CN1652821A - 抗前列腺特异性膜抗原(psma)的人单克隆抗体 - Google Patents

抗前列腺特异性膜抗原(psma)的人单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与PSMA结合的分离的人单克隆抗体，并且涉及相关的抗体为基础的组合物和分子。通过V－D－J重组和同种型转换在能产生人单克隆抗体的多种同种型的非人转基因动物例如转基因小鼠中能产生所述人抗体。还公开了含有所述人抗体的药物组合物，非人转基因动物，和产生人抗体的杂交瘤，以及使用所述人抗体的治疗和诊断方法。

Description

抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人单克隆抗体
相关申请
本申请要求2002年1月28日申请的美国用途申请登记号No.10/059,989的优先权，它是2000年7月26日申请的PCT国际申请PCT/US00/20247的继续部分申请，后者要求了1999年7月29日申请的美国临时申请系列号No.60/146,285，1999年10月12日申请的美国临时申请系列号No.60/158,759和2000年3月9日申请的美国临时申请登记号No.60/188,087的优先权。这些专利申请的全部内容在此引作参考。
发明背景
前列腺癌是男性发病率和死亡率主要原因。对于前列腺癌的治疗包括手术，激素，放射疗法，和化学疗法。对于转移性前列腺疾病几乎没有有效治疗。因此，代表诊断和预后标记，以及治疗靶物的基因和/或基因产物的鉴定是关键的。前列腺特异性抗原(PSA)是一种在前列腺癌的临床诊断和分级中有用的这样的癌标记。但是，在4-10ng/ml范围内PSA不能区别良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者前列腺癌，因此，需要证实适当诊断的细胞学和/或组织学评定(Barren，R.J.等(1998)Prostate 36：181-188)。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是与转铁蛋白受体具有54％同源性的大约110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750个氨基酸。PSMA具有三个结构域，包括一个19个氨基酸的胞内结构域，一个24个氨基酸的跨膜结构域，和一个707个氨基酸的胞外结构域。PSMA蛋白质显示神经羧肽酶和叶酸水解酶活性，据报道参与前列腺生长和分化的神经内分泌调节(Heston，W.D.(1996)Urologe-Ausgabe A.35：400-407)。PSM′是位于细胞质中的PSMA的另一种剪接形式。
PSMA主要由前列腺上皮细胞表达。在前列腺癌中，特别是在分化不好的，转移的，和激素难以治疗的癌中PSMA的表达增加(Gregorakis，A.K.等(1998)Seminars in Urologic Oncology 16：2-12；Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。前列腺外的组织例如小肠，唾液腺，十二指肠粘膜，近端肾小管，和脑中发现低水平PSMA表达(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。在一些恶性肿瘤，包括肾细胞癌和结肠癌的肿瘤外周和肿瘤内区域中的毛细血管的内皮细胞中也表达PSMA，但是在正常组织血管中不表达。另外，据报道PSMA与肿瘤血管生成相关(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。
因此，PSMA代表用于前列腺癌和特征在于PSMA表达的各种各样的其他疾病的治疗的有价值靶物。
发明概述
本发明提供与人前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合的分离的人单克隆抗体，以及免疫偶联物，双特性分子，和单独地或者与另外的治疗物质组合的含有这样的抗体的其他治疗组合物。特别地，在人效应细胞，例如，多形核细胞，单核细胞，巨噬细胞，和树状细胞的存在下，本发明的人抗体与人PSMA上的天然蛋白质表位(例如，位于人PSMA的胞外结构域中的表位)结合，并且抑制表达PSMA的细胞生长和/或介导处死这样的细胞(例如，通过溶胞作用或吞噬作用)。因此，在与PSMA表达相关的疾病，特别是PSMA-表达肿瘤和癌，例如前列腺癌，结肠癌，和肾癌的诊断，治疗，和/或预防的各种方法中能够使用这些抗体。
本发明的分离的人抗体包括各种抗体同种型，例如IgG1，(例如，IgG1k)，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD，和IgE。所述抗体可以是全长抗体(例如，IgG1或IgG3)或者可以只包括抗原-结合部分(例如，Fab，F(ab′)2，Fv，或者单链Fv片段)。
本发明的特定治疗抗体包括人单克隆抗体(HuMAb)4A3，7F12，8A11，8C12，16F9，和功能等价抗体，其例如，(a)由其可变区内分别包含SEQ ID NOs：1，3，5，7或9和SEQ ID NOs：2，4，6，8，或10中列出的核苷酸序列的人重链和人轻链核酸及其保守性修饰物编码，和/或(b)包括分别包含SEQ ID NOs：11，12，13，14，或15，和SEQ ID NOs：16，17，18，19，或20列出的氨基酸序列的重链和轻链可变区及其保守性修饰物。
本发明的其他特殊人抗体包括包含具有人重链和轻链CDR1区，人重链和轻链CDR2区，和人重链和轻链CDR3区的CDR结构域的那些，
其中
(a)人重链区的CDR1，CDR2，和CDR3包含选自图19所示CDR1，CDR2，和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NOs：21-35)，及其保守性序列修饰物的氨基酸序列，和
(b)人轻链区的CDR1，CDR2，和CDR3包含选自图22和23所示CDR1，CDR2，和CDR3区的氨基酸序列(SEQ ID NOs：36-50)，及其保守性序列修饰物的氨基酸序列。
本发明的其他特殊抗体包括与抗体4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9确定的表位结合，和/或与抗体4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9竞争与PSMA的结合，或者具有抗体4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9表现出的其他功能性结合特征的人单克隆抗体。这样的抗体包括，例如，以10-7M或更低，例如10-8M或更低，10-9M或更低，10-10M或更低，或者甚至更低(例如，10-11M或更低)的离解常数(KD)与PSMA结合的那些。这样的抗体还包括与鼠抗-PSMA抗体3C6(ATCC保藏号HB 12491)交叉反应，但是不表现出与鼠抗-PSMA抗体4D4(ATCC保藏号HB 12493)或1G9(ATCC保藏号HB 12495)交叉反应的那些。
在本发明的另一个方面中，人抗-PSMA抗体被衍生化，与另一种功能分子例如另一种肽或蛋白质(例如，Fab′片段)连接或共同表达。例如，本发明的抗体或抗原-结合部分可以与一个或多个其他分子实体，例如另一种抗体(例如，产生双特异性抗体或多特异性抗体)，细胞毒素，细胞配体或抗原功能性连接(例如，通过化学偶联，基因融合，非共价缔合或者其他)。因此，本发明包括各种各样的抗体偶联物，双特异性和多特异性分子，以及融合蛋白，它们都与表达PSMA的细胞结合并且使其他分子靶向细胞，或者其与PSMA和与其他分子或细胞结合。
在一个具体实施方案中，本发明包括双特异性或多特异性分子，其包括至少一种对于PSMA的结合特异性，其是人抗-PSMA抗体(或者其片段或模拟物)，和对于Fc受体，例如，人FcγRI或人Fcα受体，或者抗原呈递细胞(APC)上的另一种抗原的第二结合特异性。所述第二结合特异性也可以是抗体或者其片段(例如，Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，或单链Fv)，例如人抗体或者其片段，或者″嵌合″或″人源化″抗体或者其部分(例如，具有可变区，或者至少一个互补决定区(CDR)，从非人抗体衍生的(例如，鼠)带有人源保留部分)。
因此，本发明包括与人PSMA和与Fc受体，例如，人IgG受体，例如，Fc-γ受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)，和FcγRIII(CD16)两者结合的双特异性或多特异性分子。其他Fc受体，例如人IgA受体(例如FcαRI)，也可以被靶向。Fc受体优选位于效应细胞，例如，单核细胞，巨噬细胞或激活的多形核细胞的表面上。在优选的实施方案中，双特异性和多特异性分子在与受体的免疫球蛋白Fc(例如，IgG或IgA)结合位点不同的位点处的Fc受体结合。因此，双特异性和多特异性分子的结合不被免疫球蛋白生理水平所阻断。
在另一个实施方案中，本发明提供免疫偶联物，例如，免疫毒素，其包括与治疗剂例如细胞毒性药物，具有酶活性的毒素，或者其片段，放射性同位素，或者小分子抗癌药物偶联的全人抗-PSMA抗体。
或者，本发明的人抗体能与这样的治疗剂和细胞毒性药物共同施用，但是不与它们连接。它们可以与这样的药物同时共同施用(例如，以单一的组合物或者分开施用)或者能在施用这样的药物之前或之后施用。这样的药物可以包括化疗药物，例如阿霉素(亚德里亚霉素)，顺铂博莱霉素硫酸盐，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，环磷酰胺羟基脲和它们的组合。本发明的人抗体还可以与放射疗法联合施用。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，例如，药物组合物和诊断组合物/试剂盒，含有药学可接受载体和至少一种人抗-PSMA抗体，或者其抗原-结合部分。在一个实施方案中，组合物含有人抗体或其抗原-结合部分的组合，优选地其各自结合不同的表位。例如，含有在效应细胞的存在下介导高效杀伤靶细胞的人单克隆抗体的药物组合物能与抑制表达PSMA的细胞生长的另一种人单克隆抗体联合。因此，这种联合提供特制提供最大治疗利益的多功能治疗法。组合物，例如，药物组合物，含有至少一种人抗-PSMA抗体，或其抗原-结合部分，和至少一种本发明的双特异性或多特异性分子的联合，也在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过使细胞接触(例如施用给受者)一种或几种本发明的人抗体和/或含有上述抗体的相关治疗组合物，衍生物等而抑制表达PSMA的细胞增殖和/或生长，和/或诱导表达PSMA的细胞杀伤的方法。在特定的实施方案中，所述方法包括在人效应细胞的存在下表达PSMA的细胞体外或体内接触一种本发明的人抗-PSMA抗体或者组合。所述方法可以在例如体外或来自体内的培养物(例如含有表达PSMA的细胞和效应细胞的培养物)中应用。例如，可以体外培养含有表达PSMA的细胞和效应细胞的样品，并且和本发明的抗体组合。或者，例如，可以作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分对受试者施用本发明的方法。
对于在PSMA介导的疾病的体内治疗和预防中的应用，使用本领域公知的施用以抗体为基础的临床产物的任何常规的合适的途径以治疗有效剂量(例如，抑制，减轻或防止表达PSMA的细胞生长)对患者(例如人受试者)施用，例如通过注射或灌注。
因此，通过对患有特征在于PSMA表达的各种疾病的患者施用合适剂量(或连续剂量)的本发明的抗体，可以使用本发明的人抗体来治疗和/或预防各种这样的疾病。利用本发明的方法和组合物能治疗(例如改善)或预防的举例的疾病包括但不限于癌症，例如前列腺癌，结肠癌，和肾癌。
在本发明的特定实施方案中，患者可以另外接受化学治疗剂，放疗，或调节例如增强Fc受体，例如，Fcγ受体或Fcα受体，例如细胞因子的表达或活性的药物治疗。治疗期间施用的典型的细胞因子包括粒细胞集落-刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)，干扰素-γ(IFN-γ)，和肿瘤坏死因子(TNF)。典型的治疗剂包括抗肿瘤药物，例如阿霉素(亚德里亚霉素)，顺铂博莱霉素硫酸盐，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，和环磷酰胺羟基脲等。
在另一个实施方案中，本发明提供例如用于诊断PSMA-相关疾病的体外或体内检测PSMA或PSMA表达细胞存在的方法。这能通过例如使要测试的样品，任选地和对照样品一起，在允许形成抗体和PSMA之间的复合体的条件下，和本发明的人单克隆抗体(或者其抗原结合部分)接触。然后检测复合体的形成(例如，使用ELISA)。当使用对照样品和试验样品时，检测两个样品中的复合体，并且样品之间复合体形成中的任何统计学差异是试验样品中存在PSMA的指征。
另一方面，本发明提供转基因非人动物，例如转基因小鼠(这里也称作″HuMAb小鼠″)，它表达结合PSMA的全人单克隆抗体。在一个特定实施方案中，所述转基因非人动物是具有包括编码本发明的全部或部分抗-PSMA抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因小鼠。为了产生人抗-PSMA抗体，可以用PSMA抗原的纯化的或富集的制剂和/或表达PSMA的细胞免疫转基因非人动物。优选地，所述转基因非人动物，例如，转基因小鼠，通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生抗PSMA的人单克隆抗体的多种同种型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。同种型转换可以通过例如经典或非经典同种型转换而发生。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供来自如上所述的转基因非人动物例如转基因小鼠的分离的B-细胞，它表达人抗-PSMA抗体。然后通过与无限增殖化细胞融合提供人抗-PSMA抗体源(例如杂交瘤)而使得分离的B-细胞无限增殖化。这样的杂交瘤(即，产生人抗-PSMA抗体的)也包括在本发明的范围内。
根据这里举例说明的，能从表达抗体的杂交瘤直接获得人抗-PSMA抗体，或者能在宿主细胞，例如转染瘤(例如，由无限增殖化CHO细胞或淋巴细胞组成的转染瘤)中克隆和重组表达。因此，本发明提供用于制备与人PSMA结合的人单克隆抗体的方法。在一个特定实施方案中，该方法包括用人PSMA抗原和/或表达人PSMA的细胞的纯化或富集制剂免疫转基因非人动物，例如，先前所描述的转基因小鼠(例如，具有包括编码抗-PSMA抗体的全部或部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组)。然后获得动物的B细胞(例如，脾B细胞)并且与骨髓瘤细胞融合形成无限增殖化的杂交瘤细胞，它分泌抗PSMA的人单克隆抗体。
在另一方面，本发明提供编码人单克隆抗-PSMA抗体的全部或部分(例如，编码抗体的至少一个轻链或重链)的核酸，以及包括这样的核酸的重组表达载体，和用这样的载体转染的宿主细胞。本发明还包括通过培养这样的宿主细胞产生抗体的方法。本发明提供的具体核酸包括SEQID NOs：1，3，5，7，或9和SEQ ID NOs：2，4，6，8，或10中所示核苷酸序列，它们分别编码人抗-PSMA抗体(HuMAbs)4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的重链和轻链。
本发明的其他特征和优点从不应该视为限制的下面详细描述和实施例而显现。本申请引述的所有的参考文献，专利文献和公开的专利申请的内容特意在此引作参考。
附图简述
图1是说明HuMAb 11C10与全长PSMA和含有相应于氨基酸1-173，134-437，和438-750的PSMA片段的细菌表达的融合蛋白的反应性(固相ELISA)的柱形图。使用鼠7E11抗体作为对照物进行测试。
图2是说明人抗-PSMA单克隆抗体与来自人前列腺腺癌LNCaP和PC3细胞的膜级分的反应性(固相ELISA)的图。405nm的背景吸光度是0.05。
图3是说明分离的PSMA的热变性对抗体结合的影响的柱形图。纯化的PSMA，在热变性和没有热变性的情况下，包被到96-孔板上并且用指明的抗体处理。通过ELISA检测结合的抗体。
图4说明使用HuMAbs的PSMA从LNCaP细胞洗涤剂溶胞产物的免疫沉淀。通过SDS凝胶电泳分离免疫沉淀出的蛋白质，印迹到PVDF膜上，并且用鼠抗-PSMA 4D8抗体探测(2-7道)。1道说明总的LNCaP细胞溶胞产物。2-7道说明分别用下面的抗体的免疫沉淀：无关的人IgGI，4A3，7F12，8A11，8C12和16F9。箭头指示PSMA和PSM′的位置。
图5说明测定使用LNCaP细胞靶物和来自两位捐献者的PBMC′s(A道和B道)，各自E∶T之比是100∶1的HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)反应的图。
图6说明全人双特异性分子，14A8×8C12，其结合CD89(FcaR)并且结合PSMA。该分子含有抗-CD89Fab′抗体片段(从人单克隆抗-CD89抗体衍生，14A8)，该片段通过二硫键与抗-PSMA Fab′抗体片段(从人单克隆抗-PSMA抗体衍生，8C12)化学连接。
图7，A图是说明通过图6所示14A8×8C12双特异性分子的PSMA-表达细胞的单核细胞-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作为双特异性分子浓度的函数的图。测定的结果是使用没有加入抑制剂，50微克/毫升游离抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和50微克/毫升游离抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特异细胞溶胞作用的百分比；B图是说明在效应物与靶物之比是100∶1的情况下通过双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12的LNCaP细胞的单核细胞-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的图；C图是说明没有抑制剂存在下，或者在存在过量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2，并且效应物与靶物之比是100∶1的情况下，通过14A8×8C12双特异性分子的LNCaP细胞的单核细胞-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的图。
图8，A图是说明通过图6所示14A8×8C12双特异性分子的PSMA-表达细胞的嗜中性白细胞-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作为双特异性分子浓度的函数的图。测定的结果是使用没有加入抑制剂，25微克/毫升游离抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和25微克/毫升游离抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特异细胞溶胞作用的百分比；B图是说明没有抑制剂存在下，或者在存在过量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2，并且效应物与靶物之比是200∶1的情况下，通过14A8×8C12双特异性分子的LNCaP细胞的嗜中性白细胞-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的图。
图9，A图是说明通过图6所示14A8×8C12双特异性分子的PSMA-表达细胞的全血-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作为双特异性分子浓度的函数的图。测定的结果是使用没有加入抑制剂，25微克/毫升游离抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和25微克/毫升游离抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特异细胞溶胞作用的百分比；B图是说明没有抑制剂存在下，或者在存在过量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2下，通过14A8×8C12双特异性分子的LNCaP细胞的全血-介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的图。
图10是说明单核细胞产生的巨噬细胞(MDM)对PSMA表达(LNCaP)细胞的双特异性分子(14A8×8C12)-介导的吞噬作用的图(圆)。测定的结果是存在或不存在过量的作为抑制剂的14A8抗体(方块)和作为对照物的H22抗体(菱形)下吞噬作用的百分比。
图11是说明单核细胞产生的巨噬细胞(MDM)对LNCaP肿瘤细胞的双特异性分子(14A8×8C12)-介导的吞噬作用和抗体(8C12)-介导的吞噬作用的图。
图12是说明单核细胞产生的巨噬细胞(MDM)对LNCaP肿瘤细胞的双特异性分子(14A8×8C12)-介导的吞噬作用的图(圆)。插图是说明在过量14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2存在下14A8×8C12双特异性分子(1微克/毫升)介导的吞噬作用的图。
图13是说明带有LNCaP细胞肿瘤的裸鼠中125I-4A3的生物学分布。通过尾静脉对动物注射100微克的125I-4A3，并且在注射之后0.25和24小时处死小鼠。测定各种组织中存在的放射性的量。数据说明每个时间点双份动物的结果。
图14是说明培养物中LNCaP细胞对125I-标记的HuMAb的内化和处理的图。用碘化抗体标记LNCaP细胞，充分洗涤，并且在指定的时间点测定内化并且转化为TCA可溶产物的细胞表面结合的标记物的量。对于碘化后保留抗原结合性质的三种HuMAbs，以及无关的人IgG，作为阴性对照，给出结果。
图15是说明用125I碘化对一些抗-PSMA HuMAbs的抗原结合能力的影响的图，结果表明与固定化天然纯化LNCaP PSMA结合的125I-标记的HuMAb的量是抗体稀释系数的函数。
图16包括表示DOTA-标记对一些抗-PSMA HuMAbs的抗原结合能力的影响的图。结果表明ELISA测定的DOTA-标记HuMAb量，或者没有偶联的抗体，与PSMA结合，是抗体的量的效价的函数(以微克/毫升)表示。
图17A和B表示分别来自各种HuMAb 4A3，7F12，8C12，8A11，和16F9的VH-和VL-区的核苷酸序列。
图18是HuMAbs 4A3，7F 12，8A 11，8C 12，16F9的重链V区的核苷酸序列与种系核苷酸序列的相应链V区的比对。
图19是HuMAbs 4A3，7F 12，8A 11，8C 12，16F9的重链V区的氨基酸序列与种系氨基酸序列的相应链V区的比对。
图20是HuMAbs 4A3，7F 12，8C 12的轻(κ)链V区的核苷酸序列与种系核苷酸序列的相应链V区的比对。
图21是HuMAbs 8A11，16F9的轻(κ)链V区的核苷酸序列与种系核苷酸序列的相应链V区的比对。
图22是HuMAbs 4A3，7F12，8C12的轻(κ)链V区的氨基酸序列与种系氨基酸序列的相应链V区的比对。
图23是HuMAbs 8A11，16F9的轻(κ)链V区的氨基酸序列与种系氨基酸序列的相应链V区的比对。
本发明的详细描述
本发明提供用于治疗和诊断特征在于前列腺特异性膜抗原(本文称之为″PSMA″)表达的疾病的新的以抗体为基础的治疗法。本发明的治疗法使用与PSMA上存在的表位结合的分离的单克隆抗体和/或含有抗体的相关的组合物。在本文举例说明的具体的实施方案中，在经历V-D-J重组和同种型转换能产生抗PSMA人单克隆抗体的多个同种型(例如，IgG，IgA和/或IgE)的非人转基因动物，例如转基因小鼠中产生人抗体。因此，本发明的各方面不仅包括抗体，抗体片段，及其药物组合物，还包括非人转基因动物，B-细胞和产生单克隆抗体的杂交瘤。本发明还包括使用本发明的抗体体外或体内检测表达PSMA的细胞，或者抑制表达PSMA的细胞生长，分化和/或运动性的方法。
为了使本发明更容易理解，首先定义一些术语。贯穿详细描述的说明书提出其它的定义。
术语″前列腺特异性膜抗原″，″PSMA″和″PSMA抗原″在这里互换使用，并且包括人PSMA的变体，同种型和物种同源物。因此，本发明的人抗体在某些情况下可以与不是人的物种的PSMA或者与人PSMA结构相关的其他蛋白质(例如人PSMA同源物)交叉反应。在其它情况下，抗体对于人PSMA是完全特异性的并且不表现出物种或其它类型的交叉反应。
根据这里使用的，术语″抑制生长″(例如，指细胞)意在包括当与没有接触抗-PSMA抗体的相同的细胞相比较时接触抗-PSMA抗体的生长的任何可测量的降低，例如，细胞生长抑制至少大约10％，20％， 30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，99％，或100％。
这里提到的术语″抗体″包括整个抗体和任何抗原结合片段(即，″抗原结合部分″)或者其单链。″抗体″指包括由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或者其抗原结合部分。每一条重链由重链可变区(这里缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(这里缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布着更保守的区，称作构架区(FR)。每条VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，按照下面的顺序从氨基-末端向羧基-末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
这里使用的术语抗体的″抗原-结合部分″(或者简单地″抗体部分″)，指保持与抗原(例如，PSMA)特异性结合能力的抗体的一个或几个片段。已经证明抗体的抗原-结合功能能由全长抗体的片段实现。抗体的″抗原-结合部分″包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体的一条臂的VL和VH结构域构成的Fv片段，(v)由VH结构域构成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码，但是可以利用重组方法通过能使它们成为其中VL和VH区配对形成一价分子的单链蛋白质的合成接头将它们连接在一起(已知为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的″抗原-结合部分″中。利用本领域技术人员公知的常规技术获得这些抗体片段，并且对片段筛选和完整抗体一样的应用。
术语″表位″意思是能与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链构成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不与后者的结合在变性剂的存在下消失。
术语″天然构象表位″或″天然蛋白质表位″在这里互换使用，并且包括PSMA分子的线性序列的不同位置的氨基酸在三维空间中一起紧密接近时产生的PSMA分子的构象折叠产生的蛋白质表位。这样的构象表位分布在质膜细胞外侧上。
术语″双特异性分子″意在包括具有两个不同的结合特异性的任何物质，例如蛋白质，肽，后者蛋白质或肽复合体。例如，所述分子可以与下面的物质结合或相互作用：(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面上的Fc受体。术语″多特异性分子″或″杂特异性分子″意在包括具有两个以上不同的结合特异性的任何物质，例如蛋白质，肽，后者蛋白质或肽复合体。例如，所述分子可以与下面的物质结合或相互作用：(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面上的Fc受体，和(c)至少一种另一种成分。因此，本发明包括但不限于针对细胞表面抗原例如PSMA，和针对其他靶物，例如效应细胞上的Fc受体的双特异性，三特异性，四特异性，和其他多特异性分子。
术语″双特异性抗体″还包括双抗体。双抗体是其中在多肽单链上表达VL和VH结构域，但是使用太短不能在相同的链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一个链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点的二价双特异性抗体(参见例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。
术语″人抗体衍生物″指抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种物质或抗体的偶联物。
如这里使用的，如果抗体是例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者通过筛选人免疫球蛋白基因文库，从使用人免疫球蛋白序列的系统获得的，则人抗体是从特定种系序列“衍生的”。通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较，能鉴定从人种系免疫球蛋白序列“衍生的”人抗体就是这样。选择的人抗体氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种(例如，鼠种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列相比较时鉴定人抗体是人源的氨基酸残基。在一些情况下，人抗体氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％，或者甚至至少96％，97％，98％，或99％相同。典型地，从特定人种系序列衍生的人抗体显示与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列少于10个氨基酸的差异。在一些情况下，人抗体显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序不多于5个，或者甚至不多于4，3，2，或1个氨基酸差异。
根据这里使用的，术语″异抗体″指其中至少两个具有不同的特异性的两个或多个抗体，抗体结合片段(例如，Fab)，其衍生物，或者连接在一起的抗原结合区。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性，和靶细胞上例如肿瘤细胞上的抗原或表位的结合特异性。这里使用的术语″人抗体″意在包括具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点诱变或者体内躯体细胞突变诱导的突变)。但是，这里使用的术语″人抗体″没有意在包括其中从另一种哺乳动物物种衍生的CDR序列嫁接到人构架序列上的抗体。
这里使用的术语″单克隆抗体″或″单克隆抗体组合物″指单分子成分的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语″人单克隆抗体″指具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的显示单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，包括从具有包括与无限增殖化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞的杂交瘤产生人单克隆抗体。
这里使用的术语″重组人抗体″包括通过重组方法制备，表达，产生或分离的所有的人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因来说是转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或者从中制备的杂交瘤(下文第I章进一步描述)分离的抗体，(b)从经转化表达抗体的宿主细胞，例如，从转染瘤分离的抗体，(c)从重组的，组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制备，表达，产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区。但是，在一些实施方案中，让这样的重组人抗体体外诱变(或者，当在体内躯体诱变中使用对于人Ig序列是转基因的动物)，并且这样的重组体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，当从人种系VH和VL序列衍生并且相关的同时，可能在人抗体种系体内所有组成成分中天然并不存在。
根据这里使用的，″异源抗体″与产生这样的抗体的转基因非人生物相关被定义，该术语指具有相应于在不包括转基因非人动物的生物体中发现的，并且一般来自除了转基因非人动物的物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。
根据这里使用的″异杂合抗体″指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是一种异杂合抗体。异杂合抗体的例子包括上文讨论的嵌合和人源化抗体。
这里使用的″分离的抗体″意指基本上没有其他的具有不同的抗原特异性的抗体的抗体(例如，与PSMA特异性结合的分离的抗体基本上没有与除了PSMA之外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与人PSMA的一个表位，同种型或变体特异性结合的分离的抗体具有与其他相关抗原例如来自其他物种的相关抗原(例如，PSMA物种同源物)的交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合是在完全确定的成分中组合的。
根据这里使用的，″特异性结合″指与预定抗原的抗体结合。典型地，抗体以10-7M或更小的离解常数(KD)结合，并且以比其与除了预定抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)或者密切相关抗原结合的KD至少小两倍的KD与预定抗原结合。短语″识别抗原的抗体″和″对抗原特异性的抗体″在这里与术语″与抗原特异性结合的抗体″互换使用。
根据这里使用的，对于IgG抗体的″高亲和性″指具有10-8M或更小，更优选10-9M或更小并且甚至更优选10-10M或更小的KD的抗体。结合亲和性至少大约107M-1，优选至少大约109M-1，更优选至少大约1010M-1，1011M-1，1012M-1或更大，例如，大至1013M-1或更大。但是，″高亲和性″结合能根据其他抗体同种型而不同。例如，对于IgM同种型的″高亲和性″结合指具有10-7M或更小，更优选10-8M或更小的KD的抗体。
根据这里使用的，术语″Kassoc″或″Ka″，意指特定抗体-抗原相互作用的缔合速度，而这里使用的术语“Kdis”或″Kd″意指特定抗体-抗原相互作用的离解速度。根据这里使用的，术语″KD″意指离解常数，从Kd与Ka之比(即，Kd/Ka)获得，并且以摩尔浓度(M)表示。
根据这里使用的，″同种型″指重链恒定区基因编码的一类抗体(例如，IgM或IgG1)。
根据这里使用的，″同种型转换″指抗体的类型或同种型从一种Ig类变化为另一种Ig类的现象。
根据这里使用的，″非转换同种型″指当没有发生同种型转换时产生的重链的同种型类别；编码非转换同种型的CH基因一般是在功能重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换分类为经典的或非经典的同种型转换。通过转基因中涉及至少一个转换序列区的重组作用发生经典的同种型转换。通过例如人σμ和人∑μ(δ-缔合缺失)之间的同源重组，可以发生非经典的同种型转换。可以发生另一种非经典的转换机理，包括例如转基因间和/或染色体间重组作用，并且完成同种型转换。
这里使用的术语″转换序列″指负责转换重组作用的那些DNA序列。一个″转换供体″序列，典型地一个μ转换区，是转换重组作用期间要缺失的构建体区的5′(即，上游)。″转换受体″区是在要缺失的构建体区之间并且置换恒定区(例如，γ，ε等)。因为没有重组作用总是发生的特定位点，最后的基因序列一般从构建体不能预计。
根据这里使用的，″糖基化模式″定义为与蛋白质，更具体地，与免疫球蛋白共价连接的糖单元的模式。异源抗体的糖基化模式可以表征为与非人转基因动物物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式基本上相类似，此时本领域技术人员认识到异源抗体的糖基化模式比从中衍生转基因CH基因的物种相比与非人转基因动物物种的糖基化模式更相似。
这里使用的术语″天然存在的″当对一个对象使用时，指自然界能发现这个对象的事实。例如，能从自然界来源分离的生物体(包括病毒)中存在的并且没有经人在实验室故意改变的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
这里使用的术语″重排的″指重链或轻链免疫球蛋白位点的构型，其中V片段位于基本上分别编码完整VH或VL结构域的构型中紧邻D-J或J片段。重排的免疫球蛋白基因座可以通过与种系DNA相比较而鉴定；重排基因座将具有至少一个重组七聚体/九聚体同源元件。
这里关于V片段的术语″非重排″或″种系构型″指其中V片段不被重组使得与D或J片段紧邻的构型。
这里使用的术语″核酸分子″意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。
这里关于编码与PSMA结合的抗体或抗体部分(例如，VH，VL，CDR3)的核酸的术语″分离的核酸分子″意指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列没有编码结合除了PSMA之外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列的核酸分子，而其他序列可能天然在人基因组DNA核酸侧翼。在一个实施方案中，人抗-PSMA抗体，或者其部分，包括4A3，7F12，8A11，8C12，或6F9的核苷酸或氨基酸序列，以及分别具有SEQ ID NOs：1，3，5，7，或9和2，4，6，8，或10所示序列的重链(VH)和轻链(VL)可变区。
根据这里公开的和要求保护的，SEQ ID NOs：1-58中给出的序列包括″保守性序列修饰″，即，不显著影响或改变核苷酸序列编码的或包含氨基酸序列的抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。这样的保守性序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代，添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术向SEQ ID NOs：1-58引入修饰作用，例如定点诱变和PCR-介导的诱变。保守性氨基酸取代包括其中具有相似侧链的氨基酸侧链置换氨基酸残基的那些。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括下面的氨基酸：具有碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β-支化侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此人抗-PSMA抗体中预计非必须氨基酸残基优选被来自相同的侧链家族的另一种氨基酸残基置换。
或者，在另一个实施方案中，例如通过饱和诱变，沿着抗-PSMA抗体编码序列的全部或部分随机导入突变，对得到的修饰的抗-PSMA抗体筛选结合活性。
因此，这里公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列编码的和/或包含这里公开的(重链和轻链可变区)氨基酸序列(即，SEQ ID NOs：1-50)的抗体包括由保守性修饰的序列编码的或者包含保守性修饰的相似序列的基本上相似的抗体。下面提供有关怎样以这里公开的部分(即重链和轻链可变区)序列如SEQ ID NOs：1-50为基础产生这样的基本上相似的抗体。
对于核酸，术语″显著的同源性″指当最佳排列并且比较时，两个核酸，或者指定的序列，至少大约80％的核苷酸，通常至少大约90％至95％，更优选至少大约98％至99.5％的核苷酸是相同的，有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当片段在选择性杂交条件下与该链的补体杂交时存在显著的同源性。
两条序列之间的同一性百分比是序列所共有的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数×100)，考虑空位的数目，各空位的长度，两条序列的最佳比对需要引入这些。利用下面非限制性实施例中描述的数学算法实现两条序列之间的序列比较和同一性百分比的确定。
使用NWSgapdna.CMP矩阵和40，50，60，70，或80的空位权重和1，2，3，4，5，或6的长度权重，使用GCG软件包(在http：//www.gcg.com可获得)中的GAP程序测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。使用PAM120权重残余表，12的空位长度罚分和4的空位罚分，使用插入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))也能测定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和16，14，12，10，8，6，或4的空位权重和1，2，3，4，5，或6的长度权重，使用插入到GCG软件包(在http：//www.gcg.Com可获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法，测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本发明的核酸和蛋白质序列能进一步被用作″查询序列″对公众数据库进行检索，例如，鉴定相关的序列。利用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)能进行这样的检索。使用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12能进行BLAST核苷酸检索，获得与本发明的核酸分子的核苷酸序列同源性。使用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3能进行BLAST蛋白质检索，获得与本发明的蛋白质分子的氨基酸序列同源性。为了获得比较目的的有空位的比对，根据Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述能应用有空位的BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，能使用各程序(例如，XBI，AST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.。
核酸可以在全细胞中，细胞溶胞产物中，以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsC1带，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法，从其他细胞成分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质分离时，核酸是″分离的″或″使得基本上纯″。参见，F.Ausubel，等编著，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
本发明的核酸成分，虽然经常是在天然序列中(除了修饰的限制位点等)，可以从cDNA，基因组或混合物突变，根据标准技术提供基因序列。关于编码序列，这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。特别地，包括与这里描述的天然V，D，J，恒定区，转换和其他这样的序列基本上同源或者从这里描述的天然V，D，J，恒定区，转换和其他这样的序列衍生的DNA序列(其中″衍生的″指一个序列与另一个序列相同或者从另一个序列修饰)。
当与另一个氨基酸序列有功能关系时，核酸是″可操作连接的″。例如，如果它影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作连接。关于转录调节序列，可操作连接意思是连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在读框内。对于转换序列，可操作连接指序列能影响转换重组。
这里使用的术语″载体″意指能将另一种核酸转运给它所连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是″质粒″，指其中可以连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。一些载体能在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主细胞基因组复制。此外，一些载体能指导它们所可操作连接的基因的表达。这样的载体在这里称作″重组表达载体″(或者简单地，″表达载体″)。一般情况下，重组DNA技术中应用的表达载体经常是质粒形式。在本发明说明书中，″质粒″和″载体″可以互换使用，而质粒是载体最通常的使用形式。但是，本发明意在包括表达载体的其他这样的形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆病毒，腺病毒和腺-相关病毒)，它们有着等价功能。
这里使用的术语″重组宿主细胞″(或者简单地″宿主细胞″)，意指导入重组表达载体的细胞。应该明白这样的术语意在不仅指特定的受者细胞而且还指这样的细胞的后代。因为承继世代中由于突变或环境因素可能发生一些修饰，这样的后代事实上可能与亲代细胞不一样，但是仍然包括在这里使用的术语″宿主细胞″的范围内。重组宿主细胞包括，例如，CHO细胞和淋巴细胞。
这里使用的术语″受试者″包括任何人或非人动物。术语″非人动物″包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长目动物，绵羊，狗，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。
术语″转基因非人动物″指具有包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体的基因组(整合或没有整合到动物天然基因组DNA中)并且能表达全人抗体的非人动物。例如，转基因小鼠可以具有人轻链转基因和或者人重链转基因或人重链转染色体，这样当用PSM抗原和/或表达PSMA的细胞免疫时，小鼠产生人抗-PSMA抗体。人重链转基因能整合到小鼠染色体DNA中，这是对转基因例如HuMAb小鼠的情况，或者人重链转基因能保持在染色体之外，这是WO 02/43478所述的转染色体小鼠(例如，KM)的情况。这样的转基因和转染色体小鼠经历V-D-J重组和同种型转换，能产生多种同种型的抗PSMA人单克隆抗体(例如，IgG，IgA和/或IgE)。
在下面的部分进一步详细描述本发明的各个方面。
I.抗PSMA人抗体的制备
通过各种技术能制备本发明的人单克隆抗体(mAbs)，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然体细胞杂交技术是优选的，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌基因转化。
制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善确立的程序。免疫方法和用于融合的免疫脾细胞的分离是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
在优选的实施方案中，使用带有部分人免疫系统的转基因或转染色体小鼠而不是小鼠系统能产生直接抗PSMA的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括这里分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且这里通称作″转基因小鼠″。
HuMAb小鼠包含编码没有重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)和灭活内源μ和κ链基因座(loci)(Lonberg，等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出减少的小鼠IgM或κ的表达，并且对免疫有反应，导入的人重链和轻链转基因经历种类转换和体细胞突变，产生高亲和性人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等(1994)，上文；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMAb小鼠的制备详细描述于下面的II部分和Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)R Immunol.152：2912-2920；Lonberg等，(1994)Natute 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文在此引作参考。进一步参见，美国专利Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都属于Lonberg和Kay，和GenPharmInternational；Surani等的美国专利5,545,807；1998年6月11日公开的国际公开Nos.WO 98/24884；1994年11月10日公开的WO94/25585；1993年6月24日公开的WO 93/1227；1992年12月23日公开的WO 92/22645；1992年3月19日公开的WO 92/03918，所有这些文献的公开内容全部在此引作参考。或者，描述于实施例2的HCO12转基因小鼠能被用来产生人抗-PSMA抗体。
免疫法
为了产生抗PSMA全人单克隆抗体，根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和WO 98/24884所述，用纯化的或富集的PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞制剂免疫HuMAb小鼠。优选地，第一次输入时小鼠是6-16周龄。例如，可以使用纯化的或富集的PSMA抗原(例如，从PSMA-表达LNCaP细胞纯化)的制剂(5-20微克)腹膜内免疫HuMAb小鼠。在使用纯化的或富集的PSMA抗原制剂免疫不产生抗体的事件中，还可以用表达PSMA的细胞例如肿瘤细胞系免疫小鼠，来促进免疫应答。
用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原IP/SC免疫(最多共10次)时，HuMAb转基因小鼠典型地最好地应答。免疫过程中用眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，使用抗-PSMA人免疫球蛋白效价足够的小鼠进行融合。在处死之前3天用抗原对小鼠静脉内加强免疫并且取出脾。预期对于每一种抗原需要融合2-3次。每一种抗原免疫几只小鼠。例如，能免疫总共12只HCO7和HCO12品种的HuMAb小鼠。
制备分泌抗PSMA的人单克隆抗体的杂交瘤
为了制备分泌抗PSMA的人单克隆抗体的杂交瘤，从接受免疫的小鼠分离脾细胞和淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞融合。对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，使用50％PEG，来自接受免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液能与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。细胞以大约2×105在平底微量滴定板中平板培养，接着在含有20％克隆胎血清，18％″653″条件培养基，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml氢大霉素和1X HAT的选择性培养基(Sigma；融合之后24小时加入HAT)中温育两周。大约两周之后，在其中用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔筛选人抗-PSMA单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天之后观察培养基。对分泌抗体的杂交瘤再次平板培养，再次筛选，如果对于人IgG，抗-PSMA单克隆抗体仍然是阳性，则能通过限制性稀释至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
制备分泌抗PSMA的人单克隆抗体的转染瘤
利用，例如，本领域公知的重组DNA技术结合基因转染方法(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)，在宿主细胞转染瘤中也能产生本发明的人抗体。
例如，为了表达抗体，或者其抗体片段，能通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增，定点诱变)，能获得编码部分或全长轻链和重链的DNAs，并且插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列可操作连接。在上下文中，术语″可操作连接″意思是抗体基因连接到载体中使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因的转录和翻译的想要的功能。选择表达载体和表达控制序列与使用的表达宿主细胞匹配。抗体轻链基因和抗体重链基因能被插入到分开的载体中，或者，更典型地，两个基因通过标准方法插入到相同的表达载体中(例如，抗体基因片段上互补限制性位点和载体连接，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH片段与载体中的CH片段可操作连接，而VL，片段与载体中的CL片段可操作连接，这里描述的抗体的轻链和重链可变区能被用来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者，重组表达载体能编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因能被克隆到载体中使得信号读框内与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语″调节序列″意在包括启动子，增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如描述于Goeddel；Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。本领域技术人员认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以取决于象要转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白质的表达水平等这样的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)，猿病毒40(SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，例如遍在蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。
除了抗体链基因和调节序列，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节宿主细胞中载体的复制(例如，复制起点)和选择标记基因。可选择标记基因有利于将载体导入其中的宿主细胞的选择(参见，例如，美国专利Nos.4,399,216，4,634,665和5,179,017，都属于Axel等)。例如，典型地，可选择标记基因给其中导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418，潮霉素或甲氨喋呤。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(对于在dhfr-宿主细胞中使用，使用甲氨喋呤选择/扩增)和neo基因(对于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语″转染″意在包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是抗体在真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这样的原核细胞，特别是哺乳动物细胞中，比原核细胞更可能组装和分泌适当折叠和免疫活性抗体。据报道，抗体基因的原核表达对于高产率生产活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，和DHFR可选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)所述，，COS细胞和SP2细胞。特别地，与NSO骨髓瘤细胞使用，另一种优选的表达系统是WO 87/04462，WO89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，将宿主细胞培养足以使得抗体在宿主细胞中表达，更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，产生抗体。应用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
表达完整抗体的部分抗体序列的使用
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDRs)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因为这原因，CDRs中的氨基酸残基在各个抗体之间比在CDRs外的序列更变化多。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，通过构建包括来自嫁接到来自不同的抗体的具有不同的性质的构架序列的特异的天然存在的抗体的CDR序列的表达载体，有可能表达模拟特异的天然存在的抗体的性质的重组抗体(参见，例如，Riechmann，L.等，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321：522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033)。这样的构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列与成熟抗体基因序列不同，因为它们不包括完全装配的可变基因，所述可变基因是在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成的。种系基因序列与在各个平均跨可变区的高亲和性二抗所有组成成分的序列不同。例如，在构架区的氨基-末端部分体细胞突变相对不频繁。例如，在构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分体细胞突变相对不频繁。此外，很多体细胞突变不显著改变抗体的结合性质。因为这个原因，为了产生具有与原抗体相似的结合性质的完整重组抗体，不需要获得特定抗体的全DNA序列(参见1999年3月12日提出的PCT/US99/05535，这里为了全部的目的作为参考)。跨CDR区的部分重链和轻链序列一般对于该目的是足够的。使用部分序列测定对重组抗体可变基因有贡献的种系可变和连接基因片段。然后使用种系序列填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟期间裂解并且对最终抗体的性质没有贡献。为了这个原因，必须使用相应的表达载体的种系前导序列。为了添加缺失序列，通过连接或PCR扩增，克隆的cDNA序列能与合成的寡核苷酸组合。或者，可以将完整可变区合成为一套短的重叠的寡核苷酸，并且通过PCR扩增组合，产生完整合成可变区克隆。这个方法具有一些优点，例如消除或或包含特定限制位点，或者优化特定密码子。
使用来自杂交瘤的重链和轻链转录本的核苷酸序列来设计合成的寡核苷酸的重叠部分，产生具有和天然序列一样的相同氨基酸编码能力的合成的V序列。合成的重链和κ链序列和天然序列的不同在三个方面：插入重复核苷酸碱基链以有利于寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak′s规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)插入最佳翻译起始点；通过基因工程使HindIII位点位于翻译起始点的上游。
对于重链和轻链可变区两者，优化编码，和相应的非编码链序列在相应的非编码寡核苷酸的中间点裂解成大约30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可以组装成跨150-400个核苷酸片段的重叠双链部分。然后使用这些库作为模板制备150-400个核苷酸的PCR扩增产物。典型地，单一可变区寡核苷酸部分裂解成两个部分，分别被扩增产生两个重叠PCV产物。这些重叠产物然后通过PCR扩增组合生成整个可变区。还期望PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点，或γ重链的AgeI位点)，产生能容易被克隆到表达载体构建体中的片段。
再次构建的重链和轻链可变区然后与克隆的启动子，翻译起始点，恒定区，3′非翻译区，聚腺苷酸化和转录终点序列组合，产生表达载体构建体。重链和轻链表达构建体能组合成单一载体，共同转染，系列转染，或者分别转染到宿主细胞中。细胞然后融合形成表达两种链的宿主细胞。
用于人IgGκ的表达载体的构建中使用的质粒在下文中描述。构建质粒，使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可以被用来重新构建完整重链和轻链小基因。这些质粒可以被用来完整表达人或嵌合IgG1κ or IgG4κ抗体。为了表达其他重链异种型，或者为了表达包括λ轻链的抗体，可以构建类似的质粒。
因此，本发明的另一方面，利用本发明人抗-PSMA抗体的结构特征，4A3，7F12，8A11，8C12或16F9，产生结构上相关的至少保留本发明的抗体的一种功能性质例如与PSMA结合的人抗-PSMA抗体。更具体地说，4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的一个或几个CDR区能与已知的人构架区和CDR重组组合，产生本发明的另外的重组基因工程的人抗-PSMA抗体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供制备抗-PSMA抗体的方法，包括：
制备包括(1)和(2)的抗体：(1)人重链构架区和人重链CDRs，其中人重链CDRs中至少一个包括选自图19所示CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs：21-35)；和(2)人轻链构架区和人轻链CDRs，其中人轻链CDRs中至少一个包括选自图22和23所示CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs：36-50)；
其中抗体保持与PSMA结合的能力。
应用标准结合分析例如实施例中提出的那些，能测定抗体结合PSMA的能力(例如，ELISA)。
因为本领域公知，重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和性中起着特别重要的作用，如上所述制备的重组抗体优选包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重链和轻链CDR3s。抗体进一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的CDR2s。抗体进一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的CDR1s。因此，本发明进一步提供了抗-PSMA抗体，包括：(1)人重链构架区，人重链CDR1区，人重链CDR2区，和人重链CDR3区，其中人重链CDR3区选自图19所示4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的CDR3s(SEQ ID NOs：23，26，29，32，或35)；和(2)人轻链构架区，人轻链CDR1区，人轻链CDR2区，和人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区选自图22和23所示4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的CDR3s(SEQ ID NOs：38，41，44，47，或50)，其中抗体结合PSMA。抗体可以进一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体可以进一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重链CDR1和/或轻链CDR1。
优选地，上述工程抗体的CDR1，2，和/或3包括这里公开的和4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的那些一样的精确的氨基酸序列。但是，普通技术人员明白与4A3，7F 12，8A11，8C 12和16F9的精确CDR序列的某些偏差是可能的，但是仍然保留抗体选择性结合PSMA的能力(例如，保守性取代)。因此，在一个实施方案中，工程抗体可以由例如与4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的一个或几个CDRs90％，95％，98％或99.5％相同的一个或几个CDRs构成。
除了简单结合PSMA外，例如上面所描述的工程抗体可以对本发明的抗体的其他功能性质的保留进行选择，例如：
1)与表达人PSMA的活细胞结合；
2)与人PSMA结合的KD是10-8M或更小(例如，10-9M或10-10M或更小)；
3)与PSMA上的独特表位结合(消除当组合使用时具有互补活性的单克隆抗体与和相同的表位的结合相竞争的可能性)；
4)表达PSMA的肿瘤细胞的体内生长抑制；和/或
5)在人效应细胞的存在下表达PSMA的细胞的吞噬作用和/或杀伤作用(例如，在ADCC分析中)。
人单克隆抗体与PSMA结合的表征
通过，例如，标准ELISA，可以对本发明的人单克隆抗体测定与PSMA的结合，简要地说，以PBS中0.25微克/毫升的纯化的PSMA包被微量滴定板，然后用PBS中5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔加入来自PSMA-免疫小鼠的血浆的稀释液并且在37℃下温育1-2小时。培养板用PBS/Tween洗涤之后和与碱性磷酸酶的山羊-抗-人IgG Fc-特异性多克隆试剂在37℃下温育1小时。清洗之后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显影，并且在OD405-650下分析。优选地，显示高效价的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与PSMA免疫原有阳性反应性的杂交瘤。以高亲合力结合PSMA的杂交瘤被亚克隆并且进一步表征。从每一个杂交瘤筛选保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，在-140℃下保存，并且用于抗体纯化。
为了纯化人抗-PSMA抗体，在用于单克隆抗体纯化的两升旋转烧瓶中培养选择的杂交瘤。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白质A-琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43消光系数通过OD280测定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。
为了测定筛选的人抗-PSMA单克隆抗体是否与独特表位结合，使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将各种抗体生物素化。如上所述，使用PSMA包被-ELISA板能进行使用没有标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。使用链球菌-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针能检测生物素化mAb结合。
为了测定纯化抗体的同种型，进行同种型ELISAs。4℃下微量滴定板的孔用10微克/毫升抗-人Ig包被过夜。用5％BSA封闭之后，室温下平板与10微克/毫升的单克隆抗体或纯化的同种型对照物反应2小时。孔然后与人IgG1或人IgM-特异性碱性磷酸酶-偶联的探针。如上所述使平板显影并且分析。
为了证明单克隆抗体与表达PSMA的活细胞结合，可以使用流式细胞计数器。简要地说，表达PSMA的细胞系(在标准生长条件下生长)在含有0.1％Tween 80和20％小鼠血清的PBS中与各种浓度的单克隆抗体混合，并且在37℃下温育1小时。清洗之后，在和一抗染色相同的条件下细胞与荧光素-标记的抗-人IgG抗体反应。利用光和侧面散射性质在单细胞上大开通道通过FACScan扫描仪分析样品。(除了或者代替)流式细胞器测定，可以应用使用荧光显微镜的另一种测定。如上所述可以将细胞精确染色并且通过荧光显微镜检查。该方法使眼睛观察各个细胞，但是根据抗原密度可以减小灵敏性。
通过Western印迹对抗-PSMA人IgGs进一步测定与PSMA抗原的反应性。简要地说，能制备来自表达PSMA的细胞的细胞提取物并且进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移给硝基纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，用要测试的单克隆抗体探测。使用抗-人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合并且用BCIP/NBT底物片剂显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。
人单克隆抗体对PSMA的吞噬细胞的和细胞杀伤的活性
除了与PSMA特异性结合，可以对人单克隆抗-PSMA抗体测定它们介导表达PSMA细胞的吞噬作用和杀伤的能力。体外测定单克隆抗体的活性在体内模型分析之前提供最初的筛选。简要地说，通过FicollHypaque密度离心，接着溶解污染红细胞，能纯化来自健康供者的多形核细胞(PMN)，或者其他效应细胞。洗涤过的PMNs能悬浮于补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI中，并且以效应细胞与肿瘤细胞的各种比例(效应细胞：肿瘤细胞)，与51Cr标记的表达PSMA的细胞混合。然后以各种浓度加入纯化的人抗-PSMA IgGs。无关的人IgG能被用作阴性对照。测试可以在37℃下进行0-120分钟。通过测定释放到培养物上清液中的51Cr对样品测定细胞溶解。还可以在相互组合中分析抗-PSMA单克隆抗体，测定细胞溶解是否富集多克隆抗体。
也可以在体内模型(例如，小鼠)中分析结合PSMA的人单克隆抗体，测定它们在介导表达PSMA是细胞例如肿瘤细胞的吞噬作用和杀伤。例如以下面的不是为了排它的标准为基础，可以选择这些抗体：
1)与表达人PSMA的活细胞结合；
2)结合PSMA的高亲和性；
3)与PSMA上的独特表位结合(消除当组合使用时具有互补活性的单克隆抗体与和相同的表位的结合相竞争的可能性)；
4)表达PSMA的细胞的调理作用；
5)在人效应细胞的存在下介导表达PSMA的细胞的生长抑制，吞噬作用和/或杀伤作用。
本发明的优选的人单克隆抗体符合这些条件的一项或几项，优选全部。在特定的实施方案中，在例如含有两种后几种抗-PSMA单克隆抗体或者其片段的药物组合物这样的组合中使用人单克隆抗体。例如，在一项治疗方案中能联合具有不同的但是互补的活性的人抗-PSMA单克隆抗体，实现期望的治疗或诊断效果。这方面的详细说明是与抑制表达PSMA的细胞生长的另一种人抗-PSMA单克隆抗体联合的含有在效应细胞的存在下介导高效靶细胞杀伤的抗-PSMA人单克隆抗体的组合物。
II. 产生人单克隆抗-PSMA抗体的转基因非人动物的产生
另一方面，本发明提供能表达与PSMA特异性结合的人单克隆抗体的转基因和转染色体非人动物，例如转基因或转染色体小鼠。在一个具体的实施方案中，本发明提供具有包括人重链转基因的基因组，使得当用PSMA和/或表达PSMA的细胞免疫时小鼠产生人抗-PSMA抗体的转基因或转染色体小鼠。人重链转基因能整合到小鼠的染色体DNA中，这是转基因例如小鼠的情况，这里详细描述并且举例说明。或者，人重链转基因能保持在染色体之外，这是WO 02/43478中描述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况。这样的转基因和转染色体动物经历V-D-J重组和同种型转换能产生抗PSMA人单克隆抗体的多个同种型(例如，IgG，IgA和/或IgE)。同种型转换可以通过常规的或非常规的同种型转换而发生。
使用异源抗体所有组成成分设计反应外来抗原刺激的转基因或转染色体非人动物，要求B-细胞发育途径始终在转基因动物功能中正确含有异源免疫球蛋白转基因。这包括，例如，异源重链转基因的同种型转换。因此，构建转基因使得产生同种型转换和一种或几种下面的作用：(1)高水平和细胞类型特异性表达，(2)功能基因重排，(3)等位基因排斥的激活和反应，(4)充分的主要所有组成成分的表达，(5)信号转导，(6)体细胞高变，(7)免疫应答中转基因抗体基因座的控制。
不需要全部符合上面的条件。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性破坏的那些实施方案中，转基因不需要激活等位基因排斥。此外，在其中转基因包括功能性重排重链和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，功能基因重排的第二条件不是必需的，至少对于已经重排的那个转基因。有关分子免疫学背景，参见，Fundamental Immunology，第二版(1989)，Paul William E.，编著，Raven Press，N.Y.，这里引作参考。
在一些实施方案中，用来产生本发明的人单克隆抗体的转基因或转染色体非人动物在转基因动物种系中包含重排的，没有重排的或者重排的和没有重排异源免疫球蛋白重链和轻链转基因组合。每一个重链转基因至少包括一个CH基因。另外，重链转基因可以含有功能同种型转换序列，它在转基因动物的B-细胞中能支持编码多个CH基因的异源转基因的同种型转换。这样的转换序列可以是来自作为转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然存在的那些，或者这样的转换序列可以从接受转基因构建体的物种(转基因动物)中天然存在的那些衍生。例如，如果它插入了与小鼠重链基因座中天然存在的那些类似的转换序列，则用来产生转基因小鼠的人转基因构建体可以产生较高频率的同种型转换作用，根据推测小鼠转换序列被优化和小鼠转换重组酶系统发挥功能，而人转换序列则不是如此。可以分离转换序列并且通过常规克隆方法克隆，或者可以从以与免疫球蛋白转换区序列相关的公开的序列信息为基础设计的重叠合成寡核苷酸从头合成(Mills等，Nucl.Acids Res.15：7305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1：631-642(1989)，这里引作参考)。对于上述各种转基因动物，在转基因动物的B-细胞的有效级分中发现功能重排的异源重链和轻链免疫球蛋白转基因(至少10％)。
用来产生本发明的转基因动物的转基因包括包括编码至少一个可变基因片段，一个多样性基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA的重链转基因。免疫球蛋白轻链转基因包括包括编码至少一个可变基因片段，一个多样性基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻链和重链片段的基因片段与转基因非人动物的异源之处在于它们从编码来自不是由转基因非人动物构成的物种的免疫球蛋白的DNA衍生，或者相应于这样的DNA。在本发明的一方面，构建转基因使得各个基因片段不重排，即，不重排使得编码功能免疫球蛋白轻链或重链。当暴露给PSMA抗原时，这样的不重排转基因支持V，D，和J基因片段的重组(功能重排)，并且优选支持在得到的转基因非人动物中重排的免疫球蛋白重链中D区基因片段的全部或部分的插入。
在另一个实施方案中，转基因包括没有重排的″小基因座″。这样的转基因一般包括C，D，和J片段的大部分以及V基因片段的亚片段。在这样的转基因构建体中，各种调节序列，例如启动子，增强子，经典转换区，RNA加工的剪接-供体和剪接-受体序列，重组信号等，包括从异源DNA衍生的相应的序列。这样的调节序列可以被插入到来自本发明中使用的非人动物相同的或相关的物种的转基因中。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在转基因中与啮齿动物免疫球蛋白增强子序列组合用于转基因小鼠。或者，合成的调节序列可以插入到转基因中，其中这样的合成的调节序列与已知在哺乳动物的基因组中天然存在的功能DNA序列不同源。根据一致原则设计合成的调节序列，例如，剪接-受体位点或启动子/增强子基序指定允许的序列的那些。例如，小基因座包括与天然存在的种系Ig基因座相比具有至少一个非基本DNA部分(例如，插入序列；内含子或其部分)的内部缺失的基因组免疫球蛋白基因座的一部分。
在本发明的优选的实施方案中，用来产生抗PSMA的人抗体的转基因或转染色体动物包含至少一个，典型地2-10，有时25-50或更多个WO 98/24884的实施例12中描述的转基因(例如，pHC1或pHC2)，WO98/24884的实施例12繁殖了包含WO 98/24884的实施例5，6，8，或14中描述的轻链转基因的一个拷贝的动物，后代繁殖了WO 98/24884的实施例中描述的JH缺失的动物，这些内容表达上引作参考。对于这三种方案的每一个，饲养动物至纯合性。这样的动物具有下面的遗传型：人重链没有重排的小基因座的一个拷贝(每个染色体单倍体)(WO98/24884的实施例12中描述的)，没有重排的人κ轻链构建体的一个拷贝(每个染色体单倍体)(WO 98/24884的实施例14中描述的)，和去除所有的功能JH片段的每一个内源小鼠重链基因座的缺失(WO98/24884的实施例10中描述的)。用对于缺失JH片段是纯合的小鼠饲养这样的动物(WO 98/24884的实施例10)，产生对于JH缺失是纯合的并且对于人重链和轻链构建体是半合子的后代。对得到的动物注射抗原并且用于生产抗这些抗原的人单克隆抗体。
从这样的动物分离的B细胞就人重链和轻链是单特异性的，因为它们只包含各个基因的一个拷贝。此外，它们就人或小鼠重链来说是单特异性的，因为两个内源小鼠重链基因拷贝由于如WO 98/24884的实施例9和12所述导入的JH区的缺失而没有功能。此外，B细胞的重要级分就人或小鼠轻链来说是单特异性的，因为重排的人κ轻链基因的单拷贝的表达等位基因和同种型排除B细胞的重要级分中内源小鼠κ和λ链基因的重排。
优选的转基因和转染色体非人动物，例如小鼠，表现出这样的免疫球蛋白生产，即有效的全部成分实质上理想地与天然小鼠的相似。这样，例如，在其中内源Ig基因被灭活的实施方案中，总的免疫球蛋白水范围是大约0.1至10mg/ml血清，优选0.5至5mg/ml，理想地至少大约1.0mg/ml。当将能实现IgM向IgG转换的转基因被导入转基因小鼠时，成年小鼠血清IgG与IgM之比优选是大约10∶1。IgG与IgM之比比未成熟小鼠的低得多。一般情况下，多于大约10％，优选40-80％的脾细胞和淋巴结B细胞仅表达人IgG蛋白质。
所有组成成分理想的是接近的，如天然小鼠所证明的，通常至少大约10％这样高，优选25-50％或更高。一般情况下，主要根据导入到小鼠基因组中的不同的V，J和D区的数目，产生至少大约一千不同的免疫球蛋白(理想地IgG)，优选104至106或更多。这些免疫球蛋白一般识别大约一半或更多的高抗原性蛋白质，例如，葡萄球菌蛋白质A。典型地，免疫球蛋白表现出对预先选择的至少大约107M-1，优选至少大约109M-1，更优选至少大约1010M-1，1011M-1，1012M-1，或更多，例如，至多，1013M-1或更多抗原的亲和性。
在一些实施方案中，优选产生有限制对预定抗原型反应的抗体中存在的V基因的选择的预定所有的成分的非人动物。具有预定全部成分的重链转基因可以包括，例如，在人对预定抗原型反应的抗体中优先使用的人VH基因。或者，为了各种原因(例如对于预定抗原具有编码高亲和性V区的低可能性；具有经历体细胞突变和亲和性加重的低倾向性；或者对某些人的免疫原性)，可以从确定的所有成分中排除一些VH基因。因此，在含有各种重链或轻链基因片段的转基因重排之前，例如通过杂交或DNA测序，可以容易地从除了转基因动物之外的生物物种鉴定这样的基因片段。
例如用如上所述的纯化的PSMA和/或表达PSMA的细胞或其重组制剂能免疫转基因和转染色体非人动物，例如如上所述的小鼠。或者，用编码人PSMA的DNA能免疫转基因动物。动物然后产生B细胞，其通过转基因内转换重组(顺式转换)经历经典转换，并且表达与PSMA反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人抗体(也称作″人序列抗体″)，其中人转基因序列编码重链和轻链多肽，所述人转基因序列包括体细胞突变和V区重组连接衍生的序列，和种系-编码序列；可以认为这些人抗体与人VL或VH基因片段和人JL或JH片段编码的多肽序列基本上相同，但是作为体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接的结果可以存在其他非种系序列。在重链，D，基因片段的情况下，各个抗体链的可变区一般由人种系V，J，和在重链的情况下，D，基因片段编码至少80％；转基因上存在的人种系序列常常编码至少可变区的85％；转基因上存在的人种系序列经常编码可变区的90％或95％或更多。但是，因为体细胞突变和VJ与VDJ连接导入非种系序列，人序列抗体常常具有不是由小鼠种系中人转基因中发现的人V，D，或J片段编码的一些可变区序列(和，不经常地，恒定区序列)。典型地，这样的非种系序列(或者各位置)簇集在CDRs中或附近，或者已知体细胞突变簇集的区。
与预定抗原结合的人抗体可以来自同种型转换，这样产生包括人序列γ链(例如γ1，γ2，γ3，或γ4)和人序列轻链(例如κ)的人抗体。这样的同种型转换人序列抗体经常含有一个或几个体细胞突变，一般在可变区中，作为亲和性成熟和抗原对B细胞的选择的结果，特别是作为第二(或接着的)抗原攻击的结果，经常位于CDR得到大约10个残基中或之内。这些高亲和性人序列抗体可以具有10-7M或更小，例如10-8M或更小，10-9M或更小，或10-10M或更小，或者甚至更小的KD。
本发明的另一方面提供如上所述转基因或转染色体非人动物产生的B细胞。可以用B细胞产生表达以高亲和性与PSMA结合的人单克隆抗体的杂交瘤(例如，KD是10-7M或更小)。因此，在另一个实施方案中，本发明提供产生具有10-7M或更小，例如10-8M或更小，10-9M或更小，或10-10M或更小，或者甚至更小的KD的人抗体的杂交瘤，其中抗体包括：
由下面构成的人序列轻链：(1)具有与人VL基因片段和人JL片段编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的轻链可变区，和(2)具有与人CL基因片段编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的轻链恒定区；和
由下面构成的人序列重链：(1)具有与人VH基因片段，任选地D区，和人JH基因片段编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的重链可变区，和(2)具有与人CH基因片段编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的恒定区。
通过扩大具有包括整合的人免疫球蛋白转基因的基因组的转基因小鼠中人可变区基因片段文库的方法有利于开发高亲和性抗PSMA的人单克隆抗体，所述方法包括向基因组中导入包括所述整合的人免疫球蛋白转基因中不存在的V区基因片段的V基因转基因。经常是，V区转基因是酵母人工染色体，包括人VH或VL(Vk)基因片段阵列的一部分，其在人基因组中可能天然存在或者通过重组方法可以分别剪接在一起，其中各部分可以包括不按顺序或者缺V基因片段。经常是YAC上包含至少5个或多个功能V基因片段。在这个变化中，有可能通过所有的成分扩增的方法制备转基因小鼠，其中小鼠表达包括V区转基因上存在的V区基因片段编码的可变区序列和人Ig转基因上编码的C区的免疫球蛋白链。利用V所有组成成分扩增方法，能产生具有至少5个不同的V基因的转基因小鼠；这样小鼠能包含至少大约24个V基因或更多。一些V基因片段可以是没有功能的(例如，假基因等)；如果期望，通过本领域可获得的重组方法可以保留这些片段或者可以选择性缺失。
一旦小鼠种系经工程化包含具有扩增的V片段所有组成成分的功能YAC，而在含有J和C基因片段的人Ig转基因中基本上不存在，这个特征可以繁殖并且繁殖到其他遗传背景中，包括其中具有扩增的V片段所有组成成分的功能YAC繁殖成具有不同的人Ig转基因的小鼠种系。具有扩增的V片段成分的多个功能YAC可以繁殖成与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)工作的种系。虽然这里提到是YAC转基因，这样的转基因当整合到基因组中时可以实质上缺乏酵母序列，例如在酵母中自主复制需要的序列；在不要需要的在酵母中复制之后(即，导入到小鼠ES细胞或小鼠原合子之前)，通过遗传工程(例如，限制消化和脉冲场凝胶电泳或其他合适的方法)可以任选地去除这样的序列。繁殖人序列免疫球蛋白表达特征的方法，包括饲养具有人Ig转基因，和任选地还具有具有扩增的V片段成分的功能YAC的转基因小鼠。YAC上可以存在VH和VL基因片段。从业者可以将转基因小鼠饲养成任何期望的背景，包括携带其他人转基因的背景，包括人Ig转基因和/或编码其他人淋巴细胞蛋白质的转基因，本发明还提供具有扩增的V区成分YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和性人序列免疫球蛋白。虽然上文描述了本发明的转基因动物的优选的实施方案，但是也包括其他实施方案，下面将它们分为四类：
I.含有未重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
II.含有未重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
III.含有重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；和
IV.含有重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。
这些种类的转基因动物中，优先的优选顺序如下II＞I＞III＞IV，其中通过同源重组(或其他方法)敲除内源轻链基因(或者至少K基因)，和I＞II＞III＞IV，其中内源轻链基因没有被敲除，并且通过等位基因排斥一定占优势。
III.与PSMA结合的双特异性/多特异性分子
在本发明的另一个实施方案中，抗PSMA人单克隆抗体，或者其抗原结合部分可以被衍生化或者与另一个功能分子连接，例如，另一种肽或蛋白质(例如，Fab′片段)，产生与多个结合位点或靶表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体或抗原结合部分能被功能连接于(例如，通过化学偶联，基因融合，非共价缔合或者类似方法)一个或几个其他结合分子，例如另一种抗体，抗体片段，肽或结合模拟物。
因此，本发明包括包括至少一种对于PSMA的第一结合特异性和对于第二靶表位的第二结合特异性的双特异性和多特异性分子。在本发明的具体实施方案中，第二靶表位是Fc受体，例如，人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能与FcγR，FcαR或表达FcαR的效应细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞或多形核细胞(PMNs))，和与表达PSMA的靶细胞两者结合的双特异性和多特异性分子。这些双特异性和多特异性分子使得表达PSMA的细胞导向效应细胞，象本发明的人单克隆抗体，引发Fc受体-介导效应细胞活性，例如PSMA表达细胞的吞噬作用，抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，细胞因子释放，或过氧化物阴离子的产生。
本发明的双特异性和多特异性分子除了抗-Fc结合特异性和抗-PSMA结合特异性之外，能进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，所述第三结合特异性是抗-增强因子(EF)部分，例如，与细胞毒性活性中涉及的表面蛋白质结合从而加强抗靶细胞免疫应答的分子。″抗-增强因子部分″可以是抗体，功能抗体片段或与给定分子例如抗原或受体结合从而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的配体。″抗-增强因子部分″能结合Fc受体或靶细胞抗原。或者，抗-增强因子部分能与第一和第二结合特异性与之结合的个体不同的个体结合。例如，抗-增强因子部分能结合细胞毒性T-细胞(例如通过CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或导致抗靶细胞的增强的免疫应答的其他免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包括作为结合特异性的至少一种抗体，或者其抗体片段，包括，Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或者其任何最小片段例如Fv或单链构建体，如1990年8月7日公开的Ladner等美国专利No.4,946,778中所描述的，该专利文献内容表达上引作参考。
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包括对于效应细胞表面上存在的FcγR或FcαR的结合特异性，和对于靶细胞抗原例如PSMA的第二结合特异性。
在一个实施方案中，人单克隆抗体提供对于Fc受体的结合特异性，其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。根据这里使用的，术语″IgG受体″指位于染色体1上的8个γ-链基因的任一个。这些基因编码12种跨膜或溶解受体异种型的全部，它们分成三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)，和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是一种72kDa分子，它对于单体IgG具有高亲和性(108-109M-1)。
Fanger等在PCT申请WO 88/00052和美国专利No.4,954,617中描述了这些优选的单克隆抗体的制备和表征，其中教导全部在此引作参考。这些抗体与和受体的Fcγ结合位点完全不同的位点处的FcγRI，FcγRII，或FcγRIII的表位结合，这样，它们的结合基本上不被生理水平的IgG阻断。本发明中使用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb22，mAb 32，mAb 44，mAb 62和mAb 197。从美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)可获得产生mAb 32的杂交瘤，ATCC保藏号No.HB9469。在另外的实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT/US93/10384。产生H22抗体的细胞系保藏在美国典型培养物保藏中心，名称是HA022CL1，保藏号是no.CRL 11177。
在其他更优选的实施方案中，与人IgA受体例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供对于Fc受体的结合特异性，其结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语″IgA受体″意在包括位于染色体19的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知这个基因编码几个非此即彼的剪接的55-110kDa的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞，嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，而在非效应细胞上不表达。FcαRI对于IgA1和IgA2两者具有中等亲和性(5×107M-1)，其当暴露给细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时增大(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。有人描述过四种FcαRI-特异性单克隆抗体鉴定为A3，A59，A62和A77，其结合IgA配体结合结构域外的FcαRI，(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.148：1764)。
FcαRI和FcγRI优选触发本发明中使用的受体，因为它们是(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞，PMNs，巨噬细胞和树突细胞上表达；(2)以高水平表达(例如，5,000-100,000/细胞)；(3)细胞毒性活性的传递介质(例如，ADCC，吞噬作用)；(4)介导增强的抗原呈递，包括导向它们的自身抗原。
在其他实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子进一步包括识别，例如结合靶细胞抗原例如PSMA的结合特异性。在优选的实施方案中，本发明的人单克隆抗体提供结合特异性。
这里使用的″效应细胞特异性抗体″指结合效应细胞的Fc受体的抗体或功能抗体片段。本发明中使用的优选抗体结合内源免疫球蛋白没有发现的位点处的效应细胞的Fc受体。
根据这里使用的，术语″效应细胞″指与免疫应答的认知和激活期相对的免疫应答的效应期中涉及的免疫细胞。例示的免疫细胞包括髓细胞样或淋巴样源的细胞，例如，淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞包括溶细胞T细胞(CTLs))，杀伤细胞，天然杀伤细胞，巨噬细胞，单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性细胞，多形核细胞，粒细胞，肥大细胞，和嗜碱细胞。一些效应细胞表达特异Fc受体并且带有特异性免疫功能。在优选的实施方案中，效应细胞能诱导抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，例如，能诱导ADCC的嗜中性细胞。例如，表达FcR的单核细胞，巨噬细胞在靶细胞特异性杀伤和向免疫系统的其他成分呈递抗原，或与呈递抗原的细胞结合中涉及。在其他实施方案中，效应细胞能吞噬靶抗原，靶细胞，或微生物。效应细胞上特定FcR的表达能受体液因子例如细胞因子的调节。例如，发现FcγRI的表达受干扰素γ(IFN-γ)上调。这种增强的表达提高FcγRI-携带细胞抗靶物的细胞毒性活性。效应细胞能吞噬或溶解靶抗原或靶细胞。
″靶细胞″意思是本发明的成分(例如，人单克隆抗体，双特异性或多特异性分子)能导向的受试者(例如人或动物)的任何不期望的细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是表达或超表达PSMA的细胞。表达PSMA的细胞一般包括肿瘤细胞，例如膀胱，乳腺，结肠，肾，卵巢，前列腺，肾细胞，鳞状细胞，肺(非小细胞)和头颈肿瘤细胞。其他靶细胞包括滑液成纤维细胞。
虽然人单克隆抗体是优选的，但是本发明的双特异性或多特异性分子中能使用其他抗体，是鼠抗体，嵌合抗体和人源化单克隆抗体。
通过本领域公知的重组DNA技术能制备嵌合小鼠-人单克隆抗体(即，嵌合抗体)。例如，用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，去除编码鼠Fc的区，并且取代编码人Fc恒定区的基因的等价部分。(参见Robinson等，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等美国专利No.4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988Sciehce 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Cane.Res-47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等，1988，J.Natl CancerInst.80：1553-1559)。
通过用来自人Fv可变区的等价序列置换抗原结合中不直接涉及的Fv可变区的序列，能将嵌合抗体进一步人源化。Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207和Oi等，1986，BioTechniques 4：214中提供了有关人源化嵌合抗体的一般综述。这些方法包括从重链或轻链中的至少一种分离编码免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分的核酸序列的分离，操作，和表达。这样的核酸的来源对于本领域技术人员是公知的，并且例如可以从产生抗-GPIIbIIIa抗体的杂交瘤7E3获得。然后可以将编码嵌合抗体或者其片段的重组DNA克隆到合适的表达载体中。或者通过CDR取代能制备合适的人源化抗体。美国专利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等1988Science 239：1534；和Beidler等1988 J.Immunol.141：4053-4060。
用至少一部分非人CDR可以置换特定人抗体的CDR的全部或者用非人CDR可以只置换CDRs中的一些。只需要置换一些人源化抗体与Fc受体结合所述需要的CDRs。
通过能用非人抗体衍生的CDR置换人抗体的CDR的至少一部分的任何方法能将抗体人源化。Winter描述了可以用来制备本发明的人源化抗体的方法(UK专利申请GB 2188638A，1987年3月26日)，其内容表达上引作参考。根据发明名称是抗人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G的Fc受体的人源化抗体的国际申请WO 94/10332中的描述，利用寡核苷酸定点诱变，可以用非人CDRs置换人CDR。
落在本发明的范围内的还有特异氨基酸被取代，缺失或添加的嵌合和人源化抗体。特别地，优选的人源化抗体构架区中有氨基酸取代作用，使得提高对抗原的结合。例如，在具有小鼠CDRs的人源化抗体中，用小鼠抗体相应的位置处的氨基酸能置换人构架区中的氨基酸。已知这样的取代作用在某些情况下改进人源化抗体对抗原的结合。其中氨基酸被添加，缺失，或取代的抗体这里称作修饰的抗体或改变的抗体。
术语修饰的抗体还意在包括通过例如缺失，添加或取代抗体的部分的抗体，例如单克隆抗体，嵌合抗体，和人源化抗体。例如，通过缺失恒重区并且用意在提高抗体的半寿期，例如血清半寿期，稳定性或亲和性的恒定区置换它，能修饰抗体。任何修饰作用都在本发明的范围内，只要双特异性和多特异性分子具有至少一个对于FcγR特异的抗原结合区并且触发至少一个效应物功能。
利用化学技术(参见例如，D.M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)，″polydoma″技术(参见美国专利4,474,893，阅读)，或重组DNA技术，能制备本发明的双特异性和多特异性分子。
特别地，利用本领域公知的方法和这里提供的实施例所述，通过使构成结合特异性，例如，抗-FcR和抗-PSMA结合特异性偶联，能制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，能分开产生双特异性和多特异性分子的各结合特异性，然后彼此偶联在一起。当结合特异性是肽或蛋白质时，可以使用各种各样的偶联或交联剂用于共价偶联。交联剂的例子包括蛋白质A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)，5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)，N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)229：81-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)描述的那些。优选的偶联剂是SATA和磺化-SMCC，这两种都可以从Pierce ChemicalCo.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时(例如，两种人源化抗体)，能通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键合而将它们偶联。在特别优选的实施方案中，在偶联之前，对铰链区修饰使它含有奇数优选一个巯基残基。
或者，在同一个载体中能编码这两个结合特异性并且表达并且在相同的宿主细胞中组装。该方法是特别有用的，其中双特异性和多特异性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，FabxF(ab′)2或配体x Fab融合蛋白。本发明的双特异性和多特异性分子，例如，双特异性分子可以是单链分子，例如单链双特异性抗体，含有一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子，含有两个决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子还可以是单链分子或者可以包括至少两个单链分子。制备双特异性和多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
通过酶联免疫吸附测试(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，FACS分析，生物测试(例如，生长抑制)，或Western印迹能证实双特异性和多特异性分子对它们特定靶物的结合。这些测试的每一项一般通过使用对感兴趣的复合物特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特别令人感兴趣的蛋白质-抗体复合体的存在。例如，利用，例如识别和特异性结合抗体-FcR复合体的酶联抗体或抗体片段能检测FcR-抗体复合体。或者，利用各种各样的其他免疫分析能检测复合体。例如，对抗体进行放射性标记并且在放射免疫分析(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，3月，1986，这里引作参考)。通过象使用γ计数器或闪烁计数器这样的方法或者通过放射自显影方法，能检测放射性同位素。
IV.抗体偶联物/抗毒素
另一方面，本发明特征在于与另一个治疗性部分例如细胞毒素，药物或放射性同位素偶联的人抗-PSMA单克隆抗体或者其片段。当与细胞毒素偶联时，这些抗体偶联物称作″抗毒素″。细胞毒素或细胞毒性剂包括对(例如杀伤)细胞有害的或者抑制它们生长的任何试剂。实施例包括紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴乙啡啶，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，二羟蒽二酮，光辉霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素和它的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢物(例如，甲氨喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如，氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，卡莫司汀(BSNU)和罗氮芥(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露糖醇，链唑霉素，丝裂霉素C，和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环霉素(例如，道诺红菌素(以前是柔红霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前是放线菌素)，博莱霉素，光辉霉素，和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。能与本发明的抗体偶联的治疗性细胞毒素的例子包括calicheamicins和duocarmycins。
本发明的人抗体还可以与放射性同位素例如放射性碘偶联，产生用于治疗或诊断PSMA-相关疾病(例如，肿瘤)的细胞毒性或非细胞毒性放射性药物。
可以使用本发明的抗体偶联物来修饰给定生物学反应，药物部分不认为局限于常规治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物性活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括，例如，酶活性毒素，或者其活性片段，例如红豆毒素，蓖麻毒A，假单胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者，生物反应修饰剂例如，淋巴因子，白介素-1(″IL-1″)，白介素-2(″IL-2″)，白介素-6(″IL-6″)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)，或者其他生长因子。
将这样的治疗部分与抗体偶联的技术是公知的，例如，参见，Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy″，见Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld等(编著)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，见Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编著)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，见Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(编著)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，见MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编著)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
V.药物组合物
另一方面，本发明提供一种药物组合物，例如，含有与药学可接受载体配制在一起的本发明的人单克隆抗体或者其抗原结合部分中的一种或联合的药物组合物。一些组合物可以包括本发明的(例如两个或多个不同的)人抗体中的一种或联合。
在一个实施方案中，本发明提供含有与人PSMA上不同的表位结合并且具有补充活性例如作为药物组合物的人抗-PSMA的联合的治疗组合物。例如，在效应细胞的存在下介导靶细胞的高效杀伤的人单克隆抗体可以与抑制表达PSMA的细胞的生长的另一种人单克隆抗体联合。
在另一个实施方案中，治疗性组合物含有本发明的免疫偶联物或双特异性(或多特异性)分子中的一种或联合。
本发明的药物组合物还可以在联合治疗中施用，即与其他药物联合。例如，联合治疗可以包括本发明的组合物和至少一种抗肿瘤药物或者其他常规治疗法。
根据这里使用的，″药学可接受载体″包括生理相容的任何和所有的溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适合静脉内，肌内，皮下，肠胃外，脊柱或表皮施用(例如，通过注射或灌注)。根据给药途径，活性化合物，即，抗体，双特异性和多特异性分子，可以用保护化合物不受酸的作用和可能使化合物失去活性的其他天然条件的材料包衣。
″药学可接受盐″指保留了母体化合物的生物学活性但是不带来任何不期望的毒理学作用的盐(参见例如，Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从无毒性无机酸衍生的那些，例如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，亚磷酸等，以及从无毒性有机酸衍生的那些，例如脂肪族一元和二元羧酸，苯基-取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳香酸，脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括从碱土金属衍生的那些，例如钠，钾，镁，钙等，以及从无毒性有机胺衍生的，例如N，N′-二苄基乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，亚乙基二胺，普鲁卡因等。
本发明的组合物可以通过本领域公知的各种方法施用。技术人员明白，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。使用保护化合物不快速释放的载体能制备活性化合物，例如缓释制剂，包括植入物，透皮贴，和微胶囊送递系统。可以使用生物可降解，生物相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐类，聚羟基乙酸，胶原，聚原酸酯，和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法是专利或者一般为本领域技术人员公知。参见，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过一些途径施用本发明的化合物，需要用防止化合物失活的材料将化合物或者共同施用的化合物包衣。例如，可以自阿合适的载体，例如脂质体或稀释剂中对受者施用化合物。药学可接受稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液和常规的脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。使用这样的用于药学活性物质的介质和试剂是本领域公知的。除了任何常规介质或与活性化合物不相容的试剂范围外，包括在本发明的药物组合物中使用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗组合物一般必须是灭菌的并且在制备和贮存条件下稳定。可以将组合物配制成溶液。组合物可以配制成溶液，微乳状液，脂质体，或者其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如，丙三醇，聚乙二醇，和液体聚乙二醇等等)，和它们的合适的混合物的溶剂或分散剂。能保持适当的流动性，例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持要求的粒度和通过使用表面活性剂能保持流动性。在很多情况下，组合物中优选包括等张剂，例如，糖，多元醇例如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如一硬脂酸盐和明胶，能使可注射组合物延迟吸收。
通过将活性化合物以要求的量混入合适的溶剂中，并且根据需要，加入列举的成分的一种或组合，接着灭菌微过滤，能制备无菌注射液。一般情况下，通过将活性化合物掺入到含有碱性分散介质和需要的来自上面列举的那些的其他成分的灭菌赋形剂中制备分散剂。在用于制备无菌注射液的灭菌粉末剂的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，得到活性成分的粉末剂加来自前面其灭菌过滤溶液的任何另外的期望的成分。
调节剂量给药方案，提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量或者根据治疗情形的紧急状况指示的，剂量可以按比例减小或增加。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易施用并且配药均匀的单位剂量形式。这里使用的单位剂量形式指适合对要治疗的受试者的单位剂量的物理不连续单位；每一个单位含有经计算与必需的药学载体组合的期望的治疗效果的预定量的活性化合物。根据或者直接根据下面的陈述本发明的单位剂量形式的说明：(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)配制这样的用于治疗个体灵敏性的活性化合物的本领域固有的限制。
药学可接受抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，盐酸胱氨酸，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯，丁酸化羟基茴香醚(BHA)，丁化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚，等等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等等。
有关治疗组合物，本发明的制剂包括适合口服，鼻，局部(包括颊和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外给药的那些。制剂可以常规地以单位剂量形式存在并且可以通过药学领域公知的方法制备。可以与载体材料混合制备单一剂量形式的活性成分的量随着要治疗者和特定的给药方式而不同。可以与载体材料混合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的成分的量。一般，以百分比来计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％。
适合阴道给药的本发明的制剂还包括含有本领域公知是适合的载体的阴道栓，塞子，乳膏，凝胶，糊剂，泡沫剂或喷雾剂。用于局部或经皮施用本发明的组合物的剂量形式包括粉末剂，喷雾剂，软膏，糊剂，乳膏，洗剂，凝胶，溶液，贴和吸入剂。活性化合物可以在灭菌条件下与药学可接受载体混合，与任何必需的防腐剂，缓冲剂，或推进剂混合。
这里使用的短语″肠胃外给药″和″肠胃外施用”意思是除了肠道和局部给药之外的给药方式，通常通过注射，包括，非限制性地，静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眼眶内，心内，真皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和灌注。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适的含水和不含水载体的例子包括水，乙醇，多元醇(例如丙三醇，丙二醇，聚乙二醇，等等)，和它们的合适的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯。通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持必需的粒度，和通过使用表面活性剂，能保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序，和通过含有各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等，可以保证防止存在微生物。还期望组合物包括等张剂，例如糖，氯化钠等。另外，通过含有延迟吸收剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以带来可注射药学形式的延迟吸收。
当作为药物对人和动物施用本发明的化合物时，可以单独给药化合物，或者作为含有与药学可接受载体混合的例如0.01至99.5％(更优选，0.1至90％)的活性成分的药物组合物给药。
不考虑选择的给药途径，将可以是合适的水合形式的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制成药学可接受剂量形式。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，使得获得对于特定患者，组合物，和给药方式有效实现期望的治疗反应而对患者没有毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于各种药物动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物，或者它的酯，盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，使用的特定化合物的排泄速度，治疗时间，与使用的特定组合物联合的其他药物，化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康和以前的用药史，和药学领域公知的类似因素。
本领域普通医生或兽医容易确定和制定必需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以比为了实现期望的治疗效果所必须的量更低的水平开始施用药物组合物中使用的本发明的化合物，并且逐渐加大剂量，直到实现期望的效果。一般情况下，本发明的组合物的合适的日剂量是有效产生治疗效果最低剂量的化合物的量。这样的有效剂量一般取决于上述因素。优选给药是通过静脉内，肌内，腹膜内，或皮下，优选接近靶位位点给药。如果期望，在一天内可以以合适的时间间隔两次，三次，四次，五次，六次或更多次亚剂量分开给药施用有效日剂量的治疗组合物，任选地，以单位剂量形式。单独施用本发明的化合物是可能的，但是优选施用作为药物制剂(组合物)的化合物。
可以用本领域公知的药学装置施用本发明的治疗组合物。例如，在优选的实施方案中，使用无针头皮下注射装置可以施用本发明的治疗组合物，例如美国专利Nos.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。本发明中有用的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，它公开了以可控速度送递药物的可植入微输入泵；美国专利No.4,486,194，它公开了用于施用通过皮肤的药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，它公开了用于以精确输入速度送递药物的药物输入泵；美国专利No.4,447,224，它公开了用于连续药物送递的可变流动可植入输入装置；美国专利No.4,439,196，它公开了具有多腔分隔室的渗透药物送递系统；和美国专利No.4,475,196，它公开了一种渗透药物送递系统。这些专利文献在此引作参考。很多其他这样的植入物，送递系统和组件是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，能配制本发明的人单克隆抗体，保证在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥很多高亲水性化合物。为了保证本发明的化合物跨越BBB(如果期望)，可以例如在脂质体中配制这些化合物。加工脂质体的方法参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331.脂质体可以包括选择性送递给特定细胞或器官中的一个或几个部分，这样强化定向药物送递(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。举例的定向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如，美国专利5,416,016，Low等)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physio.1233：134)，可以含有本发明的制剂，以及本发明的分子成分的不同的物质；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的实施方案中，在脂质体中配制本发明的治疗化合物；在更优选的实施方案中，脂质体包括定向部分。在最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物被通过大丸剂注射送递到接近肿瘤或注射的位点。组合物必须是液体，其到容易注射的程度。其在加工和贮存的条件下必须是稳定的，并且受到保护，有微生物例如细菌和真菌的污染作用。
相对于没有接受治疗的患者，″治疗有效剂量″优选将肿瘤生长抑制至少大约20％，更优选至少大约40％，甚至更优选大约60％，更优选至少大约80％。在预测对人肿瘤的有效性的动物模型系统中能评价化合物抑制癌症的能力。或者，通过检查化合物的抑制能力来评价组合物的这个性质，这样的体外抑制作用通过技术人员公知的测试确定。治疗有效量的治疗化合物能减小患者肿瘤大小，或者另外减轻症状。本领域技术人员根据象受者体重，患者症状的严重程度，选择的施用的特定组合物或给药途径这样的因素，能确定这样的量。
组合物必须是无菌和液体，到通过注射能送递组合物的程度。除了水之外，载体可以是等张缓冲盐水，乙醇，多元醇(例如，丙三醇，丙二醇，和液体聚乙二醇等等)，和它们的合适的混合物。通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持要求的粒度和通过使用表面活性剂能保持合适的流动性。在很多情况下，组合物中优选包括等张剂，例如，糖，多元醇例如甘露糖醇，或山梨糖醇和氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如一硬脂酸盐或明胶，能使可注射组合物长时间吸收。
当如上所述适当保护活性化合物时，例如可以用惰性稀释剂或可同化可食用载体口服施用化合物。
VI.本发明的使用和方法
本发明的人单克隆抗-PSMA抗体和相关的衍生物/偶联物和组合物有着很多体外和体内诊断和治疗用途。例如，可以对例如体外或来自体内的培养物中的细胞施用这些分子。或者，可以对接受治疗的患者体内施用，预防或诊断各种PSMA相关疾病。根据这里使用的，术语″受试者″意在包括人和非人动物。优选的受试者包括有特征在于PSMA表达，典型地PSMA异常表达(例如超表达)的疾癌的人患者。因此，本发明的方法和组合物可以用来治疗有特征在于存在表达PSMA的肿瘤细胞的肿瘤发生疾病的受试者，例如，前列腺癌，结肠癌，和肾癌。术语本发明的″非人动物″包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长目，绵羊，狗，牛，鸡，两栖动物，爬虫类等。
在优选的实施方案中，本发明提供对患者治疗前列腺癌的方法，包括对患者施用本发明的一种抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，以其中抗体与例如放射性试剂或细胞毒性药物偶联的偶联物使用抗-PSMA抗体。在另一个实施方案中，以例如与抗-FcγRI或抗-Fcα连接的双特异性分子施用抗-PSMA抗体。
最初对本发明的人抗体测试体外与治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，应用如下实施例中描述的ELISA和流式细胞仪分析能测试本发明的成分。此外，能测定这些分子在触发至少一种效应物介导的效应细胞活性中的活性，包括表达PSMA细胞的细胞溶解。下面的实施例中描写了效应细胞介导的吞噬作用测定方法。
本发明的人抗体在PSMA-相关疾病的治疗和诊断中还有另外的用途。例如，使用人单克隆抗体，多特异性或双特异性分子，例如，体内或体外激发下面生物学活性中的一种或几种：调理表达PSMA的细胞；在人效应细胞的存在下介导表达PSMA的细胞的吞噬作用或细胞溶解；或者抑制表达PSMA的细胞的生长。
施用本发明的抗体和组合物的合适的方法是本领域公知的。本领域技术人员能确定合适的剂量，并且取决于患者的年龄和体重和使用的特定药物。
本发明的人抗-PSMA抗体还可以与其他治疗剂例如化学治疗剂共同给药，或者可以与其他已知的治疗法例如抗癌治疗法，例如放射疗法共同施用。这样的治疗剂其中包括抗肿瘤药物，例如阿霉素(亚德里亚霉素)，顺铂博莱霉素硫酸盐，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，和环磷酰胺羟基脲，它们本身只有在对患者有毒性或亚毒性的水平才有效。顺铂是每四周一次以100mg/m2剂量静脉内施用，阿霉素是每21天一次以60-75mg/m2剂量静脉内施用。本发明的人抗-PSMA抗体或者其抗原结合片段与化学治疗剂共同给药提供两种抗癌药物，它们通过不同的机理操作，得到对人肿瘤细胞的细胞毒性作用。这样的共同给药能解决由于产生对药物的抗药性或者肿瘤细胞抗原性的变化而使得它们与抗体不反应的问题。
与本发明的人抗体，多特异性或双特异性分子连接的靶-特异性效应细胞，例如效应细胞也能用作治疗剂。用于定向的效应细胞可以是人白细胞例如巨噬细胞，嗜中性细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞，天然杀伤细胞和其他IgG-或IgA-受体携带细胞。如果期望，可以从要治疗的患者获得效应细胞。靶-特异性效应细胞，可以作为细胞在生理可接受溶液中的悬浮液而施用。施用细胞的数目可以是108-109级，但是根据治疗目的而不同。一般情况下，这个量足以获得在靶细胞的定位，例如表达PSMA的肿瘤细胞，通过例如吞噬作用实施细胞杀伤。给药途径也可以变化。
与其他去除靶细胞的技术联合能实施靶-特异性效应细胞治疗。例如，使用本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)和/或与这些成分连接的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化疗联合使用。另外，可以使用联合免疫疗法指导两个不同的细胞毒性效应物种群朝向肿瘤细胞排斥。例如，可以与IgG-或IgA-受体特异性结合试剂联合使用与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-PSMA抗体。
本发明的双特异性和多特异性分子还可以用来调节效应细胞上FcγR或FcαR水平，例如通过将细胞表面上的受体封端和消除。还可以将抗-Fc受体的混合物用于该目的。
在补体的存在下还可以使用具有补体结合位点的本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)，例如来自结合补体的IgG1，-2，或-3或IgM的部分。在一个实施方案中，通过加入补体或含有补体的血清，能补充使用本发明的结合剂和合适的效应细胞对包括靶细胞的细胞群体的来自体内的治疗。通过补体蛋白质的结合能改进用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一个实施方案中，补体也能溶解用本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞。在另一个实施方案中，本发明的成分不激活补体。
本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)还可以与补体一起施用。因此，在本发明范围内的还有含有人抗体，多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。这些组合物的有利之处在于补体位于最接近人抗体，多特异性或双特异性分子。或者，本发明的人抗体，多特异性或双特异性分子和补体或血清可以分开施用。
也在本发明范围内的还有包括本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)和使用说明的试剂盒。试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂，例如补体，或者本发明的一种或几种人抗体(例如，具有与第一人抗体不同的与PSMA抗原中的表位结合的补体活性的人抗体)。
在其他实施方案中，使用调节，例如增强或抑制Fcγ或Fcα受体的表达或活性，通过例如用细胞因子治疗患者，来对患者进一步治疗。用多特异性分子治疗期间给药的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素-γ(IFN-γ)，和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的成分(例如人抗体，多特异性和双特异性分子)还可以用来定向表达FcγR或PSMA的细胞，例如用于标记这样的细胞。对于这样的应用，结合剂能与被检测的分子连接。因此，本发明提供来自体内或体外定位表达Fc受体，例如FcγR，或PSMA的细胞的方法。可检测标记是，例如放射性同位素，荧光化合物，酶，或酶辅助因子。
通过在抗体和PSMA之间形成复合体的条件下使样品(例如，和对照样品一起)接触人单克隆抗体，本发明的人抗体还可以用来检测样品中PSMA抗原的存在。然后检测复合体的形成，其中与对照样品相比较，样品之间形成不同的复合体是样品中存在PSMA抗原的指征。
在另一个实施方案中，本发明提供体内或体外检测Fc-表达细胞的存在和量的方法。该方法包括(i)对患者施用与可检测标记物偶联的本发明的成分(例如多特异性或双特异性分子)或者其片段；(ii)将患者暴露给检测所述可检测标记物的工具，鉴定含有Fc-表达细胞的区域。
通过下面的实施例进一步详细说明本发明，这些实施例不应该认为是进一步的限定。该申请中引述的所有的图和所有的参考文献，专利文献和公开的专利申请的内容表达上在此引作参考。
实施例
方法和材料
PSMA-特异性单克隆抗体的筛选试验：利用固相ELISA-为基础的试验检测PSMA-HuMAbs。使用来自LNCaP的免疫亲和纯化PSMA，或者细菌表达的含有PSMA衍生片段的融合蛋白在4℃下温育过夜包被Maxi-Sorp(Nunc，Rochester，NY)96-孔板。培养板用PBS-0.2％Tween-20洗涤并且用PBS中5％BSA溶液在室温下封闭1小时。向PSMA-包被的孔加入来自杂交瘤培养的50微升上清液，并且将培养极在室温下温育2小时。如上清洗培养板并且向各个孔中加入50微升的1∶1000稀释的兔-抗-人IgG H & L链(ICN，Costa Mesa，CA)。室温下温育1小时之后，如上清洗培养板并且向各个孔中加入50微升的1∶2000稀释的HRP-偶联蛋白-A(Sigma，St.Louis，MO)。室温下温育1小时之后，如上清洗培养板并且向各个孔中加入500ml的0.1M柠檬酸，pH4.35)/H2O2(每10毫升ABTS溶液10微升30％H2O2)chromagen/底物溶液中的100微升ABTS(150mg 2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。温育5分钟之后加入100微升中止溶液(SDS/二甲基甲酰胺)中止反应，并且在微板读数器上读取405nm吸收度。通过有限稀释并且进行附加分析，克隆具有高A405值的杂交瘤细胞产生的上清液。
抗体蛋白质的分离：
使用含有1-5％Fetalclone(Hyclone，Logan，UT)的RPMI-1640培养基从Cellmax生物反应器(Cellco，Laguna Hills，CA)分离单克隆抗体。根据厂商说明(KPL，Gaithersburg，MD)，在ProteinA-Agarose柱子上色谱法纯化单克隆抗体。
LNCaP细胞膜的制备：
从塑料皿上刮取LNCaP细胞，在PBS中充分清洗，再悬浮于10体积的去离子水，并且用Dounce匀浆器三次匀浆。通过在15,000xg下离心45分钟来分离膜级分，并且将沉淀再悬浮于PBS。使用Pierce(Rockford，IL)BCA试剂盒测定膜沉淀物的蛋白质浓度。
热变性实验：
通过煮沸10分钟将来自LNCaP细胞(40g/ml，PBS中)的免疫亲和纯化PSMA等份加热变性并且在冰上冷却。这样的样品，和没有加热变性的相同的等份，以1∶4在PBS中稀释，并且向96-孔Maxi-Sorp板(Nunc)的孔加入50微升，并且在4℃下包被过夜。包被之后，所有的培养板用5％BSA的PBS溶液封闭1小时，用PBS清洗，并且进行标准夹心ELISA，使用如上所述的指定的一抗。
Western印迹分折：
含有PSMA级分的SDS-PAGE之后进行Western印迹分析并且转移给PVDF膜。印迹在含有5％脱脂奶的TBS中封闭过夜并且与TBS中5微克/毫升的浓度存在的纯化抗体温育1小时。用含有0.5％Tween-20(TBS-T)的TBS将印迹冲洗5次，使用LumiGLO化学发光底物试剂盒(KPL，Gaithersburg，MD)T使印迹显影，并且通过暴露X-射线胶片目测观察。
免疫沉淀研究：通过向LNCaP细胞加入含有1％NP-40的PBS，并且温育1小时，并且离心去除颗粒物，来制备LNCaP细胞的去污溶胞产物。通过对每毫升溶胞产物加入150微克不相关人IgG，并且室温下温育1小时，接着对每毫升溶胞产物加入150微升压实的ProteinG-Sepharose珠，使得溶胞产物预先澄清。离心去除珠之后使用上清液级分。每份100微升的预先澄清的溶胞产物与5微克抗体蛋白质混合并且在4℃下温育过夜。这个时期结束之后，向各个试管加入20微升压实的Protein G-Sepharose珠，并且在4℃下将试管温育1小时。用溶解缓冲液充分清洗之后，向各样品加入50微升Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)，并且在95℃下将试管加热10分钟。将试管离心2分钟并且加载到SDS-PAGE凝胶上并且在175伏下电穿孔60分钟。将电穿孔样品电印迹到PVDF膜上进行Western印迹分析，使用鼠抗-PSMA抗体4D8(5微克/毫升)并且如上所述显影。
流式细胞术：
从组织培养瓶中新鲜收集LNCaP和PC-3细胞并且制备单细胞。对LNCaP细胞悬浮液用一抗直接染色或者用1％多聚甲醛的PBS溶液固定之后染色。在含有0.5％BSA和50-200微克/毫升一抗的PBS中再悬浮大约一百万细胞，并且在冰上温育30分钟。将细胞用含有0.1％BSA，0.01％ NaN3的PBS清洗两次，再悬浮于100微升的1∶100稀释的FITC-偶联的山羊-抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)，并且在冰上又温育30分钟。将细胞再清洗两次，再悬浮0.5毫升的清洗缓冲液，并且FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuest获取软件在分析荧光染色。
单克隆抗体的FITC标记：
首先用0.3M碳酸钠缓冲液，pH9.5对纯化的单克隆抗体充分透析。通过将1毫克固体FITC溶解于1ml的DMSO中来制备异硫氰酸荧光素(FITC)溶液原液。滴加原液FITC，以一定量恒量混合，对每毫克抗体蛋白质提供50微克FITC。一旦加入，将溶液在避光下在室温下温育1-3小时。通过在PBS平衡过的Sephadex G-I0柱子上凝胶过滤分离FITC-标记的抗体。
4A3和7F12的DOTA标记：通过直接将DOTA的四个羧酸基团中的一个与抗体蛋白质的氨基偶联将5毫克4A3和7F 12抗体蛋白质DOTA标记。DOTA(四氮杂环十二烷四酸)是用于络合放射性核素的常用螯合剂。首先使用5×4ml的1％DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)，pH5.0用25,000截留量的离心式浓缩器在大约1.5ml的PBS中将蛋白质洗涤24小时。然后应用相同的程序将抗体缓冲液变为0.1M磷酸盐，pH 7.0。通过将30mg的DOTA(0.072mmol)in溶解于0.4毫升水并且用NaOH将pH调节到7.3产生DOTA的活化酯。然后加入10毫克的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺并且让混合物在冰上冷却1小时并且加给抗体溶液，并且在4℃下搅拌过夜。通过反复用0.3M NH4Oac洗涤并且离心浓缩，从过量的DOTA和其他反应物分离得到的DOTA-抗体偶联物。
抗体抑制研究：最初，在冰上，用PBS中200微克/毫升纯化的4A3，7F12，8A11，8C12，16F9，或无关的人IgG1抗体处理大约一百万LNCaP细胞。清洗之后，在冰上细胞与50微克/毫升FITC偶联人或鼠抗-PSMA单克隆抗体温育1小时。清洗之后，细胞用10微克/毫升propidium iodide染色，并且在FACsCalibur上使用CellQuest软件用流式细胞计数器分析。
125 I-标记的HuMAb在带有LNCaP细胞肿瘤的裸鼠中的生物分布：
LNCaP细胞，2×106，在50％Matrigel(Becton-Dickinson(150微升总体积)中，对裸鼠皮下注射。当肿瘤直径达到大约0.5cm大小时，通过对尾静脉注射100微克抗体(含有5-至35μCi的125I)通过静脉内施用用125I-标记的抗体对动物体内标记。不同的时间点之后，处死动物并且测定各正常器官和组织，以及肿瘤组织中存在的125I-标记水平。
使用lodobeads(Pierce)，根据生产商说明，用1-至1.5mCi的125I将1毫克抗体蛋白质碘化。
125 I-标记的HuMAb的内化：
LNCaP细胞在6-孔板上制成平板并且使达到接近汇合。然后去除培养基并且用PBS清洗孔以去除没有附着的细胞。然后以新鲜培养基中1.5ml总体积中10微克/毫升浓度用125I-标记的HuMAb或同种型匹配不相关人IgG标记细胞，并且在37℃下温育10分钟。在这个阶段结束时去除培养基，用PBS充分清洗细胞以去除没有结合的标记的抗体，加入1.5ml的培养基，使平板再回到37℃保温箱温育期望的时间。在温育的0(加入培养基之后即刻)，4，18，和28小时时去除培养基，离心去除没有附着的细胞。上清液级分在冰上冷却，通过加入100％TCA进行TCA沉淀，得到10％最终TCA浓度。在冰上温育10分钟之后，级分以1000xg离心10分钟并且去除上清液。在γ计数器中测定TCA溶解和不溶级分中存在的放射性的量。使用胰蛋白酶释放去除用于TCA沉淀的培养基之后孔中存在的附着细胞，并且放在试管中用于计数，用0.1N NaOH洗涤一次。在γ计数器中还测定与细胞结合的放射性.以内化，加工，和分布到TCA溶解级分中的最初与细胞结合的总量的比例对时间作图。
如上所述用1mCi的125I将0.5mg纯化的抗体蛋白质碘化。各抗体的标记在0.4和1.6μCi/微克抗体蛋白质之间。
HuMAbs的ADCC和CDC筛选：
使用LNCaP细胞作为靶细胞对ADCC和CDC测定4小时51Cr释放分析。使用100∶1的效应细胞与靶细胞之比(E∶T之比)以三联对每孔2500个靶物在96-孔板中进行分析。效应细胞是从一名男性和一名女性供者分离的PBMC′s。对于CDC分析，使用1∶200最终浓度的新鲜的人血浆作为补体源。
IHC对HuMAbs的组织交叉反应性筛选：
对冷冻切片术之后用丙酮处理10分钟或者仅在染色前立即用10％中性缓冲福尔马林处理10秒而固定的冷冻组织切片，使用固定浓度的纯化的没有偶联的人单克隆抗体(5微克/毫升)和不同浓度的生物素化山羊-抗-人IgG1二抗，首先优化IHC交叉反应性筛选的条件。根据这些条件，用不同浓度的HuMAb一抗，最佳二抗浓度进行第二次试验
以这些结果为基础，在冷冻切片术时用丙酮处理10分钟后在染色前立即用10％中性缓冲福尔马林处理10秒而固定之后对人冷冻切片进行组织筛选。用含有1.5mg/ml过量载体IgG的5微克/毫升浓度的一抗进行染色，接着用含有1.5mg/ml过量载体IgG的7.5微克/毫升7.5生物素化山羊-抗-人IgG二抗进行染色切片的蛋白质阻断中包括热聚集兔(1mg/ml)，5％正常山羊血清，和1％BSA。
实施例1用于生产抗-PSMA人抗体的Cmu靶向小鼠的产生
CMD靶向载体的构建：
质粒pICEmu含有跨越mu基因的鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段，该片段是从Balb/C基因组λ噬菌体文库获得的(Marcu等Cell 22：187，1980)。该基因组片段亚克隆到质粒pICEMI9H(Marsh等；Gene 32，481-485，1984)的XhoI/EcoRI位点。PICEmu中包括的重链序列在位于mu内含子增强子的3′的EcoRI位点下游扩增到位于mu基因的最后的跨膜外显子大约1kb下游的XhoI位点；但是，通过在大肠杆菌中传代缺失了大多数mu转换重复区。
如下构建寻靶载体。从pICEmu切下一个1.3kb HindIII/SmaI片段并且亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)中。这个pICEmu片段从位于Cmu1中Cmu1至SmaI的大约1kb5′的HindIII位点扩增。得到的质粒用SmaI/SpeI消化，并且插入从仅位于最后的Cmu外显子下游的Cmu1 3′至XbaI位点中的SmaI位点扩增的来自pICEmu的大约4kb SmaI/XbaI片段。得到的质粒，pTARI，在SmaI位点线性化，并且插入neo表达盒。该表达盒由小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra等(1987)Gene60：65-74)转录控制下的neo基因构成，并且包含pgk多腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段；Boer等(1990)Biochemical Genetics 28：299-308)。该表达盒从质粒pKJ1(根据Tybulewicz等(1991)Cell 65：1153-1163所述)获得，从这个质粒切割出neo表达盒作为EcoRI/HindIII片段并且亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)，产生pGEM-7(KJ1)。通过EcoRI/SakI消化从pGEM-7(KJ1)切割neo表达盒，平端处理并且亚克隆到质粒pTARI的SmaI位点，以基因组Cmu序列的相反方向。得到的质粒用NotI线性化，并且插入单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)表达盒，使得富集带有同源重组物的ES克隆，如Mansour等(1988)Nature 336：348-352所述。该表达盒由小鼠pgk启动子所包括的tk基因的编码序列和多腺苷酸化位点构成，根据Tybulewicz等(1991)Cell 65：1153-1163所述。得到的CMD寻靶载体包含与重链基因座的总共大约5.3kb的同源性，并且设计产生突变mu基因，在第一Cmu外显子的独特SmaI位点插入neo表达盒。寻靶载体用PvuI线性化，它在电穿孔到ES细胞之前在质粒序列中切割。
靶向ES细胞的产生和分析：
基本上根据说明(Robertson，E.J.(1987)，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells：a Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，p.71-112)，在有丝分裂灭活SNL76/7细胞供给层(ibid.)上使AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell 62：1073-1085)生长。通过Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.等(1991)Nature 350：243-246)将线性化CMD寻靶载体电穿孔到AB-1细胞中。电穿孔的细胞以1-2×106细胞/培养皿的密度在100mm培养皿中平板培养。24小时之后，G418(200微克/毫升的活性成分)和FIAU(5×10-7M)加到培养基中，并且让抗药性克隆生长8-9天。采取克隆，受胰蛋白酶作用，分成两部分，并且进一步扩增。然后将从各个克隆产生的细胞的一半冷冻，并且对另一半分析载体和靶序列之间的同源性重组。
通过Southern印迹杂交进行DNA分析。根据Laird等所述(Laird，P.W.等，(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)从克隆分离DNA。分离的基因组DNA用SpeI消化并且用915bp Sad片段，探针A(见图1)探测，它与mu内含子增强子和mu转换区之间的序列杂交。探针A检测来自野生型基因座的9.9kb SpeI片段，和来自与CMD寻靶载体(含有SpeI位点的neo表达盒)同源重组的mu基因座的诊断7.6kb带。Southern印迹分析筛选的1132 G418和FIAU抗性克隆中，3显示mu基因座同源重组的7.6kb SpeI带指征。这些3克隆进一步用酶BgII，BstXI，和EcoRI消化，证实该载体同源整合到mu基因中。当与探针A杂交时，用BgII，BstXI，或EcoRI消化的野生型DNA的Southern印迹分别产生15.7，7.3，和12.5kb的片段，而寻靶mu等位基因的存在分别由7.7，6.6，和14.3kb的片段指示。SpeI消化的所有的3阳性克隆显示有助于诊断的neo表达盒插入到Cmu1外显子中的预期的BgII，BstXI，和EcoRI限制片段。
带有突变mu基因的小鼠的产生：
三个靶向ES克隆，指定号264，272，和408，被解冻并且注射给C57BL/6J胚泡，如Bradley(Bradley，A.(1987)在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：a PracticalApproach.(E.J.Robertson，编著)Oxford：IRL Press，p.113-151)中描述的。将接受注射的胚泡转移给假妊娠雌性的子宫，产生带有来自输入的ES细胞和宿主胚泡产生的混合物的嵌合小鼠。ES细胞分布到嵌合体中的程度可以通过以C57BL/6J背景为黑色，从ES细胞系产生的刺鼠外表颜色的量目测估计。克隆272和408只产生低百分比嵌合体(即低百分比的刺鼠着色)，而克隆264产生高百分比雄性嵌合体。这些嵌合体与C57BL/6J雌性繁殖产生刺鼠后代，指示ES细胞基因组的种系传播。通过来自尾活组织检查的BgII消化DNA的Southern印迹分析进行对靶mu基因的筛选(如上文对ES细胞DNA的分析)。大约50％的刺鼠后代除了15.7kb野生型带之外表现出7.7kb杂交BgII带，证明靶mu基因的种系传播。
mu基因功能失活转基因小鼠的分析：
为了测定neo表达盒插入到Cmu1中是否使Ig重链基因失活，克隆264嵌合体与对于JHD突变是纯合的小鼠繁殖，作为JH基因片段缺失的结果，它使重链表达失活(Chen等，(1993)Immunol.5：647-656)。产生四个刺鼠后代。从1月龄的这些动物获得血清，并且通过ELISA分析鼠IgM的存在。四个后代中的两个完全缺失IgM(参见表1)。通过BgII消化和与探针A杂交(见图1)，和通过StuI消化和与475bp EcoRI/StuI片段杂交(ibid.)，通过来自尾活组织检查的DNA的Southern印迹分析确定基因型证明，不能表达血清IgM的动物是其中重链基因座中的一个等位基因带有JHD突变，另一个等位基因有Cmu1突变的那些。对于JHD突变是杂合的小鼠显示野生型血清Ig水平。这些数据证明Cmu1突变使mu基因的表达失活。
                 表1
小鼠  血清IgM(微克/毫升)  Ig H链基因型
 42  ＜0.002  CMD/JHD
 43  196  +/JHD
 44  ＜0.002  CMD/JHD
 45  174  +/JHD
 129×BL6F1  153  +/+
 JHD  ＜0.002  JHD/JHD
表1说明通过ELISA检测的对于带有CMD和JHD突变的小鼠(CMD/JHD)，对于就JHD突变是杂合的小鼠(+/JHD)，对于野生型(129Sv x C57BL/6J)F1小鼠(+/+)，和对于就JHD突变是纯合的B细胞缺陷小鼠(JHD/JHD)的血清IgM的水平。
实施例2用于抗-PSMA人抗体生产的HCO12转基因小鼠的产生
HCO12人重链转基因：
通过共同注射80kb的pHC2的插入物(Taylor等，1994，Int.Immunol.，6：579-591)和25kb的pVx6的插入物产生HCO12转基因。如下所述构建质粒pVx6。
将8.5kb HindIII/SalI DNA片段，包括种系人VH1-18(DP-14)基因和大约2.5kb的5′侧翼，和5kb的3′侧翼基因组序列，被亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)中，产生质粒p343.7.16。7kb BamHI/HindlII DNA片段，包括种系人VH5-51(DP-73)基因和大约5kb的5′侧翼，和1kb的3′侧翼基因组序列，被亚克隆到pBR322为基础的质粒克隆载体(Taylor等1992，Nucleic AcidsRes.20：6287-6295)中，产生质粒p251f。从pGP1f衍生的新的克隆载体，pGP1k，用EcoRV/BamHI消化，与包括种系人VH3-23(DP47)基因和大约4kb的5′侧翼和5kb的3′侧翼基因序序列的10kbEcoRV/BamHI DNA片段连接。得到的质粒，pi 12.2RR.7，用BamHI/SalI消化并且与p251f的7kb纯化的BamHI/SalI插入物连接。得到的质粒，pVx4，用XhoI消化并且与p343.7.16的8.5kbXhoI/SalI插入物连接。
以和另两个V基因相同的方面用VH1-18基因获得一个克隆。这个克隆，指定为pVx6，然后用NotI消化并且和纯化的26kb插入物共同连接(以1∶1摩尔比和pHC2的纯化的80kb NotI插入物一起)连接到半天(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎的原核中，如Hogan等(B.Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第二版，1994，冷泉港实验出版社，Plainview NY)。从发育自接受注射胚胎的小鼠建立含有来自Vx6和HC2的独立的转基因小鼠的三个独立的种系。这些种系指定为(HCO12)14881，(HCO12)15083，和(HCO12)15087。然后，三个种系的每一个与包括实施例1描述的包括CMD突变，JKD突变(Chen等1993，EMBO J.12：811-820)，和(KCo5)9272转基因(Fishwild等1996，Nature Biotechnology 14：845-851)的小鼠繁殖。在对于分布内源小鼠重链和κ轻链转基因是纯合的背景中，得到的小鼠表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
实施例3抗PSMA人单克隆抗体和双特异性的产生
抗原：以两种形式提供抗原(Northwest Biotherapeutics，Inc)：(1)细胞膜和(2)从LNCaP细胞(Cat#CRL-1740；美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)分离的纯化的蛋白质(PSMA)。使用纯化抗原(1.05mg/ml)，进行一次免疫和最后的尾静脉加强免疫。单克隆抗体7E11。C5从Cytogen，Inc，Princeton，NJ获得。
来自LNCaP细胞的溶解的PSMA和膜与完全或不完全弗氏佐剂(CFA和IFA)混合。用0.2cc制备的抗原对小鼠腹膜内腔注射。用无菌PBS中可溶性PSMA进行最后的尾静脉免疫。
转基因小鼠：在网笼中饲养小鼠并且在免疫，取血和融合的那天评价好的生理状态。(CMD)++；(HCo12)15087+；(JKD)++；(KCo5)9272+基因型的雄性小鼠ID#17018产生杂交瘤4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9。各个转基因命名在括号内，接着是随机整合转基因的数。符号++和+指示纯合或半合子；但是，因为利用对于随机整合的人Ig转基因不能区分杂合性和纯合性的PCR-为基础的测试常规筛选小鼠，可能对实际上对于这些要素是纯合的小鼠给与了+命名。
免疫程序：表2列出了免疫程序。在HCo7和HCo12基因型的一群10只小鼠中包括第112天融合的小鼠#17018。对腹膜内腔注射所有的免疫。融合之前3和2天，进行IV加强免疫。
                     表2
作用时间 免疫：佐剂，抗原 取血和效价*
第1天 CFA，膜
第13天 IFA，PSMA(～50μg)
第27天 IFA，膜
第38天 效价
第40天 IFA，PSMA(～50μg)
第48天 效价
第55天 IFA，PSMA(50μg)
第62天 效价
第70天 IFA，膜
第80天 效价
第84天 IFA，膜
第94天 效价
融合之前3天和2天IV加强免疫第112天进行融合
*有关效价，参见表3
杂交瘤制备：对于融合使用P3 X63 ag8.653骨髓瘤细胞系(ATCCCRL 1580，lot F-15183)。将原ATCC小瓶解冻并且在培养基中扩增。从扩增产物制备冷冻小瓶的原种。细胞在培养物中保持3-6个月，一周传代两次。P388D1(ATCC TIB-63FL)扩增到200mLs结束。上清液旋转离心并过滤并且用作杂交瘤的添加基质。当新的小瓶解冻时，这个细胞系传代3-6月。
高葡萄糖DMEM：
使用含有10％FBS和青霉素是-链霉素(Gibco，#11K1763)(Mediatech Cellgro，#1001233)培养P388D1细胞和骨髓瘤细胞。向杂交瘤生长培养基加入另外的培养基补充。
来自小鼠号#17018的脾大小正常并且得到1.78×108存活细胞。融合脾细胞。
融合之后7-10天进行对人IgG，κ抗体的最初的ELISA筛选。然后在可溶性PSMA包被ELISA板上筛选人IgG，κ阳性孔。然后将抗原阳性杂交瘤转移给24孔板，最后转移给组织培养瓶。通过限制稀释保证单克隆性，将PSMA特异性杂交瘤亚克隆。通过在DMEM，50％FBS加10％DMSO(Sigma，D2650)中冷冻细胞，在发育的几个阶段保存抗原阳性杂交瘤。
下面的表中给出小鼠#17018的效价。效价是Hu-抗原特异性-γ。反复免疫之后对抗原的应答表明强的应答水平，并且制备用于融合的小鼠。
         表3
    日期     效价
    第38天     100
    第48天     50
    第62天     50
    第80天     1600
    第94天     3200
融合产生38HU-γ，κ杂交瘤，将它用抗原再次筛选。用抗原筛选之后(以ELISA为基础)，鉴定5个抗原特异性杂交瘤。对抗原再次进行试验，对所有5个克隆证明对靶物4A3，7F12，8A11，8C12和16F9是阳性的。对这5个杂交瘤的上清液进一步评价。来自这5个克隆的抗体与LNCaP细胞上表达的PSMA的天然形式结合。所有5个抗体是γ1，κ基因型。
利用标准交联方法(图6)，通过二硫键，通过来自人抗-CD89抗体14A8或14A8抗体亚克隆的Fab′2片段，指定为14A8，和人抗-PSMA抗体，8C12，的化学偶联，制备指定为14A8×8C12的双特异性分子。
实施例4人抗-PSMA抗体的结合特征
固相ELISA研究：通过比较抗全长PSMA和细菌表达的含有PSMA蛋白质的融合部分的融合蛋白的反应性(固相ELISA)，研究抗-PSMA特异性抗体的结合特征。HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9与纯化的PSMA反应，但是与含有PSMA序列的部分的任何融合蛋白不反应(结果没有给出)。相反，HuMAb 11 C 10与全长PSMA和含有PSMA氨基酸1-173序列的融合蛋白强烈反应(图1)。对氨基酸134-437PSMA片段还发现11C10抗体的较低水平的结合。
使用来自LNCaP和PC3细胞的质膜级分，通过固相ELISA，还研究了人抗-PSMA特异性抗体的结合特征。在96-孔板上系列稀释膜级分并风干。平板用5％BSA封闭并且用PBS中5微克/毫升抗体处理1小时，然后利用标准ELISA方法检测。
图2中给出的结果表明，HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的结果证明在一定抗原浓度范围下对于LNCaP细胞膜的高特异性。在该背景上几乎没有或没有观察到抗PC3细胞膜的抗体结合。利用类似测试还测定了双特异性分子14A8×8C12与PSMA-表达LNCaP细胞和CD89-表达U937细胞结合的能力。双特异性分子以剂量依赖形式结合LNCaP和U937细胞。
天然PSMA和细胞表达PSMA融合蛋白质片段的ELISA结果表明，除了11 C 10，当以天然构象存在时，所有的HuMAbs对于PSMA是特异性的。为了正是这个发现，对与天然的和热变性PSMA结合的抗体测试测定蛋白质构象对结合特异性的重要性。图3给出使用天然的和热变性PSMA的固相ELISA结果。使用对于由从蛋白质的N-末端的头六个氨基酸组成的表位是特异性的鼠抗-PSMA单克隆抗体7E11作为阳性对照。结果表明热变性对7E11结合没有影响，与其识别线性序列表位相一致。与这些结果相反，抗体4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9都强烈结合天然纯化的PSMA。但是，PSMA的热变性事实上破坏抗体结合，表明天然蛋白质构象对于抗体结合是必须的。与该结果相一致，抗体4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9在蛋白质印迹分析中检测PSMA是无效的(结果没有给出)。
因此，HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9不识别线性氨基酸序列表位，取而代之的是结合蛋白质构象表位，即，当线性序列不同部分的氨基酸在三维空间上密切接近时产生的PSMA分子的构象折叠产生的天然蛋白质表位。这样的构象表位分布在质膜的胞外侧上。
PSMA从LNCaP细胞的免疫沉淀：
通过从LNCaP细胞的1％NP-40去污溶胞产物衍生的蛋白质的免疫沉淀来研究抗体4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的结合特异性。用抗体接着加入Protein G-Sepharose珠处理溶胞产物。将珠充分清洗并且将结合的免疫复合体进行SDS凝胶电泳，并且用鼠线性PSMA序列表位特异性抗体4D8进行蛋白质印迹。结果如图4所示。泳道1表明LNCaP细胞溶胞产物中存在的PSMA和PSM′(从N-末端缺失头57个氨基酸的另一种剪接变体)的蛋白质印迹反应性。泳道2表明同种型匹配(IgG1)不相关人抗体的免疫沉淀结果。泳道3至7表明分别使用抗体4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的免疫沉淀的结果。在各种情况下，发现强的泳带相应于PSMA和PSM′，表明这些抗体与蛋白质的胞外域中存在的蛋白质表位结合。
HuMAb与活LNCaP细胞上表达的PSMA结合：使用不相关人IgG1抗体作为对照物通过流式细胞仪研究抗体与活体或非活体(固定的)LNCaP细胞的结合。活细胞是碘化丙啶阴性细胞群。在一抗处理之前用PBS中1％多聚甲醛处理固定化细胞。发现抗体4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9对活细胞和固定化LNCaP细胞有强结合。使用PC3细胞或者当和LNCaP细胞使用同种型匹配不相关人抗体时观察到阴性染色。
通过比较，使用相同的活细胞和固定化细胞的制剂，使用鼠线性表位特异性抗体和不相关鼠抗体对照物得到的抗体结果证明，与活细胞的结合低得多。与固定化细胞的结合较高，但是，在任何条件下都没有线性表位可与使用不相关人IgG1抗体作为对照物发现的用构象HuMAbs观察的结合相比较。使用PSMA阴性PC3No细胞的实验中测定鼠或人构象或线性表位抗体的结合(结果没有给出)。
因此，HuMAbs表现出与LNCaP活细胞结合的强抗体，并且和与鼠构象抗体3C6结合的相关的表位结合。
抗体结合竞争的FACS分析：进行抗体结合竞争研究，确定每一种抗体是否与PSMA上相同或不同的表位结合。在这些实验中，首先用不相关人IgG1，或PSMA-特异性HuMAbs处理LNCaP细胞，充分洗涤，在流式细胞仪分析之前用FITC-标记的各HuMAbs进行标记。测定没有标记的HuMAbs阻断FITC-标记的HuMAb的结合的能力。使用用不相关人IgG1预先处理的细胞在各种情况下发现FITC-标记的抗体的强结合。相反，用抗-PSMA特异性HuMAbs预处理在各种情况下基本上抑制FITC-标记的抗体结合。总之，数据表明7F12和16F9的竞争结合行为与其他HuMAbs最相似。使用不同的抗体对可见结合抑制程度的微小变化。例如，8C12有效抑制4A3，8A11，和8C12结合，但是对7F12的作用小得多。总之，稍微不同，但是密切分布的构象表位被这些抗体识别。
使用鼠PSMA构象抗体的HuMAb结合竞争：
开发指定为1G9，3C6，和4D4的鼠PSMA-特异性抗体，它们还直接抗蛋白质构象表位。根据流式细胞仪测定，利用抗体1G9，3C6，和4D4的抗体竞争测定HuMAbs是否识别鼠抗体普遍识别的表位。测定没有标记的HuMAbs阻断FITC-标记的1G9，3C6，和4D4的结合的能力。用HuMAbs预处理LNCaP细胞，接着用FITC-鼠4D4和1 G9标记，表明几乎没有或没有显然的抑制作用的相似结果。相反，通过HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9观察到的FITC-3C6的显著抑制作用表明其分别与3C6识别的相似或紧密分布的表位结合。
构象HuMAbs对LNCaP细胞上PSMA的结合亲和性：
PSMA HuMAbs对于PSMA的天然构象是高度灵敏的。使用纯化的PSMA测定亲和常数的多种实验均不能提供可靠的或可重复的结果。进行实验，从LNCaP活细胞中表达的天然PSMA获得一些亲和性结合信息。为了测定每一种抗体对天然PSMA的结合亲和性，使用流式细胞仪分析，其中对于固定数目的有过量FITC-标记二抗的LNCaP细胞(1×106)改变一抗浓度。表4中的数据表明以细胞标记强度中最大半变化需要的抗体浓度表示的结果。这些结果证明使用抗体4A3，7F12，和16F9观察到最高结合亲和性。抗体8C12具有比高亲和性抗体低大约3-倍的结合亲和性，接着是结合亲和性低大约20倍的抗体8A11。
                  表4
    抗体     1/2最大变化需要的抗体(μ/ml)
    7F12     7
    4A3     9
    16F9     10
    8C12     28
    8A11     195
实施例5人抗-PSMA抗体和双特异性的ADCC和CDC活性
I.人抗-PSMA抗体的抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC) 活性：
在使用来自两个供者的PBMC的实验中，对上面实施例中描述的每一种构象抗体测定抗-PSMA HuMAbs介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。图5A和B中给出的结果表明对于每一种HuMAb的强的ADCC。每一种HuMAb具有相似的效价，并且具有与作为阳性对照物Herceptin相似的反应性(图5B)。对于任何HuMAb没有发现CDC反应性(没有给出数据)。
II.人抗-PSMA双特异性抗体的抗体依赖性细胞-介导的细胞毒 性(ADCC)活性：
对双特异性分子14A8×8C12(图6所示)和单克隆抗体8C12分析标记的PSMA-表达肿瘤的多形核细胞-介导的ADCC杀伤。
特别地，从健康供者分离单核细胞(单核细胞和嗜中性细胞)，以及全血，并且与51Cr标记的PSMA表达肿瘤细胞在双特异性分子14A8×8C12的存在下温育。大约4小时之后，收获各孔中的培养上清液，并且在γ计数器上测定51Cr释放。根据下面的式子测定特异性溶胞作用百分比：(实验CPM-靶渗漏CPM)/(去污溶解CPM-靶渗漏CPM)×100％。如图7A，8A和9A所示结果证明，与对照抗体相比，通过单核细胞和嗜中性细胞和全血，14A8×8C12介导肿瘤细胞的剂量依赖性溶胞作用。
在双特异性分子14A8×8C12或单克隆抗体8C12的存在下，单核细胞和全血还与51Cr标记的LNCaP肿瘤细胞温育(图7B，7C，8B和9B)。在37℃(5％CO2)下用100μCi的51Cr标记LNCaP细胞1小时，然后与单核细胞和全血，以及各种浓度的双特异性或单克隆抗体一起温育。温育16小时之后，收集上清液并且如上所述分析放射性。
单核细胞诱导的ADCC：
如图7A所示，双特异性分子14A8×8C12以剂量依赖方式介导表达PSMA肿瘤细胞的杀伤。加入50微克/毫升的14A8 Fab′2通过1微克/毫升的双特异性分子14A8×8C12完全阻断肿瘤细胞的ADCC，证明靶向细胞杀伤仅由效应细胞上的CD89介导。如图7B所示，双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12还介导通过LNCaP肿瘤细胞的单核细胞的剂量依赖性溶胞作用。此外，与H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比较，加入过量的14A8 F(ab)′2完全抑制通过双特异性分子14A8×8C12的肿瘤细胞的ADCC，表明靶向细胞杀伤通过CD89介导(参见图7C)。
嗜中性细胞诱导的ADCC：
如图8A所示，双特异性分子14A8×8C12以剂量依赖方式介导嗜中性细胞对表达PSMA肿瘤细胞的杀伤。加入25微克/毫升的14A8Fab′2显著阻断双特异性分子对于肿瘤细胞的ADCC，证明靶向细胞杀伤由CD89与效应细胞的结合特异介导。如图8B所示，双特异性分子14A8×8C12还介导通过LNCaP肿瘤细胞的嗜中性细胞的剂量依赖性溶胞作用。与H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比较，加入过量的14A8F(ab)′2完全抑制通过14A8×8C12的肿瘤细胞的ADCC，表明靶向细胞杀伤通过CD89介导。
全血诱导的ADCC：
如图9A所示，双特异性分子14A8×8C12以剂量依赖方式介导全血对表达PSMA肿瘤细胞的细胞杀伤。加入25微克/毫升的14A8Fab′2显著阻断双特异性分子对肿瘤细胞的ADCC，再次证明靶向细胞杀伤由CD89与效应细胞的结合特异介导。类似地，如图9B所示，双特异性分子14A8×8C12还介导通过LNCaP肿瘤细胞的全血的剂量依赖性溶胞作用。与H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比较，加入过量的14A8F(ab)′2完全抑制通过14A8×8C12的肿瘤细胞的ADCC，表明靶向细胞杀伤通过CD89介导。
III. 在人效应细胞的存在下人抗-PSMA抗体和双特异性抗体介导 表达PSMA的肿瘤细胞的吞噬作用和杀伤：对双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12测定它们单独的，以及在过量14A8(人抗-FcαR)Fab′2抗体或过量H22(人源化抗-FcγRI)Fab′2抗体作为对照物下，它们介导标记的PSMA-表达肿瘤细胞(LNCaP细胞)的吞噬作用。
简要地说，通过Munn等(1990)J.Exp.Med.172：231-237描述的方法的改进，检查巨噬细胞(MDM)衍生的单核细胞对LNCaP细胞的双特异性-介导的吞噬作用。在补加10％FBS和10ng/ml的M-CSF的巨噬细胞无血清培养基(Gibco，Grand Island，NY)中，从正常成年来源单核细胞leukopacs(ABI)纯化的单核细胞在24-孔板(1×106/ml)中分化7-12天。用亲脂性红色荧光染料PKH 26(Sigma，St.Louis，MO)标记LNCaP细胞。标记的LNCaP细胞加给没有或有双特异性抗体(或对照抗体)的含有MDM的孔，并且在37℃温育5-24小时(5％CO2)。用胰蛋白酶回收MDM和没有吞噬的LNCaP细胞，并且在冰上用FITC-标记的抗-CD33 mAb(251)和抗-CD14 mAb(AML-2-23)染色1小时(4℃)。将细胞清洗并且通过使用FACScan的双色荧光进行分析。根据双阳性靶细胞(被MDM消化)的数目除以靶细胞总数×100％来计算吞噬作用百分比。
如图10所示，双特异性分子14A8×8C12以剂量依赖方式介导肿瘤细胞的加强特异性吞噬作用。加入14A8 Fab′2显著阻断双特异性分子对肿瘤细胞的吞噬作用，再次证明靶向吞噬作用由CD89与效应细胞结合特异性介导。类似地，如图11所示，双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12也以剂量依赖方式介导LNCaP细胞的吞噬作用。图12证明，与H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比较，因为加入过量的14A8F(ab)′2抑制它，所以通过CD89介导14A8×8C12介导的LNCaP肿瘤细胞的吞噬作用。
上面的实施例证明以高亲和性与PSMA特异反应的人单克隆抗体和双特异性的产生。这些抗体和双特异性物质识别分子的胞外结构域中存在的天然构象蛋白质表位，而不是线性氨基酸序列确定的表位。另外，人抗-PSMA抗体和其双特异性分子在效应细胞的存在下介导细胞杀伤和吞噬作用，抗高水平表达PSMA的人肿瘤细胞。
实施例6125I-标记的人抗-PSMA抗体对裸鼠中LNCaP细胞肿瘤的生物学分布
通过下面的标记的抗体向正常和肿瘤组织中的时间-依赖性吸收测定带有LNCaP细胞肿瘤的裸鼠中125I-标记的HuMAb的生物学分布。从两个HuMAbs，4A3和7F12获得结果。最初以适当的抗体蛋白质的结合亲和性研究和有效性为基础使用抗体7F 12。但是，后来的实验证明7F 12的碘化事实上破坏该抗体结合抗原的能力。因此，只是对4A3获得有用数据。图13给出4A3的结果，并且表明标记的抗体最初主要在血液和高血管化组织中。这随着肿瘤吸收发生而减少并且在24小时之后与正常组织相比肿瘤标记最大(与正常组织相比标记大2-倍或更大)。因此，发生对肿瘤的有效生物学分布。随吸收之后的时间的肿瘤标记的程度可以，部分是，循环抗体和结合的抗体的抗体内化的减小水平与标记的抗体蛋白质片段的细胞的结果释放的函数。
实施例7LNCaP细胞对125I-标记的人抗-PSMA抗体的内化分析
通过分析释放到TCA可溶性125I计数的培养上清液中的时间依赖性释放监测125I-标记的HuMAb蛋白质的内化。LNCaP细胞，表面用碘化抗体标记，在37℃下温育并且去除培养上清液，TCA沉淀，并且在图14所示的时间测定上清液级分中存在的125I标记的量。结果表明碘化抗体4A3，16F9，和8A11在0时间有效标记LNCaP细胞。并且有效内化到细胞中，降解，并且蛋白质片段释放到培养上清液中。用这些抗体的每一种温育18小时之后，TCA可溶级分中回收大约50％的最初结合的抗体。
对于碘化HuMAbs 7F12和8C12获得不同的细胞结合和内化结果。特别地，使用碘化7F12和8C12抗体发现低得多的总LNCaP细胞标记表明碘化作用可能对标记的抗体结合抗原的能力有影响。为了分析该假设，使用固定化天然纯化LNCaP细胞PSMA和碘化HuMAb进行固相结合分析。图15所示结果证明阳性对照碘化4A3抗体与PSMA结合，并且还证明碘化作用破坏7F 12和8C 12结合抗原的能力。因此，使用125I-标记的7F12和8C12抗体不能对抗体7F12和8C12评价内化速度。
实施例8HuMAbs 4A3和7F12的DOTA标记对与PSMA结合的影响
对抗体进行DOTA-标记，并且通过ELISA分析对抗体结合抗原的作用。DOTA(四氮杂环十二烷四乙酸)是能用于络合放射性核素的常用螯合剂。图16的结果证明DOTA-标记的抗体保留高抗原结合能力，表明这些抗体在形成放射金属螯合物中是有用的。
实施例9通过免疫组织化学的人抗-PSMA抗体结合正常和恶性人组织的组织反应性
使用对于PSMA中存在的构象表位特异性的5种HuMAbs的结合免疫组织化学分析进行与正常和恶性人组织的冷冻切片的交叉反应筛选。来自各种组织类型的单一样品的结果证明与非前列腺恶性的或者正常组织的前列腺上皮和肿瘤血管内皮的强的结合。观察到前列腺癌中血管内皮没有染色。发现其他较弱的反应性，包括来自非肿瘤组织的腺上皮的不同的反应性，脑组织中的有效交叉反应性，肝中空肠淋巴细胞和星形细胞的染色。有一些问题涉及非前列腺染色结果，一些“正常”组织中的一些从表现出与肿瘤邻近或附近有强的肿瘤血管染色的相同的供者获得。淋巴细胞染色可能由于从原发肿瘤的抗原吸收。其他组织和要素对于这些抗体是阴性的。五种试验的HuMAbs之间通过IHC没有发现显著性差异。
实施例10结合亲和性
使用LNCaP细胞利用流式细胞仪测定抗-PSMA HuMAbs的结合亲和性，其中用一系列细胞试管稀释HuMAb。使用饱和量存在的FITC-标记的二抗检测结合的抗体的量。如下是根据1/2最大变化(用饱和HuMAb见到的变化)必须的抗体蛋白质的量分析的数据：
               表5
    抗体     1/2最大变化需要的抗体(μ/ml)
    7F12     7
    4A3     9
    16F9     10
    8C12     28
    8A11     195
对HuMAbs 4A3和7F12的进一步亲和性研究使用放射性标记的抗体(111In-DOTA-标记抗体)并且与固定数目的LNCaP细胞结合。利用得到的抗体结合数据进行Scatchard分析。两种抗体(4A3和7F12)的结果证明相似的亲和常数，KD＝0.5±0.1nM或10-10M)。
实施例11V区克隆
使用mRNA分离和cDNA合成试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)从抗-PSMA杂交瘤制备PolyA+mRNA和第一链cDNA。使用相应于人VH和VL(或VK)信号序列5′引物嵌段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增4A3，7F12和8C12 V区。使用与构架1中成熟V区序列的5′末端结合的引物扩增8A11和16F9 V区。3′VH和VKPCR引物分别含有下面的序列：TGCCAGGGGGAAGACCGATGG(SEQ ID NO：57)  和CGGGAAGATGAAGACAGATG(SEQ ID NO：58)。为了监测序列中潜在的PCR-引入的变化双份进行PCR，克隆和测序。
结论
上面的实施例证明对于人PSMA上的构象表位是特异性的五种全人单克隆抗体，和含有所述抗体的治疗性双特异性药物的产生。所有的五种抗体具有高抗原特异性，和与天然的，但是没有变性的PSMA的反应性。抗体有效地内化到PSMA表达细胞中，具有强的抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，对动物模型中PSMA表达肿瘤的生物学分布，并且在人组织的免疫-组织研究中实现相似性能。在人的免疫组织化学，进行免疫组织学研究的性能。
等同方案
本领域技术人员公认，或者确认至多使用常规实验，能获得这里描述的本发明的具体实施例的很多等同方案。这样的等同方案包括在下面的权利要求书中。
引入的参考文献
这里引用的所有的专利，审而未决的专利申请和其他公开文献全文引作参考。
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tgaagacctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taacccctct tattggtatt 300
tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a                     341
<210>8
<211>302
<212>DNA
<213>人
<400>8
tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagcgtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60
gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120
gatctatagt gcatccaatt tgcaacctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180
tgggacagat ttcactctca ctatcaacag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240
cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300
ac                                                                302
<210>9
<211>341
<212>DNA
<213>人
<400>9
agtctggagc agaactgaaa aagcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggttctg 60
gatacagttt taccaactac tggatcggct gggcgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg 120
agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagtccg tccttccaag 180
gccaggtcac catctctgcc gacaagtccg tcagcaccgc ctacctgcag tggaacagtc 240
tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taactcctct ttctggaact 300
tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a                     341
<210>10
<211>302
<212>DNA
<213>人
<400>10
tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60
gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120
gatgtatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180
tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240
cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300
ac                                                                302
<210>11
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Ala Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>12
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>12
Ala Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>13
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>14
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>14
Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys
 1               5                  10                  15
Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg
            20                  25                  30
Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly
        35                  40                  45
Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Phe
    50                  55                  60
Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Pro Ser
                85                  90                  95
Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>15
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>15
Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys
 1               5                  10                  15
Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Ala Arg
            20                  25                  30
Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly
        35                  40                  45
Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile
    50                  55                  60
Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Ser Ser
                85                  90                  95
Phe Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>16
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>17
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>18
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>18
Glu lle Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser ValSer Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>19
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>19
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys
 1               5                  10                  15
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
    50                  55                  60
Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
                85                  90                  95
Val Asp Ile Lys
            100
<210>20
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>20
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
 1               5                  10                  15
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
    50                  55                  60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
                85                  90                  95
Val Asp Ile Lys
            100
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>21
Ser Tyr Trp Ile Gly
 1               5
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>22
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>23
Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu
 1               5                  10
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>24
Ser Phe Trp Ile Gly
 1               5
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>25
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>26
Ala Asn Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu
 1               5
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>27
Ser Tyr Trp IIe Gly
 1               5
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>28
Ile lle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>29
Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
 1               5                  10
<210>30
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>30
Asn Tyr Trp Ile Gly
 1               5
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>31
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>32
Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
 1               5                  10
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>33
Asn Tyr Trp Ile Gly
 1               5
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>34
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>35
Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu
 1               5                  10
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>36
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
 1               5                  10
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>37
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
 1               5
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>38
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr
 1               5                  10
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>39
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
 1               5                  10
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>40
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
 1               5
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>41
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr
 1               5                  10
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>42
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
 1               5                  10
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>43
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
 1               5
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>44
Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met Tyr Thr
 1               5                  10
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>45
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
 1               5                  10
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>46
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
 1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>47
Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr
 1               5
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>48
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
 1               5                  10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>49
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
 1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr
 1               5
<210>51
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>52
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
                85                  90
<210>53
<211>103
<212>PRT
<213>人
<400>53
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100
<210>54
<211>343
<212>DNA
<213>人
<400>54
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gatactggta 300
cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc tca                   343
<210>55
<211>283
<212>DNA
<213>人
<400>55
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggc                   283
<210>56
<211>322
<212>DNA
<213>人
<400>56
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa ac                                          322
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人
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tgccaggggg aagaccgatg g                                           21
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<212>DNA
<213>人
<400>58
cgggaagatg aagacagatg                                             20

Claims (36)

1.一种分离的包括人重链可变区和人轻链可变区的人单克隆抗体，所述人重链可变区包括FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4序列，所述人轻链可变区包括FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4序列，其中：
(a)人重链可变区CDR3序列选自SEQ ID NOs：23，26，29，32，和35，及其保守性修饰；
(b)人轻链可变区CDR3序列选自SEQ ID NOs：38，41，44，47，和50，及其保守性修饰；
(c)人抗体以10-8M或更小的KD结合人PSMA；和
(d)在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定中，人抗体介导PSMA+肿瘤细胞的溶胞作用。
2.权利要求1的分离的人抗体，其中人重链可变区CDR2序列选自SEQ ID NOs：22，25，28，31，和34，及其保守性修饰；人轻链可变区CDR2序列选自SEQ ID NOs：37，40，43，46，和49，及其保守性修饰。
3.权利要求1或2的分离的人抗体，其中人重链可变区CDR1序列选自SEQ ID NOs：21，24，27，30，和33，及其保守性修饰；人轻链可变区CDR1序列选自SEQ ID NOs：36，39，42，45，和48，及其保守性修饰。
4.权利要求1-3任一项的分离的人抗体，其以10-9M或更小的KD结合人PSMA。
5.权利要求1-4任一项的分离的人抗体，其中人重链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列从人重链VH5-51种系序列衍生。
6.权利要求1-5任一项的分离的人抗体，其中人轻链可变区FR1，FR2，FR3和FR4序列从人轻链L6或04/014种系序列衍生。
7.一种分离的包括人重链可变区和人轻链可变区的人单克隆抗体，其中：
(a)人重链可变区包括选自SEQ ID NOs：11，12，13，14，15的氨基酸序列，和与SEQ ID NOs：11，12，13，14，和15至少80％同源的序列；
(b)人轻链可变区包括选自SEQ ID NOs：16，17，18，19，20的氨基酸序列，和与SEQ ID NOs：16，17，18，19，和20至少80％同源的序列；
(c)人抗体以10-8M或更小的KD结合人PSMA；和
(d)在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定中，人抗体介导PSMA+肿瘤细胞的溶胞作用。
8.权利要求7的分离的人抗体，其中抗体以10-9M或更小的KD结合人PSMA。
9.一种分离的包括从人重链VH5-51种系序列(SEQ ID NO：54)衍生的人重链可变区和从人轻链L6(SEQ ID NO：55)或04/014(SEQ IDNO：56)种系序列衍生的人轻链可变区的人单克隆抗体，其中：
(a)人重链可变区包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或者与SEQID NO：12至少80％同源的序列；
(b)人轻链可变区包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：17至少80％同源的序列；
(c)人抗体以10-9M或更小的KD结合人PSMA；和
(d)在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定中，人抗体介导PSMA+肿瘤细胞的溶胞作用。
10.一种分离的人单克隆抗体，包括分别包括SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16给出的氨基酸序列的人重链和人轻链可变区。
11.一种分离的人单克隆抗体，包括分别包括SEQ ID N0：12和SEQ ID NO：17给出的氨基酸序列的人重链和人轻链可变区。
12.一种分离的人单克隆抗体，包括分别包括SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：18给出的氨基酸序列的人重链和人轻链可变区。
13.一种分离的人单克隆抗体，包括分别包括SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19给出的氨基酸序列的人重链和人轻链可变区。
14.一种分离的人单克隆抗体，包括分别包括SEQ ID N0：15和SEQ ID NO：20给出的氨基酸序列的人重链和人轻链可变区。
15.一种分离的人单克隆抗体，其与前面权利要求任一项的人单克隆抗体竞争与PSMA的结合。
16.通过杂交瘤产生的前面权利要求任一项的分离的人单克隆抗体，其中从与无限增殖化细胞融合的、从具有包括人重链转基因或转染色体和人轻链转基因或转染色体的基因组的转基因非人动物获得的B细胞制备杂交瘤。
17.前面权利要求任一项的人抗体，其与选自膀胱，乳腺，结肠，肾，卵巢，前列腺，肾细胞，鳞状细胞，肺(非小细胞)和头颈肿瘤细胞的肿瘤细胞结合。
18.前面权利要求任一项的人抗体，包括人IgG重链和人κ轻链。
19.前面权利要求任一项的人抗体，包括IgG1或IgG3重链。
20.一种含有前面权利要求任一项的人抗体和药学可接受载体的药物组合物。
21.一种与治疗剂连接的前面权利要求任一项的人抗体的免疫偶联物。
22.权利要求21的免疫偶联物，其中所述治疗剂是一种细胞毒素。
23.权利要求21的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。
24.一种含有权利要求21-23任一项的免疫偶联物和药学可接受载体的药物组合物。
25.一种分离的编码前面权利要求任一项的人抗体的核酸分子。
26.权利要求25的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被插入到表达载体中。
27.包括权利要求25或26的分离的核酸的转染瘤。
28.一种表达前面权利要求任一项的人抗体的转基因非人动物，其中转基因非人动物具有包括人重链转基因或转染色体和人轻链转基因或转染色体的基因组。
29.一种抑制表达PSMA的细胞生长的方法，包括让细胞接触有效量的根据前面权利要求任一项的抗体，使得细胞生长被抑制。
30.一种治疗或预防特征在于表达PSMA的肿瘤细胞生长的疾病的方法，包括对受者施用有效治疗或预防该疾病的量的前面权利要求任一项的人抗体。
31.权利要求30的方法，其中所述疾病是癌症。
32.权利要求31的方法，其中所述癌症选自前列腺癌，结肠癌和肾癌。
33.权利要求31的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
34.权利要求29的方法，其中所述人抗体与一种治疗剂偶联。
35.权利要求34的方法，其中所述治疗剂是细胞毒素。
36.权利要求34的方法，其中所述治疗剂是放射性同位素。
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