PL191251B1 - Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów - Google Patents

Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów

Info

Publication number
PL191251B1
PL191251B1 PL335695A PL33569598A PL191251B1 PL 191251 B1 PL191251 B1 PL 191251B1 PL 335695 A PL335695 A PL 335695A PL 33569598 A PL33569598 A PL 33569598A PL 191251 B1 PL191251 B1 PL 191251B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
plasmid
protein
marker
tag
Prior art date
Application number
PL335695A
Other languages
English (en)
Other versions
PL335695A1 (en
Inventor
Mitchell E. Reff
Richard Spence Barnett
Karen Retta Mclachlan
Original Assignee
Idec Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26697516&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL191251(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/819,866 external-priority patent/US5830698A/en
Application filed by Idec Pharma Corp filed Critical Idec Pharma Corp
Publication of PL335695A1 publication Critical patent/PL335695A1/xx
Publication of PL191251B1 publication Critical patent/PL191251B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

1. Sposób wprowadzania zadanego DNA w docelowe miejsce w genomie komórki ssaka, znamienny tym, ze obejmuje: i) transfekowanie albo transformowanie komórki ssaka in vitro pierwszym plazmidem („plazmid znacznikowy”) obejmujacym nastepujace sekwencje: (a) pierwszy fragment DNA obejmujacy region DNA, który jest heterologiczny wzgledem genomu komórki ssaka i który gdy jest zintegrowany z genomem komórki ssaka, zapewnia unikalny region do rekombinacji homologicznej; (b) drugi fragment DNA, który obejmuje region kodujacy czesc bialka pierwszego znacznika umozliwiajacego se- lekcje; i (c) trzeci fragment DNA, który obejmuje region kodujacy co najmniej jedno inne bialko znacznika umozliwiajace- go selekcje, które jest inne niz bialko pierwszego znacznika i zapewnia selekcje komórki ssaka, w genomie której zostal zintegrowany plazmid znacznikowy; ii) selekcjonowanie komórki, która zawiera plazmid znacznikowy zintegrowany z jej genomem przez przeszuki- wanie in vitro na ekspresje bialka znacznika umozliwiajacego selekcje kodowanego przez trzeci fragment DNA; iii) transfekowanie albo transformowanie wyselekcjonowanej komórki in vitro drugim plazmidem („plazmid kieru- jacy”), który obejmuje co najmniej jeden DNA, który nalezy wstawic do genomu komórki i ponadto obejmuje sekwencje: (a) czwarty fragment DNA obejmujacy region DNA, który jest identyczny albo wystarczajaco homologiczny z uni- kalnym regionem dla homologicznej rekombinacji w plazmidzie znacznikowym tak, ze ten region DNA moze rekombino- wac ze wspomnianym DNA plazmidu znacznikowego droga rekombinacji homologicznej; (b) piaty fragment DNA, który obejmuje region DNA kodujacy czesc bialka pierwszego znacznika umozliwiajace- go selekcje, która jest inna niz czesc tego bialka znacznika kodowana przez plazmid znacznikowy, przy czym aktywne bialko znacznika umozliwiajacego selekcje jest wytwarzane tylko gdy piaty fragment DNA kodujacy czesc bialka znacz- nikowego zawarty w plazmidzie kierujacym ulega ekspresji w powiazaniu z drugim fragmentem DNA znacznika koduja- cym czesc bialka znacznikowego zawartego w plazmidzie znacznikowym; i iv) selekcjonowanie komórek, które zawieraja plazmid kierujacy zintegrowany w unikalnym regionie dla homolo- gicznej rekombinacji przez badanie przesiewowe in vitro w kierunku ekspresji bialka pierwszego znacznika umozliwiaja- cego selekcje. PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów.
Konkretnie, wynalazek oparty jest na nowym sposobie identyfikacji docelowego miejsca aktywnego transkrypcyjnie („hot spot”) w genomie ssaka i wprowadzania w to miejsce pożądanego DNA przez rekombinację homologiczną. Wynalazek również ewentualnie umożliwia amplifikację genu pożądanego DNA w tym położeniu przez równoczesną integrację zdolnego do amplifikacji genu znacznika umożliwiającego selekcję, np. DHFR, w kombinacji z egzogennym DNA. Wynalazek ponadto obejmuje konstrukcję nowych wektorów przydatnych do przeprowadzania powyższego sposobu i umożliwia uzyskanie linii komórek ssaczych wytworzonych tymi sposobami, które zawierają pożądany egzogenny DNA zintegrowany w docelowym miejscu aktywnym.
Technologia ekspresji białek rekombinowanych zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych jest dobrze rozwinięta. Komórki ssaków oferują istotne zalety w porównaniu do komórek bakteryjnych albo drożdży, jeżeli chodzi o wytwarzanie białek, wynikające z ich zdolności do prawidłowego łączenia, glikozylacji i modyfikacji potranslacyjnej wyrażanych białek. Po transfekcji do komórek gospodarza, rekombinowane konstrukty ekspresyjne mogą być utrzymywane jako elementy pozachromosomalne albo mogą być zintegrowane do genomu komórki gospodarza. Wytwarzanie stabilnie transfekowanych linii komórkowych ssaków obejmuje zazwyczaj tę drugą możliwość; konstrukt DNA kodujący interesujący gen wraz z genem oporności na lek (dominujący znacznik umożliwiający selekcję) wprowadza się do komórki gospodarza, a następnie hoduje się w obecności leku umożliwiającego selekcję komórek, które z powodzeniem zintegrowały egzogenny DNA. W wielu przypadkach interesujący gen jest połączony z genem znacznika oporności na lek, który dalej można poddać amplifikacji. Powszechnie stosuje się do tego celu gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR). Wzrost komórek w obecności metotreksatu, inhibitora kompetytywnego DHFR, prowadzi do zwiększonego wytwarzania DHFR przez amplifikację genu DHFR. Ponieważ regiony flankujące DNA ulegają również amplifikacji, współamplifikacja genu związanego z DHFR w linii komórek transfekowanych może prowadzić do zwiększonego wytwarzania białka, powodując w ten sposób silną ekspresję interesującego genu.
Aczkolwiek podejście powiodło się, istnieje jednak wiele problemów związanych z tym układem spowodowanych losowym charakterem zjawiska integracji. Problemy te występują, ponieważ poziomy ekspresji ulegają wpływowi lokalnego środowiska genetycznego w locus genu, co zostało dobrze udokumentowane w literaturze i jest określane ogólnie jako „efekt położenia” (przykładowo, patrz Al-Shawi i in., Mol. Cell. Biol. 10: 1192-1198 (1990); Yoshimura i in., Mol. Cell. Biol. 7: 1296-1299 (1987)). Ponieważ znaczna większość DNA ssaków znajduje się w stanie nieaktywnym transkrypcyjnie, losowa metoda integracji nie zapewnia żadnej kontroli nad losem tranpkrypcyjnym integrowanego DNA. W konsekwencji, mogą nastąpić znaczne zmienności poziomu ekspresji zintegrowanych genów, zależnie od miejsca integracji. Przykładowo, integracja egzogennego DNA w nieaktywne albo transkrypcyjnie „nieme” regiony genomu spowoduje, że ekspresja będzie słaba albo nie będzie jej wcale. W przeciwieństwie, integracja w miejsce aktywne transkrypcyjnie może spowodować silną ekspresję.
Stąd, jeżeli celem pracy jest osiągnięcie wysokiego poziomu ekspresji genu, co jest typowe jako pożądany wynik metod inżynierii genetycznej, konieczne jest zwykle badanie przesiewowe wielkiej liczby transfektantów w poszukiwaniu klonu o wysokim wytwarzaniu. Oprócz tego, losowa integracja egzogennego DNA do genomu może w niektórych przypadkach przerwać istotne geny komórki powodując zmieniony fenotyp. Czynniki te powodują, że wytwarzanie silnie wyrażających stabilnych linii komórkowych ssaków jest procesem skomplikowanym i pracochłonnym.
Ostatnio opisano zastosowanie w naszym laboratorium wektorów DNA zawierających upośledzone translacyjnie dominujące znaczniki umożliwiające selekcję w ekspresji genów ssaków. (Ujawnione w zgłoszeniu USA nr 08/147 696, zgłoszonym 3 listopada, 1993).
Wektory te zawierają upośledzony translacyjnie gen fosfotransferazy neomycynowej (neo) jako dominujący znacznik umożliwiający selekcję, sztucznie przekonstruowany w taki sposób, że zawiera intron, do którego wprowadza się gen DHFR wraz z interesującym genem albo genami. Stwierdzono, że zastosowanie tych wektorów jako konstruktów ekspresyjnych istotnie zmniejsza całkowitą liczbę wytworzonych kolonii opornych na lek, ułatwiając w ten sposób procedurę badania przesiewowego w porównaniu z konwencjonalnymi ssaczymi wektorami ekspresyjnymi. Ponadto, istotny odsetek klonów otrzymanych z użyciem tego układu jest klonami o wysokim poziomie ekspresji. Wyniki te można
PL 191 251 B1 przypisać modyfikacji, której poddano znacznik neo. Z powodu upośledzenia translacyjnego genu neo, transfekowane komórki nie wytwarzają wystarczającej ilości białka neo, aby przeżyć selekcję na lek, zmniejszając w ten sposób ogólną liczbę kolonii opornych na lek. Oprócz tego, wysoki odsetek przeżywających klonów zawiera wektor ekspresyjny zintegrowany w miejscach w genomie, w których podstawowy poziom transkrypcji jest wysoki, powodując nadprodukcję neo i umożliwiając w ten sposób komórkom przezwyciężenie zaburzenia genu neo. Równocześnie, interesując geny połączone z neo są poddawane podobnemu podwyższonemu poziomowi transkrypcji. Ta sama zaleta jest również faktem jako wynik sztucznego intronu wytworzonego w neo; przeżycie jest zależne od syntezy funkcjonalnego genu neo, co z kolei zależy od prawidłowego i wydajnego składania intronów neo. Ponadto, kryteria te są najprawdopodobniej spełnione, jeżeli wektor DNA zintegrował w regionie, który już posiada wysoką aktywność transkrypcyjną.
Po integracji wektora w regionie aktywnym transkrypcyjnie, amplifikację genu prowadzi się przez selekcję w kierunku genu DHFR. Stosując ten układ można otrzymać klony selekcjonowane przy użyciu małych stężeń metotreksatu (50 nM), zawierające niewiele (< 10) kopii wektora, które wydzielają znaczne ilości białka (> 55 pg/komórkę/dzień).
Ponadto, można to osiągnąć w stosunkowo krótkim czasie. Jednakże, powodzenie amplifikacji jest zmienne. Niektóre miejsca aktywne transkrypcyjnie nie mogą ulec amplifikacji, a stąd częstość i nasilenie amplifikacji z konkretnego miejsca jest niemożliwe do przewidzenia.
W sumie, zastosowanie tych upośledzonych transkrypcyjnie wektorów stanowi istotny postęp w stosunku do innych sposobów losowej integracji. Jednakże, jak to omówiono, problem braku kontroli nad miejscem integracji pozostaje istotną przeszkodą.
Jedno z podejść do przezwyciężenia tego problemu wykorzystuje kierowanie genem, przy czym egzogenny DNA jest kierowany do konkretnego locus w genomie gospodarza. Egzogenny DNA jest wprowadzany przez rekombinację homologiczną zachodzącą pomiędzy sekwencjami DNA w wektorze ekspresyjnym i odpowiednimi sekwencjami homologicznymi w genomie. Jednakże, o ile ten rodzaj rekombinacji zachodzi w naturze z dużą częstością u drożdży i innych organizmów grzybowych, u wyższych organizmów eukariotycznych jest niezwykle rzadkim zjawiskiem. W komórkach ssaków, częstotliwość zjawiska rekombinacji homologicznej w stosunku do zjawiska rekombinacji niehomologicznej (integracji losowej) oceniana jest w zakresie od 1/100 do 1/5000 (patrz, przykładowo, Cappechi, Science 244: 1288-1292 (1989); Morrow i Kucherlapati Curr. Op. Biotech. 4: 577-582 (1993)).
Jedno z ostatnich doniesień, opisujące rekombinację homologiczną w komórkach ssaków, dotyczyło sztucznego układu wytworzonego w mysich fibroblastach (Thomas i in., Cell 44:419-428 (1986)). Wytworzono linię komórkową zawierającą zmutowaną, niefunkcjonalną wersję genu neo zintegrowaną do genomu gospodarza, a następnie kierowano drugą niefunkcjonalną kopią neo, zawierającą inną mutację. Rekonstrukcja funkcjonalnego genu neo mogła następować jedynie przez kierowanie genu. Rekombinanty homologiczne identyfikowano przez selekcjonowanie w kierunku komórek opornych na G418 i potwierdzano analizą genomowego DNA wyizolowanego z opornych klonów.
Ostatnio opisano zastosowanie rekombinacji homologicznej do zastępowania genów łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin w endogennych loci komórek wytwarzających przeciwciała (patent USA nr 5202 238, Fell i in., (1993)). Jednakże, to szczególne podejście nie jest możliwe do szerokiego zastosowania, ponieważ jest ograniczone do wytwarzania immunoglobulin w komórkach, które endogennie wyrażają immunoglobuliny, np. limfocytów B i komórek szpiczaka. Również ekspresja jest ograniczona do pojedynczej kopii genu, ponieważ współamplifikacja po rekombinacji homologicznej nie została włączona. Metoda jest również skomplikowana przez fakt, że do wytworzenia funkcjonalnej immunoglobuliny konieczne są dwa oddzielne zjawiska integracji: jedno dla genu łańcucha lekkiego i jedno dla genu łańcucha ciężkiego.
Dodatkowy przykład tego rodzaju układu opisano w przypadku komórek NS/0, w których rekombinowane immunoglobuliny są wyrażane drogą rekombinacji homologicznej w locus immunoglobuliny gamma 2A (Hollis i in., międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/IB95 (00014)). Poziom ekspresji otrzymywany z tego miejsca był niezwykle wysoki, rzędu 20 pg/komórkę/dzień z pojedynczego zjawiska integracji. Jednakże, jak w powyższym przykładzie, ekspresja jest ograniczona do tego poziomu z powodu nie wprowadzenia do tego układu genu ulegającego amplifikacji. Również inni badacze opisywali zaburzoną glikozylację rekombinowanych białek wyrażanych w komórkach NS/0 (patrz np. Flesher i in., Biotech. and Bioeng., 48: 399-407 (1995)), co ogranicza zastosowanie tego podejścia.
PL 191 251 B1
Ostatnio zaadaptowano układ rekombinacyjny cre-loxP z bakteriofaga P1 i zastosowano go wcelu ukierunkowania genu w komórkach eukariotycznych. Konkretnie, opisano swoistą kierowaną integrację egzogennego DNA do genomu komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) przy użyciu rekombinazy cre i serii wektorów zawierających lox (Fukushige i Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909 (1992)). Układ ten jest atrakcyjny z tego względu, że zapewnia powtarzalną ekspresję wtym samym położeniu chromosomalnym. Jednakże, nie przeprowadzono żadnych badań w celu znalezienia miejsca chromosomalnego, które jest optymalne dla ekspresji genu oraz, podobnie jak w powyższym przykładzie, ekspresja jest ograniczona do pojedynczej kopii genu. Jest on również skomplikowany przez fakt, że konieczna jest ekspresja funkcjonalnego enzymu, rekombinazy w komórce ssaczej.
Zastosowanie rekombinacji homologicznej pomiędzy wprowadzaną sekwencją DNA i endogennym locus chromosomalnym opisywano również jako zapewniające wygodny sposób manipulacji genetycznej w komórkach ssaków, jak również drożdży (patrz np. Bradley i in., Meth. Enzymol. 223: 855-879 (1993); Capecchi, Science 244: 1288-1292 (1989); Rothstein inni., Meth. Enzymol. 194: 281-301 (1991)). Do tej pory, większość badań nad kierowaniem do genów ssaków dotyczyła zniszczenia genu („knockout”) albo kierowanej mutagenezy wybranego locus genowego w mysich zarodkowych komórkach macierzystych (ES). Tworzenie takich mysich modeli nokautowanych umożliwia naukowcom badanie zależności specyficznej budowy i funkcji oraz badanie znaczenia biologicznego licznych genów mysich. Ta dziedzina badań jest również istotna w sensie potencjalnych zastosowań w terapii genowej.
Opisano również ostatnio wektory (Celltech (Kent, UK)), które są kierowane do miejsc aktywnych transkrypcyjnie komórek NSO, które nie wymagają amplifikacji genu (Peakman i in., Hum. Antibod. Hybridomas 5: 65-74 (1994)). Jednakże, poziom wytwarzania immunoglobulin w tych nie amplifikowanych komórkach nie przekraczał 20 pg/komórkę/dzień, podczas gdy w amplifikowanych komórkach CHO można osiągnąć do 100 pg/komórkę/dzień.
Byłoby bardzo pożądane opracowanie układu kierowania genów, który w sposób powtarzalny zapewniałby integrację egzogennego DNA w określonym miejscu genomu, o którym wiadomo, że jest aktywne transkrypcyjnie. Również pożądane byłoby, gdyby taki układ kierowania genu dalej ułatwiał równoczesną amplifikację wprowadzonego DNA po integracji. Skonstruowanie takiego układu umożliwiłoby powtarzalną i silną ekspresję dowolnego klonowanego interesującego genu w komórkach ssaków i niewątpliwie spotkałoby się z zainteresowaniem wielu badaczy.
W niniejszym zgłoszeniu dostarczono nowego ssaczego układu ekspresji, opartego na rekombinacji homologicznej zachodzącej pomiędzy dwoma sztucznymi substratami zawartymi w dwóch różnych wektorach. Konkretnie, układ ten wykorzystuje kombinację dwóch nowych ssaczych wektorów ekspresyjnych określanych jako wektor „znacznikowy” i wektor „kierujący”.
Zasadniczo, wektor znacznikowy umożliwia identyfikację i oznaczenie miejsca w genomie ssaka, które jest aktywne transkrypcyjnie, tj. miejsca, w którym ekspresja genu jest silna. Miejsce to można uważać za „hot spot” genomu. Po zintegrowaniu wektora znacznikowego, układ ekspresyjny umożliwia zintegrowanie w tym miejscu innego DNA, tj. wektora kierującego, przez rekombinację homologiczną zachodzącą pomiędzy sekwencjami DNA wspólnymi dla obu wektorów. Układ ten daje istotną przewagę nad innymi układami rekombinacji homologicznej.
W przeciwieństwie do większości innych układów homologicznych stosowanych w komórkach ssaków, układ ten nie wykazuje tła. Stąd komórki, które uległy losowej integracji wektora nie przeżywają selekcji. Tak więc, dowolny interesujący gen klonowany do plazmidu kierującego ulega silnej ekspresji w zaznaczonym miejscu aktywnym. Niniejszy sposób ekspresji genów zasadniczo albo całkowicie eliminuje problemy związane z układami losowej integracji omówione wyżej. Ponadto, układ ten zapewnia powtarzalną i silną ekspresję dowolnego rekombinowanego białka w tym samym miejscu aktywnym transkrypcyjnie w genomie ssaka. Oprócz tego, amplifikację genu można przeprowadzić w tym szczególnie aktywnym transkrypcyjnie miejscu, przez włączenie możliwego do amplifikowania dominującego znacznika selekcyjnego (np. DHFR) jako składowej wektora znacznikowego.
Według wynalazku sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie komórki ssaka obejmuje:
i) transfekowanie albo transformowanie komórki ssaka in vitro pierwszym plazmidem („plazmid znacznikowy”) obejmującym następujące sekwencje:
PL 191 251 B1 (a) pierwszy fragment DNA obejmujący region DNA, który jest heterologiczny względem genomu komórki ssaka i który gdy jest zintegrowany z genomem komórki ssaka, zapewnia unikalny region do rekombinacji homologicznej;
(b) drugi fragment DNA, który obejmuje region kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję; i (c) trzeci fragment DNA, który obejmuje region kodujący co najmniej jedno inne białko znacznika umożliwiającego selekcję, które jest inne niż białko pierwszego znacznika i zapewnia selekcję komórki ssaka, w genomie której został zintegrowany plazmid znacznikowy;
ii) selekcjonowanie komórki, która zawiera plazmid znacznikowy zintegrowany z jej genomem przez przeszukiwanie in vitro na ekspresję białka znacznika umożliwiającego selekcję kodowanego przez trzeci fragment DNA;
iii) transfekowanie albo transformowanie wyselekcjonowanej komórki in vitro drugim plazmidem („plazmid kierujący”), który obejmuje co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki i ponadto obejmuje sekwencje:
(a) czwarty fragment DNA obejmujący region DNA, który jest identyczny albo wystarczająco homologiczny z unikalnym regionem dla homologicznej rekombinacji w plazmidzie znacznikowym tak, że ten region DNA może rekombinować ze wspomnianym DNA plazmidu znacznikowego drogą rekombinacji homologicznej;
(b) piąty fragment DNA, który obejmuje region DNA kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję, która jest inna niż część tego białka znacznika kodowana przez plazmid znacznikowy, przy czym aktywne białko znacznika umożliwiającego selekcję jest wytwarzane tylko gdy piąty fragment DNA kodujący część białka znacznikowego zawarty w plazmidzie kierującym ulega ekspresji w powiązaniu z drugim fragmentem DNA znacznika kodującym część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie znacznikowym; i iv) selekcjonowanie komórek, które zawierają plazmid kierujący zintegrowany w unikalnym regionie dla homologicznej rekombinacji przez badanie przesiewowe in vitro w kierunku ekspresji białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję.
W korzystnym wykonaniu wynalazku region drugiego fragmentu DNA kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję obejmuje co najmniej jeden egzon genu kodującego białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję.
Korzystnie pierwszy znacznik umożliwiający selekcję białka jest wybrany z grupy składającej się z fosfotransferazy neomycynowej, dehydrogenazy histydynolowej, reduktazy dihydrofolianowej, fosfotransferazy higromycynowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, syntetazy glutaminowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.
Również korzystnie piąty fragment DNA plazmidu kierującego obejmuje pozostałe egzony genu kodującego pierwszy znacznik umożliwiający selekcję białka, przy czym co najmniej jeden DNA, który należy wprowadzić do genomu komórki koduje pożądane białko i jest wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym.
Korzystnie DNA kodujący dominujący znacznik umożliwiający selekcję białka, który jest inny niż pierwszy znacznik umożliwiający selekcję białka, jest dalej wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym, co zapewnia równoczesną amplifikację DNA kodującego żądane białko, przy czym żądanym białkiem jest białko ssaka, korzystnie immunoglobulina.
Sposób według wynalazku korzystnie dalej obejmuje określanie poziomu RNA znacznika umożliwiającego selekcję (c) zawartego w trzecim fragmencie DNA plazmidu znacznikowego przed integracją wektora kierującego. Najkorzystniej innym znacznikiem umożliwiającym selekcję zawartym w plazmidzie znacznikowym jest dominujący znacznik umożliwiający selekcję wybrany z grupy składającej się z dehydrogenazy histydynylowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, fosfotransferazy higromycynowej i syntetazy glutaminowej.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku komórka ssaka jest wybrana z grupy składającej się z komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki szpiczaka, komórki nerki oseska chomika, komórki COS, komórki NSO, komórki HeLa i komórki NIH 3T3, a korzystnie komórką jest komórka CHO.
W sposobie według wynalazku korzystnie plazmid znacznikowy zawiera trzeci egzon genu fosfotransferazy neomycynowej, zaś plazmid kierujący zawiera pierwsze dwa egzony genu fosfo6
PL 191 251 B1 transferazy neomycynowej. Korzystnie plazmid znacznikowy dalej obejmuje rzadką sekwencję endonukleazy restrykcyjnej, która jest wprowadzona w region homologii.
W sposobie według wynalazku korzystnie unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną obejmuje przynajmniej 300 nukleotydów i korzystnie ma wielkość od około 300 nukleotydów do 20 kb, bardziej korzystnie od 2 kb do 10 kb.
W sposobie według wynalazku korzystnie DNA pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest rozszczepiony na przynajmniej trzy egzony.
W sposobie według wynalazku korzystnie unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną jest DNA bakteryjnym, DNA owadzim, DNA wirusowym albo DNA syntetycznym i najkorzystniej nie zawiera żadnych genów funkcjonalnych.
W sposobie według wynalazku korzystnie plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Desmond” przedstawioną na fig. 7, a bardziej korzystnie plazmid kierujący obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Molly” przedstawioną nafig.8, przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 20 lub plazmid kierujący obejmuje sekwencje nukleotydowe plazmidu „Mandy” pokazanego na fig. 10 iprzy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 23.
W zakres wynalazku wchodzi układ wektorów do wprowadzania żądanego DNA w miejsce docelowe w genomie komórki ssaka, który obejmuje przynajmniej:
i) pierwszy plazmid („plazmid znacznikowy”) obejmujący następujące sekwencje:
(a) pierwszy fragment DNA, który obejmuje region DNA, który jest heterologiczny względem genomu komórki ssaka i który, gdy jest zintegrowany z genomem komórki ssaka, zapewnia unikalny region do rekombinacji homologicznej;
(b) drugi fragment DNA, który obejmuje region kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję; i (c) trzeci fragment DNA, który obejmuje region kodujący co najmniej jedno białko innego znacznika umożliwiającego selekcję, które jest różne niż białko pierwszego znacznika, zapewnia selekcję komórek ssaka, do których genomu został integrowany plazmid znacznikowy; i ii) drugi plazmid („plazmid kierujący”), który obejmuje co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki i ponadto obejmuje następujące sekwencje:
(a) czwarty fragment DNA, obejmujący region DNA, który jest identyczny albo wystarczająco homologiczny z unikalnym regionem dla homologicznej replikacji w plazmidzie znacznikowym tak, żeten region DNA może rekombinować ze wspomnianym DNA plazmidu znacznikowego drogą rekombinacji homologicznej;
(b) piąty fragment DNA obejmujący region DNA kodujący część pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję białka, który jest różny od części białka znacznikowego kodowanego przez plazmid znacznikowy, przy czym aktywne białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest wytwarzane tylko gdy piąty fragment DNA kodujący część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie kierującym ulega ekspresji w powiązaniu z drugim fragmentem DNA kodującym część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie znacznikowym.
W korzystnym wykonaniu w układzie wektorów region drugiego fragmentu DNA kodującego część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję obejmuje co najmniej jeden egzon genu znacznika umożliwiającego selekcję białka, bardziej korzystnie piąty fragment DNA plazmidu kierującego obejmuje pozostałe egzony genu kodującego białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję, które nie są obecne w plazmidzie znacznikowym.
Jeszcze bardziej korzystnie, co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki koduje pożądane białko i jest wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym, przy czym żądanym białkiem jest białko ssaka, korzystnie immunoglobulina.
Również jeszcze bardziej korzystnie DNA kodujący białko dominującego znacznika umożliwiającego selekcję, które jest inne niż białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję, jest dalej wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym, co zapewnia równoczesną amplifikację DNA kodującego pożądane białko.
Korzystne białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest wybrane z grupy składającej się z fosfotransferazy neomycynowej, dehydrogenazy histydynolowej, reduktazy dihydrofolianoPL 191 251 B1 wej, fosfotransferazy higromycynowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, syntetazy glutaminowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.
Również korzystnie innym znacznikiem umożliwiającym selekcję zawartym w plazmidzie znacznikowym jest dominujący znacznik umożliwiający selekcję wybrany z grupy składającej się z dehydrogenazy histydynolowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, fosfotransferazy higromycynowej i syntetazy glutaminowej.
Ponadto korzystnie układ wektorów zapewnia wprowadzenie pożądanego DNA w miejsce docelowe w genomie komórki ssaka wybranej z grupy składającej się z komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki szpiczaka, komórki nerki oseska chomika, komórki COS, komórki NSO, komórki HeLa i komórki NIH 3T3, bardziej korzystnie gdy komórką ssaka jest komórka CHO.
Korzystne jest również, gdy w układzie wektorów plazmid znacznikowy dalej obejmuje rzadką sekwencję endonukleazy restrykcyjnej, która jest wprowadzona w region homologii.
Korzystnie również w układzie wektorów unikalny region DNA (a), zawarty w plazmidzie znacznikowym układu wektorów, który zapewnia rekombinację homologiczną, obejmuje przynajmniej 300 nukleotydów, korzystnie unikalny region DNA ma wielkość od około 300 nukleotydów do 20 kb, bardziej korzystnie od 2 kb do 10 kb.
Korzystne jest również, gdy w układzie wektorów DNA pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest rozszczepiony na przynajmniej trzy egzony.
Korzystnie również w układzie wektorów unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną jest DNA bakteryjnym, DNA owadzim, DNA wirusowym albo DNA syntetycznym i korzystnie nie zawiera żadnych genów funkcjonalnych.
Korzystnie również w układzie wektorów plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Diamond” przedstawioną na fig. 7.
Korzystnie również w układzie wektorów plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Molly” przedstawioną na fig. 8, przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 20.
Ponadto korzystnie w układzie wektorów plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Mandy” przedstawioną na fig. 10, przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 23.
Krótki opis figur
Figura 1 przedstawia mapę plazmidu znacznikowego według wynalazku określanego jako Desmond. Plazmid jest pokazany w postaci kolistej (1a) jak również w wersji linearyzowanej stosowanej do transfekcji (1b).
Figura 2(a) przedstawia mapę plazmidu kierującego określanego jako „Molly”. Przedstawiony Molly koduje tu gen immunoglobuliny przeciwko anty-CD20, której ekspresję przedstawiono w przykładzie 1.
Figura 2(b) przedstawia linearyzowaną wersję Molly, po trawieniu enzymami restrykcyjnymi KpnI i PacI. Tę linearyzowaną postać zastosowano do transfekcji.
Figura 3 przedstawia potencjalne przyrównanie pomiędzy sekwencjami Desmond integrowanego do genomu CHO i sekwencjami kierującego Molly. Przedstawiono również jedno potencjalne uporządkowanie Molly zintegrowanego w Desmond po rekombinacji homologicznej.
Figura 4 przedstawia analizę metodą Southern blot klonów zawierających pojedynczą kopię Desmond. Próbki:
ścieżka 1: Znacznik wielkości DNA λΗ^ΙΙΙ ścieżka 2: Desmond klon 10F3 ścieżka 3: Desmond klon 10C12 ścieżka 4: Desmond klon 15C9 ścieżka 5: Desmond klon 14B5 ścieżka 6: Desmond klon 9B2.
Figura 5 przedstawia analizę metodą Northern klonów o pojedynczej kopii Desmond.Próbki:
Panel A: Northern sondowane sondami GAD i DHFR, jak zaznaczono na figurze.
Panel B: Potórzenia Northern, sondowane sondami CAD i HisD, jak zaznaczono.
Próbki RNA wprowadzone w panelu A i B: ścieżka 1: klon 9B2 ścieżka 2: klon 10C12 ścieżka 3: klon 14B5
PL 191 251 B1 ścieżka 4: klon 15C9 ścieżka 5: kontrolny RNA z CHO transfekowanych plazmidem zawierającym HisD i DHFR ścieżka 6: nietransfekowane CHO.
Figura 6 przedstawia analizę Southern klonów powstałych po integracji homologicznej Molly do Desmond. Próbki:
ścieżka 1: znacznik wielkości DNA λΗ^ΙΙΙ ścieżka 2: 20F4 ścieżka 3: 5F9 ścieżka 4: 21C7 ścieżka 5: 24G2 ścieżka 6: 25E1 ścieżka 7: 28C9 ścieżka 8: 29F9 ścieżka 9: 39G11 ścieżka 10: 42F9 ścieżka 11: 50G10 ścieżka 12: DNA plazmidu Molly, linearyzowanego przez Bglll (górny prążek i ciętego Bglll i KpNI (dolny prążek) ścieżka 13: nietransfekowany Desmond.
Figury 7A do 7G obejmują listę sekwencji Desmond.
Figury 8A do 8I obejmują listę sekwencji Molly zawierającego anty-CD20.
Figura 9 przedstawia mapę plazmidu kierującego „Mandy” kodującego tu geny anty-CD23, których ekspresję przedstawiono w przykładzie 5.
Figury 10A do 10N zawierają listę sekwencji „Mandy” zawierającego geny anty-CD23, jak to ujawniono w przykładzie 5.
Niniejszy sposób klonowania zapewnia swoistą wobec miejsca integrację pożądanego DNA w komórce ssaka, przez transfekowanie tej komórki „plazmidem znacznikowym”, który obejmuje unikalną sekwencję, która jest obca dla genomu ssaka i która stanowi substrat dla homologicznej rekombinacji z następującą po niej transfekcją „plazmidu kierującego” zawierającego sekwencję, która umożliwia rekombinację homologiczną z unikalną sekwencją zawartą w plazmidzie znacznikowym i dalej obejmuje pożądany DNA, który ma być zintegrowany z komórką ssaka. Zwykle, zintegrowany DNA koduje interesujące białko, takie jak immunoglobulina albo inna wydzielnicza glikoproteina ssaka.
Przykładowy układ rekombinacji homologicznej obejmuje gen fosfotransferazy neomycynowej, jako dominujący znacznik umożliwiający selekcję. Ten konkretny znacznik zastosowano w oparciu o następujące opublikowane uprzednio obserwacje:
(i) wykazana zdolność do kierowania i przywracania funkcji zmutowanej wersji genu neo (cytowane wcześniej); i (ii) własne badania nad wektorami ekspresyjnymi upośledzonymi transkrypcyjnie, w których gen neo skonstruowano sztucznie w postaci dwóch egzonów z interesującym genem wprowadzonym do przerywającego intronu; egzony neo są prawidłowo składane i ulegają translacji in vivo, tworząc funkcjonalne białko, zapewniające powstałej populacji komórkowej oporność na G418. W tym zgłoszeniu, gen neo rozbito na trzy egzony. Trzeci egzon neo jest obecny w plazmidzie „znacznikowym”i integruje się do genomu komórki gospodarza po integracji plazmidu znacznikowego z komórką ssaka.
Egzon 1 i 2 są obecne na plazmidzie kierującym i są przedzielone intronem, do którego klonowany jest przynajmniej jeden interesujący gen. Rekombinacja homologiczna wektora kierującego z zintegrowanym wektorem znacznikowym powoduje prawidłowe składanie wszystkich trzech egzonów genu neo, a w ten sposób umożliwia ekspresję funkcjonalnego genu neo (co określono przez selekcjonowanie kolonii opornych na G418). Przed skonstruowaniem niniejszego układu ekspresyjnego, badano doświadczalnie funkcjonalność potrójnie składanego genu neo w komórkach ssaków. Wyniki doświadczeń kontrolnych wskazywały, że wszystkie trzy egzony neo są prawidłowo składane, co wskazywało na przydatność niniejszego wynalazku.
Jednakże, o ile wynalazek przedstawiono przykładowo z użyciem genu neo, zaś konkretniej genu neo rozszczepionego na trzy części, ogólna metodyka powinna być również skuteczna w przypadku innych dominujących znaczników umożliwiających selekcję.
Jak omówiono szczegółowo dalej, wynalazek ma liczne zalety w stosunku do konwencjonalnych metod ekspresji genu, w tym sposobów losowej integracji i kierowania genu. Konkretnie, wynalaPL 191 251 B1 zek dostarcza sposobu, który umożliwia powtarzalną kierowaną integrację pożądanego DNA do domeny aktywnej transkrypcyjnie komórki ssaka. Ponadto, ponieważ niniejszy sposób wprowadza sztuczny region „homologii”, który działa jako unikalny substrat dla rekombinacji homologicznej i wprowadzania pożądanego DNA, skuteczność wynalazku nie wymaga, aby komórka endogennie zawierała albo wyrażała konkretny DNA. Tak więc, sposób jest możliwy do zastosowania we wszystkich komórkach ssaków i można go zastosować do wyrażania dowolnego rodzaju białka rekombinowanego.
Zastosowanie rozszczepionego na trzy części znacznika umożliwiającego selekcję, np. konstruktu neo rozszczepionego na trzy części, gwarantuje, że wszystkie klony oporne na G418 powstały ze zjawiska rekombinacji homologicznej (losowe integracje nie spowodują powstania funkcjonalnego genu neo, a w następstwie nie przeżyją selekcji na G418). Tak więc, wynalazek ułatwia badanie przesiewowe w kierunku pożądanego zjawiska rekombinacji homologicznej. Ponadto, częstość dodatkowych losowych integracji w komórce, którą poddano rekombinacji homologicznej, wydaje się być niska.
W oparciu o powyższe wydaje się, że istotna zaleta wynalazku polega na tym, że zasadniczo zmniejsza on liczbę kolonii, które trzeba badać przesiewowo w kierunku identyfikacji klonów silnie wytwarzających, tj. linii komórkowych zawierających pożądany DNA, które wydzielają duże ilości odpowiedniego białka. Średnio, klony zawierające zintegrowany pożądany DNA można zidentyfikować przez badanie przesiewowe około 5 do 20 kolonii (w porównaniu z kilkoma tysiącami, które trzeba badać przesiewowo stosując technikę integracji losowej, albo kilkuset stosując uprzednio opisane wektory z wprowadzonym intronem). Oprócz tego, ponieważ miejsce integracji zostało uprzednio wybrane i obejmuje domenę aktywną transkrypcyjnie, wszystkie egzogenne DNA wyrażane w tym miejscu powinny dawać porównywalne, tj. znaczne ilości interesującego białka.
Ponadto, wynalazek jest korzystny pod tym względem, że umożliwia amplifikację genu wstawianego przez integrację wektora znacznikowego. Zatem, gdy pożądany gen jest kierowany w to miejsce przez rekombinację homologiczną, ekspresję genu można dalej wzmocnić przez amplifikację genu. Odnośnie tego, w literaturze opisywano, że różne miejsca genomu mają różną zdolność do amplifikacji genu (Meinkoth i in., Mol. Cell. Biol. 7: 1415-1424 (1987)). Stąd technika ta jest również korzystna pod tym względem, że umożliwia umieszczenie pożądanego genu w konkretnym miejscu, które jest aktywne transkrypcyjnie i łatwe do amplifikacji. Stąd powinno to istotnie zmniejszyć ilość czasu konieczną do wyizolowania takich producentów.
Konkretnie, o ile konwencjonalne sposoby konstruowania silnie wyrażających linii komórek ssaków mogą zająć 6-9 miesięcy, niniejszy wynalazek umożliwia wyizolowanie takich klonów po około 3-6 miesiącach. Jest to spowodowane tym, że kolonie izolowane konwencjonalnie zwykle muszą być poddawane przynajmniej trzem rundom amplifikacji genu oporności na leki w celu osiągnięcia satysfakcjonującego poziomu ekspresji genu.
Ponieważ klony wytworzone rekombinacyjnie są tworzone w wybranym uprzednio miejscu, które jest miejscem silnej ekspresji, koniecznych jest mniej rund do osiągnięcia pożądanego poziomu ekspresji.
Ponadto, wynalazek umożliwia powtarzalną selekcję silnie produkujących klonów, w których wektor zintegrował w niskiej liczbie kopii, zwykle w pojedynczej kopii. Jest to korzystne, ponieważ zwiększa stabilność klonów i unika innych potencjalnie niepożądanych efektów ubocznych związanych z wysoką liczbą kopii. Jak to opisano wyżej, układ rekombinacji homologicznej wykorzystuje kombinację „plazmidu znacznikowego” i „plazmidu kierującego”, które opisano szczegółowo niżej.
„Plazmid znacznikowy”, który jest stosowany do znaczenia i identyfikacji miejsc aktywnych transkrypcyjnie, obejmuje przynajmniej następujące sekwencje:
i) region DNA, który jest heterologiczny albo unikalny dla genomu komórki ssaka, który działa jako źródło homologii, umożliwiając rekombinację homologiczną (z DNA zawartym w drugim plazmidzie kierującym). Konkretniej, unikalny region DNA (i) obejmuje zwykle DNA bakteryjny, wirusowy, drożdżowy, syntetyczny albo inny, który normalnie nie występuje w genomie komórek ssaków i który ponadto nie wykazuje istotnej homologii albo identyczności sekwencji z DNA zawartym w genomie komórki ssaka.
Zasadniczo, sekwencja ta powinna być wystarczająco różna od DNA ssaka, aby nie rekombinowała w istotny sposób z genomem gospodarza drogą rekombinacji homologicznej. Wielkość takiej unikalnej sekwencji DNA powinna wynosić zwykle około 2 do 10 tysięcy zasad albo więcej, korzystnie przynajmniej około 10 kb, ponieważ niektórzy badacze zaobserwowali zwiększoną częstość kierowanej rekombinacji w miarę wzrostu wielkości regionu homologii (Cappechi, Science 244: 1288-1292 (1989)).
PL 191 251 B1
Górna granica wielkości unikalnego DNA, który działa jako miejsce rekombinacji homologicznej z sekwencją drugiegowektora kierującego jest uwarunkowana potencjalnie ograniczeniami stabilności (jeżeli DNA jest zbyt duży może mieć trudności z integrowaniemdo chromosomu i trudnościami zpracą nad wielkimi DNA.
ii) DNA obejmuje fragment znacznika DNA umożliwiającego selekcję, zwykle egzon dominującego genu znacznikowego umożliwiającego selekcję. Jedyną istotną cechą tego DNA jest to, że nie koduje on funkcjonalnego białka znacznika umożliwiającego selekcję, o ile nie ulegnie ekspresji wpołączeniu z sekwencjami zawartymi w plazmidzie kierującym. Zwykle, plazmid kierujący obejmuje pozostałe egzony dominującego genu znacznika umożliwiającego selekcję (nie wchodzące w skład plazmidu „kierującego”). Zasadniczo, funkcjonalny znacznik umożliwiający selekcję powinien być wytwarzany jeżeli zajdzie rekombinacja homologiczna (co powoduje połączoną ekspresję sekwencji znacznikowego DNA (i) wraz z częścią (częściami) fragmentu znacznika DNA umożliwiającego selekcję, który jest (są) zawarte w plazmidzie docelowym.
Jak zaznaczono, niniejszy opis przedstawia przykładowo zastosowanie genu fosfotransferazy neomycynowej jako dominującego znacznika umożliwiającego selekcję, który jest rozszczepiony pomiędzy dwoma wektorami. Jednakże, przydatne są również inne znaczniki umożliwiające selekcję, np. gen dehydrogenazy histydynolowej Salmonella, gen fosfotransferazy higromycynowej, gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki, gen deaminazy adenozynowej, gen syntetazy glutaminowej i gen fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.
iii) DNA, który koduje funkcjonalne białko znacznika umożliwiającego selekcję, który jest inny niż DNA znacznika (ii). Ten znacznik zapewnia pomyślną selekcję komórek ssaka, gdy plazmid znacznikowy uległ pomyślnej integracji z komórkowym DNA. Jeszcze korzystniej, pożądane jest, aby plazmid znacznikowy zawierał dwa takie DNA dominującego znacznika umożliwiającego selekcję, umieszczone na przeciwległych końcach wektora. Jest to korzystne, ponieważ umożliwia selekcję integrantów przy użyciu różnych czynników selekcyjnych i ponadto umożliwia selekcję komórek, które zawierają cały wektor. Oprócz tego, jednym ze znaczników może być możliwy do amplifikacji znacznik, ułatwiający amplifikację genu, jak to dyskutowano wyżej. Można zastosować dowolny z dominujących znaczników umożliwiających selekcję wymienionych w (ii), jak również inne znane w stanie techniki.
Ponadto, plazmid znacznikowy może ewentualnie dalej obejmować miejsce restrykcyjne rzadkiej endonukleazy. Jest to potencjalnie pożądane, ponieważ może ułatwić cięcie. Jeżeli występuje, takie rzadkie miejsce restrykcyjne powinno być położone w pobliżu środka unikalnego regionu, który działa jako substrat do rekombinacji homologicznej. Korzystnie, taka sekwencja ma długość przynajmniej około 12 nukleotydów. Opisywano, że wprowadzenie podobnej dwuniciowej przerwy podobną metodyką zwiększało częstość rekombinacji homologicznej (Choulika i in., Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973 (1995)). Jednakże, obecność takiej sekwencji nie jest kluczowa.
„Plazmid kierujący powinien zawierać przynajmniej następujące sekwencje:
(1) taki sam unikalny region DNAzawarty w plazmidzie znacznikowym albo fragment o homologii albo identyczności wystarczającej, aby DNA był zdolny do połączenia się droga rekombinacji homologicznej z unikalnym regionem (i) plazmidu znacznikowego. Przydatne rodzaje DNA są opisane wyżej w opisie unikalnych regionów DNA (1) w plazmidzie znacznikowym.
(2) Pozostałe egzony dominującego znacznika umożliwiającego selekcję, którego jeden egzon jako (ii) włączony jest do plazmidu znacznikowego opisanego wyżej. Zasadniczymi cechami tego fragmentu DNA jest to, że daje on funkcjonalne (umożliwiające selekcję) białko znacznikowe tylko jeżeli plazmid kierujący zintegruje drogą rekombinacji homologicznej (przy czym taka rekombinacja powoduje połączenie tego DNA z innym fragmentem DNA znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie znacznikowym) i ponadto umożliwia wprowadzenie pożądanego egzogennego DNA. Zwykle, ten DNA obejmuje pozostałe egzony DNA znacznika umożliwiającego selekcję, które są oddzielone intronem. Na przykład DNA może obejmować pierwsze dwa egzony genu neo, zaś plazmid znacznikowy może obejmować trzeci egzon (jedną trzecią końcową neo).
(3) Plazmid kierujący obejmuje również pożądany DNA, np. DNA kodujący pożądany polipeptyd, korzystnie wprowadzony do fragmentu DNAznacznika umożliwiającego selekcję zawartego wplazmidzie. Zwykle, DNA powinien być wprowadzony do intronu, który jest wprowadzony pomiędzy egzonami DNA znacznika umożliwiającego selekcję. Zapewnia to, że pożądany DNA ulega również integracji, jeżeli zachodzi rekombinacja homologiczna plazmidu kierującego i plazmidu znacznikowego. Intron ten może występować naturalnie albo może być wbudowany do dominującego fragmentu DNA znacznika umożliwiającego selekcję.
PL 191 251 B1
Ten DNA koduje dowolne pożądane białko, korzystnie białko wykazujące właściwości farmaceutyczne albo inne pożądane cechy. Zwykle, DNA koduje białko ssacze, zaś w niniejszych przykładach koduje immunoglobulinę albo immunoadhezynę. Jednakże, wynalazek nie jest w żadnym razie ograniczony do immunoglobulin.
Jak omówiono uprzednio, niniejszy sposób klonowania jest przydatny dla wszystkich komórek ssaków, ponieważ nie wymaga dla skuteczności obecności żadnych swoistych sekwencji ssaka. Generalnie, takie komórki ssaka obejmują zwykle używane do ekspresji białek, np. komórki CHO, komórki szpiczaka, COS, BHK, Sp2/0, NIH 3T3 i HeLa. W poniższych przykładach wykorzystywano komórki CHO. Ich zalety obejmują dostępność przydatnych pożywek hodowlanych, ich zdolność do wydajnego wzrostu w wysokiej gęstości w hodowli, oraz ich zdolność do wyrażania ssaczych białek takich jak immunoglobuliny w postaci biologicznie czynnej.
Dalej, komórki CHO wybrano głównie z powodu uprzedniego zastosowania ich przez wynalazców do wyrażania immunoglobulin (przy użyciu wektora upośledzonego translacyjnie dominującego znacznika umożliwiającego selekcję). Tak więc, nasze laboratorium posiada istotne doświadczenie w stosowaniu tych komórek do ekspresji. Jednakże, w oparciu o poniższe przykłady należy racjonalnie oczekiwać podobnych wyników dla innych komórek ssaczych.
Ogólnie, transformację albo transfekcję komórek ssaków zgodnie z wynalazkiem przeprowadza się stosując metody konwencjonalne. W celu lepszego zrozumienia wynalazku, poniżej opisano w przykładach konstruowanie przykładowych wektorów i ich zastosowanie w tworzeniu integrantów.
Przykła d 1
Konstruowanie i wytwarzanie DNA plazmidowych wektorów znacznikowych i kierujących
Plazmid znacznikowy określany dalej jako „Desmond” połączono z następujących elementów:
(a) Mysi gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), włączono do kasety transkrypcyjnej, obejmującej promotor mysiej globiny beta 5' w stosunku do początku DHFR i sygnał poliadenylacji 3'bydlęcego hormonu wzrostu w stosunku do kodonu stop. Kasetę transkrypcyjną DHFR wyizolowano z TCAE6, wektora ekspresyjnego wytworzonego uprzednio w naszym Laboratorium (Newman i in., 1992, Biotechnology 10: 1455-1460).
(b) Gen β-galaktozydazy E. coli - dostępny w handlu, zakupiony w Promega jako wektor kontrolny pSV-e-galaktozydazy, nr kat. E1081.
(c) DNAbakulowirusa, dostępny w handlu, zakupiony z Clontech jakopBAKPAK8, nr kat. 6145-1.
(d) Kaseta obejmująca elementy promotora i wzmacniacza wirusa cytomegalii i wirusa SV40. Kasetę wytworzono przez PCR stosując pochodną wektora ekspresyjnego TCAE8 (Reff i in., Blood 83: 435-445 (1994)). Kasetę wzmacniacza wprowadzono do sekwencji bakulowirusa, który najpierw zmodyfikowano przez wprowadzenie miejsca wielokrotnego klonowania.
(e) Gen glukuronidazy (GUS) E. coli, dostępny w handlu, zakupiony w Clontech jako pB101, nr kat. 6017-1.
(f) Gen lucyferazy świetlika, dostępny w handlu, zakupiony w Promega jako pGEM-Luc (nrkat. E1541).
(g) Gen dehydrogenazy histydynolowej S. typhimurium (HisD). Gen ten był darem od Donahue i in. (Gene 18: 47-59 (1982)), który następnie włączono do kasety transkrypcyjnej zawierającej główny promotor mysiej beta globiny 5' od genu i sygnał poliadenylacji SV40 3' od tego genu.
Elementy DNAopisane w (a)-(g) połączono w szkielecie pochodzącym z plazmidu pBR tworząc ciąg DNA wielkości 7,7 kb określany na dołączonych figurach jako „homologia”. Homologia w tym sensie dotyczy sekwencji DNA, które nie są częścią genomu ssaka i są stosowane do ułatwiania rekombinacji homologicznej pomiędzy transfekowanymi plazmidami posiadającymi wspólne sekwencje homologii DNA.
(h) Gen fosfotransferazy neomycynowej z TN5 (Davis i Smith, Ann. Rev. Micro., 32: 469-518 (1987)). Kompletny gen neo klonowano do pBluescript SK- (Stratagene, nr kat 212205) w celu ułatwienia manipulacji genetycznych. Syntetyczny polilinker wprowadzono do unikalnego miejsca PstI występującego w kodonach dla aminokwasów 51 i 52 neo. Łącznik ten kodował elementy DNA niezbędne do wytworzenia sztucznego donorowego miejsca składania, intronu interwencyjnego i akceptorowego miejsca składania w genie neo i w ten sposób tworząc dwa osobne egzony, określane obecnie jako egzon 1 i 2 neo. Egzon neo kodował pierwsze 51 aminokwasów neo, podczas gdy egzon 2 kodował pozostałe 203 aminokwasy oraz kodon stop miejsca klonowania białka A NotI wytworzonego w intronie.
PL 191 251 B1
Egzon 2 neo dalej podzielono tworząc egzon 2 i 3 neo. Uzyskano to w następujący sposób: zaprojektowano zestaw starterów PCR w celu amplifikowania regionu DNA kodującego egzon 1 neo, intron i pierwsze 111 2/3 aminokwasów egzonu 2. Starter PCR 3' wprowadził nowe miejsce składania transkryptu 5' bezpośrednio po drugim nukleotydzie kodonu aminokwasu 111 w egzonie 2, tworząc nowy, mniejszy egzon 2. Fragment DNA kodujący obecnie oryginalny egzon 1, intron i nowy egzon 2, klonowano i namnożono w wektorze opartym na pBR. Pozostałość oryginalnego egzonu 2 zastosowano jako matrycę do następnej rundy amplifikacji PCR, która dała „egzon 3”. Starter 5' do tej rundy amplifikacji wprowadził nowe miejsce akceptorowe składania transkryptu, na końcu 5' nowo wytworzonego egzonu 3', tj. przed końcowym nukleotydem kodonu aminokwasu 111. Powstałe trzy egzony neo kodowały następującą informację: egzon 1 - pierwszych 51 aminokwasów neo; egzon 2 - następne 111 2/3 aminokwasów; egzon 3, końcowe 91 1/3 aminokwasów plus kodon stop genu neo.
Egzon 3 neo włączono wraz z wyżej wymienionymi elementami DNA do plazmidu znacznikowego „Desmond”. Egzony neo 1 i 2 włączono do plazmidu kierującego „Molly”. Miejsce restrykcyjne NotI wytworzono w intronie pomiędzy egzonem 1 i 2 w celu wprowadzenia interesujących genów do plazmidu kierującego.
Wytworzono również inny plazmid kierujący „Mandy”. Plazmid ten był niemal identyczny z „Molly” (zmieniono niektóre miejsca restrykcyjne) z wyjątkiem tego, że oryginalne geny HisD i DHFR w „Molly” pozostały zinaktywowane. Zmiany te włączono ponieważ linii komórkowej „Desmond” nie hodowano już w obecności histydynolu, stąd wydawało się niepotrzebne włączanie drugiej kopii genu HisD. Oprócz tego, gen DHFR inaktywowano w celu upewnienia się, że tylko jeden gen DHFR, konkretnie obecny w zaznaczonym miejscu Desmond będzie amplifikowany w powstającej linii komórkowej. „Mandy” otrzymano z „Molly” przez następujące modyfikacje:
i) syntetyczny łącznik wprowadzono do środka regionu kodującego DHFR. Łącznik ten wytworzył kodon stop i przesunął pozostały region kodujący DHFR poza ramkę odczytu, co spowodowało, że gen był nieczynny, ii) część genu HisD usunięto i zastąpiono fragmentem HisD powstałym przez PCR, pozbawionym promotora i kodonu start.
Figura 1 przedstawia uporządkowanie elementów DNA w plazmidzie znacznikowym „Desmond”. Figura 2 przedstawia uporządkowanie tych elementów w pierwszym plazmidzie kierującym „Molly”. Figura 3 przedstawia możliwe uporządkowanie w genomie CHO, różnych elementów DNA po kierowaniu i integrowaniu DNA Molly do komórek CHO znakowanych Desmond. Figura 9 przedstawia plazmid kierujący „Mandy”.
Konstruowanie plazmidu znacznikowego i kierującego z wyżej wymienionych elementów DNA przeprowadzono stosując konwencjonalne techniki klonowania (patrz, np. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Sambrook i in., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i in., wyd. 1987, John Wiley and Sons). Wszystkie plazmidy namnożono i utrzymywano w E . coli Xlblue (Stratagene, nr kat. 200236). Preparaty plazmidowego DNA na wielką skalę wytworzono stosując zestaw Promega Wizard Maxiprep DNA Purification System® według instrukcji producenta.
Przykład 2
Konstruowanie znakowanej linii komórkowej CHO
1. Hodowla komórek i procedury transfekowania w celu wytworzenia znakowanej linii komórkowej CHO
DNA plazmidu znacznikowego linearyzowano przez trawienie przez noc w 37°C przy użyciu Bst1107I. Linearyzowany wektor precypitowano etanolem i zawieszono w sterylnym TE w stężeniu 1 mg/ml. Linearyzowany wektor wprowadzono do komórek jajnika chomika chińskiego DHFR (komórki CHO), DG44 (Urlaub i in., Som. Cell and Mol. Gen., 12: 555-566 (1986)) przez elektroporację.
Komórki w wykładniczej fazie wzrostu zebrano przez odwirowanie, raz płukano lodowatym SBS (buforowany roztwór sacharozy, 272 mM sacharoza, 7 mM fosforan sodu, pH 7,4, 1 mM chlorek magnezu), a następnie zawieszono w SBS do gęstości 107 komórek/ml. Po 15 minutach inkubacji na lodzie, 0,4 ml zawiesiny komórek zmieszano z 40 μg linearyzowanego DNA w jednorazowej kuwecie do elektroporacji. Komórki poddano wstrząsowi przy użyciu urządzenia BTX electrocell manipulator (San Diego, CA) ustawionego na 230 wolt, 400 μFaradów, 13 Ohm. Poddane wstrząsowi komórki zmieszano z 20 ml ogrzanej pożywki (CHO-S-SFMII, Gibco/BRL, nr kat. 31033-012) i wysiano do płytki 96-studzienkowej. 48 godzin później płytki zasilono pożywką selekcyjną (w przypadku transfekcji Desmond, pożywką była CHO-S-SFMII bez hipoksantyny albo tymidyny, z dodatkiem 2 mM histodynoPL 191 251 B1 lu (Sigma nr kat. H6647)). Płytki utrzymywano na pożywce selekcyjnej przez 30 dni albo do momentu, gdy w którejś studzience komórki wykazały wzrost. Komórki te usunięto z płytki 96-studzienkowej i namnażano w 120 ml kolbach z mieszadełkiem (ang. spinner flask) gdzie utrzymywano je na pożywce selekcyjnej.
Przykład 3
Charakterystyka znakowanej linii komórkowej CHO (a) Analiza Southern
Genomowy DNA izolowano z wszystkich stabilnie rosnących znakowanych Desmond komórek CHO. DNA izolowano stosując zestaw Invitrogen Easy® DNA, według instrukcji producenta. Genomowy DNA trawiono Hindlll przez noc w temperaturze 37°C i poddano analizie Southern stosując wytworzoną przez PCR znakowaną digoksygeniną sondę swoistą dla genu DHFR. Hybrydyzację i płukanie przeprowadzono stosując Boehringer Mannheim DIG easy hyb (nr kat. 1603 558) i zestaw DIG Wash i Block Buffer (nr kat. 1585 762) według instrukcji producenta. Próbki DNA zawierające pojedynczy prążek hybrydyzujący z sondą DHFR oceniono jako klony zawierające Desmond, powstałe z pojedynczych komórek, które zintegrowały pojedynczą kopię plazmidu. Klony te zachowano do dalszej analizy. Spośród 45 wyizolowanych klonów komórek opornych na HisD, jedynie 5 zawierało pojedynczą kopię genu. Figura 4 przedstawia analizę Southern blot zawierającą wszystkie 5 klonów zawierających pojedynczą kopię Desmond. Nazwy klonów podano w legendzie do figur.
(b) Analiza Northern
Całkowity RNA wyizolowano z wszystkich klonów o pojedynczej kopii Desmond, przy użyciu odczynnika TRIzol (Gibco/BRL, nr kat. 15596-026) według instrukcji producenta. 10-20 μg RNA z każdegoklonu analizowano w powtórzeniu na żelach z formaldehydem. Powstałe bloty sondowano sondami DNA wytworzonymi przez PCR i znakowanymi digoksygeniną w kierunku (i) obecności sygnału DHFR, (ii) sygnału HisD i (iii) sygnału CAD. CAD jest trzyfunkcyjnym białkiem związanym z biosyntezą urydyny (Wahl i in., J. Biol. Chem. 254, 17: 8679 (1979)) i ulegającym jednakowej ekspresji we wszystkich rodzajach komórek. Jest ono stosowane tu jako wewnętrzny standard w celu określenia ilości RNA. Hybrydyzację i płukanie przeprowadzono stosując wyżej wspomniane reagenty Boehringer Mannheim. Wyniki analizy Northern przedstawiono na fig. 5. Pojedynczą kopią klonu Desmond wykazującą najwyższy poziom HisD i DHFR był 15C9, przedstawiony na fig. 5, na obu panelach figury. Klon ten oznaczono jako „znakowaną linię komórkową” i zastosowano go dalej w doświadczeniach nad kierowaniem do CHO, przykłady czego pokazano w poniższych działach.
Przykład 4
Ekspresja przeciwciała przeciwko CD20 w komórkach CHO znaczonych Desmond
C2B8, chimeryczne przeciwciało, które rozpoznaje antygen powierzchniowy limfocytów B CD20, zostało sklonowane i wytworzone przez ekspresję w naszym laboratorium. (Reff i in., Blood 83: 434-45 (1994)). Fragment DNA wielkości 4,1 kb, obejmujący geny łańcuchów ciężkich i lekkich wraz zniezbędnymi elementami regulatorowymi (promotorem eukariotycznym i sygnałami poliadenylacji) wprowadzono do sztucznego intronu wytworzonego pomiędzy egzonami 1 i 2 genu neo zawartego wwektorze do klonowania pBR. Ten nowo wytworzony fragment DNA 5 kb (zawierający egzon 1 neo, C2B8 i egzon 2 neo) wycięto i zastosowano do złożenia wektora kierującego Molly. Inne elementy DNA zastosowane w konstruowaniu Molly są identyczne z zastosowanymi do konstruowania plazmidu znacznikowego Desmond. Kompletną mapę Molly przedstawiono na fig. 2.
Wektor kierujący Molly linearyzowano przed transfekcją przez trawienie KpnI i PacI, precypitowano etanolem i zawieszono w TE do stężenia 1,5 mg/ml. Linearyzowany plazmid wprowadzono do komórek znakowanych Desmond rosnących w logarytmicznej fazie wzrostu zasadniczo jak opisano, z takim wyjątkiem, że do każdej elektroporacji zastosowano 80 μg DNA. 48 godzin po elektroporacji płytki 96-studzienkowe zasilano świeżą pożywką CHO-SSFMI z dodatkiem 400 μg/ml genetycyny (G418, Gibco/BRLnr kat. 10131-019). Płytki utrzymywano na pożywce selekcyjnej przez 30 dni albo dopóki w niektórych studzienkach nie pojawił się wzrost komórek. Taki wzrost oceniono jako wynik ekspansji klonalnej pojedynczej komórki opornej na G418). Nadsącze z komórek opornych na G418 badano na wytwarzanie C2B8 standardową techniką ELISA, zaś wszystkie produktywne klony namnażano ostatecznie w 120 ml kolbach z mieszadełkiem i dalej analizowano.
Charakterystyka komórek docelowych, wydzielających przeciwciało
W trakcie doświadczenia przeprowadzono 50 elektroporacji z wektorem kierującym Molly, przy czym każdą z nich wysiano do osobnej płytki 96-studzienkowej. W sumie otrzymano 10 żywych klonów wydzielających przeciwciało CD-20 i namnożono w 120-ml kolbach z mieszadełkiem. Następnie
PL 191 251 B1 z wszystkich klonów wyizolowano genomowy DNA i przeprowadzono analizę Southern, w celu określenia, czy klony stanowią pojedynczą rekombinację homologiczną albo czy w niektórych komórkach zaszła dodatkowa losowa integracja. Sposoby izolowania DNA i hybrydyzacji Southern opisano w poprzednich częściach. Genomowy DNA trawiono EcoRI i sondowano wytworzoną w PCR sondą znakowaną digoksygeniną, wobec segmentu regionu stałego łańcucha ciężkiego CD20. Wyniki analizy Southern przedstawiono na fig. 6. Jak można zauważyć z figury, 8 spośród 10 klonów wykazywało pojedynczy prążek hybrydyzujący z sondą CD20, co wskazuje na pojedynczą homologiczną rekombinację, która zaszła w tych komórkach. Dwa spośród 10, klony 24G2 i 28C9 wykazują obecność dodatkowych prążków, co wskazuje na dodatkową integrację losową gdzieś w genomie.
Zbadano poziom ekspresji przeciwciała anty-CD20 u wszystkich dziesięciu klonów, z czego dane przedstawiono poniżej w tabeli 1.
Tabel a 1
Poziom ekspresji anty-CD20 integrantów po rekombinacji homologicznej
Klon anty-CD20, pg/c/d
20F4 3,5
25E1 2,4
42F9 1,8
39G11 1,5
21C7 1,3
50G10 0,9
29F9 0,8
5F9 0,3
- -
28C9* 4,5
24G2* 2,1
* Klony te zawierały dodatkową losowo zintegrowaną kopię anty-CD20. Poziomy ekspresji tych klonów odzwierciedlają wkład obu miejsc, homologicznego i losowego
Poziomy ekspresji opisywano jako pikogramy na komórkę na dzień (pg/c/d) wydzielane przez poszczególne klony i stanowiące średnie poziomy otrzymane z trzech osobnych ELISA na próbkach pobranych z 120ml kolb.
Jak widać z danych, występuje w przybliżeniu 10-krotna zmienność wydzielania przeciwciał, pomiędzy najniższym i najwyższym klonem. Jest to nieco nieoczekiwane, ponieważ oczekiwano podobnych poziomów ekspresji z wszystkich klonów, ponieważ wszystkie geny anty-CD20 są zintegrowane w tym samym miejscu zaznaczonym DESMOND. Mimo to, obserwowany zakres ekspresji jest niezwykle niski w porównaniu z obserwowanym z użyciem tradycyjnego sposobu integracji losowej, albo przy użyciu wektora o upośledzonej zdolności transkrypcji.
Klon 20F4, najsilniej produkujący klon, wybrano do dalszego badania. Tabela 2 (poniżej) przedstawia dane z ELISA i hodowli komórkowej z 7 dniowego wytwarzania tego klonu.
T ab e l a 2
7-dniowe wytwarzanie dla 20F4
Dzień % żywych żywe /ml (x 105) T x 2 (godz.) mg/l Pg/C/d
1 2 3 4 5 6
1 96 3,4 31 1,3 4,9
2 94 6 29 2,5 3,4
PL 191 251 B1 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5 6
3 94 9,9 33 4,7 3,2
4 90 17,4 30 6,8 3
5 73 14 8,3
6 17 3,5 9,5
5
Klon 20F4 wysiano w gęstości 2 x 105 komórek/ml w 120 ml butelce, w dniu 0. Przez 6 kolejnych dni badano liczbę komórek, obliczono czas podwojenia i pobierano 1 ml nadsączu z hodowli i analizowano przez ELISA na anty-CD20.
Klon ten wydziela średnio 3-5 pg przeciwciała/komórkę/ dzień, w oparciu o dane ELISA. Jest to ten sam poziom co otrzymany dla innych klonów silnie wyrażających pojedynczą kopię genu otrzymany uprzednio w naszym laboratorium przy użyciu opisanych uprzednio wektorów integrujących losowo o upośledzonej zdolności translacji. Wyniki wskazują na następujące:
(1) miejsce w genomie CHO, zaznaczone przez znacznik Desmond jest bardzo aktywne transkrypcyjnie, stąd stanowi doskonałe miejsce do wyrażania rekombinowanego białka; i (2) kierowanie przy użyciu rekombinacji homologicznej można przeprowadzić przy użyciu wektorów według wynalazku i zachodzi z częstością wystarczająco dużą, żeby uczynić ten układ żywotną i pożądaną alternatywą dla metod integracji losowej.
W celu dalszego wykazania skuteczności tego układu, wykazano również, że układ ten jest możliwy do amplifikacji, dając jeszcze wyższy poziom ekspresji genu i wydzielania białka. Amplifikację uzyskano przez wysianie kolejnych seryjnych rozcieńczeń komórek 20F4, rozpoczynając od gęstości
2,5 x 104 komórek/ml, w 96-studzienkowej szalce hodowlanej i hodowanie komórek na pożywce (CHO-SSFMII) z dodatkiem 5, 10, 15 albo 20 nM metotreksatu. Klony wydzielające przeciwciała badano przesiewowo stosując standardowe techniki ELISA, zaś najsilniej produkujący klon namnożono i dalej analizowano. Podsumowanie tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 3, poniżej.
T ab e l a 3
Podsumowanie amplifikacji 20F4
nM MTX badane studzienki poziom ekspr. mg/l studzienki do namnoż. hodowli poziom ekspr. pg/c/d
10 56 3-13 4 10-15
15 27 2-14 3 15-18
20 17 4-11 1 ND
Amplifikację metotreksatem 20F4 przeprowadzono jak to opisano w tekście, stosując stężenia metotreksatu zaznaczone w tabeli. Nadsącze ze wszystkich studzienek badano przez ELISA i wyrażano zakres anty-CD20 jak zaznaczono w kolumnie 3. W oparciu o te wyniki, najsilniej wyrażające klony namnożono w 120 ml kolbach z mieszadełkiem i przeprowadzono kilka badań ELISA na nadsączach w celu określenia poziomu ekspresji w pg/c/d, co opisano w kolumnie 5.
Dane pokazują jasno, że miejsce to może być amplifikowane w obecności metotreksatu. Stwierdzono, że klony z amplifikacji 10 i 15 nM wytwarzają 15-20 pg/komórkę/dzień.
Klon 15nM, oznaczony 20F4-15A5 wyselekcjonowano jako linię komórkową najsilniejszej wyrażającą. Klon ten pochodził z płytki 96-studzienkowej, w której wzrost występował jedynie w 22 studzienkach i dlatego założono, że powstał z pojedynczej komórki. Klon 15 nM, oznaczony 20F4-15A5 wyselekcjonowano jako linię komórkową najsilniej wyrażającą. Klon ten pochodził z płytki 96-studzienkowej, w której wzrost występował jedynie w 22 studzienkach i dlatego założono, że powstał z pojedynczej komórki. Klon poddano kolejnym rundom amplifikacji na metotreksacie. Jak to opisano wyżej, kolejne rozcieńczenia hodowli wysiano do płytek 96-studzienkowych i hodowano w pożywce CHO-SS-FMII z dodatkiem 200, 300 albo 400 nM metotreksatu. Klony przeżywające badano Przesiewowo przez ELISA i kilka z nich namnożono w hodowli wirowej i dalej analizowano. Podsumowanie tego drugiego doświadczenia nad amplifikacją przedstawiono w tabeli 4.
PL 191 251 B1
Tabe la 4
Podsumowanie amplifikacji 20F4-15A5
nM MTX badane studzienki poziom ekspr. mg/l studzienki do namnoż. hodowli poziom ekspr. pg/c/d
200 67 23-70 1 50-60
250 86 21-70 4 55-60
300 81 15-75 3 40-50
Amplifikację metotreksatem 20F4 przeprowadzono jak to opisano w tekście, stosując stężenia metotreksatu zaznaczone w tabeli. Nadsącze ze wszystkich studzienek badano przez ELISA i wyrażano zakres anty-CD20 jak zaznaczono w kolumnie 3. W oparciu o te wyniki, najsilniej wyrażający klon namnożono w 120ml kolbach z mieszadełkiem i przeprowadzono kilka badań ELISA na nadsączach w celu określenia poziomu ekspresji w pg/c/d, co opisano w kolumnie 5.
Klon najsilniej wytwarzający pochodził z amplifikacji na 250 nM metotreksacie. Klon 250 nM 20F4-15A5-250A6 pochodził z płytki 96-studzienkowej, w której wzrost występował jedynie w 22 studzienkach i dlatego założono, że powstał z 1 komórki. Podsumowując, dane w tabelach3 i 4 silnie wskazują, że dwie rundy amplifikacji na metotreksacie wystarczają do osiągnięcia poziomu ekspresji rzędu 60 pg/komórkę/dzień, co jest zbliżone do maksymalnej zdolności wydzielniczej immunoglobulin w komórkach ssaków. (Reff i in., Curr. Opin. Biotech., 4: 573-576 (1993)). Możliwość osiągnięcia tej zdolności wydzielniczej po zaledwie dwóch etapach amplifikacji na metotreksacie dalej podnosi przydatność homologicznych układów rekombinacji. Zwykle, metody integracji losowej wymagają więcej niż dwóch etapów amplifikacji aby uzyskać ten poziom ekspresji i są ogólnie bardziej zawodne w sensie łatwości amplifikacji. Tak więc, układ homologiczny oferuje bardziej skuteczną i mniej czasochłonną metodę osiągania wyższego poziomu ekspresji genu w komórkach ssaka.
Przykład 5
Ekspresja przeciwciała przeciwko ludzkiej CD23 w komórkach CHO zaznaczonych Desmond
CD23 jest receptorem IgE o słabym powinowactwie, które pośredniczą w wiązaniu IgE z limfocytami B i T (Sutton i Gould, Nature, 366:421-428 (1993)). Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim IgE, 5E8 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym gamma-1, ostatnio klonowanym i wyrażonym w naszym laboratorium. Przeciwciało to ujawniono w zgłoszeniu nr 08/803,085, zgłoszonym 20 lutego, 1997.
Geny łańcuchów lekkiego i ciężkiego 5E8 klonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego N5KG1, pochodnej wektora NEOSPLA (Barnett i in., Antibody Expression and Engineering, wyd. H.Y. Young i T. Imanaka, 27-40 (1995)) po czym dokonano dwóch zmian w genach. Ostatnio zaobserwowano nieco wyższe wydzielanie łańcuchów lekkich przeciwciał w porównaniu z łańcuchami ciężkimi w innych konstruktach ekspresyjnych (Reff i in., 1997, obserwacja niepublikowana). Wcelu skompensowania tego niedoboru, zmieniono gen łańcucha ciężkiego 5E8 przez dodanie elementu silnego promotora/wzmacniacza bezpośrednio powyżej miejsca startu. W kolejnych etapach, fragment DNA wielkości 2,9 kb obejmujący modyfikowane geny łańcucha ciężkiego i lekkiego wyizolowano z N5KG1 i wprowadzono do wektora kierującego Mandy. Wytwarzanie Molly zawierającego 5E8 i elektroporacja do komórek CHO 15C9 Desmond byłytakie, jak opisano zasadniczo w poprzedniej części.
Jedną z modyfikacji wobec uprzednio opisanego protokołu była zastosowana pożywka komórkowa. Komórki CHO zaznaczone Desmond, hodowano w bezbiałkowej pożywce CD-CHO (Gibco BRL, nr kat. AS21206) z dodatkiem 3 mg/lrekombinowanej insuliny (3 mg/ml, Gibco BRLnr kat. AS22057) i 8 mM L-glutaminy (200 mM, Gibco BRL, nr kat. 25030-081). Następnie, transfekowane komórki selekcjonowano w powyższej pożywce z dodatkiem 400 μg/ml genetycyny. W tym doświadczeniu przeprowadzono 20 elektroporacji i wysiano na płytki 96-studzienkowe. Komórki rosły i wydzielały przeciwciało anty-CD23 w 68 studzienkach, z których wszystkie założono, że były klonami pochodzącymi z pojedynczej komórki G418. Komórki z 12 studzienek namnożono w120 ml kolbach z mieszadełkiem, do dalszej analizy. Uważa się, że zwiększona liczba klonów izolowanych w tym doświadczeniu (68 w porównaniu z 10 dla anty-CD20 jak opisano w przykładzie 4) spowodowana jest wyższą skutecznością klonowania i odsetkiem przeżywania komórek hodowanych na pożywce CD-CHO wporównaniu z pożywką CHO-SS-FMII. Poziom ekspresji dla tych klonów w hodowlach wirowych
PL 191 251 B1 zawierał się w granicach 0,5-3 pg/c/d, co było zgodne z poziomem obserwowanym dla klonów antyCD20. Najsilniej produkujący klon anty-CD23, oznaczony 4H12, poddano amplifikacji na metotreksacie wcelu zwiększenia poziomu ekspresji. Amplifikację przeprowadzono w sposób analogiczny do opisanego dla anty-CD20 w przykładzie 4. Kolejne rozcieńczenia komórek 4H12 w fazie logarytmicznej wzrostu wysiano do płytek hodowlanych 96-studzienkowych i hodowano w pożywce CD-CHO z dodatkiem 3 mg/l insuliny, 8 mM glutaminy i 30, 35 albo 40 nM metotreksatu. Podsumowanie tego doświadczenia przedstawiono wtabeli 5.
T ab e l a 5
Podsumowanie amplifikacji 2H12
nM MTX badane studzienki poziom ekspr. mg/l studzienki do namnoż. hodowli poziom ekspr. pg/c/d
30 100 6-24 8 10-25
35 64 4-27 2 10-15
40 96 4-20 1 ND
Klonem o najwyższej ekspresji był otrzymany klon 30 mM, izolowany z płytki na której hodowano 22 klony. Klon ten, oznaczony 4H12-30G5, wydzielał w sposób powtarzalny 18-22 pg przeciwciała na komórkę na dzień. Jest to zakres ekspresji obserwowany dla klonu 20F4 z pierwszej amplifikacji (klon 20F4-15A5, wytwarzający 18-22 pg przeciwciała na komórkę na dzień, jak to opisano w przykładzie 4). Dane te dalej wspierają obserwację, że amplifikacja w znaczonym miejscu CHO jest powtarzalna i skuteczna. Druga amplifikacja tej linii komórkowej 30 nM jest w trakcie. Oczekuje się, że poziom nasycenia ekspresji możliwy jest do osiągnięcia dla przeciwciała anty-CD23 już po dwóch etapach amplifikacji, jak miało to miejsce w przypadku anty-CD20.
Przy kła d 6
Ekspresja immunoadhezyny w komórkach CHO znaczonych Desmond
CTLA-4, członek nadrodziny Ig spotykana jest na powierzchni limfocytów T i jak się uważa, odgrywa rolę w aktywacji limfocytów T (Darivach i in., Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988); Linsley i in., J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)). W celu dalszego zbadania szczegółowej roli cząsteczki CTLA-4 w szlaku aktywacji, wytworzono rozpuszczalne białko fuzyjne obejmujące zewnątrzkomórkową domenę CTLA-4 połączoną z okrojoną postacią regionu stałego ludzkiej IgG1 (Linsley i in., wyżej). Ostatnio poddano ekspresji to białko fuzyjne CTLA-4 Ig w wektorze ekspresyjnym BLECH1, pochodnej plazmidu NEOSPLA (Barnett i in., Antibody Expression and Engineering, wyżej). Fragment wielkości 800 bp, kodujący CTLA-4 Ig, wyizolowano z tego wektora i wprowadzono pomiędzy miejsce SacII i Bglll w Molly.
Wytwarzanie CTLA-4Ig-Molly i elektroporację do klonu 15C9 Desmond komórek CHO przeprowadzono, jak to opisano w poprzednim przykładzie dotyczącym anty-CD20. Przeprowadzono 20 elektroporacji i wysiano do płytek 96-studzienkowych, jak to opisano uprzednio. Wyizolowano 18 studzienek wyrażających CTLA-4 i przeprowadzono do etapu kolb 120 ml. Analizy Southern genomowego DNA izolowanego z każdego z tych klonów wykazały dodatkowy integrant losowy. Genomowe DNA trawiono BglII i sondowano sondą wytworzoną przez PCR, znakowaną digoksygeniną, przeciwko regionowi stałemu IgGl.
Wyniki analizy wskazują, że 85% klonów CTLA-4 jest wyłącznie integrantami homologicznymi, pozostałe 15% zawierało dodatkowy losowy integrant. Wyniki te wspierają wyniki zekspresji antyCD20 dyskutowane wyżej, w których 80% klonów było pojedynczymi integrantami homologicznymi. Stąd można wnioskować, że ten układ ekspresyjny w sposób powtarzalny daje pojedyncze integranty w przynajmniej 80% klonów.
Poziomy ekspresji dla homologicznych klonów CTLA-4-Ig wynosiły 18-22 pg/komórkę/dzień. Jest to nieco więcej niż zakres opisywany dla przeciwciała anty-CD20 dyskutowanego wyżej. Jednakże, obserwowano uprzednio, że ekspresja tej cząsteczki przy użyciu wektorów z insercją intronu również powodowała istotnie wyższy poziom ekspresji niż obserwowany dla immunoglobulin. Obecnie nie można wyjaśnić tego zjawiska.
PL 191 251 B1
Pr zy kł a d 7
Kierowanie anty-CD20 do alternatywnie znaczonych Desmond linii komórkowych CHO
Jak opisano w poprzednim przykładzie, otrzymano 5 linii komórek CHO o pojedynczych kopiach Desmond (patrz figury 4 i 5). W celu wykazania, że powodzenie strategii kierowania nie zależy od unikalnych właściwości klonu 15C9 i nie jest ograniczone tylko do tego klonu, wprowadzono anty-CD20 Molly do klonu Desmond 9B2 (ścieżka 6, figura 4, ścieżka 1 figura 5). Wytwarzanie DNA Molly i elektroporację do klonu Desmond 9B2 przeprowadzono w sposób identyczny jak opisany w poprzednich przykładach. Otrzymano homologiczne integranty. Klon ten namnożono w 120 ml kolbach z mieszadełkiem, gdzie wytworzył średnio 1,2 pg anty-CD2O/komórkę/dzień. Jest to istotnie niższa ekspresja niż obserwowana z Molly kierowanym do Desmond 15C9. Jednakże, był to oczekiwany wynik, w oparciu o analizę Northern klonów Desmond. Jak widać na fig. 5, poziomy mRNA z klonu 9B2 są istotnie niższe niż w przypadku 15C9, co wskazuje, że miejsce w tym klonie nie jest aktywne transkrypcyjnie. Dlatego, doświadczenie to nie tylko wykazuje powtarzalność układu, ale również potwierdza dane dotyczące badania Northern, świadczące o tym, że miejsce w Desmond 15C9 jest najbardziej aktywne transkrypcyjnie.
Z powyższego widać, że jakkolwiek opisano tu konkretne wykonania wynalazku w celu zilustrowania, możliwe są liczne modyfikacje bez odbiegania od zakresu wynalazku. Tak więc, wynalazek nie jest ograniczony przez dołączone zastrzeżenia.

Claims (45)

Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie komórki ssaka, znamienny tym, że obejmuje:
i) transfekowanie albo transformowanie komórki ssaka in vitro pierwszym plazmidem („plazmid znacznikowy”) obejmującym następujące sekwencje:
(a) pierwszy fragment DNA obejmujący region DNA, który jest heterologiczny względem genomu komórki ssaka i który gdy jest zintegrowany z genomem komórki ssaka, zapewnia unikalny region do rekombinacji homologicznej;
(b) drugi fragment DNA, który obejmuje region kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję; i (c) trzeci fragment DNA, który obejmuje region kodujący co najmniej jedno inne białko znacznika umożliwiającego selekcję, które jest inne niż białko pierwszego znacznika i zapewnia selekcję komórki ssaka, w genomie której został zintegrowany plazmid znacznikowy;
ii) selekcjonowanie komórki, która zawiera plazmid znacznikowy zintegrowany z jej genomem przez przeszukiwanie in vitro na ekspresję białka znacznika umożliwiającego selekcję kodowanego przez trzeci fragment DNA;
iii) transfekowanie albo transformowanie wyselekcjonowanej komórki in vitro drugim plazmidem („plazmid kierujący”), który obejmuje co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki i ponadto obejmuje sekwencje:
(a) czwarty fragment DNA obejmujący region DNA, który jest identyczny albo wystarczająco homologiczny z unikalnym regionem dla homologicznej rekombinacji w plazmidzie znacznikowym tak, że ten region DNA może rekombinować ze wspomnianym DNA plazmidu znacznikowego drogą rekombinacji homologicznej;
(b) piąty fragment DNA, który obejmuje region DNA kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję, która jest inna niż część tego białka znacznika kodowana przez plazmid znacznikowy, przy czym aktywne białko znacznika umożliwiającego selekcję jest wytwarzane tylko gdy piąty fragment DNA kodujący część białka znacznikowego zawarty w plazmidzie kierującym ulega ekspresji w powiązaniu z drugim fragmentem DNA znacznika kodującym część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie znacznikowym; i iv) selekcjonowanie komórek, które zawierają plazmid kierujący zintegrowany w unikalnym regionie dla homologicznej rekombinacji przez badanie przesiewowe in vitro w kierunku ekspresji białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że region drugiego fragmentu DNA kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję obejmuje co najmniej jeden egzon genu kodującego białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję.
PL 191 251 B1
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że piąty fragment DNA plazmidu kierującego obejmuje pozostałe egzonygenu kodującego pierwszy znacznik umożliwiający selekcjębiałka.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że co najmniej jeden DNA, który należy wprowadzić do genomu komórki koduje pożądane białko i jest wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że DNA kodujący dominujący znacznik umożliwiający selekcję białka, który jest inny niż pierwszy znacznik umożliwiający selekcję białka jest dalej wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym, co zapewnia równoczesną amplifikację DNAkodującego żądane białko.
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pierwszy znacznik umożliwiający selekcję białka jest wybrany z grupy składającej się z fosfotransferazy neomycynowej, dehydrogenazy histydynolowej, reduktazy dihydrofolianowej, fosfotransferazy higromycynowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, syntetazy glutaminowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że żądanym białkiem jest białko ssaka.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że białkiem jest immunoglobulina.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje określanie poziomu RNA znacznika umożliwiającego selekcję (c) zawartego w trzecim fragmencie DNA plazmidu znacznikowego przed integracją wektora kierującego.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że innym znacznikiem umożliwiającym selekcję zawartym w plazmidzie znacznikowym jest dominujący znacznik umożliwiający selekcję wybrany zgrupy składającej się z dehydrogenazy histydynylowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, fosfotransferazy higromycynowej i syntetazy glutaminowej.
11 . Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka ssaka jest wybrana z grupy składającej się z komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki szpiczaka, komórki nerki oseska chomika, komórki COS, komórki NSO, komórki HeLa i komórki NIH 3T3.
12. Sposóbwedług zastrz. 11, znamienny tym, że komórką jest komórka CHO.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid znacznikowy zawiera trzeci egzon genu fosfotransferazy neomycynowej, zaś plazmid kierujący zawiera pierwsze dwa egzony genu fosfotransferazy neomycynowej.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid znacznikowy dalej obejmuje rzadką sekwencję endonukleazy restrykcyjnej, która jest wprowadzona w region homologii.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną obejmuje przynajmniej 300 nukleotydów.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że unikalny region DNA ma wielkość od około 300 nukleotydów do 20 kb.
17.Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że unikalny region DNAma wielkość od 2 kb do 10 kb.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest rozszczepiony na przynajmniej trzy egzony.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną jest DNA bakteryjnym, DNA owadzim, DNAwirusowym albo DNAsyntetycznym.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że unikalny region DNA nie zawiera żadnych genów funkcjonalnych.
21 . Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Desmond” przedstawioną na fig. 7.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid kierujący obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Molly” przedstawioną na fig. 8 i przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 20.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid kierujący obejmuje sekwencje nukleotydowe plazmidu „Mandy” przedstawionego na fig. 10 i przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 23.
24. Układ wektorów do wprowadzania żądanego DNA w miejsce docelowe w genomie komórki ssaka, który obejmuje przynajmniej:
i) pierwszy plazmid („plazmid znacznikowy”) obejmujący następujące sekwencje:
PL 191 251 B1 (a) pierwszy fragment DNA, który obejmuje region DNA, który jest heterologiczny względem genomu komórki ssaka i który, gdy jest zintegrowany z genomem komórki ssaka, zapewnia unikalny region do rekombinacji homologicznej;
(b) drugi fragment DNA, który obejmuje region kodujący część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję;i (c) trzeci fragment DNA, który obejmuje region kodujący co najmniej jedno białko innego znacznika umożliwiającego selekcję, które jest różne niż białko pierwszego znacznika zapewnia selekcję komórek ssaka,do których genomu został wintegrowany plazmid znacznikowy; i ii) drugi plazmid („plazmid kierujący”), który obejmuje co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki i ponadto obejmuje następujące sekwencje:
(a) czwarty fragment DNA, obejmujący region DNA, który jest identyczny albo wystarczająco homologiczny z unikalnym regionem dla homologicznej replikacji w plazmidzie znacznikowym tak, żeten region DNA może rekombinować ze wspomnianym DNA plazmidu znacznikowego drogą rekombinacji homologicznej;
(b) piąty fragment DNA obejmujący region DNA kodujący część pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję białka, który jest różny od części białka znacznikowego kodowanego przez plazmid znacznikowy, przy czym aktywne białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest wytwarzane tylko gdy piąty fragment DNA kodujący część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie kierującym ulega ekspresji w powiązaniu z drugim fragmentem DNA kodującym część białka znacznikowego zawartego w plazmidzie znacznikowym.
25. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że region drugiego fragmentu DNA kodującego część białka pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję obejmuje co najmniej jeden egzon genu znacznika umożliwiającego selekcję białka.
26. Układ wektorów według zastrz. 25, znamienny tym, że piąty fragment DNAplazmidu kierującego obejmuje pozostałe egzony genu kodującego białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję, które nie są obecne w plazmidzie znacznikowym.
27. Układ wektorów według zastrz. 26, znamienny tym, że co najmniej jeden DNA, który należy wstawić do genomu komórki koduje pożądane białko i jest wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym.
28. Układ wektorów według zastrz. 26, znamienny tym, że DNA kodujący białko dominującego znacznika umożliwiającego selekcję, które jest inne niż białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest dalej wprowadzony pomiędzy egzony pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję zawartego w plazmidzie kierującym, co zapewnia równoczesną amplifikację DNA kodującego pożądane białko.
29. Układ wektorów według zastrz. 26, znamienny tym, że białko pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest wybrane z grupy składającej się z fosfotransferazy neomycynowej, dehydrogenazy histydynolowej, reduktazy dihydrofolianowej, fosfotransferazy higromycynowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, syntetazy glutaminowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.
30. Układ wektorów według zastrz. 27, znamienny tym, że żądanym białkiem jest białko ssaka.
31. Układ wektorów według zastrz. 30, znamienny tym, że białkiem jest immunoglobulina.
32. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że innym znacznikiem umożliwiającym selekcję zawartym w plazmidzie znacznikowym jest dominujący znacznik umożliwiający selekcję wybrany z grupy składającej się z dehydrogenazy histydynolowej, kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej, deaminazy adenozynowej, fosfotransferazy higromycynowej i syntetazy glutaminowej.
33. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że zapewnia wprowadzenie pożądanego DNA w miejsce docelowe w genomie komórki ssaka wybranej z grupy składającej się z komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki szpiczaka, komórki nerki oseska chomika, komórki COS, komórki NSO, komórki HeLa i komórki NIH 3T3.
34. Układ wektorów według zastrz. 33, znamienny tym, że komórką ssaka jest komórka CHO.
35. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że plazmid znacznikowy zawiera trzeci egzon genu fosfotransferazy neomycynowej, zaś plazmid kierujący zawiera pierwsze dwa egzony genu fosfotransferazy neomycynowej.
36. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że plazmid znacznikowy dalej obejmuje rzadką sekwencję endonukleazy restrykcyjnej, która jest wprowadzona w region homologii.
PL 191 251 B1
37. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że unikalny region DNA (a), zawarty wplazmidzie znacznikowym układu wektorów, który zapewnia rekombinację homologiczną, obejmuje przynajmniej 300 nukleotydów.
38. Układ wektorów według zastrz. 37, znamienny tym, że unikalny region DNA ma wielkość od około 300 nukleotydów do 20 kb.
39. Układ wektorów według zastrz. 38, znamienny tym, że unikalny region DNA ma wielkość od 2 kb do 10 kb.
40. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że DNA pierwszego znacznika umożliwiającego selekcję jest rozszczepiony na przynajmniej trzy egzony.
41. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że unikalny region DNA, który zapewnia rekombinację homologiczną jest DNA bakteryjnym, DNA owadzim, DNA wirusowym albo DNA syntetycznym.
42. Układ wektorów według zastrz. 41, znamienny tym, że unikalny region DNA nie zawiera żadnych genów funkcjonalnych.
43. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Diamond” pokazaną na fig.7.
44. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Molly” pokazaną na fig. 8 i przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 20.
45. Układ wektorów według zastrz. 24, znamienny tym, że plazmid znacznikowy obejmuje sekwencję nukleotydową plazmidu „Mandy” pokazaną na fig. 10 i przy czym plazmid kierujący ewentualnie pozbawiony jest sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptydy przeciwciała przeciw-CD 23.
PL335695A 1997-03-14 1998-03-09 Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów PL191251B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/819,866 US5830698A (en) 1997-03-14 1997-03-14 Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US09/023,715 US5998144A (en) 1997-03-14 1998-02-13 Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
PCT/US1998/003935 WO1998041645A1 (en) 1997-03-14 1998-03-09 Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL335695A1 PL335695A1 (en) 2000-05-08
PL191251B1 true PL191251B1 (pl) 2006-04-28

Family

ID=26697516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL335695A PL191251B1 (pl) 1997-03-14 1998-03-09 Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów

Country Status (21)

Country Link
US (3) US6413777B1 (pl)
EP (1) EP0981637B1 (pl)
JP (1) JP4128227B2 (pl)
CN (1) CN1175111C (pl)
AT (1) ATE296356T1 (pl)
AU (1) AU737155B2 (pl)
BR (1) BR9808584A (pl)
CA (1) CA2283740C (pl)
CZ (1) CZ293355B6 (pl)
DE (1) DE69830312T2 (pl)
ES (1) ES2242997T3 (pl)
ID (1) ID24565A (pl)
IL (1) IL131746A0 (pl)
IN (1) IN189732B (pl)
NO (1) NO994397L (pl)
PL (1) PL191251B1 (pl)
PT (1) PT981637E (pl)
RO (1) RO120148B1 (pl)
RU (1) RU2004107694A (pl)
TW (1) TWI232239B (pl)
WO (1) WO1998041645A1 (pl)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830698A (en) * 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
PT981637E (pt) * 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
WO2000039304A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB9912965D0 (en) * 1999-06-03 1999-08-04 Oxford Biomedica Ltd In vivo selection method
AU2400500A (en) * 1999-11-01 2001-05-14 Chiron Corporation Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
DK1297170T3 (en) * 2000-06-23 2016-03-14 Novozymes As A process for stable chromosomal integration of multiple copies of the genes
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP2005535282A (ja) 2001-11-16 2005-11-24 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション 抗体のポリシストロニック発現
US7164056B2 (en) * 2002-05-03 2007-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene targeting using replicating DNA molecules
CN101537180B (zh) 2002-07-18 2016-02-10 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
AU2003286684A1 (en) * 2002-10-30 2004-06-07 Gail Bishop Somatic cell gene targeting vectors and methods of use thereof
DE602004002275T2 (de) 2003-01-07 2007-09-06 Symphogen A/S Verfahren zur herstellung rekombinanterpolyklonaler proteine
DE10303937A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-12 Icon Genetics Ag Pflanzentransformation mit Assemblierung einer gewünschten Sequenz in Vivo
AU2004207177B2 (en) * 2003-01-31 2008-02-07 Bayer Cropscience N.V. Plant transformation with in vivo assembly of a trait
PL378582A1 (pl) 2003-03-19 2006-05-02 Biogen Idec Ma Inc. Białko wiążące receptor Nogo
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1626993B1 (en) * 2003-05-09 2015-03-11 Duke University Cd20-specific antibodies and methods of employing same
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
ES2408582T3 (es) 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
EP1641826A2 (en) * 2003-06-27 2006-04-05 Biogen Idec MA Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
CA2536807C (en) 2003-09-04 2010-07-13 Medarex, Inc. Expression vector
US7344753B2 (en) * 2003-09-19 2008-03-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nanostructures including a metal
US8030833B2 (en) * 2003-09-19 2011-10-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Electron emission device incorporating free standing monocrystalline nanowires
US7935862B2 (en) * 2003-12-02 2011-05-03 Syngenta Participations Ag Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination
DK1737971T3 (da) 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
AU2005258335B2 (en) 2004-06-24 2011-03-17 Biogen Ma Inc. Treatment of conditions involving demyelination
DK2053408T3 (da) 2004-07-20 2012-06-04 Symphogen As Fremgangsmåde til strukturel karakterisering af et rekombinant polyklonalt protein eller en polyklonal cellelinje
US7846438B2 (en) 2004-08-03 2010-12-07 Biogen Idec Ma Inc. Methods of promoting neurite outgrowth with soluble TAJ polypeptides
FR2879204B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
EP2311880A3 (en) 2005-01-05 2011-07-27 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
CN100381573C (zh) * 2005-04-14 2008-04-16 北京天广实生物技术有限公司 快速构建目标基因高表达的哺乳动物细胞株的体系和方法
MX2008000253A (es) 2005-07-08 2008-04-02 Biogen Idec Inc Anticuerpos de sp35 y usos de los mismos.
EP3138403A1 (en) 2005-08-09 2017-03-08 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
EP2510934A1 (en) 2005-11-04 2012-10-17 Biogen Idec MA Inc. Methods for promoting neurite outgrowth and survival of dopaminergic neurons
US20090175872A1 (en) 2005-12-02 2009-07-09 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of Conditions Involving Demyelination
US20070136826A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-14 Biogen Idec Inc. Anti-mouse CD20 antibodies and uses thereof
ES2550099T3 (es) 2006-01-27 2015-11-04 Biogen Ma Inc. Antagonistas del receptor Nogo
DK2426143T3 (en) 2007-01-05 2017-09-11 Univ Zuerich Process for providing disease-specific binding molecules and targets
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
PT2740744T (pt) 2007-01-09 2018-06-06 Biogen Ma Inc Anticorpos sp35 e suas utilizações
EP2114433B1 (en) 2007-02-02 2014-04-09 Biogen Idec MA Inc. Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
WO2009048605A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Biogen Idec Ma Inc. Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell, survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists
EP2217697B1 (en) * 2007-11-08 2015-06-10 Biogen MA Inc. Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
US20110119779A1 (en) * 2007-12-10 2011-05-19 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination
EP2315779A2 (en) * 2008-07-09 2011-05-04 Biogen Idec MA Inc. Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
US9346873B2 (en) 2008-09-30 2016-05-24 Ablexis, Llc Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
ES2544569T3 (es) 2008-12-19 2015-09-01 Biogen International Neuroscience Gmbh Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina
EP2382238A1 (en) 2008-12-31 2011-11-02 Biogen Idec MA Inc. Anti-lymphotoxin antibodies
RU2542394C2 (ru) 2009-03-24 2015-02-20 ТЕВА БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЮЭсЭй, ИНК. Гуманизированные антитела против light и их применение
WO2011040285A1 (ja) 2009-10-01 2011-04-07 Toto株式会社 Ｄｎａ構築物およびそれを用いた組み換えｃｈｏ細胞の製造方法
EP4345163A2 (en) 2010-03-31 2024-04-03 Ablexis, LLC Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
SG184903A1 (en) * 2010-04-30 2012-11-29 Temasek Life Sciences Lab Ltd Fragment switch: a reverse genetic approach
EP2591099B1 (en) 2010-07-09 2020-11-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
PL2627672T3 (pl) 2010-10-11 2018-11-30 Biogen International Neuroscience Gmbh Ludzkie przeciwciała anty-tau
DK2640743T3 (en) 2010-11-16 2017-01-23 Excelimmune Inc PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT PROTEINS
JP5209693B2 (ja) * 2010-12-10 2013-06-12 ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー Ｃｈｏ細胞において組換えタンパク質を発現する方法
US9283271B2 (en) 2010-12-17 2016-03-15 Neurimmune Holding Ag Human anti-SOD1 antibodies
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
US10233424B2 (en) 2011-12-22 2019-03-19 Elwha Llc Compositions and methods including cytotoxic B lymphocyte cell line expressing exogenous membrane immunoglobulin different from secreted immunoglobulin
US10745468B2 (en) 2011-12-22 2020-08-18 Kota Biotherapeutics, Llc Compositions and methods for modified B cells expressing reassigned biological agents
US9175072B2 (en) 2011-12-22 2015-11-03 Elwha Llc Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including an exogenously incorporated nucleic acid expressing an exogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including an endogenous gene expressing an endogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
US8962315B2 (en) 2011-12-22 2015-02-24 Elwha Llc Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including at least one endogenous gene expressing at least one endogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including at least one exogenously incorporated nucleic acid expressing at least one exogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
JP6559063B2 (ja) 2012-05-07 2019-08-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物
CN104470541A (zh) 2012-05-14 2015-03-25 比奥根艾迪克Ma公司 用于治疗涉及运动神经元的疾患的lingo-2拮抗剂
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc CHIMERIC COAGULATION FACTORS
EP2906240A2 (en) 2012-10-09 2015-08-19 Biogen MA Inc. Combination therapies and uses for treatment of demyelinating disorders
ES2816700T3 (es) 2012-12-21 2021-04-05 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-tau humanos
WO2014102399A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Neurimmune Holding Ag Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases
HRP20231183T1 (hr) 2013-02-15 2024-01-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani gen faktora viii
SG10201707600XA (en) 2013-03-15 2017-11-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
EP3201228A2 (en) 2014-09-30 2017-08-09 Neurimmune Holding AG Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
JP2018504400A (ja) 2015-01-08 2018-02-15 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用
CN106191040B (zh) * 2015-04-30 2021-09-14 杭州菁因康生物科技有限公司 基因打靶方法
MX2018001497A (es) 2015-08-03 2018-05-15 Bioverativ Therapeutics Inc Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas.
SI3411478T1 (sl) 2016-02-01 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimirani geni dejavnika VIII
WO2017214376A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Elwha Llc Compositions and methods including b lymphocyte cell line expressing membrane immunoglobulin different from secreted immunoglobulin and cytolytic function
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
AU2017297404A1 (en) 2016-07-13 2019-01-24 Biogen Ma Inc. Dosage regimens of LINGO-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
TW201831521A (zh) 2017-01-31 2018-09-01 美商生物化學醫療公司 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備方法及使用方法
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
US20210238289A1 (en) 2018-06-04 2021-08-05 Biogen Ma Inc. Anti-vla-4 antibodies having reduced effector function
CN110607326B (zh) * 2018-06-15 2022-11-29 江苏省农业科学院 非强启动式的外源基因表达法及其在具有毒性的目标蛋白表达中的应用
SG11202103111TA (en) * 2018-10-01 2021-04-29 Lonza Ag Ssi cells with predictable and stable transgene expression and methods of formation
KR20210126078A (ko) 2019-02-13 2021-10-19 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 항-말초 림프절 어드레신 항체 및 그의 용도
WO2023028455A1 (en) 2021-08-23 2023-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Closed-end dna production with inverted terminal repeat sequences
IL310997A (en) 2021-08-23 2024-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor VIII gene optimization
IL311725A (en) 2021-09-30 2024-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acids encoding factor VIII polypeptides with reduced immunogenicity

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5464764A (en) * 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
WO1991006666A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
MX9305183A (es) * 1992-08-27 1994-05-31 Us Agriculture Intron portatil, molecula de adn genomico viral, virus vivo y vacuna que los contiene y metodo para su obtencion.
US5648267A (en) * 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
US5830698A (en) * 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same

Also Published As

Publication number Publication date
CZ293355B6 (cs) 2004-04-14
CN1255166A (zh) 2000-05-31
NO994397D0 (no) 1999-09-10
IN189732B (pl) 2003-04-19
ID24565A (id) 2000-07-27
BR9808584A (pt) 2000-05-23
RU2004107694A (ru) 2005-08-27
JP4128227B2 (ja) 2008-07-30
PT981637E (pt) 2005-09-30
CA2283740C (en) 2006-06-27
PL335695A1 (en) 2000-05-08
RO120148B1 (ro) 2005-09-30
TWI232239B (en) 2005-05-11
ATE296356T1 (de) 2005-06-15
US20020192820A1 (en) 2002-12-19
CN1175111C (zh) 2004-11-10
EP0981637A1 (en) 2000-03-01
NO994397L (no) 1999-11-09
EP0981637B1 (en) 2005-05-25
JP2001516221A (ja) 2001-09-25
US7235360B2 (en) 2007-06-26
CA2283740A1 (en) 1998-09-24
DE69830312T2 (de) 2006-02-02
US20040166528A1 (en) 2004-08-26
WO1998041645A1 (en) 1998-09-24
US6413777B1 (en) 2002-07-02
ES2242997T3 (es) 2005-11-16
IL131746A0 (en) 2001-03-19
US6841383B2 (en) 2005-01-11
DE69830312D1 (de) 2005-06-30
AU6443598A (en) 1998-10-12
AU737155B2 (en) 2001-08-09
CZ316299A3 (cs) 2000-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL191251B1 (pl) Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów
KR100571105B1 (ko) 상동 재조합에 의해 포유동물 세포의 특정 부위에 유전자를 삽입시키는 방법 및 이를 달성하기 위한 벡터
WO1998041645A9 (en) Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
USRE49347E1 (en) Mammalian expression vector
KR100479146B1 (ko) 큰게놈dna결실유발법
US5578461A (en) Gene manipulation and expression using genomic elements
JP2003510072A (ja) 遺伝子発現を改変するための組成物および方法
CN114026224A (zh) 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
AU684275B2 (en) Method for defined deletions of DNA
MXPA99008363A (en) Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
AU2003205173B2 (en) A method for generating engineered cells for locus specific gene regulation and analysis
US11591383B2 (en) Method for selecting polypeptide producing cells

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090309