JPH07503124A

JPH07503124A - 微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体

Info

Publication number: JPH07503124A
Application number: JP5501038A
Authority: JP
Inventors: ホーウィッツ，アーノルド・エイチ; ベター，マーク・ディー; キャロル，スティーブ
Original assignee: ゾーマ・コーポレーション
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-15
Publication date: 1995-04-06
Also published as: EP0590067A1; CA2110799A1; WO1992022324A1; AU2238292A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体本発明は、組換えＤＮＡ操作と微生物発酵によって抗体Ｆ（ａｂ’）＝およびＦａｂ゛断片を生産する方法と、免疫複合体を含むタンパク質複合体の調製にそれらを使用する方法に関する。

背景技術の簡単な説明モノクローナル抗体技術の開発は研究、診断および治療的応用で使用される抗体の増大をもたらしている。これらの抗体の多くはマウスハイブリドーマに由来する。このような非ヒト抗体は、その免疫原性ゆえにヒトにおけるインビボ診断薬や治療剤としての使用には問題が多いものであり得る。このことは、これらの産物を長期間にわたる反復処置に使用する場合にはとりわけ重要な要件である。

マウス抗体免疫原性の問題に対する１つの回答は、組換えＤＮＡ技術を用いて、マウスＶ領域をコード化する遺伝子配列がヒト定常領域をコード化する遺伝子配列に融合しているマウス−ヒトキメラ抗体を作成することである（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、＾ｄｖ。

Ｉ＋ｏｉ＋ｎｏ１．４４：６５−９２（１９８９）に概略が記されている）。マウスに由来する抗体の部分的な「擬人化」に加えて、容易なりラス転換を可能にすべく、キメラ抗体を生産するために使用される技術と同じ遺伝子工学技術を用いることもできる（Ｓｈａｍら、Ｊ。

Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　８０：１５５３（１９８８））。

そのままの抗体として、あるいは放射性核種、薬物および毒素などの治療的に有効な物質と結合したものとして、腫瘍転移のインビボ診断（即ち腫瘍の画像化）と治療にこれらの抗体を使用する技術の開発が、様々な腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の作成と加工に伴ってきた。しかし、そのすべてがマウスに由来するか、それともマウス−ヒトキメラであるかにかかわらず、全抗体は、より大きな腫瘍浸透性、より少ない肝臓相互作用またはより迅速な排除時間が望まれるいくつかの診断的応用および／または治療的応用にとって不都合であり得る。そのかわりに、抗原結合サブユニットから構成されるが、エフェクター機能を含有する領域（Ｆｃ）を欠＜Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）ｚなどの抗体断片は、動物モデル（Ｃｏｌａｐｉｎｔｏら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：５７０１（１９８８）　ＨＷａｈｌら、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、２S二３１６（１９８３））とヒトの臨床研究（Ｄｅｌａｌｏｙｅら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７７：３０１（１９８６））において有効であることが立証されている。全抗体のタンパク質加水分解消化によって生成するこれらの断片は、画像化により高い腫瘍／血液比を与え、治療的応用においては全抗体より深い腫瘍への浸透を促進することが示されている。

ヒンジ領域内の鏡開ジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂユニットからなるＦ（ａｂ’）２分子は全抗体によって達成される結合親和性を保持している。複合体化していないＦ（ａｂ’）２分子は有用な治療剤であり得、免疫抑制モデルにおいて全抗体に等しいか、それ以上の効能を持つことが示されている（Ｃａｒｔｅｒａｎら、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ、　５６　：３７３−３８３（１９９０）およびＨｉｒｓｃｈら、　Ｔｒ≠獅唐垂撃≠獅狽≠■ ｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　２３：２７０−２７１（１９９１））。さらに、Ｆ（ａｂ’：ｈの免疫複合体は、画像化への応用にとって、あるいは腫瘍への治療剤の送達にとって、全抗体を含有するものより優れていることもある（Ｃｏｌａｐｉｎｔｏ、上記；　Ｄｅｌａｌｏｙｅ、上記；　Ｗａｈｌ、上記）。

また、温和な還元条件を用いることによって個々の抗原結合ユニット（Ｆ　ａ　ｂ’）を分離することができるのでＦ（ａｂ’）２分子は有用である（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、Ｉ關ｕｎ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　０ｘｆｏｒｄ）、　５２頁（１９８２））。得られるＦａｂ’断片は活性なスルフヒドリル基を含有し、標識や他の臨床的または実験的に有用な分子の共有結合にこれを用いることができる。これらは、異なる特異性を有する個々のＦａｂ’ユニットからなるヘテロニ官能性Ｆ（ａｂ’）２分子の構築にとっての出発点としても機能し得る。このようなヘテロニ官能性Ｆ（ａ　ｂ“）２分子の例には腫瘍抗原に対する特異性を放射性核種にとってのキレート剤と組み合わせたものや、抗原とＦｃ受容体に対する特異性を組み合わせたものが含まれる。

いくつかの臨床的に重要な抗体と、それらのＦ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ断片は細胞毒性有機化合物、タンパク質毒素および放射性核種との免疫複合体として使用されている（Ｙａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８５：　１１８９（１９８８）　；　Ｂｌａｋｅ凾轣A　Ｆｒｏｇ、＾ｌｌｅｒｇｙ　１１５：５０（１９８８）　；　Ｄｅｌａｌｏｙｅら、上記）。典型的１：ハ、分子中ノリシン残基ヲ修飾するＮ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの二官能性架橋試薬で最初に誘導体化されている抗体分子のりジン残基に架橋試薬を結合させる。

我々は最近、サツカロミセス・セレビシｘ　（Ｈｏｒｗｉｔｚら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：８６７８−８６８２（１９８８））と大腸菌（Ｂｅｔｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４３（１９８８））か■ の分泌によって遺伝子的に加工されたＦａｂ断片を生産する２つの系について記述した。微生物が生産するＦａｂ分子はある種の試薬を開発する際の出発点として有用であるが、それらは全抗体またはＦ（ａｂ’）ｚと同程度の結合親和性を保持しない。さらにＦａｂ断片はＦａｂ’の特異的チオール複合化特性を欠いている。

Ｆ（ａ　ｂ’）２を生産する現在の方法には全抗体のペプシン消化が含まれる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、上記、　５３−５５）。この方法にはいくつかの理由で問題があり得る。第１に、ペプシン切断に対する感受性はすべての抗体において等価であるわけではない。第２に、ペプシンによる消化は非還元ゲルで分析した場合には明らかになり得ない断片の部分的分解をもたらし得る。最後に、全抗体の精製に加えて追加の精製段階が必要である。

Ｆ（ａｂ’）２分子の直接的生産へのアプローチは加工された動物細胞を用いて行われてきた。Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４（１９８４））は、免疫グロブリン分泌エクソンからの２１アミノ酸尾部を含有するようにＦｄ’遺伝子を修飾することによって、Ｆ（ａｂ’）２様断片の生産に成功した。Ｂｏｄｍｅｒら（Ｗ０８９０１７８３（１９８９））はＣＯ５細胞からＦａｂ’のみを得て、次いでそれを会合させてＦ（ａ　ｂ’）２を形成させ得ることを報告した。また、Ｇ１１ｌｉｅｓら（ＨｕＩｌｌ、　Ａｌｔｉｂｏｄ、取りｒｉｄ　１：４７（１９９０））は動物細胞からＦ（ａｂ’）、断片を直接生産する試みに失敗した。動物細胞中でそれらを生産する際に伴う困難を考慮すれば、細菌または酵母などの微生物によって、正しい折り量りおよび会合状態で機能的なＦ（ａｂ’）ｘ分子を直接生産し得るかどうかは予期できないことである。

Ｆａｂ’断片はチオール指向性の複合化にとって有用であり、Ｆ（ａｂ’）２断片の選択的還元によって作成し得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、上記、　５３−５５）。しかし、Ｆ（ａｂ’）ｚの選択的チオール還元によって作成されるＦａｂ’ は、古典的な酵素法によって作成されるＦ（ａｂ’）ｚについて上述した課題と同じ課題を有し得る。

したがって機能的なＦ（ａｂ’）ｚとＦａｂ’分子を微生物から直接的に生産する方法を確立する必要性は高い。また、効果的な免疫複合体の作成にそれらを使用するための条件を確立する必要もある。本発明は驚くべきことに、微生物がそのような抗体断片を分泌し得ることを立証する。活性なＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’免疫複合体とへテロニ官能性Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の生産にそれらを使用する方法を配本発明は全抗体の完全な結合親和性を保持するＦ（ａｂ’：ｈなどの免疫グロブリン断片を提供する。また本発明は、ポリペプチド部分および化学的部分に対する便利で選択的なチオール複合化という有用な特性を持つＦａｂ’などの免疫グロブリン断片を提供する。これらの断片は、無傷の組換えＦ（ａ　ｂ ’Ｍｒ　Ｆ（ａ　ｂ’）２）と組換えＦａｂ”（ｒＦａｂ’）断片を分泌するように加工された細菌や酵母などの微生物から直接的に生産される。この生産系は、追加の段階を有し、しばしば切れ目の入った抗体断片や部分的に分解した抗体断片を与える従来のタンパク質加水分解法より有利である。軽鎖−Ｆｄ鎖ジスルフィド結合のカルボキシル側に１または２システイン残基をコード化するキメラ・マウス可変−ヒト定常免疫グロブリンＩｇＧ１重鎮遺伝子（Ｆｄ）の先端欠失型を示す様々な遺伝子構築物を詳述する。これらの修飾された遺伝子をベクター中で組み立て、相同なキメラ軽鎖遺伝子をも発現する細菌または酵母に導入した。発酵ブロスからの精製によって無傷のＦ（ａｂ’）２分子とＦａｂ’分子を回収した。

微生物が生産したＦ（ａｂ’）ｚ分子をリシン重鎮などのタンパク質毒素と複合化して免疫毒素を形成させる方法を提供する。これらの免疫毒素は、ｒＦ（ａ’ ｂ’）２作成の標準的な技術によって導入されるタンパク質加水分解的な切れ目がもたらす不均質性のレベルが減少している点で有利である。これらの免疫毒素は、それらが高親和性結合を与え、ｒＦ（ａｂ’）２分子がマクロファージや免疫系の他の細胞による非特異的な取り込みを引き起こし得るＦｃ受容体を欠いている点でも有利である。

微生物発酵に由来する精製されたｒ　Ｆ（ａ　ｂ’）２断片とｒＦａｂ’断片は遮断されたシスティンチオール基を有し、それゆえにＦａｂ’のチオール複合化のためにはシスティンを脱遮断する方法の発見が必要であった。本発明は、Ｆｄに対する軽鎖の鏡開ジスルフィド結合を還元することなく、Ｆｄのカルボキシ末端に最も近いシスティン残基（単数または複数）の選択的な還元を達成する還元試薬と条件を提供する。これらの還元されたＦａｂ’断片を、遊離のチオール基と反応する他のタンパク質、ポリペプチドまたは化学部分に複合化する。

本発明は、ジスルフィド結合を形成させるに足る酸化条件下で遊離のチオールを含有する第２のポリペプチドと混合することによる、還元したＦａｂ’断片の複合化法を提供する。還元されたＦａｂ’断片が同様に還元されたＦａｂ’断片に成功裏に複合化して、ホモニ量体または二官能性へテロ二量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子を形成し得ることを実施例に示す。遊離のチオール基を含有する他の有用なタンパク質をＦａｂ’断片に同様に複合化して混成機能分子を形成させることができる。

また本発明は、活性化された免疫グロブリン断片の管理された複合化を達成するために、還元された微生物的に生産されるＦａｂ’断片の化学修飾法をも提供する。還元されたＦａｂ’断片の遊離のチオールをジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）などの活性化部分と反応させ、活性化されたＦａｂ’を遊離のチオールを含むポリペプチドと混合する。これはＦａｂ−リシン毒素Ａ分子や二官能性へテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２分子などの混成機能分子を形成する効率のよい複合化をもたらす。

図面の簡単な説明図１（ａ）はＩｇＧの構造の物理的な表記である。それぞれＦ（ａｂ’）ｚとＦａｂ断片を生成させる時に使用するパパインとペプシンのエンドペプチダーゼ切断の位置を示しである。鎖内ジスルフィド結合と鏡開ジスルフィド結合の両方の位置を示し、さらに重鎮上のタンパク質ドメインＶＨ，ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３並びに軽鎖上のＶＬとＣＬをも示す。

図１（ｂ）はＦ（ａ　ｂ’）ｚ、！：Ｆ　ａ　ｂ’の生産に使用されるＦｄ’モジュールヒンジ領域のＤＮＡ配列とそれに対応するペプチド配列を表す。

図２は重鎮間システィンの１または両方を伴うＦｄ’をコード化する遺伝子配列を含有するモジュールの構築法を表している。正確な縮尺で描かれたものではない。

図３は２つの重鎮間システィンと２９アミノ酸を伴うＦｄ’をコード化する遺伝子モジュールの構築法を表す。この構築法によれば、カルボキン末端アミノ酸はＡｓｐである（この位置は通常はＧｌｕである）。正確な縮尺で描かれたものではない。

図４は、ＰＧＫプロモーター（Ｐ）、インベルターゼシグナル配列（Ｓ）およびＰＧＫポリアデニル化信号（Ｔ）に融合した様々なＦｄ’とＩＮＧ−４キメラ軽鎖を含有する最適化された酵母発現プラスミドの構築法を表す。正確な縮尺で描かれたものではない。

図５は、酵母由来のＩ　ＮＧ−４Ｆ（ａ　ｂ’）２と、ＩＮＧ−４ＩｇＧのペプシン消化によって生成したＩ　ＮＧ−４’　Ｆ（ａ　ｂ’）２の結合阻害を表す。抗原陽性ＨＴ２９結腸癌腫細胞の表面に対するビオチニル化したＩＮＧ−４ＩｇＧの結合を阻害するために、酵母によって生成したｒ　ＮＧ−４Ｆ（ａ　ｂ’ ）２と、ペプシンによって生成したＩ　ＮＧ−４Ｆ（ａ　ｂ’）２を、ＩＮＧ− ４ＦａｂおよびＩｇＧと共に使用した。

ビオチニル化したＩｇＧを競合する抗体の存在下で４℃でＨＴ２９腫瘍細胞と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、さらにアビジン−ペルオキシダーゼと共に室温でインキュベートした。細胞に結合したペルオキシダーゼをＯＰＤ試薬で可視化し、その０Ｄ４９０を用いて阻害の程度を決定した。

図６は、１または２つの重鎮間システィンを伴うＦｄ’鎖とＨ６５キメラ軽鎖をコード化する遺伝子配列を含有する細菌発現プラスミドの構築法を表す。各遺伝子をＥ、　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　ｐｅｌＢリポソーム結合部位とシグナル配列に融合した。これらを互いに融合し、大腸菌中で選択するためのｔｅｔＲ遺伝子を含有するプラスミド中のｔｒｐ転写終結配列とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下においた。正確な縮尺で描かれたものではない。

図７は細菌から分泌される様々なキメラＨ６５ＦａｂおよびＦａｂ’分子のＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を表す。密度測定法で走査したゲルの領域を記す。

図８はｐＸＯＭｌ（Ｈ６５ＶＨ）のＤＮＡ配列を表す。ＡＴＧ開始コドンからＪＫ／ＣＫ連結部までを含むヌクレオチド配列が示されている。この領域の予想アミノ酸配列も示されている。太字で記載されている部分は、Ｖ−Ｊ領域を増幅するためにＰＣＲプライマーが結合した領域である。

図９はｐＸＯＭ２（Ｈ６５ＶＬ）のＤＮＡ配列を表す。ＡＴＧ開始コドンからＪＫ／ＣＫ連結部までを含むヌクレオチド配列が示されている。この領域の予想アミノ酸配列も示されている。太字で記載されている部分は、Ｖ−Ｊ領域を増幅するためにＰＣＲプライマーが結合した領域である。

図１０は４Ａ２カツパＶ領域のＤＮＡ配列を表す。ＡＴＧ開始コドンからＪＫ／ＣＫ連結部までのヌクレオチド配列が示されている。この領域の予想アミノ酸配列も示されている。太字で記載されている部分は、Ｖ−Ｊ領域を増幅するためにＰＣＲプライマーが結合した領域である。

図１１は４Ａ２ガンマＶ領域のＤＮＡ配列を表す。ＡＴＧ開始コドンからＪＨ／ＣＨ連結部までのヌクレオチド配列が示されている。この領域の予想アミノ酸配列も示されている。太字で記載されている部分は、■−Ｊ領域を増幅するためにＰＣＲプライマーが結合した領域である。

図１２は４Ａ２キメラ軽鎖とＦｄ’鎖をコード化する遺伝子配列を含有する細菌発現プラスミドの構築法を表す。各遺伝子をＥ、　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　ｐｅｌＢリポソーム結合部位とシグナル配列に融合した。これらを互いに融合し、大腸菌中で選択するためのｔｅｔＲ遺伝子を含有するプラスミド中のｔｒｐ転写終結配列とＳａｌ＋ｏｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｉ　ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下においた。正確な縮尺で描かれたものではない。

図１３はＨ２Ｓ抗体と断片から調製したりシンＡ鎖免疫複合体によって媒介される細胞毒性を表す。ヒトのＴ細胞系Ｈ８Ｂ２を、リシン毒素Ａ（ＲＴＡ）鎖に複合化したＨ６５マウス抗体（−０−）か、リシン毒素３０ｋｄ　Ａ（ＲＴＡ３０）鎖に複合化していない（−△−）か、もしくはこれに複合化した（−−）キメラＨ６５Ｆａｂ’にさらした。酸で沈殿し得る放射能中に取り込まれるロイシンの百分率によって細胞の生存能を決定した。

図１４は、様々なＨ２Ｓ抗体および断片免疫複合体によって媒介される休止（パネルａ）およびフィトヘマグルチニン活性化（パネルｂ）ヒト末梢血液単核細胞の細胞毒性を表す。試験した試料は、５−メチル−２−イミノチオランによってＲＴＡ３０に連結したＨ６５マウス抗体（−〇−）と、ＲＴＡ３０に連結したキメラＨ６５Ｆａｂ’（−口−）である。さらなる対照として、ＲＴＡ３０に連結したＩＮＤ２抗体（−△−）とＲＴＡ３０単独（−◇−）を含めた。

鵠本発明の説明を明解にするために以下の定義を行う。

用語「Ｖドメイン」は、Ｋａｂａｔら、　ｒＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔＪ　（第４版、米国保健社会福祉省、　Ｎ　Ｉ　Ｈ）（１９ｇ？）によって示されているように、免疫グロブリン軽鎖の可変領域ポリペプチド配列を表す。

用語ｒＣＬドメイン」は、Ｋａｂａｔら（上記）によって示されているように、免疫グロブリン軽鎖の定常領域ポリペプチド配列を表す。

用語ｒｃＨ１ドメイン」は、Ｋａｂａｔら（上記）によって示されているように、■ドメインのカルボキシ側にある免疫グロブリン重鎮の第１定常領域ポリペプチド配列を表す。

用語「ヒンジドメイン」は、Ｋａｂａｔら（上記）によって示されているように、ＣＨ１ドメインのカルボキシル側にある免疫グロブリン重鎮の定常領域ポリペプチド配列を表す。

用語ｒｒＦａｂ’Ｊは、鏡開ジスルフィド結合によって連結された無傷の軽鎖と先端が欠失した重鎮を含有する抗原結合性免疫グロブリン断片またはその等価物であって、軽鎖−Ｆｄ鎖鏡開スルフィド結合のカルボキシル側にあるヒンジドメイン内に少なくとも１つのシスティン残基を含む。

用語ｒＦａｂ’Ｊは組換え法によって生産されるＦａｂ’を表す。

用語ｒＦ（ａｂ’）ｚＪは、軽鎖−Ｆｄ鎖鏡開スルフィドのカルボキシル側にあるヒンジドメイン内のシスティン残基が関与する少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されたＦａｂ’分子の二量体を表す。

用語ｒ　ｒ　Ｆ（ａ　ｂ’）ｘＪは組換え法によって生産されるＦ（ａｂ’）ｚを表す。

用語ｒＦｖＪは、軽鎖および重鎮のＶドメインのみを含有する抗原結合性免疫グロブリン断片またはその等価物を表す。

用語ｒＦｄ’ＪはＦａｂ’分子の重鎮を表す。

用語ｒＲＴＡＪはりシン毒素Ａ鎖を表す。

用語ｒＲＴＡ３０Ｊ　は！Ｊレシン素ＡのＭｒ３ｏｏｏｏ型を表す。

従来のアミノ酸番号付与が左から右に向かってなされ、従来からアミノ末端が左に示され、カルボキシル末端が右側であるとの認識により、「最も高い残基番号を伴うシスティン残基」という用語は最も高いアミノ酸番号を伴うシスティン残基であり、換言すれば、カルボキシ末端に最も近いシスティンである。

用語「チオール含有活性部分」は、活性なスルフヒドリル基を含有する免疫グロブリンＦａｂ’分子、酵素、ポリペプチド、放射性核種および有機または無機化合物を表す。

用語「培養培地」は、細胞を培養または成長させるための栄養溶液を表す。このような培地を構成する成分は培養すべき細胞の種類に応じて変化し得る。栄養組成に加えて、重量オスモル濃度とｐＨも培養培地の重要な変数と見なされる。

用語「腫瘍関連抗原」は本発明のＦａｂ’またはＦ（ａｂ’）２によって認識される抗原を保持する腫瘍を表す。腫瘍関連抗原の具体例は欧州特許出願第８７３０６００号に開示されている。

好ましい態様の説明免疫グロブリン断片をコード化する様々な遺伝子が本発明によって提供される。

好ましい遺伝子は軽鎖と重鎮の両方をコード化し、少なくとも活性な免疫グロブリンＦｖ結合ドメインを与えるべく、軽鎖と重鎮について完全な可変領域を保持する。さらに、重鎮および軽鎖遺伝子は、免疫グロブリンＦｖ結合ドメイン内に位置しない少なくとも１つのシスティン残基を有する追加のペプチド配列をコード化する。これらのペプチド配列は、軽鎖についてはＣＬ（カッパまたはラムダ）領域であり、Ｆｄ鎖についてはＣＨＩおよびヒンジ領域であることが好ましい。

上記の遺伝子を宿主に適した分泌シグナル（細菌宿主についてはペクチン酸リアーゼ・シグナルペプチドなどであり、酵母宿主については酵母インベルターゼ・シグナルペプチドなどである）に連結することが好ましい。

本発明の好ましい態様は、Ｆａｂ’断片分子をコード化する完全な軽鎖遺伝子と先端が欠失した重鎮遺伝子（Ｆｄ）によって形質転換された宿主である。これらの分子は自発的に組み立てられてＦ（ａｂ’）ｉ断片になることができる。軽鎖のＣＬとＦｄ鎖のＣＨＩおよびヒンジドメインをコード化する遺伝子配列は、あらゆるイソタイプのヒトまたは非ヒト免疫グロブリンから誘導することができる。ヒトのインビボ使用にはヒトのＣＬ、ＣＨＩおよびヒンジドメインが好ましく、これらは非ヒトドメインよりもヒトの身体への適合性が高い。本発明は、ヒトＩｇＧ１イソタイプ配列をＣＨＩとヒンジドメインの供給源として使用することを例示する。ヒトＩｇＧ１イソタイプについては、軽鎖Ｆｄジスルフィド結合のカルボキシル側のＦｄ上ヒンジ域内に１（好ましくは２）以上のシスティン残基を含めることによって、微生物発酵からの均質なＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’ 分子の精製が増進される。２つのシスティン残基のカルボキシル側にポリペプチド尾が続いてもよい。

本発明の実施範囲内で他の免疫グロブリン断片を作成することができる。例えば、軽鎖のカルボキシ末端側にポリペプチド配列を付加することによって、Ｆａｂ様分子の軽鎖上に選択的に還元し得るシスティン残基を置くことができる。本発明のもう１つの態様は、部分的欠失を用いて、少なくとも１つのＦａｂ領域を含有し、ヒンジドメイン内に選択的に還元し得るシスティン残基を有する修飾された免疫グロブリンを作成するべく、重鎮遺伝子を修飾することである。本発明のもう１つの態様は、追加のポリペプチド領域（単数または複数）（ここに追加される該ポリペプチドは選択的に還元し得るシスティン残基（単数または複数）をコード化する）をコード化する配列を軽鎖または重鎮（もしくはその両方）に含ませることによって、Ｆｖ断片遺伝子を修飾することである。

本発明のＦ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’断片は様々な宿主細胞から生産することができる。好ましい宿主は細菌と酵母である。細菌である大腸菌と酵母であるＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてベクターを例示する。様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種やＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕａ＋または５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどのグラム陰性菌、グラム陽性菌、他の酵母およびカビ、植物、昆虫および動物細胞を含む他の宿主を本発明の実施において使用することができる。宿主に関する好ましい特性には、工業的な発酵およびバイオリアクターで実質的に成長させ得ることと、無傷の免疫グロブリン断片の分泌が可能であることが含まれる。Ｆ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’断片を製造する方法は、培養培地で宿主細胞を培養し、次いで、好ましくは発酵ブロスから細胞を除去した後に、そのブロスから活性な断片を単離することである。

複合化に用いられるシスティン残基の選択的な還元に有用な還元剤にはジチオスレイトール、システィン、ベーターメルカプトエタノールなどが含まれる。実施例に示すように、所望の選択的還元を達成するためには異なる濃度の還元剤が必要であろう。Ｆａｂ’分子が１つのジスルフィド結合で結合している細菌または酵母から分泌されるＦ（ａｂ’）２分子については、２．０ｍＭのシスティンが１つの重鎮−重鎮ジスルフィド結合を還元し、これが好ましい。しかし２．０ｍＭのシスティンは２つのヒンジ領域重鎮−重鎮ジスルフィド結合を還元するには不十分であり、これらの結合は選択的な還元に約５．０〜１５．０ｍＭのシスティンを必要とする。

細菌または酵母から分泌されるＦａｂ’分子については、所望のヒンジ領域システィン残基（単数または複数）が小分子量付加物で遮断される。約１１〜２．０ｍＭ濃度のジチオスレイトールか、約５．０〜１５．０ｍＭ濃度のシスティンでの還元によってこれらの残基を脱遮断することができる。

選択的に還元されたＦａｂ’断片を、酵素および非酵素ポリペプチド、Ｆａｂ’ 断片、放射性核種および他の化合物などの有用なチオール含有部分に複合化することができる。ある方法では、選択的に還元されたＦａｂ’分子を酸化条件下において、ジスルフィドで連結したＦ（ａｂ’）ｚ断片を形成させる。第２の方法では、ジチオビスにトロベンゾエート）、ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）などの活性化化合物とのジスルフィド交換でジスルフィド形成を指向する優れた脱離基を生成させることによって、Ｆａｂ’分子を反応させる。ヘテロニ官能性Ｆ（ａ　ｂ’）２またはＦａｂ’−酵素などのへテロ複合体を形成させるために、次いで、活性化したＦａｂ’をチオール含有部分と反応させる。

ヘテロ複合体形成の代替法は、Ｆａｂ’チオールとの反応性がある官能基を有するリンカ−化合物（例えばマレイミドなど）と還元したＦａｂ“分子の反応によってＦａｂ−リンカ−複合体を形成させることである。次にＦａｂ’−リンカ− 複合体を有用な活性部分と反応させてヘテロ複合体を形成させる。一般にあらゆるスルフヒドリル連結化合物を用いることができる。例えばリンカ−化合物がＳ −アセチル官能基を伴ってもよい。Ｆａｂ−リンカ−（Ｓ−アセチル）を、適当な化合物（例えばジチオビスにトロベンゾエート）またはジチオビス（ピリジン −Ｎ−オキシド））で既に活性化されているチオール含有酵素または他のポリペプチドと反応させる。このようなヘテロ複合体は活性部分に対するジスルフィド結合を有する。

リンンＡ鎖などの細胞毒性酵素とのＦａｂ’−酵素へテロ複合体については、最大細胞毒性活性のためにジスルフィド結合が好ましい。他の使用については、活性部分に対してジスフィト以外の結合を形成するリンカ−化合物を使用することができる。このような使用には例えばＦａｂ’−複合体の安定性を増大させるためのチオエーテル結合が含まれる。

本発明はホモ二量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子とへテロニ量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の両方を提供する。ホモ二量体Ｆ（ａｂ’）ａは二官能性結合を伴う単一の特異性が望まれる場合に好ましい。二特異的なヘテロニ量体Ｆ（ａｂ’）ｚ断片はへテロニ官能性抗体の別個の結合機能が望まれる場合に好ましい。ヘテロニ量体Ｆ（ａｂ’）、は、より良い組織浸透性とＦｃ−受容体細胞相互作用の最少化が望まれる場合に有利であり得るその小さい分子量とＦｃ領域の欠如の点で、既知の二特異的抗体よりも好ましい。本発明はへテロニ量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の異なる形成法をも提供する。ある方法では異なる特異性を伴うＦ（ａｂ’）ｘまたはＦａｂ’をまず還元して一価のＦａｂ’型にする。次にそれらを混合して酸化することによりヘテロニ量体Ｆ（ａ　ｂ“）２を形成させるか、当該技術分野で知られているリンカ−化合物と反応させ、次いで混合し、反応させてＦ（ａｂ’）ｚを形成させる。もう１つの方法は、本発明のベクターと宿主を用いて２つの異なるＦａｂ’分子をコード化する遺伝子を同じ宿主細胞内で別個に発現させることである。次いでヘテロニ量体Ｆ（ａｂ’）ｘを発酵培養から精製することができる。

微生物が生産したＦ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’分子に酵素を複合化して、治療的用途や診断的用途を持つ免疫複合体を形成させることができる。治療的に有用な酵素の例には、治療的に標的化した細胞の殺傷を達成するためのリポソーム阻害剤リシンＡ鎖などのタンパク質毒素と、前駆薬剤の活性薬剤（シュードモナス毒素、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））への変換によって治療的効果を達成するためのアルキル性ホスファターゼなどの他の酵素が含まれる。このようなＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’−酵素複合体をインビトロ診断検定法に用いて、当該技術分野で知られている免疫検定法と同様の方法で基質を検出可能な形態に変換することもできる。

本発明の活性化したＦａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）ｚ断片を、インターロイキン−２、表皮成長因子、免疫グロブリンＦｃ領域などの細胞受容体と相互作用する酵素でないポリペプチドに複合化することができる。このような分子は、細胞を活性化して所望のエフェクター機能（例えば標的にした細胞の選択的な活性化または殺傷）を達成し、それによって治療効果を得るうえで有用であろう。

リンカ−化合物（例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））や、好ましくは立体的に嵩高いリンカ−（例えば置換２−イミノチオラン（Ｇｏｆｆら、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ、　１：３８１−３８６（１９９０））によるアミノ酸残基の誘導体化に依存している現存の方法によって、酵素または他のポリペプチドにＦ（ａｂ’）ｚ断片を複合化することができる。リンカ−化合物の他の例は米国特許第４９７０３０３号に認めることができる。次に誘導体化したＦ（ａ　ｂ’）ｚをチオール含有ポリペプチドと反応させて安定な複合体を形成させる。

Ｆａｂ’分子のシスティンチオール（単数または複数）に複合化することができるポリペプチドまたは酵素の数と配置は、選択的に還元し得るシスティン残基の数と配置によって制限される。システィンの好ましい位置は、Ｆａｂ’の結合活性を規定し、それを遂行する可変領域から離れている。選択的に還元し得るシスティンの数は、目標とする複合化を達成し、結合活性による酵素活性の妨害を避けるために、１から約１０個までであり、好ましくは２個である。

機能的に誘導体化されたＦ（ａｂ’）ｚまたは選択的に還元されたＦａｂ’を、Ｆａｂ’に所望の第２機能を付与する化学的な部分（放射性核種および有機化合物）に複合化することもできる。そのような化合物には、トリコテセンなどの細胞毒性化合物や、ジエチルレントリアミンベンタ酢酸（Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ）などの金属キレート剤、ダウノルビシン、ドクソルビシン、メトトレキセート、ミドマイシンＣおよび当該技術分野で知られている他の化合物が含まれる。Ｇｏｏｄｍａｎら、　ｒＧｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉ１ｍａｎ’　ｓ　Ｔ）（Ｅ　ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＢＡＳＩＳ　ＯＦ　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳＪ　（第７版、　Ｍ≠モ高奄撃撃奄■ ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　（１９８３））を参照のこと。放射性核種の例にはＨ２１３ｉ、ｉｌ）、＋１＋６Ｒｅおよび９０Ｙが含まれるが、この列挙は総括的なものではない。また、選択的に還元されたＦａｂ’を、当該技術分野で知られている方法によっていくかの診断用または治療用放射性核種（例えば９９Ｔｃや１８６Ｒｅなど）に直接結合させることができることも認識されるところである。

さらに、ＦｄまたはＦｄ’遺伝子の３゛末端と他の有用な配列の間の枠内融合物を構築することができる。

ここに本発明を概説し終えたが、い（つかの特定の実施例を参照することによってさらなる理解を得ることができる。ただしこれらの実施例は単に例示を目的とするものであって、特に指定しない限り限定を意図するものではない。

Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’分子の細胞生産には、Ｆｄ’と呼ばれる重鎮断片と軽鎖をコード化する遺伝子の同時発現が必要である。ヒトＩｇＧＩＦｄ’断片は、重鎖鏡開ジスルフィド結合の形成に関与する２つのシスティンのうちの少なくとも１つを含有する（図１ａ）。

６つの異なるＦｄ’遺伝子モジュールを構築した。これらのモジュールのカルボキシ末端のＤＮＡ配列と対応するペプチド配列を図１ｂに示す。図２に概略を示すように、１つの重鎖間システィンを伴うＦｄ’をコード化するこれらのうちの最初のもの（図１ｂ−Ａ）を構築し、プラスミドｐＩＮＧ１６２４を作成した。

この構築は、過去にＦａｂ生産のために加工された（ｐｌＮＧ１４１２上の）Ｆｄ遺伝子が、２つの鏡開システィンのうちの最初のものをコード化するＤＮＡ配列内に既に導入されている停止コドンに唯一のＢｃｌＩ部位を含有するという事実を利用している。したがってＢｃｌｌによるｐＩＮＧ１４１２の消化と、それに続くヤエナＩルヌクレアーゼによる処理は、ＴＡ塩基対からなる平滑末端を残す。

この平滑末端にリンカー：５’−ＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧＡ−３゜３°−ＣＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴ−５’を融合することによって、ヒンジ内の２つのシスティンのうちの最初のものに関するコドン（ＴＧＴ）と、それに続く２つのプロリンに関するコドン（ＣＣＡ）が再生される。このＦｄ’と軽鎖の会合は、軽鎖 −Ｆｄジスルフィドのカルボキシ側に１つのＣｙｓを伴うＦａｂ’分子か、もしくは２つのＦａｂ’部分の間に１つのジスルフィド結合を伴うＦ（ａｂ’）２をもたらすであろう。Ｆａｂ生産のためのＦｄ遺伝子モジュールの構築と同様に、以降の遺伝子融合を容易にするべく、停止コドンにＢｃ１１部位を組み込んだ。

ｐｌＮＧ１６２４を出発点とし、ｐＩＮＧ１６２４の構築に用いた方法と同じ方法で、２つのＦｄ’モジュール（図１ｂ−ＢおよびＣ）を構築した。これらのモジュールは重鎖鏡開ジスルフィド結合形成のためのシスティンコドン（複数）と、そのシスティンコドン（複数）の３°側にある２個または９個の追加のアミノ酸に関するコドンの両方を含有しく図１）、これらをそれぞれｐＩＮＧ１６７３およびｐＴＮＧ１６８４と命名した（図２ｃ）。

図３に要約するように、第４のＦｄ’モジュール（図１ｂ−Ｄ）を構築した。このモジュール（ｐｌＮＧ１６９５．図３ｃ）は重鎮間システィン（複数）とそのシスティン（複数）の３゛側にある追加の２９アミノ酸の両方をコード化している。

さらに２つのＦｄ’モジュール（図１ｂ−ＥおよびＦ）を構築した。これらのモジュールでは２つの重鎮間システィンのうちの最初のものが部位特異的突然変異導入によってセリンに変えられている。これらの新規モジュールは、実施例３に記述するように、１つの鏡開尾を含有し、微生物から分泌されるＦａｂ’分子の不均質性を減少させるという試みの一部として構築された。上述のＦｄ’遺伝子モジュールはすべて停止コドンに唯一のＢｃ１１部位を含有する。

ＦｄまたはＦｄ’遺伝子モジュールの３°末端と他の有用な遺伝子配列の間の枠内融合物の構築を達成するために上述の方法を一般的に適用することができる。

そのような構築の例には、様々な他の種類の先端欠失重鎖モジュール、ならびにＦｄまたはＦｄ’と診断、治療または実験上重要な様々な分子（例えば免疫グロブリン重鎮ドメイン、受容体結合タンパク質または細胞毒性ポリペプチド）の間の融合が含まれる。

実施例２：酵母による機能的なＦ（ａｂ’）２とＦａｂ’の分泌酵母細胞は、例えばマウス−ヒトキメラＩｇＧおよびＦａｂ分子などの機能的なＦａｂおよびＩｇＧ分子を分泌することができる（Ｈｏｒｖｉｔｚら、上記）。ＩｇＧの分泌は、それぞれ酵母インベルターゼシグナル配列とＰＧＫプロモーターおよびポリアデニル化信号に融合した重鎮および軽鎖の成熟型をコード化する遺伝子の同時発現によって達成される。Ｆａｂの分泌は、ＩｇＧ１重鎖鎮重鎖入間ジスルフィド結合する２つのンステインのうちの最初のものをコード化する遺伝子配列に導入された停止コドンを含有する遺伝子的に加工されたＦｄ鎖と軽鎖の同時発現によって達成される。軽鎖遺伝子の場合と同様に、Ｆｄ鎖遺伝子を酵母インベルターゼングナル配列−ＰＧＫプロモーターおよびポリアデニル化信号に融合する。

本実施例では、酵母がマウス−ヒトキメラＦ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’分子を生産するための宿主として機能する。この実施例におけるキメラ抗体断片は、多くの黒色腫と癌腫に由来する細胞の表面に発現される抗原に結合するＭｅ４と命名されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎮可変領域を含有する。Ｍｅ４のキメラ型をＩＮＧ−４と命名する。マウスＳ　ｐ／２０細胞によるＩＮＧ−４１ｇＧ１の生産と、酵母および細菌細胞によるＦａｂの生産については既に記述されている（Ｂｅｔｔｅｒら、ＰＣＴ　ＵＳ８９０３８５２）。

ａ、酵母株と生育条件Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｐ２６（ｕｒａ３　１ｅｕ２　ＭＡＴａ）を開発し、次いでＩｔｏら。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３：　１６３−１６８（１９８３）に記述されているように行われる酵母形質転換のための宿主として使用した。ＳＤ＋］ｅｕ寒天（２％グルコース、０．６７％酵母窒素塩基、２％寒天）で酵母形質転換体を選択し、５０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で緩衝化したＳＤ＋］　ｅｕブロスで生育させた。

ｂ、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築酵母によるＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’分子の生産には、軽鎖タンパク質とＦｄ’鎖タンパク質の両方の同時生産が必要である。これは、それぞれＩｅｕ２およびｕｒａ３遺伝子と共に軽鎖遺伝子とＦｄ’鎮遺伝子を含有するプラスミドで１ｅｕ２株とｕｒａ３株を同時形質転換することによって達成することができる。最適な生産は軽鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子の両方を同じプラスミド上に置くことによって達成される。したがって、実施例１に記述したｐＩＮＧ１６２４に由来するＦｄ’遺伝子モジュール（モジュールＡ０図１）をｕｒａ３発現ベクターに連結してプラスミドｐｌＮＧ１６３６（図４ｂ）を形成させた。次に酵母発現プラスミドｐｌＮＧ１６９７を図４０に示すように構築した。ｐＩＮ０１６９７は、インベルターゼシグナル配列とＰＧＫプロモーターとポリアデニル化信号をコード化するＤＮＡ配列に融合したキメラＦｄ’鎖モジュールＡ遺伝子と、ＩＮＧ−４キメラ軽鎖の成熟型をコード化する遺伝子配列を含有する。この方法を用いて、発現ベクターｐｌＮＧ１６９８（モジュールＢ）、ｐｌＮＧ１８００（モジュールＣ）およびｐｌＮＧ１６９９（モジュールＤ）を構築するためにプラスミドｐＩＮＧ１６７３、ｐｌＮＧ１６８４およびｐｌＮＧ１６９５を使用した。

Ｃ，キメラＩＮＧ−４Ｆ（ａｂ’）２とＦａｂ’の酵母分泌ＳＤ”ｌｅｕ寒天中のＵｒａ＋コロニーに関する選択によって、プラスミドｐＩＮＧ１６９７、ｐｌＮＧ１６９８、ｐｌＮＧ１６９９およびｐｌＮＧ１８００をＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｐ　Ｓ　６に導入した。ウラシルを欠＜ＳＤジブロス中形質転換体を生育させ、分泌されるＦ（ａ　ｂ’）ｚまたはＦａｂ’のレベルをＥＬＩ　ＳＡで評価した。最も高いレベルのＦａｂ’を分泌する培養（ｐＩＮＧ１６９７，０．６μｇ／ｍｌ　：　ｐ　ｌＮＧ１６９８．１．９μｇ／μＩ　；　ｐＩＮＧ１６９９．１．９μｇ／ｍｌ　；ｐｌＮＧ１８００．２．５μｇ／ｍｌ）を１０リツトルのＳＤジブロス中６０時間生育し、Ｆ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’タンパク質を培養上清から精製した。

ｄ、キメラＦ（ａｂ’）２とＦａｂ’の酵母からの単離とＦ（ａｂ’）２のキメラＩｇＧからの生産Ｆ（ａｂ’）２とＦａｂ’の混合物を１０リツトルの培養上清から精製した。まず５１０Ｙ３０カートリツジ（アミコン）を用いるＤＣＩＯ濃縮器（アミコン）によって培養上清を濃縮し、蒸留水２０リツトルで洗浄し、再濃縮し、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄し、再度濃縮した。次にその濃縮物を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）で予め平衡化したＩ）Ｅ５２（ワットマン）カラムに充填した。ＤＥＡＥカラムからの溶出物を集め、６．８のｐＨとｌ、Ｑｍｓ／ｃｍの伝導率に調節した。次に、ｌＱｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で平衡化したＣＭ５２カラムに試料を充填した。このＣＭ５２カラムを１０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ６，８）中の２５ｍＭＮａＣｌで溶出させた。溶出液を集め、伝導率が１．０ｍｓ／ｃｍになるように水で希釈し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で平衡化した第２のＣＭ５２カラムに充填し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）中の０から２５ｍＭＮａＣ１への直線的な塩勾配で、結合した抗体を溶出させた。分画をＥＬＩ　ＳＡと５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Ｆ（ａｂ’）ｚとＦａｂ’の混合物を含有する分画を貯蔵し、濃縮した。ＴＳＫ−１２５ゲル濾過ＨＰＬＣカラムを用いてＦ（ａｂ’）２とＦａｂ’を互いに分離精製した。精製したＦａｂ’とＦ（ａｂ’ ）ｚは非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル内をそれぞれ〜４８Ｋｄと〜１００ｋｄに移動した。Ｆ（ａｂ’）２画分とＦａｂ’画分の両方から得た試料は、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で軽鎖バンドとＦｄ鎖バンドに分離した。精製の間に、軽鎖−Ｆｄジスルフィド結合のカルボキシ側に２つのヒンジ・システィンを含有する構築物（ｐＩＮＧ１６９８．ｐｒＮＧ１６９９およびｐＩＮＧ１８００）が、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおける〜４８ｋｄと〜１００ｋｄ以外のタンパク質バンドによって立証されるように、１つのシスティンを伴う構築物（ｐｌＮＧ１６９７）よりも低レベルの不均質型を有することが観測された。

Ｆ（ａｂ”）２を以下のようにしてＩＮＧ−４ＩｇＧのペプシン消化によって作成した。５０％スラリーの固定化ペプシン（ピアス）２５μｍを消化緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５））４００μｌで平衡化し、１１００Ｏｘで５分間遠心分離した。その固定化ペプシンを消化緩衝液５０μｍに再懸濁した。

５０μｌのＩＮＧ−４（１ｍｇ）をペプシン懸濁液に加え、振盪機上で３０℃で４時間インキュベートした。１０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）１５０μｌを加えた後、１０００×ｇで５分間遠心分離することによって、消化されたＩｇＧを抽出した。Ｆ（ａｂ゛）２を含有するその上清を、プロティンＡ−セファロースカラム１ｍｌに通すことによって、未消化のＩｇＧおよびＦｃ断片から分離した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってＦ（ａ　ｂ’）２と２つのより低分子量のバンドの存在が明らかになった。

ＴＳＫ−１２５ＨＰＬＣカラムでＦ（ａｂ’）ｔをさらに精製した。

ｅ、酵母によって分泌されるＦ（ａ　ｂ“）、とＦａｂ’の結合特性）’（ａｂ ’）ｚとＦａｂ’の予期されるサイズのタンパク質が酵母培養上清から精製されることは、酵母が正しく会合した分子を分泌することを示唆している。これらの分子が抗原への結合に関して機能的であることを確認するために、直接結合検定法と競争結合検定法を用いた。直接結合検定法では、様々なキメラＩＮＧ−４Ｆ（ａｂ’）ｚ分子とＦａｂ’分子がキメラＩＮＧ−４ＩｇＧおよびＦａｂと同じ標的細胞に結合した（データの記載なし）。ＨＴ２９細胞とビオチニル化したＩＮＧ−４ＩｇＧを用いる競争結合検定法において、２つの鏡開システィンを含有する酵母が生産するｐ　ＩＮＧ　１８００　Ｆ（ａ　ｂ’）２タンパク質は、キメラＩＮＧ−４１ｇＧと等価であった（図５）。ｐＩＮＧ１６９８とｐＩＮＧ１６９９から得られるＦ（ａｂ’）ｚタンパク質も試験した。ビオチニ化したＩＮＧ−４結合のこれらの競争もＩＮＧ−４ＩｇＧと等価であった（データの記載なし）。対照的に、ＩＮＧ−４のペプシン消化によって調製したＦ（ａｂ’）ｔの競争はＩｇＧではなく、むしろＩＮＧ−４Ｆａｂと等価であり（図５）、ペプシン消化がＦ（ａｂ’：ｈの結合特性に悪影響を与えることを示唆した。１個（ｐｌＮＧ１６９７）または２個（ｐＩＮＧ１６９８、ｐＩＮＧ１６９９、ｐｌＮＧ１８００）のＦｄ’鎖間鏡開ティンを含有する一価のＦａｂ’タンパク質は一価のＩＮＧ−４Ｆａｂと類似する様式で競争した（データの記載なし）。

実施例３：大腸菌による機能的なＨ６５Ｆ（ａｂ’）２とＦａｂ’の分泌大腸菌などの細菌は機能的なマウス−ヒトキメラＦａｂを分泌することができる（Ｂｅｔｔｅｒら、上記）。本実施例では大腸菌が、軽鎖−重鎖ジスルフィド結合を正常に形成するシスティンのカルボキシ側のヒンジドメイン内に１または２個の重鎮間Ｆｄ’システィンを伴うＦｄ’モジュールを含有するマウス−ヒトキメラＦ（ａ　ｂｏ）２とＦａｂ’分子を生産する宿主として機能する（図１ｂを参照のこと）。これらの実験に使用される遺伝子モジュールには、２つの重鎮間システィンと最後のシスティンのカルボキシル側に９個の追加のアミノ酸をコード化するＦｄ’モジュールＣ（図１ｂ）と、１つの重鎮間システィンを伴う数種の異なるＦｄ’モジュールＡ、ＥおよびＦ（図１ｂ）が含まれる。本実施例におけるキメラ抗体断片は、ヒトＴ細胞のＣＤ５抗原に結合するＨ６５と命名されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎮可変領域を含有する（Ｋｅｒｎａｎａら、　Ｊ、　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３３：１３７−１４６（１９８４））。

ａ、軽鎖およびＦｄ’遺伝子のためのジシストロン性発現系細菌によるＦ（ａｂ ’）ｚまたはＦａｂ“の分泌には、それぞれ細菌のリポソーム結合部位とシグナル配列に融合した軽鎖とＦｄ’鎖の両方をコード化する遺伝子の同時発現が必要である。これは、両遺伝子を互いに融合し、そのジシストロン性オペロンを強力で誘導可能なプロモーターの制御下に置くことによって最適に達成される。この実施例では、大腸菌中でキメラＨ６５Ｆ（ａｂ’）２とＦａｂ’を生産するためにＥｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｔら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：４３７９−４３８３（１９８７））とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに由来するａｒａＢＡＤプロモーター（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｅ　１４：３０９−３１９（１９８１））を用いる系について記述する。

Ｆｄ’モジュールＡ、Ｃ，ＥおよびＦ（図１を参照のこと）を含有するＨ６５Ｆ（ａｂ゛）ｚおよびＦａｂ’を生産するために、ｐＩＮＧ３２１７について図６に示すように、発現ベクターｐｌＮＧ３２１７、ｐＩＮＧ３２１９、ｐＩＮＧ３５１８およびｐｌＮＧ３５１９を構築した。

可変領域配列を提供するべ（、ＲＮＡの単離とｃＤＮＡの調製のためにマウスのＩｇＧ１カッパを分泌するＨ６５ハイブリドーマ細胞（Ｋｅｒｎａｎら、上記）を用いた。重鎮配列と軽鎖配列を決定した後、オリゴヌクレオチドを設計し、合成し、これを用いて、標準的な方法（ｒＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＪ　（Ｉｎｎｉｓ編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０））を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＶＨ−ＪＨＩおよびＶＬ−Ｊｋ１コード配列の増幅をプライムした。ＰＣＲによって増幅されたＶ遺伝子モジュールをＳａｃ　Ｉで消化したプラスミドｐＵｃ１８に連結してｐＸＯＭｌ（ＶＨ）とｐＸＯＭ２（ＶＬ）を作成シタ。図８と図９はｐＸｏＭｌとｐＸＯＭ２のＤＮＡ配列を示している。次いで、新しいプライマーを設計し、合成し、これを用いて完全にプロセシングされたＶＨおよびＶＬドメインをコード化する■領域配列を増幅した。３“ 末端に平滑末端を生成させる５ｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼとＴ４ポリメラーゼでの処理によって調製したｐｅｌＢリーダーペプチドコード化配列に連結するべく、５′末端に平滑末端が存在するように、ＰＣＲプライマーを設計した。また、■領域の３゛末端にＢｓｔＥＩＩ部位（ＪＨＩ）またはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｊ　ｋ　１）部位を含んで、Ｂｅｔｔｅｒら（上記）とＲｏｂｉｎｓｏｎら（ＰＣＴ　ＵＳ８８０２５１４）のｐｌＴ１０６発現ベクターのそれらと合致するようにＰＣＲプライマーを設計した。ＶＨのＰＣＲ増幅に用いるプライマーはＨ６５Ｇ１（５’−ＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣ；ＴＧＣＡＧＴＣＴＧ−３’）とＨ６５Ｇ２（５’−ＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴ−３’）であり、ＶＬの増幅についてはＨ６５に１（５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ−３°）とＪＫＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（５°−ＧＴＴＴＧ八ＴＴＴへＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ−３°）である。

実施例１で得たＦｄ’遺伝子モジュールを用いてまずｐＸ１５Ｆを、次いでｐＩＮＧ３２１７を組み立てた（図６）。Ｆｄ’遺伝子モジュールＣを同じ方法で用いてｐｌＮＧ３２１９を構築した。ｐｌＮＧ３５１８とｐｌＮＧ３５１９については、Ｆｄ’遺伝子モジュールＡおよびＣを鋳型として用いるＰＣＲ遺伝子増幅によってＦｄ’モジュールＥおよびＦを作成した。所望の配列変化を導入するための合成オリゴヌクレオチドを合成し、それをＰＣＲ反応で用いることによって、キメラＦｄ’ベクターｐＸ１５Ｆから得られるＤＮＡ断片に連結するためのＳａ１工ないしＸｈｏＩ　Ｆｄ’遺伝子断片を作成した。この組み立ての残りの部分はｐＩＮＧ３２１７の場合と同じである（図６）。

図６中の他の出発プラスミドの説明は次の通りである。

１、ｐＩＮＧ１５００は、唯一の５ａｌＩ部位中にＸｈｏＩリンカ−オリゴヌクレオチドが挿入されている点を除いて、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＣＴ　ＵＳ８８０２５１４の図３８に記述されているｐＲＲ１８７と同一である。

２、ｐＴＮＧ３２１５はＦｄ’遺伝子モジュールＡ（実施例１）を保持している点を除いてｐｌＮＧ１５００と同一である。

３、ｐＩＮＧ３１０４はＢｅｔｔｅｒら、ＰＣＴ　ＵＳ８９０３８５２の図１３に記述されている。

４、ｐＳ２ＤはＲｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＣＴ　ＵＳ８８０２５１４の図２７に記述されているｐｌＮＧ１４３１中に存在するヒトＣｋＨｉｎｄＩＩＩないしＸｈｏＩ配列を含有している。

５、ｐＬＥｌｏはＢｅｔｔｅｒら（上記）によって記述されているｐｌＴ１０６のヒトＣＨＩ　ＢｓｔＥＩＩないしＢｓｔＥＩＩ断片を含有している。

ｂ、細菌内におけるキメラＨ６５Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’の生産プラスミドｐＩＮＧ３２１７、ｐＩＮＧ３２１９、ｐＩＮＧ３５１８およびｐＩＮＧ３５１９を大腸菌株Ｅ１０４内に導入した。これらの株をチェマツプ（Ｃｈｅｍａｐ）　１４リツトル発酵器で、炭素源として領７％グリセロールを補足した最少培地１０リツトル中で培養し、１６時間にわたって最終濃度０．２％まで徐々にアラビノースを添加することによって誘導し、この時点でＡ６００＝１００に達した。これらの細胞を誘導の開始後、３２時間インキュベートした。

酵母Ｆａｂ’について記述した方法と類似の方法を用いて、１０リツトルの培養上清からＦ（ａｂ’）ｚとＦａｂ’を精製した。発酵ブロスを０．２μＭフィルターに通し、限外濾過（アミコンＹＭＩＯ膜）によって５倍に濃縮した。ダイアフィルトレージョンによって培地を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で置換した。第２の０．１μＭ膜に通した後、その濃縮物をＣＭセルロースカラムに結合させ、ｐＨ６，８のリン酸ナトリウム緩衝液中の領１０Ｍ塩化ナトリウムで溶出させた。その溶出物を限外濾過によって濃縮し、Ｆ（ａｂ’）ｚ断片とＦａｂ’断片をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。５００ｍｇ以上の総タンパク質を含有しない濃縮した溶出液を、ｐＨ７，４のリン酸ナトリウム緩衝液で予め平衡化した直径３．２ｃｍｘ高さ１２０ｃｍのセファクリル −８２００’カラムに充填する。試料体積は総力ラム体積の２．５％未満である。得られたタンパク質画分を、クーマシー・ブルーで染色した非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。２つの選択的に還元し得るノステイン／Ｆ　ｄ ’モジュールＣ（ｐＩＮＧ３２１９）を含有するＦａｂ’画分は予期されるＦａｂ’バンドと、軽鎖およびＦｄ鎖の小分子量のタンパク質加水分解消化産物に分離した（図７．レーン５および６）。クーマン−・ブルーで染色したゲルの密度測定走査によって測定したところ、Ｆａｂ’バンドはこれらのレーン内の相対的面積の５０％以上を構成しく下記表１を参照のこと）、標準的なりロフトグラフィー法によって小分子量の軽鎖およびＦｄ’鎖断片から容易に分離することができた。

１つの選択的に還元し得るシスティンＦｄ’モジュールＡ、ＥおよびＦ（ｐ　Ｉ　ＮＧ３２１７、ｐｌＮＧ３５１８およびｐｌＮＧ３５１９）を含有する様々なＦａｂ゛タンパク質も予期されるＦａｂ’バンドと、会合していない軽鎖およびＦｄ鎖バンドのタンパク質加水分解消化産物に分離した（図７）。単離物に応じてＦａｂ°バンドは、クーマン−・ブルーで染色したゲルの密度測定走査によって決定した場合に、各レーン内の相対的面積の３０〜４０％を構成した（表１）。

表１驚（べきことに、これらの調製物は２つのシスティンを含有するＦａｂ’では観測されなかった３つの追加のバンドを含有する（図７．レーン２．３および４）。

上記ゲルのこれらのレーンの密度測定走査によって、追加のバンドが相対的面積の約２０％を構成することが明らかになった（表１）。Ｎ−末端アミノ酸分析は、これらのバンドの最大のものが軽鎖がらなり、他の２つは２つの異なる形態の加工されたＦｄ鎖からなることを明らかにした。無傷のＦａｂ’は、イオン交換クロマトグラフィーによる分離に先立ってグアニジン塩酸塩による処理とそれに続く尿素交換を行うことによって、これらの追加の非ジスルフィド結合型から分離されるのみであったので、Ｆａｂ’タンパク質の精製は普通でなく問題が多かった。さらなる実験によって、これらのバンドの軽鎖成分のみがＲＴＡ３０との複合化に利用できる選択的に還元し得るチオールを含有することが明らかになり、Ｆｄ’バンドが選択的に還元し得るチオール基を含有しないことが示唆された。

これらの結果は、意外なことに、通常は軽鎖に結合しているシスティンのカルボキシ側にある１つのヒンジシスティンを伴うヒトＩｇＧＩ　Ｆａｂ’構築物が正しいジスルフィド結合を伴うＦａｂ’と共に、非共有結合的に会合したＦａｂ’ の混合物の生産をもたらすことを立証した。

Ｆ（ａｂ’）２両分は予期される高分子量のバンドを与え、正しく形成された二価Ｆ（ａｂ’）ｚの存在を示した。実施例１で認められたように、２つのシスティンｐＩＮＧ３２１９構築物から得られるＦ（ａ　ｂ’）２については、１つのシスティン構築物のいずれかから得られるものより高い収率と低い不均質性が認められた。

Ｃ９大腸菌によって生産されたＨ６５　Ｆａｂ”とＦ（ａｂ’）ｚの結合特性１つの選択的に還元し得るヒンジシスティンを含有する（ｐＩＮＧ３２１７）細菌が生産したＦａｂ’を、ＦＩＴＣで標識されたＨ６５　ＩｇＧとＭｏ　ｌ　ｔ− ４細胞を用いる競争結合検定法での機能について評価した。この検定法では、ＣＤ５十Ｍｏ１ｔ４細胞（１０’ｍｌ）を、固定した濃度（０，２μｇ／ｍｌ）のＨ６５−ＦＩＴＣと共に様々な濃度（１〜４　ｕ　ｇ／ｍ　ｌ　）のＨ６５ＩｇＧまたはＦａｂ’と混合した。暗所で４℃で１時間インキュベートした後、細胞に結合したＨ６５−ＦＩＴＣをフロー細胞測定法で測定した。次に、各試料に関する競争結合曲線の傾斜を比較することによって、Ｈ５５１ｇＧに対するＦａｂ ’断片の結合を定量した。したがって無傷のＨ６５ＩｇＧはこの検定における１００％の値を与えるであろう。重量ベースで、Ｈ６５Ｆａｂ’は親のネズミＨ６５ＩｇＧと等価な結合親和性を発揮した。モルベースでは、この値は親１ｇＧのほぼ３０％である。

２つの選択的に還元し得るヒンジシスティンを含有するＦａｂ’でも同一の結果が得られた。別の実験で、大腸菌が生産した８６５　Ｆ（ａｂ’）ｚが、モルベースの測定で親のネズミｉ（６５１ｇＧの結合親和性の約８０％を保持していること４Ａ２　Ｆａｂ’のための細菌発現ベクターをＨ６５Ｆａｂ’（実施例３）と同様の方法で構築した。この実施例では４Ａ２抗体を生産するマウスハイブリドーマ細胞系が抗体遺伝子単離の出発点として機能する。

ａ０発現ベクターの構築抗体４Ａ２を生産するハイブリドーマ細胞１リツトルを集め、ポリＡ　ＲＮＡを調製した。このＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、完全な長さの軽鎖（ｐ４Ａ２に−１３）と重鎮（ｐ４Ａ２ｇ−１２）を含有する個々のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンをマウス定常領域プローブへのハイブリッド形成によって同定した。

各可変領域のＤＮＡ配列を決定し、それを図１０および１１に示す。４Ａ２軽鎮（カッパ）の連結領域はＪＫＩであり、重鎮のそれはＪＨ３であった。発現ベクター中にクローニングするために、特異的なプライマーを用いてｐ４Ａ２に−１３とｐ４Ａ２ｇ−１２の遺伝子のそれぞれから可変セグメントと連結（Ｖ−Ｊ　）セグメントをＰｃＲ増幅した。正しい遺伝子が同定され、それが以降のクローニング段階で用いられることを確かめるために、軽鎖タンパク質と重鎮タンパク質の両方のＮ−末端アミノ酸配列をも決定した。細菌発現ベクター中にクローニングするために、５’−ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣ−３°と５ ’−ＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ−３’というプライマーチ軽鎖Ｖ−Ｊ領域のＰｃＲ増幅を行い、５°−ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ−３°と５′−ＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴ−３’で重鎖Ｖ−Ｊ領域を増幅した。

軽鎖Ｖ−Ｊ領域を含有するＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄｌＩ工断片へのプラントとしてヒトカッパ定常領域と共にｐＩＮＧ１５００中にクローン化することによってｐＺＩＧを作成した。さらに、重鎖Ｖ−Ｊ領域を含有するＤＮＡ断片をＢｓｔＥＩＩで消化し、ＣＨＩに由来するＢｓｔＥＩＩ断片と共にＢｓｔＥＩＩ断片へのプラントとしてｐＩＮＧ３２１５中にクローン化することにょつてｐＤ２８Ｈを作成した。プラスミドｐＺＩＧとｐＤ２８Ｈを用いて４Ａ２　Ｆａｂ’発現ヘクターｐＩＮＧ３２１８を組み立てた。このクローニング法の概略ヲ図１２に示す。

プラスミドｐｌＮＧ３２１８はカッパとＦｄ’を含有し、Ｆｄ’のＣ−末端を図１に遺伝子モジュール八として示す。図１に示すＦｄ’　Ｃ−末端、遺伝子モジュールＣを保持するこのプラスミドの誘導体ｐｌＮＧ３１９７を構築した。プラスミドｐＩＮＧ３１９７をｐＺＩＧとｐＤ２８Ｈから誘導した。ここではカッパの次にＦｄという順番（ｐＩＮＧ３２１８とは反対の順番）で遺伝子を組み立て、図１の遺伝子モジュールＣに記載のＦｄ’配列をｐＩＮＧ３２１９がらの５ａｕｌないしＸｈｏｌ断片として導入した（実施例３）。

ｂ、細菌内におけるキメラ４Ａ２　Ｆ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’の生産プラスミドｐＩＮＧ３２１８とｐｌＮＧ３１９７を大腸菌株Ｅ１０４中に導入した。これらの株をチェマップ１４リツトル発酵器で、炭素源として０．７％グリセロールを補足した１０リツトルの最少培地中で培養し、Ａ６゜。＝５０に達した時にアラビノースを０．０５％まで添加することによって誘導した。誘導後、２４時間細胞をインキュベートした。

ｐＩＮＧ３２１８かｐＩＮＧ３１９７のいずれかに由来するＦ（ａｂ’）ｚとＦａｂｏを、酵母または大腸菌に由来するＨ６５　Ｆ（ａｂ’）ｔとＦａｂ’について記述した方法と類似の方法を用いて１０リツトルの培養上清から精製した。

発酵ブロスを０．１μＭフィルターに通し、限外濾過（アミコン５１０Ｙ１０膜）によって濃縮し、ｐＨ６，５に調節した。この濃縮物を１０ｍＭリン酸緩衝液中ｐＨ６，５のＣＭ５２カラムに充填した。このＣＭ５２カラムを０．０２ＮＮａＣＩで溶出させ、５０ｍ１に濃縮した。ｐｌＮＧ３２１８（２つのヒンジシスティン）発酵からの濃縮物の５ＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンプロット分析は軽鎖を含有する３つの主要なバンド、Ｆ（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ’および遊離の軽鎖を示した。しかしｐＩＮＧ３１９７（１つのヒンジシスティン）は約７つの主要なバンドを与え、ｐＩＮＧ３２１８から得られるものより不均質性の程度が高いことを示した。この物質をバッチでＣＢＸ　Ｐｒｅｐ１５　ＨＰＬＣカラムに充填し、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６，５）中の０から０．１５ＮへのＮａＣ１勾配で溶出させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる評価で適当な画分を貯蔵することによって精製されたＦ（ａｂ’：ｈとＦａｂｏを調製する。

実施例５　：　Ｆ（ａ　ｂ’）２の還元に関する条件の確立実施例２．３および４に記述したＦａｂ’分子はインビトロで様々な分子に結合するために用いることができるシスティンチオール基を含有するはずである。

２つのＦａｂ’分子の結合によってＦ（ａｂ’）２を形成させようとする最初の試みは不成功に終わり、これらの分子上のシスティンチオール基がおそらくは付加物形成のために遮断されていることが示唆された。この仮説はエルマン試薬を用いる試験によって確認された。

我々は本実施例において、Ｆｄ−軽鎖ジスルフィド結合のカルボキシル側にあるＦｄシスティン残基（単数または複数）を選択的に還元するための条件を確立する。２つの重鎮間システィンと９個の追加のアミノ酸を含有する酵母由来のキメラＩＮＧ−４Ｆ（ａ　ｂ’）ｚＣＣｌ２ＯＣを参照のこと）と、Ｆｄ−軽鎖ジスルフィド結合システィンのカルボキシ側に１つのヒンジ鎖システィンを含有する大腸菌由来のＨ６５Ｆａｂ’を用いて還元条件を確立した。

酵母によって生産され、実施例２に記載の如く精製されたＩＮＧ−４Ｆ（ａｂ’ ）２を、０．０５ないし１ｍＭ濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）中で４℃で４時間インキュベートした。

次に、５ＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクーマシー・ブルー染色によってタンパク質を分析した。Ｆｄ−軽鎖ジスルフィド結合に影響を与えることなく　Ｆ（ａ　ｂ″）！分子をＦａｂ’に還元するには０．５ｍＭのＤＴＴ濃度で十分であった。５ＤＳ−ＰＡＧＥで評価したところ、１ｍＭかそれ以上のＤＴＴ濃度はＦ（ａ　ｂ’）ｘ分子を個々のＦｄ鎖と軽鎖に還元した。

大腸菌によって生産されたＨ６５　Ｆａｂ’を上述のように試験したところ、やはりＦｄ−軽鎖ジスルフィド結合に影響を与えることなくＦｄのカルボキシ末端に最も近い１つのヒンジシスティンを選択的に還元するのに、２０ｍＭトリス− ＨＣｌ（ｐＨ８，０）中の０．５ｍＭ　ＤＴＴが必要であった。０．ＩＮ酢酸中のゲル濾過によって過剰のＤＴＴを除去した後、エルマン試薬を用いてＦａｂ’ １分子につき約１．４個のチオール基が存在することを立証した。

実施例６　：　Ｆ（ａ　ｂ’）ｚのＦａｂ’からの形成選択的に還元し得るチオール基を伴うＦａｂ’分子を用いてホモニ量体または二官能性へテロニ量体Ｆ（ａｂ’）２分子を形成させることができる。ホモニ量体Ｆａｂ’分子はＩｇＧ分子の親和性を保持すべきである。ヘテロニ官能性Ｆ（ａ　ｂ’）２分子は２つの異なる細胞型または細胞と配位子に対する特異性を含むことができよう。

本実施例では、Ｆｄ−軽鎖ジスルフィド結合のＣ末端側に１または２個のシスティンを伴うＦｄ鎖を含有するキメラＩＮＧ−２およびＩＮＧ−４Ｆａｂ’分子を、ホモニ量体および二官能性へテロニ量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の生産に用いる。

■、ホモニ量体Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の生産ａ、Ｆ（ａｂ’）ｚのＦａｂ’からの形成Ｆｄ−軽鎖ジスルフィド結合のカルボキシル側に１個または２個のシスティンを伴うＦｄ鎖を含有するＩＮＧ−４Ｆａｂ’分子（実施例１を参照のこと）を用いてＦ（ａｂ’）２を形成させた。０．５ｍＭＤＴＴのジチオスレイトールを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）中の様々なＦａｂ’タンパク質５０μｇを５０μｍの体積で４℃で４時間インキュベートすることによって、これら追加のＦｄシスティンに結合している付加物を除去した。次に、還元されたＦａｂ’タンパク質を５０ｍＭｔ−リス−ＨＣ１（ｐＨ７，８）中の２ないし５ｍＭシスティンからなる冷たい（４℃）水溶液中に２０μｇ／ｍ１に希釈し、４ ℃で終夜インキュベートすることによって再会合を起こらせた。次に、この溶液をセントリコン１１１０で約５０μｌの体積に濃縮し、Ｆ（ａｂ’）２の形成を５ＤＳ−ＰＡＧＥ後にクーマン−・ブルー染色したバンドの密度測定走査によって定量した。さらなる特徴づけのために、Ｆ（ａｂ’）ｚをゲル濾過によってＦａｂ’から分離することができる。

鏡開ジスルフィドシスティンのカルボキシ側に２つの選択的に還元し得るヒンジシスティンを含有するＦａｂ’分子のみが上述の条件を用いて）”（ａｂ’）２分子を形成した。２つのシスティン残基を伴う３つのＦａｂ’構築物のうち（実施例１を参照のこと）、９個のアミノ酸尾を伴うものが最も良好なＦ（ａｂ’）ｚへの変換を与えるようであった。１つの選択的に還元し得るシスティンを含有するＦａｂｏでは確立された条件を用いてＦ（ａｂ’）２を生産し得なかったということは、大腸菌によって直接生産される１つのシスティンを伴うＨ６５Ｆ（ａｂ’）２が再会合緩衝液で用いた濃度と同じシスティン濃度（２ｍＭ）による処理でＦａｂ’に還元され得たという観察によって説明される。したがって２ｍＭのシスティンは１つの選択的に還元し得るシスティンを含有するＦａｂ’については還元状態に維持するが、２つの選択的に還元し得るシスティンを伴うＦａｂ’については還元状態に維持しない。

ｂ、インビトロで形成したＦ（ａｂ’）ｚの結合特性Ｆ（ａｂ’）２について予期されるサイズのタンパク質のインビトロ生産は、上記の再会合方法が正しく会合した分子の形成をもたらしたことを示唆している。競争結合検定法を用いてこれらの分子が機能的であることを確認した。ＨＴ２９細胞とビオチニル化したＩＮＧ−４ＴｇＧを用いる競争結合検定法では、２つの重鎮間システィンを含有するインビトロで生産した様々なＦ（ａ、ｂ’）２タンパク質が、酵母からの直接的分泌によって生産されたＦ（ａｂ’）ｚおよびキメラＩＮＧ−４１ｇＧと等価に競争した（データの表示なし）。

Ｉｌ、ヘテロニ官能性Ｆ（ａｂ’）２分子の生産ａ、Ｆ（ａｂ’）２分子のＦａｂ’からの形成２つの異なる特異性のＦａｂ’を単独で、もしくは等モル混合物として還元し、次いで還元したＦａｂ’分子を上述の再会合緩衝液に同時に添加することによってヘテロニ官能性Ｆ（ａｂ’）ｚ分子を作成することができる。

この手法を用いて、キメラＩＮＧ−２Ｆａｂ’分子とＩＮＧ−４Ｆａｂ’分子でヘテロニ官能性Ｆ（ａｂ゛）２を構築した。キメラＩＮＧ−２ＦａｂはＢｅｔｔｅｒら、ＰＣＴ　ＵＳ８９０３８５２に記述されており、キメラＩＮＧ−２Ｆａｂ’はＩＮＧ−４Ｆａｂ’について上述した方法と同じ方法で作成した。再会合したタンパク質を非還元クーマシー・ブルー染色ＳＤＳゲルで分析することによって、予期される分子量のＦ（ａｂ’）ｚタンパク質の存在が立証された。

ｂ、ヘテロニ官能性Ｆ（ａｂ’）ｚ分子の特性ＩＮＧ−２抗体がラムダ軽鎖を含有し、ＩＮＧ−４抗体がカッパ軽鎖を含有するという事実を利用する試験によって、この構築物のへテロニ官能性を確認した。

コートとしてヒトのラムダに対する抗血清を用い、第２抗体としてヒトのカッパに対する抗血清を用いるサンドイッチＥＬＩ　ＳＡによって、カッパ軽鎖とラムダ軽鎖の両方を伴うＦ（ａｂ’）２の存在が明らかになった。それぞれＩＮＧ− ４（カッパ軽鎖）とＩＮＧ−２（ラムダ軽鎖）によって特異的に認識されるＨＴ２９細胞とＢＴ２０細胞もしくはこれらの細胞から誘導される膜調製物を用い、Ｆ（ａｂ’）ｚで直接結合検定法を行うことができる。

実施例７　：　Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体の構築と活性免疫毒素（抗体−毒素複合体）はしばしば、ヘテロ三官能性架橋剤５ＰＤＰで抗体を無作為に誘導体化し、次いでリジン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）の遊離のチオールとジスルフィド交換することによって調製される。このようにして生成するジスルフィド結合は最大複合体細胞毒性活性にとって極めて重要である（Ｂｌａｋｅｙら、　Ｐｒｏｇ、＾１１ｅｒｇｙ　１１５：５０（１９８８））。本発明が記述する微生物によって生産されるＦａｂ’断片はＦｄ鎖上に選択的に還元し得るチオールを含有するので、ジスルフィド複合化の工程は大きく簡略化され、高度に特異的である。

同様に、以下に概略を記す手法を用いてＦａｂ’と任意の他のチオール含有毒素（即ちアブリンＡ鎖）の間の複合体を作成したり、あるいはジスルフィド橋によって連結したー特異的または二特異性Ｆ（ａｂ’）２断片を作成することができる。

５ＰＤＰや２−イミノチオランなどの適当なリンカ−と共に、選択的に還元し得るチオールを含有しない化合物、例えばＩ型すポソーム不活化タンパク質（ゲロニン、サポリン、ポルクライード（ｐｏｌｋｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、大麦ＲＩＰなど）、酵素（アルカリ性ホスファターゼ）または薬物（ダウノマイシンなど）とＦａｂ“断片の間の複合体を調製することもできよう。

Ｆａｂ’に複合化されるＲＴＡ３０分子の数は反応条件とＦａｂ’上の選択的に還元し得るチオールの数に依存する。例えば構築物ｐＩＮＧ３２１９に由来するＦａｂ’は２つの選択的に還元し得るチオールをＦｄ鎖上に持ち、これを下記の方法で複合化することによってＩＦａｂにつき２ＲＴＡ分子を伴う活性なＦａｂｏ−免疫複合体を作成した。

ａ、Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０の調製この実施例では、実施例３に記述した１つの選択的に還元し得るヒンジシスティンを含有するＨ６５　Ｆａｂ’と芳香族ジスルフィド、ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）を用いて、ＲＴＡの３０ｋＤ型（ＲＴＡ３０）とのジスルフィド架橋複合体を作成した。迅速に撹拌しながら最終濃度が２ｍＭになるようにジチオスレイトールを添加することによってＨ６５Ｆａｂ’（８６ｍｇ、’　ＰＢＳ（ｐＨ７，０）中２．４ｍｇ／ｍｌ）を還元した。２５℃で１時間インキュベートした後、ジチオビス（ピリジン−Ｎ− オキシド）を加えて７ｍＭにし、さらに１時間インキュベーションを続けた。この工程は共にＦａｂ’チオールを脱遮断し、複合化のためにこのチオールを活性化する。次に、ＰＢＳ（ｐＨ７，０）中で平衡化した５Ｘ３０ｃｍのトリスアクリル（ＴｒｉｓａｃｒｙｌＲ）ＣＦ−０５Ｌ　Ｓカラムで脱塩することにより、チオールが活性化されたＨ６５　Ｆａｂ’を回収した。エルマン試薬の添加後に分光光度測定法で測定したところ、ＩＦａｂ’あたりの活性化されたチオール基の数が１．０５であることがわかった。

複合化に先立って、ＤＴＴを加えて２５℃で３０分間５０ｍＭにすることによってＲＴＡ３０（３００ｍｇ、ＰＢＳ中６ｍｇ／ｍ＋）を還元し、２つの分割し、各半分をＰＢＳ中で平衡化したトリスアクリルＧＦ−０５ＬＳの５Ｘ３０ｃｍカラムで脱塩した。このＲＴＡ３０−３Ｈは０．９１ＳＨ／ｍｏ　Ｉを含有し、これをアミコンＹＭ１０Ｒ膜での限外濾過によって６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次にチオールが活性化されたＨ６５　Ｆａｂ’（８２ｍｇ）を５倍モル過剰（２４６ｍｇ）の新たに還元したＲＴＡ３０と混合し、２５℃で３時間インキュベートした。活性化されたＦａｂ’とＲＴＡ３０の最終濃度はそれぞれ１．０および３．０ｍｇ／ｍｌであった。

さらに４℃で１５時間インキュベートした後、プロティンＧとチバクロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ　ＢｌｕｅＲ）　Ｆ　３　Ｇ　Ａ樹脂での逐次的なアフィニティークロマトグラフィーによって、反応混合物からＦ　ａ　ｂ’−ＲＴＡ３０複合体を精製した。まず混合物を、ＰＢＳ中で予め平衡化したガンマバインド・プラス（ＧａｍｍａＢｉｎｄ　Ｐ１ｕｓＲＸジェ不ツクス（Ｇｅｎｅｘ））の１０ｍ１カラムに適用することによって、残基遊離のＲＴＡ３０を除去した。

このカラムを２８０ｎｍの吸光度がゼロに近づくまでＰＢＳで洗浄し、Ｆ　ａ　ｂ’−ＲＴＡ　３０と残りの複合化していないＦａｂ’を０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，０）で溶出させた。飽和したトリズマ（ＴｒｉｚｍａＲ）塩基でこの物質を直ちに中和し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣＩ（ｐＨ８゜０）に対して透析した。次に、透析したプロティンＧ溶出液を１０ｍＭｈリスーＨＣ１（ｐＨ８，０）で１１に希釈し、その混合物を１０ｍＭｈリスーＨＣｌ、７２ｍＭ　ＮａＣＩ（ｐＨ８，０）中で平衡化したブルー・トヨパール（Ｂｌｕｅ　ＴｏｙｏＰｅａｒｌＲ）（トーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ））の１０ｍ１カラムに適用することによって、混入した少量の遊離Ｆａｂ’を除去した。平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、精製されたＨ６５　Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０を平衡化緩衝液中のＩＭＮａＣＩでバッチ溶出させた。サイズ排除ＨＰ　Ｌ　Ｃで分析したところ、最終的な複合体（６５，４ｍｇ）は単一の対照ピークのみを示し、ＩＲＴＡ３０／Ｆａｂ’を含有した。

ｂ、Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０の評価Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体の抗原結合性と細胞毒性をいくつかの系で評価した。実施例３（ｃ）に記述した競争的結合検定法を用いることによって抗原反応性を評価した。複合化していないＨ６５Ｆａｂ’と比較して、Ｆａｂ−ＲＴＡ３０複合体の結合は実質上１００％であった（モルベースでそれぞれ対照の３０％と２７９６）。これらの値は親の二反応性Ｈ６５抗体で得られるものより低いが（モルベースでほぼ１　、／　３　）、これらの結果は複合化の工程が抗原との反応性にほとんど影響を与えないことを示している。

Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体の細胞毒性を数種の異なる細胞型で調べた。

図１３は、ＣＤ５　Ｔ細胞系ＨＳ　Ｂ　２から得た細胞（５Ｘ１０°５／ｍｌ）を増大する濃度の複合体と共に２４時間までインキュベートし、その時点でタンパク質を合成するという細胞の能力を３Ｈ−ロインンの取り込みを測定することによって定量した代表的プ；実験の結果を示す。重量ベースでＦ　ａ　ｂ’−ＲＴＡ３０複合体はこれらの細胞におけるタンパク質合成を４３％ｇ／ｍｌの濃度で５０％（ＩＣ５０）阻害した。５ｏｏｏｏダルトンの分子量に基づいて、これは０．５ＨＭのＩＣ５０に相当する。比較のために無傷のＩ　ｇｃ；　Ｈ６５− ＲＴＡ３０複合体について得られる曲線と、遊離のＨ６５Ｆａｂ’について得られる曲線をも示す。

また、細胞の細胞毒性の指標としてＤＮＡ合成の阻害を測定する検定法によって、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に対してＨ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体を試験した。正常で健康な供給者から得たＰＢＭＣをフィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）で単離し、十分に洗浄した。バルク培養中で至適濃度のフィトヘマグルチニンと共に３日間活性化することによって、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）ブラストを得た。両細胞集団を試料と共に合計９０時間インキュベートし、細胞収集の１６時間前に３Ｈ−チミジンを加えた。

休止ＰＢＭＣとＰＨＡ活性化ＰＢＭＣに関するＨ６５　Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０の細胞毒性を図１４に示す。この検定法では、Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０と対照Ｈ６５ＩｇＧ−ＲＴＡ３０の両方が類似のＩＣ５０値を示し、それは２つの細胞集団について約１１００ｎ／ｍｌの平均値であった。対照ＩｇＧ（ＩＮＤｌ−ＲＴＡ３０）またはＦａｂ”（ＩＮＧ−２ＲＴＡ３０）複合体は試験した濃度では非毒性であった。したがって、Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体はモルベースでＩｇＧ複合体のほぼ１／３活性であった。興味深いことに、両方の実験条件群（休止ＰＢＭＣおよび活性化ＰＢＭＣ）で、Ｈ６５Ｆａｂ’−ＲＴＡ３０複合体は対応するＨ６５　ＩｇＧ−ＲＴＡ３０複合体よりも高程度の細胞殺傷性を発揮した。程度は少ないが、Ｆａｂ−ＲＴＡ３０複合体でより完全に殺傷されるというこの傾向は試験した細胞系のそれぞれについても注目された（データの記載なし）。

これらの結果は微生物が生産したＦａｂ’分子から誘導体した免疫毒素複合体が動物細胞が生産した全抗体から誘導される免疫毒素と効力の点で類似し得ることを立証している。図８の８６５−ＲＴＡ対照全抗体免疫毒素はステロイド耐性移植対宿主疾患の療法に有用であることが示されている（Ｋｅｒｎａｎら、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　２５９：３１５４−３１５６（１９８８））。したがってこの実施例のＨ６５Ｆａｂ−ＲＴＡと本発明の類似のＴ−細胞反応性分子は、Ｔリンパ球の疾患と障害の処置に治療的に有用であり得る。

実施例８　活性なＦ　（ａ　ｂ’　）２−ＲＴΔ旦９複合体の構築と活性上記実施例に記述の如く、免疫毒素は典型的には還元し得るジスルフィド結合を介してリポソーム不活化タンパク質（ＲＴＡなど）に連結した抗体からなる。この形式では無傷の抗体分子の固有の二価性を利用することによって、−価抗体断片の典型例よりも一般に高い標的細胞への親和性を伴う標的化部分を提供する。

本発明が記述するＦ（ａｂ’）２断片は免疫毒素を調製する際に無傷の抗体に代わるものを提供する。高親和性結合を与えることに加えて、Ｆ（ａｂ”）２断片はマクロファージや他の免疫系の細胞による非特異的な取り込みを引き起こし得るＦｃ受容体を欠く。本実施例では同一の抗原特異性を伴うＦａｂ’断片からなるＦ（ａ　ｂｏ）２分子を使用するが、類似の方法論を用いて、異種のＦａｂ’ 断片を伴う二価免疫毒素を作成することができよう。このような複合体は異なる細胞表面抗原か、同じ抗原の異なるエピトープを標的にすることができよう。さらにＦ（ａｂ’）２断片に非ジスルフィド結合した複合体も適当なリンカ−の選択によって調製することができよう。

ａ、Ｈ６５Ｆ（ａｂ’）ｒＲＴＡ３０の調製所望の複合体を調製するためにはＦ（ａｂ’）２断片をまず架橋剤で誘導体化して、複合化に必要な反応性チオール基を導入しなければならない。この実施例では、実施例３に記述したＨ６５　Ｆ（ａ　ｂ’）ｚ分子をまずヘテロ三官能性架橋試薬５−メチル−２−イミノチオラン（Ｍ　２１　Ｔ　ＨＧｏｆｆら、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ、　１　：３８１−３８６（１９９０）および米国特許第４９７０３０３号を参照のこと）および芳香族ジスルフィド、ンチオニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応させた。この反応は共にＭ２１Ｔリンカ−を介して遊離のＳＨ基を導入し、次いで、ＲＴＡ３０−３Ｈとのジスルフィド交換反応のためにこのチオールをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）脱離基で活性化する。

８６５　Ｆ（ａｂ’）２（６５ｍｇ　：　２５ｍＭトリエタノールアミン、１５０ｍＭＮａＣ＋、２．５ｍＭ　ＤＴＮＢ、ｐＨ８，０中２．９ｍｇ／ｍｌ）を１２倍モル過剰のＭ２１Ｔと２５℃で反応させた。これらの条件下ではＦ（ａｂ’ ）２断片がまずＭ２１Ｔで誘導体化され、次いで新たにさらされたチオールがＴＮＢで活性型になる。一定の撹拌下で７０分の後、０．ＩＭＮａＰ○４、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣＬ　ｐＨ７，５中４℃で平衡化したトリスアクリルＲＧＦＯ５ＬＳの２．５ｃｍＸ４０ｃｍカラムで脱塩することによって、チオールが活性化されたＨ６５　Ｆ（ａｂ’）＊−（Ｍ２ＩＴ）−ＴＮＢを回収した。ＤＴＴ処理した試料の分光光度測定分析はＨ６５Ｆ（ａｂ’）２断片に１．９個の活性化されたチオールが導入されていることを示した。

複合化のためにチオールが活性化されたＨ６５　Ｆ（ａｂ’）ｒ（Ｍ２ＩＴ）− ＴＮＢ（６２ｍｇ）を３倍モル過剰（５８ｍｇ）のＲＴＡ３０−３Ｈ（実施例７に記述の如く調製したもの）と混合し、その混合物を２５℃で２時間インキュベートした。

Ｆ（ａｂ’）２とＲＴＡ３０の最終濃度はそれぞれ１．４および１．３ｍｇ／ｍｌであった。さらに４℃で１６時間の後、先の実施例に記述したように、プロティンＧ８とチバクロン・ブルーＲＦ３ＧＡ樹脂による逐次的なアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｈ６５Ｆ（ａｂ’）２−（Ｍ２１Ｔ）−ＲＴＡ３０複合体を残りの未反応のＦ（ａｂ’）２断片とＲＴＡ３０から精製した。最終的な複合体（１５ｍｇ）はは１または２個のＲＴＡ３０分子を含有するＦ（ａｂ’ ）２断片の混合物を含有し、その平均ＲＴＡ　Ｆ（ａｂ’）２比は１．３であった。

ｂ、８６５　Ｆ（ａｂ’）２−ＲＴＡ３０の評価Ｈ６５Ｆ（ａｂ’）２−（Ｍ２１Ｔ）−ＲＴＡ３０複合体の抗原反応性を実施例３（ｃ）に記述した競争結合検定法で調べた。無傷のＨ６５抗体と比較して、Ｆ（ａｂ’）２−ＲＴＡ複合体の結合はモルベースで実際に高かった（１４７％）。この結果は無傷のＨ６５抗体複合体について認められる結果（抗体に対して１５３％）と類似している。したがってＦ（ａｂ’）２−ＲＴＡ複合体結合は対応する無傷の抗体複合体の９７％であった。

さらにＦ（ａｂ’）ｚ複合体の細胞毒性活性を実施例７（ｂ）に記載の如く、いくつかの細胞型に対して調べた。Ｈ３Ｂ２細胞に対してＩＣ５０は１．８　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　（１３ｐＭ）であり、これに対して無傷の抗体Ｈ６５−ＲＴＡ複合体は２３　ｎ　ｇ／ｍ１（１１２ｐＭ）である。さらに、実施例７のＦ　ａ　ｂ ’−ＲＴＡ３０複合体について注記したように、Ｆ（ａ　ｂ’）複合体はＨ６５ −ＲＴＡ（７８％）よりも高程度（９２％）に標的細胞を殺傷する。ＣＥＭ細胞に対してＨ６５Ｆ（ａ　ｂ’）ｚ−（Ｍ２１　Ｔ）−ＲＴＡ３０のＩＣ５０は２２ｎｇ／ｍｌ（１５８ｐＭ）であり、Ｈ６５−ＲＴｉ、：：ついては４３ｎｇ／ｍｌ（２１４ｐＭ）であった。ＰＢＭＣについては、Ｉ　Ｃ５０が９．５１ｇ／ｍｌ（６８ｐＭ）であり、殺傷の程度は８９％であった。これ（二対してＨ６５ −ＲＴＡの場合は２６ｎｇ／ｍｌ（１２４ｐＭ）と６６％である。したがって微生物が生産したＦ（ａｂ’）２のＲＴＡ３０免疫複合体は親のマウス抗体の免疫複合体よりも強力かつ完全な様々な標的ＣＤ５　Ｔ細胞の殺傷を示す。

ここに本発明を完全に記述し終えたので、本明細書に記載の本発明の目的と範囲から逸脱することなく、本発明に多くの改変や修飾をなし得ること（ま当業者（こは明白であろう。

配列表（１）一般的情報。

（ｉ）特許出願人：ホーウィッツ、アーノルド（ｉｉ）発明の名称：微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体（ｉｉｉ）配列の数＝２５（ｉｖ）連絡先：（Ａ）名宛人ニスターン、ケスラー、ゴールドスタイン・アンド・フォックス（Ｂ）通り：エヌダブリュ・スィート３００．コネチカット・アベニュー１２２５番（Ｅ）国・アメリカ合衆国（Ｆ）　ＺＩＰ・２００３６（Ｖ）コンピューター解読書式：（＾）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター・ＩＢＭ　ＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システム・ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．　Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）本出願のデータ・（Ａ）出願番号：アメリカ合衆国（Ｂ）出願臼：　１９９１年６月１４日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：（＾）氏名・ゴールドスタイン、ジョージ・エイ（Ｂ）登録番号＋　２９．０２１（Ｃ）参照／整理番号：　０６１０．０８３００００（ｉｘ）電話連絡先情報：（Ａ）電話番号：　２０２８３３−７５３３ＣＢ）ファックス番号：　２０２８３３−８７１６（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴；（＾）配列の長さ：１４アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類二ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１：Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ｉ’ｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴；（八）配列の長さ一１２塩基対（Ｂ）配列の型；核酸（Ｃ）鎖の数−両形態（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉｉ）配列の種類；ＤＮＡ（ｘｌ）配列：配列番号２：ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡ　１２（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号３：ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣτ　２１（２）配列番号４の情報・（ｉ）配列の特徴；（＾）配列の長さ；４２塩基対（Ｂ）配列の型；核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　［１ＮＡ（ｘｉ）配列；配列番号４− ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧ　ＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡ　４２（２）配列番号５の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ一４２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号５：ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧ　４２（２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｊ　ｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号６：Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　５ｅｒＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ（２）配列番号７の情報＝（ｉ）配列の特徴＝（＾）配列の長さ：１４アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列・配列番号７：Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

（２）配列番号８の情報。

（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ・１５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類＝ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号８：＾ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣ１５（２）配列番号９の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：４２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号９：＾ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧ　ＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡ　４２（２）配列番号１０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１０：ＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＣＡＣ１５（２）配列番号１１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数；両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１１：ＴＣＧＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣ１９（２）配列番号１２の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型　核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列、配列番号１２：ＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧ　ＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧ　Ｇ（２）配列番号１３の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ　２５塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列・配列番号１３゜ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ　Ｇ丁ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣ（２）配列番号１４の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ、１０アミノ酸（Ｂ）配列の型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｘｌ）配列：配列番号１４・Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

（２）配列番号１５の情報；（１）配列の特徴：（＾）配列の長さ：４２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数０両形態（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１５：２１　ＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＴＴＧ　ＧＧＴＧＧＴＣＣＡＴ　ＧＡＴＣＡＣＴＣＧＡ　ＧＧ　４２（２）配列番号１６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロンー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１６：２５　ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ　ＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧ　ＣＴＧＧＡＣ４６（２）配列番号１７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１７：ＡＣＣＣＣＴＧＡＣＴ　ＧＡＴＣＡ　１５（２）配列番号１８の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：４１４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数８両形態（Ｄ）トポロン−直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１８：ＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧ　ＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧ　ＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧ　ＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡf　６０＾ＴＣＣＡＧＴＴＧＧ　ＴＧＣＡＧ丁ＣＴＧＧ　ＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧ　＾＾ＧＡＡＧＣＣＴＧ　ＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴ　ＣＡ＾＾ＡＴＣＴbＣ１２０ＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴ　Ｃ丁ＧＧＧＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴ＾丁ＧＧＡＡＴＧＡ　ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡ　ＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡ@１８０ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴ　ＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴ　ＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡ＾＾ＣＡＣＣＣＡＣＡ　ＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴ@２４０ＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡ　ＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴ　ＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＴＴＧＧＡＡＡＣＧ丁　ＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴO　３００ＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡ　ＡＣＣＴＣＡＡＡ＾＾ＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧ　ＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴ　ＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧ　ＡＣＧＧＧＧＴＴＡb３６０ＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴ　ＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧ　ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ　ＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡ　ＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣ４１４（２）配列番号１９の情報。

（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：１３８アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（１１）配列の種類、蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号１９゜Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｇｉｎ　５ｅｒ１　５　１０　１ｉ＾１ａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌ：Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＴｔＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＡｒｇ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ＾１ａＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　５ｅｒＴｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒｌｏｏ　’　１０５　１１０Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　ＧｌｙＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ１３０　、　１３５（２）配列番号２０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝３８８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号２０：ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡ　ＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴ　ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴ　ＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴ　ＴＣＣＡＧＧＴＡＴb６０ＡＡＡＴＧＴＧＡＣＡ　ＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ　ＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴ　ＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴ　ＧＧＧＡＧＡＧＡＧ`　１２０ＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡ　ＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡ＾＾ＴＣＡ＾＾Ｃ３８８（２）配列番号２１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２９アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ　）配列：配列番号２１：Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐｌ　５　１０　１５Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　５ｅｒ１１ｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　５ｅ■ Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａ１Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ１１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅｙｓ（２）配列番号２２の情報。

（ｉ）配列の特徴・（Ａ）配列の長さ：３９３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号２２：（２）配列番号２３の情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：１３１アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号２３：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　５ｅｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　５ｅｒＬｅｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓｌｏｏ　１０５　１１０Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ（２）配列番号２４の情報・（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：４２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数二両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類・ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号２４：（２）配列番号２５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ、１４２アミノ酸ＣＢ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号２５：Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＳｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　５ｅｒ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔｌｏｏ　１０５　１１０Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＴｒｐＰｈｅ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ＾１ａＬ　＜ｃ　＜　＜＜：　（ｔｒｙ　Ｌ　Ｌ　＜　＜占冒冒冒電罐ト謂占宴罐り八牟ＣＤ　口　Ｃト　ペ　０　べ　飄矩只　トω　＜Ｄ、＋　（Ｊ−じ− Ｌ）Ｃり　ＣＪ！　（り（！ｌ　（Ｊｌｌｋ　ＧＣりｕｒｃ＋　Ｃ！ｌａｒ　ｔ −＋Ｉ−Ｉｈｍ　Ｅ−１１−１υ−＜Ａ　ＣＪａＪＣＪ−（Ｊ垣ｒ、５＜　Ｃ！ｌ（り　）ｌ　明　じく　ベト＜ｃａ　＜＞　ｏｔｎ　（り　リ　Ｏ鈎ＯＨυ　淵、：）＜　ｇ＝　短片　矩ぶ　よ。

ＱＥ＋Ｅ−４月　υ　の　ｏ、−＋　（Ｊ　α埼甲　Ｅ−１（１）　Ｅ−１ｃ）　Ｌ）ン　炬芝Ｕ　Φ　ＣＤ　≧　ｈｒｃ＋Ｑ　ＯＯ口　ＯＬ＋　ＬＩＱ　４ａ υ　Φ　■　鈎　ト　Ｈ ”　Ｅ１５　’Ｓ　Ｅｓ　ｔｎ　Ｅ−Ｉ　Ｅ−１ｐｓ：　）−ＩυｃＤ　Ｏ−〇の　υＧ　８片Ｅ−４山　０〉　くＨ短周　ＨトＨ，ｆ：Ｅ−１ｒｄ　Ｅ−１，−１（，１，０［＞　８ｅ’ υ　−υ　ω　＜　鈎　Ｅ−４１０１ミ＝　べＥ−ＩＥ−１６Ｂト＜　Ｈ臼　ＯＵＧＪ　Ｅ＠　為８け　１昌　Ｃ，）１−Ｉ　Ｅ−１ρ　（ｊｒ−（Ｅ−ＩＥ−Ｉ　ＣＪ（り　Ｕ　山　Ｈ山　Ｑ　ＱＢ　杷　Ｏｄ　Ｏリ　Ｏ駒　Ｏりａ＜　（りよ　短片　乏か（Ｊ、−１（Ｊｒ−１（Ｊ　二＜　Ｈト鈎　（Ｊ：５　（Ｊ＄Ｊ　Ｃ）、４ＣＪ（ＬＩ　Ｅ−４Φ　ベ　ト　ト　田Ｅ−１ｃＱ　υ−Ｅ−４Ｅ−１＋、ｐ＞（Ｊｌ！ｌ　ｕｃ　Ｆ−１：）１　υ　鈎０−　０淵 ″　炬芝　ＱＱ　ベト −ＩＱ４ＱＩ′１ｊＣＪ口　Ｑひ　υ− Ｕ、４　Ｅ’　句。６　１芝　８−　〇〉ト　ω　Ｑ　ω　＜Ｃ１％　Ｏ− トぶ　ト一　υ淵トＱ−べＨ躍曝　ベト（！ｌ　φ　０　ロ　ペ　−　υ　− ００１屍浜践　。Ｃ！ｌ　ｓｈ＜＞　＜：ＩＦ−１ｖＪＣり＞Ｃり、−Ｉ　Ｆ−１０Φ冶　〇− （！ｌｏ　ｈｑ　ｈｕ　ｏｑＯの　Ｆ−Ｉｗ　ＣＪ　の　く　Φ Ａｎ＞　Ｅ−１淵　〇− 設片　）１）Ｉ　Ｅ−１山　０く）＋０４　υ−？ｒｄ　（Ｊ、−１くい　００　０−　ト旬ａ＜　＜ｃ／）　ｏｘ　（り＞Ｈｌｌｊ　Ｕｒ６Ｌ）−）＋　へＱ−υ−０ρ　＜のＯＸ　（りべ　ベト　Ｏく＜　１Ｅ−り８汗　。。

″。　起　≦Ｓ　Ｆ−１２４□。

υ　μ ｒＪＩｌｌＩＪＣＤＱＱ　コ　＜Ｏ（ＪＣＱ　リ　α Ｅ−１（Ｌｌ　（Ｊ　鈎　（！＋　飄　く　ＨＯ−Ｕ山　Ｅ−１ｃＪ　ＱＯＱコ　Ｆ−ＩＬＩ　Ｅ−１１４ＬＩＣ：Ｅ−１（Ｌｌ　（Ｊ（Ｌｌ　ｕ、ｃ　＜、−４Ｅ−１！　）ｌψ　４Ｅ−１（ＪＣ！１０　口　Φ　ｑ　ＯΦ　ＯΦ Ｅ−１ω　口目　ｈ、−ｔ　ｈ二Ｅ−ｚ−１＜ＨＥ−１山０　ω　υ　鈎　Ｅ−４絢Ｅ＠−０淵　Ｑパ　８片ｄ、Ｈ＜Ｆ−＋　＜Ｅ＠　Ｅ−ＩＦ−１＜　≦　ｃｂｈ　（Ｊ、−１（Ｊ　鈎（！＋＋！ｌ　ミ蹟　Ｑ＞　＜ヵＱ　Ｐ−１Ｅ−Ｉ　ｄ　Ｑ　Φ Ｅ−１０Ｏリ　くい　ベコＥ″″″　１片　載量　８０（Ｊ−Ｅ−１− Ｅ−４ａＪ　０６Ｊ　■　ｐ　ｈｐＨ二　日Ｈべ一　く論Ｅ−１山　、（＋　（！＋＋り　Ｅ−ＩＥ−１Ｅ−＠０　特　日−トΦ ｕｐ　（ＪＱＪ　Ｅ−４，−ＩＱ　山　ｌ＋　り　く　Ｈ（Ｊｌ−１ｏａ）　’ｚ　ｒ！３　ｕ　αＱ　＝　Ｅ−４，−ｔ　ｏ＋　ｇｔｎ＜Ｅ−４＜ＨＱべ　Ｑべｏ　Ｅ−４＜ｏ　ｏｅ　ｈｐルミ　ミ吏　＜ヵ ○　Ｉ−１Ｑ　Φ Ｕ　山（ＪＱ、　ｈ　Φ　Ｑ　鈎　ｏｍＡ　Ｚ　Ｅ−１，Ｇ　（Ｊ　（１１ＣＪｒ−ＩＱ＜Ｅ＠　山　８ψ　Ｑ　く＜１７１ｏ＞　（りＪＥ−１（Ｊ　Φ ＜に　ｔりＣり　ギ、兇　Ｈ山Ｏ鈎　Ｌ）、−１）１淵ｕｃ　ｈｙ　Ｅ−ＩＱＩ　ｏｈ（ＪＯＪ　べ（Ｑ　ｕ淵炬２　Ｅ−１，ＡｃＤｓ　よ。

＜ｊ　＜＞　ゴ二０１（Ｊ　、４　Ｃ！ｌ　Ｐ４　（！ｌ　−（、Ｄ＜　（！Ｉｃり　ｑ＊　ト　ト υ　ロ　（りｔ７ｔ　（Ｊｌ４　Ｅ−１−υ　ＯＵ二　（！ｌ　−■　Φ　く　為　トＨ＜Ｅ−４Ａ４　ｍｃ／）　Ｅ−ＩＥ−１べＨｏｏ　４＄−＋　ＣＪａ）　（りＣ：　ａ、：（Ｊ　（ＬＩ　Ｅ−ＩＰ−４＜− 認片　Ｅ＠ψ　ぺ＋　ｕｏ　じＥ−１０＜ｏ　ｏｈ　臣シ　、。

（ＪＷ　ＣＪＬ−１（Ｊ　淵Ｑ山　ＵＱ４　＜ｈ　υＱ　Ｕ− Ｅ−Ｉ＄−１ｕ−（Ｊ　ｐ　）Ｉ　（Ｑ　Ｃ５ｔｎＱＯＥ−４つ　トΦ　（り：）−１１片Ｅ−４（１）　○＞　１Ｊｔ−Ｉ　Ｅ−ＩＣ，）り　ｏ＞　４ｓ−４Ｅ−１−υ　− 摺片　（！ｌ−１０ａ３　＜＞　（Ｊ淵Ｃり（！ｌ　Ｅ−１の　ト　ト　ベ　ＨＣり：）−１Ｆ−１山　ト　陶　ト　−　Ｕ　トＣり、−１　＜ｔｎ　＜＞　べゞ　８＄００　Ｑべ　トド　トド＜ｏ　＜、ｑ　Ｅ４Ｑ＋　ｌ−４ａｔ　＜＞ＵＷ　Ｅ−４１′＋５　４の　１− ＋　、−１（り　、−１（ＪＱＩ　（り＞　ｔＪ＜　べＨＱｏＥ−４１−１日　ＬＩ　Ｑ　ｌ′ｌｊ　Ｏ鈎Ｆ＠　づ　ＵａＪ　＜　冶り＞　Ｅ−１ｃＱ　’８詞　トド８“　０　８片８　ｅ’　ｕ、−ｔＥ＠Ｅ−１りべ　淀ミ　ＨトＱ　ψ　Ｏ〔０２１日　リ＞　＜−＋Ｈｃ＋ＣＪＡ　ＣＪ　山　Ｅ−ＩＬ）　（Ｊ（！＋ｏ：５Ｆ−１　鈎　Ｏ駒　ＯＢＨΦ　Ｏω　ｏａｔ　埼甲ＯＩ−Ｉ　Ｅ−４力　Ｅ−１（１）ＱＯ問題　（Ｊ（１１＜コＨΦ　Ｅ−４Ｆ−ＩＥ−ＩＯＱ−べＨＨ− り一　（Ｊｌ、４　ＱＬＩ　ｌ−４鈎Ｅ−Ｉ　１）　Ｏ淵　Ｑ　Φ ０＞　翼ｉ’Ｅ　ｓｈ　＜。

ｕ　′：３　ｕ　づ　＜　ロ８片　トΦ　眠　。

Ｑ　淵Ｅ−ＩＥ−Ｉ　ＣＪＴｈｕＱＩＥ−４１−Ｉ　Ｅ−１１−Ｉ　Ｅ−１，−１＜　の　Ｏ垣　（ＪＧＪ　Ｅ −１田Ｑ　く　く　Ｅ−１ヒ　の　Ｑ　〉藏　１．、＋　（Ｊｌ−１■　ｓ　Ｅ−１鈎（Ｊ（Ｌｌ　（ＪＧＪ　Ｅ−４ｎ　Ｌ）（ＬＩＥ−１ｃ／）　Ｅ−ＩＣ／）　（り＞　＜ｔｎＱ：Ｉ　Ｑ≧　ｈｍ　認ヨ＜、−１ｕ　ｒ−１（Ｊ　＋−１００■　■　＜）ｄ、　ＣＤＣＤｇ個　（！Ｉｃり　（りＣ！ｌ　神（５Ｆ４　＜ｓ　８片０　為　０　りＥ−１１’ｃｌ　）ＩＷ　Ｃり　シ　）１０Ｕ、−１（りΦ　べ一　〇− ａ＜　＜ｒ、ｒｒ　ｏａ　Ｃ，）　山Ｅ−ＩＬＩ　Ｕ≧　Ｏｈ　ト一＜＞　（り−（り、−Ｉ　Ｆ−１勺Ｅ−Ｉ　Ｅ−４Ｃ！ｌ（り　（り（り　（！ｌ＞υ　：Ｉ　Ｑ　い　ト　ψ　← 　−υ　Φ。、、２　温々　＜″　Ｃ！＋１１）　Ｅ−１，−ＩＥ−ＩｏＪ（Ｊ　頴　＜ｃ／）＜ＨＬ　（りＳ　＜ＨＣＪＬ）　ＣりＪＣＱ　ｕｒ＋ｉ　（ＪＧ）　Ｃりｌ：　１≧　υＰ−Ｉ　Ｅ−ＩＰｌ　＜ｓＯ口　Ｑ　冶　０　鈎　０　Φ　υ　鈎４ｒ−＋　Ｃり、−Ｉ　Ｌ）Φ　ト淵　０淵ｕｏ　Ｃ！Ｉｃ！ｌ　べψ　ト山　ベトｓ＞　Ｅ−４ｐ　（Ｊ（Ｌｌ　ｈｈＣりＦ−１ｏ、、ＪＥ−１淵　く、８よｒ、Ｄｏ　Ｅ−１（１）　Ｅ−ＩＱＪ　Ｅ−ＩＥ−１（、）。

＜０　≦ヨ　（ＪＱ、　（４）Ｅ−４［飄ａｙ　＜　の　０　ＨＣ山　ＱＯＱべ　ギ史　ＱＱ須汐　Ｅ−１ｔ’＋ｊ（Ｊ−Ｉ　Ｌ）、−１の　＜ｓ　５ＨＬＩｔｌ　Ｅ−１飄０〉　べＥ−Ｉ　ＣＤ＜　ｒＪａｃｐｅ　ｕ　口　Ｃ５：）−１ｈ　０　Ｕ　ω＜−４認に　（り、−Ｉ　Ｅ−１，−Ｉ　Ｅ−１淵Ｑ　（！ｌ　Ｑ　Ｕ　べ　ｌ−Ｉ　Ｅ−１山わ　＜コ　＜＞　（りＯｈａ＋日ω　（！１ｌｒ−Ｉ　Ｑ鈎　−− ｈｑ　ｑｏ　（Ｊ山　べＨＯひ　Ｅ−ＩＱ。

“°　０゛　ロコ　８詞　。よ ←Φ　（り、−１　＜の（Ｊ！　（りＣ！１（Ｊ、−Ｉ　Ｆ−１１４Ｅ−１ψ　Ｆ−１，−Ｉ　Ｆ−１１Ｆ−Ｈｒｄ　（ＪＯＪ　Ｌｌ＞　Ｈｒｄ　（！＋　■す〉　日　切　θ０　０〉　くりＥ−１（１１Ｈコ　（！ｌｐ　ＣＪ−８片　、□ ８″′　６甜　−ψ　Ｅ−ＩＦ−１ｘ圓（ＪＯＪ〇　− Ｑコ　０口　＠コ　Ｏ鈎　ＣＪ、−１’Ｅ−１（Ｌ）　＜冶　Ｈｌ）９ ”　５３　（Ｊ）−Ｉ　Ｅ−ＩＥ−１（！ｌ＞　ＬＬ一（Ｊｌ−１ｔ！ｌ、−Ｉ　Ｌ）Ｌ４　Ｆ−１０８片Ｌ）ＣＬＩ　（Ｊ（Ｌ）　Ｅ −ＩＪ：＜ψ　拐ｇ　ｂ力　Ｂ〜　Ｈ← （Ｊ（ＬＩ　Ｃり仁＋−ｔｏ　（ＪＱ）　ｏｅｎＥ−１，ｆｌ：　＜、−ｔ　ｕ　ｌ−Ｉ　Ｅ−１淵　じ　阿Ｅ−１〜　Ｕリ　０〜　Ｈ山　べ　くＱ　％−４０り　ト　−　Ｏ飄 υ（１）　Ｅ−１（Ｌｌ　＜＞　’ｄ’ＧＥ−１ｃ／）　ｕｑ　Ｅ−１ｈｏｃｔ　ｈｈ　ｕｏ　正月Ｅ−１，−１（りΦ　Ｑ絢にＨ＜ｃ／）　Ｑ山　ＱＱ（ｊＬＩ　（ＪＳ−１）４ＱＩ　（Ｊ＞０６　Ｌ）１１１　＜ψ　Ｑ− ＜Ｅ−１＜（１）（り鵡　ＱＯ（Ｊ（Ｌｌ　＜ｅｕ　ｇか　８片Ｅ−１〜　＜Ｈ淀−ＨトＥ−１４トドペＩ７″　１二　く…　０− Ｑ陶　０−　く洲Ｃ）＜　（、）（り　（！ｌ＜　Ｅ−１８υ　自　０　口　υ　ｍ　ｕｏ　ｈｙｕｐ−ｔ　ｕｙ ”　２’Ａ　Ｃり＜　（Ｊｃｂ　”？’＋３’ｒｒ、Ｄ＜＜−〇の　べ鈎　（ＪＳ−１（Ｊ、−ＩＱ　淵　＠　Φ　ト　ｄｃＪｃ）　１片　ベト　ベリ　の〉Ｅ−４ｃ／）Ｅ−１−（Ｊ　ｒｃｌ　ＣＪ　Ｏａ　Ｅｓ　ＨＥ−＜　ｙべ＞　（Ｊ−＜リ　００　〇二ｈＥ−ＩＣり＜　（りべ　べの　ペ　トυ−ｈｅ　Ｌ）り　トα　υ− ぺ＞　１局　＜８　＜の　ト弓ト　ト　Ｃり（り　Ｃ：）＜　（！ｌ＞０　細　υ　Ｑ、　Ｅ−４＄４　（ＪＬＩ　Ｃ！１１１１（Ｊ　ｇ　ＣＪ　ｔＤ　＜　＞　＠　Φべ、已５　ト。　トド　〇− △・・・１：　Ｈ５５−ＲＴＡ、　（ＩＣ５０＝　８．３）！　２：　Ｈ６５［Ｆ（ＡＳ’）］、　（ＩＣ５０＞　ＭＡＸ）−一丑−＋　３：　８５５　［Ｆ（ＡＢ″）］−ＲＴＡ、３０．　（ｌｃ５０　＝　４３）ＦＩＧ、１３フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／１８　８３１８−４Ｈ１９１００８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／１９　７２３６−４Ｂ１／２１　７２３６−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／６２（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒに１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：１９）（７２）発明者　キャロル、ステイープアメリカ合衆国カリフォルニア９４５９６、ウォルナット・クリーク、ミルター・アベニュー　１３０幡Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．免疫グロブリンＦａｂ′またはＦ（ａｂ′）２断片分子のＦｄポリペプチドをコード化する配列に機能可能に連結した細菌プロモーター配列からなるポリヌクレオチド分子。
２．Ｆｄ配列が軽鎖とＦｄ鎖の間に形成したジスルフィド結合のカルボキシル側のＦｄヒンジ領域内に２またはそれ以上のシステイン残基をコード化する請求項１に記載の分子。
３．最も高いアミノ酸番号を有するシステイン残基とカルボキシル末端の間に３０アミノ酸残基未満が存在する請求項２に記載の分子。
４．ＦｄポリペプチドがＦａｂ′またはＦ（ａｂ′）２分子の一部である時にＴ細胞と反応性である可変領域をコード化している請求項１に記載の分子。
５．Ｆｄポリペプチドがキメラである請求項１、２、３または４のいずれかに記載の分子。
６．請求項１に記載の分子を含むベクター。
７．免疫グロブリンＦａｂ′またはＦ（ａｂ′）２断片分子の軽鎖ポリペプチドをもコード化する請求項６に記載のベクター。
８．請求項６または請求項７のいずれかに記載のベクターで形質転換された細菌。
９．Ｆａｂ′またはＦ（ａｂ′）２免疫グロブリン断片のＦｄポリペプチドをコード化する配列に機能可能に連結した酵母プロモーター配列からなるポリヌクレオチド分子。
１０．Ｆｄ配列が軽鎖とＦｄ鎖の間に形成したジスルフィド結合のカルボキシル側のＦｄヒンジ領域内に２またはそれ以上のシステイン残基をコード化する請求項９に記載の分子。
１１．最も高いアミノ酸番号を有するシステイン残基またはカルボキシル末端に最も近いシステイン残基とカルボキシル末端の間に３０アミノ酸残基未満が存在する請求項９に記載の分子。
１２．Ｆａｂ′またはＦ（ａｂ′）２分子がＴ細胞と反応性である請求項９に記載の分子。
１３．Ｆａｂ′またはＦ（ａｂ′）２分子がキメラである請求項９、１０、１１または１２のいずれかに記載の分子。
１４．請求項９に記載の分子を含むベクター。
１５．免疫グロブリンＦａｂ′またはＦ（ａｂ′）２断片分子の軽鎖ポリペプチドをもコード化する請求項１４に記載のベクター。
１６．請求項１４または請求項１５のいずれかに記載のベクターで形質転換された酵母。
１７．免疫グロブリンＦａｂ′分子を製造する方法であって、ａ）請求項７に記載のベクターで形質転換された細菌を培養し、ｂ）その培養培地からＦａｂ′を単離することからなる方法。
１８．免疫グロブリンＦ（ａｂ′）２分子を製造する方法であって、ａ）請求項７に記載のベクターで形質転換された細菌を培養し、ｂ）その培養培地から（Ｆａｂ′）２を単離することからなる方法。
１９．免疫グロブリンＦａｂ′分子を製造する方法であって、ａ）請求項１５に記載のベクターで形質転換された酵母を培養し、ｂ）その培養培地からＦａｂ′ を単離することからなる方法。
２０．免疫グロブリンＦ（ａｂ′）２分子を製造する方法であって、ａ）請求項１５に記載のベクターで形質転換された酵母を培養し、ｂ）その培養培地からＦ（ａｂ′）２を単離することからなる方法。
２１．免疫グロブリンＦ（ａｂ′）２分子を製造する方法であって、ａ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によって第１のＦａｂ′を製造し、ｂ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によって第２のＦａｂ′を製造し、ｃ）第１のＦａｂ′と第２のＦａｂ′を組み合わせてＦ（ａｂ′）２を形成させることからなる方法。
２２．免疫複合体を製造する方法であって、ａ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によってＦａｂ′を製造し、ｂ）そのＦａｂ′の選択的に還元し得るヒンジシステインを還元し、ｃ）還元したＦａｂ′をチオール含有活性部分に連結することからなる方法。
２３．免疫複合体を製造する方法であって、ａ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によってＦａｂ′を製造し、ｂ）そのＦａｂ′の選択的に還元し得るヒンジシステインを還元し、ｃ）還元したＦａｂ′をチオール含有活性化化合物に達結し、ｄ）還元したＦａｂ′に先に連結したチオール含有活性化化合物をさらにチオールー反応性活性部分に連結することからなる方法。
２４．活性化化合物がジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）またはジチオビス（ニトロベンゾエート）である請求項２３に記載の方法。
２５．免疫複合体を製造する方法であって、ａ）請求項１８または請求項２０に記載の方法によってＦ（ａｂ′）２を製造し、ｂ）そのＦ（ａｂ′）２を活性部分に連結することからなる方法。
２６．免疫複合体を製造する方法であって、ａ）請求項２１に記載の方法によってＦ（ａｂ′）２を製造し、ｂ）そのＦ（ａｂ′）２を活性部分に連結することからなる方法。
２７．Ｆａｂ′−酵素複合体を製造する方法であって、ａ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によってＦａｂ′を製造し、ｂ）そのＦａｂ′を酵素に連結することからなる方法。
２８．酵素がリボソーム不活化タンパク質である請求項２７に記載のＦａｂ′− 酵素複合体を製造する方法。
２９．酵素がリシン毒素Ａ鎖である請求項２７に記載のＦａｂ′−酵素複合体を製造する方法。
３０．Ｆａｂ′がヒトＴ細胞に特異的である請求項２７に記載のＦａｂ′−酵素複合体を製造する方法。
３１．Ｆａｂ′がＣＤ５またはＣＤ７に特異的である請求項２７に記載のＦａｂ ′−酵素複合体を製造する方法。
３２．Ｆ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法であって、ａ）請求項１８または請求項２０に記載の方法によってＦ（ａｂ′）２を製造し、ｂ）そのＦ（ａｂ′）２を酵素に連結することからなる方法。
３３．酵素がリボソーム不活化タンパク質である請求項３２に記載のＦ（ａｂ′ ）２−酵素複合体を製造する方法。
３４．酵素がリシン毒素Ａ鎖である請求項３２に記載のＦ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法。
３５．Ｆ（ａｂ′）２がヒトＴ細胞に特異的である請求項３２に記載のＦ（ａｂ ′）２−酵素複合体を製造する方法。
３６．Ｆ（ａｂ′）２がＣＤ５またはＣＤ７に特異的である請求項３２に記載のＦ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法。
３７．Ｆ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法であって、ａ）請求項２１に記載の方法によってＦ（ａｂ′）２を製造し、ｂ）そのＦ（ａｂ′）２を酵素に連結することからなる方法。
３８．酵素がリボソーム不活化タンパク質である請求項３７に記載のＦ（ａｂ′ ）２−酵素複合体を製造する方法。
３９．酵素がリシン毒素Ａ鎖である請求項３７に記載のＦ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法。
４０．Ｆ（ａｂ′）２がヒトＴ細胞に特異的である請求項３７に記載のＦ（ａｂ ′）２−酵素複合体を製造する方法。
４１．Ｆ（ａｂ′）２がＣＤ５またはＣＤ７に特異的である請求項３７に記載のＦ（ａｂ′）２−酵素複合体を製造する方法。
４２．２つの異なる抗原に対する特異性を有するＦ（ａｂ′）２。
４３．該抗原が腫瘍関連抗原である請求項４２に記載のＦ（ａｂ′）２。
４４．２つの異なる抗原に対する特異性を有するＦ（ａｂ′）２を製造する方法であって、ａ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によって第１の腫瘍関連抗原に対する特異性を有する第１のＦａｂ′を製造し、ｂ）請求項１７または請求項１９に記載の方法によって第２の腫瘍関連抗原に対する特異性を有する第２のＦａｂ′を製造し、ｃ）２つの異なる腫瘍関連抗原に対する特異性を有するＦ（ａｂ′）２が形成するように、第１のＦａｂ′と第２のＦａｂ′を組み合わせることからなる方法。