CN101918540B - Lingo-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过施用LINGO-4拮抗剂来治疗涉及包括多发性硬化在内的脱髓鞘和髓鞘形成障碍的疾病、病症或损伤的方法。

Description

LINGO-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用
技术领域
本发明涉及神经生物学、神经病学和药理学。更特别地，它涉及通过施用LINGO-4拮抗剂来治疗脱髓鞘、髓鞘形成障碍和中枢神经系统(CNS)疾病诸如多发性硬化的方法。本发明还涉及通过施用LINGO-4拮抗剂来促进少突胶质细胞增殖、分化或存活和神经元髓鞘形成的方法。另外，本发明涉及通过施用LINGO-4拮抗剂来促进神经突向外生长或CNS神经元存活的方法。
背景技术
神经细胞功能受到神经元与它们直接接触的环境中其它细胞之间的接触的影响(Rutishauser等人，1988，Physiol.Rev.68：819)。这些细胞包括中枢神经系统(CNS)中的特化的神经胶质细胞、少突胶质细胞，以及外周神经系统(PNS)中的施万氏细胞，其用髓鞘质覆盖神经元轴突(Lemke，1992，AnIntroductiontoMolecularNeurobiology(分子神经生物学导言)，Z.Hall编辑，第281页，Sinauer)。
髓鞘的形成是细胞间相互作用的一个精密的和动态的实例，其包括髓鞘质形成细胞和和神经元轴突。通常认为，在发育期间轴突通过表达适当信号来控制它们是否将被髓鞘质覆盖以促进或抑制该过程(Colello和Pott，Mol.Neurobiol.15：83-100(1997))。
CNS神经元具有损伤后再生的固有潜力，但它们被髓鞘质中存在的抑制性蛋白抑制了这样做(Brittis等人，2001，Neuron30：11-14；Jones等人，2002，J.Neurosci.22：2792-2803；Grimpe等人，2002，J.Neurosci.：22：3144-3160)。
已经表征了发现于少突胶质细胞的若干髓鞘质抑制性蛋白。髓鞘质抑制性蛋白的已知实例包括NogoA(Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Grandpre等人，Nature2000，403，439-444)、髓鞘质相关糖蛋白(MAG)(McKerrache等人，1994，Neuron13：805-811；Mukhopadhyay等人，1994，Neuron13：757-767)和少突胶质细胞-髓鞘质糖蛋白(OM-gp)(Mikol等人，1988，J.Cell.Biol.106：1273-1279)。已经分别显示，这些蛋白的每一种是神经元Nogo受体-1(NgR1)的配体(Wang等人，Nature2002，417，941-944；Grandpre等人，Nature2000，403，439-444；Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi等人，Neuron2002，2002年6月28日在线出版)。
神经系统的许多疾病与脱髓鞘以及髓鞘形成障碍相关，其包括多发性硬化(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、华勒氏(Wallerian)变性以及一些遗传性疾病例如脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病和佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)病(PMZ)。在这些病症中，MS是最广泛的，其影响全世界大约250万人。
MS通常以复发-缓解型的神经病变开始，随后发展为神经损害加重的慢性阶段。MS与局限于慢性损伤的髓鞘质、少突胶质细胞和轴突的破坏相关。在MS中观察到的脱髓鞘并不总是永久性的，而且在该疾病的早期阶段也曾有髓鞘再生的记载。神经元的髓鞘再生需要少突胶质细胞。
对于MS，有各种缓和疾病的治疗可用，其包括使用皮质类固醇和免疫调节剂如干扰素β。另外，由于少突胶质细胞和髓鞘形成在MS中的中心作用，人们一直在致力于开发增加少突胶质细胞数量或增进髓鞘形成的疗法。参见例如Cohen等人的美国专利第5,574,009号；Chang等人，N.Engl.J.Med.346：165-73(2002)。然而，仍然急需设计MS的另外疗法。
发明概述
本发明基于这样的发现：LINGO-4(DAAT9248、亮氨酸富集重复神经元的6D、LRRN6D、PRO34002或Q6UY18)在少突胶质细胞中表达并且负向调节少突胶质细胞分化和轴突髓鞘形成。基于这一发现，本发明一般涉及通过施用LINGO-4拮抗剂来促进少突胶质细胞增殖、分化或存活和神经元髓鞘形成的方法。
在某些实施方式中，本发明包括用于促进哺乳动物中少突胶质细胞增殖、分化和存活的方法，其包括施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂。
在其它实施方式中，本发明包括用于促进哺乳动物中神经突向外生长或CNS神经元存活的方法，其包括施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂。
在另一些实施方式中，本发明包括哺乳动物中与少突胶质细胞死亡或分化缺乏相关的疾病、病症或损伤，其包括向对其有需要的哺乳动物施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂。
在其它实施方式中，本发明包括用于促进哺乳动物中神经元的髓鞘形成或少突胶质细胞介导的髓鞘形成的方法，其包括施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂。在某些实施方式中，哺乳动物已被诊断为患有涉及脱髓鞘和髓鞘形成障碍的疾病、病症、损伤或疾患。在一些实施方式中，所述疾病、病症、损伤或疾患选自由多发性硬化(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、佩-梅病(PMZ)、球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)、华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、巴-科(Bassen-Kornzweig)综合征、马-比(Marchiafava-Bignami)综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹所组成的组。
另外，本发明包括治疗哺乳动物中涉及少突胶质细胞或髓鞘质破坏的疾病、病症或损伤的方法，其包括(a)提供表达重组LINGO-4拮抗剂的被培养的宿主细胞；以及(b)将所述宿主细胞引入哺乳动物中所述神经系统疾病、病症或损伤部位处或其附近。在另一实施方式中，本发明还包括治疗哺乳动物中CNS疾病、病症或损伤的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂。
在一些实施方式中，所述疾病、病症或损伤选自由多发性硬化(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、佩-梅病(PMZ)、球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)以及华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、巴-科综合征、马-比综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹所组成的组。在一些实施方式中，被培养的宿主细胞来源于待治疗的哺乳动物。
本发明进一步的实施方式包括通过体内基因疗法来治疗涉及少突胶质细胞或髓鞘破坏的疾病、病症或损伤的方法，其包括在所述疾病、病症或损伤部位处或其附近向哺乳动物施用载体，所述载体包含编码LINGO-4拮抗剂的核苷酸序列以使LINGO-4拮抗剂在哺乳动物中可被该核苷酸序列所表达，其中所述表达的量足以减少在损伤部位处或其附近的神经元对轴突延伸的抑制。在某些实施方式中，所述载体是病毒载体，其选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、埃巴(EpsteinBarr)病毒载体、乳多空病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体以及单纯疱疹病毒载体所组成的组。在一些实施方式中，疾病、病症或损伤选自由多发性硬化(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、佩-梅病(PMZ)、球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)以及华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、巴-科综合征、马-比综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹所组成的组。在一些实施方式中，所述载体的施用途径选自由局部施用、眼内施用、肠胃外施用、鞘内施用、硬膜下施用以及皮下施用所组成的组。
在上述方法的各种实施方式中，LINGO-4拮抗剂可以是干扰LINGO-4负向调节少突胶质细胞存活、增殖和分化以及神经元髓鞘形成的能力的任何分子。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸(例如RNA干扰)和LINGO-4适体所组成的组。
某些可溶性LINGO-4多肽包括但不限于缺乏跨膜结构域的LINGO-4多肽片段、变体或其衍生物。可溶性LINGO-4多肽包括这样的多肽，其包括(i)LINGO-4免疫球蛋白(Ig)结构域和(ii)LINGO-4亮氨酸富集重复(LRR)结构域。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽缺乏LINGO-4Ig结构域、LINGO-4LRR结构域和跨膜结构域。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽缺乏LINGO-4Ig结构域和LINGO-4跨膜结构域。在又一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽包括LINGO-4LRR结构域。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽包括LINGO-4Ig结构域。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽包括SEQIDNO：2的氨基酸残基30-486或30-491。
在一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂通过团注(bolusinjection)或慢性输注被施用。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽被直接施用到中枢神经系统中。在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽被直接施用到MS的慢性损伤中。
在一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂是包含非LINGO-4部分的融合多肽。在一些实施方式中，非LINGO-4部分选自由抗体Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、脑靶向部分、报道子部分以及促纯化部分所组成的组。在一些实施方式中，抗体Ig部分是铰链和Fc部分。
在一些实施方式中，本发明的可溶性LINGO-4多肽被轭合至聚合物。在一些实施方式中，所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖类聚合物和多肽所组成的组。在一些实施方式中，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方式中，本发明的多肽和抗体被轭合至1、2、3或4种聚合物。在一些实施方式中，聚合物的总分子量为5,000Da至100,000Da。
在一些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽是环状肽。在一些实施方式中，环状肽包括连接在所述环状肽N-末端的生物素分子和连接在所述环状肽C-末端的半胱氨酸残基。在一些实施方式中，环状肽包括连接在所述环状肽N-和C-末端的半胱氨酸残基，其中所述N-末端半胱氨酸残基是乙酰化的。
在一些实施方式中，LINGO拮抗剂包括LINGO-4抗体或其片段。在一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂包括LINGO-4拮抗剂多核苷酸。在一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂多核苷酸选自由反义多核苷酸、核酶、小干扰RNA(siRNA)和小发夹RNA(shRNA)所组成的组。在一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂多核苷酸是包括与LINGO-4mRNA的编码部分互补的至少10个碱基在内的反义多核苷酸。在另一实施方式中，LINGO-4拮抗剂是适体。
附图说明
图1-转录水平的图，其显示LINGO-4在脑和脊髓两者中高表达。
图2-hLINGO-1与hLINGO-2之间的百分比相似性和同一性分别是70.4％和60.7％。hLINGO-1与hLINGO-3之间的百分比相似性和同一性分别是66.4％和55.4％。hLINGO-1与hLINGO-4之间的百分比相似性和同一性分别是52.1％和44.3％。
图3-成年小鼠组织的Q-PCR。LINGO-4在成年小鼠组织的脑和脊髓中高表达。LINGO-4的mRNA表达的定量由Q-PCR进行。
图4-P6小鼠组织的Q-PCR。LINGO-4在出生后6天(P6)的小鼠组织的脑和脊髓中高表达。LINGO-4的mRNA表达的定量由Q-PCR进行。
图5-DNLINGO-4促进少突胶质细胞分化。使用抗MBP和抗HA抗体(内部慢病毒对照)，通过来自用外源MOPC21(对照)和1A7(抗LINGO-1)单克隆抗体处理的大鼠少突胶质细胞培养物和用hLINGO-4FL(全长)和hLINGO-4DN(显性阴性)慢病毒感染的少突胶质细胞培养物的Western印迹来检测髓鞘质碱性蛋白(MBP)表达的相对水平。
图6-DNLINGO-4和LINGO-4-Fc促进少突胶质细胞分化。使用抗MBP(成熟少突胶质细胞)抗体和MOG抗体，通过来自用hLINGO-1FL(全长)、hLINGO-1DN(显性阴性)、hLINGO-4FL(全长)和hLINGO-4-DN(显性阴性)慢病毒感染的少突胶质细胞培养物以及用hLINGO-4-Fc和对照多肽进行外源处理的少突胶质细胞的Western印迹来检测MBP和髓鞘质-少突胶质细胞糖蛋白(MOG)二种蛋白的存在。
图7-DNLINGO-4促进共同培养物中神经元的少突胶质细胞髓鞘形成。使用抗MBP，通过用外源MOPC21(阴性对照)和1A7(阳性对照)抗体处理的背根神经节(DRG)与少突胶质细胞的共同培养物和用hLINGO-4FL(全长)和hLINGO-4DN(显性阴性)慢病毒感染的共同培养物的Western印迹来检测MBP蛋白的存在。
发明详述
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。如有冲突，以包括该定义在内的本申请为准。除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。为了所有的目的，将本文中提及的所有出版物、专利以及其它参考文献的全部内容通过引用并入本文，其如同每个单独出版物或专利申请被特定地或单独地指明通过引用被并入本文一样。
尽管类似或等同于本文中所描述的那些的方法和材料可被用于本发明的实施和检测，但下文描述了合适的方法和物质。这些物质、方法和实例仅是用于说明的目的而不意为限制。根据详述和权利要求书，本发明的其它特征和优势将变得明显。
为了进一步限定本发明，提供了以下术语以及定义。
应该注意，术语“一个(a)”或“一个(an)”实体指的是一个或多个该实体；例如，“一个免疫球蛋白分子”被理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。同样地，术语“一个”、“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可互换使用。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”或其变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”表明对列出的任何整体或整体的组的包含，但不排除任何其它整体或整体的组。
如本文所用，整个说明书和权利要求书中所用的术语“由……所组成(consistsof)”或其变化形式如“由……所组成(consistof)”或“由……所组成(consistingof)”表示对列出的任何整体或整体的组的包含，但是不可将另外的整体或整体的组加入到所述具体方法、结构或组合物中。
如本文所用，整个说明书和权利要求书中所用的术语“基本上由……所组成(consistsessentiallyof)”或其变化形式如“基本上由……所组成(consistessentiallyof)”或“基本上由……所组成(consistingessentiallyof)”表示对列出的任何整体或整体的组的包含，以及对列出的不实质性改变所述具体方法、结构或组合物的基本或新颖特征的任何整体或整体的组的任选的包含。
如本文所用，“治疗有效量”指的是以必要的剂量和时间段对达到期望的治疗结果有效的量。治疗结果可以是例如症状的减轻、延长的存活、改善的活动性以及诸如此类。治疗结果不必是“治愈”。
如本文所用，“预防有效量”指的是以必要的剂量和时间段对达到期望的预防结果有效的量。通常，由于在疾病之前或其较早阶段将预防剂量用于受治疗者，所以预防有效量将少于治疗有效量。
如本文所用，“多核苷酸”可含有全长cDNA序列的核苷酸序列，其包括未翻译的5’和3’序列、编码序列以及核酸序列的片段、表位、结构域和变体。多核苷酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸所构成，其中所述多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链区和双链区的混合物的RNA、包括DNA和RNA在内的杂交分子(其中所述DNA和RNA可以是单链的或更典型地是双链的，或者单链区和双链区的混合物)所构成。另外，多核苷酸可以由包括RNA或DNA或者RNA和DNA两者在内的三链区所构成。多核苷酸还可以包括一个或多个修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基以及不常见的碱基例如肌苷。对DNA和RNA可以作各种各样的修饰；因此，“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢地修饰的形式。
在本发明中，多肽可以由通过肽键或修饰的肽键即肽等排体彼此相连的氨基酸所构成，并且可以含有除了20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)。可以通过天然过程如翻译后加工或者通过本领域公知的化学修饰技术来修饰本发明的多肽。这种修饰在基础教科书和更具体的专著当以及大量研究文献中均有详细描述。可以在多肽中的任何位置发生修饰，其包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当理解，在给定多肽的多个位点中可以以相同或不同程度存在相同类型的修饰。而且，给定多肽可含有很多类型的修饰。多肽可以是分支的(例如作为泛素化的结果)，而且它们可以是含有或没有分支的环形。环形的、分支的以及带分支的环形的多肽可由翻译后天然加工来产生或通过合成方法来制造。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸盐化、转运RNA介导的蛋白质中氨基酸的添加(如精氨酰化)和泛素化。(参见，例如，Proteins-StructureAndMolecularProperties(蛋白结构和分子特征)，第2版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1993)；PosttranslationalCovalentModificationofProteins(蛋白质的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson编辑，AcademicPress，NewYork，第1-12页(1983)；Seifter等人，MethEnzymol182：626-646(1990)；Rattan等人，AnnNYAcadSci663：48-62(1992)。)
当术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”是指本发明的LINGO-4拮抗剂时，其包括促进少突胶质细胞增殖、分化或存活和神经突生长或CNS神经元存活的任何拮抗剂分子。这些术语还包括促进神经元髓鞘形成的任何拮抗剂分子。本发明的可溶性LINGO-4多肽可包括LINGO-4蛋白水解片段、缺失片段以及尤其是当递送至动物时更易到达作用位点的片段。多肽片段还包括包含天然多肽抗原性或免疫原性表位的任何多肽部分，其中所述表位包括线性以及三维表位。本发明的可溶性LINGO-4多肽可包括含有上述片段的变体LINGO-4区以及具有因氨基酸取代、缺失或插入而改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在，例如等位变体。“等位变体”意指占据有机体染色体上特定基因座的基因的替代形式。GenesII(基因II)，Lewin，B.编辑，JohnWiley&Sons，NewYork(1985)。可使用本领域公知的诱变技术来生产非天然存在的变体。可溶性LINGO-4多肽可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。本发明的LINGO-4拮抗剂还可包括衍生分子。例如，本发明的可溶性LINGO-4多肽可包括这样的LINGO-4区，其已被改变以展现天然多肽中未发现的另外特征。实例包括融合蛋白和蛋白轭合物。
在本发明中，“多肽片段”是指LINGO-4多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是“独立的(free-standing)”，或被包含在更大的多肽中(在其中，所述片段形成区域的一部分)。本发明多肽片段的代表性实例包括，例如，含有长度约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸以及约100个氨基酸的片段。
抗体或免疫球蛋白.在一个实施方式中，用于本文所公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂是“抗体”或“免疫球蛋白”分子或其免疫特异性片段，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或者以类似于抗体分子的方式结合抗原的人工改造的抗体分子或片段。本文中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重链的可变结构域，并且通常至少包括重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对理解得较好。参见例如Harlow等人，Antibodies：ALaboratoryManual(抗体实验手册)，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，1988)。
如下文将更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可通过生物化学区分的五大类多肽。所有五类均清楚地在本发明的范围内，以下讨论一般针对免疫球蛋白分子中的IgG类。就IgG而言，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽，以及两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。这四条链通常通过二硫键连接成“Y”构型，其中所述轻链从“Y”的开口处开始一直延续到可变区而承托着重链。
轻链和重链均被划分成结构和功能同源性区域。术语“恒定的”和“可变的”是就功能而言被使用的。就此而言，应理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性诸如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合以及诸如此类。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。N末端部分是可变区，而C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
轻链分为kappa或lambda(κ、λ)。每类重链可以结合kappa或lambda轻链。一般来说，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程宿主细胞产生时，轻链和重链是彼此共价结合在一起的，而两个重链的“尾巴”部分是通过共价二硫键或非共价键彼此结合的。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端的N末端延伸到每条链底部的C末端。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，以及它们之中的一些亚类(例如，γ1-γ4)。是该链的特性决定了抗体的“分类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被充分地研究，并且已知它们赋予功能特化。鉴于本公开，技术人员可以容易地辨别这些分类和同种型中每一种的修饰型，并且因此，这些修饰型是在本发明的范围内。
如上文所述，可变区使得抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。这就是说，抗体的VL结构域和VH结构域结合起来形成界定三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在于Y的每条臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点是由位于每条VH和VL链上的三个互补决定区(CDR)所界定的。在一些情况例如衍生于骆驼科(camelid)物种或基于骆驼免疫球蛋白而改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链所组成而没有轻链。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合结构域中的6个“互补决定区”或“CDR”是短的、不连续的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列当抗体在水性环境中采取其三维构型时被特别地放置以形成抗原结合结构域。被称为“骨架”区的抗原结合结构域中氨基酸的剩余部分显示出较少的分子间可变性。骨架区在很大程度上采用β-片构型，而且CDR形成环，其中所述环连接β-片结构并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。因此，骨架区用来形成支架结构(scaffold)，其为了通过链间非共价相互作用以正确方向定位CDR而做准备。由定位的CDR所形成的抗原结合结构域界定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补性表面促进抗体对其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地鉴定分别包括CDR和骨架区在内的氨基酸，因为它们已经被精确地定义(参见“SequencesofProteinofImmunologicalInterest(免疫学上重要蛋白的序列)”Kabat，E.等人，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其通过引用全文并入本文)。
然而在骆驼科物种中，被称作VHH的重链可变区形成整个CDR。骆驼VHH可变区与衍生自一般抗体(VH)的那些可变区之间的主要差异包括(a)与VHH中相应区域相比，在VH的轻链接触表面中更多的疏水性氨基酸，(b)VHH中较长的CDR3，以及(c)VHH中在CDR1与CDR3之间二硫键的频繁出现。
在一个实施方式中，本发明的抗原结合分子包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。包括至少一个可被包含于受测抗原结合分子中的CDR在内的示例性抗体分子是本领域中已知的，而且在本文中描述了示例性分子。
用于本发明方法的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于多克隆的、单克隆的、多特异性的、人类的、人源化的、灵长类化的或嵌合体的抗体，单链抗体，表位结合片段例如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域在内的片段、由Fab表达文库所产生的片段，以及抗个体基因型(抗Id)抗体(包括例如本文所公开的结合分子的抗Id抗体)。scFv分子是本领域中已知的并在例如美国专利第5,892,019号中被描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、分类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
包括单链抗体在内的抗体片段可包括单独的可变区或与下列全部或一部分组合在一起的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其也包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。用于本文公开的诊断和治疗方法的抗体或其免疫特异性片段可以来自包括鸟和哺乳动物在内的任何动物来源。在某些实施方式中，所述抗体是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方式中，所述可变区可以是condricthoid来源的(例如来自鲨鱼)。如本文所用，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白文库或从转基因动物分离的抗体，其中所述转基因动物表达一种或多种人类免疫球蛋白但不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述并且例如Kucherlapati等的美国专利第5,939,598号。
如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包括重链部分在内的多肽包括以下至少一个：CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或者其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或者含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。此外，本发明所用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以使它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在用于本文所公开的治疗方法的某些LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段中，多聚体的一条多肽链的重链部分与所述多聚体的第二条多肽链上的那些相同。可选地，用于本发明方法的含有重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包括不同的靶结合位点，其形成例如双特异性抗体。
用于本文所公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包括衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合体铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。通常，轻链部分包括至少一个VL或CL结构域。
可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列来产生编码衍生自免疫球蛋白的多肽(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的核酸分子，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入被编码的蛋白。可以通过标准技术例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。例如，在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守的氨基酸取代。
用于本文所公开的治疗方法的抗体或其免疫特异性片段还可根据其对本发明多肽的结合亲合力来描述或说明。例如，结合亲合力包括具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的解离常数或Kd的那些。
用于本文公开的治疗方法的抗体或其免疫特异性片段充当本文描述的LINGO-4的拮抗剂。例如，用于本发明的方法的抗体可起拮抗剂的作用，其阻断或抑制LINGO-4多肽的抑制活性。
如本文所用，术语“嵌合体抗体”的意思是指任何抗体，其中免疫反应区或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(其可以为完整、部分或根据本发明修饰的)获自第二物种。在某些实施方式中，靶结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)而恒定区是人类的。
如本文所用，术语“改造的抗体”是指其中重链和轻链或两者的可变结构域被改变的抗体，所述改变是通过具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR的至少部分的替换，并且如果必要，是通过部分的骨架区替换和序列改变。虽然CDR可衍生自与骨架区所衍生自的抗体相同的分类或甚至亚类的抗体，但是根据设想，CDR将衍生自不同分类的抗体和/或不同物种的抗体。在本文中被称作“人源化的抗体”的是改造的抗体，其中来自具有已知特异性的非人类抗体的一个或多个“供体”CDR被移植进人类重链或轻链骨架区。可能不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR从而将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。相反地，可能只需转移对于维持靶结合位点的活性必要的那些残基。根据例如美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370号中所述的解释，通过进行常规的实验或者试错法检测来获得功能性改造的或人源化的抗体，将在本领域技术人员的能力之内。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换地使用。这些术语是指将两个或更多个元件或成分通过任何方法连接在一起，其中所述方法包括化学共轭或重组方法。“骨架内融合”是指以维持原始ORF的正确阅读框的方式将两个或更多个开放阅读框(ORF)连接以形成连续的更长的ORF。因此，所得的重组融合蛋白是含有两个或多个区段的单独蛋白，其中所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(在自然中所述区段通常不如此连接)。虽然所述阅读框因此在被融合的全区段中被变成连续的，但是所述区段可被例如框架内连接序列物理地或空间地分开。
在多肽的上下文中，“直线序列”或“序列”是多肽中的氨基酸从氨基至羧基末端方向的顺序，在其中序列中相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
本文所用术语“表达”是指基因通过它来产生生物化学产物例如RNA或多肽的过程。该过程包括对细胞中基因的功能性存在进行的任何操作，其包括但不限于基因敲除以及短暂表达和稳定表达两者。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将这种mRNA翻译成多肽。如果最终期望的产物是生物化学产物，那么表达包括该生物化学产物和任何前体的产生。
用“受治疗者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指代任何受治疗者，特别是希望对其作出诊断、预后或治疗的哺乳动物受治疗者。哺乳动物受治疗者包括但不限于人类，家养动物，农场动物，动物园动物，运动动物，宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴和斑马；食用动物如奶牛、猪和绵羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；熊；以及诸如此类。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人类受治疗者。
术语“RNA干扰”或“RNAi”是指沉默或减少通过siRNA的基因表达。它是动物和植物中序列特异性的转录后基因沉默过程，其由双链区与该沉默的基因序列同源的siRNA所启动。所述基因对于生物体可以是内源或外源性的，整合到染色体中存在或存在于未整合到基因组中的转染载体中。该基因的表达被完全或部分抑制。RNAi也可被认为抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全的或部分的。
LINGO-4
本发明基于这样的发现：LINGO-4在少突胶质细胞中表达并且负向调节少突胶质细胞分化和髓鞘形成。
天然存在的人类LINGO-4是由大约593个氨基酸所组成的多肽。编码人类LINGO-4mRNA的多核苷酸报告为Genbank中的登记号NM_001004432：
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tatactgcactgtgtttgcatgagcctctaccaccttcctctatctaccagatcattaaacctgctgtcaaagggc(SEQIDNO：1)。
人类LINGO-4的多肽序列(由SEQIDNO：1的核苷酸191至1972所编码)报告为GenBank中的登记号NP_001004432：
MDAATAPKQAWPPWPPLLFLLLLPGGSGGSCPAVCDCTSQPQAVLCGHRQLEAVPGGLPLDTELLDLSGNRLWGLQQGMLSRLSLLQELDLSYNQLSTLEPGAFHGLQSLLTLRLQGNRLRIMGPGVFSGLSALTLLDLRLNQIVLFLDGAFGELGSLQKLEVGDNHLVFVAPGAFAGLAKLSTLTLERCNLSTVPGLALARLPALVALRLRELDIGRLPAGALRGLGQLKELEIHLWPSLEALDPGSLVGLNLSSLAITRCNLSSVPFQALYHLSFLRVLDLSQNPISAIPARRLSPLVRLQELRLSGACLTSIAAHAFHGLTAFHLLDVADNALQTLEETAFPSPDKLVTLRLSGNPLTCDCRLLWLLRLRRHLDFGMSPPACAGPHHVQGKSLKEFSDILPPGHFTCKPALIRKSGPRWVIAEEGGHAVFSCSGDGDPAPTVSWMRPHGAWLGRAGRVRVLEDGTLEIRSVQLRDRGAYVCVVSNVAGNDSLRTWLEVIQVEPPNGTLSDPNITVPGIPGPFFLDSRGVAMVLAVGFLPFLTSVTLCFGLIALWSKGKGRVKHHMTFDFVAPRPSGDKNSGGNRVTAKLF(SEQIDNO：2)。
编码小鼠LINGO-4mRNA的多核苷酸报告为Genbank中的登记号NM_177250：
gagaagaggagggaaaaaaaaaaaaaaagaaaaaaatgcttcctggctcttttctctcctttggtcttggcagcgcgacc
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ctttcccctttcctctcctctgttgagacaaagaaggcaagatgctgctatctttggagggattcctacacagaactctc
ctatttcacattgtccgcggttcccagtgttgtgtattccaggcatgcttggcaaagggaaagccagaggggaactcctaggg(SEQIDNO：3)。
小鼠LINGO-4的多肽序列(由SEQIDNO：3的核苷酸199至2055所编码)报告为GenBank中的登记号NP_796224：
MGQAPALERCSAQLDATPQLLRPQGMDAATAPKQAWLPWSPLLFLLLLPGGSISSCPTVCDCTSQTRAVFCAHRRLDTIPGGLPLDTELLDLSGNRLWGLQRGMLSRLGQLQELDLSYNQLSTLEPGAFHGLQSLLTLRLQGNRLRIVGPGIFSGLTALTLLDLRLNQIVLFLDGAFSELGSLQQLEVGDNHLVFVAPGAFAGLAKLSTITLERCNLSTVPGLALAQLPALVALRLRELDIERLPAGALRGLGQLKELEIHHWPSLEALDPGSLVGLNLSSLAITRCNLSSVPFQALHHLSFLRILDLSQNPISAIPARRLSPLVRLQELRLSGACLTSIAAHAFHGLTAFHLLDVADNALQTLEETAFPSPDKLVTLRLSGNPLTCDCRLLWLLRLRRRLDFGTSPPACAGPQHVQGKSLREFSDILPPGHFTCKPALIRKSGPRWVIAEEGGHAVFSCSGDGDPAPTVSWMRPQGAWLGRVGRVRVLEDGTLEIRSVQLRDRGAYVCVVSNVAGNDSLRTWLEVIQVEPPNGTLSDPNITMPGIPGPFFLDSRGVAMVLAVGFLPFLTSVTLCFGLIALWSKGKGRVKHHMTFDFVAPRPSGDKNSGGNRVTAKLF(SEQIDNO：4)。
天然存在的人类LINGO-4多肽(还称为DAAT9248、亮氨酸富集重复神经元6D、LRRN6D、PRO34002或Q6UY18)是含593个氨基酸的大约64Kda的蛋白(SEQIDNO：2)。LINGO-4是LINGO蛋白家族的成员，所述家族包括至少三种其它人类旁系同源物LINGO-1、LINGO-2和LINGO-3。参见Mi等人，NatureNeurosci.7：221-28(2004)。人类LINGO-4多肽包含一段大约十二个(12)亮氨酸富集重复(包括N-末端帽(LRRNT)和C-末端帽(LRRCT))(SEQIDNO：2)。预测的重复的数目可随着使用哪种蛋白计算机建模程序而变化。LRR结构域包括LINGO-4蛋白的大约380个氨基酸残基。LINGO-4还含有包括至少约58个氨基酸在内的Ig结构域。还存在长度大约22个氨基酸的跨膜区和大约35个氨基酸的胞内结构域。另外，天然存在的LINGO-4蛋白在蛋白的N-末端含有长度大约28个氨基酸的信号序列(图2)。如本领域技术人员将理解的，本文报告的LINGO-4各结构域的长度是近似的，并且是基于计算机预测的，而且不同的计算机程序将提供不同的结果。基于SEQIDNO：2的氨基酸序列，表1列出LINGO-4各结构域的预测的边界。
表1
结构域或区 起始残基 结束残基
信号序列 1 28
LRRNT 30 64
LRR 63 82
LRR 83 106
LRR 107 130
LRR 131 154
LRR 155 178
LRR 179 202
LRR 203 226
LRR 275 298
LRR 299 322
LRR 323 346
LRRCT 358 411
Ig 426 491
跨膜 535 557
胞内 558 593
已经研究了人类和小鼠中LINGO-4的组织分布。成年小鼠和P6(出生后第6天)LINGO-4的表达局限于神经系统的神经元和脑的少突胶质细胞，如通过Northern印迹和PCR所确定的(参见图1、3和4)。
利用LINGO-4的拮抗剂的治疗方法
本发明的一个实施方式提供用于治疗患病的动物中与髓鞘形成障碍或脱髓鞘相关的疾病、病症或损伤例如多发性硬化的方法，所述方法包括、基本上或由向动物施用有效量的LINGO-4拮抗剂所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
另外，本发明针对用于促进哺乳动物中神经元髓鞘形成的方法，其包括、基本上由或由施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
本发明的另一个实施方式提供用于治疗患病的动物中与少突胶质细胞死亡或分化缺乏相关的疾病、病症或损伤例如多发性硬化症、佩-梅病或球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)的方法，所述方法包括、基本上由或由向动物施用有效量的LINGO-4拮抗剂所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
本发明的另一个方面包括用于促进哺乳动物中少突胶质细胞的增殖、分化和存活的方法，其包括、基本上由或由施用治疗有效量的LINGO-4拮抗剂所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
本发明进一步的实施方式包括用治疗有效量的组合物促进哺乳动物中神经突生长或CNS神经元存活的方法，其包括、基本上由或由施用治疗量的LINGO-4拮抗剂所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
本发明的另一个方面包括治疗哺乳动物中CNS疾病、病症或损伤的方法，其包括、基本上由或由向哺乳动物施用治疗有效量的包含LINGO-4拮抗剂的组合物所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂选自由可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸和LINGO-4适体所组成的组。
将被用于本文公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂例如可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸或LINGO-4适体可被制备并用作治疗剂，其终止、降低、防止或抑制LINGO-4通过少突胶质细胞负向调节神经元髓鞘形成的能力。另外，用于本文公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂可被制备并用作治疗剂，其终止、降低、防止或抑制LINGO-4负向调节少突胶质细胞分化、增殖和存活的能力。
本发明进一步的实施方式包括诱导少突胶质细胞增殖或存活以治疗涉及少突胶质细胞或髓鞘质的破坏的疾病、病症或损伤的方法，其包括在疾病、病症或损伤部位或其附近向哺乳动物施用足以减少轴突延伸抑制并促进髓鞘形成的量。
在本发明的方法中，可以通过直接施用例如可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸或LINGO-4适体来向患者施用LINGO-4拮抗剂。可选地，可以通过产生特异性LINGO-4拮抗剂的表达载体来施用LINGO-4拮抗剂。在本发明的某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂以下列治疗方法进行施用，其包括：(1)用表达LINGO-4拮抗剂的核酸例如载体来转化或转染可移植的宿主细胞；以及(2)在疾病、病症或损伤部位将转化的宿主细胞移植进哺乳动物中。例如，可以在MS慢性损害部位植入转化的宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，将可移植的宿主细胞从哺乳动物中取出、短暂培养、用编码LINGO-4拮抗剂的分离的核酸转化或转染并移植回其所取自的相同哺乳动物中。可以但不要求将所述细胞从其被植入的相同部位取出。有时被称为活体外基因治疗的这种实施方式可在有限的时间段内提供局限于作用部位的连续的LINGO-4拮抗剂供应。
可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或病症包括与哺乳动物神经元的髓鞘形成障碍或脱髓鞘相关的疾病、病症或损伤。具体地，在其中包围神经元的髓鞘质消失、不完整、未正确形成或变质的疾病或病症。这样的疾病包括但不限于多发性硬化(MS)，包括复发缓解、继发演进和原发演进形式的MS；进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、佩-梅病(PMZ)、球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)、华勒氏变性、视神经炎以及横贯性脊髓炎。
可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或病症包括与少突胶质细胞的死亡或者增殖或分化缺乏相关的疾病、病症或损伤。这种疾病包括但不限于多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、佩-梅病(PMZ)、球样细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)和华勒氏变性。
可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或病症包括神经变性疾病或病症。这样的疾病包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏病以及帕金森氏病。
可通过本发明的方法治疗或改善的另外的疾病、病症或损伤的实例包括但不限于括但不限于脊髓损伤、慢性脊髓病或神经根病、创伤性脑损伤、运动神经元病、轴突剪切(axonalshearing)、挫伤、瘫痪、放射后损伤或化疗的其它神经并发症、中风、大的腔隙、中到大血管栓塞、脑白质疏松症(leukoariaosis)、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏(单纯缺乏综合征、AR、巴-科综合征)、B12、B6(吡哆醇-糙皮病)、硫胺素、叶酸、烟酸缺乏、马-比综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛、贝尔氏麻痹或者需要轴突再生、髓鞘再生或少突胶质细胞存活或分化/增殖的任何神经损伤。
可溶性LINGO-4多肽
本发明的可溶性LINGO-4多肽包括可溶性LINGO-4多肽的片段、变体或其衍生物。上面的表1描述了人类LINGO-4多肽的各个结构域。对其它物种的LINGO-4多肽如小鼠LINGO-4(SEQIDNO：4)可推导相似的结构域结构。可溶性LINGO-4多肽通常缺乏LINGO-4多肽的跨膜结构域，并任选地缺乏LINGO-4多肽的胞质结构域。例如，某些可溶性人类LINGO-4多肽缺乏包含人类LINGO-4的跨膜结构域在内的SEQIDNO：2的氨基酸535-557。另外，某些可溶性LINGO-4多肽包含LINGO-4多肽的LRR结构域和Ig结构域。
变体LINGO-4多肽还可在序列上不同于相应的野生型多肽。特别地，某些氨基酸取代可被引入LINGO-4序列而不明显失去LINGO-4生物活性。在示例性的实施方式中，变体LINGO-4多肽包含一个或多个氨基酸取代，并且/或者包括与选自由如下所组成的组的参照氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQIDNO：2的氨基酸30至411、SEQIDNO：2的氨基酸30至491和SEQIDNO：2的氨基酸30至534或者SEQIDNO：4的等价片段。在序列上不同于SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的任何给定片段的变体LINGO-4多肽可包括一个或多个氨基酸取代(保守或非保守的)、一个或多个缺失和/或一个或多个插入。在本发明的某些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成，或防止脱髓鞘。
可溶性LINGO-4多肽可包括SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的至少6个，例如10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、100个或更多氨基酸的片段。另外，可溶性LINGO-4多肽可包括至少1个，例如5个、10个、15个或20个保守氨基酸取代。还考虑与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的参照LINGO-4多肽至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的可溶性LINGO-4多肽的相应片段。在本发明的某些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成，或防止脱髓鞘。
“LINGO-4参照氨基酸序列”或“参照氨基酸序列”是指不引入任何氨基酸取代的特定序列。如本领域普通技术人员将理解的，如果没有取代，那么本发明的“分离的多肽”包括与参照氨基酸序列相同的氨基酸序列。
保守的取代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中一个成员被相同组中另一成员的任何取代可被认为是保守的取代。
非保守取代包括这样的取代，在其中(i)具有正电性侧链的残基(如Arg、His或Lys)取代负电性残基(如Glu或Asp)或被后者取代，(ii)亲水残基(如Ser或Thr)取代疏水残基(如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被后者取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基或被任何其它残基取代，或(iv)具有大体积疏水或芳香侧链的残基(如Val、Ile、Phe或Trp)取代具有较小侧链(如Ala、Ser)或无侧链(如Gly)的残基或被后者取代。
如本领域中已知的，两个多肽之间的“序列同一性”可通过比较一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列来确定。当在本文中讨论时，任何特定多肽是否与另一个多肽至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％相同，可以利用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定，诸如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的版本8，GeneticsComputerGroup，UniversityResearchPark，575ScienceDrive，Madison，WI53711)。BESTFIT利用Smith和Waterman，AdvancesinAppliedMathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法来找到两个序列之间最佳的同源性片段。当利用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参照序列例如95％相同时，当然设定参数以使在参照多肽序列的全长计算同一性百分比，并且允许参照序列中的同源性差额至多为氨基酸总数的5％。
用于本发明方法中另外的可溶性LINGO-4多肽包括但不限于这样的人类LINGO-4多肽片段，其包括、基本上由或由下列所组成：SEQIDNO：2的氨基酸30至64；SEQIDNO：2的氨基酸30至82；SEQIDNO：2的氨基酸30至106；SEQIDNO：2的氨基酸30至130；SEQIDNO：2的氨基酸30至154；SEQIDNO：2的氨基酸30至178；SEQIDNO：2的氨基酸30至202；SEQIDNO：2的氨基酸30至226；SEQIDNO：2的氨基酸30至298；SEQIDNO：2的氨基酸30至322；SEQIDNO：2的氨基酸30至346；SEQIDNO：2的氨基酸30至411；SEQIDNO：2的氨基酸30至491；SEQIDNO：2的氨基酸30至534；SEQIDNO：2的氨基酸63至82；SEQIDNO：2的氨基酸63至106；SEQIDNO：2的氨基酸63至130；SEQIDNO：2的氨基酸63至154；SEQIDNO：2的氨基酸63至178；SEQIDNO：2的氨基酸63至202；SEQIDNO：2的氨基酸63至226；SEQIDNO：2的氨基酸63至298；SEQIDNO：2的氨基酸63至322；SEQIDNO：2的氨基酸63至346；SEQIDNO：2的氨基酸63至411；SEQIDNO：2的氨基酸63至491；SEQIDNO：2的氨基酸63至534；SEQIDNO：2的氨基酸83至106；SEQIDNO：2的氨基酸83至130；SEQIDNO：2的氨基酸83至154；SEQIDNO：2的氨基酸83至178；SEQIDNO：2的氨基酸83至202；SEQIDNO：2的氨基酸83至226；SEQIDNO：2的氨基酸83至298；SEQIDNO：2的氨基酸83至322；SEQIDNO：2的氨基酸83至346；SEQIDNO：2的氨基酸83至411；SEQIDNO：2的氨基酸83至491；SEQIDNO：2的氨基酸83至534；SEQIDNO：2的氨基酸107至130；SEQIDNO：2的氨基酸107至154；SEQIDNO：2的氨基酸107至178；SEQIDNO：2的氨基酸107至202；SEQIDNO：2的氨基酸107至226；SEQIDNO：2的氨基酸107至298；SEQIDNO：2的氨基酸107至322；SEQIDNO：2的氨基酸107至346；SEQIDNO：2的氨基酸107至411；SEQIDNO：2的氨基酸107至491；SEQIDNO：2的氨基酸107至534；SEQIDNO：2的氨基酸131至154；SEQIDNO：2的氨基酸131至178；SEQIDNO：2的氨基酸131至202；SEQIDNO：2的氨基酸131至226；SEQIDNO：2的氨基酸131至298；SEQIDNO：2的氨基酸131至322；SEQIDNO：2的氨基酸131至346；SEQIDNO：2的氨基酸131至411；SEQIDNO：2的氨基酸131至491；SEQIDNO：2的氨基酸131至534；SEQIDNO：2的氨基酸155至178；SEQIDNO：2的氨基酸155至202；SEQIDNO：2的氨基酸155至226；SEQIDNO：2的氨基酸155至298；SEQIDNO：2的氨基酸155至322；SEQIDNO：2的氨基酸155至346；SEQIDNO：2的氨基酸155至411；SEQIDNO：2的氨基酸155至491；SEQIDNO：2的氨基酸155至534；SEQIDNO：2的氨基酸179至202；SEQIDNO：2的氨基酸179至226；SEQIDNO：2的氨基酸179至298；SEQIDNO：2的氨基酸179至322；SEQIDNO：2的氨基酸179至346；SEQIDNO：2的氨基酸179至411；SEQIDNO：2的氨基酸179至491；SEQIDNO：2的氨基酸179至534；SEQIDNO：2的氨基酸203至226；SEQIDNO：2的氨基酸203至298；SEQIDNO：2的氨基酸203至322；SEQIDNO：2的氨基酸203至346；SEQIDNO：2的氨基酸203至411；SEQIDNO：2的氨基酸203至491；SEQIDNO：2的氨基酸203至534；SEQIDNO：2的氨基酸275至298；SEQIDNO：2的氨基酸275至322；SEQIDNO：2的氨基酸275至346；SEQIDNO：2的氨基酸275至411；SEQIDNO：2的氨基酸275至491；SEQIDNO：2的氨基酸275至534；SEQIDNO：2的氨基酸299至322；SEQIDNO：2的氨基酸299至346；SEQIDNO：2的氨基酸299至411；SEQIDNO：2的氨基酸299至491；SEQIDNO：2的氨基酸299至534；SEQIDNO：2的氨基酸323至346；SEQIDNO：2的氨基酸323至411；SEQIDNO：2的氨基酸323至491；SEQIDNO：2的氨基酸323至534；SEQIDNO：2的氨基酸358至411；SEQIDNO：2的氨基酸358至491；SEQIDNO：2的氨基酸358至534；SEQIDNO：2的氨基酸426至491；SEQIDNO：2的氨基酸426至534；或这种多肽的片段、变体或衍生物。在本发明的某些实施方式中，可溶性LINGO-4多肽在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成，或防止脱髓鞘。
如本领域普通技术人员将理解的，基于例如对LINGO-4结构域区的替代性预测，LINGO-4片段如以上所列的那些片段在长度上可以在任一端相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(更长或更短)。此外，以上所列的任何片段可在N-末端进一步包括分泌性信号肽，例如SEQIDNO：2的氨基酸1至28或SEQIDNO：2的氨基酸1至29。还可使用其它分泌性信号肽，如本文别处所述的那些。还考虑与本文所述的SEQIDNO：2、SEQIDNO：4或其片段至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的可溶性LINGO-4多肽的相应片段。
用于本发明方法的可溶性LINGO-4多肽可以包括两种或更多种可溶性LINGO-4多肽的任何组合。因此，考虑同二聚体或异二聚体的可溶性LINGO-4多肽二聚体。本文所述的两种或更多种可溶性LINGO-4多肽可直接连接，或可经由合适的肽接头连接。这样的肽接头在本文别处描述。
用于本发明方法的可溶性LINGO-4多肽可以是环状的。可溶性LINGO-4多肽的环化降低了线性肽的构象自由度并导致结构更加受限的分子。肽环化的许多方法在本领域中是已知的。例如，通过在肽的N-末端和C-末端氨基酸残基之间形成酰胺键的“主链对主链”环化。该“主链对主链”环化方法包括在两个ω-硫代氨基酸残基(例如半胱氨酸、高半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的某些可溶性LINGO-4肽包括在肽的N-末端和C-末端的修饰以形成环状LINGO-4多肽。这样的修饰包括但不限于半胱氨酸残基、乙酰化的半胱氨酸残基、具有NH2部分的半胱氨酸残基和生物素。肽环化的其它方法描述在Li&Roller.Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)中，其通过引用整体并入本文。
用于本发明方法的环状LINGO-4多肽包括但不限于C1LSPX1X2X3C2(SEQIDNO：43)，其中X1是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，X2是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，X3是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，C1任选地连接有促进环化的部分(例如乙酰基或生物素)，而且C2任选地连接有促进环化的部分(例如NH2部分)。
抗体或其免疫特异性片段
用于本发明方法的LINGO-4拮抗剂还包括LINGO-4特异性抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，其为LINGO-4活性的拮抗剂。例如，某些LINGO-4抗体对于在少突胶质细胞上表达的LINGO-4的结合阻断少突胶质细胞生长或分化的抑制，或阻断CNS神经元的脱髓鞘或髓鞘形成障碍。
用于本文所述方法的某些拮抗剂抗体特异性或优先地结合于特定LINGO-4多肽片段或结构域，例如本文所述的LINGO-4多肽、片段、变体或衍生物。在本发明的某些实施方式中，该LINGO-4拮抗剂抗体在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成，或防止脱髓鞘。
在其它实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性或优先地结合于LINGO-4的至少一个表位，其中所述表位包括、基本上由或由SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的至少约4至5个氨基酸、SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的至少7个、至少9个或至少约15个至约30个之间的氨基酸所组成。所述的SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的给定表位的氨基酸可以但不一定是连续的或线性的。在某些实施方式中，LINGO-4的至少一个表位包括、基本上由或由LINGO-4的胞外结构域形成的非线性表位所组成，其中所述LINGO-4在细胞表面上表达或作为可溶性片段例如被融合于IgGFc区。因此，在某些实施方式中，LINGO-4的至少一个表位包括、基本上由或由SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间或者至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续或不连续氨基酸所组成，其中不连续氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其它实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性或优先地结合于LINGO-4的至少一个表位，其中所述表位除了包括、基本上由或由上述SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的1、2、3、4、5、6个或更多连续或不连续的氨基酸所组成之外，还可包括修饰蛋白的另外的部分例如糖类部分以使LINGO-4抗体以相比于该蛋白的未修饰型较高的亲合力结合于修饰的靶蛋白。可选地，LINGO-4抗体完全不结合靶蛋白的未修饰型。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地结合于上述LINGO-4或者片段或变体的至少一个表位，即相比于结合于不相关或随机的表位，其更易于结合于这样的表位；优先地结合于上述LINGO-4或者片段或变体的至少一个表位，即相比于结合于相关、相似、同源或类似的表位，其更易于结合于这样的表位；竞争性地抑制自身特异性或优先地结合于上述LINGO-4或者片段或变体的某一表位的参照抗体的结合；或者结合于上述LINGO-4或者片段或变体的至少一个表位，其亲合力的特征在于解离常数KD小于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10- 5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M。在特定方面，抗体或其片段相对于鼠LINGO-4多肽或其片段优先地结合于人类LINGO-4多肽或其片段。
如在抗体结合解离常数的上下文中所使用的，术语“约”考虑到在用来测量抗体亲合力的方法中固有的差异的程度。例如，取决于所使用仪器的精密水平、基于被测样品的数量的标准误差以及舍入误差，术语“约10-2M”可以包括例如0.05M至0.005M。
在特定的实施方式中，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-4多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1。可选地，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-4多肽或者其片段或变体的解离速率(k(off))小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1。
在其它实施方式中，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-4多肽或者其片段或变体的结合速率(k(on))大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1。可选地，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物结合LINGO-4多肽或者其片段或变体的结合速率(k(on))大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1或5×106M-1秒-1或107M-1秒-1。
在一个实施方式中，用于本发明方法中的LINGO-4拮抗剂是抗体分子或其免疫特异性片段。除非特别指出，如本文中提到抗体时使用的“其片段”是指免疫特异性片段，即抗原特异性片段。在一个实施方式中，本发明的抗体是双特异性结合分子、结合多肽或者抗体例如双特异性抗体、小体(minibody)、结构域缺失的抗体或对一个以上的表位(例如一个以上的抗原或同一抗原上的一个以上的表位)具有结合特异性的融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性抗体具有对LINGO-4上至少一个表位有特异性的至少一个结合结构域。双特异性抗体可以是四价抗体，其具有两个对LINGO-4的表位有特异性的靶结合结构域和两个对另一个靶有特异性的靶结合结构域。因此，四价双特异性抗体对于每种特异性可以是二价的。
在某些实施方式中，本发明包括施用LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一部分已缺失或以其它方式被改变以便提供期望的生物化学特性，例如与具有大约相同的免疫原性的完整、未改变的抗体进行比较时，减少的效应子功能、非共价二聚化的能力、提高的定位于肿瘤部位的能力、减少的血清半衰期或提高的血清半衰期。例如，用于本文所述治疗方法的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包括类似于免疫球蛋白重链的多肽链但缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如CH2结构域的全部或部分将缺失。
在用于本文所描述的治疗方法中的某些LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段中，可以利用本领域已知技术将Fc部分突变以降低效应子功能。例如，恒定区的修饰可被用来修饰二硫键或者低聚糖部分，其由于提高的抗原特异性或抗体灵活性而允许增强的定位。所得的生理谱、生物利用度和修饰的其它生化效应可以利用熟知的免疫学技术容易地测量和量化而不需过度实验。
可以利用本领域已知技术由整个前体或亲本抗体制备用于本文公开的诊断和治疗方法中的抗体或其免疫特异性片段的修饰形式。本文更详细地讨论了示例性的技术。
可以利用本领域已知技术制备或生产用于本文公开的诊断和治疗方法中的LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组地产生的”，即利用重组DNA技术产生。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其它地方更详细地进行讨论。
可通过本领域已知的任何恰当方法生成用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂抗体或其片段。
可通过本领域熟知的各种过程产生多克隆抗体。例如，LINGO-4免疫特异性片段可被施用于各种宿主动物(其包括但不限于兔、小鼠、大鼠等)以诱导产生含对抗原有特异性的多克隆抗体的血清。取决于宿主的物种，各种佐剂可被用来提高免疫应答，而且包括但不限于弗氏(Freund’s)(完全和不完全的)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronicpolyols)、多聚阴离子、肽、油状乳液、钥孔戚血蓝素(keyholelimpethemocyanin)、二硝基苯酚以及潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)以及短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这样的佐剂也是本领域中熟知的。
可利用本领域已知的各种技术制备单克隆抗体，其包括利用杂交瘤、重组以及噬菌体展示技术或者其组合。例如，可利用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述技术包括本领域中已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies：ALaboratoryManual(抗体实验手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，(1988)；Hammerling等人，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中所教导的那些(所述参考文献通过引用全文并入本文)。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。术语“单克隆抗体”指的是衍生自单个克隆的抗体(所述单个克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆)，而不是其被制备的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。可利用本领域已知的各种技术制备单克隆抗体，其包括利用杂交瘤以及重组和噬菌体展示技术。
在一个实例中，利用本领域公认的方案，通过多次在皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的LINGO-4抗原或者包含这样的抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂而在哺乳动物中培养抗体。通常，这种免疫接种引发这样的免疫应答，其包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体。尽管可从动物血清收集所得的抗体以提供多克隆制品，但常常期望从脾、淋巴结或外周血液分离单个淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的同源制品。在某些特定的实施方式中，从脾获得淋巴细胞。
在这种熟知的过程中(Kohler等人，Nature256：495(1975))，将来自于已被注射抗原的哺乳动物的相对短寿命的或必死的淋巴细胞与不死的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)进行融合，从而产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是不死的又能够产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选取、稀释以及用包含用于形成单一抗体的特异性基因在内的每一种单株再生长而将所得的杂交体分离成单一遗传株。它们产生对期望的抗原同种的抗体，并且当提及其纯遗传来源时被称为“单克隆的”。
通常，将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，所述培养基含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可从多种来源通过商业购得，并且已经建立了标准化的方案。通常，对杂交瘤细胞在其中生长的培养基进行测定以产生针对期望抗原的单克隆抗体。在某些实施方式中，通过体外测定例如免疫沉淀、放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。在鉴定了产生具有期望特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤对该克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice(单克隆抗体原理和实践)，AcademicPress，第59-103页(1986))。将被进一步理解的是，可通过传统的纯化过程例如蛋白-A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲合层析从培养基、腹水液或血清中分离由亚克隆所分泌的单克隆抗体。
可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。例如，可利用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)，通过将免疫球蛋白分子进行蛋白水解性裂解而产生Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
本领域技术人员还将理解，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)的DNA还可衍生自抗体噬菌体文库。特别地，这样的噬菌体可被用来展示从所有组成成分(repertoire)或组合性抗体文库(例如人类或鼠)表达的抗原结合结构域。可利用抗原，例如利用标记的抗原或者被结合或捕获于固体表面或珠子上的抗原对表达抗原结合结构域(其结合感兴趣的抗原)的噬菌体进行选择或鉴定。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括由具有被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域的噬菌体所表达的fd和M13结合结构域。示例性方法在例如EP368684B1、美国专利第5,969,108号、Hoogenboom，H.R.和Chames，Immunol.Today21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.8：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：2682(2001)；Lui等人，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中列出，其每一个均通过引用并入本文。若干出版物(例如Marks等人，Bio/Technology10：779-783(1992))已经描述了通过链改组(chainshuffling)以及组合性感染和作为构建大型噬菌体文库策略的体内重组而产生高亲合力人抗体。在另一实施方式中，核糖体展示可被用来代替细菌噬菌体作为展示平台(参见例如Hanes等人，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol.Methods248：31(2001))。在又一个实施方式中，细胞表面文库可用于筛选抗体(Boder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10701(2000)；Daugherty等人，J.Immunol.Methods243：211(2000))。这样的步骤提供了用于单克隆抗体分离以及随后克隆的传统杂交瘤技术的替代品。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上被展示。特别地，编码VH和VL区域的DNA序列从动物cDNA文库(例如人类或鼠淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中被扩增。在某些实施方式中，利用scFv接头通过PCR将编码VH和VL区域的DNA连接在一起并克隆到噬菌粒载体中(例如，pCANTAB6或pComb3HSS)。该载体在大肠杆菌中被电穿孔并且该大肠杆菌被辅助噬菌体感染。在这些方法中使用的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且VH或VL区域通常被重组地融合于噬菌体基因III或基因VIII。可利用抗原，例如利用标记的抗原或被结合或捕获于固体表面或珠子上的抗原对表达结合感兴趣抗原(即LINGO-4多肽或其片段)的抗原结合结构域的噬菌体进行选择或鉴定。
可被用来制备抗体的噬菌体展示方法的另外实例包括在Brinkman等人，J.Immunol.Methods182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods184：171-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene187：9-18(1997)；Burton等人，AdvancesinImmunology57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号中所公开的那些，其各自通过引用以其整体并入本文。
如在上述参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，来自该噬菌体的抗体编码区可以被分离并用来生成整个抗体(包括人类抗体)或者任何其它期望的抗原结合片段，并且被表达在任何期望的宿主中，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，用来重组地产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以被采用，其利用本领域中已知的方法例如在PCT公布第WO92/22324号；Mullinax等人，BioTechniques12(6)：864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI34：26-34(1995)；和Better等人，Science240：1041-1043(1988)中所公开的那些(所述参考文献通过引用全文并入)。
在另一个实施方式中，利用常规步骤(例如通过利用能够特异性结合于编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，编码期望的单克隆抗体的DNA可以被容易地分离和测序。在某些实施方式中，被分离和亚克隆的杂交瘤细胞充当这样的DNA的来源。一旦分离后，该DNA可被置于表达载体中，其随后被转染入本来并不产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更特别地，分离的DNA(如本文所述，其可以是合成的)可用来克隆用于制备抗体的恒定区和可变区序列，如在Newman等人在1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中所描述的，其通过引用并入本文。实质上，这要求从选定细胞中提取RNA，转化成cDNA并利用Ig特异性引物通过PCR进行扩增。适合该目的的引物还在美国专利第5,658,570号中被描述。如下文将更详细讨论的，表达期望抗体的转化细胞可以以相对较大的量进行培养以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
在特定实施方式中，可通过本领域熟知的方法例如通过比较其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列来确定序列高变区而对重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列进行检查以鉴定互补决定区(CDR)的序列。利用常规的重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入骨架区中，例如插入人类骨架区中以使非人类抗体人源化。骨架区可以是天然存在的或共有的骨架区，如人类骨架区(关于人类骨架区的列表，参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：451-479(1998))。在某些实施方式中，通过骨架区和CDR组合所生成的多核苷酸编码这样的抗体，其特异性地结合于期望多肽(例如LINGO-4)的至少一个表位。在进一步的实施方式中，可在骨架区内进行一个或多个氨基酸取代以例如促进抗体对其抗原的结合。另外，这样的方法可用来形成参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失以生成缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其它改变被本发明所涵盖，并且在本领域的技术范围内。
在某些实施方式中，用于本文公开的治疗方法的LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段将不在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一个实施方式中，用于本文公开的治疗方法的LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可利用本领域公知的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可以将抗体人源化、灵长类化或去免疫化，或者可制备嵌合体抗体。这些类型的抗体衍生自非人类抗体，通常是鼠或灵长类抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性，但对人类具有较低的免疫原性。这可以通过各种方法实现，其包括(a)将整个非人类可变结构域拼接到人类恒定区以产生嵌合体抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分拼接到人类骨架区和恒定区上，其保留或不保留关键性骨架区残基；或者(c)移植整个非人类可变结构域，但通过替换表面残基而用类似于人类的部分将其“掩盖”。这样的方法公开在Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，以及美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370号，其所有都通过引用全文并入本文。
去免疫化也可以用来降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1、WOO03437A2)。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列，而且来自每个V区的人类T细胞表位“图谱”显示出与互补决定区(CDR)相关的表位以及序列内的其它关键残基的位置。对来自T细胞表位图谱的单个T细胞表位进行分析以鉴定具有改变最终抗体活性的较低风险的可替换氨基酸取代。设计了包括氨基酸取代的组合在内的一系列可替换VH和VL序列，并且随后将这些序列并入一系列结合多肽中，例如用于本文公开的诊断和治疗方法中的LINGO-4拮抗剂抗体或其免疫特异性片段，然后检测这些多肽的功能。通常，生成和检测在12和24个之间的变体抗体。然后将包含修饰的V区域和人类C区域在内的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并将后续的质粒引入细胞系用于生产完整抗体。然后将抗体在适当的生化和生物学测定中加以比较，并鉴定最佳的变体。
嵌合体抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合体抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison，Science229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods125：191-202(1989)；Takeda等人，Nature314：452-454(1985)，Neuberger等人，Nature372：604-608(1984)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其通过引用全文并入本文。人源化抗体是来自结合所期望的抗原的非人类物种抗体的抗体分子，其具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的骨架区。通常，人类骨架区中的骨架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变例如改善抗原结合。通过本领域中熟知的方法来鉴定这些骨架取代，例如通过CDR和骨架残基的相互作用的建模来鉴定对抗原结合重要的骨架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置的罕见的骨架残基(参见例如Queen等人的美国专利第5,585,089号；Riechmann等人，Nature332：323(1988)，其通过引用全文并入本文)。可使用本领域已知的各种技术来将抗体人源化，其包括例如CDR拼接(EP239,400；PCT公布WO91/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)、镶饰(veneering)或表面重建(EP592,106；EP519,596；Padlan，MolecularImmunology28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。
用于产生重组抗体的另一个高效的方法是由Newman，Biotechnology10：1455-1460(1992)所公开的。特别地，该技术导致含有猴可变结构域和人类恒定序列的灵长类化抗体的产生。该参考文献通过引用全文并入本文。此外，该技术还在共同受让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号中被描述，其每一个都通过引用并入本文。
对于人类患者的治疗处理来说，完全人类的抗体是尤其期望的。可通过本领域已知的各种方法来制备人类抗体，其包括使用衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示法。还参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741，其每一个通过引用全文并入本文。
还可以利用转基因小鼠来制备人类抗体，所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达不能产生内源免疫球蛋白的人类免疫球蛋白基因(参见例如，美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369，其每一个通过引用并入本文)。例如，已经描述，嵌合体和种系突变小鼠中抗体重链连接区的纯合子缺失导致对内源抗体的产生的完全抑制。人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机地或通过同源性重组而引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人类重链和轻链基因以外，人类可变区、恒定区以及多变区可以被引入小鼠胚胎干细胞。通过同源性重组对人类免疫球蛋白基因座的引入，可以分别或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因变为非功能性的。特别地，JH区的纯合子缺失防止内源性抗体生成。将修饰的胚胎干细胞扩展并显微注入胚泡以产生嵌合体小鼠。然后将嵌合体小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合子后代。以正常方式用选定的抗原对转基因小鼠进行免疫，所述抗原例如期望的靶多肽的全部或部分。利用常规杂交瘤技术，可从免疫的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠携带的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并随后发生类别转换和体细胞突变。因此，利用这种技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对这种用于产生人类抗体的技术的综述，参见Lonberg和HuszarInt.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对这种用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的技术以及用于产生这种抗体的方案的详细讨论，参见PCT公布第WO98/24893、WO96/34096、WO96/33735号；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其通过引用全文并入本文。另外，可接洽诸如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(SanJose，Calif.)等公司以利用类似于上述的技术来提供针对所选抗原的人类抗体。
另一种使用SCID小鼠产生人类抗体的方法被公开于美国专利第5,811,524号中，其通过引用并入本文。可以理解的是，还可如本文所述分离并操作与这些人类抗体相关的遗传物质。
可使用称作“定向选择”的技术产生识别所选择的表位的完全人类的抗体。在该方法中，所选择的非人类单克隆抗体例如小鼠抗体被用来指导对识别相同表位的完全人类的抗体的选择(Jespers等人，Bio/Technology12：899-903(1988))。还参见美国专利第5,565,332号。
可选择地，可使用为了产生单链抗体的所述技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；和Ward等人，Nature334：544-554(1989))。通过将Fv区的重链和轻链片段经由氨基酸桥连接产生单链抗体来形成单链抗体。也可使用用于组装大肠杆菌中功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science242：1038-1041(1988))。可用来产生单链Fv和抗体的技术的实例包括描述于美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等人，MethodsinEnzymology203：46-88(1991)；和Shu等人，PNAS90：7995-7999(1993)中的那些。
在另一个实施方式中，可通过显微操作来选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫的哺乳动物分离外周血单核细胞并体外培养约7天。可筛选培养物中符合筛选标准的特定IgG。可分离来自阳性孔的细胞。可通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定中鉴定它们而分离单独的产生Ig的B细胞。可将产生Ig的B细胞显微操作至试管中并且可使用例如RT-PCR扩增VR和VL基因。可将VH和VL基因克隆至抗体表达载体中并转染至细胞(例如真核或原核细胞)中来表达。
可选择地，可使用本领域技术人员熟知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。这种技术被描述于各种实验室手册和原始文献出版物中。在这一方面，如下文所描述的适于在本发明中使用的技术被描述于CurrentProtocolsinImmunology(免疫学最新实验方案)，Coligan等人编辑，GreenPublishingAssociatesandWiley-Interscience，JohnWileyandSons，NewYork(1991)中，其通过引用将全文包括增刊并入本文。
可通过本领域中已知的用于抗体合成的任何方法，尤其是通过化学合成或通过本文所描述的重组表达技术来产生用于本文所公开的治疗方法中的抗体。
还将理解的是，本发明的范围还涵盖抗原结合DNA序列的所有等位基因、变体和突变。
在一个实施方式中，可根据熟知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或分别制备编码抗体的轻链和重链的cDNA。可通过共有的恒定区引物或通过基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特别的引物来启动PCR。如上文所讨论的，还可使用PCR来分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在该情况下，可通过共有的引物或较大的同源探针例如小鼠恒定区探针来筛选文库。
可使用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常是质粒DNA，进行限制性作图并根据在例如前述与重组DNA技术相关的参考文献中详细地陈列的标准的熟知技术进行测序。当然，根据本发明，在分离过程或随后的分析中的任何点，所述DNA可以是合成的。
抗体或其片段、衍生物或类似物例如作为LINGO-4拮抗剂的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建含有编码抗体的多核苷酸在内的表达载体。一旦获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分(例如含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸后，可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员熟知的方法可被用于构建含有编码抗体的序列和适合的转录和翻译控制信号在内的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此本发明提供了被可操作地连接至启动子的、包含编码本发明的抗体分子或者其重链或轻链或者重链或轻链可变结构域的核苷酸序列在内的可复制载体。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公布WO86/05807；PCT公布WO89/01036和美国专利第5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可被克隆至这样的载体中以表达整个重链或轻链。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生用于本文所描述的方法中的抗体。因此，本发明包括含有被可操作地连接至异源启动子的、编码本发明的抗体或者其重链或轻链的多核苷酸在内的宿主细胞。在表达双链抗体的某些实施方式中，如下文所详细描述的，编码重链和轻链两者的载体可在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子。
各种宿主表达载体系统可被用来表达用于在本文其他地方描述的方法中的抗体分子。
可用本发明的两个表达载体、编码重链衍生的多肽的第一载体和编码轻链衍生的多肽的第二载体对宿主细胞共转染。两个载体可含有相同的可选标记，其使得重链和轻链多肽同等表达。可选地，可使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，轻链被有利地置于重链之前以避免有毒的游离重链过量(Proudfoot，Nature322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦重组表达了本发明的抗体分子后，可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来将它纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析、特别是在蛋白A之后对特定抗原的亲和层析以及分级柱层析)、离心、差别溶解法或通过用于蛋白纯化的任何其他标准技术。可选地，用于增加本发明抗体的亲和力的方法公开于US20020123057A1。
在一个实施方式中，用于本发明的方法中的结合分子或抗原结合分子包含合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或全部地缺失(“缺失了结构域的抗体”)。在某些实施方式中，相容的被修饰的抗体将包括缺失了结构域的构建物或变体，其中整个CH2结构域被去除(ΔCH2构建物)。对于其它的实施方式，可用短的连接肽取代所缺失的结构域以提供可变区的柔性和运动自由度。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体的分解代谢速率的调节特性，这种构建物在某些情况下可以是被期望的。
在某些实施方式中，用于本文所公开的方法中的修饰的抗体是小体。可使用本领域中描述的方法来制备小体(参见，例如美国专利第5,837,821号或WO94/09817A1)。
在另一个实施方式中，用于本文所公开的方法中的修饰的抗体是本领域已知的缺失了CH2结构域的抗体。可使用编码IgG1人类恒定结构域的载体(例如来自BiogenIDECIncorporated)来产生缺失了结构域的构建物(参见例如WO02/060955A2和WO02/096948A2)。这一示例性载体被人工改造以缺失CH2结构域并提供表达缺失了结构域的IgG1恒定区的合成载体。
在一个实施方式中，用于本文所公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂抗体或其片段包含具有几个甚至单个氨基酸缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的缔合。例如，CH2结构域的所选区域中单个氨基酸突变可能足以大量减少Fc结合并从而增加肿瘤定位。相似地，可能期望的是仅仅缺失控制待调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分。恒定区的这种部分缺失可改善抗体的所选择的特征(血清半衰期)而使与受验的恒定区结构域相关的其它期望的功能保持完整。此外，如上文所提及的，所公开的抗体的恒定区可以是通过对增强所得的构建物的概况(profile)的一个或多个氨基酸的突变或取代来合成的。在这一方面，可能破坏由保守的结合位点提供的活性(例如Fc结合)而基本上维持所修饰的抗体的构型和免疫原性概况。还有，其他的实施方式包括向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强期望的特征例如效应子功能或提供更多的细胞毒素或糖类附着。在这种实施方式中，可能期望插入或复制衍生自所选择的恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了抗体的用途，所述抗体包括、基本上由或由本文所描述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)所组成，其中所述抗体或其片段免疫特异性地与LINGO-4多肽结合。本领域技术人员已知的标准技术可被用来将突变引入编码结合分子的核苷酸序列中，所述技术包括但不限于产生氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。在各种实施方式中，变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替换的取代。在本领域中已经定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选地，通过例如饱和诱变，可随机地沿全部或部分编码序列引入突变，并且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
例如，仅向抗体分子的骨架区或CDR区中引入突变是可能的。所引入的突变可以是沉默的或中性的错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有影响或影响极少。这些类型的突变对于优化密码子选择或改善杂交瘤的抗体生产可能是有用的。可选地，非中性的错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性的错义突变的位置很可能是在骨架区中，而大多数非中性的错义突变的位置很可能是在CDR中，尽管这不是绝对的要求。本领域技术人员将能够设计并检测具有期望特性的突变分子，例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如抗原结合活性的改善或抗体特异性的改变)。诱变之后，所编码的蛋白可被常规地表达并且可使用本文所描述的技术或通过本领域已知的常规的修饰技术来确定所编码的蛋白的功能和/或生物活性。
融合多肽和抗体
用于本文公开的治疗方法中的LINGO-4多肽和抗体还可被重组地融合至异源多肽的N-或C-末端。例如，LINGO-4拮抗剂多肽或抗体可与在检测测定中用作标签的分子和效应子分子例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素重组地融合或轭合。参见例如PCT公布WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利第5,314,995号和EP396,387。
用于本文所公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂多肽和抗体可由通过肽键或修饰的肽键即肽等排体彼此结合的氨基酸所组成，并且可含有除了20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。
本发明提供融合蛋白，其包含下列、基本上由或由抑制LINGO-4功能的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体融合物所组成。在某些实施方式中，LINGO-4拮抗剂多肽或抗体与之融合的异源多肽对功能是有用的，或者对于靶向LINGO-4拮抗剂多肽或抗体是有用的。在本发明的某些实施方式中，可溶的LINGO-4拮抗剂多肽例如包含LRR结构域、Ig结构域或整个胞外结构域(对应于SEQIDNO：2的氨基酸34至532)在内的LINGO-4多肽或者本文所述的任何其它LINGO-4多肽片段、变体或衍生物被融合至异源多肽部分以形成LINGO-4拮抗剂融合多肽。LINGO-4拮抗剂融合蛋白和抗体可用于实现各种目的，例如增加的血清半衰期、改善的生物利用率、特定的器官或组织类型的体内靶向、改善的重组表达效力、改善的宿主细胞分泌、易于纯化和较高的亲合力。取决于有待实现的目的，异源部分可以是惰性的或具有生物学活性的。而且，可以选择稳定地融合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体，或者在体内或体外可裂解。用于实现这些其他目的的异源部分是本领域已知的。
作为表达LINGO-4拮抗剂融合多肽或抗体的替代品，可预先形成所选的异源部分并且将其与LINGO-4拮抗剂多肽或抗体化学地轭合。在大多数情况下，无论融合还是轭合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体，所选的异源部分将相似地起作用。因此，在下列异源氨基酸序列的讨论中，除非另外说明，否则应当理解的是，异源序列可以以融合蛋白的形式或作为化学轭合物连接至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体。
药理学上有活性的多肽例如LINGO-4拮抗剂多肽或抗体常常表现出快速的体内清除，这要求必须使用大剂量以在体内达到治疗有效的浓度。此外，小于约60kDa的多肽可能经历肾小球过滤，其有时导致肾毒性。可使用相对小的多肽例如LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的融合或轭合来减少或避免这种肾毒性的风险。用于增加治疗性多肽的体内稳定性(即血清半衰期)的各种异源氨基酸序列(即多肽部分或“载体”)是已知的。
由于其长的半衰期、广泛的体内分布和酶促或免疫功能的缺乏，基本上全长的人类血清白蛋白(HSA)或HSA片段通常用作异源部分。通过应用例如Yeh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：1904-08(1992)和Syed等人，Blood89：3243-52(1997)中所教导的方法和物质，HSA可被用来形成LINGO-4拮抗剂融合多肽或抗体或多肽/抗体轭合物，其借助于LINGO-4部分而表现出生理活性并表现体内稳定性的显著增加，例如高10倍至100倍。HSA的C-末端可融合至可溶性LINGO-4部分的N-末端。由于HSA是天然分泌蛋白，当融合蛋白在真核例如哺乳动物表达系统中产生时，HSA信号序列可被用于获得可溶性LINGO-4融合蛋白向细胞培养基中的分泌。
在某些实施方式中，用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体还包含靶向部分。靶向部分包括指导在身体的某部分定位，例如在脑或其中区室定位的蛋白或肽。在某些实施方式中，用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体被连接或融合至脑靶向部分。脑靶向部分被共价连接(例如直接的翻译融合或者通过直接的化学连接或通过经由可任选地裂解的间隔分子的化学连接)或非共价连接(例如通过可逆的相互作用例如卵白素、生物素、蛋白A、IgG等)。在其它实施方式中，用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体被连接至一个或多个脑靶向部分。在另外的实施方式中，脑靶向部分被连接至用于本发明的方法中的多个LINGO-4拮抗剂多肽或抗体。
与LINGO-4拮抗剂多肽或抗体缔合的脑靶向部分增强这种LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的脑递送。已经描述了当融合至蛋白或治疗剂时，穿过血脑屏障(BBB)递送蛋白或治疗剂的若干多肽。非限制的实例包括单结构域抗体FC5(Abulrob等人(2005)J.Neurochem.95，1201-1214)；mAB83-14，人类胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人(1995)Pharmacol.Res.12，807-816)；与人类转铁蛋白受体(hTfR)结合的B2、B6和B8肽(Xia等人(2000)J.Virol.74，11359-11366)；转铁蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人(1991)J.Pharmacol.Exp.Ther.259，66-70)和美国专利第6,306,365号的SEQIDNO：1-18。上述参考文献的内容通过引用全文并入本文。
通过本领域中已确立的若干方法来确定LINGO-4拮抗剂组合物的增强的脑递送。例如，向动物施用与脑靶向部分连接的放射性、酶促或荧光标记的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体；确定脑定位；并与未与脑靶向部分连接的等量放射标记的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的定位进行比较。用来确定增强的靶向的其它方法被描述于上面的参考文献中。
信号序列是对启动蛋白跨内质网膜转运的氨基酸序列进行编码的多核苷酸。对于构建免疫融合素(immunofusin)来说有用的信号序列包括抗体轻链信号序列例如抗体14.18(Gillies等人，J.Immunol.Meth.125：191-202(1989))、抗体重链信号序列例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人，Nature286：5774(1980))。可选地，可使用其他的信号序列。参见例如Watson，Nucl.AcidsRes.12：5145(1984)。信号肽通常在内质网的腔内被信号肽酶裂解。这导致含有Fc区和可溶性LINGO-4部分的免疫融合素蛋白的分泌。
在一些实施方式中，DNA序列可编码在分泌盒和可溶性LINGO-4部分之间的蛋白水解裂解位点。这种裂解位点可提供例如所编码的融合蛋白的蛋白水解裂解，从而从靶蛋白中分离Fc结构域。有用的蛋白水解裂解位点包括由蛋白水解酶例如胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶、凝血因子Xa或肠激酶K所识别的氨基酸序列。
分泌盒可被并入可复制的表达载体中。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒以及诸如此类。示例性表达载体是pdC，其中免疫融合素DNA的转录被置于人类巨细胞病毒的增强子和启动子的控制下。参见例如Lo等人，Biochim.Biophys.Acta1088：712(1991)；和Lo等人，ProteinEnGlneering11：495-500(1998)。可用编码可溶性LINGO-4多肽的DNA转化或转染适当的宿主细胞，并将所述宿主细胞用于可溶性LINGO-4多肽的表达和分泌。通常使用的宿主细胞包含不死的杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和COS细胞。
在一个实施方式中，可溶性LINGO-4多肽被融合至铰链和Fc区，即Ig重链恒定区的C-末端部分。LINGO-4-Fc融合物的潜在优点包括溶解性、体内稳定性和多价例如二聚化。所用的Fc区可以是IgA、IgD或IgGFc区(铰链-CH2-CH3)。可选地，它可以是IgE或IgMFc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。通常使用IgGFc区，例如IgG1Fc区或IgG4Fc区。在一个实施方式中，开始于铰链区的、恰在化学地定义IgGFc的木瓜蛋白酶裂解位点(即残基216，假定重链恒定区的第一个残基是根据Kabat系统的残基114)的上游的序列或其他免疫球蛋白的类似位点被用于融合。进行融合的精确位点不是关键的；特定的位点是熟知的并且可被选择以便优化分子的生物学活性、分泌或结合特征。用于构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料和方法是本领域已知的，并且可被用于获得可溶性LINGO-4融合物而无需过多的实验。本发明的一些实施方式使用LINGO-4融合蛋白，例如Capon等人的美国专利第5,428,130和5,565,335号中描述的那些。
在一些实施方式中，完全完整的野生型Fc区表现出在用于本发明方法中的Fc融合蛋白中可能不必要和不被期望的功能子效应。因此，在构建分泌盒的过程中从Fc区除去某些结合位点。例如，由于与轻链的共表达是不必要的，从IgE的Fc区的CH2结构域除去重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot等人，Immunol.Today8：111-14(1987))，以使该位点不干扰免疫融合素的有效分泌。跨膜结构域序列例如IgM中存在的那些通常也被除去。
在某些实施方式中，使用IgG1Fc区。可选地，免疫球蛋白γ的其他亚类(γ-2、γ-3和γ-4)的Fc区可被用于分泌盒中。免疫球蛋白γ-1的IgG1Fc区包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是CH2缺失的Fc，其包括铰链区和CH3区的一部分但是没有CH2区。CH2缺失的Fc已经由Gillies等人Hum.Antibod.Hybridomas1：47(1990)描述。在一些实施方式中，使用IgA、IgD、IgE或IgM中的一个的Fc区。
可以以几种不同的构型来构建LINGO-4-Fc融合蛋白。在一种构象中，可溶性LINGO-4部分的C-末端被直接融合至Fc铰链部分的N-末端。在稍微不同的构型中，短的多肽例如2-10个氨基酸在可溶性LINGO-4部分的N-末端和Fc部分的C-末端之间被并入融合物。这种接头提供构象的柔性，在某些情况下其可改善生物学活性。如果铰链区的足够的部分被保留在Fc部分中，LINGO-4-Fc融合物将二聚化，从而形成二价分子。单体Fc融合物的同种群体将产生单特异性的二价的二聚体。各自具有不同特异性的两种单体Fc融合物的混合物将产生双特异性的二价的二聚体。
可溶性LINGO-4多肽可被融合至异源肽以促进可溶性LINGO-4部分的纯化或鉴定。例如，组氨酸标签可被融合至可溶性LINGO-4多肽以促进使用商业上可得的色谱介质的纯化。
“接头”序列是一连串的一个或多个氨基酸，其将融合蛋白中的两个多肽编码区分开。典型的接头包含至少5个氨基酸。另外的接头包含至少10个或至少15个氨基酸。在某些实施方式中，选择肽接头的氨基酸以使接头是亲水的。接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(SEQIDNO：5)是可广泛用于许多抗体的优选接头，因为它提供足够的柔性。其它接头包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(G4S)2(SEQIDNO：6)、GluSerGlyArgSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO：7)、GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysSerThr(SEQIDNO：8)、GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysSerThrGln(SEQIDNO：9)、GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysValAsp(SEQIDNO：10)、GlySerThrSerGlySerGlyLysSerSerGluGlyLysGly(SEQIDNO：11)、LysGluSerGlySerValSerSerGluGlnLeuAlaGlnPheArgSerLeuAsp(SEQIDNO：12)和GluSerGlySerValSerSerGluGluLeuAlaPheArgSerLeuAsp(SEQIDNO：13)。更短的接头的实例包括上述接头的片段，而更长的接头的实例包括上述接头的组合、上述接头的片段的组合以及上述接头与上述接头的片段的组合。
本发明的LINGO-4多肽可被融合到多肽标签。本文所用的术语“多肽标签”意指可缔合、接合或连结到LINGO-4多肽，并可被用于鉴定、纯化、浓缩或分离LINGO-4多肽的任何氨基酸序列。多肽标签与LINGO-4多肽的缔合可通过例如构建包含下列在内的核酸分子来进行：(a)编码多肽标签的核酸序列和(b)编码LINGO-4多肽的核酸序列。示例性多肽标签包括例如能够被翻译后修饰的氨基酸序列，例如生物素酰化的氨基酸序列。其它示例性多肽标签包括例如能够被抗体(或其片段)或其它特异性结合反应物识别和/或结合的氨基酸序列。能够被抗体(或其片段)或其它特异性结合反应物识别的多肽标签包括例如本领域中被称作“表位标签”的那些。表位标签可以是天然或人工的表位标签。天然和人工的表位标签是本领域已知的，其包括例如人工表位诸如FLAG、Strep或多聚组氨酸肽。FLAG肽包括序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQIDNO：14)或Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(SEQIDNO：15)(Einhauer，A.和Jungbauer，A.，J.Biochem.Biophys.Methods49：1-3：455-465(2001))。Strep表位具有序列Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQIDNO：16)。还可使用VSV-G表位，其具有序列Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(SEQIDNO：17)。另一人工表位是多聚His序列，其具有六个组氨酸残基His-His-His-His-His-His(SEQIDNO：18)。天然存在的表位包括单克隆抗体12CA5识别的流感病毒血凝素(HA)序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO：19)(Murray等人，Anal.Biochem.229：170-179(1995))和单克隆抗体9E10识别的来自人类c-myc(Myc)的11个氨基酸的序列(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(SEQIDNO：20)(Manstein等人，Gene162：129-134(1995))。另一种有用的表位是三肽Glu-Glu-Phe，其被单克隆抗体YL1/2识别(Stammers等人，FEBSLett.283：298-302(1991))。
在某些实施方式中，LINGO-4多肽与多肽标签可经由连接性氨基酸序列接合。如本文所用，“连接性氨基酸序列”可以是能够被一种或多种蛋白酶识别和/或裂解的氨基酸序列。可被一种或多种蛋白酶识别和/或裂解的氨基酸序列是本领域已知的。示例性氨基酸序列是被以下蛋白酶所识别的那些：凝血因子VIIa、凝血因子IXa、凝血因子Xa、APC、t-PA、u-PA、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肠激酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶B、H、L、S、D、组织蛋白G、肾素、血管紧张素转化酶、基质金属蛋白酶(胶原酶、基质溶解素、明胶酶)、巨噬细胞弹性酶、Cir和Cis。被前述蛋白酶识别的氨基酸序列是本领域已知的。被特定蛋白酶识别的示例性序列可见于例如美国专利第5,811,252号。
在本发明的一些实施方式中，可溶性LINGO-4融合构建物被用来增强细菌中可溶性LINGO-4部分的产生。在这样的构建物中，通常以高水平表达和/或分泌的细菌蛋白被用作可溶性LINGO-4多肽的N-末端融合配偶体。参见例如Smith等人，Gene67：31(1988)；Hopp等人，Biotechnology6：1204(1988)；LaVallie等人，Biotechnology11：187(1993)。
通过在适合的融合配偶体的氨基或羧基末端融合可溶性LINGO-4部分，可获得可溶性LINGO-4多肽的二价或四价形式。例如，可溶性LINGO-4部分可被融合至Ig部分的氨基和羧基末端以产生含有两个可溶性LINGO-4部分的二价单体多肽。当这些单体中的两个借助Ig部分二聚化时，获得可溶性LINGO-4蛋白的四价形式。这种多价形式可用于获得对靶的增强的结合亲和力。可溶性LINGO-4的多价形式也可通过将可溶性LINGO-4部分成串排列以形成串联体来获得，其可被单独使用或被融合至融合配偶体例如Ig或HSA。
LINGO-4轭合物
用于本文公开的治疗方法中的LINGO-4拮抗剂多肽和抗体包括被修饰的衍生物，即通过共价连接任何类型的分子以致共价连接不防止LINGO-4拮抗剂多肽或抗体抑制LINGO-4的生物学功能。例如，但是以非限制性的方式，本发明的LINGO-4拮抗剂多肽和抗体可被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、膦酸化(phosphylation)、磷酸化、酰胺化、经由已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞配体或其他蛋白连接等。可通过已知的技术进行许多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特异性的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可包含一个或多个非经典的氨基酸。
可通过自然过程例如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰LINGO-4拮抗剂多肽和抗体。这种修饰详细描述于基础教科书并且更详细地描述于专题论文以及大量的研究文献中。修饰可在LINGO-4拮抗剂多肽或抗体中的任何地方发生，其包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端者或在例如糖的部分上。可以理解的是，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体中的多个位点上。而且，给定的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体可包含许多类型的修饰。LINGO-4拮抗剂多肽或抗体可以是支链的，例如作为泛素化的结果，并且它们可以是具有或不具有支链的环状的。环状的、支链的和支链环状的LINGO-4拮抗剂多肽和抗体可从翻译后的自然过程获得或者可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸盐化、转运RNA介导的向蛋白添加氨基酸例如精氨酰化和泛素化(参见例如Proteins-StructureandMolecularProperties(蛋白-结构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork第2版，(1993)；PosttranslationalCovalentModificationOfProteins(蛋白的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson编辑，AcademicPress，NewYork，第1-12页(1983)；Seifter等人，MethEnzymol182：626-646(1990)；Rattan等人，AnnNYAcadSci663：48-62(1992))。
含有相应的氨基反应性基团和硫醇反应性基团的若干交联剂中的任一个可被用于将LINGO-4拮抗剂多肽连接至异源融合配偶体。适合的接头的实例包括插入硫醇反应性马来酰亚胺的胺反应性交联剂，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS和GMBS。其他适合的接头插入硫醇反应性卤代乙酸酯基团，例如SBAP、SIA、SIAB。提供用于与巯基基团反应以产生可还原的键的被保护的或未被保护的硫醇的接头包括SPDP、SMPT、SATA和SATP。这种试剂是商业上可得的(例如PierceChemicals)。
共轭不一定涉及可溶性LINGO-4多肽的N-末端或血清白蛋白上的硫醇部分。例如，可溶性LINGO-4-白蛋白融合物可使用遗传工程技术来获得，其中所述可溶性LINGO-4部分在其N-末端、C-末端或两端融合至血清白蛋白基因。
本发明的一些实施方式涉及可溶性LINGO-4多肽或LINGO-4抗体，其中一种或多种聚合物被轭合(共价连接)至LINGO-4多肽或抗体。适于这种轭合的聚合物的实例包括多肽(上文所讨论的)、糖聚合物和聚亚烷基二醇链。通常但不必须地，聚合物被轭合至可溶性LINGO-4多肽或LINGO-4抗体以便改善下列中的一个或多个：溶解度、稳定性或生物利用率。
通常用来与LINGO-4拮抗剂多肽或抗体轭合的聚合物的类型是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是最常用的。PEG部分例如1、2、3、4或5个PEG聚合物可轭合至每个LINGO-4拮抗剂多肽或抗体以与单独的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体相比增加血清半衰期。PEG部分是非抗原性的并且基本上是生物学惰性的。本发明的实施中所使用的PEG部分可以是支链或非支链的。
连接至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的PEG部分的数目和单独的PEG链的分子量可变化。通常，聚合物的分子量越大，结合至多肽的聚合物链越少。通常，结合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的总聚合物质量为20kDa至40kDa。因此，如果连接一条聚合物链，所述链的分子量通常是20-40kDa。如果连接两条链，每条链的分子量通常是10-20kDa。如果连接三条链，分子量通常是7-14kDa。
聚合物例如PEG可经由多肽上任何适合的暴露的反应性基团连接至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体。所述暴露的反应性基团可以是例如内部赖氨酸残基的N-末端氨基基团或ε氨基基团，或两者。活化的聚合物可在LINGO-4拮抗剂多肽或抗体上的任何游离氨基基团上反应并共价连接。LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的游离的羧基基团、适当活化的羰基基团、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分和巯基基团(如果可得的话)也可用作连接聚合物的反应性基团。
在共轭反应中，取决于多肽浓度，通常使用每摩尔多肽约1.0至约10摩尔的活化的聚合物。通常，所选择的比例代表将反应最大化同时将可损害LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的期望的药理学活性的副反应(常常是非特异性的)最小化之间的平衡。在某些实施方式中，保留LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的至少50％的生物活性(如例如在本文所描述的或本领域已知的测定中的任一个中所证实的)。在进一步的实施方式中，保留了将近100％。
可使用常规的化学反应将聚合物轭合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体。例如，可将聚亚烷基二醇部分偶合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的赖氨酸ε氨基基团。可使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯例如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)进行与赖氨酸侧链的连接。适合的聚亚烷基二醇部分包括例如羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS、SC。这些试剂是商业上可得的。另外的胺反应性PEG接头可取代琥珀酰亚胺基部分。这些包括例如异硫氰酸酯、硝基苯基碳酸酯(PNP)、环氧化物、碳酸苯并三唑、SC-PEG、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、醛、环氧化物、羰基咪唑和PNP碳酸酯。通常优化条件以将反应的选择性和程度最大化。这种反应条件的优化是在本领域普通技术的范围内。
聚乙二醇化可通过本领域已知的聚乙二醇化反应中的任一种来进行。参见例如FocusonGrowthFactors3：4-10(1992)和欧洲专利申请EP0154316和EP0401384。可利用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。
经由酰化的聚乙二醇化通常包括将聚乙二醇的活性酯衍生物进行反应。任何反应性的PEG分子可被用于聚乙二醇化中。酯化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG是经常使用的活化的PEG酯。如本文所用，“酰化”包括但不限于治疗性蛋白和水溶性聚合物如PEG之间的下列类型的键：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯以及诸如此类。参见例如BioconjugateChem.5：133-140，1994。通常选择反应参数以避免将损害可溶性LINGO-4多肽或使其失活的温度、溶剂和pH条件。
通常，连接键是酰胺，并且通常至少95％的所得产物是单-、双-或三-聚乙二醇化的。然而，取决于所使用的特定的反应条件，可形成一定数量的具有更高聚乙二醇化程度的一些物质。任选地，可通过常规纯化方法从混合物尤其是未反应的物质中将纯化的聚乙二醇化的物质分离，所述方法包括例如透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水交换层析和电泳。
经由烷化的聚乙二醇化通常包括在还原剂存在下将PEG的末端醛衍生物与LINGO-4拮抗剂多肽或抗体反应。此外，可操纵反应条件以有利于基本上只在LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的N末端氨基基团上的聚乙二醇化，即单聚乙二醇化的蛋白。无论在单聚乙二醇化还是在多聚乙二醇化的情况下，PEG基团通常经由-CH2-NH-基团连接至蛋白。当特别提及-CH2-基团时，这一类型的键称为“烷基”键。
经由还原性烷化以产生N末端靶向的单聚乙二醇化产物的衍生化利用了衍生化可用的不同类型的伯氨基基团(赖氨酸对N末端)的差别反应性。反应在允许利用赖氨酸残基的ε氨基基团与蛋白的N末端氨基基团之间的pKa不同的pH下进行。通过这种选择性的衍生化，控制了含有反应性基团例如醛的水溶性聚合物与蛋白的连接：与聚合物的轭合主要发生在蛋白的N-末端，并且不发生其他反应性基团例如赖氨酸侧链氨基基团的显著修饰。
在酰化和烷化方法中都使用的聚合物分子选自水溶性聚合物。所选择的聚合物通常被修饰以具有单一的反应性基团例如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛，以便可如本方法中所提供的来控制聚合的程度。示例性的反应性PEG醛是水稳定性的聚乙二醇丙醛或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见例如Harris等人，美国专利第5,252,714号)。聚合物可以是支链或非支链的。对于酰化反应，所选择的聚合物通常具有单一的反应性酯基团。对于还原性烷化，所选择的聚合物通常具有单一的反应性醛基团。通常，不从天然存在的糖基残基选择水溶性聚合物，因为这些通常通过哺乳动物重组表达系统更方便地制备。
制备聚乙二醇化的可溶性LINGO-4多肽或抗体的方法通常包括步骤：(a)将LINGO-4拮抗剂多肽或抗体与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在分子由此被连接至一个或多个PEG基团的条件下进行反应，和(b)获得反应产物。通常，酰化反应的优化的反应条件将基于已知的参数和期望的结果视具体情况确定。例如，较大的PEG对蛋白的比率通常产生更大百分比的多聚乙二醇化产物。
产生单-聚合物/可溶性LINGO-4多肽或者LINGO-4抗体的基本上均质的群体的还原性烷化通常包括步骤：(a)将可溶性LINGO-4蛋白或多肽与反应性PEG分子在还原性烷化条件下在适合允许选择性修饰多肽或抗体的N末端氨基基团的pH下进行反应；和(b)获得反应产物。
对单-聚合物/可溶性LINGO-4多肽或者LINGO-4抗体的基本上均质的群体来说，还原性烷化反应的条件是允许水溶性聚合物部分与多肽或抗体的N-末端选择性连接的那些。这样的反应条件通常提供了赖氨酸侧链氨基基团和N-端氨基基团之间的pKa差异。为了本发明的目的，pH通常在3-9，典型地为3-6的范围内。
可溶性LINGO-4多肽或抗体可包括标签，例如可随后通过蛋白水解释放的部分。因此，可通过首先将修饰的His-标签与将与赖氨酸和N-末端两者反应的低分子量接头例如Traut试剂(Pierce)进行反应反应，并且随后释放His标签来对赖氨酸部分进行选择性修饰。之后多肽将包含游离的SH基团，其可被包含硫醇反应性头部基团例如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤代乙酸酯基团或游离的或受保护的SH的PEG选择性修饰。
可用将建立PEG连接的特异性位点的任何接头来代替Traut试剂。例如，可用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce)来代替Traut试剂。相似地，可将蛋白与插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、卤代乙酸酯基团(SBAP、SIA、SIAB)或乙烯基砜基团的胺反应性接头进行反应，并且将所得的产物与含有游离的SH的PEG进行反应。
在一些实施方式中，聚亚烷基二醇部分被偶合至LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的半胱氨酸基团。可使用例如马来酰亚胺基团、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团或硫醇基团实现偶合。
任选地，通过不稳定的键将可溶性LINGO-4多肽或抗体轭合至聚乙二醇部分。不稳定的键可在例如生物化学水解、蛋白水解或巯基裂解中被裂解。例如，键可在体内(生理)条件下被裂解。
如果反应性基团在N端的α氨基基团上，可通过用于将生物活性物质与惰性聚合物通常在约pH5-8，例如pH5、6、7或8下反应的任何适合的方法进行反应。通常，所述过程包括制备活化的聚合物，并且之后将蛋白与活化的聚合物反应以产生适于制剂的可溶性蛋白。
LINGO-4多核苷酸拮抗剂
特定的实施方式包括治疗脱髓鞘或髓鞘形成障碍病症的方法，其包括施用包含特异性地结合到编码LINGO-4的多核苷酸的核酸分子在内的有效量的LINGO-4多核苷酸拮抗剂。LINGO-4多核苷酸拮抗剂防止LINGO-4的表达(降低)。在本发明的某些实施方式中，LINGO-4多核苷酸拮抗剂在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成或防止脱髓鞘。LINGO-4多核苷酸拮抗剂包括但不限于反义分子、核酶、siRNA、shRNA和RNAi。通常，这种结合分子被分别施用于动物(参见例如O’Connor，J.Neurochem.56：560(1991))，但是这种结合分子也可由宿主细胞摄取并在体内表达的多核苷酸在体内表达。还参见OligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression(作为基因表达的反义抑制剂的寡聚脱氧核苷酸)，CRCPress，BocaRaton，FL(1988)。
RNAi是指干扰靶向的mRNA表达的RNA的表达。特别地，RNAi经由通过siRNA(短干扰RNA)与特定的mRNA(例如LINGO-4)相互作用而使靶向的基因沉默。之后dsRNA复合体被靶向以被细胞降解。另外的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)，也称为短干扰发夹。shRNA分子包含来自靶基因的通过环连接的有义序列和反义序列。将shRNA从核运输至细胞质，其随mRNA一起被降解。PolIII或U6启动子可被用来表达用于RNAi的RNA。
RNAi是由与它们的“靶”mRNA具有序列特异性同源性的双链RNA(dsRNA)分子所介导的(Caplen等人，ProcNatlAcadSciUSA98：9742-9747(2001))。果蝇的无细胞溶解产物的生物化学研究表明，RNA依赖性基因沉默的介体是21-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。因此，siRNA分子被有利地用于本发明的方法中。siRNA衍生自称作DICER的核糖核酸酶(RNase)加工的dsRNA(Bernstein等人，Nature409：363-366(2001))。看起来siRNA双链体被补充至称作RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望被任何特定的理论所束缚，据信RISC被引导至靶mRNA，其中siRNA双链体序列特异性地相互作用以介导通过催化方式进行的裂解(Bernstein等人，Nature409：363-366(2001)；Boutla等人，CurrBiol11：1776-1780(2001))。
RNAi已经被用来在哺乳动物细胞中分析基因功能并鉴定必要的基因(Elbashir等人，Methods26：199-213，2002；Harborth等人，JCellSci114：4557-4565，2001)，所述细胞包括非限制性的实例神经元(Krichevsky等人，ProcNatlAcadSciUSA99：11926-11929，2002)。还评估了RNAi的治疗模式，例如抑制或阻断病毒的感染、复制和/或生长并且减少致癌基因的表达(例如bcr-ab1基因；Scherr等人，BloodSep26印刷前电子出版，2002)，所述病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒(Gitlin等人，Nature418：379-380，2002)和HIV(Capodici等人，JImmunol169：5196-5201，2002)。RNAi已被用来调节哺乳动物(小鼠)和两栖动物(非洲爪蟾)胚胎(分别地，Calegari等人，ProcNatlAcadSciUSA99：14236-14240，2002；和Zhou等人，NucleicAcidsRes30：1664-1669，2002)中以及新生小鼠(Lewis等人，NatGenet32：107-108，2002)中的基因表达，而且被用来减少成年转基因小鼠中的转基因表达(McCaffrey等人，Nature418：38-39，2002)。已经描述了用于在细胞培养中和体内确定siRNA的效力和特异性的方法(参见例如Bertrand等人，BiochemBiophysResCommun296：1000-1004，2002；Lassus等人，SciSTKE2002(147)：PL13，2002和Leirdal等人，BiochemBiophysResCommun295：744-748，2002)。
可通过化学合成(Hohjoh，FEBSLett521：195-199，2002)，dsRNA的水解(Yang等人，ProcNatlAcadSciUSA99：9942-9947，2002)，通过使用T7RNA聚合酶的体外转录(Donzeet等人，NucleicAcidsRes30：e46，2002；Yu等人，ProcNatlAcadSciUSA99：6047-6052，2002)以及通过使用核酸酶例如大肠杆菌核糖核酸酶III的双链RNA水解(Yang等人，ProcNatlAcadSciUSA99：9942-9947(2002))在体外产生介导RNAi的分子，所述分子包括但不限于siRNA。
还可通过将两个寡核苷酸彼此退火来形成siRNA分子，所述siRNA分子通常具有下列通用结构，其包括双链和单链部分两者：
|-m-|(突出端)
|——x——|(“核心”)
5′-XXXXXXXXXXXXNNNNN-3′(SEQIDNO：41)
::::::::::::
3′-NNNNNYYYYYYYYYYYY-5′(SEQIDNO：42)
|-n-|(突出端)
其中N、X和Y是核苷酸；X与Y形成氢键；“:”表示两个碱基之间的氢键；x是具有1和约100之间的值的自然数；而且m和n是独立地具有0和约100之间的值的正整数。在一些实施方式中，N、X和Y独立地是A、G、C和T或U。非天然存在的碱基和核苷酸可存在，尤其是在合成的siRNA(即，将两个寡核苷酸退火的产物)的情况下。双链的中央部分称为“核心”并且具有作为测量单位的碱基对(bp)；单链的部分是突出端，其具有作为测量单位的核苷酸(nt)。所显示的突出端为3’突出端，但是具有5’突出端的分子也在本发明的范围内。同样在本发明的范围内的是没有突出端(即m＝0和n＝0)的以及在核心的一侧具有突出端而另一侧没有突出端(例如m＝0和n≥1，或反过来)的siRNA分子。
起初，RNAi技术没有表现出容易应用至哺乳动物系统。这是因为在哺乳动物中，dsRNA激活由dsRNA活化的蛋白激酶(PKR)，导致细胞凋亡级联和细胞死亡(Der等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：3279-3283，1997)。此外，很早以前就知道dsRNA激活哺乳动物细胞中的干扰素级联，其还可引起细胞生理的改变(Colby等人，Annu.Rev.Microbiol.25：333(1971)；Kleinschmidt等人，Annu.Rev.Biochem.41：517(1972)；Lampson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA58L782(1967)；Lomniczi等人，J.Gen.Virol.8：55(1970)和Younger等人，J.Bacteriol.92：862(1966))。然而，由dsRNA介导的PKR和干扰素级联的活化需要比约30个碱基对更长的dsRNA。相反，长度上小于30个碱基对的dsRNA已经被证实在哺乳动物细胞中引起RNAi(Caplen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：9742-9747(2001))。因此，期望与较长的dsRNA分子相关的不期望的非特异性作用可通过制备基本上不含较长dsRNA的短RNA来避免。
关于siRNA的参考文献：Bernstein等人，Nature409：363-366(2001)；Boutla等人，CurrBiol11：1776-1780(2001)；Cullen，NatImmunol.3：597-599(2002)；Caplen等人，ProcNatlAcadSciUSA98：9742-9747(2001)；Hamilton等人，Science286：950-952(1999)；Nagase等人，DNARes.6：63-70(1999)；Napoli等人，PlantCell2：279-289(1990)；Nicholson等人，Mamm.Genome13：67-73(2002)；Parrish等人，MolCell6：1077-1087(2000)；Romano等人，MolMicrobiol6：3343-3353(1992)；Tabara等人，Cell99：123-132(1999)和Tuschl，Chembiochem.2：239-245(2001)。
Paddison等人(Genes&Dev.16：948-958(2002))已经使用折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNAi的工具。因此，这种短发夹RNA(shRNA)分子还被有利地用于本发明的方法中。功能性shRNA的茎和环的长度是变化的；茎长度可在任何地方从约25nt变化至约30nt，而环的大小可在4nt至约25nt之间变化而不影响沉默活性。不希望被任何特定的理论所束缚，据信这些shRNA类似于DICER核糖核酸酶的dsRNA产物，并且在任何情况下都具有抑制特定基因表达的相同能力。
在本发明的一些实施方式中，从慢病毒载体(例如pLL3.7)表达shRNA。
反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成来控制基因表达。反义技术在例如Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；OligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression(作为基因表达的反义抑制剂的寡聚脱氧核苷酸)，CRCPress，BocaRaton，FL(1988)中讨论。三螺旋形成在例如Lee等人，NucleicAcidsResearch6：3073(1979)；Cooney等人，Science241：456(1988)和Dervan等人，Science251：1300(1991)中讨论。所述方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，编码LINGO-4的多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度上为约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计DNA寡核苷酸以与参与转录的基因区域互补，从而防止转录和靶蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并且阻断mRNA分子翻译为靶多肽。
在一个实施方式中，对LINGO-4基因有特异性的反义核酸通过从外源序列转录而在胞内产生。例如，载体或其部分被转录，产生反义核酸(RNA)。这种载体可保持为附加体或与染色体整合，只要其可被转录以产生期望的反义RNA。这种载体可通过本领域中标准的重组DNA技术方法来构建。载体可以是用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。反义分子的表达可以通过本领域中已知的任何启动子以在脊椎动物尤其是人类细胞中起作用，例如本文其他地方所描述的那些。
并不要求反义分子的完全互补性。与编码LINGO-4的RNA的至少一部分互补的序列指的是具有足以能够与RNA杂交以形成稳定的双链体或三链体的互补性的序列。杂交的能力将取决于互补程度和反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越大，其可能含有的错配碱基越多，并仍形成稳定的双链体(或视情况而定的三链体)。本领域技术人员可通过使用用来确定杂交复合体熔点的标准步骤来查明错配的可接受程度。
与信使RNA的5’端互补的寡核苷酸例如一直到并包括AUG起始密码子在内的5’非翻译序列应最有效地抑制翻译。然而，与mRNA的3’非翻译序列互补的序列也已经显示对mRNA翻译的有效抑制。通常参见Wagner，R.，Nature372：333-335(1994)。因此，与5’或3’非翻译的非编码区互补的寡核苷酸可被用于抑制LINGO-4翻译的反义方法中。与mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是较低效的翻译抑制剂，但是根据本发明可被使用。反义核酸通常长度是至少六个核苷酸，例如长度从6个变化至约50个核苷酸的寡核苷酸。在特定的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
用于本文公开的治疗方法中的多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或者其嵌合体混合物或衍生物或修饰型。可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰寡核苷酸以例如改善分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可包括其他的附加基团例如肽(例如用于在体内靶向宿主细胞受体)或促进跨细胞膜转运的剂(参见例如Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556(1989)；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652(1987))；1988年12月15日公开的PCT公布第WO88/09810号)或跨血脑屏障转运的剂(参见例如1988年4月25日公开的PCT公布第WO89/10134号)、杂交触发的裂解剂(参见例如Krol等人，BioTechniques6：958-976(1988))或嵌入剂(参见例如Zon，Pharm.Res.5：539-549(1988))。为此，寡核苷酸可轭合至另一个分子例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂等。
用于本文公开的治疗方法中的反义寡核苷酸可包含至少一个修饰的碱基部分，其选自包括但不限于如下在内的组：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N-6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3(3-氨基-3-N2羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
用于本文公开的治疗方法中的反义寡核苷酸还可包含至少一个修饰的糖部分，其选自包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖在内的组。
在再一个实施方式中，用于本文公开的治疗方法中的反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸主链，其选自包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物在内的组。
在再一个实施方式中，用于本文所公开的治疗方法中的反义寡核苷酸是α-异头基寡核苷酸。α-异头基寡核苷酸与互补的RNA形成特异性的双链杂交物，其中与一般的情况相反，所述链彼此平行(Gautier等人，Nucl.AcidsRes.15：6625-6641(1987))。寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucl.AcidsRes.15：6131-6148(1987))或嵌合体RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBSLett.215：327-330(1987))。
本发明的多核苷酸可通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用DNA自动合成仪(例如可从Biosearch，AppliedBiosystems等商业上获得的)。作为例子，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Stein等人，Nucl.AcidsRes.16：3209(1988)的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可通过使用受控有孔玻璃聚合物支持物(Sarin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451(1988))等来制备。
用于本文所公开的治疗方法中的多核苷酸组合物还包括催化性RNA或核酶(参见例如1990年10月4日公开的PCT国际公布WO90/11364；Sarver等人，Science247：1222-1225(1990))。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指示的位置裂解mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生是本领域中熟知的，并且被更全面地描述于Haseloff和Gerlach，Nature334：585-591(1988)中。在某些实施方式中，核酶被人工改造以使裂解识别位点位于靠近靶mRNA的5’端；即增加效力并将非功能性mRNA转录物的胞内蓄积最小化。
如在反义方法中一样，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的核酶可由修饰的寡核苷酸所组成(例如为了改善的稳定性、靶向等)，并且可被递送至在体内表达LINGO-4的细胞。编码核酶的DNA构建物可以以如上文所描述的相同的方式被引入细胞中以便引入反义的编码DNA。递送的一个方法包括使用在强的组成型或诱导型启动子(例如诸如polIII或polII启动子)控制下“编码”核酶的DNA构建物，以使被转染的细胞将产生足以破坏内源LINGO-4信使并抑制翻译的量的核酶。由于核酶与反义分子不同，是催化性的，因此为了效力需要较低的胞内浓度。
LINGO-4适体拮抗剂
在另一个实施方式中，用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂是适体。适体可以是这样的核苷酸或多肽，其具有独特的序列，具有与所期望的靶(例如多肽)特异性地结合的特性，而且是对给定的靶有特异性的配体。本发明的核苷酸适体包括与LINGO-4结合的双链DNA和单链RNA分子。在本发明的某些实施方式中，LINGO-4适体拮抗剂在例如哺乳动物中促进少突胶质细胞的增殖、分化或存活；促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成或防止脱髓鞘。
可使用本领域已知的方法例如经由通过指数富集(ExponentialEnrichment)的配体系统进化(SELEX)过程来选择核酸适体。SELEX是用于与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如例如美国专利第5,475,096、5,580,737、5,567,588、5,707,796、5,763,177、6,011,577和6,699,843号中所描述的，其通过引用全文并入本文。鉴定适体的另一种筛选方法描述在美国专利第5,270,163号中(其也通过引用并入本文)。SELEX过程是以核酸形成各种二维和三维结构的能力，以及在核苷酸单体中可得的作为实际上任何化合物的配体(形成特异性结合对儿)的化学多功能为基础的，所述化合物是单体的或聚合的，并包括其他核酸分子和多肽。任何大小的分子或组合物可作为靶。
SELEX方法包括从候选寡核苷酸的混合物选择并且使用相同的总选择方案逐步重复结合、分离和扩增以达到所期望的结合亲和力和选择性。从优选地含有随机化的序列的片段的核酸混合物开始，SELEX方法包括下列步骤：在适于结合的条件下将混合物与靶接触；将未结合的核酸同已经与靶分子特异性结合的核酸分离；解离核酸-靶复合体；对从核酸-靶复合体解离的核酸进行扩增以产生富含配体的核酸混合物。将结合、分离、解离和扩增的步骤根据需要重复许多个循环以产生对靶分子有高度特异性的高亲和力核酸配体。
核苷酸适体可用作例如诊断工具或用作分析细胞内信号转导和运输途径的特异性抑制剂(James(2001)Curr.Opin.Pharmacol.1：540-546)。核苷酸适体的高亲和力和特异性使得它们成为药物开发的良好候选物。例如，蓖麻毒素的适体拮抗剂已经被分离并且具有纳摩尔范围内的IC50值(HesselberthJR等人(2000)JBiolChem275：4937-4942)。核苷酸适体还可用来抵抗感染性疾病、恶性肿瘤和病毒表面蛋白以减少细胞传染力。
如本文中对其它多核苷酸所描述的，用于本发明的方法中的核苷酸适体可以被修饰(例如通过修饰主链或碱基或者与肽轭合)。
使用LINGO-4的蛋白结构，使用SELEX过程筛选对LINGO-4起作用的适体将允许对抑制LINGO-4介导的过程的适体的鉴定。
用于本发明的方法中的多肽适体是根据它们与LINGO-4结合并从而阻断LINGO-4作用的能力所选择的随机肽。多肽适体可包括在两个末端与蛋白支架相连的短的可变肽结构域。这一双重的结构约束将肽适体的结合亲和力大大增加至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。参见例如Hoppe-SeylerF等人(2000)J.Mol.Med.78(8)：426-430。短的可变肽的长度通常为约10至20个氨基酸，而且支架可以是具有良好的溶解性和紧凑度特性的任何蛋白。支架蛋白的一个非限制性实例是细菌蛋白硫氧还蛋白-A。参见例如CohenBA等人(1998)PNAS95(24)：14272-14277。
多肽适体是作为蛋白功能的主要抑制剂起作用的肽或小多肽。肽适体与靶蛋白特异性地结合，阻断它们的功能能力(Kolonin等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95：14，266-14，271)。以高亲和力和特异性与靶蛋白结合的肽适体可通过本领域已知的多种技术来分离。可通过酵母双杂交筛选(Xu，C.W.等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：12，473-12，478)或通过核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942)从随机的肽文库中分离肽适体。还可从噬菌体文库(Hoogenboom，H.R.等人(1998)Immunotechnology4：1-20)或者化学生成的肽文库将它们分离。另外，多肽适体还可以使用配体调节的肽适体(LiRPA)的筛选来选择。参见例如BinkowskiBF等人，(2005)Chem&Biol12(7)：847-855，其通过引用并入本文。尽管合成肽适体的困难方法使得它们的使用比多核苷酸适体更加复杂，但是它们具有无限制的化学多样性。多核苷酸适体被限制是因为它们仅利用四种核苷酸碱基，而肽适体将具有大大扩展的所有组成成分(repertoire)(即20种氨基酸)。
如本文其他地方对其他多肽所描述的，用于本发明的方法中的肽适体可以被修饰(例如轭合至多聚体或融合至蛋白)。
载体和宿主细胞
宿主表达系统代表通过其产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的LINGO-4拮抗剂多肽或抗体的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。细菌细胞例如大肠杆菌或者真核细胞(例如用于完整重组抗体分子的表达)被用于重组抗体分子的表达。例如，与载体例如来自人类巨细胞病毒的主要的中间早期基因(intermediateearlygene)启动子元件联合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是有效的抗体表达系统(Foecking等人，Gene45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology8：2(1990))。
在细菌系统中，依赖于被表达的抗体分子的预期用途而有利地选择若干表达载体。例如，当为了产生抗体分子的药物组合物而将生产大量的这种蛋白时，指导高水平表达容易纯化的融合蛋白产物的载体是期望的。这种载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBOJ.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可分别在lacZ编码区的框内连接于载体以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，NucleicAcidsRes.13：3101-3109(1985)；VanHeeke&Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；以及诸如此类。pGEX载体还可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的并且可通过吸附和结合于基质谷胱甘肽-琼脂糖微珠之后在游离的谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计以包括凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶裂解位点以便可以从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)通常被用作载体以表达外源基因。病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。抗体编码序列被分别克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用若干基于病毒的表达系统。当腺病毒被用作表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可被连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后这一嵌合体基因可通过体外或体内重组被插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如区E1或E3)中的插入将产生有活力并且能够在被感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒。(参见例如Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359(1984))。插入的抗体编码序列的有效翻译还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。此外，起始密码子必须与所期望的编码序列的读码框同相(inphase)以确保整个插入物的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可具有各种天然和合成的来源。表达的效力可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高(参见，Bittner等人，MethodsinEnzymol.153：51-544(1987))。
此外，可选择调节插入的序列的表达或者以所期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对蛋白的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有对蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性的和特定的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确的修饰和加工。为此，可使用具有用于正确加工初级转录物和将基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38，以及特别是乳腺癌细胞系例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常的乳腺细胞系例如诸如CRL7030和Hs578Bst。
对于重组蛋白的长期的高产率的生产，通常使用稳定的表达。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被人工改造。不同于使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择的标记物来转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，可使人工改造的细胞在增菌培养基(enrichedmedia)中生长1-2天，而且之后将其转移至选择性培养基中。重组质粒中的可选择的标记物提供对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合至它们的染色体中并生长以形成病灶(foci)，其反过来可被克隆并扩展至细胞系中。可有利地使用这一方法以对稳定表达抗体分子的细胞系人工改造。
若干选择系统可被使用，其包括但不限于可分别用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell22：817(1980))基因。而且，抗代谢物抗性可被用作下列基因的选择基础：dhfr，其提供对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527(1981))；gpt，其提供对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072(1981))；neo，其提供对氨基糖苷G-418的抗性(ClinicalPharmacy12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIBTECH11(5)：155-215(1993年五月))；以及hygro，其提供对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30：147(1984))。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法被描述于Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学中的最新实验方案)，JohnWiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual(基因转移和表达的实验手册)，StocktonPress，NY(1990)；和Dracopoli等人(编辑)，CurrentProtocolsinHumanGenetics(人类遗传学中的最新实验方案)，JohnWiley&Sons，NY(1994)的第12和13章中；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用全文并入本文。
LINGO-4多肽或抗体的表达水平可通过载体扩增来增加(有关综述，参见Bebbington和Hentschel，TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloning(在DNA克隆中用于在哺乳动物细胞中表达克隆基因的以基因扩增为基础的载体的应用)，AcademicPress，NewYork，第3卷(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平的增加将增加标记物基因的拷贝数目。因为被扩增的区与抗体基因相关，抗体的产生也将增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
包含编码LINGO-4拮抗剂例如可溶性LINGO-4多肽、LINGO-4抗体、LINGO-4拮抗剂多核苷酸或LINGO-4适体的核酸在内的载体可用于产生本发明的方法中使用的拮抗剂。这些核酸可操作地连接的载体和表达控制序列的选择取决于所期望的功能特性，例如蛋白表达和有待转化的宿主细胞。
可用于调节可操作地连接的编码序列的表达的表达控制元件是本领域已知的。实例包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其他调节元件。当使用诱导型启动子时，它可通过例如宿主细胞培养基中营养状态上的变化或温度上的变化来控制。
载体可包括原核复制子，即具有在细菌宿主细胞中指导自主复制并且在染色体外维持重组DNA分子的能力的DNA序列。这种复制子是本领域中熟知的。此外，包括原核复制子的载体也可包括其表达赋予可检测的标记物例如药物抗性的基因。细菌药物抗性基因的实例是赋予对氨苄青霉素或四环素的抗性的那些基因。
包括原核复制子的载体也可包括在细菌宿主细胞中指导编码基因序列表达的原核或噬菌体启动子。与细菌宿主相容的启动子序列通常在包含用于插入待表达的DNA片段的方便的限制性位点的质粒载体中提供。这种质粒载体的实例是pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何适合的原核宿主可被用于表达编码在本发明的方法中使用的蛋白的重组DNA分子。
为了本发明的目的，可使用许多表达载体系统。例如，一个类型的载体利用衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他的包括具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，可通过引入允许对转染的宿主细胞进行选择的一个或多个标记物来选择已经将DNA整合至它们的染色体的细胞。标记物可为营养缺陷型宿主提供原营养，提供杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属例如铜的抗性。可选择的标记物基因可直接与待表达的DNA序列连接，或通过共转化被引入同一细胞。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是可选择的标记物基因的实例(Southern等人，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))。mRNA的最佳合成还可能需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方式中，可使用称为NEOSPLA(美国专利第6,159,730号)的由BiogenIDEC，Inc.拥有专利权的表达载体。该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现，当在CHO细胞中转染，之后在含有G418的培养基上选择和甲氨喋呤扩增时，该载体产生非常高水平的表达。当然，能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体可用于本发明。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，SanDiego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI获得)。另外的真核细胞表达载体是本领域已知的并且是商业上可得的。通常，这种载体包含用于插入所期望的DNA片段的方便的限制性位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pml2d(InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC31255)、逆转录病毒表达载体pMIG和pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315和AAV载体。其他示例性载体系统被公开于例如美国专利第6,413,777号中。
通常，筛选大量的表达适当高的水平的拮抗剂的转化细胞是可由例如机器人系统进行的常规实验。
经常使用的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，例如衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿病毒(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))的启动子和增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski，美国专利第5,168,062号；Bell，美国专利第4,510,245号；和Schaffner，美国专利第4,968,615号。
重组表达载体可携带在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和可选择的标记物基因。可选择的标记物基因有利于选择已将载体引入其中的宿主细胞(参见例如Axel，美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，通常可选择的标记物基因对已将载体引入其中的宿主细胞赋予对药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。常用的可选择的标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在具有氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
编码LINGO-4拮抗剂的载体可用于转化适当的宿主细胞。转化可以通过任何适合的方法。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞的方法是本领域中熟知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、在脂质体中对多核苷酸的封装和将DNA直接微注射至细胞核中。此外，核酸分子可通过病毒载体被引入哺乳动物细胞中。
用于表达本发明的方法中所使用的LINGO-4拮抗剂的宿主细胞可以是原核或真核的。示例性的真核宿主细胞包括但不限于酵母和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC登记号CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC登记号CRL1658)和幼仓鼠肾细胞(BHK)。其他有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞和植物细胞。示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌。
宿主细胞的转化可通过适于所使用的载体和宿主细胞的常规方法来完成。对于原核宿主细胞的转化，可使用电穿孔和盐处理法(Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞的转化，可使用电穿孔、阳离子脂质或盐处理法。参见例如Graham等人，Virology52：456-467(1973)；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：1373-76(1979)。
在某些实施方式中，用于蛋白表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的；相信本领域技术人员具有确定对于有待在其中表达的期望的基因产物来说最适合的特定的宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于NSO、SP2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如HepG2)、A549细胞DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系、DHFR阴性)、HELA(人类宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾细胞)。宿主细胞系通常可从商业服务美国典型培养物保藏中心或从发表的文献获得。
可使用已知的技术增强来自生产细胞系的多肽的表达。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统通常被用于在某些情况下增强表达。参见例如欧洲专利第0216846、0256055和0323997号和欧洲专利申请第89303964.4号。
基因治疗
可在哺乳动物例如人类患者体内使用治疗神经系统疾病、病症或损伤的基因治疗方法来产生LINGO-4拮抗剂，在所述神经系统疾病、病症或损伤中促进少突胶质细胞的存活、增殖和分化或促进神经元的髓鞘形成将是治疗上有益的。这包括施用编码适合的LINGO-4拮抗剂的、可操作地连接至适合的表达控制序列的核酸。通常这些序列被并入病毒载体中。适合于这种基因治疗的病毒载体包括腺病毒载体、α病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、埃巴病毒载体、乳多空载体病毒、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。病毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。通常使用在其E1基因或E3基因中有缺失的腺病毒载体。当使用腺病毒载体时，载体通常不具有可选择的标记物基因。
药物组合物
用于本发明的方法中的LINGO-4拮抗剂可配制成药物组合物以用于向哺乳动物包括人类施用。本发明的方法中使用的药物组合物包括药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的方法中使用的组合物可通过任何适合的方法来施用，例如胃肠外地、心室内地、口服地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、经鼻地、向颊地、阴道地或经由植入型药盒。本文使用的术语“胃肠外的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、病灶内的或颅内的注射或输注技术。如之前所描述的，本发明的方法中使用的LINGO-4拮抗剂在神经系统中起作用以促进少突胶质细胞的存活、增殖和分化以及神经元的髓鞘形成。因此，在本发明的某些方法中，LINGO-4拮抗剂以穿过血脑屏障的方式被施用。该穿过可源于LINGO-4拮抗剂分子本身固有的物理化学特性，源于药物制剂中的其他成分，或源于突破血脑屏障的机械装置例如针、插管或手术工具的使用。当LINGO-4拮抗剂是天生并不穿过血脑屏障的分子例如与促进所述穿过的部分形成的融合物之时，适当的施用途径是例如鞘内或颅内的，例如直接施用至MS的慢性损伤中。当LINGO-4拮抗剂是天生穿过血脑屏障的分子时，施用的途径可以是通过下文描述的各种途径中的一种或多种。
本发明的方法中使用的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油脂性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用适合的分散剂或增湿剂和悬浮剂来配制。无菌的可注射的制剂还可以是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液，例如溶于1，3-丁二醇中的悬浮液。可使用的可接受的介质和溶剂是水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的单-或双-甘油酯。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物作为天然的药学上可接受的油在可注射的制剂中是有用的，所述油例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油性溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常在药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的配制中所使用的相似的分散剂。也可为了配制的目的使用通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用的表面活性剂例如吐温、司盘(Span)和其他乳化剂或生物利用率增强剂。
胃肠外制剂可以是单一的团注(bolus)剂量、输注或加载的团注剂量，以及之后的维持剂量。这些组合物可以特定的固定的或可变的间隔例如每天一次或以“根据需要”为基础来施用。
本发明的方法中所使用的某些药物组合物可以以可接受的剂型包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液口服施用。某些药物组合物还可通过经鼻的气溶胶或吸入进行施用。使用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用率的吸收促进剂，和/或其他常规的增溶剂或分散剂，这种组合物可被配制为溶于盐水的溶液。
可与运载体材料组合以产生单一剂型的LINGO-4拮抗剂的量将根据被处理的宿主、所使用的拮抗剂的类型和施用的特定模式而变化。组合物可作为单一剂量、多重剂量或经过一段确定的时间的输注而施用。还可调整给药方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性或预防性应答)。
本发明的方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的LINGO-4拮抗剂。这种治疗有效量或预防有效量可根据因素例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重而变化。治疗有效量或预防有效量也是治疗上有益的作用超过任何有毒或有害作用的量。
用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，其包括所使用的特定的LINGO-4拮抗剂、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食以及施用的时间、排泄率、药物组合和被治疗的特定疾病的严重度。通过医疗看护者对这些因素的判断是在本领域普通技术的范围内的。量还将取决于待治疗的个体患者、施用途径、制剂类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重度和所期望的作用。所使用的量可通过本领域中熟知的药理学和药物代谢动力学原理来确定。
在本发明的方法中，通常向神经系统、脑室内或鞘内例如向MS的慢性损伤中直接施用LINGO-4拮抗剂。根据本发明的方法施用的组合物可被配制以施用每天0.001-10mg/kg体重的LINGO-4拮抗剂。在本发明的一些实施方式中，剂量是每天0.01-1.0mg/kg体重。在一些实施方式中，剂量是每天0.001-0.5mg/kg体重。
为了用LINGO-4拮抗剂抗体治疗，剂量的范围可例如从约0.0001至100mg/kg宿主体重，以及更通常地0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，例如至少1mg/kg。上述范围中的剂量中间值也意为在本发明的范围内。可每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间表对受治疗者施用这样的剂量。示例性的治疗要求以一段长时间例如至少六个月施用多次剂量。另外的示例性治疗方案要求每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。示例性的剂量时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下所施用的每种抗体的剂量落在所指示的范围内。
在某些实施方式中，可用编码LINGO-4拮抗剂多核苷酸的核酸分子处理受治疗者。核酸的剂量在每位患者中是在约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μgDNA的范围内。感染性病毒载体的剂量是每剂10-100或更多个病毒颗粒。
补充的活性化合物也可掺入本发明的方法中所使用的组合物。例如，可溶性LINGO-4多肽或融合蛋白可与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用。
本发明涵盖将LINGO-4拮抗剂递送至所选的靶组织的任何适合的方法，其包括含水溶液的团注或控制释放的系统的植入。控制释放的植入物的使用减少了对重复注射的需要。
本发明的方法中使用的LINGO-4拮抗剂可直接输注至脑中。用于化合物的直接脑部输注的各种植入物是已知的并且对于向患有神经病症的人类患者递送治疗性化合物是有效的。这些包括使用泵向脑的慢性输注、立体定向地(stereotactically)植入、短暂的间质导管、永久的颅内导管植入物和手术植入的可生物降解的植入物。参见例如Gill等人，如上文；Scharfen等人，“HighActivityIodine-125InterstitialImplantForGliomas(用于神经胶质瘤的高活性碘-125间质植入物)，”Int.J.RadiationOncologyBiol.Phys.24(4)：583-591(1992)；Gaspar等人，“Permanent125IImplantsforRecurrentMalignantGliomas(用于复发的恶性神经胶质瘤的永久性125I植入物)，”Int.J.RadiationOncologyBiol.Phys.43(5)：977-982(1999)；第66章，第577-580页，Bellezza等人，“StereotacticInterstitialBrachytherapy(立体定向的间质短程疗法)”在Gildenberg等人，TextbookofStereotacticandFunctionalNeurosurgery(立体定向和功能性神经外科教科书)，McGraw-Hill(1998)中；和Brem等人，“TheSafetyofInterstitialChemotherapywithBCNU-LoadedPolymerFollowedbyRadiationTherapyintheTreatmentofNewlyDiagnosedMalignantGliomas：PhaseITrial(新诊断的恶性神经胶质瘤的治疗中使用加载BCNU的聚合物的间质化学治疗和之后的放射治疗的安全性)，”J.Neuro-Oncology26：111-23(1995)。
组合物还可包含分散在作为化合物的适合的递送或支持系统的生物相容性载体物质中的LINGO-4拮抗剂。缓释载体的适合的实例包括成型的制品(例如栓剂或胶囊)形式的半透性聚合物基质。可植入的或微胶囊缓释的基质包括聚交酯(美国专利第3,773,319号；EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP133,988)。
在本发明的一些实施方式中，LINGO-4拮抗剂通过向脑的适合区域的直接输注而施用于患者。参见例如Gill等人，“Directbraininfusionofglialcellline-derivedneurotrophicfactorinParkinsondisease(帕金森病中神经胶质细胞系来源的神经营养因子的直接脑输注)，”NatureMed.9：589-95(2003)。替代技术是可得的并且可被应用以施用根据本发明的LINGO-4拮抗剂。例如，可使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来完成导管或植入物的立体定向放置。注射了120ml的欧乃派克(omnipaque)、350mg碘/ml，具有2mm的切片厚度的对比增强的计算机断层显影术(CT)扫描可允许三维的多面治疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该设备允许以磁共振成像研究为基础的计划，其为了清晰的靶确认而合并CT和MRI靶信息。
为了该目的，可使用为了与GECT扫描仪(GeneralElectricCompany，Milwaukee，WI)一起使用而修改的Leksell立体定向系统(DownsSurgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Well(BRW)立体定向系统(Radionics，Burlington，MA)。因此，在植入那天的早上，BRW立体定向框的环形基部环可被连接至患者的颅骨。连续的CT切片可以以3mm的间隔获得，尽管具有石墨棒定位框的(靶组织)区被固定至基部板。可在VAX11/780计算机(DigitalEquipmentCorporation，Maynard，Mass.)上运行计算机化的治疗计划程序，使用石墨棒成像的CT坐标而在CT空间和BRW空间之间作图。
为了期望的治疗或预防活性，在用于人类之前，如本文所描述的脱髓鞘或髓鞘形成障碍病症的治疗方法通常被体外检测，而然后在可接受的动物模型中进行体内检测。适合的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员熟知的。例如，证实LINGO-4拮抗剂的分化和存活作用的体外测定被描述于本文。LINGO-4拮抗剂对轴突的髓鞘形成的作用可如实施例中所述进行体外检测。最后，可通过产生表达LINGO-4拮抗剂的转基因小鼠或通过向本文描述的模型中的小鼠或大鼠施用LINGO-4拮抗剂来进行体内检测。
具体实施方式
实施例1
LINGO-4在中枢神经系统中高度表达
少突胶质细胞的成熟经历多个发育阶段，从A2B5祖细胞(其表达A2B5)分化为髓鞘前少突胶质细胞(其表达O1和O4)，并最终分化为成熟的髓鞘形成少突胶质细胞(其表达O1、O4和MBP)。因此，通过监测A2B5、O1、O4和MBP标记物的存在和不存在，确定给定细胞的发育阶段并评价LINGO-4-Fc在少突胶质细胞生物学中的作用是可能的。对于少突胶质细胞生物学的一般综述，参见例如Baumann和Pham-Dinh，Physiol.Rev.81：871-927(2001)。
LINGO-4在小鼠组织中的表达通过定量PCR(Q-PCR)测定由以下方法来评价。对来自小鼠总RNAMasterPanel(Clonetech)的组织mRNA进行TaqmanRT-PCR(如Mi等人，NatureNeuroscience7：221-228(2004)所述的进行)来定量LINGO-4mRNA的水平，其使用正向引物5’-GAGCCTGGTTGGCCTCAA-3’(SEQIDNO：21)、反向引物5’-GCAGTGCTTGGAAGGGTACT-3’(SEQIDNO：22)和FAB标记的探针5’-CAGCCTGGCTATCACC-3’(SEQIDNO：23)。使用PrimerExpressv1.0(AppliedBiosystems)设计引物和FAB标记的探针。
通过首先将组织中LINGO-4mRNA水平对同一组织中肌动蛋白mRNA水平进行标准化，确定相对LINGO-4表达水平。然后，通过比较每个组织中标准化的LINGO-4mRNA水平与眼中标准化的表达水平(其被指定的值为1)来确定相对LINGO-4mRNA水平。相对LINGO-4表达水平被显示在图1中。LINGO-4在脑和脊髓中表达到最大水平。心脏、子宫、脾脏、胃、肾脏、眼、唾液腺、肝脏和淋巴结中的表达水平是可检测的，但比脑和脊髓中的较少。
实施例2
人类LINGO-4与人类LINGO-1同源
比对和比较了四种人类LINGO旁系同源物的氨基酸序列。参见图2。LINGO-1和各种其它人类旁系同源物之间的相似性和同一性百分比在下表2中显示。虽然hLINGO-1与hLINGO-2是最紧密相关的，但hLINGO-1与hLINGO-4具有显著的相似性和同一性。
表2：人类LINGO-1氨基酸序列与其它LINGO旁系同源物的比较。
h LINGO-1相对于 相似性百分比 同一性百分比
hLINGO-2 70.4％ 60.7％
hLINGO-3 66.4％ 55.4％
hLINGO-4 52.1％ 44.3％
实施例3
LINGO-4在脊髓中特异性地表达
使用实施例1中所述的方法，通过定量PCR(Q-PCR)检查各种小鼠组织的LINGO-4表达，并与LINGO-1、LINGO-2和LINGO-3相比较。首先将LINGO-1、LINGO-2、LINGO-3和LINGO-4mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA进行标准化。在这些实验中，通过与小鼠通用参照总RNA(Clonetech)中的mRNA水平(其被指定的值为1)相比较，确定了LINGO-1、LINGO-2、LINGO-3和LINGO-4mRNA的相对表达。
使用以下引物对儿测定了LINGO表达水平：
LINGO-4：与实施例1所述相同的引物。
LINGO-1：5’PCR引物
-5’-CTTTCCCCTTCGACATCAAGAC-3’(SEQIDNO：24)；
3’PCR引物-5’-CAGCAGCACCAGGCAGAA-3’(SEQIDNO：25)；和
FAM标记的探针
5’-ATCGCCACCACCATGGGCTTCAT-3’(SEQIDNO：26)。
LINGO-2：5’PCR引物
-5’-ACCTTGTATACCTGACCCACCTTAA-3’(SEQIDNO：27)；
3’PCR引物
-5’-AGAGAACATGCCAGCTTCAATAGTG-3’(SEQIDNO：28)；和
FAM标记的探针5’-CCTCTCCTACAATCCC-3’(SEQIDNO：29)。
LINGO-3：5’PCR引物-5’-CGCGGCTCCTTCAGAGA-3’(SEQIDNO：30)；
3’PCR引物-5’-GGCTCCTGCTAGGTGCA-3’(SEQIDNO：31)；和
FAM标记的探针5’-CTGGTGCGCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：32)。
检测的11种组织类型中，LINGO-4在成年和P6小鼠组织的脊髓中显示最高水平的表达。LINGO-1、LINGO-2、LINGO-3和LINGO-4的相对表达结果显示在图3(成年组织)和图4(P6组织)中。
实施例4
制备LINGO-4表达构建物
LINGO-4FL和DN慢病毒载体的构建
通常根据Mi等人，NatNeurosci.8：745-51(2005)(其通过引用全文并入本文)所述的方法，我们构建了表达野生型和显性阴性形式的LINGO-4的慢病毒载体。简单地说，使用以下引物，通过PCR从人类脑cDNA(Clontech)扩增了编码人类全长LINGO-4(FL-LINGO-4)、氨基酸残基1-593(SEQIDNO：2的)的DNA序列：
5’PCR引物：
5’-TTTTTGCGGCCGCCACCATGGATGCAGCCACAGCTCCAAAGCAAGCC-3’(SEQIDNO：33)
3’PCR引物：
5’-TTTTTGCGGCCGCTCAGAAGAGCTTGGCAGTGACCCGGTTACCCCCAG-3’(SEQIDNO：34)。
将FL-LINGO-4PCR产物克隆到pCR4bluntTOPO载体(Invitrogen)中。所得的FL-LINGO-4克隆被称作pJST1011，并且确认了插入物和侧翼载体的DNA序列。
对FL-LINGO-4克隆pJST1011进行位点定向诱变以在预测的信号序列(氨基酸1-29)之后和预测的LINGO-4胞外结构域(氨基酸30-535)之前插入HA表位标签，其使用正向PCR引物-5’-CTCCTCCTACCTGGAGGGAGCGGTGGCTACCCTTACGACGTCCCTGATTACGCTAGCTGCCCTGCTGTGTGTGACTGCACCTCCCAGC-3’(SEQIDNO：35)和反向PCR引物-5’-GCTGGGAGGTGCAGTCACACACAGCAGGGCAGCTAGCGTAATCAGGGACGTCGTAAGGGTAGCCACCGCTCCCTCCAGGTAGGAGGAG-3’(SEQIDNO：36)。所得的编码HA-FL-LINGO-4的质粒被称作pJST1037，并且确认了它的DNA序列。作为NotI片段分离了pJST1037的HA-FL-LINGO-4编码序列，并将其亚克隆到相似地消化的慢病毒载体HRST-IRESeGFP以产生pJST1040。
由PCR从pJST1037扩增了编码HA标签的显性阴性LINGO-4蛋白HA-DN-LINGO-4、编码HA标签的全长LINGO-4(HA-FL-LINGO-4)的氨基酸1-571的基因，其使用以下引物：
5’PCR引物-5’-AGGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQIDNO：37)；和
3’PCR引物
-5’-TTTTTGCGGCCGCTCAACCTTTGCCCTTGCTCCAAAGGGCAATCAGG-3’(SEQIDNO：38)。
用NotI消化了所得的PCR片段并将其克隆到相似地消化的慢病毒载体HRST-IRESeGFP中。所得的质粒被称作pJST1043，并且证实了HA-DN-LINGO-4插入物和侧翼载体序列的DNA序列。
将编码HA-FL-LINGO-4(pJST1040)和HA-DN-LINGO-4(pJST1043)的慢病毒载体转染到293细胞中以产生慢病毒，如Rubinson等人，“Alentivirus-basedsystemtofunctionallysilencegenesinprimarymammaliancells，stemcellsandtransgenicmicebyRNAinterference(在原代哺乳动物细胞、干细胞和转基因小鼠中通过RNA干涉而在功能上将基因沉默的基于慢病毒的系统)”Nat.Genet.33：401-06(2003)所述。
LINGO-4-Fc融合蛋白的构建和纯化
将人类LINGO-4(残基1-535)的胞外部分融合到人类IgG1的铰链和Fc区制备构建物以研究LINGO-4的生物功能。人类LINGO-4胞外结构域的部分编码序列是使用人类全长LINGO-4克隆pJST1011作为模板通过PCR获得的，其正向引物是5’-AGGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQIDNO：39)而反向引物是5’-AAAAAGGTCGACCATGGCCACACCTCTGCTATCCAG-3’(SEQIDNO：40)。
用NotI(5’)和SalI(3’)消化了编码LINGO-4胞外结构域的PCR产物，并与编码IgG1铰链和Fc的SalI(5’)至BamHI(3’)DNA盒一起克隆到载体pNE001(BiogenIdec)中以产生pJST1064。确定了pJST1064中插入物的DNA序列并证实为编码符合人类IgG1的铰链和Fc区的读码框的LINGO-4信号序列和胞外结构域(氨基酸1至535)。将包含LINGO-4-Fc片段的pJST1064NotI片段亚克隆到CHO表达载体PV90(BiogenIdec)的单个NotI克隆位点。通过DNA测序确认了所得的质粒，并将其称为pJST1084。
表达LINGO-4-Fc融合蛋白的稳定细胞系通过用质粒pJST1084电穿孔CHO宿主细胞DG44而产生。将转染的CHO细胞培养在存在10％透析血清和4mM谷氨酰胺的α-MEM中以筛选核苷不相关的生长。转染十四天后，用新鲜培养基供养细胞。为了筛选表达LENGO-4-Fc的细胞，用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人类IgG(JacksonLabs)标记CHO细胞，并在FACSMo-Flo(Cytomation)中对其进行高速流式细胞分选。选择了表达最高水平LINGO-4-Fc的细胞。将这些细胞扩大培养7天，然后重新标记并重新分选。将表达最高水平LINGO-4-Fc的细胞在96孔板中分离为单独克隆。将这些克隆培养两周，然后在FACS分析检查表达水平之前一天用新鲜培养基供养。将表达最高水平LINGO-4-Fc的克隆扩大，并且建立冷冻的细胞库。使细胞系适于在无血清培养基BCM16中悬浮培养地生长。这些克隆产生的LINGO-4-Fc的滴度如下确定：通过在37℃培养细胞系4-5代，随后培养细胞到50％最大细胞密度，并在28℃培养10-15天直到活细胞密度下降到75％。此时收集培养基，通过离心清除细胞和碎片，并使用抗人类Ig抗体(JacksonLab)作为探针通过蛋白质印迹分析滴定培养物上清液中的LINGO-4-Fc水平。
从澄清的培养基如下纯化LINGO-4-Fc融合蛋白：将9ml的1M的HEPESpH7.5加入到900ml的条件培养基。在4℃将培养基批次上样到3ml蛋白A琼脂糖(AmershamBioscience)3hr。将树脂收集到1.5cm(I.D.)柱，并用3mlPBS洗涤四次，用含800mMNaCl的4mlPBS洗涤两次，然后再用3mlPBS洗涤。用1.5ml级份中的25mMNaH2PO4pH2.8和100mMNaCl从柱中洗脱LINGO-4-Fc，并通过加入75μl的0.5MNaH2PO4pH8.6来中和。以在280nm的吸光度鉴定含有峰蛋白的级份，将其汇集，并在1mL蛋白A的柱上进一步纯化。上样前，将NaCl加至600mM，并将HEPESpH7.5加至50mM。用600μl的10mMHEPESpH7.5和1MNaCl将柱洗涤两次，然后用1mlPBS洗涤。用25mMNaH2PO4pH2.8和100mMNaCl从柱洗脱LINGO-4-Fc，收集0.5mL级份，并通过加入25μl0.5MNaH2PO4pH8.6来中和。以在280nm的吸光度鉴定含有峰蛋白的级份并将其汇集。将纯化的LINGO-4-Fc蛋白分等份并贮存在-70℃。
实施例5
显性阴性LINGO-4促进少突胶质细胞分化
从雌性朗依凡氏(LongEvans)P2大鼠生长少突胶质细胞的富集群体，如Conn，Meth.Neurosci.2：1-4(AcademicPress；1990)所述并如下修改。简单地说，解剖前脑并放入汉克氏缓冲盐溶液(HBSS；Invitrogen)中。将组织切成1-mm片段并在37℃下在0.01％胰蛋白酶和10μg/mlDNase中孵化15min。将解离的细胞铺板在聚-L-赖氨酸-涂布的T75组织培养烧瓶中，并在37℃下在含有20％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中生长10天。通过在37℃下以200rpm摇动烧瓶过夜来收集少突胶质细胞前体(A2B5+)，获得95％纯的群体。将培养物保持在含有FGF/PDGF(10ng/ml；Peprotech)的高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中1周。除去FGF/PDGF允许A2B5+细胞在3-7天后分化为O4+髓鞘形成前少突胶质细胞，并在7-10天后分化为O4+和MBP+成熟少突胶质细胞。用慢病毒以2MOI/细胞感染少突胶质细胞，并通过Western印迹确认FL-LINGO-4和DN-LINGO-4的过表达(数据未显示)。
A2B5少突胶质细胞的分化由Western印迹测量，其使用针对少突胶质细胞分化标记物髓鞘质碱性蛋白(MBP)的抗体。用抗LINGO-1单克隆抗体1A7(描述在国际PCT公布WO2007/008547、美国专利申请第2006/0009388号和Mi等人，NatureMedicine13，1228-1233(2007)中，其各自通过引用全文并入本文)和无关的小鼠IgGMOPC21(可从ProtosImmunoresearch(SanFrancisco，CA)获得)处理的未感染的少突胶质细胞分别被用作阳性对照和阴性对照。LINGO-4慢病毒表达HA标签，其被用作慢病毒感染的细胞的表达水平对照。如图5所示，DN-LINGO-4的过表达促进了少突胶质细胞分化，如髓鞘质碱性蛋白(MBP)表达的增加所表示的。与此相反，全长LINGO-4的过表达具有相反作用并抑制分化，如由MBP表达的减少所表明的。该研究表示，显性阴性LINGO-4蛋白在少突胶质细胞中的表达促进少突胶质细胞分化。
在类似实验中，用hLINGO-4Fc蛋白处理未感染的A2B5少突胶质细胞。通过Western印迹测量少突胶质细胞分化，其使用针对少突胶质细胞分化标记物髓鞘质碱性蛋白(MBP)的抗体以及针对另一少突胶质细胞分化标记物髓鞘质-少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的抗体。如上述的LINGO-4FL和LINGO-4DN慢病毒感染的少突胶质细胞以及LINGO-1FL和LINGO-1DN慢病毒感染的少突胶质细胞(描述在美国公布的申请第2007/0059793号中，其通过引用全文并入本文)被用作对照。如图6所示，用hLINGO-4Fc的处理以及LINGO-1DN或LINGO-4DN的过表达促进了少突胶质细胞分化，如由MBP和MOG的表达增加所示的。与此相反，全长LINGO-1或全长LINGO-4的过表达具有相反作用并抑制分化，如由缺乏MBP或MOG表达所明示的。该研究表明，外源LINGO-4-Fc蛋白的处理促进少突胶质细胞分化。
实施例6
LINGO-4-Fc促进共同培养物中少突胶质细胞的髓鞘形成
在体外检查了LINGO-4在髓鞘形成中的作用，其通过用LINGO-4FL和LINGO-4DN感染背根神经节(DRG)神经元和少突胶质细胞的共同培养物，并通过Western印迹分析来检测髓鞘形成。对于这些研究，必须首先产生DRG神经元和少突胶质细胞的原代培养物。
雌性朗依凡氏(LongEvans)大鼠E14-E17的胚胎背根神经节如Plant等人，J.Neurosci.22：6083-91(2002)中所述进行培养。将解剖的DRG铺板在聚-L-赖氨酸涂布的盖玻片(100μg/ml)上2周，其在第2-6天和第8-11天是在氟脱氧尿苷的存在下在含有1×B27、100ng/mlNGF(Invitrogen)的NLA培养基中的。
A2B5+少突胶质细胞如Mi等人，NatureNeuroscience7：221-228(2004)中所述制备，并通过胰蛋白酶消化来收集。
对于共同培养物的研究，将用如实施例4中所述制备的LINGO-4FL或LINGO-4DN慢病毒感染的A2B5+少突胶质细胞加入到DRG神经元悬滴培养物中。还在1A7或MOPC21抗体存在下制备对照共同培养物以分别作为阳性对照和阴性对照。每3天更换培养基(补充B27和100ng/mlNGF的神经基质培养基)，并持续两周。Western印迹分析证明，髓鞘质主要蛋白成分MBP的表达在LINGO-4-Fc处理的培养物中增加(图7)。DN-LINGO-4的表达或1A7的处理导致DRG髓鞘形成，如由MBP表达所证实的。与此相反，FL-LINGO-4的过表达阻断了MBP的表达。培养物中FL-LINGO-4和DN-LINGO-4蛋白的表达由Western印迹所证实(数据未显示)。这些研究进一步表明，FLLINGO-4的表达抑制髓鞘形成而且DNLINGO-4的表达可逆转该抑制。
实施例7
LINGO-4-Fc促进体内少突胶质细胞存活和髓鞘形成
对成年野生型C57B1/6雄性小鼠喂食铜宗(cuprizone)(以0.2％重量比与磨碎的小鼠食物一起研磨)6周以引起胼胝体中的脱髓鞘。在喂食铜宗的第2、2.5和3周，将LINGO-4-Fc立体定向地注射到脱髓鞘的胼胝体中。向对照小鼠以同样间隔立体定向地注射不含LINGO-4-Fc的无菌培养基。喂食铜宗6周后，将小鼠返回到正常饮食2、4和6周(仅磨碎的小鼠食物)以允许髓鞘再生。
用氯胺酮(80mg/kg体重)和赛拉嗪(10mg/kg体重)麻醉铜宗处理的小鼠，并将其放置在为立体定向手术而设计的固定装置中(DavidKopfInstruments)。打开头皮，用10mlHamilton注射器使用在前囟点后部0.7mm和侧面0.3mm的立体定向坐标以1.7mm的深度向野生型受者小鼠的急性脱髓鞘的胼胝体单侧注射无菌化合物(1mlHBSS中1μM)(Messier等人，Pharmacol.Biochem.Behav.63(2)：313-18(1999))。此外，向对照受者小鼠立体定向地注射不含化合物的HBSS。用明胶海绵填充头骨上的开口，并用青霉素和链霉素(Gibco)擦拭该部位并缝合伤口。注射后，在实验的每周处死小鼠，并取出它们的脑并为了分子、生化和组织学分析而进行加工。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图解说明和实施例的方式相当详细地描述了本发明，但对于本领域普通技术人员来说，在不背离所附权利要求书的主旨和范围的情况下，明显地可以根据本发明的教导进行某些变化和修改。
说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个单独出版物或专利申请被具体和单独地指明而通过引用并入本文的程度是一样的。

Claims (8)

1.一种包含用于促进少突胶质细胞分化或存活的LINGO-4拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-4拮抗剂是由SEQIDNO：2的氨基酸30-535组成的可溶性LINGO-4多肽，其被任选地融合到非LINGO-4部分，
其中所述非LINGO-4部分选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向多肽、报道子多肽、促纯化多肽、任何所述多肽的片段、聚亚烷基二醇、糖类聚合物和两种或更多种所述非LINGO-4部分的组合所组成的组。
2.一种包含用于促进神经元髓鞘形成或预防神经元脱髓鞘的LINGO-4拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-4拮抗剂是由SEQIDNO：2的氨基酸30-535组成的可溶性LINGO-4多肽，其被任选地融合到非LINGO-4部分，
其中所述非LINGO-4部分选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向多肽、报道子多肽、促纯化多肽、任何所述多肽的片段、聚亚烷基二醇、糖类聚合物和两种或更多种所述非LINGO-4部分的组合所组成的组。
3.根据权利要求1或2中所述的组合物，其中所述可溶性LINGO-4多肽是环状肽。
4.根据权利要求3中所述的组合物，其中所述环状多肽包括连接在N-末端的生物素分子或乙酰化的半胱氨酸和连接在C-末端的半胱氨酸分子；其中所述生物素分子或所述乙酰化的半胱氨酸分子与所述半胱氨酸分子彼此连接形成所述环状分子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物在制备用于治疗多发性硬化症的药物中的用途。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物被配制为通过快速浓注或慢性输注施用，任选地直接施用到中枢神经系统。
7.一种促进少突胶质细胞分化或存活的体外方法，包括使少突胶质细胞接触包含LINGO-4拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-4拮抗剂是由SEQIDNO：2的氨基酸30-535组成的可溶性LINGO-4多肽，其被任选地融合到非LINGO-4部分，其中所述非LINGO-4部分选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向多肽、报道子多肽、促纯化多肽、任何所述多肽的片段、聚亚烷基二醇、糖类聚合物和两种或更多种所述非LINGO-4部分的组合所组成的组。
8.一种促进神经元髓鞘形成或预防神经元脱髓鞘的体外方法，包括使神经元与少突胶质细胞的混合物接触包含LINGO-4拮抗剂的组合物，其中所述LINGO-4拮抗剂是由SEQIDNO：2的氨基酸30-535组成的可溶性LINGO-4多肽，其被任选地融合到非LINGO-4部分，
其中所述非LINGO-4部分选自由免疫球蛋白、血清白蛋白、靶向多肽、报道子多肽、促纯化多肽、任何所述多肽的片段、聚亚烷基二醇、糖类聚合物和两种或更多种所述非LINGO-4部分的组合所组成的组。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS54160B1 (sr) 2003-03-19 2015-12-31 Biogen Idec Ma Inc. Protein koji se vezuje za nogo receptor
CA2572193A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving oligodendrocytes with sp35 based agents
EP2238986A3 (en) 2005-07-08 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
NZ568705A (en) * 2005-11-04 2012-07-27 Biogen Idec Inc Methods for promoting neurite outgrowth and survival of dopaminergic neurons
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
CN101980603A (zh) * 2007-10-11 2011-02-23 比奥根艾迪克Ma公司 LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
FR2958293B1 (fr) 2010-04-01 2014-09-26 Centre Nat Rech Scient Outils pour l'identification de ligands de lingo-1,lingo-2, lingo-3 et lingo-4, et utilisations
EP2447378B1 (en) * 2010-10-29 2017-06-21 ARKRAY, Inc. Probe for detection of polymorphism in EGFR gene, amplification primer, and use thereof
JP2015518829A (ja) * 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト
CA2973266A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biogen Ma Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
US10118904B2 (en) 2015-06-05 2018-11-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of Demyelinating Diseases
US20170135969A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Jds Therapeutics, Llc Topical arginine-silicate-inositol for wound healing
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3506895A4 (en) 2016-09-01 2020-04-15 JDS Therapeutics, LLC MAGNESIUM BIOTINATE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136006A1 (en) * 2005-05-16 2006-12-28 Mcgill University Lgi, lingo and p75ntr family members: novel modulators of neuronal growth
WO2007092370A3 (en) * 2006-02-03 2007-12-13 Wyeth Corp Lingo-1 structure

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) * 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5179017A (en) * 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) * 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6054561A (en) * 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
GB8601597D0 (en) * 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5892019A (en) * 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5413923A (en) * 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5180820A (en) * 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5780225A (en) * 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5532351A (en) * 1990-07-12 1996-07-02 Arch Development Corporation Nucleic acid sequences encoding OMGP
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1995014930A1 (en) * 1993-11-23 1995-06-01 Genentech, Inc. Kinase receptor activation assay
US5877016A (en) * 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
DE4415539C2 (de) * 1994-05-03 1996-08-01 Osama Dr Dr Med Omer Pflanzen mit virustatischer und antiviraler Wirkung
US5516637A (en) * 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
EP0790246B1 (en) * 1994-10-25 2002-01-16 Toyama Chemical Co., Ltd. Potentiator for nerve growth factor activity containing 1,2-ethanediol derivative or salt thereof
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
JP2978435B2 (ja) * 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
NZ333325A (en) * 1996-07-12 2000-06-23 Genentech Inc Recombinant chimeric heteromultimer adhesins comprising extracellular domains of ErbB receptors
SK1499A3 (en) * 1996-07-19 1999-08-06 Amgen Inc Analogs of cationic proteins
EP0931159A2 (en) * 1996-09-11 1999-07-28 The General Hospital Corporation Non-mammalian dna virus having an altered coat protein
US6420140B1 (en) * 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US20070213290A1 (en) * 1996-10-17 2007-09-13 Kingsman Alan J Neurite regeneration
US6593290B1 (en) * 1996-11-01 2003-07-15 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
EP0981637B1 (en) * 1997-03-14 2005-05-25 Biogen Idec Inc. Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1205546B1 (en) * 1997-10-24 2005-11-23 Genentech, Inc. Polypeptide and nucleic acids encoding the same
US7282482B2 (en) * 1998-04-08 2007-10-16 The Regents Of The University Of California NGF for the prevention of demyelination in the nervous system
US7034132B2 (en) * 2001-06-04 2006-04-25 Anderson David W Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040067490A1 (en) * 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
JP4387625B2 (ja) * 1999-07-02 2009-12-16 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２に結合する化合物
AU6181200A (en) * 1999-07-29 2001-02-19 Helix Research Institute Stomach cancer-associated gene
US6680209B1 (en) * 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
US6977723B2 (en) * 2000-01-07 2005-12-20 Transform Pharmaceuticals, Inc. Apparatus and method for high-throughput preparation and spectroscopic classification and characterization of compositions
US7119165B2 (en) * 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
ES2273849T3 (es) * 2000-01-18 2007-05-16 Mcgill University Composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos ciclicos peptidometicos con giro beta.
NZ521540A (en) * 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001266787A1 (en) * 2000-06-07 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US7223558B2 (en) * 2001-07-11 2007-05-29 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding three novel human cell surface proteins with leucine rich repeats and immunologobulin folds, BGS2, 3, and 4 and variants thereof
US20050123990A1 (en) * 2001-09-26 2005-06-09 Incyte Corporation Membrane associated proteins
US7309485B2 (en) * 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
EP1504099A4 (en) * 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
CA2481074A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Amgen Inc. Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors
US6919426B2 (en) * 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US7816497B2 (en) * 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
RS54160B1 (sr) * 2003-03-19 2015-12-31 Biogen Idec Ma Inc. Protein koji se vezuje za nogo receptor
US7205387B2 (en) * 2003-08-28 2007-04-17 Agency For Science, Technology And Research Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist
AU2005232657B2 (en) * 2004-04-08 2010-12-16 David B. Agus ErbB antagonists for pain therapy
US8353896B2 (en) * 2004-04-19 2013-01-15 The Invention Science Fund I, Llc Controllable release nasal system
CA2572193A1 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving oligodendrocytes with sp35 based agents
US20060009288A1 (en) * 2004-07-07 2006-01-12 Devos John A Conveying information to an interrogator using resonant and parasitic radio frequency circuits
US7846438B2 (en) * 2004-08-03 2010-12-07 Biogen Idec Ma Inc. Methods of promoting neurite outgrowth with soluble TAJ polypeptides
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AR054260A1 (es) * 2005-04-26 2007-06-13 Rinat Neuroscience Corp Metodos de tratamiento de enfermedades de la neurona motora inferior y composiciones utilizadas en los mismos
AU2006255101A1 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Wyeth Anti-TrkB monoclonal antibodies and uses thereof
JP5461009B2 (ja) * 2005-06-08 2014-04-02 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 非ペプチド及びペプチドｂｄｎｆニューロトロフィン類似体を用いた神経細胞生存促進法
EP2238986A3 (en) * 2005-07-08 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007050866A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Biogen Idec Ma Inc. Oligodendrocyte-myelin glycoprotein compositions and methods of use thereof
NZ598421A (en) * 2005-12-02 2013-11-29 Biogen Idec Inc Treatment of Conditions Involving Demyelination
WO2008013782A2 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Biogen Idec Ma Inc. Methods for promoting myelination, neuronal survival and oligodendrocyte differentiation via administration of sp35 or trka antagonists
ES2363622T3 (es) * 2006-11-17 2011-08-10 Novartis Ag Moléculas de enlace de lingo y el uso farmacéutico de estas.
US8128926B2 (en) * 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
DK2732823T3 (da) * 2008-06-25 2019-09-16 H Lundbeck As Modulering af TrpV : Vps10p-domæne-receptorsystemet til behandlingen af smerte
AU2009269099B2 (en) * 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
CA3153682A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Veracyte, Inc. Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
JP5289986B2 (ja) * 2009-01-20 2013-09-11 株式会社オーディオテクニカ 赤外線送信機

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136006A1 (en) * 2005-05-16 2006-12-28 Mcgill University Lgi, lingo and p75ntr family members: novel modulators of neuronal growth
WO2007092370A3 (en) * 2006-02-03 2007-12-13 Wyeth Corp Lingo-1 structure

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sha Mi ect.al.Lingo-1 negatively regulates myelination by oligodendrocytes.《nature neuroscience》.2005,745-751. *

Also Published As

Publication number Publication date
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