CN117801102A

CN117801102A - 一种猫血清淀粉样蛋白a单克隆抗体、检测试纸条及应用

Info

Publication number: CN117801102A
Application number: CN202410231378.6A
Authority: CN
Inventors: 孙雅丽; 赵荣茂; 巩玉洁; 袁婷婷; 张琼林; 杜锦然; 王亚玲
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2024-03-01
Filing date: 2024-03-01
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2044-03-01
Also published as: CN117801102B

Abstract

本发明公开了一种猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、检测试纸条及应用，属于宠物快速生物检测技术领域。所述单克隆抗体含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区，所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。所述单克隆抗体可用于制备猫血清淀粉样蛋白A检测试剂盒和检测试纸条。本发明所提供的猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条用于定量检测猫血清中的血清淀粉样蛋白A，提高了检测灵敏度，提升了检测效率和检测灵敏度，可为猫炎症诊断提供依据。

Description

一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、检测试纸条及应用

技术领域

本发明实施例涉及宠物快速生物检测技术领域，具体涉及一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、检测试纸条及应用。

背景技术

血清淀粉样蛋白A（SAA）是一类多基因编码的多形态蛋白，一种高密度脂蛋白相关的载脂蛋白，是组织淀粉样蛋白A的前体物质，存在于许多物种中，如人、犬、猫和马等，属于非特异性急性相反应蛋白。正常情况下血浆含量极少，正常值的参考范围在0.05~2.5 μg/ml，当机体受到病毒、细菌、支原体、衣原体等抗原刺激后，肝脏合成大量的SAA进入到血液中，4-6小时内即可迅速升高约1000倍，清除病原体后则迅速降低，是反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标。

SAA是猫最有效的炎症标志物。临床上，在猫出现多种炎症或传染性疾病的时候，SAA能以最快速产生应答。SAA在猫体内有以下特征：（1）健康猫体内SAA的浓度较低；（2）炎症刺激后迅速增加（3-6小时），24小时后达到最大浓度；（3）患有炎症性疾病如猫传染性腹膜炎、急性胰腺炎和手术创伤后的猫SAA浓度通常显著升高，<5 μg/ml表示没有炎症，5-10μg/ml表示偏高或轻微炎症，>10 μg/ml表示明显炎症，同时一些非炎症性疾病如糖尿病和甲状腺功能亢进也会引起SAA升高。

SAA是一种主要的猫急性期蛋白，在猫的疾病诊断、预后及治疗起到积极的指导作用。近30年来，研究者探索出了多种猫SAA检测方法，主要包括：乳胶凝集法、ELISA以及免疫层析法。在这些检测方法中，乳胶凝集法是半定量检测法，目前已经基本上被淘汰；ELISA能检出极低浓度猫SAA，但试验流程繁琐、消耗时间长且极低浓度猫SAA的临床意义有限；胶体金免疫层析局限于定性检测，不能进一步定量反应猫体内SAA浓度。

综上所述，制备出猫SAA蛋白特异性抗体并且对于临床准确检测猫SAA指标有着重要意义。目前市面上的检测方法存在各种技术缺陷缺点，亟需通过免疫学等手段设计、筛选猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体来实现对猫血清淀粉样蛋白A特异性检测识别。

发明内容

为此，本发明提供了一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、检测试纸条及应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，其含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区，所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成；

所述单克隆抗体的V_H的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述单克隆抗体的V_L的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；

所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述单克隆抗体的V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第51-55位所示；

所述单克隆抗体的V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第70-86位所示；

所述单克隆抗体的V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第119-127位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第44-55位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第71-77位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第110-118位所示。

第二方面，编码所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。

第三方面，猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体在在制备猫血清淀粉样蛋白A检测试剂盒和检测试纸条中的应用。

优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；

优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，利用该抗体制备的猫血清淀粉样蛋白A荧光定量检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。而且可以减少购买商品化猫SAA单克隆抗体昂贵的成本。本发明试纸条可实现猫血清淀粉样蛋白A现场的快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的pET-32a菌液诱导表达纯化后SDS-PAGE鉴定图；

图2为本发明实施例提供的SAA单克隆抗体鉴定纯化后SDS-PAGE鉴定图。

图1中，1、pET-32a菌液未诱导；2、pET-32a菌液诱导后上清；3、纯化后重组SAA蛋白。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、猫血清淀粉样蛋白A制备

1.猫血清淀粉样蛋白A基因合成

根据NCBI上公布的猫SAA基因序列（GenBank Accession AB242838.1），将该基因序列做密码子优化后交由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成，合成至pET-32a载体上，以BL21感受态为宿主菌进行保种。

2.表达及纯化

取保种的pET-32a/BL21种子液按照1:1000的比例接种至10 ml含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床，37℃，220 rpm过夜培养。次日，将活化后的菌液按照1:100的比例接种至500 ml含Amp+的LB液体培养基中，置于恒温摇床，37℃，220 rpm培养约4 h，当菌液OD_600nm值为0.6时加入终浓度为0.5 mM的IPTG溶液进行诱导，30℃诱导5 h，诱导完成的菌液暂放于4℃。次日12000 rpm离心10 min收集菌体，取30 ml的缓冲A液（50 mM Tris+300 mMNaCl，pH8.0）重悬菌体，超声破碎20 min后，菌液呈澄清透亮的状态。12000 rpm离心15 min收集上清液。

用Ni预装柱（GE）对破碎后上清液进行纯化。先用10倍柱体积的双蒸水冲洗柱子，再用10倍柱体积的缓冲A液平衡柱子，然后将破碎后上清液用0.45 μm滤膜过滤后开始上样。上样结束后，再用缓冲A液平衡柱子，直至UV峰值基线平稳。先用20% B液（50mM Tris+300mM NaCl+500mM 咪唑，pH8.0）洗杂，直至UV峰值基线平稳，再用100% B液洗脱目的蛋白，当UV值升高时开始收集洗脱液，直到UV峰值基线下降至100 mAu以下停止收集。收集到的目的蛋白洗脱液用1×PBS透析，透析后测浓度并于-20℃保存备用。

3.猫重组SAA蛋白的纯度鉴定

重组pET-32a菌液诱导表达后，经镍柱亲和纯化，SDS-PAGE检测表达产物，鉴定如图1，在30kD左右的位置可见一条明显的目的条带，与预期大小一致，纯度约95%。可用于制备单克隆抗体。

实施例2、猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备

1.动物免疫

取3只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只免疫50 μg的重组SAA蛋白。首次免疫时，将SAA蛋白与弗氏完全佐剂做等体积乳化，皮下多点注射免疫小鼠。共免疫三次，每两周免疫一次，二次免疫和三次免疫均用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，免疫剂量和方式不变。三次免疫后一周对小鼠进行尾静脉采血，取血清并通过间接ELISA法测其效价，同时空白小鼠血清作为对照。免疫后小鼠血清效价结果见表1，结果显示，血清效价最高可达1:5.12×10⁵。取100 μg的SAA蛋白用1×PBS稀释成200 μL，腹腔注射对小鼠进行加强免疫，三天后可进行细胞融合。

表1免疫小鼠血清效价检测

2.SP2/0骨髓瘤细胞的培养

取出一支液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，将其立即转移到37℃恒温水浴锅中，不时轻柔晃动冻存管，当细胞融化至半冰晶状态时取出。在无菌环境下把冻存管中的SP2/0细胞转移至50 ml无菌离心管中，取预热的1640完全培养基10 ml缓慢滴入离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清。将细胞团轻柔打散，取5 ml培养基重悬细胞并将其转移至T75细胞培养瓶中，再补加5 ml培养基，“十字”方向晃动细胞瓶，放入CO₂细胞培养箱，37℃环境下培养。显微镜观察细胞状态，当密度约为80%时，对SP2/0细胞进行传代培养。

3.细胞融合

（1）实验鼠准备：取冲击后的实验鼠摘眼球取全血，收集在EP管中，37℃静置2 h后，4000 rpm离心10 min，收集血清为后续筛选单克隆抗体作为阳性对照使用。脱颈处死小鼠并将其浸泡于75%酒精中。

（2）脾细胞的制备：在生物安全柜内使用已灭菌的剪刀和镊子完成以下三个步骤：剪开小鼠外皮、腹膜、取出脾脏并剪掉多余的脂肪，每个步骤均需更换灭菌的剪刀和镊子。将脾脏放入已加入10 ml DMEM培养基的无菌15 ml离心管中，脾脏润湿后小心弃去多余培养基，再取DMEM 10 ml清洗脾脏1~2次，弃液。取50 ml无菌离心管，加入40 ml的DMEM培养基，先吸取10 ml置于无菌平皿中，用毛玻璃片在皿内同一方向研磨脾脏，制成单细胞悬液并通过200目尼龙网过滤到另一新的50 ml无菌离心管中，将50 ml无菌离心管中剩余的30ml DMEM分次吸取润洗尼龙网，全部润洗液均加入放置脾细胞悬液的50 ml离心管中。将脾细胞悬液以1500 rpm的转速离心5 min，弃上清，用手轻柔打散细胞团，再加入30 ml DMEM培养基重悬后再离心一次，然后弃上清，用手轻柔打散细胞团，再加入10 ml DMEM培养基重悬。

（3）细胞融合：1000 rpm，5 min离心收集状态良好的SP2/0细胞置于50 ml离心管中，轻柔打散SP20细胞团，加入30 ml DMEM培养基重悬，再离心一次后，然后弃上清，用手轻柔打散细胞团后加入10 ml DMEM培养基重悬，再将脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混合，1000rpm离心5 min，弃上清，轻柔打散细胞团。在37℃水浴环境下，吸取1 ml PEG融合剂1 min内缓慢滴加到离心管中，滴加过程中需晃动离心管，此时细胞状态为红色均质流沙状，转动管壁眼观似毛玻璃状。

（4）终止融合：吸取9 ml预热 DMEM培养基来终止融合，共分为三个阶段：第一阶段为前1 min内滴加1 ml，第二阶段为1 min内滴加1 ml，第三阶段为3 min内滴加完剩余的7ml培养基；滴加过程中需晃动离心管。然后在37℃水浴中静置5 min后，800 rpm离心5 min。

（5）铺板：弃上清，轻柔打散细胞团，加入HAT培养基（需要铺5块96孔板，200 μL/孔，除去已提前铺好100 μL/孔的饲养层细胞，则需要加入50 ml的HAT培养基），混匀细胞后，将融合细胞悬液均匀铺于已加入饲养层细胞的96孔细胞板中，100 μL/孔，置于CO₂细胞培养箱在37℃条件下培养。

4.阳性杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后7天，观察到细胞团比较大时，用间接ELISA法对细胞上清进行检测。以1 μg/ml的重组SAA蛋白作为检测用的抗原，阳性对照是融合小鼠的血清，阴性对照为PBS免疫小鼠血清。选取显色反应最强的杂交瘤细胞孔确定为阳性孔。将筛选到的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法亚克隆。将亚克隆后鉴定得到的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，转移至T75细胞瓶中，培养至细胞数量约80%时，可收集为制备腹水做准备。

5.腹水制备

细胞瓶中加入10 ml的无菌1×PBS，吹下细胞层，重悬后将其转移到15 ml离心管中，1000 r/min离心10 min。弃掉上清，沉淀另取1 ml无菌1×PBS重悬混匀，用1 ml注射器吸取。每只小鼠注射约500 μL的细胞悬液，注意小鼠生长状态，约一周后待小鼠腹部涨大时方可收集腹水。收集小鼠腹水于离心管中，12000 r/min离心10 min，吸取中间腹水层。

6.猫SAA单克隆抗体纯化

对收集到的腹水先进行辛酸-硫酸铵法粗纯化，再使用Protein G预装柱对粗纯化的单抗进行二次纯化。

实施例3、猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体亚类鉴定

使用Sigma公司的IgG亚类鉴定试剂盒对实施例2中纯化后得到的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体进行检测，结果表明实施例2中得到的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体为IgG1型。

2.猫SAA蛋白的单克隆抗体的浓度测定

采用核酸蛋白浓度测定仪对实施例2中纯化后的猫SAA单克隆抗体进行浓度测定，结果单克隆抗体浓度为6.3 mg/ml。

3.猫SAA单克隆抗体的纯度鉴定

SDS-PAGE鉴定实施例2中纯化后的猫SAA单克隆抗体纯度，结果见图2，在25 kDa和50 kDa附近出现2条清晰条带，25 kDa处为抗体轻链，50 kDa处为抗体重链，纯度约95%可以达到预期要求。

4.猫SAA单克隆抗体的灵敏度鉴定

采用间接ELISA方法检测猫SAA单克隆抗体灵敏度及特异性，结果见表2。实施例2中纯化后的猫SAA单克隆抗体经鉴定发现可以与1μg/ml猫SAA稀释51200倍仍与之结合，呈阳性效果，表示其灵敏度高。

表2猫SAA单克隆抗体灵敏度验证

5.猫SAA单克隆抗体特异性鉴定

分别取猫SAA蛋白、猫C反应蛋白、猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白和猫疱疹病毒gB蛋白按照1 μg/ml进行包被，取1 mg/ml的实施例2中制备的猫SAA单克隆单体做1:5000稀释，以免疫小鼠血清作为阳性对照，以1×PBS作为阴性对照，验证单抗的特异性，结果见表3。

表3猫SAA单克隆抗体特异性验证

实施例4、猫SAA单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆

1.杂交瘤细胞培养及总RNA提取

用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×10⁷时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。

2.cDNA第一链的合成

使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取到的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。

3.基因扩增

设计Lambda链，Kappa链，Heavy链的下游引物及上游通用引物。

引物：F:AAGCAGTGGTATCAACGCAGA

R_κ:AACATTGATGTCTTTGGGGTAGAA

R_λ:AATCGTACACACCAGTGTGTGGG

R_H:AGGGATCCAGAGTTCCAGGT

以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μL。模板3 μL，上游引物（10 μM）2.5 μL，下游引物（10 μM）2.5 μL，2×Taq酶25 μL，无菌水17 μL。

降落PCR反应条件为：98℃ 30 s；98℃ 15 s，64℃-58℃ 30 s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30 s；98℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循环15次；72℃ 7 min结束程序。

4.PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（购自天根）回收Kappa链，Lambda链和Heavy链扩增片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。

Heavy链和Kappa链测序结果如下：

Heavy链氨基酸序列（SEQ ID No. 1）

MYRMQLLSCIALSLALVTNSQVQLQQSGGELMKPGASVKISCKATGYRFSNDWIQWVKQRPGHGLEWIGEIPAVGSGSNYNEKFKGKVIFTADTSSNTVYMQFSSLTSEDSAVYFCARGGRDSWFVYWGQGTLVTVSA。

Heavy链核苷酸序列（SEQ ID No. 2）

ATGTACCGCATGCAGCTGCTGTCTTGCATCGCCCTGTCTCTGGCTCTGGTGACCAATAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGGAGAACTGATGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAGATCTCTTGCAAGGCCACCGGCTACAGGTTCTCCAACGACTGGATCCAGTGGGTGAAGCAGAGACCAGGACACGGACTCGAGTGGATCGGAGAAATACCTGCCGTAGGCAGCGGAAGCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGTCATCTTCACCGCCGACACCTCTAGCAACACCGTGTACATGCAGTTCAGCAGCCTGACCAGCGAGGACTCAGCCGTGTACTTTTGCGCCAGAGGAGGCAGGGACAGTTGGTTCGTCTATTGGGGGCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCAGCC。

Kappa链氨基酸序列（SEQ ID No. 3）

MYRMQLLSCIALSLALVTNSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRATREHIFSYLTWYQQKQGKSPHLLVYNAKTVAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCWIHFGAPRTFGGGTKLEIR。

Kappa链核苷酸序列（SEQ ID No. 4）

ATGTACCGCATGCAGCTGCTGTCTTGCATCGCTCTGTCTCTGGCCCTGGTGACCAATAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAGCCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGAGAGACAGTGACAATCACTTGCCGGGCCACGCGAGAACACATCTTCAGCTACCTGACTTGGTACCAGCAGAAGCAGGGCAAGAGCCCTCACCTGCTGGTGTACAACGCCAAGACAGTGGCCGAAGGAGTGCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGAACACAGTTCAGCCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGGCACCTACTATTGCTGGATCCACTTCGGCGCCCCTAGAACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAGA。

5.可变区核苷酸序列和氨基酸序列及同源性分析

将重链和轻链基因序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示，实施例2制备的猫SAA单克隆抗体重链可变区基因序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区基因序列（Sequence ID: KP771818.1）同源性最高，同源性为240/303，同源性百分比为79%。实施例2制备的猫SAA单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列（Sequence ID: AAD23750.1）同源性最高，同源性为99/119，同源性百分比为83%。实施例2制备的猫SAA单克隆抗体轻链可变区基因序列BLAST结果匹配度均比较低，与人源重链可变区基因序列（Sequence ID: KX386287.1）覆盖度为19%，同源性为61/74，且同源性百分比为82.43%。实施例2制备的猫SAA单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列（Sequence ID: ACB48001.1）同源性最高，同源性为95/108，同源性百分比为88%。编码实施例2制备的猫SAA单克隆抗体的重链和轻链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。

6.CDR区分析

将重链可变区和轻链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html使用Kabat法进行分析，得出其CDR区。

抗体重链CDR区：

CDR-H1：NDWIQ；

CDR-H2：EIPAVGSGSNYNEKFKG；

CDR-H3：GGRDSWFVY。

抗体轻链CDR区：

CDR-L1：RATREHIFSYLT；

CDR-L2：NAKTVAE；

CDR-L3：WIHFGAPRT。

实施例5、猫血清淀粉样蛋白A荧光定量检测试纸条的制备

猫血清淀粉样蛋白A荧光定量检测试纸条结构由底板、样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线、质控线和结合物释放垫组成。

具体制作步骤：

步骤一：时间分辨荧光微球标记猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和鸡IgY

时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200 nm的时间分辨荧光微球超声5 min，取200 μL微球加入1800 μL MES（50 mmol/L，pH6.0），16000 rpm离心10 min，弃上清重复两次；然后加入2 ml MES重悬微球。

微球的活化：称量NHS和EDC各40 mg，用标记缓冲液溶解至20 mg/ml的浓度，NHS和EDC需现用现配；在已清洗好的微球中加入20 μL NHS，快速混匀；然后再向微球中加入10 μL EDC，快速混匀，室温孵育20 min。

清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000 rpm离心10 min，弃上清，重复两次；然后加入2 ml MES重悬微球，备用。

时间分辨荧光微球与抗体的偶联：在活化好的微球分成两等份，分别加入0.02 mg猫SAA蛋白单克隆抗体和0.01mg鸡lgY抗体，快速混匀，室温孵育2 h。

封闭：加入与量取的微球等体积的封闭液（10% BSA），室温孵育1 h。

去除未结合的抗体：16000 rpm离心10 min，弃上清，加入1 ml MES重悬微球，重复两次，以去除未结合的抗体。

重悬复溶：配制含20%蔗糖、20%海藻糖的0.02 M Tris-HCl，调节pH=8.0作为复溶缓冲液；取1 ml复溶缓冲液重悬微球，即为时间分辨荧光微球标记的猫SAA蛋白单克隆抗体复合物和鸡lgY抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。

步骤二：结合物释放垫的制备

结合物释放垫的前处理：配制含5%蔗糖、5%海藻糖、0.5%国药Tween 20、0.1%酪蛋白、pH 8.0的0.02 M Tris-HCL结合垫处理液。

将玻璃纤维放入上述配制的结合垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上60 rpm摇晃30 min，1200 r/min，脱水14 min，40℃烘箱过夜烘干。

用金标喷金仪将制备好的时间分辨荧光微球标记的猫SAA单克隆抗体和鸡IgY抗体-微球标记复合物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1 cm结合物释放垫喷涂2.5 μL，然后置于40℃环境中16 h后取出，置于干燥环境中保存备用。

步骤三：样品垫的处理

样品吸收垫处理液的配制：配制含0.8% BSA（IgG Free）、0.1%酪蛋白、0.6%曲拉通-100、0.03%PC-300的0.1M Tris-HCl，调节pH=8.0作为样品垫处理液。

样品吸收垫的制备：将样品吸收垫放入上述配制的样品吸收垫处理液中，液体需要淹没整块样品吸收垫，置于设定转速为60 rpm的轨道摇床上，反应30 min后1200 rpm离心14 min以脱水，置于40℃烘箱干燥16 h，保存备用。

步骤四：硝酸纤维素膜的制备

（1）将时间分辨荧光微球标记的猫SAA蛋白单克隆抗体复合物包被在硝酸纤维素膜上构成检测线T。包被过程如下：用0.05 mol/L、pH7.2磷酸缓冲液将时间分辨荧光微球标记的猫SAA蛋白单克隆抗体复合物稀释至0.5 mg/ml的浓度，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线T，包被量为1.0 μL/cm。

（2）将鸡IgY抗体-微球标记复合物包被在硝酸纤维素膜上构成质控线C。包被过程如下：用0.01 mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将鸡IgY抗体-微球标记复合物稀释至20 μg/ml的浓度，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线C，包被量为1.0 μL/cm。

（3）将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥16 h，保存备用。

步骤五：各部件的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线T和质控线C，检测线T和质控线C均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线T位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线C位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，用加入干燥剂的铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。

实施例6、猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的应用

步骤一：样本的制备

采用抗凝管采血，或在采血管中加入抗凝剂，采血后混匀备用。

步骤二：试纸条检测

所需试纸条和样本稀释液恢复至室温（20~25℃）。以移液器吸取10 μL垂直加入样本稀释液中，充分混匀，此为待测液。用移液器吸取100 μL待测液垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，室温反应5 min，用荧光免疫分析仪对试纸条进行读值。若未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，应用新的试纸条重新测试。

步骤三：检测结果判读

浓度≤5 mg/L，表明处于正常生理状态，浓度>10 mg/L表明体内猫SAA蛋白含量偏高，具体见表4。

表4检测结果判读

实施例7、猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的特性鉴定

对制备的猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条进行特性鉴定，包括灵敏度鉴定、特异性鉴定、稳定性鉴定。

（1）猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的灵敏度鉴定

将猫SAA阳性质控品用样本稀释液配制成系列浓度（mg/L）：0、2、5、10、30、60、120，分别用该试纸条进行检测，结果如表5所示，T线发光值随阳性质控样浓度的增高而增高，说明猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的灵敏度较好。

表5猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的灵敏度验证

（2）猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的特异性鉴定

用猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条测试5倍稀释的猫SAA阳性样本、猫C反应蛋白（猫CRP）阳性样本、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫冠状病毒，结果见表6。检测猫SAA阳性样本为阳性，其余5份样本检测结果均为阴性且T线发光值都很低，说明该检测试纸条与猫CRP阳性样本、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫冠状病毒均没有交叉，特异性较好。

表6猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的特异性验证

（3）猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的稳定性鉴定

将制备好的试纸条放置在4℃、25℃、37℃环境中进行加速试验，分别在0 d、3 d、7d、14 d、30 d及60 d取出，并用其检测实际样品，对实测浓度和实际样品浓度数值进行误差分析，结果见表7。CV均<10%，表明本发明所提供的试纸条具有良好的稳定性。

表7猫血清淀粉样蛋白A荧光微球定量检测试纸条的稳定性验证

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区；

所述单克隆抗体的V_H的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；

所述单克隆抗体的V_L的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；

所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；

2.权利要求1所述的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，其特征在于：

编码所述单克隆抗体的V_H的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

编码所述单克隆抗体的V_L的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。

3.权利要求1所述的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体在制备猫血清淀粉样蛋白A检测制品中的应用。