JP2009517340A - ドーパミン作動性ニューロンの神経突起成長および生存を促進するための方法 - Google Patents

ドーパミン作動性ニューロンの神経突起成長および生存を促進するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般的には、ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、および生存を促進するための方法に関する。この方法には、上記ドーパミン作動性ニューロンを、Ｓｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と、接触させる工程が、含まれる。加えて、本発明は、一般的には、ドーパミン作動性ニューロンの変性または死が関係している様々な疾患、障害、あるいは損傷を、Ｓｐ３５アンタゴニストの投与によって処置する方法に関する。

Description

（発明の分野）
本発明は、神経学、神経生物学、および分子生物学に関する。さらに具体的には、本発明は、ドーパミン作動性神経突起の再生、成長、およびドーパミン作動性ニューロン（ＤＡニューロン）の生存を促進する方法に関する。加えて、本発明は、Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）受容体アンタゴニストの投与により、ドーパミン作動性ニューロンの変性または死が関係している症状を処置する方法に関する。
（発明の背景）
特定の神経変性障害は、ドーパミン作動性ニューロンの変性を特徴とする。例えば、パーキンソン病には、中脳の黒質の中のドーパミン作動性ニューロンの進行性の破壊が伴う。この破壊は、化学伝達物質であるドーパミンのレベルの低下を生じる。パーキンソン病の身体症状には、随意運動の機能障害、および特徴的な振動を生じる筋肉のグループの制御不可能な律動的な単収縮が含まれる。
最も広く使用されているパーキンソン病の処置は、ドーパミン前駆体であるＬ−ドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の投与である。Ｌ−ドーパは、残っているドーパミンニューロンによって主に脱カルボキシル化された後に、失われたドーパミンに置き換わることによって間接的に作用する。しかし、Ｌ−ドーパの使用には欠点が伴う。患者は、多くの場合には、運動障害、吐き気、嘔吐、腹部膨満、および精神医学的副作用のような副作用に悩まされ、そして患者は、通常は、時間が経つにつれてＬ−ドーパでの処置にあまり反応しなくなる。Ｌ−ドーパでの処置が時間が経つにつれて有効ではなくなってしまうことについての提案されている理由の１つは、生存しているドーパミン作動性ニューロンの数が枯渇してしまい、したがって、投与されたＬ−ドーパに反応できなくなってしまうことである。非特許文献１を参照のこと。加えて、ニューロンの結合（末端またはシナプス）が続けて失われると、ドーパミン作動性ニューロンの死が原因で、Ｌ−ドーパの有効性が低下する。上記を参照のこと。シナプス後のドーパミンアゴニストを使用する治療の別の形態にもまた、副作用が伴う。さらに、Ｌ−ドーパでの処置によって患者の生活の質は改善するが、これでは疾患の進行を停止させることはできない。
他の化合物（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））は、長期間にわたって注入によって投与された場合には、ヒト患者のパーキンソン病の処置において期待が示されている。例えば、非特許文献２を参照のこと。しかし、これらの処置のレジュメは、依然として開発の初期段階にある。
多くの他の疾患および障害もドーパミン作動性ニューロンの変性に関係している可能性がある。これらには、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性（ｃｏｒｔｉｃａｌ−ｂａｓｅｄ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群（Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ ｄｉｓｅａｓｅ）、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳血管性パーキンソニズム（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｈｅａｄ ｔｒａｕｍａ）、脳炎後のパーキンソン病、統合失調症、および神経梅毒が含まれる。
Ｉｓａｃｓｏｎ Ｏ．，「Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ａｎｄ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎｅｕｒｏｎ ４３：１６５−１６８（２００４） Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）
したがって、ドーパミン作動性ニューロンの変性または死を特徴とするパーキンソン病および他の症状についてのさらに別の処置方法が依然として必要とされている。
（発明の簡単な要旨）
本発明は、ＬＩＮＧＯ−１が中脳のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの中で発現され、そして神経突起の成長およびＤＡニューロンの生存をネガティブ調節することの発見に基づく。これらの発見に基づいて、本発明は、一般的には、ドーパミン作動性ニューロンの増殖、生存、修復、成長、および変性を促進するための方法に関する。この方法には、上記ドーパミン作動性ニューロンを、Ｓｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させる工程が含まれる。加えて、本発明は、一般的には、Ｓｐ３５アンタゴニストの投与による、ドーパミン作動性ニューロンの変性または死が関係している様々な疾患、障害、または損傷の処置方法に関する。
特定の実施形態においては、本発明には、哺乳動物においてドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、または生存を促進するための方法が含まれる。この方法には、その必要がある哺乳動物に、Ｓｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与する工程が含まれる。
さらに別の実施形態においては、哺乳動物は、ドーパミン作動性神経突起の変性または死が関係している疾患、障害、損傷、または症状を有していると診断されている。いくつかの実施形態においては、疾患、障害、損傷、または症状は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、脳血管性パーキンソニズム、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷、脳炎後のパーキンソン病、神経梅毒、および統合失調症からなる群より選択される。
上記方法の様々な実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、または生存をネガティブに調節するＳｐ３５の能力を妨害する任意の分子であり得る。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体もしくはその断片、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、Ｓｐ３５アプタマー、あるいは２つ以上のＳｐ３５アンタゴニストの組み合わせからなる群より選択される。
特定の実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドである。本発明の特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、以下のドメインの１つ以上を含むか、または以下のドメインの１つ以上が欠失している可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない：（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域、および（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン。いくつかの実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５ ＬＲＲドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが欠失している。さらに別の本発明のＳｐ３５可溶性ポリペプチドには、膜貫通ドメインと細胞質ドメインが欠失しているポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、Ｓｐ３５ ＬＲＲドメインが含まれ、そしてＳｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが欠失している。いくつかの実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２、または配列番号２のアミノ酸残基３６〜５３２が含まれる。
いくつかの実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５ではない部分を含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、Ｓｐ３５ではない部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、および精製を容易にする部分からなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、抗体Ｉｇ部分はヒンジ部分およびＦｃ部分である。
別の実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、以下のＳｐ３５ドメインの１つ以上を含むＳｐ３５ポリペプチドに結合する抗体またはその断片である：（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域、および（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン。加えて、Ｓｐ３５抗体またはその断片は、本明細書中に記載されるＳｐ３５ポリペプチド断片を含むポリペプチドの中のエピトープに特異的に結合する。
他の実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のような、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドである。
さらなる実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストはＳｐ３５アプタマーである。Ｓｐ３５アプタマーは、Ｓｐ３５に結合して、ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、および生存をネガティブに調節するＳｐ３５の能力を妨害する、小さいポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
本発明のさらなる実施形態には、インビボでの遺伝子治療による、ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、および生存を促進するための方法、あるいは、ドーパミン作動性神経突起の変性もしくは死が関係している疾患、障害、または損傷を処置する方法が含まれる。この方法には、哺乳動物に対して、疾患、障害、もしくは損傷の部位またはその近くに、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を投与する工程が含まれる。その結果、Ｓｐ３５アンタゴニストは、損傷部位もしくはその近くでのドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、または生存の阻害を少なくするために十分な量で、哺乳動物においてヌクレオチド配列から発現される。特定の実施形態においては、ベクターはウイルスベクターであり、これは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パルボウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される。いくつかの実施形態においては、疾患、障害、損傷、または症状は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、脳血管性パーキンソニズム、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷、脳炎後のパーキンソン病、神経梅毒、および統合失調症からなる群より選択される。
加えて、本発明には、ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、および生存を促進するための方法、あるいは、ドーパミン作動性神経突起の変性もしくはしに関係している哺乳動物の疾患、障害、または損傷を処置する方法が含まれる。この方法には、：（ａ）ドーパミン作動性ニューロンの中にＳｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入する工程；および（ｂ）上記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させる工程が含まれる。加えて、本発明は、（ａ）上記哺乳動物に、発現制御配列に対する動作可能な連結によりＳｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを投与する工程、および（ｂ）上記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させる工程が含まれる方法に関する。いくつかの実施形態においては、培養された宿主細胞は、処置される哺乳動物に由来する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、または直接のマイクロインジェクションにより、宿主細胞またはドーパミン作動性ニューロンの中に導入される。特定の実施形態においては、処置される疾患、障害、損傷、または症状は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、脳血管性パーキンソニズム、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷、脳炎後のパーキンソン病、神経梅毒、および統合失調症からなる群より選択される。
いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチド、アプタマー、および抗体はポリマーに結合させられる。いくつかの実施形態においては、ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドおよび抗体は、１個、２個、３個、または４個のポリマーに結合させられる。いくつかの実施形態においては、ポリマーの分子量の合計は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａまでである。
（発明の詳細な説明）
定義
他の場所で定義されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。文脈によって他の場所で必要とされない限りは単数形の用語には複数形の用語が当然含まれ、そして複数形の用語には単数形の用語が当然含まれる。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、個々の刊行物または特許出願が引用により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているかのように、全ての目的のためのそれらの全体が引用により組み入れられる。
本明細書中に記載されるものに類似しているまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定とは意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な記載から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が提供される。
用語「ａ」または「ａｎ」のものは、１つ以上のそのものを意味することに留意されたい。例えば、「免疫グロブリン分子（ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を示すと理解される。このように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中ではほとんど同じ意味で使用することができる。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、任意の記載される請求項数値または整数値のグループが含まれることを示すが、任意の他の整数値または整数値のグループの排除を示すものではない。
本明細書中で使用される場合は、「治療有効量」は、所望される治療結果を得るために、必要な投与量で、そして必要な時間の間、有効である量を意味する。治療結果は、例えば、症状の軽減、より長い生存期間、活動の改善などであり得る。治療結果は必ずしも「治癒」でなくてよい。
本明細書中で使用される場合は、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の症状を緩和するかまたは軽減するために動物に薬剤を投与することを意味する。加えて、用語「処置」または「処置する」は、疾患の進行を防ぐための動物への薬剤の投与を意味する。
本明細書中で使用される場合は、「予防有効量」は、所望される予防結果を得るために、必要な投与量で、そして必要な時間の間、有効である量を意味する。通常、予防的用量は疾患の前に、または疾患の初期段階に被験体において使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少ないであろう。
本明細書中で使用される場合は、「ポリヌクレオチド」には、全長のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列が含まれ得、これには、５’および３’非翻訳配列、コード配列、さらには、核酸配列の断片、エピトープ、ドメイン、および変異体が含まれる。ポリヌクレオチドは任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。これは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖の領域と二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖の領域と二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、また、より典型的には二本鎖であるかまたは一本鎖の領域と二本鎖の領域の混合物であってもよい、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖の領域から構成され得る。ポリヌクレオチドには、安定性または他の理由のために修飾された、１つ以上の修飾された塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格が含まれる場合もある。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基と、イノシンのような珍しい塩基が挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学修飾された形態、酵素によって修飾された形態、または代謝によって修飾された形態が含まれる。
本発明においては、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合させられたアミノ酸（すなわち、ペプチド等量式）から構成され得、そしてこれには、２０種類の遺伝子をコードするアミノ酸（例えば、自然界には存在しないアミノ酸）以外のアミノ酸が含まれる場合がある。本発明のポリペプチドは、いずれかの自然なプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）によって、あるいは、当該分野で周知の化学修飾技術によって修飾することができる。そのような修飾は、基本的なテキストに、そしてより詳細なモノグラフに、さらには、膨大な量の研究論文に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ酸末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどの場所でも起こり得る。同じタイプの修飾が、任意のポリペプチドの中のいくつかの部位で、同じ程度で、または異なる程度で存在する場合がある。また、任意のポリペプチドには、多くのタイプの修飾が含まれ得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、そしてこれらは環状である場合もあり、これには分岐を伴う場合も、また分岐を伴わない場合もある。環状のポリペプチド、分岐しているポリペプチド、および分岐している環状のポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセスの結果生じる場合も、また、合成方法によって作成される場合もある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニレル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、およびエビキチン化が含まれる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」、およびアナログには、本発明のＳｐ３５アンタゴニストについて言及される場合には、Ｓｐ３５活性を阻害する能力を少なくともいくらか保持している任意のアンタゴニスト分子が含まれる。Ｓｐ３５アンタゴニストには、本明細書中で使用される場合には、Ｓｐ３５アンタゴニストがその機能を果たす限りは、断片、変異体、または誘導体分子が制限なく含まれ得る。本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、Ｓｐ３５タンパク質分解性断片、欠失断片、そして特に、動物に投与されると作用部位により早く到達する断片が含まれ得る。ポリペプチド断片にはさらに、自然界に存在しているポリペプチドの抗原性エピトープまたは免疫原性エピトープ（直鎖状エピトープ、ならびに三次元エピトープが含まれる）を含むポリペプチドの任意の部分が含まれる。本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、上記の断片を含む変異体Ｓｐ３５領域が含まれる場合があり、そして、アミノ酸置換、欠失、もしくは挿入が原因で変化しているアミノ酸配列を有しているポリペプチドも含まれる場合がある。変異体は、自然に生じる場合があり、例えば、対立遺伝子変異体であり得る。「対立遺伝子変異体」によっては、生物の染色体上の任意の遺伝子座を占有している遺伝子の別の形態が意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．，編．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。自然界には存在しない変異体は、当該分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生産することができる。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、あるいは付加が含まれ得る。本発明のＳｐ３５アンタゴニストには、誘導分子も含まれる場合がある。例えば、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、自然界に存在しているポリペプチドについては見られないさらなる特徴を示すように変更されたＳｐ３５領域が含まれる場合がある。例としては、融合タンパク質およびタンパク質結合体が挙げられる。
本発明においては、「ポリペプチド断片」は、Ｓｐ３５ポリペプチドの短いアミノ酸配列を意味する。タンパク質断片は「独立しているもの（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」である場合も、また、その断片が一部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチドの中に含まれる場合もある。本発明のポリペプチド断片の代表的な例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸、またはそれ以上の長さを含む断片が挙げられる。
特定の実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストは、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子、またはそれらの免疫特異的断片であり、例えば、自然界に存在している抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する操作された抗体分子もしくは断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書中ではほとんど同じ意味で使用される。加えて、本発明の方法において使用される免疫グロブリン分子はまた、「免疫特異的」または「抗原特異的」または「抗原結合性」分子と記載される場合もあり、抗体分子およびその断片を言うようにほとんど同じ意味で使用される。抗体または免疫グロブリンには、重鎖の可変ドメインが少なくとも含まれ、通常は、重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインが、少なくとも含まれる。脊椎動物システムの基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、引用により本明細書中に組み入れられるＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）を参照のこと。
以下でさらに詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」には、生化学的に識別することができる５つの広いクラスのポリペプチドが含まれる。５つのクラスは全て、明らかに本発明の範囲にある。以下の議論は、一般的に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関する。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子には、およそ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同じ軽鎖ポリペプチドと、５３，０００〜７０，０００の分子量の２つの同じ重鎖ポリペプチドが含まれる。４つの鎖は、通常、「Ｙ」立体配置でジスルフィド結合によって連結されており、ここでは、軽鎖は「Ｙ」の口の部分で始まり、可変領域を介して伸びる重鎖をひとまとめにしている。
軽鎖および重鎖はいずれも、構造的相同性と機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）部分と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）部分の両方によって抗原の認識および特異性が決定されることは明らかであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）により、分泌、経胎盤運動性（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性が付与される。慣例により、定常領域ドメインの番号は、これらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から離れるに伴い、大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインには、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端がそれぞれ含まれる。
軽鎖は、カッパまたはλ（κ、λ）のいずれかとして分類される。それぞれの重鎖のクラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかに結合することができる。一般的には、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「テール」部分はジスルフィド共有結合によって、あるいは、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作成される場合には共有結合以外の結合によって互いに結合する。重鎖の中では、アミノ酸配列は、Ｙ立体配置のフォークの先端部にあるＮ末端から、それぞれの鎖の低部にあるＣ末端に向かって並ぶ。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、これらの中にはいくつかのサブクラスがある（例えば、γ１〜γ４）ことを理解するであろう。この鎖の性質が、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとしての抗体の「クラス」を決定する。免疫グロブリンのサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は十分に特性決定されており、機能的特異性を付与することが知られている。これらのクラスおよびイソ型のそれぞれの修飾されたバージョンは、本開示を考慮すれば当業者は容易に認識することができ、したがって、本発明の範囲に含まれる。
上記に示されたように、可変領域により、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインは一緒に可変領域を形成し、これが三次元的な抗原結合部位を定義する。この４つの分子からなる抗体の構造はＹのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖のそれぞれの上にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。いくつかの場合（例えば、ラクダ科の種に由来するか、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子）には、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖だけから構成され、軽鎖が含まれない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照のこと。
自然界に存在している抗体においては、それぞれの抗原結合ドメインの中に存在する６個の「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、アミノ酸の短く、不連続な配列であり、これは水性の環境の中で抗体がその三次元立体配置を確実にとると、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されている。抗原結合ドメインの中の残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼ばれ、低い分子間での可変性を示す。フレームワーク領域はほぼβ−シートの立体配置をとり、ＣＤＲは、β−シート構造を繋ぐ、または場合によってはその一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有相互作用によって、正確な方向のＣＤＲの配置を提供する足場を形成する役割を担う。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性の抗原上のエピトープに対する表面相補性を定義する。この相補性の表面は、その同種のエピトープに対する抗体の共有結合ではない結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸はそれぞれ、当業者であれば、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定することができる。なぜなら、これらは正確に定義されているからである（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照のこと、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。
しかし、ラクダ科の種においては、重鎖可変領域（ＶＨＨと呼ばれる）は、完全なＣＤＲを形成する。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と通常の抗体（ＶＨ）に由来する領域の間での主な相違点としては、（ａ）ＶＨＨの中の対応する領域と比較して、ＶＨの軽鎖接触表面の中のアミノ酸はより疎水性であること、（ｂ）ＶＨＨのＣＤＲ３のほうがより長いこと、そして（ｃ）ＶＨＨの中のＣＤＲ１とＣＤＲ３の間でジスルフィド結合が頻繁に起こることが挙げられる。
１つの実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、抗体分子の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも２つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、１つの以上の抗体分子に由来する少なくとも３つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも４個のＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも５個のＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも６個のＣＤＲが含まれる。目的の抗原結合分子に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当該分野で公知であり、そして、例示的な分子は本明細書中に記載される。
本発明の方法において使用される抗体またはその免疫特異的断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産される断片、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（本明細書中に開示される結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定はされない。ＳｃＦｖ分子は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。
抗体断片（単鎖抗体を含む）には、可変領域（単数または複数）が単独で、あるいは以下の全体または一部と組み合わせて含まれ得る：ヒンジ領域、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン、または軽鎖のＣＬ。本発明には、可変領域（単数または複数）のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＬドメインとの任意の組み合わせもまた含まれている抗原結合断片も含まれる。本明細書中に開示される方法において使用される抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、またはニワトリ抗体である。別の実施形態においては、可変領域は、軟質類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であり得る。本明細書中で使用される場合は、「ヒト」抗体には、以下に、そして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有している抗体が含まれ、そして、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、もしくは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性の免疫グロブリンは発現しない動物から単離された、抗体が含まれる。
本明細書中で使用される場合は、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドには、以下の少なくとも１つが含まれる：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部ヒンジ領域、中部ヒンジ領域、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片。例えば、重鎖部分には、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれ得る。重鎖部分にはまた、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれるポリペプチドも含まれ得る。さらに、本発明において使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメイン全体または一部）が欠失している場合がある。上記に示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を、それらの自然界に存在している免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸配列を変化させるように修飾することができることは、当業者に理解されるであろう。
本明細書中に開示される方法において使用される特定のＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片においては、多量体のうちの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体のうちの第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同じである。あるいは、本発明の方法において使用される、重鎖部分を含む単量体は同じではない。例えば、個々の単量体には、異なる標的結合部位が含まれる場合があり、これによっては、例えば、二重特異的抗体が形成される。
本明細書中に開示される方法において使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、様々な免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分には、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域が含まれる場合がある。別の例においては、重鎖部分には、一部分はＩｇＧ１分子に由来し、そして一部分はＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域が含まれる場合がある。別の例においては、重鎖部分には、一部分はＩｇＧ１分子に由来し、そして一部分はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジが含まれる場合がある。
本明細書中で使用される場合は、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分には、ＶＬドメインまたはＣＬドメインの少なくとも１つが含まれる。
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）の自然界には存在しない変異体をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失をコードされるタンパク質の中に導入するように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列の中に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作成することができる。突然変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによって媒介される突然変異誘発）によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の必須ではないアミノ酸残基に対して行われる。
本明細書中で開示される方法において使用される抗体またはその免疫特異的断片はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して記載されるかまたは明記される場合もある。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数あるいはＫｄを有しているものが挙げられる。
本明細書中で開示される方法において使用される抗体またはその免疫特異的断片は、本明細書中に記載されるように、Ｓｐ３５のアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法において使用される抗体はアンタゴニストとして機能する場合があり、Ｓｐ３５ポリペプチドの抑制活性をブロックするかまたは阻害する場合がある。
本明細書中で使用される場合は、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られたかまたは第１の種に由来し、そして定常領域（これは、完全なものである場合も、一部である場合も、また、本発明にしたがって修飾される場合もある）が第２の種から得られた任意の抗体を意味するように適用される。特定の実施形態においては、標的結合領域または部位は、ヒト以外の供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、そして定常領域はヒトである。
本明細書中で使用される場合は、用語「操作された抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれか、または両方の可変ドメインが、特異性が公知である抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、そして必要に応じて、部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列の変更によって変化させられた抗体を意味する。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにはサブクラスの抗体に由来する場合があるが、ＣＤＲが様々なクラスの抗体に由来するであろうこと、そして好ましくは、様々な種に由来する抗体に由来するであろうことが予想される。特異性が公知であるヒト以外の抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖のフレームワーク領域につながれている操作された抗体は、本明細書中では「ヒト化抗体」と呼ばれる。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに導入ためには、ドナー可変領域に由来する完全なＣＤＲ領域でＣＤＲ領域の全てを置き換えることは必ずしも必要ではない場合がある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために不可欠なそのような残基を導入することだけが必要であり得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に示されている説明を前提とすると、これが、機能性の操作された抗体またはヒト化抗体を得るために、日常的に行われている実験を行うことによるか、または試行錯誤により試験することによるかのいずれかによることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書中で使用される場合は、用語「連結させられた」、「融合させられた」、または「融合」はほとんど同じ意味で使用される。これらの用語は、化学的結合または組み換え手段を含むあらゆる手段により、２つ以上のエレメントまたは成分を一緒に結合させることを意味する。「インフレームでの融合」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合させて、連続するより長いＯＲＦを、もとのＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する様式で形成させることを意味する。したがって、得られる組み換え体融合タンパク質は、もとのＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは、自然界においては通常はそのようには結合していない）を含む１つのタンパク質である。したがって、リーディングフレームは、融合させられたセグメント全体を通じて連続させられるが、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的に、または空間的に隔てられている場合がある。
ポリペプチドの状況においては、「直鎖状配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシ末端方向でのポリペプチドのアミノ酸の順序である。ここでは、配列の中の互いに隣接している残基は、ポリペプチドの一次構造においては連続している。
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合は、それによって遺伝子が生化学的物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を生じるプロセスを意味する。このプロセスには、細胞内での遺伝子の機能性の存在のあらゆる発現が含まれ、これには、遺伝子のノックダウン、ならびに一時的な発現と安定な発現の両方が含まれるが、これらに限定はされない。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への転写、ならびに、そのようなｍＲＮＡのポリペプチド（単数または複数）への翻訳が含まれるが、これらに限定はされない。最終的な所望される産物が生化学的物質である場合には、発現には、生化学的物質および任意の前駆体の作成が含まれる。
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によっては、任意の被験体が意味され、特に、それについての診断、予後診断、または治療が所望される哺乳動物被験体が意味される。哺乳動物被験体には、ヒト、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、農場動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、動物園の動物、競技用動物、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オラウータン、およびチンパンジー）；イヌ科（例えば、イヌおよびオオカミ）；ネコ科（例えば、ネコ、ライオン、およびトラ）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ）；食用動物（例えば、乳牛、ブタ、およびヒツジ）；有蹄動物（例えば、シカ、およびキリン）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）などが含まれるが、これらに限定はされない。特定の実施形態においては、哺乳動物はヒト被験体である。
用語「ＲＮＡ干渉」すなわち「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは低下を意味する。これは、動物および植物における配列特異的な転写後の遺伝子のサイレンシングのプロセスであり、サイレンシングさせられる遺伝子の配列に対してその二本鎖領域において相同であるｓｉＲＮＡによって開始される。遺伝子は、生物体に対して内因性である場合も、また、外因性である場合もあり、染色体に組み込まれて存在する場合も、また、ゲノムの中には組み込まれないトランスフェクションベクターの中に存在する場合もある。遺伝子の発現は、完全に阻害されるかまたは部分的に阻害されるかのいずれかである。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得る；標的ＲＮＡの機能は完全である場合も、また部分的である場合もある。
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１／ＬＲＲＮ６）
本発明は、Ｓｐ３５のアンタゴニストが神経突起の成長およびＤＡニューロンの生存を促進することの発見に基づく。自然界に存在しているヒトＳｐ３５は、６１４アミノ酸からなるグリコシル化された神経系特異的タンパク質である（配列番号２）。ヒトＳｐ３５ポリペプチドには、１４個のロイシンリッチリピート（Ｎ末端キャップとＣ末端キャップを含む）からなるＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインが含まれる。細胞質ドメインには、標準的なチロシンリン酸化部位が含まれる。加えて、自然界に存在しているＳｐ３５タンパク質には、シグナル配列である短い塩基性領域がＬＲＲＣＴとＩｇドメインの間に、そして膜貫通領域がＩｇドメインと細胞質ドメインの間に含まれる。ヒトＳｐ３５遺伝子には、別の翻訳開始コドンが含まれており、その結果、６個のさらに別のアミノ酸（ＭＱＶＳＫＲ；配列番号３）がＳｐ３５シグナル配列のＮ末端に存在する場合があり、また、存在しない場合もある。表１には、配列番号２の配列をベースとするアミノ酸残基の番号にしたがった、Ｓｐ３５ドメインと他の領域が列挙される。
表１
Figure 2009517340
Figure 2009517340
 Ｓｐ３５の組織分布および発育過程での発現は、ヒトおよびラットにおいて実験されている。Ｓｐ３５の生物学は実験用の動物（ラット）モデルにおいて実験されている。ラットＳｐ３５の発現はノーザンブロットおよび免疫組織化学染色によって決定されたように、神経系のニューロンと脳の乏突起膠細胞に局在化されている。ラットＳｐ３５ ｍＲＮＡの発現レベルは、発育過程に応じて調節されており、生後間もなく（すなわち、およそ１日後に）ピークとなる。ラットの脊髄の離断損傷モデルにおいては、Ｓｐ３５は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたように、損傷部位においてアップレギュレートされる。加えて、Ｓｐ３５はＮｏｇｏ６６ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｎｏｇｏ受容体）と相互作用することが示されている。例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０８５６４を参照のこと。
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）は、Ｎｏｇｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１−ｐ７５神経栄養因子受容体複合体のさらなる成分である。Ｍｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。Ｎｏｇｏ受容体１とは異なり、Ｓｐ３５遺伝子の発現は、成人の脊髄の中の神経細胞が外傷性の損傷に曝されると増大し、このことは、Ｓｐ３５がＣＮＳ神経機構について重要な生物学的役割を有していることを示唆している。Ｉｄ．
全長のＳｐ３５分子のヌクレオチド配列は以下のとおりである：
Figure 2009517340
 （配列番号１）。
全長のＳｐ３５ポリペプチドのポリペプチド配列は以下のとおりである：
Figure 2009517340
 （配列番号２）。
Ｓｐ３５のアンタゴニストを使用する方法
本発明の１つの実施形態によっては、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの再生、成長、または生存を促進するための方法が提供される。この方法には、ＤＡニューロンを、有効量のＳｐ３５アンタゴニスト、またはＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物と接触させる工程が含まれる。ここでは、Ｓｐ３５アンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５アプタマー、および２つ以上の上記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせからなる群より選択される。様々な例示的なＳｐ３５アンタゴニスト、ならびに本発明を実施するためにこれらの分子を得るための方法および材料は以下に記載され、そして／または、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０８５６４８（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）の中に見ることができる。本発明に有用なＳｐ３５受容体アンタゴニストとしては、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２２８８１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／００２４３７（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているものが挙げられる。
本発明のさらに別の実施形態によっては、そのような疾患に罹患している動物（例えば、哺乳動物）のＤＡニューロンの変性または死が関係している疾患、障害、または損傷（例えば、パーキンソン病）を処置するための方法が提供される。この方法は、その必要がある動物に対して、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５アプタマー、および２つ以上の上記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせからなる群より選択される、治療有効量のＳｐ３５アンタゴニスト、またはＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物を投与する工程が含まれるか、本質的にそのような工程からなるか、あるいはそのような工程からなる。
本発明のさらなる実施形態には、ＤＡニューロンの死が関係している疾患、障害、または損傷を処置するために、ＤＡニューロンの再生、成長、または生存を促進する方法が含まれる。この方法には、哺乳動物に対して、疾患、障害、もしくは損傷の部位に、またはその付近に、ＤＡニューロンの再生、成長、または生存の阻害を減少させるために十分な量を投与する工程が含まれる。
本発明の方法においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５アプタマー、またはそれらの組み合わせの患者への直接の投与によって投与され得る。あるいは、Ｓｐ３５アンタゴニストは、特異的なＳｐ３５アンタゴニストを生産する発現ベクターを介して投与され得る。本発明の特定の実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、以下を含む処置方法において投与される：（１）移植することができる宿主細胞を核酸（例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストを発現するベクター）で形質転換するかまたはトランスフェクトする工程；および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物に、疾患、障害、または損傷の部位に移植する工程。例えば、形質転換された宿主細胞は、ドーパミンニューロンの供給源の特定の罹患した部位（例えば、中脳）またはそれらの接続の標的（例えば、被殻、尾状核、大脳皮質、淡蒼球、または視床下核）に移植され得る。本発明のいくつかの実施形態においては、移植することができる宿主細胞は哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトされ、そしてそれが取り出された同じ哺乳動物に移植して戻される。細胞は、移植される同じ部位から取り出すことができるが、必ずしもそうでなくてよい。エキソビボ遺伝子治療としてもよく知られているそのような実施形態によって、限られた時間の間作用部位に局在化させられた、Ｓｐ３５アンタゴニストの持続的な供給を提供することができる。
本発明の方法によって処置または緩和することができる疾患または障害としては、ＤＡニューロンの死、変性、または再生もしくは分化の不足が関係している疾患、障害、あるいは損傷が挙げられる。そのような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、脳血管性パーキンソニズム、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷、脳炎後のパーキンソン病、神経梅毒、および統合失調症が挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書中で開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト（例えば、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＳｐ３５アプタマー）は、ＤＡニューロンの成長、生存、または再生をネガティブに調節するＳｐ３５の能力を停止させる、低下させる、妨げる、または阻害する治療薬として調製され得、そして使用され得る。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、自然界に存在しているＳｐ３５の生物学的機能をブロックする、阻害する、または妨害するそのようなポリペプチドが挙げられる。詳細には、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの断片、変異体、または誘導体が挙げられる。上記の表１には、Ｓｐ３５ポリペプチドの様々なドメインが記載されている。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは膜貫通ドメインを欠いており、通常は、Ｓｐ３５ポリペプチドの細胞内ドメインが欠けている。例えば、特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、Ｓｐ３５の膜貫通ドメインを含むアミノ酸５５２〜５７６、および／またはＳｐ３５の細胞内ドメインを含むアミノ酸５７７〜６１４が欠けている。加えて、特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、Ｓｐ３５ポリペプチドのＬＬＲドメイン、Ｉｇドメイン、塩基性領域および／または細胞外ドメイン全体（配列番号２のアミノ酸３４から５３２に対応する）が含まれる。当業者は、Ｓｐ３５の細胞外ドメイン全体に、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかにあるさらなるアミノ酸もしくは数個のアミノ酸が含まれる場合があることを理解するであろう。このように、本発明の方法において使用される可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸４１から５２５；配列番号２のアミノ酸４０から５２６；配列番号２のアミノ酸３９から５２７；配列番号２のアミノ酸３８から５２８；配列番号２のアミノ酸３７から５２９；配列番号２のアミノ酸３６から５３０；配列番号２のアミノ酸３５から５３１；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号２のアミノ酸４６から５２０；配列番号２のアミノ酸４５から５２１；配列番号２のアミノ酸４４から５２２；配列番号２のアミノ酸４３から５２３；および配列番号２のアミノ酸４２から５２４、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。Ｓｐ３５ポリペプチドアンタゴニストには、表１に記載されるドメインの任意の組み合わせが含まれ得る。
本発明の方法において使用されるさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸１から３３；配列番号２のアミノ酸１から３５；配列番号２のアミノ酸３４から６４；配列番号２のアミノ酸３６から６４；配列番号２のアミノ酸６６から８９；配列番号２のアミノ酸９０から１１３；配列番号２のアミノ酸１１４から１３７；配列番号２のアミノ酸１３８から１６１；配列番号２のアミノ酸１６２から１８５；配列番号２のアミノ酸１８６から２０９；配列番号２のアミノ酸２１０から２３３；配列番号２のアミノ酸２３４から２５７；配列番号２のアミノ酸２５８から２８１；配列番号２のアミノ酸２８２から３０５；配列番号２のアミノ酸３０６から３２９；配列番号２のアミノ酸３３０から３５３；配列番号２のアミノ酸３６３から４１６；配列番号２のアミノ酸４１７から４２４；配列番号２のアミノ酸４１９から４９３；および配列番号２のアミノ酸４９４から５５１、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用されるさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸１から３３；配列番号２のアミノ酸１から３５；配列番号２のアミノ酸１から６４；配列番号２のアミノ酸１から８９；配列番号２のアミノ酸１から１１３；配列番号２のアミノ酸１から１３７；配列番号２のアミノ酸１から１６１；配列番号２のアミノ酸１から１８５；配列番号２のアミノ酸１から２０９；配列番号２のアミノ酸１から２３３；配列番号２のアミノ酸１から２５７；配列番号２のアミノ酸１から２８１；配列番号２のアミノ酸１から３０５；配列番号２のアミノ酸１から３２９；配列番号２のアミノ酸１から３５３；配列番号２のアミノ酸１から４１６；配列番号２のアミノ酸１から４２４；配列番号２のアミノ酸１から４９３；配列番号２のアミノ酸１から５５１；配列番号２のアミノ酸１から５３１；および配列番号２のアミノ酸１から５３２、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用されるなおさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３４から６４；配列番号２のアミノ酸３４から８９；配列番号２のアミノ酸３４から１１３；配列番号２のアミノ酸３４から１３７；配列番号２のアミノ酸３４から１６１；配列番号２のアミノ酸３４から１８５；配列番号２のアミノ酸３４から２０９；配列番号２のアミノ酸３４から２３３；配列番号２のアミノ酸３４から２５７；配列番号２のアミノ酸３４から２８１；配列番号２のアミノ酸３４から３０５；配列番号２のアミノ酸３４から３２９；配列番号２のアミノ酸３４から３５３；配列番号２のアミノ酸３４から４１６；配列番号２のアミノ酸３４から４２４；配列番号２のアミノ酸３４から４９３；および配列番号２のアミノ酸３４から５５１、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用されるさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３４から５３０；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号２のアミノ酸３４から５３２；配列番号２のアミノ酸３４から５３３；配列番号２のアミノ酸３４から５３４；配列番号２のアミノ酸３４から５３５；配列番号２のアミノ酸３４から５３６；配列番号２のアミノ酸３４から５３７；配列番号２のアミノ酸３４から５３８；配列番号２のアミノ酸３４から５３９；配列番号２のアミノ酸３０から５３２；配列番号２のアミノ酸３１から５３２；配列番号２のアミノ酸３２から５３２；配列番号２のアミノ酸３３から５３２；配列番号２のアミノ酸３４から５３２；配列番号２のアミノ酸３５から５３２；配列番号２のアミノ酸３６から５３２；配列番号２のアミノ酸３０から５３１；配列番号２のアミノ酸３１から５３１；配列番号２のアミノ酸３２から５３１；配列番号２のアミノ酸３３から５３１；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号２のアミノ酸３５から５３１；および、配列番号２のアミノ酸３６から５３１、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用されるなおさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３６から６４；配列番号２のアミノ酸３６から８９；配列番号２のアミノ酸３６から１１３；配列番号２のアミノ酸３６から１３７；配列番号２のアミノ酸３６から１６１；配列番号２のアミノ酸３６から１８５；配列番号２のアミノ酸３６から２０９；配列番号２のアミノ酸３６から２３３；配列番号２のアミノ酸３６から２５７；配列番号２のアミノ酸３６から２８１；配列番号２のアミノ酸３６から３０５；配列番号２のアミノ酸３６から３２９；配列番号２のアミノ酸３６から３５３；配列番号２のアミノ酸３６から４１６；配列番号２のアミノ酸３６から４２４；配列番号２のアミノ酸３６から４９３；および、配列番号２のアミノ酸３６から５５１、あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用されるさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３６から５３０；配列番号２のアミノ酸３６から５３１；配列番号２のアミノ酸３６から５３２；配列番号２のアミノ酸３６から５３３；配列番号２のアミノ酸３６から５３４；配列番号２のアミノ酸３６から５３５；配列番号２のアミノ酸３６から５３６；配列番号２のアミノ酸３６から５３７；配列番号２のアミノ酸３６から５３８；および、配列番号２のアミノ酸３６から５３９；あるいはそのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、それらの断片、変異体、または誘導体としては、Ｓｐ３５のＩｇドメインを含むポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｓｐ３５ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸４１７から４９３；配列番号２のアミノ酸４１７から４９４；配列番号２のアミノ酸４１７から４９５；配列番号２のアミノ酸４１７から４９６；配列番号２のアミノ酸４１７から４９７；配列番号２のアミノ酸４１７から４９８；配列番号２のアミノ酸４１７から４９９；配列番号２のアミノ酸４１７から５００；配列番号２のアミノ酸４１７から４９２；配列番号２のアミノ酸４１７から４９１；配列番号２のアミノ酸４１２から４９３；配列番号２のアミノ酸４１３から４９３；配列番号２のアミノ酸４１４から４９３；配列番号２のアミノ酸４１５から４９３；配列番号２のアミノ酸４１６から４９３；配列番号２のアミノ酸４１１から４９３；配列番号２のアミノ酸４１０から４９３；配列番号２のアミノ酸４１０から４９４；配列番号２のアミノ酸４１１から４９４；配列番号２のアミノ酸４１２から４９４；配列番号２のアミノ酸４１３から４９４；配列番号２のアミノ酸４１４から４９４；配列番号２のアミノ酸４１５から４９４；配列番号２のアミノ酸４１６から４９４；配列番号２のアミノ酸４１７から４９４；および配列番号２のアミノ酸４１８から４９４、あるいは、そのようなポリペプチドの断片、変異体、または誘導体が含まれる、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される。
様々な例示的な可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、ならびに本発明を実施するためにこれらの分子を得るための方法および材料は以下に記載され、そして／または、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０８５６４８（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）の中に見ることができる。
本明細書中に記載される本発明の方法において使用される可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、環状である場合がある。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの環化によっては、直鎖状ペプチドの立体構造の自由度が下がり、より構造的に拘束された分子が生じる。多くのペプチドの環化方法は当該分野で公知であり、例えば、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基との間でのアミド結合の形成による「骨格対骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｔｏ ｂａｃｋｂｏｎｅ）」環化である。「骨格対骨格」環化の方法には、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間でのジスルフィド架橋の形成が含まれる。本発明の特定の可溶性Ｓｐ３５ペプチドには、環状のＳｐ３５ポリペプチドを形成させるためのペプチドのＮ末端およびＣ末端上での修飾が含まれる。そのような修飾としては、システイン残基、アセチル化されたシステイン残基、ＮＨ２部分とビオチンを有しているシステイン残基が挙げられるが、これらに限定はされない。他のペプチドの環化方法は、Ｌｉ ＆ Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
本明細書中に記載されている可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、置換、挿入、または欠失のような様々な変更が含まれ得る。例えば、置換としては以下の置換が挙げられるが、これらに限定はされない：配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの６位のバリンのメチオニンへの置換；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの２９４位のセリンのグリシンへの置換；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの３４８位のバリンのアラニンへの置換；Ｓｐ３５ポリペプチドの４１９位のアルギニンのヒスチジンへの置換；４５６位のアルギニンのグルタミン酸への置換；および配列番号２の４５８位のヒスチジンのバリンへの置換。
本明細書中に記載される配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片もまた意図される。
当該分野で公知であるように、２つのポリペプチドの間での「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列に対して比較することによって決定される。本明細書中で議論される場合には、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、当該分野で公知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）であるが、これらに限定はされない）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、２つの配列の間での相同性について最良のセグメントを見出すために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムが使用される。特定の配列が、本発明の参照配列に対して例えば９５％同一であるかどうかを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムが使用される場合には、もちろんパラメーターはセットであり、その結果、同一性の割合（％）が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性の中のギャップが可能である。
本発明の方法において使用される可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには、２つ以上の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの任意の組み合わせが含まれ得る。
抗体またはその抗原結合断片
１つの実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストは、抗体分子またはその免疫特異的断片である。特に明記されていない限りは、本明細書中で使用される場合には、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片を意味する。１つの実施形態においては、本発明の方法において使用される抗体は、二重特異的結合分子、結合ポリペプチド、または抗体であり、例えば、二重特異的抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、または１つ以上のエピトープ（例えば、１つ以上の抗原、または同じ抗原上の１つ以上のエピトープ）に対して結合特異性を有している融合タンパク質である。１つの実施形態においては、二重特異的抗体は、Ｓｐ３５上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異的抗体は、Ｓｐ３５の１つのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインと、第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有している４価の抗体である場合もある。それゆえ、４価の二重特異的抗体は、それぞれの特異性について２価であり得る。
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストにはまた、Ｓｐ３５活性のアンタゴニストである、Ｓｐ３５特異的抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体も含まれる。例えば、ＤＡニューロン上で発現されるＳｐ３５に対する特定のＳｐ３５抗体の結合により、ＤＡ神経突起の成長、分化、および生存の阻害がブロックされる。
本明細書中に記載される方法において使用される特定のアンタゴニスト抗体は、特定のＳｐ３５ポリペプチド断片またはドメインに特異的または優先的に結合する。そのようなＳｐ３５ポリペプチド断片としては、配列番号２のアミノ酸３４から５３２；３４から４１７、３４から４２５、３４から４９３、６６から５３２、６６から４１７（ＬＲＲドメイン）、６６から４２６、６６から４９３、６６から５３２、４１７から５３２、４１７から４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７から４２４（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７から４９３、４１７から５３２、４１９から４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）、または４２５から５３２を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるＳｐ３５ポリペプチド、あるいは、配列番号２のアミノ酸３４から５３２；３４から４１７、３４から４２５、３４から４９３、６６から５３２、６６から４１７、６６から４２６、６６から４９３、６６から５３２、４１７から５３２、４１７から４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７から４９３、４１７から５３２、４１９から４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）、または４２５から５３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるＳｐ３５変異体ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法において使用される特定のＳｐ３５特異的抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体がそれに対して結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片としては、Ｓｐ３５の１つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成されるそのような断片が挙げられるが、これらに限定はされない。そのような断片としては、例えば、配列番号２のアミノ酸６６から８９、６６から１１３、６６から１３７、９０から１１３、１１４から１３７、１３８から１６１、１６２から１８５、１８６から２０９、２１０から２３３、２３４から２５７、２５８から２８１、２８２から３０５、３０６から３２９、または３３０から３５３を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される断片が挙げられる。配列番号２のアミノ酸６６から８９、６６から１１３、９０から１１３、１１４から１３７、１３８から１６１、１６２から１８５、１８６から２０９、２１０から２３３、２３４から２５７、２５８から２８１、２８２から３０５、３０６から３２９、または３３０から３５３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片もまた意図される。
本発明の特定の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体がそれに対して結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片としては、Ｓｐ３５のＬＲＲに隣接している１つ以上のシステインリッチ領域を含む、本質的にそれから構成される、またはそれから構成されるそのような断片が挙げられるが、これらに限定はされない。そのような断片としては、例えば、配列番号２のアミノ酸３４から６４（Ｎ末端ＬＲＲ隣接領域（ＬＲＲＮＴ））を含む、本質的にそれから構成される、もしくはそれから構成される断片、または配列番号２のアミノ酸３６３から４１６（Ｃ末端ＬＲＲ隣接領域（ＣＲＲＣＴ））を含む、本質的にそれから構成される、もしくはそれから構成される断片が挙げられる。配列番号２のアミノ酸３４から６４、および３６３から４１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片もまた意図される。
他の実施形態においては、本明細書中に記載される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられる。ここでは、エピトープには、配列番号２の少なくとも４個から５個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５個から約３０個の間のアミノ酸が含まれる、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される。記載されるように、配列番号２の任意のエピトープのアミノ酸は、連続している場合もあり、直鎖状である場合もあるが、必ずしもそうでなくてよい。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープには、細胞の表面上で発現される、または可溶性断片としてのＳｐ３５の細胞外ドメインによって形成される直鎖状ではないエピトープが含まれる、本質的にそれから構成される、またはそれから構成される（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合させられる）。したがって、特定の実施形態においては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープには、配列番号２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも約１５個から約３０個の間、あるいは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、もしくは１００個の連続するかまたは不連続なアミノ酸が含まれる、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される。ここでは、不連続なアミノ酸はタンパク質の折り畳みによってエピトープを形成する。
他の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合するＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられる。ここでは、エピトープには、さらに、上記のように、さらに、配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個、もしくはそれ以上の連続しているかまたは不連続なアミノ酸と、タンパク質を修飾するさらなる部分が含まれる、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される。例えば、炭水化物部分を、Ｓｐ３５抗体が、修飾されていないバージョンのタンパク質に対するよりも高い親和性で修飾された標的タンパク質に結合するように含めることができる。あるいは、Ｓｐ３５抗体は、修飾されていないバージョンの標的タンパク質には全く結合しない。
特定の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストには、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。すなわち、これらは、上記Ｓｐ３５または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、それが無関係なもしくはランダムなエピトープに結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合する；上記Ｓｐ３５または断片または変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、関連する、類似する、相同な、またはアナログであるエピトープに対してそれが結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合する；上記Ｓｐ３５または断片または変異体の特定のエピトープに対してそれ自体が特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する；あるいは、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、または約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、上記Ｓｐ３５または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特定の態様においては、抗体またはその断片は、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に対して優先的に結合する。
抗体結合解離定数の状況で使用される場合には、用語「約」は、抗体親和性を測定するために利用される方法についてある程度の固有のバリエーションを可能にする。例えば、使用される機器の精度のレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」には、例えば、０．０５Ｍから０．００５Ｍまでが含まれ得る。
特異的な実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、または１０−３ｓｅｃ−１未満あるいはそれに等しい解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられる。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、または１０−７ｓｅｃ−１未満あるいはそれに等しい解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
他の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１より大きいかまたはそれに等しい速度（ｋ（ｏｎ））で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられる。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１より大きいかあるいはそれに等しい速度（ｋ（ｏｎ））で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
本発明の特定の方法には、少なくともわずかな１つ以上の定常領域ドメインが、所望される生化学的特徴（例えば、ほぼ同じ免疫原性の完全な変更されていない抗体と比較した場合の、低いエフェクター機能、共有結合ではない結合によって二量体を形成する能力、腫瘍部位に局在化する高い能力、短い血清半減期または長い血清半減期）を提供するように欠失させられているかまたは別の方法で変更されている、Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体の投与またはその免疫特異的断片の投与が含まれる。例えば、本明細書中に記載される方法において使用される特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠失している、ドメイン欠失抗体である。例えば、特定の抗体においては、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失させられるであろう。例えば、ＣＨ２ドメイン全体または一部が欠失させられるであろう。
本明細書中に記載される方法において使用される特定のＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片においては、Ｆｃ部分は、当該分野で公知の技術を使用してエフェクター機能を低下させるように変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点変異または他の手段による）によっては、循環している修飾された抗体のＦｃ受容体結合が減少し、それによって腫瘍の局在化が高まる場合がある。他の場合には、本発明と矛盾しない定常領域の修飾によって相補結合が抑えられ、したがって、血清半減期および結合した細胞毒素の非特異的会合が減少する場合がある。定常領域のなお他の修飾を使用して、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾することができる。これにより、高い抗原特異性または抗体の可撓性の理由による高い局在化が可能となる。修飾により得られる生理学的プロフィール、生体利用性、および他の生化学的効果（例えば、腫瘍の局在化、生体分布、および血清半減期）は、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的技術を使用して容易に測定することができ、そして定量することができる。
本明細書中に開示される方法において使用される抗体またはその免疫特異的断片の修飾された形態は、当該分野で公知の技術を使用して、完全な前駆体またはもとの抗体から作成することができる。例示的な技術は、本明細書中にさらに詳細に議論される。
特定の実施形態においては、本明細書中で開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の可変領域および定常領域はいずれも、完全にヒトのものである。完全なヒト抗体は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される技術を使用して作成することができる。例えば、特異的な抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原性のチャレンジに応答してそのような抗体を生産するように修飾されているが、その内因性の遺伝子座が無効とされているトランスジェニック動物に対して抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作成するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術も当該分野で公知である。完全なヒト抗体は、おそらく、本明細書中の別の場所にさらに詳細に記載される様々なディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイシステム）によって生産することができる。
本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該分野で公知の技術を使用して作成することができ、製造することができる。特定の実施形態においては、抗体分子またはその断片は「組み換えによって生産される」。すなわち、組み換えＤＮＡ技術を使用して生産される。抗体分子またはその断片を作成するための例示的な技術は、本明細書中の別の場所でさらに詳細に議論される。
本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片としては、例えば、共有結合が、抗体がその同族であるエピトープに特異的に結合することを妨げることがないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された誘導体が挙げられる。例えば、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導、タンパク質分解的切断、細胞性のリガンドもしくは他のタンパク質に対する結合などによって修飾された抗体が挙げられるが、これらに限定はされない。任意の多数の化学修飾を、公知の技術によって行うことができ、これには、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝による合成などが含まれるが、これらに限定はされない。加えて、誘導体には、１つ以上の従来のものではないアミノ酸が含まれる場合がある。
好ましい実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、処置される動物（例えば、ヒト）において有害な免疫応答を誘発しないであろう。１つの実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該分野で認識されている技術を使用して免疫原性を低下させるように修飾することができる。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化させることができ、また、キメラ抗体を作成することもできる。元の抗体の抗原結合特性を保持しているか、または実質的に保持しているが、ヒトにおいては免疫原性が低いこれらのタイプの抗体は、ヒト以外の抗体、通常は、マウス抗体または霊長類抗体から誘導される。これは、以下の工程を含む様々な方法によって行うことができる：（ａ）キメラ抗体を作成するためにヒト定常領域上にヒト以外の可変ドメインを繋ぐ工程；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持しているか、もしくは保持していないヒトフレームワーク領域および定常領域に、ヒト以外の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部を繋ぐ工程；あるいは（ｃ）ヒト以外の可変ドメイン全体を移動させるが、それらを表面残基の置換によりヒト様のセクションで覆い隠す工程。そのような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ，Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、および米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号（これら全ては、それらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の変更が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体に由来するＶＨ配列およびＶＬ配列が分析され、そしてヒトＴ細胞エピトープが、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列中の他の鍵となる残基と比較したエピトープの位置を示しているそれぞれのＶ領域からマップされる。Ｔ細胞エピトープマップに由来する個々のＴ細胞エピトープは、別のアミノ酸置換を同定するために分析され、これに伴う最終的な抗体の活性が変化してしまうリスクは低い。アミノ酸置換の組み合わせを含む別のＶＨおよびＶＬ配列の範囲が設計され、そしてこれらの配列は、続いて、結合ポリペプチドの１つの範囲（例えば、本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片）に取り込まれる、その後、これは機能について試験される。通常、１２から２４種類のさまざまな抗体が作成され、そして試験される。その後、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が発現ベクターにクローニングされ、続いてプラスミドが、完全な抗体の生産のために細胞株に導入される。その後、抗体は、適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が同定される。
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその断片は当該分野で公知の任意の適切な方法によって作成することができる。ポリクローナル抗体は、当該分野で周知の様々な手順によって生産することができる。例えば、Ｓｐ３５免疫特異的断片は、様々な宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定はされない）に対して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘導するために投与することができる。様々なアジュバントを使用して、宿主種に応じた免疫学的応答を増大させることができる。そのようなアジュバントとしては、フロイトの（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）（完全なおよび不完全な）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに、ヒトアジュバントとして有用である可能性のあるもの（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））が挙げられるが、これらに限定はされない。そのようなアジュバントもまた当該分野で周知である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む当該分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（上記参考文献はそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して生産することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、ハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定はされない。用語「モノクローナル抗体」は、１つのクローン（任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む）に由来する抗体を意味し、生産される方法を意味するものではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、および組み換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当該分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。
１つの例においては、当該分野で認識されているプロトコールを使用して、抗体は、関連する抗原（例えば、精製されたＳｐ３５抗原またはそのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）とアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物において惹起させられる。この予防接種によっては、通常、活性化させられた脾臓細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の生産を含む免疫応答が誘発させられる。得られる抗体は、ポリクローナル調製物を提供するために動物の血清から回収することができるが、多くの場合は、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の均質な調製物を得ることが所望され得る。好ましくは、リンパ球は脾臓から得られる。
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））においては、抗原が注射された哺乳動物に由来する比較的生存期間の短い、または不死化させられたリンパ球が、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させられ、それによりハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」が生産される。これらはいずれも不死であり、Ｂ細胞の遺伝的にコードされる抗体を生産することができる。得られるハイブリッドは、１つの抗体の形成のための特異的な遺伝子を含む個々の別々の株を用いる選択、希釈、および再増殖によって１つの遺伝的な株に分離される。これらによって、所望される抗原に対して均質であり、そしてそれらの純粋な遺伝的家系について均質である、「モノクローナル」と呼ばれる抗体が生産される。
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、融合させられていないもとの骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質が含まれていることが好ましい適切な培養培地の中に播種され、そして増殖させられる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖のための試薬、細胞株、および培地を、多数の供給業者から市販によって入手することができ、標準的なプロトコールが十分に確立されていることを理解するであろう。一般的には、ハイブリドーマ細胞がその中で増殖させられている培養培地は、所望される抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、放射免疫測定（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＡＬＩＳＡ）のようなインビトロでのアッセイによって決定される。所望される特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界稀釈手順によってサブクローニングされ得、そして、標準的な方法によって増殖させられ得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の精製手順（例えば、ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地、腹水、または血清から調製することができることがさらに理解されるであろう。
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作成することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を、パパイン（Ｆａｂ断片を生じさせるため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生じさせるため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって生じさせることができる。Ｆ（ａｂ’）２断片には、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインが含まれる。
当業者はまた、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡは、抗体ファージライブラリーから導かれる場合もあることも、理解するであろう。具体的には、そのようなファージは、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現させられた抗原結合ドメインをディスプレイさせるために利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合させられたかもしくは捕捉された抗原を用いて、選択あるいは同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、通常は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組み換えによって融合させられた、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインとともに、ファージから発現させられたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、糸状ファージである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）（これらのそれぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）に示されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））には、鎖のシャッフリング、さらには、大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての組み合わせ感染およびインビボでの組み換えによる高親和性ヒト抗体の生産が記載されている。別の実施形態においては、リボソーマルディスプレイを、バクテリオファージをディスプレイプラットフォームとして置き換えるために使用することができる（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１）を参照のこと）。なお別の実施形態においては、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。このような手順により、モノクローナル抗体の単離、それに続くクローニングのための従来のハイブリドーマ技術に代わるものが提供される。
ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードしているポリヌクレオチド配列を有しているファージ粒子の表面上に提示される。具体的には、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトもしくはマウスのｃＤＮＡライブラリー）または合成のｃＤＮＡライブラリーから増幅させられる。特定の実施形態においては、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーによって互いに連結させられ、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）にクローニングされる。ベクターはＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションされ、そしてＥ．ｃｏｌｉはヘルパーファージに感染させられる。これらの方法で使用されるファージは、通常は、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、通常は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組み換えによって融合させられている。目的の抗原（すなわち、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合させられたかもしくは捕捉された抗原を使用して、選択あるいは同定することができる。
抗体を作成するために使用することができるファージディスプレイ法のさらなる例としては、以下に開示されている方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに、米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号；および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれがそれらの全体において引用により本明細書中に組み入れられる）。
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択の後、ファージに由来する抗体をコードする領域を単離し、完全な抗体（ヒト抗体または任意の他の所望される抗原結合断片を含む）を作成するために使用し、そして、任意の所望される宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）の中で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組み換えによって生じさせるための技術もまた、当該分野で公知の方法（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（上記参考文献はそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる））を使用して利用することができる。
単鎖Ｆｖおよび抗体を生産するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。ヒトにおけるインビボでの抗体の使用およびインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域を有している抗体である。キメラ抗体を生産するための方法は当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。ヒト化抗体は、ヒト以外の種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有している、所望される抗原に結合するヒト以外の種の抗体に由来する抗体分子である。多くの場合には、ヒトフレームワーク領域の中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため、好ましくは抗原結合を改善するために、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレーム残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデル化によって、および特定の位置にある珍しいフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。抗体は、当該分野で公知の様々な技術（例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および５，５８５，０８９号）、貼り付け（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、または表面再生（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））；ならびに鎖のシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）が含まれる）を使用してヒト化させることができる。
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の様々な方法によって作成することができる。米国特許第４，４４４，８８７号；および同第４，７１６，１１１号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１；（そのそれぞれがその全体において引用により本明細書中に組み入れられる）もまた参照のこと。
ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウスの胚性幹細胞にランダムに導入される場合も、また、相同組み換えによって導入される場合もある。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および送達領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入することができる。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子坐の導入とは別に、またはそれと同時に、相同組み換えによって非機能性にさせることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内因性の抗体の生産を妨げる。修飾された胚性幹細胞が増殖させられ、キメラマウスを得るために胚盤胞にマイクロインジェクションされる。その後、キメラマウスは、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を生じるように交配させられる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えば、所望される標的ポリペプチド全体または一部）を用いて通常の様式で予防接種される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、予防接種されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有しているヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞の分化の間に再配置され、続いて、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を使用して、治療上有用であるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術の詳細な考察、ならびにそのような抗体を生産するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）のような会社は、上記に記載される技術と同様の技術を使用して、選択された抗原に対して指向させられたヒト抗体を提供することに従事し得る。
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を使用して作成することができる。このアプローチにおいては、選択されたヒト以外のモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を使用して、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を導くことができる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号もまた参照のこと。
別の実施形態においては、本発明の方法において使用される所望されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、そして配列決定することができる。単離され、そしてサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターの中に置くことができ、これはその後、別の方法では免疫グロブリンを生産することのない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞にトランスフェクトされる。さらに具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書中に記載されるように、合成のものである場合がある）を使用して、１９９５年１月２５日に提出されたＮｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号（これは引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、抗体を製造するための定常領域配列および可変領域配列をクローニングすることができる。本質的に、これには、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅が必然的に伴う。この目的のための適切なプライマーはまた、米国特許第５，６５８，５７０号にも記載されている。以下にさらに詳細に議論されるように、所望される抗体を発現する形質転換された細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために、比較的多量に増殖させられる場合がある。
特定的な実施形態においては、重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、当該分野で周知の方法により（例えば、配列の超可変性の領域を決定するための他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列との比較により）相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために検査され得る。日常的に行われる組み換えＤＮＡ技術を使用して、１つ以上のＣＤＲがフレームワーク領域の中に（例えば、ヒト以外の抗体をヒト化させるためにヒトフレームワーク領域の中に）挿入される場合がある。フレームワーク領域は自然界に存在しているフレームワーク領域である場合も、また、コンセンサスなフレームワーク領域である場合もあり、そして好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって作成されたポリヌクレオチドは、所望されるポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換を、フレームワーク領域の中に作成することができ、好ましくは、アミノ酸置換によって、その抗原に対する抗体の結合が改善される。加えて、そのような方法を使用して、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合が欠失している抗体分子を作成するための、鎖間ジスルフィド結合に関与している１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更は本発明に含まれ、そして当業者の能力の範囲内である。
加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用することができる。本明細書中で使用される場合は、キメラ抗体は、様々な部分が様々な動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有している分子）であり、例えば、ヒト化抗体である。
あるいは、単鎖抗体の生産について記載されている技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、単鎖抗体を生産するように適応させることができる。単鎖抗体は、アミノ酸の架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片を連結させることによって形成させられ、それによって単鎖抗体が生じる。機能性のＦｖ断片をＥ．ｃｏｌｉの中でアセンブリさせるための技術が使用される場合もある（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体はまた、内因性の免疫グロブリンの生産ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）の中で作成されたヒト抗体または実質的なヒト抗体でもあり得る（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖系変異体マウスの中での抗体重鎖結合領域のホモ接合型の欠失によって内因性の抗体の生産の完全な阻害が生じることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖系変異体マウスへの導入によっては、抗原でチャレンジされた際にヒト抗体の生産が生じるであろう。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を作成する別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号（これは引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝的物質もまた、本明細書中に記載されるように単離することができ、そして操作することができることは明らかであろう。
組み換え体抗体を作成するためのさらに別の非常に効率の高い手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。特に、この技術によっては、サルの可変ドメインとヒト定常配列が含まれている霊長類化抗体の作成が生じる。この参考文献はその全体が引用により本明細書中に組み入れられる。さらに、この技術はまた、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）にも記載されている。
別の実施形態においては、リンパ球を顕微操作によって選択することができ、そして可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、予防接種された哺乳動物から単離し、そしてインビトロで７日間培養することができる。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。ポジティブウェルから細胞を単離することができる。個々のＩｇを生産するＢ細胞を、ＦＡＣＳによって、または補体媒介性溶血プラークアッセイにおいてそれらを同定することによって単離することができる。Ｉｇを生産するＢ細胞は、試験管の中で顕微操作することができ、そしてＶＨおよびＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅させることができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は抗体発現ベクターの中にクローニングし、そして発現のために細胞（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
あるいは、抗体を生産する細胞株を、当業者に周知の技術を使用して選択し、培養することができる。そのような技術は、様々な実験室用のマニュアルおよび主な刊行物に記載されている。これに関して、以下に記載されるような本発明での使用に適している技術は、補遣を含むＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）（これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
本明細書中に開示される方法において使用される抗体は、抗体の合成のための当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または好ましくは、本明細書中に記載される組み換え発現技術によって生産することができる。
本発明の範囲には、さらに、抗原結合ＤＮＡ配列のあらゆる対立遺伝子、変異体、および突然変異体が含まれることが、さらに理解されるであろう。
周知であるように、ＲＮＡは、もとのハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換された細胞から、標準的な技術（例えば、イソチオシアネートグアニジン抽出、および沈殿、それに続く遠心分離またはクロマトグラフィー）によって単離することができる。所望される場合には、ｍＲＮＡは、標準的な技術（例えば、クロマトグラフィーまたはオリゴｄＴセルロース）によって全ＲＮＡから単離され得る。適切な技術は当該分野でよく知られている。
１つの実施形態においては、本発明の方法において使用される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法にしたがって逆転写およびＤＮＡポリメラーゼを使用して同時に、または別々にのいずれかで作成することができる。ＰＣＲは、コンセンサスな定常領域プライマーによって、あるいは、公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始され得る。上記で議論されるように、ＰＣＲは、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用される場合もある。この場合は、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）によってスクリーニングされ得る。
ＤＮＡ（通常は、プラスミドＤＮＡ）は、当該分野で公知の技術を使用して細胞から単離され得、例えば、組み換えＤＮＡ技術に関する上記の参考文献の中に詳細に示されている標準的な周知の技術にしたがって、制限マッピングされ、配列決定される。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の分析の間の任意の時点で、本発明によって合成される場合もある。
抗体、またはその断片、誘導体、もしくはアナログ（例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖）の組み換えによる発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。一旦、本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの一部（好ましくは、重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の生産のためのベクターが、当該分野で周知の技術を使用して組み換えＤＮＡ技術によって生産され得る。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現によりタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者に周知の方法を使用して、抗体をコードする配列と適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組み換えが含まれる。したがって、本発明により、プロモーターに動作可能であるように連結された本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターが提供される。このようなベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）。そして、抗体の可変ドメインは、完全な重鎖または軽鎖の発現のために、そのようなベクターにクローニングされ得る。
発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞に導入され、そしてその後、トランスフェクトされた細胞が従来技術によって培養されて、本明細書中に記載される方法において使用される抗体が生産される。このように、本発明には、異種プロモーターに動作可能であるように連結された本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドが含まれている宿主細胞が含まれる。二本鎖の抗体の発現に好ましい実施形態においては、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターが、以下に記載されるように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞の中で同時に発現させられ得る。
様々な宿主発現ベクターシステムが、本明細書中に記載される方法において使用される抗体分子を発現させるために利用され得る。そのような宿主発現システムは媒体を示し、それによって目的のコード配列が生産され得、続いて精製され得るが、これはまた、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、インサイチュで本発明の抗体分子を発現することができる細胞をも提示し得る。これらには、微生物（例えば、抗体をコードする配列を含む組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体をコードする配列を含む組み換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組み換え体ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられた昆虫細胞システム；抗体をコードする配列を含む組み換え体ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させられたか、または組み換え体プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現構築物を有している哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定はされない。好ましくは、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびより好ましくは、真核生物細胞（特に、完全な組み換え体抗体分子の発現について）が、組み換え体抗体分子の発現に使用される。例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））は、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中期初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせて、抗体のための有効な発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
細菌システムにおいては、多数の発現ベクターが、発現させられる抗体分子について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、抗体分子の薬学的組成物の作成のために多量のそのようなタンパク質が生産される場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を支持するベクターが所望され得る。そのようなベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））（ここでは、抗体をコードする配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターの中に別々に連結させられ得、その結果、融合タンパク質が生産される）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定はされない。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにも使用することができる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、そしてマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって溶解させられた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から解離させられ得る。
昆虫システムにおいては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、通常は、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の中で増殖する。抗体をコードする配列は、ウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に個別にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置される。
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスをベースとする発現システムが利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の抗体をコードする配列がアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３成分リーダー配列）に連結させられ得る。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスゲノムの中に挿入され得る。ウイルスゲノムの必須ではない領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入によっては、感染させられた宿主の中で生存することができ、そして抗体分子を発現することができる組み換え体ウイルスが生じるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率のよい翻訳に必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであり得、天然のものであっても、合成のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
加えて、挿入された配列の発現を調節する、または所望される特異的な様式で遺伝子産物を修飾しそしてプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）が、タンパク質の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的であり、特異的な機構を有している。適切な細胞株または宿主システムは、発現させられる外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的のためには、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、およびリン酸化のための細胞性の機構を有している真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、乳ガン細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ）および正常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
長期にわたる組み換え体タンパク質の高収量での生産のためには、安定な発現が使用され得る。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞が、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入の後、操作された細胞は、富化培地の中で１〜２日間増殖させられ得、その後、選択培地に移され得る。組み換え体プラスミドの中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体の中に安定に組み込むことを可能にし、そして、その後に細胞株の中にクローニングすることができ、その中で増殖させることができる遺伝子坐を形成するように増殖させられる。この方法は、抗体分子を安定して発現する細胞株を操作するように有利に使用され得る。
使用され得る多数の選択システム（単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子を含むが、これらに限定はされない）は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子についての選択基準として使用することができる：ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０））；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１：２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月））；ならびにｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。使用することができる組み換えＤＮＡ技術についての当該分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびに、第１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって増大させることができる（概要については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクターシステムの中のマーカーが増幅可能である場合には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの増大によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に関係しているので、抗体の生産もまた増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターで同時トランスフェクションすることができ、第１のベクターは重鎖に由来するポリペプチドをコードし、そして第２のベクターは軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。２つのベクターには、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同じ選択マーカーが含まれ得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする１つのベクターが使用される場合もある。そのような状況では、軽鎖は、毒性のない（ｔｏｘｉｃ ｆｒｅｅ）重鎖が過剰になることを避けるために、重鎖の前に配置されることが有効である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列には、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡが含まれ得る。
一旦、本発明の抗体分子が組み換えによって発現させられると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ後の特異的抗原に対する親和性による）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、可溶性の差によって、あるいは、タンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、ＵＳ２００２ ０１２３０５７ Ａ１に開示されている。
１つの実施形態においては、本発明の方法において使用される結合分子または抗原結合分子には、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失させられている合成の定常領域が含まれる（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態においては、適合する修飾された抗体には、ドメイン欠失構築物または変異体が含まれるであろう。ここでは、ＣＨ２ドメイン全体が除去されている（□ＣＨ２構築物）。他の実施形態については、短い結合ペプチドが、可変領域に可撓性、および移動の自由度を提供するために、欠失させられたドメインについて置換される場合がある。当業者は、抗体の代謝速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性の理由から、そのような構築物が特に好ましいことを理解するであろう。
特定の実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用される修飾された抗体はミニボディーである。ミニボディーは当該分野で記載されている方法を使用して作成することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号、またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。
別の実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用される修飾された抗体は、当該分野で公知であるＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄによる）を使用して誘導することができる（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させて、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成のベクターを提供するように操作されている。
１つの実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその断片には、それが単量体サブユニットの間での会合が可能である限りにおいて、数個のアミノ酸もしくはさらには１つのアミノ酸の欠失または置換を有している免疫グロブリン重鎖が含まれる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域の中での１つのアミノ酸の変異が、Ｆｃの結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍の局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単純に欠失させることが望まれる場合もある。そのような定常領域の部分的な欠失によっては、目的の定常領域ドメインに付随する他の所望される機能を完全なまま残しつつ、抗体の選択された特性（血清半減期）が改善され得る。さらに、上記で触れられたように、開示される抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを高める１つ以上のアミノ酸の変異または置換による合成のものである場合もある。この態様においては、修飾された抗体の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持したまま、保存されている結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊してしまうことが可能であり得る。なお他の実施形態には、エフェクター機能のような所望される特性を高めるか、またはさらなる細胞毒素または炭水化物の結合を提供するための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加が含まれる。そのような実施形態においては、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入するまたは複製させることが所望される場合がある。
本発明によっては、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される抗体の使用も提供される。抗体またはその断片は、Ｓｐ３５ポリペプチドに免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準的な技術を使用して、アミノ酸置換を生じる部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによって媒介される突然変異誘発を含む（しかし、これらに限定はされない）結合分子をコードするヌクレオチド配列の中に変異を導入することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、または、ＶＬＣＤＲ３と比較して、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する電化を有している側鎖を持つアミノ酸で置き換えられる置換である。類似する電荷を有している側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーには以下が含まれる：塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電化を有していない側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。あるいは、変異は、コード配列全体または一部にランダムに、例えば、飽和突然変異誘発によって導入することができ、そして得られる変異体を、活性を保持している変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域だけに、またはＣＤＲ領域だけに変異を導入することが可能である。導入された変異はサイレントである場合も、または当たり障りのないミッセンス変異（すなわち、抗原に結合する抗体の能力に影響を及ぼさないか、またはほとんど影響を及ぼさない）である場合もある。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化させるため、またはハイブリドーマ抗体の生産を改善するために有用であり得る。あるいは、当たり障りのある（ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌ）ミッセンス変異によっては、抗原に結合する抗体の能力が変化する場合がある。ほとんどのサイレントな当たり障りのないミッセンス変異の位置は、おそらくフレームワーク領域の中にあり、一方、ほとんどの当たり障りのあるミッセンス変異の位置は、おそらくＣＤＲの中にある。しかしこれは絶対条件ではない。当業者は、抗原結合活性に変化がない、または結合活性に変化がある（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）のような所望される特性を有している変異体分子を設計し、そして試験することができるであろう。突然変異誘発の後、コードされるタンパク質は日常的に行われているように発現させられ得、そしてコードされるタンパク質の機能的および／または生物学的活性が、本明細書中に記載される技術を使用するか、または当該分野で公知の日常的に行われている修飾技術によって決定することができる。
本発明の方法において使用される例示的な抗体またはその断片としては、以下からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同じＳｐ３５エピトープに対して特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定はされない：２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、および１９６８（Ｌ１ａ．１３）（全て、米国仮特許出願番号６０／６９７，３３６、同６０／７７１，９９０、および同６０／８１４，５２２（これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている）。
融合タンパク質ならびに結合させられたポリペプチドおよび抗体
本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、およびアンタゴニスト抗体はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組み換えによって融合させることができ、また、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合させる（共有結合および共有結合以外の結合を含む）こともできる。例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、および抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用である分子、およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素）に組み換えによって融合させることも、あるいは、結合させることもできる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ３９６，３８７を参照のこと。
本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、および抗体としては、修飾された（すなわち、共有結合がＳｐ３５の生物学的機能を阻害することによってＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体を妨げないような任意のタイプの分子の共有結合による）誘導体が挙げられる。例えば、本発明のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、および抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスホリル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導、タンパク質分解的切断、細胞性のリガンドもしくは他のタンパク質に対する結合などによって修飾することができる。多数の化学的修飾のうちの任意のものが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝による合成などを含むがこれらに限定はされない公知の技術によって行われ得る。加えて、誘導体には、１つ以上の従来のものではないアミノ酸が含まれる場合がある。
本明細書中に開示される方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、および抗体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合させられたアミノ酸（すなわち、ペプチド等量式）から構成され得、そしてこれには、２０種類の遺伝子をコードするアミノ酸（例えば、自然界には存在しないアミノ酸）以外のアミノ酸が含まれる場合がある。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、および抗体は、自然なプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）によって、あるいは、当該分野で周知の化学修飾技術によって修飾することができる。そのような修飾は、基本的なテキストに、そしてより詳細なモノグラフに、さらには、膨大な量の研究論文に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ酸末端またはカルボキシル末端を含むＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のどの場所でも、あるいは、炭水化物のような部分に対しても起こり得る。同じタイプの修飾が、任意のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体の中のいくつかの部位で、同じ程度で、または異なる程度で存在する場合があることは明らかであろう。また、任意のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体には、多くのタイプの修飾が含まれ得る。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、そしてこれらは環状である場合もあり、これには分岐を伴う場合も、また分岐を伴わない場合もある。環状、分岐している、および分岐している環状の、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、ならびに抗体は、翻訳後の自然なプロセスの結果生じる場合も、また、合成方法によって作成される場合もある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニレル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、およびエビキチン化が含まれる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
本発明によってはまた、Ｓｐ３５機能を阻害するＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体融合体を含む、本質的にそれらから構成される、あるいはそれらから構成される融合タンパク質も提供される。好ましくは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体が融合させられる異種ポリペプチドは機能について有用であるか、あるいは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を標的化するために有用である。本発明の特定の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド（例えば、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、または細胞外ドメイン全体を含むＳｐ３５ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸３４から５３２に対応する））が、異種ポリペプチド部分に融合させられて、Ｓｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチドが形成させられる。Ｓｐ３５アンタゴニスト融合タンパク質、アプタマー、および抗体は、様々な目的（例えば、長い血清半減期、改善された生体利用性、特異的な臓器もしくは組織のタイプに対するインビボでの標的化、改善された組み換え発現効率、改善された宿主細胞の分泌、精製の容易さ、および高い親和力）を達成するために使用することができる。達成される目的（単数または複数）に応じて、異種部分は不活性であっても、または生物学的に活性であってもよい。また、これはＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、もしくは抗体に対して安定に融合させられるように、あるいは、インビトロまたはインビボで切断できるように選択することができる。これらの他の目的を達成するための異種部分は当該分野で公知である。
Ｓｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、または抗体の発現の変わりとして、異種部分の選択を行い、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に化学的に結合させることができる。ほとんどの場合には、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に対して融合させられるか、あるいは結合させられるかにはかかわらず、選択される異種部分は機能が類似しているであろう。したがって、異種アミノ酸配列についての以下の議論においては、他に明記されない限りは、異種配列は融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させることができることが理解される。
薬理学的活性のあるポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体）は、多くの場合は、迅速なインビボでのクリアランスを示し、したがって、体内で治療有効濃度を得るためには高い用量が必要である。加えて、約６０ｋＤａよりも小さいポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは多くの場合には腎臓毒性を導く。比較的小さいポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体）の融合体または結合体を、そのような腎臓毒性のリスクを下げるか、または回避するために使用することができる。治療用ポリペプチドのインビボでの安定性（すなわち、血清半減期）を高めるための様々な異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分または「担体」）は公知である。
その長い半減期、インビボでの広い分布、および酵素機能もしくは免疫学的機能の欠失の理由から、原則的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が、一般的には異種部分として使用される。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されているもののような方法および材料の適用によって、ＨＳＡは、Ｓｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、抗体、またはポリペプチド／抗体結合体を形成させるために使用することができる。これらは、Ｓｐ３５部分によって薬理学的活性を示し、一方では、有意に高いインビボでの安定性（例えば、１０倍または１００倍高い）を示す。ＨＳＡのＣ末端は、可溶性Ｓｐ３５部分のＮ末端に融合させることができる。ＨＳＡは自然に分泌されるタンパク質であるので、ＨＳＡシグナル配列を、融合タンパク質が真核生物（例えば、哺乳動物）の発現システムの中で生産される場合には、細胞培養培地中への可溶性Ｓｐ３５融合タンパク質の分泌を得るために利用することができる。
特定の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、およびその抗体断片にはさらに、標的化部分が含まれる。標的化部分には、体の特定の部分（例えば、脳またはその中の区画）への局在化を指向するタンパク質またはペプチドが含まれる。特定の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片は、脳を標的化する部分に結合または融合させられる。脳を標的化する部分は、共有結合される（例えば、直接、翻訳による融合、または直接もしくは状況に応じて切断することができるスペーサー分子を介するかのいずれかの化学的結合による）、または共有結合以外の結合によって結合させられる（例えば、アビジン、ビオチン、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、ＩｇＧなどのような可逆的相互作用による）。他の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片は、１つ以上の脳を標的化する部分に結合させられる。さらなる実施形態においては、脳を標的化する部分は、本発明の方法において使用される複数のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片に結合させられる。
Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片を伴う脳を標的化する部分は、そのようなＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片の脳への送達を促進する。タンパク質または治療薬に融合させられた場合に、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してタンパク質または治療薬を送達する多数のポリペプチドが記載されている。限定ではない例としては、以下が挙げられる：１ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂら、（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ｍＡＢ ８３−１４、ヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２：８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６、およびＢ８ペプチド（Ｘｉａら、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；および米国特許第６，３０６，３６５の配列番号１〜１８。上記参考文献の内容は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
Ｓｐ３５組成物の脳への送達の促進は、当該分野で十分に確立されている多数の手段によって決定される。例えば、脳を標的化する部分に連結させられた放射標識されたＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片の動物への投与；脳への局在化の決定；ならびに、脳を標的化する部分に結合させられていない同じ放射標識されたＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体、またはその抗体断片を用いた場合の局在化との比較である。標的化の促進を決定する他の手段は、上記参考文献に記載されている。
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）の構築に有用なシグナル配列としては、抗体の軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体の重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列も使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔で切断される。これによって、Ｆｃ領域と可溶性のＳｐ３５部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌が生じる。
いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと可溶性Ｓｐ３５部分の間のタンパク質分解的切断部位をコードし得る。このような切断部位によって、例えば、コードされる融合タンパク質のタンパク質分解的切断が提供され得、したがって、標的タンパク質からＦｃドメインが分離される。有用なタンパク質分解的切断部位としては、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターの中に組み込むことができる。有用なベクターとしては、直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、ここでは、免疫融合体ＤＮＡの転写はヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーとプロモーターの制御下に配置されている。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：７１２（１９９１）およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞は、可溶性のＳｐ３５ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトすることができ、そして可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの発現および分泌のために使用することができる。通常使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
１つの実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、ヒンジ領域およびＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合させられる。Ｓｐ３５−Ｆｃ融合体についての可能性のある利点としては、可溶性、インビボでの安定性、および多価（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、これは、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）が一般的に使用される。１つの実施形態においては、ＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義する、パパイン切断部位のすぐ上流にあるヒンジ領域の中で始まる配列（すなわち、残基２１６、Ｋａｂａｔシステムにしたがって重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）または他の免疫グロブリンの同様の部位が融合に使用される。融合が行われる正確な部位は重要ではない；特定の部位は周知であり、そして分子の生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択され得る。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築し、そして発現させるための材料および方法は当該分野で公知であり、そして過度の実験を行うことなく可溶性Ｓｐ３５融合体を得るために適用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、Ｓｐ３５融合タンパク質（例えば、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されているもの）が使用される。
完全にもとのままの野生型Ｆｃ領域は、通常は必要のないエフェクター機能を提示し、本発明の方法において使用されるＦｃ融合タンパク質においては所望されない。したがって、特定の結合部位は、通常、分泌カセットの構築の際にＦｃ領域から欠失させられる。例えば、軽鎖との同時発現は必要ないので、重鎖結合タンパク質Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：１１１−１４（１９８７））についての結合部位が、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させられる。その結果、この部位は免疫融合体の効率的な分泌を妨害することはない。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭの中に存在している膜貫通ドメイン配列）もまた、通常は欠失させられる。
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域はほとんどの場合に使用される。あるいは、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域が分泌カセットの中で使用され得る。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、一般的に、分泌カセットの中で使用され、これにはヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部が含まれる。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２が欠失させられたＦｃであり、これには、ヒンジ領域とＣＨ３領域の一部が含まれるが、ＣＨ２領域は含まれない。ＣＨ２が欠失させられたＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９９０）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ １：４７によって記載されている。いくつかの実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が使用される。
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの様々な立体配置で構築することができる。１つの立体配置においては、可溶性Ｓｐ３５部分のＣ末端が、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合させられる。わずかに異なる立体配置においては、短いポリペプチド（例えば、２〜１０アミノ酸）が、可溶性Ｓｐ３５部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間での融合の中に取り込まれる。このようなリンカーによっては、立体構造上の可撓性が提供され、これによりいくつかの状況においては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分の中に保持されている場合には、Ｓｐ３５−Ｆｃ融合体は二量体化し、それによって二価の分子を形成するであろう。単量体Ｆｃ融合体の均質な集団によっては、単特異的な二価の二量体が生じるであろう。２つの単量体Ｆｃ融合体（それぞれは異なる特異性を有している）の混合によっては、二重特異的な二価の二量体が生じるであろう。
対応するアミノ反応基とチオール反応基を含む任意の数の架橋を、血清アルブミンに対してＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドを連結させるために使用することができる。適切なリンカーの例としては、チオール反応性のマレイミドを挿入するアミン反応性の架橋剤が挙げられる（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳ）。他の適切なリンカーによっては、チオール反応性ハロアセテート基が挿入される（例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）。還元させることができるリンカーを生じさせるためのスルフヒドリル基との反応のための保護されたチオールまたは保護されていないチオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰが挙げられる。このような試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
結合は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分には関与しない。例えば、可溶性Ｓｐ３５−アルブミン融合体を、遺伝子操作技術を使用して得ることができ、ここでは可溶性Ｓｐ３５部分は、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方で血清アルブミン遺伝子に融合させられる。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、可溶性Ｓｐ３５部分の精製または同定を容易にするために異種ペプチドに融合させることができる。例えば、ヒスチジンタグを、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに融合させて、市販によって入手することができるクロマトグラフィー媒体を使用する精製を容易にすることができる。
本発明のいくつかの実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５融合構築物が、細菌の中での可溶性Ｓｐ３５部分の生産を促進するために使用される。このような構築物の中では、通常は高レベルで発現させられ、そして／または分泌される細菌タンパク質が、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７（１９９３）を参照のこと。
適切な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端に可溶性Ｓｐ３５部分を融合させることによって、二価または四価の形態の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを得ることができる。例えば、可溶性Ｓｐ３５部分を、Ｉｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させて、２つの可溶性Ｓｐ３５部分を含む二価の単量体ポリペプチドを生じさせることができる。２つのこれらの単量体の二量体化の際には、Ｉｇ部分によって、可溶性Ｓｐ３５タンパク質の四価の形態が得られる。このような多価形態は、標的に対する高い結合親和性を得るために使用することができる。可溶性Ｓｐ３５の多価形態はまた、可溶性Ｓｐ３５部分をタンデムに配置して、コンカタマーを形成させることによっても得ることができる。これは、単独で使用することができ、また、ＩｇもしくはＨＳＡのような融合パートナーに融合させることもできる。
結合させられたポリマー（ポリペプチド以外）
本発明のいくつかの実施形態には、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５アプタマー、またはＳｐ３５抗体が含まれ、ここでは、１つ以上のポリマーが、本発明の方法において使用されるＳｐ３５ポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合（共有結合）させられる。そのような結合体に適しているポリマーの例としては、ポリペプチド（上記で議論されている）、アプタマー、糖ポリペプチド、およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。通常は、ポリマーは、以下の１つ以上：可溶性、安定性、または生体利用性を改善する目的のために、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、アプタマー、またはＳｐ３５抗体に結合させられるが、必ずしもそうではない。
Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に対する結合のために一般的に使用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分（例えば、１、２、３、４、または５ ＰＥＧポリマー）を、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体の単独と比較して、血清半減期を長くするために、個々のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させることができる。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は、分岐している場合も、また、分岐していない場合もある。
Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させられるＰＥＧ部分の数、ならびに個々のＰＥＧ鎖の分子量は様々であり得る。一般的には、ポリマーの分子量が大きければ大きいほど、ポリペプチドの結合させられるポリマー鎖は少ない。通常、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させられるポリマーの質量の合計は、２０ｋＤａから４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖が結合させられる場合には、鎖の分子量は、一般的には、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。２つの鎖が結合させられる場合には、個々の鎖の分子量は、一般的には、１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が結合させられる場合には、分子量は、一般的には、７〜１４ｋＤａである。
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、ポリペプチド上の任意の適切な露出している反応基を介して、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に連結させることができる。露出している反応基（単数または複数）は、例えば、内部リジン残基のＮ末端アミノ基またはイプシロンアミノ基、あるいはそれらの両方であり得る。活性化されたポリマーは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体上の任意の遊離のアミノ基と反応することができ、それらに共有結合することができる。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体の遊離のカルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸化された炭水化物部分、およびメルカプト基（利用できる場合）もまた、ポリマーの結合のための反応基として使用することができる。
結合反応においては、ポリペプチドの濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり約１．０から約１０モルの活性化させられたポリマーが、通常、使用される。通常は、選択される比は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望される薬理学的活性を損なう可能性のある副反応（多くの場合には非特異的である）を最小につつ、反応を最大にする平衡を示す。好ましくは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体の生物学的活性（例えば、本明細書中に記載されているかまたは当該分野で公知のアッセイのうちの任意のものに示されている）の少なくとも５０％が保持され、そしてほぼ１００％が保持されることが最も好ましい。
ポリマーは、従来の化学反応を使用して、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体に結合させることができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体のリジンイプシロンアミノ基にカップリングさせることができる。リジン側鎖への結合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルシクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行うことができる。適切なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販によって入手することができる。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーをスクシンイミジル部分について置換することができる。これらとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾール、炭酸塩、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰカルボネートが挙げられる。条件は、通常、反応の選択性および程度を最大にするように最適化される。そのような反応条件の最適化は当業者の能力の範囲内である。
ＰＥＧ化は、任意の当該分野で公知のＰＥＧ化反応によって行うことができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（１９９２）、ならびに、欧州特許出願番号ＥＰ ０ １５４ ３１６および同ＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または同様の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を使用して行われる場合もある。
アシル化によるＰＥＧ化には、一般的には、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させる工程が含まれる。任意の反応性ＰＥＧ分子がＰＥＧ化において使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に対してエステル化されたＰＥＧが頻繁に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書中で使用される場合は、「アシル化」には、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間に以下のタイプの連結が含まれるが、これらに限定はされない：アミド、カルバメート、ウレタンなど。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応のパラメーターは、一般的には、可溶性ＳＰ３５ポリペプチド、アプタマー、または抗体を損傷する、あるいは不活化させる温度、溶媒、およびｐＨ条件を避けるように選択される。
一般的には、結合による連結はアミドであり、典型的には少なくとも９５％の得られる産物が、モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ化される。しかしＰＥＧ化の程度が高いいくつかの種が、使用される特異的な反応条件に応じた量で形成され得る。状況に応じて、精製されたＰＥＧ化された種は、従来の精製方法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、および電気泳動を含む）によって、混合物（具体的には、未反応の種）から分離される。
アルキル化によるＰＥＧ化には、通常、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を、還元剤の存在下で、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体と反応させる工程が含まれる。加えて、当業者は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体のＮ末端アミノ基だけを実質的にＰＥＧ化させる（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）ために好ましいように反応条件を操作することができる。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれの場合においても、ＰＥＧ基は通常は、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合させられる。特に−ＣＨ２−基に関して、このタイプの結合は「アルキル」結合として知られている。
Ｎ末端タグ化モノ−ＰＥＧ化産物を生じさせるための還元的アルキル化による誘導では、誘導に利用することができる様々なタイプの第１級アミノ基の様々な反応性（Ｎ末端に対するリジン）が利用される。反応は、リジン残基のイプシロンアミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基のイプシロンアミノ基との間のｐＫａの差を利用することができるｐＨで行われる。そのような選択的誘導によって、反応基（例えば、アルデヒド）を含む水溶性ポリマーのタンパク質に対する結合が制御される：ポリマーとの結合には、主にタンパク質のＮ末端が利用され、他の反応基（例えば、リジン側鎖のアミノ基）の有意な修飾は起こらない。
アシル化およびアルキル化のいずれのアプローチにおいても使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、通常、１つの反応基（例えば、アシル化のための活性なエステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾され、その結果、重合の程度が本発明の方法において提供されるように制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドはポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは水安定性、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ、またはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分岐していても、また分岐していなくてもよい。アシル化反応のためには、選択されるポリマー（単数または複数）は、通常、１つの反応性のエステル基を有している。還元的アルキル化のためには、選択されるポリマー（単数または複数）は、通常、１つの反応性アルデヒド基を有している。一般的には、水溶性ポリマーは、自然界に存在しているグリコシル残基からは選択されないであろう。なぜなら、これらは通常、哺乳動物の組み換え発現システムによってより簡単に作成されるからである。
ＰＥＧ化された可溶性のＳｐ３５ポリペプチド、アプタマー、または抗体を調製するための方法には、一般的には、以下の工程が含まれる：（ａ）分子を１つ以上のＰＥＧ基に結合させる条件下で、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体をポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、ならびに、（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程。一般的には、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターと所望される結果に基づいて、個々のケースに応じて決定されるであろう。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの割合が大きければ大きいほど、一般的には、ポリ−ＰＥＧ化産物のより大きな割合が導かれる。
モノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５アプタマー、またはＳｐ３５抗体の実質的に均質な集団を生じさせるための還元的アルキル化には、一般的には、以下の工程が含まれる：（ａ）可溶性Ｓｐ３５タンパク質またはポリペプチドを、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基のｐｅｎ−ｎｉｔ選択的修飾に適しているｐＨでの還元的アルキル化条件下で、反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程；ならびに、（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程。
モノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５アプタマー、またはＳｐ３５抗体の実質的に均質な集団については、還元的アルキル化反応条件は、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にする条件である。そのような反応条件によっては、通常、リジンの側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間でのｐＫａの差が提供される。本発明の目的については、ｐＨは通常、３〜９の範囲であり、典型的には３〜６である。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、アプタマー、または抗体には、タグ（例えば、その後にタンパク質分解によって解離させることができる部分）が含まれ得る。したがって、リジン部分はＴｒａｕｔ’ｓ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）（これは、リジンおよびＮ末端の両方と反応し、次いでＨｉｓタグを解離させるであろう）のような低分子量のリンカーと、修飾されたＨｉｓタグ部分が最初に反応させられることによって選択的に修飾され得る。したがって、ポリペプチドには、チオール反応性の頭基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離のもしくは保護されたＳＨ）を含むＰＥＧで選択的に修飾することができるＳＨ基が含まれるであろう。
Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＰＥＧの結合のための特異的な部位を設置するであろう任意のリンカーで置き換えることができる。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ，またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えることができる。同様に、当業者は、タンパク質を、マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ，ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させることができ、そして、得られる産物を遊離のＳＨを含むＰＥＧと反応させることができる。
いくつかの実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分は、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、または抗体のシステイン基にカップリングさせられる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を使用して行うことができる。
状況に応じて、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、アプタマー、または抗体が、不安定な結合によってポリエチレン−グリコール部分に結合させられる。不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断において切断することができる。例えば、結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断することができる。
反応は、反応基がＮ末端にあるαアミノ基上に存在する場合には、生化学的活性のある物質を不活性なポリマーと、一般的には、約ｐＨ５〜８（例えば、ｐＨ５、６、７、または８）で反応させるために使用される任意の適切な方法で行われ得る。通常、このプロセスには、活性化させられたポリマーを調製する工程と、その後に、タンパク質を活性化させられたポリマーと反応させて、処方に適している可溶性のタンパク質を生じさせる工程が含まれる。
Ｓｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニスト
本発明の方法のＳｐ３５アンタゴニストとしては、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＳｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニストが挙げられる。Ｓｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニストはＳｐ３５の発現を妨げる（ノックダウンさせる）。Ｓｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定はされない。通常、このような結合分子は動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）が、そのような結合分子はまた、宿主細胞によって取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることも、そしてインビボで発現させることもできる。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）もまた参照のこと。
ＲＮＡｉは、標的化されたｍＲＮＡの発現を妨害するＲＮＡの発現を意味する。詳細には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）を介した特異的ｍＲＮＡ（例えば、Ｓｐ３５）の相互作用により、標的化された遺伝子をサイレンシングさせる。その後、ｄｓＲＮＡ複合体は細胞による分解のために標的化される。さらなるＲＮＡｉ分子としては、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（短い干渉ヘアピンでもある）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子には、ループによってつながれた標的遺伝子に由来するセンス配列とアンチセンス配列が含まれる。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、これはｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。本発明のいくつかの実施形態においては、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＬ３．７）から発現させられる。
ＲＮＡｉは、それらの「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的相同性を有している二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの細胞を含まない溶解物の中での生化学的実験は、ＲＮＡ依存性の遺伝子のサイレンシングの媒介因子が、２１〜２５ヌクレオチドの「短い干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることを示している。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法において有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られているＲＮａｓｅによるｄｓＲＮＡのプロセシングによって導かれる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体（ＲＮＡ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ））と呼ばれる多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体の中に動員されるようである。いずれの特定の理論にも束縛されることは望ましくないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに導かれ、ここでｓｉＲＮＡ二本鎖が配列特異的に相互作用して、触媒様式で切断を媒介すると考えられている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６、２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１）。
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を分析し、そして哺乳動物細胞（これにはニューロンが含まれるが、限定はされない（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１９２６−１１９２９，２００２））の中の必須の遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−４５６５，２００１）。ＲＮＡｉはまた、治療様式（例えば、ウイルス（ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１９６−５２０１，２００２）を含むがこれに限定はされない）の感染、複製、および／または増殖の阻害あるいはブロック、ならびに腫瘍遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒら、Ｂｌｏｏｄ １０１（４）：１５６６−９，２００２）の発現の低下）についても評価される。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚の中での（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４２３６−１４２４０，２００２；およびＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：１６６４−１６６９，２００２）、ならびに、乳児マウスの中での（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３２：１０７−１０８，２００２）遺伝子発現を調節するために、そして、成体のトランスジェニックマウスの中でのトランスジーンの発現を低下させるために（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２）使用されている。細胞培養物の中およびインビボでのｓｉＲＮＡの効力および特異性を決定するための方法は記載されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓら、Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；およびＬｅｉｒｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９５：７４４−７４８，２００２を参照のこと）。
ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定はされない）を媒介する分子は、インビトロで化学合成によって（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロでの転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６０４７−６０５２，２００２）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩのようなヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７，２００２）生産することができる。
ｓｉＲＮＡ分子はまた、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングさせることによって形成させることもでき、これは通常は以下の一般的構造を有しており、これには、二本鎖部分と一本鎖部分の両方が含まれる：
Figure 2009517340
 式中、Ｎ、Ｘ、およびＹはヌクレオチドであり；ＸはＹに対する水素結合であり；「：」は、２つの塩基の間での水素結合を示し；ｘは１から約１００の間の値を有している自然数であり；そしてｍおよびｎは、０から約１００の間の値を独立して有しているあらゆる整数である。いくつかの実施形態においては、Ｎ、Ｘ、およびＹは、独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。自然界には存在しない塩基およびヌクレオチドが、特に、合成のｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング産物）の場合には存在し得る。二本鎖の中心部分は「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する；一本鎖部分は突出であり、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有している。示される突出は３’突出であるが、５’突出を有している分子もまた本発明の範囲に含まれる。本発明の範囲にはまた、突出を有していないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、およびコアの一方の側に突出を有しているが、他方には突出を有していないｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｍ＝０、およびｎ≧１、またはその逆）もまた存在する。
最初は、ＲＮＡｉ技術は、哺乳動物システムには容易には適用できないと思われていた。これは、哺乳動物においては、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡによって活性化されるプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化して、アポトーシスのカスケードおよび細胞死を生じるからである（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。加えて、ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化させることは以前から知られており、これは、細胞生理学の変化を導き得る（Ｃｏｌｂｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５８Ｌ７８２，１９７６；Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．８：５５，１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかし、ｄｓＲＮＡによって媒介されるＰＫＲおよびインターフェロンカスケードの活性化には、約３０塩基対を超える長さのｄｓＲＮＡが必要である。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを生じることが明らかにされている（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１）。したがって、より長いｄｓＲＮＡ分子に付随する望ましくない非特異的作用は、より長いｄｓＲＮＡを実質的に含まない短いＲＮＡを調製することによって回避することができると予想される。
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａら、Ｃｅｌｌ ９：１２３−１３２，１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）では、ＲＮＡｉを行うための手段として、ヘアピンに折り畳まれた小さいＲＮＡ分子が使用された。したがって、そのような短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子は、本発明の方法においても有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々である；ステムの長さは、約２５から約３０ｎｔまでのどの長さでもあり得、ループの大きさは、４から約２５ｎｔの間の範囲であり得、サイレンシング活性に影響はない。いずれの特定の理論にも束縛されることは望ましくないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に似ており、いずれにしても、特異的遺伝子の発現を阻害することについて同じ能力を有していると考えられている。
アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって、または三重ヘリックスの形成を通じて、遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術は、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｏｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において議論されている。三重ヘリックスの形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３００（１９９１）において議論されている。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。
例えば、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０から４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関係している遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによって、標的タンパク質の転写および生産が妨げられる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳をブロックする。
１つの実施形態においては、Ｓｐ３５遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で生産される。例えば、ベクターまたはその一部が転写されて、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生じる。そのようなベクターはエピソームを保持し得るか、または、それが所望されるアンチセンスＲＮＡを生じるように転写することができる限りは、染色体に組み込まれる。そのようなベクターは、当該分野で標準的である組み換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞の中での複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルス、または当該分野で公知の他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、本明細書中に別の場所に記載されるもののような、脊椎動物（好ましくは、ヒト細胞）の中で作用するように当該分野で公知の任意のプロモーターによって行うことができる。
アンチセンス分子の絶対的な相補性が好ましいが、これは必ずしも必要ではない。Ｓｐ３５をコードするＤＮＡの少なくとも一部に対する配列相補性は、ＲＮＡとハイブリダイズすることができるために十分な相補性を有している配列を意味する。形成された安定な二本鎖；または三本鎖がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に応じて様々であろう。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、より多くの塩基不適合が含まれ得るが、なおも安定な二本鎖（または場合によっては三本鎖である場合もある）が形成される。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用により、不適合を寛容できる程度を確定することができる。
メッセンジャーＲＮＡの５’末端（例えば、５’非翻訳配列まで、およびＡＵＧ開始コドンを含む）に相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害について最も効率よく作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列が、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することに関して十分に有効であることが示されている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’−もしくは３’−非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、Ｓｐ３５の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドには、ＡＵＧ開始コドンの相補物が含まれるはずである。ｍＲＮＡのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害因子としてはあまり有効ではないが、本発明にしたがって使用することができる。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６から約５０ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドである。特異的な態様においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
なお別の実施形態においては、本明細書中に開示される方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常の状況とは対照的に、鎖は互いに平行に並ぶ（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
本明細書中に開示される方法において使用されるポリヌクレオチド組成物にはさらに、触媒ＲＮＡまたはリボザイムが含まれる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、隣接する領域によって示された位置でｍＲＮＡを切断し、これは標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する。標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を有することだけが必要とされる。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生産は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）にさらに完全に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に配置されるように操作され、すなわち、効率を高め、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最少にするために、操作される。
アンチセンスアプローチと同様に、本明細書中に開示される方法において使用されるリボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などの改善のため）から構成され得、そして、インビボでＳｐ３５を発現する細胞に送達され得る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスをコードするＤＮＡの導入についての上記と同じ様式で細胞に導入され得る。好ましい送達方法には、強い構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物の使用が含まれ、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のＳｐ３５メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを生じるであろう。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるので、低い細胞濃度しか効率には必要ない。
本明細書中に開示される方法において使用されるポリヌクレオチド（以下に記載されるアプタマーを含む）は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物、あるいはそれらの誘導体または修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために修飾することができる。ポリヌクレオチドには、（インビボでの宿主細胞レセプターの標的化のための）ペプチド、または細胞膜を通過する輸送を促進する物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２（１９８７）；１９９８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは脳血液関門を通過する輸送を促進する物質（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断試薬（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、あるいは挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）のような他の付加基（ａｐｐｅｎｄｅｄ ｇｒｏｕｐ）が含まれる場合がある。この目的のためには、ポリヌクレオチドが別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断物質など）に結合させられる場合がある。
本明細書中に開示される方法において使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）には、以下からなる群より選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分が含まれ得る：５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルエオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルエオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウェイブトキシン、シュードウラシル、エオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定はされない。
本明細書中に開示される方法において使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）にはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが含まれる（が、これらに限定はされない）群より選択される少なくとも１つの糖部分が含まれる場合がある。
なお別の態様においては、本明細書中に開示される方法において使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、あるいはそれらのアナログかが含まれる（が、これらに限定はされない）群より選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格が含まれる。
本発明の方法において使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）は、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）の使用によって、当該分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された多孔性のガラスポリマー支持体の使用によって調製することができる（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：７４４８−７４５１（１９８８）など）。
アプタマー
別の実施形態においては、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、特有の配列を有しており、所望される標的（例えば、ポリペプチド）に特異的に結合する特性を有しており、そして、所定の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドあるいはポリペプチドであり得る。本発明のヌクレオチドアプタマーとしては、Ｓｐ３５に結合する二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。
核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）プロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、標的分子に対して極めて高い特異性の結合を有する核酸分子のインビトロでの進化のための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、単量体であるか多量体（他の核酸分子およびポリペプチドを含む）かどうかにはかかわらず、米国特許第５，２７０，１６３号（これもまた、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、様々な二次元−および三次元構造を形成するために、ならびに実質的に任意の化合物とともにリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ためにヌクレオチド単量体の中で利用することができる化学的多様性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）についての核酸の能力に基づく。任意の大きさまたは組成の分子が標的となり得る。
ＳＥＬＥＸ方法には、所望される結合親和性および選択性を得るための、候補のオリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的選択スキームを使用する、結合、分配、および増幅の段階的反復が含まれる。核酸の混合物（好ましくは、ランダマイズされた配列のセグメントを含む）から出発する場合には、ＳＥＬＥＸ方法には、混合物を結合に好ましい条件下での標的と接触させる工程；標的分子に特異的に結合したそのような核酸から結合していない核酸を分配する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；リガンドを多く含む核酸の混合物を得るために、核酸標的複合体から解離させられた核酸を増幅する工程。結合、分配、解離、および増幅の工程は、標的分子に対する高度に特異的な高親和性核酸リガンドを得ることが所望される場合には、複数回のサイクルによって繰り返される。
ヌクレオチドアプタマーは、例えば、細胞内シグナル伝達および輸送経路を分析するための診断ツールまたは特異的阻害因子として、使用され得る（Ｊａｍｅｓ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５４０−５４６）。ヌクレオチドアプタマーの高い親和性および特異性は、それらを、薬物の発見のための良好な候補とする。例えば、毒素リシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離されており、これらはナノモル範囲のＩＣ５０値を有している（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ ＪＲら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：４９３７−４９４２）。ヌクレオチドアプタマーもまた、細胞の感染性を低下させるために、感染性疾患、悪性腫瘍、およびウイルス表面タンパク質に対して使用される場合がある。
本発明の方法において使用されるヌクレオチドアプタマーは、他のポリヌクレオチドについて本明細書中に記載されるように（例えば、骨格もしくは塩基を修飾することによって、またはペプチドに結合させることによって）修飾することができる。
Ｓｐ３５のタンパク質構造を使用する、ＳＥＬＥＸプロセスを使用したＳｐ３５に作用するアプタマーのスクリーニングにより、Ｓｐ３５によって媒介されるプロセス（例えば、Ｓｐ３５によって媒介される軸索再生）を阻害するアプタマーを同定することができるであろう。
本発明の方法において使用されるポリペプチドアプタマーは、Ｓｐ３５に結合し、それによってＳｐ３５の作用をブロックするそれらの能力について選択されるランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーには、タンパク質の足場の両方の末端に対して結合させられた短い可変性ペプチドドメインが含まれ得る。この二重構造による拘束は、抗体のものに匹敵するレベル（ナノモルレベル）にまでペプチドアプタマーの結合親和性を大きく増大させる。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆら、（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７８（８）：４２６−４３０を参照のこと。短い可変ペプチドの長さは、通常、約１０から２０アミノ酸であり、足場は、良好な溶解度とｃｏｍｐａｃｉｔｙ特性を有している任意のタンパク質であり得る。足場タンパク質の１つの限定ではない例は細菌タンパク質チオレドキシン−Ａ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ａ）である。例えば、Ｃｏｈｅｎ ＢＡら、（１９９８）ＰＮＡＳ ９５（２４）：１４２７２−１４２７７を参照のこと。加えて、本発明の方法において使用されるポリペプチドアプタマーの限定ではない例は、Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｐｔａｍｅｒ（ＬｉＲＰＡ）である。ＬｉＲＰＡ足場は、３つのタンパク質ドメイン：ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ＦＲＢＰ−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から構成され得る。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ ＢＦら、（２００５）Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ １２（７）：８４７−８５５（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能の優性阻害因子としての役割を担うペプチドまたは低分子ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは標的タンパク質に特異的に結合して、それらの機能的な能力をブロックする（Ｋｏｌｏｎｉｎら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４，２６６−１４，２７１）。標的タンパク質に対して高い親和性および特異性で結合するペプチドアプタマーは、当該分野で公知の様々な技術によって単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって（Ｘｕ，Ｃ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２，４７３−１２，４７８）、またはリボザイムディスプレイによって（Ｈａｎｅｓら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）ランダムペプチドライブラリーから単離することができる。これらは、ファージライブラリーから（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１−２０）または化学的に作成されたペプチドライブラリーから単離することもできる。ペプチドアプタマーがそれによって合成される難しい手段によっては、それらの使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑となるが、これらは化学的送達に限定されない。
本発明の方法において使用されるペプチドアプタマーは、本明細書中で別の場所に他のポリペプチドについて記載されているように修飾することができる（例えば、ポリマーに結合させられるか、またはタンパク質に融合させられる）。
ベクター
Ｓｐ３５アンタゴニストをコードする核酸を含むベクターもまた、本発明の方法において使用されるアンタゴニストを提供するように使用され得る。そのような核酸がそれに対して動作可能であるように連結させられるベクターおよび発現制御配列の選択は、所望される機能的特性（例えば、タンパク質の発現および形質転換される宿主細胞）に応じて様々である。
動作可能であるように連結されたコード配列の発現の調節に有用な発現制御エレメントは当該分野で公知である。例として、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定はされない。誘導性プロモーターが使用される場合は、これは、例えば、宿主細胞培地の中での栄養状態の変化、温度の変化によって制御することができる。
ベクターとしては、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞の中で染色体外での組み換えＤＮＡ分子の自律複製と維持を指示する能力を有しているＤＮＡ配列を挙げることができる。そのようなレプリコンは当該分野で周知である。加えて、原核生物のレプリコンを含むベクターにはまた、その発現により薬剤耐性のような検出可能なマーカーが付与される遺伝子が含まれる場合もある。細菌の薬剤耐性遺伝子の例としては、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対して耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
原核生物のレプリコンを含むベクターには、細菌宿主細胞の中でコード遺伝子配列の発現を指示するための原核生物あるいはバクテリオファージプロモーターもまた含まれ得る。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、通常、発現させられるＤＮＡセグメントの挿入のための通常の制限部位を含むプラスミドベクターの中に提供される。そのようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主を、本発明の方法において使用されるタンパク質をコードする組み換え体ＤＮＡ分子を発現させるために使用することができる。
本発明の目的のためには、多数の発現ベクターシステムを使用することができる。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡエレメントが利用される。他には、内部リボソーム結合部位を有している多シストロン性システムの使用が含まれる。加えて、それらの染色体の中にＤＮＡが組み込まれた細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養素要求性宿主（ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｏｓｔ）に原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性（例えば、抗生物質）、あるいは、銅などの重金属に対する耐性を提供することもできる。選択マーカー遺伝子は発現させられるＤＮＡ配列に直接結合させられるか、または同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により同じ細胞内へ導入されるかのいずれかであり得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｏｅ）遺伝子は、選択マーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらに別のエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要である場合がある。これらのエレメントには、シグナル配列またはスプライシングシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。
１つの実施形態においては、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．，の工業所有権のある発現ベクター（ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と呼ばれている）が使用される場合がある。このベクターには、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ならびにリーダー配列が含まれる。このベクターは、ＣＨＯ細胞の中へのトランスフェクション、それに続き、Ｇ−４１８を含む培地の中での選択、およびメトトレキセート増幅されると非常に高い発現レベルを生じることが明らかにされている。もちろん、真核生物細胞の中で発現を誘発することができる任意の発現ベクターが本発明において使用され得る。適切なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手することができる）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手することができる）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらなる真核生物細胞発現ベクターは当該分野で公知であり、市販されている。通常、そのようなベクターには、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位が含まれる。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、およびｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＶＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクターシステムは、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
一般的には、形質転換された多数の宿主細胞を、アンタゴニストを適切な高いレベルで発現するものについてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的に行われている実験である。
哺乳動物の宿主細胞での発現のために頻繁に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞の中でのタンパク質の高レベルでの発現を指示するウイルスエレメント（例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））に由来するプロモーターおよびエンハンサー、ポリオーマおよび強力な哺乳動物プロモーター（例えば、自然界に存在している免疫グロブリンおよびアクチンプロモーター））が挙げられる。ウイルス調節エレメント、およびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
組み換え発現ベクターは、宿主細胞の中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）と選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターがその中に導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常は、選択マーカー遺伝子は薬剤（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。頻繁に使用される選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするベクターは、適切な宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は任意の適切な方法によって行うことができる。外来ＤＮＡの哺乳動物細胞への導入のための方法は当該分野で周知であり、これには、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームの中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化によるトランスフェクション、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞の中に導入することができる。哺乳動物細胞はまた、哺乳動物細胞の中に導入される外来ＤＮＡを含む組換え体ウイルスによって導入することもできる。
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適する従来法によって行うことができる。原核生物宿主細胞の形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質、または塩処理方法を使用することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものが最も好ましい；当業者は、その中で発現させられる所望される遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を特異的に決定する能力を有していると思われる。例示的な宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原でのＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、通常、商業的サービスによってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開されている文献から入手することができる。
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技術を使用して高めることができる。例えば、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）システムは、特定の条件下での発現を高めるために一般的に使用されている。例えば、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、同第０ ２５６ ０５５号、および同第０ ３２３ ９９７号、ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４を参照のこと。
宿主細胞
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物である場合も、また、真核生物細胞である場合もある。例示的な真核生物宿主細胞としては、酵母および哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ））が挙げられるが、これらに限定はされない。他の有用な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。
遺伝子治療
Ｓｐ３５アンタゴニストは、哺乳動物（例えば、ヒト患者）において、ＤＡニューロンの変性、死、もしくは欠失、または再生が関係している疾患、障害、あるいは損傷の処置のための遺伝子治療アプローチを使用して、インビボで生産することができる。これには、適切な発現制御配列に動作可能であるように連結された適切なＳｐ３５アンタゴニストをコードする核酸の投与が含まれる。一般的には、これらの配列はウイルスベクターに組み込まれる。このような遺伝子治療に適しているウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスｂ稀有ター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであり得る。それらのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠失を有しているアデノウイルスベクターが、通常は使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合には、ベクターは、通常は、選択マーカー遺伝子を有していない。
薬学的組成物
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物への投与のために、薬学的組成物に処方される。本発明の方法において使用される薬学的組成物には、薬学的に許容される担体（例えば、イオン交換体、酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。
本発明の方法において使用される組成物は、任意の適切な方法（例えば、非経口で、脳室内に、経口で、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、鼻腔内に、舌下に、膣に、または埋め込み型のレザーバーによって）投与することができる。用語「非経口」には、本明細書中で使用される場合には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、および頭蓋内への注射ならびに注入技術が含まれる。先に記載されたように、本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストは、乏突起膠細胞の生存、再生、および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進するように、神経系において作用する。したがって、本発明の方法においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、それらが脳血液関門を通過するそのような方法で投与される。この通過によっては、Ｓｐ３５アンタゴニストスト分子自体に固有の生理化学的特性によって、薬学的処方物中の他の成分によって、または血液脳関門を破るための針、カニューレ、もしくは外科手術用機器のような機械的デバイスの使用によって生じ得る。Ｓｐ３５アンタゴニストが血液脳関門を本質的には通過できない分子（例えば、通過を容易にする部分への融合体）である場合には、適切な投与経路は、例えば、髄腔内または頭蓋内であり、例えば、ＭＳの慢性的病変への直接の投与である。Ｓｐ３５アンタゴニストが、血液脳関門を本質的に通過できる分子である場合には、投与経路は、以下に記載されるさまざまな経路の１つ以上によって行われ得る。
本発明の方法において使用される組成物の滅菌の注射可能な形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤もしくは湿潤剤と懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術にしたがって処方され得る。滅菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤あるいは溶媒中の、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液）でもあり得る。中でも、使用することができる許容される媒体および溶媒は、水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常使用される。この目的のためには、任意の混合された固定油（合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む）が使用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）が、オリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容される油と同様に、注射可能な調製物において、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンが有用である。これらの油溶液または懸濁液にはまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤）も含まれ得、これらは、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される投与形態の処方物として一般的に使用される。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎｓ，Ｓｐａｎｓ、および他の乳化剤または生体利用性エンハンサー（薬学的に許容される固体、液体、もしくは他の投与形態の製造において一般的に使用される））もまた処方の目的のために使用することができる。
非経口処方物は、１回のボーラス用量、注入、または負荷ボーラス用量であり得、その後に維持用量が続き得る。これらの組成物は、例えば、特異的な固定された間隔、または様々な間隔（例えば、１日に１回）で投与される場合も、あるいは、「必要に応じ」た基準で投与される場合もある。
本発明の方法において使用される特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または溶液剤を含む許容される投与量形態で経口投与することができる。特定の薬学的組成物にはまた、鼻腔エアゾールまたは吸入によっても投与され得る。そのような組成物は、ベンジルアルコール、または他の適切な保存剤、生体利用性を高めるための吸収促進剤、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
単回の投与量形態を生じさせるために担体物質と組み合わせられ得るＳｐ３５アンタゴニストの量は、処置される宿主、使用されるアンタゴニストのタイプ、および特定の投与形式に応じて様々であろう。組成物は、単回用量として、および多用量として、またはて確立された時間にわたる注入として投与され得る。投与レジュメもまた、最適な所望される応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調整され得る。
本発明の方法では、Ｓｐ３５アンタゴニストの「治療有効量」または「予防有効量」が使用される。そのような治療有効量または予防有効量は、複数の要因（例えば、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重）にしたがって様々であり得る。治療有効量または予防有効量はまた、治療上有効な効果があらゆる毒性または有害な作用を上回る量である。
任意の特定の患者についての特異的投与量および処置レジュメは、様々な要因に応じて変化するであろう。要因には、使用される特定のＳｐ３５アンタゴニスト、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事療法、ならびに投与のタイミング、排出速度、薬物の組み合わせ、および処置される特定の疾患の重篤度が含まれる。医学的な介護人によるそのような要因の判断は、当業者の能力の範囲内である。量はまた、処置される個々の患者、投与の経路、処方物のタイプ、使用される化合物の特徴、疾患の重篤度、および所望される効果に応じても様々であろう。使用される量は、当該分野で周知の薬理学的および薬物動態的原理によって決定することができる。
本発明の方法においては、Ｓｐ３５アンタゴニストは、一般的には、神経系に直接、脳室内に、またはくも膜下に、（例えば、ＭＳの慢性病変内に）投与される。本発明の方法にしたがう投与のための組成物は、１日あたり体重１ｋｇあたり０．００１〜１０ｍｇのＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドの投与量が投与されるように処方することができる。本発明のいくつかの実施形態においては、投与量は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。いくつかの実施形態においては、投与量は、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体での処置については、投与量は、例えば、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇまで、そしてより通常は、宿主の体重について、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲内に入ると意図される。被験体には、そのような用量が毎日、１日置きに、１週間おきに、または経験的な分析によって決定された任意の他のスケジュールにしたがって投与され得る。例示的な処置には、長期間の間（例えば、少なくとも６ヶ月間）にわたる複数回の投与量での投与が必然的に伴う。さらなる例示的な処置レジュメには、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３から６ヶ月に１回の投与が必然的に伴う。例示的な投与スケジュールには、毎日連続して１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間おきに６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。いくつかの方法においては、異なる結合特異性を有している２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合は、投与される個々の抗体の投与量は、示される範囲に入る。
特定の実施形態においては、被験体は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で処置することができる。核酸についての用量は、患者１人あたり約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１μｇから１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１用量あたり１０〜１００、またはそれ以上のビリオンまでで変化する。
補助活性化合物もまた、本発明の方法において使用される組成物の中に組み入れることができる。例えば、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたは融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方することができ、そして／または同時に投与することができる。
本発明には、選択された標的組織へのＳｐ３５アンタゴニストの任意の適切な送達方法が含まれる。これには、水性溶液のボーラス注射、または徐放システムの埋め込みが含まれる。徐放用のインプラントの使用によっては、注射の反復の必要性が低減する。
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストは、脳に直接注入することができる。化合物の直接の脳への注入のための様々なインプラントが公知であり、神経学的障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。これらには、ポンプ、定位固定で埋め込まれた、一次的な間質カテーテル（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃａｔｈｅｔｅｒ）、永久的な頭蓋内カテーテルインプラント、および外科手術によって埋め込まれた生体分解性インプラントを使用する脳への長期にわたる注入が含まれる。例えば、Ｇｉｌｌら、前出；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；第６６章、５７７−５８０頁、Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
組成物にはまた、化合物に適している送達システムまたは支持システムとしての役割を担う、生体適合性の担体物質の中に分散させられたＳｐ３５アンタゴニストも含まれ得る。徐放担体の適切な例としては、成型された製品（例えば、坐剤またはカプセル剤）の形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。埋め込むことができるマトリックス、またはマイクロカプセル徐放マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態においては、Ｓｐ３５アンタゴニストが、脳の適切な領域への直接の注入により患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。別の技術を利用することができ、これは、本発明のＳｐ３５アンタゴニストを投与するために適応させることができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニット（ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ ｕｎｉｔ）を使用して行うことができる。２ｍｍの切片厚みを用いた、１２０ｍｌのｏｍｎｉｐａｑｕｅ、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌを注入する造影ＣＴ（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ））スキャンによっては三次元多平面治療計画（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が可能である。この機器によって、磁気共鳴影像法の実験に基づく計画が可能であり、明確な標的の立体構造についてのＣＴおよびＭＲＩ標的情報を比較併合することができる。
ＧＥ ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と共に使用するために改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、ならびに、Ｂｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、この目的のために使用することができる。したがって、埋め込みの朝、ＢＲＷ定位固定フレームの輪状のベースリングが患者の頭蓋骨に取り付けられ得る。連続するＣＴの断像を、ベースプレートに固定されたグラファイトロッド（ｇｒａｐｈｉｔｅ ｒｏｄ）のローカライザーフレームを用いて、領域全体（標的組織）について３ｍｍの間隔で得ることができる。コンピューター処理設計プログラム（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ）をＶＡＸ １１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上で、グラファイトロッド画像のＣＴ座標を使用して行うことができ、ＣＴ空間とＢＲＷ空間がマップされる。
本明細書中に記載されるような障害の処置方法は、通常、ヒトで使用される前に、所望される治療活性または予防活性について、インビトロで、その後、許容される動物モデルにおいてインビボで試験される。適切な動物モデル（トランスジェニック動物を含む）は当業者に公知であろう。例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストの区別および生存性の効果を明らかにするためのインビトロでのアッセイは本明細書中に記載されている。Ｓｐ３５アンタゴニストの軸索の髄鞘形成に対する効果は、実施例に記載されているようにインビトロで試験することができる。最後に、インビボでの試験は、Ｓｐ３５アンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを作成すること、またはＳｐ３５アンタゴニストを本明細書中に記載されるようなモデルにおいてマウスもしくはラットに投与することによって行うことができる。
本発明の実施では、他の場所で明記されていない限りは、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が使用されるであろう。これらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３巻セット）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ，Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ（２００３）；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（２００３）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（編）．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２０００）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編），（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９８８）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻，Ｗｕら、（編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編），（１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４巻セット），第１版，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００２）；ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照のこと。
抗体の操作の一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｂ．Ｌ．Ｌｏ（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に示されている。タンパク質の操作の一般的原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら（編），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に示されている。抗体と抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に示されている。加えて、当該分野で公知であり、詳細に記載されていない免疫学の標準的方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２版，Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９８），Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、ならびに、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（編），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載されているものに一般的にしたがう。
免疫学の一般的原理を説明している標準的な参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．；Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら、Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．（２０００）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎら、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｉ．Ｒｏｉｔｔら、Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００１）；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版；Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｈ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４巻セット），第１版，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（２００２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ら（編），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ら、（編），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）が挙げられる。
上記で引用された参考文献の全て、さらには、本明細書中で引用される全ての参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
（実施例１）
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）はラットの中脳のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの中で発現される。
Ｓｐ３５の発現を、生後７日（Ｐ７期）のラットの脳、成体ラットの脳、およびラットの一次胚培養物（Ｅ１５）において、免疫組織化学および／またはインサイチュハイブリダイゼーションによって評価した。凍結させたラットの脳の切片を、Ｐ７、および上記の成体発生段階のラットから調製した。脳の切片を、以下のプロトコールを使用し、そしてＭｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載されているように、インサイチュハイブリダイゼーションのために調製した。動物を、ＣＯ２で安楽死させた。すぐに脳を取り出し、４８時間の間、１０％の中性の緩衝化ホルマリンで固定した。脳を、冷凍保護（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）のためにＰＢＳ中の３０％のスクロースの中で平衡化させ、連続的に切片化した。インサイチュハイブリダイゼーションを、腹側の（ｖｅｎｔｒａｌ）中脳全体のそれぞれ６番目を含む、ランダムに選択した切片のシリーズについて行った。
脳切片を、ジゴキシゲニンで標識したＳｐ３５アンチセンスおよびセンスＲＮＡでプローブした。切片を、ＴＳＡと蛍光、および抗ジゴキシゲニン結合抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者の説明書にしたがって染色した。その後、切片を、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、および抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色した。Ｐ７期では、Ｓｐ３５ ｍＲＮＡは、中脳のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性ＤＡニューロンの中で中程度で発現されていた。以前に報告されているように、また、小脳の中でのＳｐ３５ ｍＲＮＡの強い発現が存在し、そして線条体の中では弱い発現が存在していた。Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）を参照のこと。しかし、成体の中脳の中においては、ＴＨ陽性ＤＡニューロンの中ではＳｐ３５ ｍＲＮＡはほとんど発現されていなかった。
一次胚腹側中脳（ＶＭ）培養物を、Ｌｉｎ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：５４７−５５５（２００５）に記載されているように、Ｅ１５ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）から単離した。簡単に説明すると、脳組織を、熱で不活化させたウマ血清（１０％）、グルコース（６．０ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、およびグルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ）を含む冷却したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，ＮＹ））の中で、研磨したパスツールピペットを用いて機械的に解離させた。２×１０５個の細胞を培地の中に再懸濁し、２４ウェルトレイ（Ｆａｌｃｏｎ）のそれぞれのウェルの１５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングしたカバースライドの上に播種した。
蛍光免疫組織化学分析を、Ｌｉｎ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：５４７−５５５（２００５）に記載されているように、脳切片およびＶＭ一次培養物について行った。簡単に説明すると、およそ２×１０５個の細胞を含むカバースライドを、０．１Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％の正常なヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｉｎｅ）および０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温で３０分間処理した。その後、カバースライドを、４℃で一晩、一次抗体とともに、その後、別の蛍光と結合させた適切な二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。ＤＡニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、１：３００希釈で使用した。Ａｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と結合させた二次抗体を、１：５００の濃度で使用した。一次抗体または過剰な抗原とともに予めインキュベートした抗体の脱落を対照として使用した。蛍光シグナルを、共焦点画像化システム（ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＮＹ）によって試験した。
一次ＶＭ培養物においては、Ｓｐ３５がＤＡニューロンの中で観察された。ここでは、Ｓｐ３５とＴＨの染色は一緒に局在化していた。Ｓｐ３５特異的抗体を過剰のＳｐ３５タンパク質とともに予めインキュベートした場合には、染色は検出されなかった。Ｓｐ３５はまた、ヒトの中脳黒質および齧歯類の中脳のいずれにおいても、非ＴＨニューロンの中で発現されていた。
これらの実験は、Ｓｐ３５が中脳胚（Ｅ１５）およびＰ７ ＤＡニューロンの中で発現されており、これは、成体ＶＭの中よりも少ないことを示している。免疫組織化学実験もまた、Ｓｐ３５タンパク質が神経突起の中だけではなく、中脳の一次培養物においてＤＡニューロンの血漿膜の中でも発現されていることを示している。
（実施例２）
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）アンタゴニストはインビトロでＤＡ神経突起の成長および生存を促進する。
Ｓｐ３５の細胞質ドメインには、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＥＧＦＲ様チロシンリン酸化部位が含まれており、したがって、シグナル伝達において直接的または間接的に関与している可能性がある。細胞質ドメインの重要性を評価するために、細胞質ドメインが欠失しているＳｐ３５の短縮型（ＤＮ−Ｓｐ３５）を作成した（配列番号２のアミノ酸３４〜５８１または３４〜５４８）。細胞質ドメインが欠失している短縮型のＳｐ３５は、Ｎｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）およびｐ７５ＮＴＲおよび／または別の受容体（例えば、ＴＡＪ／ＴＲＯＹ）と複合体を形成し、それによってシグナル伝達を妨げることによって、優性陰性（ＤＮ）分子として機能することが示されている。Ｓｈａｏら、Ｎｅｕｒｏｎ ４５：３５３−３５９（２００５）およびＰａｒｋら、Ｎｅｕｒｏｎ ４５：３４５−３５１（２００５）を参照のこと。
全長（ＦＬ）−Ｓｐ３５（配列番号２のアミノ酸２４〜６１４）または優性陰性（ＤＮ）−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスを、以下の方法を使用し、そしてＭｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載されているように作成した。全長および短縮型（ＤＮ−Ｓｐ３５）のヒトＳｐ３５のｃＤＮＡ配列を、ＨＡタグ化融合タンパク質を発現させるためにｐＳＥＣＴＡＧ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、その後、ＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰベクターに連結した。レンチウイルス構築物を、Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ４１７：９４１−９４４（２００２）に記載されているように、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）およびＨＩＶ−１パッケージングベクターデルタ８．９と共に２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトして、組み換え体レンチウイルスを作成した。
ラットの一次ＶＭニューロンの培養物を、ＦＬ−Ｓｐ３５、優性ＤＮ−Ｓｐ３５を生産するレンチウイルス、またはベクター対照で形質導入した。それぞれのウイルスのグループを、１または５の感染多重度（ＭＯＩ）でＶＭニューロン培養物に添加した。細胞を２４時間培養し、ＰＢ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定した。神経突起の成長を、これらの感染させたニューロンの中で試験した。神経突起の伸張または細胞数の試験のために、各ウェルからのいくつかの領域を、一体型のＡｘｉｏｓｋｏｐ ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＮＹ）およびＳｔｅｒｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ｉｍａｇｅ ｃａｐｔｕｒｅ機器およびソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，ＶＴ）を使用して捕捉した。
神経突起の成長は、ＤＮ−Ｓｐ３５に感染させたＴＨ陽性ニューロンの中で促進された。対照的に、ＴＨ陽性ニューロンは、ＦＬ−Ｓｐ３５で形質導入した場合には、神経突起の長さの差は示さなかった。これらの観察は、ＤＮ−Ｓｐ３５が、内因性のＳｐ３５の機能を破壊し、それによってＤＮ神経突起の成長を促進することを示している。図１を参照のこと。
Ｓｐ３５−Ｆｃタンパク質（Ｆｃドメインに融合させられた配列番号２のアミノ酸１〜５３２）を使用して、これが、ＤＡ神経突起の成長を促進することによってＤＡニューロンの中でＦＬ−Ｓｐ３５機能のアンタゴニストとして機能するかどうかを決定した。対照−ＦｃおよびＳｐ３５−Ｆｃを、Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載されているように調製した。簡単に説明すると、ヒトＳｐ３５のアミノ酸１〜５３２を、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合させた。Ｓｐ３５−ＦｃポリペプチドをＣＨＯ細胞の中で発現させ、そしてプロテインＡセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製した。精製したタンパク質（＞９５％の純度）は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のゲル電気泳動によって測定し、既知のタンパク質標準物と比較すると、９０ｋＤａの分子量を有していた。このタンパク質は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、機知の標準物と比較した場合には、１８０ｋＤａの分子量を有していた。
精製したＳｐ３５−Ｆｃポリペプチドを、ＶＭニューロンの培養物に対して外部から提供した。神経突起の成長は、過剰のＳｐ３５−Ｆｃの添加によって促進された。図１を参照のこと。外部から供給された対照ＩｇＧポリペプチドは、ＤＡ神経突起の成長を促進しなかった。加えて、ＤＮ−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスで処理した培養物のＴＨ神経突起の長さを試験した。ＤＮ−Ｓｐ３５およびＳｐ３５−Ｆｃで処理した培養物は、対照レンチウイルスでの処理と比較して（ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）、および対照Ｆｃと比較して（ｐ＜０．００３）、有意に長かった。
ＤＮ−Ｓｐ３５の効果を、また、１−メチル−フェニルピリジニウムイオン（ＭＰＰ＋）で処理した一次ＶＭ培養物に対しても試験した。ＭＰＰ＋は、通常は、一次ＤＡ神経細胞の細胞死を誘導し、そしてこれは、ＰＤの実験用の十分に確立されているモデルシステムである。Ｇｉｌｌｅら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０１８：５３３−５４０（２００４）を参照のこと。ＶＭニューロンを、上記のようにレンチウイルスに感染させた。培養した細胞を、１０μＭのＭＰＰ＋に対して、４日目に４８時間暴露し、その後、固定した（６日目）。ＤＮ−Ｓｐ３５は、ラットの中脳の一次培養物の中で１０μＭのＭＰＰ＋に暴露させられたＴＨ陽性ニューロンを保護した。図２を参照のこと。ＭＰＰ＋に暴露した場合のＴＨニューロンの数は、ＦＬ−Ｓｐ３５を形質導入したニューロンおよび対照を形質導入したニューロンと比較して（ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）、ＤＮ−Ｓｐ３５を形質導入した細胞において有意に高かった。加えて、米国仮特許出願番号６０／６９７，３３６（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、ＭＰＰ＋に暴露させた一次ＶＭ培養物は、Ｓｐ３５−ＦｃおよびＳｐ３５アンタゴニスト抗体１Ａ７への暴露によって、細胞死から保護された。Ｓｐ３５−Ｆｃおよび１Ａ７抗体で処理した細胞は、対照Ｆｃまたは対照であるＩｇＧで処理した培養物と比較して（１Ａ７についてはｐ＜０．０１、Ｓｐ３５−Ｆｃについてはｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）、ＴＨ陽性ニューロンに対して、ＭＰＰ＋の毒性に対する有意な防御効果を示した。図３を参照のこと。これらの結果は、内因性Ｓｐ３５の阻害が、ＭＰＰ＋神経毒素への暴露に対してＤＡニューロンを保護することを示している。
（実施例３）
Ｓｐ３５活性を遮断することによってＡｋｔリン酸化が誘導される
Ａｋｔは、ＰＩ３キナーゼ生存経路の下流のエフェクターである。Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２７０−２８０（１９９９）。ラットの一次ＶＭ培養物中での正常なＡｌｔリン酸化レベルを、ウェスタンブロット分析によって評価した。ラットの一次ＶＭニューロンに、実施例２に記載したように、ＦＬ−Ｓｐ３５またはＤＮ−Ｓｐ３５（ＨＡタグ化）を発現するレンチウイルスを形質導入した。形質導入したラット一次ＶＭニューロを４８時間後に回収し、そして５００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１０％のグリセロール）の中に、４℃で３０分間溶解させた。上清を、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）上で電気泳動させ、免疫ブロット膜に移動させ、そして抗ＨＡ親和性マトリックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または抗ホスホＡｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ）、またはＡｋｔ全体に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ）のいずれかでプローブした。
Ａｋｔリン酸化は、ＦＬ−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスまたは対照ベクターでの形質導入と比較して、ＤＮ−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスでのラットの一次ＶＭニューロンの形質導入の後に有意に増大した。図４を参照のこと。これらの結果は、ＤＮ−Ｓｐ３５が、ＰＩ３／Ａｋｔシグナル伝達経路の関与によって、一部、ＴＨ陽性ニューロンの生存性に影響を与えることを示唆している。
（実施例４）
Ｓｐ３５ノックアウトマウスの作成
Ｓｐ３５ノックアウトマウスを、Ｓｃｈｉｅｍａｎｎら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：２１１１−２１１４（２００１））に記載されているように、Ｓｐ３５の１つのエキソンコード配列全体を標的化するＧＦＰ／Ｎｅｏ（緑色蛍光タンパク質／ネオマイシン）の置き換えを用いて作成した。マウスのゲノム１２９／ＳｖＪ ＤＮＡを、λゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃９４６３１３）から単離した。１４．６ｋｂのＥｃｏＲＶ断片をｐＢＳＫ＋にサブクローニングし、次いで、ＡＴＧで始まるｅＧＦＰ Ｑ４０受容体遺伝子を挿入するために、細菌の中での相同組み換えによって標的化した。最終的な構築物は、Ｓｐ３５の１つのエキソンコード配列の全体である１〜１，８４１ヌクレオチドを欠失していた。この構築物を使用して、Ｄ３（１２９／Ｓｖ）胚性幹細胞の中のＳｐ３５遺伝子坐を標的化した。正確に標的化された細胞を、ＥｃｏＲＩで消化した胚性幹細胞のＤＮＡのサザンブロッティングによって同定し、そしてこれらを、キメラマウスを作成するためにＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入した。キメラをＣ５７Ｂｌ／６マウスに交配して、ヘテロ接合型の創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスを作成した。遺伝子型を、末端ＤＮＡの３プライマーＰＣＲによって決定した。正方向プライマー：５’−ＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣ−３’（配列番号６）と、２つの逆方向プライマー：５’−ＧＡＧＴＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＧ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧ−３’（配列番号８）によっては、それぞれ３５サイクルの反応（９４℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）において、２７５ｂｐの野生型と３５６ｂｐの変異体対立遺伝子産物が生じた。Ｍｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）を参照のこと。Ｓｐ３５遺伝子の欠失の確認を、サザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、およびノーザンブロット分析によって行った。突出したバンドが、野生型マウスにおいてはノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲにおいて検出されたが、複数のバンドの完全な消滅がノックアウトマウスにおいて見られた。ヘテロ接合型のサザンブロットは、野生型と修飾されたＳｐ３５の対立遺伝子の両方を示した。Ｓｐ３５ノックアウトマウスは正常であるように見え、行動、運動、または繁殖力に明白な身体的異常または変化はなかった。ヘテロ接合型Ｆ１の子孫の同腹子は様々な大きさであった。Ｓｐ３５ノックアウトマウスの作成は、Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７：２２１−２２８（２００４）（引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
（実施例５）
Ｓｐ３５ノックアウトマウスの中でのＤＡニューロンの生存および再生についてのインビトロ６−ＯＨＤＡアッセイ
Ｓｐ３５ノックアウトマウスを、Ｓｐ３５を有していないマウスが、ニューロンの生存性を増大させ、そして損傷後の脳のドーパミン作動性経路の機能回復を改善するかどうかを決定するために試験した。１３匹のＳｐ３５ノックアウトマウスと１３匹の野生型同腹子である対照マウスを、ケタミンとキシラジンを使用して（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）麻酔し、６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ）の片側性の線条体内注射を投与するために定位固定フレームの中に配置した。手術部位をベタジンとアルコールで拭い、そして０．５ｃｍの中線矢状切開を行って、ブレグマを露出させた。小さい頭蓋穿孔（ｂｕｒｒ ｈｏｌｅ）を、注射部位の上に頭蓋骨に作成し、０．０２％のアスコルビン酸／生理食塩水（Ｓｉｇｍａ）の中に溶解させた１０μｇの６−ＯＨＤＡを、頭蓋骨の表面に対して腹側ＤＶ−２．５ｍｍ、中線に対して側面に、Ｌａｔｅｒａｌ １．５ｍｍの、ＡＰ＋０４の座標で左線条体に注射した。６−ＯＨＤＡを、２６ゲージの１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して、０．５μｌ／分の速度で２分間かけて注入した。
６−ＯＨＤＡの注入後、カニューレを、さらに２分間かけて適切な場所に配置し、その後、ゆっくりと引き抜いた。この切開は１つのオートクリップ（ａｕｔｏ ｃｌｉｐ）を使用して閉じ、マウスを、麻酔から回復するまで暖かいパッドの上に置いた。マウスの線条体への６−ＯＨＤＡの注射によって、ＤＡ軸索及びニューロンの進行性の消失が生じ、これは、ＰＤの研究のための十分に確立されているモデルシステムである（Ｂｒｕｎｄｉｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３６６：３４６−３４９（１９８６）を参照のこと）。
回転試験を、６−ＯＨＤＡの注入後、１週間、２週間、３週間、および４週間で行った。回転試験のために、マウスには、０．４ｍｇ／ｋｇの用量で、０．０２％のアスコルビン酸中のアポモルヒネを皮下に注射した。病変部位に対して反対側への回転を、３０分の間カウントした。
「回転行動」は、黒質線条体ドーパミン経路に対して片側性の損傷を有している動物に、ドーパミンアゴニスト（例えば、アポモルヒネ）またはドーパミン放出剤（例えば、アムフェタミン）を投与した場合に見られる行動である。動物は線条体ドーパミン受容体によるより大きな刺激を経験した脳の側から離れる方向に円を描きながら繰り返し回転する。回転応答の大きさ（すなわち、行われた回転数）は、黒質線条体ドーパミン経路に対する損傷の程度に正比例する。例えば、Ｆｕｘｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：４１−４７（１９７６）を参照のこと。
回転行動の測定の少なくとも２４時間後に、マウスを、ＣＯ２での窒息によって安楽死させた。すぐに脳を取り出し、４８時間の間、１０％の中性の緩衝化ホルマリンで固定した。脳を、冷凍保護のためにＰＢＳ中の３０％のスクロースの中で平衡化させ、連続的に切片化した。日常的に行われているＡＢＣ免疫組織化学試験を、腹側の中脳全体のそれぞれ６番目を含む、ランダムに選択した切片のシリーズについて行った。切片を、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（１：３００、Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚ，ＡＫ）とともに４℃で一晩インキュベートし、その後、それぞれ、ビオチニル化ヤギ抗ヒツジ二次抗体（１：３００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）とともに、そしてストレプトアビジン−ビオチン複合体とともに、室温で１時間インキュベーションした。染色を、ニッケル増強（ｎｉｃｋｅｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を用いた３，３’−ジアミノベンジジン溶液とともにインキュベーションすることによって視覚化させた。一次抗体の脱落を対照とした。立体学を、一体型のＡｘｉｏｓｋｏｐ ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＮＹ）およびＳｔｅｒｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ画像取り込み機器およびソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，ＶＴ）を使用して、染色した切片上で行った。ＴＨ陽性細胞を、光学的フラクションプローブ（ｏｐｔｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）を使用してカウントした。おおよその細胞の総数を、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄソフトウェアを使用して得た。立体学的分析は、グループについての処置について知らない研究者に行わせた。
運動の対称性は、試験した全ての時点で、野生型同腹子である対照と比較して、ノックアウトマウスにおいては有意に低かった（ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ）。図５を参照のこと。６−ＯＨＤＡの注射の３２日後の死後分析により、病変である中脳の中のＴＨニューロンの数の顕著な減少が明らかになった。立体学的分析により、中脳の中のＴＨニューロンの数は、野生型マウスとノックアウトマウスにおいて相違ないことが明らかになった（ｐ＞０．０５、対応のないｔ検定）。図６Ａを参照のこと。遺伝子型によって生じた差を補正するために、病変である中脳の中のＴＨニューロンの数を、それぞれの動物の病変ではない側の数と割合として表した。統計分析により、野生型マウスよりもノックアウトマウスにおいて高いＴＨニューロンの割合が明らかになり（ｐ＝０．００２、対応のないｔ検定）、これは、ノックアウトマウスが、野生型同腹子である対照と比較して６−ＯＨＤＡモデルにおいて防御されていることを示している。図６Ｂを参照のこと。
ＴＨニューロンの数を、腹側被蓋領域（ＶＴＡ、Ａ１０領域）と黒質緻密部（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｎｉａｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ）（ＳＮｃ、Ａ９領域）領域において、Ｂｌｕｍ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：３７４−３７７（１９９８）に記載されている、偏りのない光学フラクショネーター（ｕｎｂｉａｓｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）法を使用して、立体学的にカウントした。ＫＯマウスとＷＴマウスの間に、ＴＨニューロンの数の有意な差はなかった（Ｆ１，４８＝１．３２１、ｐ＞０．０５）。しかし、ＴＨ細胞数には、病変側と、病変ではない側との間では有意な差があった（Ｆ１，４８＝２７．５３、ｐ＜０．０００１）。そして、病変側と病変ではない側との間でのＴＨ細胞数の差は、遺伝子型によって有意な影響を受けていた（遺伝子型と脳の側との間での相互作用）（Ｆ１，４８＝４．３４、ｐ＞０．０５）。図８を参照のこと。病変側のニューロンの数を、それぞれの動物の病変ではない側に対して較正して、遺伝子型によるあらゆる影響を防いだ。統計分析は、ＷＴマウス（５６％±５．５％）よりもＫＯマウスにおいてより多いＴＨニューロンの数（平均±ｓ．ｅ．ｍ．：７９％±４．５％）を示した（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定、ｔ（２４）＝３．３４；ｐ＝０．００３）。これは、これらのマウスにおけるノックアウトの神経防御効果を明らかにしている。
６−ＯＨＤＡによって誘導した実験用のパーキンソニズムモデルにした野生型マウスにおいては、Ｓｐ３５タンパク質は、注射の３日後に、線条体の中で増加していた。図９を参照のこと。Ｓｐ３５は、野生型マウスにおいては線条体６−ＯＨＤＡの投与の３日後に、反対側（対照）と比較して病変側（６−ＯＨＤＡ）の中でアップレギュレートされていた。３匹のマウスを、それぞれの時点（０日目、３日目、７日目、および１５日目）でそれぞれ試験した（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
（実施例６）
Ｓｐ３５ノックアウトマウスの中でのＤＡニューロンの生存および再生についてのインビトロＭＰＴＰアッセイ
Ｓｐ３５を有していないマウスが高いニューロン生存性と、損傷後の脳におけるドーパミン作動性経路の機能回復の改善を示すことをさらに確認するために、マウスを、ＰＤのＭＰＴＰモデルにおいても評価した。１３匹のＷＴマウスと１４匹のＳｐ３５ノックアウトマウスに、２５ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ）を４回、それぞれの注射の間に２時間あけて、腹腔内に注射した。例えば、Ｂａｔｔａｇｌｉａ Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５：１５５−１６６（２００３）を参照のこと。全ての動物を、注射の７日後に屠殺した。マウスをＣＯ２での窒息によって安楽死させた。すぐに脳を取り出し、４８時間の間、１０％の中性の緩衝化ホルマリンで固定した。脳を、冷凍保護のためにＰＢＳ中の３０％のスクロースの中で平衡化させ、連続的に切片化した。立体学を、一体型のＡｘｉｏｓｋｏｐ ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＮＹ）およびＳｔｅｒｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ画像取り込み機器およびソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，ＶＴ）を使用して、染色した切片上で行った。ＴＨ陽性細胞を、光学的フラクションプローブ（ｏｐｔｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）を使用してカウントした。おおよその細胞の総数を、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄソフトウェアを使用して得た。立体学的分析は、グループについての処置について知らない研究者に行わせた。ＭＰＴＰ処置の７日後の死後の立体学的分析により、ＷＴマウスと比較して、ＫＯマウスにおいて中脳の中のＴＨニューロンの数がより多いことが明らかになった。図６Ｃを参照のこと。
別の実験においては、１０匹のＫＯマウスと１０匹のＷＴである同腹子を、ＰＤのＭＰＴＰモデルにおいて評価した。生理食塩水を注射したＷＴマウス（ｎ＝７）およびＫＯマウス（ｎ＝８）を対照とした。ＭＰＴＰでの処置の７日後の死後の立体学的分析により、黒質緻密部（ＳＮｃ、Ａ９領域）の中のＴＨ細胞の数は、対照ＷＴマウスおよびＫＯマウスとの間で差がないことが明らかとなった。しかし、ＴＨニューロンの数は、媒体で処置したＷＴおよびＫＯマウスと比較すると、ＭＰＴＰで処置したＷＴマウスのＳＮｃの中では減少していた（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験、ｐ＜０．００１、それぞれ）。図１０を参照のこと。ＴＨニューロンの数は、対照マウスとＭＰＴＰで処置したＫＯマウスとの間では統計的な差はなかった。
対照で処置したＫＯマウスおよびＷＴマウス、ならびにＭＰＴＰで処置したＫＯマウスおよびＷＴマウスの線条体ドーパミンレベルもまた試験した。切開した線条体を超音波処理し、そして冷却した０．１Ｍのパーコール酸（ＰＣＡ、約１００μｌ／ｍｇ組織）の中で遠心分離した。上清を、Ｙａｎｇ，Ｌ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９１：８６−９３（２００５）に記載されているように、ドーパミンの測定のためにとった。簡単に説明すると、１５μｌの上清を、０．１ＭのＬｉＨ２ＰＯ４、０．８５ｍＭの１−オクタンスルホン酸、および１０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む移動相を用いて、８０×４．６ｍｍのＣ１８カラム（ＥＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）から等張で溶出させ、２チャンネルＣｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ電気化学的検出器（ＥＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）によって検出した。ドーパミンの濃度は、タンパク質１ミリグラムあたりのナノグラム数として表した。組織ホモジネートのタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用して決定した。線条体ドーパミンレベルは、対照ＷＴマウス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験、ｐ＜０．０１）および対照ＫＯマウス（ｐ＜０．０５）と比較して、ＭＰＴＰで処置したＷＴマウスにおいては低かった。図１１を参照のこと。ドーパミンレベルは、対照マウスとＭＰＴＰで処置したＫＯマウスとの間では統計学的には差はなく、これは、６−ＯＨＤＡの実例においても観察された神経保護と一致している。
Ｓｐ３５の遺伝的消耗によってＭＰＴＰ毒素の取り込みおよび代謝が変化するかどうかを決定するために、Ｓｐ３５ ＫＯおよびＷＴ（それぞれのグループについてｎ＝６）の中での線条体ＭＰＰ＋レベルを、ＭＰＴＰ処置の９０分後に測定した。ＭＰＰ＋を測定するために、線条体組織を超音波処理し、０．１ＭのＰＣＡの中で遠心分離し、そして上清のアリコートを、ＭＥＴＡ ２５０×４．６ Ｃ１８カラム（ＥＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）上に注入した。試料を、３ｍＭの硫酸水素テトラブチルアンモニウム、０．２５ｍＭの１−ヘプタンスルホン酸、および１０％のイソプロパノールを含む２０ｍＭのホウ酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７５）で等張で溶出させた。ＭＰＰ＋を、２９５ｎｍでの励起、および３７５ｎｍでの放射に設定した蛍光検出器で検出した。ＫＯおよびＷＴの中でのＭＰＰ＋レベルは、ＭＰＴＰ処置後には、有意には異ならなかった（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ検定；ｔ（１０）＝１．６９；ｐ＞０．０５、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ＷＴについては３９．６８±３．９２、そしてＫＯについては６２．０６±１２．６７）。ウェスタンブロット分析もまた、ドーパミン輸送（ＤＡＴ）レベルは、Ｓｐ３５ ＫＯマウスにおいては変化しなかったことを示していた。図１４を参照のこと。
加えて、ウェスタンブロットを、ＭＰＴＰに暴露したＫＯマウスおよびＷＴマウス、ならびに対照に由来するＶＭ組織の溶解物について行った。マウスの組織を５００μｌの溶解緩衝液［Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ，１％のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、１０％のグリセロール］の中に溶解させた。上清を、４〜２０％または１０％のいずれかのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で電気泳動させ、抗ホスホＡｋｔ、抗Ａｋｔ，および抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で免疫ブロットした。ＭＰＴＰに暴露したＫＯマウスの腹側の（ｖｅｎｔｒａｌ）中脳の中でのリン酸化Ａｋｔの増加もまた、ＭＰＴＰに暴露したＷＴ同腹子である対照のものと比較して見られた。図６Ｄ〜６Ｆを参照のこと。
加えて、Ｓｐ３５−Ｆｃタンパク質（６．５μｇ／μｌ、全部で２μｌ）（これは、優性陰性分子として機能するＳｐ３５の短縮型である）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝９）の線条体の中に片側だけに注射した。これらのマウスに、外科手術の６日後にＭＰＴＰを投与し、その後、さらに７日間生存させた。これらの動物におけるＴＨニューロン数の死後分析は、反対側のＳＮｃよりも同じ側のＳＮｃにおいてより多い数を示した（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定；ｔ（１６）＝２．１１４；ｐ＜０．０５）。図１５Ａを参照のこと。線条体ドーパミンレベルは、Ｓｐ３５−Ｆｃを注射した脳において高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験、ｐ＜０．０５）。したがって、これは神経防御効果を示している。図１５Ｂを参照のこと。さらに、ＭＰＴＰの注射の９０分後に試験した線条体ＭＰＰ＋レベルは、脳のＳｐ３５−Ｆｃを注射した側と反対側との間で差はなかった。図１５Ｃを参照のこと。
（実施例７）
ＲＮＡｉノックダウンレンチウイルスの作成
Ｓｐ３５特異的ＲＮＡｉを使用して、ＤＡ神経突起の生存、再生、および分化にＳｐ３５がどの程度寄与しているかを試験するために、ＤＡニューロンの中でのＳｐ３５の発現を除去した。ＤＡニューロン培養物を、以下のように調製したＳｐ３５特異的ＲＮＡｉ配列または対照ＲＮＡｉを有しているレンチウイルスに感染させた。
マウスおよびラットのＳｐ３５ ＤＮＡ配列を、候補の低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に使用するための相同領域を見出すために比較した。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉのレンチウイルスでの発現のために、ＣＨ３２４を、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５とＬＶ１−０３６をアニーリングさせ、そしてＨｐａＩとＸｈｏＩで消化したｐＬＬ３．７に連結させることによって構築した。ｐＬＬ３．７ベクター、さらなる方法論、およびウイルスの産生は、Ｒｕｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−０６（２００３）に記載されている。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドをＭＷＧから購入した。これは以下の配列を有している：
Figure 2009517340
 。
対照ＲＮＡｉは、小文字で示したヌクレオチドの変化を除き、同じオリゴヌクレオチド配列を用いて設計した：
Figure 2009517340
 。
レンチウイルスを生産させるために、ｐＬＬ３．７に由来するＤＮＡまたはｐＬＬ３．７中の候補のｓｈＲＮＡを、６ウェル形式で、ＣＨＯ細胞の中に５対１の割合で、マウスＳｐ３５−ＨＡタグ化プラスミドとともに同時トランスフェクトした。ノックダウンを、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞溶解物からのＳｐ３５−ＨＡタグのウェスタンブロット検出によって、さらには、２連のウェルから調製した全ＲＮＡのノーザンブロットによって分析した。ブロットを、Ｓｐ３５ ｃＤＮＡの断片でプローブした。アッセイを、トランスフェクションの４８時間後に行った。予想したとおり、対照で処置した細胞と比較して、ＣＨ３２４ ＲＮＡｉで処理したＣＨＯ細胞の中では、Ｓｐ３５ ｍＲＮＡは１０分の１に減少していた。
（実施例８）
Ｓｐ３５の発現のＳｐ３５特異的ＲＮＡｉによるノックダウンによって、ＤＡニューロンの生存および分化が促進される
ＤＡニューロンの中でのＳｐ３５の発現の欠失の効果を試験するために、Ｓｐ３５の発現を消滅させるＲＮＡｉ分子を発現するレンチウイルス（実施例７に記載した）を使用して、ラットの一次ＶＭニューロンを感染させた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有しているレンチウイルスを、Ｒｕｂｉｎｓｏｎらに記載されており、そして実施例７に記載したように作成した。ラットの一次ＶＭニューロン培養物を、対照またはＳｐ３５ ＲＮＡｉのいずれかで、１〜５の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ＧＦＰポジティブ細胞は、レンチウイルスに感染したＤＡニューロンを示す。Ｓｐ３５ノックダウンの効果を、ＤＡニューロンの伸張および生存によって決定した。
（実施例９）
Ｓｐ３５−ＦｃおよびＳｐ３５ １Ａ７抗体は、ＭＰＰ＋で処理したＶＭ培養物の中でのＥＧＦＲの発現とＡｋｔのリン酸化を増大させる。
ＭＰＰ＋で処理したＶＭ培養物中でのＡｋｔのリン酸化、およびＳｐ３５とＥＧＦＲとの間での相互作用を試験するために、ＤＡニューロンの一次培養物を、Ｅ１５またはＥ１６ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）の腹側の（ｖｅｎｔｒａｌ）中脳から得た。Ｓｈａｈら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（近刊）を参照のこと。簡単に説明すると、組織を、熱で不活化させたウマ血清（１０％）、グルコース（６．０ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、およびグルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ）を含む冷却したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，ＮＹ））の中で、研磨したパスツールピペットを用いて機械的に解離させた。２×１０５個の細胞を培地の中に再懸濁し、２４ウェルトレイ（Ｆａｌｃｏｎ）のそれぞれのウェルの１５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングしたカバースライドの上に播種した。付着しなかった細胞を４日目に吸引し、そしてＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、１Ａ７、対照ＩｇＧ、または対照−Ｆｃを含む１ｍｌの新しい培地を、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。８時間後、培養した細胞を、１０μＭのＭＰＰ＋に対して、４８時間の間暴露した。培養したＶＭ細胞を、５００μｌの溶解緩衝液［Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＥＤＴＡ，１％のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、および１０％のグリセロール）の中に、４℃で３０分間溶解させた。上清を、４〜２０％または１０％のいずれかのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で電気泳動させ、抗ホスホＡｋｔ、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、または抗アクチン抗体でプローブした。ＥＧＦＲおよびＡｋｔのリン酸化は、対照ＩｇＧおよび対照−Ｆｃタンパク質とそれぞれ比較して、１Ａ７抗体およびＳｐ３５−Ｆｃタンパク質とともにインキュベートした、ＭＰＰ＋で処理したＶＭニューロン培養物の中で増大していた（１Ａ７については、Ｆ３，１２＝２３．６４５；ｐ＜０．００１、Ｓｐ−Ｆｃについては、Ｆ３，１２＝１８．８９、ｐ＜０．００１）。図７Ａ〜７Ｃ、および７Ｇを参照のこと。
加えて、全長のＳｐ３５はＥＧＦＲの発現を低下させた。ＣＯＳ７細胞を、実施例２に記載したＦＬ−Ｓｐ３５レンチウイルスで、０、１、および５ＭＯＩで２日間、トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の中でのＥＧＦＲタンパク質の発現を、それぞれのＭＯＩについて測定した。図１２に見ることができるように、ＥＧＦＲの発現レベルは、用量依存性の様式で低下した。
培養細胞、ならびに、ＷＴおよびＫＯマウスに由来するＶＭ脳組織中でのＳｐ３５とＥＧＦＲとの間での直接の相互作用を、抗Ｓｐ３５（１Ａ７または２Ｆ３）または抗ＥＧＦＲ抗体を使用して免疫沈降によって明らかにした（図７Ｄ〜７Ｆを参照のこと）。ＣＯＳ−７またはＨＥＫ２０３細胞（１００ｍｍ皿）を、Ｓｐ３５ ＥＧＦＲ、およびＳｐ３５／ＥＧＦＲでトランスフェクトした。細胞を４８時間後に回収し、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール）またはＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．２、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のグリセロール）の中に、４℃で３０分かけて溶解させた。１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、４℃で１時間インキュベートし、その後、２００μｌの予め明澄化させた溶解物を、抗ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｓｐ３５抗体（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，、米国仮特許出願番号６０／６９７，３３６（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている）のいずれかとともに４℃で１時間インキュベートし、その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズで処理した。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｅｌｉ試料緩衝液中で沸騰させ、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そして抗ＥＧＦＲ抗体または抗Ｓｐ３５抗体を用いてウェスタンブロッティングによって分析した。ＥＧＦＲ抗体およびＳｐ３５抗体を、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを使用して視覚化させた。
Ｓｐ３５ ＫＯまたはＷＴ ＶＭをＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させ、上記に記載したように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／ＧとＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズによって予め明澄化させた。その後、１ｍｇの腹側の（ｖｅｎｔｒａｌ）中脳の抽出物について、抗Ｓｐ３５で、４℃で一晩免疫沈降させ、その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／ＧとＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズと共に１時間インキュベーションした。Ｓｐ３５とＥＧＦＲとの間での直接の相互作用もまた、腹側の（ｖｅｎｔｒａｌ）中脳培養物の中で観察した。図７Ｅを参照のこと。
加えて、Ｓｐ３５とＥＧＦＲで同時トランスフェクトした細胞株を用いたＩＰ実験においては、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７はＥＧＦＲに対するＳｐ３５の結合をブロックしたが、抗Ｓｐ３５抗体２Ｆ３は結合をブロックしなかった。図７Ｆを参照のこと。この実験では、ＯＭｇｐを抗体結合についての対照として使用した。
（実施例１０）
死後のパーキンソン病（ＰＤ）患者の中脳黒質（ＳＮ）に由来する生存しているドーパミン作動性ニューロンの中でのＳｐ３５の発現を試験した。死後組織は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｒａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから承認を得て入手した。以下の表２には、この実施例に記載した実験において使用したＰＤ患者と、それらの年齢が適合する対照に関する情報を含めた。
表２
ＰＤ患者と年齢が適合する対照についての情報
Figure 2009517340
 Ｓｐ３５の発現を、上記の患者に由来する生存しているドーパミン作動性ニューロンにおいて、インサイチュハイブリダイゼーションによって試験した。ＳＮ組織を、Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）化合物の中に包埋した。凍結切片を調製し、処理し、そしてジゴキシゲニンで標識したＳｐ３５アンチセンスおよびセンスＲＮＡで、Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載されているようにプローブした。切片を、ＴＳＡと蛍光、および抗ジゴキシゲニン結合抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を使用して、製造業者の説明書にしたがって染色した。その後、切片を、抗ＴＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）およびＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。ＰＤの死後組織のＳＮ（ｎ＝６）の中の生存しているドーパミン作動性ニューロンの中のＳｐ３５は、年齢が適合している対照（ｎ＝６）と比較してアップレギュレートされていた。
半定量的ＰＣＲもまた使用して、表２に記載した患者の中でのＳｐ３５発現を試験した。ｍＲＮＡをヒトＳＮ組織から、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、製造業者の説明書にしたがって抽出した。Ｓｐ３５ ｍＲＮＡを、Ｓｐ３５正方向プライマー−５’−ＡＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号１４）と逆方向プライマー５’−ＡＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴ−３’（配列番号１５）を使用して増幅させた。図１３Ａに示すように、Ｓｐ３５は、年齢が適合している対照と比較して、ＰＤの死後組織のＳＮの中の生存しているドーパミン作動性ニューロンの中でアップレギュレートされていた。Ｓｐ３５ ｍＲＮＡレベルは、対照よりもＰＤ ＳＮの中で統計学的に高かった（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ検定；ｔ（１０）＝２．２８０；ｐ＜０．０５）。図１３Ｂを参照のこと。
本発明は、記載した特異的な実施形態による範囲に限定はされない。記載した特異的な実施形態は、本発明の個々の態様、および任意の組成物または方法（これらは本発明の範囲の含まれるものと機能的に同等である）の１つの説明として意図される。実際、本明細書中に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改良が、上記の記載と添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改良は添付の特許請求の範囲に入るように意図される。
本明細書中に記載した全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が引用により本明細書中に組み入れられる具体的かつ個別に組み入れられることが示されているかのように、同じ程度に引用により本明細書中に組み入れられる。
Ｓｐ３５タンパク質を含まない対照Ｆｃ（＊ｐ＜０．００３）および対照レンチウイルス（＊ｐ＜０．０５）と比較した、ベクター対照、ＦＬ−Ｓｐ３５（ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１）、およびＤＮ−Ｓｐ３５（ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１）が形質導入された、あるいは、可溶性Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）タンパク質で処置された、初代ラットＤＡニューロン培養物のドーパミン作動性ニューロンの成長を示すグラフ。 全長のＳｐ３５（ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１）、優性陰性Ｓｐ３５（ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１）を生産するレンチウイルス、または対照のレンチウイルスに感染させ、そして１０μＭの１−メチル−フェニルピリジウムイオン（ＭＰＰ＋）またはＭＰＰ＋の投与に使用した媒体組成物だけで処置した、培養したラットの腹側中脳（ＶＭ）ニューロンの生存性を示すグラフ。ＭＰＰ＋に暴露した場合には、ＤＮ−ＳＰ３５とともにインキュベートしたチロシンヒドロラーゼ（ＴＨ）ニューロンの数は、ＦＬ−Ｓｐ３５および対照と比較して有意に多かった（＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。 Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）または１Ａ７ Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体、および対照Ｆｃまたは対照抗体で処置したＶＭのＴＨニューロンの数を示すグラフ。Ｓｐ３５−Ｆｃまたは１Ａ７での処置によっては、対照Ｆｃまたは対照抗体と比較して、ＭＰＰ＋に暴露した場合には、多数のニューロンが生じた（１Ａ７については＊ｐ＜０．０１、そしてＳｐ３５−Ｆｃについては＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。 ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、または対照の形質導入後のＶＭ初代ラットニューロン培養物中のリン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）のウェスタンブロット。リン酸化Ａｋｔの増加が、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１および対照と比較した場合に、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１を形質導入した細胞において観察された。 野生型マウスと比較した、Ｓｐ３５ノックアウトマウスにおける運動の対称性を示すグラフ。運動の対称性は、野生型（ＷＴ）マウスおよびノックアウト（ＫＯ）マウスの左の線条体の中に６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を注射した後、１週間、２週間、３週間、および４週間で評価した。運動の対称性は、野生型マウスと比較してノックアウトマウスにおいては有意に低かった（＊ｐ＝０．００１、二元ＡＮＯＶＡ）。 図６Ａは、６−ＯＨＤＡ実験において、野生型マウスとノックアウトマウスの病変となっていない中脳の中のＴＨニューロンの数を示しているグラフである。 図６Ｂは、６−ＯＨＤＡ実験において、ノックアウトマウスと野生型マウスの体の反対の（ｃｏｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ）病変となっていない側の数によって較正した、病変部位のＴＨニューロンの数を示しているグラフである。ＴＨニューロンの割合（％）は、ＷＴマウスよりもＫＯマウスにおいて統計的に多かった（＊ｐ＝０．００１、対応のないｔ検定）。 図６Ｃは、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）実験における、野生型マウスとノックアウトマウスの中脳の中のＴＨニューロンの数を示しているグラフである。ＴＨニューロンの割合（％）は、ＷＴマウスよりもＫＯマウスにおいて統計的に多かった（＊ｐ＝０．００２、対応のないｔ検定）。 図６Ｄは、ＭＰＴＰに暴露しなかったマウスと比較した、ＭＰＴＰ暴露後のＷＴマウスおよびＫＯマウスの中でのリン酸化Ａｋｔ（Ｐ−Ａｋｔ）のレベルを示しているウェスタンブロットである。 図６Ｅは、生理食塩水、およびＭＰＴＰで処置したＷＴおよびＫＯのＶＭの中のリン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）、Ａｋｔ、およびβ−アクチンについてのウェスタンブロットである（それぞれのグループについてｎ＝６）。 図６Ｆは、ＭＰＴＰで処置したＷＴ（＊ｐ＜０．０５）および生理食塩水で処置したＫＯ ＶＭ（＃ｐ＜０．０５、それぞれのグループについてｎ＝６）と比較して、ｐ−Ａｋｔレベルが７日目のＭＰＴＰで処置したマウスのＶＭにおいては有意に高かったことを示しているグラフである。 図７Ａは、Ｓｐ３５抗体（１Ａ７）または対照抗体で処理した、ＶＭ ＴＨニューロンのＰ−Ａｋｔおよび表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現についてのウェスタンブロットである。 図７Ｂは、Ｓｐ３５−Ｆｃまたは対照で処理したＶＭ ＴＨニューロンのＥＧＦＲおよびＰ−Ａｋｔの発現についてのウェスタンブロットである。 図７Ｃは、Ｓｐ３５−ＦｃまたはＳｐ３５抗体（１Ａ７）で処理したＶＭ培養物のＥＧＦＲ、ｐ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、およびβ−アクチンについてのウェスタンブロットである。 図７Ｄは、Ｓｐ３５および／またはＥＧＦＲでトランスフェクトした培養細胞中でのＥＧＦＲとＳｐ３５の免疫共沈である。＋または−は、ＥＧＦＲおよびＳｐ３５の存在（＋）または存在しないこと（−）を示す。ＩＰは、免疫沈降に使用した抗体を示し、そしてＩＢは、ウェスタンブロットに使用した抗体を示す。 図７Ｅは、ＷＴおよびＫＯ ＶＭ中でのＥＧＦＲとＬＩＮＧＯ−１の免疫共沈である。 図７Ｆは、Ｓｐ３５抗体１Ａ７が同時トランスフェクトした細胞株の中でのＥＧＦＲに対するＳｐ３５の結合をブロックすることを示しているウェスタンブロットである。加えて、別のＳｐ３５抗体２Ｆ３は、ＥＧＦＲに対するＳｐ３５の結合をブロックしない。乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）のトランスフェクションを対照として使用した。 図７Ｇは、対照およびＦｃ断片とそれぞれ比較した、１Ａ７およびＳｐ３５−Ｆｃで処理した培養物中でのｐ−Ａｋｔレベルの統計学的分析を示しているグラフである。 ６−ＯＨＤＡで実験用のパーキンソニズムを誘導したＷＴマウスおよびＫＯマウスの病変となっていないＶＭおよび病変側のＶＭの中のＴＨニューロンの数を示しているグラフ。 ６−ＯＨＤＡ病変後のＳｐ３５タンパク質レベルの変化を示しているグラフ。Ｓｐ３５は、野生型マウスにおいては、線条体６−ＯＨＤＡの投与の３日後に、反対側（対照）と比較して病変側（６−ＯＨＤＡ）においてアップレギュレートされていた（それぞれの時点についてｎ＝３、対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。 生理食塩水（ＷＴ：ｎ＝７、ＫＯ：ｎ＝８）およびＭＰＴＰ（それぞれのグループについてｎ＝１０）で処置したＷＴマウスおよびＫＯマウスの黒質緻密部（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉａｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ）（ＳＮｃ）の中のＴＨニューロンの数を示しているグラフ。 生理食塩水またはＭＰＴＰで処置したＫＯマウスおよびＷＴマウスの中での線条体ドーパミン（ＤＡ）レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示しているグラフ。 ０、１、および５ＭＯＩのＦＬ−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスでのトランスフェクションの２日後、ＣＯＳ−７細胞の中でのＳｐ３５およびＥＧＦＲの発現を示しているウェスタンブロット。 図１３Ａは、対照と比較したパーキンソン病患者（ＰＤ）の黒質の中のＳｐ３５レベルの有意な上昇を示す半定量的ＰＣＲ反応の結果を示しているゲルである。 図１３Ｂは、対照と比較したパーキンソン病の患者（ＰＤ）の黒質の中の較正されたＳｐ３５のｍＲＮＡレベルを示しているグラフである。 図１４Ａは、ＫＯ（−／−）マウスおよびＷＴ（＋／＋）マウス（それぞれのグループにおいてｎ＝６）の中でのドーパミン輸送（ＤＡＴ）レベルを示しているウェスタンブロットである。図１４Ｂは、ＷＴマウスとＫＯマウスにおける相対的なＤＡＴレベルを示しているグラフである。ＷＴマウスとＫＯマウスの間にはＤＡＴの発現に有意な差はなかった（対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定、ｐ＞０．０５）。 図１５Ａは、ＭＰＴＰに暴露した対照と比較した、Ｓｐ−３５−Ｆｃを注射したマウスのＳＮｃの中のＴＨニューロンの数を示しているグラフである（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝９）。 図１５Ｂは、ＭＰＴＰに暴露した対照と比較した、Ｓｐ３５−Ｆｃマウスの線条体ドーパミンレベルを示しているグラフである（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝９）。 図１５Ｃは、ＭＰＴＰに暴露した対照と比較した、Ｓｐ３５−Ｆｃを注射したマウスの線条体ＭＰＰ＋レベルを示しているグラフである。

Claims (56)

  1. ドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、または生存を促進するための方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンを、以下：
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその免疫特異的断片；
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）Ｓｐ３５アプタマー；および
    （ｖ）２つ以上の前記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させる工程が含まれる、方法。
  2. 哺乳動物においてドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、または生存を促進するための方法であって、その必要がある哺乳動物に対して、以下：
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）Ｓｐ３５アプタマー；ならびに、
    （ｖ）２つ以上の前記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与する工程が含まれる、方法。
  3. 前記哺乳動物が、ドーパミン作動性ニューロンの変性が関係している疾患、障害、または損傷に罹患している、請求項２に記載の方法。
  4. 前記疾患、障害、または損傷が、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、パーキンソン病様の特徴を有している運動神経疾患、レヴィー小体認知症、進行性核上麻痺、皮質をベースとする神経節の変性、前頭側頭認知症、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン・スパッツ病、チェディアック・東症候群、ＳＣＡ−３脊髄小脳失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム（ＤＹＴ３）、ハンチントン病（ウェストファール変異体）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、脳血管性パーキンソニズム、脳性小児麻痺、繰り返し起こる頭部外傷、脳炎後のパーキンソン病、神経梅毒、および統合失調症からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記疾患、障害、または損傷がパーキンソン病（ＰＤ）である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストに可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが含まれる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、以下：
    （ｉ）Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
    （ｉｉ）Ｓｐ３５ ＬＲＲドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
    （ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
    （ｖ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端側にあるＳｐ３５塩基性領域、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、ならびに、
    （ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の上記Ｓｐ３５ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の少なくとも２つの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５領域が含まれる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドには以下：
    （ｉ）Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、
    （ｉｉ）Ｓｐ３５ ＬＲＲドメイン、
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメイン、
    （ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、
    （ｖ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端側にあるＳｐ３５塩基性領域、および
    （ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の上記Ｓｐ３５ドメインの少なくとも２つの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５領域が欠失している、請求項６に記載の方法。
  9. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドにはＳｐ３５膜貫通ドメインとＳｐ３５細胞質ドメインが欠失している、請求項８に記載の方法。
  10. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、
    （ｉ）Ｓｐ３５ ＬＲＲドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
    （ｉｉ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端側にあるＳｐ３５塩基性領域、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、および
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体
    が含まれている、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、Ｓｐ３５ ＬＲＲドメインの少なくとも一部が含まれているが、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、およびＳｐ３５細胞質ドメインが欠失している、請求項８または請求項９に記載の方法。
  12. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、以下：
    Figure 2009517340
    Figure 2009517340
    Figure 2009517340
     （ｃｘｘｉ）任意の前記ポリペプチド断片の変異体または誘導体、および
    （ｃｘｘｉｉ）任意の前記ポリペプチド断片またはその変異体もしくは誘導体の少なくとも２つの組み合わせ
    からなる群より選択されるポリペプチド断片が含まれている、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２、または配列番号２のアミノ酸残基３６〜５３２が含まれている、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体が含まれている、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３が含まれている、請求項６に記載の方法。
  16. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに、Ｓｐ３５以外の部分がさらに含まれている、請求項６から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記Ｓｐ３５以外の部分が、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに融合させられたポリペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記Ｓｐ３５以外の部分が、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分、および精製を容易にする部分からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｓｐ３５以外の部分が抗体Ｉｇ部分である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗体Ｉｇ部分がヒンジ部分およびＦｃ部分である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがポリマーに結合させられている、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが１個、２個、３個、または４個のポリマーに結合させられている、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記ポリマーの分子量の合計が、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａまでである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストに、Ｓｐ３５抗体またはその断片が含まれる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記Ｓｐ３５抗体またはその断片が、以下：
    Figure 2009517340
     （ｘｖｉｉ）任意の前記ポリペプチド断片の変異体または誘導体；および
    （ｘｖｉｉｉ）任意の前記ポリペプチド断片またはそれらの変異体もしくは誘導体の２つ以上の組み合わせ
    からなる群より選択されるポリペプチド断片から本質的に構成されるエピトープに特異的に結合する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストにＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが含まれる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが、以下：
    （ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）リボザイム；
    （ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
    （ｉｖ）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
    からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが、Ｓｐ３５ ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記ｓｈＲＮＡに、ヌクレオチド配列：
    Figure 2009517340
     （配列番号１３）が含まれている、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストがボーラス注射または長期間にわたる注入によって投与される、請求項１から３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが中枢神経系に直接投与される、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法であって：（ａ）前記ドーパミン作動性ニューロンの中に、発現制御配列に対する動作可能な連結によって前記Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入する工程、および（ｂ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させる工程が含まれる、方法。
  39. 前記ポリヌクレオチドが、以下：
    （ａ）トランスフェクション；
    （ｂ）エレクトロポレーション；
    （ｃ）形質導入；および
    （ｄ）直接のマイクロインジェクション
    からなる群より選択される方法によって前記ドーパミン作動性ニューロンの中に導入される、請求項３８または３９のいずれか１項に記載の方法。
  40. 請求項２から３７のいずれか１項に記載の方法であって：（ａ）前記哺乳動物に対して、発現制御配列に対する動作可能な連結によって前記Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを投与する工程、および（ｂ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させる工程が含まれる、方法。
  41. 前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドを発現することができる培養された宿主細胞に投与される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される、請求項３８から４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ポリヌクレオチドが、前記哺乳動物に、神経系の疾患、障害、または損傷の部位に、あるいはその付近に導入される、請求項３８から４１のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記培養された宿主細胞が、（ａ）レシピエント宿主細胞を、請求項４０に記載のポリヌクレオチド、または請求項４２もしくは請求項４３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程、および（ｂ）前記形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程が含まれる方法によって作成される、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記宿主細胞が処置される哺乳動物に由来する、請求項４１から４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが、神経系の疾患、障害、もしくは損傷の部位またはその付近でのドーパミン作動性ニューロンの再生、成長、あるいは生存の阻害を少なくするために十分な量で発現させられる、請求項１から４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パルボウイルス、およびポックスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
  49. 前記ヘルペスウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７である、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記ベクターが、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される、請求項４３、または４８から５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. ドーパミン作動性ニューロンの中でのＥＧＦＲとＳｐ３５の相互作用を阻害するための方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンを、以下：
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）Ｓｐ３５アンタゴニストアプタマー；および
    （ｖ）２つ以上の前記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させる工程が含まれる、方法。
  55. ドーパミン作動性ニューロンの中でのＡｋｔリン酸化を増加させるための方法であって、前記ドーパミンニューロンを、以下：
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）Ｓｐ３５アンタゴニストアプタマー；および
    （ｖ）２つ以上の前記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させる工程が含まれる、方法。
  56. ドーパミン作動性ニューロンの中でのＥＧＦＲの発現を増大させるための方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンを、以下：
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）Ｓｐ３５アンタゴニストアプタマー；および
    （ｖ）２つ以上の前記Ｓｐ３５アンタゴニストの組み合わせ
    からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させる工程が含まれる、方法。
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