EA037844B1 - Сайт-направленный мутагенез антител к trem-1 - Google Patents

Abstract

В изобретении описаны антитела, которые способны специфически связывать и предупреждать активацию TREM-1, белка, экспрессируемого на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах, как с хорошей аффинностью, так и с низкой вязкостью в клинически релевантных концентрациях. Такие антитела находят применение в терапии субъектов с воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит и воспалительное заболевание кишечника.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к TREM-1 mAbs и к мутации специфических отрицательно заряженных и незаряженных аминокислот, участвующих либо во взаимодействии TREM-1 mAb с самими собой, либо во взаимодействии TREM-1 mAb с TREM-1, для снижения вязкости растворов mAb и сохранения целевой аффинности, изобретение также относится к применению таких антител для терапевтических и фармацевтических целей.

Перечень последовательностей по изобретению

SEQ ID NO: 1 изображает аминокислотную последовательность дикого типа (wt) человеческого TREM-1.

SEQ ID NO: 2 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0170 из Международной заявки WO 2013/120553).

SEQ ID NO: 3 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0170 из Международной заявки WO 2013/120553).

SEQ ID NO: 4 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0317, E27Q, E97S).

SEQ ID NO: 5 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0318, E27Q, E97Q).

SEQ ID NO: 6 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0319, E97S).

SEQ ID NO: 7 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0320, E97Q).

SEQ ID NO: 8 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0321, E27Q).

SEQ ID NO: 9 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0322, F32A).

SEQ ID NO: 10 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0323, F32S).

SEQ ID NO: 11 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0324, A59Y).

SEQ ID NO: 12 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0325, N57S).

SEQ ID NO: 13 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0326, A59Y, N57S).

SEQ ID NO: 14 изображает аминокислотную последовательность легкой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0330, F32A, E27Q, E97Q).

SEQ ID NO: 15 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0332, A59Y; 0332 представляет собой mAb, полученное в результате объединения SEQ ID NO: 15 в качестве HC и SEQ ID NO 5 в качестве LC, табл. 1).

SEQ ID NO: 16 изображает аминокислотную последовательность тяжелой цепи гуманизированного TREM-1 антитела (mAb 0333, A59Y; 0333 представляет собой mAb, полученное в результате объединения SEQ ID NO: 16 в качестве HC и SEQ ID NO 14 в качестве LC, табл. 1).

SEQ ID NO: 17 изображает аминокислотную последовательность полноразмерного cTREM-1.

SEQ ID NO 18 изображает тяжелую цепь Fab-фрагмента mAb 0170. SEQ ID NO 19 изображает легкую цепь Fab-фрагмента mAb 0170.

Сведения о предшествующем уровне техники

TREM-1 представляет собой активирующий рецептор, экспрессируемый на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах. Эти клетки играют главную роль в хронических воспалительных заболеваниях вследствие высвобождения цитокинов и других медиаторов, которые опосредуют воспаление. Экспрессия мРНК и белка TREM-1 активируется у пациентов с RA и IBD, и TREM-1-позитивные клетки накапливаются в очагах воспаления, коррелируя с тяжестью заболевания. Пептидогликанраспознающий белок 1 (PGLYRP1), экспрессируемый главным образом активированными нейтрофилами, представляет собой лиганд для TREM-1 и опосредует TREM-1 передачу сигнала при связывании.

In vitro участие TREM-1 вызывает секрецию провоспалительных цитокинов, включая TNF, IL-8, и моноцитарного хемотаксического белка-1. Кроме того, TREM-1 передача сигнала суммируется с передачей сигналов со многих Toll-подобных рецепторов (TLR), что дополнительно усиливает провоспалительные сигналы. В свою очередь, это активирует экспрессию TREM-1, в результате имеем порочный круг амплификации воспаления. Все больше экспериментальных данных указывает на то, что TLRs способствуют развитию и прогрессированию хронических воспалительных заболеваний, таких как RA и IBD.

В Международной заявке WO 2013/120553 раскрываются гуманизированные mAbs к TREM-1, которые ингибируют функцию как TREM-1 человека, так и TREM-1 яванского макака. Однако профиль вязкости mAbs к TREM-1 может затруднить производственный процесс получения лекарственного пре

- 1 037844 парата с концентрацией >50 мг/мл и может ограничить оптимальную дозу в клинических условиях. Высокая доза (несколько мг/кг) терапевтического белка часто необходима для достижения адекватного клинического эффекта, и поскольку подавляющее большинство этих терапевтических средств вводят подкожно, самостоятельное введение этого лекарственного средства ограничивается объемами <1.5 мл (Shire et al, J. Pharm. Sci. 2004,93,1390-1402). Разработка лекарственных форм с высокой концентрацией белка, пригодных для самостоятельного введения пациентом, является общей проблемой для получения и доставки, когда белковый препарат дает конечный раствор с высокой вязкостью.

Распределение заряда в mAbs изучалось с точки зрения влияния на характер изменения вязкости растворов mAb (Yadav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802). Также было показано, что слабые неспецифические взаимодействия зарядов, которые сохраняются в разбавленных растворах, влияют на вязкость концентрированных растворов mAb (Connolly et al., Biophys. I, 2012, 103, 69-78). Способы снижения вязкости растворов mAb включали введение сайт-направленных мутаций с обменом заряда, которые нарушают непосредственные межмолекулярные взаимодействия зарядов (Yadav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802), или добавление солей или противоионов (Liu et al., J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1928-1940; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2010, 99, 1152-1168; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2012, 101, 998-1011; Kanai et al., J. Pharm. Sci. 2008, 97, 4219-4227). Однако добавление солей или противоионов может вызвать у пациента побочные эффекты с учетом гиперосмолярности вводимого раствора.

В настоящей заявке раскрываются антитела к TREM-1, полученные с использованием сайтспецифической мутации CDR гуманизированного mAb к TREM-1 0170 из Международной заявки WO 2013/120553. Раскрываемые антитела не нарушают непосредственные межмолекулярные взаимодействия заряд-заряд в mAb, но имеют благоприятный профиль вязкости и сохраняют профиль связывания с мишенью. Благоприятный профиль вязкости позволяет получать лекарственный препарат с высокими концентрациями, что может иметь существенное значение для терапевтического и фармацевтического применения. Такие антитела могут оказывать значительное влияние на качество жизни субъектов с сепсисом или хроническим воспалительным заболеванием, например, таким как ревматоидный артрит, псориатический артрит и воспалительное заболевание кишечника.

Сущность изобретения

Главный аспект изобретения относится к mAb против TREM-1 (анти-TREM-1 mAb), профиль вязкости которого находится в интервале, предполагаемом для мономерных mAbs, и которое блокирует функцию TREM-1 также эффективно, как mAb0170 из Международной заявки WO 2013/120553. В дополнение к предпочтительным профилям вязкости вариантов mAbs по изобретению указанные варианты не проявляют агонизма к TREM-1 рецептору.

Один аспект изобретения относится к антителу или его фрагменту, которые способны связываться с и блокировать TREM-1, характеризующимся тем, что антитело или фрагмент указанного антитела имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 80 мг/мл, предпочтительно менее 4 сП.

Антитело или его фрагмент могут содержать вариант последовательности SEQ ID NO: 3, где один или более отрицательно заряженных остатков в областях CDR1 и CDR3 SEQ ID NO: 3 заменены на незаряженные аминокислотные остатки согласно настоящему описанию.

Антитело или его фрагмент могут содержать вариант последовательности SEQ ID NO: 3, где фенилаланин в положении 32 SEQ ID NO: 3 в результате мутации заменен на аминокислоту, выбранную из аминокислотных остатков глицина, серина, треонина, цистеина, аланина, валина, лейцина, изолейцина и метионина, предпочтительно выбранную из аланина, глицина, серина, валина и лейцина, более предпочтительно, где F32 в SEQ ID NO: 3 в результате мутации заменен на аланин или серин.

Антитело или его фрагмент могут содержать вариант последовательности SEQ ID NO: 2, где любой из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 и R106 в SEQ ID NO: 2 или F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 в SEQ ID NO 3 (мутации Fab-Fab взаимодействия) заменен на другую аминокислоту, например, такую как природная аминокислота, предпочтительно на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина.

Другой аспект изобретения относится к антителу или его фрагменту, которые способны специфически связываться с и блокировать TREM-1 с последовательностью SEQ ID NO: 1 и содержат варианты последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или обеих, причем варианты выбраны из группы, состоящей из мутаций Fab-Fab взаимодействия, мутаций Fab-TREM-1 взаимодействия и мутаций charge patch' в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (табл. 1).

В одном варианте антитела или его фрагмента по изобретению один или более отрицательно заряженных остатков в областях CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 заменены на незаряженные аминокислотные остатки. Согласно одному варианту отрицательно заряженные остатки в областях CDR1 и CDR3 в SEQ ID NO: 3 заменены на незаряженные аминокислотные остатки.

Согласно одному варианту антитело или его фрагмент по изобретению содержат вариант SEQ ID NO 3, где один или более charge patch остатков D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 в SEQ ID NO: 3 мутирован в (заменен на) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Согласно одному варианту более одного

- 2 037844 остатка charge patch D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 в SEQ ID NO 3 мутирован в аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина.

Согласно одному варианту один из остатков E27 и E97 в областях CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO 3 заменен на незаряженный аминокислотный остаток, например, такой как остаток аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Например, E27 в SEQ ID NO 3 может оставаться неизмененным, а E97 может быть заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина. Или же остаток E97 в SEQ ID NO 3 может оставаться неизмененным, а остаток E27 может быть заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина.

Согласно одному варианту как E27, так и E97 в областях CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO 3 заменены на незаряженные аминокислотные остатки, например, такие как аминокислотные остатки, выбранные из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Например, E27 в SEQ ID NO 3 может быть заменен на глутамин, E97 в SEQ ID NO 3 может быть заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина.

В другом аспекте изобретения предусматривается антитело или его фрагмент, содержащие вариант SEQ ID. NO 2, где любой из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 и R106 последовательности SEQ ID NO: 2 или F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 последовательности SEQ ID NO: 3 (мутации FabFab взаимодействия) заменен на другую аминокислоту, например, такую как природная аминокислота, предпочтительно на остаток аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина.

Согласно одному варианту антитела или его фрагмента по изобретению по меньшей мере один из остатков А59 и N57 последовательности SEQ ID NO: 2 заменен на остаток аминокислоты, например, такой как природная аминокислота, предпочтительно аминокислота, выбранная из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина или тирозина, более предпочтительно серина или тирозина. Например, остаток А59 в SEQ ID NO: 2 может оставаться неизмененным, а остаток N57 может быть заменен на другой аминокислотный остаток, например, такой как остаток природной аминокислоты, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина. Или же остаток N57 в SEQ ID NO: 2 может оставаться неизмененным, а остаток А59 последовательности SEQ ID NO: 2 может быть мутирован в другой аминокислотный остаток, например, такой как остаток природной аминокислоты, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина. Согласно другому варианту как А59, так и N57 в SEQ ID NO: 2 заменены на другой аминокислотный остаток, например, такой как остаток природной аминокислоты, предпочтительно, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина.

Другой аспект изобретения относится к улучшенной доклинической оценочной величине, полученной путем введения сайт-направленных мутаций в SEQ ID NO: 3 в аминокислотные остатки Fab-TREM1 взаимодействия с целью достижения такой же аффинности mAh к TREM-1 яванского макака, как и к человеческому TREM-1 с SEQ ID NO: 1, как например, когда остаток Phe в SEQ ID NO: 3 заменен на Ala или Ser.

Таким образом, в изобретении предусматривается антитело или его фрагмент, в которых аминокислотный остаток Fab-TREM-1 взаимодействия, F32 в SEQ ID NO: 3, заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, треонина, пролина и цистеина.

Другой аспект изобретения относится к суммарному эффекту улучшенных вязкостных свойств и улучшенной доклинической оценочной величине, полученной путем введения сайт-направленных мутаций в SEQ ID NO: 2 в области контакта mAb- TREM-1 для достижения такой же аффинности mAb к TREM-1 яванского макака, как и к человеческому TREM-1 с SEQ ID NO: 1 (например, описанной выше), в комбинации с заменой отрицательно заряженных остатков в областях CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 на незаряженные аминокислотные остатки (например, описанные выше).

Согласно любому из вышеописанных аспектов в изобретении предусматривается антитело или его фрагмент, в которых:

i) по меньшей мере один отрицательно заряженный остаток в областях CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из гли-

- 3 037844 цина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина; и ii) по меньшей мере один из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, А59, M102, I104 и R106 последовательности SEQ ID NO: 2 или F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 последовательности SEQ ID NO: 3 (мутации Fab-Fab взаимодействия) заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, и триптофана, гистидина и тирозина.

Согласно одному варианту в изобретении предусматривается антитело или его фрагмент, в которых:

i) один или оба остатка из E27 и E97 последовательности SEQ ID NO: 3 заменен/заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина; и ii) один или оба остатка из А59 и N57 последовательности SEQ ID NO: 2 заменен/заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина.

Изобретение также относится к антителу или его фрагменту, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NOs с 4 до 16.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан профиль вязкости mAb вариантов к TREM-1 и построение их экспоненциальных кривых.

На фиг. 2 показана способность mAb 0170 вариантов ингибировать передачу сигнала человеческого TREM-1 в линии клеток, содержащих человеческий ген-репортер TREM-1 (BWZ'36/hTREM-1), стимулированную PGN и (A) рекомбинантным PGLYRP1 или (B) PGLYRP1, экспрессируемым активированными нейтрофилами (среднее для N доноров).

На фиг. 3 показана способность mAb 0170 вариантов ингибировать передачу сигнала TREM-1 в линии клеток, содержащих ген-репортер TREM-1 яванского макака (TE426.27), стимулированную PGN и рекомбинантным PGLYRP1.

На фиг. 4 показана способность mAb 0170 вариантов ингибировать высвобождение TNFa из M2 макрофагов в условиях гипоксии, стимулированное PGN и рекомбинантным PGLYRP1.

На фиг. 5 показан агонистический потенциал связанных с планшетом mAb 0170 вариантов по их способности индуцировать высвобождение TNF из M2 макрофагов в условиях гипоксии. В качестве положительного контроля использовали MAb 1278 (R&D).

На фиг. 6 показан гидродинамический радиус mAb вариантов к TREM-1 по сравнению с mAb 0170.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

TREM-1 представляет собой трансмембранный белок, который состоит из 234 аминокислот, включая один внеклеточный иммуноглобулиновый домен и короткий цитоплазматический хвост без видимого мотива, участвующего в передаче сигнала. Будучи активированным TREM-1 ассоциируется с ITAMсодержащим адаптерным белком сигнального пути, DAP12. Последующая передача сигнала может включать активацию фактора транскрипции NFAT, вызывающего активацию продуцирования провоспалительных цитокинов.

Настоящее изобретение относится к антителам, способным специфически связываться с и блокировать функцию TREM-1. Антитела по изобретению могут блокировать функцию TREM-1, снижая/блокируя активацию TREM-1 и последующую передачу сигнала.

Антитела по изобретению могут блокировать TREM-1 по одному механизму или посредством комбинации нескольких различных механизмов, блокирующих TREM-1 прямо или опосредованно. Например, антитела по изобретению могут предупреждать образование функционального комплекса природного лиганда TREM-1, пептидогликанраспознающего белка 1 (PGLYRP1), с TREM-1, и/или антитела по изобретению могут блокировать TREM-1, предупреждая образование димеров или мультимеров из индивидуальных молекул TREM-1. Димеризацию или мультимеризацию TREM-1 можно понизить или предупредить с помощью антител к TREM-1, способных связываться с участком TREM-1, который в противном случае локализовался бы на поверхности контакта TREM-1 димера, тем самым предупреждая ассоциацию отдельных молекул TREM-1 друг с другом.

Димеризацию или мультимеризацию TREM-1 можно понизить или предупредить с помощью антител к TREM-1, которые препятствуют взаимодействию TREM-1 с его лигандом. Антитела согласно настоящему изобретению могут блокировать PGLYRP1-индуцированную активацию TREM-1. PGLYRP1, высококонсервативный белок протяженностью 196 аминокислот, состоящий из сигнального пептида и пептидогликансвязывающего домена, экспрессируется в нейтрофилах и высвобождается в момент их активации. Антитела по настоящему изобретению могут подавлять высвобождение провоспалительных цитокинов из миелоидных клеток. Антитела по настоящему изобретению могут блокировать высвобождение TNF, MIP-1бета, MCP-1, IL-1бета, GM.CSF, IL-6 и/или IL-8 из макрофагов, нейтрофилов, синовиальных клеток и/или репортерной клетки по данному описанию.

Антитела по изобретению могут обладать способностью связывать как человеческий TREM-1, так и

- 4 037844

TREM-1 другого вида, отличного от человека. Таким образом, в данном контексте термин TREM-1 охватывает любую природную форму TREM-1, которую можно получить из любого подходящего организма. Например, TREM- 1 для применения по данному описанию может быть TREM-1 позвоночных, например TREM-1 млекопитающих, как например, TREM-1 примата (например, человека, шимпанзе, макака яванского или макака резус); грызуна (например, такого как мышь или крыса), зайцеобразного (например, такого как кролик) или парнокопытного (например, такого как корова, овца, свинья или верблюд). Предпочтительно TREM-1 имеет последовательность SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1). TREM-1 может представлять собой зрелую форму TREM-1, такую как белок TREM-1, который подвергся посттрансляционному процессингу в подходящей клетке. Такой зрелый TREM-1 белок может, например, быть гликозилированным. TREM-1 может представлять собой полноразмерный TREM-1 белок.

Антитела по изобретению могут представлять собой моноклональные антитела в том смысле, что они прямо или опосредованно получены из одного клона В лимфоцитов. Антитела к TREM-1 можно продуцировать, подвергать скринингу и очищать, применяя методы, описанные в разделе Примеры Международной заявки WO 2013/120553. Коротко говоря, соответствующую мышь, например мышь, нокаутированную (KO) по TREM-1 или по TREM-1/TREM-3, можно иммунизировать белком TREM-1, клеткой, экспрессирующей TREM-1, или их комбинацией.

Антитела по изобретению могут быть поликлональными в том смысле, что они являются смесью моноклональных антител по настоящему изобретению.

Первичный скрининг супернатантов гибридом можно осуществлять методом прямого ELISA или FMAT, а для вторичного скрининга можно использовать метод проточной цитометрии. Положительные супернатанты гибридом можно подвергнуть затем скринингу в анализе гена-репортера.

Антитела можно рекомбинантно экспрессировать в прокариотических или эукариотических клетках. Прокариотическая клетка может представлять собой клетку E. coli. Эукариотическая клетка может представлять собой клетку дрожжей, клетку насекомого или млекопитающего, например клетку, полученную из организма, который является организмом примата (такого как человек, шимпанзе, яванский макак или макак резус), грызуна (например, такого как мышь или крыса), зайцеобразного (например, такого как кролик) или парнокопытного (например, такого как корова, овца, свинья или верблюд). Подходящие линии клеток млекопитающих включают, но без ограничения, клетки HEK293, CHO клетки и HELA клетки. Антитела к TREM-1 можно получать другими методами, известными специалистам в данной области техники, например методом фагового дисплея или дрожжевого дисплея.

После получения антитела можно подвергать скринингу на связывание, например, с полноразмерным TREM-1 или его мутантом, применяя методы, описанные в разделе Примеры Международной заявки WO 2013/120553.

Функциональные антитела к TREM-1 по настоящему изобретению представляют собой антитела, которые способны специфически связывать TREM-1 и которые оказывают влияние на активацию TREM1 и последующую передачу сигнала посредством блокирования или стимулирования TREM-1, и эти антитела в данном описании называются функциональными антителами к TREM-1. Способ идентификации функционального антитела к TREM-1 включает (a) культивирование первой клетки, экспрессирующей TREM-1, белок, участвующий в передаче сигнала, и репортерную конструкцию; (b) количественное определение активности первой клетки, когда указанная клетка инкубируется с TREM-1 модифицирующим агентом; (c) контактирование совместной культуры со стадии (b) с антителом к TREM-1; и (d) определение величины, на которую активность первой клетки меньше или больше активности, определенной на стадии (b).

Первая клетка на стадии (a) может представлять собой клетку гемопоэтического происхождения, например, такую как миелоидная клетка, такая как Т-клетка. Белок, участвующий в передаче сигнала на стадии (a), может представлять собой любой белок, участвующий в передаче сигнала, который способен образовывать комплекс с TREM-1. Подходящие белки, участвующие в передаче сигнала, включают DAP10, DAP12, TCR дзета, Fc гамма RIII и Fc рецептор или их участок. Репортерная конструкция на стадии (a) может представлять собой любую конструкцию, способную активироваться при посредстве белка, участвующего в передаче сигнала, и генерировать распознаваемый сигнал. Подходящие репортерные конструкции содержат фактор транскрипции и ген-репортер. Белок, участвующий в передаче сигнала, может передавать сигналы через посредство фактора транскрипции, выбранного из группы, состоящей из NFAT и NFkB. Ген-репортер представляет собой ген, который в естественных условиях не экспрессируется в указанной первой клетке и может представлять собой, но без ограничения, ген, который кодирует β-галактозидазу, люциферазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хлорамфеникол трансферазу. Указанную первую клетку можно трансфецировать с использованием фактора транскрипции и гена-репортера методами, хорошо известными в уровне техники.

Описанные в разделе Примеры BWZ/hTREM-1 репортерная клетка и TE426.27 репортерная клетка являются одним из примеров первой клетки.

Модифицирующий агент на стадии (b) может представлять собой лиганд к TREM-1 или активированный нейтрофил. Антитело к TREM-1 на стадии (c) может представлять собой супернатант TREM-1специфических гибридомных антител или очищенное антитело. Активность, количественно определяе- 5 037844 мая на стадии (d), представляет собой сигнал, продуцируемый репортерной конструкцией. Примером такой передачи сигнала является люминесценция, вызываемая обусловленным NFAT продуцированием

LacZ (β-лактамазы, люциферазы).

Можно специально адаптировать способ для идентификации антитела, блокирующего TREM-1. Способ идентификации антитела, блокирующего TREM-1, включает (a) культивирование первой клетки, экспрессирующей TREM-1, белок, участвующий в передаче сигнала, и репортерную конструкцию; (b) количественное определение активности первой клетки, когда указанная клетка инкубируется с активированным нейтрофилом; (c) контактирование совместной культуры первой клетки с нейтрофилом с антителом к TREM-1; и (d) определение величины, на которую активность первой клетки меньше активности, определенной на стадии (b).

Способ можно также специально адаптировать для идентификации антитела, стимулирующего TREM-1. Способ идентификации антитела, стимулирующего TREM-1, включает (a) культивирование первой клетки, экспрессирующей TREM-1, белок, участвующий в передаче сигнала, и репортерную конструкцию; (b) количественное определение активности первой клетки; (c) контактирование/инкубацию указанной клетки с антителом к TREM-1; и (d) определение величины, на которую активность первой клетки больше активности, определенной на стадии (b).

Настоящее изобретение относится к антителам, блокирующим TREM-1, которые можно идентифицировать раскрываемым в настоящей заявке способом идентификации блокирующего антитела. При тестировании по способу, описанному выше и в разделе Примеры, антитело по настоящему изобретению в концентрации менее 50 мкг/мл, например менее 40 мкг/мл, например менее 30 мкг/мл, например менее 20 мкг/мл, например менее 10 мкг/мл, например менее 5 мкг/мл и например менее 1 мкг/мл, может эффективно снижать активность указанной первой клетки на 50%, например на 60%, например на 70%, например на 80%, например на 90%, например на 95%, например на 100%. Антитело по изобретению может обладать способностью полностью подавлять активность первой клетки. При тестировании по способу, описанному выше и в разделе Примеры, антитело по настоящему изобретению в концентрации менее 1 мкг/мл, например менее 0.9 мкг/мл, например менее 0.8 мкг/мл, например менее 0.7 мкг/мл, например менее 0.6 мкг/мл, например менее 0.5 мкг/мл, например менее 0.4 мкг/мл, например менее 0.3 мкг/мл, например менее 0.2 мкг/мл, может обладать способностью подавлять активность первой клетки.

Настоящее изобретение также относится к антителам, блокирующим TREM-1, которые можно идентифицировать способами, отличными от способа по настоящему изобретению.

В данном контексте термин антитело относится к белку с последовательностью, полученной с использованием последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, который способен специфически связываться с антигеном (TREM-1) или его участком. Термин включает полноразмерные антитела любого класса или изотипа (а именно IgA, IgE, IgG, IgM и/или IgY) и любую одиночную цепь или ее фрагмент. Антитело, которое специфически связывается с антигеном или его участком, может связываться исключительно с этим антигеном или его участком или оно может связываться с ограниченным числом гомологичных антигенов или их участков. Полноразмерные антитела обычно содержат по меньшей мере четыре полипептидных цепи: две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, которые связаны между собой дисульфидными связями. Одним подклассом иммуноглобулинов, вызывающим особый интерес в фармацевтике, является семейство IgG. У человека класс IgG можно разделить на четыре подкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 на основании их последовательности константной области тяжелой цепи. Легкие цепи можно разделить на два типа, каппа и лямбда, исходя из различий в составе их последовательностей. Молекулы IgG состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой двумя или более дисульфидными связями, и двух легких цепей, каждая из которых связана с тяжелой цепью дисульфидной связью. Тяжелая цепь может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и до трех константных областей тяжелой цепи (CH): CH1, CH2 и CH3. Легкая цепь может содержать вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область легкой цепи (CL). Области VH и VL можно также подразделять на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующимися с более консервативными участками, называемыми каркасными (остовными) областями (FR). Области VH и VL обычно состоят из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей образуют [связывающий] домен, который способен взаимодействовать с антигеном, тогда как константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая, но без ограничения, различные клетки иммунной системы (эффекторные клетки), Fc рецепторы и первый компонент (Clq) классического пути системы комплемента.

Антитела по настоящему изобретению можно выделять. Термин выделенное антитело относится к антителу, которое выделено и/или регенерировано из другого (других) компонента (компонентов) в среде, в которой оно было получено, и/или которое было очищено от компонентов, присутствующих в среде, в которой оно было получено.

Некоторые антигенсвязывающие фрагменты антител могут быть пригодными в контексте настоящего изобретения, учитывая, что было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может

- 6 037844 осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Термин антигенсвязывающий фрагмент антитела относится к одному или более фрагменту(-ам) антитела, который(-е) сохраняет(-ют) способность специфически связываться с антигеном, например, таким как TREM-1 по данному описанию. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (обычно VL и VH домены одного плеча антитела), одноцепочечные Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:42S426 и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (обычно VH и CHI домен) и dAb (обычно VH домен) фрагменты; VH, VL, VhH и V-NAR домены; одновалентные молекулы, содержащие одну VH и одну VL цепь; мини-антитела, диатела, триатела, тетратела и каппа антитела (см., например, Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57); IgG верблюда; IgNAR; а также одну или более выделенных областей CDR или функциональный паратоп, где выделенные CDR или антигенсвязывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны вместе таким образом, чтобы образовывать функциональный фрагмент антитела. Описание или обзор фрагментов антитела различных типов представлено (представлен), например, в публикации Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; в Международной заявке WO 2005040219 и опубликованных патентных заявках США №№ 20050238646 и 20020161201. Эти фрагменты антитела можно получать обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и фрагменты можно подвергать скринингу на полезность таким же способом, как и интактные антитела.

Антитело по изобретению может представлять собой человеческое антитело или гуманизированное антитело. Предполагается, что в данном контексте термин человеческое антитело включает антитела, содержащие вариабельные области, в которых по меньшей мере часть каркасной области и/или по меньшей мере часть CDR области получено с использованием последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии (например, человеческое антитело может иметь вариабельные области, полученные с использованием последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека). Далее, если антитело содержит константную область, то константная область также получена с использованием последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные с использованием случайного или сайтспецифического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo).

Такое человеческое антитело может представлять собой человеческое моноклональное антитело. Такое человеческое антитело может быть получено с использованием гибридомы, которая включает В клетку трансгенного отличного от человека животного, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

Человеческие антитела могут быть выделены из библиотек последовательностей, созданных отбором последовательностей зародышевой линии человека, далее диверсифицированных с использованием разнообразия природных и синтетических последовательностей.

Человеческие антитела можно получать in vitro иммунизацией лимфоцитов человека с последующей трансформацией лимфоцитов, индуцированной вирусом Эпштейна-Барр.

Термин производное человеческого антитела относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например, к такой как конъюгат антитела и другого агента или антитела.

Термин гуманизированное антитело в данном контексте относится к человеческому химерному антителу/химерному антителу нечеловеческого происхождения, которое содержит одну или более последовательностей (областей CDR или их участков), которые получены из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (реципиентное антитело), в котором, по меньшей мере, остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области антитела нечеловеческого происхождения (донорного антитела), например антитела мыши, крысы, кролика или низшего примата, которые обладают заданной специфичностью, аффинностью, композицией последовательности и функциональностью. В некоторых примерах остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены на соответствующие остатки нечеловеческого происхождения. Примером такой модификации является введение одной или более так называемых обратных мутаций, которые обычно представляют собой аминокислотные остатки из донорного антитела. Гуманизацию антитела можно осуществлять, используя методы рекомбинантных ДНК, известные специалистам в данной области техники (см., например, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. C. Lo). Подходящую человеческую реципиентную каркасную область для вариабельного домена как тяжелой, так и легкой цепи можно идентифицировать, например, с использованием гомологии последовательностей или структурной гомологии. Или же можно использовать фиксированные реципиентные каркасные области, например, на основании информации о структуре, биофизических и биохимических свойствах. Реципиентные каркасные области могут быть получены из последовательности зародышевой линии или из последовательности зрелого антитела. Перенос областей CDR донорного антитела можно осуществлять с помощью CDR прививки. CDR привитое гуманизированное антитело можно далее оптимизировать, например, по аффинности, функциональности и биофизическим свойствам посредством идентификации важных положений в кар- 7 037844 касной области, при условии, что обратное введение (обратная мутация) аминокислотного остатка из донорного антитела оказывает положительное воздействие на свойства гуманизированного антитела.

Помимо обратных мутаций из донорного антитела гуманизированное антитело можно создавать путем введения остатков зародышевой линии в CDR или каркасные области, путем элиминирования иммуногенных эпитопов, с помощью сайт-направленного мутагенеза, созреванием аффинности и т.д.

Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации получают с целью дополнительного уточнения свойств антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по меньшей мере один обычно два - вариабельных домена, в которых все или по существу все CDR области соответствуют CDR областям иммуноглобулина нечеловеческого происхождения и в которых все или по существу все FR остатки представляют собой FR остатки последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело может, необязательно, содержать также участок константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно участок константной области (Fc) человеческого иммуноглобулина.

Термин производное гуманизированного антитела относится к любой модифицированной форме гуманизированного антитела, например, такой как конъюгат антитела и другого агента или антитела.

Термин химерное антитело в данном контексте относится к антителу, у которого гены легкой и тяжелой цепей были созданы обычно методами генной инженерии при использовании генов вариабельной и константной областей иммуноглобулина, происходящих от различных видов. Например, вариабельные сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть связаны с сегментами человеческой константной области.

Кристаллизующийся фрагмент (Fc область ''/Fc домен) антитела представляет собой N-концевую область антитела, которая содержит константные домены CH2 и CH3. Fc домен может взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, называемыми Fc рецепторами, а также с некоторыми белками системы комплемента. Fc область обеспечивает возможность взаимодействия антител с иммунной системой. В одном аспекте изобретения могут быть созданы антитела, которые включают модификации в пределах Fc области, обычно с целью изменить одно или более их функциональных свойств, в том числе, например, таких как период полужизни в сыворотке крови, фиксация комплемента, связывание с Fcрецепторами, устойчивость белка и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность или их отсутствие. Также антитело по изобретению можно модифицировать химическими методами (например, один или более химических агентов могут связываться с антителом) или модифицировать с целью изменить его гликозилирование, опять же для того, чтобы изменить одно или более функциональных свойств антитела. IgGl антитело может нести модифицированный Fc домен, содержащий одну или более и, возможно, все нижеприведенные мутации, которые приводят к пониженной аффинности к некоторым Fc рецепторам (L234A, L235E и G237A) и к пониженной Clq-опосредованной фиксации комплемента (A330S и P331S) соответственно (нумерация остатков в соответствии с EU-индексом).

Антитела по изобретению могут иметь изотип IgG, например, такой как IgGl, такой как IgG2, такой как IgG4. При необходимости класс антитела можно переключать известными методами. Например, класс антитела, которое было первоначально получено как IgM антитело, можно переключить, получая IgG антитело. Методы переключения классов антител можно применять для превращения одного IgG подкласса в другой, например из IgGl в IgG2 или IgG4; из IgG2 в IgGl или IgG4 или из IgG4 в IgGl или IgG2. Можно также конструировать константные области молекул химерного антитела, комбинируя области из различных с IgG подклассов.

Согласно одному варианту шарнирную область CHl модифицируют таким образом, что число цистеиновых остатков изменяется, например увеличивается или уменьшается. Этот способ подробнее описан, например, Bodmer et al. в патенте США № 5677425.

Константную область можно модифицировать с целью стабилизировать антитело, например, чтобы уменьшить риск разделения бивалентного антитела на два одновалентных фрагмента VH-VL. Например, в константной области IgG4 остаток S228 (нумерация остатка в соответствии с EU индексом) может быть заменен на остаток пролина (P), чтобы стабилизировать образование дисульфидного мостика в шарнирной области (см., например, Angal et al., Mol Immunol. l995; 30: l05-8).

Антитела или их фрагменты можно также определять с точки зрения их областей, определяющих комплементарность (CDR). В данном контексте термин область, определяющая комплементарность или гипервариабельная область, относится к областям антитела, в которых находятся аминокислотные остатки, участвующие в связывании с антителом. Области гипервариабельности, или CDR, можно идентифицировать как области с наивысшей вариабельностью при выравнивании аминокислотных последовательностей вариабельных доменов антител. Для идентификации CDR можно использовать базы данных, например базу данных Kabat, в соответствии с которой CDR, например, определяются как содержащие аминокислотные остатки 24-34 (Ll), 50-59 (L2) и 89-97 (L3) вариабельного домена легкой цепи 3l-35 (Hl), 50-65 (H2) и 95-l02 (H3) вариабельного домена тяжелой цепи (Kabat et al. l99l; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 9l-3242). Или же CDR можно определять как остатки из гипервариабельной петли (остатки 2633 (Ll), 50-52 (L2) и 9l-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Hl), 53-55 (H2) и 96-l0l

- 8 037844 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Обычно нумерацию аминокислотных остатков в этой области осуществляют по методу, описанному в публикации Kabat et al., см. выше. В данном контексте такие выражения, как положение по Kabat, остаток по Kabat и в соответствии с Kabat относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или для вариабельных доменов легкой цепи. Если использовать систему нумерации по Kabat, то фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньшее число аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие сокращению длины каркасной области (FR) или CDR или инсерции в каркасную область (FR) или в CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен может включать инсерции аминокислот. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерции аминокислот (остаток 52a, 52b и 52c по Kabat) после остатка 52 в CDR H2 и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c, etc. по Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat для данного антитела можно определять при помощи выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со стандартной последовательностью с нумерацией по Kabat.

Термин остатки каркасной области или FR относится к аминокислотным остаткам VH или VL, которые не находятся в пределах CDR по определению в данном описании.

Антитело mAb 0170 имеет последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 2, и последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 3. Антитело по изобретению может содержать эту последовательность вариабельной области тяжелой цепи и/или эту последовательность вариабельной области легкой цепи. Антитело mAb 0170 имеет последовательности CDR, показанные аминокислотами с 31 по 35, с 50 по 68 и со 101 по 110 последовательности SEQ ID NO: 2 и аминокислотами с 24 по 38, с 54 по 60 и с 93 по 101 последовательности SEQ ID NO: 3.

Тяжелая цепь антитела по изобретению может содержать CDR1 последовательность аминокислот с 31 по 35 (TYAMH) из SEQ ID NO: 2, где одна из этих аминокислот может быть заменена на другую аминокислоту.

Тяжелая цепь антитела по изобретению может содержать CDR2 последовательность аминокислот с 50 по 68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD) из SEQ ID NO: 2, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Тяжелая цепь антитела по изобретению может содержать CDR3 последовательность аминокислот со 101 по 110 (DMGQRRQFAY) из SEQ ID NO: 2, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Легкая цепь антитела по изобретению может содержать CDR1 последовательность аминокислот с 24 по 38 (RASESVDTFDYSFLH) из SEQ ID NO: 3, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Легкая цепь антитела по изобретению может содержать CDR2 последовательность аминокислот с 54 по 60 (RASNLES) из SEQ ID NO: 3, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Легкая цепь антитела по изобретению может содержать CDR3 последовательность аминокислот с 93 по 101 (QQSNEDPYT) из SEQ ID NO: 3, где одна или две этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Антитело mAb 0170 имеет последовательность тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 2, и последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 3. Антитело по изобретению может содержать эту последовательность тяжелой цепи или эту последовательность легкой цепи. Либо тяжелая, либо легкая цепь антитела по изобретению может являться вариантом mAb 0170. Антитело mAb 0170 имеет CDR последовательности, показанные аминокислотами с 31 по 35, с 50 по 68 и со 101 по 110 из SEQ ID NO: 2 и аминокислотами с 24 по 38, с 54 по 60 и с 93 по 101 из SEQ ID NO: 3. Антитело по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 из этих CDR последовательностей.

Тяжелая цепь антитела по изобретению может содержать CDRH3 последовательность аминокислот со 101 по 110 (DMGIRRQFAY) из SEQ ID NO: 2, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены на другую аминокислоту.

Термин антиген (Ag) относится к молекулярной частице (химическому соединению, молекуле), применяемой(-ому) для иммунизации иммунокомпетентных клеток позвоночного животного с целью продуцировать антитело (Ab), которое распознает Ag. В данном контексте термин Ag трактуется в более широком смысле и, как предполагается, включает целевые молекулы, которые специфически распознаются антителом (Ab) соответственно, включающие фрагменты или миметики молекул, применяемых в процессе иммунизации или другом процессе, например фаговом дисплее, применяемом для получения Ab.

Термин эпитоп в данном описании определяется в контексте молекулярного взаимодействия между антигенсвязывающим полипептидом, таким как антитело (Ab), и его соответствующим антигеном (Ag). Обычно термин эпитоп относится к области или участку на Ag, с которой(-ым) специфически связывается Ab, т.е. к области или участку, находящейся (находящемуся) в физическом контакте с Ab. Физический контакт может определяться с использованием различных критериев (например, интервал

- 9 037844 среза 2-бА, например, такой как ЗА, такой как 4А, такой как 5А; или доступность для растворителя) для атомов в молекулах Ab и Ag. Эпитоп на белке может содержать аминокислотные остатки в Ag, которые непосредственно участвуют в связывании с Ab (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, например, такие аминокислотные остатки Ag, которые эффективно блокируются антителом (Ab), т.е. аминокислотные остатки внутри поверхности, недоступной для растворителя и/или области узнавания Ab.

В данном контексте термин эпитоп включает оба типа области связывания на любом конкретном участке TREM-1, который специфически связывается с антителом к TREM-1. TREM-1 может содержать ряд различных эпитопов, которые могут включать, но без ограничения, конформационные эпитопы, состоящие из одной или более несмежных аминокислот, локализованных вблизи друг друга в конформации зрелого TREM-1, и посттрансляционные эпитопы, которые состоят, либо целиком, либо частично, из молекулярных структур, ковалентно связанных с TREM-1, таких как углеводные группы.

Эпитоп для данной пары антитело (Ab)/антиген (Ag) может быть описан и охарактеризован с различной степенью детализации с использованием различных экспериментальных и компьютерных методов эпитопного картирования. Экспериментальные методы включают мутагенез, рентгеноструктурный анализ (PCA, рентгенодифракционный анализ), спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР, NMR), обмен водород-дейтерий в сочетании с масс-спектрометрией (HX-MS) и различные методы конкурентного связывания, известные в уровне техники. Поскольку каждый метод основан на уникальном принципе, описание эпитопа тесно связано с методом его определения. Таким образом, в зависимости от применяемого метода эпитопного картирования эпитоп для данной пары Ab/Ag может быть описан поразному.

Наиболее подробно эпитоп для взаимодействия между Ag и Ab может быть описан с помощью пространственных координат, определяющих контакты между атомами, возникающие при взаимодействии Ag-Ab, а также с использованием сведений об их относительном вкладе в термодинамику связывания. На более низком уровне детализации эпитоп может быть охарактеризован с помощью пространственных координат, определяющих контакты между атомами Ag и Ab. На еще более низком уровне детализации эпитоп может быть охарактеризован аминокислотными остатками, которые он содержит, по определению с помощью специфических критериев, таких как расстояние между атомами или доступность для растворителя атомов в комплексе Ab:Ag. На еще более низком уровне детализации эпитоп может быть охарактеризован с использованием функции, например с использованием конкурентного связывания с другими Abs. В более общем случае эпитоп можно также определять как содержащий аминокислотные остатки, замена которых на другую аминокислоту изменит характеристики взаимодействия между Ab и Ag.

Если не указано иное или если это не противоречит смыслу, при описании решенной методом PCA кристаллической структуры, которая определяется пространственными координатами комплекса между Ab, например, Fab фрагментом, и его Ag, термин эпитоп в данном контексте определяется как остатки TREM-1, характеризующиеся наличием тяжелого атома (т.е. неводородного атома) в пределах, например, 4А от тяжелого атома в Ab.

Из того факта, что описание и определение эпитопов в зависимости от используемого метода эпитопного картирования получают с различной степенью детализации, следует, что сравнение эпитопов для различных Abs на том же самом Ag следует также проводить с различной степенью детализации.

Считают, что эпитопы, описанные на уровне аминокислот, например, определяемые с помощью PCA, являются идентичными, если они содержат один и тот же набор аминокислотных остатков. Говорят, что эпитопы перекрываются, если по меньшей мере одна аминокислота является общим для эпитопов. Говорят, что эпитопы являются особыми (уникальными), если ни один аминокислотный остаток не является общим для эпитопов.

Эпитопы можно также определять опосредованно путем сравнения кинетики связывания антител к дикого типа человеческому TREM-1 с кинетикой связывания вариантов человеческого TREM-1, которые содержат мутации аланина в предполагаемых эпитопах. Пониженная аффинность или отмена связывания антитела с вариантами человеческого TREM-1, в которых аминокислотный остаток был заменен на остаток аланина, указывает, что мутантная аминокислота вносит вклад во взаимодействие между указанным антителом и дикого типа человеческим TREM-1. Этот метод обеспечивает отрицательную идентификацию эпитопа. Способ негативно влияет на эффективное определение эпитопа в силу того, что неправильное скручивание или разворачивание белка дает такие же результаты, что и отмена взаимодействия. Анализ может быть усовершенствован за счет сравнительного положительного эффекта мутационных анализов функции ортологичного целевого белка (например, TREM-1 яванского макака), если имеется перекрестно реагирующее антитело. Сравнение позволяет определить различие эпитопов между антителом, которое не вступает в перекрестную реакцию, например с TREM-1 яванского макака, и перекрестно реагирующим антителом.

Косвенную идентификацию эпитопа можно также проводить путем количественного определения связывания антитела (или фрагмента антитела) с вариантами дикого типа антигена (TREM-1). Если анти

- 10 037844 тело или его фрагмент связывают, например, человеческий TREM-1, но не TREM-1 яванского макака, и если указанное антитело или его фрагмент способны связывать частично гуманизированный вариант TREM-1 яванского макака, тогда это восстановленное связывание указывает на то, что замененный(-е) аминокислотный(-е) остаток (остатки) является/являются важным(-и) для взаимодействия антитела с антигеном. Аналогичным образом повышенная аффинность к гуманизированным вариантам TREM-1 яванского макака антитела к TREM-1 (или его Fab фрагмента), которое слабее связывается с TREM-1 яванского макака по сравнению с человеческим TREM-1, может дать информацию об идентичности остатков, составляющих связывающий эпитоп.

Влияние одних и тех же мутаций на любое данное перекрестно-реактивное антитело дает возможность провести различие между возможным неправильным скручиванием белка (отмененным связыванием с обоими антителами) и отсутствием взаимодействия человеческого TREM-1 (связывание с одним из антител и отмена связывания с другим антителом), и в то же время четкое предоставление информации о различии эпитопов между антителом, которое не является перекрестно-реактивным, и антителом, перекрестно реагирующим, на уровне аминокислот.

Антитела по настоящему изобретению могут обладать способностью связывать варианты человеческого TREM-1, что установлено, например, методом поверхностного плазмонного резонанса.

Антитела по настоящему изобретению могут обладать способностью связывать варианты TREM-1 яванского макака, что установлено, например, методом поверхностного плазмонного резонанса.

Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать TREM-1, при этом указанное антитело способно специфически связываться (i) по меньшей мере с одним аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из А21, T22, K23, L24, T25, E26, и (ii) по меньшей мере один аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из A49, S50, S51, Q52, K53, А54, W55, Q56, I57, I58, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85, и (iii) по меньшей мере один аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из C113, V114, I115, Y116, Q117, P118 и P119 человеческого TREM-1.

Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать полипептид, содержащий аминокислоты с D38 по F48 последовательности SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1), что установлено, например, методом HX-MS или методом PCA (дифракции рентгеновских лучей).

Антитело по изобретению может иметь эпитоп, содержащий один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или все из аминокислотных остатков D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 и L45 последовательности SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1), и один, два или все из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из E46, K47 и F48 последовательности SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1), что установлено, например, методом HX-MS или методом PCA (дифракции рентгеновских лучей).

Антитело по изобретению может иметь эпитоп, содержащий одну, две, три или все из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из D42, E46, D92 и H93 последовательности SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1), что установлено с использованием вариантов TREM-1 и поверхностного плазменного резонанса.

Антитело по изобретению может иметь эпитоп, содержащий по меньшей мере аминокислотные остатки E46 и/или D92 из последовательности SEQ ID NO: I (человеческий TREM-1), что установлено с использованием вариантов TREM-1 и поверхностного плазмонного резонанса.

Антитело по изобретению может также содержать одну, две или все из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из L31, I86 и V101 последовательности SEQ ID NO: 1 (человеческий TREM-1).

Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать полипептид, содержащий аминокислотные остатки с E19 по L26 TREM-1 макака яванского (SEQ ID NO: 17), что установлено, например, методом HX-MS или методом PCA (дифракции рентгеновских лучей).

Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать человеческий TREM-1, при этом эпитоп указанного антитела содержит один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или все из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из V39, K40, C41, D42, Y43, L45, E46, K47, F48 и A49 последовательности SEQ ID NO: 1.

Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать человеческий TREM-1, при этом эпитоп указанного антитела содержит остаток D42 последовательности SEQ ID NO: 1. Антитело по изобретению может обладать способностью специфически связывать человеческий TREM1, при этом эпитоп указанного антитела содержит остаток E46 последовательности SEQ ID NO: 1. Эпитоп указанного антитела может содержать остатки V39, C41, D42, Y43, L45 последовательности SEQ ID NO: 1. Эпитоп указанного антитела может содержать остатки E46, K47 и A49 из SEQ ID NO: 1. Эпитоп указанного антитела может также содержать остаток F48 из SEQ ID NO: 1.

Термин паратоп произведен от вышеуказанного определения эпитоп обращением перспективы. Следовательно, термин паратоп относится к области или участку на антителе, с которым специфически связывается антиген, т.е. посредством которого антитело осуществляет физический контакт с антигеном.

Применительно к разрешенной методом PCA кристаллической структуре, определяемой пространственными координатами комплекса между антителом, например, таким как Fab фрагмент, и его антиге- 11 037844 ном, термин паратоп в данном описании, если не указано иное или если это не противоречит смыслу, специфически определяется как остатки антигена, характеризующиеся наличием тяжелого атома (например, неводородного атома) с расстоянием 4А от тяжелого атома в TREM-1.

Эпитоп и паратоп для данной пары антитело (АЬ)/антиген (Ag) можно идентифицировать стандартными методами. Например, общее расположение эпитопа можно определить, анализируя способность антитела связываться с различными фрагментами или вариантами TREM-1 полипептидов. Специфические аминокислоты в пределах TREM-1, которые вступают в контакт с антителом (эпитоп), и специфические аминокислоты на антителе, которые вступают в контакте с TREM-1 (паратоп), можно также определять стандартными методами. Например, антитело и молекула-мишень могут соединяться и может кристаллизоваться комплекс Ab:Ag. Кристаллическую структуру комплекса можно решать и использовать для идентификации специфических сайтов взаимодействия между антителом и его мишенью.

Антитела, которые связываются с одним и тем же антигеном, можно характеризовать с точки зрения их способности связываться с их общим антигеном одновременно и можно их подвергать конкурентному связыванию /сортировке (в общие корзины по степени связывания). В данном контексте термин сортировка относится к методу группировки антител, которые связываются с одним и тем же антигеном. Сортировка антител может быть проведена на основании конкурентного связывания двух антител с их общим антигеном в обычных анализах, например, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR, НИР), ELISA (ИФА) или проточная цитометрия.

Корзину антитела определяют, используя эталонное антитело. Если второе антитело не способно связываться с антигеном в то же самое время, что и эталонное антитело, то говорят, что второе антитело лежит в той же корзине (принадлежит к той же группе), что и эталонное антитело. В этом случае эталонное и второе антитело конкурентно связываются с одной и той же частью антигена и обозначаются термином конкурентные антитела. Если второе антитело способно связываться с антигеном в то же самое время, что и эталонное антитело, то говорят, что второе антитело лежит в отдельной корзине. В этом случае эталонное антитело и второе антитело не осуществляют конкурентное связывание с одним и тем же участком антигена и именуются неконкурентными антителами.

Сортировка, группировка антител не дает непосредственного представления об эпитопе. Конкурентные антитела, т.е. антитела, принадлежащие к одной и той же корзине, могут иметь идентичные эпитопы, перекрывающиеся эпитопы или даже разные эпитопы. Носледние бывают в том случае, когда эталонное антитело, связанное с его эпитопом на антигене, занимает место, необходимое для контакта второго антитела с его эпитопом на антигене (пространственные затруднения). Неконкурентные антитела обычно имеют различные эпитопы.

Антитело по изобретению может конкурировать с mAb 0170 за связывание с человеческим TREM1. Антитело по изобретению может конкурировать с mAb 0170 за связывание с TREM-1 яванского макака. Другими словами антитело по изобретению может принадлежать к той же корзине, что и mAb 0170.

Термин аффинность связывания в данном контексте относится к количественному определению эффективности ковалентного взаимодействия между двумя молекулами, например между антителом или его фрагментом и антигеном. Термин аффинность связывания применяется для описания одновалентных взаимодействий (собственной активности).

Аффинность связывания двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена, посредством взаимодействия одновалентных частиц можно определять количественно путем определения равновесной константы диссоциации (KD). В свою очередь, KD можно определять посредством количественного определения кинетики образования и диссоциации комплексов, например, методом SPR. Константа скорости реакции, соответствующая ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называют константой скорости ассоциации k_a (или ko_n) и константой скорости диссоциации kd (или koff) соответственно. KD относится к k_a и к kd согласно уравнению KD=kd/k_a.

Согласно приведенному выше определению аффинность связывания, ассоциированную с различными молекулярными взаимодействиями, например сравнение аффинности связывания различных антител для данного антигена, можно проводить посредством сравнения значений K_D для отдельных комплексов антитело/антиген.

Антитело по изобретению может связывать человеческий TREM-1 с аффинностью (K_D), которая составляет 1х10^-7М или менее, 1х10^-8М или менее, или 1х10^-9М или менее, или 1х10^-10М или менее, 1х10^-11М или менее, 1х10^-12М или менее или 1х10^-13М или менее, что установлено методом поверхностного плазмонного резонанса. Антитело по изобретению может связывать TREM-1 яванского макака с аффинностью (K_D), составляющей 1х10^-7М или менее, 1х10^-8М или менее, или 1х10^-9М или менее, или 1х10^-10М или менее, 1х10^-11М или менее, 1х10^-12М или менее, или 1х10^-13М или менее, по определению методом поверхностного плазмонного резонанса.

Термин специфичность связывания в данном контексте относится к взаимодействию молекулы, например антитела или ее фрагмента, с одним единственным антигеном или с ограниченным числом высокогомологичных антигенов (или эпитопов). Напротив, антитела, способные специфически связываться с TREM-1, не способны связывать молекулы разного характера. Антитела по изобретению могут не об- 12 037844 ладать способностью связывать Nkp44, белок (рецептор), связанный с естественной киллерной клеткой p44.

Специфичность взаимодействия и значение равновесной константы связывания можно определять непосредственно общеизвестными методами. Стандартные анализы по определению способности лигандов (например, таких как антитела) связывать их мишени известны в уровне техники и включают, например, анализы ELISA, вестерн-блоттинг, RIA (РИА) и анализ методом проточной цитометрии. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно определять стандартными анализами, такими как SPR (поверхностный плазмонный резонанс, НИР).

Можно проводить анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, например, таким как другое антитело.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматриваются композиции и препараты, содержащие молекулы по изобретению, например, такие как антитела к TREM-1, полинуклеотиды, векторы и клетки, описанные в данной заявке. Например, в изобретении предусматривается фармацевтическая композиция, которая содержит одно или более антител к TREM-1 по изобретению, приготовленных вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Соответственно одной целью изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей такое антитело к TREM-1, которое присутствует в концентрации от 10 до 200 мг/мл, и при этом указанная композиция имеет pH от 2.0 до 10.0, например pH от 4.0 до 8.0. Препарат может также содержать одну или более буферную систему, консервант, агент, регулирующий тоничность, хелатирующий агент, стабилизатор и/или поверхностно-активное вещество (ИВА), а также различные их комбинации. Применение консервантов, изотонических агентов, хелатирующих агентов, стабилизаторов и ИВА в фармацевтических композициях хорошо известно специалисту. Можно сделать ссылку на справочник Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

Согласно одному варианту фармацевтический препарат представляет собой водный препарат. Такой препарат обычно представляет собой раствор или суспензию, но может также включать коллоиды, дисперсии, эмульсии и многофазные материалы. Термин водный препарат (состав) определяется как препарат, содержащий по меньшей мере 50 вес.% воды. Аналогично, термин водный раствор определяется как раствор, содержащий по меньшей мере 50 вес.% воды, а термин водная суспензия определяется как суспензия, содержащая по меньшей мере 50 вес.% воды.

Согласно другому варианту фармацевтический препарат представляет собой лиофилизированный препарат, к которому врач или пациент перед употреблением добавляет растворители и/или разбавители.

В другом аспекте фармацевтический препарат содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл или выше, и указанный препарат имеет pH от примерно 2.0 до примерно 10.0, например pH от 4.0 до 8.0.

Антитела к TREM-1 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, могут применяться для лечения воспалительных заболеваний, таких как приведенные ниже, включая воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), синдром раздраженного кишечника, ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатический артрит, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, диабет типа I, болезнь Грейвса (базедову болезнь), рассеянный склероз (MS), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическую болезнь сердца, хроническую обструктивную болезнь легких, интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермию, системную склеродермию, остеоартрит, атопический дерматит, витилиго, болезнь трансплантат-против-хозяина, синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, аллергию, астму и другие аутоиммунные заболевания, которые являются результатом либо острого, либо хронического воспаления.

Антитела к TREM-1 по изобретению могут быть пригодны для применения при терапии субъектов с воспалительным заболеванием кишечника. Воспалительное заболевание кишечника (IBD) представляет собой заболевание, которое может поражать любой участок желудочно-кишечного тракта от языка до ануса, вызывая широкий ряд симптомов. Прежде всего IBD вызывает боль в области живота, диарею (которая может быть кровавой), рвоту и потерю в весе, но может также вызывать осложнения вне желудочно-кишечного тракта, например кожную сыпь, артрит, воспаление глаза, повышенную утомляемость и снижение концентрации. Пациентов с IBD можно разделить на два основных класса: пациентов с язвенным колитом (UC) и пациентов с болезнью Крона (CD). CD обычно включает подвздошную кишку и толстую кишку, она может поражать любой участок кишечника, но часто является не сплошной (сосредоточенной на областях заболевания по всему кишечнику). UC всегда включает прямую кишку (толстую кишку) и имеет большую протяженность. При CD воспаление является трансмуральным, приводя к абсцессам, свищам и сужениям, тогда как при UC воспаление обычно ограничивается слизистой оболочкой. Фармацевтические средства, а также хирургические методы лечения болезни Крона неизвестны, тогда как некоторые пациенты с UC могут быть вылечены путем хирургического удаления ободочной (толстой) кишки. Варианты лечения ограничиваются контрольными симптомами, поддержанием ремиссии и предупреждением возврата болезни. Эффективность лечения воспалительного заболевания кишечника в

- 13 037844 клинике можно количественно определять как уменьшение величины (в баллах) индекса активности болезни Крона (CDAI) для CD, который определяется по шкале баллов на основании лабораторных тестов и на основании Опросника по качеству жизни. На животных моделях эффективность измеряется главным образом увеличением веса, а также индексом активности заболевания (DAI), который представляет собой комбинацию показателей, характеризующих консистенцию стула, вес и наличие крови в кале.

Антитела к TREM-1 по изобретению могут быть пригодны для применения при лечении субъектов с ревматоидным артритом. Ревматоидный артрит (RA) является системным заболеванием, которое поражает почти весь, если не весь, организм и является одной из наиболее распространенных форм артрита. Это воспаление сустава, которое вызывает боль, скованность, разогревание, покраснение и отек. Это воспаление является результатом инвазии суставов воспалительными клетками, и эти воспалительные клетки высвобождают ферменты, которые могу расщеплять кость и хрящ. В результате это воспаление может привести к тяжелому поражению кости и хряща и к разрушению хряща и вызывать сильную боль, наряду с прочими физиологическими эффектами. Вовлеченный сустав может терять свою форму и правильное положение, что приводит к боли и потере подвижности.

Имеется несколько животных моделей для ревматоидного артрита, известных в уровне техники. Например, на модели коллагениндуцированного артрита (CIA) у мышей развивается воспалительный артрит, который похож на ревматоидный артрит у людей. Так как CIA имеет аналогичные RA иммунологические и патологические признаки, это делает его подходящей моделью для скрининга на потенциальные противовоспалительные соединения для терапии человека. Эффективность на этой модели количественно определяют уменьшением отечности суставов. Эффективность действия (препарата) на RA в клинике количественно определяют способностью уменьшить симптомы у пациентов, которая измеряется как комбинация показателей, отражающих отек сустава, скорость оседания эритроцитов, уровни Cреактивного белка и уровни сывороточных факторов, таких как антитела к цитруниллированным белкам.

Антитела к TREM-1 по изобретению могут быть пригодны для применения при лечении субъектов с псориазом. Псориаз представляет собой опосредуемое T-клетками воспалительное заболевание кожи, которое может вызвать значительный дискомфорт. Это заболевание, для лечения которого в настоящее время нет средства и оно поражает людей всех возрастов. Хотя субъекты с легким течением псориаза часто могут контролировать свое заболевание с помощью местнодействующих средств, более чем одному миллиону пациентов по всему миру требуется лечение с помощью ультрафиолетового излучения или системная иммуносупрессивная терапия. К сожалению, неудобство и повышенный риск ультрафиолетового излучения и токсичность многих препаратов ограничивают их продолжительное применение. Более того, у пациентов обычно наблюдается рецидив псориаза, и в некоторых случаях возобновление симптомов наблюдается вскоре после прекращения иммуносупрессивной терапии. Разработанная в последнее время модель псориаза на основе переноса CD4+ T клеток имитирует многие аспекты псориаза человека и, следовательно, может быть использована для идентификации соединений, подходящих для применения в терапии псориаза (Davenport et al., Internal Immunopharmacol 2:653-672, 2002). Эффективность на этой модели количественно определяют уменьшением патологических явлений на коже, используя систему подсчета баллов. Аналогично эффективность у пациентов количественно определяют уменьшением патологических явлений на коже.

Антитела TREM-1 по изобретению могут быть пригодны для применения в терапии субъектов с псориатическим артритом. Псориатический артрит (PA) представляет собой тип воспалительного артрита, который возникает в подгруппе пациентов с псориазом. У этих пациентов патологические изменения кожи/симптомы сопровождаются отеком суставов, аналогичным отеку суставов, наблюдаемому при ревматоидным артрите. Для них характерны пятнистые выпуклые красные воспаленные участки кожи с образованием псориатических чешуек. Псориаз часто поражает верхушки локтей и коленей, волосистую часть головы, пупок и области вокруг гениталий или ануса. Примерно у 10% пациентов с псориазом также наблюдается связанное с ним воспаление суставов.

Термин терапия, лечение в данном контексте относится к лекарственной терапии любого нуждающегося в этом человека или другого животного субъекта. Предполагается, что указанный субъект прошел объективное обследование практикующего врача или ветеринара, поставившего предварительный или окончательный диагноз, который предписывает, что применение указанной терапии является благотворным для здоровья указанного человека или другого животного субъекта. Продолжительность и цель указанной терапии могут меняться от одного субъекта к другому в зависимости от многих факторов, например, таких как состояние здоровья субъекта в данный момент. Так, указанная терапия может быть профилактической, паллиативной, симптоматической и/или лечебной.

Что касается настоящего изобретения, то профилактическая, паллиативная, симптоматическая и/или лечебная терапия могут представлять отдельные аспекты изобретения.

Антитело по изобретению можно вводить парентерально, например внутривенно, внутримышечно, подкожно. Или же антитело по изобретению можно вводить непарентеральным способом, например перорально или местно. Антитело по изобретению можно вводить профилактически. Антитело по изобретению можно вводить терапевтически (при необходимости).

Первый аспект изобретения основан на наблюдении, что замена отрицательно заряженных остатков

- 14 037844 областей CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 (вариабельная область легкой цепи mAb 0170) влияет на вязкость mAb. В этом первом аспекте изобретения mAb по изобретению представляет собой вариант mAb 0170, имеющий тяжелую цепь и легкую цепь, причем легкая цепь mAb 0170, а именно SEQ ID NO: 3, содержит мутации, в которых отрицательно заряженные остатки в областях CDR1 и CDR3 SEQ ID NO: 3 заменены на незаряженные остатки. Соответственно один аспект изобретения относится к варианту mAb 0170, содержащему замену любого остатка или любой комбинации остатков D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 из SEQ ID NO: 3 на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Иными словами, представляющий интерес вариант изобретения относится к антителу или его фрагменту, содержащим SEQ ID NO: 2 (или ее вариант) в качестве тяжелой цепи, а в качестве легкой цепи содержащим вариант SEQ ID NO: 3, в котором любой остаток или любая комбинация остатков D1, D30, D33, D74, D98, E27, E97 из SEQ ID NO: 3 заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Эти мутации именуются charge patch мутациями. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере один или оба остатка из E27 и E97 областей CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 заменены на незаряженные аминокислотные остатки, такие как аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Согласно предпочтительному варианту такая аминокислота выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина. Согласно предпочтительному варианту остаток E27 областей CDR1 и CDR3 SEQ ID NO: 3 заменен на глутамин, а остаток E97 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина. Согласно другому варианту остаток E27 остается неизмененным, а остаток E97 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина. Согласно другому варианту остаток E97 остается неизмененным, а остаток E27 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, более предпочтительно на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глутамина.

Другой аспект изобретения основан на наблюдении, что димеры Fab-Fab образовались в результате взаимодействий в области паратопа. Так как mAbs содержит два фрагмента Fab, было предположено, что mAbs будут способны к мультимеризации, которая может оказывать влияние на вязкостные свойства. Таким образом, следующий аспект изобретения направлен на изменение остатков в области взаимодействия Fab-Fab SEQ ID NO: 2 (а именно в вариабельной области тяжелой цепи mAb 0170) для снижения Fab-Fab димеризации. В данном контексте эти мутации называются мутациями по типу Fab-Fab взаимодействие. Соответственно один аспект изобретения относится к замене любого из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, А59, M102, I104 и R106 из SEQ ID NO: 2 или F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 из SEQ. ID NO 3 на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина. Иными словами представляющий интерес вариант изобретения относится к антителу или его фрагменту, содержащим вариант SEQ ID NO: 2, в котором любой из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, А59, M102, I104 и R106 последовательности SEQ ID NO: 2 или F32, D33, Y34, Y53, R54, D98 последовательности SEQ. ID NO 3 (мутации Fab-Fab взаимодействия) заменены на другую аминокислоту, такую как природная аминокислота, предпочтительно на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина. Предпочтительно по меньшей мере один из остатков А59 и N57 из SEQ ID NO: 2 заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина. Согласно одному варианту остаток А59 остается неизмененным, а остаток N57 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина. Согласно другому варианту остаток N57 остается неизмененным, а остаток А59 заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина. Согласно по меньшей мере одному варианту как остаток А59, так и остаток N57 заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина.

В представляющем интерес варианте i) по меньшей мере один из заряженных остатков областей CDR1 и CDR3 из SEQ ID NO: 3 заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, и ii) по меньшей мере один из остатков Y32, R52, S55, S56, N57, А59, M102, I104 и R106 из SEQ ID NO: 2 или F32, D33,

- 15 037844

Y34, Y53, R54, D98 из SEQ. ID NO 3 (мутации по типу Fab-Fab взаимодействие) заменен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина, лизина, аргинина и триптофана, гистидина и тирозина.

Согласно соответствующему варианту один или оба из остатков E27 и E97 последовательности SEQ ID NO: 3 заменен/заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина и тирозина, и один или оба из остатков А59 и N57 последовательности SEQ ID NO: 2 заменен/заменены на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, аланина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, цистеина лизина, аргинина, триптофана, гистидина и тирозина, более предпочтительно из серина или тирозина.

Другой аспект изобретения основан на наблюдении, что замена на Ala в положении Y 90 последовательности SEQ. ID NO 1 TREM-1 повышала аффинность SEQ. ID NO 3 к TREM-1. Было найдено, что Y90 взаимодействует с фенилаланиновым остатком последовательности SEQ ID NO: 3. Мутации SEQ ID NO: 3 с целью повысить эффективность взаимодействия Fab-TREM-1 называются мутациями по типу Fab-TREM-1 взаимодействие. Согласно одному варианту данного аспекта изобретения фенилаланин в положении 32 в SEQ ID NO: 3 заменен на аминокислоту, выбранную из аминокислотных остатков глицина, серина, треонина, цистеина, аланина, валина, лейцина, изолейцина и метионина, предпочтительно выбранную из аланина, глицина, серина, валина и лейцина. Согласно интересующему варианту изобретения остаток F32 в SEQ ID NO: 3 заменен на аланин или серин.

Мутации charge patch в CDR1 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 уменьшали гидродинамический радиус (Rh), тогда как мутации в области Fab-Fab взаимодействия увеличивали Rh (фиг. 6). Мутации в сайте Fab-TREM-1 взаимодействия не влияли на Rh и оказывали очень небольшое влияние на вязкость (фиг. 6 и 1, табл. 3C и 3E).

Таблица 1

Обзор полученных вариантов SEQ ID NO (0170) mAb

	mAb ID	Содержат последовательность ID No.	Мутация(-и) в SEQ ID NO: 2 или 3	Цепь
Мутации Charge patch	0317	SEQ ID NO: 4 и 2	E27Q, E97S	L
0318	SEQ ID NO: 5 и 2	E27Q, E97Q	L
0319	SEQ ID NO: 6 и 2	E97S	L
0320	SEQ ID NO: 7 и 2	E97Q	L
0321	SEQ ID NO: 8 и 2	E27Q	L
Мутации Fab-Fab взаимодействия	0324	SEQ ID NO: 11 и 3	A59Y	H
0325	SEQ ID NO: 12 и 3	N57S	H
0326	SEQ ID NO: 13 и 3	A59Y,N57S	H
Мутации Fab-TREM1 взаимодействия	0322	SEQ ID NO: 9 и 2	F32A	L
0323	SEQ ID NO: 10 и 2	F32S	L
Мутации Charge patch и Fab-TREM-1 взаимодействия	0330	SEQ ID NO: 14 и 2	F32A, E27Q, E97Q	L
Мутации Charge patch и Fab-Fab взаимодействия	0332	SEQ ID NO:: 15 и 5	A59Y/E27Q, E97Q	H/L
Charge patch, Fab-TREM1 взаимодействие и FabFab взаимодействие	0333	SEQ ID NO: 14 и 16	A59Y/F32A, E27Q, E97Q	H/L

L - легкая цепь, Н - тяжелая цепь.

Вязкость для mAb 0170 вариантов определяли, используя DLS (динамическое рассеяние света) или микрореологию (структурную реологию), и показали, что как мутации charge patch, так и мутации Fab-Fab взаимодействия снижали вязкость. Было найдено, что mAb вариант 0318, который содержит charge patch мутации E27Q и E97Q, имеет самую низкую вязкость.

Определяли кинетику связывания вариантов mAb 0170 соответственно с TREM-1-Fc человека и с TREM-1-Fc яванского макака. Было обнаружено, что все варианты mAb 0170 обладают сходной аффинностью к человеческому TREM-1-Fc. Интересно отметить, что было найдено, что mAb вариант, SEQ ID NO: 9, содержащий мутацию Fab-TREM-1 взаимодействия обладает повышенной аффинностью к TREM-1-Fc яванского макака (табл. 2).

Таблица 2

Аффинность анти-TREM-1 mAb вариантов к TREM-1-Fc человека и TREM-1-Fc яванского макака соответственно

TREM-l-Fc человека	TREM-l-Fc яванского макака
mAb	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD(nM)	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD(hM)
0170	3E+06	5E-04	0.1	0.3E+06	4E-04	2
0317	4E+06	6E-04	0.2	0.3E+06	7E-04	3
0318	3E+06	7E-04	0.2	0.3E+06	7E-04	2
0319	4E+06	6E-04	0.2	0.3E+06	6E-04	2
0320	4E+06	7E-04	0.2	0.2E+06	6E-04	3
0321	3E+06	6E-04	0.2	0.3E+06	6E-04	2
0322	3E+06	3E-04	0.1	0.6E+06	IE-04	0.1
0323	2E+06	6E-04	0.3	0.4E+06	2E-04	0.6
0324	3E+06	8E-04	0.3	0.2E+06	6E-04	4
0325	4E+06	3E-04	0.08	0.2E+06	6E-04	1
0326	3E+06	7E-04	0.2	0.2E+06	3E-04	5
0330	2E+06	3E-04	0.1	0.6E+06	7E-05	0.1
0332	3E+06	IE-03	0.4	0.2E+06	8E-04	4
0333	2E+06	5E-04	0.3	0.4E+06	IE-04	0.3

- 16 037844

Согласно одному варианту, обладающему как повышенной аффинностью к TREM-1, так и низкой вязкостью, мутации из SEQ ID NO: 9 объединяли с мутациями в SEQ ID NO: 5, чтобы получить легкую цепь из SEQ ID NO: 14, и мутации из легкой цепи из SEQ ID NO: 14 объединяли также с мутациями в тяжелой цепи из SEQ ID NO: 16. Повышенная аффинность к TREM-1-Fc яванского макака сохранялась у mAb вариантов, содержащих совместные мутации из SEQ ID NO: 14 и мутации, которые не оказывают негативного влияния на аффинность к человеческому TREM-1-Fc. Соответственно варианты изобретения, содержащие как charge patch мутации, так и мутации Fab-TREM-1 взаимодействия, предусматриваются в настоящем изобретении, также, как варианты изобретения, содержащие мутации charge patch и мутации Fab-Fab взаимодействия, также, как варианты изобретения, содержащие как мутации Fab-Fab взаимодействия, так и мутации Fab-TREM-1 взаимодействия, и варианты изобретения, включающие мутации Fab-Fab взаимодействия, мутации Fab-TREM-1 взаимодействия и charge patch мутации.

Таблица 3A

Вязкость в зависимости от концентрации белка для mAb 0170, 0317 и 0318___________

mAb
0170	0317	0318
Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)
100.0	26.0	85.0	2.9	85.0	1.9
80.0	14.5	63.8	2.2	63.8	1.9
60.0	6.0	42.5	1.9	42.5	2.0
40.0	3.1	17.0	1.3	17.0	1.2
20.0	1.6	10.2	1.2	10.2	1.2
12.0	1.3	3.4	1.1	3.4	1.2
4.0	1.1	0.0	1.0	0.0	1.0
0.0	0.9

Таблица 3B

Вязкость в зависимости от концентрации белка для mAb 0319, 0320 и 321___________

mAb
0319	0320	0321
Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/ мл)	Вязкость (сП)
85.0	2.2	107.0	7.8	106.0	5.9
63.8	2.3	80.3	3.7	79.5	3.0
42.5	2.0	53.5	2.5	53.0	2.0
17.0	1.2	26.8	1.6	26.5	1.6
10.2	1.1	13.4	1.3	13.3	1.2
3.4	1.1	6.7	1.2	6.6	1.1
0.0	1.0	3.3	1.1	3.3	1.1
		0.0	1.0	0.0	0.9

Таблица 3C

Вязкость в зависимости от концентрации белка для mAb 0322, 0323 и 324.___________

mAb
0322	0323	0324
Концентрация белка (мг/мл) 100.0 75.0 50.0 25.0 12.5	Вязкость (сП) 16.4 4.9 3.3 2.0 1.6	Концентрация белка (мг/мл) 101.0 75.8 50.5 25.3 12.6	Вязкость (сП) 21.3 11.3 3.7 2.6 2.0	Концентрация белка (мг/мл) 103.0 77.3 51.5 25.8 12.9	Вязкость (сП) 5.4 3.1 2.2 1.6 1.4
6.3	1.4	6.3	1.4	6.4	1.3
3.1	1.3	3.2	1.2	3.2	1.2
0.0	1.0	0.0	1.0	0.0	0.9

- 17 037844

Таблица 3D

Вязкость в зависимости от концентрации белка для mAb 0325, 0326 и 0330

mAb
0325	0326	0330
Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)	Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)
95.0	7.8	109.0	7.5	104.5	3.8
71.3	3.7	81.8	3.1	50.5	2.1
47.5	2.3	54.5	2.2	23.9	1.4
23.8	1.6	27.3	1.6	9.4	1.3
11.9	1.3	6.8	1.5	4.7	1.1
5.9	1.3	3.4	1.1	1.9	1.1
3.0	1.2	0.0	0.9	1.0	1.3
0.0	1.0

Таблица 3E

Вязкость в зависимости от концентрации _____белка для mAb 0332 и 0333_____

ш.
0332
Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)
114.1	5.9
53.6	2.1
22.2	2.2
9.0	2.2
4.6	1.8
1.9	1.2
1.1	1.1

АЬ
0333
Концентрация белка (мг/мл)	Вязкость (сП)
113.2	5.2
47.1	2.1
24.9	2.0
9.0	1.8
4.5	1.5
1.8	1.6
0.9	1.4

Неограничивающие варианты по настоящему изобретению включают также:

1. Антитело или его фрагмент, способные связываться с и блокировать TREM-1 последовательности SEQ ID NO: 1, характеризующееся тем, что антитело или фрагмент указанного антитела имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 50 мг/мл, как например, менее 4 сП, предпочтительно менее 3 сП (при этом способ определения вязкости в зависимости от концентрации представляет собой стандартный способ или способ по данному описанию).

2. Антитело или его фрагмент, способные связываться с и блокировать TREM-1, характеризующиеся тем, что антитело или фрагмент указанного антитела имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 80 мг/мл, как например, менее 4 сП (при этом способ определения вязкости в зависимости от концентрации представляет собой стандартный способ или способ по данному описанию).

3. Антитело или его фрагмент согласно вариантам 1 или 2, которые блокируют TREM-1 функцию с KD к SEQ ID NO: 1 менее 0.5 нМ, как например, менее 0.4 нМ, предпочтительно 0.3 нМ или менее.

4. Антитело или его фрагмент, которые конкурируют с mAb 0170 за связывание с SEQ ID NO: 1 и имеют такой профиль вязкости, при котором:

(a ) антитело или фрагмент указанного антитела имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 50 мг/мл, как например, менее 4 сП, предпочтительно менее 3 сП; или (b ) антитело или фрагмент указанного антитела имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 80 мг/мл, предпочтительно менее 4 сП.

5. Антитело или его фрагмент, способные специфически связываться с и блокировать TREM-1, при этом антитело или его фрагмент имеют мутации Fab-Fab взаимодействия из SEQ ID NO: 2.

6. Антитело или его фрагмент, способные специфически связываться с и блокировать TREM-1 с SEQ ID NO: 1, при этом антитело или его фрагмент имеют мутации charge patch, такие, что по меньшей мере один из отрицательно заряженных остатков в областях CDR1 и CDR3 из SEQ ID NO: 3 заменен на незаряженные остатки.

7. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, в которых отрицательно заряженные аминокислоты заменены на аминокислотные остатки, которые могут образовывать водородные связи с партнерами, например, такие как в случае мутации остатка Asp и Glu в любой из остатков Asn, Gln, Ser и Thr.

8. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, имеющие пониженную вязкость по сравнению с mAb 0170, но тем не менее имеющие KD к SEQ ID NO: 1 ниже 0.5 нМ.

9. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, имеющие пониженную вязкость по сравнению с mAb 0170, mAb 0170, K_D к SEQ ID NO: 1 менее 0.5 нМ и K_D к SEQ ID NO: 17 менее 0.6 нМ, в результате замены незаряженных аминокислот из SEQ ID NO: 2 и/или 3, участвующих в специфических Fab-Fab взаимодействиях, на аминокислоты измененного размера или с возможностью

- 18 037844 связывания водородной связью.

10. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, которые способны специфически связываться с и блокировать TREM-1 с последовательностью SEQ ID NO: 1 и содержат варианты из SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или обеих, при этом варианты выбраны из группы, состоящей из мутаций Fab-Fab взаимодействия, мутаций Fab-TREM-1 взаимодействия и мутаций charge-patch последовательностей SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

11. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, содержащие мутации FabTREM-1 взаимодействия, например, такие, в которых остаток Phe из SEQ ID NO: 3 заменен на Ala или Ser.

12. Антитело или его фрагмент по любому из вариантов изобретения, которые конкурируют с SEQ ID NO: 2 или 3 за связывание с SEQ ID NO: 1 и которые имеют эпитоп, содержащий один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или все из аминокислотных остатков D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 и L45 и один, два или все из аминокислотных остатков E46, K47, F48 из последовательности SEQ ID NO: 1.

13. Антитело или его фрагмент согласно любому из вариантов изобретения, которые конкурируют за связывание с SEQ ID NO: 3 и содержат LC, в которой один или оба остатка глутамата (E) в положениях 27 и 97 последовательности SEQ ID NO: 3 заменены на серин (S) или глутамин (Q), как в случае E27Q, E97S, или при этом оба остатка, E27 и E97, заменены на глутамин, или остаток E27 остается неизмененным, а остаток E97 заменен на S (E27, E97S), или остаток E27 остается неизмененным, а остаток E97 заменен на Q (E27, E97Q), или остаток E97 остается неизмененным, а остаток E27 заменен на Q или S, более предпочтительно на Q (E27, E97Q).

14. Антитело или его фрагмент согласно любому из вариантов изобретения, содержащие последовательность SEQ ID NO: 3, в которой фенилаланин в положении 32 (F32) заменен, например заменен на A (mAb 0322) или на S (mAb 0323).

15. Антитело или его фрагмент согласно любому из вариантов изобретения, содержащие последовательность SEQ ID NO: 2, в которой один или оба остатка, N57 и А59, заменены, например, таким образом, что остаток А59 заменен на тирозин, или остаток N57 заменен на серин, или таким образом, что остаток N57 заменен на серин, а остаток А59 заменен на тирозин.

16. Антитело или его фрагмент, содержащие вариант SEQ ID NO: 2, в котором незаряженные аминокислоты, участвующие в специфических Fab-Fab взаимодействиях, заменены на аминокислоты измененного размера или с возможностью связывания водородной связью, как например, в случае, когда аланин (A) или аспарагин (N) заменены на любой из остатков Ser, Thr, Phe, Tyr и Trp.

17. Антитело или его фрагмент, которые содержат вариант SEQ ID NO: 3 и которые конкурируют за связывание с SEQ ID NO: 3, где один или оба остатка глутамата (E) в положениях 27 и 97 последовательности SEQ ID NO: 3 заменены на серин (S) или глутамин (Q), например, при этом оба остатка, E27 и E97, заменены на глутамин (318), или при этом остаток E27 остается неизмененным, а остаток E97 заменен на S (E27, E97S), или при этом остаток E27 остается неизмененным, а остаток E97 заменен на Q (E27, E97Q), или при этом остаток E97 остается неизмененным, а остаток E27 заменен на Q или S, более предпочтительно на Q (E27, E97Q).

18. Антитело или его фрагмент, которые содержат вариант SEQ ID NO: 2 и которые конкурируют за связывание с SEQ ID NO: 2, где один или оба остатка, остаток N57 и остаток А59, изменены, например, при этом остаток А59 заменен на тирозин, или при этом остаток N57 заменен на серин, или при этом остаток N57 заменен на серин, а остаток А59 заменен на тирозин.

19. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 4.

20. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 5.

21. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 6.

22. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 7.

23. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 8.

24. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 9.

25. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 10.

26. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 11.

27. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 12.

28. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 13.

29. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 14.

30. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 15.

31. Антитело или его фрагмент, содержащие SEQ ID NO: 16.

32. Антитело или его фрагмент, содержащие любую из SEQ ID NOs: 4-16.

33. Композиция, содержащая антитело по определению в любом из вариантов 1-32.

34. Антитело по изобретению, такое как в вариантах 1-32, для применения в качестве лекарственного средства.

35. Антитело по изобретению, такое как в вариантах 1-32, для применения в терапии заболевания, выбранного из воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания.

36. Антитело согласно варианту 35, при этом заболевание выбрано из группы, состоящей из ревма-

- 19 037844 тоидного артрита и воспалительного заболевания кишечника.

37. Применение антитела по изобретению, такого как в соответствии с любым из вариантов 1-32, для приготовления лекарственного средства для терапии заболевания, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания или из аутоиммунного заболевания.

38. Применение согласно варианту 35, где заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита и воспалительного заболевания кишечника.

39. Способ терапии заболевания, выбранного из воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания, включающий введение антитела по изобретению (такого как антитело согласно любому из вариантов 1-32), композиции, содержащей антитело по изобретению, или лекарственного средства, содержащего антитело по изобретению.

Примеры

Пример 1. Гидродинамический радиус и вязкость mAb0170 вариантов.

Было найдено, что гидродинамический радиус mAb0170 из Международной заявки WO 2013/120553 больше (9-10 нм), чем нужный (5-6 нм). Гидродинамический радиус определяли методом динамического рассеяния света, используя 96-луночный планшет с планшет-ридером DynaPro (Wyatt Inc.). Использовали аналитические планшеты Corning 3540 (Corning). Общий объем образца был примерно 20 мкл, а температуру поддерживали 25°C для mAb0170 вариантов (фиг. 6).

Мутации charge patch в CDR1 и CDR3 вариабельной области легкой цепи уменьшали Rh до уровня, ожидаемого для мономерных mAbs, тогда как мутации в области Fab-Fab взаимодействия, по-видимому, увеличивали Rh. Мутации в сайте Fab- TREM-1 взаимодействия не влияли на Rh.

Вязкость для mAb0170 вариантов 0317, 0318, 0319, 0320, 0321, 0322, 0323, 0324, 0325, 0326 и 0330 определяли методом DLS. Гидродинамический радиус измеряли на планшет-ридере Wyatt DynaPro Platereader, используя черные с прозрачным дном необработанные микропланшеты из полистирола Corning 3540 и обычные наносферы из полистирола от компании Phosphorex Inc. со средним диаметром 206.5 нм (номер по каталогу 106). Образцы белков переносили на планшет Corning 3540 и сверху плотно закрывали. Образцы центрифугировали и гидродинамические радиусы образцов белка измеряли на Wyatt DynaPro DLS планшет-ридере. В каждую лунку добавляли 0.5 мкл полистирольных гранул и осторожно перемешивали с помощью пипетирования. Планшет снова центрифугировали и гидродинамический радиус гранул измеряли на Wyatt DynaPro DLS планшет-ридере.

Вязкость образцов белка рассчитывали по формуле

Вязкость (белок) = (гидродинамический радиус (гранулы, измер.) * вязкость (буфер))/гидродинамический радиус (гранулы, действ.), где вязкость (белок) обозначает расчетную вязкость раствора белка, гидродинамический радиус (гранулы, измер.) обозначает измеренный гидродинамический радиус полистирольных гранул в растворе белка, вязкость (буфер) обозначает вязкость буфера и гидродинамический радиус (гранулы, действ.) обозначает действительный средний диаметр гранул [He et al., Anal Biochem, 399, 141-143, 2010].

Вязкость определяли методами микрореологии для mAb0170 вариантов 0332 и 0333. Для реологического анализа использовали шприц Гамильтон LT на 250 мкл (Hamilton-Bonaduz Inc), соединенный с иглой 30G Новофайн (Novofine). Шприц помещали в изготовленный по заказу алюминиевый держатель, закрепленный на платформе. Поршень шприца приводился в движение с помощью анализатора текстуры TAXTPlus Texture Analyzer, который измерял результирующую силу давления на поршень при заданной скорости инъекции. Каждый образец испытывали при трех различных скоростях инъекции. Скорость поршневой головки и измеряемую силу применяли для расчета скорости сдвига и напряжения сдвига соответственно. Вязкость можно выражать в зависимости от скорости сдвига формулой

Пбелка = Tw/γ = (APD/4L)/((32QX^D³)) где п_белка обозначает вязкость раствора белка, γ обозначает кажущуюся (эффективную) скорость сдвига, t_w обозначает напряжение сдвига, P обозначает давление в результате движения поршня, Q обозначает скорость потока жидкости при прохождении через капиллярную иглу, a D и L обозначают внутренний диаметр и длину капилляра соответственно (Allahham et al., 2004; Intl J Pharm 270, 139-148). Вязкость, п_белка, рассчитывали, используя известные значения D, L и Q и измеренное значение P.

Анализ показал, что как мутации charge patch, так и мутации Fab-Fab взаимодействия снижали вязкость (фиг. 1). Было обнаружено, что mAb вариант SEQ ID NO: 5, который содержит charge patch мутации E27Q и E97Q, имеет самую низкую вязкость.

Пример 2. Кинетика mAb0170 вариантов.

Определялась кинетика связывания mAb 0170 вариантов с TREM-1-Fc человека и TREM-1-Fc яванского макака соответственно. Исследование связывания проводили на анализаторе ProteOn (BioRad), который количественно определяет молекулярные взаимодействия в реальном времени методом поверхностного плазмонного резонанса. Эксперименты проводили при 25°C и образцы хранили при 15°C в камере для образцов. Сигнал (RU, единицы ответа) анализатора ProteOn непосредственно коррелирует с массой на поверхности индивидуального сенсорного чипа в шести параллельных проточных кюветах. Моноклональное античеловеческое Fc-антитело или поликлональное антимышиное Fc-антитело из наборов

- 20 037844

Biacore иммобилизованных человеческих или мышиных Fc помещали в горизонтальном направлении на проточных кюветах GLM сенсорного чипа согласно инструкциям производителя. Конечный уровень иммобилизованного антитела составлял примерно 2600-6000 RU в каждом эксперименте. Захват очищенных моноклональных мышиных или рекомбинантно экспрессированных антител к hTREM-1 проводили, разбавляя антитела до концентрации 5-10 нМ подвижным (рабочим) буфером (10 мМ Hepes, 0,15 М NaCl, 5 мМ EDTA, 0.05% ПАВ P20, pH 7.4) с последующим впрыском в вертикальном направлении при скорости потока 30 мкл/мин в течение 60 с, создавая референсные точки пересечения, прилегающие ко всем проточным кюветам с единственным иммобилизованным анти-Fc антителом. В результате обычно получали конечные уровни иммобилизованных тестируемых антител примерно 100-300 RU и значения Rmax аналита 30-90 RU. Связывание hTREM-1 или cTREM-1 белков проводили, впрыскивая аналит (антиген) во все проточные кюветы в горизонтальном направлении, чтобы обеспечить возможность сравнительных анализов связывания с различными иммобилизованными антителами к TREM-1 относительно связывания с референсным interspot. Готовили серийные разведения белков hTREM-1 или cTREM-1 1:3 в концентрации 1.2-100 нМ или в подвижном буфере, инъецируя со скоростью 100 мкл/мин в течение 250 с и оставляя диссоциировать в течение 600 с. Поверхность GLM регенерировали после каждого цикла инъекций аналита посредством двух впрыскиваний по 18 с 10 мМ глицина, pH 1.7, и 50 мМ NaOH при скорости 100 мкл/мин. На этой стадии регенерации с поверхности с иммобилизованным антителом для захвата удаляли антитело kTREM-1 и любой связанный TREM-1 белок и создавали возможность для последующего связывания следующей пары взаимодействующих образцов. В процессе регенерации непосредственно иммобилизованное анти-Fc антитело не удаляли с поверхности чипа.

Аффинность связывания между антителами и антигеном количественно измеряли, определяя равновесную константу диссоциации (KD) посредством кинетических измерений образования и диссоциации комплексов. Константы скорости, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, а именно k_a (скорость ассоциации) и kd (скорость диссоциации), получали аппроксимацией данных к модели Ленгмюра 1:1 с использованием для анализа данных программное обеспечение ProteOn. Соотношение между KD и ka и kd выражается уравнением K_D=kd/ka.

Кривые связывания строили с учетом двух стандартов (вычитание сигналов референсной поверхности, а также контрольных инъекций буферов поверх иммобилизованных антител к TREM-1) перед анализом данных. Это позволяло делать поправку на шум прибора, сдвиг и дрейф массива во время инъекции образца.

Было найдено, что все mAb 0170 обладают аффинностью к человеческому TREM-1-Fc, аналогичной аффинности mAb 0170. Интересно отметить, что mAb варианты, содержащие мутацию Fab-TREM-1 взаимодействия, например mAb 0322, обладали повышенной аффинностью к TREM-1-Fc яванского макака (табл. 2).

Пример 3. Кинетика и вязкость mAb 0330 и mAb 0333.

Для того, чтобы получить mAb, обладающее как повышенной аффинностью к TREM-1 яванского макака, так и низкой вязкостью, мутации из SEQ ID NO 9 комбинировали с мутациями в последовательности SEQ ID NO 5, которая, как было обнаружено, имела самую низкую вязкость среди mAb0170 вариантов, и с SEQ ID NO: 11, которая, как было найдено, оказывала слабое влияние на вязкость. Повышенная аффинность к TREM-1-Fc яванского макака сохранялась для mAb варианта, содержащего комбинированные мутации (mAb 0330 и mAb 0333), и мутации не влияли на аффинность к человеческому TREM1-Fc. Вязкость mAb0330 и mAb 0333 была заметно ниже по сравнению с mAb 0170 из Международной заявки WO 2013/120553 (фиг. 1).

Пример 4. Культивирование стабильной клеточной линии BWZ'36/hTREM-1.

Репортерные клетки BWZ/hTREM-1 культивировали в среде RPMI 1640 без фенола красного (Cat# 11835, Gibco, Carlsbad CA, USA), дополненной 10% FCS (Cat# 16140-071, Gibco, New York, USA), 1% Pen/Strep (Cat# 15070-06, Gibco), 1 мМ пирувата натрия (Cat #11360, Gibco), 5 мкМ -2ME (Cat# 31350010, Gibco) и 2 мМ L-глутамина (Cat # 25030, Gibco). He потребовалось никаких специальных планшетов или покрытия. Добавляли 10 мл раствора Версена (Cat # 15040, Gibco) для отделения клеток (друг от друга), которые затем переносили в пробирки, центрифугировали при 1200 об/мин 5 мин и отмывали в свежей среде RPMI 1640 без фенола красного. После этого эти клетки были готовы для применения в анализе или их рекультивировали для дальнейшего выращивания.

Пример 5. Функциональная характеристика mAb 0170 вариантов.

Способность анти-TREM-1 mAb 0170 вариантов ингибировать передачу сигнала человеческого TREM-1 определяли, используя клеточную линию репортерных клеток (BWZ'36/hTREM-1), предоставленную компанией Bioxell. Клеточную линию репортерных клеток стимулировали PGN и TREM-1 лигандом PGLYRP1 либо в виде рекомбинантного белка, либо экспрессировали с использованием активированных нейтрофилов перед инкубированием с mAbs. Было найдено, что активность вариантов при ингибировании передачи сигнала TREM-1 является клинически релевантной и сравнимой с активностью mAb 0170 из Международной заявки WO 2013/120553 (фиг. 2A и B).

Аналогично определяли способность ингибировать передачу сигнала TREM-1 макака яванского для трех mAb0170 вариантов с самой низкой вязкостью и у двух вариантов наблюдали повышенную аффин- 21 037844 ность к TREM-1 макака яванского. В этом анализе при использовании устойчивой клеточной линии TE

426.27 наблюдали сходную активность mAb вариантов и mAb0170 из Международной заявки WO

2013/120553 (фиг. 3).

Также анализировали активность mAb вариантов при блокировании высвобождения TNFa из первичных клеток от здоровых доноров. В этом анализе моноциты дифференцировали в M2 макрофаги в условиях гипоксии, чтобы повысить экспрессию TREM-1, и активировали с помощью PGN и рекомбинантного PGLYRP1 перед инкубированием с mAb. Было найдено, что mAb варианты обладали такой же активностью, что и 0170, при ингибировании опосредованного TREM-1-высвобождения TNF из M2 макрофагов в условиях гипоксии (фиг. 4).

Пример 6 Кристаллическая структура комплекса Fab 0170-Fab 0170.

Способность молекул mAb 0170 специфически взаимодействовать друг с другом определяли методом PCA (рентгеноструктурного анализа, кристаллографического анализа), анализируя структуру кристалла Fab 0170-Fab 0170.

Материалы: Fab фрагмент антитела mAb 0170 (SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19) в буфере, состоящем из 10 мМ фосфата, 2.68 мМ KCl, 140 мМ NaCl, pH 7.4, с концентрацией белка 8.5 мг/мл.

Методы: Fab фрагмент антитела mAb 0170 кристаллизовали методом висячей капли посредством диффузии в парах путем уравновешивания мелкой капли, состоящей из 2 мкл раствора белка, смешанного с 2 мкл резервуарного раствора против 0.5 мл резервуарного раствора, состоящего из 20% (вес./об.) PEG 8000, 200 мМ K₂HPO₄. Кристалл переносили в каплю, состоящую из 2 мкл 35% (вес./об.) PEG3350, 200 мМ K2HPO4 и заключали в петлю LithoLoop (Molecular Dimensions Limited) диаметром 0.2 мм и мгновенно охлаждали жидким азотом.

Данные рентгеноструктурного анализа (PCA) регистрировали в MAXLAB 911-2, Lund University, Sweden, используя криопоток, воздействующий при 100 K. Первичные данные (изображения) индексировали и изображали в масштабе, используя пакет программ XDS (Kabsch, Acta Crystallogr. D66, 133-144 (2010)). Пространственная группа кристалла P2(1)2(1)2(1) с параметрами элементарной ячейки a=62.4 А, b=110.9 А, c=158.4 А. Данные собирали с разрешением 2.40 А. Структура была решена с помощью молекулярного замещения с применением программного обеспечения Phenix (Adams et al., Acta Crystallogr. D66, 213-221 (2010)), реализуемого в пакете программ CCP4i (Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 11311137 (2003)). Моделями поиска служили структуры тяжелой цепи от pdb entry 1AD0.pdb (85% идентичность) и легкой цепи из pdb entry 2QRG (94% идентичность). Уточнение структуры проводили с применением программы Refmac5 (Murshudov et al., Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997)) из пакета программ CCP4L Программу Coot version 7 (Emsley et al., Acta Crystallogr. D66, 486-501 (2010)) применяли для ручного воспроизведения и подтверждения правильности структуры.

Результаты и подтверждение.

Кристаллическая структура mAb 170 Fab области содержала четыре молекулы Fab в асимметричной элементарной ячейке (тяжелые цепи были помечены A и C, легкие цепи были помечены B и D). Молекулы Fab были упакованы в виде димеров с антигенсвязывающей областью одной молекулы Fab, взаимодействующей с антигенсвязывающей областью другой молекулы Fab. Было невозможно включить и уточнить последний цистеиновый остаток I из SEQ ID NO: 19 в кристаллической структуре, хотя можно было бы ожидать, что он будет связан дисульфидной связью с Cys в SEQ ID NO: 18 из тяжелой цепи. Имелись некоторые указания на избыточную 2Fo-Fc и Fo-Fc электронную плотность в этой области, и возможно, что дисульфидная связь присутствует в подгруппе Fab молекул. На сигма-а взвешенной разностной 2Fo-Fc карте электронной плотности не было значительной электронной плотности для остатков G26, K78-N79, I104-R105 и S138-E141 из SEQ ID NO: 18 в цепи A в асимметричной элементарной ячейке и для E1, G26-F 27, M102-R105, S136-E141, S195-K200 из SEQ ID NO: 18 цепи C в другой молекуле Fab в асимметричной элементарной ячейке. Значительная электронная плотность на сигма-а взвешенной 2FoFc карте отсутствовала также для остатков D30-Y34 из SEQ ID NO: 19 в цепи D. Эти остатки не входили в кристаллическую структуру, но были включены в анализ молекулярного взаимодействия поверхности контакта Fab-Fab посредством наложения с кристаллической структурой фрагмента mAb 0170 из кристаллической структуры раскрываемого в Международной заявке WO 2013/120553 гуманизированного анти-TREM-1 mAb 0170.

Параметры качества структуры mAb 0170 Fab фрагмента следующие: общий R-фактор структуры=24% и свободный R-фактор=30%. Общий коэффициент корреляции 0.93 и индекс точности дифракция-компонент, DPI=0.3 А (Cruickshank, Acta Crystallogr. D55, 583-601 (1999)). Среднее квадратичное отклонение длин связей в структуре от идеальных длин связей=0.025 А и среднее квадратичное отклонение от идеальных углов связей=2.326° (Engh and Huber, Acta Crystallogr. A47, 392-400 (1991)).

Анализ внутримолекулярных расстояний проводили с применением программы NCONT в пакете программ ССР4 (Potterton et al, Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003)) с отсечкой, выключением 4A для внутримолекулярных расстояний (табл. 4). Анализ показал, что аминокислотные остатки N57 и A59 из SEQ ID NO: 2 относятся к группе аминокислот, участвующих в Fab-Fab взаимодействиях в кристаллической структуре.

- 22 037844

Таблица 4

Предсказанные Fab-Fab взаимодействия на основе наложения кристаллической структуры гуманизированного анти-TREM-1 mAb 0170, раскрываемого в Международной заявке WO 2013/120553, на кристаллическую структуру mAb 0170 Fab области по настоящему изобретению.

Исходные аминокислоты, Fab 1 (Цепь А и В)	Целевые аминокислоты, Fab 2 (Цепь С и D)
F32	SEQ ID NO	3	Y32	SEQ ID NO	2
F32	SEQ ID NO	3	Ml 02	SEQ ID NO	2
D33	SEQ ID NO	3	Y53	SEQ ID NO	3
Y34	SEQ ID NO	3	Y34	SEQ ID NO	3
Y34	SEQ ID NO	3	R54	SEQ ID NO	3
D98	SEQ ID NO	3	S55	SEQ ID NO	2
R52	SEQ ID NO	2	S55	SEQ ID NO	2
R52	SEQ ID NO	2	S56	SEQ ID NO	2
S55	SEQ ID NO	2	A59	SEQ ID NO	2
S55	SEQ ID NO	2	R52	SEQ ID NO	2
S56	SEQ ID NO	2	S56	SEQ ID NO	2
N57	SEQ ID NO	2	S56	SEQ ID NO	2
N57	SEQ ID NO	2	N57	SEQ ID NO	2
N57	SEQ ID NO	2	A59	SEQ ID NO	2
А59	SEQ ID NO	2	S55	SEQ ID NO	2
А59	SEQ ID NO	2	S56	SEQ ID NO	2
А59	SEQ ID NO	2	N57	SEQ ID NO	2
1104	SEQ ID NO	2	1104	SEQ ID NO	2
1104	SEQ ID NO	2	RI 06	SEQ ID NO	2
R106	SEQ ID NO	2	F32	SEQ ID NO	3

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (21)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело или его фрагмент, которые способны связываться с TREM-1 и содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащей VH, показанную в SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащей вариант VL, показанный в SEQ ID NO: 3, где вариант VL отличается от VL, показанной в SEQ ID NO: 3, тем, что он содержит глутамин в качестве аминокислоты 27, аланин в качестве аминокислоты 32, серин в качестве аминокислоты 32, серин в качестве аминокислоты 97, глутамин в качестве аминокислоты 97, глутамин в качестве аминокислоты 27 и глутамин в качестве аминокислоты 97, глутамин в качестве аминокислоты 27 и аланин в качестве аминокислоты 32, аланин в качестве аминокислоты 32 и глутамин в качестве аминокислоты 97, глутамин в качестве аминокислоты 27 и серин в качестве аминокислоты 97 или глутамин в качестве аминокислоты 27, аланин в качестве аминокислоты 32 и глутамин в качестве аминокислоты 97.
2. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых аминокислота 27 в варианте VL представляет собой глутамин, а аминокислота 97 в варианте VL представляет собой серин или глутамин.
3. 3. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, в которых одна или обе из аминокислот 27 и 97 в варианте VL представляют собой глутамин.
4. 4. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-3, в которых вариант VL представляет собой VL в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14.
5. 5. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых вариант VL представляет собой VL в SEQ ID NO: 5.
6. 6. Антитело или его фрагмент, которые способны связываться с TREM-1 и содержат VH, содержащей вариант VH в SEQ ID NO: 2, и VL, содержащей VL в SEQ ID NO: 3, где вариант VH отличается от VH, показанной в SEQ ID NO: 2, тем, что он содержит серин в качестве аминокислоты 57 или тирозин в положении 59 или их комбинацию.
7. 7. Антитело или его фрагмент по п.6, в которых вариант VH представляет собой VH в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
8. 8. Антитело или его фрагмент, которые способны связываться с TREM-1 и содержат VH, содержащей вариант VH в SEQ ID NO: 2, и VL, содержащей вариант VL в SEQ ID NO: 3, где вариант VL отличается от VL, показанной в SEQ ID NO: 3, тем, что он содержит глутамин в качестве аминокислоты 27; аланин в качестве аминокислоты 32; серин в качестве аминокислоты 32; серин в качестве аминокислоты 97; глутамин в качестве аминокислоты 97; глутамин в качестве аминокислоты 27 и глутамин в качестве аминокислоты 97; глутамин в качестве аминокислоты 27 и аланин в качестве аминокислоты 32; аланин в качестве аминокислоты 32 и глутамин в качестве аминокислоты 97; глутамин в качестве аминокислоты 27 и серин в качестве аминокислоты 97 или глутамин в качестве аминокислоты 27, аланин в качестве аминокислоты 32 и глутамин в качестве аминокислоты 97; и вариант VH отличается от VH, показанной в SEQ ID NO: 2, тем, что он содержит серин в качестве аминокислоты 57 или тирозин в позиции 59 или их

   - 23 037844 комбинацию.
9. 9. Антитело или его фрагмент по п.8, где антитело или его фрагмент содержит VL в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14, и VH в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
10. 10. Антитело или его фрагмент по п.8, в которых VH содержит VH в SEQ ID NO: 15, a VL содержит VL в SEQ ID NO: 5.
11. 11. Антитело или его фрагмент по п.8, где VL содержит VL в SEQ ID NO: 14, a VH содержит VH в тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 16.
12. 12. Антитело по любому из пп.1-11, которое содержит константную область.
13. 13. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-12, характеризующееся тем, что антитело или его фрагмент имеют вязкость менее 5 сП при концентрации 80 мг/мл.
14. 14. Фармацевтическая композиция для уменьшения воспалительного ответа, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. 15. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент по любому из пп.1-13.
16. 16. Клетка для получения антитело или его фрагмент, содержащая полинуклеотид по п.15.
17. 17. Способ получения антитела или его фрагмента, которые способны связываться с TREM-1, включающий культивирование клетки по п.16 в подходящих условиях и очищение антитела или его фрагмента от клеток.
18. 18. Способ лечения или профилактики связанного с воспалением аутоиммунного заболевания или хронического воспаления у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-13.
19. 19. Способ лечения или профилактики связанного с воспалением аутоиммунного заболевания или хронического воспаления у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение фармацевтической композиции по п.14.
20. 20. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-13 при получении лекарственного средства для лечения связанного с воспалением аутоиммунного заболевания или хронического воспаления у нуждающегося в этом субъекта.
21. 21. Применение фармацевтической композиции по п.14 при получении лекарственного средства для лечения связанного с воспалением аутоиммунного заболевания или хронического воспаления у нуждающегося в этом субъекта.