KR20170028439A - 점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발 - Google Patents

점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발 Download PDF

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Abstract

임상적으로 연관된 농도에서 양호한 친화도 및 낮은 점도 양쪽 모두를 지니는, 단핵구, 대식세포 및 호중구 상에서 발현되는 단백질인 TREM-1에 특이적으로 결합하여 그의 활성화를 방지할 수 있는 항체가 기술된다. 이같은 항체는 염증성 질환, 예컨대 류머티스성 관절염 및 염증성 장 질환에 걸린 개체의 치료에서 유용하다.

Description

점도를 감소시키기 위한 TREM-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발{SITE DIRECTED MUTAGENESIS OF TREM-1 ANTIBODIES FOR DECREASING VISCOSITY}
기술 분야
본 발명은 TREM-1 mAb, 및 mAb 용액 점도를 낮추고 표적 친화도를 유지하기 위한, TREM-1 mAb의 자기-상호작용 또는 TREM-1에 대한 TREM-1 mAb의 상호작용에서 수반되는 특정한 음으로 하전된 아미노산 또는 하전되지 않은 아미노산의 돌연변이에 관한 것이고, 본 발명은 치료 및 제약 용도를 위한 이러한 항체의 용도에 관련된다.
본 발명의 서열 목록
서열식별번호(SEQ ID NO): 1은 야생형 (wt) 인간 TREM-1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 2는 인간화 TREM-1 항체 (WO2013/120553의 mAb 0170)의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 3은 인간화 TREM-1 항체 (WO2013/120553의 mAb 0170)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 4는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0317, E27Q, E97S)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 5는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0318, E27Q, E97Q)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 6은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0319, E97S)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 7은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0320, E97Q)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 8은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0321, E27Q)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 9는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0322, F32A)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 10은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0323, F32S)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 11은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0324, A59Y)의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 12는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0325, N57S)의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 13은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0326, A59Y, N57S)의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 14는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0330, F32A, E27Q, E97Q)의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 15는 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0332, A59Y; 0332는 HC로서의 서열식별번호: 15 및 LC로서의 서열식별번호: 5가 조합된 mAb이다 (표 1))의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 16은 인간화 TREM-1 항체 (mAb 0333, A59Y; 0333은 HC로서의 서열식별번호: 16 및 LC로서의 서열식별번호: 14가 조합된 mAb이다 (표 1))의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 17은 전장 cTREM-1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열식별번호: 18은 mAb 0170의 Fab 영역의 중쇄를 나타낸다.
서열식별번호: 19는 mAb 0170의 Fab 영역의 경쇄를 나타낸다.
배경
TREM-1은 단핵구, 대식세포 및 호중구 상에서 발현되는 활성화 수용체이다. 이러한 세포들은 염증을 유발시키는 시토카인 및 다른 매개체를 방출함으로써 만성 염증 질환에서 중심적인 역할을 한다. TREM-1 mRNA 및 단백질 발현이 RA 및 IBD 환자에서 상향-조절되고, TREM-1-양성 세포가 염증 부위에 축적되며, 이는 질환 중증도와 상호연관된다. 활성화된 호중구에 의해 주로 발현되는 펩티도글리칸-인식-단백질 1 (PGLYRP1)이 TREM-1에 대한 리간드이고, 결합 시 TREM-1 신호전달을 매개한다.
시험관 내에서, TREM-1의 맞물림은 TNF, IL-8, 및 단핵구 화학주성 단백질-1을 포함하는 염증유발성(pro-inflammatory) 시토카인의 분비를 촉발한다. 또한, TREM-1 신호전달은 여러 톨(Toll)-유사 수용체 (TLR)와 상승작용을 일으켜 염증유발성 신호를 추가로 증진시킨다. 차례로, 이는 TREM-1의 발현을 상향-조절하여, 염증을 증폭시키는 악순환을 초래한다. TLR이 만성 염증성 질환 예컨대 RA 및 IBD의 발병 및 진행에 기여한다는 것을 가리키는 증거가 증가하고 있다.
WO 2013/120553에 인간 및 시노몰구스 TREM-1 기능 양쪽 모두를 억제하는 인간화 항-TREM-1 mAb가 개시되어 있다. 그러나, 항-TREM-1 mAb의 점도 프로파일이 >50 mg/ml로 약물 제품을 생산하기 위한 제작 공정을 방해할 수 있고, 임상에서의 최적 용량 설정을 제한할 수 있다. 충분한 임상 효과를 달성하는데 종종 높은 투여량 (수 mg/kg)의 단백질 치료제가 요구되고, 대부분의 이러한 치료제가 피하 전달에 의해 투여되기 때문에, 결과적으로 치료제의 환자 자기-투여가 < 1.5 mL의 부피로 제한된다 (Shire et al., J. Pharm. Sci. 2004, 93, 1390-1402). 단백질 제제가 높은 점도의 생성 용액을 초래하는 경우 환자 자기-투여에 적합한 고농도 단백질 제제의 개발은 제조 및 전달에서의 일반적인 장애물이다.
mAb 용액의 점도 거동에 대한 효과에 관하여 mAb의 전하 분포가 연구되었다 (Ydav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802). 또한, 묽은 용액에서 지속되는 약한 비-특이적 전하 상호작용이 진한 mAb 용액의 점도에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Connolly et al., Biophys. J., 2012, 103, 69-78.). mAb 용액의 점도를 감소시키기 위한 해결책은 직접적인 분자간 전하-전하 상호작용을 파괴하는 부위-지정 전하 교환 돌연변이를 도입하는 것 (Ydav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802) 또는 염 또는 카운터 이온의 첨가 (Liu et al., J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1928-1940; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2010, 99, 1152-1168; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2012, 101, 998-1011; Kanai et al., J. Pharm. Sci. 2008, 97, 4219-4227)였다. 그러나, 염 및 카운터 이온의 첨가는 투여된 용액의 과다-오스몰랄농도의 관점에서 환자에 대한 유해 효과를 초래한다.
WO 2013/120553에 개시된 인간화 항-TREM-1 mAb 0170의 CDR의 부위-특이적 돌연변이에 의해 생성된 TREM-1 항체가 본원에서 개시된다. 개시된 항체는 mAb의 직접적인 분자간 전하-전하 자기-상호작용을 파괴하지 않지만, 유리한 점도 프로파일을 가지며, 표적 결합 프로파일을 유지하였다. 유리한 점도 프로파일은 약물 제품이 치료 및 제약 용도에 필수적일 수 있는 높은 농도로 생산되는 것을 가능하게 한다. 이러한 항체는 패혈증 또는 만성 염증성 질환 예컨대 류머티스성 관절염, 건선성 관절염 및 염증성 장 질환에 걸린 개체의 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
개요
본 발명의 주요 측면은 단량체성 mAb에 대해 예상되는 범위의 점도 프로파일을 가지며 WO 2013/120553의 mAb0170만큼 강력하게 TREM-1 기능을 차단하는 항-TREM-1 mAb에 관한 것이다. 본 발명의 변이체 mAb의 유리한 점도 프로파일에 더하여, 상기 변이체는 TREM-1 수용체에 대한 효능작용을 나타내지 않는다.
본 발명의 한 측면은 80 mg/mL의 농도에서 항체 또는 항체의 항체 단편의 점도가 5 cP 미만, 바람직하게는 4 cP 미만인 것을 특징으로 하는, TREM-1에 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
이러한 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기 중 하나 이상이 본원에 기술된 바와 같이 하전되지 않은 아미노산 잔기로 치환된 서열식별번호: 3의 변이체를 포함할 수 있다.
이러한 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 위치 32의 페닐알라닌이 아미노산 잔기 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 메티오닌으로부터 선택되는, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 발린 및 류신으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이되고, 더욱 바람직하게는 서열식별번호: 3의 F32가 알라닌 또는 세린으로 돌연변이된 서열식별번호: 3의 변이체를 포함할 수 있다.
이러한 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 임의의 하나 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 또 다른 아미노산, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된 서열식별번호: 2의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 서열식별번호: 1의 TREM-1에 특이적으로 결합하여 이를 차단할 수 있고, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 양쪽 모두의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편이고, 여기서 변이체는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이 및 "전하-패치(patch)" 돌연변이 (표 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기 중 하나 이상이 하전되지 않은 아미노산 잔기로 치환된다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기들이 하전되지 않은 아미노산 잔기들로 치환된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 "전하 패치" 잔기 D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 중 임의의 하나가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된 서열식별번호: 3의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 "전하 패치" 잔기 D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 중 1개 초과가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 E27 및 E97 중 하나가 하전되지 않은 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 서열식별번호: 3의 E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지될 수 있고, E97은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 대안적으로, 서열식별번호: 3의 E97은 돌연변이되지 않은 상태로 유지될 수 있고, E27은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다
한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 E27 및 E97 양쪽 모두가 하전되지 않은 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 서열식별번호: 3의 E27은 글루타민으로 돌연변이될 수 있고, 서열식별번호: 3의 E97은 글리신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 단편의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 E97은 글루타민으로 돌연변이되고, E27은 글리신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 서열식별번호: 3의 E27 및 E97 양쪽 모두가 글루타민으로 돌연변이될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 임의의 하나 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 또 다른 아미노산, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된 서열식별번호: 2의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 2의 잔기 A59 및 N57 중 적어도 하나가 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다. 예를 들어, 서열식별번호: 2의 A59는 돌연변이되지 않은 상태로 유지될 수 있고, N57은 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 대안적으로, 서열식별번호: 2의 N57은 돌연변이되지 않은 상태로 유지될 수 있고, 서열식별번호: 2의 A59는 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 추가 실시양태에서, 서열식별번호: 2의 A59 및 N57 양쪽 모두가 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다.
본 발명의 추가 측면은 "Fab-TREM-1 상호작용" 아미노산 잔기에서 서열식별번호: 3에 부위-지정 돌연변이를 도입하여 서열식별번호: 1의 인간 TREM-1에 대한 것과 동일한 시노몰구스 TREM-1에 대한 mAb 친화도를 달성함으로써 수득된 개선된 임상-전 평가 값에 관한 것이고, 예컨대 서열식별번호: 3의 Phe 잔기가 Ala 또는 Ser으로 치환된다.
따라서 본 발명은 서열식별번호: 3의 "Fab-TREM-1 상호작용" 아미노산 잔기인 F32가 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프롤린 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기를 하전되지 않은 아미노산 잔기로 치환하는 것 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)과 조합하여 mAb-TREM-1 계면에서 서열식별번호: 2에 부위-지정 돌연변이를 도입하여 서열식별번호: 1의 인간 TREM-1에 대해 존재하는 바와 동일한 시노몰구스에 대한 mAb 친화도를 달성함 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)으로써 수득된 개선된 점도 성질 및 개선된 임상-전 평가 값의 조합 효과에 관한 것이다.
본 발명의 상기 기술된 측면들 중 임의의 것에 따라,
i) 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 적어도 하나의 음으로 하전된 잔기가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고,
ii) 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 적어도 하나의 잔기 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 및 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된
항체 또는 그의 단편이 제공된다.
한 실시양태에서,
i) 서열식별번호: 3의 E27 및 E97 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고;
ii) 서열식별번호: 2의 A59 및 N57 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된
항체 또는 그의 단편이 제공된다.
추가로 본 발명은 서열식별번호: 4 내지 16 중 임의의 하나를 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 항-TREM-1 mAb 변이체의 점도 프로파일 및 그의 지수 곡선 피팅을 도시한다.
도 2는 PGN 및 (A) 재조합 PGLYRP1 또는 (B) 활성화된 호중구에 의해 발현된 PGLYRP1로 자극된 인간 TREM-1 리포터 세포주 (BWZ'36/hTREM-1)에서 인간 TREM-1 신호전달을 억제하는 mAb 0170 변이체의 능력을 도시한다 (N명의 공여자의 평균).
도 3은 PGN 및 재조합 PGLYRP1로 자극된 시노몰구스 TREM-1 리포터 세포주 (TE426.27)에서 시노몰구스 TREM-1 신호전달을 억제하는 mAb 0170 변이체의 능력을 도시한다.
도 4는 PGN 및 재조합 PGLYRP1로 자극된 저산소성 M2 대식세포로부터의 TNFa 방출을 억제하는 mAb 0170 변이체의 능력을 도시한다.
도 5는 저산소성 M2 대식세포로부터 TNF 방출을 유도하는 플레이트에 결합된 mAb 0170 변이체의 효능작용 잠재력을 도시한다. MAb 1278 (R&D)이 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 6은 mAb 0170에 비교된 항-TREM-1 mAb 변이체의 유체역학 반경을 도시한다.
설명
TREM-1은 단일한 세포외 면역글로불린 도메인, 및 명백한 신호전달 모티프가 없는 짧은 세포질 꼬리를 포함하는, 아미노산 234개로 이루어진 막횡단 단백질이다. 활성화되는 경우, TREM-1은 ITAM-함유 신호전달 어댑터 단백질인 DAP12와 회합된다. 하류 신호전달은 NFAT 전사 인자를 활성화하여 염증유발성 시토카인 생산의 상향-조절을 야기하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 TREM-1에 특이적으로 결합하여 그의 기능을 차단할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 TREM-1 활성화 및 하류 신호전달을 감소시킴/차단함에 의해 TREM-1 기능을 차단할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 TREM-1을 직접적으로 또는 간접적으로 차단하는 여러 상이한 메커니즘 중 하나 또는 이들의 조합에 의해 TREM-1을 차단할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 TREM-1의 천연 리간드인 펩티도글리칸 인식 단백질 1 (PGLYRP1)이 TREM-1과의 기능성 복합체를 생성하는 것을 방지할 수 있고/있거나, 본 발명의 항체가 개별적인 TREM-1 분자가 이량체 또는 다량체를 형성하는 것을 방지함으로써 TREM-1을 차단할 수 있다. 그렇지 않은 경우에는 TREM-1 이량체의 계면에 존재할 TREM-1의 일부분에 결합하여, 개별적인 TREM-1 분자들이 서로 회합하는 것을 방지할 수 있는 TREM-1 항체에 의해 TREM-1 이량체화 또는 다량체화가 감소 또는 방지될 수 있다.
TREM-1과 그의 리간드의 상호작용을 방해하는 TREM-1 항체에 의해 TREM-1 이량체화 또는 다량체화가 감소 또는 방지될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 TREM-1의 PGLYRP1-유도 활성화를 차단할 수 있다. 신호 펩티드 및 펩티도글리칸 결합 도메인으로 이루어진, 아미노산 196개 길이의 고도로 보존된 단백질인 PGLYRP1은 호중구에서 발현되고, 그의 활성화 시 방출된다. 본 발명에 따른 항체는 골수성 세포로부터의 염증유발성 시토카인 방출을 하향-조절할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는, 본원에서 개시된 바와 같이, 대식세포, 호중구, 윤활 조직 세포 및/또는 리포터 세포로부터의 TNF, MIP-1베타, MCP-1, IL-1베타, GM.CSF, IL-6 및/또는 IL-8 방출을 차단할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 TREM-1 및 인간 이외의 또 다른 종으로부터의 TREM-1 양쪽 모두에 결합할 수 있을 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "TREM-1"이라는 용어는 임의의 적절한 생물로부터 유래될 수 있는 임의의 천연 발생 형태의 TREM-1을 포괄한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 TREM-1은 척추동물 TREM-1, 예컨대 포유동물 TREM-1, 예컨대 영장류 (예컨대 인간, 침팬지, 시노몰구스 원숭이 또는 리서스 원숭이); 설치류 (예컨대 마우스 또는 래트), 토끼목 (예컨대 토끼), 또는 우제류 (예컨대 소, 양, 돼지 또는 낙타)로부터의 TREM-1일 수 있다. 바람직하게는, TREM-1은 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)이다. TREM-1은 성숙 형태의 TREM-1 예컨대 적절한 세포 내에서 번역-후 프로세싱이 진행된 TREM-1 단백질일 수 있다. 이같은 성숙 TREM-1 단백질은, 예를 들어, 글리코실화될 수 있다. TREM-1은 전장 TREM-1 단백질일 수 있다.
본 발명의 항체는 B 림프구의 단일 클론으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래된다는 점에서 모노클로날 항체일 수 있다. 예를 들어, WO2013/120553의 실시예에 기술된 방법을 사용하여, TREM-1 항체를 생산, 스크리닝 및 정제할 수 있다. 간략하게, 적절한 마우스 예컨대 TREM-1 또는 TREM-1/TREM-3 녹-아웃(knock-out) (KO) 마우스를 TREM-1, TREM-1을 발현하는 세포, 또는 양쪽 모두의 조합물로 면역화시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 본 발명에 따른 모노클로날 항체들의 혼합물이라는 점에서 폴리클로날일 수 있다.
직접적인 ELISA 또는 FMAT를 사용하여 하이브리도마 상청액의 1차 스크리닝을 수행할 수 있고, 유동 세포측정법을 사용하여 2차 스크리닝을 수행할 수 있다. 그 후 양성 하이브리도마 상청액을 리포터 유전자 검정법에서 스크리닝할 수 있다.
원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 재조합에 의해 항체가 발현될 수 있다. 원핵생물 세포는 이. 콜라이(E. coli)일 수 있다. 진핵생물 세포는 효모, 곤충 또는 포유동물 세포, 예컨대 영장류 (예컨대 인간, 침팬지, 시노몰구스 원숭이 또는 리서스 원숭이), 설치류 (예컨대 마우스 또는 래트), 토끼목 (예컨대 토끼), 또는 우제류 (예컨대 소, 양, 돼지 또는 낙타)인 생물로부터 유래된 세포일 수 있다. 적절한 포유동물 세포주는 HEK293 세포, CHO 세포 및 HELA 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 다른 방법, 예컨대 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이에 의해 TREM-1 항체가 생산될 수도 있다.
생산되었으면, WO2013/120553의 실시예에 기술된 방법을 사용하여, 예를 들어, 전장 TREM-1 또는 그의 돌연변이체에 결합하는 것에 대해 항체를 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 기능성 TREM-1 항체는 TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있고, TREM-1을 차단하거나 자극함으로써 TREM-1 활성화 및 하류 신호전달에 대한 효과가 있는 항체이고, 본원에서 "기능성 TREM-1 항체"로 지칭된다. 기능성 TREM-1 항체를 확인하는 방법은 (a) TREM-1, 신호전달 단백질 및 리포터 구축물을 발현하는 제1 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 세포가 TREM-1 변형제와 함께 인큐베이션될 때의 제1 세포의 활성을 측정하는 단계; (c) (b)의 공동-배양물을 TREM-1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (d) 제1 세포의 활성이 (b)에서 측정된 활성 미만이거나 또는 이러한 활성을 초과하는 것을 측정하는 단계를 포함한다.
(a)의 "제1 세포"는 조혈 기원의 세포, 예컨대 골수성 세포, 예컨대 T-세포일 수 있다. (a)의 신호전달 단백질은 TREM-1과 복합체를 형성할 수 있는 임의의 신호전달 단백질일 수 있다. 적절한 신호전달 단백질은 DAP10, DAP12, TCR 제타, Fc 감마 RIII 및 Fc 수용체, 또는 그의 부분을 포함한다. (a)의 리포터 구축물은 신호전달 단백질을 통해 활성화되어 인식가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 구축물일 수 있다. 적절한 리포터 구축물은 전사 인자 및 리포터 유전자를 포함한다. 신호전달 단백질은 NFAT 및 NFkB로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자를 통해 신호를 전달할 수 있다. 리포터 유전자는 상기 제1 세포에서 천연적으로는 발현되지 않는 유전자이고, β-갈락토시다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 클로람페니콜 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 상기 제1 세포를 전사 인자 및 리포터 유전자로 형질감염시킬 수 있다.
실시예에서 기술된 "BWZ/hTREM-1 리포터 세포" 및 "TE426.27 리포터 세포"가 "제1 세포"의 한 예이다.
(b)의 변형제는 TREM-1 리간드 또는 활성화된 호중구일 수 있다. (c)의 "TREM-1 항체"는 TREM-1 특이적 하이브리도마 상청액 또는 정제된 항체일 수 있다. (d)에서 측정된 활성은 리포터 구축물에 의해 생산된 신호이다. 이같은 신호전달의 예는 NFAT-구동 LacZ (β-락타마제 루시페라제) 생산에 의해 야기되는 발광이다.
이러한 방법은 차단성 TREM-1 항체를 확인하도록 개조될 수 있다. 차단성 TREM-1 항체를 확인하는 방법은 (a) TREM-1, 신호전달 단백질 및 리포터 구축물을 발현하는 제1 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 세포가 활성화된 호중구와 함께 인큐베이션될 때의 제1 세포의 활성을 측정하는 단계; (c) 제1 세포 및 활성화된 호중구의 공동-배양물을 TREM-1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (d) 제1 세포의 활성이 (b)에서 측정된 활성 미만인 것을 측정하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 자극성 TREM-1 항체를 확인하도록 개조될 수도 있다. 자극성 TREM-1 항체를 확인하는 방법은 (a) TREM-1, 신호전달 단백질 및 리포터 구축물을 발현하는 제1 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 세포의 활성을 측정하는 단계; (c) 상기 세포를 TREM-1 항체와 접촉시키는/이와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (d) 제1 세포의 활성이 (b)에서 측정된 활성을 초과하는 것을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된, 차단성 항체를 확인하는 방법에 의해 확인될 수 있는 차단성 TREM-1 항체에 관한 것이다. 상기 및 실시예에서 기술된 방법을 사용하여 테스트했을 때, 본 발명에 따른 항체는, 50 ㎍/ml 미만, 예컨대 40 ㎍/ml 미만, 예컨대 30 ㎍/ml 미만, 예컨대 20 ㎍/ml 미만, 예컨대 10 ㎍/ml 미만, 예컨대 5 ㎍/ml 미만, 예컨대 1 ㎍/ml 미만의 농도에서, 상기 제1 세포의 활성을 50％, 예컨대 60％, 예컨대 70％, 예컨대 80％, 예컨대 90％, 예컨대 95％, 예컨대 100％만큼 감소시킬 수 있을 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 제1 세포의 활성을 완전히 소멸시킬 수 있을 수 있다. 상기 및 실시예에서 기술된 방법을 사용하여 테스트했을 때, 본 발명에 따른 항체는, 1 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.9 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.8 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.7 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.6 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.5 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.4 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.3 ㎍/ml 미만, 예컨대 0.2 ㎍/ml 미만의 농도에서, 제1 세포의 활성을 소멸시킬 수 있을 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 방법 이외의 다른 수단에 의해 확인될 수 있는 차단성 TREM-1 항체에 또한 관련된다.
본원에서의 "항체"라는 용어는 항원 (TREM-1) 또는 그의 부분에 특이적으로 결합할 수 있는, 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 이러한 용어는 임의의 클래스 또는 아이소타입(isotype) (즉, IgA, IgE, IgG, IgM 및/또는 IgY)의 전장 항체, 및 그의 임의의 단일 쇄 또는 단편을 포함한다. 항원 또는 그의 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 이러한 항원 또는 그의 부분에 배타적으로 결합할 수 있거나, 또는 제한된 개수의 상동성 항원 또는 그의 부분에 결합할 수 있다. 일반적으로 전장 항체는 적어도 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다: 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L). 제약상 특히 흥미로운 한 면역글로불린 하위 클래스는 IgG 패밀리이다. 인간에서, IgG 클래스는 그의 중쇄 불변 영역의 서열을 기초로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4개의 하위 클래스로 세분될 수 있다. 경쇄는 그의 서열 조성에서의 차이를 기초로 카파 및 람다의 2개의 유형으로 나뉠 수 있다. IgG 분자는 2개 이상의 디술피드 결합으로 상호연결된 2개의 중쇄, 및 각각 디술피드 결합에 의해 중쇄에 부착된 2개의 경쇄로 구성된다. 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 CH1, CH2 및 CH3의 3개까지의 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함할 수 있다. 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 전형적으로 VH 및 VL 영역은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역은 항원과 상호작용할 수 있는 [결합] 도메인을 형성하는 한편, 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (이펙터 세포), Fc 수용체 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본 발명의 항체는 단리될 수 있다. "단리된 항체"라는 용어는 항체가 생산된 환경 내의 다른 성분(들)로부터 분리 및/또는 회수되고/되거나 항체가 생산된 환경 내에 존재하는 성분들의 혼합물로부터 정제된 항체를 지칭한다.
항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났기 때문에, 항체의 특정한 항원-결합 단편이 본 발명의 맥락에서 적절할 수 있다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어는 본원에 기술된 바와 같은, 항원, 예컨대 TREM-1에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편(들)을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (전형적으로, 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인), 단일쇄 Fv (scFv; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 1988; 242:42S-426]; 및 [Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883] 참조), dsFv, Fd (전형적으로, VH 및 CHI 도메인), 및 dAb (전형적으로, VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 쇄를 포함하는 1가 분자; 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 및 카파 바디 (예를 들어, 문헌 [Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57] 참조); 낙타 IgG; IgNAR; 뿐만 아니라 하나 이상의 단리된 CDR 또는 기능성 파라토프(paratope) (단리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드들이 함께 회합 또는 연결되어 기능성 항체 단편을 형성할 수 있음)를 포함한다. 다양한 유형의 항체 단편이, 예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136]; WO2005040219, 및 미국 특허 출원 공보 20050238646 및 20020161201에 기술 또는 개관되어 있다. 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 이러한 항체 단편을 수득할 수 있고, 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 단편을 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "인간 항체"라는 용어는 프레임워크 영역의 적어도 일부분 및/또는 CDR 영역의 적어도 일부분이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 지니는 항체를 포함하도록 의도된다. (예를 들어, 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역 양쪽 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 지닐 수 있다.) 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
이같은 인간 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 이같은 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈이 불멸화 세포에 융합된 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다.
천연 및 합성 서열 다양성으로 추가로 다양화된, 인간 생식계열 서열의 선집 상에 만들어진 서열 라이브러리로부터 인간 항체가 단리될 수 있다.
인간 림프구의 시험관 내에서의 면역화 후 림프구를 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스로 형질전환시키는 것에 의해 인간 항체가 제조될 수 있다.
"인간 항체 유도체"라는 용어는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체 및 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "인간화 항체"라는 용어는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 하나 이상의 서열 (CDR 영역 또는 그의 부분)을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체를 지칭한다. 따라서, 인간화 항체는 적어도 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 서열 조성 및 기능성을 갖는, 비-인간 종 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류로부터의 항체 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 이같은 변형의 예는 전형적으로 공여자 항체로부터 유래된 아미노산 잔기인 하나 이상의 소위 복귀-돌연변이를 도입하는 것이다. 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 항체의 인간화를 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, ed. Benny K. C. Lo] 참조). 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두에 대한 적절한 인간 수용자 프레임워크를, 예를 들어, 서열 또는 구조 상동성에 의해 확인할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 구조, 생물물리학적 및 생화학적 성질의 지식을 기초로, 고정된 수용자 프레임워크를 사용할 수 있다. 수용자 프레임워크는 생식계열로부터 유래될 수 있거나 또는 성숙 항체 서열로부터 유래될 수 있다. CDR-그래프팅(grafting)에 의해 공여자 항체로부터의 CDR 영역이 옮겨질 수 있다. 공여자 항체로부터의 아미노산 잔기의 재도입 (복귀 돌연변이)이 인간화 항체의 성질에 이로운 영향을 미치는 결정적인 프레임워크 위치의 확인에 의해 예를 들어 친화도, 기능성 및 생물물리학적 성질에 대해 CDR-그래프팅된 인간화 항체가 추가로 최적화될 수 있다. 공여자 항체에서 유래된 복귀 돌연변이에 더하여, CDR 또는 프레임워크 영역 내의 생식계열 잔기의 도입, 면역원성 에피토프의 제거, 부위-지정 돌연변이유발, 친화도 성숙 등에 의해 인간화 항체가 조작될 수 있다.
또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기가 인간 면역글로불린 서열의 것인, 적어도 1개 - 전형적으로는 2개 -의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화 항체는, 임의적으로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 수 있다.
"인간화 항체 유도체"라는 용어는 인간화 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체 및 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "키메라 항체"라는 용어는 상이한 종들로부터 유래된 면역글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로부터, 전형적으로는 유전자 조작에 의해, 경쇄 및 중쇄 유전자가 구축된 항체를 지칭한다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변 분절이 인간 불변 분절에 연결될 수 있다.
항체의 결정화가능한 단편 영역 ("Fc 영역"/"Fc 도메인")은 불변 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 N-말단 영역이다. Fc 도메인은 Fc 수용체로 칭해지는 세포 표면 수용체, 뿐만 아니라 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용할 수 있다. Fc 영역은 항체가 면역계와 상호작용할 수 있게 한다. 본 발명의 한 측면에서, Fc 영역 내의 변형을 포함하도록, 전형적으로는 그의 기능성 성질, 예컨대 특히 혈청 반감기, 보체 고정, Fc-수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성 중 하나 이상, 또는 그의 결여를 변경시키도록 항체가 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체가 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 또는 그의 글리코실화를 변경하도록 변형되어, 또 다시 항체의 하나 이상의 기능성 성질이 변경될 수 있다. IgG1 항체는 특정 Fc 수용체에 대한 감소된 친화도 (L234A, L235E, 및 G237A) 및 감소된 C1q-매개 보체 고정 (A330S 및 P331S)을 각각 초래할 돌연변이 중 하나 이상 또는 아마도 모두를 포함하는 변형된 Fc 도메인을 보유할 수 있다 (잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름).
본 발명의 항체의 아이소타입은 IgG, 예컨대 IgG1, 예컨대 IgG2, 예컨대 IgG4일 수 있다. 원한다면, 공지된 기술에 의해 항체 클래스가 "전환"될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM 분자로서 생산된 항체가 IgG 항체로 클래스가 전환될 수 있다. 클래스 전환 기술을 사용하여 한 IgG 하위 클래스를 또 다른 하위 클래스로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2 또는 IgG4로; IgG2에서 IgG1 또는 IgG4로; 또는 IgG4에서 IgG1 또는 IgG2로 변환시킬 수도 있다. 상이한 IgG 하위 클래스로부터의 영역들의 조합에 의한, 불변 영역 키메라 분자를 생성시키기 위한 항체 조작이 또한 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 힌지(hinge) 영역 내의 시스테인 잔기의 개수가 변경되도록, 예를 들어, 증가 또는 감소되도록, CH1의 힌지 영역이 변형된다. 이러한 접근법이 예를 들어 보드머(Bodmer) 등의 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기술되어 있다.
항체를 안정화시키도록, 예를 들어, 2가 항체가 2개의 1가 VH-VL 단편으로 분리되는 위험을 감소시키도록 불변 영역이 변형될 수 있다. 예를 들어, IgG4 불변 영역에서, 힌지에서의 중쇄간 디술피드 다리 형성을 안정화시키도록 잔기 S228 (잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)가 프롤린 (P) 잔기로 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Angal et al., Mol Immunol. 1995; 30: 105-8] 참조).
항체 또는 그의 단편이 그의 상보성 결정 영역 (CDR)의 관점에서 또한 정의될 수 있다. "상보성 결정 영역" 또는 "초가변 영역"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 경우에, 항원 결합에서 수반되는 아미노산 잔기가 위치하는 항체 영역을 지칭한다. 초가변성 영역 또는 CDR은 항체 가변 도메인의 아미노산 정렬 내의 가변성이 가장 높은 영역으로서 확인될 수 있다. 카바트(Kabat) 데이터베이스와 같은 데이터베이스를 CDR 확인에 사용할 수 있고, 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-59 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)를 포함하는 것으로서 CDR이 정의된다; (Kabat et al. 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 대안적으로, "초가변 루프"로부터의 잔기 (경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-33 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917])로서 CDR이 정의될 수 있다. 전형적으로, 이러한 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 상기 문헌 [Kabat et al.]에 기술된 방법에 의해 수행된다. 본원에서의 "카바트 위치", "카바트 잔기", 및 "카바트에 따르면"과 같은 구절은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 넘버링 시스템을 지칭한다. 카바트 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 프레임워크 (FR) 또는 CDR의 단축 또는 가변 도메인의 프레임워크 (FR) 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤의 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a, 52b 및 52c), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤의 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 항체 서열과 "표준" 카바트 넘버링 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 잔기의 카바트 넘버링이 결정될 수 있다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기라는 용어는 본원에서 정의된 바와 같은 CDR 내에 있지 않은 VH 또는 VL 아미노산 잔기를 지칭한다.
mAb 0170 항체는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 갖는다. 본 발명의 항체는 이러한 가변 중쇄 서열 및/또는 이러한 가변 경쇄 서열을 포함할 수 있다. mAb 0170 항체는 서열식별번호: 2의 아미노산 31 내지 35, 50 내지 68 및 101 내지 110 및 서열식별번호: 3의 아미노산 24 내지 38, 54 내지 60 및 93 내지 101에서 제시된 CDR 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 31 내지 35 (TYAMH)의 CDR1 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 50 내지 68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD)의 CDR2 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개, 2개 또는 3개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 101 내지 110 (DMGQRRQFAY)의 CDR3 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개, 2개 또는 3개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 24 내지 38 (RASESVDTFDYSFLH)의 CDR1 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개, 2개 또는 3개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 54 내지 60 (RASNLES)의 CDR2 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개 또는 2개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 93 내지 101 (QQSNEDPYT)의 CDR3 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개 또는 2개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
mAb 0170 항체는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 경쇄 서열을 갖는다. 본 발명의 항체는 이러한 중쇄 서열 또는 이러한 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 양쪽 모두가 mAb 0170의 변이체일 수 있다. mAb 0170 항체는 서열식별번호: 2의 아미노산 31 내지 35, 50 내지 68 및 101 내지 110 및 서열식별번호: 3의 아미노산 24 내지 38, 54 내지 60 및 93 내지 101에서 제시된 CDR 서열을 갖는다. 본 발명의 항체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 이러한 CDR 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 101 내지 110 (DMGIRRQFAY)의 CDRH3 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 아미노산 중 1개, 2개 또는 3개가 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다.
"항원" (Ag)이라는 용어는 이러한 Ag를 인식하는 항체 (Ab)를 생산하기 위한 면역적격 척추동물의 면역화에 사용되는 분자 물질(molecular entity)을 지칭한다. 본원에서, Ag는 더욱 광범위하게 명명되고, 일반적으로, Ab가 특이적으로 인식하는 표적 분자를 포함하도록 의도되며, 따라서 면역화 프로세스, 또는 Ab를 생성시키는데 사용되는 기타 프로세스, 예를 들어 파지 디스플레이에서 사용되는 분자의 단편 또는 모방체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "에피토프"라는 용어는 "항원 결합 폴리펩티드", 예컨대 항체 (Ab)와 그의 상응하는 항원 (Ag) 사이의 분자적 상호작용의 맥락에서 정의된다. 일반적으로, "에피토프"는 Ab가 특이적으로 결합하는 Ag 상의 구역 또는 영역, 즉 Ab와 물리적으로 접촉된 구역 또는 영역을 지칭한다. 물리적 접촉은 Ab 및 Ag 분자 내의 원자에 대한 다양한 기준 (예를 들어, 2-6Å, 예컨대 3Å, 예컨대 4 Å, 예컨대 5 Å의 거리 차단값; 또는 용매 접근성)을 통해 정의될 수 있다. 단백질 에피토프는 Ab에 결합하는 것에서 직접적으로 수반되는 Ag 내의 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우세 성분으로 또한 칭해짐), 및 결합에서 직접적으로 수반되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 Ab에 의해 효과적으로 차단되는 Ag의 아미노산 잔기, 즉 "용매-배제 표면" 및/또는 Ab의 "발자국(footprint)" 내의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본원에서의 에피토프라는 용어는 TREM-1 항체에 특이적으로 결합하는 TREM-1의 임의의 특정 영역 내의 양쪽 유형의 결합 영역을 포함한다. TREM-1은 성숙 TREM-1 입체형상 내에서 서로 가깝게 위치하는 하나 이상의 비-연속 아미노산으로 이루어진 입체형상 에피토프, 및 TREM-1에 공유결합으로 부착된 분자 구조물, 예컨대 탄수화물 기로 전체적으로 또는 부분적으로 이루어진 번역-후 에피토프를 비제한적으로 포함하는 다수의 상이한 에피토프를 포함할 수 있다.
에피토프를 맵핑(mapping)하는 다양한 실험 방법 및 컴퓨터 방법을 사용하여 소정의 항체 (Ab)/항원 (Ag) 쌍에 대한 에피토프가 상이한 상세 수준으로 기술 및 특성화될 수 있다. 실험 방법은 돌연변이유발, X-선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법, 수소/중수소 교환 질량 분광법 (HX-MS) 및 다양한 경쟁 결합 방법을 포함한다: 관련 기술 분야에 공지된 방법. 각각의 방법이 독자적인 원리에 의존하기 때문에, 에피토프를 기술하는 것은 에피토프가 결정된 방법에 밀접하게 연관된다. 따라서, 사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라, 소정의 Ab/Ag 쌍에 대한 에피토프가 상이하게 기술될 수 있다.
가장 상세하게 기술된 수준에서, Ag와 Ab 사이의 상호작용에 대한 에피토프는 Ag-Ab 상호작용에 존재하는 원자 접촉부를 정의하는 공간 좌표, 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 이들의 상대적인 기여에 관한 정보에 의해 기술될 수 있다. 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 Ag와 Ab 사이의 원자 접촉부를 정의하는 공간 좌표에 의해 특성화될 수 있다. 더욱 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 특정 기준 예컨대 Ab:Ag 복합체 내의 원자들 사이의 거리 또는 이러한 원자들의 용매 접근성에 의해 정의된 바와 같은, 에피토프가 포함하는 아미노산 잔기에 의해 특성화될 수 있다. 추가로 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 기능을 통해, 예를 들어 다른 Ab와의 경쟁 결합에 의해 특성화될 수 있다. 에피토프는 또 다른 아미노산에 의한 치환이 Ab와 Ag 사이의 상호작용의 특성을 변경시킬 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 더욱 일반적으로 정의될 수도 있다.
Ab, 예를 들어 Fab 단편과 그의 Ag 사이의 복합체의 공간 좌표에 의해 정의되는, X-선으로 유래된 결정 구조의 맥락에서, 다르게 명시되거나 또는 문맥적으로 모순되지 않는 한, 본원에서 에피토프라는 용어는 중원자(heavy atom) (즉, 비-수소 원자)가 Ab 내의 중원자로부터 예를 들어 4 Å의 거리 내에 있는 것을 특징으로 하는 TREM-1 잔기로서 명시적으로 정의된다.
사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라 에피토프의 기술 및 정의가 상이한 상세 수준으로 수득된다는 사실로부터, 동일한 Ag 상의 상이한 Ab에 대한 에피토프의 비교가 상이한 상세 수준으로 유사하게 수행될 수 있게 된다.
아미노산 수준에서 기술된, 예를 들어 X-선 구조로부터 결정된 에피토프들이 동일한 세트의 아미노산 잔기를 함유하면, 이들을 동일하다고 한다. 에피토프들이 적어도 1개의 아미노산을 공유하면, 이들을 중첩된다고 한다. 에피토프들이 아미노산 잔기를 공유하지 않으면, 이들을 개별적 (독자적)이라고 한다.
야생형 인간 TREM-1에 대한 항체의 결합 동역학을 예상 에피토포 내에 알라닌 돌연변이가 있는 인간 TREM-1 변이체의 것과 비교함으로써, 간접적으로 에피토프가 정의될 수도 있다. 아미노산 잔기가 알라닌 잔기로 교체된 인간 TREM-1의 변이체에 대한 항체의 친화도 감소 또는 결합 폐지는 돌연변이된 아미노산이 상기 항체와 야생형 인간 TREM-1 사이의 상호작용에 기여한다는 것을 가리킨다. 이러한 접근법은 에피토프의 음성 확인을 제공한다. 이러한 방법은 단백질 미스폴딩(misfolding) 또는 언폴딩(unfolding)이 상호작용 폐지와 유사한 결과를 제공할 것이라는 사실로 인해 에피토프를 효과적으로 정의하는 것이 손상된다. 교차-반응성 항체가 존재하면, 오르토로그(orthologous) 표적 단백질 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이 TREM-1)의 기능 획득 돌연변이 비교 분석에 의해 이러한 분석이 보완될 수 있다. 이러한 비교는 예를 들어 시노몰구스 원숭이 TREM-1과 교차-반응하지 않는 항체와 교차-반응성 항체 사이의 에피토프 차이를 정의할 것이다.
야생형 항원 (TREM-1)의 변이체에 대한 항체 (또는 항체 단편) 결합을 측정함으로써 에피토프의 간접적인 확인이 또한 제공될 수 있다. 항체 또는 그의 단편이 예를 들어 인간 TREM-1에는 결합하지만 시노몰구스 원숭이 TREM-1에는 결합하지 않고, 상기 항체 또는 그의 단편이 시노몰구스 원숭이 TREM-1의 부분적으로 인간화된 변이체에 결합할 수 있으면, 이러한 재획득된 결합은 치환된 아미노산 잔기(들)가 항체와 항원의 상호작용에 중요하다는 것을 가리킨다. 동일한 방식으로, 인간 TREM-1에 비교하여 시노몰구스 원숭이 TREM-1에 대한 결합이 더 약한 항-인간 TREM-1 항체 (또는 그의 Fab 단편)의 시노몰구스 원숭이 TREM-1의 인간화 변이체에 대한 친화도 증가는 결합 에피토프를 구성하는 잔기의 신원에 대한 정보를 제공할 수 있다.
임의의 소정의 교차-반응성 항체 상에서의 동일한 돌연변이의 효과는 가능한 단백질 미스폴딩 (양쪽 항체에 대한 결합이 폐지됨)과 인간 TREM-1에서의 상호작용의 상실 (항체 중 하나에는 결합하고, 다른 항체에 대한 결합은 폐지됨)을 구별하는 것을 가능하게 하는 한편, 아미노산 수준에서 교차 반응하지 않는 항체와 교차-반응성 항체 사이의 에피토프 차이에 대한 정보를 명백하게 제공한다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 인간 TREM-1의 변이체에 결합할 수 있을 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 시노몰구스 원숭이 TREM-1의 변이체에 결합할 수 있을 수 있다.
본 발명의 항체는 TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있고, 여기서 상기 항체는 인간 TREM-1의 (i) A21, T22, K23, L24, T25, E26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기, 및 (ii) A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, I57, I58, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기, 및 (iii) C113, V114, I115, Y116, Q117, P118 및 P119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 HX-MS 또는 X-선 회절을 사용하여 결정 시, 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 아미노산 D38 내지 F48을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 HX-MS 또는 X-선 회절을 사용하여 결정 시, 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 아미노산 잔기 D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 및 L45 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 모두, 및 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 E46, K47 및 F48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개 또는 모두를 포함하는 에피토프를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는, TREM-1의 변이체 및 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 D42, E46, D92 및 H93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함하는 에피토프를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는, TREM-1의 변이체 및 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 적어도 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 아미노산 잔기 E46 및/또는 D92를 포함하는 에피토프를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는 서열식별번호: 1 (인간 TREM-1)의 L31, I86 및 V101로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 1개, 2개 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 HX-MS 또는 X-선 회절을 사용하여 결정 시, 시노몰구스 원숭이 TREM-1 (서열식별번호: 17)의 아미노산 잔기 E19 내지 L26을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있고, 여기서 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 V39, K40, C41, D42, Y43, L45, E46, K47, F48 및 A49로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모두를 포함한다.
본 발명의 항체는 인간 TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있고, 여기서 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 D42를 포함한다. 본 발명의 항체는 인간 TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있을 수 있고, 여기서 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 E46을 포함한다. 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 V39, C41, D42, Y43, L45를 포함할 수 있다. 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 E46, K47 및 A49를 포함할 수 있다. 상기 항체의 에피토프는 서열식별번호: 1의 F48을 추가로 포함할 수 있다.
"파라토프"라는 용어의 정의는 상기 "에피토프" 정의로부터 관점을 뒤집어서 유래된다. 따라서, "파라토프"라는 용어는 항원이 특이적으로 결합하는 항체 상의 구역 또는 영역을 지칭하고, 즉 항체가 이러한 구역 또는 영역으로 항원과 물리적인 접촉을 이룬다.
항체, 예컨대 Fab 단편과 그의 항원 사이의 복합체의 공간 좌표에 의해 정의되는, X-선으로 유래된 결정 구조의 맥락에서, 다르게 명시되거나 또는 문맥적으로 모순되지 않는 한, 본원에서 파라토프라는 용어는 중원자 (즉, 비-수소 원자)가 TREM-1 내의 중원자로부터 4 Å의 거리 내에 있는 것을 특징으로 하는 항원 잔기로서 명시적으로 정의된다.
소정의 항체 (Ab)/항원 (Ag) 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프를 일상적인 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 상이한 단편 또는 변이체 TREM-1 폴리펩티드에 결합하는 항체의 능력을 평가함으로서 에피토프의 일반적인 위치가 결정될 수 있다. 항체와 접촉되는 TREM-1 내의 특정 아미노산 (에피토프) 및 TREM-1과 접촉되는 항체 내의 특정 아미노산 (파라토프) 또한 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 표적 분자을 조합하고, Ab:Ag 복합체를 결정화시킬 수 있다. 복합체의 결정 구조를 결정하여, 항체와 그의 표적 사이의 특이적인 상호작용 부위를 확인하는데 사용할 수 있다.
동일한 항원에 결합하는 항체들을 이들의 공통 항원에 동시에 결합하는 능력에 관하여 특성화할 수 있고, "경쟁 결합"/"비닝(binning)"에 적용할 수 있다. 이러한 맥락에서, "비닝"이라는 용어는 동일한 항원에 결합하는 항체들을 집단화하는 방법을 지칭한다. 항체의 "비닝"은 표준 기술 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR), ELISA 또는 유동 세포측정법을 기초로 하는 검정법에서의 2개의 항체의 이들의 공통 항원에 대한 경쟁 결합을 기초로 할 수 있다.
기준 항체를 사용하여 항체의 "빈(bin)"이 정의될 수 있다. 제2 항체가 기준 항체와 동시에 항원에 결합할 수 없으면, 제2 항체가 기준 항체와 동일한 "빈"에 속한다고 한다. 이러한 경우에, 기준 항체 및 제2 항체는 항원의 동일한 부분에 경쟁적으로 결합하고, "경쟁 항체"로 조어된다. 제2 항체가 기준 항체와 동시에 항원에 결합할 수 있으면, 제2 항체가 별도의 "빈"에 속한다고 한다. 이러한 경우에, 기준 항체 및 제2 항체는 항원의 동일한 부분에 경쟁적으로 결합하지 않고, "비-경쟁" 항체로 조어된다.
항체 "비닝"은 에피토프에 관한 직접적인 정보를 제공하지 않는다. 경쟁 항체, 즉 동일한 "빈"에 속하는 항체는 동일한 에피토프, 중첩되는 에피토프, 또는 심지어 별개의 에피토프를 가질 수 있다. 후자는 항원 상의 기준 항체의 에피토프에 결합된 기준 항체가 제2 항체가 항원 상의 제2 항체의 에피토프에 결합하는데 필요한 공간을 차지하는 경우이다 ("입체 장애"). 비-경쟁 항체는 일반적으로 별개의 에피토프를 갖는다.
본 발명의 항체는 인간 TREM-1에 결합하는 것에 대해 mAb 0170과 경쟁할 수 있다. 본 발명의 항체는 시노몰구스 원숭이 TREM-1에 결합하는 것에 대해 mAb 0170과 경쟁할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명의 항체는 mAb 0170과 동일한 "빈"에 속할 수 있다.
본원에서의 "결합 친화도"라는 용어는 2개의 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 사이의 비-공유결합 상호작용의 강도의 측정치를 지칭한다. "결합 친화도"라는 용어는 1가 상호작용 (고유 활성)을 기술하도록 사용된다.
1가 상호작용을 통한 2개의 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 사이의 결합 친화도를 평형 해리 상수 (KD)의 결정에 의해 정량할 수 있다. 차례로, KD를 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해, 예를 들어 SPR 방법에 의해 결정할 수 있다. 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수가 각각 회합 속도 상수 ka (또는 k온 (on)) 및 해리 속도 상수 kd (또는 k오프 (off))로 지칭된다. KD = kd / ka의 식을 통해 KD가 ka 및 kd와 관련된다.
상기 정의에 따라, 상이한 분자적 상호작용들과 연관된 결합 친화도, 예컨대 소정의 항원에 대한 상이한 항체들의 결합 친화도의 비교를 개별적인 항체/항원 복합체에 대한 KD 값의 비교에 의해 비교할 수 있다.
본 발명의 항체는, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 1 × 10-7 M 이하, 1 × 10-8 M 이하, 또는 1 × 10-9 M 이하, 또는 1 × 10-10 M 이하, 1 × 10-11 M 이하, 1 × 10-12 M 이하 또는 1 × 10-13 M 이하인 친화도 (KD)로 인간 TREM-1에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정 시, 1 × 10-7 M 이하, 1 × 10-8 M 이하, 또는 1 × 10-9 M 이하, 또는 1 × 10-10 M 이하, 1 × 10-11 M 이하, 1 × 10-12 M 이하 또는 1 × 10-13 M 이하인 친화도 (KD)로 시노몰구스 원숭이 TREM-1에 결합할 수 있다.
본원에서의 "결합 특이성"이라는 용어는 분자 예컨대 항체 또는 그의 단편과 단일한 배타적 항원 또는 제한된 개수의 고도로 상동성인 항원 (또는 에피토프)의 상호작용을 지칭한다. 반대로, TREM-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 유사하지 않은 분자에 결합할 수 없다. 본 발명에 따른 항체는 Nkp44 (천연 살해 세포 p44-관련 단백질)에 결합할 수 없을 수 있다.
상호작용의 특이성 및 평형 결합 상수의 값을 널리 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정할 수 있다. 리간드 (예컨대 항체)가 그의 표적에 결합하는 능력을 평가하는 표준 검정법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot), RIA, 및 유동 세포측정법 분석을 포함한다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도를 관련 기술 분야에 공지된 표준 검정법, 예컨대 SPR에 의해 또한 평가할 수 있다.
항체가 표적에 결합하는 것을 이러한 표적의 또다른 리간드, 예컨대 또 다른 항체가 표적에 결합하는 것과 비교하는 경쟁적 결합 검정법을 수행할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 분자, 예컨대 본원에 기술된 TREM-1 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 세포를 포함하는 조성물 및 제형을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형된 하나 이상의 본 발명의 TREM-1 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 목표는 0.25 mg/ml 내지 250 mg/ml의 농도, 예컨대 10 내지 200 mg/ml의 농도로 존재하는 이같은 TREM-1 항체를 포함하는 제약 제형이고, 상기 제형의 pH가 2.0 내지 10.0, 예컨대 4.0 내지 8.0인 제약 제형을 제공하는 것이다. 제형은 완충제 시스템, 방부제, 장성 부여제, 킬레이팅제, 안정화제 및/또는 계면활성제 중 하나 이상, 뿐만 아니라 그의 다양한 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 제약 조성물 내의 방부제, 등장성 작용제, 킬레이팅제, 안정화제 및 계면활성제는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조할 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 제형은 수성 제형이다. 이같은 제형은 전형적으로 용액 또는 현탁액이지만, 콜로이드, 분산액, 에멀션, 및 다중상 물질을 또한 포함할 수 있다. "수성 제형"이라는 용어는 적어도 50％ w/w 물을 포함하는 제형으로 정의된다. 유사하게, "수성 용액"이라는 용어는 적어도 50％ w/w 물을 포함하는 용액으로 정의되고, "수성 현탁액"이라는 용어는 적어도 50％ w/w 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.
또 다른 실시양태에서, 제약 제형은 동결-건조 제형이고, 의사 또는 환자가 사용 전에 여기에 용매 및/또는 희석제를 추가한다.
추가 측면에서, 제약 제형은 이같은 항체 및 완충제의 수성 용액을 포함하고, 여기서 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 제형은 pH가 약 2.0 내지 약 10.0이고, 예컨대 pH가 4.0 내지 8.0이다.
본 발명의 TREM-1 항체 및 이같은 항체를 포함하는 제약 조성물은 하기와 같은 염증성 질환의 질환의 치료에 사용될 수 있다: 염증성 장 질환 (IBD), 크론병 (CD), 궤양성 결장염 (UC), 과민성 장 증후군, 류머티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 관절염, 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 루푸스 신장염, 제I형 당뇨병, 그레이브병, 다발성 경화증 (MS), 자가면역 심근염, 가와사키병, 관상 동맥 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 간질성 폐 질환, 자가면역 갑상선염, 피부 경화증, 전신성 경화증, 골관절염, 아토피성 피부염, 백반증, 이식편 대 숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 자가면역 신장염, 굿파스처 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 알레르기, 천식, 및 급성 또는 만성 염증의 결과인 기타 자가면역 질환.
본 발명의 TREM-1 항체는 염증성 장 질환에 걸린 개체의 치료에서의 용도에 적절할 수 있다. 염증성 장 질환 (IBD)은 입에서 항문까지의 위장관의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있는 질환으로, 광범위한 증상을 야기한다. IBD는 주로 복부 통증, 설사 (유혈성일 수 있음), 구토 또는 체중 감소를 야기하지만, 위장관 외부에서의 합병증 예컨대 피부 발진, 관절염, 눈의 염증, 피로 및 집중력 결여를 또한 야기할 수 있다. IBD 환자는 궤양성 결장염 (UC) 환자 및 크론병 (CD) 환자의 2가지 주요 클래스로 나뉠 수 있다. CD는 일반적으로 회장 및 결장을 수반하고, 장의 임의의 영역에 영향을 미칠 수 있지만, 종종 불연속적이다 (질환의 병소가 장 전반에 걸쳐 분포된다). UC는 직장 (결장)을 항상 수반하고, 더 연속적이다. CD에서는, 염증이 경벽성이어서, 농양, 누공 및 협착을 초래하는 반면, UC에서는, 염증이 전형적으로 점막에 국한된다. 크론병에 대해서는 공지된 제약에 의한 치유법 또는 수술적 치유법이 없지만, 일부 UC 환자는 결장 제거 수술에 의해 치유될 수 있다. 치료 선택권은 증상 제어, 완화 유지 및 재발 방지에 제한된다. 실험실 테스트 및 삶의 질 질문서를 기초로 하는 채점 척도인 CD에 대한 크론병 활성 지수 (CDAI) 점수의 감소로서 임상에서의 염증성 장 질환에서의 효능을 측정할 수 있다. 동물 모델에서는, 대부분 체중 증가 및 또한 질환 활성 지수 (DAI) (대변 굳기, 체중 및 대변 내 혈액의 조합)에 의해 효능이 측정된다.
본 발명의 TREM-1 항체는 류머티스성 관절염에 걸린 개체의 치료에서의 용도에 적합할 수 있다. 류머티스성 관절염 (RA)은 모두는 아니더라도 거의 모든 신체에 영향을 미치는 전신성 질환이고, 관절염의 가장 통상적인 형태 중 하나이다. 이는 통증, 강직, 열기, 발적 및 부기를 야기하는 관절의 염증을 특징으로 한다. 이러한 염증은 관절에 침습하는 염증성 세포의 결과이고, 이러한 염증성 세포는 뼈 및 연골을 소화시킬 수 있는 효소를 방출한다. 그 결과, 이러한 염증은, 여러 생리학적 효과 중에서도, 중증의 뼈 및 연골 손상 및 관절 악화 및 중증 통증에 이를 수 있다. 수반된 관절은 그의 형상 및 정렬을 잃을 수 있어, 통증 및 운동 상실을 초래한다.
류머티스성 관절염에 대한 여러 동물 모델이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 콜라겐-유도 관절염 (CIA) 모델에서, 인간 류머티스성 관절염과 유사한 염증성 관절염이 마우스에서 발달된다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특색을 공유하기 때문에, 이는 CIA를 잠재적인 인간 항-염증 화합물을 스크리닝하기 위한 적절한 모델로 만든다. 이러한 모델에서의 효능은 관절 종창의 감소에 의해 측정된다. 임상에서의 RA에서의 효능은 관절 종창, 적혈구 침강 속도, C-반응성 단백질 수준, 및 혈청 인자, 예컨대 항-시트룰린화 단백질 항체의 수준의 조합으로서 측정되는 환자에서의 증상을 감소시키는 능력에 의해 측정된다.
본 발명의 TREM-1 항체는 건선에 걸린 개체의 치료에서의 용도에 적절할 수 있다. 건선은 상당한 불편을 야기할 수 있는, T-세포에 의해 매개되는 피부의 염증성 장애이다. 이는 현재 치유책이 없고 모든 연령의 사람에 영향을 미치는 질환이다. 경도의 건선에 걸린 개체는 종종 이들의 질환을 국소 작용제로 제어할 수 있지만, 세계적으로 백만명을 초과하는 환자가 자외선 치료 또는 전신성 면역억제 요법을 필요로 한다. 불행하게도, 자외선 조사의 불편함 및 위험 및 다수의 요법의 독성이 이들의 장기 사용을 제한한다. 또한, 환자가 일반적으로 건선 재발을 겪고, 일부 경우에는 면역억제 요법을 중지한 직후에 되돌아온다. CD4+ T 세포의 전달을 기초로 하는 최근에 개발된 건선 모델이 인간 건선의 다수의 측면을 모방하고, 따라서 건선 치료에서 사용하기에 적절한 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다 (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002). 이러한 모델에서의 효능은 채점 시스템을 사용하여 피부 병리학의 감소에 의해 측정된다. 유사하게, 피부 병리학에서의 감소에 의해 환자에서의 효능이 측정된다.
본 발명의 TREM-1 항체는 건선성 관절염에 걸린 개체의 치료에서의 용도에 적절할 수 있다. 건선성 관절염 (PA)은 건선 환자의 하위 집단에서 발생하는 염증성 관절염의 유형이다. 이러한 환자에서, 류머티스성 관절염에서 나타나는 것과 유사한 관절 종창이 피부 병리학/증상에 동반된다. 이는 비늘화와 함께 반점형의 융기성 적색 피부 염증 영역을 특색으로 한다. 건선은 종종 팔꿈치 및 무릎의 끝부분, 두피, 배꼽, 및 음부 및 항문 주변에 영향을 미친다. 건선에 걸린 환자의 약 10％는 그의 관절의 연관된 염증이 또한 발달된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료"라는 용어는 이를 필요로 하는 임의의 인간 또는 기타 동물 대상체의 의학적 요법을 지칭한다. 상기 대상체는 의사 또는 수의사에 의한 신체 검사를 받은 것으로 예상되고, 이들은 상기 치료의 사용이 상기 인간 또는 기타 동물 대상체의 건강에 이롭다는 것을 가리킬 잠정적 또는 확정적 진단을 제공하였다. 상기 치료의 시기 및 목적은 다수의 요인, 예컨대 대상체의 현재 건강 상태에 따라 개체마다 다를 수 있다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 완화적, 증상적 및/또는 치유적일 수 있다.
본 발명에 있어서, 예방적, 완화적, 증상적 및/또는 치유적 치료가 본 발명의 별도의 측면들을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항체는 주사에 의해, 예컨대 정맥 내로, 예컨대 근육 내로, 예컨대 피하로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 비-경구가 아닌 경로로, 예컨대 경구로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 치료적으로 (요구 시에) 투여될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에서, 서열식별번호: 3 (mAb 0170의 가변 경쇄)의 CDR1 및 CDR3 영역의 음으로 하전된 잔기의 치환이 mAb의 점도에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 본 발명의 이러한 제1 측면에서, 본 발명의 mAb는 mAb 0170의 경쇄, 즉 서열식별번호: 3이 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기가 하전되지 않은 잔기로 치환된 돌연변이를 포함하는, 중쇄 및 경쇄가 있는 mAb 0170의 변이체이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 서열식별번호: 3의 잔기 D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하는 mAb 0170의 변이체에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명의 흥미로운 실시양태는 서열식별번호: 2 (또는 그의 변이체)를 중쇄로서 포함하고, 서열식별번호: 3의 잔기 D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 중 임의의 하나 또는 임의의 조합이 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된 서열식별번호: 3의 변이체를 경쇄로서 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 이러한 돌연변이들은 "전하 패치" 돌연변이로 지칭될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 E27 및 E97 중 적어도 하나 또는 양쪽 모두가 하전되지 않은 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 바람직한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 E27은 글루타민으로 돌연변이되고, E97은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 추가 실시양태에서, E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E97은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이된다. 또 다른 실시양태에서, 잔기 E97은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E27은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 또 다른 측면은 파라토프 구역에서의 상호작용으로 인해 Fab-Fab 이량체가 형성되었다는 관찰을 기초로 한다. mAb는 2개의 Fab를 포함하기 때문에, mAb가 다량체화될 수 있을 것이고, 이는 점도 성질에 영향을 미칠 수 있을 것으로 구상되었다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 2 (즉, mAb 0170의 가변 중쇄 구역)의 Fab-Fab 상호작용 구역 내의 잔기를 돌연변이시켜 Fab-Fab 이량체화를 감소시키는 것에 관한 것이다. 이러한 돌연변이들은 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이로 지칭된다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 임의의 하나를 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환하는 것에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명의 흥미로운 실시양태는 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 임의의 하나 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 또 다른 아미노산, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된 서열식별번호: 2의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열식별번호: 2의 잔기 A59 및 N57 중 적어도 하나가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, A59는 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, N57은 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다. 또 다른 실시양태에서, N57은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, A59는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된다. 적어도 하나의 실시양태에서, A59 및 N57 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다.
흥미로운 실시양태에서, i) 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 적어도 하나의 음으로 하전된 잔기가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고, ii) 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 적어도 하나의 잔기 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 및 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된다.
적절한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 E27 및 E97 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고, 서열식별번호: 2의 A59 및 N57 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된다.
본 발명의 추가 측면은 TREM-1의 서열식별번호: 1의 위치 Y90에서의 Ala 치환이 TREM-1에 대한 서열식별번호: 3의 친화도를 개선하였다는 관찰을 기초로 한다. Y90은 서열식별번호: 3의 페닐알라닌 잔기와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. Fab-TREM-1 상호작용을 개선하기 위한 서열식별번호: 3의 돌연변이는 Fab-TREM-1 상호작용 돌연변이로 지칭된다. 본 발명의 이러한 측면의 한 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 위치 32의 페닐알라닌이 아미노산 잔기 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 메티오닌으로부터 선택되는, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 발린 및 류신으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이된다. 흥미로운 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 F32가 알라닌 또는 세린으로 돌연변이된다.
서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3에서의 전하 패치 돌연변이는 유체역학 반경 (Rh)을 감소시킨 반면, Fab-Fab 상호작용 영역에서의 돌연변이는 Rh를 증가시켰다 (도 6). "Fab-TREM-1 상호작용" 부위에서의 돌연변이는 Rh에 영향을 미치지 않았고, 점도에 대한 효과가 거의 없었다 (도 6 및 1, 표 3C 및 3E).
<표 1>
Figure pct00001
DLS 또는 미세유변학(microrheology)에 의해 mAb 0170 변이체에 대해 점도를 결정하였고, "전하 패치" 돌연변이 및 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이 양쪽 모두가 점도를 감소시킨 것으로 나타났다. 전하 패치 돌연변이 E27Q 및 E97Q를 포함하는 mAb 변이체 0318이 점도가 가장 낮은 것으로 확인되었다.
인간 TREM-1-Fc 및 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 mAb 0170 변이체의 결합 동역학을 각각 결정하였다. mAb 0170 변이체 모두가 인간 TREM-1-Fc에 대한 친화도가 유사한 것으로 확인되었다. 흥미롭게, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이를 포함하는 서열식별번호: 9의 mAb 변이체가 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 친화도가 증가된 것으로 확인되었다 (표 2).
<표 2>
Figure pct00002
TREM-1에 대한 개선된 친화도 및 낮은 점도 양쪽 모두를 지니는 실시양태에서, 서열식별번호: 9로부터의 돌연변이를 서열식별번호: 5에서의 돌연변이와 조합하여 서열식별번호: 14로부터의 경쇄를 생성시켰고, 서열식별번호: 14로부터의 경쇄로부터의 돌연변이를 서열식별번호: 16으로부터의 중쇄 돌연변이와 추가로 조합하였다. 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 증가된 친화도가 서열식별번호: 14의 조합된 돌연변이를 포함하는 mAb 변이체에 대해 유지되었고, 이러한 돌연변이는 인간 TREM-1-Fc에 대한 친화도에 음성으로 영향을 미치지 않았다. 따라서, "전하 패치" 돌연변이 및 "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이 양쪽 모두를 포함하는 실시양태, 뿐만 아니라 "전하 패치" 돌연변이 및 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이 양쪽 모두를 포함하는 실시양태, 뿐만 아니라 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이 및 "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이 양쪽 모두를 포함하는 실시양태, 및 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이 및 "전하 패치" 돌연변이를 포함하는 실시양태가 본 발명에 의해 구상된다.
<표 3A>
Figure pct00003
<표 3B>
Figure pct00004
<표 3C>
Figure pct00005
<표 3D>
Figure pct00006
<표 3E>
Figure pct00007
본 발명의 비제한적인 실시양태는 하기를 추가로 포함한다:
1. 50 mg/mL의 농도에서 항체 또는 항체의 항체 단편의 점도가 5 cP 미만, 예컨대 4 cP 미만, 바람직하게는 3 cP 미만인 것을 특징으로 하는, 서열식별번호: 1의 TREM-1에 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편 (여기서, 점도 대 단백질 농도 조건을 결정하는 방법은 통상적이거나 또는 본원에서 기술된 바와 같음).
2. 80 mg/mL의 농도에서 항체 또는 항체의 항체 단편의 점도가 5 cP 미만, 바람직하게는 4 cP 미만인 것을 특징으로 하는, TREM-1에 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편 (여기서, 점도 대 단백질 농도 조건을 결정하는 방법은 통상적이거나 또는 본원에서 기술된 바와 같음).
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 0.5 nM 미만, 예컨대 0.4 nM 미만, 바람직하게는 0.3 nM 이하의 서열식별번호: 1에 대한 KD로 TREM-1 기능을 차단하는 항체 또는 그의 단편.
4. 항체 또는 그의 단편이 서열식별번호: 1에 결합하는 것에 대해 mAb 0170과 경쟁적으로 결합하고,
(a) 50 mg/mL의 농도에서 항체 또는 항체의 항체 단편의 점도가 5 cP 미만, 예컨대 4 cP 미만, 바람직하게는 3 cP 미만이거나;
(b) 80 mg/mL의 농도에서 항체 또는 항체의 항체 단편의 점도가 5 cP 미만, 바람직하게는 4 cP 미만인
점도 프로파일을 갖는 항체 또는 그의 단편
5. 항체 또는 그의 단편에 서열식별번호: 2의 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이가 있는, TREM-1에 특이적으로 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편.
6. 항체 또는 그의 단편에 "전하 패치" 돌연변이가 있고, 예컨대 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3의 음으로 하전된 잔기 중 적어도 하나가 하전되지 않은 잔기로 치환된, 서열식별번호: 1의 TREM-1에 특이적으로 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편.
7. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 음으로 하전된 아미노산이 수소 결합 파트너를 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 치환되고, 예컨대 Asp 또는 Glu 잔기가 Asn, Gln, Ser 및 Thr 중 임의의 하나로 돌연변이된 항체 또는 그의 단편.
8. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, mAb 0170에 비교하여 점도가 더 낮지만, 서열식별번호: 1에 대한 KD가 여전히 0.5 nM 미만인 항체 또는 그의 단편.
9. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 특이적인 "Fab-Fab 상호작용"에서 수반되는 서열식별번호: 2 및/또는 3의 하전되지 않은 아미노산을 변경된 크기 또는 수소 결합 잠재력의 아미노산으로 치환하는 것에 의한, mAb 0170에 비교하여 점도가 더 낮고, 서열식별번호: 1에 대한 KD가 0.5 nM 미만이며, 서열식별번호: 17에 대한 KD가 0.6 nM 미만인 항체 또는 그의 단편.
10. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 TREM-1 에 특이적으로 결합하여 이를 차단할 수 있고, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 양쪽 모두의 변이체를 포함하며, 이러한 변이체가 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이 및 "전하-패치" 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그의 단편.
11. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이를 포함하고, 예컨대 서열식별번호: 3의 Phe 잔기가 Ala 또는 Ser으로 치환된 항체 또는 그의 단편.
12. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1에 결합하는 것에 대해 서열식별번호: 2 또는 3과 경쟁하고, 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 및 L45 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 모두, 및 아미노산 잔기 E46, K47, F48 중 1개, 2개 또는 모두를 포함하는 에피토프를 갖는 항체 또는 그의 단편.
13. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 결합에 대해 서열식별번호: 3과 경쟁하고, 서열식별번호: 3의 위치 27 및 97의 1개 또는 양쪽 모두의 글루타메이트 (E) 잔기가 세린 (S) 또는 글루타민 (Q), 예컨대 E27Q, E97S로 돌연변이된 LC를 포함하며, 예컨대 E27 및 E97 양쪽 모두가 글루타민으로 돌연변이되거나, 또는 E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고 E97은 S로 돌연변이되거나 (E27, E97S), 또는 E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고 E97은 Q로 돌연변이되거나 (E27, E97Q), 또는 E97은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E27은 Q 또는 S, 더욱 바람직하게는 Q로 돌연변이된 (E27, E97Q), 항체 또는 그의 단편.
14. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 위치 32의 페닐알라닌 (F32)이 돌연변이된, 예컨대 A (mAb 0322) 또는 S (mAb 0323)로 돌연변이된 서열식별번호: 3을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
15. 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 잔기 N57 및 잔기 A59 중 하나 또는 양쪽 모두가 돌연변이되고, 예컨대 잔기 A59가 티로신으로 돌연변이되거나, 또는 잔기 N57이 세린으로 돌연변이되거나, 또는 잔기 N57이 세린으로 돌연변이되고 잔기 A59가 티로신으로 돌연변이된 서열식별번호: 2를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
16. 특이적인 Fab-Fab 상호작용에서 수반되는 하전되지 않은 아미노산이 변경된 크기 또는 수소 결합 잠재력의 아미노산으로 치환된, 예컨대 알라닌 (A) 또는 아스파라긴 (N)이 Ser, Thr, Phe, Tyr 및 Trp 중 임의의 하나로 치환된 서열식별번호: 2의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
17. 서열식별번호: 3의 위치 27 및 97의 1개 또는 양쪽 모두의 글루타메이트 (E) 잔기가 세린 (S) 또는 글루타민 (Q)으로 돌연변이되고, 예컨대 E27 및 E97 양쪽 모두가 글루타민으로 돌연변이되거나 (318), 또는 E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고 E97은 S로 돌연변이되거나 (E27, E97S), 또는 E27은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고 E97은 Q로 돌연변이되거나 (E27, E97Q), 또는 E97은 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E27은 Q 또는 S, 더욱 바람직하게는 Q로 돌연변이된 (E27, E97Q), 서열식별번호: 3의 변이체를 포함하고 결합에 대해 서열식별번호: 3과 경쟁하는 항체 또는 그의 단편.
18. 잔기 N57 및 잔기 A59 중 하나 또는 양쪽 모두가 돌연변이되고, 예컨대 잔기 A59가 티로신으로 돌연변이되거나, 또는 잔기 N57이 세린으로 돌연변이되거나, 또는 잔기 N57이 세린으로 돌연변이되고 잔기 A59가 티로신으로 돌연변이된, 서열식별번호: 2의 변이체를 포함하고 결합에 대해 서열식별번호: 2와 경쟁하는 항체 또는 그의 단편.
19. 서열식별번호: 4를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
20. 서열식별번호: 5를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
21. 서열식별번호: 6을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
22. 서열식별번호: 7을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
23. 서열식별번호: 8을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
24. 서열식별번호: 9를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
25. 서열식별번호: 10을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
26. 서열식별번호: 11을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
27. 서열식별번호: 12를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
28. 서열식별번호: 13을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
29. 서열식별번호: 14를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
30. 서열식별번호: 15를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
31. 서열식별번호: 16을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
32. 서열식별번호: 4 내지 16 중 임의의 하나를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
33. 실시양태 1-32 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물.
34. 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 예컨대 실시양태 1-32의 항체.
35. 염증성 질환 또는 자가면역 질환으로부터 선택되는 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 예컨대 실시양태 1-32의 항체.
36. 실시양태 35에 있어서, 질환이 류머티스성 관절염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
37. 염증성 질환 또는 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체, 예컨대 실시양태 1-32 중 어느 하나의 항체의 용도.
38. 실시양태 35에 있어서, 질환이 류머티스성 관절염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
39. 본 발명의 항체 (예컨대 실시양태 1-32 중 어느 하나의 항체)를 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환으로부터 선택되는 질환을 치료하는 방법, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물, 또는 본 발명의 항체를 포함하는 의약.
실시예
실시예 1: mAb0170 변이체의 유체역학 반경 및 점도
WO2013/120553의 mAb0170의 유체역학 반경이 원하는 것 (5-6 nm)보다 큰 것 (9-10 nm)으로 확인되었다. 96-웰 플레이트 구성과 다이나프로(DynaPro) 플레이트 판독기 (와이어트 인크(Wyatt Inc.))를 사용하여 동적 광 산란 분석에 의해 유체역학 반경을 결정하였다. 사용된 플레이트는 코닝(Corning) 3540 검정법 플레이트 (코닝)였다. 총 샘플 부피는 약 20 ㎕였고, mAb0170 변이체에 대해 온도가 25℃에서 유지되었다 (도 6).
가변 경쇄의 CDR1 및 CDR3에서의 전하 패치 돌연변이는 Rh를 단량체성 mAb에 대해 예상되는 수준으로 감소시킨 반면, Fab-Fab 상호작용 영역에서의 돌연변이는 Rh를 증가시키는 것으로 보였다. Fab-TREM-1 상호작용 부위에서의 돌연변이는 Rh에 영향을 미치지 않았다.
mAb0170 변이체 0317, 0318, 0319, 0320, 0321, 0322, 0323, 0324, 0325, 0326 및 0330의 경우, DLS에 의해 점도를 결정하였다. 바닥이 투명한 코닝 3540 흑색 미처리 폴리스티렌 마이크로플레이트 및 평균 직경이 206.5 nm인 포스포렉스 인크(Phosphorex Inc.)로부터의 일반 폴리스티렌 나노구체(nanosphere) (카탈로그 번호 106)를 사용하여 와이어트 다이나프로 플레이트 판독기 상에서 유체역학 반경을 측정하였다. 단백질 샘플을 코닝 3540 플레이트로 옮기고, 상부 밀봉재로 덮었다. 샘플을 원심분리하고, 단백질 샘플의 유체역학 반경을 와이어트 다이나프로 DLS 플레이트 판독기에서 측정하였다. 각각의 웰에 0.5 ㎕ 폴리스티렌 비드를 첨가하고, 피펫팅에 의해 부드럽게 혼합하였다. 플레이트를 다시 원심분리하고, 비드의 유체역학 반경을 와이어트 다이나프로 DLS 플레이트 판독기에서 측정하였다.
하기와 같이 단백질 샘플의 점도를 계산하였다:
점도(단백질) = (유체역학 반경(비드, 측정)×점도(완충제))/유체역학 반경(비드, 실제)
[식 중, 점도(단백질)은 단백질 용액의 계산된 점도이고, 유체역학 반경(비드, 측정)은 단백질 용액 내의 폴리스티렌 비드의 측정된 유체역학 반경이고, 점도(완충제)는 완충제의 점도이며, 유체역학 반경(비드, 실제)는 비드의 실제 평균 직경이다] [He et al., Anal Biochem, 399, 141-143, 2010].
mAb0170 변이체 0332 및 0333의 경우, 미세유변학에 의해 점도를 결정하였다. 유변학적 분석을 위해, 30G 노보파인(Novofine) 바늘이 부착된 250 ㎕ 해밀튼(Hamilton) LT 주사기 (해밀튼-보나두즈 인크(Hamilton-Bonaduz Inc))를 사용하였다. 주사기를 플랫폼에 고정된 주문 제작 알루미늄 홀더 내에 놓았다. 주사기의 플런저를 TAXT플러스 텍스처 애널라이저(TAXTPlus Texture Analyzer)에 의해 구동시켰고, 이는 미리 결정된 주입 속도로 플런저 상의 생성된 힘을 측정하였다. 각각의 샘플을 3가지 상이한 주입 속도로 테스트하였다. 크로스-헤드(cross-head) 속도 및 측정된 힘을 사용하여, 전단 속도 및 전단 응력을 각각 계산하였다. 전단 속도와 관련하여 하기와 같이 점도가 표현될 수 있다:
η단백질 = τW/γ = (ΔPD/4L)/((32Q)/(πD3 ))
[식 중, η단백질은 단백질 용액의 점도이고, γ는 겉보기 전단 속도이고, τW는 전단 응력이고, P는 플런저를 구동시키는 것으로부터 초래되는 압력이고, Q는 모세관 바늘을 통과하는 유체의 체적 유량이며, D 및 L은 각각 모세관의 내부 직경 및 길이이다] (Allahham et al., 2004; Intl J Pharm 270, 139-148). 공지된 D, L 및 Q 값 및 측정된 P 값으로부터 점도 η단백질을 계산하였다.
이러한 분석은 "전하 패치" 돌연변이 및 "Fab-Fab 상호작용" 돌연변이 양쪽 모두가 점도를 감소시켰음을 나타냈다 (도 1). 전하 패치 돌연변이 E27Q 및 E97Q를 포함하는 서열식별번호: 5의 mAb 변이체가 점도가 가장 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 2: mAb0170 변이체의 동역학
인간 TREM-1-Fc 및 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 mAb 0170 변이체의 결합 동역학을 각각 결정하였다. 표면 플라즈몬 공명을 통해 분자적 상호작용을 실시간으로 측정하는 프로테온 애널라이저(ProteOn Analyzer) (바이오래드(BioRad)) 상에서 결합 연구를 수행하였다. 25℃에서 실험을 실행하였고, 샘플을 샘플 구획에서 15℃에서 보관하였다. 프로테온이 보고하는 신호 (RU, 반응 단위(response unit))는 6개의 평행한 유동 셀(cell) 내의 개별적인 센서 칩 표면 상에서의 질량과 직접적으로 상호관련된다. 비아코어(Biacore)의 인간 또는 마우스 Fc 포착 키트로부터의 항-인간 Fc 모노클로날 또는 항-뮤린(murine) Fc 폴리클로날 항체를 제조사의 설명서에 따라 GLM 센서 칩의 유동 셀 상에 수평 방향으로 고정시켰다. 포착 항체의 최종 고정 수준은 각각의 실험에서 약 2600-6000 RU였다. 항체를 러닝 완충제 (10 mM 헤페스(Hepes), 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05％ 계면활성제 P20, pH 7.4) 내로 5-10 nM로 희석한 후, 60초 동안 30 ㎕/분으로 수직 방향으로 주입함으로써, 정제된 모노클로날 마우스 또는 재조합 발현 항-hTREM-1 항체의 포착을 수행하여, 항-Fc 항체만 고정된 모든 유동 셀에 인접한 기준 인터스팟(interspot)을 생성시켰다. 이는 전형적으로 약 100-300 RU의 테스트 항체의 최종 포착 수준 및 30-90 RU의 피분석물의 Rmax 값을 초래하였다. 피분석물 (항원)을 모든 유동 셀에 수평 방향으로 주입함으로써 hTREM-1 또는 cTREM-1 단백질의 결합을 수행하여, 기준 인터스팟에 결합하는 것에 대해 상대적인 상이한 포착된 항-TREM-1 항체들에 결합하는 것의 비교 분석을 허용하였다. hTREM-1 또는 cTREM-1 단백질을 단계적으로 1:3으로 1.2-100 nM으로 또는 러닝 완충제 내로 희석하고, 250초 동안 100 ㎕/분으로 주입하고, 600초 동안 해리되게 하였다. 피분석물의 각각의 주입 사이클 후, 100 ㎕/분의 10 mM 글리신, pH 1.7 및 50 mM NaOH의 2회의 18초 주입을 통해 GLM 표면을 재생시켰다. 이러한 재생 단계는 고정된 포착 항체 표면으로부터 항-TREM-1 항체 및 임의의 결합된 TREM-1 단백질을 제거하였고, 다음 상호작용 샘플 쌍의 후속 결합을 허용하였다. 재생 절차는 직접적으로 고정된 항-Fc 포착 항체를 칩 표면으로부터 제거하지 않았다.
복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해 평형 해리 상수 (KD)를 결정함으로써 항체와 항원 사이의 결합 친화도를 정량하였다. 데이터 분석을 위한 프로테온 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 피팅함으로써 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수 예컨대 ka (회합 속도) 및 kd (해리 속도)가 회수되었다. KD = kd / ka의 식을 통해 KD가 ka 및 kd와 관련된다.
데이터 분석 전에 이중 레퍼런싱(double referencing) (포착된 항-TREM-1 항체에 대한 기준 표면 신호, 뿐만 아니라 블랭크(blank) 완충제 주입물의 차감)에 의해 결합 곡선을 프로세싱하였다. 이는 샘플 주입 동안의 기기 노이즈(noise), 벌크 시프트(bulk shift) 및 드리프트(drift)의 수정을 허용하였다.
mAb 0170 변이체 모두가 인간 TREM-1-Fc에 대한 친화도가 mAb 0170과 유사한 것으로 확인되었다. 흥미롭게, "Fab-TREM-1 상호작용" 돌연변이를 포함하는 mAb 변이체, 예컨대 mAb 0322가 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 친화도가 증가하였다 (표 2).
실시예 3: mAb 0330 및 mAb 0333의 동역학 및 점도
시노몰구스 TREM-1에 대한 개선된 친화도 및 낮은 점도 양쪽 모두를 지니는 mAb를 생성시키려는 시도로, 서열식별번호: 9로부터의 돌연변이를 mAb0170 변이체 중에서 점도가 가장 낮은 것으로 확인된 서열식별번호: 5에서의 돌연변이 및 점도에 대한 효과가 적당한 것으로 확인된 서열식별번호: 11과 조합하였다. 시노몰구스 TREM-1-Fc에 대한 증가된 친화도가 조합된 돌연변이를 포함하는 mAb 변이체 (mAb 0330 및 mAb 0333)에 대해 유지되었고, 이러한 돌연변이는 인간 TREM-1-Fc에 대한 친화도에 영향을 미치지 않았다. WO2013/120553의 mAb 0170과 비교하여 mAb0330 및 mAb 0333의 점도가 현저하게 감소되었다 (도 1).
실시예 4: 안정적인 BWZ'36 / hTREM -1 세포주의 배양
10％ FCS (카탈로그# 16140-071, 깁코(Gibco), 미국 뉴욕), 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (카탈로그# 15070-06, 깁코), 1 mM 피루브산나트륨 (카탈로그# 11360, 깁코), 5 μM -2ME (카탈로그# 31350-010, 깁코) 및 2 mM L-글루타민 (카탈로그# 25030, 깁코)이 보충된, 페놀 레드(phenol red)가 없는 RPMI 1640 (카탈로그# 11835, 깁코, 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 BWZ/hTREM-1 리포터 세포를 배양하였다. 특수 플레이트 또는 코팅이 요구되지 않았다. 10 ml 베르센(Versene) (카탈로그 # 15040, 깁코)을 첨가하여 세포를 탈착시킨 후, 이를 튜브로 옮기고, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 페놀 레드가 없는 신선한 RPMI 1640에서 세정하였다. 그 후, 이러한 세포가 분석법에서 사용하거나 또는 추가 증식을 위해 재배양하기 위한 준비가 되었다.
실시예 5: mAb 0170 변이체의 기능적 특성화
인간 TREM-1 신호전달을 억제하는 항-TREM-1 mAb 0170 변이체의 능력을 바이오엑셀(Bioxell)이 제공한 리포터 세포주 (BWZ'36/hTREM-1)를 사용하여 결정하였다. 리포터 세포주를 PGN 및 TREM-1 리간드 PGLYRP1 (재조합 단백질이거나 또는 활성화된 호중구에 의해 발현됨)로 자극한 후, mAb와 함께 인큐베이션하였다. TREM-1 신호전달을 억제하는 변이체의 효능이 임상적으로 적절하고, WO2013/120553의 mAb 0170의 것과 동등한 것으로 확인되었다 (도 2A 및 B).
유사하게, 점도가 가장 낮은 3개의 mAb0170 변이체 및 시노몰구스 TREM-1에 대한 친화도가 증가된 것으로 관찰된 2개의 변이체에 대해 시노몰구스 TREM-1 신호전달을 억제하는 능력을 결정하였다. 확립된 리포터 세포주 TE 426.27을 사용한 이러한 검정법에서, mAb 변이체들 및 WO2013/120553의 mAb0170의 유사한 효능이 관찰되었다 (도 3).
또한, 건강한 공여자로부터의 1차 세포로부터의 TNFa 방출을 차단하는 mAb 변이체의 효능을 평가하였다. 이러한 검정법에서, 단핵구를 TREM-1 발현을 증가시키기 위해 저산소성 조건 하에 M2 대식세포로 분화시키고, PGN 및 재조합 PGLYRP1로 활성화한 후, mAb와 함께 인큐베이션하였다. 저산소성 M2 대식세포로부터의 TREM-1-매개 TNFa 방출을 억제하는 것에서 mAb 변이체들이 0170만큼 효능이 있는 것으로 확인되었다 (도 4).
실시예 6: Fab 0170- Fab 0170 복합체의 결정 구조
특이적인 자가-상호작용에 의해 상호작용하는 mAb 0170 분자의 잠재력을 Fab 0170-Fab 0170 결정 구조의 결정학적 분석에 의해 평가하였다.
재료: 단백질 농도 8.5 mg/mL의 10 mM 포스페이트, 2.68 mM KCl, 140 mM NaCl, pH 7.4로 이루어진 완충제 내의 mAb 0170의 Fab 영역 (서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 19).
방법: 20％ (w/v) PEG 8000, 200 mM K2HPO4로 구성된 0.5 mL 저장소에 대한 2 ㎕ 저장소 용액과 혼합된 2 ㎕ 단백질 용액으로 이루어진 액적의 평형에 의해 현적(hanging drop) 증기 확산 실험에서 mAb 0170의 Fab 영역을 결정화시켰다. 결정을 2 ㎕ 35％ (w/v) PEG3350, 200 mM K2HPO4로 이루어진 액적으로 옮기고, 0.2 mm 직경 리소루프(litholoop) (몰레큘러 디멘션스 리미티드(Molecular Dimensions Limited)) 상에 마운팅하고, 액체 질소에서 급속 냉각시켰다.
100 K에서 작동된 크라이오-스트림(Cryo-stream)을 사용하여 MAXLAB 911-2 (룬드 유니버시티(Lund University), 스웨덴)에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. XDS 프로그램 패키지 (Kabsch, Acta Crystallogr. D66, 133-144 (2010))를 사용하여, 미처리 데이터 영상을 인덱싱하고, 통합하고, 스케일링하였다. 결정의 공간 군은 P2(1)2(1)2(1)이었고, 단위 격자 파라미터는 a = 62.4 Å, b = 110.9 Å, c = 158.4 Å였다. 2.40 Å의 해상도로 데이터를 수집하였다. CCP4i 프로그램 스위트 (Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))에서 실행된 바와 같이 피닉스(Phenix) 소프트웨어 (Adams et al., Acta Crystallogr. D66, 213―221 (2010))를 사용하여 분자 교체에 의해 구조를 해상하였다. 검색 모델은 pdb 등록물 1AD0.pdb (85％ 동일성)로부터의 중쇄 및 pdb 등록물 2QRG (94％ 동일성)로부터의 경쇄의 구조였다. CCP4i 프로그램 스위트로부터의 Refmac5 (Murshudov et al., Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997))를 사용하여 구조를 정밀화하였다. 쿠트(Coot) 버전 7 (Emsley et al., Acta Crystallogr. D66, 486-501 (2010))을 수동 구조 재구축 및 검증에 사용하였다.
결과 및 논의
mAb 170 Fab 영역의 결정 구조는 비대칭 단위 내의 4개의 Fab 분자를 함유하였다 (중쇄는 A 및 C로 표지되고, 경쇄는 B 및 D로 표지되었다). 한 Fab 분자의 항원 결합 영역이 또 다른 Fab 분자의 항원 결합 영역과 상호작용하고 있는 이량체로서 Fab 분자가 패킹(packing)되었다. 결정 구조 내에 서열식별번호: 19로부터의 마지막 시스테인을 포함하고 이를 정밀화하는 것이 가능하지 않았지만, 중쇄로부터 서열식별번호: 18로부터의 Cys과의 디술피드 결합 내에 있을 것으로 예상될 것이다. 이러한 구역 내의 과도한 2Fo-Fc 및 Fo-Fc 전자 밀도의 일부 징후가 있었고, 디술피드 결합이 Fab 분자의 부분집합 내에 존재하는 것이 가능하다. 비대칭 단위 내의 사슬 A 내의 서열식별번호: 18로부터의 잔기 G26, K78-N79, I104-R105 및 S138-E141 및 비대칭 단위 내의 다른 Fab 분자 내의 서열식별번호: 18 사슬 C로부터의 E1, G26-F 27, M102-R105, S136-E141, S195-K200에 대해 유의한 시그마a 가중 2Fo-Fc 전자 밀도가 없었다. 사슬 D 내의 서열식별번호: 19로부터의 잔기 D30-Y34에 대해서 유의한 시그마a 가중 2Fo-Fc 전자 밀도가 또한 결여되었다. 이러한 잔기들은 결정 구조에 포함되지 않았지만, WO2013/120553에 개시된 인간화 항-TREM-1 mAb 0170 결정 구조로부터의 mAb 0170 단편 결정 구조와의 중첩에 의해 Fab-Fab 계면의 분자적 상호작용 분석 내에 포함되었다.
mAb 0170 Fab 단편 구조의 품질 파라미터는 구조의 전체 R-인자 = 24％ 및 유리 R-인자 = 30％를 나타냈다. 전체 상관관계 계수는 0.93이었고, 회절-성분 정확도 지수 (diffraction component precision index, DPI) = 0.3 Å였다 (Cruickshank, Acta Crystallogr. D55, 583-601 (1999)). 이상적인 결합 길이로부터의 구조 내의 결합 길이의 평균제곱근 편차 = 0.025 Å이었고, 이상적인 결합 각도로부터의 평균제곱근 편차 = 2.326°였다 (Engh and Huber, Acta Crystallogr. A47, 392-400 (1991)).
분자간 거리에 대한 4Å의 차단값으로 CCP4 프로그램 스위트 내의 NCONT 프로그램 (Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))을 사용하여 분자간 거리의 분석을 수행하였다 (표 4). 이러한 분석은 서열식별번호: 2로부터의 아미노산 잔기 N57 및 A59가 결정 구조 내의 Fab-Fab 상호작용에서 수반되는 아미노산들의 군에 속한다는 것을 나타냈다.
<표 4>
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> SITE DIRECTED MUTAGENESIS OF TREM-1 ANTIBODIES <130> P45251WO-PJG <150> EP14177547.8 <151> 2014-07-17 <150> EP14194893.5 <151> 2014-11-26 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 1 5 10 15 Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys 20 25 30 Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 45 Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 65 70 75 80 Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95 Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln 100 105 110 Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 120 125 Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn 130 135 140 Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr 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Lys Ser Ser Asn Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Ile Arg Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 16 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of a humanised TREM-1 antibody <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Ile Arg Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg 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Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 <210> 19 <211> 218 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Expression construct for crystallization <400> 19 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (18)

  1. 80 mg/mL의 농도에서 항체 또는 단편의 점도가 5 cP 미만, 바람직하게는 4 cP 미만인 것을 특징으로 하는, TREM-1에 결합하여 이를 차단할 수 있는 항체 또는 그의 단편.
  2. 서열식별번호(SEQ ID NO): 3의 CDR1 및 CDR3 영역 내의 음으로 하전된 잔기 중 하나 이상이 하전되지 않은 아미노산 잔기로 치환된 것인 항체 또는 그의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열식별번호: 3의 잔기 D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 중 임의의 하나 이상 ("전하 패치(patch)" 돌연변이)이 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된 것인 서열식별번호: 3의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 E27 및 E97 중 적어도 하나 또는 양쪽 모두가 하전되지 않은 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것인 항체 또는 그의 단편.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 서열식별번호: 3의 E27이 글루타민으로 돌연변이되고, E97이 글리신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것인 항체 또는 그의 단편.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 서열식별번호: 3의 E97이 글루타민으로 돌연변이되고, E27이 글리신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 것인 항체 또는 그의 단편.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 서열식별번호: 3의 E27 및 E97이 글루타민으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서, 서열식별번호: 3의 E27이 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E97이 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  9. 제3항 또는 제4항에 있어서, 서열식별번호: 3의 잔기 E97이 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, E27이 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  10. 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 임의의 하나 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 또 다른 아미노산, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환된 서열식별번호: 2의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 2의 잔기 A59 및 N57 중 적어도 하나가 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  12. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 2의 A59가 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, N57이 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  13. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 2의 N57이 돌연변이되지 않은 상태로 유지되고, 서열식별번호: 2의 A59가 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된 것인 항체 또는 그의 단편.
  14. 제10항에 있어서, 서열식별번호: 2의 A59 및 N57 양쪽 모두가 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된 항체 또는 그의 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열식별번호: 3의 CDR1 및 CDR3 영역의 적어도 하나의 음으로 하전된 잔기가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고,
    ii) 서열식별번호: 2의 잔기 Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 및 R106 또는 서열식별번호: 3의 잔기 F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 중 적어도 하나의 잔기 ("Fab-Fab 상호작용" 돌연변이)가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 및 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이된 것인
    항체 또는 그의 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열식별번호: 3의 E27 및 E97 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 돌연변이되고;
    서열식별번호: 2의 A59 및 N57 중 하나 또는 양쪽 모두가 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 시스테인, 리신, 아르기닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린 또는 티로신으로 돌연변이된 것인
    항체 또는 그의 단편.
  17. 서열식별번호: 3의 위치 32의 페닐알라닌이 아미노산 잔기 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 메티오닌으로부터 선택되는, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 발린 및 류신으로부터 선택되는 아미노산으로 돌연변이되고, 더욱 바람직하게는 서열식별번호: 3의 F32가 알라닌 또는 세린으로 돌연변이된 서열식별번호: 3의 변이체를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  18. 서열식별번호: 4 내지 16 중 임의의 하나를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
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