CN117736331B - 一种特异性结合psma胞外段的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体的轻链可变区的3个互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.3‑5所示，重链可变区的3个互补决定区CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.6‑8所示。该单克隆抗体可特异性靶向结合PSMA胞外段，并被成功地应用于纳米复合示踪剂的制备。此外，该单克隆抗体还能用于制备表达PSMA蛋白的阳性肿瘤的检测试剂、抗体芯片、抗体探针或流式细胞仪等。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及为一种特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体及其应用。
背景技术
前列腺特异性膜抗原（PSMA）又称为谷氨酸羧肽酶II或叶酸水解酶，是一种含有750个氨基酸的II型跨膜糖蛋白，由6个结构域组成，分别为：19个氨基酸的胞内段、24个氨基酸的跨膜段、707个氨基酸组成的4个胞外结构域。虽然PSMA的氨基酸组成表明其分子量大约为84kDa,但在SDS-聚丙酰胺凝胶电泳检测中发现，其分子量大约为100-120kDa。PSMA在前列腺癌组织及非前列腺实体瘤的新生血管中高表达，在人体正常的肾脏、前列腺、脑组织等也均有表达，在进一步的定量研究中表明，在蛋白水平层面，PSMA显著表达仅限于前列腺。在前列腺癌中随着疾病进展，PSMA的表达也随之升高。由于PSMA的稳定表达，且较前列腺特异性抗原PSA不易受到其他因素的干扰，同时鉴于PSMA显著表达仅限于在正常和恶性前列腺组织中以及其具有完整膜蛋白的性质，使得PSMA在基于细胞的诊断或治疗策略中特别适用于抗体靶向。
现有的抗PSMA的单克隆抗体7E11.C5已应用于临床，然而由于7E11.C5识别的是PSMA胞膜内的抗原表位，仅能与死亡的细胞结合，这会导致一些应用的缺陷和局限性，往往不能直接应用于前列腺癌的临床靶向示踪及直观地反映PSMA的实际表达水平。因此，有必要开发可靶向结合PSMA胞外段的单克隆抗体，其必然在前列腺癌诊断和治疗中具有重要的应用价值。
目前吲哚菁绿ICG作为前列腺癌最常见的示踪剂，虽一定程度上有助于前列腺癌的诊疗，但其存在稳定性弱、靶向性差等特点。因此有必要进一步优化其特性，开发新型纳米复合示踪剂，进而提升前列腺癌的诊疗质量和精准性。
发明内容
（一）要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可特异性靶向结合PSMA胞外段，能用于制备表达PSMA蛋白的阳性肿瘤的靶向示踪、检测试剂以及前列腺癌的治疗药物。
（二）技术方案
第一方面，本发明提供一种特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区具有3个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述重链可变区具有3个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；其中：
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
根据本发明的较佳实施例，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
第二方面，本发明提供一种编码上述单克隆抗体的编码基因。
根据本发明的较佳实施例，所述编码基因包括用于编码所述单克隆抗体轻链可变区的如SEQ ID NO.9所示的DNA序列，以及用于编码所述单克隆抗体重链可变区的如SEQ IDNO.10所示的DNA序列。
第三方面，本发明还提供一种核酸分子，其包括上述的编码基因。
第四方面，本发明提供一种表达载体，其含有所述的核酸分子。
第五方面，本发明还提供一种用于生产所述单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系。
所述单克隆抗体为小鼠（IgG1,κ）亚型单克隆抗体。
第六方面，本发明还提供一种所述单克隆抗体的制备方法，其包括将表达载体或重组质粒转入宿主细胞，培养宿主细胞，收集细胞上清液并纯化；所述表达载体或重组质粒携带有所述编码所述单克隆抗体的编码基因；或者培养上述小鼠杂交瘤细胞系，收集细胞上清液并纯化。
第七方面，本发明涉及所述单克隆抗体、编码基因、核酸分子、表达载体或重组质粒在制备PSMA检测试剂盒、抗体芯片、抗体探针或流式细胞仪中的应用。
优选地，所述检测试剂盒，包括：所述单克隆抗体、HRP酶标二抗、EDTA修复液、过氧化氢酶封闭液、DAB浓缩液、DAB缓冲液、苏木素和返蓝液。
第八方面，本发明涉及所述单克隆抗体、编码基因、核酸分子或表达载体在制备前列腺癌治疗药物中的应用。
第九方面，本发明涉及一种用于前列腺癌诊疗的特异性新型纳米复合示踪剂，其包括所述的单克隆抗体、壳聚糖纳米颗粒以及吲哚菁绿；所述单克隆抗体被吸附于壳聚糖纳米颗粒的表面，吲哚菁绿ICG被包裹于壳聚糖纳米颗粒的内部。此外，本发明还涉及所述单克隆抗体或所述特异性新型纳米复合示踪剂在制备前列腺癌诊疗材料中的应用。
（三）有益效果
本发明所提供的特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体，可特异性靶向结合PSMA胞外段，并利用该单克隆抗体成功制备了前列腺癌的复合纳米靶向示踪剂。所述单克隆抗体还能用于制备表达PSMA蛋白的阳性肿瘤的检测试剂，以解决传统靶向结合PSMA胞内段抗体在应用中存在的不足。所述单克隆抗体与PSMA胞外段具有很高的亲和力，在IHC染色中染色信号更强，可提高检测试剂的灵敏度和抗背景信号干扰的能力，进而可在较低抗体浓度条件下获得较高检测数据，提高检测准确性的同时节约试剂成本。同时基于此PSMA单克隆抗体制备的纳米复合示踪剂具有稳定性好、肿瘤特异靶向性强等特点。
附图说明
图1为SDS-PAGE凝胶电泳分析经protein G纯化的单克隆抗体纯度分析。
图2为本发明的单克隆抗体细胞免疫荧光靶标特异性分析和半定量图像。
图3为本发明的Anti-PSMA-CS@ICG纳米粒透射电镜图。
图4为本发明的Anti-PSMA-CS@ICG复合示踪剂细胞免疫荧光靶标特异性分析和半定量图像。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例为制备靶向人PSMA膜外段单克隆抗体的方法。
（1）免疫小鼠
通过购买商业化的重组PSMA蛋白（SinoBiological， #15877-H07H），将其稀释至1mg/ml，与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma，#F5881）充分混合乳化；取8-10周龄BALB/c小鼠（AAALAC认证）进行腹腔注射初次免疫，免疫剂量为120.0µg/只。一周后进行第二次免疫，PSMA蛋白使用弗氏不完全佐剂（Sigma，#F5506）充分乳化，免疫剂量为60µg/只。4天后进行第三次免疫，抗原乳化与免疫剂量与第二次一致。第三次免疫后采血，采用PMSA蛋白作为包被抗原，通过ELISA法检测免疫后血清中抗体效价。血清转阳标准，血清滴度>1:32000。
ELISA检测血清抗体效价方法：将抗原（PMSA蛋白）用包被液（10 mM PBS，pH7.4）稀释，浓度1.25 µg/mL，每孔100 µL，4°C过夜；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液（PBST）冲洗3次；每孔加200 µL封闭液（2% BSA），37°C孵育1-1.5小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液（PBST）冲洗3次；每孔加倍比稀释小鼠血清（免疫后），稀释方法为起始1:1000，2倍比稀释，设置10个梯度，免疫前血清为阴性对照，37°C孵育1-1.5小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液（PBST）冲洗3次；每孔加100 µL二抗（山羊抗鼠IgG-HRP（Sigma，#A0168）标记），37°C孵育1小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液（PBST）冲洗5次；拍干孔中残留液体，每孔加100µL TMB显色液，37°C避光显色5-10 min；每孔加50μL 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nmOD值。
（2）细胞融合及筛选阳性杂交瘤细胞株
选取效价最高的小鼠，分离小鼠脾脏细胞，制成脾细胞悬液，用IMDM培养基（Hyclone，#SH30228.01）洗涤一次，弃上清液，加入5 mL红细胞裂解液（Invitrogen，A1049201），在室温裂解5分钟；再加入IMDM培养基至30 mL，1500转/分钟，离心5分钟；接着用新的IMDM培养基重悬脾细胞，进行细胞计数。收集骨髓瘤细胞（FO），用IMDM培养基洗涤2次，进行细胞计数。脾细胞和FO细胞按照2:1-4:1的比例混合，1500转/分钟，离心5分钟，弃上清液，将混合细胞用电融合缓冲液（Qiwenbio，#CEB005）20mL洗涤2次；再弃上清液，加入电融合缓冲液，使脾细胞的浓度在1-2×107/mL，将细胞悬液加到细胞电融合室中，在电融合仪上启动电融合程序。
完成电融合后，将融合细胞静置5分钟。将融合细胞转入含有HAT的筛选性培养基中。具体地，将细胞转到20块铺有饲养层细胞（腹腔巨噬细胞）的培养板上，200 µL/孔，将细胞板放到37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养。培养第五天时，将HAT培养基换成HT培养基。培养第7-8天进行融合细胞的抗体ELISA检测。检测以商业化重组PSMA蛋白作为包被抗原进行ELISA筛选阳性细胞株，同时结合免疫荧光实验筛选，第一次亚克隆采用梯度稀释法，第二次亚克隆采用有限稀释法，经2次复筛后获得杂交瘤细胞株，并将该细胞株命名为2430CT22.1.1。
（3）单克隆抗体制备及亚型鉴定
①将杂交瘤细胞株2430CT22.1.1以含10%胎牛血清的IMDM培养基培养，通过体外培养杂交瘤细胞2430CT22.1.1获取上清。
②收集细胞上清后，以3000转/分钟，室温离心10分钟，收集上清液。采用proteinG亲和层析法纯化抗体，具体方法为：首先将protein G亲和柱用平衡液PBS（20 mM，pH 7.4）平衡，通过紫外检测仪监测柱子，使其A280的基线达到平衡。细胞上清手动加到protein G亲和柱上方，使其流经柱子，收集流穿液。上样完毕，用平衡液PBS（20 mM，pH 7.4）洗涤柱子，直至基线平衡。用洗脱液（0.1 M甘氨酸，pH 2.7）洗脱柱子，收集洗脱下的抗体，并同时用2M Tris（pH 8.0）中和，每毫升洗脱液加入2M Tris（pH 8.0）溶液100µL。
③将前面收集的抗体加到透析袋中，用聚乙二醇20000浓缩抗体，使其浓度达到1.0mg/mL以上。将加有抗体的透析袋置于PBS（10 mM，pH 7.4）中透析。PBS更换2-3次。抗体用紫外分光光度计测定浓度后，添加0.05‰Proclin300的防腐剂。纯化的最终抗体置于-20℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度（如图1所示），并用小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明2430CT22.1.1产生的单克隆抗体亚型为IgG1,κ。图1中，1表示：蛋白marker（记为Std）；2表示：1µg单克隆抗体上样量；3表示：2µg单克隆抗体上样量。在两种不同上样量下都可以得到深灰度的清晰条带。
（4）细胞免疫荧光测定单克隆抗体靶标特性
通过以人前列腺癌细胞DU145为阴性对照，人前列腺癌细胞LnCAP细胞和22RV1为阳性对照，取杂交瘤细胞2430CT22.1.1的上清液（含单克隆抗体）进行免疫荧光验证。
首先，将爬片铺入24孔板中，分别将DU145，22RV1及LnCAP细胞种入24孔板中，待细胞爬片增长至60%-80%时，以PBS浸洗3次，每次2-3分钟；用4%的多聚甲醛固定爬片上的细胞15min，PBS浸洗玻片3次，每次2-3分钟；吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清200µL，室温封闭30min；吸干封闭液，每张玻片滴加200µL的稀释好的所述上清液并放入湿盒，4℃孵育过夜；孵育后，用PBST 浸洗爬片2-3次，每次2-3分钟；吸尽PBST，在避光条件下加入200µL/孔山羊抗鼠荧光二抗，室温下孵育1h；用PBST浸洗3次，每次2-3分钟；而后避光加入200ul/孔，DAPI进行染核5min，吸尽，用PBST洗3次，每次5分钟。最后吸干PBST，取出爬片用抗荧光猝灭剂进行封片。采用荧光显微镜观察并采集图像，如图2的A所示，在PSMA阴性细胞DU145中呈现染色阴性；在PSMA阳性细胞LnCAP及22RV1中呈现染色阳性，对不同细胞的染色荧光强度进行统计，统计结果如图2的B所示。由图2可看出，本发明的单克隆抗体具有特异性识别和结合PSMA的能力，且PSMA阳性细胞LnCAP及22RV1的染色具有较高的荧光强度，说明所述单克隆抗体与PSMA具有较好的亲和力，可用于PSMA阳性细胞的检测。
（5）单克隆抗体测序
从液氮中复苏杂交瘤细胞并用含有10%胎牛血清的IMDM培养基进行培养，待细胞增殖传代至一定数量后，按照说明书用HiPure RNA Mini Columns（Magen）提取细胞总RNA，采用NanoDrop和凝胶电泳来检测RNA的浓度和完整性。然后，根据SMARTScribe ReverseTranscriptase（Takara）将RNA反转录获取cDNA，将得到的cDNA进行稀释以进行扩增。将正向引物锚定在TSO上，反向引物锚定在重链或轻链恒定区域。在不同的反应中扩增重链和轻链片段。将纯化的PCR产物通过拓扑异构酶I插入pCE2载体，得到的环状重组载体，将该重组载体转化至感受态细胞。采用菌落PCR法筛选阳性菌落。20个阳性菌落用于后续分析。从阳性菌落中提取质粒，用正向引物进行测序。最终获得单克隆抗体的轻链与重链可变区序列及相应的互补决定区（CDRs）。
轻链可变区具有3个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，重链可变区具有3个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.3-5所示，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.6-8所示。轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码单克隆抗体轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，编码重链可变区的DNA序列如SEQID NO.10所示。
上述氨基酸或核苷酸序列如下表：
；
（6）Anti-PSMA-CS@ICG复合纳米颗粒的制备和表征
将本发明的抗PSMA胞外段抗体溶于磷酸盐缓冲液pH7.4中，随后加入壳聚糖水溶液，蛋白与壳聚糖的质量比为(0.01-100):1。继续加入ICG(吲哚菁绿)磷酸盐缓冲液，其中ICG的质量与蛋白比为(0.1-10):1，形成抗体-壳聚糖-ICG的混合溶液。将混合溶液在冰浴条件下，使用探针超声，超声结合10min，再经过PBS透析后，得到Anti-PSMA-CS@ICG复合纳米颗粒(抗PSMA胞外段抗体纳米颗粒示踪剂)。
取上述100μl Anti-PSMA-CS@ICG纳米粒水溶液滴在干净的透射电镜铜网上，用滤纸吸走多余的液体，在室温条件下自然干燥，接着使用磷钨酸染色剂进行染色后，在透射电镜下观察Anti-PSMA-CS@ICG纳米粒的形态。进一步采用透射电镜观察Anti-PSMA-CS@ICG复合纳米颗粒，如图3所示，Anti-PSMA-CS@ICG复合纳米颗粒呈大小较为均一的椭圆形颗粒结构，纳米颗粒的尺寸约为50nm。
（7）检测Anti-PSMA-CS@ICG复合示踪剂的靶向特性
以人前列腺癌细胞DU145为阴性对照（不含PSMA抗原），人前列腺癌细胞LnCaP细胞（含有PSMA抗原）为阳性对照，检测Anti-PSMA-CS@ICG复合示踪剂的靶向特性。
取适当数量的爬片于10cm培养皿中，并放置于超净台中，紫外照射30min，以保证爬片无菌。随后将爬片放置于24孔板板底；取适当细胞数目的DU145、LNCaP细胞接种于24孔板，温和吹打细胞使之均匀分布，随后放置于细胞培养孵箱中培养。第二天，待细胞贴壁并且细胞融合密度达60%时，根据设计浓度将适当体积的ICG、上述复合纳米颗粒Anti-PSMA-CS@ICG滴加于细胞孔板中，放入培养箱中继续孵育4h，注意避光；随后，在避光条件下使用4%的多聚甲醛固定液固定细胞2h，PBS缓冲液洗涤3次（水平摇床，转速80rpm），每次5min；避光，DAPI染核5min；避光，PBS 缓冲液洗涤细胞3 次，每次5min，小心取出细胞爬片置于载玻片上，用防荧光淬灭剂封片以后，在高分辨激光共聚焦扫描显微镜下观察拍照。
如图4的A所示为在785 nm左右激发波长条件下，ICG分别与PSMA阴性细胞DU145PSMA(-)和PSMA阳性细胞LNCAP PSMA(+)结合的荧光图，图4的C为A中相对荧光强度的统计图；由图4的A和C可以看出，ICG与PSMA阴性细胞DU145 PSMA(-)和PSMA阳性细胞LNCAP PSMA(+)细胞的结合无明显差异，说明ICG对PSMA阳性细胞无明显靶向特异性。与此同时，参见图4的B所示为在785 nm左右激发波长条件下，Anti-PSMA-CS@ICG分别与PSMA阴性细胞DU145PSMA(-)和PSMA阳性细胞LNCAP PSMA(+)结合的荧光图，图4的D为B中相对荧光强度的统计图；由图4的B和D可以看出，Anti-PSMA-CS@ICG对LNCAP PSMA(+)细胞的结合能力明显优于DU145 PSMA(-)细胞，这表明Anti-PSMA-CS@ICG新型纳米复合示踪剂对PSMA阳性细胞具有明显的细胞特异靶向性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体，其特征在于，其包括轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区具有3个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述重链可变区具有3个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；其中：
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
2.根据权利要求1所述的特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种编码权利要求1或2所述的特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括用于编码所述单克隆抗体轻链可变区的如SEQ ID NO.9所示的DNA序列，以及用于编码所述单克隆抗体重链可变区的如SEQ ID NO.10所示的DNA序列。
5.一种核酸分子，其特征在于，其包括权利要求3或4所述的编码基因。
6.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种用于前列腺癌诊疗的特异性纳米复合示踪剂，其特征在于,其包括权利要求1或2所述的单克隆抗体、壳聚糖纳米颗粒以及吲哚菁绿；所述单克隆抗体被吸附于壳聚糖纳米颗粒的表面，吲哚菁绿被包裹于壳聚糖纳米颗粒的内部。
8.权利要求1或2所述的特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体、权利要求3或4所述的编码基因、权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体在制备PSMA检测试剂盒、抗体芯片、抗体探针或前列腺癌治疗药物中的应用。
9.权利要求1或2所述的特异性结合PSMA胞外段的单克隆抗体或权利要求7所述的特异性纳米复合示踪剂在制备前列腺癌诊疗材料中的应用。
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