功能性表达。在一种实施方式中，CAR-CD3ζ融合蛋白被转运至免疫细胞(优选NK细胞)的细胞膜。在一种实施方式中，CAR-CD3ζ融合蛋白的CAR片段在免疫细胞(优选NK细胞)的细胞表面表达并具有功能性。
CAR的功能性由CAR在细胞表面(特别是NK细胞)的呈递介导，其特征在于CAR抗体结构域与肿瘤细胞表面呈递的抗原的最佳结合。所述结合通过与CAR片段融合的CD3ζ结构域触发信号转导级联，介导破坏肿瘤细胞。在一种实施方式中，在NK细胞的细胞表面上的所述CAR的CAR抗体结构域识别并结合肿瘤细胞表面呈递的抗原，其中所述结合触发破坏肿瘤细胞的信号转导级联。用CD3ζ/CD247 KI方法产生的原代和永生化NK细胞提供了优于现有技术的出乎意料的杀伤能力。
特别有益的是减少表达CAR的细胞的细胞耗竭(如果有)，以及增强CAR呈递治疗性细胞(特别是NK细胞)的细胞持久性。所述CAR呈递NK细胞的增强细胞持久性特别有利于完全肿瘤根除。未诱导细胞因子风暴或使其最小化。出乎意料地，患者在治疗期间或之后的复发被最小化或完全避免。
在一种实施方式中，在NK细胞中，本发明提供的CD3ζ缺陷型CAR转基因可以在CD3ζ/CD247启动子而非TRAC启动子的控制下表达(参考实施例4)。CD3ζ蛋白在NK细胞中以充分的水平表达(参考实施例4和16)并且对于其他NK细胞功能(例如，杀死肿瘤细胞/缺失自我识别)不是必需的(参考实施例4)。原代CD247 KI NK细胞和永生化CD247 KI NK细胞的优异杀伤能力优选地优于现有技术的CAR NK细胞，后者从异位基因座和/或安全港(例如hAAVS1)过表达CAR(参考实施例16)。因此，本发明的另一个有利方面是靶向编码CD3ζ链的基因以整合本发明的CAR片段转基因，因为CD3ζ/CD247基因也在除了T细胞之外的免疫细胞中表达，这些免疫细胞也适用于有效且安全的免疫疗法，包括NK细胞(参考实施例4和12)。如本文所述，CD247 KI方法还使得重编程不同细胞类型以进行过继细胞转移。例如，TCRγ/δT细胞、Treg和NK细胞可以通过CD247-KI方法进行重编程(参考实施例13和4)。本发明提供了对各种免疫细胞中的内源CD247基因进行基因修饰以表达抗原特异性CAR的方法，其中所述免疫细胞在体外遇到肿瘤之后表现出明显更少的衰竭。在一种实施方式中，TCRγ/δT细胞可以使用CD247 KI方法进行基因修饰，并用于癌症治疗的过继T细胞转移。现有技术中用作整合位点的TCR复合物组分TRAC(WO2017/1809893)不提供此优势。
整合至CD3ζ/CD247基因座中的CD3ζ缺陷型CAR转基因与NK细胞或其他免疫细胞诸如Treg的组合是本发明的优选实施方式。
出乎意料且特别有利的是，通过将CAR转基因整合至CD3ζ/CD247基因中，特别是编码细胞质结构域的基因区域，内源CD3ζ表达被破坏并且在CAR T细胞上没有呈递内源TCR。预期本发明的构建体将不直接影响细胞内人CD3ζ链的表达。因此，本发明还提供了破坏内源TCR表达并使同种异体CAR-T细胞的安全免疫疗法成为可能的方法，从而使免疫疗法不仅更安全，而且更容易、更快且显著更便宜。此外，出乎意料的是，靶向的免疫细胞正确地剪接整合在CD3ζ/CD247基因中的CAR转基因，而没有CD3ζ链的外显子序列，以形成与内源CD3ζ结构域互补的功能性CAR转录物。
在一种实施方式中，将截短的CD3ζ缺陷型CAR转基因插入内源CD3-ζ/CD247基因实现CAR的充分表达(参考实施例7)。出乎意料的是，本发明中的CAR表达水平低于现有技术的CAR表达水平，导致CAR在CAR-T细胞或CAR-NK细胞中的充分和治疗相关表达(参考实施例8)。CAR作为CAR-CD3ζ融合蛋白在CAR-T细胞和CAR-NK细胞中的这种较低表达率，对应于所述细胞中CD3ζ/CD247的内源表达率，预期不是特别有利于肿瘤根除的功效和免疫疗法的安全性(参考实施例3)。特别有利的是，所提到的CAR-T细胞或CAR-NK细胞显示出与CAR-T细胞或CAR-NK细胞产品的抗肿瘤活性提高和扩增相关的细胞耗竭减少和分化减少。
表达的内源性调节对本文所述的本发明的CAR-T细胞和CAR-NK细胞的性能和耐力出人意料地有益。
因此，本发明提供了用于在具有强效且对抗原具有特异性的体外消除肿瘤细胞的能力的CAR-T细胞或CAR-NK细胞中产生CD3ζ启动子依赖性表达的CD3ζ缺陷型CAR的方法(参考实施例8和9)。将CD3-ζ缺陷型CAR整合至其他基因组位点而不是CD3ζ/CD247基因则缺乏细胞毒性作用。因此，可以通过精确定位插入CD3ζ缺陷型CAR转基因来产生功能完全的TCR阴性CAR-T细胞。
在一些实施方式中，提供了CAR-T细胞或CAR-NK细胞中编码对肿瘤具有特异性的CAR、免疫刺激蛋白(例如细胞因子或检查点抑制剂分子)、CAR调节蛋白和/或治疗性蛋白的转基因组合，也实现局部更有效且更安全的抗肿瘤反应。
在一些实施方式中，可以将另外的序列置于构建体中，优选地置于第一核酸序列中，其中这些序列编码一种或多种治疗性蛋白，这些序列通过编码自切割肽的序列、蛋白水解切割位点和/或IRES位点与CAR片段编码区分离。
与另外的治疗性蛋白(优选地在与CAR片段相同的启动子下表达)组合,导致此类蛋白的独特局部表达和分泌，其诱导涵盖免疫应答的多个臂的局部抗肿瘤反应，而没有如同在肿瘤患者中应用免疫刺激分子(例如细胞因子)中经常观察到的那样诱导毒性。
本发明的另外优点是插入的CAR转基因的基因表达的细胞类型依赖性调节。CD3ζ/CD247基因在免疫系统的细胞中(优选地在淋巴细胞诸如T细胞和NK细胞中)表达。其他细胞类型(例如肌肉细胞)不表达CD3ζ/CD247或以极低程度表达。因此，本发明的策略和方法还实现被错误地转移至非靶细胞中并插入它们的基因组中的CAR转基因在这些非靶细胞中保持不表达或表现出没有任何治疗性或毒性相关性的表达率。
在一种实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列区包含：
-编码细胞外抗原结合结构域的核酸序列，所述抗原结合结构域优选包含抗体或抗体片段，
-编码跨膜结构域的核酸序列，和
-编码一种或多种细胞内共刺激结构域的核酸序列。
在一种实施方式中，CAR抗原结合结构域结合癌抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合选自由以下组成的组的癌症相关抗原：CD19，APRIL/TNFSF13，Mic A/B，T细胞相关抗原：CD3、CD5、CD7、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、EphrinB2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6,E7、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1及其衍生物，所述衍生物包含多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、泛素化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰，天然存在的和非天然存在的。
在一种实施方式中，CAR抗原结合结构域结合自体抗原或同种异体抗原，其中自体抗原或同种异体抗原选自HLA单倍型的组，所述HLA单倍型包括HLA-A2、HLA-B7、HLA-DR以及HLA相关抗原，诸如Mic A或Mic B。
在一种实施方式中，CAR抗原结合结构域结合与炎症相关的自体抗原或外源引入的抗原，其中所述外源引入的自体抗原可以选自包括MOG、水通道蛋白4、谷蛋白-组织转谷氨酰胺酶复合物、腺病毒或AAV的组。
在一些实施方式中，在其中表达编码CAR片段的第一核酸的免疫细胞，优选NK细胞或T细胞，对靶抗原敏感。在一种实施方式中，CAR片段的抗原结合结构域识别(优选特异性地结合)CD19。表达所述CAR片段的相应免疫细胞，优选CAR-T细胞或CAR-NK细胞产品，表现出对CD19阳性致病细胞的高细胞毒活性。
在一种实施方式中，CAR片段的抗原结合结构域识别(优选特异性地结合)HER2。表达所述CAR片段的相应免疫细胞，优选CAR-T细胞或CAR-NK细胞产品，表现出对HER2阳性致病细胞的高细胞毒活性。
在另一方面，本发明还涉及细胞产品，诸如设计和生产用于医疗用途的先进治疗药物产品，其包含可以用于治疗具有CD19阳性肿瘤细胞的癌症的下一代抗CD19 CAR转染或转导的免疫细胞(参考实施例8)。
除了靶向CD19外，ζ方法还可转移至其他CAR靶点(例如HER2，参考实施例15)。在一种实施方式中，CAR片段的抗原结合结构域识别(优选特异性地结合)HER2。表达所述CAR片段的相应免疫细胞，优选CAR-T细胞或CAR-NK细胞产品，表现出对HER2阳性致病细胞的高细胞毒活性。在另一种实施方式中，包含下一代抗HER2 CAR转染或转导的免疫细胞的细胞产品可以用于治疗具有HER2阳性肿瘤细胞的癌症。抗HER2 CAR表达免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞，在体外扩增之后显示出耗竭标志物表达减少。有益地减少了抗HER2 CAR T细胞的分化。
因此，本发明提供了用于靶向CD3ζ/CD247基因的特异性向导RNA序列，其还可应用于NK细胞，例如用于产生靶向HER2的CAR-NK细胞。本文公开的向导RNA最有效地导致包含CAR片段的核酸构建体在优选的位置处特异性地整合至CD3ζ/CD247基因中，诸如靶向CD19或HER2的CAR片段。这种用于精确整合的特异性向导对于CAR/CD3ζ融合蛋白的精确合成和CAR片段的功能性，诸如表面呈递和靶向是至关重要的，并且是本文公开的向导RNA优于现有技术中向导RNA的有利特征。
以下列出了编码CAR片段的第一核酸序列区的其他实施方式。在一些实施方式中，编码本文所述的CAR的抗原结合结构域的核酸区编码通过铰链区与跨膜结构域偶联的抗原结合结构域。
在一些实施方式中，跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包含共刺激信号转导结构域，所述共刺激信号转导结构域包含从选自由以下组成的组的蛋白获得的功能性信号转导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、gp130、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a或与其具有至少80％氨基酸序列同一性的衍生物。
在一种实施方式中，编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸构建体包含：
-CAR信号序列，优选地根据SEQ ID NO 27或与SEQ ID NO 27具有至少80％序列同一性的序列；
-特异性地结合抗原的CAR的抗原结合结构域，更优选与根据SEQ ID NO 29的接头连接的根据SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 30的CD19，或具有根据SEQ ID NO 29的接头的根据SEQ ID NO 60的CD19Y，或与SEQ ID NO 28、29、60和39具有至少80％序列同一性的序列；
-CAR的免疫球蛋白重链恒定区，优选地根据SEQ ID NO 31-33，或与SEQ ID NO31-33具有至少80％序列同一性的序列；和/或
-CD28信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO 34和35或与SEQ ID NO 34和35具有至少80％序列同一性的序列；其中CD28信号转导结构域包含跨膜结构域，优选地根据SEQID NO 34，或与SEQ ID NO 34具有至少80％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，核酸构建体编码CD3ζ缺陷型CAR片段，其进一步包含
-包含蛋白翻译终止信号的细胞质CD3ζ信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO44，或与SEQ ID NO 44具有至少80％序列同一性的序列，和
-poly-A信号，优选地根据SEQ ID NO 45，或与SEQ ID NO 45具有至少80％序列同一性的序列，或
-缺少蛋白翻译终止信号和缺少poly-A信号的截短的CD3ζ信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO 41，或与SEQ ID NO 41具有至少80％序列同一性的序列。
在一种实施方式中，poly-A信号是技术人员已知的并且可以是基因结构内的内源poly-A信号、合成的转录终止子序列或改造自哺乳动物基因的poly-A序列。
在一些实施方式中，与SEQ ID 28-33的特定CAR序列具有70％或更多序列同一性的序列变体保持CD19结合，其功能特性与具有SEQ ID NO 28-33或SEQ ID NO 60的特定CAR序列的VH和VL结构域基本上相同或相似，即CD19结合在亲和力、特异性和表位结合模式方面基本上相同或相似。在一些实施方式中，编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸序列经密码子优化以便提高所述CAR片段的表达。此类修饰能够在T细胞或NK细胞上充分表面表达，并且仍保持适当的抗原结合。高亲和力和高亲合力使CAR-T细胞或CAR-NK细胞或CAR-Treg细胞能够i)识别具有高、中或低肿瘤抗原表面表达的肿瘤靶细胞，ii)被这些肿瘤靶细胞激活，以及iii)杀死这些肿瘤靶细胞。
在一种实施方式中，CAR片段的抗原结合结构域特异性地结合CD19。本文所述的抗CD19 CAR-T细胞和抗CD19 CAR-NK细胞产品以有益特性为特征。本文所述的抗CD19 CAR具有高亲和力并赋予T细胞和/或NK细胞高特异性和亲合力。这些特性使CAR-T细胞或CAR-NK细胞能够i)识别具有高或低CD19表面表达的肿瘤靶细胞，ii)被这些肿瘤靶细胞激活，以及iii)杀死这些肿瘤靶细胞。例如，可以使用与Quantibrite珠(例如来自BD)结合的偶联至荧光染料的抗CD19抗体来定量在肿瘤细胞表面表达的CD19抗原的数量。用于定量在肿瘤细胞表面表达的CD19抗原的优选方法是“荧光激活细胞分选/细胞分析”(FACS)。
没有TCR表达的抗CD19 CAR-T细胞，特别是在同种异体CAR细胞产品中，将能够靶向肿瘤微环境中的肿瘤细胞，如本文所述的实例所示(参考实施例11)。
在一种实施方式中，CAR片段的抗原结合结构域特异性地结合CD19。本文所述的抗HER2 CAR-T细胞和抗HER2 CAR-NK细胞产品以有益特性为特征。如本文所述的抗HER2 CAR具有高亲和力并赋予T细胞和/或NK细胞高特异性和亲合力。这些特性使CAR-T细胞或CAR-NK细胞能够i)识别具有高或低HER2表面表达的肿瘤靶细胞，ii)被这些肿瘤靶细胞激活，以及iii)杀死这些肿瘤靶细胞。例如，可以使用与Quantibrite珠(例如来自BD)结合的偶联至荧光染料的抗HER2抗体来定量在肿瘤细胞表面上表达的HER2抗原的数量。用于定量在肿瘤细胞表面上表达的HER2抗原的优选方法是“荧光激活细胞分选/细胞分析”(FACS)。
没有TCR表达的抗HER2 CAR细胞，特别是在同种异体CAR细胞产品中，将能够靶向肿瘤微环境中的肿瘤细胞，如本文所述的实例所示(参考实施例15)。
本文所述的对肿瘤抗原具有特异性的CAR-T细胞适用于治疗不适合其他疗法的实体瘤或液体瘤患者的优选实施方式。更具体地，本发明的实施方式涉及以下患者人群的治疗：
i.多药耐药患者，
ii.不适合同种异体/造血干细胞移植的患者，
iii.患有合并症无法进一步化疗的患者，
iv.患有固体和/或液体癌症的患者，
v.不能耐受化疗的老年患者，
vi.即使在进行性疾病和多线其他标准护理疗法失败之后，CAR也适用于挽救疗法，和/或
vii.甚至适合在靶肿瘤细胞上的低抗原密度，其中抗体可能失败，和/或
viii.适合单药治疗，而抗体则不然，和/或
ix.适合与一种或多种抗癌治疗、抗癌药物或移植联合使用。
如以下实例所示，在体外共培养系统中，抗CD19 CAR-T细胞或抗CD19 CAR-NK细胞在暴露于表达CD19的人肿瘤细胞系后被激活(参考实施例8和9)然后，这些T细胞或NK细胞发展出具有高水平细胞毒活性的效应表型。此外，针对选择的靶细胞系CD19阴性细胞的细胞毒性测定显示选择性细胞毒性仅针对CD19阳性细胞系被获得(参考实施例8)。
在一种实施方式中，靶向序列被配置成用于将所述第一核酸序列区与内源CD3ζ编码序列框内整合，优选地整合至内源CD3ζ基因的外显子中。
在一种实施方式中，靶向序列被配置成用于将构建体框内整合至内源CD3ζ编码基因的外显子中。
在一种实施方式中，CD3ζ缺陷型CAR转基因的插入位点优选地在CD3ζ/CD247启动子的下游，其中插入可以发生在CD3ζ/CD247基因的外显子或内含子中，优选外显子中。在一些实施方式中，用于插入所述CAR转基因的CD3ζ/CD247基因的外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8，优选外显子1、2、3、4、5或6，更优选外显子2或外显子3，更优选外显子2，其中所得CAR多肽包括至少一个细胞内ITAM结构域。
在一种实施方式中，由所述第一核酸序列区编码的CAR转基因不与外源启动子可操作地连接。
在一种实施方式中，位于第一序列区上游的第三核酸序列区编码第一自切割肽、蛋白酶切割位点或内部核糖体进入位点(IRES)。
在一种实施方式中，第三核酸序列的蛋白分离位点编码内部核糖体进入位点(IRES)。
启动子下游的序列可以被转录但不一定被翻译。启动子下游并延伸至第一个翻译起始密码子的非翻译区是5'非翻译区(5'UTR)。在本发明的一种实施方式中，因此，CAR转基因的插入位点在5'UTR的下游。
在一些情况下，CAR片段上游的序列区段与外源CAR转基因一起转录。在一些实施方式中，因此，提供了在翻译期间或之后分离CAR多肽上游的任何序列的方法。
在一些实施方式中，编码蛋白分离位点的核酸序列区，例如自切割肽、蛋白酶切割位点或内部核糖体进入位点(IRES)，优选自切割肽，位于编码CAR片段的核酸序列区的上游。蛋白分离位点用于分离CAR上游的任何序列，这些序列与CAR一起翻译，其在CAR多肽中可能功能异常或不需要。
在一种实施方式中，因此，CAR片段编码区通过编码自切割肽、蛋白水解切割位点和/或IRES位点的序列与内源基因和/或mRNA序列区段分离。
在一种实施方式中，多肽切割位点选自由P2A、T2A、E2A和F2A组成的组。
在一种实施方式中，蛋白水解切割位点是细胞内蛋白水解切割酶的氨基酸识别位点。
在一种实施方式中，IRES位点，例如能够以帽非依赖性方式在核糖体处启动mRNA翻译，是病毒IRES位点，例如HCV样IRES、微小核糖核酸病毒科IRES或脑心肌炎病毒IRES。
在一些实施方式中，自切割肽优选是2A肽，更优选地选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒(ERAV)2A肽、东亚细亚病毒(Thesea asigna virus(TaV)2A肽、猪捷申病毒-1(PTV-l)2A肽、Theilovirus 2A肽和脑心肌炎病毒2A肽。
在一种实施方式中，核酸构建体被配置成用于在内源CD3ζ启动子控制下，表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含由第一序列区编码的CAR片段和由内源CD3ζ基因编码的细胞内结构域。
这种构建体能够将编码CD3ζ缺陷型CAR片段的转基因整合至基因组内的位置，使得通过利用细胞内基因调控元件，使整合的核酸序列(即转基因)在内源启动子和内源poly-A信号的控制下。在一些实施方式中，内源启动子是TCR复合物组分的启动子。
因此，内源启动子被例如来自免疫细胞的细胞信号内在调节和/或诱导。在一些实施方式中，内源启动子在免疫细胞亚群(优选NK细胞或T细胞或Treg细胞)中具有活性。在一些实施方式中，内源启动子优选是编码TCR复合物蛋白的基因的启动子，例如CD3ζ、CD3ε、CD3δ、CD3γ，优选编码包含至少一个细胞内ITAM结构域的蛋白的基因的启动子。
在一种实施方式中，整合之后第一核酸序列区的表达由内源CD3ζ基因表达终止信号和/或使用内源poly-A信号终止。
本发明的特别优点是它不仅使用内源启动子表达，而且使用内源终止信号。CD3ζ/CD247的内源基因调节是TCR复合物形成的限速步骤，并且受肿瘤微环境的影响。此外，由于不存在外源终止信号，本发明的构建体更小并且导致核酸序列的特别有效的转移和整合。
缺乏外源启动子和表达终止信号(包括poly-A信号)的CD3ζ缺陷型CAR构建体的出乎意料的效果是，与现有技术的CAR构建体相比，它对靶细胞表现出出乎意料的低毒性，而技术人员预测现有技术的CAR构建体不具有这种低毒性。在优选的实施方式中，这对于非病毒转移方法，诸如本文公开的那些特别明显。这有利于靶细胞存活、转基因整合率和靶细胞的功能(参考实施例3和6)。
在一种实施方式中，内源CD3ζ/CD247基因表达终止信号包含转录终止子序列、poly-A信号和翻译终止密码子，并且是技术人员已知的，技术人员能够鉴定合适的融合位点和/或生成被配置成用于融合的核酸构建体，这取决于内源CD3ζ/CD247基因内用于融合的预期靶位点。
在一些实施方式中，第一序列区被整合至其中的CD3ζ基因的靶位点是外显子和/或内含子，优选是外显子2，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
在一些实施方式中，第一序列区被整合至其中的CD3ζ基因的靶位点是外显子2，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个ITAM。
在一些实施方式中，第一序列区被整合至其中的CD3ζ基因的靶位点是外显子，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个ITAM。
在一些实施方式中，第一序列区被整合至其中的CD3ζ基因的靶位点是内含子，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个ITAM。
在一些实施方式中，CAR的包含ITAM的CD3蛋白结构域可以是CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε，优选是CD3ζ。CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε的细胞内部分各自携带至少一个保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序，称为“ITAM”，其对TCR信号转导至关重要，特别是产生T淋巴细胞中的激活信号。CD3ζ的内源细胞内结构域含有三个ITAM基序，但并非所有基序均是必需的。在优选的实施方式中，CAR融合蛋白包含融合至具有至少一个ITAM结构域的功能性CD3ζ片段的CAR片段。
CD3ζ蛋白包含细胞外结构域和跨膜结构域，随后是包含三个ITAM的细胞内结构域。对于其作为CAR内信号转导结构域的功能，至少一个ITAM是必需的。在某些实施方式中，当选择构建体的整合位点时，选择CD3ζ/CD247基因内的位点，其是至少一个ITAM的上游，更优选地是所有三个ITAM的上游。技术人员能够鉴定编码ITAM结构域的序列和用于框内整合的合适位点。
含有ITAM的CD3ζ细胞内结构域的编码序列从外显子2开始。因此，在本发明的一个方面，外显子2作为插入位点特别有利，从而产生没有CD3ζ的内源细胞外区或跨膜区的CAR。在还一些实施方式中，CAR转基因的插入位点还可以位于外显子3、外显子4、外显子5或外显子6中。
在一些实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列区另外包含编码CAR调节蛋白、免疫刺激蛋白和/或治疗性蛋白的序列，其位于框内并通过编码第二自切割肽的序列、启动子和/或IRES位点与CAR片段编码区分离。
因此，该构建体可以导致其他有益蛋白(例如细胞因子和/或检查点抑制剂分子)的表达，旨在吸引免疫效应细胞和辅助细胞、诱导免疫激活、促进记忆免疫细胞的成熟和/或抑制抑制性和/或调节性免疫细胞的发育和持久性。
在一些实施方式中，编码CAR片段的第一核酸序列区另外包含至少一个编码免疫刺激蛋白(例如趋化因子、细胞因子和/或检查点抑制剂)的序列。刺激免疫应答的细胞因子、趋化因子和检查点抑制剂是技术人员已知的并且可以通过已建立的常规测定进行评估和/或确定。在一些实施方式中，作为细胞因子的免疫刺激蛋白选自由以下组成的组：IL2、IL12、IL15、IL18、IL-7，或组成型活性细胞因子受体、外源激活的共刺激受体或细胞因子信号转导促进受体。该策略避免所述免疫刺激蛋白的全身应用的潜在不良影响。
肿瘤诱导的免疫抑制主要由存在于具有调节表型的肿瘤中(例如源自单核细胞的调节性T细胞和抑制细胞)的免疫细胞和控制蛋白(例如免疫检查点蛋白，诸如PD-1)分泌抗炎细胞因子介导。因此，本发明另外提供了用于修饰肿瘤微环境的有利方法，使其促炎、促进存在于肿瘤中的免疫细胞的激活以及外部免疫细胞的募集和激活，从而促进免疫系统对肿瘤的广泛激活和/或增加抗肿瘤免疫治疗的有效性。
在一种实施方式中，构建体编码检查点抑制蛋白，例如PD-L1和/或PD-1抑制剂。癌细胞利用避免常规免疫系统控制的机制。检查点蛋白已显示出通过与潜在癌细胞不被破坏的免疫系统沟通来发挥作用。
在一种实施方式中，编码CAR调节蛋白。在一些情况下，可能期望提供使所给药的T细胞选择性缺失的安全机制，因为被操纵的T细胞可能在给药之后扩散并持续数年。如本文所述，本发明提供了任选地关闭表达CAR的基因修饰的细胞产品的另外方法，即用于安全临床用途。因此，在一些实施方式中，构建体编码自杀基因，其能够在给药于受试者之后降低毒性和/或T细胞不受控增殖的风险。自杀基因能够在体内使转化细胞选择性缺失。
在一些实施方式中，第一核酸序列区内的另外序列被框内插入，并且通过编码自切割肽的序列、蛋白水解切割位点和/或IRES位点与CAR片段编码区分离。
在一种实施方式中，编码CAR片段的第一序列区与编码例如CAR调节蛋白、免疫刺激蛋白或检查点抑制剂分子的另外核酸序列区连接，并被配置成编码多顺反子mRNA。
在一些实施方式中，第二序列区的靶向序列被配置成用于通过基因编辑技术，优选CRISPR-Cas、锌指核酸酶(ZFN)、整合酶、位点特异性重组酶、兆核酸酶、归巢核酸内切酶或TALEN，更优选源自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9，整合至宿主基因组中。
在一种实施方式中，使用基因编辑技术优选在CD3ζ等位基因中的靶位点处产生双链断裂，并且通过双链断裂位点的同源定向修复将核酸构建体掺入靶位点中。非病毒载体优选用于将编码CAR片段的核酸构建体转移至细胞中。在一种实施方式中，递送方法是非病毒的，优选电穿孔(参考实施例6)。使用构建体的CRISPR-Cas9机制的基因转移可以通过电穿孔或病毒(例如慢病毒)介导或转座子控制进行。
在一些实施方式中，核酸构建体(优选线性DNA)或载体，诸如质粒载体、病毒载体或转座子载体使进入人T细胞或NK细胞中的转移率特别高。
在本发明的其他方面，本发明涉及分离的核酸分子，优选为载体形式，诸如合成的线性DNA或环状质粒载体、病毒载体或转座子载体，优选质粒载体，选自由以下组成的组：
i.包含核苷酸序列的核酸分子，
其编码根据本文所述的任何实施方式的CD3ζ缺陷型CAR多肽，
其编码细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内共刺激结构域，或
其中细胞外抗原结合结构域由SEQ ID NO 28、29、30、31、32、33、60中的至少一个序列编码
和/或
ii.包含核苷酸序列的核酸分子，
根据本文描述的CAR片段的任何实施方式，其编码包含与预期整合至其中的内源DNA序列的识别位点相同的序列的靶向序列，也称为同源臂，其中该同源臂是根据SEQ IDNO 25、36、39、42、43的至少一个序列，
和/或
iii.包含核苷酸序列的核酸分子，
其编码或包含根据本文所述的任何实施方式的蛋白分离位点，其中该蛋白分离位点由SEQ ID NO 26的至少一个序列编码，和/或
iv.与根据i、ii和/或iii的核苷酸序列互补的核酸分子，
v.包含具有充分序列同一性以与根据i-iv的核苷酸序列在功能上类似/等同的核苷酸序列的核酸分子，优选地包含与根据i-iv的核苷酸序列具有至少70％序列同一性；
vi.由于遗传密码而简并为根据i-v的核苷酸序列的核酸分子；和/或
vii.通过缺失、添加、取代、易位、倒位和/或插入进行修饰并且与根据i-vi的核苷酸序列在功能上类似/等同的根据i-vi的核苷酸序列的核酸分子。
在一种实施方式中，基因编辑技术可以用于产生基因修饰的免疫细胞，所述免疫细胞包含在内源基因的至少一个等位基因(优选所述基因的两个等位基因，优选内源CD3ζ/CD247基因，更优选CD3ζ/CD247基因的两个等位基因)上编辑的染色体序列。
在另一个方面，本发明进一步涉及用于产生基因修饰的细胞的方法，该方法包括递送或转移如本文所述的核酸构建体。
此外，可以交换CAR编码核酸构建体的信号转导组分，例如在三步克隆程序中，这实现模块化组成，并且由技术人员定制构建临床适用的抗肿瘤-抗原CAR，例如抗CD19 CAR(参考实施例10和11)或抗HER2 CAR(参考实施例15)。
在一种实施方式中，CD247 KI方法可转移至用于CAR疗法的其他靶标(例如其他癌症抗原)。在一种实施方式中，表达CD247-KI CAR的免疫细胞靶向HER-2。靶向HER-2的表达CD247-KI CAR的免疫细胞提供了与TRAC-KI HER2-CAR T细胞或通过EF1α启动子或CMV启动子驱动的表达盒从hAAVS1安全港基因座过表达CAR的CAR T细胞相当的显著益处(参考实施例15)。CD247-KI HER2-CAR T细胞在典型的CAR-T扩增之后显示出耗竭减少、分化减少和激活诱导的细胞死亡大量减少。CD247-KI HER2CAR T细胞保持活力，而AAVS1-KI和TRAC-KICAR T细胞开始出现凋亡。
在一些实施方式中，靶向序列包含与预期整合至其中的内源DNA序列的识别位点相同的序列，优选地选自由以下组成的组：同源臂、向导RNA靶位点、限制性酶识别位点、ZFN识别位点、ZFN切割位点、TALEN DNA结合位点、重组酶识别位点、整合酶位点和/或归巢核酸酶识别位点。
在某些实施方式中，靶向序列(称为“同源臂”)包含与靶细胞的内源基因组序列互补的至少一个序列。在一种实施方式中，被配置成用于整合至宿主基因组中的第二序列区的靶向序列包含与内源整合位点互补的(如上所述，优选地与CD3ζ/CD247基因内的位点互补的)同源臂。
在一些实施方式中，核酸构建体以5'到3'顺序包含：第一载体DNA序列、左同源臂、编码自切割肽的核酸序列、编码CD3ζ缺陷型CAR的核酸序列片段、右同源臂和第二载体DNA序列。在某些实施方式中，第一和第二载体DNA序列还可以是第一和第二病毒序列(参考实施例1)。在一些实施方式中，不需要或不使用载体序列。
在一些实施方式中，核酸构建体以5'至3'顺序包含或由以下组成：左同源臂、编码自切割肽的核酸序列、编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸序列和右同源臂。
在某些实施方式中，用于将CD3ζ缺陷型CAR片段引入免疫细胞的基因编辑系统包含：
i.编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸序列，
ii.编码或包含蛋白分离位点的核酸序列，和
iii.编码同源重组系统的核酸序列，该重组系统适用于在细胞的基因组内的靶位点处靶向整合核酸序列，
从而同源重组系统将构建体整合在所述细胞的CD3ζ/CD247基因内的位点处。
在一种实施方式中，免疫细胞优选地与靶向CD3ζ/CD247基因的向导RNA(例如sgRNA)共同电穿孔，其中构建体的第二核酸序列区包含：
i)与CD3ζ/CD247基因内的第一靶序列互补的在构建体5'端的CAR片段上游的左同源臂和
ii)与CD3ζ/CD247基因内的第二靶区互补的在构建体3'端处的CAR片段下游的右同源臂。
在一种实施方式中，NK细胞优选地与靶向CD3ζ/CD247基因的向导RNA共同电穿孔。向导RNA序列对于靶向的基因破坏至关重要。本文公开的向导RNA(参考实施例5)通过引导特异性切割为靶向基因破坏提供有益效果。靶向破坏CD3ζ/CD247基因导致通过基因融合正确整合CAR片段，并且导致功能性CD3ζ/CAR融合蛋白的充分翻译。这种功能性CD3ζ/CAR融合蛋白是有利的，因为它被有效地转运到并锚定到质膜中，CAR结构域功能性地呈递在细胞表面处和细胞内的CD3ζ元件用于诱导细胞信号转导。使用本文公开的向导RNA的CD247-KI方法提供的有益效果包括减少CAR细胞耗竭、减少分化、大量减少激活诱导的细胞死亡，以及降低CAR疗法副作用的风险，特别是使用原代和永生化NK细胞。
因此，本发明提供了向导RNA序列，其用于靶向也可以应用于NK细胞的CD3ζ/CD247基因，以及用于减少CAR疗法的副作用和CAR细胞产品耗竭，其通过实现空间、时间和持久的肿瘤特异性效应，优选地通过细胞的全身给药实现，但由于在适当条件下的CAR表达，以组织特异性方式发挥作用。
在一些实施方式中，同源定向修复(HDR)模板是核酸分子，优选双链DNA，也用于基于同源定向修复基因编辑的技术。在用于产生基因修饰的免疫细胞的方法的一些实施方式中，双链DNA修复模板是同源定向修复(HDR)模板。
在一些实施方式中，如Roth等人(2018Nature)所述来产生同源定向修复(HDR)模板。
在一种实施方式中，本发明提供了使用同源定向修复(HDR)方法将转基因插入细胞中的方法。在一种实施方式中，HDR dsDNA模板连同与单向导RNA(sgRNA)复合的CRISPR-Cas9核糖核蛋白(Cas9)通过共同电穿孔的方式转移至细胞中(参考实施例1和5)。
通过HDR进行基因组编辑有利于将大的转基因特异性地且高效地以及无病毒载体地插入靶细胞。有利的是保持被转染细胞的活力和细胞功能并使得高产率的基因修饰的细胞用于临床应用(参考实施例6)。
本发明的其他方面涉及基因修饰的人细胞，其包含外源核酸序列区，所述外源核酸序列区编码嵌合抗原受体(CAR)片段，没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，所述外源核酸序列区被框内整合至内源CD3ζ基因中。
在一些实施方式中，基因修饰的细胞是用本文所述的构建体修饰细胞的产物。关于上述构建体或方法公开的特征适用于基因修饰的细胞，反之亦然。
在一些实施方式中，基因修饰的细胞将嵌合抗原受体(CAR)表达为包含CAR片段和内源CD3ζ基因的细胞内结构域的框内融合蛋白，所述细胞内结构域包含一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
如上所述，CD3ζ蛋白包含细胞外结构域和跨膜结构域，随后是包含三个ITAM的细胞内结构域。对于基因修饰的免疫细胞中的功能性CAR，需要至少一个ITAM，使得为了选择用于将CAR转基因融合至CD3ζ/CD247基因中的整合位点，优选地选择CD3ζ/CD247基因内的位点，其在至少一个ITAM(更优选三个ITAM)的上游。技术人员能够鉴定编码ITAM结构域的序列和用于CAR/CD3ζ融合的框内整合的合适位点。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，将编码CAR片段的至少第一核酸序列区和内源CD3ζ序列融合，以使多顺反子mRNA能够包含CAR片段的多肽序列和内源CD3ζ的编码区，其中包含蛋白分离位点(例如肽切割位点)的氨基酸序列位于CAR多肽的上游。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，构建体可以另外包含例如编码CAR调节蛋白、免疫刺激蛋白和/或治疗性蛋白的序列，如上所述，其融合至所述CAR片段并被配置成编码多顺反子mRNA，其中氨基酸序列包含蛋白分离位点，例如肽切割位点，其位于CAR多肽和每个另外的多肽之间。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，编码CD3ζ缺陷型CAR片段的第一核酸直接跟随提供蛋白分离位点的第三核酸区。细胞的剪接体能够正确剪接由融合至所述CD3ζ缺陷型CAR片段和所述蛋白分离位点的内源CD3ζ序列组成的转录物，使得保持外源CAR片段后随至少一个内源CD3ζITAM的开放阅读框用于翻译。在CAR片段的上游，外源蛋白分离位点跟随内源CD3ζ序列。蛋白分离位点，优选P2A肽切割位点，适合于在翻译期间或翻译之后将与CD3ζITAM多肽融合的CAR片段多肽与不需要的内源CD3ζ片段分离。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，所述融合CAR多肽具有功能性并且呈递在所述免疫细胞的表面上。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，嵌合抗原受体(CAR)-CD3ζ融合基因在内源CD3ζ启动子和内源CD3ζ表达终止信号的控制下表达。
在基因修饰的免疫细胞的一种实施方式中，嵌合抗原受体(CAR)-CD3ζ融合基因在内源CD3ζ启动子的控制下表达，并且其中嵌合抗原受体(CAR)的表达被内源CD3ζ基因表达终止信号和内源poly-A信号终止。
在基因修饰的细胞的一些实施方式中，CAR转基因被融合至内源CD3ζ/CD247基因，其中融合位点在内源CD3ζ/CD247基因启动子的下游，使得所述融合CAR在内源CD3ζ/CD247基因的启动子和表达终止信号的控制下。
在一些实施方式中，融合至CD3ζ/CD247基因中的CAR转基因是或可以称为CAR-CD3ζ融合基因及其相应的转录物CAR-CD3ζ融合mRNA，其中从CAR-CD3ζ融合mRNA翻译的多肽是或可称为CAR-CD3ζ融合蛋白或融合CAR。
专家将不期望CAR/CD3ζ融合的内源表达调节对CAR细胞产品的抗肿瘤活性、耐力、扩增提供如此有益的作用，尤其是在一些实施方式中，与现有技术的CAR相比，CAR/CD3ζ融合蛋白的表达减少。
在TCR-复合物组分的内源启动子下控制基因表达提供了根据肿瘤信号和激活免疫细胞的信号，由所述细胞对致病细胞(优选肿瘤细胞)变得有效所需的调节基因表达的优势。
在一些实施方式中，在基因修饰的细胞中，TCR复合物的内源表达和/或功能，优选TCRα和/或β链，或TCRα、β、δ和/或γ链的表达和/或功能，被干扰(扰乱、破坏和/或抑制)。
在基因修饰的细胞的一些实施方式中，TCRα和/或β链的内源表达和/或功能被破坏。
在一些实施方式中，构建体的整合破坏或减少选自由CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链和CD3ζ链组成的组的蛋白的表达(参考实施例2和3)。
在一些实施方式中，提供了免疫细胞，其中融合CAR在细胞的表面处表达，并且其中功能性TCR复合物的表达和在细胞表面处的呈递减少和/或不存在。
在一些实施方式中，基因修饰的细胞是免疫细胞，优选地选自由以下组成的组：T淋巴细胞、T调节(Treg)细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、永生化免疫细胞(包括NKT、NK-92和YT细胞)，或源自人外周血、人脐带血、骨髓干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的细胞，其中所述T淋巴细胞优选是CD4或CD8 T细胞，更优选是细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。如实施例13中所示，CD247-KI方法提供了用于重编程用于过继T细胞转移的不同细胞类型的方法。
在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是T淋巴细胞，其中T淋巴细胞优选是CD4或CD8 T细胞，更优选细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是T调节性(Treg)细胞。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是自然杀伤T(NKT)。
在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是永生化免疫细胞，包括NKT、NK-92和YT细胞。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是源自人外周血、骨髓干细胞或人脐带血的细胞。在基因修饰的细胞的一些实施方式中，细胞是源自诱导型多能干细胞(iPSC)的细胞。
在过继细胞转移中，基于T细胞的细胞毒性反应用于攻击癌细胞。对患者的癌症有响应的天然的或经基因工程化的T细胞在体外产生，并且然后转移回癌症患者体内。此类T细胞可以通过高浓度的IL-2和/或其他细胞因子(诸如IL-7和IL-15)、抗CD3和抗CD28包被的微珠刺激体外增殖。因此，在一些实施方式中，本发明涵盖过继细胞转移与给药本文所述的CAR表达细胞联合使用。
刺激性细胞因子的表达仅在局部(优选地在肿瘤内或肿瘤附近)增强T细胞的激活，并且随后导致记忆效应细胞表型，从而延长治疗的疗效。与插入TRAC基因座中的现有技术CAR相比，通过整合至CD3ζ/CD247基因中的本发明的CD3ζ截短CAR在抗原接合之后出乎意料地减少细胞因子产生是另外有利的。此外，在一些实施方式中，CAR转基因的特别优势是CAR表达和CAR表面密度降低，导致毒性降低，过度激活或非肿瘤在靶毒性诸如细胞因子释放综合征或ICANS的风险降低。(参考实施例10)。
在基因修饰的免疫细胞的实施方式中，免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg细胞。如实施例12所示，CD3ζ截短CAR整合至CD3ζ/CD247基因中可以用于产生CAR阳性CD4+调节性T细胞。
在一种实施方式中，表达CAR的细胞表达多于一种免疫刺激和/或免疫抑制失效基因和/或使得所述细胞被破坏的诱导性自杀基因。作为非限制性实施方式，自杀基因是编码α疱疹病毒(HHV1-3)的胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶脱氨酶(其可以将5-氟胞嘧啶转化成高毒性化合物5-氟尿嘧啶)以及诱导型caspase-9或caspase-8或胞嘧啶脱氨酶的基因。诱导型caspase-9可以被特定的二聚化的化学诱导剂(CID)激活。自杀基因还可以是在细胞表面上表达的多肽，并且可以使细胞对治疗性单克隆抗体敏感。自杀基因表达可以是诱导型的，例如通过适于人细胞的多西环素。
本发明的另外方面涉及用作药物的基因修饰的细胞。
在一些实施方式中，细胞用于治疗与存在的表达癌基因的致病细胞，诸如癌细胞，更优选实体和血液恶性肿瘤的癌症干细胞相关的医学疾患的用途。
在一些实施方式中，细胞用于治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的用途。
因此，本发明的CAR代表用于治疗本文所述的各种疾病的显著且有益的方法，这些疾病对修饰的免疫细胞的靶向活性敏感。由于表达调节的选择性和特异性而导致的最小(如果有)不良副作用也代表本发明的有益和出乎意料的方面。特别是在对其他实体或液体肿瘤治疗产生耐药性的患者中，本发明代表根除恶性肿瘤的有前景方法。如实施例11中所示，CAR整合至CD3ζ/CD247中消除了CAR T细胞的同种异体反应性，类似于TRAC插入的CAR T细胞。
在一些实施方式中，有利的是本发明中的CAR构建体可以用于治疗实体瘤和/或液体肿瘤，即白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，基因修饰的细胞用作药物，其中待用所述免疫细胞治疗的疾患选自如本文所述的癌症的组，优选地由前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)组成。
在免疫缺陷NRG小鼠的异种移植前B ALL小鼠模型中，使用CD247 KI CD19 CAR T细胞在体内测试CD247 KI方法。在使用CD247-KI CD19-CAR T细胞的异种移植前B ALL小鼠模型中证明了对现有技术有利的显著白血病控制(参考实施例14)。这证实了本文公开的CD247 KI CAR细胞策略的益处和高效、安全性、功效以及功能。
本发明的各个方面均受到抗肿瘤免疫应答中局部免疫系统刺激的出乎意料和有益的概念的约束，通过先天免疫系统或通过联合免疫疗法。出乎意料的是，TCR缺陷型CAR-T细胞将表达并呈递功能性转基因CAR/CD3ζ融合蛋白，如实施例2至5所示，其表现出如此有效的抗肿瘤作用。此外，出乎意料的是，CAR-NK细胞和CAR-Treg细胞将有效表达并呈递转基因CAR/CD3ζ融合蛋白，如实施例中所示。
本发明通过如本文所述的CAR-T细胞或CAR-NK细胞中的CAR/CD3ζ融合蛋白实现有利于抗肿瘤作用的出乎意料且有利的内源CAR表达率。如本文所述，内源调节的CAR表达(实施例3)与提高的细胞扩增和耐力相结合支持抗肿瘤免疫应答并导致肿瘤尺寸和/或生长的减少，并且显示明显减少和/或避免在同种异体条件下由CAR和TCR复合物表达的过表达产生的副作用(参考实施例11)。副作用，诸如GvHD、ICANS(免疫效应细胞相关的神经毒性综合征)、细胞因子释放综合征、对重组蛋白的免疫应答、肿瘤逃逸、恶心和呕吐、口腔或嘴唇溃疡、腹泻、嗜睡、过敏反应、发热或冷颤、荨麻疹、瘙痒、头痛、咳嗽、呼吸急促，或面部、舌或喉咙肿胀，可以通过本文所述的方法避免。
因此，本发明提供了通过实现空间、时间和持久的肿瘤特异性效应来减少CAR疗法的副作用和CAR细胞产品耗竭的方法，该肿瘤特异性效应优选地通过细胞的全身给药来实现，但由于在适当条件下的CAR表达，以组织特异性方式发挥作用。
作为在CAR疗法中避免或减少副作用的进一步积极作用，与现有技术的CAR相比，在通过整合在CD247基因中的CD3ζ缺陷型CAR暴露抗原之后观察到显著更低的细胞因子产生。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞是CD4+和/或CD8+T细胞，优选CD4+和CD8+T细胞的混合物。这些T细胞群，以及优选包含CD4+和CD8+转化细胞的组合物，显示出对各种实体或液体肿瘤特别有效的细胞溶解活性。
在一种实施方式中，修饰的细胞包含CD4+和CD8+T细胞，优选地比例为1:10至10:1，更优选地比例为5:1至1:5、2:1至1:2或1:1。以所述比例，优选地以1:1CD4+/CD8+比例，给药表达本文所述的CAR片段(例如抗CD19 CAR片段或抗HER2 CAR片段)的抗肿瘤抗原定向的修饰的CAR-T细胞，导致在治疗本文提及的疾病期间的有益特征，例如这些比率导致治疗响应提高和毒性降低(参考实施例8和11)。
在一种实施方式中，携带编码在并非CD3ζ/CD247的另一个基因座中的CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸构建体的基因修饰的细胞不提供细胞毒性水平或提供非治疗相关的细胞毒性水平。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是同种异体的，优选是同种异体T细胞、NK细胞或Treg。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是同种异体NK细胞。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是同种异体Treg。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是同种异体TCRγ/δT细胞。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是自体的，优选是自体NK细胞。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是自体NK细胞。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是自体Treg。
在一种实施方式中，基因修饰的细胞对于患者是自体TCRγ/δT细胞。
在一些实施方式中，细胞可以获自不同于预期患者的受试者，因此是同种异体细胞。如本文所用，如果细胞或其祖细胞之一源自同一物种的另一受试者，则该细胞对于受试者是“同种异体的”。如本文所用，如果细胞或其祖细胞源自同一受试者，则该细胞对于受试者是“自体的”。
为了使用“现成的”同种异体或自体CAR-T细胞或CAR-NK细胞，优选CAR-NK细胞，本发明人开发了工程化表达肿瘤抗原的CAR-T细胞或CAR-NK细胞的方法，迄今为止，与同种异体表达CAR的细胞相比，这些细胞表现出更少的不良副作用(如果有)。
根据适应症和/或肿瘤特异性抗原，同种异体“现成的”CAR-T细胞产品，如本发明所述，可以从储备的健康供体的细胞中产生，并且适用于大量患者人群。本发明提供的方法能够降低个体剂量的CAR-T细胞产品的成本和产生CAR-T细胞的失败率。特别地，治疗的开始被加速以对患者有益(参考实施例12)。
与使用同种异体T细胞产品相关的最严重风险是经常致命的急性移植物抗宿主病(GvHD)，由此供体的(CAR修饰的)T细胞将患者的组织识别为“外来的”并通过它们的内源TCR对其进行攻击。由于本发明的细胞的有益特性，与已知方法相比，这些风险降低。
表达本发明的融合CAR的自体或同种异体细胞的移植是可行的。例如，当在自体细胞移植之后重新引入患者体内时，用如本文所述的本发明的CAR片段修饰的T细胞可以识别并杀死肿瘤细胞(参考实施例9)。
使用CAR-NK细胞允许降低在同种异体细胞环境中移植物抗宿主病的风险。CAR-NK细胞产品可以优选地用作同种异体“现成的”产品。本发明能够出乎意料地安全且有利地使用同种异体免疫细胞，特别是同种异体CAR-T细胞，因为它们有益地缺失在细胞表面上的TCR呈递，如上所述，以及细胞内肿瘤依赖性调节表达在CAR-T细胞或CAR-NK细胞中的CAR/CD3ζ融合蛋白，如本文所述。
本发明进一步涉及从如本文所述的基因修饰的细胞表达的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含作为框内融合蛋白的嵌合抗原受体(CAR)，该框内融合蛋白包含外源CAR片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，和内源CD3ζ/CD247基因的细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
在一种实施方式中，CAR片段包含：
-CAR信号序列，优选地根据SEQ ID NO 4或与SEQ ID NO 4具有至少80％序列同一性的序列，和
-单链可变片段，例如对人CD19抗原特异的鼠单链可变片段，优选地根据SEQ IDNO 5和7或根据SEQ ID NO 59，或与SEQ D NO 5和7或与SEQ ID NO 59具有至少80％序列同一性的序列，和
-CAR的免疫球蛋白重链恒定区或间隔子，优选地根据SEQ ID NO 8-10，或与SEQID NO 8-10具有至少80％序列同一性的序列；和
-CD28信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO 11和12或与SEQ ID NO 11和12具有至少80％序列同一性的序列；其中CD28信号转导结构域包含跨膜结构域，优选地根据SEQID NO 11，或与SEQ ID NO 11具有至少80％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，构建体可以进一步包含
-包括蛋白翻译终止信号的截短的CD3ζ信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO21，或与SEQ ID NO 21具有至少80％序列同一性的序列，或
-缺少蛋白翻译终止信号的截短的CD3ζ信号转导结构域，优选地根据SEQ ID NO18，或与SEQ ID NO 18具有至少80％序列同一性的序列，或
在另外一些实施方式中，本发明涉及CAR多肽，其包含一个或多个外源接头、外源间隔子、外源跨膜以及外源和内源信号转导结构域。在一种实施方式中，CAR包含细胞内结构域，其包含外源共刺激结构域和内源信号转导(激活)结构域，其中内源信号转导结构域优选是CD3ζ结构域。
外源信号转导结构域的交换满足对强大而快速的效应阶段(CD28共刺激结构域)或由T细胞记忆群(4-1BB信号转导结构域)保护的持久复发控制的需求。如本文所证明的，各种信号转导结构域可以在多种配置中交换，从而在不损失有利结合特性的情况下为CAR提供关于其设计的灵活性。
由于将变体(通过添加可选组分)用作接头、间隔子、跨膜和细胞内结构域，显然可以根据技术人员的需要交换各种组分，并且可以保持肿瘤-抗原结合特性，从而保持期望的生物学效应。
还可以根据需要交换包含蛋白结构域的细胞内ITAM，例如CD3链ε、γ和δ是本领域技术人员已知的。
在一些实施方式中，“TCR复合物特异性”启动子的使用可以与CAR-T细胞或CAR-NK细胞激活信号、细胞特异性和细胞扩增结合在减少不需要的全身副作用方面表现出协同效应。本发明的CAR-T细胞或CAR-NK向炎性组织，特别是肿瘤组织迁移。使用启动子用于表达优先在炎症条件下表达或存在于肿瘤组织中的细胞因子，进一步以协同方式增强全身表达减少，从而提供出乎意料的益处(参考实施例7)。
本发明进一步涉及药物组合物，其包含如本文所述的基因修饰的细胞和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，用根据本发明的基因修饰的细胞的治疗可以与一种或多种抗癌治疗或药物联合使用，该抗癌治疗或药物优选地选自以下的组：抗体疗法、疫苗、溶瘤病毒疗法、化学疗法、放射疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法、免疫抑制或移植。
本发明进一步涉及治疗本文所述的医学病症的方法，通常包括向需要所述治疗的患者给药治疗有效量的与内源CD3ζ结构域互补的CD3ζ缺陷型CAR片段或表达所述CAR的免疫细胞。
本发明进一步涉及药物组合物，其包含根据本文所述的本发明的基因修饰的细胞和药学上可接受的载体。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴内注射或腹腔向患者给药。
本说明书中所述的所有特征可以用于定义本发明的任何其他实施方式或方面，例如，用于描述细胞的特征可以用于描述构建体，反之亦然。类似地，用于描述本发明方法的特征可以用于描述细胞或构建体，反之亦然。
具体实施方式
免疫系统的重要功能是识别和消除肿瘤。肿瘤抗原或者在肿瘤细胞上特异性表达，但在非致病性细胞上不存在，或者异常表达，例如高于非致病细胞，诸如CD19中存在水平至少两倍。抗原，特异性地存在于肿瘤细胞上，对于免疫系统可能是外来的，并且它们的存在可能导致免疫细胞攻击转化的肿瘤细胞。
免疫系统对肿瘤的应答是在杀伤性T细胞、自然杀伤(NK)细胞的帮助下，有时在辅助性T细胞的帮助下，破坏异常细胞。肿瘤抗原以与病毒抗原类似的方式呈递在MHC I类分子上。这使杀伤性T细胞(CD8+T细胞)能够将肿瘤细胞识别为异常。MHC II类分子呈递肿瘤抗原刺激T辅助细胞(CD4+T细胞)。NK细胞也以类似的方式杀死肿瘤细胞，尤其是如果肿瘤细胞表面的MHC I类分子比正常细胞少；这是肿瘤中的普遍现象。一些肿瘤细胞还释放抑制免疫应答的产物，例如通过分泌抑制巨噬细胞和淋巴细胞活性的细胞因子TGF-β。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是表现出T样和NK样混合表型的一组免疫效应细胞。
因此，如本文所述，本发明提供了在基因修饰的免疫细胞(例如T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、NK细胞)中，通过表达针对肿瘤抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)来实现和/或增强抗肿瘤免疫应答的方法。如本文所述，所述CAR的表达受特异性内源启动子的控制，同时在所述基因修饰的免疫细胞中放弃TCR复合物。
在本发明背景下的免疫疗法应理解为包括使用免疫系统进行癌症治疗的任何治疗剂。免疫疗法利用癌细胞的表面上具有细微不同分子的事实，这些分子可以被免疫系统识别。免疫疗法涵盖但不限于细胞疗法和抗体疗法。细胞疗法通常涉及给药从患者的血液或肿瘤中分离的免疫细胞。针对待治疗肿瘤的免疫细胞被激活、培养并返回到免疫细胞攻击癌症的患者体内。可以这种方式使用的细胞类型包括但不限于自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、细胞毒性T细胞和树突细胞。树突细胞疗法通过使树突细胞呈递肿瘤抗原来激发抗肿瘤反应。树突状细胞将抗原呈递至淋巴细胞，使其激活，启动它们杀死呈递抗原的其他细胞。
因此，本发明提供了用于免疫细胞治疗的策略，该策略使用基因编辑方法优选地在至少一个内源启动子和表达终止信号的控制下整合一个或多个治疗性转基因，从而能够在治疗性免疫细胞中进行细胞特异性和内源控制的表达。以上描述了本发明的各个方面和实施方式，以及它们相对于现有技术的优点。
嵌合抗原受体：
在各种实施方式中，提供了重定向免疫效应细胞的细胞毒性的基因修饰的受体。这些基因工程化的受体在本文中称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将基于抗体的对期望抗原(例如CD19)的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域结合，以生成表现出(例如对CD19的)特异性抗基因细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用，术语“嵌合”描述了由来自不同来源的不同蛋白或DNA的部分组成。
根据本发明，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该细胞外抗原结合结构域包含结合靶抗原的抗体或抗体片段。CAR通常被描述为包含源自抗体的细胞外胞外域(抗原结合结构域)和包含最初源自T细胞信号转导蛋白的信号转导模块的胞内域。
在优选的实施方式中，胞外域优选地包含来自免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，其被配置作为单链可变片段(scFv)。scFv优选地附接至铰链区，该铰链区提供柔性并通过锚定跨膜部分将信号转导至细胞内信号转导结构域。跨膜结构域优选地源自CD8a或CD28。在第一代CAR中，信号转导结构域由TCR复合物的ζ链组成。术语“生成”是指细胞内信号转导结构域的结构。第二代CAR配备了源自CD28或4-1BB的单一共刺激结构域。第三代CAR已经包括两个共刺激结构域，例如CD28、4-1BB、ICOS或OX40、CD3ζ。第四代CAR另外递送免疫刺激蛋白和/或检查点调节蛋白。第五代CAR掺入用于调节CAR表达的控制元件，这允许例如通过自杀基因，诱导和/或完全关闭CAR表达或CAR表达细胞。本发明优选地涉及第三代、第四代或第五代CAR。
本发明的方法包括给药设计用于表达CAR的细胞。在一些实施方式中，选择配体或细胞外配体结合结构域，使得表达CAR的细胞靶向癌细胞或肿瘤。任何癌抗原可以是肿瘤抗原，并且任何肿瘤抗原均可以是癌症抗原。CAR的细胞外抗原结合结构域通常源自单克隆抗体(mAb)或源自受体或其配体。
本文设想的CAR包含结合优选靶蛋白的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原结合结构域)、跨膜结构域和细胞内结构域或细胞内信号转导结构域。“靶蛋白”和“靶抗原”可互换使用。在一种实施方式中，优选的靶蛋白是CD19。CAR的抗CD19抗原结合结构域与在靶细胞表面上的CD19接合导致CAR聚集，并向含有CAR的细胞传递激活刺激。
在各种实施方式中，CAR包含细胞外结合结构域，其包含对人源化CD19具有特异性的结合结构域；跨膜结构域；一个或多个细胞内信号转导结构域。在具体实施方式中，CAR包含细胞外结合结构域，其包含其人源化抗CD19抗原结合片段；一种或多种间隔子结构域；跨膜结构域；一种或多种细胞内信号转导结构域。“细胞外抗原结合结构域”或“细胞外结合结构域”可互换使用，并具有特异性地结合目标靶抗原CD19的能力。结合结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在一些实施方式中优选的是scFv结构域或VHH(仅可变重链)结构域片段。
“特异性结合”应理解为通过本领域技术人员，由此技术人员清楚地知晓可用于测试结合和结合特异性的各种实验程序。用于确定平衡缔合或平衡解离常数的方法是本领域已知的。在许多蛋白质-蛋白质相互作用中，一些交叉反应或背景结合可能是不可避免的；这并不是降低CAR和表位之间结合的“特异性”。举例来说，“特异性结合”描述了例如抗CD19抗体或其抗原结合片段(或包含其的CAR)以比背景结合更大的结合亲和力与CD19的结合。当在理解抗体和表位之间的相互作用时考虑术语“特异性”时，术语“针对”也适用。
“抗原(Ag)”是指可以刺激动物产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物或物质。在具体实施方式中，靶抗原是CD19多肽的表位。“表位”是指结合剂结合的抗原区域。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。可以根据癌症的类型选择任何合适的抗原。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中并以任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)存在。通常，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合期望的结构。在优选的实施方式中，本文设想的CAR包含对抗原具有特异性的结合结构域，其是scFv并且可以是鼠、人或人源化scFv。单链抗体可以从对期望的靶标具有特异性的杂交瘤的V区基因中克隆。
在具体实施方式中，对抗原具有特异性的结合结构域是结合人CD19多肽的人源化scFv。适用于构建本文设想的抗CD19 CAR的可变重链的示例性实例包括但不限于SEQ IDNO:5-7中所示的氨基酸序列。适用于构建本文设想的抗CD19 CAR的可变轻链的示例性实例包括但不限于SEQ ID NO:5-7中所示的氨基酸序列。
抗体和抗体片段：
CAR包含细胞外抗原结合结构域，其包含例如结合CD19多肽的抗体或抗体片段。因此，本发明的抗体或抗体片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链片段(scFv)、单可变片段(ssFv)、单域抗体(诸如纳米抗体的VHH片段)、Fab片段、F(ab')2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体和表位结合片段或其任何上述的组合，前提是它们保留与本文所述的CAR(优选地包含相应的CDR，或如本文所述的VH和VL区)相似的结合特性。微型抗体和多价抗体诸如双抗体、三抗体、四价抗体和多聚肽体(peptabody))也可用于本发明的方法中。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类别(即IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或免疫球蛋白分子的亚类。因此，如本文所用，术语抗体还包括本发明的CAR所包含的抗体和抗体片段，其通过修饰完整抗体产生或使用重组DNA方法从头合成。
如本文所用，“抗体”通常是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白。当使用术语“抗体”时，也可以认为是指术语“抗体片段”。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知基本免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体或二聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(L)链(约25kD)和一条“重”(H)链(约50-70kD)。每条链的N端限定了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”和“可变重链”分别是指轻链和重链的这些可变区。任选地，抗体或抗体的免疫学部分可以与其他蛋白化学缀合或表达为融合蛋白。
本发明的CAR旨在针对哺乳动物(特别是人)蛋白靶点进行结合。蛋白名称的使用可能对应于蛋白的小鼠或人形式。
根据本公开的结合结构域多肽和CAR蛋白的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)，或通过结合缔合，或使用标记配体的置换测定，或使用表面-等离激元共振装置，诸如Biacore。
抗体的可变区是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)组成，框架区由三个互补决定区(CDR)连接，也称为高变区。每条链中的CDR被FR紧密结合在一起，并且与来自另一条链的CDR一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。
CAR的其他组分
在某些实施方式中，本文设想的CAR可以包含在各种结构域之间的接头残基，其添加用于分子的适当间隔和构象，例如包含氨基酸序列的接头，该氨基酸序列连接VH和VL结构域并提供与两个亚结合结构域的相互作用相当的间隔子功能，使得所得多肽保留对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本文设想的CAR可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在具体实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸或任何插入长度的氨基酸。接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸-丝氨酸聚合物；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和本领域已知的其他柔性接头，诸如Whitlow接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可能能够充当融合蛋白诸如本文所述的CAR的结构域之间的中性系链。在具体实施方式中，CAR的结合结构域后接一个或多个“间隔子”或“间隔子多肽”，其是指将抗原结合结构域从效应细胞表面移开以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域。在某些实施方式中，间隔子结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔子结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一种实施方式中，间隔子结构域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。在一种实施方式中，此类间隔区/铰链区的Fc结合结构域以阻止CAR与在巨噬细胞和其他先天免疫细胞上表达的Fc受体结合的方式发生突变。
在一些实施方式中，CAR的结合结构域可以后接一个或多个“铰链结构域”，其在将抗原结合结构域定位远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活方面发挥作用。CAR可以在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述CAR的示例性铰链结构域包括源自1型膜蛋白诸如CD8α、CD4、CD28、PD1、CD 152和CD7的细胞外区的铰链区，它们可以是这些分子的野生型铰链区或可能被改变。在另一种实施方式中，铰链结构域包含PD1、CD 152或CD8α铰链区。
“跨膜结构域”是CAR的一部分，其融合细胞外结合部分和细胞内信号转导结构域，并将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。TM结构域可源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD3s、ΟΩ3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一种实施方式中，本文设想的CAR包含源自CD8α或CD28的TM结构域。
在具体实施方式中，本文设想的CAR包含细胞内信号转导结构域。“细胞内信号转导结构域”是指CAR的一部分，其参与将有效的抗CD19 CAR与人CD19多肽结合的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包括CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或抗原与细胞外CAR结构域结合引起的其他细胞反应。术语“效应功能”是指免疫效应细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或协助或活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号转导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白部分。本文设想的CAR包含一个或多个共刺激信号转导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效、扩增和/或记忆形成。如本文所用，术语“共刺激信号转导结构域”是指共刺激分子的细胞内信号转导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其提供T淋巴细胞在与抗原结合后有效激活和发挥功能所需的第二信号。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其有助于有效的免疫应答。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。包括但不限于，此类共刺激分子的其他实例是CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD 26)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性结合CD83的配体。
共刺激细胞内信号转导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。在一种实施方式中，CAR包含细胞内结构域，其包含共刺激结构域和信号转导(激活)结构域。因此，CAR构建体可以包括天然T细胞受体复合物的细胞内信号转导结构域(CD3ζ)和提供第二信号以刺激完全T细胞激活的一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域被认为可以增加CAR-T细胞细胞因子的产生并促进T细胞复制和T细胞持久性。共刺激结构域还被证明可以潜在地防止CAR-T细胞耗竭，增加T细胞抗肿瘤活性，并提高CAR-T细胞在患者体内的存活率。作为非限制性实例，在临床前研究中，具有4-1BB共刺激结构域的CAR构建体已经与T细胞亚群组成中的渐进、持续扩增和效应功能、持久性增加以及中央记忆细胞(TCM)富集相关。4-1BB是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员，并且它是体内可诱导的糖蛋白受体，其主要在抗原激活的CD4和CD8 T细胞上表达。作为非限制性实例，CD28是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。它在静息和激活的CD4和CD8 T细胞上组成型表达，并且通过刺激PI3K-AKT信号转导通路在T细胞激活中发挥关键作用。在一种实施方式中，细胞内结构域包含4-1BB和CD28共刺激结构域。其他共刺激结构域包含可以与CD3ζ信号转导(激活)结构域组合的ICOS和OX40。
在一些非限制性实施方式中，CAR的细胞内结构域可以另外包含至少一个共刺激信号结构域。这种共刺激信号结构域可以导致T细胞的激活增加。
本文所述的多肽结构域可以用于抗癌CAR以介导期望的功能，诸如信号肽、抗原、结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号结构域和/或共刺激结构域的功能。潜在的期望功能可以包含但不限于提供信号肽和/或跨膜结构域。
本文所述的细胞因子可以涉及对应于本文命名的细胞因子的任何哺乳动物细胞因子。优选地，细胞因子涉及人细胞因子或小鼠细胞因子。癌症免疫疗法尝试刺激免疫系统以排斥和破坏肿瘤。最初，免疫疗法治疗涉及给药细胞因子，诸如，如本文所述的“白介素”。
检查点抑制剂，也称为免疫检查点调节剂，旨在降低检查点蛋白的有效性。它们可能具有多种作用机制，但如果有效，它们能够使免疫系统识别癌细胞表面的其他分子。免疫应答的检查点抑制剂选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。
CAR调节蛋白还可以是诱导或完全关闭CAR表达或表达CAR的细胞的蛋白。在另一种实施方式中，CAR-T细胞或CAR-NK细胞另外包含一种或多种免疫抑制失效蛋白和/或引起CAR-T细胞或CAR-NK细胞死亡以使其选择性破坏的诱导型自杀基因。在一些情况下，可能期望提供使所给药的基因修饰的细胞选择性缺失的安全机制，因为被操纵的细胞可以在给药之后扩散并持续数年。因此，在一些实施方式中，本发明的方法可以包括优选地用重组自杀基因转化T细胞、NK细胞或Treg。该重组自杀基因可以用于优选地降低这些T细胞、NK细胞或Treg在给药于受试者之后的直接毒性和/或不受控制的增殖的风险。自杀基因还能够在体内使转化细胞选择性缺失。具体地，自杀基因具有将无毒前体药物转化成细胞毒性药物或表达毒性基因表达产物的能力。换言之，“自杀基因”优选地是编码产物的核酸，由此产物本身或在其他化合物的存在下导致细胞死亡。
TCR、CD3和CD3ζ
“T细胞受体”(TCR)是TCRα和TCRβ链的异二聚体。TCR复合物由TCR和CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ形成。T细胞受体α、T细胞受体β、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ链中的一条或多条链的中断或表达减少可以用于减少或防止功能性T细胞受体(TCR)复合物的形成。通过减少或阻止功能性TCR复合物的形成，T细胞不再通过其TCR复合物介导免疫应答。在实施方式中，编码CAR的核酸被整合至细胞基因组内部的位点处，该位点中断或减少T细胞受体α链、T细胞受体β链、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链或CD3ζ链的表达。虽然减少TCR复合物的蛋白中的一种可能已充分，但应理解，如有需要，可以减少TCR复合物的多于一种组分。
抗原呈递细胞激活T细胞受体(TCR)，并且TCR介导的信号通过CD3ζ链、δ链、ε链和γ链跨细胞膜传递。所有CD3链均在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。CD3ζ是TCR-CD3复合物的一部分，其存在于T淋巴细胞表面上并在适应性免疫应答中发挥重要作用。CD3ζ由CD247基因编码。仅内源CD3-ζ包含三个ITAM并将激活信号传递至细胞，例如与抗原结合之后的淋巴细胞系，诸如T细胞。在一些实施方式中，CAR包含可以激活或刺激T细胞的细胞内CD3-ζ信号结构域。CD3ζ/CD427基因的表达是TCR复合物形成的限速因素，并且CD247表达决定了TCR复合物的组装率和功能。应当理解，CD3ζ核酸分子是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。
多肽
除非另有说明，否则“肽”、“多肽”、“多肽片段”和“蛋白”可互换使用，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列。多肽不限于特定长度，例如，它们可以包含全长蛋白序列或全长蛋白的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰，天然存在的和非天然存在的。
在各种实施方式中，本文设想的CAR多肽在蛋白的N端处包含信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后指导蛋白的转移。可以使用多种熟知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备多肽。本文设想的多肽特别涵盖本公开的CAR，或具有如本文公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换的序列。
如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从细胞环境中以及从与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化，即它与体内物质没有显著缔合。类似地，“分离的细胞”是指已经从体内组织或器官获得并且基本上不含细胞外基质的细胞。
融合蛋白、融合基因
如本文所用，“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包含通过连接两个或更多个最初编码单独的蛋白、多肽或蛋白片段的核酸区段而形成的蛋白。“融合基因”、“基因融合”或“融合的基因”是根据本发明优选地连接的核酸序列区段，其中至少一个核酸序列也是外源核酸序列并且至少一个其他核酸序列也是内源核酸序列。在优选的实施方式中，外源核酸被整合并融合至内源核酸序列(例如内源基因)中。在一些实施方式中，待融合的整合外源核酸序列可以具有数个组合的基因结构和/或由一个或多个蛋白分离位点分离的编码多肽的序列。
融合基因的翻译产生单个或多个多肽，其功能特性源自每个原始蛋白或蛋白片段。在另外实施方式中，融合的基因可以含有一个或多个编码多肽的核酸序列，其中多肽在翻译后可作为单独的多肽或蛋白存在，其分离由蛋白分离位点介导。
嵌合体(Chimera或chimeras)是指由具有不同功能或属性的多肽组成的杂合蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白组合完整的肽，并且因此含有原始蛋白的所有功能结构域。在某些实施方式中，融合蛋白仅组合部分编码序列，并且因此仅保留形成它们的基因的部分原始功能。
基因融合还可以引起调节变化，从而改变这些基因表达的时间、程度和位置。在一些实施方式中，不同活性位点和/或结合结构域的重排可以另外导致具有新功能和/或特异性的蛋白的形成。编码CD3ζ缺陷型CAR片段和蛋白分离位点的核酸序列可以融合在内源基因内、内源基因启动子下游、内源外显子的连接位点处或之内、或内源内含子的连接位点处或之内。
核酸
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物学活性。
在各种示例性实施方式中，本发明部分设想了包含表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸，以及包含它们的组合物和细胞。可以使用本领域已知的且可用的多种成熟技术中的任何一种来制备、操作和/或表达多核苷酸。为了表达期望的多肽，可以将编码该多肽的核苷酸序列插入合适的载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。其他示例性载体包括，但不限于质粒、噬菌粒、黏粒、人工染色体诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或PI来源的人工染色体(PAC))、噬菌体诸如λ噬菌体或Ml 3噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒类别的实例包括，但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)，用于哺乳动物细胞中慢病毒介导的基因转移和表达。在具体实施方式中，本文公开的嵌合蛋白的编码序列可以连接至此类表达载体中，用于在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区——复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括泛素启动子(ubiquitous promoter)和诱导型启动子。
载体
在具体实施方式中，用非病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体),优选编码CAR的非病毒载体转染细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞)。例如，用编码CAR的载体转染免疫效应细胞，该载体包含人源化抗CD19抗体或结合CD19多肽的抗原结合片段，其具有跨膜和细胞内信号转导结构域，使得这些转导的细胞可以引发CAR介导的细胞毒性反应。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入。载体可以包括指导细胞中自主复制的序列，或可以包括足以实现整合至宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括，例如，质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括，例如，复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。在本发明的其他实施方式中，可以采用介导编码核酸的CD19CAR整合至宿主基因组中的基因编辑技术，优选CRISPR-Cas。用于CRISPR/Cas和TALEN介导的插入的合适载体是技术人员已知的。在某些实施方式中，基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)、整合酶、位点特异性重组酶、兆核酸酶、归巢核酸内切酶或TALEN，更优选源自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9。
对于本领域的技术人员而言显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如，转移质粒)，其包括通常促进核酸分子转移或整合至细胞基因组中的病毒衍生核酸元件，或介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒通常包括各种病毒组分，并且有时除一种或多种核酸外还包括宿主细胞组分。
因此，在优选的实施方式中，本发明涉及用编码CAR的表达载体转染细胞的方法。例如，在一些实施方式中，载体包含另外的序列，诸如促进CAR表达的序列，诸如启动子、增强子、poly-A信号和/或一个或多个内含子。在优选的实施方式中，CAR编码序列的侧翼是转座子序列，使得转座酶的存在实现编码序列整合至转染细胞的基因组中。
在一些实施方式中，基因转化的细胞进一步用转座酶转染，该转座酶促进CAR编码序列整合至转染细胞的基因组中。在一些实施方式中，转座酶作为DNA表达载体提供。然而，在优选的实施方式中，转座酶作为可表达的RNA或蛋白提供，使得转座酶的长期表达不在转基因细胞中发生。例如，在一些实施方式中，转座酶作为mRNA提供(例如，包含帽和poly-A尾的mRNA)。根据本发明的实施方式可以使用任何转座酶系统。然而，在一些实施方式中，转座酶是鲑鱼型Tel样转座酶(SB)。例如，转座酶可以是所谓的“睡美人”转座酶，参见例如，美国专利6,489,458，其通过援引并入本文。在一些实施方式中，转座酶是具有增加的酶活性的工程化酶。转座酶的一些特定实例包括但不限于SB 10、SB 11或SB 100X转座酶(参见，例如Mates等人,2009,Nat Genet.41(6):753-61，或US9228180)。例如，一种方法可以涉及用编码SB 10、SB 1 1或SB 100X转座酶的mRNA对细胞进行电穿孔。
基因编辑和转移
基因编辑技术可以用于干扰在基因组上的任何表达结构(优选TCR复合物组分、CD5、CD7、CD52、MHC和/或控制点基因中涉及的分子)的内源表达。如本文所用，“内源”特别用于定义源自系统诸如宿主、生物体、组织或细胞内的基因表达，而“外源”特别定义通过一种或多种基因、生化或其他方法从外部引入细胞中的基因序列。
基因编辑是一种基因工程，其中通过操纵核酸酶或“分子剪刀”在活生物体的基因组中插入、缺失或替换DNA。这些核酸酶在基因组中的期望位点处产生位点特异性双链断裂(DSB)。诱导的双链断裂通过非同源末端化合物(HEJ)或同源重组(HR)进行修复，导致靶向突变(“编辑”)。五个操纵核酸酶家族可用于基因编辑：(a)兆核酸酶、(b)锌指核(ZFN)、(c)基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、(d)Mega-TALEN、和(e)CRISPR-Cas系统。
在某些实施方式中，CRISPR-Cas9优选地用于基因编辑。“靶向序列”、“靶序列”或“靶位点”主要是指限定结合分子结合和/或切割的核酸的一部分的染色体或染色体外核酸序列，前提是有足够的条件用于结合和/或切割。在任何这些诱导双链断裂的基因编辑方法中，靶序列包含与预期整合至其中的内源DNA序列的识别位点相同的序列，优选地选自由以下组成的组：同源臂、向导RNA靶位点、限制酶识别位点、ZFN识别位点、ZFN切割位点、TALENDNA结合位点、重组酶识别位点、整合酶位点和/或归巢核酸酶识别位点。使用这些人工核酸酶中的每一种的技术为专家所熟知。例如，当使用基因组编辑复合物(例如，TALEN、CRISPR/Cas9、ZFN、Mega-TALEN或兆核酸酶)编辑细胞以引入功能基因或敲除基因时，核酸酶(例如，FokI或Cas9)在修饰位点处诱导双链断裂。在诱导双链断裂后，蛋白，诸如DNA修复蛋白，例如磷酸化(serl778)53BP1(p53BPl)或gH2AC，可以在双链断裂位点处蓄积并指示DNA损伤反应。
这些技术中的一种或多种可以单独使用或以任何组合使用以破坏本发明方法中TCR-复合物组分的内源表达。当基因编辑技术被用于破坏TCR复合物组分的表达时，基因编辑技术可以特别地靶向以下的一种或多种：(i)Cd3ζ基因座，(ii)安全港基因座，(iii)TRAC基因座；(ii)控制TCR-β表达的基因座；(iii)控制TCRγ表达的基因座；(iv)控制TCRδ表达的基因座；(v)控制CD3链表达的基因座。CD3链如上所述。CD3链可以是CD3ζ、CD3ε、CD3δ或CD3γ。在某些实施方式中，携带用于表达至少一个ITAM结构域的基因信息的基因组基因座优选是基因编辑的靶点。
在一些实施方式中，包含失活基因组序列的基因修饰的细胞或动物可以称为“敲除”或“条件性敲除”。类似地，包含整合的序列的基因修饰的细胞或动物可称为“敲入”或“条件性敲入”。
蛋白分离位点
如本文所用，术语“蛋白分离位点”包含触发蛋白序列的双顺反子或多顺反子表达的分离以获得不同表达的蛋白的核酸序列元件。蛋白分离位点可以但不限于是指自切割肽、内部核糖体进入位点(IRES)和/或蛋白水解切割位点。在本发明的优选方面，核酸构建体可以任选地设计成包括蛋白分离位点，优选地在编码CAR或CAR片段的核酸序列的上游。在具体实施方式中，本文设想的核酸序列包含编码一种或多种肽和/或蛋白的一个或多个目标核酸序列区。为了实现大量蛋白中每一种的有效翻译，核酸序列区可以被一个或多个IRES等同物或编码自切割肽或蛋白水解切割位点的核酸序列分离。
“自切割肽(self-cleavage peptide或self-cleaving peptide)”，例如P2A，可以在细胞中的蛋白翻译过程中介导核糖体跳跃。
如本文所用，术语“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的起始密码子，诸如ATG的元件，导致基因的RNA非帽依赖性翻译。专业人员通常使用的IRES实例是美国专利号6,692,736中描述的那些。科学界已知的“IRES”实例包括可以从小核糖核酸病毒获得的IRES和可以从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，诸如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGFII)、翻译起始因子eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、可从Novagen商购获得的脑心肌炎病毒(EMCV)，以及还已在微小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)物种以及HCV中、Friend鼠白血病病毒(FrMLV)和Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒基因组中检测到的VEGF IRES IRES。
术语“蛋白水解切割位点”是指细胞内蛋白水解切割酶破坏蛋白中氨基酸之间的肽键的识别核酸序列。
TCR复合物组分启动子
术语“启动子”用于通过蛋白的结合启动和调节来自其下游DNA的转录的DNA序列。转录的RNA可以编码蛋白。启动子优选地位于基因的转录起始位点附近，在编码DNA的上游(朝向正义链的5'区)。
在一些实施方式中，可以优选使用细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现期望的多核苷酸序列的细胞类型、谱系或组织特异性表达(例如以表达编码仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子集中或在某些发育阶段期间的肽的特定核酸)。
在本发明的方面，提供了一种方法，其中整合的转基因的调节置于内源启动子下，由此待整合的转基因的核酸构建体优选地是启动子缺陷的。在一些实施方式中，编码CAR或CAR片段的待整合的转基因的核酸构建体优选地是启动子缺陷的。一种这样的构建体能够将编码CAR或CAR片段的转基因整合至基因组内的位置，使得整合的核酸序列，即转基因，在内源启动子的控制下。在一些实施方式中，内源启动子是TCR复合物组分的启动子。在一些实施方式中，所述内源启动子优选是编码TCR复合物蛋白的基因的启动子，例如CD3ζ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、TCRα链或TCRβ链，优选包含至少一个细胞内ITAM结构域的基因编码蛋白。
表达终止信号
“表达终止信号”包含在RNA和/或DNA水平下指定转录和/或翻译结束和/或异源核酸转录物的聚腺苷酸化的任何结构元件。转录终止通常由终止子定义，终止子是定义(例如基因的)转录结束并启动新合成RNA释放的核酸序列。终止子位于待转录基因的下游并直接出现在3'调控元件，诸如poly-A信号之后。如本文所用，术语“poly-A位点”、“poly-A信号”或“poly-A序列”是指通过RNA聚合酶II发出新生RNA转录物终止和聚腺苷酸化信号的核酸序列。聚腺苷酸化序列可以通过在编码序列的3'端添加poly-A尾来增强mRNA的稳定性，从而有助于提高翻译效率。重组转录物的有效聚腺苷酸化是优选的，因为没有poly-A尾的转录物不稳定并迅速降解。“终止密码子”也是信使RNA中三个连续核苷酸(称为三联体)的序列，表示在核糖体处的蛋白翻译过程的终止。在本发明的方面，CAR转基因优选地使用内源表达终止信号，包括poly-A信号、RNA翻译成蛋白的终止密码子和转录终止信号。
整合的序列
“整合的序列”或“整合序列”特别是指包含待插入转染细胞基因组中的编码和/或非编码元件的核酸构建体。在一些实施方式中，编辑的染色体序列可以包含整合的序列。整合的序列可以编码内源蛋白、外源或异源蛋白、野生型蛋白、修饰蛋白、融合蛋白等。在一些实施方式中，整合的序列也是转基因。在本发明的特定方面，不同的转基因在不同的整合位点处被整合。如本文所用，“整合位点”或“融合位点”是基因组内产生双链断裂的确切核酸位置，并且通过在双链断裂位置处的同源定向修复将核酸构建体掺入基因组中。可以通过整合外源序列来中断内源序列，使得外源序列处于内源启动子的控制下。在一些实施方式中，整合的外源序列和/或整合的外源序列将与内源序列一起表达。整合的蛋白编码序列也可以置于内源启动子的控制下和/或与内源蛋白编码序列框内融合。此外，整合的序列还可以作为控制元件。因此，整合的序列对于细胞可以是内源的或外源的。外源序列可以是内源序列的同源物或与其相关。外源序列还可以是人序列。具有这种整合的序列的动物或细胞可称为“敲入”。在某些实施方式中，可以整合序列以改变目标蛋白的表达模式。例如，可以创建条件性敲除系统。在本发明的方面，整合的序列可以是编码CAR、CAR片段、蛋白分离位点、CAR调节蛋白和/或免疫刺激蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，整合至转染细胞基因组中的核酸构建体包含CAR片段和所述CAR片段上游的蛋白分离位点。
“CD3ζKI”和“CD247 KI”以及“ζKI”是指包含外源核酸序列构建体的CD247基因，例如本文所述的核酸序列构建体，其整合在CD247基因中。在实施方式中，本文公开的CAR片段被整合至CD3ζ/CD247基因中。
核酸和转移方法
将外源分子(例如核酸序列)引入细胞的方法是专家所熟知的，并且包括脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米粒子、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。“基因转移”、“核酸转移”、基因序列转移、“转基因转移”可互换使用。在一些实施方式中，优选地通过电穿孔将核酸构建体转移至细胞中。
“基因”是指编码基因产物的DNA区，包括调节基因产物产生的区域，无论这些序列是否邻近编码和/或转录序列。基因包含但不限于启动子序列、终止子、翻译调控序列诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附接位点和基因座控制区。
“基因表达”特指将基因编码的信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白。基因产物还包括经过过程诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑修饰的RNA，以及经过过程诸如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化修饰的蛋白。
序列变异：
要求保护的核酸、蛋白、抗体、抗体片段和/或CAR的序列变体，例如由序列同一性％限定的那些，保持本发明的相似结合特性的序列变体也包括在本发明的范围内。此类变体显示出可选的序列，但基本上保持相同的结合特性，诸如靶点特异性，因为所提供的特定序列被称为功能类似物或功能上的类似物。
序列同一性涉及进行序列比对时相同核苷酸或氨基酸的百分比。如本文所用，表述“序列同一性”是指在比较窗口中序列在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下计算：在比较窗口中比较两个最佳比对序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。包括的核苷酸和多肽与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物学活性。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有极小的同源性或序列同一性。尽管如此，本发明特别设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。属于所述序列同一性的序列中的缺失、置换和其他变化也包括在本发明中。
可以通过置换发生的蛋白序列修饰也包括在本发明的范围内。如本文所定义的置换是对蛋白的氨基酸序列进行的修饰，由此一个或多个氨基酸被相同数量的(不同的)氨基酸取代，产生包含与原蛋白不同的氨基酸序列的蛋白。可以进行优选地不显著改变蛋白功能的置换。如同添加，置换可以是天然的或人工的。本领域公知可以进行氨基酸置换而不显著改变蛋白的功能。当修饰涉及“保守”氨基酸置换时尤其如此，这是用一个氨基酸置换另一个具有相似性质的氨基酸。这种“保守”氨基酸可以是天然的或合成的氨基酸，它们由于大小、电荷、极性和构象可以被置换而不显著影响蛋白的结构和功能。通常，许多氨基酸可以被保守氨基酸置换而不有害地影响蛋白的功能。
通常，非极性氨基酸Gly、Ala、Val、Ile和Leu；非极性芳香族氨基酸Phe、Trp和Tyr；中性极性氨基酸Ser、Thr、Cys、Gin、Asn和Met；带正电的氨基酸Lys、Arg和His；带负电荷的氨基酸Asp和Glu，代表保守氨基酸的组。此列表并未详尽。例如，已知Ala、Gly、Ser和有时Cys可以相互置换，即使它们属于不同的组。
置换变体去除抗体分子中的至少一个氨基酸残基，并在其位置中插入不同的残基。对置换诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也设想了框架改变。如果此类置换导致生物活性发生变化，则可以引入更实质性的变化，在紧接着的下表中命名为“示例性置换”，或如下文参考氨基酸类别进一步描述的，并且可以筛选产物。
可能的氨基酸置换：
原始残基 优选的保守置换 示例性置换的实例
Ala(A) Val Val；Leu；Ile
Asg(R) Lys Lys；Gln；Asn
Asn(N) Gln Gln；His；Asp、Lys；Arg
Asp(D) Glu Glu；Asn
Cys(C) Ser Ser；Ala
Gln(Q) Asn Asn,Glu
Glu(E) Asp Asp；Gln
Gly(G) Ala Ala
His(H) Arg Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I) Leu Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
Leu(L) Ile 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K) Arg Arg；Gln；Asn
Met(M) Leu Leu；Phe；Ile
Phe(F) Tyr Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr；Phe
Tyr(Y) Phe Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V) Leu Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
抗体的生物学特性的实质性修饰通过选择其在保持对以下方面的作用有显著差异的置换来实现：(a)置换区域中的多肽主链结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。
保守氨基酸置换不限于天然存在的氨基酸，还包括合成氨基酸。常用的合成氨基酸有各种链长的ω氨基酸和中性非极性类似物环己基丙氨酸；中性非极性类似物瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜，芳香族中性类似物苯基甘氨酸；带负电荷的类似物磺基丙氨酸和带正电荷的氨基酸类似物鸟氨酸。如同天然存在的氨基酸，该列表并非详尽，而仅是本领域熟知的置换的示例。
基因修饰的细胞和免疫细胞
在具体实施方式中，本发明设想了经基因修饰以表达本文所设想的CAR的细胞，用于治疗医学病症。如本文所用，术语“基因工程化的”或“基因修饰的”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质添加到细胞的总遗传物质中。可以在细胞基因组的特定位置处选择性地或非选择性地进行基因修饰。在实施方式中，基因变化具有位点特异性。在实施方式中，基因修饰不具有位点特异性。术语“基因修饰的细胞”、“基因修饰的免疫细胞”、“修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。如本文所用，术语“基因疗法”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质永久地或暂时地引入细胞的总遗传物质中，从而恢复、纠正或修饰基因的表达，或为了表达治疗性多肽，例如CAR。在具体的实施方式中，本文设想的CAR被引入免疫效应细胞中并在其中表达，以便将它们的特异性重定向到目标靶抗原，例如CD19多肽。
“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应功能(例如细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC诱导)的免疫系统的任何细胞。免疫效应细胞还可以从iPSC(诱导型多能干细胞)分化或源自外周人血和/或人脐带血。
本发明的免疫效应细胞可以是自体的/自生的(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如，同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所用，“自体的”是指来自同一受试者的细胞，并且代表本发明的优选实施方式。如本文所用，“同种异体的”是指同一物种的细胞在基因上与比较的细胞不同。
如本文所用，“同基因的”是指不同受试者的细胞在基因上与比较的细胞相同。如本文所用，“异种的”是指与比较的细胞不同物种的细胞。在优选的实施方式中，本发明的细胞是自体的或同种异体的。与本文设想的CAR一起使用的示例性免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)或激活的T淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞通常是CD3阳性的和CD56阳性的、非主要组织相容性复合体(MHC)受限的、自然杀伤(NK)样的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th；CD4+T细胞)细胞，例如T辅助(Th)细胞，诸如TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH细胞。T细胞可以是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4 CD8 T细胞或调节性T细胞(reg)或任何其他T细胞亚群。T细胞可以是初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、效应储存T细胞、中央储存T细胞、记忆干T细胞。T细胞可以是脐带血细胞。T细胞可以是外周淋巴细胞。T细胞可以从PBMNC扩增。T细胞相对于待给药的个体可以是自体的。T细胞相对于待给药的个体可以是同种异体的。T细胞与待给药的个体可以是部分HLA不相容的。
如本文所用，“永生化的”是指永生化的细胞，作为正常情况下将不繁殖无限数量的细胞周期的细胞群。由于突变，永生细胞从正常细胞衰老中逃逸，并且从而继续进行细胞增殖。突变可以自发发生，或可以由UV线、基因操作或病毒、毒素或细菌进入细胞中引起。因此，出于实验、治疗或医学目的，细胞可以在体外培养更长时间。所述永生化的免疫细胞包括K13、αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、NK-92和YT细胞、干细胞或包括上述免疫系统细胞的干细胞来源的细胞，优选NKT细胞、NK-92细胞、YT细胞和NK细胞。永生化的T细胞系可以保留其溶解功能。
适用于具体实施方式的其他示例性T细胞群包括初始T细胞和记忆T细胞以及干细胞样记忆细胞(TSCM)。
例如，当在自体细胞移植之后重新引入患者时，用如本文所述的本发明的CAR修饰的T细胞可以识别并杀死肿瘤细胞。与其他T细胞相比，CIK细胞可以具有增强的细胞毒活性，并且因此代表本发明的免疫细胞的优选实施方式。
如本领域技术人员将理解的，其他细胞也可以用作具有如本文所述的CAR的免疫效应细胞。具体地，免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导此类祖细胞分化成免疫效应细胞。祖细胞可以是iPSC，其在定义的培养条件下成为免疫效应细胞。本发明提供了用于制备表达本文设想的CAR的免疫效应细胞的方法。在一种实施方式中，该方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达一种或多种如本文所述的CAR。在某些实施方式中，免疫效应细胞分离自个体并且在没有进一步体外操作的情况下进行基因修饰。然后，可以将此类细胞直接重新给药至个体中。在其他实施方式中，免疫效应细胞在经基因修饰以表达CAR之前首先在体外被激活和刺激以增殖。在这方面，免疫效应细胞可以在经基因修饰(即，转导或转染以表达本文设想的CAR)之前和/或之后培养。
在具体实施方式中，在对本文所述的免疫效应细胞进行体外操作或基因修饰之前，细胞来源获自受试者。在具体实施方式中，CAR修饰的免疫效应细胞包含T细胞。T细胞可以获自多种来源，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方式中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，诸如沉降，例如FICOLLTM分离，基于抗体缀合的珠粒的方法，诸如MACSTM分离(Miltenyi)，从受试者收集的血液单位中获得。在一种实施方式中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一种实施方式中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以移除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中用于后续处理。可以用PBS或用另一种不含钙、镁和大多数(如果不是，所有其他)二价阳离子的合适溶液洗涤细胞。如本领域普通技术人员将理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，诸如通过使用半自动流通式离心机。例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate等。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液或其他含或不含缓冲液的盐水溶液中。在某些实施方式中，可以在细胞直接重悬培养基中移除单采样品的非期望组分。
在某些实施方式中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心，从外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群。一种用于本文的方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
PBMC可以使用本文设想的方法进行直接基因修饰以表达CAR。在某些实施方式中，在分离PBMC后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施方式中，细胞毒性和辅助T淋巴细胞可以在基因修饰和/或扩增之前或之后分选成初始T细胞、记忆T细胞和效应T细胞亚群。CD8+细胞可以通过使用标准方法获得。在一些实施方式中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关的细胞表面抗原，CD8+细胞被进一步分选成初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。
在一些实施方式中，本发明的免疫细胞，例如本文所述的T细胞，可以使用技术人员已知的方法从诱导型多能干细胞(iPSC)中获得。用于产生CAR-T细胞的公认方法依赖于成熟循环T细胞的基因修饰和扩增。这些过程利用自体T细胞并通过内源TCR表达以及通过MHC不相容性排斥来降低同种异体T细胞发生移植物抗宿主(GvHD)疾病的风险。作为可选方案，从多能干细胞，诸如诱导型多能干细胞直接体外分化工程化T细胞提供了基本上无限的细胞来源，这些细胞可以经基因修饰以表达本发明的CAR。在一些实施方式中，可以保持所谓的主iPSC系，其代表用于一致且重复地生产同质细胞产品的可再生来源。在一些实施方式中，在扩增和分化成期望的免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)之前，设想用CAR编码核酸转化主iPSC细胞系。例如，T淋巴细胞可以从iPSC产生，使得iPSC可以用CAR或CD3ζ缺陷型CAR片段编码核酸进行修饰，然后扩增和分化成T细胞用于向患者给药。在给药之前，用CAR或CD3ζ缺陷型CAR编码的核酸转化和扩增之前也可以从iPSC分化成合适的免疫细胞，诸如T细胞。本发明设想了iPSC扩增、基因修饰和扩增的所有可能组合，以提供合适数量的细胞用于给药。
免疫效应细胞，诸如T细胞、NK细胞、CIK细胞或Treg，可以在使用已知方法分离后进行基因修饰，或者免疫效应细胞可以在经基因修饰之前在体外激活和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在具体实施方式中，免疫效应细胞，诸如T细胞、NK细胞、CIK细胞或Treg，用本文设想的CD3ζ缺陷型CAR片段进行基因修饰(例如，用核酸和预复合的Cas9酶转染或用包含编码CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸的病毒载体转导)，并且然后在体外激活和扩增。在各种实施方式中，可以使用如下所述的方法在基因修饰之前或之后激活和扩增T细胞以表达CAR或CD3ζ缺陷型CAR片段：例如，美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
在其他实施方式中，例如一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同表达载体的混合物可以用于基因修饰免疫效应细胞的供体群，其中每个载体编码不同的如本文设想的嵌合抗原受体蛋白。产生的修饰免疫效应细胞形成混合的修饰细胞群，其中部分修饰细胞表达多于一种不同的CAR蛋白。
在一种实施方式中，本发明提供了储存表达靶向CD19蛋白的免疫效应细胞的基因修饰的鼠、人或人源化CAR蛋白的方法，该方法包括冷冻保存免疫效应细胞，使得细胞在解冻时保持活力。一部分表达CAR蛋白的免疫效应细胞可以通过本领域已知的方法冷冻保存，以提供此类细胞的永久来源，用于未来治疗患有B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞(DC)、细胞毒性诱导的杀伤细胞(CIK)相关病症的患者。需要时，冷冻保存的转化免疫效应细胞可以解冻、生长和扩增以获得更多此类细胞。
上游/下游
如本文所用，“上游”和“下游”在核酸链的5'→3'方向的背景下使用。上游是指朝向任何给定核酸的5'端的核苷酸，并且下游朝向3'端的核苷酸。
框内、框外
当开放阅读框在核酸整合位点下游的3'区保持完整时，无论融合连接点处插入或缺失的氨基酸数量如何，融合产物均被定义为“框内”。蛋白编码基因序列的开放阅读框的移位是指“框外”。
组合物和制剂
本文设想的组合物可以包含一种或多种多肽、多核苷酸、包含它们的载体、基因修饰的免疫效应细胞等，如本文设想的。组合物包括但不限于药物组合物。
“药物组合物”是指配制成药学上可接受的或生理学上可接受的溶液的组合物，用于单独使用或与一种或多种其他治疗方式联合使用向细胞或动物给药。还应当理解，如有需要，本发明的组合物还可以与其他试剂，诸如，例如，细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药物活性剂联合给药。对还可以包括在组合物中的其他组分实际上没有限制，只要另外的试剂未不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品药品监督管理局批准可接受用于人或家畜用途的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。
可以将质粒、核酸、与Cas酶复合的核酸、AAV载体、慢病毒载体和/或其他组合物、剂、药物、生物制品(蛋白)掺入药物组合物中，例如，药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物组合物特别适用于体内或离体给药和递送至受试者。
在具体实施方式中，本发明的组合物包含一定量的本文设想的表达CAR的免疫效应细胞。如本文所用，术语“量”是指“有效的量”或“有效量”的基因修饰的治疗性细胞，例如T细胞、NK细胞、CIK细胞或Treg细胞，以实现有益或期望的预防或治疗结果，包括临床结果。
“预防有效量”是指有效实现期望的预防结果的基因修饰的治疗性细胞的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病发生之前或在疾病的早期阶段用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。术语预防不一定是指完全禁止或预防具体医学疾患。术语预防还指降低某种医学疾患发生或其症状恶化的风险。
“治疗有效量”的基因修饰的免疫细胞可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量还是病毒或者转导的或转染的治疗性细胞的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所抵消的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待给药的本发明组合物的精确量可以由医师考虑在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况方面的个体差异来确定。通常可以规定，包含本文所述的T细胞或CIK细胞或NK细胞或Treg细胞的药物组合物可以以102至1010个细胞/kg体重，优选105至107个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量给药。细胞的数量将取决于组合物预期的最终用途以及其中包括的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以是500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/mL，通常为108个细胞/mL或更高。临床相关数量的免疫细胞可以被分配到多次输注中，累计等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞。在本发明的一些方面，特别是因为所有输注的细胞将被重定向至特定的靶抗原，所以可以给药较少数量的细胞。表达CAR的细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次给药。细胞对于接受治疗的患者可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。
通常，包含如本文所述的激活和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防在免疫功能低下的个体中出现的疾病。具体地，包含本文设想的CAR修饰的T细胞、CAR修饰的NK细胞、CAR修饰的CIK细胞或CAR修饰的Treg细胞的组合物用于治疗癌症，优选实体癌症或液体癌症，更优选实体恶性肿瘤，更优选直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌，更优选CD19阳性的转移性肿瘤细胞。本发明的CAR修饰的T细胞、CAR修饰的NK细胞、CAR修饰的CIK细胞或CAR修饰的Treg细胞可以单独给药，或者作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其他组分诸如白介素或其他免疫应答刺激细胞因子(例如IL-15)和/或检查点抑制分子(例如PD1多肽或PD1抗体)或细胞群联合给药。
在具体实施方式中，本文设想的药物组合物包含一定量的基因修饰的T细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂联合使用。在具体实施方式中，本文设想的药物组合物包含一定量的基因修饰的NK细胞、基因修饰的CIK细胞或基因修饰的Treg细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂联合使用。
本发明的药物组合物包含表达CAR的免疫效应细胞群，诸如T细胞或NK细胞或CIK细胞或Treg细胞，其可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地被配制用于肠胃外给药，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹腔或肌内给药。
液体药物组合物，无论是溶液、混悬液或其他类似形式，可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油诸如可以用作溶剂或混悬介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲诸剂诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。
在具体实施方式中，本文设想的组合物包含有效量的表达CAR的免疫效应细胞，其单独使用或与一种或多种治疗剂联合使用。因此，表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独给药或与其他已知的癌症治疗，诸如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等联合给药。组合物还可以与抗生素联合给药。此类治疗剂在本领域中可以被接受作为用于如本文所述的特定疾病状态诸如特定癌症的标准治疗。设想的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎药、化学疗法、放射疗法、治疗性抗体或其他活性剂和辅助剂。
联合免疫疗法涵盖同时治疗、共同治疗或联合治疗，并且包括给药表达编码CAR或CD3ζ缺陷型CAR片段的核酸构建体的基因修饰的免疫细胞，联合免疫疗法，诸如检查点抑制剂和/或免疫刺激性细胞因子，由此治疗可以在相互之间数分钟内、在彼此同一小时、同一天、同一周或同一个月内发生。还可以使用包含一种或多种所述基因修饰的免疫细胞与另一种免疫治疗剂的组合药物，以便在单次给药或药剂中共同给药各种组分。“药物”特指包括免疫治疗性细胞或基因修饰的细胞的药物，用于治愈、治疗或预防疾病。
如本文所用，术语“肿瘤微环境”涉及任何给定肿瘤存在于其中的细胞环境，包括肿瘤间质、周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、其他细胞、信号转导分子和ECM。
治疗方法
本文设想的基因修饰的免疫效应细胞提供了过继免疫疗法的改进方法，用于治疗与表达CD19的致病细胞的存在相关的医学疾患中的用途，包括但不限于免疫调节病症和/或血液和/或固体恶性肿瘤。
如本文所用，“与表达CD19的致病细胞的存在相关的医学疾患”是指医学病症，诸如癌症或自身免疫性疾病，其中参与疾病病理生理学的细胞表现出CD19的表达，并且优选CD19呈递在细胞表面上。CD19的表达可以通过技术人员已知的各种方法来确定，例如通过从患者分离细胞，并通过使用针对CD19转录物的引物的PCR、用抗CD19抗体的免疫染色或通过流式细胞术分析来评估这些。此类致病细胞通常可以是致病性成熟B细胞和/或记忆B细胞和/或致病性T细胞和/或滤泡性辅助性T细胞和/或肿瘤干细胞和/或实体瘤细胞和/或液体肿瘤和/或转移癌细胞和/或NK细胞和/或CIK细胞，和/或Treg细胞，和/或树突细胞。
如本文所用，“癌症”是以异常细胞不受控制的生长为特征的疾病。癌症是指任何类型的癌性生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或浸润阶段。癌细胞可以局部扩散或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。扩散到身体其他部位的癌细胞被称为“转移性细胞”或“转移性肿瘤细胞”。本文使用的术语“肿瘤”和“癌症”可互换使用，例如这两个术语均包括固体和液体，例如全身或循环肿瘤，癌前和恶性癌症和肿瘤。液体癌的实例包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(急性髓细胞白血病(AML))、慢性骨髓癌、慢性髓细胞白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤。实体瘤的实例是肝脏、肺、乳腺、淋巴系统、消化器官(例如结肠)、泌尿生殖器官(例如肾脏、尿路上皮细胞)、前列腺和咽喉、恶性器官系统(包括肿瘤诸如肉瘤、腺癌)和癌症。可以治疗的乳腺癌的实例是导管原位癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)、浸润性导管癌(IDC)、浸润性导管癌(包括管状癌、髓样癌、粘液癌、乳头状癌和筛状癌)、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌、男性乳腺癌、乳头偑吉特(Paget)病、乳腺叶状肿瘤、复发性和/或转移性乳腺癌。腺癌包括大多数恶性肿瘤诸如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。在某些形式中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。还可以用本发明的方法和组合物治疗或预防癌症的转移性病变。可以治疗的其他类型癌症的实例是骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、faropius管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓系白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性或急性白血病(包括慢性淋巴性白血病)、儿童实体瘤、淋巴性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌，中枢神经系统(CNS)原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、石棉诱导的T细胞淋巴瘤(包括环境癌症的组合)以及癌症包括转移性癌症的治疗，例如表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)可以用本发明中描述的抑制性分子进行。
“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”在癌细胞表面可互换表达，可以完全表达也可以作为片段表达(例如MHC/肽)，并且药物优先靶向癌细胞。分子(通常是蛋白、碳水化合物或脂质)是有用的。肿瘤抗原是指在特定的过度增殖性疾病中常见的抗原。在一方面，本发明的过度增殖性疾病的抗原是原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、源自癌症诸如肾癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腺癌诸如胰腺癌。在某些实施方式中，肿瘤抗原是在正常细胞和癌细胞上表达的标志物，诸如细胞谱系的标志物，如B细胞上的CD19。在某些实施方式中，与正常细胞相比，肿瘤抗原在癌细胞中过表达，例如与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多过表达。细胞表面的分子。在某些形式中，肿瘤抗原是在癌细胞中未充分合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞中表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在某些实施方式中，肿瘤抗原在癌细胞的细胞表面上排他地、完全地或作为片段(例如MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在某些实施方式中，本发明的CAR包含含有结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源蛋白的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的口袋，并被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合体由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒和/或对肿瘤具有特异性的肽/MHC复合体代表一类独特的免疫疗法的细胞表面靶标。TCR样抗体已被描述为靶向与人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2相关的病毒或肿瘤抗原的肽(参见例如Sastry等人,JVirol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther2012 19(2):84-100)。例如，TCR样抗体可以通过搜索文库诸如人scFv噬菌体展示文库来鉴定。
在具体实施方式中，包含本文设想的CAR修饰的T细胞的组合物用于治疗癌症，包括但不限于实体或液体/血液恶性肿瘤，诸如，例如，直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌和CD19阳性转移性肿瘤细胞，或血液恶性肿瘤，诸如白血病和淋巴瘤或骨髓增生性疾患/肿瘤，伴有或不伴有白血病性肿瘤细胞播散，优选实体瘤和多发性骨髓瘤。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”包括对疾病或病理病症的症状或病理的任何有益或期望的效应，并且可以包括正在治疗的疾病或病症的一种或多种可测量标志物的甚至极小程度的降低。治疗可以任选地涉及减轻或改善疾病或病症的症状，或延缓疾病或病症的进展。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。
如本文所用，“预防(prevent)”和类似用语诸如“预防的”、“预防(preventing)”或“预防性”表示用于预防、抑制或降低疾病或病症发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似用语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低该疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
在一种实施方式中，治疗有需要的受试者的癌症相关病症的方法包括给药有效量(例如治疗有效量)的组合物，其包含本文设想的基因修饰的免疫效应细胞。给药的量和频率将由因素诸如患者的病症、患者疾病的类型和严重程度来确定，尽管合适的剂量可以通过临床试验来确定。
本文设想的组合物的给药可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。在优选的实施方式中，组合物经肠胃外给药。本文所用的短语“肠胃外的给药”和“肠胃外给药的”是指肠内和外用给药以外的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、瘤内、心内、真皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内和胸骨内注射和输注。在一种实施方式中，本文设想的组合物通过直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位而给药于受试者。
序列
本发明的优选氨基酸序列：
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本发明的优选核酸序列：
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特定实施方式中使用的和实施例中提供的其他序列共享如下所示的核酸和氨基酸序列。可以根据给定的序列ID组装特定构建体的完整序列。
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SEQ ID NO 59至SEQ ID NO 64的完整序列公开于本申请所附的序列表中。
在特定实施方式中，用于比较目的的实施例中使用的现有技术的CAR核酸序列构建体，即编码由Roth等人2018公开的TRAC-CD19CAR(完整)或TRAC-eGFP多肽的核酸构建体已根据PMID:29995861以及以上列出的CD19CAR和eGFP各自的SEQ ID进行设计。
本发明的优选sgRNA核酸序列：
sgRNA序列和各自的位置/供体模板。[sg＝单导向RNA，AAVS1＝腺相关病毒整合位点1]]
附图
通过本文公开的附图以示例的方式展示本发明。所提供的附图表示特定的、非限制性的实施方式并且不旨在限制本发明的范围。
附图的简短说明：
图1：新策略在基因水平上将ζ缺陷型CAR转基因与内源CD3ζ融合
图2：敲除TRAC或CD247阻断在原代人T细胞表面上形成TCR-CD3复合物
图3：将GFP框内插入至不同的T细胞受体复合物基因中导致CD3-TCR复合物表面表达的丢失
图4：与TRAC启动子相比，在CD247启动子的控制下表达时GFP强度较低
图5：在NK细胞中，转基因可以在CD247而不是TRAC的控制下表达
图6：将完整和ζ缺陷型CAR转基因插入至CD247基因中来诱导CAR蛋白表面表达
图7：在非病毒基因插入之后，引入更短的插入片段往往增加绝对CAR T细胞生成
图8：CAR表达水平在CD247基因的控制下受到最严格的调控
图9：短CAR CD247 ki CAR T细胞以抗原特异性和剂量依赖性方式(以及以与TRAC/CD247整合的完整CAR相当的速率)裂解CD19+靶细胞
图10：CD247短CAR KI T细胞在连续肿瘤攻击中的表现与完整CAR敲入相当
图11：CD247基因中整合的截短CAR对比TRAC基因座中的完整CAR在抗原接合之后细胞因子产生的减少
图12：CD247 KI消除了与TRAC KI相当的CAR T的同种异体反应性
图13：将截短的CAR整合至CD247基因中可以用于生成CAR+调节性T细胞
图14：TCRγ/δT细胞和NK细胞可以通过CD247-KI方法重编程
图15：CD3ζ蛋白在NK细胞中表达
图16：CD247敲除后原代NK细胞扩增
图17：在连续肿瘤攻击测定后，比较与T细胞耗竭相关的表面蛋白的表达。
图18：CD247-KI CD19-CAR T细胞对白血病的优异控制
图19：CD247-KI HER2-CAR T在体外扩增后(d14)显示耗竭标志物表达减少
图20：体外扩增2周后，CD247-KI HER2-CAR T细胞的分化减少。
图21：CD247-KI Her2/neu-CARs在刺激后激活诱导的细胞死亡减少
图22：具有CD3ζKO的原代NK细胞(NKC)的完整杀伤能力
图23：与从异位基因座(hAAVS1)过表达CAR的CAR-NK相比，ζ-KI CAR-NK细胞具有优异的杀伤能力
附图的详细说明：
图1：新策略在基因水平上将ζ缺陷型CAR转基因与内源CD3ζ融合：(A)表达CD3-ζ蛋白形成的CD247基因。在RNA转录过程中，CD247外显子被剪接在一起以形成成熟的CD247信使RNA，其作为核糖体翻译蛋白的模板。形成的CD3-ζ蛋白与其他蛋白组装以形成功能完全的TCR/CD3复合物。TCR/CD3复合物中CD3-ζ蛋白的细胞内结构域与传统嵌合抗原受体的CD3-ζ结构域相同。(B)该示意图也示出了本发明。截短的CD3-ζ缺陷型CAR转基因(优选但不完全编码自切割2A肽、抗原结合结构域(例如scFv)、铰链/间隔子结构域、跨膜结构域和一个或多个共刺激或调节结构域，但没有含有信号转导结构域的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM))被插入CD247基因中。修饰的CD247基因被转录成编码具有内源CD3-ζ结构域的完整CAR的mRNA。在蛋白翻译过程中，表达的融合蛋白的N端通过2A肽的自切割从CAR蛋白切割下来。虽然功能性CAR蛋白在编辑的免疫细胞表面上表达，但切割N端的CD3-ζ基因是无功能的且不能用于TCR/CD3复合物的形成。因此，成功编辑的免疫细胞可以表达CAR蛋白，但不能表达TCR。
图2：敲除TRAC或CD247阻断在原代人T细胞表面上形成TCR-CD3复合物：从静脉血中分离出健康的人T细胞，并在存在IL-7和IL-15(各10ng/ml)的情况下，在抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的组织培养板上进行多克隆刺激。激活两天后，用靶向T细胞受体α链基因(TRAC，左小图)或CD247基因(CD3-ζ，右小图)的恒定区的sgRNA对T细胞进行电穿孔。随后在含有细胞因子的培养基中扩增四天后，通过流式细胞术分析细胞的CD3和TCRα/β表达。[KI＝敲入；KO＝敲除]
图3：将GFP框内插入至不同的T细胞受体复合物基因中导致CD3-TCR复合物表面表达的丢失：在该实验中，将绿色荧光蛋白(GFP)报告转基因经核酸酶辅助基因插入至CD247基因(编码CD3ζ)或TRAC基因(编码TCRα链)的蛋白编码阅读框中，以研究对CD3-TCR表面表达的影响。如流式细胞术蛋白分析所示，在CD3-TCR阴性群(Y轴)中观察到大多数GFP表达。具有不同sgRNA的多种Cas9核酸酶用于CD247外显子2和3，获得相似的结果。将GFP插入至TRAC基因中反映了在CD247中所见的结果，尽管最大GFP强度更高。
图4：与TRAC启动子相比，在CD247启动子的控制下表达时，GFP强度较低：(A)先前实验的亚组分析(图3)比较了GFP敲入(KI)率和荧光强度，在三次重复中总结优选条件(CD247：HDR模板外显子2+sgRNA2.1；TRAC：外显子1Charité+TRAC sg1)。(B)虽然相对KI在TRAC和CD247之间没有显著差异，但在CD247启动子的控制下表达的GFP导致较低的中位荧光强度(MFI)。[KI＝敲入；KO＝敲除]
图5：在NK细胞中，转基因可以在CD247而不是TRAC的控制下表：对于该实验，使用优选的HDR模板和sgRNA-核酸酶在自然杀伤(NK)细胞(由NK92细胞系建模)中重复核酸酶辅助基因插入，如前所述(图6，CD247：HDR模板外显子2+sgRNA2.1；TRAC：外显子1Charité+TRAC sg 1)。为此，将NK92细胞在补充有10％ FCS、1％青霉素/链霉素(Biochrom)和IL-2(500IU/ml)的RPMI1640培养基中扩增。电穿孔之前四天，将NK92接种在不含抗生素的培养基中。在制备过程中，如前所述制备RNP和HDRT以及细胞(图3)。使用程序CA137进行核转染。随后将NK92细胞培养2天。如前所述进行流式细胞术分析，但不使用CD3抗体。此处，显示了代表性流式细胞术分析，并与原代T细胞实验的结果进行比较(图4)。
图6：将完整和CD3ζ缺陷型CAR转基因插入至CD247基因中诱导CAR蛋白表面表达：核酸酶辅助基因插入用于将完整或CD3ζ缺陷型(截短的)CAR转基因引入至CD247基因中。为了进行该实验，设计新HDR模板。我们合理地设计了第2代CAR，其由对鼠CD19具有特异性的单链可变片段(scFv)、克隆FMC63、中间铰链CH3间隔子(源自人Fc-IgG1)、CD28跨膜结构域、CD28共刺激细胞内结构域和CD3细胞质ζ链组成。将该CAR克隆到之前提供的HDR模板中(图3-5，实施例5中的表1)。对于CD247 HDR模板，生成具有CD3ζ和poly-A终止子序列的完整CAR表达模块以及缺少poly-A终止子序列的短CAR序列以检验本发明的假设。如图3中所述进行核转染。核转染后7天进行流式细胞术。为了通过其IgG1铰链对CAR进行染色，首先用LIVE/dead和抗Fc Alexa Fluor 647(Jackson)对细胞进行染色。洗涤后，用抗CD3 PacBlue(Biolegend)进行第二次表面染色。(注：对于本实验，使用CD247 sg2.2。对于所有后续实验，使用CD247 sg2.1)
图7：在非病毒基因插入之后，引入更短的插入片段往往增加绝对CAR T细胞生成：在使用两种不同的非病毒dsDNA HDR模板变体进行核酸酶辅助基因插入后，比较插入大小(完整CAR相对于短ζ-较小CAR)对绝对CAR+T细胞计数的影响。HDR模板使用常规同源臂(HA)(图3，先前描述于PMID:29995861中)或使用截短的Cas9靶向序列(tCTS)修饰的同源臂(16bp，先前描述于PMID:31819258中)生成。电穿孔后，细胞在T细胞培养基中或在补充有15uM(0.5％)Alt-R HDR-增强剂(Integrated DNA Technologies，货号1081073)的T细胞培养基中培养。比较两种HDR模板浓度(0.75或1.50ug/20ul电穿孔)。无论使用何种HDR模板形式，由于ζ-较小CAR转基因导致更小的插入尺寸，导致转染后7天CAR+T细胞恢复改善，从而表明使用这种方法生成CAR T细胞具有优势。
图8：CAR表达水平在CD247基因的控制下受到最严格的调控：在本实验中，比较不同策略生成的CAR T细胞之间的CAR表达水平。显示了代表性流式细胞术图和CAR+CD3-细胞的中位荧光强度总结。与TRAC整合的CAR或其他对照相比，通过将截短的CAR转基因插入CD247外显子2(sg 2.1)生成的CAR T细胞显示出最低MFI。对于过表达控制，将图6中所示的CAR克隆到通常用于通过慢病毒或通过转座酶-转座子技术生成CAR T细胞的表达盒中。它包括EF1-α启动子和BGH poly-A终止子序列。将表达盒克隆到HDR模板中，以插入人安全港基因座hAAVS1中。此外，将CAR克隆到SIN epHIV7慢病毒载体质粒中用于病毒制备，并如前所述(PMID:22707919)进行慢病毒转导。
图9：短CAR CD247 KI CART细胞以抗原特异性和剂量依赖性方式(以及以与TRAC/CD247整合的完整CAR相当的速率)裂解CD19+靶细胞：由短(截短)或完整CAR转基因生成的CAR T细胞以抗原和剂量依赖性方式裂解靶细胞，并且与TRAC整合的CAR T细胞具有相似的功效。在2-1和1-1T细胞:靶标比率下具有降低杀伤能力的仅CAR T细胞条件，是使用插入完整CAR表达盒的HDR模板CD247外显子3生成的。为了测试通过转基因插入至CD247基因座中生成的CAR T细胞的细胞溶解活性，进行与肿瘤细胞共培养过夜测定。测试使用核酸酶辅助基因插入至CD247外显子2、CD247外显子3或TRAC外显子1中生成的CAR T细胞。(A)CD19+肿瘤细胞(Nalm6)或(B)CD19-肿瘤细胞(Jurkat)用CFSE染色，以实现区分靶标(肿瘤细胞)和效应细胞(CAR T细胞)。共培养在96-U形底孔板中进行，每孔25,000个肿瘤细胞。根据期望的T细胞:靶标比率，将相应数量的CAR T细胞添加到特定孔中。作为对照，在没有任何T细胞的情况下培养肿瘤细胞。次日，用PBS洗涤细胞，以400G离心10分钟，并用LIVE/Dead染料染色以排除凋亡细胞。随后，通过基于体积的流式细胞仪采集(Cytoflex LX，Beckman)对存活细胞进行定量。通过归一化为阴性对照来计算杀伤百分比。TRAC整合的CAR T细胞作为阳性对照。[KI＝敲入]
图10：CD247短CAR KI T细胞在连续肿瘤攻击中的表现与完整CAR KI相当：通过将截短的(ζ缺陷型)CAR插入至CD247基因中而重编程的CAR T细胞能够反复消除肿瘤细胞。在测定设置当天，将25,000个T细胞与50,000个CD19+肿瘤细胞(Nalm6)在无细胞因子培养基(RPMI1640+10％FCS)中混合。每个条件，制备四个孔。在设置日分析第一个孔以作为绝对肿瘤细胞计数的对照。每三天，分析每个条件的每个孔，并将50,000个CD19+肿瘤细胞(Nalm6)添加到剩余的孔。总之，提供绝对肿瘤细胞计数。在阴性对照(没有T细胞或有野生型T细胞的条件)中，肿瘤细胞生长不受控制。TRAC整合的完整CAR装备的T细胞和CD247整合的短CAR重编程的T细胞均反复消除肿瘤细胞。[KI＝敲入]
图11：CD247基因中整合的截短CAR对比TRAC基因座中的完整CAR在抗原接合之后细胞因子产生减少：如前所述(例如图8)，CD247整合的ζ缺陷型CAR重编程的T细胞具有较低CAR表达水平。虽然细胞溶解活性不受较低CAR表面密度的影响(图9、10)，但在CD4+和CD8+T细胞中用CD19+肿瘤细胞(Nalm6)攻击后，炎症细胞因子TNF-α的分泌减少。共培养开始后一小时，以10μg/ml添加布雷菲德菌素A(Sigma)以防止细胞因子分泌到培养基中。孵育总共6小时后，通过在冷PBS中洗涤来终止反应。然后，用LIVE/dead蓝色细胞染料(1:100，ThermoFisher)进行表面染色以排除死细胞。根据生产商的建议(Ebioscience，ThermoFisher)，使用Foxp3转录染色试剂盒进行固定和透化。随后的细胞内染色分两步进行；首先用抗FcAlexa Fluor 647(1:50，Jackson)在4℃下染色20分钟。在用Permbuffer(与之前相同的试剂盒)洗涤后，用CD4、CD8和TNF-α的抗体进行第二次细胞内染色。
图12：CD247 KI消除了与TRAC KI相当的CAR T的同种异体反应性：如前所述(例如图6)，将(截短的)CAR插入至TRAC以及CD247基因中从T细胞表面消除CD3-TCR。为了测试这是否消除同种异体细胞杀伤，我们对来自两个不匹配的健康供体的人T细胞进行共培养测定，这些供体对表达GFP报告基因的CD19阴性细胞系MM1S具有强同种异体反应性。四天后，未修饰的野生型T细胞消除了显著部分的肿瘤细胞。相比之下，插入TRAC的CAR T细胞的肿瘤细胞数量保持不变，或者它们在存在CD247整合的CAR T细胞的情况下增加，表明同种异体活性的比率不可检测。
图13：将截短的CAR整合至CD247基因中可以用于生成CAR+调节性T细胞：如前所述，CD4+Treg从PBMC生成(图3)。在PBMC分离当天，使用CD8+微珠去除(Miltenyi Biotec)消除CD8+细胞。次日，从CD8阴性细胞级分富集CD25+细胞(CD25微珠，Miltenyi Biotec)以分离含有>70％调节性T细胞的CD4+CD25+T细胞。随后，用抗CD3/28包被的珠粒激活细胞并在补充有10％ FCS、高剂量IL-2(500IU/ml)和雷帕霉素(Treg培养基)的X-Vivo细胞培养基(Lonza)中扩增，如前所述(PMID:33087345)。在PBMC分离后第7天，用抗CD3/28包被的珠粒重新刺激调节性T细胞。第二天，如前所述(图3)，对珠粒进行磁力耗尽和核转染。使用Treg培养基进行挽救。再静置一天后，用经辐照的CD19+靶细胞(Nalm-6)重新刺激核转染的T细胞，并在流式细胞仪分析之前再传代额外培养7天。
图14：TCRγ/δT细胞和NK细胞可以通过CD247-KI方法重编程。(A)使用MiltenyiMACS柱纯化对TCRγ/δ进行阳性富集。随后，在结合抗CD3/CD28的板上刺激细胞，并用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和用于AAVS1或CD247的HDR供体模板进行核转染。代表性流式细胞术读数显示在CD247基因座的有效编辑中的CAR表达和电穿孔后4天的CAR表达。(n＝2个生物重复)(B)NK细胞可以通过CD247-KI方法重编程。作为原代NK细胞的模型，用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和dsDNA供体转染NK92细胞系。虽然TRAC-KI不诱导GFP/CAR表达，但CD247基因靶向允许转基因的表达。(C)CD247-KI CAR在6小时VITAL测定(n＝1)中增强对Nalm-6 CD19+而非CD19阴性对照细胞的杀伤。
图15：CD3ζ蛋白在NK细胞中表达
与前述不同，原代NK细胞(NKC)确实表达CD3ζ蛋白。根据生产商的说明(MiltenyiBiotec)，通过MACS通过人NK细胞分离试剂盒从PBMC中分离原代NK细胞，CD3阴性CD56阳性NK细胞表型的流式细胞术分析表明纯度超过95％。随后，在补充有10％ FCS和IL-2以及IL-15的MACS NK细胞扩增培养基(Miltenyi Biotec)中扩增NK细胞。收集、洗涤增殖的NK细胞，并将1×10e6个NK细胞重悬于20μl P3缓冲液(Lonza)中，并通过Lonza 4D Nucleofector程序DN-100用对CD247具有特异性的RNP(包括sgRNA2.1)进行电穿孔。对于流式细胞术分析，NK细胞用Live/Dead蓝色可固定染料(ThermoFisher)标记，然后固定、透化并用抗CD247 PE抗体和抗CD56 AlexaFluor 647抗体(均Biolegend)染色。
图16：原代NK细胞在CD3ζKO后扩增。核转染后原代NK细胞在有或没有来自人NK细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi)的珠粒的情况下扩增：(A)无RNP(假的(mock))，(B)对TRAC具有特异性的RNP(TRAC KO，TRAC sg 1(SEQ ID NO 55))、(C)对CD247具有特异性的RNP(ζKO，CD247sg2.1(SEQ ID NO 52))或(D)对B2M具有特异性的RNP(B2M KO，sgRNA靶序列：SEQID NO 65)。通过锥虫蓝拒染技术和Neubauer计数室确定细胞计数。NK细胞在CD247/CD3ζ基因缺失后能够增殖(流式细胞仪证实>90％KO，图15)。然而，B2M中断造成严重的自相残杀，这是由于HLA 1类表达的缺失以及因此导致的自体识别缺失。来自代表性供体的结果(n＝3)。[RNP：核糖核蛋白复合物，由sgRNA和重组Sp.Cas9蛋白组成]
图17：在连续肿瘤攻击测定后，比较与T细胞耗竭相关的表面蛋白的表达。图显示了流式细胞仪读数的代表性SPICE分析(n＝2个生物重复)。来自A)的CAR T细胞总共扩增14天并冷冻保存5个月。在第一次肿瘤攻击之前，将CAR T细胞解冻并静置过夜。然后，对CAR+T细胞进行计数，并以1个肿瘤:2个CAR+T细胞比例在含有50IU/ml IL-2的培养基中与经辐照的CD19+GFP+Nalm-6肿瘤细胞共培养。每12小时向相应的孔中添加新的经辐照的Nalm-6细胞。末次肿瘤攻击后24小时进行流式细胞术。
图18：CD247-KI CD19-CAR T细胞对白血病的优异控制。比较在CD247-KI细胞、TRAC-KI细胞和慢病毒转导的CD19-CAR T细胞之间在前体B细胞急性淋巴细胞白血病异种移植小鼠模型中的治疗效果。实验设置：八周龄Nod.Rag.Gammma(NRG)小鼠接受i.v.5×105个Nalm-6/GFP/fLuc细胞的攻击。未接受白血病(“无肿瘤”)的小鼠被用作分析的对照。白血病攻击后4天，小鼠被随机分为三个队列：(I)i.v.注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，对应于“仅肿瘤”组)，(ii)i.v.注射5×105个CD19-CAR T细胞，所述细胞通过慢病毒转移和连续TRAC KO(‘LV-CD19CAR’)生成，(iii)i.v.注射5×105个对CD19具有特异性的TCR缺陷型CAR T细胞，所述细胞通过用完整CAR的TRAC敲入(‘TRAC-KI CD19-CAR’)生成，或(iii)CD247敲入短/截短的CD19-CAR(ζ-KI CD19-CAR)。在输注之前，从两种类型的CAR T细胞类型中去除残留的CD3+T细胞。每2-3天监测小鼠的疾病严重程度，并每周测量体重。通过每周生物发光成像(BLI)分析评估白血病移植、生物分布和进展。实验终点是白血病攻击后五周。(A)在5周观察期内所有小鼠的BLI。BLI图片从第1周至第5周顺序生成。显示了小鼠的正面照片，右侧的彩色条形码描绘了生物发光信号辐射(光子/秒/cm2/sr)。(B)通过BLI定量白血病的扩散。辐射度(光子/秒)描绘了含有整个身体正面的感兴趣区域(ROI)面积上的每个像素的总和。在对数转换后，使用重复测量双因素ANOVA结合Geisser-Greenhouse校正，随后进行邓肯(Dunnett)多重比较检验，比较每个时间点每个队列与“仅肿瘤”队列的统计分析。第5周最终BLI测量显示的显著性；与无治疗对照相比，仅TRAC-KI和CD247-KI显示出显著降低的肿瘤负荷，表明CD247-KI的抗肿瘤活性优于传统的慢病毒CAR T细胞。
图19：CD247-KI HER2-CAR T在体外扩增后显示耗竭标志物表达减少。将五个对HER2具有特异性的CAR克隆到TRAC-KI或AAVS1-KI的HDR模板中。HER2-CAR的不同之处在于它们各自的scFv序列具有从10e-11至10e-7的Kd的不同亲和力，并且共享相同的通用第2代CAR设计(IgG1-铰链、CD28跨膜、CD28细胞内信号转导结构域和CD3ζ)。对于CD247-KI，将截短的CD3缺陷型HER2 CAR克隆到用于外显子2的CD247HDR模板中。通过针对相应靶基因和dsDNAHDR模板的Cas9-sgRNA RNP的共同电穿孔生成HER2-CAR T细胞。电穿孔后，CAR T细胞在含有IL-2、IL-7和IL-15的培养基中再扩增14天，并通过流式细胞仪分析常见的耗竭标志物PD-1、TIM-3和LAG-3。Spice分析显示，当通过敲入至TRAC或hAAVS1基因座中生成时，CART细胞的耗竭率更高，但在CD247-KI后表达的耗竭标志物减少。在所有四种HER2构建体(n＝2)中均见到这种效果。
图20：体外扩增2周后，CD247-KI HER2-CAR T细胞的分化减少。对HER2具有特异性的CAR T细胞在含有IL-2、IL-7和IL-15的培养基中再扩增14天，并通过流式细胞仪分析其记忆表型(CCR7、CD45RA)。TRAC-KI和AAVS1-KI HER2 CAR T细胞显示出更高比例的具有分化表型的细胞(Tem、Temra)。CD247-KI CAR T细胞显示出最高比例的具有较低分化表型的细胞(T初始样：Tn)。(A)显示了代表性流式图。(B)总结以条形表示平均比例(+/-标准差)。(Temra：CCR7阴性CD45RA阳性；Tem：CCR7阴性和CD45RA阴性，Tcm：CCR7阳性和CD45RA阴性，Tn：CCR7阳性和CD45RA阳性)。
图21：CD247-KI Her2/neu-CAR刺激后激活诱导的细胞死亡减少。解冻冷冻保存的HER2-CAR T细胞，并通过结合抗Fc抗体的板刺激48小时，所述抗Fc抗体结合CAR IgG1铰链结构域。在流式细胞仪分析之前，用7AAD和与Alexa Fluor 647缀合的膜联蛋白V对细胞进行细胞凋亡标志物染色。具有最高亲和力(Kd:10e-11)和中等亲和力(Kd:10e-9)的HER2-CAR的代表性流式图表明，与通过由EF1α-LTR-启动子或CMV启动子驱动的表达盒的TRAC-KI或AAVS1-KI生成的CAR T细胞相比，CD247-KI CAR T细胞的激活诱导的细胞死亡显著减少。
图22：具有CD3ζKO的原代NK细胞(NKC)的完整杀伤能力。原代人NK细胞在4小时的共培养实验中显示出MHC缺陷型K562肿瘤细胞以及MHC完整Raji淋巴瘤和Nalm-6白血病细胞系的剂量依赖性裂解。假的电穿孔、CD3ζKO和TRAC KO对照NK细胞均赋予K562癌细胞相当的剂量依赖性裂解，表明CD3ζ蛋白对于缺失自体识别和缺失自体肿瘤杀伤不是必需的。平均值+/-标准差，n＝3。
图23：与从异位基因座(hAAVS1)过表达CAR的CAR-NK相比，ζ-KI CAR-NK细胞具有优异的杀伤能力。使用VITAL测定比较不同NK92细胞系的抗原特异性细胞毒性。在测定中，CD19阳性GFP阳性Nalm-6靶细胞和等量的CD19阴性RFP阳性Nalm-6对照细胞与不同NK92效应细胞系共培养。根据靶标:对照细胞比率相对于没有效应细胞的对照条件的变化来计算由不同CAR-NK介导的抗原特异性细胞毒性。如预期，与CD19阴性对照Nalm-6细胞相比，未修饰的NK92或用假的-CAR重编程的NK92不诱导表达CD19的靶标的抗原特异性裂解。然而，与通过完整对CD19具有特异性的CAR(NK92 AAVS1 CMV CD19CAR-Y，SEQ ID NO 61和62)或另一个CD19-CAR(NK92 AAVS1-CMV CD19CAR-K，SEQ ID NO 63和64)的表达盒的AAVS1敲入生成的CAR-NK92相比，通过短/截短的对CD19具有特异性的CAR(NK92ζ--KIΔY，SEQ ID NO 59和60)的CD247敲入重编程的NK92细胞对靶细胞具有优异的抗原特异性裂解。负值设置为0。平均值+/-标准差(n＝6)。使用在NK92 z-Y和所有其他效应细胞之间的双因素ANOVA进行统计分析，并使用邓肯检验计算p值。所有检验的P值<0.0001(由****表示)。
实施例
通过本文公开的实施例证明本发明。所提供的实施例代表特定的实施方式并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例被认为是为实施本发明提供非限制性说明和技术支持。
在以上序列表中公开了实施例中使用的构建体。
实施例1：新策略在基因水平上将ζ缺陷型CAR转基因与内源CD3ζ融合
在一种实施方式中，图1中的示意图展示了传统方法生成的CAR-T细胞(图1A)与本发明提供的优选策略(图1B)之间的比较。如图1A中所示，从CD247基因表达CD3-ζ蛋白。在RNA转录过程中，CD247外显子被剪接在一起以形成成熟的CD247信使RNA，其作为核糖体翻译蛋白的模板。形成的CD3-ζ蛋白与其他蛋白组装以形成功能完全的TCR/CD3复合物。TCR/CD3复合物中CD3-ζ蛋白的细胞内结构域与传统嵌合抗原受体的CD3-ζ结构域相同。图1B示出了本发明的优选实施方式的策略。截短的CD3-ζ缺陷型CAR转基因(优选但不完全编码自切割2A肽、抗原结合结构域(例如scFv)、铰链/间隔子结构域、跨膜结构域和一个或多个共刺激或调节结构域，但没有含有信号转导结构域的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM))被插入至CD247基因中。修饰的CD247基因被转录成编码具有内源CD3-ζ结构域的完整CAR的mRNA。在蛋白翻译过程中，表达的融合蛋白的N端通过2A肽的自切割从CAR蛋白切割下来。虽然功能性CAR蛋白在编辑的免疫细胞表面上表达，但切割N端的CD3-ζ基因是无功能的且不能用于TCR/CD3复合物的形成。因此，成功编辑的免疫细胞可以表达CAR蛋白，但不能表达TCR。
实施例2：将GFP框内插入至不同的T细胞受体复合物基因中导致CD3-TCR复合物表面表达的丢失
在如图2和3中所示的这些实验中，将绿色荧光蛋白(GFP)报告转基因经核酸酶辅助基因插入至CD247基因(编码CD3ζ)或TRAC基因(编码TCRα链)的蛋白编码阅读框中，以研究对CD3-TCR表面表达的影响。如流式细胞术蛋白分析所示，在CD3-TCR阴性群(Y轴)中观察到大多数GFP表达。具有不同sgRNA的多种Cas9核酸酶用于CD247外显子2和3，获得相似的结果。将GFP插入至TRAC基因中反映了在CD247中所见的结果，尽管最大GFP强度更高。
用于同源定向DNA修复的dsDNA模板的生成：为此，设计了三种不同的同源定向修复(HDR)模板，通过核酸酶辅助基因插入将转基因序列框内插入至CD247基因的外显子2或3和TRAC外显子1中。对于TRAC基因座，生成两个模板：一个先前由Roth等人(PMID:29995861)公开，一个自行设计的模板(TRAC外显子1Charité)与sgRNA TRAC sg1一起使用,其具有较少预测脱靶(PMID:32241852)。为了实现独立的蛋白表达，插入物被设计成包括P2A肽酶序列和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。根据生产商的方案(Clontech，Takara)，使用In-Fusion系统将合成的同源臂(各约400bp)和插入物克隆到pUC19质粒主链中。使用基于柱的质粒纯化(Zymo Research，ZymoPure Miniprep Kit)纯化质粒，并使用桑格测序验证序列。为了生成由双链DNA(dsDNA)制成的高度纯化的HDR模板，使用10-20ng质粒模板以大体积(通常500-1000ul反应)进行使用高保真酶(KAPAHiFi HS聚合酶，2x Readymix；Roche)的聚合酶链反应(PCR)。使用Ampure XP磁珠纯化(1体积珠粒:1体积PCR产物)根据生产商手册(Beckman Coulter)纯化HDR模板。将dsDNAHDR模板重悬于无核酸酶的水中；它们的纯度通过琼脂糖凝胶电泳验证。使用NanoDrop 1000分光光度计(ThermoFisher)测量HDR模板浓度。随后，HDR模板以1000ng/微升或2000ng/微升等分分装，并在-20℃下冷冻保存直至进一步使用。
核酸酶制剂：CRISPR-Cas9核酸酶系统用于诱导DNA双链断裂并在靶基因座引发DNA修复。为此，每项实验新鲜配制核糖核蛋白(RNP)。每20μl核转染体积，将0.5μl聚-L-谷氨酸(15-50kDa，100mg/mL，Sigma)、0.48ul的相应sgRNA(100uM，Synthego)和0.4μl的Sp.Cas9(10mg/ml，IDT)按此顺序混合并在室温下在无核酸酶PCR管中孵育15分钟。在核转染之前，立即将RNP与dsDNA HDR模板混合。
细胞培养和电穿孔：在知情同意后，从健康成人的肝素化静脉血中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用CD3+微珠和磁柱富集(MACS，Miltenyi Biotec)来富集T细胞。通过使用人NK细胞分离试剂盒和磁柱去除(MACS，LD柱，Miltenyi Biotec)来富集NK细胞。通过DSMZ-德国微生物收集和细胞培养(German Collection of Microorganisms and CellCultures)GmbH(DSMZ编号：ACC 488)获得NK92细胞系。T细胞在RPMI1640(PAN)中培养，其中含有10％ FCS(Biochrom)，补充有IL-2(100IU/ml，Novartis)、IL-7(10ng/ml，Cellgenix)和IL-15(5ng/ml，Cellgenix)。根据生产商的说明(Miltenyi Biotec)，在MACS NK细胞扩增培养基中培养NK细胞，其中含有10％ FCS(PAN)，补充有IL-2(200IU/ml，Miltenyi)和IL-15(5ng/ml，Miltenyi)。在一些实施方式中，通过用人NK细胞激活/扩增试剂盒(MiltenyiBiotec)刺激来辅助NK细胞扩增。NK-92细胞在RPMI 1640(PAN)中培养，其中含有10％ FCS，补充有200IU/ml IL-2(Miltenyi)。在抗CD3/28包被的组织培养孔板上进行48小时多克隆刺激，收集激活的T细胞并通过重悬于1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并以100G离心10分钟洗涤两次。每20ul核转染，使用1-1.5×10e6个T细胞或0.5-1.0×10e6个NK细胞/NK-92细胞。用核转染缓冲液P3原代细胞(Lonza)重悬干燥的沉淀物，并与RNP-HDR模板混悬液混合，并使用用于T细胞的程序EH-115、用于原代NK细胞的DN-100和用于NK-92细胞的CA-137程序进行电穿孔(4D-核转染，Lonza)。随后，用预热的含有细胞因子的培养基挽救核转染的T细胞，并将其转移至含有补充有15μM HDR增强剂(IDT)的T细胞培养基的组织培养孔中。对于NK细胞实验，未使用HDR增强剂。电穿孔后16小时，更换培养基以去除HDR增强剂。分裂T细胞和NK细胞，每隔一天补充含有细胞因子的培养基。
流式细胞术分析：核转染后(2-)7(/14)天，收获T细胞，用PBS洗涤，以400G离心4分钟。弃去上清液并重悬细胞沉淀物，然后用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色试剂盒(1:100，Molecular Probes，现为ThermoFisher)和用于CAR检测的抗体(含有IgG铰链的构建体，通过抗人Fc-γ片段抗体，1:50，Jackson Laboratories；对于其他CAR，通过Myc-Tag，抗Myc AF647，1:50，细胞信号转导)于4℃下在黑暗中染色15分钟。然后，用CD3APC-AF700(1:100，Beckman Coulter)或CD3 PacBlue(1:50，Biolegend或Beckman Coulter)洗涤细胞并进行其他表面标志物染色。在一些实施方式中，将另外的表面标志物，诸如CD4(抗人CD4PE，1:25，Beckman Coulter)、CD8(抗人CD8 BV510，1:100，Biolegend)、CD45RA(抗人CD45RAECD，1:50，Beckman Coulter)、CCR7(抗人CCR7 Alexa Fluor 488，1:50，Biolegend)、CD56(抗人CD56 Alexa Fluor 647，Biolegend)，于4℃下在黑暗中染色15分钟。为了分析NK细胞中的CD3ζ，在分析前用Fix/Perm(BD)固定和透化细胞。随后，再次洗涤细胞并重悬用于在Cytoflex LX流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo 10软件(BD)分析数据。选择代表图，在y轴的CD3(TCR复合物)和GFP(成功的基因插入)的维度中显示活的单个淋巴细胞。
实施例3：与TRAC启动子相比，在CD247启动子的控制下表达时GFP强度较低
图4中显示的来自先前实验的亚组分析(图3)比较了GFP敲入(KI)率和荧光强度，在三次重复中总结优选条件(CD247：HDR模板外显子2+sgRNA 2.1；TRAC：外显子1Charité+TRAC sg1)。虽然相对KI在TRAC和CD247之间没有显著差异，但在CD247启动子的控制下表达的GFP导致较低的中位荧光强度(MFI)。[KI＝敲入]
实施例4：在NK细胞中，转基因可以在CD247而不是TRAC的控制下表达
CD3ζ蛋白在NK细胞中以充分的水平表达并且对于其他NK细胞功能(例如，杀死肿瘤细胞/缺失自我识别)不是必需的。(图14A、B和图15)。对于如图5中所示的另一项实验，使用优选的HDR模板和sgRNA-核酸酶在自然杀伤(NK)细胞(由NK92细胞系建模)中重复核酸酶辅助基因插入，如前所述(图4，CD247：HDR模板外显子2+sgRNA2.1；TRAC：外显子1Charité+TRAC sg 1)。为此，将NK92细胞在补充有10％ FCS、1％青霉素/链霉素(Biochrom)和IL-2(500IU/ml)的RPMI1640培养基中扩增。电穿孔之前四天，将NK92接种在不含抗生素的培养基中。在制备过程中，如前所述制备RNP和HDRT以及细胞(图3)。使用程序CA137进行核转染。随后将NK92细胞培养2天。如前所述进行流式细胞术分析，但不使用CD3抗体。此处，显示了代表性流式细胞术分析，并与原代T细胞实验的结果进行比较(图4)。使用CD247 KI策略用CD19靶向CAR来工程化的NK92细胞(图14C)，并显示优于通过从AAVS1安全港基因座过表达产生的CAR-NK92的对抗原具有特异性的细胞毒性(图23)。此外，原代NK细胞在CD3ζKO后扩增(图16)。
实施例5：将完整和ζ缺陷型CAR转基因插入至CD247基因中来诱导CAR蛋白表面表达
核酸酶辅助基因插入用于将完整或ζ缺陷(截短的)CAR转基因引入至CD247基因中(图6)。为了进行该实验，设计新HDR模板。我们合理地设计了第2代CAR，其由对鼠CD19具有特异性的单链可变片段(scFv)、克隆FMC63、中间铰链CH3间隔子(源自人Fc-IgG1)、CD28跨膜结构域、CD28共刺激细胞内结构域和CD3细胞质ζ链组成。将该CAR克隆到之前提供的HDR模板中(图3-5，表1)。对于CD247 HDR模板，生成具有CD3ζ和poly-A终止子序列的完整CAR表达模块以及缺少poly-A终止子序列的短CAR序列以检验本发明的假设。如图3中所述进行核转染。核转染后7天进行流式细胞术。为了通过其IgG1铰链对CAR进行染色，首先用LIVE/dead和抗Fc Alexa Fluor 647(Jackson)对细胞进行染色。洗涤后，用抗CD3PacBlue(Biolegend)进行第二次表面染色。(注：对于本实验，使了CD247sg2.2。对于所有后续实验，使用CD247 sg2.1)
表1：sgRNA序列和各自的位置/供体模板。[sg＝单导向RNA，AAVS1＝腺相关病毒整合位点1]]
实施例6：在非病毒基因插入之后，引入更短的插入片段往往增加绝对CAR T细胞生成
在使用两种不同的非病毒dsDNA HDR模板变体进行核酸酶辅助基因插入后，比较插入大小(完整CAR相对于短ζ-较小CAR，图7)对绝对CAR+T细胞计数的影响。HDR模板使用常规同源臂(HA)(图3，先前描述于PMID:29995861中)或使用截短的Cas9靶向序列(tCTS)修饰的同源臂(16bp，先前描述于PMID:31819258中)生成。电穿孔后，细胞在T细胞培养基中或在补充有15μM(0.5％)Alt-R HDR-增强剂(Integrated DNA Technologies，货号1081073)的T细胞培养基中培养。比较两种HDR模板浓度(0.75或1.50μg/20μl电穿孔)。无论使用何种HDR模板形式，由于ζ-较小CAR转基因导致更小的插入尺寸，导致转染后7天CAR+T细胞恢复改善，从而表明使用这种方法生成CAR T细胞具有优势。
实施例7：CAR表达水平在CD247基因的控制下受到最严格的调控
在图8所示的本实验中，比较不同策略生成的CAR T细胞之间的CAR表达水平。显示了代表性流式细胞术图和CAR+CD3-细胞的中位荧光强度总结。与TRAC整合的CAR或其他对照相比，通过将截短的CAR转基因插入CD247外显子2(sg 2.1)生成的CAR T细胞显示出最低MFI。对于过表达控制，图6中所示的CAR被克隆到通常用于通过慢病毒或通过转座酶-转座子技术生成CAR T细胞的表达盒中。它包括EF1-α启动子和BGH poly-A终止子序列。将表达盒克隆到HDR模板中，以插入人安全港基因座hAAVS1中。此外，将CAR克隆到SIN epHIV7慢病毒载体质粒中用于病毒制备，并如前所述(PMID:22707919)进行慢病毒转导。[MFI＝中位荧光强度]
Nalm-6肿瘤细胞再攻击测定和耗竭图(panel)
使用补充有10％ FCS和50IU/ml IL-2的X-vivo 15培养基，将不同的CD19-CAR T细胞条件以25,000个CAR+细胞/孔的密度接种到平底96孔板中。每12小时，将经γ辐照的(30Gy)的GFP+Nalm-6以1:1的细胞比率添加到CAR T细胞中。第4轮共培养24小时后，通过流式细胞术分析CAR T细胞的抑制性受体PD-1(抗PD1 BV785，1:25，Biolegend)、LAG-3(抗人LAG3PerCp-eFluor710，1:25，eBioscience)和Tim-3(抗人Tim-3 APC-Cy7，1:50，Biolegend)的表达。
在重复的肿瘤再攻击后，与慢病毒或AAVS1的过表达相比，CD247-KI CAR T细胞表达更少的耗竭标志物，诸如Tim-3、PD-1和LAG-3(图17)。TRAC-KI和CD247-KI策略的结果相当。用CD247 KI方法工程化的CAR-T细胞的细胞适应性得到改善(图17)。
实施例8：CD247 KI CAR T细胞以抗原特异性和剂量依赖性方式(以及以与整合TRAC/CD247的完整CAR相当的速率)裂解CD19+靶细胞
由短(截短)或完整CAR转基因生成的CAR T细胞以抗原和剂量依赖性方式裂解靶细胞，并且与整合TRAC的CAR T细胞具有相似的功效(图9)。在2-1和1-1T细胞:靶标比率下具有降低杀伤能力的仅CAR T细胞条件，是使用插入完整CAR表达盒的HDR模板CD247外显子3生成的。为了测试通过转基因插入至CD247基因座中生成的CAR T细胞的细胞溶解活性，进行与肿瘤细胞共培养过夜测定。测试使用核酸酶辅助基因插入至CD247外显子2、CD247外显子3或TRAC外显子1中生成的CAR T细胞。将CD19+肿瘤细胞(Nalm6)或CD19-肿瘤细胞(Jurkat)用CFSE染色，以允许区分靶标(肿瘤细胞)和效应细胞(CAR T细胞)。共培养在96-U形底孔板中进行，每孔25,000个肿瘤细胞。根据期望的T细胞:靶标比率，将相应数量的CART细胞添加到特定孔中。作为对照，在没有任何T细胞的情况下培养肿瘤细胞。次日，用PBS洗涤细胞，以400G离心10分钟，并用LIVE/Dead染料染色以排除凋亡细胞。随后，通过基于体积的流式细胞仪采集(Cytoflex LX，Beckman)对存活细胞进行定量。通过归一化为阴性对照来计算杀伤百分比。TRAC整合的CAR T细胞作为阳性对照。[KI＝敲入]
实施例9：CD247短CAR KI T细胞在连续肿瘤攻击中的表现与完整CAR敲入相当
通过将截短的(ζ缺陷型)CAR插入至CD247基因中而重编程的CAR T细胞能够反复消除肿瘤细胞(图10)。在测定设置当天，将25,000个T细胞与50,000个CD19+肿瘤细胞(Nalm6)在无细胞因子培养基(RPMI1640+10％FCS)中混合。每个条件，制备四个孔。在设置日分析第一个孔以作为绝对肿瘤细胞计数的对照。每三天，分析每个条件的每个孔，并将50,000个CD19+肿瘤细胞(Nalm6)添加到剩余的孔。总之，提供绝对肿瘤细胞计数。在阴性对照(没有T细胞或有野生型T细胞的条件)中，肿瘤细胞生长不受控制。TRAC整合的完整CAR装备的T细胞和CD247整合的短CAR重编程的T细胞均反复消除肿瘤细胞。[KI＝敲入]
实施例10：CD247基因中整合的截短CAR对比TRAC基因座中的完整CAR在抗原接合之后细胞因子产生的减少
如前所述(例如图8)，CD247整合的ζ缺陷型CAR重编程的T细胞具有较低CAR表达水平。虽然细胞溶解活性不受较低CAR表面密度的影响(图9、10)，但在CD4+和CD8+T细胞中用CD19+肿瘤细胞(Nalm6)攻击后，炎症细胞因子TNF-α的分泌减少(图11)。共培养开始后一小时，以10μg/ml添加布雷菲德菌素A(Sigma)以防止细胞因子分泌到培养基中。孵育总共6小时后，通过在冷PBS中洗涤来终止反应。然后，用LIVE/dead蓝色细胞染料(1:100，ThermoFisher)进行表面染色以排除死细胞。根据生产商的建议(Ebioscience，ThermoFisher)，使用Foxp3转录染色试剂盒进行固定和透化。随后的细胞内染色分两步进行；首先用抗FcAlexa Fluor 647(1:50，Jackson)在4℃下染色20分钟。在用Permbuffer(与之前相同的试剂盒)洗涤后，用CD4、CD8和TNF-α的抗体进行第二次细胞内染色。
实施例11：CD247 KI消除了与TRAC KI相当的CAR T的同种异体反应性
如前所述(例如图6)，将(截短的)CAR插入至TRAC以及CD247基因中从T细胞表面消除CD3-TCR。为了测试这是否消除同种异体细胞杀伤，我们对来自两个不匹配的健康供体的人T细胞进行共培养测定，这些供体对表达GFP报告基因的CD19阴性细胞系MM1S具有强同种异体反应性(图12)。四天后，未修饰的野生型T细胞消除了显著部分的肿瘤细胞。相比之下，TRAC插入的CAR T细胞的肿瘤细胞数量保持不变，或者它们在存在整合了CD247的CAR T细胞的情况下增加，表明未检测出的同种异体活性的比率。[KI＝敲入]
实施例12：将截短的CAR整合至CD247基因中可以用于生成CAR+调节性T细胞
如前所述，CD4+Treg从PBMC生成(图3)。在PBMC分离当天，使用CD8+微珠去除(Miltenyi Biotec)消除CD8+细胞。次日，从CD8阴性细胞级分富集CD25+细胞(CD25微珠，Miltenyi Biotec)以分离含有>70％调节性T细胞的CD4+CD25+T细胞。随后，用抗CD3/28包被的珠粒激活细胞并在补充有10％ FCS、高剂量IL-2(500IU/ml)和雷帕霉素(Treg培养基)的X-Vivo细胞培养基(Lonza)中扩增，如前所述(PMID:33087345)。在PBMC分离后第7天，用抗CD3/28包被的珠粒重新刺激调节性T细胞。第二天，如前所述(图3)，对珠粒进行磁力耗尽和核转染。使用Treg培养基进行挽救。在再静置一天之后，用经辐照的CD19+靶细胞(Nalm-6)重新刺激核转染的T细胞，并在流式细胞仪分析之前，额外进行7天再传代培养。
实施例13：CD247-KI策略允许对用于过继T细胞转移的不同细胞类型进行重编程
TCRγ/δT细胞、Treg细胞和NK细胞可以通过CD247-KI方法重编程。使用MiltenyiMACS柱纯化对TCRγ/δ进行阳性富集(图14A、B)。随后，在结合抗CD3/CD28的板上刺激细胞，并用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和用于AAVS1或CD247的HDR供体模板进行核转染。代表性流式细胞术读数显示在CD247基因座的有效编辑中的CAR表达和电穿孔后4天的CAR表达。CD4调节性T细胞可以用TRAC或CD247-KI重编程(图13)。在两步MACS选择过程中分离CD4+Treg，以分离含有>70％ CD25+Foxp3+调节性T细胞的CD4+CD25+T细胞。随后，用抗CD3/28包被的珠粒激活细胞，并在补充有高剂量IL-2(500IU/ml)和雷帕霉素的培养基中扩增。在分离和扩增后第7天，磁珠被耗尽并且调节性T细胞被核转染。静置一天后，用经辐照的CD19+靶细胞(Nalm-6)重新刺激核转染的T细胞，并在流式细胞仪分析之前，额外进行7天再传代培养。NK细胞还可以通过CD247-KI方法重编程(图14C，图16)。作为原代NK细胞的模型，用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和dsDNA供体转染NK92细胞系。虽然TRAC-KI不诱导GFP/CAR表达，但CD247基因靶向允许转基因表达(图5，图14C)。CD247-KI CAR在6小时VITAL测定中增强对Nalm-6CD19+而非CD19阴性对照细胞的杀伤(图14D)。
实施例14：CD247-KI CAR T细胞在体外和白血病异种移植小鼠模型中表现出改善的功能性，优于慢病毒CD19-CAR T细胞
使用sgRNA2.1和短/截短的CD19-CAR的整合，与传统的慢病毒转导的CD19-CAR T细胞相比，我们生成的CD247-KI CAR T细胞在四轮肿瘤刺激后显示出耗竭标志物的频率降低(图17)。为了验证这是否也可以转化成优异的体内抗肿瘤活性，我们比较了它们在全身性白血病异种移植小鼠模型中的功能性。为此，对8周龄NRG小鼠以每只小鼠用5×10e5 GFP和表达荧光素酶的Nalm-6白血病细胞i.v.进行攻击。肿瘤细胞输注后四天，每只小鼠通过尾部静脉注射移植5×10e6 CAR阳性和TCR阴性CAR T细胞。为了在所有条件下避免异种GvHD，慢病毒转导的CAR T细胞用TRAC sgRNA1和Sp进行电穿孔。病毒自旋转导后两天的Cas9。为了去除任何污染的TCR/CD3阳性细胞，在CAR-T细胞输注之前对所有条件进行CD3MACS去除(根据生产商的说明，Miltenyi Biotec)。使用IVIS装置通过生物发光每周分析肿瘤负荷(方法部分)。五周后，将小鼠处死，没有表现出任何GvHD或重度疾病的体征。生物发光成像显示，在前三周内，所有CAR T细胞条件均减缓白血病的进展；然而，在第5周，只有ζ-KI CD19-CAR T细胞显示出比无CAR T细胞对照组显著降低的肿瘤负荷，表明抗肿瘤活性更优(图18A、B)。
实施例15：ζ方法可转移至其他CAR靶标(例如HER2)
有限的CAR T细胞持久性和耗竭相关功能障碍与CAR T细胞疗法在不同实体瘤适应症中的疗效降低有关。由于ζ-KI CD19-CAR T细胞的数据表明耗竭能力降低和抗肿瘤活性提高(图17+18)，我们将CD247-KI方法转移至与不同实体瘤适应症相关的另一个CAR平台。因此，我们生成了HDR模板以整合之前描述的多个第2代对HER2(又名HER2/neu，人表皮生长因子受体2，ERB2)具有特异性的CAR T细胞(Textor等人2014；Cancer Res.2014Dec 1；74(23):6796-805.doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-0079PMID:25297631)。所有构建体均具有相同的基本设计，包括IgG1铰链、CD28跨膜、CD28共刺激结构域和细胞内CD3ζ链，但在各自的对Her2具有特异性的scFv上有所不同，这些scFv具有从10e-11至10e-7的Kd值的不同亲和力。如前所述生成CAR T细胞，具有含有用于TRAC-KI和AAVS1-KI条件的转基因的完整CD3ζ以及用于ζ-KI和sgRNA 2.1(SEQ ID NO 52)的短/截短的CD3ζ缺陷型CAR。两周扩增后，对CAR T细胞进行耗竭标志物(图19)、分化状态(图20)的免疫表型分析并冷冻保存。无论scFv亲和力如何，CD247-KI HER2 CAR T细胞在没有再刺激的情况下进行体外扩增后，在细胞表面上的耗竭标志物的表达显著降低。类似地，与AAVS1-KI或TRAC-KI CAR T细胞相比，更高比例的CD247-KI HER2 CAR T细胞保留分化程度较低的表型(CCR7阳性，CD45RA阳性)(图20)。随后，将冷冻保存的T细胞解冻并用板结合的抗IgG抗体重新刺激，以评价它们经历激活诱导的细胞死亡的倾向(图21)。虽然许多AAVS1-KI和TRAC-KI CAR T细胞的早期凋亡标志物Annexin V染色呈阳性，但大多数CD247-KI HER2 CAR T细胞仍然存活。
实施例16：不含CD3ζ蛋白的原代NK细胞(NK)的完整杀伤能力
CD3ζ包含多个ITAM结构域，因此被认为在不依赖CAR的NK细胞激活和功能中很重要。原代NK细胞可以裂解没有MHC表达的不同癌症(诸如K562细胞)，但是也可以裂解MHC完整的细胞，诸如Raji淋巴瘤细胞或Nalm-6白血病细胞(图22A)。为了确定缺乏可溶性CD3ζ的原代NK细胞的功能性是否受到损害，通过Sp.Cas9和对CD247具有特异性的sgRNA 2.1的电穿孔进行CD3ζKO。出乎意料的是，在有和没有珠粒刺激的情况下扩增的原代CD3ζKO NK细胞能够以剂量依赖性方式有效地裂解K562细胞，并且结果与假的电穿孔或TRAC编辑的NK细胞相当(图22)。此外，与CAR-NK92相比，ζ-KI CAR-NK92显示出更优的细胞溶解活性，CAR-NK92从具有共同表达盒的异位基因座过表达相同的CAR(图23：NK92ζ-KI Y(CD247-外显子2_CD19CAR-Y)-SEQ ID NO 59和60；NK92AAVS1-KI Y(AAVS1_CMV_CD19CAR-Y)-SEQ ID NO 61和62；NK92AAVS1-KI K(AAVS1_CMV_CD19CAR-K)-SEQ ID NO 63和64)。
参考文献
Elsallab,M.,Levine,B.L.,Wayne,A.S.&Abou-El-Enein,M.CAR T-cell productperformance in haematological malignancies before and after marketingauthorisation.Lancet Oncol.21,e104–e116(2020).
Gundry,M.C.et al.Highly Efficient Genome Editing of Murine and HumanHematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9.Cell Rep.17,1453–1461(2016).
Osborn,M.J.et al.Evaluation of TCR Gene Editing Achieved by TALENs,CRISPR/Cas9,and megaTAL Nucleases.Mol.Ther.24,570–581(2016).
Qasim,W.et al.Molecular remission of infant B-ALL after infusion ofuniversal TALEN gene-edited CAR T cells.Sci.Transl.Med.9,(2017).
Eyquem,J.et al.Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9enhances tumour rejection.Nature 543,113–117(2017).
MacLeod,D.T.et al.Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha ChainLocus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR TCells.Mol.Ther.25,949–961(2017)。
序列表
<110> 柏林夏瑞蒂医科大学(CHARITÉ - UNIVERSITÄTSMEDIZIN BERLIN)
<120> 通过靶向整合ζ缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞
<130> XII 2280/20WO
<150> EP20216649
<151> 2020-12-22
<160> 65
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 1
Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Arg Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg
20 25 30
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
35 40 45
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg
85 90 95
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser
115 120 125
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
130 135 140
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
145 150 155 160
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
165 170 175
Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
195 200 205
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
210 215 220
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
225 230 235 240
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
245 250 255
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
275 280 285
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
290 295 300
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
355 360 365
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
370 375 380
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
385 390 395 400
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
405 410 415
Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
435 440 445
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
450 455 460
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
465 470 475 480
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
485 490 495
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
500 505
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 2
Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Arg Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 3
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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<212> PRT
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 7
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 8
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 9
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 10
Lys Asp Pro Lys
1
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 12
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 13
000
<210> 14
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 14
Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Arg Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg
20 25 30
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
35 40 45
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg
85 90 95
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser
115 120 125
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
130 135 140
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
145 150 155 160
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
165 170 175
Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
195 200 205
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
210 215 220
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
225 230 235 240
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
245 250 255
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
275 280 285
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
290 295 300
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
355 360 365
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
370 375 380
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
385 390 395 400
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
405 410 415
Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
435 440 445
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
450 455 460
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
465 470 475 480
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
485 490 495
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
500 505 510
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
515 520 525
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
530 535 540
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
545 550 555 560
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
565 570 575
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
580 585 590
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
595 600 605
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 15
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 15
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Ala Thr Asn Phe Ser Leu
1 5 10 15
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu
20 25 30
Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala
35 40 45
Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
290 295 300
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
325 330 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
340 345 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
355 360 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
370 375 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr
385 390 395 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe
405 410 415
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
420 425 430
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
435 440 445
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
450 455 460
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
465 470 475 480
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
485 490 495
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
500 505
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 16
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 17
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
20 25 30
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr
35 40 45
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg
50 55 60
Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
65 70 75 80
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser
85 90 95
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
100 105 110
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
115 120 125
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
130 135 140
Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
165 170 175
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
180 185 190
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
275 280 285
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
290 295 300
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
305 310 315 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325 330 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
340 345 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355 360 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370 375 380
Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385 390 395 400
Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
405 410 415
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
420 425 430
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
435 440 445
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
450 455 460
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
465 470
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
1 5
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 19
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 20
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Ala Thr Asn Phe Ser Leu
1 5 10 15
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu
20 25 30
Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala
35 40 45
Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
115 120 125
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
165 170 175
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
180 185 190
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
195 200 205
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
210 215 220
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
245 250 255
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
260 265 270
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
275 280 285
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
290 295 300
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
325 330 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
340 345 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
355 360 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
370 375 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr
385 390 395 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe
405 410 415
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
420 425 430
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
435 440 445
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
450 455 460
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
465 470 475 480
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
485 490 495
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
500 505 510
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
515 520 525
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
530 535 540
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
545 550 555 560
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
565 570 575
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
580 585 590
Pro Pro Arg
595
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 22
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强的GFP
<400> 22
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 23
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr
20 25
<210> 24
<211> 2221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 24
ggcaggagct ctgtgcacag agaacagcct catctgctcg ccttgtttcc acctcccctc 60
ccattgcccc aggttctttg gccccacagc ggccacatct gccgttggtg ccaataggtt 120
ttccaggagc tggttgaggt gggagggagg gagagggttg tgatcaggct gaggcatggg 180
gattggatat agtctccgtg tcatgattta tttggtcagt cagtcctagt gccaccctgg 240
ggtaatgggg atgtgttctc gtcaccttgg gcctggctga ccagctttat ctcttggcac 300
agaggcacag agctttggcc tgctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct 360
cttcatctat cgtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga gccaccaact tctctctttt 420
gaagcaggcc ggagatgtgg aagaaaatcc tgggcccatg gctcttcctg tgactgccct 480
tctgctgccc ctggctctcc tgctccatgc tgcccggcca gacatccaga tgacacagac 540
aaccagcagc ctcagcgcca gcctggggga cagagtgacc attagctgcc gggcctctca 600
ggacatcagc aaatacctga actggtacca gcagaaacca gatggcactg tcaagctgct 660
gatttaccac acctccaggc tccacagcgg cgtgcccagt cgcttcagcg gcagtgggag 720
cgggacagat tattccctca caatctccaa cctggagcag gaagatattg ccacatactt 780
ctgccagcaa ggcaacaccc tgccatacac atttggaggc ggcaccaaat tggagatcac 840
cggcggtggt ggatctggag gagggggcag cggaggtggc ggctctgagg tgaaactgca 900
ggagagtggc cctggcctgg tggctcccag ccagagcctt tctgtcacct gcaccgtgtc 960
tggggtgtcc ctgcctgact atggagtctc ctggatccgg cagcctccaa gaaaaggact 1020
ggaatggctg ggcgtcatct ggggaagtga gaccacctac tataattcag ccctcaagtc 1080
ccggctcacc atcattaagg acaactccaa atcccaggtg ttcctgaaga tgaattctct 1140
ccagactgat gacacagcca tctactactg tgccaagcat tattattacg gcgggtccta 1200
tgccatggac tactggggcc aggggaccag tgtcactgtt tcttctgaaa gcaagtatgg 1260
ccccccatgc cctccctgcc ccggacagcc gcgggagccc caggtctaca ccctcccacc 1320
ctccagagat gagctgacca agaaccaggt ttcactgaca tgcctggtga agggcttcta 1380
cccctctgac attgctgtgg agtgggagag caatgggcag ccagagaaca actacaagac 1440
cacacctcct gtcctggaca gcgacggctc cttcttcctc tacagtaagc tcactgtgga 1500
caagagccgc tggcagcagg gcaatgtctt ctcctgcagc gtgatgcacg aggccctgca 1560
caatgcctat acccagaagt cactctctct gagccctgga aagaaggatc ccaagttttg 1620
ggtcctcgtg gtggtcgggg gtgtgctggc ctgctacagc ttgctggtca cagtggcctt 1680
catcatcttc tgggtgcgct ccaagaggag ccggctgctt cacagtgatt acatgaacat 1740
gacccccagg aggccaggac ccaccaggaa gcactaccag ccctacgctc ccccgcggga 1800
ctttgctgct taccgcagca gagtgaaggt gggtaccact gggctttggg aggagggcac 1860
ggggtccccc acttgatgga tgttcagagg ggccttggtc ttggaaggtc tcaagctcgg 1920
gtggtgcctg gggcttggta tccaggagca aagcaaggac cagccaagtg tgtgccttga 1980
gtgggctgag gaggaggtgg cagtgtctgg ctgagatgga cagggtagga gggagagcct 2040
ggtgctaggc acctccatga caagccgtac aaatgtgtgc acatcagagt gtcccaggga 2100
aggcgatgct actggtgaca aaggggctta cactcaggca gaggtccttc tttccaagtg 2160
tgaatgaagg ccatgttagc ctttctcttg aaaaggccct ttcctcatct gtaactgggg 2220
a 2221
<210> 25
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 25
ggcaggagct ctgtgcacag agaacagcct catctgctcg ccttgtttcc acctcccctc 60
ccattgcccc aggttctttg gccccacagc ggccacatct gccgttggtg ccaataggtt 120
ttccaggagc tggttgaggt gggagggagg gagagggttg tgatcaggct gaggcatggg 180
gattggatat agtctccgtg tcatgattta tttggtcagt cagtcctagt gccaccctgg 240
ggtaatgggg atgtgttctc gtcaccttgg gcctggctga ccagctttat ctcttggcac 300
agaggcacag agctttggcc tgctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct 360
cttcatctat cgtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga 400
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 26
gccaccaact tctctctttt gaagcaggcc ggagatgtgg aagaaaatcc tgggccc 57
<210> 27
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 27
atggctcttc ctgtgactgc ccttctgctg cccctggctc tcctgctcca tgctgcccgg 60
cca 63
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 28
gacatccaga tgacacagac aaccagcagc ctcagcgcca gcctggggga cagagtgacc 60
attagctgcc gggcctctca ggacatcagc aaatacctga actggtacca gcagaaacca 120
gatggcactg tcaagctgct gatttaccac acctccaggc tccacagcgg cgtgcccagt 180
cgcttcagcg gcagtgggag cgggacagat tattccctca caatctccaa cctggagcag 240
gaagatattg ccacatactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgccatacac atttggaggc 300
ggcaccaaat tggagatcac c 321
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 29
ggcggtggtg gatctggagg agggggcagc ggaggtggcg gctct 45
<210> 30
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 30
gaggtgaaac tgcaggagag tggccctggc ctggtggctc ccagccagag cctttctgtc 60
acctgcaccg tgtctggggt gtccctgcct gactatggag tctcctggat ccggcagcct 120
ccaagaaaag gactggaatg gctgggcgtc atctggggaa gtgagaccac ctactataat 180
tcagccctca agtcccggct caccatcatt aaggacaact ccaaatccca ggtgttcctg 240
aagatgaatt ctctccagac tgatgacaca gccatctact actgtgccaa gcattattat 300
tacggcgggt cctatgccat ggactactgg ggccagggga ccagtgtcac tgtttcttct 360
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 31
gaaagcaagt atggcccccc atgccctccc tgcccc 36
<210> 32
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 32
ggacagccgc gggagcccca ggtctacacc ctcccaccct ccagagatga gctgaccaag 60
aaccaggttt cactgacatg cctggtgaag ggcttctacc cctctgacat tgctgtggag 120
tgggagagca atgggcagcc agagaacaac tacaagacca cacctcctgt cctggacagc 180
gacggctcct tcttcctcta cagtaagctc actgtggaca agagccgctg gcagcagggc 240
aatgtcttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca atgcctatac ccagaagtca 300
ctctctctga gccctggaaa g 321
<210> 33
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 33
aaggatccca ag 12
<210> 34
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
ttttgggtcc tcgtggtggt cgggggtgtg ctggcctgct acagcttgct ggtcacagtg 60
gccttcatca tcttctgggt g 81
<210> 35
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
cgctccaaga ggagccggct gcttcacagt gattacatga acatgacccc caggaggcca 60
ggacccacca ggaagcacta ccagccctac gctcccccgc gggactttgc tgcttaccgc 120
agc 123
<210> 36
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 36
agagtgaagg tgggtaccac tgggctttgg gaggagggca cggggtcccc cacttgatgg 60
atgttcagag gggccttggt cttggaaggt ctcaagctcg ggtggtgcct ggggcttggt 120
atccaggagc aaagcaagga ccagccaagt gtgtgccttg agtgggctga ggaggaggtg 180
gcagtgtctg gctgagatgg acagggtagg agggagagcc tggtgctagg cacctccatg 240
acaagccgta caaatgtgtg cacatcagag tgtcccaggg aaggcgatgc tactggtgac 300
aaaggggctt acactcaggc agaggtcctt ctttccaagt gtgaatgaag gccatgttag 360
cctttctctt gaaaaggccc tttcctcatc tgtaactggg ga 402
<210> 37
<211> 2812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 37
ggcaggagct ctgtgcacag agaacagcct catctgctcg ccttgtttcc acctcccctc 60
ccattgcccc aggttctttg gccccacagc ggccacatct gccgttggtg ccaataggtt 120
ttccaggagc tggttgaggt gggagggagg gagagggttg tgatcaggct gaggcatggg 180
gattggatat agtctccgtg tcatgattta tttggtcagt cagtcctagt gccaccctgg 240
ggtaatgggg atgtgttctc gtcaccttgg gcctggctga ccagctttat ctcttggcac 300
agaggcacag agctttggcc tgctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct 360
cttcatctat cgtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga gccaccaact tctctctttt 420
gaagcaggcc ggagatgtgg aagaaaatcc tgggcccatg gctcttcctg tgactgccct 480
tctgctgccc ctggctctcc tgctccatgc tgcccggcca gacatccaga tgacacagac 540
aaccagcagc ctcagcgcca gcctggggga cagagtgacc attagctgcc gggcctctca 600
ggacatcagc aaatacctga actggtacca gcagaaacca gatggcactg tcaagctgct 660
gatttaccac acctccaggc tccacagcgg cgtgcccagt cgcttcagcg gcagtgggag 720
cgggacagat tattccctca caatctccaa cctggagcag gaagatattg ccacatactt 780
ctgccagcaa ggcaacaccc tgccatacac atttggaggc ggcaccaaat tggagatcac 840
cggcggtggt ggatctggag gagggggcag cggaggtggc ggctctgagg tgaaactgca 900
ggagagtggc cctggcctgg tggctcccag ccagagcctt tctgtcacct gcaccgtgtc 960
tggggtgtcc ctgcctgact atggagtctc ctggatccgg cagcctccaa gaaaaggact 1020
ggaatggctg ggcgtcatct ggggaagtga gaccacctac tataattcag ccctcaagtc 1080
ccggctcacc atcattaagg acaactccaa atcccaggtg ttcctgaaga tgaattctct 1140
ccagactgat gacacagcca tctactactg tgccaagcat tattattacg gcgggtccta 1200
tgccatggac tactggggcc aggggaccag tgtcactgtt tcttctgaaa gcaagtatgg 1260
ccccccatgc cctccctgcc ccggacagcc gcgggagccc caggtctaca ccctcccacc 1320
ctccagagat gagctgacca agaaccaggt ttcactgaca tgcctggtga agggcttcta 1380
cccctctgac attgctgtgg agtgggagag caatgggcag ccagagaaca actacaagac 1440
cacacctcct gtcctggaca gcgacggctc cttcttcctc tacagtaagc tcactgtgga 1500
caagagccgc tggcagcagg gcaatgtctt ctcctgcagc gtgatgcacg aggccctgca 1560
caatgcctat acccagaagt cactctctct gagccctgga aagaaggatc ccaagttttg 1620
ggtcctcgtg gtggtcgggg gtgtgctggc ctgctacagc ttgctggtca cagtggcctt 1680
catcatcttc tgggtgcgct ccaagaggag ccggctgctt cacagtgatt acatgaacat 1740
gacccccagg aggccaggac ccaccaggaa gcactaccag ccctacgctc ccccgcggga 1800
ctttgctgct taccgcagca gggtcaaatt ttctagatct gcagatgcgc cggcctatca 1860
acaaggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt 1920
tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc 1980
tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat 2040
tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag 2100
tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaata 2160
agaattctaa ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 2220
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 2280
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 2340
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg 2400
gagcggccgc agagtgaagg tgggtaccac tgggctttgg gaggagggca cggggtcccc 2460
cacttgatgg atgttcagag gggccttggt cttggaaggt ctcaagctcg ggtggtgcct 2520
ggggcttggt atccaggagc aaagcaagga ccagccaagt gtgtgccttg agtgggctga 2580
ggaggaggtg gcagtgtctg gctgagatgg acagggtagg agggagagcc tggtgctagg 2640
cacctccatg acaagccgta caaatgtgtg cacatcagag tgtcccaggg aaggcgatgc 2700
tactggtgac aaaggggctt acactcaggc agaggtcctt ctttccaagt gtgaatgaag 2760
gccatgttag cctttctctt gaaaaggccc tttcctcatc tgtaactggg ga 2812
<210> 38
<211> 2258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR片段
<400> 38
attgtcctca gagtccccgg aggaagggat cctagagaat actcatgtcc ccgggggcgc 60
agaccaagaa ccttatacct ctgcgcacgc gcgagggcgc tagcccggga agaataaact 120
ccagcgggtc ctgggccagc gtgatgaatg cacgtgtcac aggcgggagg aaaaaggaca 180
actgggctca gaaaaagggg ctgccacgcc ccggcccctg caagggctca gccccaggag 240
gcagggcagc attgttagtt gccaaggagc ggagtagggc tgtccctcgg gtcgccgcgc 300
gccctggcac cccggctccc ctgcgcgccc tcgcggagca gtaacgcgct ttgctttctg 360
tgttgcagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacgc caccaacttc tctcttttga 420
agcaggccgg agatgtggaa gaaaatcctg ggcccatggc tcttcctgtg actgcccttc 480
tgctgcccct ggctctcctg ctccatgctg cccggccaga catccagatg acacagacaa 540
ccagcagcct cagcgccagc ctgggggaca gagtgaccat tagctgccgg gcctctcagg 600
acatcagcaa atacctgaac tggtaccagc agaaaccaga tggcactgtc aagctgctga 660
tttaccacac ctccaggctc cacagcggcg tgcccagtcg cttcagcggc agtgggagcg 720
ggacagatta ttccctcaca atctccaacc tggagcagga agatattgcc acatacttct 780
gccagcaagg caacaccctg ccatacacat ttggaggcgg caccaaattg gagatcaccg 840
gcggtggtgg atctggagga gggggcagcg gaggtggcgg ctctgaggtg aaactgcagg 900
agagtggccc tggcctggtg gctcccagcc agagcctttc tgtcacctgc accgtgtctg 960
gggtgtccct gcctgactat ggagtctcct ggatccggca gcctccaaga aaaggactgg 1020
aatggctggg cgtcatctgg ggaagtgaga ccacctacta taattcagcc ctcaagtccc 1080
ggctcaccat cattaaggac aactccaaat cccaggtgtt cctgaagatg aattctctcc 1140
agactgatga cacagccatc tactactgtg ccaagcatta ttattacggc gggtcctatg 1200
ccatggacta ctggggccag gggaccagtg tcactgtttc ttctgaaagc aagtatggcc 1260
ccccatgccc tccctgcccc ggacagccgc gggagcccca ggtctacacc ctcccaccct 1320
ccagagatga gctgaccaag aaccaggttt cactgacatg cctggtgaag ggcttctacc 1380
cctctgacat tgctgtggag tgggagagca atgggcagcc agagaacaac tacaagacca 1440
cacctcctgt cctggacagc gacggctcct tcttcctcta cagtaagctc actgtggaca 1500
agagccgctg gcagcagggc aatgtcttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca 1560
atgcctatac ccagaagtca ctctctctga gccctggaaa gaaggatccc aagttttggg 1620
tcctcgtggt ggtcgggggt gtgctggcct gctacagctt gctggtcaca gtggccttca 1680
tcatcttctg ggtgcgctcc aagaggagcc ggctgcttca cagtgattac atgaacatga 1740
cccccaggag gccaggaccc accaggaagc actaccagcc ctacgctccc ccgcgggact 1800
ttgctgctta ccgcagcagg gtcaaatttt ctagatctgc agatgcgccg gcctatcaac 1860
aaggccagaa ccagctctat aacgtaagtc agcctcgccg tagaccctcc ggaaaggaag 1920
ggcagcctcc tcctcggacc tagggaacgc gcccgccaga gtcttgggtt taggtttggt 1980
ccctagctat cacctctgcg acccggctgc aacttgttta acctcagttt tctaacccac 2040
aaaacaggtg tagtaattgt acctgtctca aagggcgcca taaagattac atgctttaat 2100
gtcttgatgc atggaacgag cttagtctag tgcctgccac tagtgagccc ccaagccatc 2160
agcaatttgc aaaggctaga ggggggtgga gaaggaatgt attagaatct tcccagagga 2220
ggggaaagcg atttcacact ccctgtgcaa tgggactg 2258
<210> 39
<211> 398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 39
attgtcctca gagtccccgg aggaagggat cctagagaat actcatgtcc ccgggggcgc 60
agaccaagaa ccttatacct ctgcgcacgc gcgagggcgc tagcccggga agaataaact 120
ccagcgggtc ctgggccagc gtgatgaatg cacgtgtcac aggcgggagg aaaaaggaca 180
actgggctca gaaaaagggg ctgccacgcc ccggcccctg caagggctca gccccaggag 240
gcagggcagc attgttagtt gccaaggagc ggagtagggc tgtccctcgg gtcgccgcgc 300
gccctggcac cccggctccc ctgcgcgccc tcgcggagca gtaacgcgct ttgctttctg 360
tgttgcagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtac 398
<210> 40
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR体
<400> 40
gccaccaact tctctctttt gaagcaggcc ggagatgtgg aagaaaatcc tgggcccatg 60
gctcttcctg tgactgccct tctgctgccc ctggctctcc tgctccatgc tgcccggcca 120
gacatccaga tgacacagac aaccagcagc ctcagcgcca gcctggggga cagagtgacc 180
attagctgcc gggcctctca ggacatcagc aaatacctga actggtacca gcagaaacca 240
gatggcactg tcaagctgct gatttaccac acctccaggc tccacagcgg cgtgcccagt 300
cgcttcagcg gcagtgggag cgggacagat tattccctca caatctccaa cctggagcag 360
gaagatattg ccacatactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgccatacac atttggaggc 420
ggcaccaaat tggagatcac cggcggtggt ggatctggag gagggggcag cggaggtggc 480
ggctctgagg tgaaactgca ggagagtggc cctggcctgg tggctcccag ccagagcctt 540
tctgtcacct gcaccgtgtc tggggtgtcc ctgcctgact atggagtctc ctggatccgg 600
cagcctccaa gaaaaggact ggaatggctg ggcgtcatct ggggaagtga gaccacctac 660
tataattcag ccctcaagtc ccggctcacc atcattaagg acaactccaa atcccaggtg 720
ttcctgaaga tgaattctct ccagactgat gacacagcca tctactactg tgccaagcat 780
tattattacg gcgggtccta tgccatggac tactggggcc aggggaccag tgtcactgtt 840
tcttctgaaa gcaagtatgg ccccccatgc cctccctgcc ccggacagcc gcgggagccc 900
caggtctaca ccctcccacc ctccagagat gagctgacca agaaccaggt ttcactgaca 960
tgcctggtga agggcttcta cccctctgac attgctgtgg agtgggagag caatgggcag 1020
ccagagaaca actacaagac cacacctcct gtcctggaca gcgacggctc cttcttcctc 1080
tacagtaagc tcactgtgga caagagccgc tggcagcagg gcaatgtctt ctcctgcagc 1140
gtgatgcacg aggccctgca caatgcctat acccagaagt cactctctct gagccctgga 1200
aagaaggatc ccaagttttg ggtcctcgtg gtggtcgggg gtgtgctggc ctgctacagc 1260
ttgctggtca cagtggcctt catcatcttc tgggtgcgct ccaagaggag ccggctgctt 1320
cacagtgatt acatgaacat gacccccagg aggccaggac ccaccaggaa gcactaccag 1380
ccctacgctc ccccgcggga ctttgctgct taccgcagc 1419
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR组分
<400> 41
agggtcaaat tttctagatc tgca 24
<210> 42
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 42
gatgcgccgg cctatcaaca aggccagaac cagctctata acgtaagtca gcctcgccgt 60
agaccctccg gaaaggaagg gcagcctcct cctcggacct agggaacgcg cccgccagag 120
tcttgggttt aggtttggtc cctagctatc acctctgcga cccggctgca acttgtttaa 180
cctcagtttt ctaacccaca aaacaggtgt agtaattgta cctgtctcaa agggcgccat 240
aaagattaca tgctttaatg tcttgatgca tggaacgagc ttagtctagt gcctgccact 300
agtgagcccc caagccatca gcaatttgca aaggctagag gggggtggag aaggaatgta 360
ttagaatctt cccagaggag gggaaagcga tttcacactc cctgtgcaat gggactg 417
<210> 43
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 43
caaggccaga accagctcta taacgtaagt cagcctcgcc gtagaccctc cggaaaggaa 60
gggcagcctc ctcctcggac ctagggaacg cgcccgccag agtcttgggt ttaggtttgg 120
tccctagcta tcacctctgc gacccggctg caacttgttt aacctcagtt ttctaaccca 180
caaaacaggt gtagtaattg tacctgtctc aaagggcgcc ataaagatta catgctttaa 240
tgtcttgatg catggaacga gcttagtcta gtgcctgcca ctagtgagcc cccaagccat 300
cagcaatttg caaaggctag aggggggtgg agaaggaatg tattagaatc ttcccagagg 360
aggggaaagc gatttcacac tccctgtgca atgggactg 399
<210> 44
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
agggtcaaat tttctagatc tgcagatgcg ccggcctatc aacaaggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 45
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 45
taagaattct aactagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 60
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 120
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 180
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg 240
gggagcggcc gc 252
<210> 46
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强的GFP
<400> 46
atggtatcca agggtgaaga attgttcact ggcgtagttc ctatcttggt ggagctcgac 60
ggagatgtca atggacacaa gttttcagtc agtggcgaag gtgagggtga tgcaacttac 120
gggaagctta cactgaaatt catttgtact actggcaagt tgccggtgcc atggcccacg 180
ctggtaacga cccttaccta cggtgtccaa tgtttttctc gataccccga tcatatgaaa 240
cagcatgact tttttaaatc tgctatgccc gagggatacg tacaggaaag gactatattt 300
tttaaggacg atggtaacta taagacccgc gccgaagtca agtttgaggg agatactctt 360
gttaatcgaa tcgagctcaa ggggatagat tttaaggagg atggcaacat tctcggccac 420
aagctggagt acaattacaa tagtcacaat gtttacataa tggctgataa gcaaaaaaac 480
ggcatcaaag ttaattttaa aattaggcat aatatagaag acggttcagt tcaactcgcc 540
gaccactacc agcagaatac ccctattggc gatgggccgg ttctcctgcc tgacaaccat 600
tacctctcaa cacagtctgc tttgagtaaa gaccctaacg agaagcgaga tcatatggtc 660
ttgctcgagt tcgtaacggc cgccggtata accctgggca tggatgagct ctacaaataa 720
<210> 47
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 47
cctattaaat aaaagaataa gcagtattat taagtagccc tgcatttcag gtttccttga 60
gtggcaggcc aggcctggcc gtgaacgttc actgaaatca tggcctcttg gccaagattg 120
atagcttgtg cctgtccctg agtcccagtc catcacgagc agctggtttc taagatgcta 180
tttcccgtat aaagcatgag accgtgactt gccagcccca cagagccccg cccttgtcca 240
tcactggcat ctggactcca gcctgggttg gggcaaagag ggaaatgaga tcatgtccta 300
accctgatcc tcttgtccca cagatatcca gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag 360
agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc 400
<210> 48
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 48
attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca 60
aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca 120
acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct 180
tcttccccag cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag 240
gaatggccag gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg 300
gtctcggcct tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag tgagccttgt 360
tctggcagtc cagagaatga cacgggaaaa aagcagatg 399
<210> 49
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 49
accgtttttc tggacaaccc caaagtaccc cgtctccctg gctttagcca cctctccatc 60
ctcttgcttt ctttgcctgg acaccccgtt ctcctgtgga ttcgggtcac ctctcactcc 120
tttcatttgg gcagctcccc tacccccctt acctctctag tctgtgctag ctcttccagc 180
cccctgtcat ggcatcttcc aggggtccga gagctcagct agtcttcttc ctccaacccg 240
ggcccctatg tccacttcag gacagcatgt ttgctgcctc cagggatcct gtgtccccga 300
gctgggacca ccttatattc ccagggccgg ttaatgtggc tctggttctg ggtactttta 360
tctgtcccct ccaccccaca gtggggccac tagggacag 399
<210> 50
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 50
gtttattaca gggacagcag agatccagtt tggggatcaa ttgcatgaag aatctgctta 60
gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgagg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg 120
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 180
ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 240
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 300
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg catctctcct 360
tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg 420
cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg 480
tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag ccggctctcc 540
acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc tgttctgcgc 600
cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acggctagcg ccgccacc 648
<210> 51
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 51
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggccgtc 300
tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360
tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct 400
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 52
gauggaaucc ucuucaucua 20
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 53
gacgcccccg cguaccagca 20
<210> 54
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 54
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 55
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 55
gggaaucaaa aucggugaau 20
<210> 56
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 56
ggggccacua gggacaggau 20
<210> 57
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 57
ugguacccac cuucacucuc 20
<210> 58
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 58
ugccuuguuc cugagaguga 20
<210> 59
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 59
Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Arg Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg
20 25 30
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
35 40 45
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
85 90 95
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
100 105 110
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
115 120 125
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
145 150 155 160
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
165 170 175
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
195 200 205
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
210 215 220
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
225 230 235 240
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
245 250 255
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
260 265 270
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
275 280 285
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
290 295 300
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
305 310 315 320
Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
325 330 335
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
340 345 350
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
355 360 365
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
370 375 380
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
385 390 395 400
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
405 410 415
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
420 425 430
Val Lys
<210> 60
<211> 1999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 60
ggcaggagct ctgtgcacag agaacagcct catctgctcg ccttgtttcc acctcccctc 60
ccattgcccc aggttctttg gccccacagc ggccacatct gccgttggtg ccaataggtt 120
ttccaggagc tggttgaggt gggagggagg gagagggttg tgatcaggct gaggcatggg 180
gattggatat agtctccgtg tcatgattta tttggtcagt cagtcctagt gccaccctgg 240
ggtaatgggg atgtgttctc gtcaccttgg gcctggctga ccagctttat ctcttggcac 300
agaggcacag agctttggcc tgctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct 360
cttcatctat cgtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga gccaccaact tctctctttt 420
gaagcaggcc ggagatgtgg aagaaaatcc tgggcccatg gctcttcctg tgactgccct 480
tctgctgccc ctggctctcc tgctccatgc tgcccggcca gagcaaaaac ttatctctga 540
agaggacctc gacatccaga tgacacagac aaccagcagc ctcagcgcca gcctggggga 600
cagagtgacc attagctgcc gggcctctca ggacatcagc aaatacctga actggtacca 660
gcagaaacca gatggcactg tcaagctgct gatttaccac acctccaggc tccacagcgg 720
cgtgcccagt cgcttcagcg gcagtgggag cgggacagat tattccctca caatctccaa 780
cctggagcag gaagatattg ccacatactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgccatacac 840
atttggaggc ggcaccaaat tggagatcac cggcggtggt ggatctggag gagggggcag 900
cggaggtggc ggctctgagg tgaaactgca ggagagtggc cctggcctgg tggctcccag 960
ccagagcctt tctgtcacct gcaccgtgtc tggggtgtcc ctgcctgact atggagtctc 1020
ctggatccgg cagcctccaa gaaaaggact ggaatggctg ggcgtcatct ggggaagtga 1080
gaccacctac tataattcag ccctcaagtc ccggctcacc atcattaagg acaactccaa 1140
atcccaggtg ttcctgaaga tgaattctct ccagactgat gacacagcca tctactactg 1200
tgccaagcat tattattacg gcgggtccta tgccatggac tactggggcc aggggaccag 1260
tgtcactgtt tcttctatag aagtaatgta tccccctccc tacttggaca acgagaaatc 1320
taacggcaca atcatacacg ttaagggcaa gcatctgtgt ccctcccctc ttttccccgg 1380
accgtctaag ccattttggg tcctcgtggt ggtcgggggt gtgctggcct gctacagctt 1440
gctggtcaca gtggccttca tcatcttctg ggtgcgctcc aagaggagcc ggctgcttca 1500
cagtgattac atgaacatga cccccaggag gccaggaccc accaggaagc actaccagcc 1560
ctacgctccc ccgcgggact ttgctgctta ccgcagcaga gtgaaggtgg gtaccactgg 1620
gctttgggag gagggcacgg ggtcccccac ttgatggatg ttcagagggg ccttggtctt 1680
ggaaggtctc aagctcgggt ggtgcctggg gcttggtatc caggagcaaa gcaaggacca 1740
gccaagtgtg tgccttgagt gggctgagga ggaggtggca gtgtctggct gagatggaca 1800
gggtaggagg gagagcctgg tgctaggcac ctccatgaca agccgtacaa atgtgtgcac 1860
atcagagtgt cccagggaag gcgatgctac tggtgacaaa ggggcttaca ctcaggcaga 1920
ggtccttctt tccaagtgtg aatgaaggcc atgttagcct ttctcttgaa aaggcccttt 1980
cctcatctgt aactgggga 1999
<210> 61
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
275 280 285
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
290 295 300
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
305 310 315 320
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
325 330 335
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
340 345 350
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
355 360 365
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 62
<211> 3175
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 62
accgtttttc tggacaaccc caaagtaccc cgtctccctg gctttagcca cctctccatc 60
ctcttgcttt ctttgcctgg acaccccgtt ctcctgtgga ttcgggtcac ctctcactcc 120
tttcatttgg gcagctcccc tacccccctt acctctctag tctgtgctag ctcttccagc 180
cccctgtcat ggcatcttcc aggggtccga gagctcagct agtcttcttc ctccaacccg 240
ggcccctatg tccacttcag gacagcatgt ttgctgcctc cagggatcct gtgtccccga 300
gctgggacca ccttatattc ccagggccgg ttaatgtggc tctggttctg ggtactttta 360
tctgtcccct ccaccccaca gtggggccac tagggacagc attgattatt gagtagttat 420
taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 480
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 540
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 600
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 660
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 720
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 780
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 840
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 900
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 960
gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggtcg 1020
ccaccatggc tcttcctgtg actgcccttc tgctgcccct ggctctcctg ctccatgctg 1080
cccggccaga gcaaaaactt atctctgaag aggacctcga catccagatg acacagacaa 1140
ccagcagcct cagcgccagc ctgggggaca gagtgaccat tagctgccgg gcctctcagg 1200
acatcagcaa atacctgaac tggtaccagc agaaaccaga tggcactgtc aagctgctga 1260
tttaccacac ctccaggctc cacagcggcg tgcccagtcg cttcagcggc agtgggagcg 1320
ggacagatta ttccctcaca atctccaacc tggagcagga agatattgcc acatacttct 1380
gccagcaagg caacaccctg ccatacacat ttggaggcgg caccaaattg gagatcaccg 1440
gcggtggtgg atctggagga gggggcagcg gaggtggcgg ctctgaggtg aaactgcagg 1500
agagtggccc tggcctggtg gctcccagcc agagcctttc tgtcacctgc accgtgtctg 1560
gggtgtccct gcctgactat ggagtctcct ggatccggca gcctccaaga aaaggactgg 1620
aatggctggg cgtcatctgg ggaagtgaga ccacctacta taattcagcc ctcaagtccc 1680
ggctcaccat cattaaggac aactccaaat cccaggtgtt cctgaagatg aattctctcc 1740
agactgatga cacagccatc tactactgtg ccaagcatta ttattacggc gggtcctatg 1800
ccatggacta ctggggccag gggaccagtg tcactgtttc ttctatagaa gtaatgtatc 1860
cccctcccta cttggacaac gagaaatcta acggcacaat catacacgtt aagggcaagc 1920
atctgtgtcc ctcccctctt ttccccggac cgtctaagcc attttgggtc ctcgtggtgg 1980
tcgggggtgt gctggcctgc tacagcttgc tggtcacagt ggccttcatc atcttctggg 2040
tgcgctccaa gaggagccgg ctgcttcaca gtgattacat gaacatgacc cccaggaggc 2100
caggacccac caggaagcac taccagccct acgctccccc gcgggacttt gctgcttacc 2160
gcagcagggt caaattttct agatctgcag atgcgccggc ctatcaacaa ggccagaacc 2220
agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac 2280
gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt 2340
acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg 2400
agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg 2460
acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaaagatct cgagtctagc 2520
tcgagggcgc gccccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 2580
tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 2640
aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 2700
gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 2760
cggtgggctc tatgggattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc tccttcctag 2820
tctcctgata ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca gattccttat ctggtgacac 2880
acccccattt cctggagcca tctctctcct tgccagaacc tctaaggttt gcttacgatg 2940
gagccagaga ggatcctggg agggagagct tggcaggggg tgggagggaa gggggggatg 3000
cgtgacctgc ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc tctcccagaa cctgagctgc 3060
tctgacgcgg ccgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc tgcagcttcc ttacacttcc 3120
caagaggaga agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag ttggtcctga gttct 3175
<210> 63
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 63
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Pro Gly Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
290 295 300
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
305 310 315 320
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
325 330 335
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
340 345 350
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
355 360 365
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
370 375 380
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
385 390 395 400
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
405 410 415
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
420 425 430
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
435 440 445
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
450 455 460
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
465 470 475 480
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
485 490 495
Leu Pro Pro Arg
500
<210> 64
<211> 3199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 64
accgtttttc tggacaaccc caaagtaccc cgtctccctg gctttagcca cctctccatc 60
ctcttgcttt ctttgcctgg acaccccgtt ctcctgtgga ttcgggtcac ctctcactcc 120
tttcatttgg gcagctcccc tacccccctt acctctctag tctgtgctag ctcttccagc 180
cccctgtcat ggcatcttcc aggggtccga gagctcagct agtcttcttc ctccaacccg 240
ggcccctatg tccacttcag gacagcatgt ttgctgcctc cagggatcct gtgtccccga 300
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taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 480
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 540
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 600
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ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 780
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 840
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 900
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 960
gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggtcg 1020
ccaccatggc tcttcctgtg actgcccttc tgctgcccct ggctctcctg ctccatgctg 1080
cccggccaga gcaaaaactt atctctgaag aggacctcga catccagatg acacagacaa 1140
ccagcagcct cagcgccagc ctgggggaca gagtgaccat tagctgccgg gcctctcagg 1200
acatcagcaa atacctgaac tggtaccagc agaaaccaga tggcactgtc aagctgctga 1260
tttaccacac ctccaggctc cacagcggcg tgcccagtcg cttcagcggc agtgggagcg 1320
ggacagatta ttccctcaca atctccaacc tggagcagga agatattgcc acatacttct 1380
gccagcaagg caacaccctg ccatacacat ttggaggcgg caccaaattg gagatcaccg 1440
gcggtggtgg atctggagga gggggcagcg gaggtggcgg ctctgaggtg aaactgcagg 1500
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gggtgtccct gcctgactat ggagtctcct ggatccggca gcctccaaga aaaggactgg 1620
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ggctcaccat cattaaggac aactccaaat cccaggtgtt cctgaagatg aattctctcc 1740
agactgatga cacagccatc tactactgtg ccaagcatta ttattacggc gggtcctatg 1800
ccatggacta ctggggccag gggaccagtg tcactgtttc ttctcccggg aagccgacca 1860
caacaccagc accgcgccca ccaacaccag ctcccacaat agcctcgcag ccgctctcac 1920
tgcgcccgga ggcttgtagg cccgctgccg gtggagcagt tcatacgcga ggacttgatt 1980
tcgcctgtga catatatatt tgggcacctc tcgccggaac ctgtggggtc ttgctgctgt 2040
ctctcgttat aacgctttat tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac 2100
aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc 2160
cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gggtcaaatt ttctagatct gcagatgcgc 2220
cggcctatca acaaggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg 2280
agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa 2340
ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct 2400
acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc 2460
agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc 2520
ctcgctaaag atctcgagtc tagctcgagg gcgcgccccg ctgatcagcc tcgactgtgc 2580
cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2640
gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 2700
ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2760
acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg attggtgaca gaaaagcccc 2820
atccttaggc ctcctccttc ctagtctcct gatattgggt ctaaccccca cctcctgtta 2880
ggcagattcc ttatctggtg acacaccccc atttcctgga gccatctctc tccttgccag 2940
aacctctaag gtttgcttac gatggagcca gagaggatcc tgggagggag agcttggcag 3000
ggggtgggag ggaagggggg gatgcgtgac ctgcccggtt ctcagtggcc accctgcgct 3060
accctctccc agaacctgag ctgctctgac gcggccgtct ggtgcgtttc actgatcctg 3120
gtgctgcagc ttccttacac ttcccaagag gagaagcagt ttggaaaaac aaaatcagaa 3180
taagttggtc ctgagttct 3199
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导RNA
<400> 65
ggccacggag cgagacaucu 20

Claims (17)

1.一种核酸构建体，其包含：
-第一核酸序列区，其编码嵌合抗原受体(CAR)片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，
-第二核酸序列区，其包含被配置成用于将所述构建体整合在人细胞的内源CD3ζ基因处的靶向序列，和
-第三核酸序列区，其编码和/或包含在所述第一序列区的上游的蛋白分离位点。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中编码CAR片段的所述第一核酸序列区包含：
-编码细胞外抗原结合结构域的核酸序列，所述抗原结合结构域优选包含抗体或抗体片段，
-编码跨膜结构域的核酸序列，和
-编码一种或多种细胞内共刺激结构域的核酸序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中，所述靶向序列被配置成用于将所述构建体与内源CD3ζ编码序列框内整合，优选整合至内源CD3ζ基因的外显子中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述第三核酸序列的蛋白分离位点编码第一自切割肽、蛋白酶切割位点或内部核糖体进入位点(IRES)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一序列区被整合至其中的所述CD3ζ基因的靶位点是外显子和/或内含子，优选是外显子2，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中编码CAR片段的所述第一核酸序列区另外包含编码CAR调节蛋白、免疫刺激蛋白和/或治疗性蛋白的序列，所述序列位于框内并通过蛋白分离位点，诸如编码第二自切割肽的序列、启动子和/或IRES位点，与CAR片段编码区分离。
7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第二序列区的靶向序列被配置成用于通过基因编辑技术，优选CRISPR-Cas、锌指核酸酶(ZFN)、整合酶、位点特异性重组酶、兆核酸酶、归巢核酸内切酶或TALEN，更优选源自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR-Cas9，整合至宿主基因组中，
和/或
其中所述靶向序列包含与预期整合至其中的内源DNA序列的识别位点相同的序列，优选地选自由以下组成的组：同源臂、向导RNA靶位点、限制酶识别位点、ZFN识别位点、ZFN切割位点、TALEN DNA结合位点、重组酶识别位点、整合酶位点和/或归巢核酸酶识别位点。
8.一种基因修饰的人细胞，其包含外源核酸序列区，所述外源核酸序列区编码CAR片段，而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，所述外源核酸序列区被框内整合至内源CD3ζ基因中。
9.根据权利要求8所述的基因修饰的细胞，其中，CAR被表达为包含CAR片段和内源CD3ζ基因的细胞内结构域的框内融合蛋白，所述细胞内结构域包含一个或多个ITAM。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的基因修饰的细胞，其中，所述CAR-CD3ζ融合基因在内源CD3ζ启动子的控制下表达，其中所述CAR的表达优选地由内源CD3ζ基因表达终止信号和内源poly-A信号终止。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的基因修饰的细胞，其中，TCR复合物的内源表达和/或功能，优选TCRα和/或β链的表达和/或功能，被破坏。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的基因修饰的细胞，其中，所述细胞是免疫细胞，优选地选自由以下组成的组：T淋巴细胞、T调节性(Treg)细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、包括NKT、NK-92和YT细胞的永生化免疫细胞，或源自人外周血、人脐带血、骨髓干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的细胞，其中所述T淋巴细胞优选是CD4或CD8 T细胞，更优选是细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的基因修饰的细胞，用作药物的用途，优选地用于治疗与存在表达癌基因的致病细胞诸如癌细胞，更优选实体和血液恶性肿瘤的癌症干细胞相关的医学疾患的用途，或优选地用于治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的用途。
14.根据权利要求13所述的用途的基因修饰的细胞，其中，所述基因修饰的细胞对于患者是同种异体的，优选是同种异体T细胞、NK细胞或Treg。
15.根据权利要求13所述的用途的基因修饰的细胞，其中，所述基因修饰的细胞对于患者是自体的，优选是自体T细胞、NK细胞或Treg。
16.一种CAR多肽，由根据权利要求8至12中任一项所述的基因修饰的细胞表达，其包含作为框内融合蛋白的CAR，所述框内融合蛋白包含外源CAR片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，和所述内源CD3ζ基因的细胞内结构域，所述细胞内结构域包含一个或多个ITAM。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求8至12中任一项所述的基因修饰的细胞和药学上可接受的载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4353252A1 (en) 2022-10-10 2024-04-17 Charité - Universitätsmedizin Berlin Antigen-specific t cells by gene editing of cd3 epsilon
WO2024081879A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of cd247 expression

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
DK0973928T3 (da) 1997-03-11 2010-08-09 Univ Minnesota DNA-baseret transposonsystem til indføring af nukleinsyre i DNA i en celle
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6692736B2 (en) 2000-03-24 2004-02-17 Cell Genesys, Inc. Cell-specific adenovirus vectors comprising an internal ribosome entry site
US9228180B2 (en) 2007-07-04 2016-01-05 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Polypeptide variants of sleeping beauty transposase
WO2017080989A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. (r)-fluriprofen for the prevention and/or treatment of diabetes
KR102437015B1 (ko) * 2016-04-15 2022-08-29 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 유전자이식 t 세포 및 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 관련 방법
KR20210029707A (ko) * 2018-04-05 2021-03-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법 및 관련 조성물
US20220218750A1 (en) * 2019-05-01 2022-07-14 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods

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