CN1175111C - 将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经由同源重组将所需DNA位点特异性地整合至哺乳动物细胞靶位点的方法，此方法能可再现地选择细胞系，在所述细胞系中，所需DNA被整合至已用标记质粒标记的预定的转录活性位点。此方法特别适用于产生哺乳动物细胞系，所述细胞系可高水平分泌哺乳动物蛋白质，尤其是免疫球蛋白。本发明也提供了此克隆方法中所用的载体和载体组合。

Description

将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体
发明领域
本发明涉及将所需外源DNA靶向整合至哺乳动物细胞基因组内的特定位置的方法，本发明更具体地描述了鉴定哺乳动物基因组中的转录活性靶位点(“热点”)并经同源重组将所需DNA插入此位点的新方法。通过使可扩增的选择性标记，如DHFR与外源DNA一起共整合，本发明还任选提供了此位置处所需DNA的基因扩增能力。本发明还描述了适于实现上述目的的新载体的构建，还提供了通过上述方法产生的哺乳动物细胞系，此细胞系含有整合至靶热点的所需外源DNA。
背景
在原核和真核生物体中表达重组蛋白的技术已发展成熟。哺乳动物细胞在蛋白质生产方面明显优于细菌或酵母，原因在于它们能正确装配，糖基化和翻译后修饰重组表达的蛋白质。转染至宿主细胞之后，重组表达构建体可作为染色体外的元件存在，或整合至宿主细胞基因组中。稳定转染的哺乳动物细胞系的产生通常包括下列步骤：将编码所需基因以及药物抗性基因(显性选择性标记)的DNA构建体导入宿主细胞，随后在药物的存在下培养以选择已成功整合外源DNA的细胞。在很多场合下，所需基因与随后可被基因扩增的药物抗性选择性标记相连。编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因是最常用的标记基因。在DHFR的竞争性抑制剂氨甲碟呤的存在下培养细胞会因DHFR基因的扩增导致DHFR的产量增加。由于DNA的侧翼区也可被扩增，经感染的细胞系中与DHFR相连基因的共扩增会导致蛋白质产量增加，从而导致所需基因的高水平表达。
尽管此方法经证明是成功的，但因整合事件的随机性使得该系统中仍存在很多问题。这些问题存在的原因是基因座处的局部基因环境的作用会大大影响表达水平，此现象在文献中有详细记载，一般称之为“位置效应”(例见Al-Shawi等，分子细胞生物学，10：1192-1198(1990)；Yoshimura等，分子细胞生物学，7：1296-1299(1987))。由于绝大多数哺乳动物DNA处于无转录活性的状态，随机整合法无法控制整合DNA的转录状况，结果，因整合位点的不同，整合基因的表达水平差异很大。例如，外源DNA整合至基因组的无活性或转录“沉默”区会导致很少或不表达。而与之形成对照的是，整合至转录活性位点会导致高表达。
因此，当工作目标是得到高水平的基因表达时，这也是基因工程方法典型的所需结果，一般必需筛选大量转染子以找到这种高产量的克隆。另外，外源DNA随机整合至基因组在某些情况下会破坏重要的细胞基因，导致表型改变。这些因素使高表达的稳定哺乳动物细胞系的产生变得复杂和费力。
最近，我们实验室描述了含有翻译受损显性选择性标记的DNA载体在哺乳动物基因表达中的使用(公开于1993年11月3日提交的美国流水号08/147,696，最近已授权)。
这些载体含有翻译受损的新霉素磷酸转移酶(neo)基因作为显性选择性标记，经人工改造后含有内含子，其中插入了DHFR基因以及一个或多个所需基因。我们发现相对于常规哺乳动物表达载体而言，将这些载体用作表达构建体可显著降低所产生的药物抗性集落的总数，从而便于进行筛选。另外，使用此系统得到的较高比例的克隆是高表达克隆。这些结果明显归功于对neo选择性标记所作的修饰。由于neo基因的翻译受损，被转染的细胞不能产生足够的neo蛋白以在药物选择中存活，从而使药物抗性集落的总数减少。另外，较高百分比的存活克隆含有整合至基因组位点的表达载体，该位点处基础转录水平高，导致neo过量产生，从而使细胞能克服neo基因受损所带来的问题。同时，与neo相连的所需基因也会类似地提高转录水平。neo内产生人工内含子的结果使这一相同的优点也是真实的；存活取决于功能性neo基因的合成，而neo基因的合成反过来又取决于neo内含子正确和有效的剪接。另外，如果载体DNA被整合至已具有高转录活性的区域则更有可能符合这些标准。
载体整合至转录活性区域之后，通过DHFR基因选择进行基因扩增。使用此系统，可以得到使用低水平氨甲碟呤(50nM)选择的克隆，所述克隆含有几(＜10)拷贝分泌高水平蛋白质(＞55pg/细胞/天)的载体。另外，可以在相对较短的时间内获得上述克隆。然而，扩增的成功是可变的。一些转录活性位点不能被扩增，因此，由特定位点扩增的频率和程度是不可预测的。
总的说来，相对于随机整合的其它方法而言，使用这些翻译受损的载体的方法有显著改善。然而，如上所述，对整合位点缺乏控制的问题仍然是显著的。
克服随机整合问题的一个方法是利用基因靶向，籍此，外源DNA被靶向至宿主基因组内的特定基因座。利用表达载体中的DNA序列和基因组中相应同源序列之间发生的同源重组插入外源DNA。然而，尽管在酵母和其它真菌生物体中自然发生此类重组的频率较高，但在高等真核生物体中，此类重组的频率极低。据报道，在哺乳动物细胞中，同源对非同源(随机整合)重组的频率范围为1/100至1/5000(例见Capecchi，科学，244：1288-1292(1989)；Morrow和Kucherlapati，Curr.Op.Biotech.，4：577-582(1993))。
描述哺乳动物细胞同源重组的最早报道之一包括在小鼠成纤维细胞中产生的人工系统(Thomas等，细胞，44：419-428(1986))。产生了含有整合至宿主基因组中的突变的，非功能性形式的neo基因的细胞系，随后用第二个含有不同突变的非功能性neo拷贝靶向该细胞系。只有通过基因靶向才能进行功能性neo基因的重构。通过选择G418抗性细胞来鉴定同源重组体，通过分析分离自抗性克隆的基因组DNA进一步确证之。
最近，使用同源重组取代分泌抗体的细胞中内源性基因座处的重链和轻链免疫球蛋白基因已有报道(美国专利5,202,238，Fell等，1993)。然而，这一特别的方法未能广泛应用，因为该方法局限于在内源性表达免疫球蛋白的细胞，如B细胞和骨髓瘤细胞中产生免疫球蛋白。由于未能包括同源重组之后的共扩增，表达也只局限于单拷贝基因水平。产生功能性免疫球蛋白需要两个独立的整合事件：一个为轻链基因所用，一个接着为重链基因所用，这一事实使该方法进一步复杂化。
在NS/0细胞中报道了这一类型系统的另一例子，其中通过免疫球蛋白γ2A基因座内的同源重组表达了重组免疫球蛋白(Hollis等，国际专利申请#PCT/IB95(00014).)。得自此位点的表达水平十分高，单拷贝整合体大约为20pg/细胞/天。然而，与上述例子相同，表达仅局限于此水平，因为可扩增的基因未共整合至此系统中。据其它研究人员报道，NS/0细胞中表达的重组蛋白糖基化异常(例见Flesher等，Biotech.andBioeng.，48：399-407(1995))，从而限制了此方法的实用性。
最近，噬菌体P1的cre-loxP重组系统被改造并用作真核细胞中基因靶向的工具。具体地说，描述了使用cre重组酶和一系列含lox的载体将外源DNA位点特异性地整合至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞基因组(Fukushige和Sauer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：7905-7909(1992))。此系统吸引人的原因是它可在相同染色体位置处提供可再现的表达。然而，未致力于鉴定最适于基因表达的染色体位点，而且，与上述例子相同，此系统中的表达局限于单拷贝水平。需要在哺乳动物细胞中表达功能性重组酶这一事实也使问题复杂化。
据报道，被导入的DNA序列及其内源性染色体基因座之间同源重组的使用提供了在哺乳动物细胞以及酵母细胞中进行基因操作的有用工具(例见Bradley等，Meth.Enzymol.，223：855-879(1993)；Capecchi，科学，244：1288-1292(1989)；Rothstein等，Meth.Enzymol.，194：281-301(1991))。迄今为止，大多数哺乳动物基因靶向研究针对的是小鼠胚胎干(ES)细胞中选定靶基因基因座的基因破坏(“敲除”)或位点特异性诱变。这些“敲除”小鼠模型的产生使得科学家们能检查特异性的结构-功能关系，并检查大量小鼠基因的生物学重要性。这一研究领域与潜在的基因疗法应用也有重要的关联。
最近，Celltech(Kent，U.K.)也报道了载体，据称该载体靶向不需要基因扩增的NSO细胞的转录活性位点(Peakman等，Hum.Antibod.Hybridomas，5：65-74(1994))。然而，据报道这些未扩增细胞中的免疫球蛋白分泌水平不超过20pg/细胞/天，而在扩增的CHO细胞中，水平高达100pg/细胞/天(文献同上)。
开发基因靶向系统是非常必要的，该系统应能可再现地将外源DNA整合至已知具有转录活性的基因组预定位点。也有必要使这种基因靶向系统进一步便于整合后共扩增插入的DNA。这种系统的设计应能允许任何所需克隆基因在哺乳动物细胞中可再现的和高水平的表达，毫无疑问，很多研究人员对此很感兴趣。
在本申请中，我们基于两个不同载体中所含的两个人工底物(substrate)之间发生的同源重组，提供了新的哺乳动物表达系统。具体地说，此系统联合使用了两个新的哺乳动物表达载体，它们被称为“标记”载体和“靶向载体”。
实质上，标记载体可以鉴定和标记哺乳动物基因组中具有转录活性的位点，即基因表达水平高的位点。此位点可被看作是基因组中的“热点”。标记载体整合之后，本申请的表达系统利用两个载体共有的DNA序列之间发生的同源重组使另一DNA整合至此位点，即靶向载体。此系统显著优于其它同源重组系统。
与哺乳动物细胞中使用的大多数其它同源系统不同的是，此系统未表现出背景，因此，仅被载体随机整合的细胞不会在选择中存活，任何克隆至靶向质粒的所需基因都从标记的热点处开始高水平的表达。因此，本发明的基因表达方法基本上或完全消除了上文曾详细讨论的随机整合系统内部存在的问题。另外，此系统使得任何重组蛋白质能在哺乳动物基因组的相同转录活性位点可再现地和高水平地表达。通过使可扩增的显性选择标记(如DHFR)成为标记载体的一部分，可在此特定的转录活性位点处实现基因扩增。
发明目的
因此，本发明的目的是提供一改良的方法，以将所需DNA靶向至哺乳动物细胞的特定位点。
本发明另一个具体的目的是提供一新的方法，以经由同源重组将所需DNA靶向至哺乳动物细胞的特定位点。
本发明另一个具体的目的是提供一新的载体，以使所需DNA在哺乳动物细胞中能实现位点特异性整合。
本发明另一个具体的目的是提供一新的哺乳动物细胞系，所述细胞系中含有整合至可提供高表达的预定位点的所需DNA。
本发明另一个具体的目的是提供一新的方法，以使所需DNA在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中能实现位点特异性整合。
本发明另一个具体的目的是提供一新的方法，以使免疫球蛋白基因，或任何其它基因能整合至哺乳动物细胞中可提供高表达的预定染色体位点。
本发明另一个具体的目的是提供一新的载体和载体组合，所述载体适用于将免疫球蛋白基因整合至哺乳动物细胞中可提供高表达的预定位点。
本发明另一个具体的目的是提供一新的哺乳动物细胞系，所述细胞系中含有整合至可提供高表达的预定位点的免疫球蛋白基因。
本发明另一个具体的目的是提供一新的方法，以使免疫球蛋白基因整合至可提供高表达的CHO细胞，以及提供新的载体和载体组合，使免疫球蛋白基因可整合至CHO细胞中。
另外，本发明另一个具体的目的是提供一新的CHO细胞系，所述细胞系中含有整合至可提供高表达的预定位点的免疫球蛋白基因，该细胞系已经氨甲碟呤选择扩增可分泌更多的功能性免疫球蛋白。
具体来说，本发明涉及：
1).在分离的哺乳动物细胞基因组的靶位点插入所需DNA的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)用标记质粒转染或转化分离的哺乳动物细胞，所述质粒含有下列序列：
(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，可为同源重组提供独一无二的位点；
(b)编码第一个选择标记蛋白部分的DNA片段的第一部分；和
(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；
(ii)通过筛选至少一种其它选择标记而选择含有标记质粒的细胞，所述质粒已整合至该细胞的基因组中；
(iii)用靶向质粒转染或转化所述选定细胞，所述质粒含有下列序列：
(a)DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述独一无二的区域重组；
(b)编码与标记质粒中所含选择标记相同的选择标记部分的DNA片段的第二部分，其中仅当所述第二部分与第一选择标记蛋白的第一部分联合表达时，才会产生第一选择标记蛋白；和
(iv)通过筛选第一个选择标记蛋白的表达选择出含有靶向质粒的细胞，所述质粒整合至靶位点。
2).上述1)的方法，其中编码第一个选择标记片段的DNA片段是显性选择标记的一个外显子。
3).上述2)的方法，其中靶向质粒含有所述第一个选择标记的其余外显子。
4).上述3)的方法，其中至少一种编码所需蛋白质的DNA被插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间。
5).上述4)的方法，其中还将编码显性选择标记的DNA插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间以共扩增编码所需蛋白质的DNA。
6).上述3)的方法，其中第一个显性选择标记选自由新霉素磷酸转移酶，组氨醇脱氢酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素磷酸转移酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，腺苷脱氨酶，谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶组成的组。
7).上述4)的方法，其中所需蛋白质是哺乳动物蛋白质。
8).上述7)的方法，其中蛋白质是免疫球蛋白。
9).上述1)的方法，其进一步包括在整合靶向载体之前，测定标记质粒中所含权利要求1中步骤(i)(c)中DNA的RNA水平。
10).上述9)的方法，其中标记质粒中所含的其它选择标记是显性选择标记，它选自由组氨醇脱氢酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，潮霉素磷酸转移酶，腺苷脱氨酶和谷氨酰胺合成酶组成的组。
11).上述1)的方法，其中哺乳动物细胞选自由中国仓鼠卵巢细胞，骨髓瘤细胞，幼仓鼠肾细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞和NIH 3T3细胞组成的组。
12).上述11)的方法，其中细胞是CHO细胞。
13).上述1)的方法，其中标记质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的第三个外显子，靶向质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的前两个外显子。
14).上述1)的方法，其中标记质粒还含有一个不常见的限制性内切核酸酶序列，所述序列被插入同源性区域内。
15).上述1)的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，病毒DNA或合成的DNA。
16).上述1)的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域至少为300个核苷酸。
17).上述16)的方法，其中独一无二的DNA区域的大小范围约为300个核苷酸至20个千碱基。
18).上述17)的方法，其中独一无二的DNA区域的大小范围为2至10个千碱基。
19).上述1)的方法，其中第一个选择标记DNA至少被分成3个外显子。
20).上述1)的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，昆虫DNA，病毒DNA或合成的DNA。
21).上述20)的方法，其中独一无二的DNA区域不含任何功能性基因。
22).将所需DNA插入哺乳动物细胞基因组靶位点的载体系统，该系统中至少含有下列：
(i)标记质粒，它至少含有下列序列：
(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，可为同源重组提供独一无二的位点；
(b)编码第一个选择标记蛋白之一部分的DNA片段；和
(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；和
(ii靶向质粒，它至少含有下列序列：
(a)一个DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述独一无二的区域重组；
(b)编码与标记质粒中所含选择标记相同的选择标记部分的DNA片段，其中仅当所述片段与标记质粒中所含的所述选择标记DNA片段联合表达时，才会产生由所述DNA编码的活性选择标记蛋白。
23).上述22)的载体系统，其中编码第一个选择标记蛋白之一部分的DNA片段是显性选择标记的一个外显子。
24).上述23)的载体系统，其中靶向质粒含有所述第一个选择标记的其余外显子。
25).上述24)的载体系统，其中至少一种编码所需蛋白质的DNA被插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间。
26).上述24)的载体系统，其中还将编码显性选择标记的DNA插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间以共扩增编码所需蛋白质的DNA。
27).上述24)的载体系统，其中第一个显性选择标记选自由新霉素磷酸转移酶，组氨醇脱氢酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素磷酸转移酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，腺苷脱氨酶，谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶组成的组。
28).上述25)的载体系统，其中所需蛋白质是哺乳动物蛋白质。
29).上述28)的载体系统，其中蛋白质是免疫球蛋白。
30).上述22)的载体系统，其中标记质粒中所含的其它选择标记是显性选择标记，它选自由组氨醇脱氢酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，潮霉素磷酸转移酶，腺苷脱氨酶和谷氨酰胺合成酶组成的组。
31).上述22)的载体系统，它帮助所需细胞插入哺乳动物细胞基因组的靶位点，所述哺乳动物细胞选自由中国仓鼠卵巢细胞，骨髓瘤细胞，幼仓鼠肾细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞和NIH 3T3细胞组成的组。
32).上述31)的载体系统，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
33).上述22)的载体系统，其中标记质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的第三个外显子，靶向质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的前两个外显子。
34).上述22)的载体系统，其中标记质粒还含有一个不常见的限制性内切核酸酶序列，所述序列被插入同源性区域内。
35).上述22)的载体系统，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，病毒DNA或合成的DNA。
36).上述22)的载体系统，其中标记质粒载体系统中所含的提供同源重组的独一无二的、权利要求1中(i)(a)的DNA区域至少为300个核苷酸。
37).上述36)的载体系统，其中独一无二的DNA区域的大小范围约为300个核苷酸至20个千碱基。
38).上述37)的载体系统，其中独一无二的DNA区域的大小范围为2至10个千碱基。
39).上述22)的载体系统，其中第一个选择标记DNA至少被分成3个外显子。
40).上述22)的载体系统，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，昆虫DNA，病毒DNA或合成的DNA。
41).上述40)的载体系统，其中独一无二的DNA区域不含任何功能性基因。
附图简述
图1表示本发明中被称为Desmond的标记质粒的图谱。质粒以环状(1A)以及用于转染的线性化形式(1B)表示。
图2(A)表示被称为“Molly”的靶向质粒的图谱。按图示，Molly编码抗CD20免疫球蛋白基因，其表达描述于实施例1。
图2(B)表示Molly经限制性酶KpnI和PacI消化后的线性化形式。此线性化形式可用于转染。
图3表示整合至CHO基因组的Desmond序列和进来的靶向Molly序列之间潜在的序列对比。还显示出在同源重组之后整合至Desmond的Molly的一个可能发生的排布。
图4显示出单拷贝Desmond克隆的Southern分析。样品如下：
泳道1：λHindIII DNA大小标记物
泳道2：Desmond克隆10F3
泳道3：Desmond克隆10C12
泳道4：Desmond克隆15C9
泳道5：Desmond克隆14B5
泳道6：Desmond克隆9B2
图5显示出单拷贝Desmond克隆的Northern分析。样品如下：A系列：如图所示，用CAD和DHFR探针探测的Northern。B系列：如图所示，用CAD和HisD探针探测的双份Northern。A和B系列中上样的RNA样品如下：泳道1：克隆9B2，泳道2：克隆10C12，泳道3：克隆14B5，泳道4：克隆15C9，泳道5：得自被含有HisD和DHFR的质粒转染的CHO的对照RNA，泳道6：未转染的CHO。
图6表示Molly同源整合至Desmond所得克隆的Southern分析。样品如下：
泳道1：λHindIII DNA大小标记物，泳道2：20F4，泳道3：5F9，泳道4：21C7，泳道5：24G2，泳道6：25E1，泳道7：28C9，泳道8：29F9，泳道9：39G11，泳道10：42F9，泳道11：50G10，泳道12：用BglII线性化(最靠上的带)，并用BglII和KpnI切割(下面的带)的Molly质粒DNA，泳道13：未转染的Desmond。
图7A至7X为Desmond的序列表。
图8A至8X为含有Molly的抗CD20的序列表。
图9为靶向质粒“Mandy”的图谱，据图示，该质粒编码抗CD23基因，其表达描述于实施例5。
图10A至10U为实施例5所述的含有抗CD23基因的“Mandy”序列表。
发明详述
本发明提供了经由同源重组将所需外源DNA整合至哺乳动物细胞基因组内的靶位点的新方法。本发明还提供了能使DNA位点特异性整合至哺乳动物细胞基因组靶位点的新载体。
更具体地说，本发明的克隆方法通过先用“标记质粒”，接着用“靶向质粒”转染哺乳动物细胞而使所需DNA位点特异性地整合至所述细胞中，所述标记质粒含有对哺乳动物细胞基因组而言为外源的独一无二序列，并可为同源重组提供底物，所述靶向质粒含有可与标记质粒中所含独一无二序列同源重组的序列，还含有需整合至哺乳动物细胞的所需DNA。整合的DNA一般编码所需的蛋白质，如免疫球蛋白或其它分泌的哺乳动物糖蛋白。
例举的同源重组系统使用新霉素磷酸转移酶基因作为显性选择标记。这一特定标记物的应用是基于以下已知的观察结果：
(i)能靶向和恢复突变形式的neo基因(前述)的功能，和
(ii)我们开发了翻译受损的表达载体，其中neo基因被人工制备为两个外显子，而所需基因被插入间插的内含子中；neo外显子在体内经正确剪接和翻译，产生功能性蛋白质，籍此将G418抗性赋予所得细胞群体。在本申请中，neo基因被分成3个外显子。第三个neo外显子存在于“标记”质粒上，因标记质粒整合至哺乳动物细胞中而随之整合至宿主细胞基因组中。外显子1和2存在于靶向质粒中，并被其中克隆了至少一个所需基因的间插内含子分开。靶向质粒与整合的标记质粒之间的同源重组使得neo基因的3个外显子都能正确剪接，从而能表达功能性的neo蛋白(由对G418抗性集落的选择测定)。在设计本申请的表达系统之前，我们已经实验性地检测了这种三重剪接的neo构建体在哺乳动物细胞中的功能性。这一对照实验的结果表明3个neo外显子都被正确剪接，由此说明了本发明的可行性。
然而，尽管本发明例举的是neo基因，更具体地是分成三份的neo基因，但一般的方法学对其它显性选择标记也是有效的。
如下文之详述，本发明为传统的基因表达方法提供了很多优点，包括随机整合和基因靶向方法。具体地说，本发明提供了能可再现地使所需DNA位点特异性地整合至哺乳动物细胞的转录活性区域的方法。另外，本发明的方法导入了人工“同源性”区域，该区域可用作同源重组和所需DNA插入的独一无二底物，因此，本发明的效力不需要细胞内源性地含有或表达特定的DNA。该方法普遍适用于所有哺乳动物细胞，并可用于表达任何形式的重组蛋白质。
三重剪接的选择标记，如例举的三重剪接的neo构建体的应用确保产生的所有G418抗性集落是由同源重组事件产生的(随机整合体不会产生功能性的neo基因，因此不会在G418选择中存活)。因此，本发明使得筛选所需的同源重组事件变得容易。另外，已发生过同源重组的细胞中再发生其它随机整合的频率较低。
如上所述，本发明的显著优点显然是显著减少了需经筛选以鉴定高产克隆的集落数目，所述高产克隆即为含有所需DNA，可高水平分泌相应蛋白质的细胞系。一般水平上，筛选约5至20个集落即可鉴定出含有整合的所需DNA的克隆(而使用标准的随机整合技术需筛选几千个集落，使用前述的内含子插入载体需筛选几百个集落)。另外，由于整合位点是预先选定的，并含有转录活性区域，在此位点表达的所有外源DNA应能产生相当多的，即高水平的所需蛋白质。
另外，本发明的有利之处还在于通过标记载体的整合插入了可扩增的基因。因此，当所需基因经由同源重组靶向此位点时，本发明通过基因扩增使基因表达进一步增强。在这点上，据文献报道，不同基因组位点的基因扩增能力不同(Meinkoth等，分子细胞生物学，7：1415-1424(1987))。因此，此技术的有利之处还在于可以将所需基因放置于具有转录活性并易于扩增的特定位点，这应可以显著减少分离这种高产细胞系所需的时间。
具体地说，尽管构建高表达哺乳动物细胞系的常规方法需费时6至9个月，本发明分离这种克隆一般仅需费时约3至6个月。这可以归结为这样一个事实，即常规分离的克隆一般必须经过至少三轮药物抗性基因扩增才能达到令人满意的基因表达水平。由于同源重组产生的克隆是从预先选定的高表达位点处产生的，因此仅需较少轮扩增即可达到令人满意的生产水平。
本发明还能可再现地选择高产克隆，所述克隆中整合有低拷贝数，一般为单拷贝数的载体。其优点在于增强了克隆的稳定性，并可避免与高拷贝数相关的其它潜在的有害副作用。如上所述，本发明的同源重组系统联合使用了下文详述的“标记质粒”和“靶向质粒”。
用于标记和鉴定转录热点的“标记质粒”至少含有下列序列：
(i)相对于哺乳动物细胞基因组而言为异源的或独一无二的DNA区域，该DNA区域可用作同源性的来源，能允许(与第二个靶向质粒中所含的DNA的)同源重组发生。更具体地说，独一无二的DNA区域(i)一般含有不常存在于哺乳动物细胞基因组中的细菌，病毒，酵母合成的或其它的DNA，所述DNA与哺乳动物细胞基因组中所含的DNA不具有显著的同源性或序列同一性。实质上，此序列应与哺乳动物DNA尽量不同，以使其不会经由同源重组与宿主细胞基因组显著重组。这种独一无二的DNA的大小一般至少约为2至10千碱基，或更大，更优选至少约为10kb，因为几个其他的研究人员提到当同源区域的大小增加时，靶向重组的频率也随之增加(Capecchi，科学，244：1288-1292(1989))。
上述独一无二的DNA可用作与第二个靶向载体中的序列进行同源重组的位点，其大小的上限在很大程度上受潜在的稳定性限制因素(如果DNA太大，不易于整合至染色体中)和处理很大DNA时的困难所约束。
(ii)包括选择标记DNA片段的DNA，所述片段一般为显性选择标记基因的外显子。此DNA的唯一必要特征是除了与靶向质粒中所含的序列联合表达外，它不编码功能性的选择标记蛋白。靶向质粒一般含有(“靶向”质粒中不含的那些)显性选择标记基因的其余外显子。实质上，如果发生了同源重组(导致此标记DNA(i)序列与靶向质粒中所含的选择标记DNA片段部分联合并表达)才会产生功能性的选择标记。
如上所述，本发明例举了被“分成”两个载体的新霉素磷酸转移酶基因作为显性选择标记的应用。然而，其它选择标记也是适用的，如沙门氏菌属组氨醇脱氢酶基因，潮霉素磷酸转移酶基因，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，腺苷脱氨酶基因，谷氨酰胺合成酶基因和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因。
(iii)编码功能性选择标记蛋白的DNA，此选择标记不同于选择标记DNA(ii)。此选择标记可成功地选择出其中标记质粒已成功整合至细胞DNA的哺乳动物细胞。更优选标记质粒含有两个这种显性选择标记DNA，所述DNA被置于载体相反的末端。其有利之处在于可使用不同的选择剂选择整合体，还可选择出含有整个载体的细胞。另外，一个标记可以是上述便于基因扩增的可扩增标记。(ii)中所列的任何显性选择标记可以同现有技术中公知的其它选择标记一样被使用。
另外，标记质粒还任选含有一个不常见的内切核酸酶限制性位点。由于其便于裂解，所以可能是必需的。这种不常见的限制性位点如果存在的话，应被置于用作同源重组底物的独一无二的区域的中间附近。优选此序列至少约为12个核苷酸。据报道，由类似方法学导入双链断裂会增强同源重组的频率(Choulika等，分子细胞生物学，15：1968-1973(1995))。然而，此序列的存在不是必需的。
“靶向质粒”至少含有下列序列：
(1)DNA独一无二的区域，该区域与标记质粒中所含DNA的独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性或序列同一性以使所述DNA能通过与标记质粒中的独一无二的区域(i)进行同源重组而组合在一起。在上文对标记质粒中DNA独一无二的区域(i)的说明中描述了适当类型的DNA。
(2)显性选择标记的其余外显子，其中一个外显子与上述标记质粒中的(ii)相同。此DNA片段的必要特征是仅当靶向质粒经由同源重组(其中该重组导致此DNA与标记质粒中所含的其它选择标记DNA片段联合)整合时才会产生功能性(选择)标记蛋白，另外，此DNA片段中还可插入所需外源DNA。此DNA一般含有选择标记DNA的其余外显子，它们被内含子隔开。例如，此DNA可含有neo基因的前两个外显子，标记质粒可含有第三个外显子(neo的后面第三个外显子)。
(3)靶向质粒也可含有所需DNA，如编码所需多肽的DNA，优选该DNA插入质粒所含的选择标记DNA片段内。DNA一般插入选择标记DNA外显子之间所含的内含子中。这可确保靶向质粒和标记质粒之间发生同源重组时所需DNA也可被整合。所述内含子可以是天然的，或被改造成显性选择标记DNA片段。
此DNA可编码任何所需的蛋白质，优选编码具有药物或其它所需特性的蛋白质。最优选此DNA编码哺乳动物蛋白质，在本文所述的实施例中为免疫球蛋白或免疫粘附素。然而，本发明并不局限于产生免疫球蛋白。
如上所述，本发明的克隆方法适用于任何哺乳动物细胞，因为其效力无需任何特定哺乳动物序列的存在。这种哺乳动物细胞一般包括常用于蛋白质表达的细胞，如CHO细胞，骨髓瘤细胞，COS细胞，BHK细胞，Sp2/0细胞，NIH 3T3细胞和HeLa细胞。在以下实施例中，使用了CHO细胞。其优点包括适当培养基的可得性，有效生长并能达到高培养密度的能力，和表达生物活性形式的哺乳动物蛋白质，如免疫球蛋白的能力。
另外，之所以选择CHO细胞大半是因为本发明人以前就使用过这种细胞来表达免疫球蛋白(使用了上述载体，其中含有翻译受损的显性选择标记)。因此，本实验室对使用这种细胞进行表达具有丰富经验。然而，根据下列实施例，可以合理地预期用其它哺乳动物细胞也可得到类似的结果。
一般来说，根据常规方法即可实现本发明哺乳动物细胞的转化或转染。为了更好地理解本发明，下文实施例中将描述例举载体的构建及其产生整合体的用途。
                         实施例1
              设计和制备标记和靶向质粒DNA载体
本文被称之为“Desmond”的标记质粒由下列DNA元件装配而成：
(a) 鼠二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，其被掺入转录盒中，并在DHFR起始位点的5’端含有小鼠β珠蛋白启动子，在DHFR终止密码子的3’端含有牛生长激素聚腺苷酸化信号。DHFR转录盒分离自本实验室以前构建的表达载体TCAE6(Newman等，1992，生物技术，10：1455-1460)。
(b)大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因，可商购自Promega，其商品名为pSV-b-半乳糖苷酶对照载体，目录号为#E1081。
(c)杆状病毒DNA，可商购自Clontech，其商品名为pBAKPAK8，目录号为#6145-1。
(d)含有巨细胞病毒和SV40病毒启动子和增强子元件的盒，该盒是使用表达载体TCAE8的衍生物，经PCR产生的(Reff等，血液，83：435-445(1994))。增强子盒被插入杆状病毒序列中，该序列已通过插入多克隆位点而预先得以修饰。
(e)大肠杆菌GUS(葡糖醛酸酶)基因，可商购自Clontech，其商品名为pB101，目录号为#6017-1。
(f)萤火虫萤光素酶基因，可商购自Promega，其商品名为pGEM-Luc(目录号为#E1541)。
(g)鼠伤寒沙门氏菌组氨醇脱氢酶基因(HisD)，此基因原为赠品(Donahue等，基因，18：47-59(1982))，随后被掺入转录盒中，该基因的5’端为小鼠β珠蛋白主要启动子，3’端为SV40聚腺苷酸化信号。
(a)-(g)所述的DNA元件被组建于衍生自pBR的质粒骨架中，产生了一段7.7kb的邻接DNA序列，附图中称之为“同源性”。此意义上的同源性指的是非哺乳动物基因组部分的DNA序列，可用于促进享有相同同源性DNA序列的转染质粒之间的同源重组。
(h)TN5的新霉素磷酸转移酶基因(Davis和Smith，Ann.Rev.Micro.，32：469-518(1978))。完整的neo基因被亚克隆至pBluescript SK-(Stratagene目录号为#212205)以便于基因操作。然后将合成的接头插入独一无二的PstI位点，该位点位于neo氨基酸密码子51和52处。此接头编码产生neo基因内人工剪接供体位点，间插内含子和剪接受体位点所必需的DNA元件，因而产生了两个分离的外显子，本文称之为neo外显子1和2。neo外显子1编码neo的前51个氨基酸，而外显子2编码其余的203个氨基酸加上蛋白质的终止密码子。内含子中也产生了一个NotI克隆位点。
neo外显子2被进一步次分，产生neo外显子2和3。方法如下：设计一套PCR引物以扩增编码neo外显子1，内含子和外显子2的前111 2/3个氨基酸的DNA区域。3’PCR引物可紧接外显子2氨基酸111密码子的第二个核苷酸之后导入新的5’剪接位点，从而产生新的较小的外显子2。然后将编码原来的外显子1，内含子和新的外显子2的DNA片段亚克隆至基于pBR的载体，并在其中增殖。将原来的外显子2的其余部分用作另一轮PCR扩增的模板，该PCR可产生“外显子3”。这一轮PCR扩增的5’引物在新产生的外显子3的5’端，即氨基酸111密码子最后一个核苷酸之前导入了新的剪接受体位点。所得的3个neo外显子编码下列信息：外显子1-neo的前51个氨基酸；外显子2-接下来的111 2/3个氨基酸；外显子3-最后的91 1/3个氨基酸加上neo基因的翻译终止密码子。
neo外显子3与上述DNA元件一起被掺入标记质粒“Desmond”。neo外显子1和2被掺入靶向质粒“Molly”。在随后的克隆步骤中使用了于外显子1和2之间的内含子内产生的NotI克隆位点以将所需基因插入靶向质粒。
还产生了第二个靶向质粒“Mandy”，此质粒与“Molly”几乎相同(载体上的一些限制性位点已经改变)，不同之处是“Molly”中所含的原先的HisD和DHFR基因被灭活。掺入这些变化的原因是Desmond细胞系再也不会在组氨醇存在的条件下培养，因此似乎没必要包括第二个HisD基因拷贝。另外，DHFR基因被灭活以确保仅有单个DHFR基因，即Desmond标记位点存在的那个基因能在任何最终细胞系中扩增。通过下列修饰，由“Molly”衍生出“Mandy”：
(i)将合成的接头插入DHFR编码区的中间，此接头产生终止密码子并将DHFR编码区的其余部分移出读码框，从而使基因失去功能。
(ii)部分HisD基因被缺失，并由PCR产生的HisD片段取代之，该片段缺乏基因的启动子和起始密码子。
图1表示这些DNA元件在标记质粒“Desmond”中的排布，图2表示这些元件在第一个靶向质粒“Molly”中的排布，图3表示Molly DNA靶向并整合至Desmond标记的CHO细胞中后，多个DNA元件在CHO基因组中可能的排布。图9表示靶向质粒“Mandy”。
根据常规的克隆技术可由上述DNA元件构建标记和靶向质粒(例见分子克隆，实验室手册，J.Sambrook等，1987，冷泉港实验室出版社，分子生物学最新方法，F.M.Ausubel等编，1987，John Wiley和Sons)。在大肠杆菌XLI blue(Stratagene，目录号为#200236)中增殖并维持所有质粒。使用Promega Wizard Maxiprep DNA纯化系统_，根据厂商说明制备大量质粒制品。
                       实施例2
                构建标记的CHO细胞系
1.产生标记的CHO细胞系的细胞培养和转染方法
37℃下，用Bst1107I消化过夜以使标记质粒DNA线性化。用乙醇沉淀线性化的载体，并将其重新悬浮于无菌的TE中使其浓度为1mg/ml。按下述通过电穿孔将线性化的载体导入DHFR-中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，DG44细胞(Urlaub等，Som.Cell and Mol.Gen.，12：555-566(1986))。
离心收获指数生长的细胞，用冰冷的SBS(蔗糖缓冲溶液，272mM蔗糖，7mM磷酸钠，pH7.4，1mM氯化镁)洗涤1次，然后重新悬浮于SBS中使其浓度为107个细胞/ml。于冰上保温15分钟后，在一次性电泳槽中将0.4ml细胞悬浮液与40μg线性化的DNA混合，使用BTX电细胞操作器(San Diego，CA)电激细胞，该操作器的设置为电压230伏，电容400微法拉第，电阻13欧姆。然后将遭电激的细胞与20ml预温的CHO生长培养基(CHO-S-SFMII，Gibco/BRL，目录号为#31033-012)混合，并铺于96孔组织培养板上。电穿孔后48小时，将选择培养基加至培养板中(用Desmond转染时，选择培养基是不含次黄嘌呤或胸苷的CHO-S-SFMII，其中添加了2mM组氨醇(Sigma目录号为#H6647))。将培养板维持于选择培养基中达30天，或直至一些孔表现出细胞生长。然后将这些细胞从96孔培养板中取出，最终在120ml旋转培养瓶中扩增，其中这些细胞始终在选择培养基中维持。
                    实施例3
              鉴定标记的CHO细胞系
(a)Southern分析
基因组DNA分离自所有稳定生长的Desmond标记的CHO细胞。使用Invitrogen Easy_DNA试剂盒，根据厂商说明分离DNA。然后于37℃用HindIII消化基因组DNA过夜，使用由PCR产生，经洋地黄毒苷标记，并特异于DHFR基因的探针对上述DNA进行Southern分析。使用Boehringer Mannheim’s DIG easy hyb(目录号为#1603 558)和DIG洗涤和封闭缓冲液套(目录号为#1585 762)，根据厂商说明进行杂交和洗涤。推定含有一条与DHFR探针杂交的带的DNA样品为Desmond克隆，该克隆是由整合了单拷贝质粒的单个细胞产生的。保留这些克隆以作进一步分析，在所分离的总共为45个HisD抗性细胞系中，仅有5个为单拷贝整合体。图4表示含有这5个单拷贝Desmond克隆的Southern印迹，在图的说明中提供了克隆的名称。
(b)Northern分析
使用TRIzol试剂(Gibco/BRL目录号#15596-026)，根据厂商说明从所有单拷贝Desmond克隆中分离总RNA。在双份甲醛凝胶上分析10-20μg得自各个克隆的RNA，用由PCR产生，经洋地黄毒苷标记，并特异于(i)DHFR信使RNA，(ii)HisD信使RNA和(iii)CAD信使RNA的探针探测所得印迹。CAD是参与尿苷生物合成的三重功能的蛋白质(Wahl等，生物化学杂志，254，17：8679-8689(1979))，它在所有细胞类型中都能同等表达。本发明中将其用作内在的对照以帮助定量RNA上样。使用上述Boehringer Mannheim试剂进行杂交和洗涤，Northern分析的结果示于图5，据该图两个系列中的泳道4所示，表现出最高水平的HisD和DHFR信使RNA的单拷贝Desmond克隆是克隆15C9。将此克隆称为“标记的细胞系”，并用于在CHO中进行靶向实验，其实施例在下文章节中提供。
                        实施例4
       在Desmond标记的CHO细胞中表达抗-CD20抗体
C2B8是识别B细胞表面抗原CD20的嵌合抗体，我们实验室以前曾克隆和表达过该抗体(Reff等，血液，83：434-45(1994))。将含有C2B8轻链和重链基因以及必需的调节元件(真核启动子和聚腺苷酸化信号)的4.1kb DNA片段插入人工内含子中，该内含子位于衍生自pBR的克隆载体中所含neo基因的外显子1和2之间。切下新产生的5kb DNA片段(含有neo外显子1，C2B8和neo外显子2)，并用于装配靶向质粒Molly。用于构建Molly的其它DNA元件与用于构建上文鉴定的标记质粒Desmond的那些元件相同。Molly的完整图谱示于图2。
转染前，用KpnI和PacI消化以使靶向质粒Molly线性化，用乙醇沉淀线性化的质粒并将其重新悬浮于无菌的TE中至浓度为1.5mg/ml。基本上如上所述将线性化的质粒导入对数生长的Desmond标记细胞中，不同之处是在每次电穿孔中使用了80μg DNA。电穿孔后48小时，将添加有400μg/ml遗传霉素(G418，Gibco/BRL目录号为#10131-019)的选择培养基-CHO-SSFMII加入96孔培养板中。将培养板维持于选择培养基中达30天，或直至一些孔中出现细胞生长。推定这种生长是单个G418抗性细胞克隆扩增的结果。通过标准ELISA技术测定所有G418抗性孔上清液中C2B8的产生，最后将所有生产克隆转移至120ml旋转的培养瓶中并进一步分析。
鉴定分泌抗体的靶向细胞
在此实验中用Molly靶向质粒共进行了50次电穿孔，将每一个铺于独立的96孔培养板中，总共得到10个存活的，可分泌抗CD20抗体的克隆，将所述克隆转移至120ml旋转的培养瓶中。从所有克隆中分离基因组DNA，随后进行Southern分析以测定克隆是否代表单次同源重组事件或在相同细胞中是否发生过其它随机整合。DNA分离和Southern杂交的方法如上文章节所述。用EcoRI消化基因组DNA，并用由PCR产生，经洋地黄毒苷标记，并特异于CD20重链恒定区区段的探针探测之。这一Southern分析的结果示于图6，从图中可以看出，10个克隆中有8个显示出一条与CD20探针杂交的带，这表示这些细胞中发生了单次同源重组事件。10个中的2个，即克隆24G2和28C9显示出存在其它带，这表示在基因组的其它地方发生了其它随机整合。
我们检查了所有10个克隆中抗CD20抗体的表达水平，其数据示于下表1。
         表1：分泌抗CD20的同源整合体的表达水平
     克隆                     抗-CD20，pg/c/d
    20F4                           3.5
    25E1                           2.4
    42F9                           1.8
    39G11                          1.5
    21C7                           1.3
    50G10                          0.9
    29F9                           0.8
    5F9                            0.3
    28C9*                          4.5
    24G2*                          2.1
*这些克隆含有其它随机整合的抗CD20拷贝，因此这些克隆的表达水平可反映出同源和随机位点的贡献。
表达水平表示为各个克隆每天每个细胞所分泌的皮克数(pg/c/d)，并代表由取自120ml旋转培养瓶之样品的3个独立的ELISA所得的平均水平。
从上述数据中可看出，最高产和最低产克隆之间所分泌的抗体约相差10倍。在某种程度上，这不是我们所期望的，由于抗CD20基因都整合至相同的Desmond标记位点这一事实，我们预期的是从所有克隆中得到类似的表达水平。然而，与任何传统的随机整合方法或我们的翻译受损载体系统相比，所观察到的表达变化非常小。
选择最高产的单拷贝整合体，即克隆20F4作进一步研究。表2(下文)描述了此克隆7天生产产品的ELISA和细胞培养数据。
                 表2：20F4的7天生产产品数据
天       ％存活      存活数/ml         T×2(hr)         mg/l      pg/c/d
                      (×105)
1          96           3.4               31             1.3       4.9
2          94           6                 29             2.5       3.4
3          94           9.9               33             4.7       3.2
4          90           17.4              30             6.8       3
5          73           14                               8.3
6          17           3.5                              9.5
在第0天，将2×105/ml的克隆20F4接种于120ml旋转培养瓶中，在以后的6天中，进行细胞计数，计算细胞倍增的时间，从培养瓶中取出1ml上清液样品，通过ELISA分析其所分泌抗CD20。
根据ELISA数据，此克隆平均分泌3-5pg抗体/细胞/天，此水平与我们实验室用以前开发的翻译受损随机整合载体所得的其它高表达单拷贝克隆的表达水平相同。这一结果说明：
(1)CHO基因组中由Desmond标记载体标记的位点具有高转录活性，因此是表达重组蛋白的极好位点，和
(2)使用本发明载体可实现利用同源重组进行靶向的目的，该靶向发生的频率足够高以使此系统成为随机整合方法的可行的和合乎需要的替代物。
为了进一步阐明此系统的效力，我们还证明了此位点是可扩增的，可导致甚至更高的基因表达和蛋白质分泌水平。通过将密度原为2.5×104个细胞/ml的20F4细胞经连续稀释后铺于96孔组织培养板上，在添加有5，10，15或20nM氨甲碟呤的培养基(CHO-SSFMII)中培养这些细胞即可达到扩增的目的。使用标准的ELISA技术筛选出分泌抗体的克隆，扩增最高产的克隆以作进一步分析。此扩增实验的概况示于下表3。
                  表3：20F4扩增概况
nM MTX   分析的孔数     96孔中的表     扩增的孔数      旋转培养瓶中的
            #           达水平mg/l         #           表达水平pg/c/d
10          56             3-13            4               10-15
15          27             2-14            3               15-18
20          17             4-11            1               ND
按上文所述，使用上表所示氨甲碟呤浓度对20F4进行氨甲碟呤扩增。通过ELISA分析所有存活的96孔集落的上清液，第3栏中示出了这些克隆所表达的抗CD20范围。根据这些结果，将最高产的克隆转移至120ml旋转培养瓶中，对旋转培养瓶中的上清液进行几个ELISA以测定pg/细胞/天表达水平，结果示于第5栏。
此数据清楚地表明：氨甲碟呤存在时，此位点可被扩增。10和15nM氨甲碟呤扩增出的克隆达到约15-20pg/细胞/天。
将被称为20F4-15A5的15nM克隆选择为最高表达的细胞系，此克隆来自其中仅有22个孔生长的96孔培养板，因此推定它由单细胞产生。对此克隆再进行一轮氨甲碟呤扩增。如上所述，将连续稀释的培养物铺于96孔培养板中，并在添加有200，300或400nM氨甲碟呤的CHO-SS-FMII培养基中培养。通过ELISA筛选存活的克隆，将几个高产克隆转移至旋转培养瓶中培养，并进一步分析之。第二次扩增实验的概况示于表4。
                          表4：20F4-15A5扩增概况
nM MTX   分析的孔数      96孔中的表达   扩增的孔数     旋转培养瓶中的表
            #            水平mg/l           #          达水平pg/c/d
200          67        23-70        1          50-60
250          86        21-70        4          55-60
300          81        15-75        3          40-50
按上文所述建立并分析20F4-15A5的氨甲碟呤扩增。将最高产的细胞(其数目示于第4栏)转移至120ml旋转培养瓶中，将得自这些孔的细胞系的表达水平表示为pg/细胞/天，结果示于第5栏。
最高产的克隆来自250nM氨甲碟呤扩增，250nM克隆20F4-15A5-250A6来自其中仅有？孔生长的96孔培养板，因此推定它由单细胞产生。表3和4的数据合在一起很清楚地说明：两轮氨甲碟呤扩增足以使表达水平达到60pg/细胞/天，接近哺乳动物细胞分泌免疫球蛋白的最大能力(Reff，M.E.Curr.Opin.Biotech.，4：573-576(1993))。仅用两个扩增步骤即可达到此分泌水平的能力进一步增强了此同源重组系统的实用性。随机整合方法一般需要两个以上的扩增步骤才能达到此表达水平，扩增起来也较为困难。因此，同源系统是在哺乳动物细胞中获得高水平基因表达的更加有效和节约时间的方法。
                       实施例5
        在Desmond标记的CHO细胞中表达抗人CD23抗体
CD23是低亲和性的IgE受体，它可介导IgE与B和T淋巴细胞的结合(Sutton，B.J.，和Gould，H.J.，自然，366：421-428(1993))。抗人CD23单克隆抗体5E8是我们实验室最近克隆和表达的人γ-1单克隆抗体。此抗体公开于1997年2月20日提交的共同转让的流水号08/803,085中。
将5E8的重链和轻链基因克隆至哺乳动物表达载体N5KG1(衍生于载体NEOSPLA(Barnett等，抗体表达和工程，H.Y.Yang和T.Imanaka编，p27-40(1995))，然后对基因进行两次修饰。据最新观察，我们实验室的其它表达构建体中分泌的免疫球蛋白轻链在某种程度上比重链要多一些(Reff等，1997，未公开的的结果)。在补偿此亏空的尝试中，我们通过在紧靠起始位点的上游添加强的启动子/增强子元件改变了5E8重链基因。在随后的步骤中，从N5KG1载体中分离含有5E8经修饰的轻链和重链基因的2.9kb DNA片段，将其插入靶向载体Mandy中。基本上按上文章节中所述制备含有5E8的Molly并电穿孔至Desmond 15C9 CHO细胞中。
对上述方法的一个修饰是所用培养基的类型。Desmond标记的CHO细胞在无蛋白质的CD-CHO培养基(Gibco-BRL，目录号为#AS21206)中培养，该培养基中添加有3mg/l重组胰岛素(3mg/ml储存液，Gibco-BRL，目录号为#AS22057)和8mM L-谷胺酰胺(200mM储存液，Gibco-BRL，目录号为#25030-081)。随后，在添加有400μg/ml遗传霉素的上述培养基中选择转染细胞。在此实验中，进行20个电穿孔并铺于96孔组织培养板中。共有68个孔中呈现细胞生长并分泌出抗CD23，推定它们都是来自单个G418细胞的克隆。将其中的12个转移至120ml旋转培养瓶中以进一步分析。我们相信在此实验中可分离出更多数目的克隆(为68个，而据实施例4描述，抗CD20的克隆仅为10个)，原因是相对于CHO-SS-FMII培养基而言，在CD-CHO培养基中生长的细胞有更高的克隆效力和存活率。所分析的旋转培养克隆的表达水平范围为0.5-3pg/c/d，与抗CD20克隆中所见的表达水平非常接近。对被称为4H12的最高产抗CD23克隆进行氨甲碟呤扩增以增加其表达水平。以类似于实施例4中抗CD20克隆的方式建立此扩增。将对数生长的4H12细胞连续稀释，铺于96孔组织培养板中，在添加有3mg/l胰岛素，8mM谷氨酰胺和30，35或40nM氨甲碟呤的CD-CHO培养基中培养。这一扩增实验的概况示于表5。
                            表5：2H12扩增概况
nM MTX 分析的孔数    96孔中的表     扩增的孔数     旋转培养瓶中的表达
          #          达水平mg/l         #          水平pg/c/d
30        100           6-24            8              10-25
35        64            4-27            2              10-15
40        96            4-20            1              ND
所得的最高表达克隆是30nM克隆，它分离自其中仅有22个孔有细胞生长的培养板。此克隆被称为4H12-30G5，它可再现地分泌18-22pg抗体/细胞/天。这与抗CD20克隆20F4第一次扩增的表达水平范围相同(如实施例4所述，克隆20F4-15A5产生15-18pg/c/d)。此数据进一步支持这样一个观察结果，即在CHO中的此标记位点处的扩增是可再现的和有效的。最近正对30nM细胞系进行第二次扩增，预期与抗CD20的情况相同，仅用两个扩增步骤即可使抗CD23抗体达到饱和表达水平。
                             实施例6
           在Desmond标记的CHO细胞中表达免疫粘附素
CTLA-4是Ig超家族的成员，它位于T淋巴细胞的表面，据认为在抗原特异性T细胞激活中起作用(Dariavach等，欧洲免疫学杂志，18：1901-1905(1988))；和Linsley等，实验医学杂志，174：561-569(1991))。为了进一步研究CTLA-4分子在激活途径中的精确作用，产生了可溶性的融合蛋白，它含有与人IgG1恒定区之截短形式相连的CTLA-4胞外域(Linsley等(文献同上)，我们最近在哺乳动物表达载体BLECH1(衍生于质粒NEOSPLA(Barnett等，抗体表达和工程，H.Y.Yang和T.Imanaka编，p27-40(1995))中表达了CTLA-4 Ig融合蛋白)。从此载体中分离出编码CTLA-4 Ig的800bp片段，并插入Molly的SacII和BglII位点之间。
按上文中抗CD20相关实施例所述，制备CTLA-4-Molly并电穿孔至Desmond克隆15C9 CHO细胞。如上所述进行12个电穿孔并铺于96孔组织培养板中。从96孔培养板中分离出18个表达CTLA-4的孔，将其转移至120ml旋转培养瓶中培养。然后对分离自各个克隆的基因组DNA进行Southern分析以测定多少个同源克隆另外还含有随机整合体。用BglII消化基因组DNA，并用由PCR产生，经洋地黄毒苷标记，并特异于人IgG1恒定区的探针进行探测。分析结果表明85％的CTLA-4克隆仅是同源整合体；其余15％另外含有一个随机整合体。这一结果确证了上文所讨论的抗CD20表达中的发现，其中80％的克隆是单个同源整合体。因此，我们可以得出这样一个结论，此表达系统在至少80％所产生的克隆中可再现地产生了单个靶向的同源整合体。
同源CTLA4-Ig克隆的表达水平范围为8-12pg/细胞/天，在某种程度上高于上文讨论的抗CD20抗体和抗CD23抗体克隆的表达水平范围。然而，我们以前观察到使用内含子插入的载体系统表达此分子也会导致比免疫球蛋白显著较高的表达水平。目前，我们还不能提供这一观察结果的解释。
                        实施例7
        将抗CD20靶向其它的Desmond标记的CHO细胞系
如以上章节中所讨论的，我们得到了5个单拷贝的Desmond标记的CHO细胞系(见图4和5)。为了阐明靶向策略的成功不是因为Desmond克隆15C9的一些独一无二性质，该成功也不仅限于此克隆，我们将抗CD20Molly导入了Desmond克隆9B2(图4中的泳道6，图5中的泳道1)。按上文中抗CD20相关实施例所述，制备Molly DNA并电穿孔至Desmond9B2。由此实验得到一个同源整合体，将此克隆转移至120ml旋转培养瓶中，其平均产生1.2pg抗CD20/细胞/天。与将Molly靶向至Desmond 15C9相比，这是相当低的表达水平。然而，根据Desmond克隆的Northern分析，这是预期的结果。从图5中可以看出，克隆9B2的mRNA水平比15C9的低很多，这表明此克隆的位点不如15C9中的转录活性高。因此，这一实验不仅阐明了此系统的可再现性-推定任何标记的Desmond位点都能被Molly靶向-也证实了Desmond 15C9中的位点最具转录活性这一Northern数据。
鉴于上文的公开，应懂得尽管为了阐明本发明描述了本发明具体的实施方案，但在不背离本发明范围的前提下可对本发明作出多种修饰。因此，本发明不受所附权利要求书的限制。

Claims (41)

1.在分离的哺乳动物细胞基因组的靶位点插入所需DNA的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)用标记质粒转染或转化分离的哺乳动物细胞，所述质粒含有下列序列：
(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，可为同源重组提供独一无二的位点；
(b)编码第一个选择标记蛋白部分的第一部分的DNA片段；和
(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；
(ii)通过筛选至少一种其它选择标记而选择含有标记质粒的细胞，所述质粒已整合至该细胞的基因组中；
(iii)用靶向质粒转染或转化所述选定细胞，所述质粒含有下列序列：
(a)DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述独一无二的区域重组；
(b)编码标记质粒中所含同一第一选择标记的第二部分的DNA片段，其中仅当所述第二部分与第一选择标记蛋白的第一部分联合表达时，才会产生第一选择标记蛋白；和
(iv)通过筛选第一个选择标记蛋白的表达选择出含有靶向质粒的细胞，所述质粒整合至靶位点。
2.权利要求1的方法，其中编码第一个选择标记片段的DNA片段是显性选择标记的一个外显子。
3.权利要求2的方法，其中靶向质粒含有所述第一个选择标记的其余外显子。
4.权利要求3的方法，其中至少一种编码所需蛋白质的DNA被插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间。
5.权利要求4的方法，其中还将编码显性选择标记的DNA插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间以共扩增编码所需蛋白质的DNA。
6.权利要求3的方法，其中第一个显性选择标记选自由新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶组成的组。
7.权利要求4的方法，其中所需蛋白质是哺乳动物蛋白质。
8.权利要求7的方法，其中蛋白质是免疫球蛋白。
9.权利要求1的方法，其进一步包括在整合靶向载体之前，测定标记质粒中所含权利要求1中步骤(i)(c)中DNA的RNA水平。
10.权利要求9的方法，其中标记质粒中所含的其它选择标记是显性选择标记，它选自由组氨醇脱氢酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、潮霉素磷酸转移酶、腺苷脱氨酶和谷氨酰胺合成酶组成的组。
11.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞选自由中国仓鼠卵巢细胞、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞和NIH3T3细胞组成的组。
12.权利要求11的方法，其中细胞是CHO细胞。
13.权利要求1的方法，其中标记质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的第三个外显子，靶向质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的前两个外显子。
14.权利要求1的方法，其中标记质粒还含有一个不常见的限制性内切核酸酶序列，所述序列被插入同源性区域内。
15.权利要求1的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，病毒DNA或合成的DNA。
16.权利要求1的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域至少为300个核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中独一无二的DNA区域的大小范围为300个核苷酸至20个千碱基。
18.权利要求17的方法，其中独一无二的DNA区域的大小范围为2至10个千碱基。
19.权利要求1的方法，其中第一个选择标记DNA至少被分成3个外显子。
20.权利要求1的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA、昆虫DNA、病毒DNA或合成的DNA。
21.权利要求20的方法，其中独一无二的DNA区域不含任何功能性基因。
22.将所需DNA插入哺乳动物细胞基因组靶位点的载体系统，该系统中至少含有下列：
(i)标记质粒，它至少含有下列序列：
(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，它可为同源重组提供独一无二的位点；
(b)编码第一个选择标记蛋白之一部分的DNA片段；和
(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；和
(ii)靶向质粒，它至少含有下列序列：
(a)一个DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述独一无二的区域重组；
(b)编码与标记质粒中所含同一第一选择标记之一部分的DNA片段，其中仅当所述片段与标记质粒中所含的所述选择标记DNA片段联合表达时，才会产生由所述DNA编码的活性选择标记蛋白。
23.权利要求22的载体系统，其中编码第一个选择标记蛋白之一部分的DNA片段是显性选择标记的一个外显子。
24.权利要求23的载体系统，其中靶向质粒含有所述第一个选择标记的其余外显子。
25.权利要求24的载体系统，其中至少一种编码所需蛋白质的DNA被插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间。
26.权利要求24的载体系统，其中还将编码显性选择标记的DNA插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间以共扩增编码所需蛋白质的DNA。
27.权利要求24的载体系统，其中第一个显性选择标记选自由新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶组成的组。
28.权利要求25的载体系统，其中所需蛋白质是哺乳动物蛋白质。
29.权利要求28的载体系统，其中蛋白质是免疫球蛋白。
30.权利要求22的载体系统，其中标记质粒中所含的其它选择标记是显性选择标记，它选自由组氨醇脱氢酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、潮霉素磷酸转移酶、腺苷脱氨酶和谷氨酰胺合成酶组成的组。
31.权利要求22的载体系统，它帮助所需细胞插入哺乳动物细胞基因组的靶位点，所述哺乳动物细胞选自由中国仓鼠卵巢细胞、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞和NIH 3T3细胞组成的组。
32.权利要求31的载体系统，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
33.权利要求22的载体系统，其中标记质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的第三个外显子，靶向质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的前两个外显子。
34.权利要求22的载体系统，其中标记质粒还含有一个不常见的限制性内切核酸酶序列，所述序列被插入同源性区域内。
35.权利要求22的载体系统，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA、病毒DNA或合成的DNA。
36.权利要求22的载体系统，其中标记质粒载体系统中所含的提供同源重组的独一无二的DNA区域至少为300个核苷酸。
37.权利要求36的载体系统，其中独一无二的DNA区域的大小范围为300个核苷酸至20个千碱基。
38.权利要求37的载体系统，其中独一无二的DNA区域的大小范围为2至10个千碱基。
39.权利要求22的载体系统，其中第一个选择标记DNA至少被分成3个外显子。
40.权利要求22的载体系统，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA、昆虫DNA、病毒DNA或合成的DNA。
41.权利要求40的载体系统，其中独一无二的DNA区域不含任何功能性基因。
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