CN101980603A - LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途 - Google Patents

LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元存活和再生的方法。此外，本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂治疗压力诱导的视神经病变的方法。本发明还通常涉及使用LINGO-1拮抗剂增加TrkB活性并抑制JNK通路信号转导的方法。

Description

LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途
技术领域
本发明涉及神经学、神经生物学、分子生物学和药理学。更特别地，本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元存活和再生的方法。此外，本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂治疗压力诱导的视神经病变的方法。本发明还通常涉及使用LINGO-1拮抗剂增加TrkB活性并抑制JNK通路信号转导的方法。 
背景技术
视神经病变是包括各种临床表现和病因的一组眼部疾病。青光眼是示例性的视神经病变，其包括在视神经上的病理变化，视神经乳头盘(optic disk)可见以及相应的视野减小，如果不治疗会导致失明。青光眼与眼内压增加有关，但也涉及其他因素。 
目前对青光眼的治疗旨在减少眼内压。医学治疗包括减少眼内液的产生或增加眼内液的流出的局部眼用滴剂或口服药物。然而对于青光眼的这些药物治疗有时伴随显著的副作用，例如头痛、视觉模糊、变应性反应、由心肺并发症导致的死亡以及与其他药物的可能的相互作用。也使用手术治疗，但是它们也具有许多缺点以及并不大的成功率。 
因此，有对另外的用于压力引起的视神经病变(包括青光眼和由视网膜神经节细胞(RGC)的变性表征的其他病况)的治疗方法的需求。 
发明简述 
本发明是以神经元中LINGO-1与TrkB相互作用并抑制TrkB的发现为基础的。眼内高压后，TrkB配体脑源性神经营养因子(BDNF)被上调。BDNF促进TrkB磷酸化和细胞存活信号转导通路的活化。然而在眼内高压后，LINGO-1也被上调。本文所描述的实验使用LINGO-1拮抗剂以显示LINGO-1抑制TrkB的磷酸化和活化，由此抑制细胞存活信号转导通路。本文描述的实验还显示LINGO-1促进与细胞死亡有关的JNK信号转导通路的活性。因此LINGO-1的拮抗剂和TrkB的激动剂促进细胞存活。 
以这些发现为基础，本发明通常涉及通过施用LINGO-1拮抗剂抑制LINGO-1-TrkB相互作用的方法。本发明还涉及通过施用LINGO-1拮抗剂促进TrkB磷酸化和TrkB信号转导的方法以及抑制JNK磷酸化和JNK信号转导的方法。而且，本发明涉及通过施用LINGO-1拮抗剂促进视网膜神经节细胞存活或者治疗压力诱导的视神经病变的方法。此外，本发明涉及通过施用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元细胞存活的方法。在某些实施方式中，本发明涉及通过施用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂治疗与神经元细胞死亡相关的病况的方法。 
在某些实施方式中，本发明包括抑制细胞中LINGO-1和TrkB相互作用的方法，其包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。在其他的实施方式中，本发明包括促进细胞中TrkB磷酸化或TrkB通路信号转导的方法，其包括将共表达 LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。在某些其他的实施方式中，本发明包括促进TrkB磷酸化的方法，其包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。 
在某些实施方式中，本发明包括促进细胞中JNK磷酸化的方法，其包括将表达LINGO-1和JNK的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。在其他实施方式中，本发明提供抑制JNK磷酸化的方法，其包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。 
在某些实施方式中，本发明包括促进处于死亡危险的神经元存活的方法，其包括将神经元与有效量的INGO-1拮抗剂和TrkB激动剂接触。 
在其他的实施方式中，本发明包括促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中视网膜神经节细胞存活的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和载体。本发明还包括治疗与神经元细胞死亡相关的疾病或病症的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂。在一些实施方式中，哺乳动物已经被确诊为青光眼。 
在上文的方法的不同实施方式中，TrkB激动剂可以是增加TrkB促进神经元存活的能力的任何分子。在某些实施方式中，TrkB激动剂选自由TrkB激动剂化合物、TrkB激动剂多肽、TrkB激动剂抗体或其片段、TrkB激动剂多核苷酸、TrkB适体或者两种或更多种TrkB激动剂的组合所组成的组。 
在某些实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂化合物。本发明的某些TrkB激动剂化合物包括但不限于L-783,281腺苷和CGS21680。此外，TrkB激动剂化合物可以是模拟神经营养蛋白的决定 性区域的小分子。例如，小分子可决定性地为BDNFβ-转角环(β-turn loop)的模拟物。可根据本发明使用的小分子模拟物的特定的实例公开于美国公开申请第2007/0060526A1号，其通过引用全文引入本文。 
在某些实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂多肽。本发明的某些TrkB激动剂多肽包括但不限于BDNF、NT-3和NT-4/5。在某些实施方式中，TrkB激动剂多肽包含SEQ ID NO：4。在一些实施方式中，TrkB激动剂是包含非TrkB-激动剂异源多肽或聚合物的融合多肽或轭合物。在一些实施方式中，非TrkB-激动剂多肽或聚合物选自由聚乙二醇、1-酰基-甘油衍生物和抗体Ig肽、血清白蛋白肽、靶向肽、报告肽和促进纯化的肽所组成的组。在一些实施方式中，抗体Ig肽是铰链和Fc肽。 
在可选择的实施方式中，TrkB激动剂是与TrkB多肽结合的抗体或其片段。本发明的方法中使用的TrkB激动剂抗体包括但不限于6E2、7F5、11E1、16E11、17D11、19E12、29D7。 
在其他的实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂多核苷酸，例如编码肽或蛋白的多核苷酸，或适体。 
在另外的实施方式中，TrkB激动剂是TrkB适体。TrkB适体是结合TrkB并促进TrkB增加神经元存活的能力的小的多核苷酸。 
在上文方法的不同实施方式中，LINGO-1拮抗剂可以是干扰LINGO-1负调节神经元存活和/或与TrkB结合和/或抑制或减少TrkB磷酸化的能力的任何分子。在某些实施方式中，LINGO-1拮抗剂选自由LINGO-1拮抗剂多肽、LINGO-1抗体或其片段、LINGO-1拮抗剂多核苷酸(例如RNA干扰)、LINGO-1适体或者两种或更多种LINGO-1拮抗剂的组合所组成的组。 
在某些实施方式中，LINGO-1拮抗剂多肽是可溶的LINGO-1多肽。本发明的某些可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含或缺少下列结构域中的一个或多个的可溶的LINGO-1多肽：(i)LINGO-1富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域，(ii)LRR结构域C-端的LINGO-1碱性区，和(iii)LINGO-1免疫球蛋白(Ig)结构域。在一些实施方式中，可溶的LINGO-1多肽缺少LINGO-1Ig结构域、LINGO-1LRR结构域、跨膜结构域和胞质结构域中的一个或多个。本发明的另外的LINGO-1可溶多肽包括缺乏跨膜结构域和胞质结构域的多肽。在一些实施方式中，可溶的LINGO-1多肽包含LINGO-1LRR结构域但缺乏LINGO-1Ig结构域、LINGO-1碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方式中，可溶的LINGO-1多肽包含SEQ ID NO：2的34-532或SEQ ID NO：2的36-532氨基酸残基。 
在一些实施方式中，LINGO-1拮抗剂是包含非LINGO-1拮抗剂异源多肽的融合多肽。在一些实施方式中，非LINGO-1拮抗剂多肽选自由抗体Ig多肽、血清白蛋白多肽、靶向多肽、报告多肽和促进纯化的多肽组成的组。在一些实施方式中，抗体Ig多肽是铰链和Fc多肽。 
在可选择的实施方式中，LINGO-1拮抗剂是与包含下列LINGO-1结构域中的一个或多个的LINGO-1多肽结合的抗体或其片段：(i)LINGO-1富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域，(ii)LRR结构域C-端的LINGO-1碱性区，和(iii)LINGO-1免疫球蛋白(Ig)结构域。另外，LINGO-1拮抗剂抗体或其片段特异地结合含有如本文所描述的LINGO-1多肽片段的多肽中的表位。在另外的实施方式中，LINGO-1拮抗剂抗体或其片段选自由201′、3A3、3A6、3B5、1A7、1D5、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1B1.1F9、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、 3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、6P4F4.1Ds、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、1B6.4、2C7.2、2D6.1、2F7.3、2H3.2、3C11.1、3E3.1、3H11.2、3G8.1、2B8.1、3B5.230-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(L1a.1)、3495(L1a.2)、3563(L1a.3)、3564(L1a.4)、3565(L1a.5)、3566(L1a.6)、3567(L1a.7)、3568(L1a.8)、3569(L1a.9)、3570(L1a.10)、3571(L1a.11)、3582(L1a.12)、1968(L1a.13)、3011、3012、3013、3418、3422、3562、D05、D07、D08、D10和D11组成的组。LINGO-1拮抗剂可以是这些抗体中的任一种的抗原结合片段或者两种或更多种抗体或其片段的组合。 
在其他的实施方式中，LINGO-1拮抗剂是LINGO-1拮抗剂多核苷酸，例如反义多核苷酸、适体、核酶、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。 
在另外的实施方式中，LINGO-1拮抗剂是LINGO-1适体。LINGO-1适体是结合LINGO-1和干扰LINGO-1与TrkB相互作用和/或促进或增加TrkB磷酸化的小的多肽或多核苷酸。 
在上文方法的一些实施方式中，TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂通过包含下列步骤的方法施用：(a)向CNS神经元引入通过与表达控制序列可操作连接的编码TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂的多核苷酸；和(b)允许所述TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂的表达。在一些实施方式中，CNS神经元是在哺乳动物中并且所述引入包括(a)向所述哺乳动物施用通过与表达控制序列可操作连接的编码TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂的多核苷酸。在一些实施方式中，培养的宿主细胞来源于有待被治疗的哺乳动物。在某些实 施方式中，多核苷酸通过转染、电穿孔、病毒转导或直接的显微注射被引入宿主细胞或CNS神经元。 
在某些实施方式中，TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂是可在疾病、病症或损伤的部位或附近向哺乳动物施用的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸作为表达载体被施用。在一些实施方式中，载体是病毒载体，其选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体(例如埃巴病毒载体(Epstein Barr viral vector)或单纯疱疹病毒载体)、乳多空病毒载体、痘病毒载体(例如牛痘病毒载体)和细小病毒组成的组。在一些实施方式中，载体通过选自由局部施用、眼内施用和胃肠外施用(例如静脉内的、动脉内的、肌肉内的、心内的、皮下的、真皮内的、鞘内的、腹膜内的)所组成的组的路线施用。 
附图说明
图1A和B-概括实施例中使用的2周(图1A)和4周(图1B)的实验性眼内高压模型的图示。 
图2-显示在视网膜裱片(flat-mounted retinas)中定量视网膜神经节细胞(RGC)所用的切片的图示。在200×200μm2的目镜网格下沿着每一象限的中线从视神经盘(optic disc)开始至边缘处以500μm的间隔定量RGC。 
图3-激光凝固前(顶部)和之后立即(底部)的房水静脉图像。 
图4A和B-正常和受伤的大鼠视网膜切片中LINGO-1的表达。 
图5-正常和受伤的大鼠视网膜中LINGO-1的蛋白质印迹和其定量。 
图6-用PBS、对照蛋白、抗LINGO-1抗体(1A7)或可溶的LINGO-1(LINGO-1-Fc)治疗的左眼(正常的)和右眼(受伤的)中的眼内压测量。 
图7A和B-受伤并用PBS、对照蛋白、1A7或LINGO-1-Fc治疗两周和四周后存活的RGC的数目(图7A)和密度(图7B)的定量。 
图8A和B-用PBS、LINGO-1-Fc或1A7治疗的正常的动物和受伤的动物中RGC(图8A)和内网层的细胞(图8B)中的微结构的图像。 
图9-体外生长并暴露于对照蛋白、LINGO-1-Fc、BDNF和对照蛋白或BDNF和LINGO-1-Fc的存活的RGC的定量。 
图10-正常视网膜中、受伤但没有治疗的视网膜中和受伤并用PBS、LINGO-1-Fc或1A7治疗的视网膜中的BDNF的蛋白质印迹和其定量。 
图11A和B-用PBS、抗BDNF抗体、1A7、1A7和抗BDNF抗体、LINGO-1-Fc或LINGO-1-Fc和抗BDNF抗体治疗的受伤的眼睛中RGC的数目(图11A)和密度(图11B)的定量。 
图12A和B-来自共表达TrkB和LINGO-1的293细胞的抗LINGO-1免疫沉淀物中TrkB和LINGO-1的蛋白质印迹(图12A)。来自具有和不具有LINGO-1表达并且具有和不具有BDNF刺激的细胞的抗TrkB免疫沉淀物中磷酸-TrkB、总TrkB和LINGO-1的 蛋白质印迹和其定量(图12B)。 
图13A和B-来自正常的和受伤的视网膜溶解产物的抗TrkB、抗LINGO-1和抗对照蛋白免疫沉淀物中LINGO-1的蛋白质印迹(图13A)。视网膜切片中的LINGO-1和磷酸-TrkB免疫染色(图13B)。 
图14A和B-用PBS、LINGO-1-Fc或1A7治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷酸-TrkB和总TrkB的蛋白质印迹和其定量(图14A)。用BDNF、BDNF和LINGO-1-Fc或BDNF和1A7治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷酸-TrkB和总TrkB的蛋白质印迹(图14B)。 
图15-用或不用LINGO-1-Fc治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷酸-Akt和总Akt的蛋白质印迹和其定量。 
图16-视网膜切片中的pAkt免疫染色。 
图17A和B-用PBS、LY294002(P13K/Akt通路的抑制剂)、LINGO-1-Fc或LY294002和LINGO-1-Fc治疗的受伤的眼睛中RGC的数目(图17A)和密度(图17B)的定量。 
图18-用LINGO-1-Fc和LY294002或LY294002单独治疗的左眼(正常的)和右眼(受伤的)中的眼内压测量。 
图19-正常的眼睛和用PBS、LINGO-1-Fc和1A7治疗的受伤的眼睛中的磷酸-JNK-2、磷酸-JNK-1、总JNK-2和总JNK-1的蛋白质印迹和其定量。 
图20-显示建议的分子机制的图示。眼内压的升高导致LINGO-1和BDNF的水平增加。BDNF促进TrkB的磷酸化和细胞 存活信号转导通路的活化，但是LINGO-1抑制这一活性。LINGO-1拮抗剂例如1A7或LINGO-1-Fc通过干扰LINGO-1阻止响应于BDNF信号转导的TrkB磷酸化的能力来促进细胞存活。 
图21-用PBS或LINGO-1-Fc治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的GTP-RhoA和总RhoA的蛋白质印迹和其定量。 
发明详述 
定义 
除非另外说明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。矛盾的情况下，以本申请包括的定义为准。除非内容上另外要求，否则单数的术语将包括复数形式而复数的术语将包括单数形式。本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献为所有目的通过引用全文并入本文，如同明确并单独地指示每个单独的出版物或专利申请通过引用并入本文。 
尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可用来实行或检测本发明，但下文描述了适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅是示例性的并不意为限制性的。从详细的描述和权利要求书来看本发明的其他特征和优点将是明显的。 
为了进一步定义本发明，提供了下列术语和定义。 
应注意术语“一”(a)或“一”(an)实体是指一个或多个那种实体；例如“免疫球蛋白分子”应理解为代表一个或多个免疫球蛋白分子。像这样，术语“一”(a)(或“一”(an))、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。 
整个说明书和权利要求中，词语“包含”(comprise)或其变化形式例如“包含”(comprises)或“包含”(comprising)表明包括所叙述的任何整体或整体的组而不排除任何其他的整体或整体的组。术语“包含”是包含的或开放的，并不排除另外的、未叙述的元素或方法步骤。短语“主要由......构成”表明包括特定的材料或步骤以及不实质上影响权利要求所要求的本发明的基本的和新的特征的那些材料或步骤。如本文所用的，术语“组成”仅指表明的材料或方法步骤。 
如本文所用的“治疗有效量”是指以必要的剂量和时间段对获得所期望的治疗结果有效的量。治疗结果可以是例如，症状的减轻、延长的存活、改善的活动性以及类似结果。治疗结果不必为“治愈”。 
如本文所用的，术语“治疗”(treatment)或“治疗”(treating)是指向动物施用药剂以便改善或减轻疾病的症状。此外，术语“治疗”(treatment)或“治疗”(treating)是指向动物施用药剂以阻止疾病的发展。 
如本文所用的，“预防有效量”是指以必要的剂量和时间段对获得所期望的预防结果有效的量。通常，由于预防剂量在疾病之前或疾病的早期用于受治疗者，预防有效量将少于治疗有效量。 
如本文所用的，“多核苷酸”可包括全长eDNA序列的核酸序列并且可包括核酸序列的未翻译的5’和3’序列、编码区或者片段或变体。多核苷酸可包括任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，所述多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可包括单链或双链DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链或双链RNA、和为单链区和双链区的混合物的RNA、含有DNA和RNA 的杂交分子，所述杂交分子中的DNA和RNA可以是单链的或通常为双链的或单链区和双链区的混合物。此外，多核苷酸可包括包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。多核苷酸还可含有一种或多种修饰的碱基或为了稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基或不常见碱基例如肌苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此“多核苷酸”包括化学修饰、酶促修饰或代谢修饰的形式。 
在本发明中，“多肽”可包括通过肽键或修饰的肽键即肽电子等排体彼此连接的氨基酸并且可包括20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸(即非天然存在的氨基酸)。如描述本发明所用的，术语“肽”和“多肽”可互换使用。本发明的多肽可通过天然过程例如翻译后加工或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。在教科书、更加详细的专题论文以及大量的研究文献中描述了这种修饰。修饰可在多肽中任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应当理解的是在给定的多肽中相同类型的修饰可以相同或不同的程度在多个位点存在。并且，给定的多肽可包含许多类型的修饰。多肽可以是支链的，例如作为泛素化的结果，并且它们可以是具有或不具有分支的环状的。环状的、支链的和支链环状的多肽可从翻译后的天然过程获得或通过合成的方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白加入氨基酸例如精氨酰化、和泛素化(参见，例如Proteins-Structure and MolecularProperties(蛋白结构和分子特性)第2版，T.E.Creighton，W.H. Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational CovalentModification of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，MethEnzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。 
术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”在指本发明的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂时包括保持至少一些抑制LINGO-1活性或促进TrkB活性的能力的任何拮抗剂或激动剂分子。只要LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂仍起到其作用，如本文所描述的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂可无限制地包括片段、变体或衍生物分子。本发明的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽可包括LINGO-1或TrkB-激动剂蛋白水解片段、缺失片段、和特别是当递送至动物时更容易到达作用位点的片段。多肽片段还包括包含天然多肽的抗原表位或免疫表位(包括线性以及三维表位)的多肽的任何部分。本发明的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽可包含变异的LINGO-1或TrkB-激动剂区(包括如上文所描述的片段)，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有变化的氨基酸序列的多肽。变体可天然存在，例如等位基因变体。通过“等位基因变体”意指占据生物体的染色体上给定的基因座的基因的不同形式。Genes II(基因II)，Lewin，B.编辑，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然存在的变体可使用领域已知的诱变技术产生。LINGO-1或TrkB-激动剂多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。本发明的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂还可包括衍生物分子。例如，本发明的LINGO-1或TrkB激动剂多肽还可包括已被改变的LINGO-1或TrkB激动剂区以便表现在天然多肽未发现的另外的特征。实例包括融合蛋白和蛋白轭合物。 
在本发明中，“多肽片段”是指LINGO-1或TrkB-激动剂多肽 的短的氨基酸序列。蛋白片段可以是“独立式的”或包含在所述片段形成其部分或区域的更大的多肽中。本发明的多肽片段的代表性的实例包括例如包含长度为约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸和约100个氨基酸或者更多的片段。 
在一些实施方式中，用于本文公开的方法中的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂是“抗体”或“免疫球蛋白”分子或其免疫特异性片段，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或以与抗体分子类似的方式结合抗原的工程抗体分子或片段。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文互换使用。此外，用于本发明方法中的免疫球蛋白分子也描述为“免疫特异性”或“抗原特异性”或“抗原结合”分子，并可互换使用以指抗体分子和其片段。抗体或免疫球蛋白包含至少重链的可变结构域并且通常包含至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构是相对充分理解的。参见例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)，其通过引用并入本文。 
如下文更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括生物化学上区分的五大类型的多肽。所有五个类型清楚地在本发明的范围中，下列讨论将通常针对IgG类的免疫球蛋白分子。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量53,000-70,000的重链多肽。四个链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链托住起始于“Y”的开口处并且持续整个可变区的重链。 
重链和轻链分为结构和功能同源的区。就其功能使用术语“恒 定的”和“可变的”。在这一点上，应当理解的是轻链的可变结构域(VL)和重链的可变结构域(VH)部分确定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定区(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学特性，例如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合和类似特性。按照惯例，恒定区结构域的编号随它们变得离抗原结合位点或抗体的氨基端更远而增加。N端部分是可变区而C-端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。 
轻链分为kappa或lambda(κ，λ)。每种重链类型可与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合并且两个重链的“尾”部通过共价的二硫键合或非共价键合彼此结合。在重链中，氨基酸序列从位于Y构型的叉状末端的N-端延伸至位于每条链的底部的C-端。本领域技术人员将理解的是，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如γ1-γ4)。重链的性质决定抗体的“类型”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等也是充分表征的并且已知赋予功能特化。根据本公开内容，这些类型和同种型中的每一个的修饰形式对本领域技术人员来说是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。 
如上文所表明的，可变区允许抗体选择性地识别并特异地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域组合形成定义三维的抗原结合位点的可变区。这一四级抗体结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在VH和VL链中的每一个上的三个互补决定区(CDR)界定。在一些实例，例如一些来源于骆驼物种的免疫球蛋白分子或以骆驼免疫球蛋白为基础工程化的免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可 仅由重链组成，没有轻链。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)。 
在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、不连续的氨基酸序列，其当抗体在水环境中呈现其三维构型时特异地放置以形成抗原结合结构域。称为“框架”区的抗原结合结构域中其余的氨基酸显示出较小的分子间变异性。框架区主要采用β-折叠构型而CDR形成连接并且在某些情况下形成部分β-折叠结构的环。因此框架区起到形成提供通过链间的非共价反应以正确的方向放置CDR的支架的作用。通过所放置的CDR形成的抗原结合结构域界定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这一互补的表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区来说，分别构成CDR和框架区的氨基酸可由本领域的普通技术人员容易地鉴定，因为它们已经被明确地定义(参见“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫上重要蛋白的序列)”Kabat，E.等人，U.S.Departmentof Health and Human Services，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其都通过引用全文并入本文)。 
然而，在骆驼物种中，称为VHH的重链可变区形成整个CDR。骆驼VHH可变区和源自普通抗体的可变区(VH)之间的主要差异包括(a)与VHH中相应的区相比VH的轻链接触面的疏水氨基酸更多，(b)VHH中的CDR3较长，以及(c)在VHH中的CDR1和CDR3之间频繁出现二硫键。 
在一些实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少两个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原 结合分子包含至少三个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少四个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少五个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少六个来自一个或多个抗体分子的CDR。包含可包括在主题抗原结合分子中的至少一个CDR的示例性的抗体分子是本领域已知的并且本文描述了示例性分子。 
本发明的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于多克隆的、单克隆、多特异性的、人类的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体，单链抗体、表位结合片段例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗个体基因型(抗Id)抗体(包括例如本文所公开的结合分子的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域中已知的并且被描述于例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。 
包括单链抗体的抗体片段可包含单独或与下列的整体或部分组合的可变区：铰链区、重链的CH1、CH2和CH3结构域、或轻链的CL。本发明还包括的是还包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3或CL结构域的任何组合的抗原结合片段。本文公开的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段可来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物来源。抗体可以是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区在来源上可以是condricthoid(例如来自鲨)。如本文所用的，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并包括从人类免疫球蛋白 文库或从以一种或多种人类免疫球蛋白转基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文描述的并且例如Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号中的。这种抗体还包括含有一个或多个氨基酸取代的变体。 
如本文所用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含下列中的至少一个：CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，重链部分可包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。重链部分也可包括包含含有CH3结构域的多肽链的多肽。此外，本发明中使用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上文所展示的，本领域普通技术人员应理解的是，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以便它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。 
在本文所公开的方法中使用的一些LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段中，多聚体的一个多肽链的重链部分可与多聚体的另一多肽链上的那些相同。可选择地，本发明的方法中使用的含有重链部分的单体是不相同的。例如每个单体可包含不同的靶向结合位点，形成例如双特异性抗体。 
在本文所公开的方法中使用的结合多肽的重链部分可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含来源于IgG1分子的CH1结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子并且部分来源于IgG3分子的 铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子并且部分来源于IgG4分子的嵌合的铰链区。 
如本文所用的，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链部分可包含VL或CL结构域的至少一个。 
编码来源于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的核酸分子可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核酸取代、添加或缺失，以致一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入编码的蛋白来产生。通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变可引入突变。保守的氨基段取代可在一个多个非必需氨基酸残基进行。 
还以对本发明的多肽的结合亲和力的方式描述或详细说明本文公开的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段。在某些实施方式中，结合亲和力是具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的解离常数或Kd的那些。 
如本文描述的，本文公开的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段作为LINGO-1的拮抗剂或TrkB的激动剂起作用。例如，本发明的方法中使用的抗体可作为阻滞或抑制LINGO-1多肽的抑制活性的拮抗剂或作为促进TrkB的活性的激动剂起作用。 
如本文所用的，术语“嵌合抗体”将适用于意指其中免疫反应性区或位点获得或来源于一种物种而恒定区(依照本发明其是完整的、部分的或修饰的)获得于另一种物种的任何抗体。在某些实施方式中，靶向结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类) 而恒定区是人类的。 
如本文所用的，术语“工程化抗体”是指这样的抗体，其中重链或轻链或者两者中的可变结构域通过来自已知特异性的一个或多个CDR的至少部分替代并且如果必要的话通过部分的框架区替代和序列变化而改变。虽然CDR可来源于与框架区源自的抗体相同类或者甚至亚类的抗体，设想CDR将来源于不同类的抗体或来自来源于不同物种的抗体。其中来自已知特异性的非人类抗体的一个或多个“供体”CDR被嫁接到人类重链或轻链框架区中的工程化抗体在本文称为“人源化抗体”。不必用来自供体可变区的完整CDR替代所有的CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。相反地，只需要转移对维持靶向结合位点的活性来说必要的那些残基。考虑到在例如美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中展示的解释，通过进行常规实验或通过试错试验以获得功能性工程化或人源化抗体在本领域技术人员的能力之内。 
如本文所用的，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括化学共轭或重组方法的任何方法将两个或更多个元件或成分连接在一起。“框内融合”是指将两个或更多个开放读码框(ORF)以保持原始ORF的正确读码框的方式连接以形成连续的更长的ORF。因此，所得的重组的融合蛋白是含有与由原始ORF编码的多肽(其片段天然不是正常地如此连接的)相符的两个或多个片段的单一的蛋白。尽管整个融合片段中读码框因此为连续的，但片段可以是物理上或空间上由例如框内连接序列分隔的。 
对于多肽来说，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端到羧基端方向的氨基酸的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的 一级结构中是连续的。 
如本文所用的术语“表达”是指DNA序列用于产生生物化学物质例如RNA或多肽的过程。所述过程包括细胞中功能性存在的基因的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他的RNA产物以及这种mRNA翻译为多肽。如果最终所期望的产物是生物化学物质，表达包括生物化学物质和任何前体的产生。 
“受治疗者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指期望对其诊断、预后或治疗的任何受治疗者，尤其是哺乳动物受治疗者。哺乳动物受治疗者包括但不限于人类、家畜、农场动物、动物园动物、体育动物(sport animals)、宠物动物例如犬、猫、豚鼠、仓鼠、兔、大鼠、小鼠；灵长类动物例如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物例如狐狸和狼；猫科动物例如狮子和老虎；马科动物例如马、驴和斑马；食用动物例如牛、猪和绵羊；有蹄动物例如鹿和长颈鹿；熊等等。在一些实施方式中，哺乳动物是人类受治疗者。 
术语“RNA干扰”或“RNAi”是指通过siRNA沉默或减少基因表达。其是在动物和植物中序列特异性的转录后的基因沉默过程，由在双链区与所沉默的基因同源的siRNA起始。基因可以是生物体内源或异源的，整合在染色体中或存在于没有整合至基因组中的转染载体中。基因的表达可以被完全或部分抑制。还可认为RNAi抑制了靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全或部分的。 
LINGO-1(Sp35/LRRN6) 
天然存在的人类LINGO-1是糖基化的神经系统特异的蛋白， 其由614个氨基酸(SEQ ID NO：2)组成。人类LINGO-1多肽含有由14个富含亮氨酸的重复序列组成的LRR结构域(包括N-端帽和C-端帽)、Ig结构域、跨膜区和胞质结构域。胞质结构域含有标准的酪氨酸磷酸化位点。此外，天然存在的LINGO-1蛋白含有信号序列、LRRCT和Ig结构域之间的短的碱性区以及Ig结构域和胞质结构域之间的跨膜区。人类LINGO-1含有可选的翻译起始密码子，以致六种另外的氨基酸(MQVSKR；SEQ ID NO：7)可在LINGO-1信号序列的N-端存在或不存在。根据氨基酸残基数目，以SEQ IDNO：2的序列为基础，表1列出了LINGO-1结构域和其他区。如本领域技术人员应理解的，下文所列的结构域的起始残基和终止残基可取决于确定结构域所使用的计算机建模程序或所使用的方法而变化。LINGO-1多肽被更详细地表征于PCT公开第WO2004/085648号和美国公开专利申请第2006/0009388A1号中，其通过引用全文并入本文。 
表1 
  结构域或区   起始残基   终止残基
  信号序列   1   33或35
  LRRNT   34或36   64
  LRR   66   89
  LRR   90   113
  LRR   114   137
  LRR   138   161
  LRR   162   185
  LRR   186   209
  LRR   210   233
  LRR   234   257
  LRR   258   281
  LRR   282   305
  LRR   306   329
  LRR   330   353
  LRRCT   363   414或416
  碱性   415或417   424
  Ig   419   493
  连接序列   494   551
  跨膜   552   576
  胞质   577   614
已经在人类和大鼠中研究了LINGO-1的组织分布和发育中的表达。已经在实验动物(大鼠)模型中研究了LINGO-1生物学。如通过RNA印迹和免疫组化染色所测定的，大鼠LINGO-1的表达局限于神经系统神经元和脑少突胶质细胞。大鼠LINGO-1mRNA表达水平是发育上调节的，出生后不久即大约出生后第一天达到峰值。在大鼠脊索横切损伤模型中，如通过RT-PCR所测定的，在受伤的部位LINGO-1被上调。此外已经显示LINGO-1与Nogo66受体(Nogo受体)相互作用。参见例如国际专利申请第PCT/US2004/00832号、PCT公开第WO2004/08564号。 
LINGO-1是Nogo受体-1-p75-Taj神经营养蛋白受体络合物的另外的成分。参见Mi等人，Nat Neurosci.7：221-228(2004)，其通过引用并入本文。不像Nogo受体1，当脊索中的成熟神经细胞暴露于外伤时，LINGO-1基因表达增加，表明LINGO-1对CNS神经系统功能具有重要的生物学作用。同上(Id.) 
全长人类LINGO-1分子的核苷酸序列如下： 
ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTG 
GCCTGCTGGCAGCCCATCCTCCTGCTGGTGCTGGGCTCAGTG 
CTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGTGC 
TCCGCCCAGGACCGCGCTGTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTT 
GTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTG 
GACCTAGGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACCAGGACGA 
GTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTCAACGA 
GAACATCGTGAGCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCT 
CTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTCCGCAGCAACCGCCTGAA 
GCTCATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGAC 
CAAGCTGGACATCAGCGAGAACAAGATTGTTATCCTGCTGGA 
CTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCTCAAGTCACTGGAGGT 
TGGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTCACCGCGCCTTCAG 
CGGCCTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTGGAGAAATGCA 
ACCTGACCTCCATCCCCACCGAGGCGCTGTCCCACCTGCACG 
GCCTCATCGTCCTGAGGCTCCGGCACCTCAACATCAATGCCA 
TCCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCT 
TGGAGATCTCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCA 
ACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATCACAC 
ACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCACC 
TAGTCTATCTCCGCTTCCTCAACCTCTCCTACAACCCCATCAG 
CACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTGCTCCGGCTGCA 
GGAGATCCAGCTGGTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGC 
CCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGT 
CTCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATCAGTCTTCCA 
CTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTGGACTCCAACCC 
GCTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCG 
CTGGCGGCTCAACTTCAACCGGCAGCAGCCCACGTGCGCCAC 
GCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGA 
TGTGCTACTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCAT 
CCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAGGGCC 
ACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGC 
CCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGAAAGCACCTGGTCTCAG 
CCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGC 
TGGAGGTGCGCTACGCCCAGGTACAGGACAACGGCACGTAC 
CTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCC 
GCCCACCTGCATGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCAT 
CAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAACCAGCCGGGC 
GAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCC 
TTCGACATCAAGACCCTCATCATCGCCACCACCATGGGCTTC 
ATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGT 
TTCTCTGGAGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATC 
GAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATCAG 
CTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAACATGAAGATGATATG 
A(SEQ ID NO：1)。 
全长人类LINGO-1多肽的多肽序列如下： 
MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSA 
QDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFASF 
PHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVF 
TGLSNLTKLDISENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISH 
RAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRLRHLNINAI 
RDYSFKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCN 
LTAVPYLAVRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLV 
GGQLAVVEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLE 
TLILDSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGK 
EFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRA 
DGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQD 
NGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISN 
QPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLF 
LWSRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGIS SADAPRKFNMKMI(SEQ 
ID NO：2)。 
TrkB(NTRK2) 
神经营养蛋白是负责神经元的分化、存活和功能的高同源性生长因子小家族。在哺乳动物中，已知的神经营养蛋白是神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)，还称为NT-4/5或NT-5、神经营养因子-6(NT-6)和神经营养因子-7(NT-7)(Barbacid，J.of Neurobiol.25：1386-1403(1994)和Nilsson等人FEBS 424：285-290(1998))。神 经营养蛋白结合两种受体类型，p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和酪氨酸激酶的Trk受体家族的三个成员(哺乳动物中)(TrkA、TrkB和TrkC)。神经营养蛋白与Trk受体胞外结构域的结合起始信号传导通路。神经营养蛋白的结合导致受体的二聚化和自磷酸化。TrkB的自磷酸化导致包括细胞分裂素活化的蛋白激酶(MAPK)、磷脂酶C-γ(PLC-γ)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K)的信号转导通路的活化(Yamada，J.Pharmacol.Sci.91：267-270(2003))。 
下列核苷酸序列报道为人类TrkB受体的mRNA并且在Genbank中登录号为NM_006180。 
AAGACGGATTCTCAGACAAGGCTTGCAAATGCCCCGCAGCC 
ATCATTTAACTGCACCCGCAGAATAGTTACGGTTTGTCACCC 
GACCCTCCCGGATCGCCTAATTTGTCCCTAGTGAGACCCCGA 
GGCTCTGCCCGCGCCTGGCTTCTTCGTAGCTGGATGCATATC 
GTGCTCCGGGCAGCGCGGGCGCAGGGCACGCGTTCGCGCAC 
ACCCTAGCACACATGAACACGCGCAAGAGCTGAACCAAGCA 
CGGTTTCCATTTCAAAAAGGGAGACAGCCTCTACCGCGATTG 
TAGAAGAGACTGTGGTGTGAATTAGGGACCGGGAGGCGTCG 
AACGGAGGAACGGTTCATCTTAGAGACTAATTTTCTGGAGTT 
TCTGCCCCTGCTCTGCGTCAGCCCTCACGTCACTTCGCCAGCA 
GTAGCAGAGGCGGCGGCGGCGGCTCCCGGAATTGGGTTGGA 
GCAGGAGCCTCGCTGGCTGCTTCGCTCGCGCTCTACGCGCTC 
AGTCCCCGGCGGTAGCAGGAGCCTGGACCCAGGCGCCGCCG 
GCGGGCGTGAGGCGCCGGAGCCCGGCCTCGAGGTGCATACC 
GGACCCCCATTCGCATCTAACAAGGAATCTGCGCCCCAGAGA 
GTCCCGGGAGCGCCGCCGGTCGGTGCCCGGCGCGCCGGGCC 
ATGCAGCGACGGCCGCCGCGGAGCTCCGAGCAGCGGTAGCG 
CCCCCCTGTAAAGCGGTTCGCTATGCCGGGGCCACTGTGAAC 
CCTGCCGCCTGCCGGAACACTCTTCGCTCCGGACCAGCTCAG 
CCTCTGATAAGCTGGACTCGGCACGCCCGCAACAAGCACCGA 
GGAGTTAAGAGAGCCGCAAGCGCAGGGAAGGCCTCCCCGCA 
CGGGTGGGGGAAAGCGGCCGGTGCAGCGCGGGGACAGGCAC 
TCGGGCTGGCACTGGCTGCTAGGGATGTCGTCCTGGATAAGG 
TGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGG 
CTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGT 
CCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTT 
CTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTG 
TAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGA 
AAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATG 
TGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAAT 
TTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGC 
ACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGA 
AACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGG 
CAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGAC 
TCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTA 
CTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCT 
GCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGC 
ACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATC 
CTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGA 
TGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCA 
CACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGA 
CAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGG 
AGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACC 
AACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTG 
GTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCT 
TCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATA 
CATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCA 
CGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGG 
GGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATG 
AGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTG 
ACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAG 
ATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAAC 
AGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACC 
GGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCG 
TCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTA 
AGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCAT 
GGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCC 
CAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCAC 
TCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGG 
AAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCC 
CTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTC 
AGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATA 
ACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGA 
AAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAG 
GACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAG 
TGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCT 
GACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGT 
CTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACAT 
GAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCC 
CTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAAC 
TGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCG 
CGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCG 
ATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGG 
TGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCA 
CTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTC 
GCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGA 
CGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAG 
ATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAAC 
AATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAG 
CGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTG 
GGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAA 
GGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCC 
GGTCTACCTGGACATTCTAGGCTAGGGCCCTTTTCCCCAGAC 
CGATCCTTCCCAACGTACTCCTCAGACGGGCTGAGAGGATGA 
ACATCTTTTAACTGCCGCTGGAGGCCACCAAGCTGCTCTCCTT 
CACTCTGACAGTATTAACATCAAAGACTCCGAGAAGCTCTCG 
AGGGAAGCAGTGTGTACTTCTTCATCCATAGACACAGTATTG 
ACTTCTTTTTGGCATTATCTCTTTCTCTCTTTCCATCTCCCTTG 
GTTGTTCCTTTTTCTTTTTTTAAATTTTCTTTTTCTTTTTTTTTT 
CGTCTTCCCTGCTTCACGATTCTTACCCTTTCTTTTGAATCAAT 
CTGGCTTCTGCATTACTATTAACTCTGCATAGACAAAGGCCTT 
AACAAACGTAATTTGTTATATCAGCAGACACTCCAGTTTGCC 
CACCACAACTAACAATGCCTTGTTGTATTCCTGCCTTTGATGT 
GGATGAAAAAAAGGGAAAACAAATATTTCACTTAAACTTTGT 
CACTTCTGCTGTACAGATATCGAGAGTTTCTATGGATTCACTT 
CTATTTATTTATTATTATTACTGTTCTTATTGTTTTTGGATGGC 
TTAAGCCTGTGTATAAAAAAGAAAACTTGTGTTCAATCTGTG 
AAGCCTTTATCTATGGGAGATTAAAACCAGAGAGAAAGAAG 
ATTTATTATGAACCGCAATATGGGAGGAACAAAGACAACCA 
CTGGGATCAGCTGGTGTCAGTCCCTACTTAGGAAATACTCAG 
CAACTGTTAGCTGGGAAGAATGTATTCGGCACCTTCCCCTGA 
GGACCTTTCTGAGGAGTAAAAAGACTACTGGCCTCTGTGCCA 
TGGATGATTCTTTTCCCATCACCAGAAATGATAGCGTGCAGT 
AGAGAGCAAAGATGGCTTCCGTGAGACACAAGATGGCGCAT 
AGTGTGCTCGGACACAGTTTTGTCTTCGTAGGTTGTGATGAT 
AGCACTGGTTTGTTTCTCAAGCGCTATCCACAGAACCTTTGTC 
AACTTCAGTTGAAAAGAGGTGGATTCATGTCCAGAGCTCATT 
TCGGGGTCAGGTGGGAAAGCCAAGAACTTGGAAAAGATAAG 
ACAAGCTATAAATTCGGAGGCAAGTTTCTTTTACAATGAACT 
TTTCAGATCTCACTTCCCTCCGACCCCTAACTTCCATGCCCAC 
CCGTCCTTTTAACTGTGCAAGCAAAATTGTGCATGGTCTTCGT 
CGATTAATACCTTGTGTGCAGACACTACTGCTCCAGACGTCG 
TTTCCCTGATAGGTAGAGCAGATCCATAAAAAGGTATGACTT 
ATACAATTAGGGGAAGCTAATGGAGTTTATTAGCTGAGTATC 
AATGTCTCTGCGTTGTACGGTGGTGATGGGTTTTAATGAATA 
TGGACCCTGAAGCCTGGAAATCCTCATCCACGTCGAACCCAC 
AGGACTGTGGGAAGGGCAGAATCAATCCCTAAGGGAAAGGA 
AACCTCACCCTGAGGGCATCACATGCACTCATGTTCAGTGTA 
CACAGGTCAAGTCCCTTGCTCTGGGCTCTAGTTGGGAGAGTG 
GTTTCATTCCAAGTGTACTCCATTGTCAGTATGCTGTTTTTGT 
TTCCTTCACTCCATTCAAAAAGTCAAAATACAAAATTTGGCA 
CAGCATGCCAACGGGAGGCTGTGCCCAGACCAAGCACTGGA 
AGTGTGCTTCTAGGCATAGTCATTGGTTTTGCAAAAAGAGGG 
CTCAAATTTAAATAGAAATTTACAGCTATTTGAATGGTCAGA 
TATACCAAGAAAGAAAAATATTTCTGTTCCTCAAGAAAACTT 
GCTACCCTCTGTGAGGGGAATTTTGCTAAACTTGACATCTTTA 
TAACATGAGCCAGATTGAAAGGGAGTGATTTTCATTCATCTT 
AGGTCATGTTATTTCATATTTGTTTCTGAAGGTGCGATAGCTC 
TGTTTTAGGTTTTGCTTGCGCCTGTTAATTACTGGAACACCTT 
ATTTTTCATTAAAGGCTTTGAAAGCCAATTCTCAAAAATTCA 
AAAGTGCAAATTAACAGAACAAAAGGAAATCCAGTAGCAAC 
TGCAGTCAAGCGAGGGAGTTGACAAGATAAACCTTACGTCC 
ATTCAAGTTATATGCTGGCCTATGAGAGATGAGAGTTGGGTC 
GTTTGTTCTCTTTGTTGATGATTT(SEQ ID NO：3) 
下列多肽序列报道为人类TrkB多肽序列(由SEQ ID NO：3的核苷酸939-3455编码)并且在Genbank中登录号为NP_006171。 
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSAS 
RIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVE 
AYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSR 
KHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCL 
NESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAG 
DPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISC 
VAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGN 
PKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTH 
MNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVI 
YEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIA 
SVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVG 
PASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIEN 
PQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAEC 
YNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHI 
VKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEG 
NPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVG 
ENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYR 
KFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVL 
QRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASP 
VYLDILG(SEQ ID NO：4)。 
下列核苷酸序列报道为大鼠TrkB受体的mRNA并且在Genbank中登录号为NM_012731。 
ATCTGTGTGCGAGTGCGTGTGCGTGCGTGTGTGTGTGTGTGT 
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGCGTGTGTGTTTTTGGATT 
TCATACTAATTTTCTGGAGTTTCTGCCCCTGCTCTGCGTCAGC 
CCTCACGTCACTTCGCCAGCAGTAGCAGAGGCGGCGGCGGCC 
GCCGGTTAGAGCCCAGTCGCTGCTTCAGCTGCTGTTGCTGCTT 
CTGCGGCGCTCTGCTCCCTGCGCTGGCTACGGGAGGCCGGGG 
GAGCCGCGCCGACAGTCCTCTGTGGCCAGGGCCGGCACTGTC 
CTGCTACCGCAGTTGCTCCCCAGCCCTGAGGTGCGCACCGAT 
ATCGATATCCGTGCCGGTTTAGCGGTTCTGCGACCCAAAGAG 
TCCAGGGAGAGCCACCGAGTGGCGCCTGGCGTATAGGACCA 
TGCAGCCGCCTTGTGGCTTGGAGCAGCGGCCCGTGATGTTCC 
AGCCACTGTGAACCATTTGGTCAGCGCCAACCTGCTCAGCCC 
CAGCACCGACAGGCTCAGCCTCTGGTACGCTCCTCTCGGCGG 
GAGGCCATCAGCACCAAGCAGCAAGAGGGCTCAGGGAAGGC 
CTCCCCCCTCCGGCGGGGGACGCCTGGCTCAGCGTAGGGACA 
CGCACTCTGACTGACTGGCACTGGCAGCTCGGGATGTCGCCC 
TGGCCGAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGG 
CTTATGCTTGCTGGTCTTGGGCTTCTGGAGGGCTTCTCTTGCC 
TGCCCCATGTCCTGCAAATGCAGCACCACTAGGATTTGGTGT 
ACCGAGCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGGTTGGAA 
CCTAACAGCATTGACCCAGAGAACATCACCGAAATTCTCATT 
GCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAATGAAGATGATGT 
CGAAGCTTACGTGGGGCTGAAAAACCTTACAATTGTGGATTC 
CGGCTTAAAGTTTGTGGCTTACAAGGCGTTTCTGAAGAACGG 
CAACCTGCGGCACATCAATTTCACTCGAAACAAGCTGACGAG 
TTTGTCCAGGAGACATTTCCGCCACCTTGACTTGTCTGACCTG 
ATCCTGACGGGTAATCCGTTCACGTGTTCCTGTGACATCATGT 
GGCTCAAGACTCTCCAGGAGACGAAATCCAGCCCCGACACTC 
AGGATTTGTATTGCCTCAATGAGAGCAGCAAGAATACCCCTC 
TGGCGAACCTGCAGATTCCCAATTGTGGTCTGCCGTCTGCAC 
GTCTGGCCGCTCCTAACCTCACGGTGGAGGAAGGGAAGTCTG 
TGACCATTTCCTGCAGCGTCGGGGGTGACCCGCTCCCCACCT 
TGTACTGGGACGTTGGGAATTTGGTTTCCAAACACATGAATG 
AAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACAAACATT 
TCATCGGATGACAGTGGGAAACAAATCTCTTGTGTGGCAGAA 
AACCTCGTCGGAGAAGATCAAGACTCTGTGAACCTCACTGTG 
CATTTTGCACCAACCATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAG 
ACCACCACTGGTGCATCCCATTCACTGTGAGAGGCAACCCCA 
AGCCAGCACTTCAGTGGTTCTACAACGGAGCCATACTGAATG 
AATCCAAGTACATCTGTACCAAAATACACGTCACCAATCACA 
CGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAACCCCACTCATA 
TGAATAATGGAGACTACACCCTAATGGCCAAGAATGAATAT 
GGGAAGGACGAGAGACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCCG 
GCCTGGAGTTGACTATGAGACAAACCCAAATTACCCTGAAGT 
CCTCTATGAAGACTGGACCACGCCAACTGACATCGGGGATAC 
TACAAACAAAAGTAATGAGATCCCCTCCACGGATGTTGCTGA 
CCAAACCAATCGGGAGCATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGT 
GATTGCCTCTGTGGTAGGATTCTGCCTGCTGGTGATGCTGCTT 
CTGCTCAAGTTGGCGAGACATTCCAAGTTTGGCATGAAAGGC 
CCAGCTTCCGTCATCAGCAACGACGATGACTCTGCCAGCCCT 
CTCCACCACATCTCCAACGGGAGCAACACTCCGTCTTCTTCG 
GAGGGCGGGCCCGATGCTGTCATCATTGGGATGACCAAGATC 
CCTGTCATTGAAAACCCCCAGTACTTCGGTATCACCAACAGC 
CAGCTCAAGCCGGACACATTTGTTCAGCACATCAAGAGACAC 
AACATCGTTCTGAAGAGGGAGCTTGGAGAAGGAGCCTTTGG 
GAAAGTTTTCCTAGCGGAGTGCTATAACCTCTGCCCCGAGCA 
GGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACGCTGAAGGACGCCA 
GCGACAATGCTCGCAAGGACTTTCATCGCGAAGCCGAGCTGC 
TGACCAACCTCCAGCACGAGCACATTGTCAAGTTCTACGGTG 
TCTGTGTGGAGGGCGACCCACTCATCATGGTCTTTGAGTACA 
TGAAGCACGGGGACCTCAACAAGTTCCTTAGGGCACACGGG 
CCAGATGCAGTGCTGATGGCAGAGGGTAACCCGCCCACCGA 
GCTGACGCAGTCGCAGATGCTGCACATCGCTCAGCAAATCGC 
AGCAGGCATGGTCTACCTGGCATCCCAACACTTCGTGCACCG 
AGACCTGGCCACCCGGAACTGCTTGGTAGGAGAGAACCTGCT 
GGTGAAAATTGGGGACTTCGGGATGTCCCGGGATGTATACAG 
CACCGACTACTACCGGGTTGGTGGCCACACAATGTTGCCCAT 
CCGATGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCAC 
CACCGAGAGTGACGTCTGGAGCCTGGGAGTTGTGTTGTGGGA 
GATCTTCACCTACGGCAAGCAGCCCTGGTATCAGCTATCAAA 
CAACGAGGTGATAGAATGCATCACCCAGGGCAGAGTCCTTC 
AGCGGCCTCGCACGTGTCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGC 
TGGGATGCTGGCAGCGGGAACCACACACAAGGAAGAACATC 
AAGAACATCCACACACTCCTTCAGAACTTGGCGAAGGCGTCG 
CCCGTCTACCTGGACATCCTAGGCTAGACTCCCTCTTCTCCCA 
GACGGCCCTTCCCAAGGCACCCCTCAGACCTCTTAACTGCCG 
CTGATGTCACCACCTTGCTGTCCTTCGCTCTGACAGTGTTAAC 
AAGACAAGGAGCGGCTCTCCGGGGTGAGGCAGTGCGCACTT 
CCCCATCCACAGACAGTATCGACTCGCTTCTGGCTTTGTCGCT 
TTCTCTCCCTTTGGTTTGTTTCTTTCTTTTGCCCATTCTCCATTT 
ATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTA 
TCTATCTATCTATCTATTTATTTATTTATTTATTGGTCTTCACT 
GCTTCATGGTCCTCGGCCTCTCTCCTTGACCGATCTGGCTTCT 
GTACTCCTATTCACTGTACATAGACAAAGGCCTTAACAAACC 
TGATTTGTTATATCAGCAGACACTCCAGTTTGCCCACCACAA 
CTAACAATGCCTTGTTGTATTCCTGCCTTTGATGTGGATGAAA 
AAAAGGGAAAAAAAATAATCAAACATCTGACTTAAACCGTC 
ACTTCCGATGTACAGACACGGGGCGTTTCTATGGATTCACTT 
CTATCTATCTATTTATTTATTTATCTATTTATTTATTTCTCTTCT 
TTGTTGTTTTCCGGTGGTTTTAGCCTGTGTATGAGAAGGGAA 
AGTCATGTACAGTCTGGGAAAACTTTATCTGTGGGAAATGGA 
AACCAGAAGGGGAAAGAAGCTTTACCATAAAGCACAGCAGG 
AGTGAGACACAGAAAAGCCATTGGATCAGCCAGAGTCCGTC 
CTGCATAGGAAAACCCAGCAGCCATCAGGCTGGAGGATCAT 
GTTCGGCACTGACCCCCGAGGACCTTTCTGAGGAGGACACAG 
AATGTTAAACTCTGCATCATGGACACAGTTTCCGATCACAGA 
TACTGGCCTTCAATGGAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCAGAT 
AGTTCTTGTGAGACCTGGACAGCACGTCCAACATCCAGACAT 
TGTGGTCGGGCACAGTGACAGAGTTGATGCATTTCTCACGGG 
TTATTCTACAGAGCTTTTGTCAAGTCCAATGGAAGGAGGTAG 
ATTCTTGTTCAGATATGATTTCGGGAAAAACCGAGTCCTTGA 
CAAAGACAGGAGACACCCTCAGTTGGGAGGCAAGTTTCTCTT 
ACCTTGGACTTTCTCACACAGCAATTCTCACCCCCACCCCCTC 
CACTCTCACCTGTCTTGTAACTGTGCAAACAAAAGTGTGCAT 
GGTCTTTGTCAGTTGATACCTTTGTGCACCTCTGTGCAGAAAC 
TGCTGTCTGTCCCGGCTGTGGTACCCGATCAGTGGGGTAGAT 
CCACGAAAGGTCTCATTTTAGGCCGCTTTGGGAAGGTAACCA 
GATCGGTAGCTGGAAGCACTCTCCAGTAGGTGGCGAAGGGT 
GAGTGGGTCTGCTGAAGCCTGCATATCTTCACCCACCTCAAA 
CCCACCGGGCTGCACAGGGGACAGGCACAGGCCACCCCTGA 
GGGACAGGGAAGCTCTCTTGGGATACCACCTGAGTTTACATT 
CAGTGTGCTCAGGTCAAGTCTCTCGCTCGGGGCTCTGTTTCG 
GGGAGAATGGTTTCATTCCAACGCACTCATTATCAGGATTCT 
GTTTTC(SEQ ID NO：5)。 
下列多肽序列报道为大鼠TrkB多肽序列(由SEQ ID NO：5的核苷酸665-3130编码)并且在Genbank中登录号为NP_036863。 
MSPWPRWHGPAMARLWGLCLLVLGFWRASLACPMSCKCSTTR 
IWCTEPSPGIVAFPRLEPNSIDPENITEILIANQKRLEIINEDDVEA 
YVGLKNLTIVDSGLKFVAYKAFLKNGNLRHINFTRNKLTSLSRR 
HFRHLDLSDLILTGNPFTCSCDIMWLKTLQETKSSPDTQDLYCL 
NESSKNTPLANLQIPNCGLPSARLAAPNLTVEEGKSVTISCSVGG 
DPLPTLYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISC 
VAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVRGN 
PKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTH 
MNNGDYTLMAKNEYGKDERQISAHFMGRPGVDYETNPNYPEV 
LYEDWTTPTDIGDTTNKSNEIPSTDVADQTNREHLSVYAVVVIA 
SVVGFCLLVMLLLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHI 
SNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFV 
QHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTL 
KDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVF 
EYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQI 
AAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVY 
STDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWE 
IFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGC 
WQREPHTRKNIKNIHTLLQNLAKASPVYLDILG(SEQ ID NO：6)。 
根据氨基酸残基数目，以SEQ ID NO：4的序列为基础，表2列出了TrkB结构域和其他区。如本领域技术人员应理解的，下文所列的结构域的起始残基和终止残基可取决于确定结构域所使用的计算机建模程序或所使用的方法而变化。 
表2 
  结构域或区   起始残基   终止残基
  信号肽   1   31
  富含半胱氨酸  1   32   67
  LRR   68   139
  富含半胱氨酸  2   140   195
  Ig-样1   214   270
  Ig-样2   301   365
  跨膜   434   454
  酪氨酸激酶  催化结构域   552   828
使用LINGO-1的拮抗剂的方法 
本发明的一个实施方式提供了用于抑制细胞中LINGO-1和TrkB相互作用的方法，其包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。用于本发明的目的的LINGO-1拮抗剂可以是LINGO-1拮抗剂多肽、LINGO-1抗体、LINGO-1拮抗剂多核苷酸、LINGO-1适体或两种或更多种LINGO-1拮抗剂的组合。 
本发明的另外的实施方式包括用于相对于LINGO-1拮抗剂不存在的情况下的TrkB磷酸化水平，促进细胞中TrkB磷酸化的方法，其包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。相似地，本发明还提供了用于促进TrkB信号传导的方法，其包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。本发明还包括促进TrkB磷酸化的方法，其包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。 
本发明的另外的实施方式包括用于抑制细胞中JNK磷酸化的方法，其包括将共表达LINGO-1和JNK的细胞与LINGO-1拮抗剂 接触，以及用于抑制JNK通路信号转导传导的方法，其包括将共表达LINGO-1和JNK的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。根据本发明，抑制JNK磷酸化包括抑制JNK-1磷酸化、抑制JNK-2磷酸化或抑制JNK-1和JNK-2磷酸化。根据本发明，抑制JNK磷酸化可包括降低磷酸化的JNK蛋白的总量或降低JNK蛋白保持磷酸化的时间长度。本发明还包括用于抑制JNK磷酸化的方法，其包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。 
本发明的另外的实施方式提供了在显示压力引起的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中促进视网膜神经节细胞存活的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和运载体。在一个实施方式中，压力引起的视神经病变是青光眼。 
使用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的方法 
在本发明的某些方法中，使用了LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂两者。例如，本发明的一个实施方式包括用于促进处于死亡危险的神经元存活的方法，包括将神经元与有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合接触。在使用了LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂两者的本发明的实施方式中，术语“有效量“是指足以产生所期望的结果的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合的量。在一些实例中，单独使用LINGO-1拮抗剂时产生期望的作用的LINGO-1拮抗剂的量可大于与TrkB激动剂组合使用时的量。相似地，在某些实例中，单独使用TrkB激动剂时产生期望的作用的TrkB激动剂的量可大于与LINGO-1拮抗剂组合使用时的量。 
本发明的另一个实施方式提供了用于治疗与神经元细胞死亡有关的疾病或病症的方法，包括向需要这种治疗的动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合。在某些特定的实施方式 中，所述疾病或病症可以是压力引起的视神经病变。本发明的另外的实施方式包括用于在显示包括神经元细胞死亡的体征、症状或病况的哺乳动物中促进CNS神经元的再生或存活的方法，包括向哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合。在本发明的某些实施方式中，疾病或病症是ALS、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、糖尿病性神经病变、中风或听力损失。在另一个特定的实施方式中，CNS神经元是感觉神经元，例如视网膜神经节细胞或毛细胞。 
在涉及使用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合的本发明的实施方式中，LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂可以以单一的组合物施用或分别施用。此外，LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂可同时或顺序地施用。 
LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂化合物 
本发明的方法中的LINGO-1拮抗剂包括任何化学品或合成的化合物，与拮抗剂化合物不存在的情况下LINGO-1的活性相比，其抑制或降低LINGO-1的活性。 
本发明的方法中的TrkB激动剂包括任何化学品或合成的化合物，与激动剂化合物不存在的情况下TrkB的状态相比，其促进或增加TrkB的活性或促进或增加TrkB的磷酸化。 
TrkB激动剂化合物包括但不限于神经营养蛋白模拟物。TrkB激动剂化合物还包括但不限于L-783,281、腺苷、CGS 21680等等，如Pollack等人Curr.Drug Targ-CNS and Neurol.Disorders 1：59-80(2002)中所综述的，其通过引用全文并入本文。在某些实施方式中，TrkB激动剂化合物是对TrkB选择性的并且比TrkA和TrkC活化TrkB至更大的程度。在某些实施方式中，TrkB激动剂化合物是对 TrkB特异性的并且不活化TrkA和TrkC。此外，TrkB激动剂化合物还可是模拟神经营养蛋白的关键区的小分子。例如小分子可以是BDNF β-转角环的模拟物。根据本发明可使用的小分子模拟物的特定的实例公开于美国公开专利申请第2007/0060526A1号，其通过引用全文并入本文。 
本领域的普通技术人员将知道如何筛选和检测将可用于本发明的方法中的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂化合物，例如通过使用本文其他地方描述的测定筛选改变神经元存活的化合物。 
可溶的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂多肽 
可溶的LINGO-1多肽 
将在本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂包括阻滞、抑制或干扰天然存在的LINGO-1的生物学功能的那些多肽。特别地，本发明的可溶的LINGO-1多肽包括可溶的LINGO-1多肽的片段、变体或其衍生物。上文表1描述了LINGO-1多肽的不同结构域。可溶的LINGO-1多肽缺少跨膜结构域并且通常缺少LINGO-1多肽的胞内结构域。例如，某些可溶的LINGO-1多肽缺少包含LINGO-1的跨膜结构域的氨基酸552-576和/或包含LINGO-1的胞内结构域的氨基酸577-614。此外，某些可溶的LINGO-1多肽包含LINGO-1多肽的LRR结构域、Ig结构域、碱性区和/或整个胞外结构域(相应于SEQ ID NO：2的氨基酸34至532)。如本领域技术人员将理解的，LINGO-1的整个胞外结构域可在胞外结构域多肽的C-端或N-端包含添加的或较少的氨基酸。 
像这样，用于本发明的方法中的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸41至525、SEQ ID NO：2的40至526、SEQ ID NO：2的 39至527、SEQ ID NO：2的38至528、SEQ ID NO：2的37至529、SEQ ID NO：2的36至530、SEQ ID NO：2的35至531、SEQ IDNO：2的34至531、SEQ ID NO：2的46至520、SEQ ID NO：2的45至521、SEQ ID NO：2的44至522、SEQ ID NO：2的43至523和SEQ ID NO：2的42至524、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。LINGO-1多肽拮抗剂可包括如表1中所描述的结构域的任何组合。 
用于本发明的方法中的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸1至33、SEQ ID NO：2的1至35、SEQ ID NO：2的34至64、SEQ ID NO：2的36至64、SEQ ID NO：2的66至89、SEQ IDNO：2的90至113、SEQ ID NO：2的114至137、SEQ ID NO：2的138至161、SEQ ID NO：2的162至185、SEQ ID NO：2的186至209、SEQ ID NO：2的210至233、SEQ ID NO：2的234至257、SEQID NO：2的258至281、SEQ ID NO：2的282至305、SEQ ID NO：2的306至329、SEQ ID NO：2的330至353、SEQ ID NO：2的363至416、SEQ ID NO：2的417至424、SEQ ID NO：2的419至493和SEQ ID NO：2的494至551、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸1至33、SEQ ID NO：2的1至35、SEQ ID NO：2的1至64、SEQ ID NO：2的1至89、SEQ ID NO：2的1至113、SEQ ID NO：2的1至137、SEQ ID NO：2的1至161、SEQ ID NO：2的1至185、SEQ ID NO：2的1至209、SEQ ID NO：2的1至233、SEQ ID NO：2的1至257、SEQ ID NO：2的1至281、SEQ ID NO：2的1至305、SEQ ID NO：2的1至329、SEQ ID NO：2的1至353、SEQ ID NO：2的1至416、SEQ ID NO：2的1至424、SEQ ID NO：2的1至493、 SEQ ID NO：2的1至551、SEQ ID NO：2的1至531和SEQ ID NO：2的1至532、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法中的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸34至64、SEQ ID NO：2的34至89、SEQ ID NO：2的34至113、SEQ ID NO：2的34至137、SEQ ID NO：2的34至161、SEQID NO：2的34至185、SEQ ID NO：2的34至209、SEQ ID NO：2的34至233、SEQ ID NO：2的34至257、SEQ ID NO：2的34至281、SEQ ID NO：2的34至305、SEQ ID NO：2的34至329、SEQ IDNO：2的34至353、SEQ ID NO：2的34至416、SEQ ID NO：2的34至424、SEQ ID NO：2的34至493和SEQ ID NO：2的34至551、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法中的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸34至530、SEQ ID NO：2的34至531、SEQ ID NO：2的34至532、SEQ ID NO：2的34至533、SEQ ID NO：2的34至534、SEQ ID NO：2的34至535、SEQ ID NO：2的34至536、SEQ IDNO：2的34至537、SEQ ID NO：2的34至538、SEQ ID NO：2的34至539、SEQ ID NO：2的30至532、SEQ ID NO：2的31至532、SEQID NO：2的32至532、SEQ ID NO：2的33至532、SEQ ID NO：2的34至532、SEQ ID NO：2的35至532、SEQ ID NO：2的36至532、SEQ ID NO：2的30至531、SEQ ID NO：2的31至531、SEQ IDNO：2的32至531、SEQ ID NO：2的33至531、SEQ ID NO：2的34至531、SEQ ID NO：2的35至531和SEQ ID NO：2的36至531、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法中的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不 限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸36至64、SEQ ID NO：2的36至89、SEQ ID NO：2的36至113、SEQ ID NO：2的36至137、SEQ ID NO：2的36至161、SEQID NO：2的36至185、SEQ ID NO：2的36至209、SEQ ID NO：2的36至233、SEQ ID NO：2的36至257、SEQ ID NO：2的36至281、SEQ ID NO：2的36至305、SEQ ID NO：2的36至329、SEQ IDNO：2的36至353、SEQ ID NO：2的36至416、SEQ ID NO：2的36至424、SEQ ID NO：2的36至493和SEQ ID NO：2的36至551、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法中的另外的可溶的LINGO-1多肽包括但不限于包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸36至530、SEQ ID NO：2的36至531、SEQ ID NO：2的36至532、SEQ ID NO：2的36至533、SEQ ID NO：2的36至534、SEQ ID NO：2的36至535、SEQ ID NO：2的36至536、SEQ IDNO：2的36至537、SEQ ID NO：2的36至538和SEQ ID NO：2的36至539、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
另外的可溶的LINGO-1多肽、其片段、变体或衍生物包括包含LINGO-1的Ig结构域的多肽。例如，包含、主要由或由以下组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸417至493；SEQ IDNO：2的417至494；SEQ ID NO：2的417至495；SEQ ID NO：2的417至496；SEQ ID NO：2的417至497；SEQ ID NO：2的417至498；SEQ ID NO：2的417至499；SEQ ID NO：2的417至500；SEQ IDNO：2的417至492；SEQ ID NO：2的417至491；SEQ ID NO：2的412至493；SEQ ID NO：2的413至493；SEQ ID NO：2的414至493；SEQ ID NO：2的415至493；SEQ ID NO：2的416至493；SEQ IDNO：2的411至493；SEQ ID NO：2的410至493；SEQ ID NO：2的410至494；SEQ ID NO：2的411至494；SEQ ID NO：2的412至494； SEQ ID NO：2的413至494；SEQ ID NO：2的414至494；SEQ IDNO：2的415至494；SEQ ID NO：2的416至494；SEQ ID NO：2的417至494；和SEQ ID NO：2的418至494、或者这样的多肽的片段、变体或衍生物。 
用于本发明的方法中的可溶的LINGO-1多肽还包括本文公开的两种或更多种可溶LINGO-1多肽的组合。用于本发明的方法中的两种或更多种可溶的LINGO-1多肽可融合在一起以形成包含本文所公开的多个LINGO-1可溶多肽的单一的多肽，或可以是单独的可溶LINGO-1多肽，组成用于本发明的方法中的组合物。 
用于实行本发明的不同的示例性可溶LINGO-1多肽和获得这些分子的方法和材料描述于下文和/或可在例如PCT公开第WO2004/085648、WO 2006/002437、WO 2007/0059793、WO2007/008547、WO 2007/056161和WO 2007/064882号和美国公开专利申请第2006/017673号中找到，其通过引用全文并入本文。 
TrkB激动剂多肽 
本发明的方法中使用的TrkB激动剂多肽包括可促进、放大、增强或增加TrkB活性的任何多肽。这种蛋白包括但不限于包括神经营养蛋白例如BDNF、NT-3和NT-4/5的TrkB配体。此外，本发明的TrkB激动剂多肽还包括TrkB配体的片段、变体或衍生物以及嵌合的神经营养蛋白分子。在某些实施方式中，TrkB配体多肽、其片段、变体或衍生物是二聚化或多聚化的。本发明的TrkB激动剂多肽可作为同源二聚体或异源二聚体起作用。本发明的TrkB激动剂多肽还包括泛-神经生长素，例如在Ibanez等人EMBO12：12：2281-2293(1993)中所公开的那些。尤其是，本发明的TrkB激动剂多肽包括结合至TrkB的TrkB配体的结构域或者这种多肽的 变体。在本发明的特定的实施方式中，TrkB激动剂是脑源性神经营养因子(BDNF)或其片段、变体或衍生物。 
如美国专利第7,205,387号中所公开的，本发明的TrkB激动剂多肽可以是TrkB配体的发夹基序。另外地，TrkB配体多肽、其片段、变体或衍生物可融合至其他的蛋白或肽序列和/或可如美国专利第5,770,577号中所描述的连接至包括聚乙二醇的水溶性的聚合物，或可如美国专利第6,800,607号中所描述的连接至1-酰基-甘油衍生物。此外或可选择地，如美国专利第6,723,701号中所描述的，TrkB配体、其片段或变体可被改变以便增加施用时的稳定性，例如通过使用具有较低的等电点的变体。如Williams等人JBC 280：5862-5869(2004)中所描述的，TrkB配体，以及其片段或变体可串联布置并环化，例如以形成“小神经营养蛋白”，诸如BAG。 
此外，用于本发明的方法中的TrkB激动剂多肽包括但不限于TrkB多肽、其片段、变体或衍生物。用于本发明的方法中的TrkB多肽、其片段、变体或衍生物还包括包含、主要由或由融合至免疫球蛋白结构域的全长的TrkB蛋白组成的TrkB多肽，例如包含、主要由或由融合至IgG结构域的SEQ ID NO：4的氨基酸1至828、SEQID NO：4的32至828组成的TrkB多肽。本文描述的另外的TrkB多肽、其片段、变体或衍生物也可融合至免疫球蛋白结构域。在某些实施方式中，本发明的TrkB多肽被二聚化或多聚化。本发明的TrkB多肽还包括与SEQ ID NO：4的多肽相比，不与LINGO-1相互作用、具有增加的二聚化和多聚化的倾向、具有对内源或非内源配体的增加的亲和性和/或具有增加的激酶活性的TrkB片段、变体、同种型或衍生物。 
此外，用于本发明的方法中的另外的TrkB激动剂多肽还包括本文公开的两种或更多种TrkB激动剂多肽的组合。用于本发明的 方法中的两种或更多种TrkB激动剂多肽可融合在一起以形成含有多个本文公开的TrkB激动剂多肽的单一的多肽，或可以是单独的TrkB激动剂多肽，组成用于本发明的方法中的组合物。 
可溶的LINGO-1拮抗剂和/或trkB激动剂多肽 
用于本文描述的本发明方法中的可溶的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂多肽可以是环状的。可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽的环化减少了线性肽的构象自由度并产生结构上更受限的分子。肽环化的许多方法是本领域中已知的，例如通过肽的N-端和C端氨基酸残基之间的酰胺键的形成的“主链对主链”环化。 
“主链对主链”环化方法包括两个ω-硫代氨基酸残基(例如半胱氨酸、高半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的一些可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽包括对肽的N-端和C-端的修饰以形成环状的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽。这种修饰包括但不限于半胱氨酸残基、乙酰化的半胱氨酸残基、具有NH2部分和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其他方法描述于Li & Roller，Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)，其通过引用全文并入本文。 
本文描述的可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽可具有不同的变化例如取代、插入或缺失。例如，取代包括但不限于下列取代：SEQ ID NO：2的LINGO-1多肽的位置6的缬氨酸取代为甲硫氨酸；SEQ ID NO：2的LINGO-1多肽的位置294的丝氨酸取代为甘氨酸；SEQ ID NO：2的LINGO-1多肽的位置348的缬氨酸取代为丙氨酸；SEQ ID NO：2的LINGO-1多肽的位置419的精氨酸取代为组氨酸；位置456的精氨酸取代为谷氨酸；和SEQ ID NO：2的位置458的组氨酸取代为缬氨酸。 
预期可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽的相应的片段 与本文描述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。 
如本领域中已知的，两个多肽之间的“序列同一性”是通过将一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列对比来确定的。当在本文讨论时，可使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575ScienceDrive，Madison，WI 53711)来确定任何具体多肽是否是与另一种多肽至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法，以找到两个序列之间的最佳同源性部分。当使用BESTFIT或任何其他的序列比对程序以确定特定的序列是否是例如与根据本发明的参考序列95％相同时，当然设置参数以使同一性的百分比是对参考多肽序列的全长计算的，并且允许参考序列中的氨基酸总数的多达5％的同源性差异。 
用于本发明的方法中的可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽可包括两种或更多种可溶LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽的任意组合。 
抗体或其抗原结合片段 
在一个实施方式中，用于本发明的方法中的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂包括为LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。例如某些LINGO-1或TrkB抗体与如CNS神经元所表达的LINGO-1或TrkB的结合促进神经元存活。 
在某些实施方式中，LINGO-1抗体是1A7抗体。1A7抗体已被描述于2006年7月7日提交的国际申请PCT/US06/26271中，其 通过引用全文并入本文。1A7抗体的序列示于下文表格中。 
表3-1A7抗体序列 
本发明的抗体还可是包括1A7抗体的一个或多于一个CDR的抗体。下列分别是1A7抗体的VH CDR1、CDR2和CDR3区的序列：NYGMN(SEQ ID NO：10)、WINTDTGEPTYTEDFQG(SEQID NO：11)和EGVHFDY(SEQ ID NO：12)。下列分别是1A7抗体的VL CDR1、CDR2和CDR3区的序列：SASSSVSYMH(SEQ IDNO：13)、DTSKLAS(SEQ ID NO：14)和QQWSSNPFT(SEQ IDNO：15)。 
在某些实施方式中，LINGO-1抗体是单克隆抗体3B5.2(也称为3B5)，其可从杂交瘤2.P3B5.2生产。2.P3B5.2杂交瘤于2006年12月27日保藏于Mannasssas，VA的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，3B5抗体已被描述于2007年1月9日提交的美国临时申请第60/879,324号中，其通过引用全文并入本文。3B5抗体的序列示于下文表格中。 
表4-3B5抗体序列 
  多肽序列   SEQ  ID  NO：
  VH   QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCRASGYTFTSYWMH  WVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTNYNQKFRGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARPYYGSHWF  FDVWGTGTTVTVSS   16
  VL   QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVSYVHWYQ  QKSGTSPKRWLYDTSNLASGVPARFGGNGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSTNPPTFGGGTKLEIK   17
本发明的抗体还可是包括3B5抗体的一个或多于一个CDR的抗体。下列分别是3B5抗体的VH CDR1、CDR2和CDR3区的序列：SYWMH(SEQ ID NO：18)、VIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQID NO：19)和PYYGSHWFFDV(SEQ ID NO：20)。下列分别是3B5抗体的VL CDR1、CDR2和CDR3区的序列：SASSRVSYVH(SEQID NO：21)、DTSNLAS  (SEQ ID NO：22)和QQWSTNPPT(SEQID NO：23)。 
在某些实施方式中，LINGO-1抗体是单克隆抗体L133。L133抗体已被描述于2007年1月9日提交的美国临时申请第60/879,324号中，其通过引用全文并入本文。LI33抗体的序列示于下文表格中。 
表5-LI33抗体序列 
  多肽序列   SEQ ID  NO：
  VH   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYPMF  WVRQAPGKGLEWVSWIGPSGGITKYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAREGH  NDWYFDLWGRGTLVTVSS   24
  VL   DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA  WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPLTFGGGT  KVEIK   25
本发明的抗体还可是包括LI33抗体的一个或多于一个CDR的抗体。下列分别是LI33抗体的VH CDR1、CDR2和CDR3区的序列：IYPMF(SEQ ID NO：26)、WIGPSGGITKYADSVKG(SEQ IDNO：27)和EGHNDWYFDL(SEQ ID NO：28)。下列分别是LI33抗体的VL CDR1、CDR2和CDR3区的序列：RASQSVSSYLA(SEQID NO：29)、DASNRAT(SEQ ID NO：30)和QQYDKWPLT(SEQID NO：31)。 
在另一个实施方式中，LINGO-1抗体是单克隆抗体7P1D5.1G9，其可从杂交瘤7.P1D5.1.G9产生。7.P1D5.1.G9杂交瘤于2006年12月27日保藏于Mannasssas，VA的美国典型培养物保藏中心(ATCC)而7.P1D5.1.G9抗体被描述于 
用于本文所描述的方法中的某些LINGO-1拮抗剂抗体特异或优先地与特定的LINGO-1多肽片段或结构域结合。这种LINGO-1多肽片段包括但不限于包含下列氨基酸序列、主要由下列氨基酸序列组成或由下列氨基酸序列组成的LINGO-1多肽：SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；34至417、34至425、34至493、66至532、66至417(LRR结构域)、66至426、66至493、66至532、417至532、417至425(LINGO-1碱性区)、417至424(LINGO-1碱性区)、417至493、417至532、419至493(LINGO-1Ig区)、或SEQ ID NO：2的425至532、或者与SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；34至417、34至425、34至493、66至532、66至417、66至426、66至493、66至532、417至532、417至425(LINGO-1碱性区)、417至493、417至532、419至493(LINGO-1Ig区)或425至532至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的LINGO-1变体多肽。 
本发明的方法中使用的某些LINGO-1特异性抗体或其抗原结 合片段、变体或衍生物结合的另外的LINGO-1肽片段包括但不限于包含LINGO-1的一个或多个富含亮氨酸的重复序列(LRR)，主要由LINGO-1的一个或多个富含亮氨酸的重复序列(LRR)组成或由LINGO-1的一个或多个富含亮氨酸的重复序列(LRR)组成的那些片段。这些片段包括例如，包含下列氨基酸序列、主要由下列氨基酸序列组成或由下列氨基酸序列组成的片段：SEQ ID NO：2的氨基酸66至89、66至113、66至137、90至113、114至137、138至161、162至185、186至209、210至233、234至257、258至281、282至305、306至329或330至353。也预期与SEQ ID NO：2的氨基酸66至89、66至113、90至113、114至137、138至161、162至185、186至209、210至233、234至257、258至281、282至305、306至329、或330至353至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的变体LINGO-1多肽的相应片段。 
本发明的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合的另外的LINGO-1肽片段包括但不限于包含LINGO-1的LRR旁侧的富含半胱氨酸的区域、主要由LINGO-1的LRR旁侧的富含半胱氨酸的区域组成或由LINGO-1的LRR旁侧的富含半胱氨酸的区域组成的那些片段。这些片段包括例如包含SEQ ID NO：2的氨基酸34至64(N端的LRR旁侧区(LRRNT))、主要由SEQ ID NO：2的氨基酸34至64(N端的LRR旁侧区(LRRNT))组成或由SEQ ID NO：2的氨基酸34至64(N端的LRR旁侧区(LRRNT))组成的片段，或者包含SEQ ID NO：2的氨基酸363至416(C端的LRR旁侧区(LRRCT))、主要由SEQ ID NO：2的氨基酸363至416(C端的LRR旁侧区(LRRCT))组成或由SEQ ID NO：2的氨基酸363至416(C端的LRR旁侧区(LRRCT))组成的片段。也预期与SEQID NO：2的氨基酸34至64和363至416至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的变体LINGO-1多肽的相应的片段。 
在其它实施方式中，有待被用于本文所描述的方法中的LINGO-1拮抗剂包括特异或优先地与LINGO-1的至少一个表位结合的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述表位包含下列氨基酸、主要由下列氨基酸组成或由下列氨基酸组成：SEQ IDNO：2的至少四至五个氨基酸，SEQ ID NO：2的至少七个、至少九个或至少约15至约30个之间的氨基酸。如本文描述的SEQ ID NO：2的给定表位的氨基酸可以是但不必须是连续或线性的。在某些实施方式中，LINGO-1的至少一个表位包含下列表位、主要由下列表位组成或由下列表位组成：由在细胞表面上表达或为可溶片段(例如与IgG Fc区融合的)的LINGO-1的胞外结构域形成的非线性的表位。因此，在某些实施方式中，LINGO-1的至少一个表位包含下列氨基酸、主要由下列氨基酸组成或由下列氨基酸序列组成：SEQ IDNO：2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少约15至约30个之间、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续或不连续的氨基酸，其中不连续的氨基酸通过蛋白折叠形成表位。 
用于本文所描述的方法中的某些TrkB激动剂抗体特异或优先地与特定的TrkB多肽片段或结构域结合。例如，本发明的抗体可结合TrkB的IgG-1或IgG-2区中的表位并且可结合IgG-1和/或IgG-2结构域的环区中的序列。本发明的抗体还包括增加TrkB自体磷酸化的那些。TrkB激动剂抗体的某些非限制性实例还包括但不限于阻滞配体例如BDNF与TrkB受体结合的单克隆抗体、部分地阻滞配体例如BDNF与TrkB受体结合的单克隆抗体、不阻滞配体例如BDNF与TrkB受体结合的单克隆抗体和促进或增加配体例如BDNF与TrkB受体结合的单克隆抗体。本发明的TrkB激动剂抗体还包括不影响配体例如BDNF与TrkB受体结合的单克隆抗体。TrkB激动剂抗体的某些非限制性实例包括6E2、7F5、11E1、16E11、 17D11、19E12、29D7(其描述于美国公开专利申请第2007/0059304号和Quin等人，Jour.of Neuroscience.26：9394-9403(2006)中，其通过引用并入本文)以及与这些抗体结合相同表位的抗体或抗原结合片段。在本发明的方法中使用的示例性TrkB激动剂抗体还包括与上文列出的TrkB激动剂抗体特异性结合相同的TrkB表位的分离的抗体或其抗原结合片段。 
在本发明的方法中使用的示例性的抗体或其片段包括但不限于分离的抗体或其抗原结合片段，其与选自由下列单克隆抗体所组成的组的参考单克隆抗体特异性结合相同的LINGO-1表位：201′、3A3、3A6、3B5、1A7、1D5、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1B1.1F9、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、6P4F4.1Ds、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、1B6.4、2C7.2、2D6.1、2F7.3、2H3.2、3C11.1、3E3.1、3H11.2、3G8.1、2B8.1、3B5.230-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(L1a.1)、3495(L1a.2)、3563(L1a.3)、3564(L1a.4)、3565(L1a.5)、3566(L1a.6)、3567(L1a.7)、3568(L1a.8)、3569(L1a.9)、3570(L1a.10)、3571(L1a.11)、3582(L1a.12)、1968(L1a.13)、3011、3012、3013、3418、3422、3562、D05、D07、D08、D10和D11，如Mi等人2006年7月7日提交的题目为“Sp35 Antibodies and UsesThereof(Sp35抗体和其用途)”的国际申请PCT/US06/26271中所描述的，其通过引用全文并入本文。 
在其他的实施方式中，有待用于本发明的方法中的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂包括与LINGO-1或TrkB的至少一个表位特 异或优先地结合的LINGO-1或TrkB抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中表位分别包含下列氨基酸、分别主要由下列氨基酸组成或分别由下列氨基酸组成：分别如上所述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个连续的或不连续的氨基酸，和修饰蛋白的另外的部分，例如可包括糖部分以使LINGO-1或TrkB抗体以比其与未修饰版本的蛋白更高的亲和力与修饰的靶蛋白结合。可选择地，LINGO-1或TrkB抗体根本不与未修饰版本的蛋白结合。 
在某些实施方式中，有待用于本发明的方法中的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂包括本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其与上文描述的LINGO-1或TrkB或片段或变体的至少一个表位特异性结合，即与不相关的或随机的表位相比更容易地与这样的表位结合；优先地与上文描述的LINGO-1或TrkB或片段或变体的至少一个表位结合，即与相关的、相似的、同源的或类似的表位相比更容易地与这样的表位结合；竞争性抑制自身与上文描述的LINGO-1或TrkB或片段或变体的某个表位特异或优先地结合的参考抗体的结合；或以由低于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10-5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M的解离常数KD表征的亲和力与上文描述的LINGO-1或TrkB或片段或变体的至少一个表位结合。在特定的方面，相对于鼠LINGO-1或TrkB多肽或其片段，抗体或其片段优先地与人类LINGO-1或TrkB多肽或其片段结合。 
如抗体结合解离常数的上下文中所用的，术语“约”允许用于 测量抗体亲和力的方法中本身固有的程度的变化。例如取决于所使用的仪器的精确度的水平，基于所测量的样品数目的标准误差和舍入误差，术语“约10-2M”可包括例如从0.05M至0.005M。 
在特定的实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂包括本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其以小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1的解离速率((k(off))与LINGO-1或TrkB多肽或其片段或变体结合。可选择地，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率((k(off))与LINGO-1或TrkB多肽或其片段或变体结合。 
在其他的实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂包括本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其以大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1的结合速率(k(on))与LINGO-1或TrkB多肽或其片段或变体结合。可选择地，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1或5×106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合速率(k(on))与LINGO-1或TrkB多肽或其片段或变体结合。 
在一个实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体是抗体分子或其免疫特异性片段。除非特别指出，否则如本文所用的，关于抗体的“其片段”是指免疫特异性片段，即抗原特异性片段。在一个实施方式中，本发明方法中所使用的抗体是双特异性的结合分子、结合多肽或抗体，例如具有对多于一个表位，例如具有对多于一种抗原或相同抗原上的多于一个表位的结合特异性的双特异性抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体、或 融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性抗体具有对LINGO-1或TrkB的至少一个表位特异性的至少一个结合结构域。双特异性抗体可以是四价抗体，其具有对LINGO-1或TrkB的表位特异性的两个靶结合结构域和对另一个靶特异性的两个靶结合结构域。因此，四价双特异性抗体可以是对每一个特异性二价的。 
本发明的某些方法包括施用LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一部分缺失或者以其它方式改变以提供所需要的生物化学特征，例如与具有几乎相同的免疫原性的完整的未改变的抗体相比，减少的效应子功能、非共价二聚化的能力、增加的定位于所期望的位点的能力、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，本文描述的方法中所使用的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包含与免疫球蛋白重链相似但是缺少一个或多个重链结构域的至少一部分的多肽链。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整的结构域将缺失，例如CH2结构域的全部或部分将缺失。 
在本文所描述的方法中使用的某些LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段中，可使用本领域中已知的技术将Fc部分突变以降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方法)将降低循环中的修饰的抗体的Fc受体结合，从而增加在所期望的作用位点的定位。在其他的实例中，可以是根据本发明的恒定区修饰调节补体结合并且由此降低了轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性结合。其他所期望的对恒定区的修饰包括设计以改变糖基化(例如以减少糖基化)以便影响效力、安全性、抗原结合、Fc效应子功能、稳定性和/或抗体产物一致性的突变。另外可期望的修饰包括改变抗体溶解度的修饰，例如通过已知或预期参与多聚体形成的残基的修饰。恒定区的其他的修饰可被用于修饰二硫键或寡糖部分，其允许由增加的抗原特异性或抗体柔性 所导致的增强的定位。所产生的生理谱、生物可利用率和修饰的其他生物化学影响例如定位、生物分布或血清半衰期可使用熟知的免疫技术容易地被测量并且定量而无需过多的实验。 
可使用本领域中已知的技术从完整的前体或母体抗体制备本文公开的方法中所使用的抗体或其免疫特异性片段的修饰的形式。本文更详细地讨论了示例性技术。 
在某些实施方式中，本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段的可变区或恒定区是完全人类的。可使用本领域已知的技术并如本文所描述的制备完全人类的抗体。例如，抗特异性抗原的完全人类的抗体可通过向已被修饰以响应于抗原性攻击产生这种抗体但其内源基因座已不可用的转基因动物施用抗原来制备。可用来制备这种抗体的示例性技术描述于美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140中。其他技术是本领域中已知的。同样地，完全人类的抗体可通过不同的展示技术例如噬菌体展示或其他的病毒展示系统来生产，如本文其他地方更详细地描述的。 
可使用本领域已知的技术来制备或制造本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，是使用重组DNA技术产生的。在本文其他地方更详细地讨论了用于制备抗体分子或其片段的示例性的技术。 
本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂抗体或其片段可通过本领域中已知的任何适当的方法来产生。 
可通过本领域中熟知的多种程序来生产多克隆抗体。例如可向不同的宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等施用LINGO-1或 TrkB免疫特异性片段以诱导含有对抗原特异性的多克隆抗体的血清的产生。取决于宿主物种，可使用不同的佐剂以增加免疫响应并且佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、肽、油性乳液、钥孔戚血蓝素、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂例如BGG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这种佐剂也是本领域中熟知的。 
可使用本领域已知的各种各样的技术包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合的使用来制备单克隆抗体。例如，可使用包括本领域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版.(1988)；Hammerling等人，在：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)Elsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述文献通过引用全文并入)中教导的那些的杂交瘤技术来生产单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆包括真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是产生其的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。可使用本领域已知的各种各样的技术包括杂交瘤和重组和噬菌体展示的使用来制备单克隆抗体。 
在一个实例中，使用本领域认可的方案，通过多次的皮下或腹腔内注射相关抗原(例如纯化的LINGO-1或TrkB抗原或包含这种抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂来在哺乳动物中产生抗体。这一免疫接种通常导致免疫响应，包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体。尽管可以从动物血清收集所得的抗体以提供多克隆的制剂，但常常期望的是从脾、淋巴结或外周血分离单一的淋巴细胞以提供单克隆抗体(mAb)的同源制品。淋巴细胞可以例如从 脾获得。 
在这一熟知的过程(Kohler等人，Nature 256：495(1975))中，将来自已经用抗原注射的哺乳动物的相对短寿命的或必死的淋巴细胞与不死的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，由此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是不死的并且能够产生B细胞的遗传编码的抗体。所得的杂交物通过每种单独的含有对于单一抗体的形成来说特异的基因的株的筛选、稀释和再生而被分离为单一的遗传株。它们产生抗所期望的抗原的同质的抗体并且就它们的纯的遗传来源来说是所谓的“单克隆的”。 
通常，接种由此制备的杂交瘤细胞并且培养在含有抑制未融合的母本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的适当培养基中。本领域技术人员应理解的是，用于杂交瘤的形成、筛选和培养的试剂、细胞系和培养基是可商业上从多个来源获得的并且标准流程是已建立的。通常，为了产生抗所期望的抗原的单克隆抗体而测定在其中培养杂交瘤细胞的培养基。杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性可通过体外测定例如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。杂交瘤细胞被鉴定为产生具有所期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体之后，可将克隆通过有限的稀释程序来亚克隆并通过标准方法来培养(Goding，Monoclonal A ntibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，Academic Press，第59-103页(1986))。还应理解的是，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规的纯化程序例如蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水液或血清分离。 
识别特异抗原的抗体片段可通过已知的技术产生。例如Fab和F(ab’)2片段可使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白 酶(以产生F(ab’)2片段)通过免疫球蛋白分子的蛋白水解性裂解来产生。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。 
本领域技术人员还应当理解的是，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)的DNA也可衍生自抗体噬菌体文库。尤其是，这种噬菌体可用来展示从全部或组合的抗体文库(例如人类或小鼠的)表达的抗原结合结构域。可用抗原，例如使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或小珠的抗原来筛选或鉴定表达结合所感兴趣的抗原的抗原结构域的噬菌体。这些方法中所用的噬菌体通常是包含从具有重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达的fd和M13结合结构域的丝状噬茵体。示例性的方法展示于例如EP 368 684 B1；美国专利5,969,108、Hoogenboom，H.R.和Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy等人Nat.Med.8：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中，其每一个通过引用并入本文。若干出版物(例如Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))已经描述了通过作为用于构建大的噬菌体文库的策略的链改组以及组合感染和体内重组来产生高亲和性的人类抗体。在另一个实施方式中，核糖体展示可用来代替噬菌体作为展示的平台(参见例如Hanes等人，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在还有另外的实施方式中，可对细胞表面文库筛选抗体(Boder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty等人，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。这种程序提供了用于分离和随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术的替代技术。 
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。尤其是，编码VH和VL 区的DNA序列是从动物eDNA文库(例如淋巴组织的人类或鼠cDNA文库)或者合成的cDNA文库扩增的。在某些实施方式中，编码VH和VL区的DNA通过PCR由scFV接头连接在一起并且克隆至噬菌粒载体(例如p CANTAB 6或pComb 3HS S)中。载体被电穿孔至大肠杆菌(E.coli)中并且用辅助噬菌体感染大肠杆菌。这些方法中所用的噬菌体通常是包含fd和M13的丝状噬菌体，并且VH和VL区通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可使用抗原例如使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或小珠的抗原筛选或鉴定表达结合所感兴趣的抗原(例如LINGO-1或TrkB多肽或其片段)的抗原结合结构域的噬菌体。 
可用来制备抗体的噬菌体展示方法的另外的实例包括Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公开WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO95/20401和美国专利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108中公开的那些，其每一个都通过引用全文并入本文。 
如上文参考文献中所描述的，在噬菌体筛选后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生整个抗体，包括人类抗体或任何其他所期望的抗原结合片段，并在任何所期望的宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达。例如，使用本领域已知的方法例如PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34 (1995)和Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献通过引用全文并入本文)中描述的那些，也可使用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术。 
在另一个实施方式中，使用常规程序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可容易地分离并测序编码本发明的方法中所使用的期望的单克隆抗体的DNA。分离并亚克隆的杂交瘤细胞作为这种DNA的可能的来源。分离后，DNA可被放入表达载体中，其之后被转染至不另外产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中。更特别地，如Newman等人1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中描述的，分离的DNA(其可以是如本文所描述的合成的)可用于克隆恒定区和可变区序列以便制造抗体。必然地，这使得从所筛选的细胞提取RNA、转化为cDNA并且通过使用Ig特异性引物的PCR扩增成为必需。用于这一目的的适合的引物也描述于美国专利第5,658,570号中。如下文中将更详细地讨论的，可以相对大的量培养表达所期望的抗体的转化的细胞以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。 
在特定的实施方式中，可通过本领域熟知的方法例如通过与已知的其他重链和轻链可变区的氨基酸序列相比较以确定序列高可变性的区域来检查重链和/或轻链的可变结构域的氨基酸序列以鉴定互补决定区(CDR)的序列。使用常规的重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入框架区，例如插入人类框架区以使非人类抗体人源化。框架区可以是天然存在的或通用的框架区，并且可以是人类框架区(参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人类框架区的列表)。通过将框架区和CDR组合产生的多核苷酸可编码与所期望的多肽例如LINGO-1的至少一个表位特异性结 合的抗体。可在框架区中进行一个或多个氨基酸取代并且氨基酸取代可改善抗体与其抗原的结合。此外，这种方法可用于对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行氨基酸取代或缺失以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其他改变也被本发明包括并且在本领域技术的范围内。 
在某些实施方式中，本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段将不会在有待被治疗的动物例如人类中导致有害的免疫响应。在一个实施方式中，可使用本领域公认的技术修饰本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段以减少它们的免疫原性。例如抗体可被人源化、灵长源化、去免疫化，或可使用嵌合抗体。这些类型的抗体来自非人类抗体，通常是鼠或灵长类抗体，其保留或基本保留母本抗体的抗原结合特性，但是其在人类中免疫原性较低。这可通过不同的方法实现，所述方法包括(a)将整个非人类可变结构域嫁接到人类恒定区上以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分嫁接到保留或不保留关键框架残基的人类框架和恒定区中；或(c)移植整个非人类可变结构域，但是通过替换表面残基将它们用类人类的部分“遮蔽”。这些方法公开于Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)和美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370号中，其所有都通过引用全文并入本文。 
去免疫化还可用于减少抗体的免疫原性。如本文所用的，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的VH 和VL序列并且将人类T细胞表位从每个V区“作图”，显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列中其他关键残基的定位。分析T细胞表位图的单独的T细胞表位以便鉴定具有改变最终抗体的活性的低风险的可选择的氨基酸取代。设计可选择的VH和VL序列的范围，包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被并入至本文所公开的方法中使用的结合多肽例如LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫特异性片段的范围中，之后检测其功能。通常产生并检测12至24个变体抗体。之后将包含修饰的V区和人类C区的完整的重链和轻链基因克隆至表达载体中并且随后将质粒引入细胞系中以便产生整个抗体。之后将抗体在适当的生物化学和生物学测定中比较并鉴定最佳的变体。 
嵌合抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有来自小鼠单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715、4,816,567和4,816397号，其通过引用全文并入本文。人源化抗体是来自结合所期望的抗原的非人类物种的抗体的抗体分子，具有来自非人类物种的一个或多个抗原决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。常常，人类框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应的残基取代以改变并且可能地改善抗原结合。这些框架取代通过本领域中熟知的方法来鉴定，例如通过CDR和框架残基的相互作用的建模来鉴定对抗原结合来说重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置的罕见的框架残基(参见例如Queen等人，美国专利第5,585,089号；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其通过引用全文并入本文)。可使用本领域已知的各种技术来将抗体人源化，包括例如CDR嫁接(EP239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利第5,225,539、5,530,101 和5,585,089号)、镶饰(veneering)或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。 
用于产生重组抗体的另一个高效的方法由Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)公开。特别地，这一技术导致含有猴可变结构域和人类恒定序列的灵长源化抗体的产生。这一参考文献通过引用全文并入本文。而且这一技术还描述于共同受让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号中，其每一个都通过引用全文并入本文。 
对于人类患者的治疗处理来说，完全人类的抗体是尤其期望的。人类抗体可通过本领域已知的各种方法来制备，其包括使用来自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上文所描述的噬菌体展示法。也参见美国专利第4,444,887和4,716,111号以及PCT公开WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，其每一个通过引用全文并入本文。 
还可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但是可表达人类免疫球蛋白的转基因小鼠产生人类抗体。例如，人类重链和轻链免疫球蛋白基因络合物可随机地或通过同源重组被引入小鼠胚胎干细胞中。可选择地，除了人类重链和轻链基因以外，人类可变区、恒定区和多变区可被引入小鼠胚胎干细胞中。可通过通过同源重组引入人类免疫球蛋白基因座分别或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能。特别地，JH区的纯合缺失阻止了内源抗体的产生。修饰的胚胎干细胞可被扩展并微注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。之后繁殖嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合后代。用选择的抗原例 如所期望的靶多肽的全部或一部分以通常的方式将转基因小鼠免疫。可使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得抗抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠携带的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用来生产人类抗体的这一技术的综述，参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对于这一用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的技术和产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其通过引用并入本文。此外，可雇用公司例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)以使用与本文描述相似的技术提供抗所选择的抗原的人类抗体。 
另一种使用SCID小鼠产生人类抗体的方法公开于美国专利第5,811,524号中，其通过引用并入本文。可以理解的是，可如本文所描述的分离和操作与这些人类抗体相关的遗传物质。 
可使用也称为“定向选择”的技术产生识别所选择的表位的完全的人类抗体。在这一方法中，所选择的非人类单克隆抗体例如小鼠抗体被用于定向选择识别相同抗原的完全人类抗体(Jespers等人，Bio/Technology 12：899-903(1988))。也参见美国专利第5,565,332号。 
可选择地，为了产生单链抗体所描述的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)和Ward等人，Nature334：544-554(1989))可被适用于产生单链抗体。单链抗体通过将Fv区的重链和轻链片段通过氨基酸桥连接产生单链抗体来形成。也可 使用用于组装大肠杆菌中功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。可用来产生单链Fv和抗体的技术的实例包括公开于美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS90：7995-7999(1993)和Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)中的那些。对于某些用途(尤其是包括人类中抗体的体内使用和体外检测测定)来说，可使用嵌合的、人源化的或人类抗体。 
此外，可使用为了通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起产生“嵌合抗体”所开发的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))。如本文所用的，嵌合抗体是其中不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有来自小鼠单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些，诸如人源化抗体。 
LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体还可以是在不能产生内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中产生的人类或基本上人类的抗体(参见例如美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369号，其每一个通过引用并入本文)。例如，已经描述了嵌合和胚系突变小鼠中抗体重链连接区的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人类免疫球蛋白基因阵列转移至这一胚系突变小鼠将导致在抗原攻击后产生人类抗体。 
在另一个实施方式中，可通过显微操作来选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫的哺乳动物分离外周血单核细胞并体外培养约7天。可筛选培养物中符合筛选标准的特异性IgG。可分离来自阳性孔的细胞。可通过FACS来分离单独的产生Ig的B细胞， 或通过在补体介导的溶血斑测定中鉴定单独的产生Ig的B细胞而分离。可将产生Ig的B细胞显微操作至试管中并且可使用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可将VH和VL基因克隆至抗体表达载体中并转染至细胞(例如真核或原核细胞)中以便表达。 
可选择地，可使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养产生抗体的细胞系。这种技术描述于各种实验室手册和基础出版物中。在这一方面，如下文所描述的适于在本发明中使用的技术描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等人编辑，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)中，其通过引用全文包括增补并入本文。 
本文所公开的方法中使用的抗体可通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法，尤其是通过化学合成或通过本文所描述的重组表达技术来产生。 
还应理解的是，本发明的范围还涵盖抗原结合DNA序列的所有等位基因、变体和突变体。 
正如所熟知的，可通过标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀之后离心或层析从原始的杂交瘤细胞或从其他转化的细胞分离RNA。期望的话，可通过标准技术例如寡聚脱氧胸苷纤维素上的层析从总RNA分离mRNA。适合的技术是本领域中熟知的。 
在一个实施方式中，可根据熟知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶同时或分别制备编码本发明的方法中所使用的抗体的重链和轻链的cDNA。可通过通用的恒定区引物或通过基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异的引物来起始PCR。如上文所讨论的，还可使用PCR以分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这一实例中，可通过通用的引物或较大的同源探针例如小鼠恒定 区探针来筛选文库。 
DNA，通常是质粒DNA，可使用本领域已知的技术从细胞分离，根据详细地在例如前文的与重组DNA技术相关的参考文献中展示的标准的熟知的技术进行限制性作图并测序。当然，可根据本发明在分离过程或随后的分析过程中的任何点合成DNA。 
抗体或其片段、衍生物或类似物例如为LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(其可含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸后，用于产生抗体分子的载体可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术来产生。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适合的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此本发明提供了可操作地连接至启动子的包含编码本发明的抗体分子或者其重链或轻链或者重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公开WO 86/05807、PCT公开WO 89/01036和美国专利第5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可被克隆至这样的载体中以便表达整个重链或轻链。 
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中并且之后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文所描述的方法中所使用的抗体。因此，本发明包括含有可操作地连接至异源启动子的编码本发明的抗体或者其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的某些实施方式中，如下文所详细描述的，编码重链和轻链两者的载体可在宿主细胞中共表达以便表达整个免疫球蛋白分子。 
各种宿主表达载体系统可用来表达在本文其他地方描述的方法中使用的抗体分子。 
可用本发明的两个表达载体，编码衍生重链的多肽的第一载体和编码衍生轻链的多肽的第二载体，共转染宿主细胞。两个载体可含有同一可选择的标记，其能够使重链和轻链相等表达。可选择地，可使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，轻链被有利地置于重链之前以避免有毒的自由重链过量(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA和基因组DNA。 
本发明的抗体分子被重组表达后，其可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析、特别是在蛋白A之后通过对特异抗原的亲和层析和分级柱层析)、离心、差异溶解或通过纯化蛋白的任何其他的标准技术。可选择地，用于增加本发明的抗体的亲和力的另一种方法公开于美国2002 0123057A1中，其通过引用并入本文。 
在一个实施方式中，本发明的方法中使用的结合分子或抗原结合分子包含合成的恒定区，其中缺失一个或多个结构域的部分或全部(“缺失结构域的抗体”)。在某些实施方式中，相容的修饰的抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被去除(ΔCH2构建体)。对于另外的实施方式，可用短的连接肽取代所缺失的结构域以提供可变区的运动的柔性和自由度。本领域技术人员应理解的是，由于CH2结构域对抗体的代谢速度的调节特性所以这种构建体是特别有用的。 
在某些实施方式中，本文所公开的方法中所使用的修饰的抗体是微型抗体。可使用本领域中描述的方法来制备微型抗体(参见， 例如美国专利5,837,821或WO 94/09817A1)。 
在另一个实施方式中，本文所公开的方法中所使用的修饰的抗体是本领域已知的缺失CH2结构域的抗体。可使用编码IgG1人类恒定区结构域的载体(例如来自Biogen IDEC Incorporated)产生缺失结构域的构建体(参见例如WO 02/060955A2和WO02/096948A2，其通过引用并入本文)。这一示例性载体被工程化以缺失CH2结构域并提供表达缺失结构域的IgG1恒定区的合成的载体。 
在一个实施方式中，本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其片段包含具有几个甚至单个氨基酸缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的结合。相似地，可能所期望的是仅缺失控制有待被调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分。这种恒定区的部分缺失可改善抗体的所选择的特征(血清半衰期)而将其与主题恒定区结构域有关的其它期望的功能保留完整。而且，如上文所提及的，所公开的抗体的恒定区可以是通过增强所得的构建体的概况(profile)的对一个或多个氨基酸的突变或取代来合成的。在这一方面，破坏由保守的结合位点提供的活性(例如Fc结合)而大致上维持所修饰的抗体的构象和免疫原性概况是可能的。还有其他的实施方式包括向恒定区加入一个或多个氨基酸以增强所期望的特征例如效应子功能或提供更多的细胞毒素或糖类连接。在这种实施方式中，可能所期望的是插入或复制衍生自所选择的恒定区结构域的特定序列。 
本发明还提供了抗体的用途，所述抗体包含下列、主要由下列组成或由下列组成：本文所描述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)，其中抗体或其片段免疫特异地与 LINGO-1或TrkB多肽结合。本领域技术人员已知的标准技术可用来将突变引入编码结合分子的核苷酸序列中，其包括但不限于产生氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。变体(包括衍生物)可编码相对于参考的VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代、或少于2个氨基酸的取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基取代的取代。在本领域中具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选择地，可随机地沿全部或部分编码序列引入突变，例如通过饱和诱变，并且可筛选所得到的突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。 
例如，仅向抗体分子的框架区或仅向抗体分子的CDR区引入突变是可能的。所引入的突变可以是沉默或中性的错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有影响或仅有极少影响。这些类型的突变对优化密码子选择或改善杂交瘤的抗体生产来说可能是有用的。可选择地，非中性的错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默或中性的错义突变的定位倾向于在框架区中，而大多数非中性的错义突变的定位倾向于在CDR中，尽管这不是绝对的要求。本领域 技术人员应当能够设计并检测具有所期望的特性的突变分子，例如抗原结合活性上没有改变或结合活性上有改变(例如抗原结合活性上的改善或抗体特异性上的变化)。诱变之后，所编码的蛋白可被常规地表达并且可使用本文所描述的技术或通过本领域已知的常规的修饰技术确定所编码的蛋白的功能和/或生物活性。 
本发明的方法中使用的另外的拮抗剂和激动剂和其组合 
除了之前描述的激动剂和拮抗剂，本发明的方法中使用的另外的TrkB激动剂包括其将促进、增加或增强TrkB的活性的任何多肽、抗体、化合物或核苷酸。这种激动剂包括多肽、抗体、化合物或核苷酸，其干扰或促进TrkB配体例如脑来源的神经营养因子(BDNF)与TrkB受体的结合并且因此也被称为BDNF激动剂。这种分子包括但不限于扰乱配体和TrkB之间的相互作用的抗体、TrkB的肽模拟激动剂和配体类似物，例如5,770,577、6,077,829、6,723,701、和6,800,607中所描述的那些，其通过引用全文并入本文。 
本发明的方法中使用的本文所描述的拮抗剂和激动剂可作为组合物而以不同组合施用。例如，不同的TrkB激动剂可用来与LINGO-1拮抗剂组合。在本发明的方法中使用的组合物还可包括多种TrkB激动剂和/或LINGO-1拮抗剂。 
另外，在本发明中使用的组合物可包括在CNS中表达的蛋白(例如Nogo受体1(NgR1)、LINGO-1(LINGO-1)、TAJ或少突胶质细胞-髓鞘质糖蛋白(OMgp))的其它拮抗剂或激动剂。NgR1的拮抗剂描述于美国公开第2002/0077295和2005/0271655A1号和国际申请公开第WO 01/51520、WO 03/031462、WO 2004/014311和WO 2005/016955号中，其通过引用全文并入本文。LINGO-1(LINGO-1)的拮抗剂可在美国公开第2006/0009388A1号和国际 申请公开第WO 2004/085648号中找到，其通过引用全文并入本文。TAJ拮抗剂的实例描述于美国公开第2006/0058223A1号中，其通过引用全文并入本文。OMgp拮抗剂描述于美国临时申请第60/730,357和60/735,170号中，其通过引用全文并入本文。在本发明的方法中使用的组合物还可包括任何数目和组合的TrkB、LINGO-1、NgR1、TAJ和OMgp拮抗剂。 
适体 
在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂是适体。适体可以是具有独特序列、具有特异性地与所期望的靶(例如多肽)特异结合的特性并且是给定的靶的特异配体的核苷酸或多肽。本发明的核苷酸适体包括与LINGO-1或TrkB结合的双链DNA和单链RNA分子。 
可使用本领域已知的方法例如通过通过指数富集的配体的系统进化(SELEX)过程来选择核酸适体。SELEX是用于具有与靶分子的高特异性结合的核酸分子的体外进化方法，如例如美国专利第5,475,096、5,580,737、5,567,588、5,707,796、5,763,177、6,011,577和6,699,843号中所描述的，其通过引用全文并入本文。鉴定适体的另一种筛选方法描述在美国专利第5,270,163号(也通过引用并入本文)。SELEX过程是以核酸形成各种二维或三维结构的能力、以及在核苷酸单体中可获得的作为实际上任何化合物的配体(形成特异结合对)的化学多功能为基础的，所述化合物无论是单体或聚合的，包括任何其它核酸分子和多肽。任何大小的分子或组合物都可作为靶。 
SELEX方法包括从候选寡核苷酸的混合物选择并且使用相同的总选择方案逐步重复结合、分离和扩增以达到所期望的结合亲和 力和选择性。从含有随机化的序列的片段的核酸混合物开始，SELEX方法包括下列步骤：在适于结合的条件下将混合物与靶混合；将未结合的核酸与已经与靶分子特异性结合的那些核酸分离；解离核酸-靶络合物；扩增从核酸-靶络合物解离的核酸以产生富集配体的核酸混合物。将结合、分离、解离和扩增的步骤如所需的重复许多个循环以产生靶分子的高特异性的高亲和力核酸配体。 
核苷酸适体可用作例如诊断工具或用作分析细胞内信号转导和运输途径的特异性抑制剂。参见James Curr.Opin.Pharmacol.1：540-546(2001)。核苷酸适体的高亲和力和特异性使得它们成为药物开发的良好候选者。例如，蓖麻毒素的适体拮抗剂已经被分离并且具有纳摩尔范围内的IC50值。参见Hesselberth JR等人J BiolChem 275：4937-4942(2000)。核苷酸适体还可被用来抗感染性疾病、恶性肿瘤和病毒表面蛋白以减少细胞传染力。 
如本文中对其它多核苷酸所描述的，本发明的方法中使用的核苷酸适体可以被修饰(例如通过修饰主链或碱基或与肽轭合)。 
使用LINGO-1或TrkB的蛋白结构，使用SELEX过程筛选对LINGO-1或TrkB起作用的适体将允许鉴定抑制LINGO-1介导的或促进TrkB-介导的过程(例如LINGO-1或TrkB-介导的细胞存活的促进)的适体。 
本发明的方法中使用的多肽适体是从它们与LINGO-1结合并阻滞LINGO-1作用的能力选择的随机多肽。多肽适体可包括在两个末端与蛋白支架相连的短的可变肽结构域。这一双重的结构上的约束将肽适体的结合亲和力大大增加至可与抗体相比的水平(纳摩尔范围)。参见例如Hoppe-Seyler F等人J.Mol.Med.78(8)：426-430(2000)。短的可变肽的长度通常为约10至20个氨基酸，并且支架 可以是具有良好的溶解性和紧凑度特性的任何蛋白。支架蛋白的一个非限制性实例是细菌蛋白硫氧还蛋白-A。参见例如Cohen BA等人PNAS 95(24)：14272-14277(1998)。本发明的方法中使用的多肽适体的另外的非限制性的实例是配体调节的肽适体(LiRPA)。LiRPA支架可包括三个蛋白结构域：FK506结合蛋白(FKBP)、FRBP-雷帕霉素结合结构域(FRB)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。参见例如Binkowski BF等人，Chem & Biol 12(7)：847-855(2005)，其通过引用并入本文。 
多肽适体是作为蛋白功能的主要抑制剂起作用的肽或小的多肽。肽适体与靶蛋白特异结合，阻滞它们的起作用的能力。Kolonin等人Proc.Natl.Acad.Sci.95：14，266-14，271(1998)。以高亲和力和特异性与靶蛋白结合的肽适体可通过本领域已知的多种方法来分离。可通过酵母双杂交筛选(Xu，C.W.等人Proc.Natl.Acad.Sci.94：12，473-12，478(1997))或通过核糖体展示(Hanes等人Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942(1997))从随机的肽文库分离肽适体。还可从噬菌体文库(Hoogenboom，H.R.等人Immunotechnology 4：1-20(1998))或者化学生成的肽文库分离它们。尽管合成肽适体的困难方法使得它们的使用比多核苷酸适体更加复杂，但是它们具有无限制的化学多样性。 
如本文其他地方对其他多肽所描述的，本发明的方法中使用的肽适体可以被修饰(例如被轭合至多聚体或与蛋白融合)。 
融合蛋白和轭合的多肽、适体、化合物和抗体 
本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物和抗体还可在N-或C-端与异源多肽重组融合或者与多肽或其他分化学轭合(包括共价和非共价轭合)。例如， LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物和抗体可与在检测测定中用作标签的分子和效应子分子例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素重组融合或轭合。参见例如PCT公开WO92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美国专利第5,314,995号和EP 396,387。 
本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物和抗体包括被修饰(即通过共价连接任何类型的分子以致共价连接不阻止LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物或抗体抑制LINGO-1或TrkB的生物学功能)的衍生物。例如，但是以非限制性的方式，本发明的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物和抗体可被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、膦酸化(phosphylation)、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护或封闭基团的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞配体或其他蛋白结合等。可通过已知的技术实现许多化学修饰中的任一种，包括但不限于特异化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可包含一个或多个非典型的氨基酸。 
本文所公开的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体和抗体可包括通过肽键或修饰的肽键即肽电子等排体彼此结合的氨基酸，并且可含有除了20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。可通过自然过程例如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体和抗体。这种修饰详细描述于基础教科书以及更详细地描述于专题论文以及大量的研究文献中。修饰可在LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽或抗体中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端或在例如糖的部分上。可以理解的是，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体中的多个位点。而且，给定的LINGO-1拮抗剂或 TrkB激动剂多肽、适体或抗体可包含许多类型的修饰。LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体可以是支链的，例如作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，具有或不具有支链。环状、支链和支链环状的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体和抗体可从翻译后的自然过程获得或者可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白加入氨基酸例如精氨酸化(arginylation)和泛素化(参见例如Proteins-Structure and Molecular Properties(蛋白-结构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，New York第2版.，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann NYAcad Sci 663：48-62(1992))。 
本发明还提供了融合蛋白，其包含下列、主要由下列组成或由下列组成：抑制或降低LINGO-1或者增加或促进TrkB功能的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体融合物。在一些实施方式中，LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体与之融合的异源多肽对功能是有用的，或者对靶向LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽或抗体是有用的。在本发明的某些实施方式中，可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽，例如包含LRR结构域、Ig结构域或整个胞外结构域(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸34至532)的LINGO-1多肽被融合至异源多肽部分以形成LINGO-1 拮抗剂融合多肽或TrkB-激动剂多肽，例如BDNF多肽被融合至异源多肽部分以形成TrkB激动剂融合多肽。LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂融合蛋白、适体和抗体可用于实现不同目的，例如增加的血清半衰期、改善的生物可利用率、体内靶向特定的器官或组织类型、改善的重组表达效力、改善的宿主细胞分泌、容易纯化和高亲合力。取决于有待实现的目的，异源部分可是惰性或是生物学上活性的。同样，可以选择稳定融合至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体或者是体内或体外可裂解的。达到这些另外的目的的异源部分是本领域已知的。 
作为表达LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂融合多肽、适体或抗体的替代，选择的异源部分可被预先形成并且化学地与LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体轭合。在大多数情况下，无论融合还是轭合至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体，所选择的异源部分将相似地起作用。因此，在下列异源氨基酸序列的讨论中，除非以另外的方式说明，否则应当理解的是，异源序列可以融合蛋白形式或作为化学轭合物连接至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体。 
药理上有活性的多肽例如LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体常常表现出迅速在体内清除，于是被迫使用大剂量以在体内达到治疗上有效的浓度。此外，小于约60kDa的多肽可能经历肾小球过滤，其有时导致肾毒性。可使用相对小的多肽例如LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的融合或轭合以减少或避免这种肾毒性的风险。用于增加治疗性多肽的体内稳定性(即血清半衰期)的不同异源氨基酸序列(即多肽部分或“载体”)是已知的。 
由于其长的半衰期、广泛的体内分布和酶促功能或免疫功能的 缺乏，大致上全长的人类血清白蛋白(HSA)或HSA片段通常被用作异源部分。通过使用例如Yeh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：1904-08(1992)和Syed等人，Blood 89：3243-52(1997)中所教导的那些方法和材料，HSA可用来形成由于LINGO-1或TrkB-激动剂部分而表现出生理活性并表现体内稳定性上的显著增加例如高10倍至100倍的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂融合多肽、适体、抗体或多肽/抗体轭合物。HSA的C-端可融合至可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分的N-端。由于HSA是天然分泌蛋白，当融合蛋白在真核例如哺乳动物表达系统中产生时，HSA信号序列可用于获得可溶LINGO-1或TrkB-激动剂融合蛋白向细胞培养基中的分泌。 
在某些实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体和其抗体片段还包含靶向部分。靶向部分包括指导定位至身体的某部分，例如定位至脑或其中的室的蛋白或肽。在某些实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体和其抗体片段连接或融合至脑靶向部分。脑靶向部分被共价连接(例如直接的、翻译融合或者通过直接或通过任选地可是可裂解的间隔分子的化学连接)或非共价连接(例如通过可逆反应例如抗生物素蛋白、生物素、蛋白A、IgG等)。在另外的实施方式中，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段被连接至一个或多个脑靶向部分。在另外的实施方式中，脑靶向部分连接至本发明的方法中使用的多个LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段。 
与LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段结合的脑靶向部分增强了这种LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段的脑递送。已经描述了被融合至蛋白或治疗剂，递送蛋白或治疗剂穿过血脑屏障 (BBB)的许多蛋白。非限制的实例包括单结构域抗体FC5(Abulrob等人J.Neurochem.95，1201-1214(2005))；mAB 83-14，人类胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人Pharmacol.Res.12，807-816(1995))；与人类铁传递蛋白受体(hTfR)结合的B2、B6和B8肽(Xia等人J.Virol.74，11359-11366(2000))；铁传递蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人J.Pharmacol.Exp.Ther.259，66-70(1991))和美国专利第6,306,365号的SEQ ID NO：1-18。上述参考文献的内容通过引用全文并入本文。 
通过本领域已良好建立的许多方法确定LINGO-1或TrkB组合物的增强的脑递送。例如，向动物施用与脑靶向部分连接的放射性标记、酶促标记或荧光标记的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段；确定脑定位；和与未与脑靶向部分连接的等量放射标记的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物、抗体或其抗体片段的定位比较。确定增强的靶向的另外的方法描述于上文参考文献中。 
信号序列是编码启动蛋白穿过内质网膜的运输的氨基酸序列的多核苷酸。对于构建免疫融合物来说有用的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等人，J.Immunol.Meth.125：191-202(1989))、抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人，Nature 286：5774(1980))。可选择地，可使用其他的信号序列。参见例如Watson，Nucl.Acids Res.12：5145(1984)。信号肽通常在内质网的腔内被信号肽酶裂解。这导致分泌含有Fc区和可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分的免疫融合蛋白。 
在某些实施方式中，DNA序列可编码分泌盒和LINGO-1或TrkB-激动剂部分之间的蛋白水解裂解位点。这种裂解位点可提供例如所编码的融合蛋白的蛋白水解裂解，由此从靶蛋白分离Fc结 构域。有用的蛋白水解裂解位点包括由蛋白水解酶例如胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、凝血因子Xa或肠激酶K识别的氨基酸序列。 
分泌盒可被结合至可复制的表达载体中。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒和类似物。示例性表达载体是pdC，其中免疫融合物DNA的转录被置于人类巨细胞病毒的增强子和启动子的控制下。参见例如Lo等人，Biochim.Biophys.Acta 1088：712(1991)；和Lo等人，Protein Engineering 11：495-500(1998)。可用编码可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽的DNA转化或转染适当的宿主细胞，并将所述宿主细胞用于可溶LINGO-1或TrkB-激动剂多肽的表达和分泌。通常使用的宿主细胞包含不死的杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、239细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和COS细胞。 
在一个实施方式中，可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽融合至铰链区和Fc区，即Ig重链恒定区的C-端部分。LINGO-1-Fc或(of)TrkB-激动剂-Fc融合物的潜在的优点包括溶解性、体内稳定性和多价例如二聚化。所用的Fc区可以是IgA、IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。可选择地，其可是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。通常使用IgG Fc区，例如IgG1Fc区或IgG4Fc区。在一个实施方式中，开始于铰链区、恰在化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶裂解位点的上游的序列(即残基216，假定重链恒定区的第一个残基是根据Kabat系统的残基114)或其他免疫球蛋白的类似位点被用于融合。进行融合的准确位点并不是关键的，特定的位点是熟知的并且可被选择以便优化分子的生物学活性、分泌或结合特征。用于构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料和方法是本领域已知的，并且可被用于获得可溶的LINGO-1-拮抗剂或TrkB激动剂融合物而无需过多的实验。本发明的一些实施方式使用 LINGO-1-拮抗剂或TrkB激动剂融合蛋白例如Capon等人，美国专利第5,428,130和5,565,335号中描述的那些。 
完全完整的野生型的Fc区表现出通常在本发明的方法中所用的Fc融合蛋白中不是必须的并且不期望的功能子效应。因此，在构建分泌盒的过程中通常从Fc区去除某些结合位点。例如，由于与轻链的共表达是不必须的，从IgE的Fc区的CH2结构域除去重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot等人，Immunol.Today8：111-14(1987))，以便这一位点不会干扰免疫融合物的有效分泌。跨膜结构域序列例如IgM中存在的那些也通常被除去。 
最常使用的是IgG1Fc区。可选择地，免疫球蛋白γ的其他亚类(γ-2、γ-3或γ-4)的Fc区可用于分泌盒。免疫球蛋白γ-1的IgG1Fc区通常被用于分泌盒并且包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。在某些实施方式中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是CH2缺失的Fc，其包括铰链区和CH3区的一部分但是没有CH2区。CH2缺失的Fc已通过Gillies等人Hum.Antibod.Hybridomas 1：47(1990)描述。在某些实施方式中，使用IgA、IgD、IgE或IgM中的一个的Fc区。 
可以几种不同的构象构建LINGO-1拮抗剂-Fc或TrkB-激动剂-Fc融合蛋白。在一种构象中，可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分的C-端直接融合至Fc铰链部分的N-端。在稍微不同的构象中，短的多肽例如2-10个氨基酸在可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分的N-端和Fc部分的C-端之间被结合至融合物。这种接头提供构象上的柔性，在某些情况下其可改善生物学活性。如果铰链区的足够的部分被保留在Fc部分中，LINGO-1-Fc或TrkB-激动剂-Fc融合物将二聚化，由此形成二价分子。单体Fc融合的均质群将产生单特异性的双价的二聚体。每一个具有不同特异性的两种单体Fc融合物的混合物将产生双特异性的二价的二聚体。 
含有相应的氨基反应性基团和硫醇反应性基团的许多交联剂中的任一个可用于将LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽连接至血清白蛋白。适合的接头的实例包括插入硫醇反应性的马来酰亚胺的胺反应性的交联剂，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS和GMBS。其他适合的接头插入硫醇反应性的卤代乙酸酯基团，例如SBAP、SIA、SIAB。提供用于与巯基基团反应以产生可还原的键的保护的或非保护的硫醇的接头包括SPDP、SMPT、SATA和SATP。这些试剂是商业上可得的(例如Pierce Chemicals)。 
轭合并不一定涉及可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽的N-端或血清白蛋白上的硫醇部分。例如，可溶的LINGO-1-白蛋白或TrkB-激动剂-白蛋白融合物可使用遗传工程技术来获得，其中所述可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分在其N-端、C-端或两端融合至血清白蛋白基因。 
可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽可在N-或C-端融合至异源肽以便促进可溶LINGO-1或TrkB-激动剂部分的纯化或鉴定。例如，组氨酸标签可被融合至可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽以促进使用商业上可得的色谱介质进行纯化。此外，表位标签可使可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂融合多肽能够通过使用抗标签抗体或与表位标签结合的另一种类型的亲合力基质的亲和纯化而被容易地纯化。这种纯化标签的许多实例是本领域已知的并且包括但不限于：多聚-组氨酸(聚-his)或多聚-组氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)标签；流感病毒血凝素(HA)标签多肽和其抗体12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol，8：2159-2165(1988))；c-myc标签和其结合的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人，Mol.Cell.Bio.5：3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签和其抗体(Paborsky等人，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。另 外的标签多肽包括Flag-肽(Hopp等人，BioTechnology 6：1204-1210(1988))、KT3表位肽(Martin等人，Science 255：192-194(1992))、α-微管蛋白表位肽(Skinner等人，J.Biol.Chem.266：15163-15166(1991))和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990))。标签可以是由抗体识别并且不干扰可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽功能的任何肽表位。 
在本发明的某些实施方式中，可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂融合物构建体用来增强细菌中可溶LINGO-1或TrkB-激动剂部分的产生。在这样的构建体中，通常以高水平表达和/或分泌的细菌蛋白被用作可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽的N-端融合配体。参见例如Smith等人，Gene 67：31(1988)；Hopp等人，Biotechnology6：1204(1988)；La Vallie等人，Biotechnology 11：187(1993)。 
通过在适合的融合配体的氨基或羧基端融合可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分，可获得可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽的二价或四价形式。例如，可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分可融合至Ig部分的氨基端和羧基端以产生含有两个可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分的二价单体多肽。当这些单体中的两个借助Ig部分二聚化时，获得可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂蛋白的四价形式。这种多价形式可被用于获得对靶的增强的结合亲和力。可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂的多价形式也可通过将可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂部分成串排列以形成串联体来获得，其可单独使用或融合至融合配体例如Ig或HSA。 
轭合的聚合物(除了多肽以外) 
本发明的某些实施方式涉及可溶LINGO-1或TrkB-激动剂多肽、LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂适体、TrkB激动剂化合物或者 拮抗性LINGO-1或激动性TrkB抗体，其中一种或多种聚合物被轭合(共价连接)至本发明的方法中使用的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽、化合物、适体或抗体。适于这种轭合的聚合物的实例包括多肽(上文所讨论的)、适体、糖聚合物和聚亚烷基二醇链。通常但不必须地，聚合物被轭合至可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽、适体、TrkB激动剂化合物或者LINGO-1或TrkB抗体以便改善下列中的一个或多个：溶解度、稳定性或生物可利用率。 
通常用来与LINGO-1拮抗剂多肽、化合物、适体或抗体或与TrkB激动剂多肽、化合物、适体或抗体轭合的聚合物的类型是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是最常用的。PEG部分例如1、2、3、4或5个PEG聚合物可被轭合至每个LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体或者TrkB激动剂化合物以与单独的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物或抗体相比增加血清半衰期。PEG部分是非抗原性的并且基本是生物学上惰性的。本发明的实施中所使用的PEG部分可是支链或非支链的。 
连接至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体、化合物或抗体的PEG部分的数目和各个PEG链的分子量可变化。通常聚合物的分子量越大，结合至多肽的聚合物链越少。通常，结合至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、化合物、适体或抗体的总聚合物量为20kDa至40kDa。因此，如果一个聚合物链被连接，每个链的分子量通常是20-40kDa。如果两个链被连接，每个链的分子量通常是10-20kDa。如果三个链被连接，分子量通常是7-14kDa。 
聚合物例如PEG可通过多肽上任何适合的暴露的反应性基团被连接至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体。暴露的反应性基团可以是例如内部赖氨酸残基的N-端氨基基团或ε氨基或两者。活化的聚合物可在LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、 适体或抗体上的任何自由氨基基团上反应并共价连接。LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的自由的羧基基团、适当活化的羰基基团、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分和巯基基团(如果可得)也可用作聚合连接的反应性基团。 
在轭合反应中，取决于多肽浓度，通常使用每摩尔多肽从约1.0至约10摩尔的活化的聚合物。通常，所选择的比例代表将反应最大化同时将可损害LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽或抗体的所期望的药理活性的副反应(常常是非特异性的)最小化之间的平衡。在一些实施方式中，保留LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的至少50％的生物活性(如所证实的，例如在本文所描述的或本领域已知的测定中的任一个中)，而在一些实施方式中，保留近100％。 
可使用常规的化学反应将聚合物轭合至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体。例如，可将聚亚烷基二醇部分偶联至LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的赖氨酸ε氨基基团。可使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯例如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)进行与赖氨酸侧链的连接。适合的聚亚烷基二醇部分包括例如羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS、SC。这些试剂是商业上可得的。另外的胺反应性的PEG接头可取代琥珀酰亚胺基部分。这些包括例如异硫氰酸酯、硝基苯基碳酸酯(PNP)、环氧化物、碳酸苯并三唑、SC-PEG、三氟乙基磺酸酯、醛、环氧化物、羰基二咪唑和PNP碳酸酯。通常优化条件以将反应的选择性和程度最大化。这种反应条件的优化在本领域技术人员的能力范围内。 
聚乙二醇化可通过本领域已知的聚乙二醇化反应中的任一种来实现。参见例如Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)和欧洲专利 申请EP 0 154 316和EP 0 401 384。可利用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。 
通过酰化的聚乙二醇化通常包括将聚乙二醇的活性酯衍生物反应。任何反应性的PEG分子可被用于聚乙二醇化中。酯化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG是通常所使用的活化的PEG酯。如本文所用的“酰化”包括但不限于治疗性蛋白和水溶性聚合物如PEG之间的下列类型的键：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯和类似键。参见例如Bioconjugate Chem.5：133-140，1994。通常选择反应参数以避免损害或使可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽、适体或抗体失活的温度、溶剂和pH条件。 
通常，连接的键是酰胺并且通常至少95％的所得产物是单-、双-或三-聚乙二醇化的。然而，取决于所使用的特定的反应条件，也可形成一定数量的具有更高程度的聚乙二醇化的一些物质。任选地，可通过常规纯化方法从混合物，尤其是未反应的物质分离纯化的聚乙二醇化的物质，所述方法包括但不限于例如透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水交换层析和电泳。 
通过烷基化的聚乙二醇化通常包括在还原剂存在的条件下将PEG的末端醛衍生物与LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体反应。此外，可操纵反应条件以有利于基本上仅在LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的N端氨基基团上聚乙二醇化，即单聚乙二醇化的蛋白。无论在单聚乙二醇化还是多聚乙二醇化的实例中，PEG基团通常通过CH2-NH-基团连接至蛋白。当特别地提及-CH2-基团时，这一类型的键被称为“烷基”键。 
通过还原性烷基化以产生N端靶向的单聚乙二醇化产物的衍 生化利用了衍生化可用的不同类型的伯氨基基团(赖氨酸对N端)的不同反应性。反应在允许利用赖氨酸残基的ε氨基基团和蛋白的N端氨基基团之间的pKa差异的pH进行。通过这种选择性的衍生化，含有反应性基团例如醛的水溶性聚合物与蛋白的连接被控制：与聚合物的轭合大部分在蛋白的N-端发生并且没有其他反应性基团例如赖氨酸侧链氨基基团的显著的修饰发生。 
在酰化和烷基化方法中所用的聚合物分子选自水溶性聚合物。所选择的聚合物通常被修饰以具有单一的反应性基团例如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以便可如本方法中所提供的控制聚合物化的程度。示例性的反应性PEG醛是水稳定性的聚乙二醇丙醛或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见例如Harris等人，美国专利第5,252,714号)。聚合物可以是支链或非支链的。对于酰化反应，所选择的聚合物通常具有单一的反应性酯基团。对于还原性烷基化，所选择的聚合物通常具有单一的反应性醛基团。通常，不从天然存在的糖基残基选择水溶性聚合物，因为这些通常通过哺乳动物重组表达系统更方便地制备。 
制备聚乙二醇化的LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽、适体或抗体的方法通常包括步骤：(a)将LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在由此分子被连接至一个或多个PEG基团的条件下反应和(b)获得反应产物。通常，酰化反应的优化的反应条件将以已知的参数和所期望的结果为基础视具体情况确定。例如较大比例的PEG比蛋白通常产生更大百分比的多聚乙二醇化产物。 
产生单-聚合物/可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽、LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂适体或者拮抗性LINGO-1抗体或激动性TrkB抗体的大致上均质的群体的还原性烷基化通常包括步骤： (a)将LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂蛋白或多肽与反应性PEG分子在还原性烷基化条件下在适于多肽或抗体的N端氨基基团的挑剔的(pen-nit)选择性修饰的pH反应和(b)获得反应产物。 
对单-聚合物/可溶的LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽、LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂适体或者拮抗性LINGO-1抗体或激动性TrkB抗体的大致上均质的群体来说，还原性烷基化反应的条件是允许水溶性聚合物部分与多肽或抗体的N-端选择性连接的条件。这样的反应条件通常提供了赖氨酸侧链氨基基团和N-端氨基基团之间的pKa差。为了本发明的目的，pH通常在3-9，典型地3-6的范围内。 
LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽、适体或抗体可包括标签，例如可随后通过蛋白水解释放的部分。因此，赖氨酸部分可通过首先将修饰的His-标签与将与赖氨酸和N-端两者反应的低分子量的接头例如Traut试剂(Pierce)反应，并且之后释放His标签来选择性修饰。之后多肽将包含自由的SH基团，其可被包含硫醇反应性头部基团例如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤代乙酸酯基团或自由或受保护的SH的PEG选择性修饰。 
可用将建立PEG连接的特异性位点的任何接头代替Traut试剂。例如，可用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce)代替Traut试剂。相似地，可将蛋白与插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、卤代乙酸酯基团(SBAP、SIA、SIAB)或乙烯基砜基团的胺反应性的接头反应并且将所得的产物与含有自由SH的PEG反应。 
在一些实施方式中，聚亚烷基二醇部分被偶联至本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多肽、适体或抗体的半胱 氨酸基团。可使用例如马来酰亚胺基团、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团或硫醇基团实现偶联。 
任选地，LINGO-1拮抗剂或TrkB-激动剂多肽、适体或抗体通过不稳定的键被轭合至聚乙二醇部分。不稳定的键可在例如生物化学水解、蛋白水解或巯基裂解中被裂解。例如，键可在体内(生理)条件下被裂解。 
如果反应性基团在N端的α氨基基团上，反应可通过用于将生物活性材料与惰性聚合物通常在约pH 5-8，例如pH 5、6、7或8反应的任何适合的方法进行。通常过程包括制备活化的聚合物并且之后将蛋白与活化的聚合物反应以产生适于制剂的可溶的蛋白。 
LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂多核苷酸 
LINGO-1拮抗剂多核苷酸 
本发明方法中的LINGO-1拮抗剂包括包含与编码LINGO-1的多核苷酸特异性结合的核酸分子的LINGO-1拮抗剂多核苷酸。LINGO-1多核苷酸拮抗剂通常阻止LINGO-1的表达(敲低)。LINGO-1拮抗剂包括但不限于反义分子、核酶、siRNA、shRNA、RNAi。通常，这种结合分子被分别施用于动物(参见例如O’Connor，J.Neurochem.56：560(1991))，但是这种结合分子也可从由宿主细胞获得的多核苷酸体内表达和体内表达。还参见 Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(作为基因表达的反义抑制剂的寡聚脱氧核苷酸)，CRC Press，BocaRaton，FL(1988)。 
RNAi是指干扰靶向的mRNA的表达的RNA的表达。特别地，RNAi通过通过siRNA(短的干扰RNA)的与特定的mRNA(例如 LINGO-1或TrkB)相互作用而沉默靶向的基因。之后dsRNA络合物被靶向以便被细胞降解。另外的RNAi分子包括短的发夹RNA(shRNA)，也称为短的干扰发夹。shRNA分子包含来自靶基因的由环连接的有义和反义序列。shRNA被从核运输至细胞质，其随mRNA一起被降解。Pol III或U6启动子可用来表达用于RNAi的RNA。在本发明的一些实施方式中，从慢病毒载体(例如pLL3.7)表达shRNA。 
RNAi是由具有与它们的“靶”mRNA的序列特异性同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导的(Caplen等人，Proc Natl Acad SciUSA 98：9742-9747(2001))。果蝇(Drosophila)的无细胞溶解产物的生物化学研究表明，RNA依赖性基因沉默的介质是21-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。因此，siRNA分子被有利地用于本发明的方法中。siRNA来自被称为DICER的核糖核酸酶的dsRNA加工(Bernstein等人，Nature 409：363-366(2001))。看起来siRNA双链产物被补充至称为RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望被任何特定的理论束缚，据信RISC被引导以靶向mRNA，其中siRNA双链体序列特异性地相互作用以介导催化方式的裂解(Bernstein等人，Nature 409：363-366(2001)；Boutla等人，Curr Biol 11：1776-1780(2001))。 
RNAi已经被用来在哺乳动物细胞中分析基因功能和鉴定必需基因(Elbashir等人，Methods 26：199-213(2002)；Harborth等人，J CellSci 114：4557-4565(2001))，所述细胞非限制性示例地包括神经元(Krichevsky等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：11926-11929(2002))。RNAi还作为治疗模式而被评估，例如抑制或阻滞病毒的感染、复制和/或生长和减少致癌基因的表达(例如bcr-abl基因，Scherr等人，Blood 101(4)：1566-9(2002))，所述病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒(Gitlin等人，Nature 418：379-380(2002))和HIV(Capodici 等人，J Immunol 169：5196-5201(2002))。RNAi还已用来调节哺乳动物(小鼠)和两栖动物(非洲爪蟾(Xenopus))胚胎(分别地，Calegari等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：14236-14240(2002)；和Zhou等人，Nucleic Acids Res 30：1664-1669(2002))中以及新生小鼠中的基因表达(Lewis等人，Nat Genet 32：107-108(2002))并且用于减少成年转基因小鼠中的转基因表达(McCaffrey等人，Nature418：38-39(2002))。已经描述了用于确定在细胞培养中和体内确定siRNA的效力和特异性的方法(参见例如Bertrand等人，BiochemBiophys Res Commun 296：1000-1004(2002)；Lassus等人，Sci STKE2002(147)：PL 13(2002)和Leirdal等人，Biochem Biophys Res Commun295：744-748(2002))。 
介导RNAi的分子(包括但不限于siRNA)可通过化学合成(Hohioh，FEBS Lett 521：195-199(2002))，dsRNA的水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947(2002))，通过使用T7RNA聚合酶的体外转录(Donzeet等人，Nucleic Acids Res 30：e46，(2002)；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：6047-6052(2002))和通过使用核酸酶例如大肠杆菌核糖核酸酶III水解双链RNA(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947(2002))在体外产生。 
siRNA分子还可通过将两个寡核苷酸对彼此退火来形成，通常具有下列结构，其包括双链和单链部分： 
Figure GPA00001159802300921
其中N、X和Y是核苷酸；X氢与Y键合；“：”表示两个碱 基之间的氢键；x是具有1和约100之间的值的自然数；并且m和n是各自独立地具有0和约100之间的值的整数。在一些实施方式中，N、X和Y彼此独立地为A、G、C和T或U。非天然存在的碱基和核苷酸可存在，尤其是在合成的siRNA(即退火两个寡核苷酸的产物)的情况下。双链的中心部分被称为“核”并且具有作为测量单位的碱基对(bp)；单链的部分是悬垂，具有作为测量单位的核苷酸(nt)。所显示的悬垂为3’悬垂，但是具有5’悬垂的分子也在本发明的范围内。同样在本发明的范围内的是没有悬垂(即m＝0和n＝0)和在核的一侧具有悬垂而另一侧没有悬垂(例如m＝0和n≥1或反过来)的siRNA分子。 
起初，RNAi技术没有表现出容易被应用至哺乳动物系统。这是因为在哺乳动物中，dsRNA活化dsRNA活化的蛋白激酶(PKR)，导致细胞凋亡级联和细胞死亡(Der等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：3279-3283(1997))。此外，很早以前就知道dsRNA活化哺乳动物细胞中的干扰素级联，其还可引起细胞生理的改变(Colby等人，Annu.Rev.Microbiol.25：333(1971)；Kleinschmidt等人，Annu.Rev.Biochem.41：517(1972)；Lampson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA58L782(1967)；Lomniczi等人，J.Gen.Virol.8：55(1970)和Younger等人，J.Bacteriol.92：862(1966))。然而，dsRNA介导的PKR和干扰素级联的活化需要比约30个碱基对更长的dsRNA。相反，长度上小于30个碱基对的dsRNA已经被证实在哺乳动物细胞中引起RNAi(Caplen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-9747(2001))。因此，预料与较长的dsRNA分子相关的不期望的非特异性的作用可通过制备基本上不含较长的dsRNA的短的RNA来避免。 
关于siRNA的参考文献：Bernstein等人，Nature 409：363-366(2001)；Boutla等人，Curr Biol 11：1776-1780(2001)；Cullen，NatImmunol.3：597-599(2002)；Caplen等人，Proc Natl Acad Sci USA 98：9742-9747(2001)；Hamilton等人，Science 286：950-952(1999)；Nagase等人，DNA Res.6：63-70(1999)；Napoli等人，Plant Cell2：279-289(1990)；Nicholson等人，Mamm.Genome 13：67-73(2002)；Parrish等人，Mol Cell 6：1077-1087(2000)；Romano等人，MolMicrobiol 6：3343-3353(1992)；Tabara等人，Cell 99：123-132(1999)和Tuschl，Chembiochem.2：239-245(2001)。 
Paddison等人(Genes & Dev.16：948-958(2002))已经使用折叠为发夹的小的RNA分子作为实现RNAi的工具。相应地，这种短的发夹RNA(shRNA)分子还被有利地用于本发明的方法。功能性shRNA的茎和环的长度是变化的；茎长度可大概从约25nt变化至约30nt，而环的大小可在4nt至约25nt之间变化而不影响沉默活性。不希望被任何特定的理论所束缚，据信这些shRNA类似于DICER核糖核酸酶的dsRNA产物，并且无论在什么情况下，具有抑制特定基因表达的相同能力。 
反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成来控制基因表达。反义技术在例如Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(作为基因表达的反义抑制剂的寡聚脱氧核苷酸)，CRC Press，BocaRaton，FL(1988)中被讨论。三螺旋形成在例如Lee等人，NucleicAcids Research 6：3073(1979)；Cooney等人，Science 241：456(1988)和Dervan等人，Science 251：1300(1991)中讨论。所述方法是以多核苷酸与互补的DNA或RNA的结合为基础的。 
例如，编码LINGO-1的多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度上从约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计以与参与转录的基因的区互补，由此阻止转录和靶蛋白的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并且阻滞mRNA分子翻 译为靶多肽。 
在一个实施方式中，对LINGO-1基因特异的反义核酸通过从外源序列的转录而胞内生成。例如，载体或其部分被转录，产生反义核酸(RNA)。这种载体可保持为附加体或与染色体整合，只要其可被转录以产生所期望的反义RNA。这种载体可通过本领域中标准的重组DNA技术方法来构建。载体可以是用于在脊椎动物细胞中复制并表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。反义分子的表达可以通过本领域中已知的任何启动子以在脊椎动物，尤其是人类细胞(例如本文其他地方所描述的那些)中起作用。 
并不要求反义分子的完全互补性。与编码LINGO-1的RNA的至少一部分互补的序列意指具有足以能够与RNA杂交以形成稳定的双链体的互补性的序列；或可测定三链体的形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度。通常，杂交的核酸越大，其可含有的错配碱基越多但仍形成稳定的双链体(或视情况而定的三链体)。本领域技术人员可通过使用确定杂交复合体的熔点的标准程序来确定错配的可接受程度。 
与信使RNA的5’端例如整个5’非翻译序列并包括AUG起始密码子互补的寡核苷酸应对抑制翻译最有效。然而，与mRNA的3’非翻译序列互补的序列已经显示出同样对抑制mRNA的翻译有效。参见，通常Wagner，R.，Nature 372：333-335(1994)。因此，与无论5’还是3’非翻译的非编码区互补的寡核苷酸都可被用于抑制LINGO-1的翻译的反义方法中。与mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的互补部分。与编码区mRNA互补的反义寡核苷酸是较不有效的翻译抑制剂，但是根据本发明可被使用。反义核酸可以是长度上至少六个核苷酸，并且在一些实施方式中寡核苷酸长度从6个变化至约50个核苷酸。在特定的方面，寡 核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。 
在还有另一个实施方式中，本文所公开的方法中使用的反义寡核苷酸是α-端基异构寡核苷酸。α-端基异构寡核苷酸与互补的RNA形成特异的双链杂交物，其中与一般的情况相反，链彼此平行(Gautier等人，Nucl.Acids Res.15：6625-6641(1987))。寡核苷酸是2’-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucl.Acids Res.15：6131-6148(1987))或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBSLett.215：327-330(1987))。 
本文所公开的方法中所使用的多核苷酸组合物还包括催化性RNA或核酶(参见例如1990年10月4日公开的PCT国际公开WO90/11364；Sarver等人，Science 247：1222-1225(1990))。在本发明的某些实施方式中，使用了锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的旁侧区所指示的位置裂解mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生是本领域中熟知的并且更全面地描述于Haseloff和Gerlach，Nature 334：585-591(1988)中。核酶可被工程化以便裂解识别位点位于靠近靶mRNA的5’端；即以增加效力并将非功能的mRNA转录物的胞内积累最小化。 
如在反义方法中一样，本文所公开的方法中使用的核酶可包括修饰的寡核苷酸(例如为了改善的稳定性，靶向等)，并且可被体内递送至表达LINGO-1的细胞。编码核酶的DNA构建体可以如上文所描述的相同的方式被引入细胞中以便引入反义的编码DNA。递送的一个方法包括使用在强的组成型启动子(例如诸如pol III或pol II启动子)控制下的“编码”核酶的DNA构建体，以便所转染的细胞将产生足以破坏内源LINGO-1信使并抑制翻译的量的核酶。 由于核酶与反义分子不同，是催化性的，因此效力需要较低的胞内浓度。 
TrkB激动剂多核苷酸 
本发明的方法中使用的TrkB激动剂包括包含编码TrkB多肽、其片段、同种型或变体的核酸分子的TrkB激动剂多核苷酸。本发明的TrkB激动剂多核苷酸还包括编码TrkB配体多肽、其片段、同种型或变体的核酸分子。在一些实施方式中，TrkB激动剂多核苷酸编码BDNF。TrkB激动剂多核苷酸包括编码本发明的TrkB激动剂多肽的任何多核苷酸。 
LINGO-1拮抗剂和/或TrkB激动剂多核苷酸 
本文公开的方法中使用的多核苷酸(包括上文描述的适体)可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的版本，可为单链或双链的。可在碱基部分、糖部分或磷酸主链修饰多核苷酸例如以改善分子的稳定性、杂交等。多核苷酸可包括其他的附加的基团例如肽(例如用于体内靶向宿主细胞受体)或促进跨细胞膜(参见，例如Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556(1989)；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652(1987))；1988年12月15日公开的PCT公开第WO88/09810号)或血脑屏障(参见，例如1988年4月25日公开的PCT公开第WO89/10134号)运输的剂、杂交促发的裂解剂(参见例如Krol等人，BioTechniques 6：958-976(1988))或嵌入剂(参见例如Zon，Pharm.Res.5：539-549(1988))。为此，多核苷酸可轭合至另一个分子例如肽、杂交促发的交联剂、运输剂、杂交促发的裂解剂等。 
本文公开的方法中使用的多核苷酸(包括适体)可包含选自下列组的至少一个修饰的碱基部分，所述组包括但不限于5-氟尿嘧 啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N-6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’甲基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N-6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3(3-氨基-3-N2羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。 
本文公开的方法中使用的多核苷酸(包括适体)还可包含选自下列组的至少一个修饰的糖部分，所述组包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖。 
在还有另一个实施方式中，本文公开的方法中使用的多核苷酸(包括适体)还可包含选自下列组的至少一个修饰的磷酸主链，所述组包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛或其类似物。 
本文公开的方法中使用的多核苷酸(包括适体)可通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用DNA自动合成仪(例如可从Biosearch，Applied Biosystems等商业上获得的)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Stein等人，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可通过使用可控多孔玻璃聚合物支持物(Sarin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451(1988))等制 备。 
载体和宿主细胞 
宿主表达系统代表通过其产生并随后纯化所感兴趣的编码序列的载体，但是也代表其在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用包含抗体编码序列的重组的噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))、用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))，用含有抗体编码序列的重组的病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统、用包含抗体编码序列的重组的病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用包含抗体编码序列的重组的质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统、或包含含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。细菌细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(特别用于完整重组抗体分子的表达)被用于重组抗体分子的表达。例如，与载体例如来自人类巨细胞病毒的主要的中早期基因(intermediate early gene)启动子元件联合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是有效的抗体表达系统(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。 
在细菌系统中，依赖于被表达的抗体分子的预期用途而有利地选择许多表达载体。例如，当为了产生抗体分子的药物组合物而将生产大量的这种蛋白时，期望的是指导容易被纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体 pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可分别在lacZ编码区的框内连接于载体以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；VanHeeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))和类似载体。pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的并且可通过吸附并与基质谷胱甘肽-琼脂糖微珠结合之后在游离的谷胱甘肽存在的情况下洗脱而容易地从裂解的细胞纯化。pGEX载体被设计以包括凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶裂解位点以便可从GST部分释放克隆的靶基因产物。 
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)常常被用作载体以表达外源基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)中生长。抗体编码序列被分别克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。 
在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达载体可被使用。当腺病毒被用作表达载体的情况下，所感兴趣的抗体编码序列可被连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。这一嵌合的基因之后可通过体外或体内重组被插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如区E1或E3)中插入将产生有活力并且能够在所感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒。(参见例如Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。插入的抗体编码序列的有效翻译还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。而且起始密码子必须与所期望的编码序列的读码框同相以确保整个插入物的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可具有不同的来源，可为天然和合成的。表达的效力可通过包含适当的转录增强元件、转录终止 子等来增强(参见，Bittner等人，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。 
此外，可选择调节插入的序列的表达或以所期望的特定的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对蛋白的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有对蛋白和基因产物的特有的和特定的翻译后加工和修饰的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确的修饰和加工。为此，可使用具有用于正确加工初级转录物和将基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38以及特别地，乳腺癌细胞系例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D以及正常的乳腺细胞系例如诸如CRL7030和Hs578Bst。 
对于重组蛋白的长期的高产量的生产来说，可使用稳定的表达。例如稳定表达抗体分子的细胞系可被工程化。不同于使用含有病毒复制起点的表达载体，可用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择的标记转化宿主细胞。引入外源DNA之后，可使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，之后将其转换至选择培养基。重组质粒中的可选择的标记提供对选择的抗性并且允许细胞将质粒稳定地整合至它们的染色体中并生长以形成焦点(foci)，其反过来可被克隆并扩展至细胞系中。可有利地使用这一方法以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。 
许多选择系统可被使用，包括但不限于可分别用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980))基因。同样，抗代谢物抗性可被用作下列基因选择的基础：dhfr，其提供对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其提供对麦考酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其提供对氨基糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(May，1993))和hygro，其提供对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验手册)，Stockton Press，NY(1990)和Dracopoli等人(编辑)，Current Protocolsin Human Genetics(人类遗传学中的最新实验方案)，John Wiley &Sons，NY(1994)的第12和13章中；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用全文引入本文。 
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来增加(综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning(在DNA克隆中用于在哺乳动物细胞中表达克隆基因的以基因扩增为基础的载体的应用)，Academic Press，New York，第3卷.(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养基中存在的抑制剂的水平的增加将增加标记基因的拷贝数目。因为扩增的区与抗体基因有关，抗体的产生也将增加 (Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。 
包含编码LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的核酸的载体也可用于产生本发明的方法中使用的多核苷酸或多肽。这些核酸可操作地连接的载体和表达控制序列的选择取决于所期望的功能特性，例如蛋白表达和有待转化的宿主细胞。 
用于调节可操作地连接的编码序列的表达的表达控制元件是本领域已知的。实例包括但不限于可诱导的启动子、组成型启动子、分泌信号和其他调节元件。当使用可诱导的启动子时，其可通过例如宿主细胞培养基中营养条件上的变化或温度上的变化来控制。 
载体可包括原核复制子，即具有在细菌宿主细胞中指导自主复制并且维持染色体外的重组的DNA分子的能力的DNA序列。这种复制子是本领域中熟知的。此外，包括原核复制子的载体也可包括其表达提供可检测的标记例如药物抗性的基因。细菌药物抗性基因是提供对氨苄青霉素或四环素的抗性的那些。 
包括原核复制子的载体也可包括在细菌宿主细胞中指导编码基因序列的表达的原核或噬菌体启动子。与细菌宿主相容的启动子序列通常在包含用于插入有待表达的DNA片段的方便的限制性位点的质粒载体中提供。这种质粒载体的实例是pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何适合的原核宿主可用于表达编码在本发明的方法中使用的蛋白的重组DNA分子。 
为了本发明的目的，可使用许多表达载体系统。例如，一个类型的载体利用来自于动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他的包括具有内部核糖体结合位点 的多顺反子系统的使用。此外，可通过引入允许选择转染的宿主细胞的一个或多个标记来选择已经将DNA整合至它们的染色体的细胞。标记可为营养缺陷型宿主提供原营养、提供杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属例如铜的耐受性。可选择的标记基因可直接与有待表达的DNA序列连接或通过共转化被引入同一细胞。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是可选择的标记基因的实例(Southern等人，J.Mol. Anal.Genet.1：327-341(1982))。mRNA的最佳合成还可能需要其他的元件。这些元件可包括信号序列或剪接序列以及转录启动子、增强子和终止信号。 
在一个实施方式中，可使用称为NEOSPLA(美国专利6,159,730，通过引用并入本文)的表达载体。这一载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和引导序列。已经发现这一载体当在CHO细胞中转染，之后在含有G418的培养基上选择和甲氨喋呤扩增时产生非常高水平的表达。当然，能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体可用于本发明。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI获得)。其他的真核细胞表达载体是本领域已知的并且是商业上可得的。通常，这种载体包括用于插入所期望的DNA片段的方便的限制性载体。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pm12d(Intemational B iotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录病毒表达载体pMIG和pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315、和AAV载体。其他的示例性载体系统描述于例如美国专利6,413,777中。 
通常，筛选大量的表达适当高的水平的拮抗剂的转化细胞是由例如机器人系统进行的常规实验。 
经常使用的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿病毒(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))的启动子和增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。病毒调节元件和其序列的进一步的描述参见例如美国专利第5,168,062号；Bell，美国专利第4,510,245号和Schaffner，美国专利第4,968,615号。 
重组表达载体可携带在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因有利于选择已将载体引入其中的宿主细胞(参见例如Axel，美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，通常可选择的标记基因为已将载体引入其中的宿主细胞赋予对药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。常用的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在具有氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。 
编码LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的载体可用于转化适当的宿主细胞。转化可以通过任何适合的方法。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞的方法是本领域中熟知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、通过在脂质体中包封多核苷酸的转染和将DNA直接微注射至细胞核中。此外，核酸分子可通过病毒载体被引入哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞还可通过包含有待被引入哺乳动物细胞中的外源DNA的 重组病毒来转导。 
用于表达在本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的宿主细胞可以是原核或真核的。示例性的真核宿主细胞包括但不限于酵母和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC登记号CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC登记号CRL1658)和幼仓鼠肾细胞(BHK)。其他可用的真核宿主细胞包括昆虫细胞和植物细胞。示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌。 
宿主细胞的转化可通过适于所使用的载体和宿主细胞的常规方法来完成。对于真核宿主细胞的转化，可使用电穿孔和盐处理法(Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞的转化，可使用电穿孔、阳离子脂质或盐处理法，参见例如Graham等人，Virology 52：456-467(1973)；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1373-76(1979)。 
在某些实施方式中，用于蛋白表达的宿主细胞系可为哺乳动物来源；相信本领域技术人员具有确定对于有待在其中表达的所期望的基因产物来说最适合的特定的宿主细胞系的能力。示例性的哺乳动物宿主细胞系包括但不限于NSO、SP2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系、DHFR阴性)、HELA(人类宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾细胞)。用于表达在本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的宿主细胞还可以 是原核的。示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌。宿主细胞系通常可从商业机构、American Tissue Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)或从公开的文献获得。 
可使用已知的技术增强来自生产细胞系的多肽的表达。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统常被用于在某些情况下增强表达。参见例如欧洲专利第0216846、0256055和0323997号和欧洲专利申请第89303964.4号。 
基因治疗 
使用治疗与神经元退化、死亡或缺乏再生有关的疾病、病症或损伤的基因治疗方法，可在哺乳动物例如人类患者中体内产生LINGO-1和某些TrkB激动剂(例如多核苷酸、多肽、抗体和适体)。这包括施用编码适合的LINGO-1拮抗剂和/或TrkB激动剂的可操作地连接至适合的表达控制序列的核酸。通常这些序列被并入至病毒载体中。适合于这种基因治疗的病毒载体包括腺病毒载体、α病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体(例如，埃巴病毒载体或单纯疱疹病毒载体)、乳多空载体病毒、痘病毒载体(例如牛痘病毒载体)和细小病毒。病毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。通常所用的是在它们的E1基因或E3基因中有缺失的腺病毒载体。当使用腺病毒载体时，载体通常不具有可选择的标记基因。 
药物组合物和施用方法 
本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂可被配制在用于向哺乳动物包括人类施用的药物组合物中。本发明的方法中使用的药物组合物包括药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、 缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、以纤维素为基础的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。 
本发明的方法中使用的组合物可通过任何适合的方法来施用，例如胃肠外地、心室内地、口服地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、经鼻地、向颊地、阴道地或通过植入型药盒。如本文使用的，术语“胃肠外的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、病灶内的或颅内的注射或输注技术。如之前所描述的，本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂在神经系统中起作用以促进神经元的存活。相应地，在本发明的方法中，LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂以使其穿过血脑屏障的方式施用。这一穿过可源于LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂分子本身固有的物化特性，源于药物制剂中的其他成分，或源于突破血脑屏障的机械装置例如针、插管或手术工具的使用。当LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂是本身并不穿过血脑屏障的分子时，例如与有利于穿过的部分的融合物，适当的施用途径是例如鞘内或颅内的，例如直接至MS的慢性损伤中。当LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂是本身穿过血脑屏障的分子时，施用的途径可以是通过下文描述的不同途径中的一种或多种。 
本发明的方法中使用的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用适合的分散剂或增湿剂和悬浮剂来配制。无菌的可注射的制剂还可以是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液，例如为溶于1，3-丁二醇中的悬浮液。可接受的可使用的介质和溶剂是水、林格溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥 发的油通常可被用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可使用任何温和的不挥发的油，包括合成的单-或双-甘油二酯。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物作为天然的药学上可接受的油在可注射的制剂中是有用的，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙烯化形式。这些油性溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常在药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的配制中所用的相似的分散剂。也可为配制的目的使用通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他制剂形式的其他常用的表面活性剂例如吐温、司盘和其他乳化剂或生物利用率增强剂。 
胃肠外剂型可以是单一的弹丸注射剂量，输注或加载的弹丸注射剂量，以及之后的维持剂量。这些组合物可以特定的固定的或可变的间隔例如每天一次或基于“根据需要”的间隔施用。 
本发明的方法中所使用的某些药物组合物可以可接受的剂型包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液口服施用。某些药物组合物还可通过经鼻的喷雾或吸入施用。使用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用率的吸收促进剂，和/或其他常规的增溶剂或分解剂，这种组合物可被配制为溶于盐水的溶液。 
可与运载体材料组合以产生单一剂型的LINGO-1拮抗剂和/或TrkB激动剂的量将取决于所治疗的宿主、所使用的拮抗剂的类型和施用的特定的形式而变化。组合物可作为单一剂量、多个剂量或一段确定的时间的输注而施用。给药方案还可被调整以提供最佳的所期望的响应(例如治疗或预防响应)。 
本发明的方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂。这种治疗有效量或预防有效量可根据因素例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重而变化。治疗有效量或预 防有效量还可以是治疗上有益的作用超过任何有毒或有害的作用的量。 
用于任何特定的患者的特定的剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食以及施用的时间、排泄的速度、药物组合和所治疗的特定的疾病的严重度。通过医疗看护者判断这些因素在本领域技术人员的能力范围之内。量还将取决于有待治疗的个体患者、施用的途径、制剂的类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重度和所期望的作用。所使用的量可通过本领域中熟知的药理学和药物动力学原理来确定。 
在本发明的方法中，通常可直接向神经系统、脑室内地或鞘内地向例如MS的慢性损伤施用LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂。根据本发明的方法施用的组合物可被配制以致施用每天0.001-10mg/kg体重的LINGO-1拮抗剂多肽。在本发明的一些实施方式中，剂量是每天0.01-1.0mg/kg体重。在某些实施方式中，剂量是每天0.001-0.5mg/kg体重。 
为了用LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体治疗，剂量的范围可从约0.0001至100mg/kg宿主体重，和更通常地0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，任选地至少1mg/kg。上文范围中的剂量中间值也意为在本发明的范围内。受治疗者可被每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其他的时间表施用这样的剂量。示例性的治疗要求以一段长时间例如至少六个月的多次剂量的施用。另外的示例性治疗方案要求每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。示例性的剂量方案包括连续每 天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下所施用的每种抗体的剂量在所指示的范围内。 
在某些实施方式中，可用编码LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂多核苷酸的核酸分子治疗受治疗者。核酸的剂量在每位患者从约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA的范围内。感染性病毒载体的剂量为每剂量10-100或更多病毒粒子。 
在某些实施方式中，LINGO-1拮抗剂可以有效量施用以与LINGO-1拮抗剂不存在时LINGO-1和TrkB的相互作用相比，阻滞LINGO-1和TrkB相互作用的至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，如由竞争性测定或免疫沉淀测定测量的。 
在某些实施方式中，LINGO-1拮抗剂可以有效量施用以与LINGO-1拮抗剂不存在时的磷酸化的TrkB的量相比促进至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的TrkB的磷酸化。 
在某些实施方式中，LINGO-1拮抗剂可以有效量施用以与LINGO-1拮抗剂不存在时的磷酸化的JNK的量相比减少至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的JNK的磷酸化。 
在某些实施方式中，TrkB激动剂和LINGO-1拮抗剂可以有效量施用以与未治疗的CNS神经元或哺乳动物中的存活的神经元数目相比促进CNS神经元的存活，存活的神经元数目增加至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、 170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。 
补充的活性化合物也可被掺入至本发明的方法中所使用的组合物中。例如，可溶的LINGO-1或TrkB-激动剂多肽或融合蛋白可与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。 
本发明涵盖将LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂递送至所选择的靶组织的任何适合的方法，包括含水溶液的弹丸注射或可控制释放的系统的植入。可控制释放的植入的使用减少了对多次注射的需要。 
本发明的方法中使用的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂可直接输注至脑中。用于化合物的直接脑部输注的不同的植入物是已知的并且对向患有神经学病症的人类患者递送治疗化合物是有效的。这些包括使用泵向脑的慢性输注、立体排列地植入、临时的间质导管、永久的颅内导管植入物和手术植入生物可降解的植入物。参见例如Gill等人，如上文；Scharfen等人，“High Activity Iodine-125Interstitial Implant For Gliomas(用于神经胶质瘤的高活性碘-125间质植入物)，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：583-591(1992)；Gaspar等人，“Permanent 125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas(用于复发的恶性神经胶质瘤的永久性125I植入物)，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5)：977-982(1999)；第66章，第577-580页，Bellezza等人，“Stereotactic InterstitialBrachytherapy(立体排列的间质短程疗法)，”在Gildenberg等人，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery(立体排列和功能性神经外科教科书)，McGraw-Hill(1998)；和Brem等人，“TheSafety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly DiagnosedMalignant Gliomas：Phase I Trial(新诊断的恶性神经胶质瘤的治疗中使用加载BCNU的聚合物的间质化学治疗和之后的放射治疗的安全性)，”J.Neuro-Oncology 26：111-23(1995)。 
组合物还可包含分散在起到化合物的适合的递送或支持系统的作用的生物相容的载体材料中的LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂。缓释载体的适合的实例包括成型的制品(例如栓剂或胶囊)形式的半透性的聚合物基质。可植入的或微胶囊缓释基质包括聚交酯(美国专利第No.3,773,319号；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯基醋酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。 
在本发明的一些实施方式中，LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂通过向脑的适合的区域的直接输注而施用至患者。参见例如Gill等人，“Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factorin Parkinson disease(帕金森病中神经胶质细胞系来源的神经营养因子的直接脑输注)，”Nature Med.9：589-95(2003)。替代技术是可得的并且可被应用以根据本发明施用LINGO-1拮抗剂。例如，可使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来完成导管或植入物的立体排列的放置。注射120ml的欧乃派克、350mg碘/ml，具有2mm的层厚的反差增强的计算机X线断层摄影术(CT)扫描可允许三维的多面的治疗设计(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。这一设备允许以磁共振成像研究为基础的设计，为了清晰的靶确认而合并CT和MRI靶信息。 
为了这一目的可使用为了与GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，WI)一起使用而改进的Leksell立体定向系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Well(BRW)立体定向系统(Radionics，Burlington，MA)。因此，在植入的早上，BRW立体定向框的环形的基区环可被连接至患者的颅骨。系列的CT切片可以3mm的间隔获得，尽管(靶组织)区以石墨棒定位框固定至基区板。使用石墨棒成像的CT坐标以在CT空间和BRW空间之间作图，可在VAX 11/780计算机(DigitalEquipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行计算机化的治疗设计程序。 
为了所期望的治疗活性或预防活性，在于人类中使用之前，如本文所描述的病症的治疗方法通常被体外检测，并且之后在可接受的动物模型中体内检测。适合的动物模型(包括转基因动物)是本领域技术人员熟知的。例如证实LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的存活作用的体外测定描述于本文。最后，体内检测可通过通过产生表达LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂的转基因小鼠或向本文描述的模型中的小鼠或大鼠施用LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂来进行。 
除非另外说明，否则本发明的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。这种技术被充分阐述于文献中。参见，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)(3-卷集)，J.Sambrook，D.W.Russell，Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)；Genes VIII(基因VIII)，B.Lewin，Prentice Hall(2003)；PCR Primer(PCR引物)，C.W.Dieffenbach和G.S.Dveksler，CSHL Press(2003)；DNA Cloning(DNA克隆)，D.N.Glover编辑，第I和II卷(1985)；Oligonucleotide Synthesis：Methodsand Applications(寡核苷酸合成：方法和应用)(Methods in MolecularBiology(分子生物学中的方法))，P.Herdewijn(编辑)，Humana Press (2004)；Culture of Animal cell：A Manual of B asic Technique(动物细胞的培养：基础技术手册)，第4版，R.I.Freshney，Wiley-Liss(2000)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)，M.J.Gait(编辑)，(1984)；Mullis等人，美国专利第4,683,195号；Nucleic AcidHybridization(核酸杂交)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)，M.L.M.Anderson，Springer(1999)；Animal Cell Culture and Technology(动物细胞培养和技术)，第2版，M.Butler，BIOS Scientific Publishers(2004)；Immobilized celland Enzymes：A Practical Approach(固定的细胞和酶：实用方法)(Practical Approach Series(实用方法系列))，J.Woodward，Irl Pr(1992)；Transcription and Translation(转录和翻译)，B.D.Hames &S.J.Higgins(编辑)(1984)；Culture Of Animal cell(动物细胞的培养)，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized cell andEnzymes(固定的细胞和酶)，IRL Press，(1986)；A Practical Guide toMolecular Cloning(分子克隆的实用指南)，第3版，B.Perbal，JohnWiley & Sons Inc.(1988)；专著，Methods In Enzymology(酶学中的方法)，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors ForMammalian cell(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)，J.H.Miller和M.P.Calos编辑，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；MethodsIn Enzymology(酶学中的方法)，第154和155卷，Wu等人(编辑)；Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)，Mayer和Walker，(编辑)，AcademicPress，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell(编辑)，(1986)；Immunology Methods Manual：The ComprehensiveSourcebook of Techniques(免疫方法手册：技术的全面资料)(4卷集)，第1版，I.Lefkovits，Academic Press(1997)；Manipulating theMouse Embryo：A Laboratory Manual(小鼠胚胎操作：实验手册)， 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002)和在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的最新实验方案)，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)中。 
抗体工程化的一般原理阐述于Antibody Engineering：Methodsand Protocols(抗体工程化：方法和实验方案)(Methods in MolecularBiology(分子生物学中的方法))，B.L.Lo(编辑)，Humana Press(2003)；Antibody engineering(抗体工程化)，R.Kontermann和S.Dubel(编辑)，Springer Verlag(2001)；Antibody Engineering(抗体工程化)，第2版，C.A.K.Borrebaeck(编辑)，Oxford Univ.Press(1995)中。蛋白工程化的一般原理阐述于Protein Engineering，APractical Approach(蛋白工程化实用方法)，Rickwood，D.等人(编辑)，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述于：Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验手册)，E.Harlow和D.Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press(1988)；Nisonoff，A.，Molecular Immunology(分子免疫学)，第2版，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；和Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure and Function(抗体、它们的结构和功能)，Chapman和Hall，New York，NY(1984)中。此外，本领域已知的免疫学中的并且未特别描述的标准方法一般为下列中的：Current Protocols in Immunology(免疫学最新实验方案)，JohnWiley & Sons，New York；Stites等人(编辑)，ImmunochemicalProtocols(免疫化学实验方案)(Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法))，第2版，J.D.Pound(编辑)，Humana Press(1998)，Weir′s Handbook of ExperimentalImmunology(实验免疫学的Weir手册)，第5版，D.M.Weir(编辑)，Blackwell Publishers(1996)，Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的方法)，第2版，R.Fernandez-Botran，CRC Press(2001)；Basic and ClinicalImmunology(基础和临床免疫学)，第8版，Appleton & Lange， Norwalk，CT(1994)和Mishell和Shiigi(编辑)，Selected Methods inCellular Immunology(分子免疫学中的精选方法)，W.H.Freeman andCo.，New York(1980)中。 
阐述免疫学的一般原理的标准参考工具书包括CurrentProtocols in Immunology(免疫学最新实验方案)，John Wiley & Sohs，New York；Klein，J.；Kuby Immunology(Kuby免疫学)，第4版，R.A.Goldsby等人，H.Freeman & Co.(2000)；Basic and ClinicalImmunology(基础和临床免疫学)，M.Peakman等人，ChurchillLivingstone(1997)；Immunology(免疫学)，第6版，I.Roitt等人，Mosby，London(2001)；Cellular and Molecular Immunology(细胞和分子免疫学)，第5版；A.K.Abbas，A.H.Lichtman，Elsevier-HealthSciences Division(2005)；Immunology Methods Manual：TheComprehensive Sourcebook of Techniques(免疫学方法手册：技术的全面资料)(4卷集)，第1版，I.Lefkovits，Academic Press(1997)；Immunology(免疫学)，第5版，R.A.Goldsby等人，W.H.Freeman(2002)；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第3版，J.W.Goding，Academic Press(1996)；Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(免疫学：辨别自我和非自我的科学)，John Wiley & Sohs，New York(1982)；Kennett，R.等人(编辑)，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A NewDimension in Biological Analyses(单克隆抗体、杂交瘤：在生物分析中的新维度)，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology(单克隆抗体技术)”于Burden，R.等人(编辑)，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology(生物化学和分子生物学中的实验技术)中，第13卷，Elsevere，Amsterdam(1984)。 
上文引用的所有的参考文献以及本文引用的所有参考文献通 过引用全文并入本文。 
具体实施方式
材料和方法 
重组LINGO-1-Fc和抗LINGO-1单克隆抗体的产生 
如先前所描述的制备LINGO-1-Fc(LINGO-1-Fc蛋白)(Mi等人，Nat.Neurosci.7：221-228(2004)。人类LINGO-1的残基1-532被融合至人类IgG1的铰链和Fc区并在CHO细胞中表达。从ProtosImmunoresearch(San Francisco，CA)购得人类IgG1(对照蛋白)。在用LINGO-1-Fc免疫的小鼠中产生抗LINGO-1mab 1A7。杂交瘤细胞系在DMEM中培养并且通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化抗体。从Protos Immunoresearch(San Francisco，CA)购得MOPC21Mouse IgG(对照蛋白)。 
眼内高压模型 
实验根据1996年修订的美国国立卫生研究院关于实验室动物的护理和使用的指南(NIH出版号80-23)进行并得到the UniversityofHong Kong Animal Ethics Committee(香港大学动物伦理委员会)批准。使用重约250g的成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠。每标准实验笼3只饲养它们并且维持无限制的食物和水以及维持12小时黑暗/光照循环(上午7:00/下午7:00)。在用克他命(80mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)腹膜内注射麻醉的动物中进行所有操作。在所有操作前将0.5％盐酸丙关卡因(Alcon-Couvreur，Belgium)用于眼部并且在处理后将无菌的眼部滴液(Tobres[托普霉素(Tobramycin)0.3％]，Alcon-Couvreur，Belgium)用来防止感染。手术后持续7天，溶于饮用水的力莫敌(Rimadyl)(0.025mg/ml)被用来 缓解疼痛。 
使用慢性高血压模型诱导实验性青光眼。SD大鼠在右眼受到1000mW功率、500-100μm点大小和0.1s持续时间的巩膜上静脉和角膜缘静脉的氩激光凝固(Ji等人，Eur.J.Neurosci.19：265-272(2004)；WoldeMussie等人，Invest.Ophthalmol.42：2849-2855(2001))。约90个点被使用于三个巩膜上静脉而70个点在角膜缘静脉周围。七天后进行第二次激光手术以阻止重新连接的血管流。动物的左眼被用作对侧对照并且没有被手术。在第一次激光暴露后动物被处死前允许动物存活2或4周。使用Tonopen XL压力计在激光手术后不同的时间点测量右眼和左眼的IOP。获得每个眼的十次测量的平均值。处死之前四天进行RGC的FG标记。在除去一小片颅骨和皮层后暴露两个上丘(SC)，并将用FG(6％v/v，Fluorochrome，Denver，CO)浸泡的明胶海绵(Pharmacia & Upjohn)放在SC的表面上。FG退行地标记完整的RGC。用PBS处理十二只动物并且允许它们在第一次激光暴露后存活4周。在所有其他的实验组中使用十只动物。青光眼模型的流程总结于图1中。 
第一次激光处理后，动物立即接受溶于PBS的2μgLINGO-1-Fc、2μg 1A7或2μg对照蛋白的玻璃体内注射。在4周的青光眼模型中，一周再注射一次蛋白。掩饰处理以避免实验者在RGC的计数过程中的偏向。用过量的麻醉将所有动物安乐死。 
在预定的时间，用过量的麻醉处死大鼠。每只动物的两眼被摘出并且用4％多聚甲醛固定60分钟。如所描述的(Cheung等人，Mol.Cell.Neurosci.25：383-393(2004)；Ji等人，Eur.J.Neurosci.19：265-272(2004))将视网膜制备为裱片并且使用紫外滤光片在荧光显微镜下对FG标记的RGC计数(激发波长＝330-380nm)。在200×200μm2目镜网格下沿每个象限的中线从视神经盘开始至边 缘以500μm间隔定量RGC(图2)。将每个象限八个显微场和每个视网膜四个象限总共32个显微场计数，相当于每个视网膜区域大约3-3.2％。测量RGC的百分比损失以检查不同处理的存活作用。以与对测完整的眼睛相比受损的眼睛中RGC损失的相对百分比的形式表示数据(％对测，平均+标准平均误差)。 
用于透射电子显微镜的组织加工 
从正常组和用PBS、可溶的LINGO-1或1A7处理的2周青光眼组获得2mm的视网膜切片。将它们于4℃放置在Kamovsky电子显微镜(EM)固定剂中2-4小时。在0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中清洗后，将组织样品后固定在溶于0.1M PB的1％四氧化锇中，之后在乙醇中脱水并且包埋于环氧树脂(Epon)中。使用具有在LKB玻璃刀制造器上制作的玻璃刀的Reichert-Jung超微切片机从每个块获得半薄(1μm)切片。用甲苯胺蓝将切片染色。获得具有银干扰色的超薄切片，用Reynolds柠檬酸铅和乙酸铀酰染色并用电子显微镜检查。 
原代RGC培养 
将P7Long-Evans大鼠的眼睛摘除并放在分离介质中(DM；90mM Na2SO4、30mM K2SO4、5.8mM MgCl2、0.25mM CaCl2、1mMHEPES、0.001％酚红)(Furshpan和Potter，1989)。从眼摘除视网膜并且于37℃在含有15U/ml木瓜蛋白酶(Worthington，NJ)、1mM L-半胱氨酸、0.5mM EDTA、0.005％DNA酶I的2ml DM中孵育30分钟。将视网膜在DM中漂洗两次，重悬于含有10mg/ml卵类粘蛋白蛋白酶抑制剂、10mg/ml牛血清白蛋白(都来自Worthington)的2ml DM中并使用2ml血清移液管轻柔地粉碎10-15次。将分离的细胞于1000rpm成团(pellet)5分钟，重悬于从 Meyer-Franke等人(Meyer-Franke等人Neuron 15：805-819(1995))改良的2ml生长培养基(神经基质、来自Invitrogen的1x B27、5μM毛喉素、60nM T3、1mM丙酮酸盐、2mM谷氨酰胺)中并用血球计计数。在用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的BD Biocoat 96-孔组织培养板(BD Biosciences，Bedford，MA)中以50,000细胞/cm2的密度将细胞铺平板并在CO2孵育器中培养3天。在铺平板时，将细胞在一式四份孔中用人类IgG1(10μtg/ml)、LINGO-1-Fc(10μg/ml)单独、人类IgG1和25ng/ml BDNF或LINGO-1Fc和BDNF处理。 
将细胞于-20℃在甲醇中固定15分钟，在PBS中漂洗两次并且在溶于PBS的5％正常的山羊血清中封闭1小时。将细胞于4℃在Thy1.1抗体(Serotec，克隆OX-7，1∶40溶于PBS)中孵育过夜，在PBS中漂洗3次每次5分钟，在与Alexa 594轭合的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes，Eugene，OR；1∶1000)中孵育1小时并在PBS中清洗3次每次5分钟。 
在用Zeiss axiovert倒置显微镜的表面荧光显微镜法下鉴定RGC。每个孔的整个表面在表面荧光下被视觉扫描以计数存活的RGC。仅对具有神经元形态并且具有最小长度3倍于细胞体直径的至少一个突起(process)的Thy 1.1阳性细胞计数。 
LINGO-1和p-TrkB的免疫组织化学 
在处死前4天用FG退行地标记RGC。在用0.9％盐水经心脏(transcardial)灌注损伤后2周摘除眼并随后在4％PFA中后固定4小时。将十微米厚的冰冻切片与小鼠抗LINGO-1(Biogen)、兔抗磷酸-TrkB(Tyr785)(来自B.Sun博士，上海生物科学研究所，中国上海的赠物)抗体孵育(Ji等人，Nat.Neurosci.8：164-172(2005))，之后用Alexa标记的第二抗体处理。清洗后，用荧光封固介质 (fluorescent mounting medium，DakoCytomation)封固切片并在CarlZeiss LSM 510META共聚焦显微镜下分析。 
蛋白质印迹 
为了测量视网膜中的LINGO-1、BDNF或p-TrkB，激光凝固后2周将动物安乐死。为了测定Akt磷酸化的时间概况，在激光凝固后6小时、1天和5天将用LINGO-1-Fc或PBS处理的动物安乐死。为了测量损伤、BDNF和LINGO-Fc或1A7对TrkB磷酸化的作用，我们在激光凝固的同时玻璃体内注射BDNF(5μg/眼，重组的人类BDNF；Regeneron Pharmaceutical，Tarrytown，NY)或与LINGO-1-Fc或1A7(2μg/眼)组合的BDNF，然后在5天后将动物安乐死。将视网膜解剖并且在补充有来自Sigma的10％蛋白酶抑制剂混合物和1％磷酸酶抑制剂混合物的细胞溶解缓冲液(10mM Tris pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA)中均质化。于13,000rpm离心30分钟以除去细胞残渣之后，使用Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)测量上清液的蛋白浓度。将来自单个动物的40-80μg等份的蛋白经受6-12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到PVDF膜上。将膜于室温用溶于含有0.1％吐温20的Tris-缓冲的盐水(TBST)中的5％无脂奶粉和2％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。使用小鼠抗LINGO-1(Biogen)、兔抗BDNF(Chemicon)、小鼠抗磷酸-Akt(1∶1000)、兔总Akt(1∶1000)、抗磷酸-JNK(1∶1000)、总-JNK(Cell Signaling Technology)、兔抗磷酸-TrkB(Tyr785)(1∶1000)(来自B.Sun博士，上海生物科学研究所，中国上海的赠物)(Ji等人，Nat.Neurosci.8：164-172(2005))和鸡IgY总TrkB(Promega)(1∶100)抗体的孵育于4℃进行过夜。清洗之后，用溶于含有5％无脂奶粉和2％BSA的TBST的轭合辣根过氧化物酶的第二抗体于室温孵育膜1小时。使用增强的化学发光法(ECL，Amersham)检测免疫活性的蛋白。使用抗肌 动蛋白的单克隆山羊抗体(1∶1000，C-11，Santa Cruz Biotechnology)控制蛋白上样。每条带的强度通过使用Labworks凝胶成像(UVP，Inc，Upland，CA)的光密度扫描来定量。用每组3-5只动物进行蛋白质印迹的所有实验并且在凝胶上运行单个动物的样品。蛋白水平最终表达为与正常视网膜的总蛋白相比的相对值。 
LINGO-1和TrkB的免疫沉淀和蛋白质印迹 
用HA标签化的全长人类LINGO-1、myc标签化的全长人类TrkB或LINGO-1/TrkB的组合转染293T细胞(100mm盘)。48小时后收获细胞并于4℃在1ml RIPA缓冲液(50mM Tris、pH 7.2，1％Triton X-100、0.5％去氧胆酸钠、0.1％SDS、150mM NaCl、10mM MgCl2、5％甘油)中溶解30分钟。于14,000xg离心15分钟后，将上清液于4℃用加上蛋白A/G的琼脂糖凝胶珠(ProteinA/G plus-Sepharose beads，Santa Cruz Biotechnology，CA)孵育1小时。之后用抗LINGO-1抗体(Biogen Idec)于4℃孵育预澄清的溶解产物1小时之后加入蛋白A/G-琼脂糖凝胶珠1小时。将小珠用1％Triton缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、lmM EGTA、1％Triton X-100和10％甘油)清洗3次，在Laemmli样品缓冲液中煮沸，经受4-20％SDS-PAGE并且通过使用抗TrkB抗体(Myc，Roche)或抗LINGO-1抗体(HA，Roche)的蛋白质印迹分析。将来自正常或2周眼内高压的大鼠的视网膜溶解产物也用抗TrkB抗体(Chemicon)、抗LINGO-1抗体(Upstate)或非特异性抗体于4℃免疫沉淀过夜并且通过使用抗LINGO-1抗体(Upstate)的蛋白质印迹分析。 
将具有过表达的稳定HA-LINGO1的Neuroscreen-1细胞(PC12细胞的亚克隆系，Cellomics)或Neuroscreen细胞用慢病毒感染2天。在细胞于无血清培养基中经受BDNF 0或30分钟前将 它们血清饥饿过夜。将细胞溶解产物用pan-Trk抗体(Santa Cruz，sc-139)免疫沉淀并且之后通过使用磷酸-TrkB的抗磷酸-Tyr抗体或总TrkB的抗TrkB抗体(Santa Cruz)的蛋白质印迹的进行评估。还通过蛋白质印迹来评估细胞溶解产物的LINGO-1表达(HA，Roche)。 
统计 
对于两组之间的比较，使用学生t检验进行统计分析，或对于多于两组之间的比较，使用单向方差分析(ANOVA)以及之后的事后检验(Student-Neuman-Keuls)进行统计分析。 
实施例1 
大鼠青光眼模型中LINGO-1的增加的表达 
在大鼠青光眼模型中检查LINGO-1的表达。在这一模型中，氩激光被用于通过角膜缘和巩膜引流管的激光凝固阻止房水的外流，导致眼内压(IOP)的可靠的增加(参见图1)。 
为了产生眼内高压状态，使用氩激光以7天的间隔将角膜缘静脉和三个巩膜上静脉激光凝固两次。如图3中所示，激光凝固之前和之后立即进行的房水静脉的检查显示静脉血流的显著下降。 
在正常和受损的大鼠视网膜切片中检查LINGO-1表达。正常视网膜神经节细胞(RGC)表现出低水平的LINGO-1染色，但是对LINGO-1的强得多的免疫反应性发生在激光凝固后2周的RGC中。标记的RGC的数目和标记的强度都增加(参见图4)。(术语“激光凝固后”意指“第一次激光凝固后”) 
这些发现被蛋白质印迹证实，其显示LINGO-1表达在正常视网膜中是低的并且在损伤后2周增加至1.6倍(P＜0.05)(参见图5)。 
实施例2 
LINGO-1拮抗剂起神经元保护剂的作用但没有影响眼内压 
实验性眼内高压可通过测量压力上的变化或神经元存活来监测。因此，检查了LINGO-1拮抗剂对眼内压和RGC存活的作用。如上文所描述的，动物经受激光处理，并且之后立即接受LINGO-1-Fc、1A7或对照蛋白的玻璃体内注射。 
监测处理和未处理的眼中的眼内压(IOP)。处理的动物的对侧左眼中的IOP为约13mmHg(参见图6)并在整个实验中保持在相同的水平。在所有四组中，在第一次激光手术后激光处理的右眼的IOP增加，达到约22mmHg并且保持在这一水平直到处死。在这些实验条件下，使用LINGO-1-Fc和中和性抗LINGO-1抗体，mAb 1A7的处理没有降低IOP(参见图6)。 
LINGO-1拮抗剂对神经元存活具有影响。首先，在激光损伤后2周对存活的RGC定量。制备来自两个眼的视网膜并且将存活的RGC计数。激光凝固后两周PBS和对照蛋白处理组中的RGC损失分别是13.93±1.44％和12.37±1.84％(参见图7A)。注射LINGO-1-Fc防止了RGC损失。LINGO-1-Fc处理的视网膜仅有0.09±1.47％RGC损失(P＜0.001，与PBS和人类IgG对照组相比)。相似地，mAb 1A7处理将RGC损失限制到1.46±1.32％(P＜0.001，与对照组相比)。 
为了研究LINGO-1拮抗剂对RGC的长期存活的影响，每周一 次玻璃体内注射LINGO-1-Fc和中和性LINGO-1抗体1A7并且允许动物存活4周。结果(参见图7A)显示用LINGO-1-Fc拮抗剂处理将激光凝固后4周损伤的RGC的损失从20.09±1.36％(PBS对照)显著降低至5.98±0.83％(P＜0.001)(对于LINGO-1-Fc来说)和4.73±1.72％(P＜0.001)(对于1A7来说)。 
RGC存活的数据同样显示为每组的平均密度(细胞的数目/mm2)(参见图7B)。在我们的大鼠青光眼模型中在激光凝固后2、4、8和12周进行的RGC死亡的先前研究显示在4周后RGC的损失达到最大水平(Li等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47：2951-2958(2006))。相反，在激光凝固后4周观察到LINGO-1-Fc和1A7的显著的神经保护。与睫状神经营养因子(CNTF)处理不同(数据未显示)，无论LINGO-1-Fc还是抗LINGO-1抗体都未在长期存活实验中导致白内障。 
电子显微术也被用于估计LINGO-1拮抗剂的影响。如图8A中显示的，眼内高压后两周，PBS处理的RGC中的一些具有不规则的或者甚至破裂的细胞核以及膨胀并溶解的线粒体。一些还显示出粗糙内质网(ER)和高尔基细胞器的损失。相反，用可溶的LINGO-1和1A7处理的眼保持具有正常的ER和高尔基细胞器的典型的视网膜神经节细胞的特征。还检测了RGC、无长突细胞和双极细胞在其中发生连接的内网层(IPL)中的细胞的细胞器。与保持差不多正常的轴突和树突的LINGO-1或1A7处理的动物相比，PBS处理的动物中的细胞在更膨胀的轴突和树突内部具有较少的细胞器(参见图8B)。此外，PBS处理的动物中的突触变窄但是还是保持未分离，而接受LINGO-1-Fc或1A7的处理的视网膜维持了突触的正常的特征。 
实施例3 
单独的LINGO-1拮抗剂没有促进体外视网膜神经节细胞的存活 
为了进一步研究LINGO-1-Fc对RGC存活的影响，使用了RGC原代培养体系(Meyer-Franke等人，Neuron，15：805-819(1995))。在对照蛋白或LINGO-1-Fc存在的情况下使分离的视网膜培养物生长3天。通过RGC的标志物Thy 1.1免疫染色来鉴定原代RGC并且对原代RGC计数。与体内明显的神经保护活性不一样，在这些实验条件下，单独的LINGO-1-Fc处理没有促进培养的RGC的存活(参见图9)。 
实施例4 
LINGO-1对BDNF通路起作用 
还检查了在脑源性神经营养因子(BDNF)存在的条件下LINGO-1拮抗剂对体外RGC的存活的影响。在BDNF存在的条件下，LINGO-1拮抗剂能够促进RGC的存活。将RGC如实施例3中培养并且用BDNF和对照蛋白或BDNF和LINGO-1-Fc处理。在BDNF存在的条件下，用LINGO-1-Fc处理的细胞中存活的细胞的百分比明显高于用对照蛋白处理的细胞中的。除了体内动物视网膜被暴露于内源BDNF而RGC培养物没有任何BDNF的事实之外，这一结果证明LINGO-1-Fc通过调节RGC对BDNF的响应来拯救RGC和/或LINGO-1-Fc通过增强神经营养蛋白受体而间接增加存活。 
因此，为了研究视网膜中LINGO-1-Fc和BDNF的关系，使用蛋白质印迹测量了眼内高压大鼠的视网膜中的BDNF。之前的研究显示正常的大鼠视网膜表达BDNF(Rudzinski等人，J.Neurobiol.58：341-351(2004))。结果显示正常视网膜中的低水平的BDNF(P ＜0.05，图10)。然而，BDNF水平在激光凝固后2周增加超过3倍(P＜0.05)，与之前报道的结果(Rudzinski等人，J.Neurobiol.58：341-351(2004))一致。因此，激光凝固活化内源的神经营养蛋白响应。然而，这一响应不足以完全地针对神经元损伤进行保护，如图7中所示。眼内高压之后使用LINGO-1-Fc和1A7的处理与PBS对照组相比没有改变BDNF的高水平(P＜0.05，与正常的相比，图10)。这些结果和体外数据表明LINGO-1-Fc或1A7调节对BDNF的响应并加强青光眼的视网膜中内源BDNF的神经保护活性。 
在LINGO-1-Fc和1A7的存在下，也注射中和性抗BDNF抗体。在这些实验中，激光凝固后0、3、7和10天将3μg的抗BDNF抗体(Chemicon)玻璃体内地注射至实验用眼和/或在0天施用2μgLINGO-1-Fc或1A7一次。在2周时将大鼠安乐死并且对FG标记的RGC计数。 
激光凝固后2周时抗BDNF抗体显著逆转了LINGO-1-Fc(P＝0.002)或1A7(P＝0.004)的保护功能。在PBS和抗BDNF抗体组或与LINGO-1-Fc或1A7组合的抗BDNF抗体组之间RGC损失没有差异(图11A)。数据还被表示为RGC的平均密度(细胞的数目/mm2)(图11B)。每组中的蛋白对眼内压没有影响。这些结果还证实LINGO-1-Fc或1A7通过加强视网膜中的增加的内源BDNF拯救了受损的RGC。 
实施例5 
LINGO-1与TrkB结合并负调节TrkB 
如实施例4中所示，LINGO-1-Fc通过调节对BDNF的响应发挥其神经保护活性。使用免疫沉淀和免疫印迹的方法检查LINGO-1和BDNF受体TrkB的关系。神经营养蛋白活化依次活化许多下游 信号转导通路的两种不同类型的受体，受体酪氨酸激酶的TrK家族和p75NTR。TrK受体包括TrkA、B和C。BDNF活化TrkB(Huang和Reichardt，2003，Annu.Rev.Biochem.72：609-642；Huang和Reichardt，2001，Annu.Rev.Neurosci.24：677-736)。之前已经证实视网膜中的主要Trk受体是TrkB(Cui等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43：1954-1964(2002))。 
为了确定LINGO-1是否与TrkB直接相互作用，检查了来自共表达TrkB和LINGO-1的转染的293T细胞的细胞溶解产物。用抗LINGO-1抗体免疫沉淀溶解产物并且将抗TrkB抗体或抗LINGO-1抗体用于蛋白质印迹。我们的结果显示TrkB与抗LINGO-1抗体从共表达TrkB和LINGO-1的293T细胞免疫沉淀(图12A)。这显示LINGO-1结合TrkB。此外，用TrkB慢病毒转染LINGO-1表达细胞系两天并且用BDNF处理细胞。使用全-Trk抗体免疫沉淀溶解产物并且之后通过蛋白质印迹估计磷酸-TrkB(p-TrkB)和总TrkB的水平。在所有的组中总TrkB保持在大约相同的水平(图12B)。在LINGO-1不存在的情况下，BDNF刺激导致磷酸化的TrkB的增加(图12B的泳道3和4)。然而，在LINGO-1存在的条件下，BDNF刺激后p-TrkB的水平较低(图12B的泳道7和8，P＜0.05)。这些结果显示LINGO-1结合TrkB并且在TrkB与神经营养蛋白结合后限制TrkB的活化。LINGO-1因此调节TrkB受体的功能，起到BDNF-TrkB系统的神经保护活性的负调节剂的作用。 
为了确定在体内LINGO-1和TrkB是否从RGC免疫共沉淀，用抗TrkB抗体、抗LINGO-1抗体或非特异性抗体免疫沉淀来自正常的或2周眼内高压的大鼠的视网膜溶解产物，并且抗LINGO-1抗体被用于蛋白质印迹。用抗TrkB抗体从视网膜溶解产物免疫共沉淀LINGO-1，指示正常的视网膜中LINGO-1与TrkB相互作用。 此外，眼内高压诱导后2周LINGO-1组成性地结合至TrkB(图13)。还检查了RGC中LINGO-1和TrkB的共定位。在用FG退行地标记的RGC中LINGO-1和p-TrkB共表达。图13B显示眼内高压的诱导并用1A7处理后两周LINGO-1和p-TrkB的共定位的代表性显微成像。 
为了进一步评估眼内高压模型中LINGO-1-Fc和1A7的机制，用蛋白质印迹评估LINGO-1-Fc和1A7对TrkB活化的作用。正常的大鼠视网膜表达高水平的总TrkB(图14A)。眼内高压诱导后2周对照组和LINGO-1-Fc组或1A7组之间的总TrkB水平没有差异(图14A)。然而，激光处理后2周LINGO-1-Fc或1A7施用比对照蛋白更显著地上调了p-TrkB水平(图14A)，证明LINGO-1-Fc和1A7处理在内源水平的BDNF存在的条件下允许TrkB的活化。在激光凝固后注射BDNF。无论单独用BDNF或用BDNF和LINGO-1-Fc或1A7的组合处理眼，总TrkB水平保持在相同的水平直到激光凝固视网膜后5天(图14B)。单独的BDNF处理增加了p-TrkB水平但是变化在处理5天后并不是统计学上显著的。然而与LINGO-1-Fc或与1A7组合的BDNF显著增加视网膜中p-TrkB的水平(图14B)。 
这些发现显示单独的BDNF刺激仅产生TrkB受体的限制性的活化。甚至当加入外源BDNF时也是如此。然而使用LINGO-1-Fc或1A7的处理缓解了这一限制。这些结果与显示LINGO-1与TrkB结合并且在TrkB与BDNF结合后负调节TrkB活化的体外结果一致。LINGO-1-Fc和1A7处理通过增加TrkB受体的BDNF活化促进神经保护活性。 
实施例6 
LINGO-1拮抗剂增加眼内高压后的Akt活化 
TrkB受体的BDNF活化起始几种下游的信号转导通路，包括PI-3激酶(PI3K)。通过PI3K的丝氨酸473和苏氨酸308的磷酸化是神经元的重要的存活信号(Brazil等人，Cell 111：293-303(2002))。如实施例4和5中所示，LINGO-1-Fc和1A7调节BDNF和其同源受体TrkB的功能。此外，通过在激光凝固手术后不同时间测量总Akt和pAkt(Akt的活性形式)来检查LINGO-1-Fc对PI3K/Akt信号转导通路的作用。蛋白质印迹分析表明总Akt水平保持不变直到激光凝固后5天(图15)。pAkt水平在正常对照视网膜中是低的但在激光凝固后6小时增加5倍并且之后从激光凝固后1天至5天下降。之前已经报道在视神经横断后pAkt水平上相似的钟形反应(Cheung等人，Mol.CellNeurosci.25：383-393(2004))。在LINGO-1-Fc处理的视网膜中，在pAkt的水平遵照相似的模式，激光凝固后6小时达到峰值并且之后下降持续5天。然而5天时LINGO-1-Fc处理的视网膜中pAkt的水平显著高于用PBS处理的对照视网膜中的水平(P＜0.05，图15)。因此，使用LINGO-1-Fc的处理影响Akt信号。 
为了证实在RGC而不是在视网膜的其他细胞中发生pAkt水平上的改变，通过视网膜的免疫组织化学研究来检查pAkt定位。pAkt免疫反应性仅在用FG退行性标记的RGC中，而在激光损伤和用LINGO-1-Fc.处理后pAkt定位没有改变。图16显示在激光凝固和用LINGO-1-Fc处理后6小时，pAkt免疫标记视网膜的代表性显微成像。 
为了进一步检查损伤后pAkt在LINGO-1-Fc的神经保护活性中的作用，观察PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002(LY，Calbiochem)的作用。在这些实验中，将10mM LY294002溶解在100％二甲亚 砜(DMSO；Sigma)中并且随后用无菌的PBS稀释至2mM。在右眼上进行第一次激光凝固后0、3、7和10天时玻璃体内注射2mMLY294002或2μl载体(溶于PBS的20％DMSO)。在14天将动物安乐死并且对FG标记的RGC计数。 
LINGO-1-Fc在眼内高压后2周促进RGC存活，而将LINGO-1-Fc与LY294002组合消除了神经保护作用(图17A)。RGC的损失从用LINGO-1-Fc处理的眼中的0.09±1.47％增加至用LINGO-1-Fc和LY294002处理的眼中的9.0±1.6％(P＝0.004)。数据还通过RGC的密度来表示(图17B)。无论LY294002单独还是与LINGO-1-Fc组合都不降低眼内压(图18)。 
实施例7 
LINGO-1拮抗剂降低眼内高压后的c-Jun N-端激酶活化 
JNK通路可由不同的细胞应激活化。最近，在人类和实验大鼠青光眼视网膜中检测了磷酸化的JNK，并且JNK的活化与RGC的死亡在时间上相关(Tezel等人Invest.Opthamol.Vis.Sci.44：3025-3033(2003))。最新的发现还证实IOP升高后磷酸化的JNK定位于RGC中。总JNK-1和JNK-2水平保持不变直到眼内高压后5天(图19)。磷酸化的JNK-1，2在正常的视网膜中是低的，之后5天后升高至超过8倍。大鼠青光眼模型中IOP升高后p-JNK水平的相似的反应之前已通过免疫组织化学法报道。用LINGO-1-Fc或1A7处理后，JNK的活化几乎降低至正常水平((P＜0.01)(图19)。这些结果表明LINGO-1拮抗剂可通过抑制JNK信号转导通路的活化拯救受损的RGC。 
实施例8 
LINGO-1拮抗剂降低眼内高压后的RhoA活化 
由于Rho在NgR1-LINGO-1-p75/TROY复合体下游起作用并且作为Rho活化的下游结果JNK被磷酸化，因此还进行实验以确定LINGO-1拮抗剂是否对眼内高压后的Rho的活性有影响。Rho活性可通过评价GTP-RhoA水平来评估，其中GTP-RhoA水平的增加与Rho活性的增加有关。在正常的视网膜中观察到低水平的GTP-RhoA并且激光凝固后五天GTP-RhoA水平增加差不多两倍(p＜0.05，与正常组相比)(图21)。相反，LINGO-1-Fc处理的视网膜将高水平的GTP-RhoA显著降低至基础水平(p＜0.05，与PBS组相比)(图21)。这些结果显示LINGO-1-Fc通过抑制RhoA活化发挥神经保护活性。 
*** 
本发明的范围不受所描述的具体实施方式的限制，所述具体实施方式意图作为本发明的个体方面的单独说明，并且功能相同的任何组合物或方法在本发明的范围内。实际上，除了本文所显示和描述的那些之外，从前文的描述和附图，本发明的不同的修饰对本领域技术人员来说将变得明显。这种修饰意图在所附的权利要求的范围内。 
这一说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，引用程度就如同将每一个体出版物或专利申请特定且单独地表明通过引用并入。 
应理解的是发明详述部分而非概述和摘要部分意图用来说明权利要求。概述和摘要可展示发明人考虑的本发明的一个或多个但不是全部的示例性实施方式，并且因此不意图以任何方式限制本发明和所附的权利要求。 
序列表
<110>比奥根艾迪克MA公司
 
<120>通过施用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂治疗压力诱导的视神经病变、阻止神经元变性和促进神经元细胞存活的方
法
 
<130>2159.173PC01/EJH/CLD
 
<140>待分配
<141>2008-10-10
 
<150>60/979,338
<151>2007-10-11
 
<160>34
 
<170>专利版本3.3
 
<210>1
<211>1845
<212>DNA
<213>智人
 
<400>1
atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc     60
ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc    120
gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc    180
gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc    240
aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc    300
gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc    360
cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc    420
aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg    480
tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc    540
ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc    600
cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac    660
atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc    720
tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg    780
tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta    840
gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg    900
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ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg   1080
gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg   1140
ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag   1200
ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc   1260
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cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc   1380
tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac   1440
gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac   1500
tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac    1560
aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc    1620
actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc    1680
tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag    1740
ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc    1800
agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga                    1845
 
<210>2
<211>614
<212>PRT
<213>智人
 
<400>2
 
Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys
1               5                   10                  15
Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala
        35                  40                  45
Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro
    50                  55                  60
Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu
65                  70                  75                  80
Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu
            100                 105                 110
Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile
        115                 120                 125
Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile
    130                 135                 140
Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile
                165                 170                 175
Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu
            180                 185                 190
Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu
        195                 200                 205
His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile
    210                 215                 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile
225                 230                 235                 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly
                245                 250                 255
Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val
            260                 265                 270
Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu
        275                 280                 285
Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu
    290                 295                 300
Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val
305                 310                 315                 320
Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val
                325                 330                 335
Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Val
            340                 345                 350
Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp
        355                 360                 365
Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn
    370                 375                 380
Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu
385                 390                 395                 400
Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg
                405                 410                 415
Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu
            420                 425                 430
Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro
        435                 440                 445
Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser
    450                 455                 460
Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr
465                 470                 475                 480
Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala
                485                 490                 495
Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Val Arg Ser Tyr Ser
            500                 505                 510
Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn
        515                 520                 525
Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe
    530                 535                 540
Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile
545                 550                 555                 560
Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp
                565                 570                 575
Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Val
            580                 585                 590
Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys
        595                 600                 605
Phe Asn Met Lys Met Ile
    610
 
<210>3
<211>5608
<212>DNA
<213>智人
 
<400>3
aagacggatt ctcagacaag gcttgcaaat gccccgcagc catcatttaa ctgcacccgc     60
agaatagtta cggtttgtca cccgaccctc ccggatcgcc taatttgtcc ctagtgagac    120
cccgaggctc tgcccgcgcc tggcttcttc gtagctggat gcatatcgtg ctccgggcag    180
cgcgggcgca gggcacgcgt tcgcgcacac cctagcacac atgaacacgc gcaagagctg    240
aaccaagcac ggtttccatt tcaaaaaggg agacagcctc taccgcgatt gtagaagaga    300
ctgtggtgtg aattagggac cgggaggcgt cgaacggagg aacggttcat cttagagact    360
aattttctgg agtttctgcc cctgctctgc gtcagccctc acgtcacttc gccagcagta    420
gcagaggcgg cggcggcggc tcccggaatt gggttggagc aggagcctcg ctggctgctt    480
cgctcgcgct ctacgcgctc agtccccggc ggtagcagga gcctggaccc aggcgccgcc    540
ggcgggcgtg aggcgccgga gcccggcctc gaggtgcata ccggaccccc attcgcatct    600
aacaaggaat ctgcgcccca gagagtcccg ggagcgccgc cggtcggtgc ccggcgcgcc    660
gggccatgca gcgacggccg ccgcggagct ccgagcagcg gtagcgcccc cctgtaaagc    720
ggttcgctat gccggggcca ctgtgaaccc tgccgcctgc cggaacactc ttcgctccgg    780
accagctcag cctctgataa gctggactcg gcacgcccgc aacaagcacc gaggagttaa    840
gagagccgca agcgcaggga aggcctcccc gcacgggtgg gggaaagcgg ccggtgcagc    900
gcggggacag gcactcgggc tggcactggc tgctagggat gtcgtcctgg ataaggtggc    960
atggacccgc catggcgcgg ctctggggct tctgctggct ggttgtgggc ttctggaggg   1020
ccgctttcgc ctgtcccacg tcctgcaaat gcagtgcctc tcggatctgg tgcagcgacc   1080
cttctcctgg catcgtggca tttccgagat tggagcctaa cagtgtagat cctgagaaca   1140
tcaccgaaat tttcatcgca aaccagaaaa ggttagaaat catcaacgaa gatgatgttg   1200
aagcttatgt gggactgaga aatctgacaa ttgtggattc tggattaaaa tttgtggctc   1260
ataaagcatt tctgaaaaac agcaacctgc agcacatcaa ttttacccga aacaaactga   1320
cgagtttgtc taggaaacat ttccgtcacc ttgacttgtc tgaactgatc ctggtgggca    1380
atccatttac atgctcctgt gacattatgt ggatcaagac tctccaagag gctaaatcca    1440
gtccagacac tcaggatttg tactgcctga atgaaagcag caagaatatt cccctggcaa    1500
acctgcagat acccaattgt ggtttgccat ctgcaaatct ggccgcacct aacctcactg    1560
tggaggaagg aaagtctatc acattatcct gtagtgtggc aggtgatccg gttcctaata    1620
tgtattggga tgttggtaac ctggtttcca aacatatgaa tgaaacaagc cacacacagg    1680
gctccttaag gataactaac atttcatccg atgacagtgg gaagcagatc tcttgtgtgg    1740
cggaaaatct tgtaggagaa gatcaagatt ctgtcaacct cactgtgcat tttgcaccaa    1800
ctatcacatt tctcgaatct ccaacctcag accaccactg gtgcattcca ttcactgtga    1860
aaggcaaccc caaaccagcg cttcagtggt tctataacgg ggcaatattg aatgagtcca    1920
aatacatctg tactaaaata catgttacca atcacacgga gtaccacggc tgcctccagc    1980
tggataatcc cactcacatg aacaatgggg actacactct aatagccaag aatgagtatg    2040
ggaaggatga gaaacagatt tctgctcact tcatgggctg gcctggaatt gacgatggtg    2100
caaacccaaa ttatcctgat gtaatttatg aagattatgg aactgcagcg aatgacatcg    2160
gggacaccac gaacagaagt aatgaaatcc cttccacaga cgtcactgat aaaaccggtc    2220
gggaacatct ctcggtctat gctgtggtgg tgattgcgtc tgtggtggga ttttgccttt    2280
tggtaatgct gtttctgctt aagttggcaa gacactccaa gtttggcatg aaagatttct    2340
catggtttgg atttgggaaa gtaaaatcaa gacaaggtgt tggcccagcc tccgttatca    2400
gcaatgatga tgactctgcc agcccactcc atcacatctc caatgggagt aacactccat    2460
cttcttcgga aggtggccca gatgctgtca ttattggaat gaccaagatc cctgtcattg    2520
aaaatcccca gtactttggc atcaccaaca gtcagctcaa gccagacaca tttgttcagc    2580
acatcaagcg acataacatt gttctgaaaa gggagctagg cgaaggagcc tttggaaaag    2640
tgttcctagc tgaatgctat aacctctgtc ctgagcagga caagatcttg gtggcagtga    2700
agaccctgaa ggatgccagt gacaatgcac gcaaggactt ccaccgtgag gccgagctcc    2760
tgaccaacct ccagcatgag cacatcgtca agttctatgg cgtctgcgtg gagggcgacc    2820
ccctcatcat ggtctttgag tacatgaagc atggggacct caacaagttc ctcagggcac    2880
acggccctga tgccgtgctg atggctgagg gcaacccgcc cacggaactg acgcagtcgc    2940
agatgctgca tatagcccag cagatcgccg cgggcatggt ctacctggcg tcccagcact    3000
tcgtgcaccg cgatttggcc accaggaact gcctggtcgg ggagaacttg ctggtgaaaa    3060
tcggggactt tgggatgtcc cgggacgtgt acagcactga ctactacagg gtcggtggcc    3120
acacaatgct gcccattcgc tggatgcctc cagagagcat catgtacagg aaattcacga    3180
cggaaagcga cgtctggagc ctgggggtcg tgttgtggga gattttcacc tatggcaaac    3240
agccctggta ccagctgtca aacaatgagg tgatagagtg tatcactcag ggccgagtcc    3300
tgcagcgacc ccgcacgtgc ccccaggagg tgtatgagct gatgctgggg tgctggcagc    3360
gagagcccca catgaggaag aacatcaagg gcatccatac cctccttcag aacttggcca    3420
aggcatctcc ggtctacctg gacattctag gctagggccc ttttccccag accgatcctt    3480
cccaacgtac tcctcagacg ggctgagagg atgaacatct tttaactgcc gctggaggcc    3540
accaagctgc tctccttcac tctgacagta ttaacatcaa agactccgag aagctctcga    3600
gggaagcagt gtgtacttct tcatccatag acacagtatt gacttctttt tggcattatc    3660
tctttctctc tttccatctc ccttggttgt tcctttttct ttttttaaat tttctttttc    3720
tttttttttt cgtcttccct gcttcacgat tcttaccctt tcttttgaat caatctggct    3780
tctgcattac tattaactct gcatagacaa aggccttaac aaacgtaatt tgttatatca    3840
gcagacactc cagtttgccc accacaacta acaatgcctt gttgtattcc tgcctttgat    3900
gtggatgaaa aaaagggaaa acaaatattt cacttaaact ttgtcacttc tgctgtacag    3960
atatcgagag tttctatgga ttcacttcta tttatttatt attattactg ttcttattgt    4020
ttttggatgg cttaagcctg tgtataaaaa agaaaacttg tgttcaatct gtgaagcctt    4080
tatctatggg agattaaaac cagagagaaa gaagatttat tatgaaccgc aatatgggag    4140
gaacaaagac aaccactggg atcagctggt gtcagtccct acttaggaaa tactcagcaa    4200
ctgttagctg ggaagaatgt attcggcacc ttcccctgag gacctttctg aggagtaaaa    4260
agactactgg cctctgtgcc atggatgatt cttttcccat caccagaaat gatagcgtgc    4320
agtagagagc aaagatggct tccgtgagac acaagatggc gcatagtgtg ctcggacaca    4380
gttttgtctt cgtaggttgt gatgatagca ctggtttgtt tctcaagcgc tatccacaga    4440
acctttgtca acttcagttg aaaagaggtg gattcatgtc cagagctcat ttcggggtca    4500
ggtgggaaag ccaagaactt ggaaaagata agacaagcta taaattcgga ggcaagtttc    4560
ttttacaatg aacttttcag atctcacttc cctccgaccc ctaacttcca tgcccacccg    4620
tccttttaac tgtgcaagca aaattgtgca tggtcttcgt cgattaatac cttgtgtgca    4680
gacactactg ctccagacgt cgtttccctg ataggtagag cagatccata aaaaggtatg    4740
acttatacaa ttaggggaag ctaatggagt ttattagctg agtatcaatg tctctgcgtt    4800
gtacggtggt gatgggtttt aatgaatatg gaccctgaag cctggaaatc ctcatccacg    4860
tcgaacccac aggactgtgg gaagggcaga atcaatccct aagggaaagg aaacctcacc    4920
ctgagggcat cacatgcact catgttcagt gtacacaggt caagtccctt gctctgggct    4980
ctagttggga gagtggtttc attccaagtg tactccattg tcagtatgct gtttttgttt    5040
ccttcactcc attcaaaaag tcaaaataca aaatttggca cagcatgcca acgggaggct    5100
gtgcccagac caagcactgg aagtgtgctt ctaggcatag tcattggttt tgcaaaaaga    5160
gggctcaaat ttaaatagaa atttacagct atttgaatgg tcagatatac caagaaagaa    5220
aaatatttct gttcctcaag aaaacttgct accctctgtg aggggaattt tgctaaactt    5280
gacatcttta taacatgagc cagattgaaa gggagtgatt ttcattcatc ttaggtcatg    5340
ttatttcata tttgtttctg aaggtgcgat agctctgttt taggttttgc ttgcgcctgt    5400
taattactgg aacaccttat ttttcattaa aggctttgaa agccaattct caaaaattca    5460
aaagtgcaaa ttaacagaac aaaaggaaat ccagtagcaa ctgcagtcaa gcgagggagt    5520
tgacaagata aaccttacgt ccattcaagt tatatgctgg cctatgagag atgagagttg    5580
ggtcgtttgt tctctttgtt gatgattt                                       5608
 
<210>4
<211>838
<212>PRT
<213>智人
<400>4
 
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1               5                   10                  15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
            20                  25                  30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
        35                  40                  45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
    50                  55                  60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
            100                 105                 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
        115                 120                 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
    130                 135                 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145                 150                 155                 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
                165                 170                 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
            180                 185                 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
        195                 200                 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
    210                 215                 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225                 230                 235                 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
                245                 250                 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
            260                 265                 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
        275                 280                 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
    290                 295                 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
                325                 330                 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
            340                 345                 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
        355                 360                 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
    370                 375                 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385                 390                 395                 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
                405                 410                 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
            420                 425                 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
        435                 440                 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
    450                 455                 460
Lys Asp Phe Ser Trp Phe Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly
465                 470                 475                 480
Val Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
                485                 490                 495
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
            500                 505                 510
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
        515                 520                 525
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
    530                 535                 540
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
545                 550                 555                 560
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
                565                 570                 575
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
            580                 585                 590
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
        595                 600                 605
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
    610                 615                 620
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
625                 630                 635                 640
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
                645                 650                 655
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
            660                 665                 670
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
        675                 680                 685
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
    690                 695                 700
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
705                 710                 715                 720
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
                725                 730                 735
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
            740                 745                 750
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
        755                 760                 765
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
    770                 775                 780
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
785                 790                 795                 800
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
                805                 810                 815
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
            820                 825                 830
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
        835
 
<210>5
<211>4757
<212>DNA
<213>家鼠属
 
<400>5
atctgtgtgc gagtgcgtgt gcgtgcgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt     60
gtgtgagcgt gtgtgttttt ggatttcata ctaattttct ggagtttctg cccctgctct    120
gcgtcagccc tcacgtcact tcgccagcag tagcagaggc ggcggcggcc gccggttaga     180
gcccagtcgc tgcttcagct gctgttgctg cttctgcggc gctctgctcc ctgcgctggc     240
tacgggaggc cgggggagcc gcgccgacag tcctctgtgg ccagggccgg cactgtcctg     300
ctaccgcagt tgctccccag ccctgaggtg cgcaccgata tcgatatccg tgccggttta     360
gcggttctgc gacccaaaga gtccagggag agccaccgag tggcgcctgg cgtataggac     420
catgcagccg ccttgtggct tggagcagcg gcccgtgatg ttccagccac tgtgaaccat     480
ttggtcagcg ccaacctgct cagccccagc accgacaggc tcagcctctg gtacgctcct     540
ctcggcggga ggccatcagc accaagcagc aagagggctc agggaaggcc tcccccctcc     600
ggcgggggac gcctggctca gcgtagggac acgcactctg actgactggc actggcagct     660
cgggatgtcg ccctggccga ggtggcatgg acccgccatg gcgcggctct ggggcttatg     720
cttgctggtc ttgggcttct ggagggcttc tcttgcctgc cccatgtcct gcaaatgcag     780
caccactagg atttggtgta ccgagccttc tcctggcatc gtggcatttc cgaggttgga     840
acctaacagc attgacccag agaacatcac cgaaattctc attgcaaacc agaaaaggtt     900
agaaatcatc aatgaagatg atgtcgaagc ttacgtgggg ctgaaaaacc ttacaattgt     960
ggattccggc ttaaagtttg tggcttacaa ggcgtttctg aagaacggca acctgcggca    1020
catcaatttc actcgaaaca agctgacgag tttgtccagg agacatttcc gccaccttga    1080
cttgtctgac ctgatcctga cgggtaatcc gttcacgtgt tcctgtgaca tcatgtggct    1140
caagactctc caggagacga aatccagccc cgacactcag gatttgtatt gcctcaatga    1200
gagcagcaag aatacccctc tggcgaacct gcagattccc aattgtggtc tgccgtctgc    1260
acgtctggcc gctcctaacc tcacggtgga ggaagggaag tctgtgacca tttcctgcag    1320
cgtcgggggt gacccgctcc ccaccttgta ctgggacgtt gggaatttgg tttccaaaca    1380
catgaatgaa acaagccaca cacagggctc cttaaggata acaaacattt catcggatga    1440
cagtgggaaa caaatctctt gtgtggcaga aaacctcgtc ggagaagatc aagactctgt    1500
gaacctcact gtgcattttg caccaaccat cacatttctc gaatctccaa cctcagacca    1560
ccactggtgc atcccattca ctgtgagagg caaccccaag ccagcacttc agtggttcta    1620
caacggagcc atactgaatg aatccaagta catctgtacc aaaatacacg tcaccaatca    1680
cacggagtac cacggctgcc tccagctgga taaccccact catatgaata atggagacta    1740
caccctaatg gccaagaatg aatatgggaa ggacgagaga cagatttctg ctcacttcat    1800
gggccggcct ggagttgact atgagacaaa cccaaattac cctgaagtcc tctatgaaga    1860
ctggaccacg ccaactgaca tcggggatac tacaaacaaa agtaatgaga tcccctccac    1920
ggatgttgct gaccaaacca atcgggagca tctctcggtc tatgctgtgg tggtgattgc    1980
ctctgtggta ggattctgcc tgctggtgat gctgcttctg ctcaagttgg cgagacattc    2040
caagtttggc atgaaaggcc cagcttccgt catcagcaac gacgatgact ctgccagccc    2100
tctccaccac atctccaacg ggagcaacac tccgtcttct tcggagggcg ggcccgatgc    2160
tgtcatcatt gggatgacca agatccctgt cattgaaaac ccccagtact tcggtatcac    2220
caacagccag ctcaagccgg acacatttgt tcagcacatc aagagacaca acatcgttct    2280
gaagagggag cttggagaag gagcctttgg gaaagttttc ctagcggagt gctataacct    2340
ctgccccgag caggataaga tcctggtggc cgtgaagacg ctgaaggacg ccagcgacaa    2400
tgctcgcaag gactttcatc gcgaagccga gctgctgacc aacctccagc acgagcacat   2460
tgtcaagttc tacggtgtct gtgtggaggg cgacccactc atcatggtct ttgagtacat   2520
gaagcacggg gacctcaaca agttccttag ggcacacggg ccagatgcag tgctgatggc   2580
agagggtaac ccgcccaccg agctgacgca gtcgcagatg ctgcacatcg ctcagcaaat   2640
cgcagcaggc atggtctacc tggcatccca acacttcgtg caccgagacc tggccacccg   2700
gaactgcttg gtaggagaga acctgctggt gaaaattggg gacttcggga tgtcccggga   2760
tgtatacagc accgactact accgggttgg tggccacaca atgttgccca tccgatggat   2820
gcctccagag agcatcatgt acaggaaatt caccaccgag agtgacgtct ggagcctggg   2880
agttgtgttg tgggagatct tcacctacgg caagcagccc tggtatcagc tatcaaacaa   2940
cgaggtgata gaatgcatca cccagggcag agtccttcag cggcctcgca cgtgtcccca   3000
ggaggtgtac gagctgatgc tgggatgctg gcagcgggaa ccacacacaa ggaagaacat   3060
caagaacatc cacacactcc ttcagaactt ggcgaaggcg tcgcccgtct acctggacat   3120
cctaggctag actccctctt ctcccagacg gcccttccca aggcacccct cagacctctt   3180
aactgccgct gatgtcacca ccttgctgtc cttcgctctg acagtgttaa caagacaagg   3240
agcggctctc cggggtgagg cagtgcgcac ttccccatcc acagacagta tcgactcgct   3300
tctggctttg tcgctttctc tccctttggt ttgtttcttt cttttgccca ttctccattt   3360
atttatttat ttatttattt atttatttat ttatttattt atttatctat ctatctatct   3420
atttatttat ttatttattg gtcttcactg cttcatggtc ctcggcctct ctccttgacc   3480
gatctggctt ctgtactcct attcactgta catagacaaa ggccttaaca aacctgattt   3540
gttatatcag cagacactcc agtttgccca ccacaactaa caatgccttg ttgtattcct   3600
gcctttgatg tggatgaaaa aaagggaaaa aaaataatca aacatctgac ttaaaccgtc   3660
acttccgatg tacagacacg gggcgtttct atggattcac ttctatctat ctatttattt   3720
atttatctat ttatttattt ctcttctttg ttgttttccg gtggttttag cctgtgtatg   3780
agaagggaaa gtcatgtaca gtctgggaaa actttatctg tgggaaatgg aaaccagaag   3840
gggaaagaag ctttaccata aagcacagca ggagtgagac acagaaaagc cattggatca   3900
gccagagtcc gtcctgcata ggaaaaccca gcagccatca ggctggagga tcatgttcgg   3960
cactgacccc cgaggacctt tctgaggagg acacagaatg ttaaactctg catcatggac   4020
acagtttccg atcacagata ctggccttca atggaaaaaa aaaaaaaaaa aacccagata   4080
gttcttgtga gacctggaca gcacgtccaa catccagaca ttgtggtcgg gcacagtgac   4140
agagttgatg catttctcac gggttattct acagagcttt tgtcaagtcc aatggaagga   4200
ggtagattct tgttcagata tgatttcggg aaaaaccgag tccttgacaa agacaggaga   4260
caccctcagt tgggaggcaa gtttctctta ccttggactt tctcacacag caattctcac   4320
ccccaccccc tccactctca cctgtcttgt aactgtgcaa acaaaagtgt gcatggtctt   4380
tgtcagttga tacctttgtg cacctctgtg cagaaactgc tgtctgtccc ggctgtggta   4440
cccgatcagt ggggtagatc cacgaaaggt ctcattttag gccgctttgg gaaggtaacc   4500
agatcggtag ctggaagcac tctccagtag gtggcgaagg gtgagtgggt ctgctgaagc   4560
ctgcatatct tcacccacct caaacccacc gggctgcaca ggggacaggc acaggccacc   4620
cctgagggac agggaagctc tcttgggata ccacctgagt ttacattcag tgtgctcagg   4680
tcaagtctct cgctcggggc tctgtttcgg ggagaatggt ttcattccaa cgcactcatt   4740
atcaggattc tgttttc                                                  4757
 
<210>6
<211>821
<212>PRT
<213>家鼠属
 
<400>6
 
Met Ser Pro Trp Pro Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1               5                   10                  15
Gly Leu Cys Leu Leu Val Leu Gly Phe Trp Arg Ala Ser Leu Ala Cys
            20                  25                  30
Pro Met Ser Cys Lys Cys Ser Thr Thr Arg Ile Trp Cys Thr Glu Pro
        35                  40                  45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Ile Asp
    50                  55                  60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Ile lle Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Lys Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala Tyr Lys Ala Phe Leu
            100                 105                 110
Lys Asn Gly Asn Leu Arg His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
        115                 120                 125
Ser Leu Ser Arg Arg His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Asp Leu Ile
    130                 135                 140
Leu Thr Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
                165                 170                 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Thr Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
            180                 185                 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Arg Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
        195                 200                 205
Glu Glu Gly Lys Ser Val Thr Ile Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp Pro
    210                 215                 220
Leu Pro Thr Leu Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225                 230                 235                 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
                245                 250                 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
            260                 265                 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
        275                 280                 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
    290                 295                 300
Phe Thr Val Arg Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
                325                 330                 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
            340                 345                 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Met Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
        355                 360                 365
Lys Asp Glu Arg Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Arg Pro Gly Val
    370                 375                 380
Asp Tyr Glu Thr Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Val Leu Tyr Glu Asp Trp
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Thr Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Lys Ser Asn Glu Ile
                405                 4l0                 415
Pro Ser Thr Asp Val Ala Asp Gln Thr Asn Arg Glu His Leu Ser Val
            420                 425                 430
Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu Val
        435                 440                 445
Met Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys
    450                 455                 460
Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu
465                 470                 475                 480
His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly
                485                 490                 495
Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn
            500                 505                 510
Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe
        515                 520                 525
Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly
    530                 535                 540
Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys
545                 550                 555                 560
Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala
                565                 570                 575
Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr
            580                 585                 590
Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu
        595                 600                 605
Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu
    610                 615                 620
Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu
625                 630                 635                 640
Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala
                645                 650                 655
Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val
            660                 665                 670
His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu
        675                 680                 685
Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp
    690                 695                 700
Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro
705                 710                 715                 720
Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp
                725                 730                 735
Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro
            740                 745                 750
Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly
        755                 760                 765
Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu
    770                 775                 780
Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Thr Arg Lys Asn Ile Lys
785                 790                 795                 800
Asn Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr
                805                 810                 815
Leu Asp Ile Leu Gly
            820
 
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>智人
 
<400>7
 
Met Gln Val Ser Lys Arg
1               5
 
<210>8
<211>116
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VH序列
 
<400>8
 
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>9
<211>106
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VL序列
 
<400>9
 
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lle Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VH CDR1序列
 
<400>10
 
Asn Tyr Gly Met Asn
1               5
 
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VH CDR2序列
 
<400>11
 
Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VH CDR3序列
 
<400>12
 
Glu Gly Val His Phe Asp Tyr
1               5
 
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VL CDR1序列
 
<400>13
 
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1               5                   10
 
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VL CDR2序列
 
<400>14
 
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1               5
 
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>1A7抗体的VL CDR3序列
 
<400>15
 
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1               5
 
<210>16
<211>120
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VH序列
 
<400>16
 
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser His Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>17
<211>106
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VL序列
<400>17
 
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Leu Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VH CDR1序列
<400>18
 
Ser Tyr Trp Met His
1               5
 
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>3B5抗体的VH CDR2序列
<400>19
 
Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VH CDR3序列
 
<400>20
 
Pro Tyr Tyr Gly Ser His Trp Phe Phe Asp
1               5                   10
 
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VL CDR1序列
 
<400>21
 
Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Val His
1               5                   10
 
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VL CDR2序列
 
<400>22
 
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
 
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>3B5抗体的VL CDR3序列
 
<400>23
 
Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr
1               5
 
<210>24
<211>119
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VH序列
 
<400>24
 
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>25
<211>107
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VL序列
 
<400>25
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VH CDR1序列
 
<400>26
 
Ile Tyr Pro Met Phe
1               5
 
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VH CDR2序列
 
<400>27
 
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VH CDR3序列
 
<400>28
 
Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5                   10
 
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VL CDR1序列
 
<400>29
 
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VL CDR2序列
 
<400>30
 
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1           5
 
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>未知
 
<220>
<223>LI33抗体的VL CDR3序列
 
<400>31
 
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu Thr
1               5
 
<210>32
<211>200
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA分子制备中使用的寡核苷酸的一般合成结构
 
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(200)
<223>n为a，g，c，t或u
 
<220>
<221>其他特征
<222>(2)..(200)
<223>核苷酸可能缺失
<400>32
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    120
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn                                                200
 
<210>33
<211>200
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>siRNA分子制备中使用的寡核苷酸的一般合成结构
 
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(200)
<223>n为a，g，c，t或u
 
<220>
<221>其他特征
<222>(2)..(200)
<223>核苷酸可能缺失
 
<400>33
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    120
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn                                                200
 
<210>34
<211>55
<212>RNA
<213>未知
 
<220>
<223>LINGO-1拮抗剂多核苷酸的shRNA序列
 
<400>34
ugaucgucau ccugcuagac uucaagagag ucuagcagga ugacgaucuu uuuuc          55

Claims (107)

1.一种抑制细胞中LINGO-1和TrkB相互作用的方法，包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。
2.一种促进细胞中TrkB磷酸化的方法，包括将共表达LINGO-1和TrkB的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。
3.一种促进TrkB磷酸化的方法，包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。
4.一种抑制细胞中JNK磷酸化的方法，包括将共表达LINGO-1和JNK的细胞与LINGO-1拮抗剂接触。
5.一种抑制JNK磷酸化的方法，包括将CNS神经元与LINGO-1拮抗剂接触。
6.一种促进处于死亡危险的神经元存活的方法，包括将所述神经元与有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂接触。
7.一种促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中视网膜神经节细胞存活的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的LINGO-1拮抗剂和载体。
8.一种促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中视网膜神经节细胞存活的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂的组合。
9.一种治疗与神经元细胞死亡相关的疾病或病症的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括将所述细胞与TrkB激动剂接触。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂包含可溶的LINGO-1多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含选自由下列组成的组的LINGO-1区：
(i)LINGO Ig结构域或者其片段、变体或衍生物，
(ii)LINGO LRR结构域或者其片段、变体或衍生物，
(iii)LINGO胞质结构域或者其片段、变体或衍生物，
(iv)LINGO跨膜结构域或者其片段、变体或衍生物，
(v)LRR结构域C-端的LINGO碱性区或者其片段、变体或衍生物，和
(vi)(i)至(v)的所述LINGO-1结构域或者其片段、变体或衍生物中的至少两种的组合。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽缺少选自由下列所组成的组的LINGO-1区：
(i)LINGO Ig结构域，
(ii)LINGO LRR结构域，
(iii)LINGO胞质结构域，
(iv)LINGO跨膜结构域，
(v)LRR结构域C-端的LINGO碱性区，和
(vi)(i)至(v)的所述LINGO-1结构域中的至少两种的组合。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽缺少LINGO-1跨膜结构域和LINGO-1胞质结构域。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含
(i)LINGO-1LRR结构域或者其片段、变体或衍生物，
(ii)LRR结构域C-端的LINGO碱性区或者其片段、变体或衍生物，和
(iii)LINGO-1免疫球蛋白(Ig)结构域或者其片段、变体或衍生物。
16.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含所述LINGO-1LRR结构域的至少一部分，但缺少LINGO-1 Ig结构域、LINGO-1碱性区、LINGO-1跨膜结构域和LINGO-1胞质结构域。
17.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含选自由下列组成的组的多肽片段：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1至33；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至35；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至64；
(iv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至64；
(v)SEQ ID NO：2的氨基酸66至89；
(vi)SEQ ID NO：2的氨基酸90至113；
(vii)SEQ ID NO：2的氨基酸114至137；
(viii)SEQ ID NO：2的氨基酸138至161；
(ix)SEQ ID NO：2的氨基酸162至185；
(x)SEQ ID NO：2的氨基酸186至209；
(xi)SEQ ID NO：2的氨基酸210至233；
(xii)SEQ ID NO：2的氨基酸234至257；
(xiii)SEQ ID NO：2的氨基酸258至281；
(xiv)SEQ ID NO：2的氨基酸282至305；
(xv)SEQ ID NO：2的氨基酸306至329；
(xvi)SEQ ID NO：2的氨基酸330至353；
(xvii)SEQ ID NO：2的氨基酸363至416；
(xviii)SEQ ID NO：2的氨基酸417至424；
(xix)SEQ ID NO：2的氨基酸419至493；
(xx)SEQ ID NO：2的氨基酸494至551；
(xxi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至64；
(xxii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至89；
(xxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至113；
(xxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至137；
(xxv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至161；
(xxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至185；
(xxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至209；
(xxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至233；
(xxix)SEQ ID NO：2的氨基酸1至257；
(xxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸1至281；
(xxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至305；
(xxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至329；
(xxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至353；
(xxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至416；
(xxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至424；
(xxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至493；
(xxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至551；
(xxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至531；
(iL)SEQ ID NO：2的氨基酸1至532；
(Li)SEQ ID NO：2的氨基酸34至89；
(Lii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至113；
(Liii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至137；
(Liv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至161；
(Lv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至185；
(Lvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至209；
(Lvii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至233；
(Lviii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至257；
(Lix)SEQ ID NO：2的氨基酸34至281；
(Lx)SEQ ID NO：2的氨基酸34至305；
(Lxi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至329；
(Lxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至353；
(Lxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至416；
(Lxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至424；
(Lxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至493；
(Lxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至551；
(Lxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至530；
(Lxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至531；
(Lxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；
(Lxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至533；
(Lxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至534；
(Lxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至535；
(Lxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至536；
(Lxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至537；
(Lxxix)SEQ ID NO：2的氨基酸34至538；
(Lxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸34至539；
(Lxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸30至532；
(Lxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸31至532；
(Lxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸32至532；
(Lxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸33至532；
(Lxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；
(Lxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸35至532；
(Lxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至532；
(Lxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸30至531；
(Lxxxix)SEQ ID NO：2的氨基酸31至531；
(Lxxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸32至531；
(Lxxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸33至531；
(Lxxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至531；
(Lxxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸35至531；
(Lxxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至531；
(Lxxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至89；
(Lxxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至113；
(Lxxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至137；
(Lxxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至161；
(Lxxxxvc)SEQ ID NO：2的氨基酸36至185；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸36至209；
(ci)SEQ ID NO：2的氨基酸36至233；
(cii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至257；
(ciii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至281；
(civ)SEQ ID NO：2的氨基酸36至305；
(cv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至329；
(cvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至353；
(cvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至416；
(cviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至424；
(cix)SEQ ID NO：2的氨基酸36至493；
(cx)SEQ ID NO：2的氨基酸36至551；
(cxi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至530；
(cxii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至531；
(cxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至532；
(cxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至533；
(cxv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至534；
(cxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至535；
(cxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至536；
(cxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至537；
(cxix)SEQ ID NO：2的氨基酸36至538；
(cxx)SEQ ID NO：2的氨基酸36至539；
(cxxi)任何所述多肽片段的变体或衍生物，以及
(cxxii)任何所述多肽片段或者其变体或衍生物中的至少两种的组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-532或SEQ ID NO：2的氨基酸36-532。
19.如权利要求11-18中任一项所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含LINGO-1 Ig结构域或者其片段、变体或衍生物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸417-493。
21.如权利要求11至20中任一项所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽还包含非LINGO-1部分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述非LINGO-1部分是融合至所述可溶的LINGO-1多肽的异源多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中异源多肽选自由免疫球蛋白片段、血清白蛋白、靶向蛋白、报告蛋白和促进纯化的蛋白组成的组。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述异源多肽是免疫球蛋白片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述免疫球蛋白片段含有铰链和Fc区。
26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽被轭合至聚合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖聚合物和多肽所组成的组。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述聚合物是聚亚烷基二醇。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述可溶的LINGO-1多肽被轭合至1、2、3或4个聚合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述聚合物的总分子量从5,000Da至100,000Da。
32.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂包含LINGO-1抗体或其片段。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述LINGO-1抗体或其片段与主要由选自由下列所组成的组的多肽片段组成的表位特异性结合：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸66至89；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸66至113；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸66至137；
(iv)SEQ ID NO：2的氨基酸90至113；
(v)SEQ ID NO：2的氨基酸114至137；
(vi)SEQ ID NO：2的氨基酸138至161；
(vii)SEQ ID NO：2的氨基酸162至185；
(viii)SEQ ID NO：2的氨基酸186至209；
(ix)SEQ ID NO：2的氨基酸210至233；
(x)SEQ ID NO：2的氨基酸234至257；
(xi)SEQ ID NO：2的氨基酸258至281；
(xii)SEQ ID NO：2的氨基酸282至305；
(xiii)SEQ ID NO：2的氨基酸306至329；
(xiv)SEQ ID NO：2的氨基酸330至353；
(xv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至64；
(xvi)SEQ ID NO：2的氨基酸363至416；
(xvii)任何所述多肽片段的变体或衍生物，以及
(xviii)任何所述多肽片段或者其变体或衍生物中的两种或更多种的组合。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述LINGO-1抗体选自由下列所组成的组：201′、3A3、3A6、3B5、1A7、1D5、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1B1.1F9、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、6P4F4.1Ds、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、1B6.4、2C7.2、2D6.1、2F7.3、2H3.2、3C11.1、3E3.1、3H11.2、3G8.1、2B8.1、3B5.230-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(L1a.1)、3495(L1a.2)、3563(L1a.3)、3564(L1a.4)、3565(L1a.5)、3566(L1a.6)、3567(L1a.7)、3568(L1a.8)、3569(L1a.9)、3570(L1a.10)、3571(L1a.11)、3582(L1a.12)、1968(L1a.13)、3011、3012、3013、3418、3422、3562、D05、D07、D08、D10和D11。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述LINGO-1抗体是1A7。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述LINGO-1抗体是3B5。
37.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂包含LINGO-1拮抗剂多核苷酸。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂多核苷酸选自由下列组成的组：
(i)反义多核苷酸；
(ii)核酶；
(iii)小干扰RNA(siRNA)；和
(iv)小发夹RNA(shRNA)。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂多核苷酸是包含与LINGO-1 mRNA的编码部分互补的至少10个碱基的反义多核苷酸。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂多核苷酸是核酶。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂多核苷酸是siRNA。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂多核苷酸是shRNA。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述shRNA包含核苷酸序列：UGAUCGUCAU CCUGCUAGAC UUCAAGAGAGUCUAGCAGGA UGACGAUCUU UUUUC(SEQ ID NO：34)。
44.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂是适体。
45.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述接触包括(a)将通过与表达控制序列可操作连接的编码所述LINGO-1拮抗剂的多核苷酸引入所述细胞或所述CNS神经元，和(b)允许所述LINGO-1拮抗剂的表达。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述多核苷酸通过选自由下列所组成的组的方法引入所述细胞：
(a)转染；
(b)电穿孔；
(c)转导；和
(d)直接的微注射。
47.如权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体施用。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、痘病毒载体和细小病毒所组成的组。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述疱疹病毒载体选自由单纯疱疹病毒载体和埃巴病毒载体所组成的组。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述痘病毒载体是牛痘病毒载体。
52.如权利要求49所述的方法，其中所述慢病毒载体是pLL3.7。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述细小病毒载体是腺伴随病毒(AAV)。
54.如权利要求1-6或10中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述细胞、所述神经元或所述CNS神经元与选自由下列所组成的组的另外的拮抗剂接触：
(i)NGF拮抗剂；
(ii)NgR1拮抗剂；
(iii)TAJ拮抗剂；和
(iv)OMgp拮抗剂。
55.如权利要求7-9中任一项所述的方法，所述方法还包括施用选自由下列所组成的组的另外的拮抗剂：
(i)NGF拮抗剂；
(ii)NgR1拮抗剂；
(iii)TAJ拮抗剂；和
(iv)OMgp拮抗剂。
56.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动剂化合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述TrkB激动剂化合物选自由L-783,281、腺苷和CGS 21680所组成的组。
58.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB-激动剂多肽。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽选自由TrkB配体、TrkB配体的片段、TrkB配体的变体、TrkB多肽、TrkB多肽的片段或TrkB多肽的变体所组成的组。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽是BDNF多肽。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽还包含非TrkB-激动剂部分。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分是融合至所述TrkB激动剂多肽的异源多肽。
63.如权利要求61或62中任一项所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分选自由免疫球蛋白片段、血清白蛋白、靶向蛋白、报告蛋白和促进纯化的蛋白所组成的组。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分是免疫球蛋白片段。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述免疫球蛋白片段包含铰链和Fc区。
66.如权利要求61所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至聚合物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖聚合物和多肽所组成的组。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
69.如权利要求61所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至1-酰基-甘油衍生物。
70.如权利要求66所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至1、2、3或4个聚合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述聚合物的总分子量是从5,000Da至100,000Da。
72.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动剂抗体或其片段。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述TrkB激动剂抗体或其片段选自由下列所组成的组：6E2、7F5、11E1、16E11、17D11、19E12、29D7或TrkB单克隆抗体。
74.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动剂多核苷酸。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述TrkB激动剂多核苷酸编码神经营养蛋白或其片段或变体。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述神经营养蛋白是BDNF。
77.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动剂适体。
78.如权利要求1-6或10中任一项所述的方法，其中所述细胞或神经元或所述CNS神经元是在哺乳动物中，并且其中所述接触包括向需要其的哺乳动物施用有效量的LINGO-1拮抗剂或所述LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂。
79.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物已经被诊断为患有涉及神经变性的疾病、病症或损伤。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病、病症或损伤是青光眼。
81.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂或LINGO-1拮抗剂中的至少一种通过弹丸注射或慢性输注来施用。
82.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂或LINGO-1拮抗剂中的至少一种被直接施用至中枢神经系统中。
83.如权利要求6、8、9、10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂选自由TrkB激动剂多核苷酸或者编码TrkB激动剂多肽或TrkB激动剂适体的多核苷酸所组成的组。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述接触或施用包括(a)向细胞引入所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激动剂的多核苷酸和(b)允许所述TrkB激动剂的表达。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述多核苷酸通过选自由下列所组成的组的方法引入所述细胞：
(a)转染；
(b)电穿孔；
(c)转导；和
(d)直接的微注射。
86.如权利要求84-85中任一项所述的方法，其中所述细胞是在哺乳动物中，并且其中所述引入包括(a)向所述哺乳动物施用所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激动剂的所述多核苷酸和(b)允许所述TrkB激动剂的表达。
87.如权利要求83所述的方法，其中所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激动剂的所述多核苷酸被施用于能够表达所述多核苷酸的培养的宿主细胞中。
88.如权利要求84至87中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体施用。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
90.如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述疾病、病症或损伤的部位或附近被引入所述哺乳动物中。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述培养的宿主细胞通过包括以下的方法来制备：(a)用如权利要求83所述的TrkB激动剂多核苷酸或编码TrkB激动剂的多核苷酸或如权利要求88或权利要求89所述的载体转化或转染受体宿主细胞，和(b)培养所述转化或转染的宿主细胞。
92.如权利要求87至91中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞来源于有待被治疗的哺乳动物。
93.如权利要求89所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、痘病毒载体和细小病毒所组成的组。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述疱疹病毒载体选自由单纯疱疹病毒载体和埃巴病毒载体所组成的组。
95.如权利要求93所述的方法，其中所述痘病毒载体是牛痘病毒载体。
96.如权利要求93所述的方法，其中所述慢病毒载体是pLL3.7。
97.如权利要求93所述的方法，其中所述细小病毒载体是腺伴随病毒(AAV)。
98.如权利要求8-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂通过选自由局部施用、眼内施用、玻璃体内施用、胃肠外施用、鞘内施用、硬膜下施用、皮下施用所组成的组的路线或通过胶囊植入物施用。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂中的至少一种被直接施用至眼中。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述LINGO-1拮抗剂或TrkB激动剂中的至少一种通过胶囊植入物被施用。
101.如权利要求1-6或78中任一项所述的方法，其中所述细胞或神经元或者所述CNS神经元是感觉神经元。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述感觉神经元在视网膜神经节细胞(RGC)中。
103.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有视神经病变。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述视神经病变是青光眼。
105.如权利要求101所述的方法，其中所述感觉神经元是毛细胞。
106.如权利要求9或78所述的方法，其中所述哺乳动物患有选自由ALS、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、糖尿病性神经病变、中风和听力损失所组成的组的疾病或病症。
107.如权利要求34所述的方法，其中所述LINGO-1抗体是Li33。
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