Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy
CZ293355B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Mitchell E. Reff Richard Spence Barnett Karen Retta Mclachlan
Worldwide applications
Application CZ19993162A events
1997-03-14
2000-02-16
2004-04-14
Description
translated from
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu cílené integrace požadované exogenní DNA do specifického místa v genu savčí buňky. Konkrétně vynález popisuje nový způsob identifikace transkripčně aktivního cílového místa („žhavé místo“) v genomu savčí buňky, a vložení požadované DNA do tohoto místa prostřednictvím homologní rekombinace. Vynález také poskytuje možnost genové amplifikace požadované DNA v takovém místě, a to tím, že se současně v kombinaci s exogenní DNA integruje amplifikovaný selekční markér, např. DHFR. Vynález dále popisuje konstrukci nových vektorů vhodných k provádění výše uvedených způsobů, a dále poskytuje savčí buněčné linie připravené způsobem podle vynálezu, které obsahují požadovanou exogenní DNA integrovanou v cílovém „žhavém místě“
Dosavadní stav techniky
Technologie exprese rekombinantních proteinů jak v prokaryotických tak eukaryotických organismech jsou již dobře zavedeny. Savčí buňky ve srovnání s bakteriemi nebo kvasinkami nabízejí značné výhody pro produkci proteinu, neboť mají schopnost správně sestavit, glykosylovat, a také posttranslačně modifikovat rekombinantně exprimovaný protein. Po transfekci do hostitelské buňky se rekombinantní expresní konstrukt může udržovat jako extrachromozomální element, nebo se může integrovat do genomu hostitelské buňky. Vytvoření stabilně transfekované savčí buněčné linie obvykle zahrnuje následující: konstrukt DNA kódující požadovaný gen společně s genem rezistence k chemické látce, zpravidla léčivu (dominantní selekční markér) se vnese do hostitelské buňky a poté následuje růst v přítomnosti léčiva, kteiý umožní selekci buněk, které úspěšně integrovaly exogenní DNA. V mnoha případech je požadovaný gen spojen se selektovatelným markérem rezistence k léčivu, který pak může být podroben amplifikaci. Pro tento účel se nejčastěji užívá gen spojen se selektovatelným markérem rezistence k léčivu, který pak může být podroben amplifikaci. Pro tento účel se nejčastěji užívá gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR). Růst buněk v přítomnosti methotrxatu, který je kompetitivním inhibitorem DHFR, vede ke zvýšené produkci DHFR amplifikaci genu DHFR. Sousední úseky DNA se také amplifikují, a výsledná současná amplifikace (kamplifikace) genu spojeného sDHFR vtransfekované buněčné linii může vést ke zvýšené produkci proteinu, čili vede ke zvýšené expresi požadovaného genu.
Tento přístup se ukázal být úspěšným, ale v systému je celá řada problémů, neboť integrační událost je náhodné povahy. Tyto problémy existují, neboť expresní hladiny jsou z velké míry ovlivněny působením lokálního genetického prostředí v genovém lokusu, což je jev dobře dokumentovaný v odborné literatuře a obecně označovaný jako „poziční efektů (např. viz. Al-Shawi et al, Mol. Cell. Biol. 10: 1192-1198, 1990, Yoshimura et al., Mol. Cell. Bio. 10: 1192-1198, 1990, Yoshimura et al., Mol. Cell. Biol. 7: 1296-1299,1987). Jelikož valná většina savčí DNA je v transkripčně neaktivním stavu, způsoby náhodné integrace nenabízejí žádnou možnost kontroly transkripce integrované DNA. Tudíž dochází ke značné variaci v hladině exprese integrovaných genů v závislosti na místu integrace. Tak např. výsledkem integrace exogenní DNA do inaktivního, transkripčně „umlčeného“ úseku genomu, bude velmi nízká nebo nulová exprese. Naopak integrace do transkripčně aktivního místa povede k vysoké expresi.
Proto, pokud je cílem práce získat vysokou hladinu genové exprese, což je většinou typickým požadovaným výstupem metod genového inženýrství, je obecně třeba testovat velký počet transfekovaných buněk transfektant), aby byl nalezen klon s vysokou produktivitou.
-1 CZ 293355 B6
Kromě toho náhodná integrace exogenního DNA do genomu může v některých případech narušit důležité buněčné geny, což vede k změněnému fenotypu. Díky těmto faktorům může být příprava stabilní savčí linie s vysokou produktivitou značně složitým a pracným procesem.
Nedávno byly vnáší laboratoři připraveny DNA vektory obsahující translačně oslabené dominantní selektovatelné markéry, a byly použity k savčí genové expresi (US patent č. 5 648 267).
Tyto vektory obsahují translačně oslabený gen pro neomycinfosfotransferázu (neo) jako dominantní selektovatelný markér, uměle upravený tak, aby obsahoval intron, do kterého je vložen gen DHFR společně s požadovaným genem/geny. Bylo zjištěno, že použití těchto vektorů jako expresních konstruktů významně snižuje celkový počet vzniklých kolonií rezistentních k léčivu, což usnadňuje proces testování a selekce vzhledem ke konvenčním savčím vektorům. Kromě toho významné procento klonů získaných pomocí tohoto systému patří ke klonům s vysokou expresí. Tyto výsledky lze přičíst modifikacím, provedených na selektovatelném markéru neo. Díky translačnímu oslabení genu neo transfekované buňky nevytvářejí dostatek neo proteinu, aby přežily selekci na léčivu, a tím se snižuje celkový počet kolonií rezistentních k léčivu. A navíc, vysoké procento přežívajících klonů obsahuje expresní vektor integrovaný do místa genomu, kde je bazální hladina transkripce vysoká, což vede k nadprodukci neo, což umožňuje buňkám překonat translační oslabení genu nebo. A jakožto průvodní jev i požadované geny spojené s nebo mají stejně zvýšenou hladinu transkripce. A stejná výhoda je také důsledkem umělého intronu vytvořeného uvnitř neo, přežívání je závislé na syntéze funkčního genu, neo, což je zase závislé na správném a účinném sestřihu intronů neo. Avšak tato kritéria jsou mnohem pravděpodobněji splněna, jestliže se vektorová DNA integruje do úseku, který již má vysokou transkripční aktivitu.
Po integraci vektoru do transkripčně aktivního úseku se provede amplifikace genu selekcí na gen DHFR. Pomocí tohoto systému lze získat klony selektované použitím nízké koncentrace methotrexatu (50 nM), které obsahují několik (<10) kopií vektoru a které vylučují vysoké hladiny proteinu (>55 pg/buňka/den). Navíc toho lze dosáhnou v relativně krátké době. Avšak úspěch amplifikace je proměnlivý. Některá transkripčně aktivní místa nemohou být amplifikována a tudíž frekvence a rozsah amplifikace z určitého místa nelze předpovědět.
Celkově však představuje toto použití translačně oslabených vektorů výrazně zlepšení ve srovnání se způsobem náhodné integrace. Avšak stále zde zůstává vážný problém chybějící kontroly integračního místa, jak jsme již diskutovali dříve.
Jednou možností, jak překonat problém náhodné integrace, je genové cílení („targeting“), kdy je exogenní DNA nasměrována do specifického lokusu v hostitelském genomu. Exogenní DNA je vložena pomocí homologní rekombinace, ke které dojde mezi sekvencí DNA expresního vektoru a odpovídající homologní sekvencí v genomu. Avšak zatímco k tomuto typu rekombinace dochází přirozeně a s vysokou frekvencí u kvasinek a jiných hub, u vyšších eukaryotických organismů je to velmi vzácná událost. V savčích buňkách je poměr frekvence homologní rekombinace knehomologní (tj. náhodné integraci) v rozmezí 1/100 až 1/500 (např. Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989, Morrow and Kucherlapati, Curr. Op. Biotech. 4: 577-582, 1993).
Jedna z prvních zpráv popisující homologní rekombinaci u savčích buněk se týkala umělého systému vytvořeného u myších fibroblastech (Thomas et al., Cell44: 419-428, 1986). Byla vytvořena buněčná linie, která obsahuje mutovanou nefunkční verzi genu neo integrovanou do hostitelského genomu, a potom byla zacílena druhou nefunkční kopií neo, která obsahuje odlišnou mutaci. Díky genovému cílení došlo k rekonstrukci funkčního genu neo. Homologní rekombinace byla identifikována pomocí selekce buněk na rezistenci k G418 a byla potvrzena analýzou genomové DNA izolované z rezistentních klonů.
Nedávno bylo popsáno použití homologní rekombinace k nahrazení těžkých a lehkých imunoglobulinových genů v endogenním lokusu v buňkách secemujících protilátky (US patentu
-2CZ 293355 B6
č. 5 202 238, Fell et al., 1993). Ale tento konkrétní přístup není široce využitelný, neboť je omezen pouze na produkci imunoglobulinu v buňkách, které endogenně exprimují imunoglobuliny, tj. B-buňky a myelomové buňky. Exprese je také omezena na úroveň jedné genové kopie, neboť koamplifikace po genové integraci není součástí systému. Způsob je navíc komplikován skutečností, že jsou potřebné dvě samostatné integrační události, aby došlo k produkci funkčního imunoglobulinu: jedné pro gen lehkého řetězce a pak k jedné pro gen těžkého řetězce.
Další příklad takového systému byl popsán pro buňky NS/10, kde jsou exprimovány rekombinantní imunoglobuliny, a to homologní rekombinací do lokusu 2A imunoglobulinu gama (Hollis et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/IB9500014). Expresní hladiny získané z tohoto místa byly mimořádně vysoké - řádu 20 pg/buňka/den- z integrace jediné kopie genu. Avšak, stejně jako ve výše uvedeném příkladu, exprese je omezena na tuto hladinu, neboť v systému není současně integrován žádný amplifikovatelný gen. A také jinými vědci byla popsána aberantní glykosylace rekombinantních proteinů exprimovaných v buňkách NS/0 (např. viz Flasher et al., Biotech. and Bioeng. 48: 399-407, 1995), což značně omezuje využitelnost tohoto systému.
Rekombinační systém cre-loxP bakteriofága PÍ byl nedávno adaptován a použit jako nástroj genového cílení v eukaryotických buňkách. Konkrétně byla provedena místně specifická integrace exogenní DNA do genomu buněk ovarií čínského křečka (CHO) použitím rekombinázy cre a série vektorů obsahujících lox (Fukushiga a Sauer, roc. Nalt. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909, 1992). Tento systém je velmi atraktivní, neboť poskytuje reprodukovatelnou expresi vtémže chromozómovém místě. Ale nebylo vyvinuto žádné úsilí v témže chromozómovém místě. Ale nebylo vyvinuto žádné úsilí k tomu, aby se stanovilo chromozomové místo, kde je exprese optimální a podobně jako ve výše uvedeném příkladu, exprese v tomto systému je omezena na úroveň jediné genové kopie. Systém je také komplikován skutečností, že je třeba dosáhnout exprese funkčního rekombinázového enzymu v savčí buňce.
Užití homologní rekombinace mezi sekvencí vnesené DNA a jejím endogenním chromozómovým lokusem bylo také popsáno jako systém, který poskytuje užitečný nástroj pro genové manipulace v savčích buňkách a také v kvasinkách (viz např. Bradley et al., Met. Enzymol. 223: 855879, 1993, Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989, Rothstein et al., Met. Enzymol. 194: 281301, 1991). Dodnes byla většina výzkumů cílení v savčích genech zaměřena na narušení/vyřazení funkce genu („knock-out“) nebo na místně-specifíckou mutagenezi vybraných cílových genových lokusů v kmenových buňkách myších embryí (ES). Vytvoření těchto myších „knock-out“ modelů umožnilo zkoumat specifický vztah struktura-funkce a vyšetřit biologický význam mnoha myších genů. Toto pole výzkumu má také řadu potenciálních aplikací v oblasti genové terapie.
V současnosti byly také popsány vektory firmy Cell-tech (Kent, U.K.), které jsou zacíleny do transkripčně aktivních míst buněk NSO, a které nevyžaduje genovou amplifikaci (Peakman et al., Hum. Antibody hibridom 5: 65-74, 1994). Avšak hladina sekrece imunoglobulinů v těchto buňkách bez amplifíkace nepřesahovala podle publikace 20 pg/buňka/den, zatímco u amplifikovaných buněk CHO je možné dosáhnout až 100 pg/buňka/den (Peakman et al. 1994).
Je proto vysoce žádoucí vyvinout systém genového cílení, který umožní reprodukovatelně integrovat exogenní DNA do předem určeného místa genomu, o kterém se ví, že je transkripčně aktivní. Bylo by také žádoucí, aby takový systém dále umožňoval koamplifíkaci vložené DNA po integraci. Takový systém by dovolil reprodukovatelnou expresi vysoké úrovně libovolného požadovaného genu v savčí buňce, a nepochybně by byl předmětem zájmu mnoha výzkumných pracovníků.
-3CZ 293355 B6
Podstata vynálezu
V této přihlášce se popisuje nový expresní systém pro savčí buňky, založený na homologní rekombinaci, ke které dochází mezi dvěma umělými substráty obsaženými ve dvou různých vektorech. Konkrétně tento systém užívá kombinace dvou nových savčích expresních vektorů, pojmenovaných zde jako „markerový“ (markerový) vektor a „cílový“ vektor.
V podstatě markerový vektor umožní identifikaci a označení místa v savčím genomu, které je transkripčně aktivní, tj. místo, kde je vysoká genová exprese. Toto místo lze považovat za „žhavé místo“ („hot spot“) genomu. Po integraci markerového vektoru, expresní systém podle předkládaného vynálezu umožní, aby se další DNA, tj. cílový vektor, integrovala do tohoto místa, a sice prostřednictvím homologní rekombinace, ke které dojde mezi DNA sekvencemi společnými pro oba vektory. Tento systém přináší významné výhody ve srovnání s jinými systémy homologní rekombinace.
Na rozdíl od jiných systémů homologní rekombinace užitých u savčích buněk, systém podle předkládaného vynálezu nevykazuje žádné pozadí. Tudíž buňky, u kterých došlo jen k náhodné integraci vektoru, nepřežijí selekci. Takže jakýkoliv požadovaný gen klonovaný do cíleného plazmidu je exprimován na vysoké hladině z označeného „žhavého místa“. Takže způsob genové exprese podle vynálezu podstatně nebo zcela odstraňuje problémy, které jsou vlastní systému náhodné integrace, které jsme diskutovali v předchozím textu. Navíc tento systém poskytuje pro jakýkoliv rekombinantní protein reprodukovatelnou expresi vysoké úrovně za stejného transkripčně aktivním místě vložením amplifikovatelného dominantního selektovatelného markéru (např. DHFR) jakožto součásti markerového vektoru.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy zlepšený způsob cílení integrace požadované DNA do specifického místa v savčí buňce.
Konkrétním předmětem vynálezu je zlepšený způsob cílené integrace požadované DNA do specifického místa v savčí buňce homologní rekombinaci.
Dalším předmětem vynálezu jsou nové vektory k dosažení místně specifické integrace požadované DNA v savčí buňce.
Ještě dalším předmětem vynálezu jsou nové savčí buněčné linie, které obsahují požadovanou DNA integrovanou v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi.
Vynález dále poskytuje nový způsob dosažení místně specifické integrace požadované DNA v buňkách ovarií čínského křečka (CHO).
Dalším specifickým předmětem vynálezu je způsob integrace imunoglobulinových genů, nebo jakýchkoliv jiných genů, do předem určeného chromozómového místa v savčí buňce, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším specifickým předmětem vynálezu jsou nové vektory a kombinace vektorů, které jsou vhodné pro integraci imunoglobulinových genů do předem určeného chromozómového místa v savčí buňce, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším předmětem vynálezu jsou savčí buněčné linie, které obsahují imunoglobulinové geny integrované v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším specifickým předmětem vynálezu je nový způsob integrace imunoglobulinových genů do buněk CHO, které poskytují vysokou expresi a také nové vektory a kombinace vektorů, které umožňují takovou integraci imunoglobulinových genů do buněk CHO.
-4CZ 293355 B6
Navíc jsou specifickým předmětem předkládaného vynálezu nové linie buněk CHO, které obsahují imunoglobulinové geny integrované v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi, a které byly amplifikovány selekci na methotrexatu, aby vylučovaly ještě větší množství funkčních imunoglobulinů.
Popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje mapu markerového plazmidu podle předkládaného vynálezu označeného „Desmond“. Plazmid je znázorněn jak v kruhové formě (la) tak i v linearizované verzi (lb) použité pro transfekci.
Obr. 2(a) ukazuje mapu cílového plazmidu označeného „Molly“. Plazmid Molly zde kóduje imunoglobulinové geny anti-CD20, jejichž exprese je popsána v příkladu 1.
Obr. 2(b) ukazuje linearizovanou verzi Molly, tj. po štěpení enzymy KpnI a PacI. Tato linearizovaná forma byla užita pro transfekci.
Obr. 3 znázorňuje potenciální přiřazení („allgnment“) sekvencí plazmidu Desmond integrovaných do genomu CHO buňky a cílových sekvencí plazmidu Molly. Je také uvedeno jedno možné uspořádání plazmidu Molly integrovaného do plazmidu Desmond po homologní rekombinaci.
Obr. 4 ukazuje analýzu Southemovým přenosem klonů s jedinou kopií plazmidu Desmond. Vzorky byly následující:
Dráha 1: velikostní standard XHindlII DNA, dráha 2: klon Desmond 10F3, dráha 3: klon Desmond 10C12, dráha 4: klon Desmond 15C89, dráha 5: klon Desmond 14B5, dráha 6. klon Desmond 9B2.
Obr. 5 ukazuje analýzu northemovým přenosem klonů s jednou kopií Desmond. Panel A: northemový přenos se sondami CAD a DHFR, jak je popsáno na obrázku. Panel B: duplikátní northemový přenos se sondami CAD a HisD, jak je popsáno na obrázku. Vzorec RNA nanesené v panelech A a B byly následující:
Dráha 1: klon 9B2, dráha 2: klon 1002, dráha 3: klon 14B2, dráha 4: klon 15C9, dráha 5: kontrolní RNA z HO transfekovaných plazmidy obsahujícími HisD a DHFR, dráha 6: netransfekované CHO.
Obr. 6 ukazuje analýzu Southemovým přenosem klonů, které vznikly po homologní integraci Molly do Desmond. Vzorky byly následující:
Dráha 1: velikostní standard XHindlII DNA, dráha 2: 20F4, dráha 3: 5F9, dráha 4: 21C7, dráha 5: 24G2, dráha 6: 25E1, dráha 7: 28C9, dráha 8: 29R9, dráha 9: 39G11, dráha 10: 42F9, dráha 1 l:50G10, dráha 12: DNA plazmidu Molly linearizovaného BglII (vrchní pás) a štěpeného BglII a KpnI (dolní pás), dráha 13: netransfekovaný Desmond.
Obr. 7A až 7G uvádí výpis sekvence Desmond.
Obr. 8A až 81 uvádí výpis sekvence Molly obsahující anti-CD20.
Obr. 9 znázorňuje mapu cílového plazmidu „Mandy“, který zde kóduje geny anti-CD23, jejichž exprese je popsána v příkladu 5.
-5CZ 293355 B6
Obr. 10A až ION uvádí výpis sekvence Mandy obsahující geny anti-CD23, jak je popisuje příklad 5.
Předkládaný vynález poskytuje nový způsob integrace požadované exogenní DNA v cílovém místě uvnitř genomu savčí buňky prostřednictvím homologní rekombinace. Vynález také poskytuje nové vektory pro dosažení místně specifické integrace DNA v cílovém místě uvnitř genomu savčí buňky.
Konkrétněji způsob klonování podle předkládaného vynálezu poskytuje místně specifickou integraci požadované DNA do savčí buňky transfekcí této buňky „markerovým“ plazmidem, kteiý obsahuje jedinečnou sekvenci, která je cizorodá vzhledem ke genomu savčí buňky a která poskytuje substrát pro homologní rekombinaci, která je pak následována transfekcí „cílovým“ plazmidem, obsahujícím sekvenci, která zajistí homologní rekombinaci sjedinečnou sekvencí obsaženou v markerovém plazmidu, a dále obsahujícím požadovanou DNA, která má být integrována do savčí buňky. Typicky integrovaná DNA kóduje požadovaný protein, jako je např. imunoglobulin nebo jiný vylučovaný savčí glykoprotein.
Systém homologní rekombinace demonstrovaný v příkladech užívá genu neomycinfosfotransferázy jako dominantního selektovatelného markéru. Tento markér byl užit na základě dříve publikovaných zjištění, že
I) je schopen zacílit a obnovit funkci mutované verze genu neo (viz dříve uvedené citace), a
II) na základě našeho vývoje translačně oslabených expresních vektorů, ve kterých byl gen neo uměle vytvořen v podobě dvou exonů s požadovaným genem vloženým jako intron, kde exony neo byly správně sestřiženy a translatovány in vivo, čímž vznikl funkční protein, který udělil vzniklé buněčné populaci rezistenci ke G418.
V této přihlášce je gen neo rozdělen do třech exonů. Třetí exon neo je umístěn na markerovém plazmidu a integruje se do hostitelského genomu po integraci markerového plazmidu do savčí buňky. Exony 1 a 2 jsou přítomny v cílovém plazmidu a jsou odděleny vmezeřeným intronem, do kterého je klonován alespoň jeden požadovaný gen. Homologní rekombinace cílového vektoru s integrovaným markerovým vektorem vede ke správnému sestřihu všech třech exonů genu neo a tudíž k expresi funkčního proteinu nebo (jak bylo zjištěno selekcí kolonií rezistentních k G418). Před navržením současného expresního systému jsme testovali funkčnost takového konstruktu neo genu s trojím sestřihem v savčích buňkách. Výsledky tohoto kontrolního pokusu ukázaly, že všechny tři exony neo genu byly správně sestřiženy a tudíž je vhodný pro předkládaný vynález.
Ačkoliv je vynález demonstrován pomocí genu neo, a konkrétně trojnásobně rozděleného genu neo, způsob podle vynálezu je vhodný i pro jiné dominantní selektovatelné markéry.
Jak bylo již podrobně diskutováno výše, předkládaný vynález poskytuje mnohé výhody vzhledem ke konvenčním metodám exprese genů, včetně náhodné integrace a cílení genů. Předkládaný vynález poskytuje způsob, který reprodukovatelně umožňuje místně specifickou integraci požadované DNA do transkripčně aktivní domény savčí buňky. Kromě toho, jelikož způsob podle vynálezu vnáší do buňky umělý úsek „homologie“, který působí jako jedinečný substrát pro homologní rekombinaci a inzerci požadované DNA, účinnost způsobu podle vynálezu nevyžaduje, aby buňka endogenně obsahovala nebo exprimovala specifickou DNA. Takže způsob je použitelný obecně na všechny savčí buňky a lze ho užít k expresi jakéhokoliv typu rekombinantního proteinu.
Použití trojitě sestřiženého selektovatelného markéru, v příkladném provedení trojitě sestřiženého konstruktu neo, je zárukou toho, že všechny vzniklé kolonie rezistentní k G418 jsou důsledkem homologní rekombinace (náhodná integrace nevede k produkci funkčního neo genu a tudíž neumožní přežití na G418). Takže vynález usnadňuje testování a selekci požadované homologní
-6CZ 293355 B6 rekombinace. A kromě toho je frekvence náhodné integrace v buňce, ve které dochází k homologní rekombinaci, velmi nízká.
Vzhledem k tomu, co bylo již dříve uvedeno, je zřejmé, že významnou výhodou vynálezu je to, že podstatně snižuje počet kolonií, které je třeba testovat pro identifikaci vysoce produktivních klonů, tj. buněčných linií obsahujících požadovanou DNA, které secernují požadovaný protein ve vysoké hladině. V průběhu je možné identifikovat klony obsahující integrovanou požadovanou DNA pomocí screeningu 5 až 20 kolonií (ve srovnání s několika tisíci, které je třeba testovat při použití standardní náhodné integrace, nebo několika sty při užití dříve popsaných vektorů při intronovou inzerci). Navíc, jelikož bylo místo integrace předem vybráno a obsahuje transkripčně aktivní doménu, každá endogenní DNA exprimovaná v tomto místě bude poskytovat srovnatelnou, tj. vysokou hladinu požadovaného proteinu.
Navíc je předkládaný vynález výhodný tím, že umožňuje vložení amplifikovatelného genu integrací markerového vektoru. Takže když je požadovaný gen zacílen do takového místa pomocí homologní rekombinace, vynález umožňuje, aby se exprese ještě zvýšila genovou amplifikací. Co se tohoto týče, v odborné literatuře bylo publikováno, že různá genomová místa mají různou kapacitu pro amplifikací genu (Meinkoth et al., Mol. Cell. Bio.. 7: 1415-1424, 1987). Proto je tento způsob dále výhodný tím, že umožňuje umístěný požadovaného genu do specifického místa, které je jak transkripčně aktivní, tak i snadno amplifikovatelné. To významně snižuje potřebný k izolaci takových vysoce produktivních buněk.
Konkrétně, jestliže konvenční způsoby konstrukce vysoce produktivních savčích buněčných linií mohou zabrat čas 6 až 9 měsíců, předkládaný vynález umožňuje izolaci takových klonů v průměru v čase 3 až 6 měsíců. To je dáno tím, že konvenčně izolované klony se musí podrobit přinejmenším třem běhům genové amplifikace pomocí chemické/lékové rezistence, aby bylo dosaženo uspokojivé výše genové exprese. Jelikož homologně produkované klony jsou vytvářeny z předem vybraného místa, které je místem vysocké exprese, je potřeba menšího počtu amplifikace pro uspokojivou produkci.
Navíc předkládaný vynález umožňuje reprodukovatelnou selekci vysoce produktivních klonů, kde je vektor integrovaný v malém počtu kopií, typicky v jediné kopii. To je výhodné, neboť to zvyšuje stabilitu klonů a zabraňuje případným škodlivým vedlejším účinkům, které může mít velký počet kopií.
Jak již bylo uvedeno výše, systém homologní rekombinace podle vynálezu užívá kombinace „markerového“ plazmidu a „cílového“ plazmidu, které jsou dále podrobně popsány.
„Markerový“ plazmid, který je užit k označení a identifikaci transkripčního „žhavého místa“, obsahuje alespoň následující sekvence:
I) Usek DNA, která je heterologní nebo jedinečná vzhledem ke genomu savčí buňky, což slouží jako zdroj homologií a umožňuje homologní rekombinaci (s DNA obsaženou v druhém, „cílovém“ plazmidu). Konkrétně úsek jedinečné DNA (I) obecně obsahuje bakteriální, virovou, kvasinkovou, syntetickou nebo jinou DNA, která normálně není přítomna v genomu savčí buňky a která neobsahuje významnou homologií nebo sekvenční identitu k DNA obsažné v genomu savčí buňky. Tato sekvence musí být nezbytně dostatečně odlišná od savčí DNA, takže nedochází k rekombinaci s hostitelským genomem prostřednictvím homologní rekombinace. Velikost takové jedinečné DNA je obecně alespoň 2 až lOkilobází, nebo více, výhodněji nejméně 10 kb, neboť některé jiné výzkumy uvádějí zvýšenou frekvenci cílené rekombinace, když je zvětšena velikost homologního úseku (Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989).
Horní limit velikosti jedinečné DNA, která slouží jako místo pro homologní rekombinaci se sekvencí v druhém cílovém vektoru, je dána z velké míry omezeními plynoucími ze stability
-7CZ 293355 B6 (jestliže je DNA příliš velká, nesnadno se integruje do chromozomu, a navíc s příliš velkou DNA se obtížně pracuje).
II) DNA obsahují fragment DNA selektovatelného markéru, typicky exon dominantního selektovatelného markerového genu. Jedinou nezbytnou vlastností takové DNA je to, že nekóduje funkční selektovatelný markerový protein, dokud není exprimována ve spojení se sekvencí obsahující cílový plazmid. Typicky cílový plazmid obsahuje zbývající exony dominantního selektovatelného markerového genu (ty, které nejsou obsaženy v „cílovém“ plazmidu). Funkční selektovatelný markér je nezbytně produkován pouze, proudu dojde k homologní rekombinaci (která vede k asociaci a expresi markerové sekvence DNA (I) společně s částí fragmentu DNA selektovatelného markéru, která je obsažena v cílovém plazmidu.
Jak bylo již uvedeno, předkládaný vynález užívá jako příklad dominantního selektovatelného markéru, kteiý je rozdělen do dvou vektorů, gen neomycinfosfotransferázy. Ale i jiné selektovatelné markéry jsou vhodné, např. gen pro histidinoldehydrogenázu, gen hygromycinfosfotransferázy ze salmonely, gen thymidinkinázy z viru Herper simplex, gen adenosindeaminázy, gen glutaminsyntetázy a gen hyoxantinguaninfosforibosyltransferázy.
III) DNA, která kóduje protein funkčního selektovatelného markéru, kterýžto selektovatelný markér je odlišný do selektovatelné markerové DNA (II). Tento markér umožňuje úspěšnou selekci savčích buněk, ve kterých je markerový plazmid úspěšně integrovaný v buněčné DNA. Výhodněji je žádoucí, aby markerový plazmid obsahoval dvě DNA dominantního selektovatelného markéru, které jsou umístěny na opačných koncích vektoru. T je výhodné proto, že to umožňuje selekci integrantů pomocí různých selekčních činidel a dále to umožňuje selekci buněk, které obsahují celý vektor. Navíc jeden z markérů může být amplifikovatelný markér, který podporuje amplifikaci genu, jak bylo popsáno v předchozím textu. Kterýkoliv z dominantních selektovatelných markérů uvedených v (II) může být užit stejně dobře jako další odborníkovi známé markéry.
Navíc markerový plazmid může ještě volitelně obsahovat vzácná místa pro restrikční endonukleázy. To je případně potřebné pro usnadnění štěpení. Pokud jsou taková místa přítomna, měla by být v blízkosti středu jedinečného úseku který působí jako substrát pro homologní rekombinaci. Výhodně je taková sekvence dlouhá alespoň 12 nukleotidů. Bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcového zlomu podobným způsobem zvyšuje frekvenci homologní rekombinace (Choulika et al., Mol. Cell., Biol. 15: 1968-1973,1995). Avšak přítomnost takové sekvence není nezbytná.
„Cílový plazmid“ obsahuje alespoň následující sekvence:
1) Stejný jedinečný úsek DNA, který je obsažen také vmarkerovém plazmidu nebo takový úsek DNA, který má dostatečnou homologii nebo sekvenční identitu, tak aby uvedená DNA byla schopna homologní rekombinace s jedinečným úsekem (I) v markerovým plazmidu. Vhodné typy DNA již byly popsány výše v popisu jedinečného úseku DNA (1) markerového plazmidu.
2) Zbývající exony dominantního selektovatelného markéru, z nichž jeden exon je obsažen jako (II) v markerovém plazmidu popsaném výše. Nezbytnou vlastností tohoto fragmentu DNA je to, že poskytuje funkční (selektovatelný) markerový protein pouze v případě, jestliže se cílový plazmid integruje homologní rekombinaci (kde taková rekombinace vede k asociaci této DNA sjiným fragmentem DNA selektovatelného markéru obsaženým ve markerovým plazmidu), a dále to, že umožňuje inzerci požadované exogenní DNA. Typicky tato DNA obsahuje zbývající exony DNA selektovatelného markéru, které jsou odděleny intronem. Např. tato DNA obsahuje první dva exony genu neo a markerový plazmid obsahuje třetí exon (zadní třetinu genu neo).
3) Cílový plazmid také obsahuje požadovanou DNA, např. DNA kódující požadovaný polypeptid, výhodně vloženou do fragmentu DNA selektovatelného markéru, obsaženého v plazmidu. Typicky je DNA vložena do intronu, který leží mezi exony DNA selektovatelného markéru.
-8CZ 293355 B6
To zaručuje, že požadovaná DNA se také integruje, jestliže dojde k homologní rekombinaci cílového plazmidu a markerového plazmidu. Tento intron buď může být přirozeně se vyskytující intron nebo může být uměle vytvořen ve fragmentu DNA dominantního selektovatelného markéru.
Tato DNA kóduje požadovaný protein, výhodně takový protein, který má požadované farmaceutické nebo jiné vlastnosti. Typicky kóduje DNA savčí protein, např. je to imunoglobulin nebo imunoadhesin, jak je dále uvedeno v příkladech. Avšak vynález se v žádném případech neomezuje pouze na produkci imunoglobulinů.
Jak bylo již uvedeno dříve, způsob klonování podle předkládaného vynálezu je vhodný pro jakoukoliv savčí buňku, neboť pro svou účinnost nevyžaduje přítomnost žádné specifické sekvence nebo sekvencí. Obecně k takovým savčím buňkám patří buňky, které se typicky užívají k expresi proteinů jako jsou např. buňky CHO, myelomové buňky, buňky COS, BHK, Sp2/0, NIH 3T3 a HeLa. V následujících příkladech byly užity buňky CHO. K jejich výhodám patří to, že jsou schopné dobře růst v kultuře a do vysoké hustoty, a že jsou schopné exprimovat savčí proteiny jako jsou např. imunoglobuliny v biologicky aktivní formě.
Buňky CHO byly kromě toho z větší části vybrány i proto, že byly již předtím použity původci pro expresi imunoglobulinů (pomocí vektorů obsahujících translačně oslabený dominantní selektovatelný markér, popsaných dříve). Tudíž v laboratoři původce měli značnou zkušenost s použitím těchto buněk pro expresi. Ale na základě uvedených příkladů lze rozumně očekávat podobné výsledky i při použití jiných savčích buněk.
Obecně transformace nebo transfekce savčích buněk podle předkládaného vynálezu se provádí obvyklým způsobem odborníkovi známým. Aby nebyl vynález podrobněji a srozumitelněji vysvětlen, uvádíme následující příklady konstrukce vektorů a jejich použití.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Návrh a příprava markerových a cílových plamidových vektorů
Markerový plazmid nazvaný „Desmond“ byl sestaven z následujících prvků:
a) Gen dihydrofolátreduktázy (DHFR) z myší, vložený do transkripční kazety, obsahující betaglobinový promotor myši na 5-konci před počátečním místem DHFR a polyadenylační signál bovinního růstového hormonu na 3'konci od stop-kodonu. Transkripční kazeta DHFR byla izolována zTCAEó, expresního vektoru vytvořeného dříve vnáší laboratoři (Newman et al., 1992, Biotechnology 10: 1455-1460).
b) Gen β-galaktoosidázy zE coli - konečně dostupný, získaný od firmy Promega jako kontrolní vektor ppSV-fJ-galaktosidáza, katalog, č. El081.
c) DNA bakuloviru, komerčně dostupná, získaná od firmy Clontech jako pBAKPAK.8, katalog, č. 6145-1.
d) Kazeta obsahující promotorový a zesilovací prvek z cytomegaloviru a viru SV40. Tato kazeta byla vytvořena pomocí PCR z derivátu expresního vektoru TCAE8 (Raff et al., Blood 83: 435^445, 1994. zesilovací kazeta byla vložena do bakulovirové sekvence, která byla předtím modifikována vložením vícenásobného klonovacího místa.
-9CZ 293355 B6
e) Gen GUS (glukuronidáza) zE. coli, komerčně dostupný, získaný od firmy Clontech jako pB 101, katalog. Č.E1541.
f) Gen luciferázy světlušky, komerčně dostupný, získaný od firmy Promega jako pGem-luc, katalog, č. El541.
g) Gen histidinoldehydrogenázy (HisD) ze S. typhimurium. Tento gen nám byl původně darován (Donahue et al, gene 18: 47-59, 1982) a byl vložen do transkripční kazety obsahující myší β-globinový promotor na 5'-konci genu a polyadenylační signál SV40 na 3'-konci genu.
Prvky DNA popsané v odstavcích a) až g) byly vloženy do plazmidové kostry odvozené z plazmidu pBR a vytvořily souvislý úsek DNA velikosti 7,7 kb, který je nazván na přiložených obrázcích „homologie“. Termín homologie se v tomto smyslu týká sekvencí DNA, které nejsou součástí savčího genomu a jsou užity k tomu, aby podpořily homologní rekombinaci mezi transfekovanými plazmidy, které sdílejí stejné homologní sekvence DNA.
h) Gen neomycinfosfotransferázy z TN5 (Davis a Smith, Ann. Rev. Micro 32: 469-518, 1978). Úplný gen neo byl subklonován do plazmidu pBluescriptSK-(Stratgene., katalog, č. 212205) pro usnadnění genové manipulace. Pak byl syntetický linker (spojovací prvek) vložen do jedinečného místa Pstl vyskytujícího se vkodonech pro aminokyseliny 51 až 52 genu neo. Linker kódoval nezbytné DNA prvky pro vytvoření umělého donorového setřihového místa („splice donor“), vmezeřeného intronu a akceptorového sestřihového místa („splice acceptor“) v genuneo, čímž se vytvořily dva oddělené exony, které jsou označeny jako exony neol a neo2. Kodon neol kóduje prvních 51 aminokyselin neo a exon neo2 kóduje zbývajících 203 aminokyselin a stop-kodon proteinu A. V intronu bylo také vytvořeno kolonovací místo Notl.
Exon neo2 byl dále rozdělen tak, že vytvořil exony neo2 a neo3. Toho bylo dosaženo takto: Byla navržena sada trimerů PCR pro amplifikaci úseku DNA kódujícího exon neol, intron prvních 111 2/3 aminokyselin exonu neo2. PCR primer na 3' konci vedl k vložení nového 5' sestřihového místa ležícího bezprostředně za druhým nukleotidem kodonu pro 111 aminokyseliny v exonu neo2, tudíž k vytvoření nového menšího exonu 2. Fragment DNA kódující původní exon 1, intron a nový exon 2 byl pak subklonován a pomnožen ve vektoru odvozeném z pBR. Zbytek původního exonu 2 byl užit jako templát pro jiný cyklus PCR, kdy se vytvořil exon 3. 5'primer pro tuto PCR vnesl nové akceptorové sestřihové místo na 5'konci nově vytvořeného exonu 3, tj.před posledním nukleotidem kodonu pro 111. aminokyselinu. Výsledné 3 exony genu neo kódují následující informaci: exon 1 - prvních 51 aminokyselin nebo, exon 2 - dalších 111 2/3 a exon 3 - konečný 19 1/3 aminokyselin a translační sto-kodon genu neo.
Exon neo3 byl vložen společně s výše uvedenými DNA prvky do markerového plazmidu „Desmond“. Exony neol a neo2 byly vloženy do cílového plazmidu „Molly“. Klonovací místo Notl vytvořené v intronu mezi exony 1 a 2 bylo užito v následujících klonovacích krocích pro vložení požadovaných genů do cílového plazmidu.
Byl také vytvořen druhý cílový plazmid „Mandy“. Tento plazmid je téměř shodný s plazmidem „Molly“ (některá restrikční místa ve vektoru byl změněna), až na to, že původní geny HisD aDHFR byly inaktivovány. Tyto změny byly do plazmidu vneseny proto, že buněčná linie Desmond již nebyla dále kultivována za přítomnosti histidinolu, proto nebyla nutná přítomnost druhé kopie genu HisD. Navíc byl inaktivován gen DHFR, aby bylo jisté, že pouze jediný gen DHFR, a sice ten, který je přítomen v markerovém místě plazmidu Desmond, bude amplifikovatelný ve vzniklé buněčné linii. Plazmid „Mandy“ byl tedy z plazmidu „Molly“ odvozen pomocí následujících modifikací:
I) Do středu kódujícího úseku DHFR byl vložen syntetický linker. Tento linker vytvořil stop-kodon a posunul zbývající úsek kódující DHFR mimo čtecí rámec, čímž se tento gen stal nefunkčním.
-10CZ 293355 B6
II) Část genu HisD byla odstraněna a nahrazena fragmentem HisD, který byl vytvořen pomocí PCR a postrádal promotor a počáteční kodon genu.
Obrázek 1 ukazuje uspořádání těchto DNA prvků v markerovém plazmidu „Desmond“. Obrázek 2 znázorňuje uspořádání těchto DNA prvků v prvním cílovém plazmidu „Molly“. Obrázek 3 ukazuje možné uspořádání různých prvků DNA v genomu CHO, jestliže došlo k integraci DNA plazmidu Molly do CHO buněk označených pomocí plazmidu Desmond. Obrázek 9 znázorňuje cílový plazmid Mandy.
Konstrukce markerového i cílového plazmidu zvýše uvedených prvků DNA byla provedena pomocí standardních způsobů odborníkovi známých (viz např. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Asubel et al., eds, 1987, John Wiley and Sons). Všechny plazmidy byly množeny a udržovány pomocí E. coli XLI blue (Stratagene, katalog, č. 200236). Příprava plazmidů ve velkém měřítku byla provedena pomocí soupravy Wizard Maxiprep DNA Purification Systém(R) (Promega) podle pokynů výrobce.
Příklad 2
Příprava označené linie buněk CHO
1. Buněčná kultura a transfekce buněk pro přípravu označené linie CHO
DNA markerového plazmidu byla linearizována štěpením Bstl 1071 přes noc při 37 °C. Linearizovaný vektor se precipitoval etanolem a resuspendoval ve sterilním TE na koncentraci 1 mg/ml. Linearizovaný vektor byl vnesen do buněk ovarií Čínského křečka (CHO buněk) DG44 (Urlaub et al., Som. Cell and Mol. Gen. 12: 555-566, 1986) elektroporací podle následujícího postupu:
Exponenciálně rostoucí buňky byly sklizeny centrifugací, jedenkrát promyty v ledovém SBS (pufrovaný roztok sacharózy: 272mM sacharóza, 7mM fosforečnan sodný, pH 7,4, lmM chlorid hořečnatý) a pak resuspendovány v SBS na koncentraci 107 buněk/ml. Po 15minutové inkubaci na ledu bylo 0,4 ml buněčné suspenze smícháno se 40 pg linearizované DNA v elektroporační kývete najedno použití. Buňky byly podrobeny elektrickému „šoku“ pomocí zařízení Electrocell manipulátor, BTX (San Diego, A) s nastavením napětí na 230 V, kapacitance 400 pF a odparu 13 Ω. Buňky byly po šoku smíchány s 20 ml předehřátého kultivačního média pro CHO buňky (CHO-S-SFMII, Bibco/BRL, katalog, č. 31033-012) a vysety na 96jamkové destičky pro tkáňové kultury. 48 hodin po elektroporací byly destičky naplněny selekčním médiem (v případě kotransfekce s plazmidem Desmond bylo selekčním médiem médium CHO-S-SFMII bez hypoxantinu nebo thymidinu, doplněné 2mM histidinolem (Sigma, katalog, č. H6647). Destičky byly udržovány v selekčním médiu po 30 dnů, nebo až do doby, kdy byl patrný růst buněk v některých jamkách. Tyto buňky pak byly přeneseny z jamky v destičce a dále kultivovány ve 120ml kultivační rotační láhvi, kde byly pak udržovány v selekčním médiu po celou dobu.
Příklad 3
Charakterizace označených linií CHO
a) Analýza Southemovým přenosem
Genomová DNA byla izolována ze všech trvale rostoucích označených buněk CHO. DNA byla izolována pomocí soustavy „Easy®DNA kit“ firmy Introgen podle pokynů výrobce. Genomová
-11 CZ 293355 B6
DNA byla naštěpena enzymem HindlII přes noc při 37 °C a pak analyzována Southemovým přenosem se sondami specifickými pro gen DHFR, které byly připraveny a označeny dioxygeninem pomocí PCR. Hydridizace a promývání byly provedeny pomocí zařízení „DIG Easy Hyb“ (Boehringer Mannheim, katalog, č. 1603 558) a soupravy „DIG Wash and Block Buffer Set“ (Boehringer Mannheim, katalog, č. 1585 762) podle pokynů výrobce. Vzorky DNA obsahující jediný pás hybridizující se sondou DHFR představovaly klony Desmond vzniklé zjediné buňky, ve které se integrovala jediná kopie plazmidu. Tyto klony byly ponechány pro další analýzu. Ze 45 celkem izolovaných rezistentních buněčných linií bylo pouze 5 linií, kde se integrovala jediná kopie. Obr. 4 ukazuje Southemův přenos všech 5 klonů obsahujících jedinou kopii plazmidu Desmond. Jména klonů jsou uvedena v popisu obrázku.
b) Analýza northemovým přenosem
Celková RNA byla izolována ze všech klonů obsahujících jedinou kopii Desmond pomocí činidla „TRIzol“ (Gibco/BRL, katalog, č. 15596-026) podle pokynů výrobce. 10 až 20 pg RNA byla analyzováno ve dvou opakováních na formaldehydovém gelu. Výsledné membrány s přenesenou RNA byla testovány sondami označenými dioxygeninem pomocí PCR, a sice pro I) messenger (tj. messengerová RNA) DHFR, II) messenger HisD a III) messenger CAD. CAD je trifunkční protein účastnící se biosyntézy uridinu (Wahl et al., J. Biol. Chem. 254, 17: 8679-9689, 1979), který je exprimován shodně ve všech buněčných typech. Zde byl použit jako vnitřní kontrola a pro pomoc při kvantifikaci nanesené RNA. Hybridizace a promývání byly provedeny pomocí výše zmíněných činidel a zařízení firmy Boehringer Mannheim. Výsledky analýzy northemovým přenosem jsou uvedeny na obr. 5. Klon s jedinou kopií plazmidu Desmond, který má nejvyšší intenzitu signálu jak pro messenger HisD tak pro messenger DHFR je klon 15C9, analyzovaný v dráze 4 v obou panelech na zmíněném obrázku. Tento klon byl nazván „označená buněčná linie“ a použit v dalších cílových experimentech, která jsou uvedeny v následujících příkladech.
Příklad 4
Exprese protilátek anti-CD20 v buňkách CHO označených plazmidem Desmond
C2B8, chimérická protilátka rozpoznávající povrchový antigen B-buněk CD20, byla klonována a exprimována již dříve v naší laboratoři (Reff et al., Blood 83: 434—45, 1994). Fragment DNA velikosti 4,1 kb obsahující geny pro lehký a těžký řetězec, společně s nezbytnými regulačními prvky (eukaotický promotor a polyadenylační signály) byl vložen do umělého intronu vytvořeného mezi exonem 1 a exonem 2 genu neo obsaženého vklonovacím vektoru odvozeném z plazmidu pBR. Tento nově vytvořený fragment DNA o velikosti 5 kb (obsahující exon neol, C2B8 a exon neo2) byl vystřižen a použit k sestavení cílového plazmidu Molly. Ostatní prvky DNA použité v konstrukci plazmidu Molly byly shodné s prvky užitými při konstrukci markerového plazmidu Desmond, jak byly popsány dříve. Úplná mapa plazmidu Molly je uvedena na obrázku 2.
Cílový vektor Molly byl před transfekcí linearizován štěpením Kpni a PacI, precipitován etanolem a resuspendován ve sterilním TE na koncentraci 1,5 mg/ml. Linearizovaný plazmid byl vnesen do exponenciálně rostoucích buněk v podstatě způsobem, který byl popsán v předchozím textu s výjimkou toho, že v každé elektroporaci bylo užito 80 pg DNA. 48 hodin po elektroporaci bylo do 96jamkových destiček přidáno selekční médium CHO-SSFMI se 400 pg/ml geneticinu (G418, Gibco/BRL, katalog, č. 10131-019). Destičky byly udržovány v selekčním médiu po 30 dnů nebo až do doby, kdy se projevil růst z některých jamkách. Tento růst byl považován za klonální expanzi jediné buňky rezistentní kG418. Supematanty ze všech jamek rezistentních k G418 byly testovány na tvorbu C2B8 standardním testem ELISA a všechny produktivní klony byl rozmnoženy ve 120ml rotačních kultivačních lahvích a podrobeny další analýze.
-12CZ 293355 B6
Charakterizace zaměřených buněk vylučujících protilátku
V tomto experimentu bylo celkem provedeno 50 elektroporací s cílovým plazmidem Molly, přičemž každá byla vyseta na samostatné 96jamkové destičce. Souhrnně bylo získáno 10 živo5 taschopných klonů vylučujících protilátku anti-CD20 a pomnoženo ve 120ml kultivačních lahvích. Za všech klonů byla izolována genomová DNA, která pak byla analyzována Southernovým přenosem, aby se určilo, zda klony představují výsledek jediné homologní rekombinace nebo zda došlo k další náhodné integraci v téže buňce. Způsob izolace DNA a Southemova analýza byla již popsána v předchozích kapitolách. Genomová DNA byla štěpena EcoRI a testována sondou, 10 kterou byl fragment konstantního úseku těžkého řetězce CD20 označený pomocí PCR dioxygeninem. Výsledky této Southemovy analýzy jsou uvedeny na obr. 6. Jak je na tomto obrázku vidět, 8 z 10 analyzovaných klonů vykazovalo jediný hybridizační pás se sondou CD20, což ukazuje, že v těchto buňkách došlo k jediné homologní rekombinaci. U 2 z 10 klonů, a sice 24G2 a 28C9, se ukázaly ještě další pásy, svědčící o tom že došlo ještě navíc k náhodné integraci na 15 jiném místě genomu.
U všech 10 klonů byla analyzována hladina protilátek anti-CD20, výsledky této analýzy ukazují následující tab. 1.
Tabulka 1
Hladina exprese anti-CD20 klonů po homologní integraci
| Klon | Anti-CD20 (pg/buňka/den) |
| 20F4 | 3,5 |
| 25E1 | 2,4 |
| 42F9 | 1,8 |
| 39G11 | 1,5 |
| 21C7 | 1,3 |
| 50G10 | 0,9 |
| 29F9 | 0,8 |
| 5F9 | 0,3 |
| 28C9* | 4,5 |
| 24G2* | 2,1 |
*Tyto klony obsahovaly ještě další náhodně integrované kopie antiCD20. Hladiny exprese v těchto klonech proto odrážejí příspěvek jak homologní integrace, tak i integrace do náhodného místa. Hladina exprese jsou uvedeny v hodnotách sekrece jednotlivých klonů v pg na jednu buňku na den (pg/buňka/den) a představují průměrnou hodnotu ze 3 nezávislých testů ELISA na 30 vzorcích odebraných ze 120ml kultivačních lahví.
Jak lze vidět z údajů v tabulce 1, existuje variabilita ve vylučování protilátky, která představuje až lOnásobek mezi klonem s největší a nejmenší sekrecí. To bylo poněkud nečekané zjištění, neboť jme očekávali podobné hladiny exprese u všech klonů, neboť gen anti-CD20 se integroval 35 do stejného místa označeného plazmidem Desmond. Avšak i tato variabilita je extrémně nízká ve srovnání s tím, co lze získat užitím tradičního způsobu náhodné integrace nebo pomocí našeho dříve popsaného systému s translačně oslabeným vektorem.
Klon 20F4, tj. klon s nejvyšší produkcí, která je výsledkem jediné integrace, byl vybrán pro další 40 zkoumání. Následující tabulka 2 ukazuje údaje o buněčné kultuře a testech ELISA ze 7denní produkční kultivace tohoto klonu.
-13CZ 293355 B6
Tabulka 2
Výsledky 7denní produkční kultivace klonu 20F4
| Den | % životaschopných | životaschopné počet/ml (x io5) | Tx2 (hodiny) | mg/1 | pg/buňka/den |
| 1 | 96 | 3,4 | 31 | 1,3 | 4,9 |
| 2 | 94 | 6 | 29 | 2,5 | 3,4 |
| 3 | 94 | 9,9 | 33 | 4,7 | 3,2 |
| 4 | 90 | 17,4 | 30 | 6,8 | 3 |
| 5 | 73 | 14 | 8,3 | ||
| 6 | 17 | 3,5 | 9,5 |
Klon 20F4 byl na počátku, tj. 0. den, naočkován do 120ml kultivační láhve v hustotě 2 x 105 buněk/ml. Po následujících 6 dnů se provádělo počítání buněk, stanovila se doba zdvojení kultury a odebral se 1 ml vzorek z kultivační lahve a ten byl analyzován na vylučovanou protilátku anti-CD20 testem ELISA.
Tento klon dosáhl průměrné hodnoty vylučování protilátky 3 až 5 pg/buňka/den, jak ukázaly výsledky ELISA testů. Tato hodnota se shoduje s hodnotami, které jsou získány již dříve v naší laboratoři také u jiných vysoce exprimujících klonů s jednou kopií genu, které byly připraveny pomocí náhodně se integrujících vektorů s oslabenou translací. Výsledky ukázaly následující fakta:
1) Místo označené v genomu CHO buněk markerovým plazmidem Desmond je transkripčně vysoce aktivní a proto představuje vynikající místo pro expresi rekombinantních proteinů.
2) Cílení pomocí homologní rekombinace může být provedeno uvedenými vektory a dochází k němu s frekvencí, která je dostatečná k tomu, aby tento systém byl vhodnou a žádoucí alternativou k dosavadnímu způsobu náhodné integrace.
Pro další demonstraci účinnosti tohoto vynálezu bylo ukázáno, že místo je také amplifikovatelné, což vede ještě k vyšším úrovním exprese a vyššímu vylučování proteinu. Amplifikace bylo dosaženo tak, že se na 96jamkovou kultivační misku vyselo sériové ředění buněk 20F4, s počáteční hustotou 2,5 x 104 buněk/ml, a tyto buňky se potom kultivovaly v médiu CHO-SSFMI, kam se přidal 5,10,15 nebo 20nM methotrexat. Klony vylučující anti-CD20 se testovaly ELISA a klony nejvyšší sekrecí byly dále analyzovány. Souhrn výsledků z tohoto amplifikačního pokusu je uveden v následující tabulce 3.
Tabulka 3
Souhrnné údaje o amplifikaci 20F4
| nM MTX | počet testovaných jamek | exprese mg/1, 96 jamek | počet jamek dále pěstovaných | exprese pg/buňka/den kultivační láhev |
| 10 | 56 | 3-13 | 4 | 10-15 |
| 15 | 27 | 2-14 | 3 | 15-18 |
| 20 | 17 | 4-11 | 1 | nestanoveno |
Amplifikace 20F4 byla provedena jak je popsáno v textu, použitím koncentrací methotrexatu uvedených v tabulce. Supematanty ze všech přežívajících kolonií na 96jamkové destičce byly testovány ELISA, rozsahu exprese anti-CD20 je uveden ve 3. sloupci tabulky. Na základě těchto výsledků byly vybrány klony s nejvyšší produkcí a dále namnoženy ve 120ml kultivačních lah
-14CZ 293355 B6 vích, na vzorcích supematantu z těchto lahví pak byly provedeny testy ELISA pro stanovení expresní hladiny vyjádřené v 5. sloupci v pg/buňka/den.
Tyto údaje jasně ukazují, že místo může být amplifikováno v přítomnosti methotrexatu. Klony z amplifikací s 10 a 15 nM methotrexatem produkovaly v rozsahu 15 až 20 pg/buňka/den.
Klon z 15nm methotrexytu označený 20F4-15A5 byl vybrán jako buněčná linie s nejvyšší produkcí. Tento klon byl vybrán z 96jamkové destičky, kde rostlo pouze 22 jamek, a proto lze předpokládat, že pochází z jediné buňky. Tento klon byl podroben ještě další amplifikaci s methotraxatem. Jak již bylo popsáno dříve, sériové ředění bylo vyseto na 96jamkové kultivační misky a kultivovalo se v médiu CHO-SSFMI s přídavkem 200, 300 a 400nM methotrexatu. Přeživší klony byly analyzovány ELISA a několika klonů s vysokou produkcí bylo namnoženo ve 120ml kultivačních lahvích a dále analyzováno. Přehled výsledků ze druhého amplifikačního experimentuje uveden v následující tabulce 4.
Tabulka 4
Výsledky amplifíkace 20F4-15A5
| nM MTX | počet testovaných jamek | exprese mg/1, 96 jamek | počet jamek dále pěstovaných | exprese pg/buňka/den kultivační láhev |
| 200 | 67 | 23-70 | 1 | 50-60 |
| 300 | 86 | 21-70 | 4 | 55-60 |
| 400 | 81 | 15-75 | 3 | 40-50 |
Amplifíkace 20F4-15A5 pomocí methotrexatu byla provedena jak je popsáno v textu. Jamky s nejvyšší produkcí, jejichž čísla jsou uvedena v 4. sloupci, byly namnoženy ve 120ml kultivačních lahvích. Exprese buněčných linií odvozených z těchto buněk je uvedena v 5. sloupci v pg/buňka/den.
Klon s nejvyšší produkcí pochází z amplifíkace s 250nM methotrexatem. Tento klon 20F415A5-250A6 byl vybrán z 96jamkové destičky, kde rostlo pouze několik málo jamek, proto lze předpokládat, že pochází z jediné buňky. Souhrnně lze uvést, že údaje v tabulkách 3 a 4 přesvědčivě ukazují, že dvojitý proces amplifíkace s methotrexatem je dostatečný pro dosažení hladiny exprese 60 pg/buňka/den, která se blíží maximální expresní kapacitě imunoglobulinů v savčí buňce (Reff, M.E., Curr. Opinion. Biotech. 4: 573-576, 1993). Schopnost dosáhnout maximální expresní kapacity již po dvou opakováních methotrexatové amplifíkace dále zvyšuje užitečnost systému homologní rekombinace podle předkládaného vynálezu. Systém náhodné integrace typicky vyžaduje více než dva kroky amplifíkace s methotrexatem k dosažení takové hladiny exprese a je podstatně méně spolehlivý z hlediska snadnosti amplifíkace. Takže systém homologní rekombinace podle vynálezu nabízí účinnější a rychlejší způsob, jak dosáhnout vysoké exprese u savčích buněk.
Příklad 5
Exprese protilátky proti lidskému CD23 v CHO buňkách označených plaumidem Desmond
CD23 je receptoro IgE s nízkou afinitou, který zprostředkovává vazbu IgE na B- a T-lymfocyty (Sutton, B.J. a Gould, H.J., Nátuře 366: 421-428, 1993). Monoklonální protilátka 5E8 proti lidskému CD23 je lidská monoklonální protilátka gama-1, která byla v současnosti klonována a exprimována v naší laboratoři. Tato protilátka je popsána v současně podané patentové přihlášce č. 08/808 085 (podané 20. února 1997).
-15CZ 293355 B6
Geny pro lehký a těžký řetězec 5E8 byly klonovány do savčího expresního vektoru N5KG1, který je derivátem vektoru NEOSPLA (Bamett et al., in Antibody Epression and Engineering, H.Y. Yang adn T. Imanaka, eds., pp. 27-40, 1995) a přitom byly do genů vneseny dvě modifikace. Nedávno jsme v naší laboratoři pozorovali poněkud vyšší sekreci lehkých imunoglobulinových řetězců ve srovnání s těžkými řetězci v jiných expresních (Bamett et al., in Antibody Epression and Engineering, H.Y. Yang and T. Imanaka, eds., pp. 27-40, 1995) konstruktech (Reff et al., 1997, nepublikováno). Abychom odstranili tento nedostatek, změnili jsme gen pro těžký řetězec 5E8 tím že jsme dodali silný promotorový/zesilovací prvek bezprostředně před počáteční místo genu. V následujících krocích byl z vektoru N5KG1 izolován fragment DNA velikosti 2,9 kb obsahující modifikované geny pro lehký a těžký řetězec 5E8, a byl vložen do cílového vektoru Mandy. Příprava vektoru Molly obsahujícího 5E8 a elektroporace do CHO buněk 15C9 označených plazmidem Desmond byly provedeny v podstatě postupem popsaným v předchozím textu.
Jednou modifikací proti dříve popsaným postupům bylo použití jiného kultivačního média. CHO buňky označené plazmidem Desmond byly kultivovány v médiu CD-CHO bez proteinů (Gibco/BRL, katalog, č. AS21206) s přídavkem 3 mg/1 rekombinantního inzulínu (zásobní roztok 3 mg/ml, Gibco/BRL, katalog, č. AS22057) a 8mM glutaminu (zásobní roztok 200nM, Gibco/BRL, katalog, č. AS25030-081). Poté následovalo selekce transformovaných buněk ve výše uvedeném médiu doplněném 400 mg/ml geneticinu. V tomto experimentu bylo provedeno 20 elektroporací a vyseto na 96jamkové kultivační misky. Buňky rostly a vylučovaly anti-CD23 celkem v 68 jamkách, které všechny pocházely z jedné G418 rezistentní buňky. 12 z těchto jamek bylo namnoženo ve 120ml kultivačních lahví a dále analyzováno. Máme za to, že zvýšený počet klonů izolovaných v tomto pokusu (68 ve srovnání s 10 pro CD20, jak bylo popsáno v příkladu 4) je způsobeno vyšší klonovací účinností a mírou přežívání v médiu CD-CHO ve srovnání s médiem CHO-S-FMII. Expresní hladiny těchto klonů analyzované v kultivačních lahvích byly v rozmezí od 0,5 do 3,0 pg/buňka/den, což je v dobré shodě s hladinami pozorovanými pro klony anti-CD20. Klon CD23 snejvyšší expresí, označený 4H12, byl podroben methotrexatové amplifikaci, aby se zvýšila hladina exprese. Tato amplifikace byla provedena způsobem podobným způsobu, který byl popsán pro anti-CD20 v příkladu 4. Sériové ředění exponenciálně rostoucích buněk 4H12 bylo vyseto na 96jamkové kultivační misky a kultivováno v médiu CD-CHO s přídavkem 3 mg/1 inzulínu, 8mM glutaminu a 30, 35 a 40mM methotrexatu. Přehled výsledků tohoto amplifikačního pokusuje uveden v následující tabulce 5.
Tabulka 5
Souhrn výsledků z amplifikace 4H12
| nMMTX | počet testovaných jamek | exprese mg/1, 96 jamek | počet jamek dále pěstovaných | exprese pg/buňka/den kultivační láhev |
| 30 | 100 | 6-24 | 8 | 10-25 |
| 35 | 64 | 4-27 | 2 | 10-15 |
| 40 | 96 | 4-20 | 1 | nestanoveno |
Klon s nejvyšší expresí byl získán z 30nM koncentrace z destičky, n a které rostlo jen 22 jamek. Tento klon, označený 4H12-30G5, reprodukovatelně vylučoval protilátku v množství 18 až 22 pg/buňka/den. To je stejná úroveň exprese, jaká byla pozorována po první amplifikaci klonu 20F4 produkujících anti-CD20 (klon 20F4-15A5, produkující 15 až 18 pg/buňka/den, popsaný v příkladu 4). Tyto údaje dále podporují pozorování, že amplifikace v takto označeném místě v CHO buňkách je reprodukovatelná a účinná. V současné době probíhá druhá amplifikace této buněčné linie vybrané ze 30nM koncentrace. Očekáváme, že saturační úroveň exprese lze s protilátkou CD23 dosáhnout po 2 amplifikacích, stejně jako tomu bylo u anti-CD20.
-16CZ 293355 B6
Příklad 6
Exprese imunoadhesinu v buňkách CHO označených plazmidem Desmond
CTLA-4, člen superrodiny Ig, se vyskytuje na povrchu T-lymfocytů a má se za to, že hraje důležitou roli v antigenně-specifické aktivaci T-buněk (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905, 1988, Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569, 1991. Aby bylo možné podrobněji zkoumat úlohu molekul CTLA-4 v aktivační dráze, byl připraven rozpustný fúzní protein obsahující extracelulámí doménu CTLA-4 spojenou se zkrácenou formou konstantního úseku lidského IgGl (Linsley et al., viz výše). My jsme exprimovali tento fúzní protein v savčím expresním vektoru BLECH1, který je derivátem plazmidu NEOSPLA ((Bamett et al., inAntibody Epression and Engineering, H.Y. Yang and T. Imanaka, eds., pp. 27-40, 1995). Fragment velikosti 800 bp kódující CTLA-4 Ig byl izolován z tohoto vektoru a vložen mezi místa Scal a BglII v plazmidu Molly.
Příprava CTLA-4Ig-Molly a elektroporace do klonu 15C9 buněk CHO označených plazmidem Desmond byly provedeny v podstatě stejně jako v případě anti-CD20 popsaném v předchozím příkladu. Z 96jamkových kultivačních misek bylo izolováno 18 jamek exprimujících CTLA-4 a dále kultivováno ve 120ml kultivační lahvích. Byla provedena Southemova analýza DNA z každého z těchto klonů, aby se určilo, kolik homologních klonů obsahuje další náhodné integranty. Genomová DNA byla štěpena BglII a testovaná sondou, kterou byl konstantní úsek lidského IgGl označený dioxygeninem pomocí PCR. Výsledky této analýzy ukázaly, že 85 % klonů CTLA-4 byly pouze homologní integranty, zbývající 15 % obsahovalo jedno další náhodný integrant. Tyto výsledky podporují údaje o expresi anti-CD20 diskutované dříve, kde 80 % klonů bylo výsledkem jedné homologní integrace. Proto je možné na závěr shrnout, že tento expresní systém reprodukovatelně vede k cílené homologní integraci alespoň v 80 % vzniklých klonů.
Expresní hladiny u homologních klonů CTLA4-Ig byly v rozmezí 8 až 12 pg/buňka/den. To je rozmezí poněkud vyšší, než jaké bylo zjištěno pro klony produkující protilátky anti-CD20 a antiCD23, jak bylo již diskutováno výše. Avšak my jsme již dříve pozorovali, že vektorový systém s inzercí do intronu vede k významně vyšším hladinám exprese, než jsou obvykle uváděny hodnoty pro imunoglobuliny. V současnosti nejsme schopni poskytnout vysvětlení tohoto jevu.
Příklad 7
Zacílení anti-CD20 do jiné buněčné linie CHO označené plazmidem Desmond
Jak jsme uvedli již v předchozích příkladech, získali jsme 5 buněčných linií CHO označených jedinou kopií plazmidu Desmond (viz obr. 4 a 5). Abychom demonstrovali, že úspěch uvedené strategie cílení a integrace není důsledkem nějaké jedinečné vlastnosti klonu Desmond 15C9 a že je tudíž omezen pouze na tento klon, zavedli jsme anti-CD20 Molly do klonu Desmond 9B2 (dráha 6 na obr. 4, dráha 1 na obr. 5). Příprava DNA z Molly a elektroporace do Desmond 9B2 byly provedeny přesně jak bylo popsáno v předchozím příkladu pro anti-CD20. Z tohoto pokusu byl získán homologní integrant. Tento klon byl namnožen ve 120ml kultivační lahvi, kde produkoval protilátku anti-CD20 v průměru v množství 1,2 pg/buňka/den. To je podstatně nižší exprese, než jaká byla pozorována, když Molly byl zacílen a integrován do Desmond 15C9. Avšak tento výsledek se dal očekávat na základě výsledků northemové analýzy klonů Desmond. Jak je vidět na obr. 5, hladina MRNA klonu 9B2 je podstatně nižší než u klonu 15C9, což ukazuje, že místo v tomto klonu není tolik transkripčně aktivní jako v klonu 15C9. Takže tento experiment neukazuje jen reprodukovatelnost systému - pravděpodobně jakékoliv místo označení plazmidu Desmond může být zacíleno plazmidem Molly - ale potvrzuje také údaje z norhemové analýzy, že Desmond 15C9 vykazuje nej vyšší transkripční aktivitu.
-17CZ 293355 B6
Z výše uvedeného je zřejmé, že ačkoliv pro lepší vysvětlení a ilustraci vynálezu byla popsána specifická provedení vynálezu, je možné provést různé modifikace vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky. Tudíž vynález zahrnuje i takovéto modifikace.
Claims (41)
Hide Dependent
translated from
Claims (41)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob vložení požadované DNA do cíleného místa v genomu izolované savčí buňky, vyznačující se tím, že obsahuje následuj ící kroky:(I) transfekci nebo transformaci izolovaných savčích buněk markerovým plazmidem, který obsahuje následující sekvence:(a) úsek DNA, který je heterologní vzhledem k genomu savčí buňky, a který po integraci do genomu savčí buňky poskytuje jedinečné místo pro homologní rekombinaci, (b) fragment DNA kódující první část prvního selektovatelného markerového proteinu, a (c) DNA alespoň jednoho dalšího selektovatelného markem, který je odlišný od prvního selektovatelného markéru a který umožňuje selekci savčích buněk, kde byl úspěšně integrován markerový plazmid, (II) selekci buněk, které obsahují markerový plazmid integrovaný v genomu, na základě screeningu na alespoň jeden další selekční markér, (III) transfekci nebo transformaci selektovaných buněk cílovým plazmidem, který obsahuje alespoň následující sekvence:(a) úsek DNA, který je identický nebo dostatečně homologní s jedinečným úsekem vmarkerovém plazmidu, takže tento úsek DNA může rekombinovat s DNA prostřednictvím homologní rekombinace, (b) fragment DNA kódující druhou část stejného selektovatelného markéru, který je obsažen v markerovém plazmidu, přičemž protein prvního selekčního markéru je tvořen pouze v případě, že druhá část je exprimována společně s první částí prvního selektovatelného markem, a (IV) selekci buněk, které obsahují cílový plazmid integrovaný do cílového místa, tím že se provede screening na expresi proteinu prvního selektovatelného markem.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že fragment DNA kódující první selektovatelný markér je exon dominantního selektovatelného markéru.
- 3. Způsob podle nároku 2, vy zn ač u j í cí se t í m , že druhý plazmid obsahuje zbývající exony prvního selektovatelného markéru.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se tím, že alespoň jedna DNA kódující požadovaný protein je vložena mezi exony prvního selektovatelného markem obsaženého v cílovém plazmidu.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že cílový plazmid dále obsahuje DNA kódující dominantní selektrovatelný markér vložený mezi exony prvního selektovatelného-18CZ 293355 B6 markéru obsaženého v cílovém plazmidu, aby se umožnila koamplifikace DNA kódující požadovaný protein.
- 6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že první dominantní selektovatelný markér je vybrán ze skupiny obsahující neomecinfosfotransferázu, histidinoldehydrogenázu, dihydrofolátdreduktázu, hygromycinfosfotransferázu, thymidinkinázu z viru Herpes Simplex, adenosindeaminázu, glutaninsyntetázu a hypoxyntinguaninfosforibosyltransferázu.
- 7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že požadovaný protein je savčí protein.
- 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že protein je imunoglobulin.
- 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok stanovení hladiny RNA selektovatelného markéru kódovaného DNA podle bodu (i) (c) nároku 1 před transfekcí nebo transformací buněk cílovým plazmidem.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že další selektovatelný markér obsažený v markerovém plazmidu je dominantní selektovatelný markér vybraný ze skupiny obsahující histidinoldehydrogenázu, thymidinkinázu viru Herpes simplex, hygromycinfosfotransferázu, adenosindeaminázu a glutaminsyntetázu.
- 11. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že savčí buňka je vybrána ze skupiny obsahující buňky ovarií čínského křečka (CHO), myelomové buňky, buňky ledvin křeččích mláďat, buňky COS, buňky NOS, buňky HeLa a buňky NIH3T3.
- 12. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že buňka je buňka CHO.
- 13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první část prvního selektovatelného markéru obsahuje třetí exon genu neomycinfosfotransferázy a druhá část prvního selektovatelného markéru obsahuje první dva exony genu neomycinfosfotransferázy.
- 14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že markerový plazmid dále obsahuje sekvenci pro vzácně štěpící endonukleázu, která je vložena do úseku homologie.
- 15. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je bakteriální DNA, virová DNA nebo syntetická DNA.
- 16. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je dlouhý alespoň 300 nukleotidů.
- 17. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA má velikost v rozmezí výhodně od 300 nukleotidů do 20 kilobází.
- 18. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA má velikost v rozmezí výhodně v rozmezí od 2 do 10 kilobází.
- 19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že DNA prvního selektovatelného markéru je rozdělena alespoň do třech exonů.
- 20. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je bakteriální DNA, DNA hmyzu, virová DNA nebo syntetická DNA.
- 21. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA neobsahuje žádné funkční geny.-19CZ 293355 B6
- 22. Vektorový systém pro vkládání požadované DNA do cílového místa v genomu savčí buňky, který obsahuje přinejmenším následující:(I) markerový plazmid, který obsahuje alespoň následující sekvence:(a) úsek DNA, který je heterologní vzhledem ke genomu savčí buňky, a který po integraci do genomu savčí buňky poskytuje jedinečné místo pro homologní rekombinaci, (b) fragment DNA kódující první část prvního selektovatelného markerového proteinu, a (c) DNA alespoň jednoho dalšího selektovatelného markéru, který se liší od prvního selektovatelného markéru a který umožňuje selekci savčích buněk, kde byl úspěšný integrován markerový plazmid, (II) cílový plazmid, který obsahuje alespoň následující sekvence:(a) úsek DNA, který je identický nebo dostatečně homologní s jedinečným úsekem v markerovém plazmidu, takže tento úsek DNA může rekombinovat s uvedenou DNA prostřednictvím homologní rekombinace, (b) fragment DNA kódující druhou část stejného selektovatelného markéru, který je obsažen v markerovém plazmidu, přičemž protein prvního selektovatelného markéru je tvořen pouze v případě, kdy druhá část je exprimována společně s první částí prvního selektovatelného markéru.
- 23. Vektorový systém podle nároku 22, kde fragment DNA kódující první nebo druhou část prvního selektovatelného markéru je exon dominantního selektovatelného markéru.
- 24. Vektorový systém podle nároku 23, kde druhý plazmid obsahuje zbývající exony prvního selektovatelného markéru.
- 25. Vektorový systém podle nároku 24, kde alespoň jedna DNA kódující požadovaný protein je vložen mezi exony prvního selektovatelného markéru obsaženého v cílovém plazmidu.
- 26. Vektorový systém podle nároku 24, kde cílový plazmid dále obsahuje DNA kódující dominantní selektovatelný markér vložený mezi exony prvního selektovatelného markéru obsaženého v cílovém plazmidu, aby se zajistila koamplifikace DNA kódující požadovaný protein.
- 27. Vektorový systém podle nároku 24, kde první dominantní selektovatelný markér je vybrán ze skupiny obsahující neomycinfosfotransferázu, histidinoldehydrogenázu, dihydrofolátdreduktázu, hygromycinfosfotransferázu, thymidinkinázu z viru Herpes simplex, adenosindeaminázu, glutaminsyntetázu a hypoxantinguaninfosforibosyltransferázu.
- 28. Vektorový systém podle nároku 25, kde požadovaný protein je savčí protein.
- 29. Vektorový systém podle nároku 28, kde protein je imunoglobulin.
- 30. Vektorový systém podle nároku 22, kde další selektovatelný markér obsažený v markerovém plazmidu je dominantní selektovatelný markér vybraný ze skupiny obsahující histidinoldehydrogenázu, thymidinkinázu viru Herpes simplex, hygromycinfosfotransferázu, adenosindeaminázu a glutaminsyntetázu.
- 31. Vektorový systém podle nároku 22, který zajistí vložení požadované DNA do cílového místa v genomu savčí buňky, která je vybrána ze skupiny obsahující buňky ovarií čínského-20CZ 293355 B6 křečka (CHO), myelomové buňky, buňky ledvin křeččích mláďat, buňky COS, buňky NOS, buňky HeLa a buňky NIH3T3.
- 32. Vektorový systém podle nároku 31, kde savčí buňka je buňka CHO.
- 33. Vektorový systém podle nároku 31, kde první část prvního selektovatelného markéru obsahuje třetí exon genu neomycinfosfotransferázy a druhá část prvního selektovatelného markéru obsahuje první dva exony genu neomycinfosfotransferázy.
- 34. Vektorový systém podle nároku 22, kde markerový plazmid dále obsahuje sekvenci pro vzácně štěpící endonukleázu, která je vložena do úseku homologie.
- 35. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je bakteriální DNA, virová DNA nebo syntetická DNA.
- 36. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA podle části (I) (a) nároku 1, obsažený ve vektorovém systému markerového plazmidu, který zajišťuje homologní rekombinaci, je dlouhý alespoň 300 nukleotidů.
- 37. Vektorový systém podle nároku 36, kde jedinečný úsek DNA má velikost v rozmezí od 300 nukleotidů do 20 kilobází.
- 38. Vektorový systém podle nároku 37, kde jedinečný úsek DNA má velikost výhodně v rozmezí od 2 do 10 kilobází.
- 39. Vektorový systém podle nároku 22, kde DNA prvního selektovatelného markéru je rozdělena alespoň do třech exonů.
- 40. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je bakteriální DNA, DNA hmyzu, virová DNA nebo syntetická DNA.
- 41. Vektorový systém podle nároku 40, kde jedinečný úsek DNA neobsahuje žádné funkční geny.