CN110642952A - 抗her3抗体、其制法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类抗HER3抗体、其制法及其应用。具体地，本发明提供了一种新型的抗HER3抗体，该抗体与HER3分子具有很强的亲和力，可特异性结合抗原分子，尤其是人鼠嵌合抗体有效降低了鼠抗的免疫原性。本发明的HER3抗体与西妥昔联用，能够显著增强西妥昔单抗的活性，并且能够降低西妥昔单抗的用量。

Description

抗HER3抗体、其制法及其应用

本案是申请日为2014年8月14日、申请号为CN201410401545.3、发明名称为“抗HER3抗体、其制法及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及抗HER3抗体、其制法及其应用。

背景技术

HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3、SEQ IDNO.:41)是编码表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶家族的一名成员，该家族还包括HER1(又称为EGFR)、HER2、和HER4等。HER3结构包括结合配体的胞外区，α螺旋的跨膜区，具有酪氨酸激酶结构域和富含酪氨酸的C端磷酸化位点胞内区。其中胞外区又可分为Ⅰ(L1)、Ⅱ(S1)、Ⅲ(L2)和Ⅳ(S2)，结构域Ⅰ和Ⅲ是配体结合区，而Ⅱ和Ⅳ结构域是结合配体后发生构象改变暴露的二聚化结构域。Heregulin(HRG)是HER3的特异性配体，HER3的表达和功能受到配体时空表达的影响，HRG通过促进HER3与HER家族的其他成员形成异二聚体来激发胞内信号。因此，它能结合此配体，但是不能经由蛋白质磷酸化将信号传送入细胞中。然而，它与具有激酶活性的其它HER家族成员形成异二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径的激活及其胞内域的转磷酸化。HER家族成员间的二聚体形成扩大HER3的信号传导潜力，并且是一种不仅用于信号多样化，而且用于信号放大的手段。例如，HER2/HER3异二聚体在HER家族成员间经由PI3K和AKT途径诱导最重要的促有丝分裂信号之一，已经在许多癌症，包括前列腺、膀胱、和乳腺肿瘤中报告了此基因的扩增和/或其蛋白质的过表达。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。一种同等型缺乏膜间区，并且分泌到细胞外。此形式作用为调控膜结合形式的活性。还已经报告了别的剪接变体，但是它们尚未彻底表征。

WO97/35885涉及HER3抗体。WO2003/013602涉及HER活性抑制剂，包括HER抗体。WO2007/077028和WO2008/100624也涉及HER3抗体。但是本领域中仍然缺乏一种针对HER3的灵敏性好特异性强的抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的HER3特异性抗体或其片段。

本发明的另一目的是提供上述抗体或其片段的制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

(1)互补决定区CDR1

所述互补决定区CDR1选自：SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:23、SEQ ID NO.:29和SEQID NO.:35；

(2)互补决定区CDR2

所述互补决定区CDR2选自：SEQ ID NO.:18、SEQ ID NO.:24、SEQ ID NO.:30和SEQID NO.:36；

(3)互补决定区CDR3

所述互补决定区CDR3选自：SEQ ID NO.:19、SEQ ID NO.:25、SEQ ID NO.:31和SEQID NO.:37。

在另一优选例中，所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示。

在另一优选例中，所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:23、SEQ ID NO.:24和SEQ ID NO.:25所示。

在另一优选例中，所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31所示。

在另一优选例中，所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:35、SEQ ID NO.:36和SEQ ID NO.:37所示。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:SEQ ID NO.:2、6、10或12所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种抗体重链，所述抗体重链具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体重链具有SEQ ID NO.:42、43、44或45所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

(1)互补决定区CDR1'

所述互补决定区CDR1'选自：SEQ ID NO.:20、SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:38；

(2)互补决定区CDR2'

所述互补决定区CDR2'选自：SEQ ID NO.:21、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:33和SEQ ID NO.:39；

(3)互补决定区CDR3'

所述互补决定区CDR3'选自：SEQ ID NO.:22、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:34和SEQ ID NO.:40。

在另一优选例中，所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:20、SEQ ID NO.:21和SEQ ID NO.:22所示。

在另一优选例中，所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27和SEQ ID NO.:28所示。

在另一优选例中，所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:32、SEQ ID NO.:33和SEQ ID NO.:34所示。

在另一优选例中，所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:38、SEQ ID NO.:39和SEQ ID NO.:40所示。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:4、8、12或16所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如权利要求3所述的抗体的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体轻链具有SEQ ID NO.:46、47、48或49所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链的恒定区和/或所述轻链的恒定区是人源的。

本发明的第五方面，提供了一种特异性结合HER3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有以下特性：

(1)与HER3蛋白亲和力常数M≥1×10^-10；

(2)结合HER3胞外区的DI或DIII结构域。

在另一优选例中，所述单克隆抗体抑制HER3与其配体Heregulin结合的IC₅₀值≤3nM。

在另一优选例中，所述单克隆抗体与HER3的结合位点包括选自下组的一个或多个位点：第125位的丝氨酸、第150位天冬氨酸、151位精氨酸和第467位组氨酸。

在另一优选例中，所述单克隆抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述单克隆抗体具有：

(1)如权利要求2所述的重链；和/或

(2)如权利要求4所述的轻链。

在另一优选例中，所述单克隆抗体包括：单链抗体、双链抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、人源化抗体或其组合。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体，为IgG(IgG1)型抗体。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求2所述的抗体重链、如权利要求3所述的抗体的轻链可变区、如权利要求4所述的抗体轻链、或如权利要求5所述的单克隆抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HER3。

在另一优选例中，所述的重组蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.:42-49所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(a)衍生的且特异性抗HER3的多肽。

本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)载体部分，所述载体部分含有如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求2所述的抗体重链、如权利要求3所述的抗体的轻链可变区、如权利要求4所述的抗体轻链、或如权利要求5所述的单克隆抗体或权利要求7所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的蛋白质：

如本发明第一方面所述的抗体的重链可变区、如本发明第二方面所述的抗体重链、如本发明第三方面所述的抗体的轻链可变区、如本发明第四方面所述的抗体轻链、或如本发明第五方面所述的单克隆抗体或本发明第六方面所述的所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11、13、15或50-57所示的DNA序列。

本发明的第九方面，提供了一种载体，它含有本发明第八方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第十方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有本发明第八方面所述的多核苷酸。

本发明的第十一方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第十方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的所述的单克隆抗体或本发明第六方面所述的所述的重组蛋白。

本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述组合物中含有：

(i)如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求2所述的抗体重链、如权利要求3所述的抗体的轻链可变区、如权利要求4所述的抗体轻链、或如权利要求5所述的单克隆抗体或权利要求7所述的重组蛋白；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

在另一优选例中，所述组合物还包含西妥昔单抗。

在另一优选例中，所述组合物中含有本发明第五方面所述的单克隆抗体和西妥昔单抗，其中,所述的单克隆抗体和所述西妥昔单抗的重量比为1-10：10-1；优选地，所述的单克隆抗体和西妥昔的重量比为1-5：10-1；更优选地，所述的单克隆抗体和西妥昔的重量比为1-5：1

本发明的第十三方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体的重链可变区、如本发明第二方面所述的抗体重链、如本发明第三方面所述的抗体的轻链可变区、如本发明第四方面所述的抗体轻链、或如本发明第五方面所述的单克隆抗体或本发明第六方面所述的所述的重组蛋白的用途，用于：

(a)细胞的分离、制备、提取、检测；或

(b)制备用于分离、制备、提取、检测细胞的产品。

在另一优选例中，所述的细胞为表达HER3分子的细胞；较佳地为人表达HER3分子的细胞。

在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：介质、磁珠、荧光标记抗体、化学标记物标记抗体、放射性同位素标记抗体、胶体金标记抗体、酶标记抗体等。

在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：装置、试剂盒等。

本发明的第十四方面，提供了一种体外分离人表达HER3分子的细胞的方法，包括步骤：将本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白(或分离、制备、提取、检测细胞用的产品)与人表达HER3分子的细胞共孵育或结合，分离(如洗脱或纯化)出与所述的抗体结合的细胞，从而实现人表达HER3分子的细胞的分离。

在另一优选例中，所述的分离、制备、提取、检测细胞用的产品包括：含有本发明第五方面所述的单克隆抗体的介质、磁珠、荧光标记抗体、化学标记物标记抗体、放射性同位素标记抗体、胶体金标记抗体、酶标记抗体等。

本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中是否含有HER3蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第五方面所述的单克隆抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HER3蛋白。

在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HER3蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HER3蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。

在另一优选例中，所述第一抗体或所述第二抗体上带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记、荧光蛋白标记。

在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、培养的人或动物细胞样品。

在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。

在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。

本发明的第十六方面，提供了一种治疗与HER3分子相关的病症的方法，包括步骤：给需要抑制或需要治疗的对象施用本发明第五方面所述的单克隆抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白或本发明第十二方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的与HER3分子相关的疾病包括肿瘤、拮抗器官移植免疫排斥反应。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示流式检测仪检测的检测结果，其中图1A为抗体927的检测结果，图1B为993的检测结果，图1C为抗体1044的检测结果，图1D为抗体1050的检测结果。

图2显示鼠单抗抑制HER3与配体结合的IC₅₀的检测结果，图2A显示了HER3抗体927抑制HER3与配体HRG的结合，图2B显示了HER3抗体993抑制HER3与配体HRG的结合，图2C显示了HER3抗体1044抑制HER3与配体HRG的结合，图2D显示了HER3抗体1050抑制HER3与配体HRG的结合。

图3显示人非细胞肺癌A549体内肿瘤模型实验，图3A为肿瘤体积的检测结果，图3B为肿瘤重量的检测结果。

图4显示了HER3单抗与西妥昔单抗的协同效果，图4A显示了HER3抗体1044与西妥昔协同抑制A431生长实验、图4B显示了HER3抗体927与西妥昔协同抑制A431生长实验、图4C显示了HER3抗体993与西妥昔协同抑制A431生长实验、图4D显示了HER3抗体1050与西妥昔协同抑制A431生长实验。图中，西妥昔单独组用量为5μg/ml，协同组西妥昔用量为2.5μg/ml；各图中横坐标数值单位为μg/ml(抗体用量)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一类抗HER3的特异性抗体，实验结果表明，该类抗体能够显著抑制HER3与其配体的结合。并且意外的发现使用该抗体与西妥昔单抗联用具有显著的协同作用，能够明显的减少西妥昔的用量。在此基础上完成了本发明。

HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3、SEQ IDNO.:41)是编码表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶家族的一名成员，在本发明的一个优选地实施方式中，HER3的氨基酸序列如下所示：

MRANDALQVLGLLFSLARGSEVGNSQAVCPGTLNGLSVTGDAENQYQTLYKLYERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRVVRGTQVYDGKFAIFVMLNYNTNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDKLCHMDTIDWRDIVRDRDAEIVVKDNGRSCPPCHEVCKGRCWGPGSEDCQTLTKTICAPQCNGHCFGPNPNQCCHDECAGGCSGPQDTDCFACRHFNDSGACVPRCPQPLVYNKLTFQLEPNPHTKYQYGGVCVASCPHNFVVDQTSCVRACPPDKMEVDKNGLKMCEPCGGLCPKACEGTGSGSRFQTVDSSNIDGFVNCTKILGNLDFLITGLNGDPWHKIPALDPEKLNVFRTVREITGYLNIQSWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNRGFSLLIMKNLNVTSLGFRSLKEISAGRIYISANRQLCYHHSLNWTKVLRGPTEERLDIKHNRPRRDCVAEGKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAHEAECFSCHPECQPMEGTATCNGSGSDTCAQCAHFRDGPHCVSSCPHGVLGAKGPIYKYPDVQNECRPCHENCTQGCKGPELQDCLGQTLVLIGKTHLTMALTVIAGLVVIFMMLGGTFLYWRGRRIQNKRAMRRYLERGESIEPLDPSEKANKVLARIFKETELRKLKVLGSGVFGTVHKGVWIPEGESIKIPVCIKVIEDKSGRQSFQAVTDHMLAIGSLDHAHIVRLLGLCPGSSLQLVTQYLPLGSLLDHVRQHRGALGPQLLLNWGVQIAKGMYYLEEHGMVHRNLAARNVLLKSPSQVQVADFGVADLLPPDDKQLLYSEAKTPIKWMALESIHFGKYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAEPYAGLRLAEVPDLLEKGERLAQPQICTIDVYMVMVKCWMIDENIRPTFKELANEFTRMARDPPRYLVIKRESGPGIAPGPEPHGLTNKKLEEVELEPELDLDLDLEAEEDNLATTTLGSALSLPVGTLNRPRGSQSLLSPSSGYMPMNQGNLGESCQESAVSGSSERCPRPVSLHPMPRGCLASESSEGHVTGSEAELQEKVSMCRSRSRSRSPRPRGDSAYHSQRHSLLTPVTPLSPPGLEEEDVNGYVMPDTHLKGTPSSREGTLSSVGLSSVLGTEEEDEDEEYEYMNRRRRHSPPHPPRPSSLEELGYEYMDVGSDLSASLGSTQSCPLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQRDGGGPGGDYAAMGACPASEQGYEEMRAFQGPGHQAPHVHYARLKTLRSLEATDSAFDNPDYWHSRLFPKANAQRT(SEQ ID NO.:41)

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HER3的抗体，例如具有重链(如SEQ ID NO.:42、43、44、45的氨基酸序列)和/或轻链(如SEQ ID NO.:46、47、48、49的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明提供了一种抗HER3的抗体(单克隆抗体)或其片段。

优选地，所述抗体的重链可变区可具有选自下组的互补决定区CDR：SEQ ID NO.:17、23、29、35所示的CDR1，SEQ ID NO.:18、24、30、36所示的CDR2，和SEQ ID NO.:19、25、31、37所示的CDR3。

更佳地，所述的重链可变区可具有SEQ ID NO.:2、6、10、14所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗体的轻链可变区可具有选自下组的互补决定区CDR：SEQ ID NO.:20、26、32、38所示的CDR1'，SEQ ID NO.:21、27、33、39所示的CDR2'，和SEQ ID NO.:22、28、34、40所示的CDR3'。

更佳地，所述的轻链可变区可具有SEQ ID NO.:4、8、12、16所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体为抗HER3人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有人HER3结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:50-57所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:50-57所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:10和/或SEQ ID NO.:15所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合人HER3分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)提供了一类新型的抗HER3抗体，所述抗体与HER3分子具有很强的亲和力，可特异性结合抗原分子，尤其是人鼠嵌合抗体有效降低了鼠抗的免疫原性。

(2)本发明的抗HER3抗体具有显著的抑制肿瘤生长的活性。

(3)本发明的HER3抗体与西妥昔联用，能够显著增强西妥昔单抗的活性，并且能够降低西妥昔单抗的用量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，Balb/c小鼠购自上海斯莱克公司；CHO/dhfr^-细胞购自美国ATCC，ATCC的货号CRL-9096^TM；Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞购自美国ATCC，ATCC货号

CRL-1581^TM。

实施例1、HER3鼠源单克隆抗体的制备

一、HER3单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

1、免疫原

免疫原为HER3胞外区第584位的组氨酸突变成苯丙氨酸胞外区全长(HER3-ECD-H584F)，通过CHO/dhfr^-细胞(购自ATCC)稳转表达，纯化细胞培养上清得到。

2、免疫Balb/c小鼠

Balb/c小鼠购自上海斯莱克公司，所有免疫用Balb/c小鼠均为3周龄、雌性、标准化无病、健康的纯种小鼠，符合美国FDA标准。

3、Balb/c小鼠免疫方法

第一次免疫：将50μg(250μl)抗原与250μlMF59佐剂混匀，配置成500μl溶液，注射于Balb/c小鼠皮下多点及足掌。第二次免疫：距第一次免疫间隔三周后，同法同剂量进行第二次免疫。第三、四次免疫：距第二次免疫间隔二周后，同法同剂量进行第三、四次免疫。四次免疫后小鼠尾静脉采血，采用常规酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定血清抗体滴度，待血清滴度>10⁵以上时(为3.3×10⁶)，准备做细胞融合。细胞融合前三天进行加强免疫：小鼠尾静脉注射抗原20μg(100μl)。

4、细胞融合：

Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞购自美国ATCC。

(1)融合前一天换液，使Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞保持良好生长状态。

(2)脾细胞：取免疫小鼠，放血，断颈猝死，于75％酒精浸泡3-4min。无菌条件下取出小鼠脾脏，放入15ml离心管中，加入少许无血清RPM 1640培养液，用移液管轻轻吹打，碾碎，直至没有组织结块、细胞均匀为止。然后，用无血清RPM 1640培养液洗涤小鼠脾脏细胞三次，计数备用。

(3)取对数生长期的Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞，无血清RPM 1640培养液洗涤三次，计数备用。

(4)将小鼠脾脏细胞和Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞以10：1的比例混合，1500rpm离心7min。洗去上清液，准备融合。

(5)一分钟内缓缓加入1ml PEG(1450)，轻摇90sec；再在2.5min中内加入5ml无血清RPM 1640培养液，最后再加入5ml无血清培液终止反应，静置5min后，1280rpm离心8min，弃去上清，加入常规RPM 1640培养液(含有10％胎牛血清)，制备成细胞悬液。

(6)将上述细胞悬液以每孔2×10⁴个细胞的密度种入96孔板，每孔200μl，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育。培养24h后，更换含有HAT(25×)的常规RPM1640培养液，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续孵育。培养14d后用ELISA法检测各个克隆细胞的上清液筛选HER3抗体的阳性克隆。

5、细胞筛选与亚克隆：

首先使用含有HAT的常规RPM 1640培养液进行培养筛选，培养7d后，改用HT的常规RPM 1640培养液培，进行再次培养筛选。培养14d后，用ELISA方法以各个克隆细胞的上清液筛选HER3抗体的阳性克隆。采用有限稀释法，将细胞悬液稀释至60个/ml，于96孔板中每孔加100μl(约6个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排。重复一次。置37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育。每隔2～3天，更换1/2培养液。培养约10d后，选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后，经ELISA法检测抗体阳性率为100％时确定为稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞株，保种建库。

6、鼠源单抗的制备与纯化

提前一周注射液体石蜡，0.5ml/只腹腔注射6周龄以上的Balb/c小鼠，每种杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠3只。7天后腹腔注射1～2×106个杂交瘤细胞，隔7～10天取腹水。抗体纯化过程参照GE protein G蛋白柱进行：

(1)腹水12000rpm离心15min去杂质与上层降脂烷，平衡缓冲液(pH7.0PBS)5倍稀释，用0.45um膜过滤。

(2)protein G柱用ddH2O平衡柱子5～10柱体积后用平衡缓冲液平衡柱子10个柱体积；

(3)按照1ml protein G胶结合5mg蛋白的载量上样(腹水抗体含量通常为：1～5mg/ml)

(4)用平衡缓冲液液平衡柱子10柱体积；

(5)用洗脱液洗脱(0.1M pH 2.7甘氨酸-HCl)10个柱体积，分管收集，洗脱蛋白迅速按每1ml加入150ul 1M Tris-Cl pH 9.0的比例进行中和。

(6)SDS-PAGE分析洗脱抗体的量和纯度。

实施例2、鼠单抗亲和力测定

采用proteonTMXPR36Protein Interaction Array System法(可参考文献Bronner V,Denkberg G,Peled M,et al.Therapeutic antibodies:Discovery anddevelopment using the ProteOn XPR36biosensor interaction array system.AnalBiochem 2010；406：147-156)测定HER3单克隆抗体的亲和力。

抗体编号	亲和力常数M
		927	4.13E-9
993	1.66E-10
		1044	5.25E-10
1050	5.83E-9

实施例3、抗Her3单抗对细胞表面Her3分子的识别

采用流式细胞术(FACS)进行检测，间接免疫荧光染色法。

(1)计数：取对数生长期的SKBR-3细胞，调整单细胞悬液浓度为2×106/ml。

(2)洗涤：取1ml单细胞悬液加入1.5ml离心管中，1000rpm×3min。弃上清，用2％PBA(PBS加2％的胎牛血清)洗涤并重悬细胞，1000rpm×3min，弃上清。

(3)一抗孵育：用2％PBA稀释抗Her2单抗至10μg/ml，加入200μl，轻轻吹打混匀细胞，4℃冰浴30min。同时做空白对照和鼠IgG单抗同型对照。1000rpm×3min，弃上清。

(4)荧光二抗孵育：用预冷的2％PBA洗涤一次，加入PBA适当稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG多抗(1μg/106细胞)200μl。轻轻吹打混匀细胞，4℃避光冰浴30min。

(5)用预冷的2％PBA洗涤2次。将细胞重悬于200μl PBS中，轻轻混匀，置流式管中，避光，用流式检测仪检测。

检测结果如图1所示，图1A为抗体927的检测结果，图1B为993的检测结果，图1C为抗体1044的检测结果，图1D为抗体1050的检测结果，从图中可以看出相对于阴性对照，抗体927、993、1044、1050都有一定程度的荧光偏移，并且1044的荧光偏移最大。

图中所示：鼠源抗体927,、993、1044、1050流式细胞术结果。黑色表示对照组，绿色线表示抗体组，M1表示对照组荧光偏移量，M2表示抗体实验组荧光偏移量。

实施例4、HER3鼠源抗体结合HER3胞外区结构域确定

为了确定抗体的表位是在HER3胞外区的具体结构域，本发明人分别构建了分段表达HER3胞外区结构域的真核表达载体。根据HER3胞外区的四个结构域，把胞外区分成DⅠ、DⅡ、DⅢ、DⅣ、DⅠ+Ⅱ、DⅡ+Ⅲ、DⅢ+Ⅳ、DⅠ+Ⅱ+Ⅲ、DⅡ+Ⅲ+Ⅳ九段，分别构建与hGH融合表达的pCDNA3.1(+/-)真核表达载体。分别将这九个表达载体进行瞬时转染表达，以鼠抗hGH单抗包板，检测结构域表达水平；以我们筛选的鼠单抗包ELISA板，检测鼠单抗与HER3胞外区结构域的结合。

单抗	927	993	1044	1050
					结合结构域	DⅠ	DⅢ	DⅢ	DⅠ

实施例5、HER3鼠源单抗表位的确定

通过点突变技术，将HER3胞外区全长的表达质粒的几个氨基酸突变，突变位点分别为第Ⅰ结构域的第125位丝氨酸突变成亮氨酸(S125L)，第150和151位天冬氨酸和精氨酸突变成缬氨酸和脯氨酸(D150V-R 151P)，第162位精氨酸突变成甘氨酸(R162G)第Ⅲ结构域的第467位组氨酸突变酪氨酸(H467Y)，第471和472位精氨酸和精氨酸突变成亮氨酸和甘氨酸(R471L-R472G)。完成突变之后，将突变过的表达质粒通过瞬时转染的方式表达，之后用ELISA的方法检测HER3单抗与具有突变的HER3胞外区结合情况。

从上表中可已看出HER3的第125位的丝氨酸、第150位天冬氨酸和151位精氨酸与抗体927结合相关；HER3的第467位组氨酸与抗体1044结合相关；HER3的第125位的丝氨酸、第150位天冬氨酸和151位精氨酸与抗体1050结合相关。

实施例6、ELISA检测抗体抑制HER3与配体Heregulin的结合

以10μg/ml浓度Trx-HRG融合蛋白包被ELISA板，10％牛奶封闭。

(1)以固定浓度的HER3-ECD融合蛋白(1μg/ml)与不同浓度梯度的单抗混合，37℃预先孵育30min，100μl/孔，加入ELISA板，37℃孵育1h。

(2)PBST洗板10遍，拍干。用5％的脱脂牛奶PBST按1：6000比例稀释兔抗hGH多抗，100μl/孔，37℃孵育1h。

(3)PBST洗板10遍，拍干。用5％的脱脂牛奶PBST按1：6000比例稀释HRP标记的羊抗兔多抗，100μl/孔，37℃孵育1h，用0.5‰PBST洗板10遍。

(4)显色：用DAB法显色，100μl/孔，于室温反应5～10min。

(5)终止：用2M/L硫酸溶液，100μl/孔。

(6)测定OD₄₅₀。

结果如图2所示，从图2中可以看出，鼠单抗抑制HER3与配体HRG(参考文献，Wallasch C,Weiss F U,Niederfellner G,et al.Heregulin-dependent regulation ofHER2/neu oncogenic signaling by heterodimerization with HER3[J].EMBO J.1995,14(17):4267-4275.)结合的IC₅₀分别为927为1.5nM，1044为2.3nM、933为0.3nM、1050为2.8nM。

实施例7、抗HER3单抗对肿瘤生长的抑制作用

(1)处于对数生长期的A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系，购自中国科学院细胞库)，0.25％胰酶消化、收集并计数。

(2)无血清的培养液洗一遍，1000rmp室温离心5min。无血清培养液重悬。按1×10⁷/只的A549细胞接种的裸鼠背部皮下。

(3)两周左右能看到明显的肿瘤长出时，将裸鼠随机分组，每组8只，抗体按500μg/只的剂量进行腹腔注射治疗，以PBS作为对照，每隔三天治疗一次并测量肿瘤体积，治疗持续一个月时间。裸鼠肿瘤体积大小：V＝0.5×a×b²，a为肿瘤实体长直径，b为肿瘤实体短直径。

(4)实验结束时将肿瘤取下，去皮后称重。

结果如图3所示，图3A显示了结果如图3所示，图3A显示了持续治疗时各组的肿瘤体积，图3B显示了治疗结束后取出肿瘤的重量；从图3中可以看出抗体927、抗体993、抗体1044、抗体1050可以显著地抑制肿瘤的生长，4个抗体的肿瘤抑制率≥65％

实施例8、HER3单抗与西妥昔单抗协同抑制A431细胞生长

处于对数期生长的A431细胞(人头颈部表皮癌细胞系，购自中国科学院细胞库)，胰酶消化后计数，用含有1％FBS的DF/12培养基调整细胞密度到20000个细胞/ml，将稀释好的细胞以200ul/孔的量铺到96孔板中，37℃，5％CO₂培养24小时。之后选取96孔板中间的8排4列32个孔，分成8组，每组4个重复，对应加入不同浓度的单抗，单独作用组，HER3单抗终浓度共六个梯度，分别为12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml；西妥昔单抗终浓度为5ug/ml，协同作用组HER3单抗与西妥昔单抗浓度减半混合。对照组中不加入任何抗体。37℃，5％CO₂培养4到5天，之后用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(购自同仁化学)检测细胞活性，细胞活性与OD450读数正相关。

实验结果如图4所示，从图中可以看出将HER3抗体与西妥昔单抗联用，产生了协同效果，1044抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了38％。927抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了32％。993抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了16％。1050抗体与西妥昔单抗的协同效果较不明显。而且，使用本发明的抗体和西妥昔单抗联用可以显著降低西妥昔的用量。

实施例9、HER3单抗可变区编码序列的克隆和鉴定

以实施例1中筛选所得HER3杂交瘤细胞株cDNA为模板，利用PCR技术，克隆HER3鼠源单抗可变区基因；经测序，选取无突变无终止密码子的序列，采用5’RACE技术克隆出功能性V_L和V_H基因。

一、HER3鼠源单抗可变区编码序列的克隆

(一)从杂交瘤细胞株中提取HER3单抗的总RNA

用上海飞捷生物公司FAST1000试剂盒提取。

(1)取4×10⁵杂交瘤细胞,1000rpm×3min，弃上清。用PBS洗涤一次。将细胞重悬于100μlPBS中，放入离心管内。

(2)加入RB1液1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。

(3)加入RB2液500μl，充分颠倒混匀1min。将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管中离心1min。

(4)弃去外套管中液体，内套管中加入500μl洗液，离心1min，再重复一次。

(5)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。

(6)将内套管移入新的离心管中，在膜中央加入洗脱液40μl，室温静置1min，获得总RNA。

(以上枪头、离心管和无菌水均用DEPC处理，经121℃灭菌20min。)

(二)RT-PCR制备HER3鼠源单抗cDNA

以总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，RT-PCR扩增HER3单抗cDNA。反应体系和步骤如图3所示。

(三)HER3鼠源单抗可变区基因的克隆

A、兼并引物的合成

根据抗体信号肽及骨架区基因的保守性，设计并合成以下兼并引物(以下引物中W＝A/T，K＝G/T，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，N＝C/G/T，V＝A/C/G)：

(1)轻链上游可变区兼并引物：根据信号肽序列设计(5’-3’)

根据FR1保守序列设计(5’-3’)

MKac-Fwd GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO.:78)

(2)轻链下游兼并引物(5’-3’)

MKac-Rev GGATACAGTTGGTGCAGCATC(SEQ ID NO.:63)

(3)重链上游兼并引物：根据信号肽序列设计(5’-3’)

(4)重链上游兼并引物：根据FR1保守序列设计(5’-3’)

MHFR Fwd1	SARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO.:71)
		MHFR Fwd2	SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO.:72)
MHFR Fwd3	CAGGTTACTCTGAAAGWGTST(SEQ ID NO.:73)
		MHFR Fwd4	GAGGTCCARCTGCAACARTC(SEQ ID NO.:74)
MHFR Fwd5	GAGGTCCAACTVCAGCARCC(SEQ ID NO.:75)
		MHFR Fwd6	AGAGTGAASSTGGTGGAATC(SEQ ID NO.:76)
MHFR Fwd7	GATGTGAACTTGGAAGTGTC(SEQ ID NO.:77)

(5)重链下游兼并引物

MHCC-Rev ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO.:79)

B、可变区基因的克隆

以上述兼并引物和已制备HER3单抗cDNA为模板，PCR扩增HER3鼠源单抗可变区基因。

(1)PCR体系和参数设置如下：

PCR参数设置：95℃，预变性，5min；30轮如下循环：95℃变性，0.5min，65℃复性，0.5min，72℃延伸，0.5min；72℃延伸，10min。

(2)用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，并与DNA分子量标记LD2000判断扩增片段的大小(如图4所示)。结果显示：分别有5条兼并引物扩增出轻链可变区基因，有4条兼并引物扩增出重链可变区基因，其大小约为330bp左右，条带单一，与轻/重链可变区基因片段的理论大小基本一致。

采用博大泰克公司的胶回收试剂盒回收330bp处的单抗可变区PCR扩增片段，并连接于pMD18T克隆载体(购自Takara公司)上，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送Invitrogen公司测序验证。

根据NCBI IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析结果，筛选出功能性抗体可变区基因，设计抗体轻链和重链可变区下游引物：

采用5’RACE扩增出可变区5’端的序列。最终获得HER3单抗的功能性可变区基因。

得到的抗体基因序列及对应氨基酸序列如下。其中下划线部分表示CDR区。

927H可变区基因序列如(SEQ ID NO.:1所示。

927H可变区氨基酸序列为

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPRSGHTNYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQVSSLTSEDSAVYFCARSRDYYGTNAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:2)。

927L可变区基因序列如SEQ ID NO.:3所示。

927L可变区氨基酸序列为

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.:4)。

927抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：

927抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：

1044H可变区基因序列如SEQ ID NO.:5所示。

1044H可变区氨基酸序列为

EVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGGTFSNYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGGTDYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:6)。

1044L可变区基因序列如SEQ ID NO.:7所示。

1044L可变区氨基酸序列：

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.:8)。

1044抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：

1044抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:8中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISC
CDR1'	24-39	<u>RSSKSLLHSNGITYLY</u>(SEQ ID NO.:26)
			FR2'	40-54	WYLQKPGQSPQLLIY
CDR2'	55-61	<u>QMSNLAS</u>(SEQ ID NO.:27)
			FR3'	62-93	GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
CDR3'	94-102	<u>AQNLELPWT</u>(SEQ ID NO.:28)
			FR4'	103-113	FGGGTKLEIKR

993H可变区基因序列如SEQ ID NO.:9所示。

993H可变区氨基酸序列：

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYSLSWVRQTPEKRLEWVASITFGGTAYYSDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGDGYEDPMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:10)。

993L可变区基因序列如SEQ ID NO.:11所示。

993L可变区氨基酸序列：

DIVMTQTTVSLAVSLGQRATISCRASESVDSYGKSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVSTYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO.:12)。

993抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：

993抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:12中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQTTVSLAVSLGQRATISC
CDR1'	24-38	<u>RASESVDSYGKSFMH</u>(SEQ ID NO.:32)
			FR2'	39-53	WYQQKPGQPPKLLIY
CDR2'	54-60	<u>RASNLES</u>(SEQ ID NO.:33)
			FR3'	61-92	GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVSTYYC
CDR3'	93-101	<u>QQSNEDPYT</u>(SEQ ID NO.:34)
			FR4'	102-111	FGGGTKLEIR

1050H可变区基因序列如SEQ ID NO.:13所示。

1050H可变区氨基酸序列：

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSGHTKCNENFKAKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSRDYYGSNAVDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:14)。

1050L可变区基因序列如SEQ ID NO.:15所示。

1050L可变区氨基酸序列：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.:16)

1050抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:14中位置	序列
			FR1	1-25	QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS
CDR1	26-35	<u>GYSFTSYYIH</u>(SEQ ID NO.:35)
			FR2	36-49	WVKQRPGQGLEWIG
CDR2	50-66	<u>WIFPGSGHTKCNENFKA</u>(SEQ ID NO.:36)
			FR3	67-98	KATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR
CDR3	99-110	<u>SRDYYGSNAVDY</u>(SEQ ID NO.:37)
			FR4	111-121	WGQGTSVTVSS

1050抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:16中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC
CDR1'	24-40	<u>KSSQSLLNSGNQKNYLT</u>(SEQ ID NO.:38)
			FR2'	41-55	WYQQKPGQPPKLLIY
CDR2'	56-62	<u>WASTRES</u>(SEQ ID NO.:39)
			FR3'	63-94	GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC
CDR3'	93-103	<u>QNDYSYPYT</u>(SEQ ID NO.:40)
			FR4'	104-114	FGGGTKLEIKR

实施例10、HER3人-鼠嵌合单克隆抗体真核表达载体的构建

利用重叠PCR技术将轻链V_L基因与人Ig的C_L基因进行拼接，构成轻链嵌合基因；轻链5’端引入BamHI限制性内切酶位点，轻链3’端引入EcoRI限制性内切酶位点。同理，构建重链嵌合基因。分别将上述轻链/重链基因插入pcDNA3.1(+/-)表达载体(购自Invitrogen公司)的单克隆酶切位点，构建HER3人-鼠嵌合抗体的表达载体。

(1)按常规方法设计上下游物，利用PCR技术分别于重链/轻链可变区基因5’端引入BamHI单酶切位点，在重链/轻链恒定区基因3’端引入EcoR I单酶切位点。BamHI和EcoRI双酶切重链/轻链嵌合基因，切胶回收目的片段。

(2)pcDNA3.1(+/-)真核表达载体的处理：BamHI和EcoRI双酶切pcDNA3.1(+/-)载体，切胶回收目的片段(～5400bp)。

(3)将(1)中抗体重链/轻链基因分别克隆到(2)中pcDNA3.1(+/-)载体的BamHI和EcoRI位点。

(4)用上述连接产物转化DH5α感受态细胞，小量抽提重组质粒DNA。挑选插入目的片段的阳性克隆送上海Invitrogen公司测序鉴定。

经酶切及测序鉴定，验证本发明构建的HER3单抗重链/轻链的重组表达载体其序列正确。

本实施例中的HER3人-鼠嵌合单克隆抗体的核酸序列和氨基酸序列如下。

人-鼠嵌合序列927重链氨基酸序列为：

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPRSGHTSNYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQVSSLTSEDSAVYFCARSRDYYGTNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:42)

人-鼠嵌合序列927重链核酸酸序列如SEQ ID NO.:50所示。

人-鼠嵌合序列993重链氨基酸序列为：

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYSLSWVRQTPEKRLEWVASITFGGTAYYSDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGDGYEDPMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:43)

人-鼠嵌合序列993重链核酸序列如SEQ ID NO.:51所示。

人-鼠嵌合序列1044重链氨基酸序列：

EVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGGYTFSNYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGGTDYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:44)

人-鼠嵌合序列1044重链核酸序列如SEQ ID NO.:52所示。

人-鼠嵌合序列1050重链氨基酸序列：

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSGHTKCNENFKAKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSRDYYGSNAVDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:45)

人-鼠嵌合序列1050重链核酸序列如SEQ ID NO.:53所示。

人-鼠嵌合序列927轻链氨基酸序列：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:46)

人-鼠嵌合序列927轻链核酸序列如SEQ ID NO.:54所示。

人-鼠嵌合序列993轻链氨基酸序列：

DIVMTQTTVSLAVSLGQRATISCRASESVDSYGKSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVSTYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO.:47)

人-鼠嵌合序列993轻链核酸序列如SEQ ID NO.:55所示。

人-鼠嵌合序列1044轻链氨基酸序列：

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:48)

人-鼠嵌合序列1044轻链核酸序列如SEQ ID NO.:56所示。

人-鼠嵌合序列1050轻链氨基酸序列：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:49)

人-鼠嵌合序列1050轻链核酸序列如SEQ ID NO.:57所示。

实施例11、HER3人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

采用脂质体法将本发明的HER3人-鼠嵌合抗体重链/轻链表达载体共转染CHO/dhfr^-细胞(购自ATCC)，以未转染质粒的空细胞对照。培养72h后，采用常规ELISA法，用HRP标记的羊抗人IgG抗体检测HER3人-鼠嵌合抗体的表达及嵌合抗体对HER3抗原的特异性识别。

鉴定结果如下表所示：

ELISA法检测了培养72h后细胞培养上清的OD450值，上表中“+”表示阳性、“-”表示阴性。

结果显示，共转染表达质粒载体的CHO细胞成功表达嵌合抗体，能有效识别HER3抗原，而未转染表达质粒的CHO细胞培养上清不能识别HER3抗原。即瞬时转染CHO成功表达了能特异性识别HER3抗原的人-鼠嵌合抗体。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海生物制品研究所有限责任公司

<120> 抗HER3抗体、其制法及其应用

<130> P2019-1050

<160> 79

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactata tacactgggt gaaacagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttccta gaagtggtca tactaattac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcaggtca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgaga 300

gattactacg gaactaatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tcc 363

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Arg Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Tyr Gly Thr Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 3

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgttt aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

gaggtccagc tgcaacagtc tggaactgaa ctgatgaaac ctggggcctc ggtgaagata 60

tcctgcaagg ctactggcgg cacattcagt aactactgga tagactgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtgg tactgactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagagatgat 300

tacgacgtgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctcttc c 351

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 7

gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120

tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagttggaa atcaaacgg 339

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 9

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctattccc tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attacttttg gtggtaccgc ctactattca 180

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240

caaatgagca gtctgaagtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgtaag aggcgatggt 300

tacgaagatc ctatggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Phe Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Asp Gly Tyr Glu Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 333

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 11

gatattgtga tgacccagac tacagtctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atatcttgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca aaagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc gcccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggagg ctgatgatgt ttcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggagata aga 333

<210> 12

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Lys Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105 110

<210> 13

<211> 363

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 13

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtca tactaagtgc 180

aatgagaact tcaaggccaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgaga 300

gattactacg gtagtaatgc tgtggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tcc 363

<210> 14

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Lys Cys Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ala Val Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 342

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 15

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttctcaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342

<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

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<213> 小鼠

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<213> 小鼠

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Trp Ile Phe Pro Arg Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

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Gly

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<213> 小鼠

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Ser Arg Asp Tyr Tyr Gly Thr Asn Ala Met Asp Tyr

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<213> 小鼠

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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

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<213> 小鼠

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Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

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Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Asp

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<213> 小鼠

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Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

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Gly

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<213> 小鼠

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Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr

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Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

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Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

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Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr

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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Ser

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Ser Ile Thr Phe Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly

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Gly Asp Gly Tyr Glu Asp Pro Met Asp Tyr

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Ala

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<213> 小鼠

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Ser Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ala Val Asp Tyr

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<213> 小鼠

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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

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<213> 小鼠

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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

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Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

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<212> PRT

<213> 人

<400> 41

Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu

1 5 10 15

Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr

35 40 45

Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu

50 55 60

Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile

65 70 75 80

Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr

85 90 95

Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp

100 105 110

Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser

115 120 125

His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser

130 135 140

Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr

145 150 155 160

Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val

165 170 175

Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly

180 185 190

Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr

195 200 205

Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn

210 215 220

Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp

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Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val

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Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu

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Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala

275 280 285

Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala

290 295 300

Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys

305 310 315 320

Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser

325 330 335

Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val

340 345 350

Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu

355 360 365

Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu

370 375 380

Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln

385 390 395 400

Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr

405 410 415

Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile

420 425 430

Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu

435 440 445

Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr

450 455 460

His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu

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Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu

485 490 495

Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro

500 505 510

Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val

515 520 525

Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala

530 535 540

His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu

545 550 555 560

Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys

565 570 575

Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly

580 585 590

Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn

595 600 605

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Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr

625 630 635 640

His Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe

645 650 655

Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln

660 665 670

Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu

675 680 685

Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe

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Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe

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Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys

725 730 735

Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser

740 745 750

Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His

755 760 765

Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln

770 775 780

Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg

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Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val

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Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His

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Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val

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Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys

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Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu

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Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu

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His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu

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Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly

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Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr

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Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala

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Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met

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1325 1330 1335

Ala Gln Arg Thr

1340

<210> 42

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

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Ser Pro Gly Lys

450

<210> 43

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ser Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Ser Ile Thr Phe Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

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Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

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Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

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Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

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420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 44

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gly Tyr Thr Phe Ser Asn

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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

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405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 45

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 45

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Lys Cys Asn Glu Asn Phe

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Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ala Val Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 46

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 47

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Lys Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 48

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 49

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 50

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactata tacactgggt gaaacagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttccta gaagtggtca ttctaattac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcaggtca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgaga 300

gattactacg gaactaatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

<210> 51

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctattccc tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attacttttg gtggtaccgc ctactattca 180

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240

caaatgagca gtctgaagtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgtaag aggcgatggt 300

tacgaagatc ctatggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210> 52

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gaggtccagc tgcaacagtc tggaactgaa ctgatgaaac ctggggcctc ggtgaagata 60

tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga tagactgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtgg tactgactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagagatgat 300

tacgacgtgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctcttc cgcatccacc 360

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctccgggtaa a 1341

<210> 53

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagtggtca tactaagtgc 180

aatgagaact tcaaggccaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgaga 300

gattactacg gtagtaatgc tgtggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

<210> 54

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgttt aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

<210> 55

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gatattgtga tgacccagac tacagtctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atatcttgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca aaagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc gcccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggagg ctgatgatgt ttcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggagata agaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 56

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120

tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagttggaa atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210> 57

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttctcaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

<210> 58

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gaattcccac catggagaca gacacactcc tgctat 36

<210> 59

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gaattcccac catggatttt caagtgcaga ttttcag 37

<210> 60

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gaattcccac catggagwca cakwctcagg tctttrta 38

<210> 61

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gaattcccac catgkccccw rctcagytyc tkgt 34

<210> 62

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

gaattcccac catgaagttg cctgttaggc tgttg 35

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26

<210> 65

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

atgatggtgt taagtcttct gtacc 25

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

atgtacttgg gactgagctg tgtat 25

<210> 69

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

atgagagtgc tgattctttt gtg 23

<210> 70

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

atggattttg ggctgatttt ttttattg 28

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 71

sargtnmagc tgsagsagtc 20

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 72

sargtnmagc tgsagsagtc wgg 23

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

caggttactc tgaaagwgts t 21

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gaggtccarc tgcaacartc 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gaggtccaac tvcagcarcc 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

agagtgaass tggtggaatc 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 78

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gayattgtgm tsacmcarwc tmca 24

<210> 79

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

atagacagat gggggtgtcg ttttggc 27

Claims (18)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

(1)互补决定区CDR1

所述互补决定区CDR1选自：SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:29和SEQ ID NO.:35；

(2)互补决定区CDR2

所述互补决定区CDR2选自：SEQ ID NO.:18、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:36；

(3)互补决定区CDR3

所述互补决定区CDR3选自：SEQ ID NO.:19、SEQ ID NO.:31和SEQ ID NO.:37。

2.如权利要求1所述的抗体的重链可变区，其中，所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示；或者

所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31所示；或者

所述重链可变区的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:35、SEQ ID NO.:36和SEQ ID NO.:37所示；

优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:2、10或14所示的氨基酸序列。

3.一种抗体重链，其特征在于，所述抗体重链具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区；优选地，所述抗体重链具有SEQ ID NO.:42、43或45所示的氨基酸序列。

4.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

(1)互补决定区CDR1'

所述互补决定区CDR1'选自：SEQ ID NO.:20、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:38；

(2)互补决定区CDR2'

所述互补决定区CDR2'选自：SEQ ID NO.:21、SEQ ID NO.:33和SEQ ID NO.:39；

(3)互补决定区CDR3'

所述互补决定区CDR3'选自：SEQ ID NO.:22、SEQ ID NO.:34和SEQ ID NO.:40。

5.如权利要求4所述的抗体的轻链可变区，其中，所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:20、SEQ ID NO.:21和SEQ ID NO.:22所示；或者

所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.:32、SEQ ID NO.:33和SEQ ID NO.:34所示；或者

所述轻链可变区的三个互补决定区CDR1'、CDR2'、CDR3'的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.:38、SEQ ID NO.:39和SEQ ID NO.:40所示；

优选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:4、12或16所示的氨基酸序列。

6.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求4所述的抗体的轻链可变区；优选地，所述抗体轻链具有SEQ ID NO.:46、47或49所示的氨基酸序列。

7.一种特异性结合HER3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有以下特性：

(1)与HER3蛋白亲和力常数M≥1×10^-10；

(2)结合HER3胞外区的DI或DIII结构域。

8.如权利要求7所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区，和/或

(2)如权利要求4所述的轻链可变区；或者

所述单克隆抗体具有：

(1)如权利要求3所述的重链，和/或

(2)如权利要求6所述的轻链。

9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求3所述的抗体重链、如权利要求4所述的抗体的轻链可变区、如权利要求6所述的抗体轻链、或如权利要求7所述的单克隆抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HER3。

在另一优选例中，所述的重组蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.:42、43、45、46、47或49所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(a)衍生的且特异性抗HER3的多肽。

10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)载体部分，所述载体部分含有如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求3所述的抗体重链、如权利要求4所述的抗体的轻链可变区、如权利要求6所述的抗体轻链、或如权利要求7所述的单克隆抗体或权利要求9所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

11.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：

如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求3所述的抗体重链、如权利要求4所述的抗体的轻链可变区、如权利要求6所述的抗体轻链、或如权利要求7所述的单克隆抗体或权利要求9所述的重组蛋白。

12.一种载体，其特征在于，它含有权利要求11所述的多核苷酸。

13.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求12所述的载体或基因组中整合有权利要求11所述的多核苷酸。

14.一种制备重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求7所述的单克隆抗体或权利要求9所述的重组蛋白。

15.一种药物组合物，其特在于，所述组合物中含有：

(i)如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求3所述的抗体重链、如权利要求4所述的抗体的轻链可变区、如权利要求6所述的抗体轻链、或如权利要求7所述的单克隆抗体或权利要求9所述的重组蛋白；以及

(ii)药学上可接受的载体。

16.如权利要求16所述的药物组合物，其特在于，所述组合物还包含西妥昔单抗。

17.如权利要求1所述的抗体的重链可变区、如权利要求3所述的抗体重链、如权利要求4所述的抗体的轻链可变区、如权利要求6所述的抗体轻链、或如权利要求7所述的单克隆抗体或权利要求9所述的重组蛋白，用于：

(a)细胞的分离、制备、提取、检测；或

(b)制备用于分离、制备、提取、检测细胞的产品。

18.一种检测样品中是否含有HER3蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)将样品与权利要求7所述的单克隆抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HER3蛋白。

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