CN1551783A

CN1551783A - 治疗多发性骨髓瘤的方法

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Publication number: CN1551783A
Application number: CNA028174437A
Authority: CN
Inventors: ˹��ء��ɭ; 罗伯特·林赛·雷森; 罗莎奈·多箩西·邓恩; ��ҡ��; 布恩·华·安德烈·朱
Original assignee: PACMAB Pty Ltd
Current assignee: Blood Pump Pte Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2022-07-05
Also published as: DK1414492T3; MXPA04000130A; NZ530099A; DE60223688T2; ZA200400959B; US20040214761A1; JP4535424B2; EP1414492A4; WO2003004056A1; CA2461989C; EP1414492A1; US20090263358A1; US7556803B2; US20080199463A1; AUPR617901A0; US7838041B2; DE60223688D1; ES2296952T3; CN1551783B; EP1414492B1

Abstract

本发明涉及治疗多发性骨髓瘤的方法。更特别地，本发明涉及通过施用类K121抗体(K121－like antibody)诱导骨髓瘤细胞编程性细胞死亡的方法。

Description

治疗多发性骨髓瘤的方法

发明领域

本发明涉及治疗多发性骨髓瘤的方法。更特别地，本发明涉及通过施用类K121抗体(K121-like antibody)诱导骨髓瘤细胞中编程性细胞死亡的方法。

发明背景

多发性骨髓瘤(MM)是一种B细胞恶性肿瘤，其特征在于在骨髓中聚集终末分化的B细胞(浆细胞)。近来的研究鉴别了在骨髓瘤浆细胞中存在的一些遗传和分子缺陷(Drach，J.等(2000)，Cancer ResClin Oncol.126：441；Ludwig，H.等(1999)Annals Oncol.10(6)：S31)。这些资料表明多发分子事件导致有深远意义的细胞遗传不稳定性，化疗抗性及骨髓新血管化增加。目前治疗MM的方法是大剂量化疗和/或自体周围血干细胞移植。现在比较偏爱后一治疗方法，因为其5年存活率较高(52％对12％)。最近，抗血管发生剂如Thalidomide在大约30％的难治患者中产生了客观应答。尽管用这样猛烈的药物治疗，MM仍然是不可逆转地致命的，根据治疗模式的不同平均存活时间为4-6年(Kyle，RA.等(2001)The Oncologist.6(2)：119).。

在美国目前有40,000名MM患者，估计每年有大约14,000名新诊断的患者(Chauhan，D.和Anderson KC.(2001)Apoptosis.6(1-2)：47)。根据国家的不同，MM在世界的发生率在1.5-4.5个人/100,000个人/年之间(Hurez，D.(1993)Revue du Praticien.43(3)：271)。

MM中的恶性B细胞产生过量的轻链，这是免疫球蛋白的一种成分，这些轻链存在于患有该疾病的患者的血清和尿液中。大约70％的MM患者产生κ类型轻链，剩余30％患者产生λ类型轻链(Kyle，RA.(1999)Path Biol.47(2)：148)。

K121是一种鼠单克隆抗体(mAb)，其特异性识别人游离κ轻链及在κ类型骨髓瘤细胞表面上表达的抗原。这个抗原称为κ骨髓瘤抗原或KMA(Boux，HA.等(1983)J Exp Med.158：1769)。已经确定KMA由游离κ轻链组成，所述轻链与肌动蛋白非共价缔合在细胞膜上表达(Goodnow等(1985)J.Immunol.135：1276)。K121与任何正常或恶性淋巴细胞或者与完整的人免疫球蛋白分子均不呈现交叉反应性(Boux，HA等(1984)Eur.J.Immunol.14：216)。

已经揭示了使用K121进行定量免疫分析以测定MM患者血清和尿液中的游离κ轻链(Axiak，SM.(1987)J Immunol Methods.99：141)。近来的文献提示量化游离轻链可用于监测这些患者病情进展及对治疗的反应(Drayson，M.(2001)Blood 97(9)：2900)。

也已经提示K121可用于将细胞毒素输送至κ骨髓瘤细胞(Goodnow等(1985)J.Immunol.135：1276)。确实已经揭示了一种免疫毒素作为治疗MM的潜在治疗剂，所述免疫毒素包含与K121 scFv片段连接的溶细胞肽蜂毒肽(scFv-mel)(Dunn，RD.等，(1996)Immunotechnology 2：229)。

发明概述

本发明人现今发现单独的K121(即未与毒素或胞毒剂缀合)能通过诱导编程性细胞死亡杀死携带KMA的细胞。另外，本发明人已经证实K121单独就能防止肿瘤细胞在体内生长。这些发现表明类K121抗体在治疗多发性骨髓瘤中能潜在地用作主要治疗剂。

因此，本发明的第一方面提供了一种治疗κ类型多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括为所述治疗对象施用有效量的类K121抗体，其中所述类K121抗体未与毒素或胞毒剂缀合。

本发明还提供了类K121抗体在制备治疗κ类型多发性骨髓瘤的药物中的应用，其中类K121抗体未与毒素或胞毒剂缀合。

在所述第一方面的一个优选的实施方案中，所述方法还包括在施用类K121抗体之前治疗所述对象以降低其体液中游离κ轻链水平的步骤。优选地，所述对象血清中存在的游离κ轻链水平被降低。游离κ轻链水平的降低可通过例如血浆除去法(plasmapharesis)而实现。优选对所述对象进行的降低游离κ轻链水平的治疗就在施用类K121抗体之前进行。

第二方面，本发明提供了一种在治疗对象体内进行自体造血干细胞移植的方法，所述方法包括：

(i)从所述对象中获得造血祖细胞群，

(ii)用类K121抗体处理所述细胞群，

(iii)将步骤(ii)的经处理的细胞群移植入所述对象中，

其中类K121抗体未与毒素或胞毒剂缀合。

在第二方面的一个优选实施方案中，所述方法还包括将类K121抗体静脉内注入所述对象体内。

在第二方面的一个优选实施方案中，自体移植方法在肿瘤细胞减灭术(cytoreductive)治疗期间或之后对所述对象进行。

第三方面，本发明提供了一种杀死混合细胞群中κ类型骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括将所述混合细胞群与类K121抗体接触，其中所述类K121抗体未与毒素或胞毒剂缀合。

第四方面，本发明提供了一种在携带KMA细胞中诱导编程性细胞死亡的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于类K121抗体，其中类K121抗体未与毒素或胞毒剂缀合。

在第四方面的一个优选的实施方案中，所述携带KMA的细胞是κ类型骨髓瘤细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述类K121抗体包含K121抗体的CDR环(CDR1，CDR2和CDR3)，如图9a所示。在另一个实施方案中，所述类K121抗体包含K121抗体的VH和VL基因，如图9a所示。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述类K121抗体是一种嵌合抗体或人源化抗体。

附图简述

图1：(a)通过胞质LDH渗漏测定的mAb K121对HMy2和K562类淋巴母细胞的胞毒性活性(在492nm的吸光度)。将细胞在有或无K121 mAb(6.25μM)的情况下温育20小时。(b)K121诱导细胞死亡的动力学。(c)K121杀死HMy2细胞的浓度依赖性。

图2：K121诱导的HMy2编程性细胞死亡的流式细胞计量分析。与PBS或K121温育16和20小时的HMy2细胞的光散射。FSC和SSC分别相应于细胞大小和细胞复杂度。

图3：(a)使用膜联蛋白V-FITC对K121诱导的HMy2编程性细胞死亡的流式细胞计量分析。将HMy2细胞在无K121(对照)或有K121的情况下在37℃温育16或20小时。然后将该细胞与膜联蛋白V-FITC温育并用碘化丙锭复染。(b).与膜联蛋白V分析平行进行的K121 mAb对HMy2细胞的胞毒性。将HMy2细胞在无K121 mAb(对照)或有K121 mAb(5.35μM)的情况下在37℃温育16或20小时。收获培养上清以分析胞质LDH渗漏。

图4：(a)使用TUNEL分析对K121诱导的HMy2编程性细胞死亡的流式细胞计量分析。将HMy2细胞在无K121(对照)或有K121的情况下在37℃温育16或20小时。然后将细胞固定并将胞内DNA在3’末端用荧光素-12-dUTP酶促标记。(b)与TUNEL分析平行进行的与或不与K121温育16和20小时后HMy2细胞的胞毒性。将HMy2细胞在无K121 mAb(对照)或有K121 mAb(5.35μM)的情况下在37℃温育16或20小时。收获培养上清以分析胞质LDH渗漏。

图5：在进行以下处理之后，SCID小鼠中HMy2分泌的人IgG的血清水平时程：(a)未处理(PBS)，(b)用scFv-mel处理，或者(c)用K121 mAb处理。在第0天i.p.注射细胞(10⁷)及在第1-3天用scFv-mel(0.5mg/剂)或K121 mAb(1.25mg/剂)处理。在处理组内，每个符号代表一个小鼠的IgG值。

图6：抗体处理对SCID小鼠中肿瘤生长的作用。在第0天为SCID小鼠注射HMy2细胞并施用K121 Mab三天(第1，2和3天)，总剂量水平为3.0，1.5，0.3，0.15和0(PBS对照)mg。通过量化小鼠血清中人IgG而确定肿瘤生长情况。图示数值是6只小鼠的平均值，但未处理组第6周的数值除外，该数值来自一个小鼠。

图7：抗体剂量对携带肿瘤的小鼠存活率的作用。

图8：在注射肿瘤细胞42天后，未处理及抗体处理的小鼠血清中人IgG水平。数值针对各个小鼠。*：人IgG未检测到；：死亡。

图9：(a)K121重链(VH)和轻链(VL)可变区氨基酸序列和相应的DNA序列。CDR区域以黑体字示出。(b)衍生自K121的VH基因的重叠寡核苷酸(VH1-VH6)。(c)衍生自K121的VL基因的重叠寡核苷酸(VL1-VL6)。(d)K121 VH的寡核苷酸延伸的PCR引物。(e)K121 VL的寡核苷酸延伸的PCR引物。(f)使用寡核苷酸延伸产生K121单克隆抗体重链和轻链可变区的方法图示。

图10：通过PCR扩增K121 VH和VL基因的PCR引物。下划线处是定向克隆入哺乳动物表达载体中的限制酶位点。cK-VH-R和cK-VL-R引物包括一个剪接受体位点(黑体字所示)。

图11：(a)用于检测和定量转染的CHO细胞上清中人抗体的ELISA。将转染的CHO细胞的培养上清系列稀释，使用山羊抗人Fc特异性AP缀合物检测与固定化山羊抗人IgG+A+M结合的人抗体。使用人IgG1κ的系列稀释液平行作标准曲线。通过显色及在405nm测定的吸光度观测结合的抗体。(b)用于检测与人κ轻链结合的嵌合K121的ELISA。将转染和未转染的CHO细胞的培养上清系列稀释，使用山羊抗人Fc特异性AP缀合物检测与固定化人κ轻链结合的抗体。在显色之后，通过在405nm的吸光度检测结合的抗体。

图12：嵌合的K121(cK121)对HMy2和K562类淋巴母细胞的胞毒性活性，通过胞质LDH渗漏测定。将靶细胞在37℃，在5％CO₂气氛中，在存在PBS(对照)，5.5μM鼠K121(mK121)或者0.8μM嵌合K121(cK121)的情况下温育20小时。

图13：各个克隆分泌的cK121的浓度。cK121的浓度使用抗人IgG，IgA和IgM包被的孔通过ELISA确定。数据表示阳性克隆1-5和阴性克隆6。

图14：(a)使用人VL基因作为构架人源化K121 VL的方法图示。(b)人构架VL和K121 VL的DNA序列。(c)使用PCR人源化K121 VL的寡核苷酸。

图15：(a)K121和人VH3(hVH)可变重链基因的DNA序列。(b)用于人源化K121中的VH诱变引物。

发明详述

本文所用短语“类K121抗体”是指一种抗体，其与具有图9a所示VH和VL区域的抗体竞争结合κ类型骨髓瘤细胞。优选地，术语“类K121抗体”是指一种抗体，其与具有图9a所示VH和VL区域的抗体结合相同的表位。

所述类K121抗体优选包含K121抗体的CDR环(CDR1，CDR2和CDR3)，如图9a所示。所述类K121抗体可包含图9a所示K121抗体的VH和VL基因。

类K121抗体可以通过其与K121(或嵌合或人源化形式的K121)竞争结合HMy2细胞上KMA的能力而鉴别。在这个程序中，可使用公知的程序(Hofmann K，等(1982)Biochemistry 21：978-84)将K121与生物素缀合。然后通过其与生物素酰化的K121竞争结合HMy2细胞上的KMA的能力而评价类K121抗体。生物素酰化的K121与HMy2细胞的结合可通过加入荧光素标记的链亲和素而确定，所述链亲和素结合K121分子上的生物素。然后通过流式细胞计量术量化细胞的荧光染色，类K121抗体的竞争作用以相对于无竞争剂情况中获得的荧光水平的百分率表示。

针对本发明的目的，术语“抗体”，除非特别说明，包括保留与靶抗原结合性的整个抗体的二价片段。这种片段包括例如F(ab′)₂片段。

在本发明优选的实施方案中，类K121抗体是一种重组或单克隆抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是嵌合的或人源化抗体。

当在本发明的方法中使用时，类K121抗体是不与毒素或胞毒剂缀合的。“毒素”是指本领域已知的任何毒素，如蓖麻毒蛋白，沙卜林(saprin)，白喉毒素和假单胞菌外毒素。“胞毒剂”是指使细胞溶解的一种制剂如蜂毒肽。

在本说明书中，术语“包含”是指包含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或者其它要素、整数或步骤组。

单克隆抗体

本领域技术人员可容易地产生KMA表位的单克隆抗体。通过杂交瘤生产单克隆抗体的一般方法是熟知的。产生抗体的无限增殖细胞系可通过细胞融合产生，也可以通过其它技术产生，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或者用Epstein-Barr病毒转染。抗KMA表位产生的单克隆抗体组合可针对各种性质加以筛选，即针对同种型和表位亲和性加以筛选。

小鼠衍生的单克隆抗体可用于直接在体内或者在体外进行免疫治疗这两种情况。然而，已经观测到当小鼠衍生的单克隆抗体用于人体作为治疗剂时，患者产生人抗小鼠抗体。因此，小鼠衍生的单克隆抗体用于治疗，尤其是长期使用不是优选的。然而，使用熟知的遗传工程技术可以产生嵌合或人源化的抗体，所述抗体具有动物衍生的及人衍生的部分。所述动物可以是小鼠或另一种啮齿动物如大鼠。

如果嵌合抗体的可变区是小鼠衍生的而恒定区是人衍生的，则该嵌合抗体一般比“纯”小鼠衍生的单克隆抗体的免疫原性低。如果“纯”小鼠衍生的抗体是不适合的，这些嵌合抗体可能更适于治疗应用，

嵌合抗体

产生嵌合抗体的方法是本领域技术人员可获得的。例如轻链和重链可使用例如免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链在单独的质粒中分别表达。然后将其纯化并在体外装配为完整抗体；对实现这种装配的方法已有描述。见例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69：125(1974)所述。也见于Oi等，Bio Techniques 4(4)：214-221(1986)；及Sun等，Hybridoma 5(1986)Suppl 1：517-20所述。这种DNA构建体可包含与编码人恒定区的DNA连接的编码类K121抗体的轻链或重链的可变区的功能性重排基因的DNA。淋巴样细胞如用编码轻链和重链的所述DNA构建体转染的骨髓瘤或杂交瘤可表达及装配所述抗体链。

从还原的分离的轻链和重链中形成IgG抗体的体外反应参数也已经描述。见例如Beychok，S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，学术出版社，纽约，p.69，1979。轻链和重链在相同细胞中共表达以实现重链和轻链胞内缔合及连接成为完整的H₂L₂ IgG抗体也是可能的。这种共表达可以使用相同宿主细胞中的相同或不同质粒实现。

人源化抗体

在本发明另一个优选的实施方案中，类K121抗体是人源化的，即通过分子模型技术产生的抗体，其中抗体的人含量最大且小鼠抗体可变区所带来的结合亲和性几乎不丧失或不丧失。

以下所述方法可用于人源化类K121抗体。可使用两步方法，包括(a)选择用作人源化的人构架的人抗体序列，(b)确定应选择动物单克隆抗体的哪些可变区残基插入选择的人构架中。

第一步包括选择最佳的可利用的人构架序列，其序列信息是可获得的。这个选择方法基于以下选择标准。

(1)相同性百分率

将准备人源化的动物单克隆抗体的重链和轻链可变区的序列与所有已知的人抗体重链和轻链可变区序列进行最佳排列并优选地进行对比。

一旦这样对比序列，记录残基相同性并确定相同性百分率。所有其它因素均是相同的情况下，希望的是选择与所述动物抗体具有最高百分率相同性的人抗体。

(2)序列分歧(sequence ambiguities)

在序列是通过直接蛋白质测序而衍生的情况中，可以评价已知人抗体链序列中未鉴别的残基和/或分歧的存在情况，所述分歧是序列不确定性。最常见的这种不确定性是由于在测序程序期间丢失一个氨而将一个酰胺氨基酸错误鉴别为一个酸性氨基酸，例如当真正存在于蛋白质中的残基是谷氨酰胺残基时不正确地鉴别是谷氨酸残基。所有其它因素是相同的情况下，希望的是选择这种分歧尽可能少的人抗体。

(3)Pin-区域间隔

抗体链可变区含有结构域内二硫键。包含这些键的半胱氨酸残基之间的距离(残基数)称为Pin-区域间隔(Pin-region spacing，Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。所有其它因素是相同的情况下，最希望的是所选择的人抗体的Pin区域间隔与动物抗体的Pin区域间隔相似或相同。也希望人序列Pin区域间隔与已知抗体三维结构的Pin区域间隔相似，以便于计算机建模。

基于前述标准，选择具有最佳全部希望的特性组合的人抗体作为人源化动物抗体的构架。选择的重链和轻链可以来自相同或不同的人抗体。

本发明方法中的第二步包括确定应选择哪个动物抗体可变区序列接入人构架中。这个选择方法基于以下选择标准：

(1)残基选择

评价动物抗体序列中两种类型的潜在可变区残基，第一种称为“最小残基”。这些最小残基包含CDR结构环加上任何额外的如计算机建模所示的支持和/或定向所述CDR结构环所需的残基。

另一类型的潜在可变区残基称为“最大残基”。其包含最小残基加上任何额外的如通过计算机建模所确定的落入大约10的CDR结构环残基内并具有水溶剂可及表面的残基(Lee等，J.Biol.Chem.55：379(1971))。

(2)计算机建模

为鉴别潜在的可变区残基，对以下结构进行计算机建模，(a)准备人源化的动物抗体的可变区序列，(b)选择的人抗体构架序列，及(c)包含人抗体构架序列的所有可能的重组抗体，其中已经接入各种最小和最大动物抗体残基。

使用适于蛋白质建模的软件及得自一抗体的结构信息进行计算机建模，所述抗体(a)具有与动物抗体的那些序列最接近相同的可变区氨基酸序列，(b)具有已知的三维结构。可以使用的软件例如是SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。从中可获得结构信息的抗体可以是但非必须是人抗体。

基于在前述分析中获得的结果，选择如下重组链以进行人源化，所述重组链含有产生最接近动物抗体结构的计算机建模结构的动物可变区。

完整人抗体可通过使用人免疫球蛋白表达文库(Stratagene Corp.，La Jolla，Calif.)产生，以产生人抗体片段(V_H，V_L，F_V，Fd，Fab或F(ab′)₂)，及使用与产生嵌合抗体相似的方法用这些片段构建完整人抗体。

施用模式

类K121抗体可直接施用于需要治疗多发性骨髓瘤的患者。

肿瘤细胞的生长可通过为患者施用治疗有效量类K121抗体而得以抑制或降低。典型地，施用的抗体量可以是大约0.001-2000mg/kg体重/剂，更优选为大约0.01-500mg/kg体重/剂。根据主治医生的处方可重复施用。然而，其它量也是合适的。一般地，抗体的施用通过输注而进行，以便可能产生有害作用的抗体量可以通过改变施用速度而控制。典型地，单次剂量的输注可以持续几个小时。然而，针对治疗目的也期望持续输注单次剂量以使得血清中抗体水平保持恒定。可如下输注类K121抗体。静脉内(I.V.)管道可例如用0.9％NaCl和5％血清白蛋白预处理，并放置以进行静脉内施用。静脉内输注可包含总体积为250ml的0.9％NaCl和5％人血清白蛋白，并根据观测到的任何速度依赖性副作用而在大约2小时期间输注完毕。例如应在输注期间每15分钟及每次输注后1小时获取生命体征直至稳定。在输注之前及之后进行彻底的心肺功能检测。随时准备药物包括对乙酰氨基酚，苯海拉明，肾上腺素和皮质类固醇以处理可能发生的过敏反应。所述抗体可根据医生希望的结果而重复施用。

本领域熟练技术人员意识到，一些骨髓瘤患者在其循环中具有显著水平的游离κ轻链。由于类K121抗体与游离κ轻链反应，因此其在患者体液中的存在可降低治疗效力。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述治疗方法还包括在施用类K121抗体之前处理治疗对象，以降低其体液(例如血液)中循环的游离κ轻链水平的步骤。这个额外的治疗步骤可包括例如血浆去除法。如本领域技术人员所已知，血浆去除法是通过称为细胞分离器的设备将血浆从血细胞中去除的方法。所述分离器通过高速旋转血液以从液体中分离细胞或者通过将血液经过一个孔径很小只允许血浆通过的膜而运行。将细胞回输入患者，而含有游离κ轻链的血浆则弃去并用其它液体代替。在进行该步骤期间可通过静脉给予保持血液免于凝集的药物(例如抗凝血剂)。

类K121抗体也可用于从生物学样品中清除恶性浆细胞，所述样品是体液或组织样品。从体液样品中清除骨髓瘤细胞是本发明的一部分，并可以通过将怀疑包含恶性浆细胞的生物学液体与类K121抗体接触而实施，所述抗体能选择性结合恶性细胞并导致其编程性细胞死亡。这种方法可用于清除源于体内的不必要的细胞，通过从患者体内提取生物学样品，通过类K121抗体诱导的编程性细胞死亡而清除恶性细胞，然后为患者补充净化的样品。

应意识到包括使用类K121抗体的治疗多发性骨髓瘤的方法可以单独进行或者作为已知化疗或放疗方案的辅助方法进行。例如，类K121抗体治疗可与药物如苯丙氨酸氮芥或环磷酰胺治疗联合或者在其之后进行。

为了可以更清晰地理解本发明，参考以下非限制性实施例描述优选的形式。

实施例1：评定胞毒性

mAb K121的胞毒性使用CytoTox96非放射性胞毒性分析试剂盒(Promega)评价，其测定在细胞溶解期间由细胞释放入上清中的乳酸脱氢酶(LDH)。从原种培养物中收获HMy2(KMA阳性)和K562(KMA阴性)细胞，以1×10⁶个细胞/ml再悬浮于补加5％FBS的2×RPMI中。将3×10⁴细胞等份加入96孔组织培养平板的各个孔中。将浓度为2.5，5.0，7.5，10，12.5μM的K121 mAb以30μl体积一式两份加入合适的孔中。在37℃，在5％CO₂气氛中温育20小时后，收集每个孔的上清并在3000g离心1分钟。将澄清的上清(50μl)移至另一个96孔微滴定分析平板中，与等体积的底物混合。将该平板在室温黑暗温育30分钟，并用50μl终止溶液终止反应。在OrganonTeknika microelisa平板读出器上(Tumhout，Belgium)测定492nm处吸光度值。单独的培养基(补加2.5％FBS的1×RPMI)作为背景对照，因为培养基中的FBS和酚红可导致明显提高的LDH水平。针对时程研究，将HMy2细胞与12.5μM的K121 mAb温育，在加入所述抗体4，8，12，16和20小时后收获培养上清。

实施例2：编程性细胞死亡分析

K121对HMy2细胞的胞毒性活性的机制以两种方式评价：膜联蛋白V结合及TUNEL分析。在这两种分析期间进行平行LDH分析以证实发生细胞死亡。

膜联蛋白V结合：膜联蛋白V是一种蛋白质，其特异性结合细胞膜内的磷脂酰丝氨酸。一旦所述膜开始出现破坏及磷脂“翻转入”胞外基质中，则发生结合。结果是该方法测定编程性细胞死亡的最早阶段。以下简要描述膜联蛋白V结合方法。从原种培养物中收获HMy2细胞，再悬浮于补加5％FBS的1×RPMI中，至密度为1×10⁶个细胞/ml。将500μl细胞等份加入6孔组织培养平板中。将浓度为10.7μM的等体积的K121 mAb加入细胞中，在37℃在5％CO₂气氛中温育分析平板。加入等体积的PBS作为阴性对照。在16和20小时从孔中通过离心收获细胞。取一等份上清分析胞外LDH，细胞沉淀在结合缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl₂.2H₂O)中洗涤。将洗涤的细胞再悬浮于100μl结合缓冲液中，用2μl膜联蛋白V-FITC(Bender MedSystems，Vienna，Austria)在室温温育15分钟。加入另外400μl结合缓冲液，将细胞计数器用1μl的1mg/ml碘化丙锭(Sigma-Aldrich，St Louis，MI)在冰上染色15分钟。然后使用FACScan(BD)通过流式细胞计量术分析细胞。

TUNEL分析：在编程性细胞死亡的最后阶段，染色体DNA经历一种特殊的片段化模式。TUNEL分析依赖于末端转移酶标记片段化的DNA的3’末端。因此，该分析是测定编程性细胞死亡的最后阶段。简而言之，准备含有在K121/或PBS存在下的HMy2细胞的孔各一式两份，如前述温育。使用编程性细胞死亡检测系统荧光素(Promega，Madison，WI)进行TdT-介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析。制备细胞并如厂商指导进行分析。简而言之，将细胞在PBS中洗涤，用10％甲醛及随后的70％乙醇固定。胞内DNA用荧光素-12-dUTP在3’末端酶促标记，并在FACScan上分析。

实施例3：SCID小鼠肿瘤模型

为评价K121在体内的潜在抗肿瘤作用，将6周龄的SCID小鼠在第0天腹膜内(i.p.)注射HMy2细胞。在注射肿瘤细胞之后，通过i.p.注射为小鼠施用K121抗体或PBS。由于HMy2细胞分泌人IgG，肿瘤生长的进程通过使用人IgG特异性免疫分析量化受体小鼠血清中人IgG而监测。

实施例4：量化人IgG

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)量化SCID小鼠血清中人IgG的水平。将于PBS-Az中的蛋白质A(100μg/ml的50μl/孔)在96孔ELISA平板中在37℃温育1小时。将孔用PBS-Az洗涤三次，并用于PBS-Az中的3％BSA在37℃封闭1小时。将孔在PBS-Az中洗涤两次，并与50μl/孔的用PBS-Az中1％BSA稀释2.5倍的小鼠血清在37℃温育1小时。在用PBS-Az洗涤3次后，结合的抗体用50μl/孔的山羊抗人κ-轻链AP缀合物(于1％BSA-PBS-Az中1∶1000稀释)在37℃检测1小时。结合的抗原—抗体复合物通过加入于ELISA底物缓冲液(0.1M甘氨酸，1mM MgCl₂，1mM ZnCl₂，pH10.4)中的对硝基苯磷酸(pNPP)底物(50μl/孔，1mg/ml)，随后在PBS-Az中洗涤2次，在MilliQ水中洗涤1次，及在ELISA底物缓冲液中洗涤1次而观测。在室温生色10分钟，通过加入3M NaOH(50μl/孔)终止反应。在405nm的吸光度使用Organon Teknika microelisa平板读出器(Turnhout，Belgium)确定。

为量化人IgG，在此分析中包括一个标准曲线。小鼠血清用系列稀释的纯化的IgG1κ(6μg/ml-6ng/ml；Serotec Ltd，Oxford，England)代替。

实施例5：与K121温育导致携带抗原的细胞死亡

将HMy2和K562细胞与K121温育表明mAb以时间和浓度依赖性方式诱导特异的靶细胞死亡(图1)。K121的胞毒性在加入靶细胞培养物后大约12小时第一次检测到，细胞死亡水平在随后的8小时增加。K121的胞毒性作用在终浓度为3.6μM时最大，在2.5μM检测到明显的胞毒性。在没有加入的补充效应细胞或血清成分(即补体)的情况下存在观测到的K121的胞毒性活性。

在有或无K121情况下温育的HMy2细胞在倒置光学显微镜下在200×放大倍率观测。同时研究与scFv-mel免疫毒素(Dunn，RD.等，(1996)Immunotechnology 2：229)温育的HMy2细胞。与K121 Mab温育的细胞示出细胞收缩及膜“水泡样”迹象。对比之下，scFv-mel导致细胞成块及膜溶解。

K121处理的HMy2细胞的流式细胞计量术示出与未处理的细胞相比90°光散射性质提高(图2)，反映了抗体处理的细胞中内在粒度和染色质浓缩增加。抗体处理的细胞的前向光散射性质也降低，表示细胞收缩。由K121处理的细胞粒度增加、染色质浓缩及细胞收缩的组合提示这些细胞由于诱导编程性细胞死亡的结果而死亡。

实施例6：K121与靶细胞相互作用诱导编程性细胞死亡

使用两种独立的分析系统以确定K121杀死携带抗原的细胞的机制。早期编程性细胞死亡通过膜联蛋白V与K121处理的细胞的结合而评估。用膜联蛋白V-FITC进行免疫荧光染色表明与非抗体处理的细胞相比，在开始用K121处理后16和20小时阳性染色的HMy2细胞数增加(图3a)。通过用碘化丙锭染色(图3a)及LDH渗漏(图3b)确定，膜联蛋白V染色的细胞百分率增加与死亡细胞的比例增加相关。

使用TUNEL方法评定DNA的片段化，这是编程性细胞死亡的晚期阶段。当与未处理的细胞相比时，在与K121温育的HMy2细胞中观测到的荧光变化在温育16和20小时后明显(图4a)，而且是与编程性细胞死亡相关的典型DNA片段化模式。同样地，通过LDH的渗漏确定编程性细胞死亡的测定与死亡细胞数增加相关(图4b)。当将这些数据组合在一起时，示出K121处理的细胞正在经历编程性细胞死亡。

实施例7：K121阻止小鼠中HMy2肿瘤细胞生长

为在第0天接受10⁷个HMy2细胞的SCID小鼠在第1，2和3天连续施用3剂K121(1.25mg/剂)(n＝6)或scFv-mel(0.5mg/剂)(n＝7)，或者施用PBS(1.25mg/剂)(n＝6)作为治疗对照。在施用肿瘤细胞之前及在注射肿瘤细胞后每周一次间隔取血液样品，通过动物血清中人IgG的出现情况监测HMy2细胞的生长。在PBS处理的对照小鼠中，人IgG在6只动物血清中均检测到(图5a)，时间为在注射肿瘤细胞后3-8周的范围内首次检测到人IgG。相似地，用免疫毒素处理的小鼠示出在注射细胞后3周人IgG水平提高(图5b)。形成对照的是在K121处理的动物血清中在同样时间未检测到人IgG(图5c)。总的来说PBS和scFv-mel处理的动物呈现腹胀，变得昏睡及在9周后6只小鼠中有5只死亡。用K121处理的小鼠不呈现这种症状，所有小鼠在第9周均存活，此时从该组中取一小鼠与在对照组中存活的小鼠一起处死并尸检。K121处理的动物无明显器官异常。然而未处理的动物在腹腔内有大块肿瘤，脾大，及肺萎缩。将这两只动物的组织样品通过免疫细胞化学方法检测HMy2浸润情况。这些研究清楚表明单独的K121在免疫缺陷的(SCID)小鼠模型中能阻止人体类淋巴母细胞肿瘤细胞生长。

在第二个例子中，将SCID小鼠在第0天注射10⁷ HMy2细胞，如下在第1，2和3天接受各种剂量水平的K121：

1组：PBS对照(n＝6)

2组：1.0mg K121/剂，总抗体剂量为3.0mg(n＝6)。

3组：0.5mg K121/剂，总抗体剂量1.5mg(n＝6)。

4组：0.1mg K121/剂，总抗体剂量0.3mg(n＝6)。

5组：0.05mg K121/剂，总抗体剂量0.15mg(n＝6)。

通过量化小鼠血清中人IgG监测肿瘤进展。

所有未处理的小鼠示出在第28天人IgG水平提高(图6)，该组小鼠在第42天大部分(4/5)死亡(图7)。尸检表明脾大及肉眼可见肝脏和肾脏肿瘤。用K121处理携带肿瘤的小鼠示出肿瘤进展延迟发作或者完全没有肿瘤生长，这由血清中人IgG水平示出(图6和8)，在第56天结束试验进行尸检。在4个处理组中，24只小鼠有7只在第42天示出其血清中不可检测到人IgG水平(图8)。这些小鼠中有6只在第56天尸检示出无明显肿瘤生长迹象。所有未处理的小鼠在第49天死亡或者出于伦理原因而安乐死，而抗体处理组的小鼠有13/24在第56天仍存活(图7)。

概括而言，携带肿瘤的小鼠以剂量依赖性方式对K121处理有反应。在第42天在30％的小鼠中完全没有肿瘤生长，这种作用在接受总剂量为1.5mg K121的小鼠中最明显(图8)。在未处理的小鼠中肿瘤进展迅速及具有浸润性，在第49天死亡率为100％(图7)。在此时，组合处理组示出死亡率低于10％。

实施例8：使用PCR通过寡核苷酸装配合成类K121抗体

通过使用PCR延伸合成寡核苷酸而产生单克隆抗体的策略的一个实例已经在文献中加以描述(Sato等(1994)Molecular Immunology 31(5)：371)。为从公布的DNA序列(如图9a所示)中产生类K121单克隆抗体，VH基因可分为6个重叠寡核苷酸VH1-VH6(图9b)。同样，K121 VL基因可分为6个重叠寡核苷酸VL1-VL6(图9c)。VH寡核苷酸有三个具有有义DNA序列(图9d，VH1，3和5)，三个具有反义DNA序列(图9d，VH2，4和6)。相似地，VL寡核苷酸有三个具有有义DNA序列(图9e，VL1，3和5)，三个具有反义DNA序列(图9e，VL2，4和6)。

使用Taq聚合酶的第一个PCR装配三套寡核苷酸以生产三种双链DNA片段(图9f)。然后将第一次扩增的三个产物通过凝胶提取，分离的DNA片段用作模板使用Taq聚合酶装配完整基因序列。在VH基因的最后装配中，使用与所述基因的5’区域(VHF)互补的PCR引物及与所述基因3’区域(VHR)互补的反义引物，产生完整的K121 VH基因序列。相似地，用VL基因的5’(VLF)和3’(VLR)区域的PCR引物扩增完整的K121 VL基因。最后的基因产物应加以测序以证实全部V基因的存在及保真性。

合成的K121 VH和VL基因然后应连接入一种哺乳动物表达载体中，所述载体含有相关的小鼠Ig恒定区基因，重链为Cγ1，轻链为Cκ。然后将哺乳动物细胞系用所得载体转染，通过如针对嵌合抗体所述免疫分析监测功能性K121的表达。

实施例9：构建嵌合抗体cK121

分离K121 VH和VL基因

单克隆抗体K121的重链可变区基因(K121 VH)和轻链可变区基因(K121 VL)通过PCR分离。扩增VH和VL基因的模板是scFv-mel基因构建体。设计用于扩增的PCR引物(图10)以将用于定向克隆的合适限制位点导入哺乳动物表达载体pCMV-γ1和pCMV-KR(Mahler等，(1997)Immunotechnology 3：31)。

PCR扩增产物通过在1％琼脂糖凝胶上电泳而分离，期望大小的DNA条带使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)提取。然后将分离的基因片段连接入pGEM-T载体中并转化进感受态细菌细胞JM109(Promega，美国)中。在过夜温育后，使用载体特异性引物(M13)进行PCR筛选以筛选含有插入体的菌落。选择VH和VL的阳性克隆，使用Wizard Mini-prep试剂盒(Promega，美国)制备质粒DNA。将代表VH和VL的两个克隆由Sydney University PrinceAlfred Macromolecular Analysis Centre(SUPAMAC)在ABI自动DNA测序仪上测序。K121 VH和VL的DNA序列与图9a所示那些相同，额外的限制酶位点及核苷酸插入PCR引物(图10)中。

将K121 VH和VL连接入表达载体中

K121 VH和VL的基因使用限制酶Bam HI和Apa LI从pGEM-T克隆中切割下来。切割下来的VH和VL插入体通过凝胶提取而纯化。重链和轻链的前导序列通过用Apa LI和Hind III限制pCMV-γ1，随后通过凝胶提取前导序列插入体而分离。将Hind III和Apa LI消化的前导序列与K121 VH和VL基因同时连接入Hind III和BamHI限制的pCMV-γ1和pCMV-KR中。在转化入感受态JM109细胞中之后，含有插入体的菌落使用VH和VL基因特异性引物通过PCR筛选。从阳性克隆中制备质粒DNA，插入体通过用限制酶Bam HI和Hind III消化而证实。在此阶段，应对pCMV-γ1-cVH和pCMV-KR-cVL质粒使用载体特异性引物测序，以证实正确的K121 VH和VLDNA序列。

将表达质粒转染入CHO细胞中

将CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞在具有10％FBS(Sigma Aldrich，美国)的DMEM/F12培养基中生长，在37℃在5％CO₂气氛下温育。将共5μg的质粒制备物pCMV-γ1-cVH和pCMV-KR-cVL与4×10⁶个CHO细胞在补加10％FBS和2mM L-谷氨酰胺(Trace Biosciences，NSW)的200μl的RPMI培养基(Sigma Aldrich，美国)中温育。将细胞/DNA混合物置于试管中，在基因脉冲仪(BioRad，美国)上以如下设定进行电穿孔：电阻100欧姆，0.3伏，电容Ext 960μFD，时间常数33-38毫秒。之后将细胞移至具有10％FBS的10ml的DMEM/F12培养基中，在37℃在5％CO₂气氛下生长48小时。使用含有于DMEM/F12中400μg/ml的G418抗生素(GENETICIN，Sigma Aldrich，美国)的neo选择培养基选择转染的细胞。3天后，更换培养上清并将细胞扩充至150cm²的组织培养瓶中。7天后，通过两个单独的ELISA确定选择培养基中cK121的表达。

实施例10：确定表达的嵌合抗体cK121

如实施例4所述进行ELISA，特异性试剂有一些改变。简而言之，为确定含有人Fc区域的嵌合抗体的表达，通过用山羊抗人IgG、IgA和IgM(50μl/孔，10μg/ml)包被96孔平板进行ELISA。然后将转染的CHO细胞的条件培养基在所述孔中温育，随后与山羊抗人(Fc-特异性)-AP缀合物温育并用底物pNPP(Sigma Aldrich，美国)生色。第一个ELISA的标准曲线使用系列稀释的人IgG1κ(6μg/ml-6ng/ml)制备。并列地将转染的CHO细胞的澄清上清进行系列稀释并分析样品(图11a)。从表达cK121的CHO细胞获得与标准曲线相似的稀释曲线。CHO细胞条件培养基中cK121的浓度估计为6ng/μl。

进行第二个ELISA以证实表达的抗体与K121特异性识别的抗原结合。将第二个分析平板的孔用人游离κ轻链(50μl/孔，100μg/ml溶液)包被。在第二个ELISA中，澄清的CHO细胞上清示出在样品稀释范围内与人游离κ轻链结合(图11b)。对比之下，在未转染的CHO细胞条件培养基中未观测到结合。

实施例11：纯化cK121

通过硫酸铵沉淀CHO细胞条件培养基(1.4升)中的蛋白质而纯化cK121。在PBS-Az中深入透析重新溶解的蛋白质之后，将样品在蛋白质A琼脂糖(Sigma Aldrich，美国)上进行亲和纯化。洗脱的样品在PBS pH7.4中透析，在Amicon搅拌池(Millipore，USA)上浓缩并过滤灭菌(Minisart RC15，0.2μm，Sartorius，AG)。cK121的浓度使用消光系数为14在280nm的吸光度加以评估。

实施例12：cK121对HMy2和K562类淋巴母细胞的胞毒性

cK121对HMy2和K562类淋巴母细胞的胞毒性使用实施例1所述胞质LDH渗漏分析确定。纯化的cK121对抗原阳性HMy2细胞呈现明显胞毒性活性，与未携带抗原的细胞K562不反应(图12)。这些结果表明cK121保留诱导靶细胞系中细胞死亡的能力。为证实细胞死亡的机制是编程性细胞死亡，使用纯化的cK121对HMy2细胞进行实施例2所述分析。

实施例13：选择稳定分泌cK121的细胞

大规模生产cK121需要选择一种细胞系，其能在没有选择抗生素G418的情况下稳定分泌抗体。因此，从在两个ELISA中均产生阳性结果(A 405nm＞0.2)的孔中选择克隆，通过有限稀释克隆。随后，将来自能生产分泌的cK121的单一克隆的CHO细胞在没有抗生素的DMEM-F12中生长。选择在没有抗生素的情况下持续分泌cK121的细胞作为稳定的cK121生产细胞。cK121 CHO细胞系的条件培养基通过如实施例9所述免疫分析评估，产生的抗体量根据人IgG1κ标准曲线确定。图13示出5个阳性克隆(克隆1-5)，选择这5个阳性克隆进一步表达。一个阴性克隆作为对照样品。

为对实施例13中产生的cK121克隆进行进一步功能性研究，进行大规模的表达实验。可以纯化cK121并可以进行动物体内研究实验。

实施例14：使用Vκ人VL构架区人源化K121可变轻链区基因(VL)的策略

用于人源化K121 VL的PCR程序示意图示于图14a。预先鉴别人VL构架区(hVL)，使用先前所述的基于PCR的策略(Asvadi，博士论文，UTS，1998)从cDNA中分离。对来自含有hVL基因的一个单一克隆的质粒DNA进行测序，并与图14b中的K121 VL的DNA序列相对比。黑体字所示的DNA序列编码K121的互补决定区(CDR)。用于将K121的CDR1，CDR2和CDR3的DNA序列掺入hVL的构架区的寡核苷酸示于图14c。通过用限制酶Age1消化可将含有K121CDR2的构架区与hVL加以区分，该限制位点在PCR引物VLC中示出。

PCR扩增

如图14a所示，PCR扩增的模板为hVL基因，第一个PCR中的反应使用引物对VLA+VLE，VLB+VLF，VLC+VLG及VLD+VLH进行。使用TITANIUM Taq PCR试剂盒(Clontech，CA)扩增四个片段。每个反应的产物通过具有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳观测并通过凝胶提取(Promega，MA)分离。进行第二个PCR以装配扩增的片段。所得扩增产物为大约380bp。根据厂商推荐的方案(Promega，MA)经凝胶提取DNA条带并连接入载体pGEM-T中。将等份的连接混合物转化入JM109热感受态细胞中，将样品铺板于LB-amp平板上。在37℃温育过夜后，挑取单一菌落，根据方案在SOC培养基中生长过夜(Promega，MA)。质粒DNA使用Wizard Plus Miniprep DNA纯化系统分离。将10个克隆根据推荐的消化程序用限制酶Age1和Bam H1消化(Promega，MA)。消化产物在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上观测。对产生接近正确大小的DNA片段的单一克隆进行测序，以证实该插入体含有修饰的VL基因。人源化的K121 VL基因然后应连接入哺乳动物表达载体pCMV-KR中，如实施例9所述。

实施例15：使用人VH3构架基因人源化K121重链可变区基因(VH)

分离人重链可变区基因hVH，使用如实施例14所述PCR策略克隆。含有hVH基因的pGEM-T质粒用作模板，进行QuikChange定点诱变试剂盒程序(图15a)。用于将来自K121 VH的三个CDR掺入hVH构架的引物示于图15b。在诱变的每次循环之后，应对质粒进行测序以证实DNA序列是正确的。人源化的K121 VH基因然后应连接入哺乳动物表达载体pCMV-γ1中，如实施例9所述。

讨论

本文所述这些实验表明小鼠单克隆抗体K121在人类淋巴母细胞系HMy2中，在无任何附加的效应细胞或不加入血清补体蛋白的情况下，诱导细胞死亡。我们先前已经示出HMy2细胞表达一种抗原KMA，其由K121识别。当HMy2细胞只与浓度为3.6μM的K121温育时，通过胞内LDH的释放表示存在明显的细胞死亡(图1)。

K121的胞毒性活性的特异性由这样的事实表明，即KMA阴性细胞系K562的处理不产生明显的细胞死亡(图1)。

对在有或无K121的情况下温育的HMy2细胞进行显微镜观测表明在存在K121的情况下存在细胞死亡。在存在K121的情况下，细胞呈现收缩并有膜“水泡样”的迹象。这些作用是细胞经历称为编程性细胞死亡过程的特征(Kerr，JFR.等，(1972)Br J Cancer 26：239)。相反，HMy2细胞与免疫毒素scFv-mel温育导致细胞成块状及膜溶解。与K121温育的细胞外形很清楚地和与免疫毒素scFv-mel温育的那些细胞不同。这些初步观测提示使用K121导致细胞死亡的机制与scFv-mel的胞毒作用不同。

对经历K121诱导的细胞死亡的HMy2细胞进行光散射分析表明细胞的内部结构和大小与编程性细胞死亡一致(图2)。关于K121杀死靶细胞的机制的解释通过针对编程性细胞死亡的两个独立分析而证实，即分别测定该过程的早期和晚期阶段(图3及4)。因此，K121在没有任何外源因子的情况下，在体外诱导携带KMA的细胞编程性细胞死亡。另外，K121阻止肿瘤细胞在体内生长。将K121施用于已经给予诱导肿瘤剂量的HMy2细胞的小鼠可阻止肿瘤生长，这是通过受体小鼠的血清中存在人IgG而测定的(图5)。在PBS处理组的所有小鼠中均观测到肿瘤生长，这由血清人IgG水平及解剖时的明显形态学改变表明。

编程性细胞死亡是参与胚胎发育尤其免疫系统发育和功能的重要生物学事件(Mastrangelo AJ.and Betenbaugh M.(1998)TIBTECH.16：88)。与起因于坏死的细胞死亡相反，编程性细胞死亡在没有任何病理学的情况下发生，而且不引起炎症应答(Kerr，JFR.等，(1972)Br JCancer 26：239)。这是关于可触发靶细胞编程性细胞死亡的潜在治疗剂的应用的一项重要考虑。

上文提及的所有出版物在此均以其全文并入参考。

本说明书中包括的文献，操作，材料，设备，物品等的任何讨论，只是为理解本发明而提供。这并非是承认任何或所有这些构成现有技术基础或者是与本发明相关领域的常识。

本发明熟练技术人员意识到对本发明可以加以多种改变和/或修改，如在不偏离本发明精神或范围的前提下在特异的实施方案中示出。本发明的实施方案因此只是例证而无限制本发明之意。

序列表

<110>PacMab Pty Ltd

<120>治疗多发性骨髓瘤的方法

<130>500564

<150>AU PR 6179

<151>2001-07-06

<160>50

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ala Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

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Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ala Ser

115

<210>2

<211>357

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>2

caggtgcagc tgcagcagtc aggggcggag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa cactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccgctata atagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc taggggggtc 300

taccatgatt acgacgggga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt cgcctcc 357

<210>3

<211>107

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>4

<211>321

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>4

gacatcgtca tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

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gggaccaagc tggaaataaa g 321

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<212>DNA

<213>Mus musculus

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tcctgtac 68

<210>6

<211>66

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>6

caacaggaca tgtcgaagac cgaagttgta atttctgtgg atatacgtga cccacttcgt 60

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<210>7

<211>73

<212>DNA

<213>Mus musculus

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tgaagcagag gcctgaacag ggcctggagt ggattggaag gattgatcct gcgaatggta 60

aacactaaat atg 73

<210>8

<211>73

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>8

tgtgatttat actgggcttc aaggtcccgt tccggcgata ttatcgtctg tgtaggaggt 60

tgtgtcggat gga 73

<210>9

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<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>9

cacagcctac ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc 60

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<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>10

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<212>DNA

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<213>Mus musculus

<400>13

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<212>DNA

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<400>14

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<213>Mus musculus

<400>15

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aac 63

<210>16

<211>56

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>16

cgttatattg gtcgataggc atgtgcaagc ctcccccctg gttcgacctt tatttc 56

<210>17

<211>66

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>17

ggcctctgct tcacccagtg catataggtg tctttaatgt tgaagccaga agctgtacag 60

gacaac 66

<210>18

<211>73

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>18

aggtaggctg tgttggagga tgtgtctgct attatagcgg ccttgccctg gaacttcggg 60

tcatatttag tgt 73

<210>19

<211>58

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>19

ggtgaccgtg gtcccttggc cccagtagtc cccgtcgtaa tcatggtaga ccccccta 58

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>20

caggtgcagc tgcagcag 18

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>21

ggtgaccgtg gtcccttgg 19

<210>22

<211>67

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>22

ggtttctgtt gataccaggc tacattagta cccacattct gactggcctt gcaggtgacg 60

ctgaccc 67

<210>23

<211>66

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>23

gatggtgaga gtgaaatctg tcccagatcc actgcctgtg aagcgatcag ggactccact 60

gtaccg 66

<210>24

<211>55

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>24

ctttatttcc agcttggtcc cccctccgaa cgtgtacgga tagctgttat attgc 55

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>25

gacatcgtca tgacccag 18

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>26

ctttatttcc agcttgg 17

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>27

ggggtgcact cccaggtgca gctgcagcag tca 33

<210>28

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>28

cgcggatcca ctcaccggag gcgacggtga ccgtgg 36

<210>29

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>29

ggggtgcact ccgacatcgt catgacccag tct 33

<210>30

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>30

cgcggatcca ctcacccttt ctttccagct tggtcc 36

<210>31

<211>321

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>31

gacatccaaa tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gggtattggt aattggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggacagccc ctaaactcct gatctctaag gcgtctagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180

aggatcagcg gcagtggatt tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaaccc tataatgatt atttcagttt cggtggaggg 300

accagggtgg agatgaaacg a 321

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>32

ggggtgcact ccgacatcca aatgacccag 30

<210>33

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>33

atcacttgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca g 51

<210>34

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>34

ctcctgatct actcgacatc ctaccggtac agtggggtcc ca 42

<210>35

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>35

acttattact gccagcaata taacagctat ccgtacacgt tcggtgga 48

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>36

gcaagtgatg gtgactctg 19

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>37

gtagatcagg agtttagg 18

<210>38

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>38

gcagtaataa gttgcaaa 18

<210>39

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>39

gccggatcca ctcacctttc atctccaccc t 31

<210>40

<211>357

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>40

caggtgcagc tgctggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcttgtgtag cgtctggatt caccttcagt atctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atgctatatg atggaagtct taaatattat 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactctat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggctgtgt attactgtgc gagaggccga 300

tctcgtctgc ttatcacgcc ctcttggggc cggggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210>41

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>41

caccttcagt gacacctata tgcactgggt caagcaggct ccagg 45

<210>42

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>42

cctggagcct gcttgaccca gtgcatatag gtgtgactga aggtg 45

<210>43

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>43

gtgggtggca aggattgatc ctgcgggaag tctt 34

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>44

aagacttccc gcaggatcaa tccttgccac ccac 34

<210>45

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>45

tgatcctgcg aatggtaacc actaaatatg gagact 36

<210>46

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>46

agtctccata tttagtggtt accattcgca ggatca 36

<210>47

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>47

actaaatatg acccgaagtt ccagggccga ttc 33

<210>48

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>48

gaatcggccc tggaacttcg ggtcatattt agt 33

<210>49

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>49

tgcgagaggg gtctaccatg attacgacgg ggactactgg ggccg 45

<210>50

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>50

cggccccagt agtccccgtc gtaatcatgg tagacccctc tcgca 45

Claims

1.一种治疗患者κ类型多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括为患者施用有效量的类K121抗体，其中所述类K121抗体不与毒素或胞毒剂缀合。

2.权利要求1的方法，其进一步包括在施用类K121抗体之前处理患者，以降低其体液中存在的游离κ轻链的水平。

3.权利要求2的方法，其中游离κ轻链的水平通过血浆去除法降低。

4.在患者体内进行自体造血细胞移植的方法，所述方法包括：

(i)从患者中取出造血祖细胞群，

(ii)用类K121抗体处理所述细胞群，

(iv)将(ii)步骤中的处理的细胞群移植入该患者中

其中类K121抗体不与毒素或胞毒剂缀合。

5.权利要求4的方法，其中所述方法进一步包括将类K121抗体经静脉内注入患者体内。

6.权利要求4或5的方法，其中对患者自体移植的方法在肿瘤细胞减灭术治疗期间或之后进行。

7.在混合细胞群中杀死κ类型骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括将混合细胞群与类K121抗体接触，其中所述类K121抗体不与毒素或胞毒剂缀合。

8.在携带KMA的细胞中诱导编程性细胞死亡的方法，所述方法包括将细胞暴露于类K121抗体，其中所述类K121抗体不与毒素或胞毒剂缀合。

9.权利要求8的方法，其中携带KMA的细胞是κ类型骨髓瘤细胞。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中类K121抗体是单克隆抗体。

11.权利要求1-9任一项的方法，其中所述类K121抗体包含K121抗体的CDR环(CDR1，CDR2和CDR3)，如图9a所示。

12.权利要求1-9任一项的方法，其中所述类K121抗体包含K121抗体的VH和VL基因，如图9a所示。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述类K121抗体是嵌合抗体或人源化抗体。