CN116063487B - 抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗人干扰素α2的单克隆抗体及其应用，属于生物检测技术领域。该单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；该兔单克隆抗体A的轻链可变区包含如SEQ ID No.5～7所示的CDR区，重链可变区包含如SEQ ID No.8～10所示的CDR区；该兔单克隆抗体B的轻链可变区包含如SEQ ID No.15～17所示的CDR区，重链可变区包含如SEQ ID No.18～20所示的CDR区。该单克隆抗体能够特异性结合人干扰素α2，用于检测人干扰素α2时具有抗干扰能力强、稳定性好、检测灵敏度高等优点。

Description

抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
干扰素α2(IFN-α2)是一种由位于9号染色体上的IFNA2基因编码的细胞因子。它属于I型干扰素(Type-linterferon)家族，其包括13个α亚型、1个β亚型和1个ω亚型。干扰素α2是这些亚型中第一个通过药物产生的亚型，也是研究最广泛的亚型。成熟的干扰素α2分泌蛋白由165个氨基酸组成，含有5个α-螺旋和两个二硫键。干扰素α2有几个等位基因变体，包括干扰素α2a、干扰素α2b和干扰素α2c。
由于I型干扰素受体(IFNAR)的普遍表达，IFN-α2可以作用于所有类型的细胞。干扰素α2通过刺激抑制病毒复制和阻止病毒进入邻近细胞的蛋白质的产生来对抗感染；也可通过启动T细胞和NK细胞介导的细胞毒性来刺激免疫系统；还可以抑制癌细胞增殖，激活免疫系统以靶向癌细胞。干扰素-α2已用于治疗多种病毒感染(包括乙型和丙型肝炎)和某些癌症(如黑色素瘤、肾细胞癌)。尽管干扰素α2最常与病毒感染相关，但它也与其他病理事件也相关。I型干扰素代表了抑制乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)的护理标准。而且，它与神经精神症状有关，如抑郁、快感减退、焦虑和认知障碍。干扰素α2在癌症中的作用也是复杂的，例如，在炎症性乳腺癌的情况下，干扰素α2上调。干扰素α2与细胞衰老和凋亡相关，其某些亚型与细胞迁移和耐药性增加相关。另外，血液中I型干扰素缺乏也被认为是SARS-CoV-2病毒疾病重症者的特征。
干扰素α2的失调也与许多自身免疫疾病有关，如系统性红斑狼疮(SLE)和原发性干燥综合征。但干扰素α2蛋白在人体样本中的直接测定具有挑战性，在正常人的血清中，干扰素α2蛋白水平的参考范围为35～108.3pg/mL(ELISA方法)，属于一个比较低的水平，目前很难实现高灵敏、准确检测血清中干扰素α2，因此有必要开发出一种高灵敏度的干扰素α2蛋白的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种抗人干扰素α2(IFN-α2)的兔单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性结合人干扰素α2，用于检测人干扰素α2时具有抗干扰能力强、稳定性好、检测灵敏度高等优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
抗人干扰素α2的单克隆抗体，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；所述兔单克隆抗体A的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体A的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体B的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体B的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20所示的互补决定区。
优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述兔单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，且所述兔单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，且所述兔单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述兔单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且所述兔单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，且所述兔单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
本发明还提供了编码所述兔单克隆抗体A和编码所述兔单克隆抗体B的核酸分子。
优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
优选地，所述兔单克隆抗体A的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，且所述兔单克隆抗体A的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。
优选地，所述兔单克隆抗体B的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。
进一步优选地，所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，且所述兔单克隆抗体B的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码所述兔单克隆抗体A的核酸分子或/和编码所述单克隆抗体B的核酸分子。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明提供的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。所述表达载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，例如所述表达载体为pBR322。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述重组表达载体，或者所述宿主细胞的基因组中整合有编码所述兔单克隆抗体A的核酸分子或/和编码所述单克隆抗体B的核酸分子。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞，例如293细胞。
所述兔单克隆抗体A和所述兔单克隆抗体B各自的轻链恒定区均为κ链，各自的重链恒定区均为IgG1型。所述兔单克隆抗体A和所述兔单克隆抗体B分别与人干扰素α2表面的不同抗原决定簇相结合。所述人干扰素α2包括重组表达的人干扰素α2蛋白，或细胞分泌的人干扰素α2蛋白，或人血清中的人干扰素α2蛋白。
本发明提供的抗人干扰素α2的单克隆抗体、编码所述单克隆抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的重组表达载体、包含所述重组表达载体或基因组中整合有所述核酸分子的宿主细胞均可用于制备检测人干扰素α2的产品(例如，试剂或试剂盒)；还可以用于检测人干扰素α2的方法中。
优选地，所述检测人干扰素α2的方法为酶联免疫检测法。
进一步优选地，所述酶联免疫检测法为双抗体夹心酶联免疫检测法。
更进一步优选地，所述双抗体夹心酶联免疫检测法中，捕获抗体为兔单克隆抗体A，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体B。
本发明的有益效果是：本发明用来制备人干扰素α2兔单克隆抗体的免疫原是利用酵母在体外重组表达的、经验证具有生物活性的人干扰素α2蛋白。利用单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人干扰素α2兔单克隆抗体A和B，兔单克隆抗体A和重组表达人干扰素α2结合的亲和常数为8.45×10-10，兔单克隆抗体B和重组表达人干扰素α2结合的亲和常数为1.86×10-9。所述兔单克隆抗体A和所述兔单克隆抗体B可以识别人干扰素α2蛋白表面的不同抗原决定簇，且具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。以兔单克隆抗体A为捕获抗体，经生物素标记的兔单克隆抗体B为检测抗体，采用双抗夹心酶联免疫法检测人干扰素α2时的灵敏度为0.43pg/mL。该方法能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人干扰素α2蛋白，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
附图说明
图1为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图；
图2为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图；
图3为人干扰素α2蛋白兔单克隆抗体A和B的亲和力测定结果图；
图4为人干扰素α2蛋白兔单克隆抗体A和B的抗原决定簇测定结果图；
图5为本发明实施例2中使用兔单克隆抗体A与兔单克隆抗体B对人干扰素α2进行双抗夹心酶联免疫检测的结果图；
图6为本发明实施例3中对兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B特异性检测的结果图；
图7为实施例3中对兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B热稳定性测试的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
在本发明中，“双抗体夹心酶联免疫检测法”、“双抗夹心酶联免疫法”、“双抗夹心酶联免疫检测方法”、“双抗夹心酶联免疫检测”表示同一概念，可以互换使用。“人干扰素α2”、“人干扰素α2蛋白”、“重组人干扰素α2蛋白”表示同一概念，可以互换使用。
实施例1
本实施例提供了抗人干扰素α2的单克隆抗体的制备方法，用来制备人干扰素α2兔单克隆抗体的免疫原来自哺乳表达系统具有生物活性的高质量重组干扰素α2成熟蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号：13833-HNAY)；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，具体包括以下步骤：
1.1、动物免疫：以重组人干扰素α2蛋白为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人干扰素α2的滴度，取血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
1.2、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
1.3、B淋巴细胞分选：采用中国专利CN110016462B(专利名称：从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法)说明书中第[0030]～[0044]段的方法。
1.4、编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
其中，PCR反应体系如下：4μLcDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL2×GloriaHiFi，6.5μL N.F H2O。2×GloriaHiFi试剂由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供。
其中，轻链可变区引物对为：VL-Primer-F(SEQ ID No.25)：5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'；VL-Primer-R(SEQ ID No.26)：5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'；重链可变区引物对为：VH-Primer-F(SEQ ID No.27)：5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'；VH-Primer-R(SEQ ID No.28)：5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'。
PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
1.5、单克隆抗体制备和纯化
1.5.1、为了获得多株识别人干扰素α2蛋白的兔单克隆抗体，将步骤1.4中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图1和图2。图1和图2中，pRB322origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40PAterminator是加尾信号，图1中Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图2中Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
1.5.2、将含兔单克隆抗体重链恒定区(图1)和轻链恒定区(图2)的哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)表达载体分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
1.5.3、将步骤1.4中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染72～96小时获得培养上清中含有重组的识别人干扰素α2的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人干扰素α2蛋白的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
1.6、单克隆抗体筛选及鉴定
获得多株人干扰素α2兔单克隆抗体后，首先对兔单克隆抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，具体方法如下：
1.6.1、单克隆抗体的筛选：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定。其中使用到的材料为重组人干扰素α2蛋白，使用浓度为150nM、75nM，兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和常数≤1×10-9的抗体。
1.6.2、抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中使用到的材料为重组人干扰素α2蛋白，使用浓度为5μg/mL，第一兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL，第二兔单克隆抗体的浓度为5μg/mL；通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体，分别命名为兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B。对兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B的亲和力进行测定，测定结果见图3；二者的抗原决定簇测定结果见图4。图3中A表示兔单克隆抗体A，B表示兔单克隆抗体B，根据图3计算出的亲和力常数见表1。从图4中可以看出，兔单克隆抗体A和B分别识别的是不同的抗原表位，因此二者可用于ELISA配对。
表1兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B亲和力常数
单克隆抗体 koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
A 2.10×10-4 2.49×105 8.45×10-10
B 3.75×10-4 2.01×105 1.86×10-9
对筛选出的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B分别进行核苷酸测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。测得的兔单克隆抗体A的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.21所示：gctcaagtcctgacgcagaccccttcttccgtgtccgcggctgtcggcggaacagtgtcaatctcatgtcaaagttcaaaaagcgtttacaataacaactgcctgtcttggtttcagcaaaaacctggacagcctcctaagctgctcatttacggcgcaagtactctcgcctcaggagttccatcacggttcaagggttccgggtccggtactcaatttactctgactatttctgacgtgcaatgcgatgatgcggcaacgtactattgtgctggggactatgtggatgacatggaaaacacatttggcgggggaactgaggtggtcgtgaaa；兔单克隆抗体A的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示：cagagtgtggaggaatctgggggaaggctggtgactccaggcacacctctgaccctcacttgtattgcctcaggtttcagcttgagttcctacgcgatgggttgggttcggcaggctcctgggaaaggcctggagtggattggcatagttttgtctgggggtacagtttactacactaactgggcaaaaggaagattcactatatccaaaaccagttcaacagtggatctgaagatgacaagtcccacgacggaggatactgccacatacttctgcgcaagaacggattacccagcttacggttttacgagctttaacatttggggaccaggaacattggtcactgtgagttca；兔单克隆抗体B的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示：gctgctgtgctcacgcagacacctagccccgtctctgctgcggtgggaggtacagtcagcatttcctgtcaatctagcaagagtgtctacaacaacaactggattagttggttccaacagaaacctggtcagcccccgaaattgttgatctacgaggcttcaaaactggcatctggcgtcccttcaaggttcaagggctccggctctggaacccaatttaccctcaccatcagcgacgttcaatgcgatgacgcagcgacctattattgcgccggtgggtacgtgtccaattctgacatgtatacattcggcggtggtacagaggtcgtcgttaag；兔单克隆抗体B的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示：caggaacagttggtggagtcaggagggggcctggtcacgctcggcgggtcattgaaactgtcttgtaaggtgagtggcatcgatttcagctcctatggaatatcttgggtcaggcaagcgcctgggaagggcttggaatggatcgcttacatttatgctggagatgggtctacgggctacgctagctgggtgaacggacgcttcaccatttccctggacaatgcgcagaataccgtcttcctccaaatgacatcactcacagcggcggacaccgcaacttacttttgcacaacctacgctggaacttcctattacatgagctattttaatttgtgggggccgggtacattggttacagttagctcc。根据核苷酸序列翻译推导出氨基酸序列，兔单克隆抗体A的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVSISCQSSKSVYNNNCLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGDYVDDMENTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC；兔单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCIASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGIVLSGGTVYYTNWAKGRFTISKTSSTVDLKMTSPTTEDTATYFCARTDYPAYGFTSFNIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK；兔单克隆抗体A的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：AQVLTQTPSSVSAAVGGTVSISCQSSKSVYNNNCLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGDYVDDMENTFGGGTEVVVK；兔单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCIASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGIVLSGGTVYYTNWAKGRFTISKTSSTVDLKMTSPTTEDTATYFCARTDYPAYGFTSFNIWGPGTLVTVSS；兔单克隆抗体A的轻链可变区的三个互补决定区(CDR区)VLACDR1的氨基酸序列如SEQID No.5所示：KSVYNNNCLSW，VLACDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示：LIYGASTLASGV，VLACDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示：AGDYVDDMENTF；兔单克隆抗体A的重链可变区的三个互补决定区(CDR区)VHACDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示：FSLSSYAMG，VHACDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示：WIGIVLSGGTVYYTNWAK，VHACDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.10所示：YFCARTDYPAYGFTSFNI。兔单克隆抗体B的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示：MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSKSVYNNNWISWFQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGGYVSNSDMYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC；兔单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示：METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVTLGGSLKLSCKVSGIDFSSYGISWVRQAPGKGLEWIAYIYAGDGSTGYASWVNGRFTISLDNAQNTVFLQMTSLTAADTATYFCTTYAGTSYYMSYFNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK；兔单克隆抗体B的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示：AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSKSVYNNNWISWFQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGGYVSNSDMYTFGGGTEVVVK；兔单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示：QEQLVESGGGLVTLGGSLKLSCKVSGIDFSSYGISWVRQAPGKGLEWIAYIYAGDGSTGYASWVNGRFTISLDNAQNTVFLQMTSLTAADTATYFCTTYAGTSYYMSYFNLWGPGTLVTVSS；兔单克隆抗体的B的轻链可变区的三个互补决定区(CDR区)VLBCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示：KSVYNNNWISW，VLBCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示：LIYEASKLASGV，VLBCDR3的氨基酸序列如SEQ ID SEQ ID No.17所示：AGGYVSNSDMYTF；兔单克隆抗体B的重链可变区的三个互补决定区(CDR区)VHBCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示：IDFSSYGIS，VHBCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示：WIAYIYAGDGSTGYASWVN，VHBCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示：YFCTTYAGTSYYMSYFNL。
实施例2
本实施例提供了基于抗人干扰素α2兔单克隆抗体A和B建立的双抗夹心酶联免疫检测方法，具体包括以下步骤：
2.1、包被：将兔单克隆抗体A用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/孔加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。
2.2、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.3、封闭：将封闭液(1×PBS中含2％ BSA+5％蔗糖+0.05％ Tween 20+0.1％proclin 300，pH＝7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，于37℃烘0.5-2h，取出备用。
2.4、加蛋白：将人干扰素α2蛋白用pH＝7.2的含2％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20、0.1％proclin 300的磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释后的浓度为：100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL、1.56pg/mL、0pg/mL，然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
2.5、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.6、加检测抗体：将用生物素标记的兔单克隆抗体B稀释成0.1μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。
2.7、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.8、加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
2.9、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.10、加TMB显色液：将TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
2.11、孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm和630nm下测定吸光度值，用OD450nm减去OD630nm位校正后的吸光度值。
2.12、以重组人干扰素α2蛋白浓度为横坐标，吸光度值的校正值Y1(Y1＝OD450nm-OD630nm)为纵坐标作图，使用Logistic曲线四参数拟合得到的曲线图如图5所示。图5中，吸光度差值(OD450nm-OD630nm)与重组人干扰素α2蛋白浓度X1之间的关系满足方程Y1＝0.082+56.75X1 1.077/(X1 1.077+4045.41)(R2＝0.9999)。以20个0孔平均值+2*SD值代入标准拟合曲线，回算得到灵敏度，计算出的基于抗人干扰素α2蛋白兔单克隆抗体A和B建立的双抗夹心酶联免疫检测方法的检测灵敏度为0.43pg/mL。
其中，步骤2.6中生物素标记兔单克隆抗体B的方法为：
2.6.1、将抗人干扰素α2兔单克隆抗体B配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液；
2.6.2、取200μL 1mg/mL的抗人干扰素α2兔单克隆抗体B溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50μg 500mM pH＝9.0的Tris-HCl溶液终止反应；
2.6.3、最后加入4mL pH＝7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。
实施例3
本实施例中对抗人干扰素α2的兔单克隆抗体A和B进行了性能检测，具体方法如下：
3.1、对兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B特异性的检测
分别用七种与人干扰素α2蛋白相近的干扰素蛋白对抗人干扰素α2蛋白的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B的特异性进行检测，采用实施例2中的双抗夹心法酶联免疫检测方法，每种标准品蛋白的浓度均为100pg/mL。七种干扰素蛋白分别为人干扰素β(IFN-β)、小鼠干扰素β(IFN-β)、人干扰素λ1(IFN-λ1)、人干扰素λ2(IFN-λ2)、大鼠干扰素γ(IFN-γ)、小鼠干扰素γ(IFN-γ)、人干扰素γ(IFN-γ)。
检测结果如图6所示，从图6中可以看出，使用本发明制备的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B对不同干扰素蛋白进行双抗夹心酶联免疫检测时，兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B只与人干扰素α2结合，不与其他干扰素产生任何交叉反应；说明本发明制备的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B对人干扰素α2具有高度的特异性。
3.2、对兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B热稳定性的测试
将抗人干扰素α2蛋白兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B分别依次放置于-20℃、4℃、37℃下密封保存，7天后取出，采用与实施例2中相同的双抗夹心法酶联免疫检测方法对人干扰素α2标准品蛋白进行检测；计算经不同温度处理7天后的抗体样品在检测人干扰素α2标准品蛋白时的变异系数，结果如图7所示。图7中，兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B经-20℃处理后，测定人干扰素α2浓度的结果使用Logistic曲线四参数建立的标准曲线方程为Y2＝0.100+4.98X2 1.205/(X2 1.205+297.82)(R2＝0.9966)，Y2为-20℃下吸光度值的校正值(Y2＝OD450nm-OD630nm)；经4℃处理后建立的标准曲线方程为Y3＝0.097+9.69X2 1.068/(X2 1.068+389.62)(R2＝0.9993)，Y3为4℃下吸光度值的校正值(Y3＝OD450nm-OD630nm)；经37℃处理后建立的标准曲线方程为Y4＝0.092+75.65X2 0.960/(X2 0.960+2591.89)(R2＝0.9984)，Y4为37℃下吸光度值的校正值(Y4＝OD450nm-OD630nm)；X2为人干扰素α2的浓度。通过数据计算，可以发现分别经过-20℃、4℃、37℃处理的兔单克隆抗体A和B检测人干扰素α2蛋白浓度的变异系数小于10％(见表2)，说明本发明制备的抗人干扰素α2蛋白兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B的热稳定性较强。
表2兔单克隆抗体A和B经不同温度处理后对人干扰素α2浓度检测结果的差异性比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗人干扰素α2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；所述兔单克隆抗体A的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体A的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体B的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17所示的互补决定区；所述兔单克隆抗体B的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID No.18、SEQID No.19、SEQ ID No.20所示的互补决定区。
2.根据权利要求1所述的抗人干扰素α2的单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或/和所述兔单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No.13所示，或/和所述兔单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
3.根据权利要求1所述的抗人干扰素α2的单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体A的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或/和所述兔单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述兔单克隆抗体B的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，或/和所述兔单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
4.编码如权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体的核酸分子。
5.包含权利要求4所述的核酸分子的重组表达载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的重组表达载体或所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子。
7.权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6所述的宿主细胞在制备检测人干扰素α2的产品中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6所述的宿主细胞在以非诊断为目的检测人干扰素α2的方法中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测人干扰素α2的方法为酶联免疫检测法。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酶联免疫检测法中，捕获抗体为兔单克隆抗体A，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体B。
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