CN106589122A - 人源抗人多亚型干扰素α抗体及其应用 - Google Patents

人源抗人多亚型干扰素α抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人源抗人多亚型干扰素α抗体及其编码基因与应用。运用X射线结晶学和计算机辅助药物设计方法对人源抗人干扰素α抗体AIA22进行分子设计与改造获得的干扰素α抗体能特异结合受体IFNAR2结合区；与抗原表位为受体IFNAR1结合区的IFN-α抗体存在协同效应；相比AIA22，对IFN-α1b、2b、4a的亲和力分别提高约50倍、10倍、20倍；对IFN-α1b的中和活性提高约50倍，对IFN-α5、6、10、16、21的中和活性提高10倍以上，对IFN-α2b、4b、17的中和活性提高5倍以上。本发明为治疗IFN-α相关疾病，如系统性红斑狼疮等自身免疫病，提供了高效特异的抗体药物。

Description

人源抗人多亚型干扰素α抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基于计算机辅助设计方法的人源基因工程抗体的体外亲和力成熟以及人源基因工程抗体的制备与应用，主要是特异性针对人干扰素α(interferon alpha，IFN-α)的多种亚型，通过阻断IFN-α与其受体IFNAR2的结合，抑制IFN-α的生物学功能，从而达到治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等与IFN-α相关的自身免疫病的治疗用基因工程抗体。
背景技术
目前，抗体药物主要是以细胞工程和基因工程为主体的抗体工程技术制备的药物，能够与靶抗原的特异性表位相结合，发挥杀伤、阻断、中和、免疫调理等作用。治疗性抗体凭借其适应症广泛、作用机理灵活、高度特异、毒副作用低等特点，已成为生物技术产业的核心种类之一，广泛应用于肿瘤、免疫、感染、代谢、心血管、炎症等众多疾病类型的治疗。
抗体的实验室研究始于1890年代，也正是在同一时期开启了抗体作为药物用于治疗人类疾病的历史。经过120多年的曲折发展，抗体药物经历了多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体三个阶段，也经历了鼠源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体到全人源抗体的变迁。全人源抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用全人源抗体，患者顺从性好，可减少抗体的免疫原性，延长药物在体内的半衰期，并可借助抗体Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC等效应，进而增强抗体的生物学效应。目前，全人源抗体的制备技术主要包括转基因小鼠技术、抗体库技术和B细胞分选单细胞PCR技术等，其中噬菌体抗体库是制备特异性抗体最简单、快速和经济的方法，具备基因型与表型统一，选择能力与扩增能力偶联，筛选能力强大等特点，广受抗体药物开发者的青睐。该技术目前已经非常成熟，被认为是目前最成功的开发治疗性抗体的技术手段之一。
治疗性抗体发展过程中所面临的诸如免疫原性、亲和力低、特异性差、用量大产能低等一系列问题也促进了治疗性抗体研发相关技术的发展和进步，包括抗体的制备技术、亲和力成熟技术、高效表达技术、大规模培养平台技术等。其中，计算机辅助药物设计方法是抗体分子体外亲和力成熟的重要技术手段之一，该方法是基于抗原-抗体复合物结构信息对抗体分子进行设计的方法，有很强的结构依赖性。而复合物结构信息的获得主要依靠分子模拟(Molecular Simulation，MS)和结构测定两种途径。高效的抗体分子设计对抗原-抗体复合物结构的准确性和精确度要求较高，而分子模拟的发展目前尚未达到能够精确预测蛋白质结构的程度。因此，对抗原-抗体复合物结构进行测定对更高效准确地设计抗体分子来说是很有必要的。目前，测定蛋白质三维结构的物理方法主要有：X射线结晶学(X-ray crystallography)、核磁共振波普学(nuclear magneticresonance spectroscopy)、冷冻电子显微镜技术(cryoelectron microscopy，cryo-EM)等。X射线结晶学又是目前测定生物大分子三维结构的最主要方法，其一般过程包括晶体培养、衍射数据收集(数千帧二维的电子密度图)、相位确认(同重原子置换、同分子置换)、晶体结构的拟合与修正。衍射产生的结构的好坏取决于晶体的质量；而蛋白质晶体的产生又是蛋白质结晶学中的制约性步骤，其对蛋白质浓度、纯度、结晶条件要求均较高。
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种弥散性结缔组织病(简称结缔组织病[CTD])，属自身免疫病。其主要的病理改变是由于大量自身抗体与抗原结合形成免疫复合物并激活补体而引起的血管炎症，表现为包括皮肤、肾、肌肉骨骼、心血管、肺、神经系统、消化系统、血液系统等在内的多系统损害，多数患者可见肾脏病变，即狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)。SLE的发病率在0.02％～0.15％之间；患者以育龄女性尤为多见，约占90％。
SLE病程以病情缓解和急性发作交替为特点；目前尚不能根治，临床上依靠合理治疗缓解病情。通过早期诊断和综合治疗，目前SLE的十年存活率约为70％。常规用药包括激素、免疫抑制剂以及抗疟药(氯喹)等；手段单一，毒副作用大，长期使用会导致向心性肥胖、血糖升高、高血压、诱发感染、股骨头无菌性坏死和骨质疏松等不良反应，进一步增加患者痛苦和治疗成本。SLE的抗体治疗是近年来研究的热点之一，多个不同作用机制的治疗性抗体处于临床试验阶段。2011年，FDA批准了55年来首个治疗SLE的新药贝利木单抗(靶向BAFF)，为SLE的抗体治疗开启了新的大门，但单一品种并不能满足巨大的个体差异的治疗需求，更多不同作用机制的治疗药物仍亟待推向市场。但是，SLE治疗药物的研发依然重重困难，原因包括发病机制复杂，患者表型差异较大，缺乏有效的生物标志物，动物模型差异较大，感染风险高和临床周期长等。
SLE确切的发病机制尚不清楚，可能受遗传、表观遗传、环境、激素等的影响，因免疫调节的混乱导致免疫耐受缺陷，最终引起组织损伤。目前的研究主要集中在中枢免疫耐受缺陷，细胞凋亡异常，自身反应性T、B细胞异常活化，固有免疫系统的作用以及细胞因子的作用等方面。关于SLE发病机制的研究很多，结论各异，但在干扰素α(IFN-α)及其诱导基因的高水平表达与SLE的相关性研究上较为一致。
干扰素(interferon，IFN)分为I型、II型和III型，IFN-α属I型干扰素。人类基因组中至少有15个功能基因与编码IFN-α家族成员有关，主要位于染色体9p22上，其编码的氨基酸序列的同源性在80％以上。IFN-α有12个亚型(Subtype)：IFN-α1、IFN-α2、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α14、IFN-α16、IFN-α17、IFN-α21，各亚型相对分子量在20kD左右，由166个氨基酸残基组成(IFN-α2只有165AA)。IFN-α1、2、4、14均被发现存在等位基因突变体(allelic variants)。IFN-α各亚型具有类似的结构，包含A～B五个相互交叠的α螺旋和一个长环结构LoopAB。IFN-α及其它I型干扰素(IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)具有共同的受体，即I型干扰素受体(type I interferon receptor，IFNAR)。IFNAR由IFNAR1和IFNAR2两部分构成，均为膜蛋白。其中，IFNAR2是IFN-α的低亲和力受体(0.5～100nM)，单独的IFNAR1几乎不与IFN-α结合(亲和力在uM水平)。IFNAR2/IFN-α/IFNAR1结合形成异三聚体复合物，亲和力达10～100pM。单独的IFNAR1或者IFNAR2结合配体后均不能激活下游JAK-STAT信号通路。I型干扰素受体分布广泛，主要存在于单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等表面。
近年来，大量研究证据均指向异常高水平表达的IFN-α与SLE疾病的发生发展密切的相关性。Yihong Yao等人的研究(Yihong Yao，HGP，2009)也表明，几乎全部亚型的IFN-α均与SLE相关。综合各项研究报道，以凋亡清除异常为前提，就IFN-α在SLE疾病进展中的作用描述如下：在环境诱因(例如，细菌或者病毒等微生物的感染)的刺激下，天然产生干扰素的主要细胞——浆细胞样树突细胞(pDC)通过TLR7或者TLR9的交联作用分泌产生IFN-α和IL-6等细胞因子。产生的IFN-α一方面可促进更多的自身反应性B细胞分化成浆母细胞，并在IL-6的刺激下进一步分化成为分泌自身抗体的自身反应性浆细胞。另一方面，IFN-α的产生促使更多单核细胞分化成熟，进一步激活成为髓样树突状细胞(mDC)，也可迁移到淋巴结和组织中，这些成熟的DC细胞并不清除被中枢耐受(central tolerance)遗漏的自身反应性T细胞，而是将自身抗原递呈给自身反应性Tc细胞和自身反应性Th细胞。激活的Tc细胞损伤组织，产生更多核小体，进而被DC细胞捕获，放大自身免疫反应。同时，激活的Th细胞刺激自身反应性B细胞来产生更多自身抗体，结合内源性核酸、来自于凋亡小体的染色质以及其它凋亡暴露的自身抗原，进而形成大量免疫复合物(immune complex，IC)，含有染色质成分的IC通过B细胞受体(BCR)和TLRs共同作用促进自身免疫性B细胞增殖，通过FcγR和TLRs协同刺激pDCs产生更多内源性的IFN-α，如此形成一个恶性循环，并最终导致组织损伤。
针对上述机制，通过IFN-α拮抗剂(包括中和抗体)，抑制IFN-α的活性，阻断下游细胞间级联效应，打破IFN-α介导的恶性循环，有望达到缓解病情，治疗疾病的目的。目前，已有三个靶向多亚型IFN-α的治疗性抗体进入临床研究，包括Genentech公司的Rontalizumab，Argos Therapeutics公司的AGS-009以及MedImmune公司的Sifalimumab。其中，又以Sifalimumab的研究进展最为良好。抗原-抗体复合物晶体结构数据表明，Sifalimumab的抗原表位位于IFNAR1结合区。体外活性实验表明，Sifalimumab能够有效阻断除IFN-α21以外的IFN-α亚型的功能活性。I、II期临床研究显示，Sifalimumab的安全性和耐受性良好，仅存在带状疱疹复发的风险。2014年，阿斯利康(AstraZeneca)宣布Sifalimumab用于中重度狼疮(SLE/lupus)治疗的IIb期临床试验(NCT01283139)在第365天达到其主要临床终点，并观察到患者关节、皮肤等组织特异性指标的改善以及主述症状的缓解。同时，特定剂量实验组亦达到两项次级临床终点，包括患者皮肤红斑症状的改善和疲劳感的缓解。总体而言，Sifalimumab用于中重度狼疮患者的治疗效果显著，进一步在实践层面上证实了IFN-α作为SLE治疗靶点的有效性。此外，Sifalimumab用于皮肌炎(DM)、多肌炎(PM)等多种自身免疫病治疗的临床研究亦正在进行。为临床用药提供更多新的、有效的人源抗人多亚型干扰素α抗体是研究人员的追求的目标，因此有必要在现有技术的基础上，为丰富备选抗体药物，提供更多中和活性好、亲和力强的人源抗人多亚型IFN-α抗体。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种亲和力更高、中和活性更好的人源抗人多亚型IFN-α抗体及其活性片段的氨基酸序列。
本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的编码基因。
本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备IFN-α相关自身免疫病的治疗药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供上述人源抗人多亚型IFN-α抗体的抗原表位。
AIA22是一种来源于全合成单链人噬菌体抗体库的人源抗人多亚型IFN-α基因工程抗体(中国专利申请号为201410506009.X，公开号CN104292331A，公开日2015年1月21日)。本发明通过X射线结晶学(X-ray crystallography)的方法测定了AIA22的Fab段与IFN-α2b复合物的结构，明确了AIA22的抗原表位；并基于复合物结构数据，采用计算机辅助抗体药物设计方法对AIA22进行定向设计与改造，获得至少一种对多数亚型IFN-α的亲和力提高10～50倍，中和活性提升5～50倍的突变体抗体。
本发明运用X射线结晶学的方法测定了AIA22-Fab/IFN-α2b复合物结构。在本发明的实施例1中，通过对960个结晶条件的初步筛选，获得AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体生长条件；经过进一步的条件优化，最终获得0.2mm×0.1mm×0.1mm大小的复合物晶体。收集AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体的X射线衍射数据，最高分辨率为采用分子置换法对复合物的晶体结构进行解析，获得AIA22-Fab/IFN-α2b复合物的晶体结构数据。对复合物晶体结构的分析揭示了抗体识别IFN-α的分子机制，也进一步明确了抗体分子的抗原表位。
基于此，本发明运用计算机辅助抗体分子设计方法对抗体AIA22进行旨在提高亲和力与中和活性的分子设计。在本发明的实施例中，采用同源模建的方法构建了IFN-α4a、6、7、14等亚型的结构模型；通过结构叠合，获得AIA22-Fab与不同亚型IFN-α的复合物结构模型。分析AIA22与各亚型IFN-α相互作用界面，确定拟突变的氨基酸位点。以突变前后结合自由能的变化(ΔΔG)为评价指标，对前述位点进行定点突变并对有利突变进行组合；依靠相互作用动力学曲线测定、亲和力测定、稳定性评价、体外中和活性评价等多种鉴定手段，对突变体抗体进行筛选，并最终优选出突变体GGE和96GE。
本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个互补决定区。FR1～4可以是从恒定区序列分离而来(比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从个人抗体框架区分离而来，或从不同的框架区基因组合而来，例如Kabat数据库(http://kabatdatabase.com)中收录的众多人抗体框架区序列。此处，重链为人免疫球蛋白亚群VH III家族，轻链为Lambda I家族。关于轻重链的CDR区，本发明基于抗原-抗体复合物晶体结构，采用计算机辅助抗体分子设计方法，并结合本领域常规的定点突变PCR技术，设计获得了大量突变体。对轻链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明，CDRL1序列为:SGSSSNIGSNYVA(SEQ ID NO 2)；CDRL2序列为：DNNQRPS(SEQ ID NO 3)；CDRL3序列为：QSNDXSLVE(SEQ ID NO 4)，其中，X可以是Glu、Ala、Asn、Ile、Lys、Vla或Tyr，优选为Glu。对重链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明，CDRH1序列为：SGAMS(SEQ ID NO 5)；CDRH2序列为：AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO 6)；CDRH3序列为：YX1X2FYTSFDY(SEQ ID NO 7)，其中，X1可以是Gly、Glu、Trp或Tyr，优选为Gly；X2可以是Gly或Ser，优选为Gly。
对该抗体与IFN-α2b相互作用界面的分析结果表明，除重链CDR1(CDRH1)外的其它5个CDR区均直接参与对抗原的识别，具体见实施例2。
因此，本发明提供了一种人源抗人多亚型IFN-α抗体，其轻链CDR1序列含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2序列含有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体的重链CDR2序列含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体，其轻链CDR1序列含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2序列含有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
其重链CDR1含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR2序列含有如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
更进一步地，本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体AIA22的突变体抗体GGE(96GE)的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，在SEQ ID NO.9中，当第101位的Xaa为Gly时，SEQ ID NO.9为突变抗体GGE的重链可变区氨基酸序列；当第101位的Xaa为Ser时，SEQ ID NO.9为突变抗体96GE的重链可变区氨基酸序列。
本发明提供的突变体抗体GGE(96GE)相较于AIA22存在5(4)个氨基酸位点的突变，对除IFN-α14以外的其余全部IFN-α亚型的中和活性存在至少5倍的提升(多数在10倍以上)，对IFN-α1b的中和活性提高甚至达50倍。
本发明提供的突变体抗体GGE(96GE)对IFN-α1b、2b、4a的亲和力KD分别为4.53nM、0.034nM和1.96nM(4.43、0.030和1.79nM)，相较于AIA22对IFN-α1b、2b、4a的亲和力KD(分别为210.90nM、0.33nM和36.10nM)存在至少10倍的提升。同时，突变体抗体GGE、96GE与IFN-α1b和IFN-α4a相互作用动力学曲线的解离过程改善明显(图11、图12)。
本发明提供的抗体为全抗体或各种其他形式的基因工程抗体，如单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD中的一种。
本发明提供的抗体本身可用于治疗和诊断，也可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物(如细胞毒性物质、放射性核素和\或化学分子等)用于治疗和诊断。
本发明更进一步提供编码上述抗体轻、重链可变区的基因，
编码抗体轻链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：
1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；或
3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链可变区的DNA分子；
编码抗体重链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：
1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示；或
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；或
3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的DNA分子。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上，较佳地至少80％以上，更佳地90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明所公开和要求保护的SEQ ID NO.2～9所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NO.2～9中。保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优先选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人源抗人多亚型IFN-α抗体中的非必须氨基酸残基。
因此，此处公开的核苷酸序列编码的抗体或/和含有此处公开的氨基酸序列的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。
此外，考虑到密码子的简并性，编码本发明SEQ ID NO.10～11所述抗体的基因可以但不局限于SEQ ID NO.10和11，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏好性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
本发明还提供一种抗体靶向药物分子，包含连接于化学分子、放射性同位素、多肽分子、毒素或生物大分子的上述人源抗人多亚型IFN-α抗体。连接方式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。
本发明还提供一种双特异性或多特异性分子，包含上述人源抗人多亚型IFN-α抗体或抗体的抗原结合部位。
一种抗体与其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，包含上述人源抗人多亚型IFN-α抗体和功能性蛋白或多肽分子的复合物。
上述融合蛋白是将抗体基因与融合蛋白基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。
本发明还提供了含有上述人源抗人多亚型IFN-α抗体的药物、制剂或检测试剂。
本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。本治疗用组分为无菌，可低温冻干。
本发明提供了人源抗人多亚型IFN-α抗体在制备以IFN-α为靶标的疾病治疗药物中的应用。所述的疾病为系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、银屑病、多肌炎、皮肌炎、硬化病、类风湿性关节炎等。
本发明提供一种抗人多亚型IFN-α多个亚型的抗体，该抗体可以抑制IFN-α所表现的一种或多种生物学活性。本抗体通过阻碍IFN-α与其受体结合发挥作用，也可以通过降低体内IFN-α水平发挥作用。IFN-α拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。
本发明利用X射线结晶学(X-ray crystallography)的方法测定了AIA22-Fab/IFN-α2b复合物结构，明确了抗原表位，并基于此采用计算机辅助抗体分子设计方法对人源抗人多亚型IFN-α抗体分子AIA22进行定向设计，获得亲和力与中和活性均显著提高的突变体抗体GGE和96GE，同时也证实了一系列的有利突变位点。利用上述获得的人源抗人多亚型IFN-α基因工程抗体可变区基因以及抗体序列特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产该抗体；或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其它基因，获得具有抑制IFN-α生物学活性的抗体产物；或利用体外标记或交联的方法获得的复合物，制成临床上用于治疗与IFN-α相关的自身免疫病的特异性抗体药物。
附图说明
图1为AIA22-Fab表达、纯化产物SDS-PAGE电泳图；M：蛋白分子量标准；1～3为非还原电泳：4～6为还原电泳；1，4：纯化过程杂蛋白；2，5：纯化产物；3，6：表达上清浓缩液。
图2为AIA22-Fab结合活性(forteBIO)鉴定结果；选用SABiosensor，Loading相同量的生物素标记的IFN-α2b，采用标准生物大分子相互作用动力学检测方法。
图3为结晶用抗原IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图；R表示还原电泳；N表示非还原电泳。
图4所示为复合物晶体初筛及优化结果；A图：0.1M phosphate-citrate pH4.2,40％(v/v)ethanol,5％(w/v)PEG1000,18℃；B图：0.1M Tris-HCl pH8.0,8％(w/v)PEG 8000,18℃；C图：0.1M BICINE pH 9.0,2％(v/v)Dioxane,10％(w/v)PEG 20000,18℃；D图：0.1MBICINE pH 8.5,2％(v/v)Dioxane,8％(w/v)PEG 20000,18℃。
图5所示为晶体衍射数据收集过程的二维电子密度图(φ为衍射角)。
图6所示为AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体结构。
图7所示为AIA22与IFN-α2b相互作用界面。
图8所示为AIA22结合IFN-α2b的抗原表位。
图9所示为中间突变体抗体AIAGWA-Fab与不同亚型IFN-α的复合物结构模型。
图10所示为部分突变体抗体与IFN-α1b-His相互作用的动力学曲线(forteBIOTM)。
图11A为AIA22与IFN-α1b相互作用图，其中上图为AIA22与IFN-α1b相互作用亲和力常数测定过程的代表性动力学曲线，下图为拟合过程；图11B为AIA22与IFN-α4a相互作用图，其中上图为AIA22与IFN-α4a相互作用亲和力常数测定过程的代表性动力学曲线，下图为拟合过程。
图12所示为突变体抗体与IFN-α1b和IFN-α4a相互作用亲和力常数测定过程的代表性动力学曲线；GGE与IFN-α1b(A图)和IFN-α4a(B图)相互作用；96GE与IFN-α1b(C图)和IFN-α4a(D图)相互作用；图例说明从高到低顺序标示了各曲线对应浓度；图例说明从高到低顺序标示了各曲线对应浓度。
图13为突变体抗体GGE、96GE与AIA22轻链(图13A)与重链(图13B)可变区序列比对结果；此处序列对应编号为Cα序号，本申请中其它出现氨基酸位点标记的地方均采用Kabat编秩规则(http://kabatdatabase.com)。
图14所示为GGE与Sifalimumab对各亚型IFN-α体外中和活性的协同效应评价结果；其中，"GGE+Sif(1:1)"表示GGE与Sifalimumab按浓度1:1混合的实验组。图14A～图14L依次对应各IFN-α亚型(图上方标示)，横坐标均为抗体浓度，纵坐标为中和活性，以处理组相对于对照组Daudi细胞活力的百分数形式体现。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1AIA22-Fab/IFN-α2b复合物结晶与结构解析
一、材料与方法：
1.材料：FreeStyleTM293-F哺乳动物细胞表达系统(包括培养基及转染试剂)购自Invitrogene公司。forteBIOTM Octet QKe系统(配套Biosensor购自北京托普生物科技有限公司)。真核表达载体pABG1为本室保存，载体结构图谱参见中国专利CN104292331A；限制性内切酶Afl II、Nhe I为NEB公司产品；T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶为TAKARA公司产品；Pfu PCR Master Mix及去内毒素质粒大提试剂盒购自天根生物技术有限公司；大肠杆菌感受态细胞Top10购自北京全式金生物技术有限公司。
结晶用抗原IFN-α2b由上海近岸科技有限公司提供。晶体筛选试剂盒Classic，ClassicII，Protein complex，PACT，JCSG+均为QIAGEN公司产品。分子排阻层析柱SuperdexS200(26/60)，AKTAPurifier 100，HiTrap Q Sepharose FF均购自GE公司，蛋白质浓缩装置Centricon(截留分子量为10kD)，超滤杯Stirred Cell Model 8200(及其配套滤膜)购自Millipore公司。
衍射数据收集工作在上海同步辐射光源(SSRF)Beamline BL17U线站上进行，衍射波长为探测器为ADSC Q315 CCD detector。
2.方法
AIA22是一种人源抗人多亚型IFN-α抗体，其分子来源、载体构建、表达与纯化以及活性鉴定等相关技术与方法参见中国专利CN104292331A。
2.1 AIA22-Fab的构建、表达、纯化与鉴定
1)AIA22-Fab的重链表达载体，其恒定区部分仅含有抗体重链CH1序列，不含CH2、CH3序列；采用引物H3F(SEQ ID NO.13)和HR(SEQ ID NO.14)扩增抗体重链可变区基因并克隆到pABG1表达载体；AIA22-Fab的轻链表达载体与AIA22的相同；
2)AIA22-Fab的轻重链质粒共转染FreeStyleTM293-F表达细胞，130rpm，37℃、5％CO2摇床培养3天；
3)AIA22-Fab的纯化采用HiTrap Q Sepharose FF，在AKTA系统进行纯化，步骤如下：10000rpm×10min离心收集表达上清；超滤浓缩上清至尽可能小的体积；脱盐柱将浓缩上清缓冲液置换为20mM pH5.8PBS；样品过Q柱，收集穿过峰，即为纯化AIA22-Fab样品，1M NaCl洗脱纯化柱吸附的杂蛋白；脱盐柱将纯化后AIA22-Fab的缓冲液置换为20mM,pH4.0,HAc-NaAc。
4)fortBIOTM系统鉴定AIA22-Fab纯化产物的结合活性。
2.2抗原-抗体复合物的形成条件探究
1)取1mg AIA22-Fab和1mg IFN-α2b蛋白样品混合配成AIA22-Fa/IFN-α2b复合物，18℃放置3小时；
2)取1ml复合物样品分别透析到1)20mM NaAc-HAc,20mM NaCl,pH 5.0；2)20mMTris-HCl,500mM NaCl,pH 7.5；3)20mM NaAc-HAc,100mM NaCl,pH 4.0的缓冲液中；
3)将样品注射到用相同缓冲液平衡好的Superdex S200(26/60)分子排阻层析柱中，根据出峰体积判断复合物是否形成，以及复合物是否稳定。
2.3复合物晶体的筛选和优化
1)复合物的晶体初筛：采用汽相坐滴扩散法进行晶体培养，将蛋白复合物样品在两个温度下(4℃和18℃)，针对Classic，Classic II，Protein complex，PACT，JCSG+共5个晶体筛选试剂盒分别进行筛选，总共960个晶体生长条件；
2)复合物的晶体优化：采用汽相悬滴扩散法对筛选到的蛋白复合物晶体进行优化，pH范围从8.0-9.5，PEG20000浓度从5％-15％(w/v)，获得可用于衍射的复合物晶体。
2.4复合物晶体的X-射线衍射数据收集与处理
复合物晶体先用沾有保护液(80％结晶池液+20％甘油)的尼龙环捞起并迅速放入液氮中冷却，随后将液氮冷却后的晶体迅速转移至衍射仪的测角头上进行衍射数据收集，获得晶体衍射数据。原始晶体衍射数据采用晶体学软件Imosflm和Scala进行积分处理。
采用分子置换法对复合物的晶体结构进行解析，分子置换法采用的软件为晶体学软件CCP4中的Phaser。分子置换获得初步相位后，对复合物结构进行多轮修正，结构修正采用的软件为晶体学软件CCP4中的REFMAC和Coot。
二、结果
1.AIA22-Fab的构建、表达、纯化与鉴定
本实施例成功构建了AIA22-Fab表达载体，并在FreeStyleTM293-F系统中实现了表达。表达上清及纯化产物SDS-PAGE结果如图1所示，AIA22-Fab分子量约为50kD，还原电泳显示轻重链片段在25kD左右。
本实施例采用forteBIOTM系统对AIA22-Fab纯化产物的结合活性进行鉴定；选用SABiosensor，Loading相同量的生物素标记的IFN-α2b，AIA22与AIA22-Fab的结合解离曲线如图2所示。考虑到分子效价的差异，本发明认为AIA22-Fab结合活性良好，可以用于下一步抗原-抗体复合物结晶。
2.AIA22-Fab/IFN-α2b复合物的形成条件分析
在进行复合物晶体培养条件探究之前，需要获得高浓度和高纯度的AIA22-Fab/IFN-α2b复合物样品，以利于高质量晶体的生长。本节的内容即是要探究形成复合物的合适条件，亦即下一步复合物结晶筛选的缓冲液条件。
首先结晶用抗原IFN-α2b的SDS-PAGE电泳结果如图3所示，样品条带正确，纯度高。
将前述AIA22-Fab纯化产物与IFN-α2b等质量混合形成复合物后，将样品透析到三种不同缓冲液(见本实施例方法的2.2的步骤2)中；使用Superdex S200(280ml)分子排阻层析柱对不同缓冲液条件下的复合物形成情况进行研究分析，结果表明：在20mMNaAc-HAc，100mM NaCl,pH 4.0的溶液中，AIA22-Fab和IFN-α2b两个蛋白均无沉淀，样品混合后过分子筛的出峰体积为243ml和266ml，其中复合物出峰体积为243ml，266ml的峰由混合体系中多出的IFN-α2b部分形成。收集复合物样品，浓缩到5mg/ml以上亦无蛋白沉淀。因此，本实施例确定的结晶筛选缓冲液即为：20mM NaAc-HAc，100mM NaCl,pH 4.0。
需要说明，在其它两个缓冲液条件下，混合AIA22-Fab和IFN-α2b后即出现了较为严重的蛋白沉淀现象(结果未列出)。
3.AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体的筛选和优化
就上述获得的AIA22-Fab/IFN-α2b复合物浓缩样品，本实施例采用汽相坐滴扩散法对960个晶体生长条件进行了筛选，得到的结晶条件为0.1M BICINE pH 9.0,2％(v/v)Dioxane,10％(w/v)PEG 20000，温度为18℃(图4的C图)。
随后采用汽相悬滴扩散法进行晶体优化，pH范围从8.0-9.5，PEG 20000浓度从5％-15％,最终得到可用于衍射的晶体生长条件为0.1M BICINE pH 8.5,2％(v/v)Dioxane,8％(w/v)PEG 20000，晶体大小为0.2mm*0.1mm*0.1mm(图4的D图)。
4.AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体的X-射线衍射数据收集与处理
AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体的X-射线衍射数据收集工作在上海同步辐射光源(SSRF)Beamline BL17U线站上进行，衍射波长为本发明获得了分辨率最高为的晶体衍射数据(图5)。原始晶体衍射数据采用晶体学软件Imosflm和Scala进行积分处理后的统计学数据如表1中“Data collection statistics”所示。
采用分子置换法对复合物的晶体结构进行解析。由于晶体结构为IFN-α2b和AIA22-Fab复合物，所以针对不同的蛋白分子采用了不同的模板：AIA22-Fab的重链采用PDB:2FB4的抗体结构进行分子置换，AIA22-Fab的轻链采用PDB:3TNN的抗体结构进行分子置换，IFN-α2b的结构则采用PDB:3S9D的蛋白结构进行分子置换。获得初步相位后，对复合物结构进行多轮修正，修正后的最终统计学数据如表1中“优化统计表”所示。
表1 AIA22-Fab/IFN-α2b晶体衍射数据及晶体结构解析统计学数据
括号内代表最高分辨率层的分辨率范围。
Rmerge＝ΣhΣi|Ihi–<Ih>|/ΣhΣiIhi,其中，Ihi和<Ih>分别代表第i个h反射的实测强度和总体均值。-
Rwork＝Σh|Fo(h)–Fc(h)|/ΣhFo(h),其中，Fo(h)与Fc(h)分别为实测和计算的h反射结构因子振幅，覆盖95％以上的反射。-Rfree的计算方法同-Rwork，覆盖全部的反射。
||最终的模型省略了电子密度解析较差的残基。
|||与立体化学理想结构数据集比较的均方根偏差。
*MolProbity定义。
表1数据显示，收集到衍射数据的完整度为99.8％，最高分辨率(Rwork和Rfree分别为22.52％和26.37％)。数据涵盖了AIA22-Fab重链1-132、143-191、198-219位氨基酸(Cα顺序)，轻链的2-211位氨基酸(Cα顺序)，以及复合物中IFN-α2b(-A链)的8-99、112-156AA。此外，每个不对称单元(ASU)还存在一个因晶体堆积而形成的非特异性相互作用分子IFN-α2b(-B链)。前述AA中，99.85％的氨基酸残基主链二面角都处于其允许构象，97.04％分布在最优区。总的说来，本发明解析获得的AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体结构数据准确，分辨率高，足以支持后续抗体分子的设计。
实施例2相互作用界面与抗原表位分析
一、材料与方法：
1.材料：复合物结构分析工作在一台双CPU(8-core)工作站及一台终端计算机上完成。操作系统为Windows 7(64bits)；软件系统包括：平台软件Discover Studio 2.5.5及YASARA(V 1.4.21)，蛋白质设计软件包FoldX Molecular Design Toolkit(V3.0)，图形显示及分析软件VMD、PyMol等。
2.方法
AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体结构的分析采用平台软件DiscoverStudio 2.5.5(简称“DS”)及PDBe Pisa完成。
二、结果
实施例1中所述获得的AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体结构如图6。本实施例采用Discovery Studio平台软件对复合物晶体结构数据进行了分析，揭示了抗原表位的信息：AIA22的抗原表位为IFN-α2b的LoopAB区第26～43位氨基酸和α螺旋E(Helix E)第142～157位氨基酸(图7)。而根据PDB:3S9D的结果，IFNAR2结合表位包括α螺旋A(Helix A)、LoopAB第12～35位氨基酸和α螺旋E第142～157位氨基酸。可见，AIA22的抗原表位与IFNAR2结合表位基本一致。
此处，因IFN-α2序列仅有165个氨基酸，较其它IFN-α亚型缺失第44位氨基酸，在本发明的研究分析中，为使IFN-α2与其它亚型序列对齐，在其序列第44位AA人为键入空格，即44位以后的氨基酸位点的编号在对应Cα序号的基础上加“1”(SEQ IDNO.1)。
进一步地，对AIA22与IFN-α2b相互作用机制进行分析，结果如图8与表2所列。表中所列抗体氨基酸序号采用Kabat编秩规则(http://kabatdatabase.com)。不难看出，除重链CDR1以外，AIA22的其余5个CDR均直接参与了对IFN-α2b的相互作用，参与相互作用的位点广泛分布于各CDR区，作用界面广，有利于牢固结合抗原并有效封闭抗原表位。此外轻链框架FR3的K66亦参与了对IFN-α2b的结合。
表2 AIA22-Fab/IFN-α2b复合物界面氨基酸残基及氢键相互作用列表
抗体序列采用Kabat编秩规则(http://kabatdatabase.com)；IFN-α2b第44为插入空格；表中相互作用的原子间距离采用DS进行测量。
实施例3基于复合物晶体结构的分子设计与突变体鉴定
一、材料与方法：
1.材料：全部分子设计工作在一台双CPU(8-core)工作站及一台终端计算机上完成。操作系统为Red Hat Linux 5.4及Windows 7(64bits)；分子模拟软件系统包括：平台软件Discover Studio 2.5.5(简称“DS”)及YASARA(V 1.4.21)，蛋白质设计软件包FoldX Molecular Design Toolkit(V3.0)，图形显示及分析软件VMD、PyMol等。
ForteBIOTM Octet QKe系统(配套Biosensor购自北京托普生物科技有限公司)。Daudi细胞株(人Burkitt's淋巴瘤细胞)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；细胞活性检测试剂CCK-8购自日本株式会社同仁化学研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清FBS、双抗均购自Life Technologies公司。IFN-αSampler试剂盒(包含全部12个IFN-α亚型)购自PBL公司。抗原IFN-α1b-His、IFN-α2b-His、IFN-α4a-His(蛋白C末端加6个组氨酸标签)由本实验室自行构建、表达、纯化、鉴定与保存。
2.方法
2.1突变体设计
2.1.1结构叠合
1)结构来源：IFN-α1b结构来源于PDB:3S9D；IFN-α4a、6、14等亚型的结构模型由在线软件I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)同源模建产生；前述获得的AIA22-Fab/IFN-α2b复合物晶体结构；
2)结构叠合：分别比对上述IFN-α1b、4a、6、7、14结构模型的序列和复合物晶体结构中的IFN-α2b序列；采用DS内置Align Structures(MODELER)功能叠合各亚型IFN-α结构与复合物晶体结构，参数默认；
3)复合物模型构建：删除结果中的IFN-α2b，构建AIA22-Fab与IFN-α1b、4a、6、7、14等亚型的复合物结构模型。
2.1.2 AIA22突变体设计
DS平台分析前述复合物结构模型的相互作用界面；综合考虑相互作用界面情况，依据对结合自由能变化(△△G)的计算，设计突变体抗体。结合自由能的计算由蛋白质设计软件包FoldX实现。
2.1.3突变体抗体与IFN-α相互作用动力学特征检测
采用forteBIOTM系统对突变体抗体与IFN-α相互作用的动力学特征进行比较与检测。选用AHC Biosensor，Loading相同量的突变体抗体及对照抗体，检测各抗体与等量抗原分子IFN-α的实时结合与解离情况。
2.1.4体外中和活性测定
1)取对数生长期Daudi细胞，计数，培养基稀释细胞悬液至2×105cells/ml的终密度，按50ul/孔接种至96孔细胞培养板；
2)含有2倍临界浓度IFN-α(参见中国专利CN104292331A)的培养基梯度稀释待测抗体，按50ul/孔加入相应细胞培养孔中，每一稀释度做一重复；同时设置抗体浓度为0(记为Ab，0％中和活性)和不含IFN-α(记为Ao，100％中和活性)的对照孔；
3)360rpm×3min振摇培养板，然后置于37℃，5％CO2细胞孵箱孵育72h；
4)培养基3倍稀释CCK-8，充分混匀后按50ul/孔加样，360rpm×3min振摇培养板，使充分混合；37℃、5％CO2孵育3h后，酶标仪检测450nm波长吸光值，630nm作为参考波长；
5)数据处理：记梯度浓度待测抗体的实验孔显色值为As，则抗体中和活性＝[(As-Ab)/(A0-Ab)]×100％，GraphPad Prism绘制细胞增殖曲线，拟合计算EC50值。
2.1.5其它
突变体抗体及对照抗体Sifalimumab的载体构建、表达与纯化以及活性鉴定等相关技术与方法参见中国专利CN104292331A。
二、结果
1.突变体设计与有利突变位点的优选
通过结构叠合，本发明构建了AIA22-Fab/IFN-α1b复合物结构模型(图9)，通过对结合界面的分析，结合AIA22丙氨酸扫描结果及体外实验数据(参见中国专利CN104292331A)，证实L-S34A、H-Y32G、H-Y96W三个位点的突变对提升AIA22对IFN-α1b的亲和力和中和活性是有益的，将该突变体抗体称为“过程突变体抗体”，记为AIAGWA。首先，采用DS将AIA22-Fab的前述三个相点进行突变，构建突变体抗体AIAGWA-Fab结构模型；同时采用同源模建的方法构建了IFN-α4a、6、14等亚型的结构模型；结构叠合，获得突变体抗体AIAGWA-Fab与不同IFN-α亚型的复合物结构模型，结果如图9所示。
通过对上述复合物结构模型相互作用界面的分析，尝试对以下位点进行突变设计，可能有助于其整体亲和力的提高。这些位点包括：轻链Y32、Q53、A93和重链Y58、Y99、T100，其中各亚型结合界面对H-Y99和L-Q53为不利位点的指向性明确。同时，分析结果表明，空间上可能影响到前述位点(特别是H-Y99和L-Q53)构象的相关氨基酸位点包括：轻链D50、A34、Q89、S90、N91、E96和重链W96、S97、T100、D101。就前述位点，本发明设计了一系列单个位点突变的突变体抗体，并以突变前后抗体对各亚型IFN-α结合自由能的改变(ΔΔG，kcal/mol)为衡量指标，对突变体抗体进行了第一轮优选，排除原则为：突变后对各亚型结合自由能ΔΔG＜0，则优选该突变体抗体。部分结果如表3所列，本发明亦设置了对设计方法的检验对照(如L-Q53N、L-D50N、H-T100M)，不难看出，理论计算的结果与实验结果是存在差异的，因此，也说明本发明以“对多个亚型IFN-α结合自由能的改变”为筛选原则是相对合理的，减少了实验的盲目性。
对于前述优选出的突变体抗体，进一步采用forteBIOTM系统检测其对IFN-α1b-His的动力学特征，并同时着重考察各突变体抗体相对于“过程突变体抗体”AIAGWA解离曲线的改善情况(表3)。基于鉴定结果，优选出H-S97G、H-W96G、L-A93N、L-A93I、L-A93E、L-A93K、L-A93V、L-Y93Y八个有利突变。
表3基于复合物晶体结构设计的部分单个位点突变体抗体评价及鉴定结果
NB＝no binding；NS＝not significant；指动力学特征变化不明显。Ass＝association，结合相；Disa＝disassociation，解离相；↓，↓↓，↓↓↓：表示相对AIAGWA动力学特征变差，程度由前到后逐渐增强；↑，↑↑，↑↑↑：表示相对AIAGWA动力学特征改善，程度由前到后逐渐增强；对于解离相而言，↑↑↑代表解离曲线的改善达到sifalimumab的程度。
2.有利突变的组合与鉴定
基于前述优选的有利突变，进一步地进行多个位点的组合，构建新的突变体抗体，计算其突变前后结合自由能的变化(ΔΔG)并评价其对IFN-α1b-His和IFN-α2b-His的动力学特征，部分结果如表4所列，forteBIOTM系统动力学特征评价的典型结果如图10所示。不难看出，多个突变体抗体对IFN-α1b-His结合的解离曲线改善明显，包括：H-96G97G+L-A93E，H-W96E，H-W96G+L-A93V，H-W96G+L-A93K，H-W96G+L-A93E，H-S97G+L-A93V，H-S97G+L-A93K等。
表4多个位点组合突变的评价结果
相对亲和力比较采用forteBIOTM系统。NS＝not significant；指亲和力变化不明显。↓，↓↓，↓↓↓：表示相对AIAGWA亲和力降低，程度由前到后逐渐增强；↑，↑↑，↑↑↑：表示相对AIAGWA亲和力升高，程度由前到后逐渐增强。
3.中和活性初步评价
对于前述优选的组合突变体，进行体外中和活的初步评价，更进一步地优选突变体抗体。结果如表5所示，其中，H-96G97G+L-A93E(记为“GGE”)、H-W96G+L-A93E(记为“96GE”)以及H-W96G+L-A93K(记为“96GK”)三个突变体抗体对IFN-α1b、IFN-α2b两个亚型的中和活性均有较大幅度的提升。
表5突变体抗体中和活性筛选结果
实施例4亲和力与中和活性测定
一、材料与方法：
1.材料：GE BIAcoreTM T200系统(配套试剂盒、耗材及HBS-EP+缓冲液均购自GE公司)。其它涉及的材料参见实施例3相应内容。
2.方法BIAcoreTM T200测定抗体亲和力步骤如下：
1)按Human Antibody Capture Kit(GE healthcare,BR-1008-39)产品说明将捕获抗体偶联至CM5芯片(GE healthcare,10226578)表面；采用多循环动力学(Multi-cyclekinetics)测定方法进行实验；
2)将纯化后待检测抗体用HBS-EP+缓冲液稀释至1.0ug/mL，捕获条件为：25℃，5μL/min×1min，捕获目标响应值(Response)为270RU；对于稳态测定，可通过调整浓度及时间，减少捕获的待测抗体的量(响应值)，以便在较短结合时间达到稳态；
3)HBS-EP+缓冲液度稀释抗原IFN-α，测试条件为：25℃，流速30μL/min；结合时间为2min(根据抗体分子特性确定，特别是对于稳态测定方法，结合时间应保证各浓度抗原的结合均能达到稳定响应值)，解离时间为10～40min(根据抗体分子特性确定)；设置一个浓度的重复测量，作为质量控制；设置两个空白对照，以校正系统偏差；
4)每一个浓度循环后，芯片再生条件为：3M MgCl2，30uL/min×30s；
5)实验完毕，用BIAcore T200 Evaluation Software进行结果分析。
二、结果
1.抗体分子体外中和活性
对实施例3中获得的三个突变体抗体，本发明就其对全部亚型IFN-α的体外中和活性进行了全面的评价，方法如实施例3中所述，结果如表6所示。总体而言，GGE、96GE以及96GK三个突变体抗体对除IFN-α14以外全部亚型的中和活性相较于AIA22均有很大幅度的提升，其中GGE和96GE提升更为显著。具体地，与AIA22相比，突变体抗体GGE和96GE对IFN-α1b的中和活性提高了约50倍，对IFN-α5、6、10、16、21的中和活性提高了10倍以上，对IFN-α2b、4b、17的中和活性提高了5倍以上，对IFN-α8的中和活性提高了2倍以上。
由此可见，基于复合物晶体结构进行的抗体分子设计达到了预期提高整体中和活性的目的。
2.抗体分子亲和力常数测定结果
抗体亲和力(Affinity)是评价抗体分子的重要指标。表面等离子共振(SPR)技术是定量抗体亲和力的金标准之一。BIAcoreTM系统即是基于SPR原理的精确检测生物大分子相互作用的商业化系统，在生物制药领域广泛使用。本发明采用BIAcoreTM T200系统测定了突变体抗体与IFN-α相互作用的亲和力常数，结果如表7所列。总体而言，与其中和活性的提高一致，GGE和96GE对IFN-α1b、IFN-α2b及IFN-α4a的亲和力均有较大幅度的提升。具体地，与AIA22相比，GGE和96GE对IFN-α1b的亲和力提高了约50倍，对IFN-α2b的亲和力提高了约10倍，对IFN-α4a的亲和力提高了约20倍。更重要的是，BIAcoreTM T200系统的检测显示，GGE、96GE与IFN-α1b、IFN-α4a相互作用的动力学曲线解离过程改善明显(图11、图12)。
需要特别说明的是，BIAcoreTM系统测定抗体亲和力的常用方法有两种：动力学测定(Kinetic analysis)和稳态测定(Measurement of steady-state)，两种方法基本能够涵盖所有常见的生物大分子相互作用类型。其中动力学测定适用广泛，是根据既有数学模型对实测的相互作用动力学曲线进行拟合，计算相互作用过程的结合速率常数(association rate constant，ka)和解离速率常数(disassociation rate constant，kd)，再依据KD＝kd/ka求得亲和力常数，亦即平衡解离常数(equilibrium disassociation constant，KD)。而稳态测定仅适用于1:1结合模型的亲和力测定，对于抗体的亲和力测定而言，该方法通过拟合不同抗原浓度与对应稳态响应值的浓度-响应曲线，计算获得KD。一般地，对于特定的一对相互作用分子，仅适用一种测定方法。本实施例中，AIA22与IFN-α1b、IFN-α4a的相互作用动力学过程不适合采用动力学测定方法进行有效拟合计算，因此采用了稳态测定方法进行亲和力常数的测定(图11)，该方法的结果分析过程并不依赖对ka和kd的计算。
3.突变体抗体与AIA22序列比对与分析
本发明比较了GGE和96GE与AIA22的轻重链可变区氨基酸序列差异，结果如图13所示，GGE在AIA22轻重链可变区的基础上总共进行了5个位点的突变，96GE总共进行了4个位点的突变。根据前述实验结果，突变体抗体的亲和力与中和活性较亲本抗体AIA22有了实质性的提升。由此可见，基于复合物晶体结构进行的抗体分子设计是成功的，不仅准确找到了有利突变位点，还依靠对有利突变位点进行的组合突变最终达到了大幅度提升整体亲和力与中和活性的预期。
此外，根据实施例2的分析，轻链第34位氨基酸(对应图13的A图中第35位)以及重链第32位氨基酸(对应图13的B图中第32位)和第96位氨基酸(对应图13的B图第100位)均不直接参与对抗原的结合，并且突变后的残基侧链较突变前更小，因此，其对亲和力提升的作用更可能是改善相邻氨基酸残基的空间构象，使其更有利于抗原结合。因此，可以确定，前述4～5个位点的突变不会对抗体的抗原表位产生实质性的影响，亦即突变体抗体GGE和96GE的抗原表位与AIA22的抗原表位一致。
表7 BIAcoreTM T200测定抗体亲和力常数结果
ka：结合速率常数(association rate constant)，kd：解离速率常数(disassociation rateconstant)，KD：平衡解离常数(equilibrium disassociation constant)；Chi2为拟合计算过程卡方值，表征实际情况(动力学曲线或者响应曲线)与对应计算模型的匹配程度。NA＝not available。表中数据均来源于三次独立测定的结果，以“均数±标准差”的形式呈现。*稳态测定(Measurement of steady-state)，拟合不同浓度抗原与其对应稳态响应值曲线计算获得KD(1:1结合)。其余均采用动力学测定(Kinetic analysis)，KD＝kd/ka(1:1结合)。
实施例5本发明的人源抗人多亚型干扰素α抗体GGE与Sifalimumab的协同效应
一、材料与方法：
参见实施例3所述“体外中和活性的测定”方法，不同之处在于，本实施例中增加了GGE和Sifalimumab按浓度1:1混合的协同效应实验组。
二、结果：
根据公开的报道，Sifalimumab的抗原表位位于IFN-α的IFNAR1结合区。而本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体的抗原表位位于IFN-α的IFNAR2结合区。从前述表6、表7的结果可以看出，本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体GGE和96GE与Sifalimumab具有相当的亲和力与整体中和活性。但在对不同亚型IFN-α的中和活性存在差异，亦即对多亚型IFN-α的中和谱不同。
考虑到抗原表位与中和谱的差异，本实施例以体外中和活性为评价指标，初步探究本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体与对照抗体Sifalimumab的协同效应，结果以Daudi细胞增殖曲线的形式呈现，如图14所示。
结果显示，在对IFN-α1b、2b、5、6、8、10、16、17的中和活性方面，本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体GGE与Sifalimumab存在明显的协同效果；在对IFN-α4b、14、17的中和活性方面的协同效果不明显，但协同效应实验组的中和活性均不亚于GGE和Sifalimumab单独使用时较优的一个。总体而言，本发明提供的人源抗人多亚型IFN-α抗体与Sifalimumab按照浓度1:1混合后对IFN-α各亚型的中和活性得到进一步的提升。

Claims (12)

1.一种人源抗人多亚型IFN-α抗体的抗原表位，其特征在于，其为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第26～43位氨基酸和第142～157位氨基酸形成的空间表位。
2.如权利要求1所述的抗原表位在制备人源抗人多亚型IFN-α抗体中的应用。
3.一种人源抗人多亚型IFN-α抗体，其特征在于，其能够特异地识别权利要求1所述的抗原表位，
其轻链可变区的CDR1序列含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR2序列含有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
其重链可变区的CDR2序列含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，CDR3序列含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，其重链可变区的CDR1序列含有如SEQID NO.5所示的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
6.如权利要求3～5任一所述的抗体，其特征在于，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD。
7.编码权利要求3～5任一所述抗体的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：
1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；或
3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链可变区的DNA分子；
编码重链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：
1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的DNA分子。
8.含有权利要求7所述基因的表达载体或含有该表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。
9.一种双特异性或多特异性分子，其特征在于，包含权利要求3～5任一所述抗体或抗体的抗原结合部位。
10.一种抗体与其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，其特征在于，包含权利要求3～5任一项所述抗体和功能性蛋白或多肽分子的复合物。
11.含有权利要求3～5任一所述抗体的药物、制剂或检测试剂。
12.权利要求3～5任一项所述抗体在制备以多亚型IFN-α为靶标的疾病治疗药物中的应用。
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