WO2014198223A1

WO2014198223A1 - 一种抗前列腺特异性膜抗原(psma)的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: WO2014198223A1
Application number: PCT/CN2014/079710
Authority: WO
Inventors: 段小波
Original assignee: 广州康合生物科技有限公司
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2014-12-18
Also published as: CN103333249A

Abstract

本发明提供了一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体，其轻、重链的互补决定区（CDR）的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:3-8所示。该单克隆抗体能特异性结合活的肿瘤细胞表面胞膜外的PSMA抗原，并识别该抗原的一个保守决定簇，还能与降解的抗原片段结合。该单克隆抗体仅识别肿瘤组织和细胞，是理想的识别肿瘤特异标志物的抗体，在癌症诊断和治疗上具有应用前景。

Description

一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA) 的单克隆抗体及其应用技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA) 的单克隆抗体，及其在制备前列腺癌和其它 PSMA阳性肿瘤诊断和治疗药物中的应用。

背景技术

前列腺癌是当今严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，前列腺癌占全部男性癌症患者的 11%，占全部男性癌症死亡人数的 9%。根据世界卫生组织的数据，每年有近百万人被诊断为前列腺癌患者，死亡率仅次于肺癌占第二位。大约 20%临床诊断前列腺癌的患死于此病，当其发展至超过可切除范围时，多数患者出现症状吋 W部巳属晚期或 d 转移，目前没有治愈性的治疗方法，因此，前列腺癌的早期诊断和治疗仍然是目前有待攻克的医学难题。

前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA) 是一种较前列腺特异性抗原（PSA) 更加敏感和特异的前列腺癌（PCa) 肿瘤标记物。 PSMA 冈位十 -11号染色体的短 ^;上（O'Keefe DS et al ， 1998)，所:仃|¾'列腺组织都表达 PSMA (Silver DA， 1997)。在正常的前列腺 I：皮细胞， PSMA主要表达成一种称为 PSM的细胞质 ift A (Su L, 1995)。在前列腺癌中， PSMA mRNA的不 M剪接致. 达成为一种含有 750 个氨基酸的 II型跨膜糖蛋白 (Israeli RS et al, 1993; Schmittgen TD et al 2003; Ghosh A et al 2004)。它也是一个球形大分子金属肽酶，分子量为 100Kda，是 zn依赖的外肽酶超家族成员之一（Carter RE, 1996; Pinto JT et al 1996)。 PSMA特异的表达于前列腺上皮，在前列腺外组织只有少量表达。在正常前列腺分泌上皮中表达呈异质性或低表达。随病情进展， PSMA的:衣达增《，在转移性和激素难治性肿瘤 ¹1¹的表达丄¾卨 (Kawakami M et al 1993; Israeli RS et al, 1994; Sweat SD et al, 1998; Wright GL et al, 1996; Burger MJ et al 2002; Ross JS et al 2003)。 PSMA在前列腺癌组织和多种实体瘤新形成的血管中会过度表达，而不表达于正常组织中的血管，是一种比较特异的肿瘤新生血管内皮细胞标记物。 PSMA水平在 i 列腺癌患者血洁中也升 W(Horoszewicz JS et al 1987; Holmes EH et al 1996; Troyer JK, 1995; SokoloffRL, 2000)。 PSMA在区分前列腺癌和其它类型恶性肿瘤的敏感度和特异性分别是 65.9%和 94.5 %，所以 PSMA仍然是前列腺癌细胞上一个相当敏感的、高度特异性的抗原物质。 PSMA在抗雄激素的状态下的前列腺癌细胞上表达还会上调，其表达水平可能与前列腺癌不良的临床后果一致。如今，靶向制剂已成为制剂行业的潮流。 PSMA可以作为免疫治疗的有用靶标分子，因为它符合以下标准：（1 ) 表达主要局限于前列腺；（2) PSMA是在疾病的所有阶段都大量表达的蛋白质；（3 ) 它位于细胞表面，但不会脱落进入循环；（4) 表达与酶活性或信号传导活性相关。 PSMA的肿瘤 Π关的血管内皮细胞的表达的特异性、在前列腺癌及其转移灶增高，使其成为具有较高前列腺组织器官特异性的新型肿瘤标志物，是前列腺基因治疗的理想靶标，已成为前列腺癌的研究热点，尤其以它为目标靶向治疗前列腺癌和其它癌症给人们带来很大的希望 (Schiilke N et al 2003)。

PSMA分为三个部分：胞内部分 (氨基酸序列 1一 18)，跨膜部分 (19_143)，胞外区域 (44一 750)。由于 PSMA的靶向特异性，使其成为开发前列腺癌的诊断和治疗应用中的单克隆抗体（mAb)的重要抗原。 PSMA最初是被单抗 7E11、C5识别并定义的（Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; U.S. Pat. No. 5,162,504).。 ^mIn—标记的单抗 7E11已获美国 FDA批准，用于检测软组织中转移性前列腺癌，在市场上的商品名为 ProstaScint™ (Cytogen, Philadelphia, PA；)。但是，因为单抗 7E11只识别 PSMA细胞内的抗原决定基 (Troyer JK et al, 1995), 也就是说只有在肿瘤细胞死亡、细胞膜破裂、细胞质 PSMA暴露出来后，此类抗体才能与之结合。此类抗体无法结合活的细胞，使它们作为肿瘤治疗和诊断的价值大打折扣。也巳发现， ProstaScint 的确在确) ii软組织血管转移病灶的敏感性往往比确: ί骨病灶的敏感性 ft许多倍（Rosenthal SAet al 2001)。因此，目前的研究集中在研发针对 PSMA分子胞外区域更易接近肿瘤、副作用更少、清除率更快的治疗性抗体。目前与 PSMA结合的人或人源化抗体已有报道（Yao.D等人

(2002) Semin.Urol.Oncol.20:211-218;专利： WO 02/098897 WO 01/034903、 WO 03/064606), 这些抗体已经用于对前列腺癌细胞成像（Yao.D等人（2002) Semin.Urol. Oncol.20 :211-218； Bander N.H.等人（2003 ) J.Urol. l70: 1717-1721 )。抗 -PSMA抗体也已经在前列腺癌治疗中用于治疗性干预，一般与化疗剂或放射性同位素联合使用。利用单克隆抗体结合放射性药物靶向 PSMA胞外区域，以细胞毒素为基础的针对 PSMA的免疫疗法等都已得到深入研究。证明它对前列腺癌动物模型显示了有效的抗癌效应。这些抗 PSMA抗休在休外使 LNCaP细胞的球粒减小， 1 J以诱导表达 PSMA的细胞凋亡， ^剂 M放射性标记的 PSMA特^性 ^克隆抗体能够使异种移植荷瘤小鼠的肿瘤休积平均减少 15-90%，并且这个剂量对动物没有产生毒性；单克隆抗体一 auristatin (来源于海洋生物的环肽衍生物)结合物在体外和体内的雄性激素非依赖的前列腺癌模型上都有有效的和选择性的抗肿瘤活性（Lopes AD et al 1990; McDevitt MR et al 2000; Ballangmd AM et al, 2001; Smith-Jones PM et al, 2003; Bander H et al, 2003;

Vallabhajosula S et al, 2004; Fracasso G et al, 2002)。同时，这 *抗休可以使 PSMA能快速地内陷，这不仅可以促进抗体依赖免疫细胞 ADCs进入肿瘤内部， lilj且使抗体一药物结合物更容易进入细胞内部。然而，与许多抗肿瘤抗休药物- t-, 所这 PSMA抗休，由 Τ其 k人的分 T' (> 150kDa), 将面临难以渗透到固体肿瘤。为了解决这个问题，已有研究选择性地结合到 i 列腺特异性膜抗原的多肽和核酸迠休等较小的配休（<15 kDa的）的报逍（Aggarwal S et al, 2006; Lupoid SE et al, 2002)„ fl ，迄今为止这些 ft!体还没有已被证明 nj以作为试剂或药物来提 M iW列腺癌的诊断和治疗效力。因为，这 *小配休临人源化、休内快速被沽除和易 T 产生耐药性等凼难，使它们难于开发成为真 ιΗ意义 I：的治疗药物。

本发明应用完整 LNcaP肿瘤细胞免疫小鼠，通过应用细胞膜蛋白特异单抗的细胞 ELISA

(cELISA) 和蛋白质组学分析，筛选制备了可一株识别 PSMA胞外的抗原决定基，且可以结合有表达 PSMA的活细胞的单克隆抗体。此抗体高度特异，它识别 PSMA的一个高度稳定的抗原决定簇，只结合 PSMA阳性细胞。它具有可以选择性地靶向非前列腺实体瘤新生的血管，用于影像学诊断和生物靶向治疗，放射性同位素标记的能精确定位前列腺癌的骨和软组织转移灶和做为载体制备的肿瘤特异性抗体药物的广阔应用前景。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗前列腺特异性膜抗原（PSMA) 的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体的编码基因。

本发明的另一个目的是提供含有上述单克隆抗体的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体在制备前列腺癌或 /和其它 PSMA 阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于，所述轻链可变区的 3个互补决定区 (CDR) 的氨基酸序列为：一

CDR1：如 SEQ ID NO:3所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如 SEQ ID N0 5所示；

所述重链可变区的 3个互补决定区（CDR) 的氨基酸序列为：

CDR1：如 SEQ ID NO:6所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如 SEQ ID NO:8所示。

所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID ΝΟ: 1 所示，所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。所述的单克隆抗体在制备前列腺癌或 /和其它 PSMA 阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

编码上述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列的基因。

编码上述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列的基因。

编码上述单克隆抗体的基因。

含有编码上述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列 /重链可变区氨基酸序列 /单克隆抗体氨基酸序列的基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系，转基因动植物或重组病毒和细菌。

分泌上述单克隆抗体的细胞系。

所述的基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、细胞系在制备前列腺癌或 / 和其它 PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

具体技术手段包括：

1. 制备 LNcaP细胞特异性单克隆抗体：体外培养获得前列腺癌 LNcaP肿瘤细胞，体外固定灭活后，免疫 Balb/c 小鼠；应用 LNcaP肿瘤细胞单层固定的 96孔细胞培养板，建立特异细胞 ELISA (cELISA) 测定免疫小鼠的特异性抗体应答；数次强化免疫后，取高效价抗体应答小鼠的脾脏，分离脾脏淋巴细胞，在体外与小鼠骨髓瘤细胞系 NSO-1融合制备杂交瘤细胞；以前列腺癌肿瘤细胞 PC3, DU145 和 BPH-1为阴性对照，应用 LNcaP特异细胞 ELISA

(cELISA)筛选出 LNcaP特异阳性细胞株；通过线性稀释法获得稳定的杂交瘤细胞系；体外培养制备特异性单克隆抗体；在体外通过流式细胞仪、 ELISA、免疫印迹和免疫沉淀等实验测定这些单克隆抗体与各种人正常细胞和肿瘤细胞的反应性，筛选出 LNcaP细胞特异单克隆抗体；鉴定特异单克隆抗体的型和亚型。

2. 鉴定 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的靶标分子：生物素化标记 LNcaP细胞膜蛋白；应用 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体做免疫沉淀，通过 SDS-PAGE电泳和免疫印迹确定靶标膜蛋白的分子量;体外裂解 LNcaP细胞，应用 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体做免疫沉淀，在体外俘获靶标膜蛋白分子；从抗体-靶标膜蛋白分子复合物 SDS-PAGE 电泳后的凝胶上切取靶标膜蛋白，酶切消化后，在 MASCOT™ LC-MSMS 分析获得靶标膜蛋白多. tt，通过蛋 ΰ质组学分析确定靶标膜蛋白分子。

3. LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的特异性和在诊断前列腺癌上的应用：体外培养纯化制备特异性单克隆抗体。合成 PSMA基因 cDNA，克隆到表达载体，制备 PSMA重组蛋白，通过 SDS-PAGE电泳和免疫印迹实验测定 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体与 PSMA的反应性。以同一亚型的小鼠抗体做对照，用此单克隆抗体在前列腺癌细胞和肿瘤组织切片做免疫组化测定其特异性；用生物素和荧光素标记 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体，测定其与活细胞的反应性。从分泌 LNcaP细胞膜特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系提前总 rnRNA, 通过 RT-PCR扩增编码 IgG的特异性抗体 mRNA基因，测定其可变区的重链和轻链的基因序列，确定编码抗体 CDRs的氨基酸序列。

基于上述抗前列腺特异性膜抗原（PSMA) 的单克隆抗体的氨基酸序列和其编码基因序列，可构建重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因动植物或重组蛋白、病毒和细菌等生物制品，用于生产基因工程抗体和制备各种药物、同位素、纳米颗粒、毒素和酶等具有诊断和治疗意义的靶向聚合物。

本发明的有益效果在于：

本发明的抗 PSMA特异单克隆抗体是一株具有高特异性和亲和力的单克隆抗体。与其它 PSMA单克隆抗体的制备方法不同，这株单抗是以完整肿瘤细胞作为抗原制备的，使其具备识别结合体内具有天然构象的 PSMA抗原的能力。实验表明，它不仅能特异性的结合活的肿瘤细胞表面胞膜外的 PSMA抗原，而且还能识别 PSMA分子上一个稳定保守的抗原决定族，使其还能够与降解的 PSMA蛋白片段结合；通过现有抗体基因数据库的对比发现，此抗体具有独特的抗原结合位点 (CDRs)和构象；它具有高度的肿瘤特异性：它只识别肿瘤组织和细胞，而与正常人体组织细胞没有反应。因此，它是一个理想的识别肿瘤特异标志物的单克隆抗体，在癌症治疗和诊断上都具有广泛的重要应用前景：它不仅可以作为特异的 PSMA抗体试剂，用于检查 PSMA抗原的各种免疫学诊断、免疫组化病理诊断、体内外肿瘤细胞靶向诊断和捕获肿瘤干细胞等外，它还可以通过人缘化改造，赋予其具有直接启动生长抑制信号或诱导凋亡或间接激活宿主防御机制发挥抗肿瘤的活性；通过作为肿瘤特异靶向载体，与放射性核素、药物和毒素偶联制备抗肿瘤单克隆抗体免疫偶联物，如放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素等用于癌症治疗。

附图说明

图 1为重组 PSMA蛋 tl的表达制备（A: 重组 PSMA蛋白在大肠杆菌的表达，其中， M: 蛋白分子量标志， 1 : 大肠杆菌细胞裂解液， 2-4: 镍柱亲和层析纯化的重组 PSMA蛋白洗脱液， 5 : 镍柱亲和层析过滤液； B : 重组 PSMA蛋白在 HEK293的表达，其中， M: 蛋白分子量标志， 1-3: 镍柱亲和层析纯化的重组 PSMA蛋白洗脱液）。

图 2为 SDS-PAGE 电泳分析特异单克隆抗体 mAb L-186经 Protein G亲和层析纯化后的纯度（M: 蛋白分子量标志物； 1-2: 特异单克隆抗体 mAb L-186; 3-4：和小鼠 IgG对照）。

图 3为 mAb L-186杂交瘤细胞上清液对 LNCaP细胞全细胞裂解液的蛋白质印迹分析（ 1 : 分子量标志物， 2-13依次为： DU145细胞， PC3细胞， He3907细胞， OKAR5细胞， A2780 细胞， SKOV4细胞， OVAR3细胞， MCF7细胞， 518A2细胞， colo320细胞, SW480细胞, MDA 细胞, HT29细胞的全细胞裂解液， 14为 LNCaP细胞全细胞裂解液）。

图 4为纯化的特异单克隆抗休 mAb L-186从含 ·Υ.牛物素标 id胶蛋 0的 LNCaP细胞裂解液屮免疫沉淀一个 110 kDa蛋 -l。

图 5为单克降抗休 mAb L-186从 LNCaP细胞裂解液中免疫沉淀特异蛋 0质的质 iff分析。图 6为 Western blot分析特异 ^克隆抗体 mAb L-186 ¾ L PSMA ifi 的反应性（ 1：特异单克隆抗体检测 PSMA LNCaP细胞裂解液； 2: 重组 PSMA蛋白； 3 : 抗 His标签抗体检测重组 PSMA蛋白）。

图 7为不同浓度单克隆抗体 mAb L-186与 |¾'列腺癌 LNCaP细胞和 PC细胞的流式细胞仪分析。

图 8为荧光标 d的単克隆抗休 mAb L-186与 |¾'列腺癌 LNCaP细胞和 PC细胞的反应性。图 9为特异克隆抗体 mAb L-186染色 PSMA阳性的 LNCaP细胞。

具体難方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下步骤所用到的试剂、质粒及菌株：限制性内切酶、 PfU DNA多聚酶、 T4 DNA连接酶购自 Promega; Exp Taq DNA聚合酶、 DNA maker购自 Takara; pET-22b ( + ) 载体、大肠杆菌 Rosetta (DE3 ) 购自 Novagen; E.coli DH5 α、 Ni-NTA Agarose试剂盒购自 Invitrogen; 不完全 DMEM培养基购自赛默飞；辣根过氧化物酶（HRP )标记的羊抗鼠抗体购自博士德； TMB购自 eBioscience 公司；骨髓瘤细胞 NSO- 1 购自 ATCC;其它所用试剂盒为常规市售产

P 人前列腺癌细胞 LNcaP购自购自美国 ATCC公司（LNCaP clone FGC, ATCC编号

CRL-1740 ) 。实验动物： BALB/c 雌鼠购自美 |κ| Charles River公司，体重 20g左右， 8周龄。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括 PCR扩增、质粒提取、质粒转化、 DNA 片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》（第三版）（Sambrook J, Russell DW， Janssen K, Argentine J. 黄培堂等译， 2002, 北京：科学出版社），或按照制造厂商所建议的条件进行。

1. PSMA抗原制备

1.1 PSMA cDNA 扩增及重组表达载体 pDEST17-PSMA 和高效瞬时表达载体 pTT5-PSMA的构建

人前列腺癌细胞 LNcaP 购自购自美国 ATCC 公司（ LNCaP clone FGC， ATCC 编号 CRL-1740 )， RNA的分离及 cDNA的合成均按试剂盒操作指南进行。根据 GenBank上公布的人 PSMA 序列（ GenBank 登录号为： NM_001193471.1 ) 设计引物： PL5'-CACCAAATCCTCCAATGAAGCTACTAAC- ( SEQ ID NO :9 ) ， P2: 5"-TTAGGCTACTTCACTCAAAGTCTCTG-3 ' ( SEQ ID NO: 10) (引物中引入 6个氨基酸的 His标签)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成。取反转录 cDNA链为模板进行 PCR, 一个 2, 136 碱基的 PCR产物和经凝胶电泳纯化后，克隆到 pENTR/D-TOPO 载体 (Invitrogen), 再穿梭克隆到表达载体 pDEST17 禾 P pTT5,得到重组表达载体 pDEST17-PSMA 和 pTT5-PSMA。分别转入大肠杆菌 DH5 α感受态细胞中。筛选阳性克隆进行 DNA测序鉴定，测序结果表明重组表达载体 pDEST17-PSMA和 pTT5-PSMA构建成功。

1.2 重组 PSMA蛋白在大肠杆菌的诱导表达

将 pDEST17-PSMA转入大肠杆菌 Rosetta (DE3 ) 感受态细胞中，挑选单克隆菌落接种于含有 50 ^glmL氨苄青霉素和 34 g/mL氯霉素的 LB培养基中，置于 37°C摇床中，200 r/min 培养至 OD_6QQnm=0.6〜0.8时，加入 ImM IPTG, 继续培养 4〜6小时诱导蛋白表达。

1.3 PSMA重组蛋白在人胚胎肾细胞 HEK293EBNA高效瞬时表达：

将 HEK-293 EBNA1 细胞以 3 x l0⁵个 /ml的密度接种于 Ex-Cell 293培养基中，放置于 lOOrpm摇瓶或 75rpm转瓶中在 37°C、 5%C02的环境下培养 3天，当细胞密度增为 1.5~2x l0⁶ 个 /ml，细胞活力大于 95%的情况下进行后续的转染工作。在无菌环境下取出所有细胞液，以 lOOOrpm的转速离心 5min，弃去所有培养上清并用新鲜的 Ex-Cell 293培养基重悬细胞沉淀，同时调整细胞密度为 20X 10⁶个 /ml，将高密度的细胞悬液置于摇瓶中保持低速振荡状态以免细胞抱团。缓慢向细胞液中滴加待转质粒 pTT5-PSMA，用量为 50μ_§/ιη1_; 质粒滴加完毕后，同样缓慢滴加 ΡΕΙ，用量为 100μ_§/ιη1，将高浓度的转染细胞液置于摇瓶或转瓶中振荡孵育 4h。孵育完毕后，使用 Ex-Cell 293培养基稀释转染细胞的密度至 l x lO⁶个 /ml，再加入 1%的 Pluronic F68完成整个转染过程。将细胞悬液置于 37°C、 5% C0₂摇瓶或转瓶的环境中培养 5天即可收液。 8000rpm离心 30分钟除去细胞核及细胞及碎片，置于 4°C保存过夜，次日用镍柱亲和层析纯化。

1.4 重组 PSMA蛋白的纯化

4°C、 8000 rpm离心 5 min, 弃上清，用高压灭菌的 PBS洗涤菌体，重复一次。菌体用 1/20菌液体积的 PBS重悬，置冰上进行超声波破碎（功率 400 W，工作 5 s，间隔 10 s) 80 次。超声后的悬液 4°C、 8000 rpm离心 5 min, 分别收集上清和沉淀，作 SDS-PAGE电泳分析，观察目的蛋白在上清和沉淀中的含量，以此判定该蛋白以可溶形式还是包涵体形式表达。本发明表达的蛋白是以包涵体形式存在。取沉淀用包涵体洗涤缓冲液（50mM Tris、 lOOmM NaCK 2M尿素、 ImM二硫苏糖醇 pH8.5 ) 洗涤 3次，每次 4°C、 6000g 离心 10 分钟，弃上清。包涵体沉淀用包涵体裂解液（50mM Tris、 lOOmM NaCK 8M尿素、 ImM二硫苏糖醇 pH8.5 ) 溶解，室温搅拌 1 小时。 4°C、 12000g 离心 10 分钟，取上清，以 1 ： 500 比例缓慢加入到复性缓冲液（50mM Tris、 lOOmM NaCK 0.5M L-精氨酸、 3mM还原型谷胱甘肽、 0.3mM氧化性谷胱甘肽 pH 9.5 )中， 4°C静置 48小时，复性蛋白用 Millpore 公司的 LabScale TEF system -100 kDa浓缩膜进行浓缩，蛋白浓缩液在透析缓冲液（50mM Tris、 lOOmM NaCl pH9.0) 中透析过夜。

用镍柱亲和层析（Ni-NTA Agarose试剂盒）纯化大肠杆菌表达浓缩后的复性蛋白和人胚胎肾细胞 HEK293EBNA高效瞬时表达的重组 PSMA蛋白，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，在咪唑洗脱目洗脱液中得到纯度较高复性效果较好的 PSMA蛋白洗脱液。将含有目的蛋白的洗脱液用 Millipore浓缩管进行浓缩和 Bio-Rad 蛋白定量试剂盒进行定量，最后可以得到纯度大于 85%、浓度为 1 mg/mL的 PSMA重组蛋白。如图 1重组 PSMA蛋白的表达所示。

2. 抗人 PSMA蛋白单克隆抗体的制备 2.1 小鼠免疫及脾细胞的制备

培养的 LNCaP 细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次后，用预冷的含 4% 多聚甲醛 (Paraformaldehyde PFA) PBS室温固定 10分钟，经预冷的 PBS漂洗 2 次。将固定的 LNCaP 细胞稀释到终浓度为 1X10⁷ 细胞每毫升。 0.5ml 细胞与等体积完全弗氏佐剂混合，充分混匀形成油包水状，取 8-10周龄的 BALB/c 雌鼠进行初次免疫，每只小鼠腹腔和皮下各注射 lOOuL 以后间隔 2周免疫一次，使用相同剂量固定的 LNCaP细胞与等体积不完全弗氏佐剂混合。免疫 5次后， LNCaP细胞 ELIS A检测小鼠血清效价不低于 1 : 100,000时，小鼠腹腔注射 2X10⁶ LNCaP细胞，三天后取小鼠脾细胞。

脾细胞的制备方法：将上述免疫后的 BALB/c小鼠眼眶采血后脱白处死，无菌取脾脏，过 200目细胞筛，收集脾细胞悬液，冰浴中放置 10 min后弃沉降物， 4°C， 750g 离心 10 分钟，收集细胞，加入 1 mL红细胞裂解液（0.155M H₄C1， 10mM KHCO₃， 0.1mM Na₂EDTA pH7.4)作用 5 分钟，加入 20 mL不完全 DMEM培养基中止反应。 4°C , 750g 离心 10 分钟，弃上清，细胞沉淀用 20 mL不完全 DMEM培养基洗涤 2 次，每次 4°C， 750g 离心 10 分钟。弃上清，细胞沉淀用不完全 DMEM培养基重悬。

LNCaP细胞 ELISA检测抗体效价的方法：在 96孔细胞培养板上培养的 LNCaP细胞形成 90%的单层后，吸掉细胞培养液；每孔加 200ul预冷的 PBS轻轻漂洗 2 次后，每孔加 lOOul预冷的含 4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA) PBS室温固定 10分钟，用 PBST ( 0.05% Tween20-PBS, pH 7.4) 清洗 3 遍， 1%BSA封闭， 37°C 孵育 2 小时。 PBST 清洗 3遍，加入待测 4倍比稀释的小鼠血清（实验组），设置 6-7 个梯度，未免疫小鼠做阴性对照， ΙΟΟμΙ 每孔， 37°C孵育 1 小时。 PBST 清洗 3 遍，每孔加入 100 辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗鼠抗体 C1 : 10000 稀释)， 37°C孵育 1小时。 PBST 清洗 3 遍后加入 TMB底物， 100 每孔，避光显色 10-15 分钟，加入终止液（1M HC1) ΙΟΟ μί每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长 450nm 的吸光值（OD₄₅。）及 630nm 的吸光值 (OD₆₃。)，计算 ΔΟΟ450 =

OD450-OD630。与 PBS 孔相比，实验组 AOD450 与阴性对照组 AOD450 的比值大于 5倍的为阳性。

2.2 饲养细胞的制备

在细胞融合的前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞。将 8 周 BALB/c小鼠脱臼处死，无菌操作下，剪开腹部，吸取 5mL DMEM不完全培养基注入腹腔，反复冲洗腹腔，吸回冲洗液并用 DMEM不完全培养基洗涤 2 次，每次 4。C 300g 离心 10 分钟，收集细胞用含 10%小牛血清的 DMEM完全培养基重悬细胞，使浓度为 2x l0⁵/mL，加入 96 孔板中，每孔 100ul， 37°C , 5% C0₂ 条件下培养。

2.3 骨髓瘤细胞 NSO-1的培养

复苏骨髓瘤细胞 NSO-1 ,用 8-氮鸟嘌吟筛选 HGPRT 缺陷株，细胞融合时细胞要处于对数生长期，融合前用不完全的 DMEM培养基洗涤，每次 4。C 300g 离心 10 分钟，收集细胞并用不完全的 DMEM培养基重悬。

2.4 细胞融合剂杂交瘤细胞的制备

取制备好的免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞 NSO-1 于离心管中，分别取 10⁸和 2.5x l0⁷，用不完全的 DMEM培养基洗涤一次。离心后弃上清，轻轻弹散细胞，加入 0.7 mL 40°C的 PEG (分子量 1500 ) 溶液， PEG的终浓度为 50% (W/V), 60 秒之后开始加入 40°C预热的不完全 DMEM培养基（5分钟加完），首先加 1 mL, 1 分钟后加 4 mL,二分钟后加入 20 mL。 4°C 300g 离心 10 分钟收集细胞，用 2XHAT 培养基轻轻悬起细胞，使浓度为 2x l0⁶/mL。 100 每孔加到含饲养细胞的 96 孔板中，继续培养。每两天吸出上清 100 μί，加入等体积的 HAT 培养基 (20% FCS 10mM sodium hypoxanthine 40mM aminopterin 1.6mM thymidine 的 DMEM培养基)。一周后，用 HT培养基（包含 20% FCS、 10mM sodiumhypoxanthine 1.6mM thymidine 的 DMEM 培养基）培养 2-3 周。当观察到杂交瘤细胞克隆长出时，用含 20%小牛血清的 DMEM培养基培养，并用 LNCaP 细胞 ELISA法检测是否有抗体分泌。接着用有限稀释法筛选阳性克隆，多次筛选后获得杂交瘤细胞株。连续体外培养 2个月以上或者冻存 6个月之后，细胞株仍能稳定和大量分泌抗人 PSMA蛋白抗体，从而获取杂交瘤细胞株命名为 mAb L-186。

2.5 单克隆抗体的制备

单克隆抗体的大量制备一般有两种方法，方法一，增殖培养法，杂交瘤细胞体外低血清培养 2-3 天后大量收培养上清，上清中含有较高浓度的单克隆抗体。方法二，小鼠腹腔接种法，首先 500 无菌的液体石蜡通过腹腔免疫 8-10 周龄的 BALB/C 鼠，一周之后腹腔注射 l x lO⁶ 杂交瘤细胞， 7-10 天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体，用 Protein G亲和层析方法纯化并进行 SDS-PAGE 鉴定抗体纯度，如图 2所示。经过纯化的单克隆抗体纯度高于^ %，抗体的重链约为^ kDa，轻链约为 21kDa。用小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体 mAb L-186 亚型为 IgGl，轻链类型为 κ链。

3. 单克隆抗体 mAbL-186靶标分子的鉴定_∑

3.1. 单克隆抗体 mAbL-186与肿瘤细胞的反应性

应用细胞 ELISA法，对单克隆抗体 mAbL-186与在 96孔细胞培养板上培养的 LNCaP细胞和其它 33 肿瘤细胞以及人和动物细胞系的反应性进行了检测。这些细胞包括：前列腺癌细胞系 (PC3， DU145和 BPH-1),卵巢癌细胞系 (He3907， OKAR5 , A2780, SKOV4和 OVAR3), 乳腺癌细胞系 (MCF7),皮肤癌细胞系（518A2, FBI),结肠癌细胞系（colo320， SW480, MDA， CAC02, RKO和 HT29)，肺癌细胞系（A549)，膀胱癌细胞系（SW780, UMUC, J82, RT4), 人骨细胞系（MG92) , 猴子细胞系（COS-1) , 仓鼠细胞系（BHK21 , G9) 和小鼠细胞系 (OSE1.2.2, Shinoqi)。在 96孔细胞培养板上培养这些细胞，当细胞形成 80-90%的单层后，吸掉细胞培养液；每孔加 200ul预冷的 PBS轻轻漂洗 2 次后，每孔加 lOOul预冷的含 4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA) PBS室温固定 10分钟，用 PBST ( 0.05% Tween20-PBS, pH 7.4) 清洗 3 遍， 1%BSA封闭， 37°C 孵育 2 小时。 PBST 清洗 3遍，加入待测 4倍比稀释的小鼠血清（实验组），设置 6-7 个梯度，未免疫小鼠做阴性对照， ΙΟΟμΙ 每孔， 37°C孵育 1 小时。 PBST 清洗 3 遍，每孔加入 100 辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗鼠抗体 (1 : 10000稀释)， 37°C孵育 1小时。 PBST 清洗 3 遍后加入 TMB底物， 100 每孔，避光显色 10-15 分钟，加入终止液（1M HC1) ΙΟΟ μί每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长 450nm 的吸光值 ( OD₄₅₀) 及 630nm 的吸光值 (OD₆₃。)，计算 AOD450 = OD450-OD630。与 PBS 孔相比，实验组 AOD450 与阴性对照组 AOD450 的比值大于 5倍的为阳性。结果表明，单克隆抗体 mAbL-186只与 LNCaP肿瘤细胞反应，而与其它细胞没有交叉反应。

3.2. 制备 LNCaP细胞裂解物

培养的 LNCaP细胞经预冷的 PBS漂洗 2 次，裂解液（Nonidet-P40 ( P40)缓冲液）中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；吸净 PBS，加入预冷的裂解液，（（1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask；)。用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中， 4°C摇动 30 min。 4°C离心 12,000 rpm， 20 min。轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

3.3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)

制备 10 %分离胶。将细胞裂解物和重组蛋白质样品与 5 X样品缓冲液（20ul+5ul) 在一个 Eppendorf管中混合。放入 100 °C加热 5— 10min，取上清点样。 8.0 ml, 混匀；在不同的样品槽内分别加约 20μ1分子量标志物、细胞裂解物和重组蛋白质样品。上样后，稳压 200V, 溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需〜 lhr。卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色 1〜2 hr; 加入脱色液，置于 80 rpm脱色摇床上，每 20 min更换一次脱色液（ 10 ml 冰乙酸； 45 ml乙醇； 45 ml蒸熘水）至完全脱净。

3.4. 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB )

过 PAGE分离的蛋 ΰ质样品，转移到 «酸纤維素薄胶上。 100V, 1 电流约为 0.3Α)。用 25 ml TBS 洗膜 5min，室温，摇动。置膜于 25 ml 封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）中 lh，室温，摇动。用 15mlTBS/T (含 0.5% Tween-20的 Tris 缓冲液，洗 3次 (5 min/T)。加入合适稀释度的一抗（Anti-His Tag抗体），室温孵育 l-2h或 4°C过夜，缓慢摇动。用 15mlTBS/T 洗 3次 (5 min/T)。加入 1 :5,000稀释度的辣根过氧化酶 (HRP)标记的二抗（样抗鼠 IgG-HRP)，室温孵育 lh，缓慢摇动。用 15mlTBS/T洗 3次 (5 min/T)。应用化学发光自显影试剂盒（美国 Peierce产品），加入底物后在 X-光片自显影。如图 3 所示，单克降抗休 mAb L-186只识别 LNCaP 细胞，检测到一个约 110 kDa 的蛋 A条带， lilj 其它几种肿瘤细胞 -DU145, PC3 , He3907, OKAR5 , A2780, SKOV4, OVAR3 , MCF7, 518A2, colo320, SW480, MDA, HT29全细胞裂解液没有反应。

3.5. 特异性单克隆抗体 mAbL-186免疫沉淀 LNcaP细胞膜特异蛋白质

培养的 LNCaP细胞经预冷的 PBS漂洗 2 次后，加 8ml含有 40ul/ml生物素化试剂（美国， Amersham ECL Protein Biotinylation Module Cat #2202)，在平面摇动器上 4。C培养 30分钟。经预冷的 PBS漂洗 2 次后，加入 5ml细胞 IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰浴裂解 2-5分钟， 4°C， 12,000g离心30 min后取上活；取少量裂解液以备 Western blot分析，剩余裂解液将 l g相应的抗体和 10-50 μΐ protein A/G-beads加入到细胞裂解液， 4°C缓慢摇孵育过夜；免疫沉淀反应后，在 4。C 以 3,000 g速度离心 5 min,将 protein A/G-beads离心, 管底; 将 I：清小心吸去， protein G-beads用 1ml裂解缓冲液洗 3-4次；最后加入 15μ1的 2><SDS 加样缓冲液，沸水煮 10分钟；进行 SDS-PAGE, Western blotting分析。图 4 示特异单克隆抗休 mAb L-186从含有生物素标记膜 IfiA的 LNCaP细胞裂解液屮免疫沉淀（IP)—个 110 kDa蛋白。

3.6. 应用特异性单克隆抗体 mAbL-186免疫沉淀 LNcaP细胞中特异蛋白质

为了用特异性单克隆抗体 mAbL-186免疫沉淀制备大量 LNcaP细胞中特异蛋白质，培养的 LNCaP细胞经预冷的 PBS漂洗 2 次后，加入适量细胞 IP裂解缓冲液（含蛋酶抑制剂），冰浴裂解 30分钟， 4°C , 12,000g离心 30 min后取上洁-；取少量裂解液以备 Western blot分析，剩余裂解液将 l g相应的抗体和 10-50 μΐ protein A/G-beads加入到细胞裂解液， 4°C缓慢摇兄孵育过夜；免疫沉淀反应后，在 4°C 以 3,000 g速度离心 5 mi 将 protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去， protein G-beads川 lml裂解缓冲液洗 3-4次； ϋ后加入 15μ1的 2xSDS 加样缓冲液，沸水煮 10分钟；进行 SDS-PAGE。从抗体-靶标膜蛋白分子复合物在分离胶浓度 12%，浓缩胶浓度 4%的 SDS-P AGE电泳分离抗体和靶标膜蛋白，考马氏亮蓝染色后，从凝胶上切取 110kD的蛋白带。在 PBS缓冲液中研磨凝胶释放出蛋白质；离心沉淀除去凝胶碎片，采用 BSA作标准曲线，用 Bradford法测定蛋白浓度。

3.7 单克隆抗体 mAbL-186靶标分子的质谱分析鉴定

3.7.1 样品酶解：

取蛋白上清液复溶在 20 μΐ 50mmol-L-l H4HC03 溶液中，加入 1 μΐ 20 mmol-L-lDTT, 60°C水浴 45 min;加入 2 μΐ 20 mmol-L-l 碘乙酰胺溶液，避光室温放置 30 min;再加入 2 μΐ 20 mmol-L-lDTT, 601水浴30 1^ 加入乙腈，终浓度达到 10%左右；加入 20 ng-μΐ-ΐ 胰蛋白酶 10 μ1， 37°C酶解 12 h; 加入 Ο. ΐ μΐ 甲酸终止反应。

3.7.2 样品液相色谱分离：

用纳升级 /毛细管液相色谱系统 Ultimate (美国 DIO EX 公司）分离消化后的多肽，采用 pepmapl00 C18 柱，缓冲液 A: 0.1%甲酸溶液。缓冲液 B: 含 0.1%甲酸的 95%乙腈溶液。试验前将各溶液过滤（0.22 μιη滤膜），在线脱气。系统为柱前分流，设置分流后流速 200 nl-min-l , 进样体积 6 μ1，自动进样器进样，室温运行。上样后，阀切换使上样液单独冲洗预柱，随后将预柱切换到分析柱流路开始洗脱。洗脱方法： 3%Β 液平衡色谱柱，上样后 8%〜 50%Β 液洗脱 30 min, 50%〜60%B 液洗脱 4 min, 60%〜95%B液洗脱 4 min, 95%B 液等梯度洗脱 6 min。洗脱组分直接经电喷雾离子化进入质谱检测。

3.7.3 样品液相质谱分析：

用电喷雾-串联四极杆-飞行时间质谱 ESI-Q-TOF (德国 Bruker 公司）进行串联质谱分析：所有测定均在正离子方式下进行。雾化气体为氮气，碰撞气体为氮气，碰撞能量随前体离子电荷数不同智能优化。 TOF 加速电压 190V， MCP 检测器电压 1 900 V，毛细管电压 4 200 V。 MS 谱质量扫描范围在 0〜2 400 Da，扫描时间 2 s。选择每个 MS 谱中前 2 个强度最大且响应值大于 1 000的肽段作串联质谱， MS/MS 谱质量扫描范围在 0〜2400 Da, 扫描时间 2 s。 MS/MS 扫描时前体离子采用了动态排除原则，经串级分析的前体离子在 5 min 内不再重复扫描。

3.7.4数据库检索：

MS/MS 数据通过 MASCOT ( http://www. matrixscience.com ) 搜索 NCBInr禾 P EST数据库。搜索条件：胰酶消化，最大遗漏酶切位点 1个，肽段质量精确度 ±0.1， MS/MS 质量精确度 ±0.1，固定修饰 Carbamidomethyl ( C) 。通过蛋白质组学分析 mAb L-186的靶标确定为前列腺特异膜蛋白抗原 (prostate-specific membrane antigen, human folate hydrolase 1 isoform 1)

(图 5 ) 。

4. PSMA特异单克隆抗体 mAb L-186的鉴定

4.1 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB ) 分析特异^克隆抗体 mAb L-186 J原核和真核细胞.表达的重组 PSMA蛋 ΰ的反应性

将 10ug在大肠朴表达的 PSMA ig組 ifiA, 放«在室温过夜，使部分¾ 蛋^质降解。分别取 lug在人肠杆菌表达的和在 HEK293细胞. 达的 PSMA重组蛋 0以及 5ul降解后的蛋质，按照 3.3所描述的方法在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶做电泳 CSDS-PAGE)。然后，转移到 Λ酸纤维素薄胶—-匕按照 3.4所描述的方法进行蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB ) 。如图 6所示， mAb L-186 单克隆抗体不但能够特异性的结合 PSMA重组蛋白，而且能够与降解后的 PSMA重组蛋白片段结合，说明 mAb L-186 单克隆抗体识别一个稳定的抗原决定簇。

4.2 PSMA特异单克隆抗体 mAb L-186与活 LNCaP肿瘤细胞的结合性

4.2.1流式细胞仪（Flow Cytometer, FCM) 分析：用胰酶从细胞培养瓶消化分离 LNCaP 和 PC3单层细胞，用冰冷的含 0.01%叠氮钠的 PBS洗 3次；取一 ) ϊ:的 LNCaP和 PC3细胞 (约 1X10⁶ 细胞 / ml ) 到离心中，分别加入合 lug/ml , 0. lug/ml , 0.01ug/ml 和 0.001ug/ml, 特异的 mAb L-186抗体或小鼠 IgGl冰冷的 PBS (含 0.01%叠氮钠）；在冰浴放置 1小吋，待反应后用冰冷的含 0.01%叠氮钠的 PBS洗 3次，洗去未结介抗休； W加入光标记的羊抗鼠 IgG抗体，在冰浴放賈 1小时，成抗原-抗体-抗抗体合物，待反应后用冰冷的含 0.01%叠氮钠的 PBS洗 3次，洗去结' 抗休；以 FCM检测^上标 id的荧光素被激发后发出的荧光。顯 7所小， mAb L-186抗体能够 ¾ PSMA阳性的 LNCaP细應结' ，似不与 PSMA阴性的 PC3 细胞结合。

4.2.2免疫荧光显微镜分析：

将盖玻片放置在 6孔板中培养 LNCaP和 PC3细胞。待形成约 80%单层细胞后，用冰冷的 PBS漂洗盖玻片 3次，每次 5分钟；在 4%多聚甲醛固定液中固定半小时； PBS洗 3次，每次 5分钟；力 B 10%封闭血清或者 1-10%BSA，室温， 30-60分钟；加稀释的 mABL-186抗体（3%BSA, PBS)， 4°C，过夜； PBS洗 3次，每次 5分钟；加 1 : 1000稀释的荧光标记羊抗鼠抗体（3%BSA， PBS ), 室温 30-60分钟； PBS洗 3次，每次 5分钟，室温；用 Hoechst染色， 5-10分钟，室温； PBS洗 3次，每次 5分钟；最后在荧光显微镜下观察检测。如图 8 所示， mAb L-186抗休能够结合到 PSMA Ι Ί性的 LNCaP细跑胶，似不与 PSMA阴性的 PC3 细腿口 :|

4.3 PSMA特异单克隆抗体 mAb L-186针对 |¾'列腺癌组织的免疫组化（HIC) 分析：

10份诊断为前列腺癌的肿瘤和 5份良性瘤的活体采取的前列腺组织用于检测 mAB-186识别人体组织前列腺癌的特异性。将前列腺癌组织和癌旁肝组织均做成蜡快。所有的蜡快均切成 5 岬厚的切片，附贴在 FISHER载玻片上。用一片已知的 PSMA阳性的组织作为阳性对照。切片在 56°C烘干 2 h，在二甲苯中脱蜡 (每次 3分钟) 2次并在 5个梯度酒精和 2个去离子水中进行水化 (100% , 100 % , 90 % , 70 % ， 50 % , 0 % , 0 % , 每个 5分钟)，在 3 %的双氧水 /甲醇中浸泡 30分钟以灭活内源性过氧化物酶的活性，然后在去离子水中 (每次 5分钟)和 PBS中 (每次 3 分钟)各清洗 2次。将切片浸于 10mmol / L， pH6. 0的柠檬酸缓冲液中，微波照射 10分钟 (控制微波功率以使缓冲液温度在 92°C〜98°C)进行抗原修复。等缓冲液自然冷却至室温，将切片置于湿盒中，按以下顺序进行温育，间隔在 PBS中的清洗 (5分钟 x4): 与用 PBS / 2%BSA稀释的 5 %的正常羊血清在室温中温育 30分钟以阻断非特异性的蛋白结合，与用 PBS / 2%BSA稀释的 1 : 50的一抗 (mAb L-186或鼠 IgGl对照)在 4°C 温育过夜，与二抗 (生物素标记的羊抗小鼠抗体)在室温中温育 10分钟，与过氧化物酶标记的链霉卵白素在室温中温育 10分钟，与酶作用底物 (新配制的用 PBS稀释的 50% DAB, 0.04 % 氯化镍， 0 002%过氧化氢)在室温中温育 15 分钟，最后用去离子水清洗以终止温育过程。切片然后在 5个梯度酒精中脱水 (50%， 70% , 90% ， 100% , 100%), 在 2个二甲苯中透明，用中性树胶封于盖玻片下，在光学显微镜下进行读片。所用的酶作用底物使得阳性 PSMA蛋白表现为棕色的细致颗粒。切片的免疫组化染色程度被判为一， +， ++，分别代表阴性 (0%)，阳性 (<10%)，强阳性 (> =10%)。结果显示， mAb L-186能够特异性的识别人体前列腺癌组织，用于免疫组化的检测，它在所有来自 10位诊断为前列腺癌患者的肿瘤组织均成不同程度的阳性，而 5份良性瘤的前列腺组织为阴性。

4.4 PSMA特异单克隆抗体 mAb L-186的序列分析

复苏分泌抗单克隆抗体 mAb L-186的杂交瘤细胞株，传至 3代使细胞数目达 2.8x l0⁷/L 后收获细胞。用 TRIzol™ Reagents (购自 TaKaRa公司）、氯仿和异丙醇抽提 RNA后，以无水乙醇沉淀。以 ΙΟμί ΚΝΑ为模板，以 Oligo (dT) 20为随机引物，反转录合成 cDNA第 1 链。用小鼠 IgG引物库试剂盒（美国 USBiological公司产品），在 25 反应体系中，加入 CDNA2 μί， Back和 For引物各 1 进行 PCR。在 GeneAmp PCR System (Perlin Elmer公司产品）上进行扩增，反应参数为： 94°C变性 60分， 55°C退火 60分， 72°C 延伸 60分， 30次循环。 PCR产物用 1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。将琼脂糖凝胶电泳回收的 PCR_产物纯化 (Qiagen,gel extraction kit) 后，克隆在末端 T突出的 pEGMR-T Vector中，转化感受态细菌 CM1601 , 挑选阳性克隆，抽提质粒 DNA， T7及 SP6通用引物在 310 A全自动 DNA序列分析仪 (ABI)公司双向测序。通过 IMGT Web (the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org. ) 的 IMGT/V-QUEST序列分析软件对获得的序列进行分析；使用 BLAST分别将 V_H或 VL DNA序列与 GenBank和 EMBL数据库已收录序列进行碱基局部同源性比较。然后，以推导的 V_H和 VL氨基酸序列与 Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序列分类进行对比，确定抗体重链和轻链的互补决定区（CDRs)。测序结果表明，该抗体轻链可变区基因的长度为 330 bp，编码 110个氨基酸（SEQ ID NO: l)，该抗体重链可变区基因的长度为 354 bp，编码 118个氨基酸 (SEQ ID NO:2)。

轻链可变区的 3个互补决定区 (CDR) 的氨基酸序列为：

CDR1：如 SEQ ID NO:3所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如 SEQ ID N0 5所示；

所述重链可变区的 3个互补决定区（CDR) 的氨基酸序列为：

CDR1：如 SEQ ID NO:6所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如 SEQ ID NO:8所示。

Claims

权利要求书

1. 一种单克隆抗体，由轻链和重链组成，其特征在于，所述轻链可变区的 3 个互补决定区

( CDR) 的氨基酸序列为：一

CDR1：如 SEQ ID NO:3所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:4所示，

CDR3：如 SEQ ID N0 5所示；

所述重链可变区的 3个互补决定区（CDR) 的氨基酸序列为：

CDR1：如 SEQ ID NO:6所示，

CDR2: 如 SEQ ID NO:7所示，

CDR3：如 SEQ ID NO:8所示。

2. 根据权禾 ^要求 1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID ΝΟ: 1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

3. 编码权利要求 1或 2所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列的基因。

4. 编码权利要求 1或 2所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列的基因。

5. 编码权利要求 1或 2所述单克隆抗体的基因。

6. 含有权利要求 3〜5任一项所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系，转基因动植物或重组病毒和细菌。

7. 分泌权利要求 1或 2所述单克隆抗体的细胞系。

8. 权利要求 1或 2所述的单克隆抗体在制备前列腺癌或 /和其它 PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。

9. 权利要求 3〜5任一项所述的基因、权利要求 6所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求 8所述的细胞系在制备前列腺癌或 /和其它 PSMA阳性肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的应用。