CN115819578B - 高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供高亲和力Human IL‑5兔单克隆抗体及其应用。本发明提供针对Human IL‑5的高亲和力兔单克隆抗体对，开发出高灵敏度、特异性针对IL‑5蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法。其中，捕获抗体为针对人IL‑5的兔单克隆抗体16D2，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体24A10，检测灵敏度高。同时，该方法经验证与人Human IL‑5相似的其他人白介素系列蛋白及大鼠来源的IL‑5蛋白没有交叉反应。

Description

高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

IL-5是由活化的T细胞产生的细胞因子，可刺激嗜酸性粒细胞生长和分化。IL-5不仅使嗜酸性粒细胞的数量增加，而且能增强其功能。在蠕虫感染和过敏性疾病时出现的嗜酸性粒细胞增多主要是由IL-5引起的。人IL-5还能促进嗜碱性粒细胞释放组胺和白三烯等炎症介质，从而提高嗜碱性粒细胞的活性。

IL-5的临床意义在于：多见于机体损伤、炎症、类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮、肝炎、烧伤及肾脏移植排斥反应等。在消化道恶性肿瘤患者中，血清IL-5升高，手术后降低；对于器官移植患者，血、尿及局部组织液IL-5测定可用于鉴别排斥、监测排斥和疗效评价等；在有急性排斥反应时，体液中的IL-5明显升高，治疗有效后又迅速下降，治疗无效者IL-5则持续升高。在正常人的血清中，IL-5蛋白水平的参考范围为56.37～150.33pg/mL。

目前，市面上的IL-5ELISA检测试剂盒采用鼠抗人IL-5单克隆抗体，亲和力较低。

发明内容

基于此，有必要提供高亲和力的Human IL-5兔单克隆抗体及其应用，针对HumanIL-5检测的亲和力高，灵敏度高，特异性强。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体16D2和/或兔单克隆抗体24A10。

其中，所述兔单克隆抗体16D2的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。所述兔单克隆抗体16D2的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。所述兔单克隆抗体16D2的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示。

所述兔单克隆抗体24A10的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。所述兔单克隆抗体24A10的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ IDNO.17所示。所述兔单克隆抗体24A10的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体在制备检测Human IL-5的试剂或者试剂盒中的应用。

在其中一些实施例中，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人Human IL-5，其中所述兔单克隆抗体16D2作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体24A10经生物素标记后作为标记抗体。在检测Human IL-5的试剂盒中，所述Human IL-5选自重组Human IL-5、细胞分泌的Human IL-5、人血清中Human IL-5中的至少一种。

本发明还可以提供高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体的基因或者该包含基因的表达载体，便于通过基因工程实现兔单克隆抗体的表达和纯化。

本发明还提供一种高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组Human IL作为免疫原，免疫兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，进一步构建到表达载体上，转染细胞，获得含有兔单克隆抗体16D2、24A10的上清，纯化，即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明实质提供了高亲和力的Human IL-5兔单克隆抗体对：兔单克隆抗体16D2和24A10，并证明了这两个抗体可以识别Human IL-5蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。本发明利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高等优点。

附图说明

图1为抗体16D2和24A10的可变区序列比对图。

图2为哺乳动物表达载体pBR322的谱图。

图3为抗体16D2和24A10的验证胶图。

图4为抗体16D2和24A10与Human IL-5的亲和力测试图。

图5为抗体16D2和24A10与Human IL-5的抗原决定簇测定结果。

图6为基于抗体16D2和24A10建立的酶联免疫检测Human IL-5的方法的标准曲线图。

图7为基于抗体16D2和24A10建立的酶联免疫检测Human IL-5的方法的特异性试验结果统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例提供针对Human IL-5的兔单克隆抗体为16D2和24A10。

其中：

16D2抗体相关序列如下：

>16D2-轻链全长(FL)序列:

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPSSASEPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCEQHYTPSNVHNTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:1)

>16D2-轻链可变区(VL)序列:

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPSSASEPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCEQHYTPSNVHNTFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:2)

>16D2-轻链的互补决定区1(LCDR1)序列:

EDIYNLLAW(SEQ ID NO:3)

>16D2-轻链的互补决定区2(LCDR2)序列:

LIYSASTLASGV(SEQ ID NO:4)

>16D2-轻链的互补决定区2(LCDR3)序列:

EQHYTPSNVHNTF(SEQ ID NO:5)

>16D2-重链全长(FH)序列:

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGDLVKPEGSLTLTCTASGFSFSINYWICWVRQAPGKGLEWIACIYGGSSGSAYYATWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDDEGGGIFYNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:6)

>16D2-重链可变区(VH)序列:

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGDLVKPEGSLTLTCTASGFSFSINYWICWVRQAPGKGLEWIACIYGGSSGSAYYATWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDDEGGGIFYNLWGPGTLVTVSS(SEQID NO:7)

>16D2-重链的互补决定区1(HCDR1)序列:

FSFSINYWIC(SEQ ID NO:8)

>16D2-重链的互补决定区2(HCDR2)序列:

WIACIYGGSSGSAYYATWAK(SEQ ID NO:9)

>16D2-重链的互补决定区3(HCDR3)序列:

YFCARDDEGGGIFYNL(SEQ ID NO:10)。

24A10抗体相关序列如下：

24A10-轻链全长(FL)序列:

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSISSYLAWYQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCESNYDITSSYFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:11)

>24A10-轻链可变区(VL)序列:

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSISSYLAWYQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCESNYDITS

SYFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:12)

>24A10-轻链的互补决定区1(LCDR1)序列:

QSISSYLAW(SEQ ID NO:13)

>24A10-轻链的互补决定区2(LCDR2)序列:

LIYEASKLASGV(SEQ ID NO:14)

>24A10-轻链的互补决定区3(LCDR3)序列:

ESNYDITSSYF(SEQ ID NO:15)

>24A10-重链全长(FH)序列:

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIAAGSSGISYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTGLTAADTATYLCSRSCDIYSDGGTSFDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:16)

>24A10-重链可变区(VH)序列:

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIAAGSSGISYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTGLTAADTATYLCSRSCDIYSDGGTSFDLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)

>24A10-重链的互补决定区1(HCDR1)序列:

FSFSSSYYMC(SEQ ID NO:18)

>24A10-重链的互补决定区2(HCDR2)序列:

WIGCIAAGSSGISYYASWAK(SEQ ID NO:19)

>24A10-重链的互补决定区3(HCDR3)序列:

YLCSRSCDIYSDGGTSFDL(SEQ ID NO:20)。

下面对本发明兔单克隆抗体为16D2和24A10的制备及应用进行举例说明。

试验例1

采用重组人IL-5(购自艾璞，货号HF-1005，为哺乳表达系统体外重组表达且经验证具有生物活性的重组人IL-5蛋白)为免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。

三次免疫后用ELISA方法测定血清效价：血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD_450nm大于0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三至四天后取脾脏。

脾脏细胞分离：在生物安全柜中无菌操作，取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基(RPMI Medium 1640basic+1％Pen Strep；RPMI 1640购自Gibco，C11875500BT；PenStrep购自Gibco，15140-163)，放入一个细胞筛网，将脾脏取出放置于细胞筛中，用无菌剪刀、镊子剪去脾脏上多余的结缔组织、脂肪组织后，将脾脏尽量剪碎于研筛中，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨，尽可能研磨彻底至整个脾脏组织接近于白色；研磨后的细胞会通过细胞筛网过滤至培养基中；用移液管吸取含有细胞的培养基至无菌的50mL离心管中，并吸取10mL培养基再次清洗一遍培养皿，将残余在培养皿中的细胞尽可能吸取至离心管中；室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自Biogems公司)，用移液枪轻柔的吹打细胞几次后计时1min，进行红细胞裂解，计时完成后加入37mL的基础培养基以终止反应，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入40mL常温放置的基础培养基，用移液枪吹打重悬细胞，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入20mL常温放置的B细胞培养基，用移液枪吹打重悬细胞，经由筛网再次过滤细胞，进行计数。

进行B淋巴细胞分选，方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞。

编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞的上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后，用Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA并反转录成cDNA。

采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体的重链可变区基因(VH)、轻链可变区基因(VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑取若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。

其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL 2×Gloria HiFi，6.5μL N.F H₂O。2×Gloria HiFi试剂由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供。

其中，轻链可变区的引物对为：

VL-Primer-F：

5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO:21)；

VL-Primer-R：

5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO:22)；

重链可变区的引物对为：

VH-Primer-F：

5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO:23)；

VH-Primer-R：

5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO:24)。

PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

经测序确定序列，抗体可变区序列比对见图1。

试验例2

本试验例提供兔单克隆抗体的生产和纯化方法，包括如下步骤：

将兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上。所使用的哺乳动物表达载体为pBR322，见图2的a和b。图中，pBR322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，图2的a图中Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图2的b图中Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。将含兔单克隆抗体重链恒定区(图2中的a)及轻链恒定区(图2中的b)的哺乳动物细胞表达载体分别用NheⅠ和XbaⅠ限制性内切酶常规线性化处理。再将试验例1中通过PCR扩增出来的产物(重链可变区的基因和轻链可变区的基因)纯化后，采取同源重组的方式，分别将两株抗体的重链可变区的基因和轻链可变区的基因构建到相应的哺乳动物表达载体中。

其中兔单克隆抗体16D2的重链可变区基因的序列如下：

GTTGCAGTCCTGAAAGGCGTGCAATGCCAAGAGCAGCTCGAAGAGAGTGGGGGCGATTTGGTTAAGCCCGAAGGTTCATTGACTCTCACCTGTACGGCGAGTGGGTTCAGCTTTAGTATTAATTACTGGATATGTTGGGTGCGGCAAGCCCCCGGAAAGGGGCTCGAGTGGATTGCCTGTATTTATGGCGGGTCCTCTGGCAGTGCTTACTACGCTACATGGGCGAAAGGGCGGTTCACAATTAGCAAGACATCATCCACTACTGTCACCTTGCAAATGACGAGCCTGACGGCAGCAGACACAGCTACCTATTTTTGTGCTAGAGACGACGAGGGCGGGGGTATCTTCTATAATCTGTGGGGTCCTGGGACACTGGTCACTGTCTCCTCAGGCCAACCGAAGGCCCCCAGCGTCTTCCCTTTGGCACCTTGTTGTGGAGATACG(SEQIDNO:25)。

轻链可变区基因的序列如下：

GGTCTGTTGTTGCTCTGGTTGCCAGGAGCGCGGTGCGCGTACGATATGACGCAAACTCCTAGTTCCGCCAGCGAACCAGTGGGAGGCACTGTTACGATCAAATGCCAAGCGTCCGAAGACATTTACAATTTGCTGGCATGGTATCAGCAAAAACCGGGACAGCCTCCGAAGCTCCTGATATACTCCGCATCAACGCTCGCCTCCGGCGTGCCGAGTCGCTTCAAAGGATCCGGCTCCGGTACTGAATACACTTTGACCATCAGTGACCTGGAATGCGCCGATGCCGCTACTTACTATTGTGAGCAACACTACACGCCCAGTAACGTCCATAATACGTTCGGCGGCGGAACGGAGGTGGTTGTGAAGGGTGATCCTGTTGCACCCACAGTCCTGATATTCCCTCCTGCG(SEQ ID NO:26)。

其中，兔单克隆抗体24A10的重链可变区基因的序列如下：

GTTGCCGTTCTGAAGGGAGTGCAGTGTCAGAGTTTGGAGGAAAGCGGAGGTGGTCTGGTGCAACCGGAGGGATCACTCACGCTCACATGCACTGCATCTGGATTTTCTTTCTCATCATCATACTATATGTGCTGGGTGCGGCAAGCCCCGGGCAAGGGCCTGGAATGGATAGGGTGCATAGCGGCAGGTTCTAGTGGCATTTCATATTATGCATCATGGGCCAAAGGAAGGTTTACAATAAGCAAGACATCTTCCACCACTGTCACGTTGCAAATGACTGGCCTGACAGCCGCAGATACAGCAACTTATCTGTGCTCCAGGTCATGCGATATTTACTCCGATGGAGGAACCTCTTTCGATCTCTGGGGTCCGGGCACTCTCGTTACGGTCAGTTCAGGCCAACCCAAAGCTCCCAGCGTGTTTCCACTCGCGCCTTGCTGTGGTGATACT(SEQ ID NO:27)。

轻链可变区基因的序列如下：

GGCCTGTTGTTGCTCTGGTTGCCCGGTGCGAGGTGCGACGTGGTTATGACTCAGACGCCTGCCTCTGTCTCTGAGCCTGTCGGAGGAACGGTGACCATTAAGTGCCAGGCATCCCAGTCAATAAGTAGTTATTTGGCTTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGCCACCAAAACTCTTGATCTACGAGGCTTCAAAACTCGCGAGCGGAGTTCCTTCTCGCTTCAAAGGGAGTGGTAGTGGAACAGAATTTACACTGACGATCAGCGATTTGGAATGCGCCGATGCAGCTACATATTACTGCGAGTCTAACTACGATATTACATCATCTTACTTTGGTGGAGGCACGGAAGTTGTTGTTAAAGGCGATCCGGTTGCCCCTACAGTGCTCATCTTTCCGCCTGCT(SEQ ID NO:28)。

经测序验证后，将含有相应兔单克隆抗体重链基因和轻链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染72～96小时后，获得的培养上清中将含有重组的识别人IL-5蛋白的兔单克隆抗体。

使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别humanIL-5的兔单克隆抗体(抗人IL-5兔单克隆抗体)。具体步骤如下：

1)收集上清：将培养上清转移至无菌50mL离心管中，1000g离心，4℃(或常温)离心10min，收集上清液。

2)孵育：将预处理后的Protein A Agarose悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育室温3～4小时或4℃过夜。

3)洗杂：孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，用掌上离心机常温离心1min，使固液分离，收集流穿液。加入十倍Protein A Agarose体积的洗涤缓冲液并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。

4)洗脱：向吸附柱中加入洗脱缓冲液，用掌上离心机离心，获得抗体上清。

5)透析：将抗体上清装入透析袋中，透析袋两端使用透析夹固定夹紧。将透析袋置于4℃下，在所需缓冲液(0.01M PBS)中过夜透析，第二天早上更换缓冲液继续透析3～6小时，透析缓冲液的体积至少为洗脱液的100倍以上。

使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，均为1mg/mL，测试结果见图3：兔单克隆抗体16D2和24A10的重链及轻链的条带清晰可见；验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。

试验例3

本试验例提供抗体的筛选和鉴定方法，包括如下步骤：用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对试验例2纯化获得的抗人IL-5兔单克隆抗体16D2和24A10与重组人IL-5蛋白(购自R&D Systems，205-IL-005)亲和力进行精确测定。

其中，本试验例使用16D2抗体和24A10抗体的浓度分别为2μg/mL，并分别将其固定在proA探针上；然后针对16D2抗体和24A10抗体分别用150nM、70nM两个浓度的重组人IL-5蛋白去结合，获得亲和力曲线，结果见图4。

最终通过曲线拟合和计算，抗体亲和力KD＝K_off/Kon，获得人IL-5兔单克隆抗体16D2的亲和力为4.03×10^-9M；人IL-5兔单克隆抗体24A10的亲和力为3.06×10^-10M。

试验例4

本试验例提供抗原识别表位的鉴定方法，使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪，对兔抗人IL-5兔单克隆抗体在人IL-5蛋白上面所结合的抗原识别表位进行鉴定。其中，使用到的材料为His-tag重组human IL-5(购自R&D Systems，205-IL-005)，浓度为5μg/mL，使用所获得Human IL-5克隆抗体16D2和24A10的浓度分别为2μg/mL和5μg/mL。

测试结果见图5：通过分析两种兔单克隆抗体之间的配对数据可知，在抗人IL-5兔单克隆抗体16D2和重组human IL-5结合后，人IL-5兔单克隆抗体24A10仍旧能够结合重组human IL-5，曲线进一步上升，表明结合在探针上的抗体浓度及厚度进一步增强，证明兔单克隆抗体16D2和24A10结合在IL-5蛋白表面不同的部位，且相互不干扰。

实施例5

基于人IL5蛋白的兔单克隆抗体16D2和24A10，建立双抗夹心法酶联免疫检测方法：

1)包被：将兔单克隆抗体16D2(捕获抗体，试验例2制备获得)用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h。

2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

3)封闭：将E013封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％吐温、0.1％proclin300，pH＝7.2)以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用。

4)加蛋白：将标准样品(重组human IL-5，购自R&D Systems，205-IL-005)用稀释液(2％BSA、0.05％吐温、0.1％proclin 300的PBS缓冲体系，pH＝7.2)稀释，稀释浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0pg/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

6)加检测抗体：将24A10-biotin(检测抗体)稀释成0.08μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。

其中，标记单克隆抗体24A10的方法为：将抗人重组Human IL-5蛋白的单克隆抗体24A10配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚胺基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL单克隆抗体24A10溶液，加入10μLTris-HCl溶液终止反应；最后加入4mL pH＝7.4的1×PBS溶液，用排阻极限为30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

10)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

11)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm和630nm下进行读数，用OD_450nm减去OD_630nm位校正后的吸光度值。

12)以重组人Human IL-5蛋白浓度为横坐标，吸光度值的校正值Y1(Y1＝OD_450nm-OD_630nm)为纵坐标作图，使用Logistic曲线四参数拟合得到的曲线图如图6所示。

图6中，吸光度值Y1与横坐标重组人Human IL-5蛋白浓度X1之间的关系满足方程式：Y1＝0.08583+16.054X1^1.034/(X1^1.034+580.25)(R²＝0.9999)。

以20个0孔平均值+2*SD代入标准拟合曲线，回算得到灵敏度，计算出基于抗人Human IL-5蛋白的单克隆抗体16D2和24A10建立的双抗夹心酶联免疫检测方法的检测灵敏度为0.885pg/mL。

实施例6

本实施例参照实施例5的方法步骤进行双抗夹心法酶联免疫检测方法的特定性测试，其中步骤4)加蛋白过程为：

将重组Human IL-5蛋白(购自R&D Systems，205-IL-005)用稀释液稀释成100pg/mL。

其他需要测交叉反应的蛋白(Human IL-2、Human IL-3、Human IL-4、Human IL-9、Mouse IL-5、Mouse IL-2、Mouse IL-4、Mouse IL-9、Human GM-CSF、Mouse GM-CSF、Rat GM-CSF)稀释成2ng/ml，然后以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。测试统计结果见图7。

由图7可以看出：采用上述试验例制备的兔单克隆抗体16D2和24A10对不同的白介素因子进行双抗夹心酶联免疫检测，16D2和24A10兔单克隆抗体只与Human IL-5结合。证明本发明的兔单克隆抗体16D2和24A10对于Human IL-5蛋白具有高度的特异性。

总体来讲，本发明通过采用特定重组人IL-5蛋白免疫兔的方法，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞并进行相关培养，并通过特定引物提取抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，进一步构建到特定表达载体上，转染细胞，获得含有兔单克隆抗体16D2、24A10的上清，纯化得到兔单克隆抗体16D2和24A10。相对于常规杂交瘤方法生产的鼠源单克隆抗体，上述制备兔单克隆抗体16D2和24A10的方法的稳定性较高，批间差异小。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.Human IL-5兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体16D2或兔单克隆抗体24A10；

所述兔单克隆抗体16D2的轻链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，重链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示；

所述兔单克隆抗体24A10的轻链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15所示，重链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的Human IL-5兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体16D2的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求2所述的Human IL-5兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体16D2的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求1所述的Human IL-5兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体24A10的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。

5.根据权利要求4所述的Human IL-5兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体24A10的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。

6.如权利要求1至5任一项所述的Human IL-5兔单克隆抗体在制备检测Human IL-5的试剂或者试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人Human IL-5，其中所述兔单克隆抗体16D2作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体24A10经标记后作为标记抗体。

8.一种检测Human IL-5的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至5任一项所述的针对Human IL-5的兔单克隆抗体16D2和/或兔单克隆抗体24A10。

9.根据权利要求8所述的检测Human IL-5的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述HumanIL-5选自重组Human IL-5、细胞分泌的Human IL-5、人血清中Human IL-5中的至少一种。

10.一种权利要求1至5任一项所述的Human IL-5兔单克隆抗体的基因或者包含该基因的表达载体。