BR112019011198A2 - métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região fc.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA IMUNE A FATORES DE COAGULAÇÃO.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos Serial Nos. 62/429.516 registrado em 2 de dezembro de 2016, 62/466.937 registrado em 03 de março de 2017, 62/529.866 registrado em 7 de julho de 2017, 62/558.790 registrado em 14 de setembro de 2017, e 62/582.829 registrado em 7 de novembro de 2017, cada um dos quais é incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção refere-se de modo geral ao campo de produtos terapêuticos para distúrbios hemostáticos.
ANTECEDEDENTES [0003] Hemofilia é um transtorno hemorrágico ligado ao X causado por mutações e/ou deleções em genes codificando proteínas da coagulação, em particular o gene do Fator VIII (FVIII), resultando em uma deficiência da atividade do FVIII (hemofilia A), ou o gene do Fator IX, resultando em uma deficiência da atividade do FIX (hemofilia B) (vide, por exemplo, Peyvandi, F. et a/. Haemophilia 12:82-89 (2006)). A doença é caracterizada por hemorragia espontânea e sangramento excessivo depois de trauma. O tratamento da hemofilia é por terapia de reposição tendo por alvo a restauração da atividade de FVIII e/ou FIX de modo a prevenir o sangramento espontâneo (vide, por exemplo, Mannucci, P.M., et ai., N. Engl. J. Med. 344:1773-1779 (2001).
[0004] A terapia de reposição do fator de coagulação é o principal tratamento da hemofilia. No entanto, uma substancial porção dos pacien
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2/162 tes com hemofilia, incluindo quase 30% dos pacientes com hemofilia A severa desenvolve inibidores contra os produtos dos fatores de coagulação, reduzindo muito sua eficácia nestes pacientes. A resposta imune é uma resposta imune dependente de células T ou mediada por de células B direcionada contra o fator de coagulaçâo infundido, por exemplo, uma terapia de reposição de FVIII.
[0005] Embora pessoas com hemofilia severa tenham mais probabilidade de desenvolver inibidores, aproximadamente 5 a 8% das pessoas com hemofilia A branda ou moderada desenvolve inibidores. O desenvolvimento de inibidores dos fatores de coagulaçâo pode ser fatal porque os anticorpos podem inibir não somente o concentrado de fatores infundido, mas também qualquer pequena percentagem de proteína de fatores que o corpo estiver produzindo naturalmente. Portanto, uma pessoa com hemofilia branda ou moderada que desenvolva um inibidor agora, em efeito, tem hemofilia severa (<1% de fator circulante).
[0006] Aproximadamente 2 a 3% das pessoas com hemofilia B desenvolvem inibidores. Embora os inibidores em pessoas com hemofilia B sejam menos comuns do que com hemofilia A, pode ser ainda mais desafiante já que cerca da metade dos pacientes com inibidores da hemofilia B vão desenvolver uma reação anafilática contra o fator IX infundido, a qual pode ser apresentar risco de vida.
[0007] Portanto, continua a existir a necessidade de métodos de indução de tolerância imune em um ser humano o qual já tenha desenvolvido uma resposta imune para um ou mais fatores de coagulaçâo e o qual não tenha respondido a uma terapia de tolerância imune prévia.
BREVE SUMÁRIO [0008] A presente invenção proporciona um método de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a
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3/162 administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o ser humano tenha desenvolvido um inibidor contra o fator de coagulação e tenha falhado em responder a uma ou mais terapias de tolerância imune prévias contra o fator de coagulação. Em alguns aspectos, o método adicionalmente compreende medir o nível de uma resposta imune inibitória antes da administração e medir o nível de uma resposta imune inibitória depois da administração. Em alguns aspectos, o método adicionalmente compreende comparar o nível da resposta imune inibitória antes da administração com o nível da resposta imune inibitória depois da administração.
[0009] A presente invenção adicionalmente proporciona um método de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo (1) administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica induz tolerância imune no ser humano; e (2) depois da indução de tolerância imune, administração ao ser humano de um regime de redução gradual de dose da proteína quimérica. Em determinados aspectos, a indução de tolerância imune ocorre quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB. Em determinados aspectos, o método adicionalmente compreende (3) depois do regime de redução gradual de dose, administração ao ser humano de uma dose profilática do fator de coagulação. Em determinados aspectos, o ser humano não foi tratado com uma terapia de tolerância imune prévia contra o fator de coagulação.
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4/162 [0010] Em alguns aspectos, o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação. Em algumas modalidades, a resposta imune inibitória compreende a produção de anticorpos inibitórios contra o fator de coagulação. Em algumas modalidades, o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 0,6 Unidades Bethesda (UB). Em algumas modalidades, o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de cerca de 0,6 UB.
[0011] Em alguns aspectos, a resposta imune compreende uma resposta imune mediada por células. Em algumas modalidades, a resposta imune mediada por células compreende a liberação de uma citocina. Em algumas modalidades, a administração reduz o nível da citocina no ser humano comparado com o nível no ser humano depois de um tratamento prévio com um polipeptideo consistindo em um polipeptideo FVIil. Em algumas modalidades, a citocina selecionada entre o grupo consistindo em: IL-12, IL-4, IL-17, TNF-α, e qualquer combinação das mesmas.
[0012] Em determinados aspectos, uma expressão de uma ou mais moléculas tolerogênicas é aumentada depois da administração em relação ao nível de expressão da uma ou mais moléculas tolerogênicas antes da administração. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas tolerogênicas são selecionadas entre IL-10, TGF-β, IL-35, IDO-1, e qualquer combinação das mesmas. Em outras modalidades, a resposta imune compreende um sintoma clínico selecionado entre o grupo consistindo em: aumento da tendência a sangramento, alto consumo de fator de coagulação, falta de resposta à terapia de fator de coagulação, diminuição da eficácia da terapia de fator de coagulação, e encurtação da meia-vida do fator de coagulação.
[0013] Em algumas modalidades, o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune inibitória para
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5/162 o fator de coagulação no mínimo cerca de 1 mês, no mínimo cerca de 2 meses, no mínimo cerca de 3 meses, no mínimo cerca de 6 meses, no mínimo cerca de 12 meses, no mínimo cerca de 18 meses, no mínimo cerca de 24 meses, no mínimo cerca de 30 meses, no mínimo cerca de meses, no mínimo cerca de 42 meses, no mínimo cerca de 48 anos, no mínimo cerca de 54 meses, no mínimo cerca de 60 meses, no mínimo cerca de 6 anos, no mínimo cerca de 7 anos, no mínimo cerca de 8 anos, ou no mínimo cerca de 10 anos antes da administração. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é cerca de 1 a cerca de 24 semanas, cerca de 1 a cerca de 23 semanas, cerca de 1 a cerca de 22 semanas, cerca de 1 a cerca de 21 semanas, cerca de 2 a cerca de 20 semanas, cerca de 2 a cerca de 19 semanas, cerca de 2 a cerca de 18 semanas, cerca de 2 a cerca de 17 semanas, cerca de 3 a cerca de 16 semanas, cerca de 3 a cerca de 15 semanas, cerca de 3 a cerca de 14 semanas, cerca de 3 a cerca de 13 semanas, cerca de 4 a cerca de 12 semanas, cerca de 4 a cerca de 11 semanas, cerca de 4 a cerca de 10 semanas, cerca de 4 a cerca de 9 semanas, cerca de 5 a cerca de 8 semanas, cerca de 5 a cerca de 7 semanas, cerca de 5 a cerca de 6 semanas, cer ca de 1 a cerca de 12 semanas, cerca de 1 a cerca de 11 semanas, cerca de 1 a cerca de 10 semanas, cerca de 1 a cerca de 9 semanas, cerca de 1 a cerca de 8 semanas, cerca de 1 a cerca de 7 semanas, cerca de 1 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 5 semanas, ou cerca de 1 a cerca de 4 semanas.
[0014] Em alguns aspectos, o fator de coagulação é o fator VIII (FVIII). Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende FVIII-Fc. Em determinadas modalidades, a proteína quimérica compreende uma porção FVIII e uma porção VWF, em que a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVIII ou um fragmento da mesma, em que a porção
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VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento da mesma, em que a porção FVIII é ligada a uma primeira região Fc, em que a porção VWF é ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra.
[0015] Em alguns aspectos, a proteína quimérica ainda compreende uma porção de prolongamento da meia-vida. Em determinadas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação a albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido poli-siálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0016] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é de cerca de 20 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de um dia, cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias, cerca de seis dias, cerca de sete dias, cerca de oito dias, cerca de nove dias, cerca de dez dias, cerca de 11 dias, cerca de 12 dias, cerca de 13 dias, cerca de 14 dias, cerca de 15 dias, cerca de 16 dias, cerca de 17 dias, cerca de 18 dias, cerca de 19 dias, cerca de 20 dias, cerca de 21 dias, cerca de 22 dias, cerca de 23 dias, ou cerca de 24 dias.
[0017] Em determinados aspectos, o ser humano desenvolveu previamente uma resposta imune inibitória de FVIII. Em algumas modalidades, o ser humano tem uma condição de sangramento selecionada entre o grupo consistindo em: um distúrbio da coagulação hemorrágico, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia dentro dos músculos, hemorragia oral, trauma, traumatismo craniano,
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7/162 sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaringeano, sangramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliopsoas. MODALIDADES [0018] E1. Um método de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o ser humano tenha desenvolvido um inibidor contra o fator de coagulação e tenha falhado em responder a uma ou mais terapias de tolerância imune prévias contra o fator de coagulação.
[0019] E2. O método de E1, ainda compreendendo medir o nível de uma resposta imune inibitória antes da administração e medir o nível de uma resposta imune inibitória depois da administração.
[0020] E3. O método de E2, ainda compreendendo comparar o nível da resposta imune inibitória antes da administração com o nível da resposta imune inibitória depois da administração.
[0021] E4. O método de qualquer um de E1 a E3, em que o ser humano tenha desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação.
[0022] E5. O método de E4, em que a resposta imune inibitória compreende a produção de anticorpos inibitórios contra o fator de coagulação.
[0023] E6. O método de E5, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 0,6 Unidades Bethesda (UB).
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8/162 [0024] E7. O método de E5 ou E6, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 1 UB, no mínimo cerca de 2 UB, no mínimo cerca de 3 UB, no mínimo cerca de 4 UB, no mínimo cerca de 5 UB, no mínimo cerca de 6 UB, no mínimo cerca de 7 UB, no mínimo cerca de 10 UB, no mínimo cerca de 20 UB, no mínimo cerca de 30 UB, no mínimo cerca de 40 UB, no mínimo cerca de 50 UB, no mínimo cerca de 100 UB, no mínimo cerca de 150 UB, ou no mínimo cerca de 200 UB.
[0025] E8. O método de qualquer um de E5 a E7, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 5 UB.
[0026] E9. O método de qualquer um de E5 a E8, em que o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de cerca de 0,6 UB.
[0027] E10. O método de qualquer um de E5 a E9, em que o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é 0 UB.
[0028] E11. O método de qualquer um de E1 a E10, em que a resposta imune compreende uma resposta imune mediada por células.
[0029] E12. O método de E11, em que a resposta imune mediada por células compreende a liberação de uma citocina.
[0030] E13. O método de E12, em que a administração reduz o nível da citocina no ser humano comparado com o nível no ser humano depois de um tratamento prévio com um polipeptídeo consistindo em um polipeptídeo FVIII.
[0031] E14. O método de E12 ou E13, em que a citocina selecionada entre o grupo consistindo em: IL-12, IL-4, IL-17, TNF- a, e qualquer combinação das mesmas.
[0032] E15. O método de qualquer um de E1 a E14, em que uma expressão de uma ou mais moléculas tolerogênicas é aumentada depois da
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9/162 administração em relação ao nível de expressão da uma ou mais moléculas tolerogênicas antes da administração.
[0033] E16. O método de E15, em que a uma ou mais moléculas tolerogênicas são selecionadas entre IL-10, TGF-β, IL-35, IDO-1, e qualquer combinação das mesmas.
[0034] E17. O método de qualquer um de E1 a E14, em que a resposta imune compreende um sintoma clínico selecionado entre o grupo consistindo em: aumento da tendência a sangramento, alto consumo de fator de coagulação, falta de resposta à terapia de fator de coagulação, diminuição da eficácia da terapia de fator de coagulação, e encurtação da meia-vida do fator de coagulação.
[0035] E18. O método de qualquer um de E1 a E17, em que o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de 3 meses, no mínimo cerca de 6 meses, no mínimo cerca de 12 meses, no mínimo cerca de 18 meses, no mínimo cerca de 24 meses, no mínimo cerca de 30 meses, no mínimo cerca de 36 meses, no mínimo cerca de 42 meses, no mínimo cerca de 48 anos, no mínimo cerca de 54 meses, no mínimo cerca de 60 meses, no mínimo cerca de 6 anos, no mínimo cerca de 7 anos, no mínimo cerca de 8 anos, ou no mínimo cerca de 10 anos antes da administração.
[0036] E19. O método de qualquer um de E1 a E18, em que o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de 5 anos antes da administração.
[0037] E20. O método de qualquer um de E1 a E19, em que o tempo para tolerância é cerca de 1 a cerca de 24 semanas, cerca de 1 a cerca de 23 semanas, cerca de 1 a cerca de 22 semanas, cerca de 1 a cerca
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10/162 de 21 semanas, cerca de 2 a cerca de 20 semanas, cerca de 2 a cerca de 19 semanas, cerca de 2 a cerca de 18 semanas, cerca de 2 a cerca de 17 semanas, cerca de 3 a cerca de 16 semanas, cerca de 3 a cerca de 15 semanas, cerca de 3 a cerca de 14 semanas, cerca de 3 a cerca de 13 semanas, cerca de 4 a cerca de 12 semanas, cerca de 4 a cerca de 11 semanas, cerca de 4 a cerca de 10 semanas, cerca de 4 a cerca de 9 semanas, cerca de 5 a cerca de 8 semanas, cerca de 5 a cerca de 7 semanas, cerca de 5 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 12 semanas, cerca de 1 a cerca de 11 semanas, cerca de 1 a cerca de 10 semanas, cerca de 1 a cerca de 9 semanas, cerca de 1 a cerca de 8 semanas, cerca de 1 a cerca de 7 semanas, cerca de 1 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 5 semanas, ou cerca de 1 a cerca de 4 semanas.
[0038] E21. O método de qualquer um de E1 a E20, em que o tempo para tolerância é menos de cerca de 24 semanas, menos de cerca de 23 semanas, menos de cerca de 22 semanas, menos de cerca de 21 semanas, menos de cerca de 20 semanas, menos de cerca de 19 semanas, menos de cerca de 18 semanas, menos de cerca de 17 semanas, menos de cerca de 16 semanas, menos de cerca de 15 semanas, menos de cerca de 14 semanas, menos de cerca de 13 semanas, menos de cerca de 12 semanas, menos de cerca de 11 semanas, menos de cerca de 10 semanas, menos de cerca de 9 semanas, menos de cerca de 8 semanas, menos de cerca de 7 semanas, menos de cerca de 6 semanas, menos de cerca de 5 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de 2 semanas, ou menos de cerca de 1 se mana.
[0039] E22. O método de qualquer um de E1 a E21, em que o tempo para tolerância é cerca de 4 a cerca de 12 semanas.
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11/162 [0040] E23. O método de qualquer um de E1 a E22, em que o tempo para tolerância é cerca de 4 semanas.
[0041] E24. O método de qualquer um de E1 a E23, em que o ser humano está recebendo terapia com interferon.
[0042] E25. O método de qualquer um de E1 a E24, em que o ser humano está recebendo terapia antiviral.
[0043] E26. O método de qualquer um de E1 a E25, em que o ser humano tem um polimorfísmo genético associado com aumento de TNFo.
[0044] E27. O método de E26, em que o polimorfísmo é TNF 308G>A.
[0045] E28. O método de qualquer um de E1 a E27, em que o ser humano tem um polimorfísmo genético associado com aumento de IL10.
[0046] E29. O método de E28, em que o polimorfísmo é o alelo 134 do microssatélite IL10G.
[0047] E30. O método de qualquer um de E1 a E29, em que o ser humano teve menos de 150 dias de exposição (ED) ao fator de coagulação.
[0048] E31. O método de E30, em que o ser humano teve menos de dias de exposição.
[0049] E32. O método de E31, em que o ser humano teve menos de dias de exposição.
[0050] E33. O método de qualquer um de E1 a E32, em que o fator de coagulação é o fator VIII (FVIII).
[0051] E34. O método de qualquer um de E1 a E33, em que a proteína quimérica compreende FVIII-Fc.
[0052] E35. O método de qualquer um de E1 a E34, em que a proteína quimérica compreende uma porção FVIII e uma porção VWF, em que
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12/162 a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVIII ou um fragmento da mesma, em que a porção VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento da mesma, em que a porção FVIII é ligada a uma primeira região Fc, em que a porção VWF é ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra.
[0053] E36. O método de qualquer um de E33 a E35, em que o polipeptídeo FVIII compreende FVIII maduro.
[0054] E37. O método de qualquer um de E33 a E35, em que o polipeptídeo FVIII compreende um FVIII com o domínio B deletado.
[0055] E38. O método de E37, em que o FVIII com o domínio B deletado compreende uma deleção de todo ou parte do domínio B de FVIII.
[0056] E39. O método de E37 ou E38, em que o FVIII com o domínio
B deletado compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro.
[0057] E40. O método de qualquer um de E33 a E39, em que o polipeptídeo VWF compreende um fragmento de VWF compreendendo um domínio D’ e o domínio D3 de VWF.
[0058] E41. O método de qualquer um de E1 a E40, em que a proteína quimérica ainda compreende uma porção de prolongamento da meiavida.
[0059] E42. O método de E41, em que a porção de prolongamento da meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação a albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido poli-siálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.
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13/162 [0060] E43. O método de E41 ou E42, em que a porção de prolongamento da meia-vida é inserida dentro do fator de coagulação.
[0061] E44. O método de E41 ou E42, em que a porção de prolongamento da meia-vída é inserida entre o fator de coagulação e a região Fc.
[0062] E45. O método de qualquer um de E33 a E44, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é de cerca de 20 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg.
[0063] E46. O método de E45, em que a quantidade eficaz da proteina quimérica compreendendo FVIII-Fc é de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 200 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 140 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 130 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 120 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 110 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 240
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Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, ou de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg.
[0064] E47. O método de E45 ou E46, em que a quantidade eficaz da proteína quiméríca compreendendo FVIII-Fc é cerca de 100 Ul/kg, cerca de 105 Ul/kg, cerca de 110 Ul/kg, cerca de 115 Ul/kg, cerca de 120 Ul/kg, cerca de 125 Ul/kg, cerca de 130 Ul/kg, cerca de 135 Ul/kg, cerca de 140 Ul/kg, cerca de 145 Ul/kg, cerca de 150 Ul/kg, cerca de 155 Ul/kg, cerca de 160 Ul/kg, cerca de 165 Ul/kg, cerca de 170 Ul/kg, cerca de 175 Ul/kg, cerca de 180 Ul/kg, cerca de 185 Ul/kg, cerca de 190 Ul/kg, cerca de 195 Ul/kg, cerca de 200 Ul/kg, cerca de 225 Ul/kg, cerca de 250 Ul/kg, cerca de 275 Ul/kg, ou cerca de 300 Ul/kg.
[0065] E48. O método de qualquer um de E33 a E47, em que a proteína quiméríca compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias, cerca de seis dias, cerca de sete dias, cerca de oito dias, cerca de nove dias, cerca de dez dias, cerca de 11 dias, cerca de 12 dias, cerca de 13 dias, cerca de 14 dias, cerca de 15 dias, cerca de 16 dias, cerca de 17 dias, cerca de 18 dias, cerca de 19 dias, cerca de 20 dias, cerca de 21 dias, cerca de 22 dias, cerca de 23 dias, ou cerca de 24 dias.
[0066] E49. O método de qualquer um de E33 a E47, em que a proteína quiméríca compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 1 a cerca de 14 dias, cerca de 1 a cerca de 13 dias, cerca de 1 a cerca de 12 dias, cerca de 1 a cerca de 11 dias, cerca de 1 a cerca de 10 dias, cerca de 1 a cerca de 9 dias, cerca de 1 a cerca de 8 dias, cerca de 1 a cerca de 7 dias, cerca de 1 a cerca de 6 dias, cerca de 1 a cerca de 5 dias, cerca de 1 a cerca de 4 dias, cerca de 1 a cerca de 3 dias, cerca de 1 a cerca de 2 dias, cerca de 2 a cerca de 14 dias,
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15/162 cerca de 3 a cerca de 14 dias, cerca de 4 a cerca de 14 dias, cerca de 5 a cerca de 14 dias, cerca de 6 a cerca de 14 dias, cerca de 7 a cerca de 14 dias, cerca de 8 a cerca de 14 dias, cerca de 9 a cerca de 14 dias, cerca de 10 a cerca de 14 dias, cerca de 11 a cerca de 14 dias, cerca de 12 a cerca de 14 dias, cerca de 13 a cerca de 14 dias, ou cerca de 5 a cerca de 10 dias.
[0067] E50. O método de qualquer um de E33 a E49, em que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 3 dias a cerca de 5 dias.
[0068] E51. O método de qualquer um de E1 a E33, em que a proteína quimérica compreende uma porção FVHI, uma porção VWF, uma primeira região Fc, e uma segunda região Fc;
em que a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVHI ou um fragmento da mesma;
em que a porção VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento da mesma;
em que a porção FVIII é ligada à primeira região Fc;
em que a porção VWF é ligada à segunda região Fc; e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra.
[0069] E52. O método de qualquer um de E1 a E51, em que o ser humano desenvolveu previamente uma resposta imune inibitória de FVIII. [0070] E53. O método de E52, em que a resposta imune inibitória de
FVIII se desenvolveu em resposta a um produto de FVIII selecionado entre o grupo consistindo em: ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATEDVI®, AFSTYLA®, e ΗΥΑΤΕΌ®.
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16/162 [0071 ] E54. O método de E52, em que a resposta imune inibitória de
FVIII é desenvolvida em resposta a um produto de FVIII recombinante.
[0072] E55. O método de qualquer um de E1 a E54, em que o ser humano tem uma condição de sangramento selecionada entre o grupo consistindo em: um distúrbio da coagulaçâo hemorrágico, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia dentro dos músculos, hemorragia oral, trauma, traumatismo craniano, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema nervoso central, sangramento no espaço retrofaringeano, sangramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliopsoas.
[0073] E56. O método de E55, em que o distúrbio da coagulaçâo hemorrágico é hemofilia A.
[0074] E57. O método de qualquer um de E33 a E56, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é cerca de 50 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg.
[0075] E58. O método de qualquer E57, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é cerca de 50 Ul/kg, cerca de 60 Ul/kg, cerca de 70 Ul/kg, cerca de 80 Ul/kg, cerca de 90 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg, cerca de 110 Ul/kg, cerca de 120 Ul/kg, cerca de 130 Ul/kg, cerca de 140 Ul/kg, cerca de 150 Ul/kg, cerca de 160 Ul/kg, cerca de 170 Ul/kg, cerca de 180 Ul/kg, cerca de 190 Ul/kg, cerca de 200 Ul/kg, cerca de 225 Ul/kg, cerca de 250 Ul/kg, cerca de 275 Ul/kg, ou cerca de 300 Ul/kg.
[0076] E59. O método de E57 ou E58, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica é cerca de 200 Ul/kg e é administrada diariamente.
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17/162 [0077] E60. O método de E57 ou E58, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica é cerca de 50 Ul/kg e é administrada cerca de três vezes por semana.
[0078] E61. O método de qualquer um de E57 a E60, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica é administrada em duas ou mais doses ao longo do dia.
[0079] E62. O método de qualquer um de E57 a E61, em que a proteína quimérica é administrada até ser observada tolerância imune, em que é observada tolerância imune quando o título dos anticorpos ínibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB.
[0080] E63. O método de E62, em que depois de tolerância imune, é administrado ao ser humano um regime de redução gradual de dose da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc.
[0081] E64. O método de E63, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc.
[0082] E65. O método de E63 ou E64, em que a dose de redução gradual de dose é administrada uma vez ao dia ou uma vez a cada dois dias.
[0083] E66. O método de qualquer um de E63 a E65, em que a dose de redução gradual de dose é administrada por no mínimo cerca de 1 semana, no mínimo cerca de 2 semanas, no mínimo cerca de 3 semanas, no mínimo cerca de 4 semanas, no mínimo cerca de 5 semanas, no mínimo cerca de 6 semanas, no mínimo cerca de 7 semanas, no mínimo cerca de 8 semanas, no mínimo cerca de 9 semanas, no mínimo cerca de 10 semanas, no mínimo cerca de 11 semanas, no mínimo cerca de 12 semanas, no mínimo cerca de 13 semanas, no mínimo cerca de 14 se
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18/162 manas, no mínimo cerca de 15 semanas, no mínimo cerca de 16 semanas, no mínimo cerca de 17 semanas, no mínimo cerca de 18 semanas, no mínimo cerca de 19 semanas, no mínimo cerca de 20 semanas, no mínimo cerca de 21 semanas, no mínimo cerca de 22 semanas, no mínimo cerca de 23 semanas, no mínimo cerca de 24 semanas, no mínimo cerca de 25 semanas, no mínimo cerca de 26 semanas, no mínimo cerca de 27 semanas, no mínimo cerca de 28 semanas, no mínimo cerca de 29 semanas, no mínimo cerca de 30 semanas, no mínimo cerca de 31 semanas, ou no mínimo cerca de 32 semanas.
[0084] E67. O método de qualquer um de E63 a E66, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg.
[0085] E68. O método de qualquer um de E63 a E67, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune.
[0086] E69. O método de qualquer um de E63 a E67, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 100 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune.
[0087] E70. O método de E68 ou E69, em que o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 6 até a semana 12 depois de tolerância imune.
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19/162 [0088] E71. O método de E70, em que o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteina quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 12 até a semana 16.
[0089] E72. O método de qualquer um de E66 a E71, adicionalmente compreendendo a administração de uma dose profilática do fator de coagulação depois do regime de redução gradual de dose.
[0090] E73. O método de E72, em que a dose profilática compreende de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg.
[0091] E74. O método de E72 ou E73, em que a dose profilática é administrada cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, cerca de três vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada três a cinco dias.
[0092] E75. Um método de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo:
(1) administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc induz tolerância imune no ser humano; e (2) depois da indução de tolerância Imune, administração ao ser humano de um regime de redução gradual de dose da proteína quimérica.
[0093] E76. O método de E75, em que ocorre indução de tolerância imune quando o título dos anticorpos Inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB [0094] E77. O método de E75 ou E76, ainda compreendendo:
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20/162 [0095] (3) depois do regime de redução gradual de dose, administração ao ser humano de uma dose profiiática de um fator de coaguiação.
[0096] E78. O método de qualquer um de E75 a E77, em que o ser humano não foi tratado com uma terapia de tolerância imune prévia contra o fator de coagulação.
[0097] E79. O método de qualquer um de E75 a E78, ainda compreendendo medir o nível de uma resposta imune inibitória antes da administração e medir o nível de uma resposta imune inibitória depois da administração.
[0098] E80. O método de E79, ainda compreendendo comparar o nível da resposta imune inibitória antes da administração com o nível da resposta imune inibitória depois da administração.
[0099] E81. O método de qualquer um de E75 a E80, em que o ser humano tenha desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação.
[00100] E82. O método de E81, em que a resposta imune inibitória compreende a produção de anticorpos inibitórios contra o fator de coagulação.
[00101] E83. O método de E82, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 0,6 Unidades Bethesda (UB).
[00102] E84. O método de E82 ou E83, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 1 UB, no mínimo cerca de 2 UB, no mínimo cerca de 3 UB, no mínimo cerca de 4 UB, no mínimo cerca de 5 UB, no mínimo cerca de 6 UB, no mínimo cerca de 7 UB, no mínimo cerca de 10 UB, no mínimo cerca de 20 UB, no mínimo cerca de 30 UB, no mínimo cerca de 40 UB, no mínimo cerca de 50 UB,
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21/162 no mínimo cerca de 100 UB, no mínimo cerca de 150 UB, ou no mínimo cerca de 200 UB.
[00103] E85. O método de qualquer um de E82 a E84, em que o título dos anticorpos inibitórios antes da administração é no mínimo cerca de 5 UB.
[00104] E86. O método de qualquer um de E82 a E85, em que o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de cerca de 0,6 UB.
[00105] E87. O método de qualquer um de E82 a E86, em que o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é 0 UB.
[00106] E88. O método de qualquer um de E79 a E87, em que a resposta imune compreende uma resposta imune mediada por células.
[00107] E89. O método de E88, em que a resposta imune mediada por células compreende a liberação de uma citocina.
[00108] E90. O método de E88, em que a administração reduz o nível da citocina no ser humano comparado com o nível no ser humano depois de um tratamento prévio com um polipeptídeo consistindo em um polipeptídeo FVIII.
[00109] E91. O método de qualquer um de E75 a E90, em que uma expressão de uma ou mais moléculas tolerogênicas é aumentada depois da administração em relação ao nível de expressão da uma ou mais moléculas tolerogênicas antes da administração.
[00110] E92. O método de qualquer um de E75 a E91, em que o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de 3 meses, no mínimo cerca de 6 meses, no mínimo cerca de 12 meses, no mínimo cerca de 18 meses, no mínimo cerca de 24 meses, no mínimo cerca de 30 meses, no mínimo cerca de 36 meses, no mínimo cerca de
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22/162 meses, no mínimo cerca de 48 anos, no mínimo cerca de 54 meses, no mínimo cerca de 60 meses, no mínimo cerca de 6 anos, no mínimo cerca de 7 anos, no mínimo cerca de 8 anos, ou no mínimo cerca de 10 anos antes da administração.
[00111] E93. O método de qualquer um de E75 a E92, em que o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de anos antes da administração.
[00112] E94. O método de qualquer um de E75 a E93, em que o tempo para tolerância é cerca de 1 a cerca de 24 semanas, cerca de 1 a cerca de 23 semanas, cerca de 1 a cerca de 22 semanas, cerca de 1 a cerca de 21 semanas, cerca de 2 a cerca de 20 semanas, cerca de 2 a cerca de 19 semanas, cerca de 2 a cerca de 18 semanas, cerca de 2 a cerca de 17 semanas, cerca de 3 a cerca de 16 semanas, cerca de 3 a cerca de 15 semanas, cerca de 3 a cerca de 14 semanas, cerca de 3 a cerca de 13 semanas, cerca de 4 a cerca de 12 semanas, cerca de 4 a cerca de 11 semanas, cerca de 4 a cerca de 10 semanas, cerca de 4 a cerca de 9 semanas, cerca de 5 a cerca de 8 semanas, cerca de 5 a cerca de 7 semanas, cerca de 5 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 12 semanas, cerca de 1 a cerca de 11 semanas, cerca de 1 a cerca de 10 semanas, cerca de 1 a cerca de 9 semanas, cerca de 1 a cerca de 8 semanas, cerca de 1 a cerca de 7 semanas, cerca de 1 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 5 semanas, ou cerca de 1 a cerca de 4 semanas.
[00113] E95. O método de qualquer um de E75 a E94, em que o tempo para tolerância é menos de cerca de 24 semanas, menos de cerca de 23 semanas, menos de cerca de 22 semanas, menos de cerca de 21 semanas, menos de cerca de 20 semanas, menos de cerca de 19 semanas,
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23/162 menos de cerca de 18 semanas, menos de cerca de 17 semanas, menos de cerca de 16 semanas, menos de cerca de 15 semanas, menos de cerca de 14 semanas, menos de cerca de 13 semanas, menos de cerca de 12 semanas, menos de cerca de 11 semanas, menos de cerca de 10 semanas, menos de cerca de 9 semanas, menos de cerca de 8 semanas, menos de cerca de 7 semanas, menos de cerca de 6 semanas, menos de cerca de 5 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de 2 semanas, ou menos de cerca de 1 semana.
[00114] E96. O método de qualquer um de E75 a E95, em que o tempo para tolerância é cerca de 4 a cerca de 12 semanas.
[00115] E97. O método de qualquer um de E75 a E96, em que o tempo para tolerância é cerca de 4 semanas.
[00116] E98. O método de qualquer um de E75 a E97, em que o ser humano está recebendo terapia com interferon.
[00117] E99. O método de qualquer um de E75 a E98, em que o ser humano está recebendo terapia antiviral.
[00118] E100. O método de qualquer um de E75 a E91, em que o ser humano tem um polimorfismo genético associado com aumento de TNFo.
[00119] E101. O método de E100, em que o polimorfismo é TNF 308G>A.
[00120] E102. O método de qualquer um de E75 a E101, em que o ser humano tem um polimorfismo genético associado com aumento de IL10.
[00121] E103. O método de E102, em que o polimorfismo é o alelo 134 do microssatélite IL10G.
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24/162 [00122] E104. O método de qualquer um de E75 a E103, em que o ser humano teve menos de 150 dias de exposição (ED) ao fator de coagulação.
[00123] E105. O método de E104, em que o ser humano teve menos de 50 dias de exposição.
[00124] E106. O método de E105, em que o ser humano teve menos de 20 dias de exposição.
[00125] E107. O método de qualquer um de E75 a E106, em que o fator de coagulação é o fator VIII (FVIII).
[00126] E108. O método de qualquer um de E75 a E107, em que a proteína quimérica compreende FVIII-Fc.
[00127] E109. O método de qualquer um de E75 a E108, em que a proteína quimérica compreende uma porção FVIII e uma porção VWF, em que a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVIII ou um fragmento da mesma, em que a porção VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento da mesma, em que a porção FVIII é ligada a uma primeira região Fc, em que a porção VWF é ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra.
[00128] E110. O método de qualquer um de E75 a E109, em que o polipeptídeo FVIII compreende FVIII maduro.
[00129] E111. O método de qualquer um de E75 a E109, em que o polipeptídeo FVIII compreende um FVIII com o domínio B deletado.
[00130] E112. O método de E110, em que o FVIII com o domínio B deletado compreende uma deleção de todo ou parte do domínio B de FVIII.
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25/162 [00131] E113. O método de E110 ou E111, em que o FVIil com o domínio Β deletado compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIil maduro.
[00132] E114. O método de qualquer um de E109 a E113, em que o polipeptideo VWF compreende um fragmento de VWF compreendendo um domínio D’ e o domínio D3 de VWF.
[00133] E115. O método de qualquer um de E75 a E114 em que a proteína quiméríca adicionalmente compreende uma porção de prolongamento da meia-vida.
[00134] E116. O método de E115, em que a porção de prolongamento da meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação a albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido poli-siálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00135] E116. O método de E115 ou E116, em que a porção de prolongamento da meia-vida é inserida dentro do fator de coagulação.
[00136] E117. O método de E115 ou E116, em que a porção de prolongamento da meia-vida é inserida entre o fator de coagulação e a região Fc.
[00137] E118. O método de qualquer um de E75 a E118, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIil e uma região Fc é de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg. (00137 N.T.: Numeração errada, auto-referência; falta E119.) [00138] E120. O método de E119, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 200 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 280
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26/162
Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 140 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 130 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 120 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 110 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, ou de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg.
[00139] E121. O método de E119 ou E120, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é cerca de 50 Ul/kg, cerca de 60 Ul/kg, cerca de 70 Ul/kg, cerca de 80 Ul/kg, cerca de 90 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg, cerca de 110 Ul/kg, cerca de 120 Ul/kg, cerca de 130 Ul/kg, cerca de 140 Ul/kg, cerca de 150 Ul/kg, cerca de 160 Ul/kg, cerca de 170 Ul/kg, cerca de 180 Ul/kg, cerca de 190 Ul/kg, cerca de 200 Ul/kg, cerca de 225 Ul/kg, cerca de 250 Ul/kg, cerca de 275 Ul/kg, ou cerca de 300 Ul/kg..
[00140] E122. O método de qualquer um de E75 a E121, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica é cerca de 200 Ul/kg e é administrada diariamente.
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27/162 [00141] E123. O método de qualquer um de E75 a E122, em que a proteina quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias, cerca de seis dias, cerca de sete dias, cerca de oito dias, cerca de nove dias, cerca de dez dias, cerca de 11 dias, cerca de 12 dias, cerca de 13 dias, cerca de 14 dias, cerca de 15 dias, cerca de 16 dias, cerca de 17 dias, cerca de 18 dias, cerca de 19 dias, cerca de 20 dias, cerca de 21 dias, cerca de 22 dias, cerca de 23 dias, ou cerca de 24 dias.
[00142] E124. O método de qualquer um de E75 a E121, em que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 1 a cerca de 14 dias, cerca de 1 a cerca de 13 dias, cerca de 1 a cerca de 12 dias, cerca de 1 a cerca de 11 dias, cerca de 1 a cerca de 10 dias, cerca de 1 a cerca de 9 dias, cerca de 1 a cerca de 8 dias, cerca de 1 a cerca de 7 dias, cerca de 1 a cerca de 6 dias, cerca de 1 a cerca de 5 dias, cerca de 1 a cerca de 4 dias, cerca de 1 a cerca de 3 dias, cerca de 1 a cerca de 2 dias, cerca de 2 a cerca de 14 dias, cerca de 3 a cerca de 14 dias, cerca de 4 a cerca de 14 dias, cerca de 5 a cerca de 14 dias, cerca de 6 a cerca de 14 dias, cerca de 7 a cerca de 14 dias, cerca de 8 a cerca de 14 dias, cerca de 9 a cerca de 14 dias, cerca de 10 a cerca de 14 dias, cerca de 11 a cerca de 14 dias, cerca de 12 a cerca de 14 dias, cerca de 13 a cerca de 14 dias, ou cerca de 5 a cerca de 10 dias.
[00143] E125. O método de qualquer um de E75 a E122, em que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 3 dias a cerca de 5 dias.
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28/162 [00144] E126. O método de qualquer um de E75 a E125, em que a proteina quimérica compreende uma porção FVIII, uma porção VWF, uma primeira região Fc, e uma segunda região Fc;
[00145] em que a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVIII ou um fragmento do mesmo;
[00146] em que a porção VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento do mesmo;
[00147] em que a porção FVIII é ligada à primeira região Fc;
[00148] em que a porção VWF é ligada à segunda região Fc; e [00149] em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra.
[00150] E127. O método de qualquer um de E75 a E126, em que o ser humano desenvolveu previamente uma resposta imune inibitória de FVIII. [00151] E128. O método de E127, em que a resposta imune inibitória de FVIII se desenvolveu em resposta a um produto de FVIII selecionado entre o grupo consistindo em: ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI®, AFSTYLA®, e HYATE:C®.
[00152] E129. O método de E128, em que a resposta imune inibitória de FVIII é desenvolvida em resposta a um produto de FVIII recombinante. [00153] E130. O método de qualquer um de E75 a E129, em que o ser humano tem uma condição de sangramento selecionada entre o grupo consistindo em: um distúrbio da coagulação hemorrágico, hemartrose, sangramento muscular, sangramento oral, hemorragia, hemorragia dentro dos músculos, hemorragia oral, trauma, traumatismo craniano, sangramento gastrointestinal, hemorragia intracraniana, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fratura óssea, sangramento do sistema
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29/162 nervoso central, sangramento no espaço retrofaringeano, sangramento no espaço retroperitoneal, e sangramento na bainha do iliopsoas.
[00154] E131. O método de E130, em que o distúrbio da coagulação hemorrágico é hemofilia A.
[00155] E132. O método de qualquer um de E75 a E131, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica é administrada em duas ou mais doses ao longo do dia.
[00156] E133. O método de qualquer um de E75 a E132, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg da proteína quimérica.
[00157] E134. O método de qualquer um de E75 a E133, em que a dose de redução gradual de dose é administrada uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, ou três vezes por semana.
[00158] E135. O método de qualquer um de E75 a E134, em que a dose de redução gradual de dose é administrada por no mínimo cerca de 1 semana, no mínimo cerca de 2 semanas, no mínimo cerca de 3 semanas, no mínimo cerca de 4 semanas, no mínimo cerca de 5 semanas, no mínimo cerca de 6 semanas, no mínimo cerca de 7 semanas, no mínimo cerca de 8 semanas, no mínimo cerca de 9 semanas, no mínimo cerca de 10 semanas, no mínimo cerca de 11 semanas, no mínimo cerca de 12 semanas, no mínimo cerca de 13 semanas, no mínimo cerca de 14 semanas, no mínimo cerca de 15 semanas, no mínimo cerca de 16 semanas, no mínimo cerca de 17 semanas, no mínimo cerca de 18 semanas, no mínimo cerca de 19 semanas, no mínimo cerca de 20 semanas, no mínimo cerca de 21 semanas, no mínimo cerca de 22 semanas, no mínimo cerca de 23 semanas, no mínimo cerca de 24 semanas, no mínimo cerca de 25 semanas, no mínimo cerca de 26 semanas, no mínimo cerca
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30/162 de 27 semanas, no mínimo cerca de 28 semanas, no mínimo cerca de 29 semanas, no mínimo cerca de 30 semanas, no mínimo cerca de 31 semanas, ou no mínimo cerca de 32 semanas.
[00159] E136. O método de qualquer um de E74 a E135, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg.
[00160] E137. O método de qualquer um de E75 a E136, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune.
[00161] E138. O método de qualquer um de E75 a E136, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 100 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune.
[00162] E139. O método de E137 ou E138, em que o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 6 até a semana 12 depois de tolerância imune.
[00163] E140. O método de E139, em que o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 12 até a semana 16.
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31/162 [00164] E141. O método de qualquer um de E77 a E140, em que a dose profilática compreende cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg.
[00165] E142. O método de qualquer um de E77 a E141, em que a dose profilática é administrada cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, cerca de três vezes por semana, ou cerca de três vezes por semana.
[00166] E143. O método de qualquer um de E79 a E91 e 94 a E142, em que a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 1 dia, menos de cerca de 2 dias, menos de cerca de 3 dias, menos de cerca de 4 dias, menos de cerca de 5 dias, menos de cerca de 6 dias, menos de cerca de 7 dias, menos de cerca de 2 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 2 meses, menos de cerca de 3 meses, menos de cerca de 4 meses, menos de cerca de 5 meses, menos de cerca de 6 meses, ou menos de cerca de 1 ano depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória no ser humano.
[00167] E144. O método de qualquer um de E79 a E91 e 94 a E143, em que a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 1 dia depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória no ser humano.
[00168] E145. O método de qualquer um de E79 a E91 e 94 a E144, em que a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 12 horas depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória no ser humano.
[00169] E146. O método de qualquer um de E1 a E145, em que a administração da proteína quimérica resulta em um menor tempo para tolerância no ser humano em comparação com o tempo para tolerância em
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32/162 um ser humano depois de tratamento com um fator de coagulaçâo isolado.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00170] A FIG. 1 é um fluxograma, delineando os métodos utilizados para investigar os efeitos de rFVIIIFc sobre ligação ao FcyR, internalização, sinalização e produção de citocinas, e modificações da expressão genética, bem como subsequentes interações e efeitos sobre células T /n vitro.
[00171] As FIGs. 2A a 2C são representações gráficas dos níveis de expressão superficial de macrófagos e células dendríticas relativa dos receptores de Fey CD16 (FIG. 2A), CD32 (FIG. 2B), e CD64 (FIG. 2C) depois de tratamento com complexos imunes de peroxidase de raiz forte (HRP-IC; controle positivo), igG1, FVIII recombinante (rFVIII), ou uma proteína de fusão de rFVIII e Fc (rFVIIIFc). Asteriscos (*) indicam o grau de significância (n=3; ** ~ P<0,01, *** = P<0,005, a significância para HRP-IC em comparação com os outros tratamentos não é mostrada).
[00172] As FIGs. 3A a 3C são representações gráficas ilustrando a sinalização relativa depois de tratamento com rFVIII ou rFVIIIFc. A FIG. 3A mostra a sinalização, conforme medido por fosforilação de Syk, na linhagem celular monocítica THP-1 (THP-1), monócitos, macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico (macrófago), e células dendríticas derivadas de monócitos do sangue periférico tratados com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc por 15 minutos. A FIG. 3B mostra a fosforilação de Syk relativa em macrófagos tratados com rFVIIIFc (WT), rFVIIIFc mutante que é incapaz de ligar ao receptor Fc neonatal (FcRn mutantee), ou com rFVIIIFc mutante que é incapaz de ligar ao FcyR (FcyR mutante). A FIG. 3C mostra a produção relativa das citocinas próinflamatórias interleucina 1b (IL-1 b), IL-6, IL-8, IL-10, e fator de necrose
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33/162 tumoral alfa (TNFa) em macrófagos vinte e quatro horas depois de tratamento com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIHFc.
[00173] A FIG. 4 mostra o estado de fosforilação relativa de fosfatase1 contendo 2 domínios da região de homologia de Src (SHP1), pSHP2, fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 5-fosfatase 1 (SHIP1), e pSHIP2 um minuto, cinco minutos, e trinta minutos depois de tratamento com rFVIII ou rFVIHFc. Asteriscos (*) indicam o grau de significância (n-3; **P<0,01, ***P<0,005).
[00174] As FIGs. 5A a 5M sâo representações gráficas de padrões de expressão genética de macrófagos tolerogênicos depois de tratamento com rFVIII ou rFVIHFc. As FIGs. 5A a 5B são diagramas de Venn, ilustrando a distribuição de genes que foram significativamente subregulados (FIG. 5A) e a distribuição de genes que foram significativamente supra-regulados (FIG. 5B) em macrófagos derivados de monócitos tratados com lgG1, rFVIII, ou rFVIHFc por seis horas (n=3). As FIGs. 5C a 5G são gráficos mostrando as expressões relativas de vários genes da via do metabolismo dos lipídeos e de NRF2, tais como heme oxigenase 1 (Hmoxl; FIG. 5C), receptor gama ativado por proliferadores de peroxissoma (PPARy; FIG. 5D), lipoproteína lipase (LPL; FIG. 5E), resposta de cerscimento precoce 2 (EGR2; FIG. 5F), e membro 4A1 da família de transportadores de ânions orgânicos de transportadores de soluto (SLCO4A1; FIG. 5G); CD206 em 6 horas (FIG. 5I) e 12 horas (FIG. 5J) pós tratamento; e arginase 1 (ARG1; FIG. 5L) conforme medido por PCR quantitativo, depois de tratamento com rFVIII ou rFVIHFc. Asteriscos (*) indicam o grau de significância (n-8; *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,005; FIGs. 5C a 5G). As FIGs. 5K e 5M são gráficos mostrando o número de células coletadas por citometria de fluxo expressando CD206. Além disso, Foi visto que macrófagos educados com rFVIHFc apresentavam um
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34/162 fenótipo similar a M2 característico (FIGs. 5I a 5M). Em particular, macrofagos tratados com rFVIIIFc tiveram maior expressão de CD206 relativa (também conhecido como receptor C de manose - tipo 1; MRC1) do que células tratadas com rFVIII depois de 6 horas (FIG. 5I) e depois de 24 horas (FIG. 5J), e macrófagos tratados com rFVIIIFc tiveram maior expressão de ARG1 relativa do que células tratadas com rFVIII depois de 24 horas (FIG. 5M).
[00175] A FIG. 6A é um fluxograma diagramando os métodos utilizados para determinar os efeitos do tratamento com rFVIIIFc sobre a diferenciação de células T. A FIG. 6B é uma representação gráfica da percentagem de células T regulatórias seis dias depois de macrófagos ou células dendríticas serem tratados com lgG1 (controle), rFVIII, ou rFVIIIFc por 24 horas, e em seguida colocados em cocultura com células T CD4 positivas *naíve. A FIG. 60 é uma representação gráfica da percentagem de células T regulatórias depois de cultura de células T CD4 positivas naive nos meios condicionados de macrófagos ou células dendríticas prétratados com lgG1, rFVIII, ou rFVIIIFc.
[00176] A FIG. 7 é uma ilustração do mecanismo proposto de diferenciação de células T regulatórias de rFVIIIFc.
[00177] A FIG. 8 é uma ilustração dos efeitos propostos de rFIXFc sobre macrófagos.
DESCRIÇÃO DETALHADA [00178] A presente invenção proporciona métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o ser humano tenha desenvolvido um inibidor contra o fator de
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35/162 coagulação e tenha falhado em responder a uma ou mais terapias de tolerância imune prévias contra o fator de coagulação. Em algumas modalidades, o fator de coagulação é selecionado entre o grupo consistindo em: fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), FVIII, FIX, fator X (FX), fator von Willebrand (VWF), e qualquer combinação dos mesmos.
I, Definições [00179] Deve ser observado que o termo um ou uma entidade refere-se a um ou mais daquela entidade; por exemplo, uma sequência de nucleotídeos, é entendido como representando uma ou mais sequências de nucleotídeos. Deste modo, os termos um (ou uma), um ou mais, e no mínimo um podem ser utilizados de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente.
[00180] Além disso, e/ou onde utilizado aqui, neste pedido de patente, deve ser tomado com revelação específica de cada uma das duas características ou de cada um dos dois componentes especificados com ou sem o outro. Deste modo, o termo e/ou conforme utilizado em uma expressão tal como A e/ou B aqui, neste pedido de patente, se destina a incluir A e B, A ou B, A (isolado), e B (isolado). Do mesmo modo, o termo e/ou conforme utilizado em uma expressão tal como A, B, e/ou C se destina a englobar cada um dos seguintes aspectos: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isolado); B (isolado); e C (isolado).
[00181] Deve ser entendido que onde quer que aspectos sejam descritos aqui, neste pedido de patente, com a linguagem compreendendo, também são proporcionados aspectos análogos de modo diverso descritos em termos de consistindo em e/ou consistindo essencialmente em. [00182] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo
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36/162 significado que o comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção se refere. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pel-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Moiecuiar Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, proporcionam a um versado um dicionário gerai de muitos dos termos utilizados nesta invenção.
[00183] Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em sua forma aceita em seu Sistema Internacional de Unidades (SI, Système International de Unites). Intervalos numéricos são inciusivos dos números que definem o intervalo. A menos que indicado de modo diverso, sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em orientação de amino para carbóxi. Os cabeçalhos proporcionados aqui, neste pedido de patente, não são limitações dos vários aspectos da invenção, os quais podem ser tidos por meio de referência à especificação como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente abaixo são mais plenamente definidos por meio de referência à especificação em sua totalidade.
[00184] O termo cerca de é utilizado aqui, neste pedido de patente, para indicar aproximadamente, a grosso modo, em torno de, ou nas regiões de. Quando o termo cerca de é utilizado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica aquele intervalo prolongando os limites acima e abaixo dos valores numéricos estipulados. Deste modo, cerca de 10 a 20 significa cerca de 10 a cerca de 20. Em geral, o termo cerca de pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor determinado por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).
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37/162 [00185] Administração, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa proporcionar uma composição farmaceuticamente aceitável, por exemplo, compreendendo uma proteína quimérica, revelada aqui, neste pedido de patente, a um indivíduo através de uma via farmaceuticamente aceitável. As vias de administração podem ser íntravenosas, por exemplo, injeção intravenosa e infusão intravenosa. Vias de administração adicionais incluem, por exemplo, administração subcutânea, intramuscular, oral, nasal e pulmonar. Proteína quimérica e proteínas híbridas podem ser administradas como parte de uma composição farmacêutica compreendendo no mínimo um excipiente. Em algumas modalidades, o fator de coagulação e/ou Fc, por exemplo, a proteína quimérica, são administrados a um ser humano através de uma terapia genética, por exemplo, em que um ou mais polinucleotídeos codificando o fator de coagulação e/ou Fc, por exemplo, a proteína quimérica, são administrados ao ser humano, e o fator de coagulação e/ou Fc, por exemplo, a proteína quimérica, é expresso no ser humano.
[00186] Tratar, tratamento, ou tratando, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a, por exemplo, a redução na gravidade de uma doença ou condição; a redução na duração do curso de uma condição; a melhora ou eliminação de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição; a provisão de efeitos benéficos a um indivíduo com uma doença ou condição, sem necessariamente curar a doença ou condição. Em algumas modalidades, o termo tratar ou tratando significa reduzir ou eliminar uma resposta imune inibítória para um fator de coagulação, por exemplo, FVIII.
[00187] O termo induzir tolerância imune, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa provocar em um indivíduo uma condição por meio da qual o indivíduo não tem uma resposta imune quando
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38/162 lhe é administrado um estímulo particular, por exemplo, a administração de um fator de coagulação (por exemplo, FVIII). Esta condição, tolerância imune, pode ser temporária, de tal modo que o indivíduo seja tolerante ao estímulo por um período de tempo definido, ou prolongada, de tal modo que o indivíduo seja tolerante ao estímulo indefinidamente. Em determinadas modalidades, o indivíduo permanece tolerante ao estímulo na medida que o estímulo seja administrado ao indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, o indivíduo permanece tolerante ao fator de coaguiação na medida que a proteína quimérica compreendendo o fator de coagulação e uma região Fc seja administrada ao indivíduo em um determinado intervalo de dosagem. Em outras modalidades, o indivíduo permanece tolerante ao fator de coagulação mesmo depois de ser terminada a administração da proteína quimérica compreendendo o fator de coaguiação e uma região Fc.
[00188] Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune inibitória. Uma resposta imune inibitória é uma resposta imune que bloqueia ou diminui os efeitos do estímulo, por exemplo, administração de um fator de coagulação (por exemplo, FVIII). Em determinadas modalidades, a resposta imune inibitória compreende a produção de anticorpos inibitórios contra o estímulo, por exemplo, anticorpos anti-FVIII inibitórios. O termo anticorpo inibitório ou anticorpos inibitórios, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a anticorpos que bloqueiam ou diminuem a função do antígeno reconhecido pelo anticorpo. Por exemplo, um anticorpo inibitório contra FVIII bloqueia ou diminui a atividade de FVIII. Em algumas modalidades, o anticorpo inibitório se liga ao antígeno, por exemplo, o FVIII, e acelera o clearance do antígeno do soro do ser humano. Quando o anticorpo acelera o clearance do antígeno, o anticorpo reduz a meia-vida do antígeno.
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39/162 [00189] Respostas imunes inibltórias podem ser determinadas usando testes laboratoriais tais como o teste Bethesda ou a modificação de Nijmegan do teste Bethesda. Um nível de no mínimo 0,6 Unidades Bethesda (UB) pode indicar a presença de uma resposta imune inibitória. Um nível de no mínimo 5 UB pode indicar a presença de um alto título de inibidor. Também podem ser utilizadas medições da recuperação in vivo e da meia-vida da infusão de bolus de fator de coagulação. Em determinadas modalidades, é observada tolerância imune quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 5 UB, menos de cerca de 4 UB, menos de cerca de 3 UB, menos de cerca de 2 UB, menos de cerca de 1 UB, menos de cerca de 0,9 UB, menos de cerca de 0,8 UB, menos de cerca de 0,7 UB, menos de cerca de 0,6 UB, menos de cerca de 0,5 UB, menos de cerca de 0,4 UB, menos de cerca de 0,3 UB, menos de cerca de 0,2 UB, menos de cerca de 0,1 UB, ou cerca de 0 UB. Em uma modalidade particular, é observada tolerância imune quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB.
[00190] Em outras modalidades, a resposta imune compreende uma resposta imune mediada por células. Em algumas modalidades, a resposta imune mediada por células compreende a liberação de uma citocina. Em determinadas modalidades, as citocina liberadas como parte de uma resposta imune mediada por células podem ser selecionadas entre o grupo consistindo em: IL-12, IL-4, IL-17, TNF-α, e qualquer combinação dos mesmos.
[00191] Em outras modalidades, a resposta imune compreende um sintoma clínico selecionado entre o grupo consistindo em: aumento da tendência a sangramento, alto consumo de fator de coagulação, falta de resposta à terapia de fator de coagulação, diminuição da eficácia da tera
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40/162 pia de fator de coagulação, encurtação da meia-vida do fator de coagulação, e qualquer combinação dos mesmos.
[00192] Em outras modalidades, a tolerância imune é medida por um aumento na meia-vida do fator de coagulação depois de administração ao ser humano. Em algumas modalidades, a tolerância imune é induzida assim que a meia-vida do fator de coagulação é aumentado por no mínimo cerca de 10%, no mínimo cerca de 15%, no mínimo cerca de 20%, no mínimo cerca de 25%, no mínimo cerca de 30%, no mínimo cerca de 35%, no mínimo cerca de 40%, no mínimo cerca de 45%, no mínimo cerca de 50%, no mínimo cerca de 75%, no mínimo cerca de 100%, no mínimo cerca de 150%, no mínimo cerca de 200%, no mínimo cerca de 300%, no mínimo cerca de 400%, no mínimo cerca de 500%, ou no mínimo cerca de 1000% em comparação com a meia-vida do fator de coagulação administrado ao ser humano antes da indução de tolerância imune. Em determinadas modalidades, a meia-vida do fator de coagulação é no mínimo cerca de 3 horas, no mínimo cerca de 4 horas, no mínimo cerca de 5 horas, no mínimo cerca de 6 horas, no mínimo cerca de 7 horas, no mínimo cerca de 8 horas, no mínimo cerca de 9 horas, no mínimo cerca de 10 horas, no mínimo cerca de 11 horas, no mínimo cerca de 12 horas, no mínimo cerca de 13 horas, no mínimo cerca de 14 horas, ou no mínimo cerca de 15 horas depois da indução de tolerância imune.
[00193] O termo comparável conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa uma taxa ou nível comparado resultado do utilização, por exemplo, da proteína quiméríca ser igual a, substancialmente igual a, ou similar à taxa ou ao nível de referência. O termo similar conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa que uma taxa ou nível comparado tem uma diferença de não mais de 10% ou não mais de 15% da taxa ou do nível de referência (por exemplo, taxa de produção de FXa
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41/162 por uma proteína quimérica consistindo essencialmente em ou consistindo em duas porções Fc e FVIH processado, em que o FVIII processado é fundido a um Fc das duas porções Fc). O termo substancialmente igual significa que uma taxa ou nível comparado tem uma diferença de não mais de 0,01%, 0,5% ou 1% da taxa ou do nível de referência.
[00194] Distúrbio hemostático, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa uma condição geneticamente hereditária ou adquirida caracterizada por uma tendência a hemorragia, quer espontaneamente ou em consequência de trauma, devido a uma capacidade prejudicada ou incapacidade de formar um coágulo de fibrina. Exemplos de similares distúrbios incluem as hemofilias. As três principais formas são hemofilia A (deficiência do Fator VIII), hemofilia B (deficiência do Fator IX ou doença de Christmas) e hemofilia C (deficiência do Fator XI, tendência a sangramento moderado). Outros distúrbios hemostáticos incluem, por exemplo, a doença de Von Willebrand, deficiência do Fator XI (deficiência de PTA), deficiência do Fator XII, deficiências ou anormalidades estruturais em fibrinogênio, protrombina, Fator V, Fator VII, Fator X ou Fator XIII, síndrome de Bernard-Soulier, a qual é um defeito ou deficiência em GPIb. GPIb, o receptor para VWF, pode ser defeituoso e levar a falta de formação de coágulo primário (hemostasia primária) e aumento da tendência a sangramento), e trombastenia de Glanzman e Naegeli (trombastenia de Glanzmann). Na falência hepática (formas aguda e crônica), existe produção insuficiente de fatores de coagulação peto fígado; isto pode aumentar o risco de sangramento.
[00195] Área sob a curva de concentração plasmática versus tempo (AUC), conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, é o mesmo que o termo da técnica em farmacologia, e se baseia na taxa e na extensão da absorção de FVIII depois da administração. A AUC é determinada so
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42/162 bre um periodo de tempo especificado, tal como 12, 18, 24, 36, 48, ou 72 horas, ou para o infinito usando extrapolação baseada na inclinação da curva. A menos que especificado de modo diverso aqui, neste pedido de patente, a AUC é determinada para o infinito. A determinação da AUC pode ser realizada em um único indivíduo, ou em uma população de indivíduos para os quais é calculada a média.
[00196] O termo atividade pró-coagulante significa a capacidade do fator de coagulação, por exemplo, um FVIII, da invenção para participar na cascata de coagulação no sangue, substituindo o fator de coagulação nativo, por exemplo, FVIII nativo. Estão disponíveis vários testes para media a atividade do Fator VIII, incluindo o teste de coagulação de um estágio (tempo de tromboplastina parcial ativada; aPTT), tempo de produção de trombina (TGA) e tromboelastometria rotacional (ROTEM®).
[00197] Referências feitas à numeração de aminoácidos de imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas, ou regiões, são todas baseadas em Kabat et aí 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD, incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. (O receptor FcRn foi isolado a partir de várias espécies de mamíferos incluindo humanos. São mostradas as sequências do FcRn humano, do FcRn de rato, e do FcRn de camimdongo (Story et aí, J. Exp. Med. 180: 2377 (1994), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade.) Um Fc pode compreender os domínios CH2 e CH3 de uma imunoglobulina com ou sem a região de articulação da imunoglobulina. Exemplos de variantes de Fc são proporcionados em WO 2004/101740 e em WO 2006/074199, incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade.
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43/162 [00198] Polípeptídeos e proteínas híbridos, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa uma combinação de uma proteína quimérica com um segundo polipeptídeo. A proteína quimérica e o segundo polipeptídeo em um híbrido podem ser associados um com o outro por meio de interações de proteína-proteína, tais como carga-carga ou interações hidrofóbicas. A proteína quimérica e o segundo polipeptídeo em um híbrido podem ser associados um com o outro por meio de uma ou mais ligações de dissulfeto ou covalentes diversas. Híbridos são descritos em WO 2004/101740 e em WO 2006/074199, cada um dos quais é incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. Vide também as Patentes U.S. Nos. 7.404.956 e 7.348.004, cada uma das quais é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. O segundo polipeptídeo pode ser uma segunda cópia da mesma proteína quimérica ou pode ser uma proteína quimérica não idêntica.
[00199] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, um aminoácldo correspondente a, sítio correspondente a, ou aminoácido equivalente em uma sequência de proteína é identificado por alinhamento de modo a maximizar a identidade ou similaridade entre uma primeira sequência de proteína, por exemplo, um sequência de FVIII, e uma segunda sequência de proteína, por exemplo, uma segunda sequência de FVIII. O número utilizado para identificar um aminoácido equivalente em uma segunda sequência de proteína é baseado no número utilizado para identificar o aminoácido correspondente na primeira sequência de proteína.
[00200] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo sítio de inserção refere-se a um número do resíduo de aminoácido em um polipeptídeo (tipicamente um polipeptídeo maduro; por exemplo, um polipeptídeo FVIII maduro), ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo, o
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44/162 qual está imediatamente a montante da posição na qual uma porção heteróloga pode ser inserida. Um sítio de inserção é especificado como um número, o número sendo o número do aminoácido especificado da sequência de proteína à qual corresponde o sítio de inserção, o qual está imediatamente N-terminal à posição da inserção. Por exemplo, a expressão o FVIII compreende porção heteróloga em um sítio de inserção o qual corresponde ao aminoácido 745 de uma dada sequência indica que a porção heteróloga está localizada entre dois aminoácidos correspondentes ao aminoácido 745 e ao aminoácido 746 a sequência. No entanto, um versado na técnica prontamente vai ser capaz de identificar uma posição correspondente em qualquer variante da proteína indicada, e a presente invenção não é limitada a inserções feitas unidamente nas variantes especificamente reveladas aqui, neste pedido de patente. Pelo contrário, as inserções reveladas aqui, neste pedido de patente, podem ser feitas em quaisquer variantes relacionadas ou fragmentos das mesmas tendo atividade em uma posição correspondente a uma posição das variantes reveladas aqui, neste pedido de patente.
[00201] A expressão imediatamente a jusante de um aminoácido conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se uma posição logo a seguir ao grupo carboxila terminal do aminoácido. De modo similar, a expressão imediatamente a montante de um aminoácido refere-se à posição logo a seguir ao grupo amina terminal do aminoácido. Portanto, a expressão entre dois aminoácidos de um sítio de inserção conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a uma posição na qual uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de prolongamento da meia-vida) é inserida entre dois aminoácidos adjacentes.
[00202] Os termos inserida, é inserida, inserida em, ou termos gramatical mente relacionados, conforme utilizado aqui, neste pedido de
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45/162 patente, referem-se à posição de uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de prolongamento da meia-vida) em um polipeptídeo de fusão em relação à posição análoga na proteína especificada (por exemplo, uma proteína FVIII). Os versados na técnica vão entender como identificar posições de inserções correspondentes com respeito a outras sequências de polipeptídeos, por exemplo, outras variantes de FVIII. Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, os termos referem-se às características do polipeptídeo recombinante revelado aqui, neste pedido de patente, e não indicam, implicam ou inferem quaisquer métodos ou processo pelos quais foi produzido o polipeptídeo de fusão. Por exemplo, em referência a um polipeptídeo de fusão proporcionado aqui, neste pedido de patente, a expressão uma porção heteróloga é inserida imediatamente a jusante do resíduo 745 do polipeptídeo FVIII” significa que o polipeptídeo de fusão compreende uma porção heteróloga imediatamente a jusante de um aminoácido o qual corresponde ao aminoácido 745 em uma variante de FVIII particular, por exemplo, ligado por aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 745 e 746 da variante de FVIII.
[00203] Uma proteína de fusão ou quimérica compreende uma primeira sequência de aminoácidos ligada a uma segunda sequência de aminoácidos com a qual não é ligada naturalmente na natureza. As sequências de aminoácidos as quais existem normalmente em proteínas separadas podem ser trazidas juntas no polipeptídeo de fusão, ou as sequências de aminoácidos as quais existem normalmente na mesma proteína podem ser colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão, por exemplo, fusão de um FVIII domínio da invenção com um domínio Fc da Ig. Uma proteína de fusão é criada, por exemplo, por síntese química, ou por criação e translação de um polinucleotídeo no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada. Uma proteína de
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46/162 fusão pode compreender adicionalmente uma segunda sequência de aminoácidos associada com a primeira sequência de aminoácidos por uma ligação covalente, não peptídica ou por uma ligação não covalente.
[00204] Os termos heterólogo e porção heteróloga significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou outra porção é derivado de uma entidade distinta da entidade à qual está sendo comparado. Por exemplo, um polipeptídeo heterólogo pode ser sintético, ou derivado a partir de uma espécie diferente, de um tipo celular diferente de um indivíduo, ou do mesmo tipo celular ou de tipo celular diferente de indivíduos distintos. Em um aspecto, uma porção heteróloga é um polipeptídeo fundido a outro polipeptídeo para produzir um polipeptídeo de fusão ou uma proteína de fusão. EM outro aspecto, uma porção heteróloga é um não polipeptídeo tal como PEG conjugado a um polipeptídeo ou a uma proteína.
[00205] Os termos ligada e fundida conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a uma primeira sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos unida de modo covalente ou de modo não covalente a uma segunda sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos, respectivamente. A primeira sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos pode ser unida diretamente ou justaposta à segunda sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos ou alternativamente uma sequência intermediária pode unir de modo covalente a primeira sequência à segunda sequência. O termo ligada significa não somente uma fusão de uma primeira sequência de aminoácidos a uma segunda sequência de aminoácidos no término carbóxi ou no término amino, mas também inclui inserção de toda a primeira sequência de aminoácidos (ou toda a segunda sequência de aminoácidos) dentro de quaisquer dois aminoácidos na segunda sequência de aminoácidos (ou na primeira sequência de aminoácidos, respectivamente). Em uma modalidade, a primeira sequência de
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47/162 aminoácidos é ligada a uma segunda sequência de aminoácidos por uma ligação peptídica ou por um encadeador. A primeira sequência de nucleotídeos pode ser ligada a uma segunda sequência de nucleotídeos por uma ligação de fosfodiéster ou por um encadeador. O encadeador pode ser um peptídeo ou um polipeptídeo (para cadeias polipeptídicas) ou um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos (para cadeias de nucleotídeos) ou qualquer porção química (para tanto cadeias de polipeptídeos quanto de polinucleotídeos). O termo ligada” também é indicado por um hífen (-).
[00206] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo associada com” refere-se a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira cadeia de aminoácidos e uma segunda cadeia de amínoácidos. Em uma modalidade, o termo associada com significa uma ligação covalente, não peptídica ou uma ligação não covalente. Esta associação pode ser indicada por dois pontos, isto é, (:). Em outra modalidade, significa uma ligação covalente exceto uma ligação peptídica. Por exemplo, o aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissulfeto ou com um grupo tiol sobre um segundo resíduo de cisteína. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CH1 e CL são associadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são associadas por duas ligações de dissulfeto em posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da União Européia). Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não estão limitados a, uma ligação peptídica, uma ligação metálica, uma ligação de hidrogênio, uma ligação de dissulfeto, uma ligação sigma, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, uma ligação agnóstica, uma ligação dobrada, uma ligação dipolar, uma ligação do tipo Pi
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48/162 backbond, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quíntupla, uma ligação sêxtupla, conjugação, hiperconjugação, aromaticidade, hapticidade, ou antiligante (antibonding). Exemplos não limitantes de ligação não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação cátion-pi ou ligação salina), uma ligação metálica, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de di-hidrogênio, complexo de di-hidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa barreira, ou ligação de hidrogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogênio, aurofilicidade, intercalação, empilhamento, força entrópica, ou polaridade química.
[00207] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo sítio de clivagem ou sítio de clivagem enzimática refere-se a um sítio de reconhecido por uma enzima. Alguns sítios de clivagem enzimática compreendem um sítio de processamento intracelular. Em uma modalidade, um polipeptideo tem um sítio de clivagem enzimática clivado por uma enzima que é ativada durante a cascata de coagulação, de tal modo que ocorre clivagem de similares sítios no sítio de formação de coágulo. Exemplos de similares sítios incluem, por exemplo, os reconhecidos por trombina, Fator Xla ou Fator Xa. Outros sítios de clivagem enzimática são conhecidos na técnica.
[00208] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo sítio de processamento ou sítio de processamento intracelular refere-se a um tipo de sítio de clivagem enzimática em um polipeptideo o qual é um alvo para enzimas que funcionam depois de translação do polipeptideo. Em uma modalidade, as enzimas referidas funcionam durante o transporte do lúmen de Golgi para o compartimento trans-Golgi. Enzimas de processamento intracelular clivam polipeptídeos antes de secreção da proteína a partir da célula. Exemplos de similares sítios de processamento incluem,
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49/162 por exemplo, os visados pela família de endopeptidases PACE/furinas (onde PACE é um acrônimo para Enzima de Clivagem de Aminoácidos básicos Pareados). Estas enzimas são localizadas para a membrana de Golgi e clivam proteínas sobre o lado carbóxi terminal do motivo da sequência Arg-[qualquer resíduo]-(Lys ou Arg)-Arg. Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, a família de enzimas furinas inclui, por exemplo, PCSK1 (também conhecida como PC1/PC3), PCSK2 (também conhecida como PC2), PCSK3 (também conhecida como furina ou PACE), PCSK4 (também conhecida como PC4), PCSK5 (também conhecida como PC5 ou PC6), PCSK6 (também conhecida como PACE4), ou PCSK7 (também conhecida como PC7/LPC, PC8, ou SPC7). Outros sítios de processamento são conhecidos na técnica.
[00209] Em constructos que incluem mais de um sítio de processamento ou clivagem, será entendido que os sítios referidos podem ser os mesmos ou diferentes.
[00210] Um encadeador processável conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a um encadeador compreendendo no mínimo sítio de processamento intracelular, o qual é descrito em outra parte aqui, neste pedido de patente.
[00211] Linha basal, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, é o menor nível plasmático medido de um dado analito, por exemplo, um fator de coagulação (por exemplo, FVIII) ou um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-FVIII), em um indivíduo antes da administração de uma dose. Os níveis plasmáticos podem ser medidos em dois pontos do tempo antes da dosagem: em uma visita de triagem e imediatamente antes da dosagem.
[00212] Dose equivalente, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa a mesma dose de atividade do fator de coagulação, por
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50/162 exemplo, atividade do FVIII, conforme expresso em Unidades Internacionais, a qual é independente do peso molecular do polipeptídeo em questão. Por exemplo, uma Unidade Internacional (UI) de atividade do FVIII corresponde aproximadamente à quantidade de FVIII em um mililitro de plasma humano normal. Estão disponíveis vários testes para medir a atividade do fator de coagulação, incluindo o teste de substrato cromogênico da Farmacopéia Européia e um teste de coagulação de um estágio.
[00213] Intervalo de dosagem, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa a dose de tempo que decorre entre múltiplas doses sendo administradas a um indivíduo. A comparação do intervalo de dosagem pode ser realizada em um único indivíduo ou em uma população de indivíduos, e em seguida pode ser calculada a média obtida na população.
[00214] Indivíduo, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa um indivíduo humano. Indivíduo pode ser um paciente que esteja sofrendo atualmente de um transtorno hemorrágico ou que se espera que venha a necessitar de tal tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo nunca foi tratado previamente com o fator de coagulação (isto é, o indivíduo é um indivíduo não tratado previamente ou um paciente não tratado previa mente). Em algumas modalidades, o indivíduo é um feto e os métodos compreendem a administração da composição ou da proteína quimérica à mãe do feto e a administração ao indivíduo ocorre a partir da mãe através da placenta. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma criança ou um adulto. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma criança de menos de um ano de idade, menos de dois anos de idade, menos de três anos de idade, menos de quatro anos de idade, menos de cinco anos de idade, menos de seis anos de idade, menos de sete anos de idade, menos de oito anos de idade, menos de nove anos de idade, me
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51/162 nos de dez anos de idade, menos de onze anos de idade, ou menos de doze anos de idade. Em algumas modalidades, a criança tem menos de um ano de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo criança ou adulto desenvolve um transtorno hemorrágico, em que o início dos sintomas do transtorno hemorrágico é depois de um ano de idade. Em algumas modalidades, a administração da composição ou da proteína quiméríca ao indivíduo é suficiente para prevenir, inibir, ou reduzir o desenvolvimento de uma resposta imune selecionada entre uma resposta imune humoral, uma resposta imune mediada por células, ou tanto uma resposta imune humoral quanto uma resposta imune mediada por células contra o fator de coagulação. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano, e o indivíduo desenvolveu previamente uma resposta imune para um fator de coagulação. Em algumas modalidades, o ser humano previamente falhou em responder a uma terapia de tolerância imune. Em algumas modalidades, a terapia de tolerância imune prévia compreende administração de uma alta dose de um fator de coagulação. Em outras modalidades, a terapia de tolerância imune prévia compreende administração de um ou mais imunossupressores. Em uma modalidade, a terapia de tolerância imune prévia foi um Regime de Malmo. Em outra modalidade, a terapia de tolerância imune prévia foi um Protocolo de Bonn.
[00215] Uma dose terapêutica, dose, dose eficaz, ou quantidade da dosagem conforme utilizado (de modo intercambiável) aqui, neste pedido de patente, significa uma dose que atinge um objetivo terapêutico, conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Em algumas modalidades, uma dose terapêutica significa uma dose que induz uma tolerância imune em um indivíduo. Em determinadas modalidades, uma dose terapêutica significa uma dose que induz uma tolerância imune em um indi
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52/162 víduo dentro de um período de tempo para tolerância especificado, por exemplo, dentro de 12 semanas da administração da primeira dose.
[00216] Também são incluídos na presente invenção fragmentos ou variantes de polipeptídeos, e qualquer combinação dos mesmos. O termo fragmento ou variante, quando refere-se aos polipeptídeos utilizados nos métodos da presente invenção, inclui quaisquer polipeptídeos os quais conservam no mínimo algumas das propriedades (por exemplo, afinidade de ligação ao FcRn para um domínio de ligação ao FcRn ou variante de Fc, ou atividade de coagulação para um FVIII) do polipeptídeo de referência. Fragmentos de polipeptídeos incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos em outra parte aqui, neste pedido de patente, mas não incluem o polipeptídeo de comprimento total que ocorre naturalmente (ou polipeptídeo maduro). Variantes de domínios de ligação de polipeptídeo ou moléculas de ligação utilizadas nos métodos da presente invenção incluem fragmentos conforme descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ser que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente. Variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras.
[00217] Uma substituição de aminoácido conservadora é uma substituição de aminoácido na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares têm sido definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina,
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53/162 arglnina, histidina), cadeias laterais acidíferas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Deste modo, se um aminoácido em um polipeptídeo for substituído com outro aminoácido da mesma família de cadeias laterais, a substituição é considerada como sendo conservadora. Em outra modalidade, uma cadeia de aminoácidos pode ser substituída de maneira conservadora com uma cadeia estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição de membros de famílias de cadeias laterais.
[00218] O termo percentagem de identidade de sequências entre duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos refere-se ao número de posições correspondentes idênticas partilhadas pelas sequências sobre uma janela de comparação, tendo em conta adições ou deleções (isto é, intervalos) que devem ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. Uma posição correspondente é qualquer posição onde um nucleotídeo ou aminoácido idêntico é apresentado tanto na sequência alvo quanto na sequência de referência. Os intervalos apresentados na sequência alvo não são contados desde que os intervalos não sejam nucleotídeos ou aminoácidos. Do mesmo modo, os intervalos apresentados na sequência de referência não são contados desde que nucleotídeos ou aminoácidos da sequência sejam contados, não nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de referência.
[00219] A percentagem de identidade de sequências é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido
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54/162 idêntico ou base de ácido nucléico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequências. A comparação de sequências e determinação de percentagem de identidade de sequências entre duas sequências podem ser realizadas usando software prontamente disponível tanto para utilização online quanto para download. Programas de software adequados estão disponíveis a partir de várias fontes, e para alinhamento tanto de sequências de proteínas quanto de nucleotídeos. Um programa adequado para determinar a percentagem de identidade de sequências é b!2seq, parte do pacote BLAST de programas disponíveis do web site National Center for Biotechnology Information BLAST do governo dos Estados Unidos (blast.ncbi.nlm.nih.gov). BI2seq realiza uma comparação entre duas sequências usando ou o algoritmo BLASTN ou o BLASTP. BLASTN é utilizado para comparar sequências de ácidos nucléicos, ao passo que BLASTP é utilizado para comparar sequências de aminoácidos. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water, ou Matcher, parte da suite EMBOSS de programas de bioinformática e também disponíveis no European Bioinformatics Institute (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
[00220] Diferentes regiões dentro de uma única sequência alvo de polinucleotídeos ou polipeptídeos que alinha com uma sequência de referência de polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ter cada uma sua própria percentagem de identidade de sequências. Deve ser observado que o valor da percentagem de identidade de sequências é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13, e 80,14 são arredondados para baixo para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18,
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55/162 e 80,19 sâo arredondados para cima para 80,2. Também deve ser observado que o valor do comprimento vai ser sempre um inteiro.
[00221] Um versado na técnica vai reconhecer que a geração de um alinhamento de sequência para o cálculo de uma percentagem de identidade de sequências não é limitada a comparações de sequênciasequência binárias exclusivamente acionadas por dados de sequências primárias. Alinhamentos de sequências podem ser derivados a partir de alinhamentos de múltiplas sequências. Um programa adequado para gerar alinhamentos de múltiplas sequências é ClustalW2, disponível em www.clustal.org. Outro programa adequado é MUSCLE, disponível em www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 e MUSCLE estão disponíveis alternativamente, por exemplo, no EBI.
[00222] Também será reconhecido que alinhamentos de sequências podem ser gerados integrando dados de sequências com dados de fontes heterogêneas tais como dados estruturais (por exemplo, estruturas proteicas cristalográficas), dados funcionais (por exemplo, localização de mutações), ou dados filogenéticos. Um programa adequado que integra dados heterogêneos para gerar um alinhamento de múltiplas sequências é T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org, e alternativamente disponível, por exemplo, no EBI. Também será reconhecido que o alinhamento final utilizado para calcular a percentagem de identidade de sequências pode ser curado quer automaticamente ou manualmente.
[00223] As variantes de polinucleotídeos podem conter alterações nas regiões codificantes, nas regiões não codificantes, ou em ambas. Em uma modalidade, as variantes de polinucleotídeos contêm alterações as quais produzem substituições, adições, ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em outra modalidade, variantes de nucleotídeos são produzidas por substitul
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56/162 ções silenciosas devido à degeneraçâo do código genético. Em outras modalidades, variantes nas quais 5 a 10, 1 a 5, ou 1 a 2 aminoácidos são substituídos, deletados, ou adicionados em qualquer combinação. Variantes de polinucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de códons para um hospedeiro em particular (modificar códons no mRNA humano para outros, por exemplo, um hospedeiro bacteriano tal como E. coii).
[00224] Variantes que ocorrem naturalmente são denominadas variantes alélicas, e referem-se a uma de várias formas alternadas de um gene ocupando um determinado *locus sobre um cromossoma de um organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas podem variar ou ao nível do polinucleotídeo e/ou do polipeptídeo e são incluídas na presente invenção. Alternativamente, variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.
[00225] Usando métodos conhecidos de engenharia de proteína e tecnologia de DNA recombinante, podem ser geradas variantes para aprimorar ou alterar as características dos polipeptídeos. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do término amino ou término carbóxí da proteína secretada sem perda substancial de função biológica. Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade, reportaram proteínas KGF variantes tendo atividade de ligação a heparina mesmo depois de deleção de 3, 8, ou 27 resíduos de aminoácidos do término amino. De modo similar, gama Interferon apresentou atividade até dez vezes maior depois de deleção de 8 a 10 resíduos de aminoácidos do término carbóxi desta proteína. (Dobeli et at, J. Biotechnology 7:199-216
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57/162 (1988), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade.) [00226] Além disso, ampla evidência demonstra que variantes frequentemente retém uma atividade biológica similar à da proteína que ocorre naturalmente. Por exemplo, Gayle e colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade) conduziram extensiva análise mutacional da citocina humana IL-1a. Usaram mutagênese aleatória para gerar mais de 3.500 mutantes de IL-1 a individuais que calcularam a média de 2,5 modificações de aminoácidos por variante sobre todo o comprimento da molécula. Múltiplas mutações foram examinadas em todas as posições possíveis de aminoácido. Os pesquisadores descobriram que a maior parte da molécula pode ser alterada com pouco efeito sobre ou [ligação ou atividade biológica]. (Vide Resumo.) De fato, somente 23 sequências de aminoácidos únicas, de mais de 3.500 sequências de nucleotídeos examinadas, produziram uma proteína que diferiu significativamente em atividade da selvagem.
[00227] Conforme declarado acima, variantes de polipeptídeos incluem, por exemplo, polipeptídeos modificados. Modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação covalente de flavina, anexação covalente de uma porção heme, anexação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, anexação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, anexação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, demetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação (Mei et aí, Blood 116:270-79 (2010), o qual é
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58/162 incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade), processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos, mediada por RNA de transferência, a proteínas tais como arginilação, e ubiquitinação. Em algumas modalidades, FVIII é modificado, por exemplo, peguilado, em qualquer localização conveniente. Em algumas modalidades, FVIII é peguilado em um aminoácido de FVIII exposto superficialmente, por exemplo, uma cisteína exposta superficialmente, a qual pode ser uma cisteína manipulada. Id. Em algumas modalidades, FVIII modificado, por exemplo, FVIII peguilado, é um FVIII quimérico ou de fusão.
[00228] O termo a jusante refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada 3’ a uma sequência de nucleotídeos de referência. A jusante também pode se referir a uma sequência de peptídeos que está localizada C-termlnal a uma sequência de peptídeos de referência.
[00229] O termo a montante refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada 5' a uma sequência de nucleotídeos de referência. A montante também pode se referir a uma sequência de peptídeos que está localizada N-terminal a uma sequência de peptídeos de referência.
[00230] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo região reguladora refere-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificantes 3!) de uma região codificante, e as quais influenciam a transcrição, o processamento de RNA, a estabilidade, ou a translação da região codificante associada. Regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de translação, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de
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59/162 ligação a efetores e estruturas de haste-laço (stem-loop). Se uma região codificante for destinada para expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e sequência de terminação de transcrição vão ser geral mente localizados 3! à sequência codificante.
[00231] Um polinucleotideo, o qual codifica um produto genético, por exemplo, um polipeptídeo, pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou translação associados operacional mente com uma ou mais regiões codificantes. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo reforçadores, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição, também podem ser associados operacional mente com uma região codificante para dirigir a expressão de produtos genéticos.
[00232] Uma variedade de regiões de controle de transcrição são de conhecimento dos versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição, as quais funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitadas a, segmentos promotores e reforçadores de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com íntron-A), de vírus símio 40 (o promotor precoce), e de retrovirus (tais como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem os derivados de genes de vertebrados tais como actina, proteína do choque térmico, hormônio do crescimento bovino e βglobina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão genética em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e reforçadores específicos de tecidos bem como promotores indutíveis por linfocinas (por exemplo, promotores indutíveis por interferons ou interleucinas).
[00233] De modo similar, uma variedade de elementos de controle de translação são de conhecimento dos versados na técnica. Estes incluem,
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60/162 mas não estão limitados a sítios de ligação de ribossoma, códons de iniciação e terminação de translação, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio interno de entrada do ribossoma, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).
[00234] O termo expressão conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto genético, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo.
[00235] Um vetor refere-se a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de um ácido nucléico para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de ácido nucléico pode ser anexado de modo a produzir a replicação do segmento anexado. Um replicon refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação in vivo, isto é, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo vetor inclui tanto veículos virais quanto não virais para introdução do ácido nucléico em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Um grande número de vetores é conhecido e utilizado na técnica incluindo, por exemplo, plasmídeos, vírus eucarióticos modificados, ou vírus bacterianos modificados. A inserção de um polinucleotídeo em um vetor adequado pode ser realizada ligando os fragmentos de polinucleotídeos apropriados em um vetor escolhido que tenha términos coesivos complementares.
[00236] O termo plasmídeo refere-se a um elemento extracromossômico frequentemente carregando um gene que não é parte do metabolismo central da célula, e geralmente sob a forma de moléculas de DNA de cadeia dupla circular. Os elementos referidos podem ser sequências replicando autonomamente, sequências de integração de genoma, sequências de fagos ou de nucleotídeos, lineares, circulares, ou
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61/162 superespiraladas, de um DNA ou RNA de cadeia única ou de cadeia dupla, derivadas a partir de qualquer fonte, na quais uma série de sequências de nucleotídeos tenham sido unidas ou recombinadas em uma única construção a qual é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado junto com sequência não traduzida 3' apropriada dentro de uma célula.
[00237] Vetores virais eucarióticos que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, vetores de adenovirus, vetores de retrovirus, vetores de vírus adeno-associados, e poxvirus, por exemplo, vetores do vírus vaccinia, vetores de baculovírus, ou vetores de herpes vírus. Vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídeos eletricamente carregados (citofectinas), complexos de DNA-proteína, e biopolímeros.
[00238] Um vetor de clonagem refere-se a um replicon, o qual é uma unidade de comprimento de um ácido nucléico que replica sequencial mente e o qual compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, um fago ou um cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucléico pode ser anexado de modo a produzir a replicação do segmento anexado. Determinados vetores de clonagem são capazes de replicação em um tipo de célula, por exemplo, bactérias, e de expressão em outro, por exemplo, células eucarióticas. Vetores de clonagem tipicamente compreendem uma ou mais sequências que podem ser utilizadas para seleção de células compreendendo o vetor e/ou um ou mais sítios de múltipla clonagem para inserção de sequências de ácidos nucléicos de interesse.
[00239] O termo vetor de expressão refere-se a um veículo designado para permitir a expressão de uma sequência de ácidos nucléicos inserida depois de inserção dentro de uma célula hospedeira. A sequência de
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62/162 ácidos nucléicos inserida é colocada em associação operável com regiões reguladoras conforme descrito acima.
[00240] Vetores são introduzidos dentro de células hospedeiras por métodos de conhecimento geral na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, dextrano DEAE, precipitação de fosfato de cálcio, lipofection (fusão de lisossoma), utilização de uma pistola genética, ou um transportador de vetor de DNA.
[00241] Um polipeptídeo isolado” ou um fragmento, variante, ou derivado do mesmo refere-se a um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Não é requerido um nível particular de purificação. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser simplesmente removido de sem meio ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos produzidos de maneira recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para os fins da invenção, assim como polipeptídeos nativos ou recombinantes os quais tenham sido separados, fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.
[00242] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo célula hospedeira refere-se a uma célula ou uma população de células abrigando ou capazes de abrigar um ácido nucléico recombinante. Células hospedeiras podem ser algumas células procarióticas (por exemplo, E. coli), ou alternativamente, as células hospedeiras podem ser eucarióticas, por exemplo, células fúngicas (por exemplo, células de levedura tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, ou Schizosaccharomyces pombé), e várias células de animais, tais como células de insetos (por exemplo, Sf-9) ou células de mamíferos (por exemplo, HEK293F, CHO, COS- 7, NIH-3T3).
[00243] Volume de distribuição em estado estacionário (Vss), conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, tem o mesmo significado
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63/162 que o termo utilizado em farmacologia, o qual é o espaço (volume) aparente no qual um fármaco se distribui, Vss ~ a quantidade de fármaco no corpo dividida pela concentração plasmática em estado estacionário.
II. Métodos da Invenção [00244] A presente invenção se baseia na descoberta de que um fator de coagulação fundido a uma região Fc pode ser utilizado para induzir tolerância imune em um ser humano com hemofilia, em que o ser humano tenha desenvolvido um inibidor contra um fator de coagulação e tenha falhado uma ou mais terapias de tolerância imune prévias. Embora previamente se acreditasse que o tratamento com uma proteína quimérica de FVIII-Fc pudesse prevenir uma resposta imune para o tratamento de FVIII, surpreendentemente se descobriu na presente invenção que o tratamento com uma proteína quimérica de fator de coagulação-Fc pode reduzir uma resposta imune previamente desenvolvida em um ser humano que não tenha respondido a terapias de tolerância imune prévias. Portanto, a presente invenção proporciona métodos para indução de tolerância imune em um ser humano, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um fator de coagulação e um Fc ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou um polinucleotídeo codificando os mesmos.
[00245] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo (1) administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um fator de coagulação e um Fc ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica induz tolerância imune no ser humano; e (2) depois da indução
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64/162 de tolerância imune, administração ao ser humano de um regime de redução gradual de dose da composição ou da proteína quiméríca. Em determinadas modalidades, ocorre indução de tolerância imune quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB. Em determinadas modalidades, ocorre indução de tolerância imune quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB, e 60% de recuperação da atividade do fator de coagulação conforme monitorado no plasma. Em algumas modalidades da presente invenção, o método adicionalmente compreende (3) depois do regime de redução gradual de dose, administração ao ser humano de uma dose profilática do fator de coagulação. Em determinados aspectos, o ser humano não foi tratado com uma terapia de tolerância imune prévia contra o fator de coagulação. A composição ou a proteína quiméríca compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc pode ser administrada ao ser humano em qualquer momento que tenha sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória no ser humano. Em outras modalidades, a composição ou a proteína quiméríca pode ser administrada ao ser humano o qual ainda não tenha desenvolvido uma ou mais respostas imunes inibitórias para prevenir o desenvolvimento de uma resposta imune inibitória. Em algumas modalidades, a composição ou a proteína quiméríca é administrada ao ser humano o qual tenha uma alta probabilidade (por exemplo, histórico familiar, predisposição genética, ou apresentação de um biomarcador) de desenvolver uma resposta imune inibitória. Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória antes da administração. Em algumas modalidades, a composição ou a proteína quimérica com
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65/162 preendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 1 dia, menos de cerca de 2 dias, menos de cerca de 3 dias, menos de cerca de 4 dias, menos de cerca de 5 dias, menos de cerca de 6 dias, menos de cerca de 7 dias, menos de cerca de 2 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 2 meses, menos de cerca de 3 meses, menos de cerca de 4 meses, menos de cerca de 5 meses, menos de cerca de 6 meses, menos de cerca de 1 ano, menos de cerca de 2 anos, menos de cerca de 3 anos, menos de cerca de 4 anos, ou menos de cerca de 5 anos depois de ter sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória ou que o ser humano tem uma probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória no ser humano. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano imediatamente depois de ter sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória ou que o ser humano tem uma probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória no ser humano. Em modalidades particulares, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 5 minutos, menos de cerca de 10 minutos, menos de cerca de 15 minutos, menos de cerca de 20 minutos, menos de cerca de 30 minutos, menos de cerca de 45 minutos, menos de cerca de 1 hora, menos de cerca de 2 horas, menos de cerca de 3 horas, menos de cerca de 4 horas, menos de cerca de 5 horas, menos de cerca de 6 horas, me
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66/162 nos de cerca de 7 horas, menos de cerca de 8 horas, menos de cerca de 9 horas, menos de cerca de 10 horas, menos de cerca de 11 horas, menos de cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, ou menos de cerca de 24 horas depois de ter sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória ou que o ser humano tem uma probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória no ser humano. Em modalidades particulares, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, ou cerca de 24 horas depois de ter sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória ou que o ser humano tem uma probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória no ser humano. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano menos de cerca de 1 dia depois de ter sido determinado que o ser humano desenvolveu uma resposta imune inibitória ou que o ser humano tem uma probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória, por exemplo, depois de medir o nível de uma resposta imune inibitória ou a probabilidade de desenvolver uma resposta imune inibitória no ser humano.
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67/162 [00246] A indução de uma resposta imune pode ser continuada até o nível de inibidor ser menor do que um determinado nível ou até não serem detectáveís inibidores. Em determinadas modalidades, o período de indução pode continuar por no mínimo cerca de 24 semanas, no mínimo cerca de 26 semanas, no mínimo cerca de 28 semanas, no mínimo cerca de 30 semanas, no mínimo cerca de 32 semanas, no mínimo cerca de 34 semanas, no mínimo cerca de 36 semanas, no mínimo cerca de 38 semanas, no mínimo cerca de 40 semanas, no mínimo cerca de 42 semanas, no mínimo cerca de 44 semanas, no mínimo cerca de 46 semanas, no mínimo cerca de 48 semanas, no mínimo cerca de 50 semanas, no mínimo cerca de 52 semanas, no mínimo cerca de 54 semanas, no mínimo cerca de 56 semanas, no mínimo cerca de 58 semanas, no mínimo cerca de 60 semanas, no mínimo cerca de 62 semanas, no mínimo cerca de 64 semanas, no mínimo cerca de 66 semanas, no mínimo cerca de 68 semanas, no mínimo cerca de 70 semanas. Em uma modalidade particular, o período de indução é menos de 60 semanas.
[00247] A resposta imune inibitória tratada pelos métodos da presente invenção pode incluir qualquer resposta dentro do ser humano que impact© de maneira negativa um ou mais efeitos de um tratamento de fator de coagulação. Em algumas modalidades, a resposta imune inibitória compreende a produção de anticorpos inibitórios contra o fator de coagulação, por exemplo, anticorpos antí-FVIII inibitórios. Em determinadas modalidades, o método de a presente invenção adicionalmente compreende medir o título de um ou mais anticorpos inibitórios no ser humano antes (por exemplo, na linha basal) e depois da administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou um polinucleotídeo codificando os mesmos. Em algumas modalidades, o título dos
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68/162 anticorpos inibitórios antes da administração (por exemplo, na linha basal) é no mínimo cerca de 0,6 Unidades Bethesda (UB). Em determinadas modalidades, o título dos anticorpos inibitórios antes da administração (por exemplo, na linha basal) é no mínimo cerca de 1 UB, no mínimo cerca de 2 UB, no mínimo cerca de 3 UB, no mínimo cerca de 4 UB, no mínimo cerca de 5 UB, no mínimo cerca de 6 UB, no mínimo cerca de 7 UB, no mínimo cerca de 10 UB, no mínimo cerca de 20 UB, no mínimo cerca de 30 UB, no mínimo cerca de 40 UB, no mínimo cerca de 50 UB, no mínimo cerca de 100 UB, no mínimo cerca de 150 UB, ou no mínimo cerca de 200 UB. Em uma modalidade particular, o título dos anticorpos inibitórios antes da administração (por exemplo, na linha basal) é no mínimo cerca de 5 UB.
[00248] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção reduzem o título de anticorpos inibitórios em um ser humano em relação ao título dos anticorpos inibitórios antes da administração. Em determinadas modalidades, o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de cerca de 0,6 UB. Em algumas modalidades, o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de cerca de 0,5 UB, menos de cerca de 0,4 UB, menos de cerca de 0,3 UB, menos de cerca de 0,2 UB, ou menos de cerca de 0,1 UB. Em uma modalidade particular, o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é 0 UB. Em outras modalidades, o título dos anticorpos inibitórios depois da administração é menos de 5 UB, menos de 4 UB, menos de 3 UB, menos de 2 UB, menos de 1 UB, menos de 0,9 UB, menos de 0,8 UB, menos de 0,7 UB, ou menos de 0,6 UB.
[00249] Em algumas modalidades, a administração aumenta a diferenciação de macrófagos no ser humano para um fenótipo similar a M2, em comparação com a diferenciação de macrófago em controles não trata
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69/162 dos e seres humanos tratados com o fator de coagulação isolado. Em algumas modalidades, o fenótipo similar a M2 compreende supraregulação da via NRF2, da via PPAR gama, ou tanto da via NRF2 quanto da via PPAR gama. Em algumas modalidades, o fenótipo similar a M2 compreende supra-regulação de CD206 (MRC1). Em algumas modalidades, o fenótipo similar a M2 compreende supra-regulação de ARG1. Em algumas modalidades, o fenótipo similar a M2 compreende supraregulação de CD206 (MRC1) e ARG1.
[00250] Em algumas modalidades, a administração resuita em maior expressão de um ou mais genes no ser humano, em relação à expressão do um ou mais genes em um indivíduo não tratado ou em um indivíduo tratado com o fator de coagulação isolado. Em algumas modalidades, a administração resulta em maior expressão de um ou mais genes selecionados entre o grupo consistindo em: Hmoxl, PPAR gama, LPL, EGR2, SLCO4A1, heme oxigenase 1 (HO-1), inibidor do crescimento induzido por estresse oxidativo 1 (OSGIN1), superóxido dismutase 1 (SOD1), glutationa-dissulfeto redutase (GSR), subunidade catalítica da glutamatocisteína ligase (GCLC), ligase subunidade modificadora da glutamatocisteína ligase (GCLM), NAD(P)H quinona dehidrogenase 1 (NQO1), proteína de ligação de ácido graxo 5 (FABP5), B7-H3 (CD276), membro 3 da família SLAM (SLAMF3; antígeno linfocitário 9; LY9), membro 7 da família SLAM (SLAMF7), receptor C de manose -tipo 1 (MRC1), membro 4 da família 12 de transportadores de soluto (SLC12A), neuropilina 1 (NRP1), e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a administração resulta em maior expressão de um ou mais genes da via NRF2. Em determinadas modalidades, o um ou mais genes da via NRF2 são selecionados entre o grupo consistindo em: HO-1, OSGIN1, SOD1, GSR, GCLC, GCLM, NQO1, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas
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70/162 modalidades, a administração resulta em maior expressão de um ou mais genes da via PPAR gama. Em algumas modalidades, o um ou mais genes da via PPAR gama são selecionados entre o grupo consistindo em: PPAR gama, LPL, FABP5, EGR2, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a administração resulta em maior expressão de um ou mais genes selecionados entre o grupo consistindo em: B7-H3 (CD276), SLAMF3, SLAMF7, MRC1, SLC12A, NRP1, e qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, a administração resulta em maior expressão do um ou mais genes em relação à expressão do um ou mais genes em um ser humano não tratado ou em um ser humano ao qual foi administrado o fator de coagulação isolado, em que a expressão é no mínimo cerca de 1,5 vezes maior, no mínimo cerca de 2 vezes maior, no mínimo cerca de 2,5 vezes maior, no mínimo cerca de 3 vezes maior, no mínimo cerca de 3,5 vezes maior, no mínimo cerca de 4 vezes maior, no mínimo cerca de 4,5 vezes maior, ou no mínimo cerca de 5 vezes maior.
[00251] Em algumas modalidades, a expressão diferencial do um ou mais genes é observada menos de 6 horas depois da administração. Em algumas modalidades, a expressão diferencial é observada menos de 12 horas depois da administração. Em algumas modalidades, a expressão diferencial é observada menos de 18 horas depois da administração. Em algumas modalidades, a expressão diferencial é observada menos de 24 horas depois da administração.
[00252] Em algumas modalidades, a resposta imune inibitória compreende uma resposta imune mediada por células. Em determinadas modalidades, a resposta imune mediada por células compreende a liberação de uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é qualquer citocina associada com um aumento da resposta imune. Em algumas modalida
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71/162 des, a citocina selecionada entre o grupo consistindo em: IL-1, IL-6, IL-16, IL-12, IL-4, IL-17, fator de necrose tumoral α (TNF-α), interferon a, interferon γ e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a resposta imune mediada por células compreende aumento dos níveis séricos de IL-12. Em outra modalidade, a resposta imune mediada por células compreende aumento dos níveis séricos de IL-4. Em outra modalidade, a resposta imune mediada por células compreende aumento dos níveis séricos de IL-17. Em outra modalidade, a resposta imune mediada por células compreende aumento dos níveis séricos de TNF- a.
[00253] Várias mutações genéticas têm sido ligadas com um aumento do risco de desenvolver uma resposta imune inibitória. Por exemplo, o polímorfismo TNF-α -308G>A dentro de Hap2, o qual está associado com aumento de níveis de transcrição constitutiva e indutível de TNF tem sido ligado com um aumento do risco de desenvolver uma resposta imune inibitória. Vide Astermark et al., Blood 108: 3739-3745 (2006), o qual é aqui, a este pedido de patente, incorporado por meio de referência em sua totalidade. Portanto, em algumas modalidades, o ser humano tem um polimorfismo genético associado com aumento de TNF-α. Em algumas modalidades, o polimorfismo é o polimorfismo TNF-α -308G>A. Em algumas modalidades, o ser humano tem um polimorfismo em um gene IL10, por exemplo, um polimorfismo associado com aumento de secreção de IL10. Em algumas modalidades, FVIII-Fc é administrada a um indivíduo com o alelo 134 do mícro-satélite IL10G na região promotora do gene IL10. Vide Astermark et al. Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108: 3739-3745 (2006), o qual é aqui, a este pedido de patente, incorporado por meio de referência em sua totalidade.
[00254] Em algumas modalidades, o ser humano tem um polimorfismo genético associado com redução da expressão de CTLA-4 (Antigeno 4
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Associado ao Linfócito T Citotóxico). Em algumas modalidades, o ser humano tem uma mutação em moléculas da Classe II de MHC (complexo de histocompatibilidade maior) DR15 (HLA-DR15) ou DQB0602. Outras moléculas da Classe II de MHC associadas com o desenvolvimento de uma resposta imune inibitória em indivíduos com hemofilia são A3, B7, C7, DQA0102, C2, DQA0103, DQB0603, e DR13 (vide Inhibitors in Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan & C.A. Lee, Eds., Blackwell Science, Ltd,, 2002).
[00255] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção reduzem o nível de uma ou mais citocinas no indivíduo comparado com o nível da uma ou mais citocinas no indivíduo depois de um tratamento prévio com um polipeptídeo consistindo em um polipeptídeo FVIII. Em outra modalidade, os métodos da presente invenção reduzem o nível de uma ou mais citocinas no indivíduo comparado com o nível da uma ou mais citocinas no indivíduo antes da administração. Em outras modalidades, a expressão de uma ou mais moléculas tolerogênicas é aumentada depois da administração dos métodos da presente invenção em relação ao nível de expressão da uma ou mais moléculas tolerogênicas antes da administração. Em determinadas modalidades, a uma ou mais moléculas tolerogênicas são selecionadas entre IL-10, TGF-β, IL-35, IDO-1, e qualquer combinação das mesmas.
[00256] Em outras modalidades, a resposta imune compreende um sintoma clínico selecionado entre o grupo consistindo em: aumento da tendência a sangramento, alto consumo de fator de coagulação, falta de resposta à terapia de fator de coagulação, diminuição da eficácia da terapia de fator de coagulação, encurtação da meia-vida do fator de coagulação, e qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, a resposta imune compreende um sintoma clínico selecionado entre
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73/162 o grupo consistindo em: aumento da tendência a sangramento, alto consumo de fator de coagulação, falta de resposta à terapia de fator de coagulação, diminuição da eficácia da terapia de fator de coagulação, diminuição da recuperação da atividade do fator de coagulação conforme monitorado no plasma, encurtação da meia-vida do fator de coagulação, e qualquer combinação dos mesmos.
[00257] Em determinadas modalidades, o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo uma resposta imune inibitória. Um diagnóstico semelhante pode ser feito usando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um ser humano pode ser caracterizado como tendo uma resposta imune para um fator de coagulação, por exemplo, um FVIII, se o ser humano tiver um ou mais dos seguintes: (a) um título de anticorpos inibitórios para o fator de coagulação maior do que ou Igual a 0,6 UB;
(b) aumento dos níveis séricos de uma ou mais cltocinas selecionadas entre o grupo consistindo em: IL-12, IL-4, IL-17, e TNF-α; (c) aumento da tendência a sangramento; (d) alto consumo de fator de coagulação; (e) uma falta de resposta à terapia de fator de coagulação; (f) diminuição da eficácia da terapia de fator de coagulação; (g) encurtação da meia-vida do fator de coagulação, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade particular, o ser humano é caracterizado como tendo uma resposta imune para um fator de coagulação se o ser humano tiver um título de anticorpos inibitórios para o fator de coagulação maior do que ou igual a 0,6 UB.
[00258] Em algumas modalidades, o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta imune Inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de 1 mês, no mínimo cerca de 2 meses, no mínimo cerca de 3 meses, no mínimo cerca de 4 meses, no mínimo cerca de 5 meses, no mínimo cerca de 6 meses, no mínimo cerca
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74/162 de 7 meses, no mínimo cerca de 8 meses, no mínimo cerca de 9 meses, no mínimo cerca de 10 meses, no mínimo cerca de 11 meses, no mínimo cerca de 12 meses, no mínimo cerca de 13 meses, no mínimo cerca de 14 meses, no mínimo cerca de 15 meses, no mínimo cerca de 16 meses, no mínimo cerca de 17 meses, no mínimo cerca de 18 meses, no mínimo cerca de 19 meses, no mínimo cerca de 20 meses, no mínimo cerca de 21 meses, no mínimo cerca de 22 meses, no mínimo cerca de 23 meses, no mínimo cerca de 24 meses, no mínimo cerca de 27 meses, no mínimo cerca de 30 meses, no mínimo cerca de 33 meses, no mínimo cerca de 36 meses, no mínimo cerca de 39 meses, no mínimo cerca de 42 meses, no mínimo cerca de 45 meses, no mínimo cerca de 48 anos, no mínimo cerca de 51 meses, no mínimo cerca de 54 meses, no mínimo cerca de 57 meses, no mínimo cerca de 60 meses, no mínimo cerca de 6 anos, no mínimo cerca de 7 anos, no mínimo cerca de 8 anos, no mínimo cerca de 10 anos, no mínimo cerca de 15 anos, ou no mínimo cerca de 20 anos antes da administração. Em uma modalidade, o ser humano foi diagnosticado previamente como tendo desenvolvido uma resposta Imune inibitória para o fator de coagulação no mínimo cerca de 5 anos antes da administração.
[00259] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção proporcionam um tempo para tolerância melhorado em comparação com métodos de indução de tolerância imune de padrão de tratamento. O termo tempo para tolerância, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se à quantidade de tempo entre a administração da primeira dose da composição ou da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc e o desenvolvimento de tolerância imune no ser humano. A diminuição do tempo para tolerância pode ter benefícios significativos para o ser humano, incluindo, mas não limitados a, rePetição 870190050918, de 30/05/2019, pág. 117/210
75/162 dução da carga financeira total requerida para atingir tolerância. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é cerca de 1 a cerca de 24 semanas, cerca de 1 a cerca de 23 semanas, cerca de 1 a cerca de 22 semanas, cerca de 1 a cerca de 21 semanas, cerca de 2 a cerca de20 semanas, cerca de 2 a cerca de 19 semanas, cerca de 2 a cerca de18 semanas, cerca de 2 a cerca de 17 semanas, cerca de 3 a cerca de16 semanas, cerca de 3 a cerca de 15 semanas, cerca de 3 a cerca de14 semanas, cerca de 3 a cerca de 13 semanas, cerca de 4 a cerca de12 semanas, cerca de 4 a cerca de 11 semanas, cerca de 4 a cerca de10 semanas, cerca de 4 a cerca de 9 semanas, cerca de 5 a cerca de 8 se manas, cerca de 5 a cerca de 7 semanas, cerca de 5 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 12 semanas, cerca de 1 a cerca de 11 semanas, cerca de 1 a cerca de 10 semanas, cerca de 1 a cerca de 9 semanas, cerca de 1 a cerca de 8 semanas, cerca de 1 a cerca de 7 semanas, cerca de 1 a cerca de 6 semanas, cerca de 1 a cerca de 5 semanas, ou cerca de 1 a cerca de 4 semanas. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 70 semanas, menos de cerca de 65 semanas, menos de cerca de 60 semanas, menos de cerca de 58 semanas, menos de cerca de 56 semanas, menos de cerca de 54 semanas, menos de cerca de 52 semanas, menos de cerca de 50 semanas, menos de cerca de 48 semanas, menos de cerca de 46 semanas, menos de cerca de 44 semanas, menos de cerca de 42 semanas, menos de cerca de 40 semanas, menos de cerca de 38 semanas, menos de cerca de 36 semanas, menos de cerca de 34 semanas, menos de cerca de 32 semanas, menos de cerca de 30 semanas, menos de cerca de 28 semanas, menos de cerca de 26 semanas, menos de cerca de 24 semanas, menos de cerca de 23 semanas, menos de cerca de 22 semanas, menos de cerca de 21 semanas, menos de cerca de 20 semanas, menos de cerca de 19 se
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76/162 manas, menos de cerca de 18 semanas, menos de cerca de 17 semanas, menos de cerca de 16 semanas, menos de cerca de 15 semanas, menos de cerca de 14 semanas, menos de cerca de 13 semanas, menos de cerca de 12 semanas, menos de cerca de 11 semanas, menos de cerca de 10 semanas, menos de cerca de 9 semanas, menos de cerca de 8 semanas, menos de cerca de 7 semanas, menos de cerca de 6 semanas, menos de cerca de 5 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de 2 semanas, ou menos de cerca de 1 semana. Em determinadas modalidades, o tempo para tolerância é cerca de 4 a cerca de 12 semanas. Em uma modalidade, o tempo para tolerância é cerca de 4 semanas. Em outra modalidade, o tempo para tolerância é cerca de 12 semanas. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 10 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 9 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 8 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 7 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 6 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 5 meses. Em algumas modalidades, o tempo para tolerância é menos de cerca de 4 meses. Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção resultam em um tempo para tolerância mais curto no ser humano depois de tratamento com uma composição ou com a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc em comparação com o tempo para tolerância depois de tratamento com o fator de coagulação isolado.
[00260] Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,6 UB. Em algumas modalidades,
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77/162 o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,5 UB. Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,4 UB. Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,3 UB. Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,2 UB. Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de menos de cerca de 0,1 UB. Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por um título de um anticorpo inibitório para o fator de coagulação de 0,0 UB. Em determinadas modalidades, o título de anticorpos imunes inibitórios é observado em duas medições consecutivas, por exemplo, em duas semanas consecutivas dentro de um período de quatro semanas.
[00261] Em algumas modalidades, o desenvolvimento de tolerância imune é caracterizado por recuperação incrementai >66% (por exemplo, recuperação incrementai de cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100%). Conforme utilizado aqui, nes
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78/162 te pedido de patente, recuperação incrementai refere-se a níveis de pico de FVIII 15 a 30 minutos depois da infusão.
[00262] Depois do período de indução e do período de redução gradual de dose estarem completos, o indivíduo pode ficar então em tratamento profilático da proteína quimérica. Um regime de dosagem profilática de exemplo pode ser cerca de 50 Ul/kg de uma proteína quimérica a cada quatro dias ou cerca de 25 Ul/kg a cerca de 65 Ul/kg de uma proteína quimérica em intervalos de três a cinco dias. Para crianças com menos de 6 anos de idade, pode ser administrado cerca de 50 Ul/kg de uma proteína quimérica duas vezes por semana ou cerca de 25 Ul/kg a cerca de 65 Ul/kg de uma proteína quimérica em intervalos de três a cinco dias. Vide a bula do ELOCTATE® (N.T.: em inglês, ELOCTATE® Package Insert) disponível em worldwideweb.eloctate.co m/_assets/pdf/ELOCTATE_PI__January2017.pdf.
[00263] Em algumas modalidades, o ser humano tratado usando os métodos da presente invenção está recebendo ou recebeu recentemente uma terapia imunoestimuladora. Por exemplo, inibidores também foram reportados em pacientes com hemofilia A positivos para o HCV submetidos a tratamento com interferon bem como em pacientes com hemofilia A positivos para o HIV tendo uma síndrome inflamatória de reconstituição imune associada com terapia anti-retroviral. Vide o Report of Expert Meeting on FVIII Products and Inhibitor Development, European Medicines Agency (February 28, 2006-March 2, 2006). Portanto, em algumas modalidades, o ser humano está recebendo terapia com interferon. Em algumas modalidades, o ser humano está recebendo terapia antiviral. Em algumas modalidades, o ser humano está recebendo uma terapia antiretroviral e tendo uma síndrome inflamatória de reconstituição imune.
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79/162 [00264] Em determinadas modalidades, o ser humano teve menos de 150 dias de exposição (ED) ao fator de coagulação, por exemplo, FVIII. Em uma modalidade, o ser humano teve menos de 50 dias de exposição. Em outra modalidade, o ser humano teve menos de 20 dias de exposição.
[00265] Alguns aspectos da presente invenção referem-se a métodos de redução da gravidade ou da ocorrência de uma reação alérgica ou anafilática a um fator de coagulação em um indivíduo que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo o fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, a administração da composição ou da proteína quimérica reduz a gravidade de uma reação anafilactóide para o fator de coagulação. Em algumas modalidades, a administração da composição ou da proteína quimérica reduz a gravidade de uma reação alérgica para o fator de coagulação.
Π.Α. Proteínas quiméricas [00266] Os métodos de indução de tolerância imune revelados aqui, neste pedido de patente, são geral mente aplicáveis a composições ou proteínas quiméricas compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o fator de coagulação pode ser qualquer fator de coagulação conhecido, fragmento do mesmo, ou variante do mesmo, e em que a região Fc pode ser qualquer região Fc conhecida, fragmento da mesma, ou variante da mesma. Em algumas modalidades, o fator de coagulação é selecionado entre o grupo consistindo em: fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator X (FX), fator von Willebrand (VWF), ou qualquer combinação dos mesmos. Por conseguinte, as presentes revelações referentes a proteínas quiméricas FVIIIFc, e seus usos, são igualmente aplicáveis a outras proteínas quiméricas compreen
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80/162 dendo uma porção do fator de coagulação e uma porção Fc. Qualquer fator de coagulação ou qualquer fragmento do mesmo ou qualquer variante do mesmo pode ser utilizado nos métodos da presente invenção. De modo similar, qualquer Fc ou qualquer fragmento do mesmo ou qualquer variante do mesmo pode ser utilizado nos métodos da presente invenção. Em alguns exemplos específicos, a porção do fator de coagulação da proteína quimérica é FVIII.
[00267] Em algumas modalidades, o fator de coagulação e o Fc estão presentes em cadeias polipeptídícas separadas. Em algumas modalidades, o fator de coagulação e o Fc não são ligados ou associados um com o outro por uma ligação covalente.
[00268] Em outras modalidades, o fator de coagulação pode ser um mimetizador do fator de coagulação. Mimetizadores do fator de coagulação podem manifestar uma ou mais atividades do fator de coagulação. Por exemplo, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antigeno do mesmo pode agir como FVIII por ligação tanto ao Fator IX quanto ao Fator X. Os referidos anticorpos ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos podem ser utilizados para os presentes métodos se os anticorpos ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos contiverem uma região Fc. Em outra modalidade, o fator de coagulação é um peptídeo que tem uma atividade de FVIII.
[00269] Neste contexto, a presente invenção proporciona em geral um método de indução de tolerância imune em um ser humano compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição ou de uma proteína quimérica compreende uma porção do fator de coagulação e uma porção Fc.
II.A.1. Fator Vill
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81/162 [00270] Fator VIII, abreviado do início ao fim do presente pedido como FVIII, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa polipeptídeo FVIII funcional em seu papel normal na coagulação, a menos que especificado de modo diverso. Deste modo, o termo FVIII inclui variantes de polipeptídeos que são funcionais. Uma proteína FVIII é utilizada de modo intercambiável com polipeptídeo FVIII (ou proteína) ou FVIII. Exemplos das funções de FVIII incluem, mas não estão limitadas a, uma capacidade para ativar a coagulação, uma capacidade para agir como um cofator para o fator IX, ou uma capacidade para formar um complexo de tenase com o fator IX na presença de Ca2+ e fosfolipídeos, o qual em seguida converte o Fator X para a forma ativada Xa. A proteína FVIII pode ser a proteína FVIII humana, porcina, canina, de rato, ou murina. Além disso, comparações entre FVIII de humanos e outras espécies identificaram resíduos conservados que são prováveis de serem necessários para a função (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632). As sequências de polipeptídeos e de polinucleotídeos de comprimento total são conhecidas, assem como muitos fragmentos funcionais, mutantes e versões modificadas. Várias sequências de aminoácidos e de nucleotídeos FVIII são reveladas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US Nos. 2015/0158929 A1, 2014/0308280 A1, e 2014/0370035 A1 e na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2015/106052 A1. Polipeptídeos FVIII incluem, por exemplo, FVIII de comprimento total, FVIII de comprimento total menos Met no terminal amino, FVIII maduro (menos a sequência de sinal), FVIII maduro com uma Met adicional no terminal amino, e/ou FVIII com uma deleção total ou parcial do domínio B. Variantes de FVIII incluem deleções do domínio B, quer deleções parciais ou totais.
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82/162 [00271 ] A porção FVHI no fator de coagulação ou a proteína quimérica utilizada aqui, neste pedido de patente, tem atividade de FVIII. A atividade de FVHI pode ser medida por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Estão disponíveis uma série de testes para avaliar a função do sistema de coagulação: teste do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), ensaio cromogênico, ensaio ROTEM, teste do tempo de protrombina (PT) (também utilizado para determinar INR), teste de fibrinogênio (frequentemente pelo método de Clauss), contagem de plaquetas, teste da função plaquetária (frequentemente por PFA-100), TCT, tempo de sangramento, teste de mistura (se uma anormalidade é corrigida caso o plasma do paciente for misturado com plasma normal), testes de fatores de coagulação, anticorpos antifosfolipídeos, D-dímero, testes genéticos (por exemplo, fator V Leiden, mutação da protrombina G20210A), tempo do veneno da víbora de Russell diluído (dRVVT), diversos testes da função plaquetária, tromboelastografia (TEG ou Sonoclot), tromboelastometria (TEM®, por exemplo, ROTEM®), ou tempo de lise da euglobulina (ELT).
[00272] O teste aPTT é um indicador da performance medindo a eficácia tanto das vias intrínseca (também referidas como a via de ativação por contato) quanto de coagulação comum. Este teste é comumente utilizado para medir a atividade de coagulação dos fatores de coagulação recombinantes disponíveis comercialmente, por exemplo, FVHI. É utilizado em conjunto com tempo da protrombina (PT), o qual mede a via extrínseca.
[00273] A análise ROTEM proporciona informação de toda a cinética de hemostasia: tempo de coagulação, formação de coágulo, estabilidade do coágulo e lise. Os diferentes parâmetros em tromboelastometria são dependentes da atividade do sistema de coagulação plasmática, da fun
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83/162 ção plaquetária, da fibrinólise, ou de muitos fatores os quais influenciam estas interações. Este teste pode proporcionar uma visão completa da hemostasia secundária.
[00274] O mecanismo do ensaio cromogênico se baseia nos princípios da cascata de coagulação sanguínea, onde FVIII ativado acelera a conversão do Fator X em Fator Xa na presença de Fator IX ativado, fosfolipídeos e íons cálcio. A atividade do Fator Xa é avaliada por hidrólise de um substrato de p-nitroanilida (pNA) específico para o Fator Xa. A taxa inicial de liberação de p-nitroanílina medida a 405 nM é díretamente proporcional à atividade do Fator Xa e portanto para a atividade de FVIII na amostra.
® ensaio cromogênico é recomendado peto FVIII e Factor IX Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee (SSC) of the International Society on Thrombosis and Hemostatsis (ISTH). Desde 1994, o ensaio cromogênico também tem sido o método de referência da Farmacopéia Européia para a atribuição de potência de concentrado de FVIII. Deste modo, em uma modalidade, a proteína quimérica compreendendo FVIII tem atividade de FVIII comparável a uma proteína quimérica compreendendo FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®).
[00275] Em outra modalidade, a proteína quimérica compreendendo FVIII desta invenção tem uma taxa de geração de Fator Xa comparável a uma proteína quimérica compreendendo FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®).
[00276] De modo a ativar o Fator X para Fator Xa, o Fator IX ativado (Fator IXa) hidrolisa uma ligação de arginina-isoleucina no Fator X para formar Fator Xa na presença de Ca2+, fosfolipídeos da membrana, e um cofator de FVIII. Portanto, a interação de FVIII com Fator IX é crucial na
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84/162 via de coagulação. Em determinadas modalidades, a proteína quimérica compreendendo FVIII pode interagir com o Fator IXa em uma taxa comparável a uma proteína quimérica compreendendo sequência de FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®).
[00277] Além disso, FVIII é ligado ao Fator de von Willebrand enquanto inativo em circulação. FVIII se degrada rapidamente quando não ligado ao VWF e é liberado do VWF pela ação da trombina. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo FVIII se liga ao Fator de von Willebrand em um nível comparável a uma proteína quimérica compreendendo sequência de FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®).
[00278] FVIII pode ser inativado por proteína C ativada na presença de cálcio e fosfolipídeos. A proteína C ativada diva a cadeia pesada de FVIII depois da Arginina 336 no domínio A1, o que provoca a disrupção de um sítio de interação de substrato do Fator X, e cliva depois da Arginina 562 no domínio A2, o que reforça a dissociação do domínio A2 bem como provoca a disrupção de um sítio de interação com o Fator IXa. Esta divagem também bifurca o domínio A2 (43 kDa) e gera os domínios A2-N (18 kDa) e A2-C (25 kDa). Deste modo, a proteína C ativada pode catalisar múltiplos sítios de divagem na cadeia pesada. Em uma modalidade, a proteína quimérica compreendendo FVIII é ínativada por Proteína C ativada em um nível comparável a uma proteína quimérica compreendendo sequência de FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®).
[00279] Em outras modalidades, a proteína quimérica compreendendo FVIII tem atividade de FVIII in vivo comparável a uma proteína quimérica compreendendo sequência de FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exem
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85/162 pio, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®). Em uma modalidade particular, a proteína quimérica compreendendo FVIII é capaz de protege um camundongo HemA em um nível comparável a uma proteína quimérica compreendendo sequência de FVIII maduro ou um BDD FVIII (por exemplo, ADVATE®, REFACTO®, ou ELOCTATE®) em um modelo de transecção da veia da cauda de camundongo HemA.
[00280] Um domínio B de FVIII, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, é o mesmo que o domínio B conhecido na técnica que é definido por identidade de sequência de aminoácidos interna e sítios de divagem proteolítica por trombina, por exemplo, ao resíduos Ser741 a Arg1648 de FVIII humano maduro. Os outros domínios de FVIII humano são definidos pelos seguintes resíduos de aminoácidos, em relação do FVIII humano maduro: A1, resíduos Alai a Arg372; A2, resíduos Ser373 a Arg740; A3, resíduos Ser1690 a lle2032; C1, resíduos Arg2033 a Asn2172; C2, resíduos Ser2173 a Tyr2332 de FVIII maduro. Os números de resíduos de sequência utilizados aqui, neste pedido de patente, sem referência a quaisquer Números de SEQ ID correspondem à sequência de FVIII sem a sequência de peptídeos de sinal (19 aminoácidos) a menos que indicado de modo diverso. A sequência A3-C1-C2, também conhecida como a cadeia pesada de FVIII, inclui os resíduos Ser1690 a Tyr2332. A sequência remanescente, resíduos Glu1649 a Arg1689, geralmente é referida como o peptídeo de ativação de cadeia leve de FVIII. As localizações dos limites para todos os domínios, incluindo os domínios B, para FVIII porcino, de camundongo e canino também são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o domínio B de FVIII é deletado (FVIII deletado o domínio B ou BDD FVIII). Um exemplo de um BDD FVIII é REFACTO® (BDD FVIII recombinante). Em uma modalidade particular o
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FVIM com o domínio B deletado variante compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro.
[00281] Um FVIII deletado o domínio B pode ter as deleções totais ou parciais reveladas nas Patentes U.S. Nos. 6.316.226, 6.346.513, 7.04.,635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.22.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112, e 6.458.563 e Publicação do Pedido de Patente Internacional. No. WO 2015106052 A1 (PCT/US2015/010738). Em algumas modalidades, uma sequência de FVIII deletado o domínio B utilizada nos métodos da presente invenção compreende qualquer uma das deleções reveladas na col. 4, linha 4 à col. 5, linha 28 e nos Exemplos 1 a 5 da Patente U.S. No. 6.316.226 (também na Patente U.S. 6.346.513). Em outra modalidade, um Fator VIII deletado o domínio B é o Fator VIII deletado o domínio B S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (por exemplo, Fator VIII tendo uma deleção do aminoácido 744 ao aminoácido 1637, por exemplo, Fator VIII tendo os aminoácidos 1 a 743 e os aminoácidos 1638 a 2332 de FVIII maduro). Em algumas modalidades, um FVIII deletado o domínio B utilizado nos métodos da presente invenção tem uma deleção revelada na col. 2, linhas 26 a 51 e exemplos 5 a 8 da Patente U.S. No. 5.789.203 (também Patentes US 6.060.447, US 5.595.886, e US 6.228.620). Em algumas modalidades, um Fator VIII deletado o domínio B tem uma deleção descrita na col. 1, linhas 25 à col. 2, linha 40 da Patente US No. 5.972.885; col. 6, linhas 1 a 22 e exemplo 1 da Patente U.S. no. 6.048.720; col. 2, linhas 17 a 46 da Patente U.S. No. 5.543.502; col. 4, linha 22 à col. 5, linha 36 da Patente U.S. no. 5.171.844; col. 2, linhas 55 a 68, figura 2, e exemplo 1 da Patente U.S. No. 5.112.950; col. 2, linha 2 à col. 19, linha 21 e tabela 2 da Patente U.S. No. 4.868.112; col. 2, linha 1 à col. 3, linha 19, col. 3, linha 40 à col. 4, linha 67, col. 7, linha 43 à col. 8, linha 26, e
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87/162 col. 11, linha 5 à col. 13, linha 39 da Patente U.S. no. 7.041.635; ou col. 4, linhas 25 a 53, da Patente U.S. No. 6.458.563. Em algumas modalidades, um FVIII deletado o domínio B tem uma deleção da maior parte do domínio B, mas ainda contém sequências de amino-terminal do domínio B que são essenciais para processamento proteolitico in vivo do produto de translação primária em duas cadeias polipeptídicas, conforme revelado em WO 91/09122. Em algumas modalidades, um FVIII deletado o domínio B é construído com uma deleção dos aminoácidos 747 a 1638, isto é, virtualmente uma deleção completa do domínio B. Hoeben R.C., et ai. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Um Fator VIII deletado o domínio B também pode conter uma deleção dos aminoácidos 771 a 1666 ou dos aminoácidos 868 a 1562 de FVIII. Meulien P., et a/. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Deleções do domínio B adicionais que são parte da invenção incluem: deleção dos aminoácidos 982 a 1562 ou 760 a 1639 (Toole et aí, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et ai. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (pedido de patente internacional publicado PCT No. WO 87/04187)), 747 a 1560 (Sarver, et aí, DNA (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (PCT pedido No.88/00831)), ou 816 a 1598 ou 741 a 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, patente EP No. 295597)). Em uma modalidade particular, o FVIII deletado o domínio B compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro. Em outra modalidade, o FVIII deletado o domínio B compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 745 a 1648 de FVIII maduro.
[00282] Em outras modalidades, BDD FVIII inclui um polipeptídeo FVIII contendo fragmentos do domínio B que conservam um ou mais sítios de glicosilação N-ligados, por exemplo, resíduos 757, 784, 828, 900, 963, ou opcionalmente 943, os quais correspondem à sequência de aminoácidos
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88/162 da sequência de FVIII de comprimento total. Exemplos dos fragmentos do domínio B incluem 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B conforme revelado em Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et at., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), e Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (isto é, os primeiros 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B são conservados). Em ainda outras modalidades, BDD FVIII adicionalmente compreende uma mutação pontual no resíduo 309 (de Phe a Ser) para melhorar a expressão da proteína BDD FVIII. Vide Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). Em ainda outras modalidades, o BDD FVIII inclui um polipeptídeo FVIII contendo uma porção do domínio B, mas não contendo um ou mais sítios de clivagem de furina (por exemplo, Arg1313 e Arg 1648). Vide Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Em algumas modalidades, o BDD FVIII compreende FVIII de cadeia única que contém uma deleção nos aminoácidos 765 a 1652 correspondente ao FVIII de comprimento total maduro (também conhecido como rVIIISingle Chain e AFSTYLA®). Vide a Patente US No. 7.041.635. Cada uma das deleções precedentes pode ser feita em qualquer sequência de FVIII. [00283] É conhecido um grande número de variantes de FVIII funcionais, conforme é discutido acima e abaixo. Além disso, centenas de mutações não funcionais em FVIII foram identificadas em pacientes com hemofilia, e foi determinado que o efeito destas mutações sobre a função de FVIII é devido mais a onde se situam dentro da estrutura tridimensional de FVIII do que da natureza da substituição (Cutler et at, Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)), incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. Além disso, comparações entre FVIII de humanos e outras espécies identificaram resíduos conservados que são prováveis de serem requeridos para função (Cameron et al., Thromb. Ha
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89/162 emost. 79:317-22 (1998); Patente US 6.251.632), incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade.
[00284] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é equivalente a uma quantidade eficaz do FVIII sem a região Fc. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 20 Ul/Kg a cerca de 400 Ul/kg. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 20 Ul/Kg a cerca de 300 Ul/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 50 Ul/Kg a cerca de 300 Ul/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 200 Ul/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é cerca de 100 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 200 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 140 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 130 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 120 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 110 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg. Em outras modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200
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Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, ou de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg.
[00285] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é cerca de 50 Ul/kg, cerca de 60 Ul/kg, cerca de 70 Ul/kg, cerca de 80 Ul/kg, cerca de 90 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg, cerca de 105 Ul/kg, cerca de 110 Ul/kg, cerca de 115 Ul/kg, cerca de 120 Ul/kg, cerca de 125 Ul/kg, cerca de 130 Ul/kg, cerca de 135 Ul/kg, cerca de 140 Ul/kg, cerca de 145 Ul/kg, cerca de 150 Ul/kg, cerca de 155 Ul/kg, cerca de 160 Ul/kg, cerca de 165 Ul/kg, cerca de 170 Ul/kg, cerca de 175 Ul/kg, cerca de 180 Ul/kg, cerca de 185 Ul/kg, cerca de 190 Ul/kg, cerca de 195 Ul/kg, cerca de 200 Ul/kg, cerca de 225 Ul/kg, cerca de 250 Ul/kg, cerca de 275 Ul/kg, ou cerca de 300 Ul/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é cerca de 150 Ul/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 200 Ul/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 250 Ul/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 50 Ul/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 100 Ul/kg.
[00286] O intervalo de dosagem ao administrar a proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc ou um fragmento da mesma pode ser no mínimo cerca de uma vez e meia mais longo do que o intervalo de dosagem requerido para uma dose equivalente do fator de coagulação sem o domínio Fc. O intervalo de dosagem pode ser no mínimo cerca de uma vez e mela a seis vezes mais longo, uma vez e mela a cinco vezes mais longo, uma vez e meia a quatro vezes mais longo, uma vez e meia a três vezes mais longo, ou uma vez e meia a duas vezes mais longo, do
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91/162 que o intervalo de dosagem requerido para uma dose equivalente do FVIII sem o domínio Fc.
[00287] Em algumas modalidades, a dose eficaz da proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de cerca de um dia, cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias, cerca de seis dias, cerca de sete dias, cerca de oito dias, cerca de nove dias, cerca de dez dias, cerca de 11 dias, cerca de 12 dias, cerca de 13 dias, cerca de 14 dias, cerca de 15 dias, cerca de 16 dias, cerca de 17 dias, cerca de 18 dias, cerca de 19 dias, cerca de 20 dias, cerca de 21 dias, cerca de 22 dias, cerca de 23 dias, ou cerca de 24 dias. Em algumas modalidades, a dose eficaz da proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de cerca de 25 dias, cerca de 26 dias, cerca de 27 dias, cerca de 28 dias, cerca de 29 dias, cerca de 30 dias, cerca de 45 dias, ou cerca de 60 dias.
[00288] Em algumas modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 1 a cerca de 14 dias, cerca de 1 a cerca de 13 dias, cerca de 1 a cerca de 12 dias, cerca de 1 a cerca de 11 dias, cerca de 1 a cerca de 10 dias, cerca de 1 a cerca de 9 dias, cerca de 1 a cerca de 8 dias, cerca de 1 a cerca de 7 dias, cerca de 1 a cerca de 6 dias, cerca de 1 a cerca de 5 dias, cerca de 1 a cerca de 4 dias, cerca de 1 a cerca de 3 dias, cerca de 1 a cerca de 2 dias, cerca de 2 a cerca de 14 dias, cerca de 3 a cerca de 14 dias, cerca de 4 a cerca de 14 dias, cerca de 5 a cerca de 14 dias, cerca de 6 a cerca de 14 dias, cerca de 7 a cerca de 14 dias, cerca de 8 a cerca de 14 dias, cerca de 9 a cerca de 14 dias, cerca de 10 a cerca de 14 dias, cerca de 11 a cerca de 14 dias, cerca de 12 a cerca de 14 dias, cerca de 13 a cerca de 14 dias, ou cerca de 5 a
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92/162 cerca de 10 dias. Em outras modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 1 a cerca de 21 dias, cerca de 1 a cerca de 20 dias, cerca de 1 a cerca de 19 dias, cerca de 1 a cerca de 18 dias, cerca de 1 a cerca de 17 dias, cerca de 1 a cerca de 16 dias, cerca de 1 a cerca de 15 dias, cerca de 1 a cerca de 14 dias, cerca de 1 a cerca de 13 dias, cerca de 1 a cerca de 12 dias, cerca de 1 a cerca de 11 dias, cerca de 1 a cerca de 10 dias, cerca de 1 a cerca de 9 dias, cerca de 1 a cerca de 8 dias, cerca de 1 a cerca de 7 dias, cerca de 1 a cerca de 6 dias, cerca de 1 a cerca de 5 dias, cerca de 1 a cerca de 4 dias, cerca de 1 a cerca de 3 dias, cerca de 1 a cerca de 2 dias, cerca de 2 a cerca de 21 dias, cerca de 3 a cerca de 21 dias, cerca de 4 a cerca de 21 dias, cerca de 5 a cerca de 21 dias, cerca de 6 a cerca de 21 dias, cerca de 7 a cerca de 21 dias, cerca de 8 a cerca de 21 dias, cerca de 9 a cerca de 21 dias, cerca de 10 a cerca de 21 dias, cerca de 11 a cerca de 21 dias, cerca de 12 a cerca de 21 dias, cerca de 13 a cerca de 21 dias, cerca de 14 a cerca de 21 dias, cerca de 15 a cerca de 21 dias, cerca de 16 a cerca de 21 dias, cerca de 17 a cerca de 21 dias, cerca de 18 a cerca de 21 dias, cerca de 19 a cerca de 21 dias, cerca de 20 a cerca de 21 dias, cerca de 5 a cerca de 10 dias, cerca de 10 a cerca de 15 dias, cerca de 15 a cerca de 20 dias. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 2 a cerca de 6 dias. Em outra modalidade, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de cerca de 3 a cerca de 5 dias.
[00289] Em uma modalidade, a dose eficaz é 25 a 65 Ul/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
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46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 62, 64, ou 65 Ul/kg) e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 3 a 5, 3 a 6, 3 a 7, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 ou mais dias, ou três vezes por semana, ou não mais de três vezes por semana. Em outra modalidade, a dose eficaz é 65 Ul/kg e o intervalo de dosagem é uma vez por semana, ou uma vez a cada 6 a 7 dias. As doses podem ser administradas repetidamente na medida que forem necessárias (por exemplo, no mínimo 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52, ou 57 semanas, no mínimo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 anos). Em uma modalidade particular, a dose eficaz é cerca de 25 a 65 Ul/kg e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 3 a 5 dias.
[00290] Em uma modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 200 Ul/kg e a quantidade eficaz é administrada diariamente. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é cerca de 50 Ul/kg, e a quantidade eficaz é administrada cerca de três vezes por semana.
[00291] Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz ou a dose eficaz é administrada como uma dose única. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz ou a dose eficaz é administrada em duas ou mais doses ao longo do dia.
[00292] Em algumas modalidades, a composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em uma dose de cerca de 200 Ul/kg uma vez ao dia até ser observada tolerização. Em algumas modalidades, o período de tolerização se estende por cerca de 4 semanas a cerca de 36 meses. Em algumas modalidades, o período de tolerização se estende por cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses,
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94/162 cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 12 meses, cerca de 13 meses, cerca de 14 meses, cerca de 15 meses, cerca de 16 meses, cerca de 17 meses, cerca de 18 meses, cerca de 19 meses, cerca de 20 meses, cerca de 21 meses, cerca de 22 meses, cerca de 23 meses, cerca de 24 meses, cerca de 25 meses, cerca de 26 meses, cerca de 27 meses, cerca de 28 meses, cerca de 29 meses, cerca de 30 meses, cerca de 31 meses, cerca de 32 meses, cerca de 33 meses, cerca de 34 meses, cerca de 35 meses, ou cerca de 36 meses.
[00293] Em determinadas modalidades, assim que é atingida tolerância imune, o ser humano vai ser submetido a um período de redução gradual de dose. Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, os termos período de redução gradual de dose e regime de redução gradual de dose são utilizados de modo intercambiável para se referir a um regime de dosagem em que uma ou mais doses de redução gradual de dose são administradas. Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 20 Ul/Kg a cerca de 400 Ul/kg. Em determinadas modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 20 Ul/Kg a cerca de 300 Ul/kg. Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 50 Ul/Kg a cerca de 300 Ul/kg. Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 50 Ul/Kg a cerca de 100 Ul/kg. Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 200 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 250
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Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, cerca de 100 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, de cerca de 100 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 150 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 140 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 130 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 120 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 110 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg. Em uma modalidade particular, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg. Em outra modalidade, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 290 Ul/kg. Em outras modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração de a partir de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 280 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 270 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 260 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 250 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 240 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 230 Ul/kg, de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 220 Ul/kg, ou de cerca de 200 Ul/kg a cerca de 210 Ul/kg. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em uma modalidade particular, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 50 Ul/kg da composição ou, a proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 150 Ul/kg da composição
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96/162 ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 125 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade particular, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 100 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 90 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 80 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 75 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 70 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 60 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 40 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 30 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 25 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradu
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97/162 al de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 20 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica. Em outra modalidade, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 10 Ul/kg da composição ou da proteína quimérica.
[00294] Em algumas modalidades, o periodo de redução graduai de dose compreende administração da composição ou da proteina quimérica todo dia. Em outras modalidades, o período de redução gradual de dose compreende administração da composição ou da proteína quimérica cerca de uma vez a cada dois dias, cerca de uma vez a cada três dias, cerca de uma vez a cada quatro dias, cerca de uma vez a cada cinco dias, cerca de uma vez a cada seis dias, cerca de uma vez a cada sete dias, cerca de uma vez a cada oito dias, cerca de uma vez a cada nove dias, cerca de uma vez a cada dez dias, cerca de uma vez a cada onze dias, cerca de uma vez a cada doze dias, cerca de uma vez a cada treze dias, ou cerca de uma vez a cada quatorze dias.
[00295] Em determinadas modalidades, a dose de redução gradual de dose é administrada uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, ou três vezes por semana. Em algumas modalidades, a dose de redução gradual de dose é administrada por no mínimo cerca de 1 semana, no mínimo cerca de 2 semanas, no mínimo cerca de 3 semanas, no mínimo cerca de 4 semanas, no mínimo cerca de 5 semanas, no mínimo cerca de 6 semanas, no mínimo cerca de 7 semanas, no mínimo cerca de 8 semanas, no mínimo cerca de 9 semanas, no mínimo cerca de 10 semanas, no mínimo cerca de 11 semanas, no mínimo cerca de 12 semanas, no mínimo cerca de 13 semanas, no mínimo cerca de 14 semanas, no mínimo cerca de 15 semanas, no mínimo cerca de 16 semanas, no mínimo cerca de 17 semanas, no mínimo cerca de 18 semanas, no mínimo cerca de 19 sema
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98/162 nas, no mínimo cerca de 20 semanas, no mínimo cerca de 21 semanas, no mínimo cerca de 22 semanas, no mínimo cerca de 23 semanas, no mínimo cerca de 24 semanas, no mínimo cerca de 25 semanas, no mínimo cerca de 26 semanas, no mínimo cerca de 27 semanas, no mínimo cerca de 28 semanas, no mínimo cerca de 29 semanas, no mínimo cerca de 30 semanas, no mínimo cerca de 31 semanas, ou no mínimo cerca de 32 semanas. Em uma modalidade particular, a dose de redução gradual de dose é administrada por cerca de 16 semanas ou menos.
[00296] Em determinadas modalidades, a dose da composição ou da proteína quimérica é gradualmente reduzida durante o período de redução gradual de dose e o intervalo de dosagem permanece o mesmo. Em outras modalidades, o intervalo de dosagem é aumentado durante o período de redução gradual de dose e a dose da composição ou da proteína quimérica permanece o mesmo. Em algumas modalidades, a dose da composição ou da proteína quimérica é gradualmente reduzida durante o período de redução gradual de dose e o intervalo de dosagem é gradualmente aumentada.
[00297] Em uma modalidade particular, o período de redução gradual de dose compreende administração de cerca de 200 Ul/kg do fator de coagulação quiméríco a cada dois dias, seguida por redução adicional na dosagem e no Intervalo de dosagem. Em outras modalidades, as doses da proteína quimérica requeridas para um dia podem ser divididas em até duas doses, três doses, ou mais. Por exemplo, cerca de 200 Ul/kg da proteína quimérica podem ser divididas até cerca de 100 Ul/kg duas vezes ao dia, cerca de 70 Ul/kg três vezes ao dia, ou cerca de 50 Ul/kg quatro vezes ao dia.
[00298] Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose se estende a partir de cerca de 1 mês a cerca de 6 meses. Em de
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99/162 terminadas modalidades, o período de redução gradual de dose se estende por cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, ou cerca de 6 meses. Em uma modalidade particular, o período de redução gradual de dose se estende por cerca de 4 meses.
[00299] Em determinadas modalidades, o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 100 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune. Em determinadas modalidades, o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 6 até a semana 12 depois de tolerância imune. Em determinadas modalidades, o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 12 até a semana 16.
[00300] Em algumas modalidades, o período de redução gradual de dose é seguido por um período de seguimento. Em algumas modalidades, o período de seguimento compreende tratamento profilático com composição ou a proteína quimérica. Em algumas modalidades, o período de seguimento compreende tratamento profilático com o fator de coagulação. O fator de coagulação utilizado no período de seguimento pode ser selecionado entre o fator de coagulação utilizado nos períodos de toterização e de redução gradual de dose, com ou sem a região Fc, e quaisquer variantes da mesma. O fator de coagulação pode incluir, mas não é limitado a, um fator de coagulação nativo, qualquer variante descrita aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, variantes de FVIII com o
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100/162 domínio B deletado), e qualquer fator de coagulação quimérico descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, FVIII-Fc, FVIII-albumina, etc.). Em determinadas modalidades, o tratamento profilático compreende a administração da dose profilática aprovada de, por exemplo, FVIIIFc recombinante. Em algumas modalidades, o tratamento profilático compreende 25 a 65 Ul/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, ou 65 Ul/kg) e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 3 a 5, 3 a 6, 3 a 7, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 ou mais dias, ou três vezes por semana, ou não mais de três vezes por semana. Em outra modalidade, o tratamento profilático compreende 65 Ul/kg e o intervalo de dosagem é uma vez por semana, ou uma vez a cada 6 a 7 dias. Em outra modalidade, o tratamento profilático compreende a administração de uma dose do fator de coagulação de 50 Ul/kg. Em outra modalidade, o tratamento profilático compreende a administração de uma dose do fator de coagulação de 50 Ul/kg e o intervalo de dosagem é cerca de três vezes por semana. Em uma modalidade particular, o tratamento profilático compreende cerca de 25 a 65 Ul/kg e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 3 a 5 dias. Em determinadas modalidades, o período de seguimento se estende por cerca de 8 meses.
[00301] Em uma modalidade particular, a proteína quimérica, por exemplo, FVIIIFc, é administrada em cerca de 200 Ul/kg/dia até ser observada tolerância imune, por exemplo, quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB; em seguida, depois de tolerância imune, é administrado um regime de redução gradual de dose, em que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica, por exemplo, FVIIIFc, de cerca de 100 Ul/kg uma vez ao dia da
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101/162 semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune, administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica, por exemplo, FVIIIFc, de cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 6 até a semana 12 depois de tolerância imune, e administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica, por exemplo, FVIIIFc, de cerca de 50 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 12 até a semana 16; e em seguida, depois do regime de redução gradual de dose, uma dose profilática do fator de coagulaçâo de cerca de 50 Ul/kg é administrada cerca de três vezes por semana.
[00302] A composição ou a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc, pode ser formulada para uma maneira de administração apropriada, incluindo, por exemplo, administração tópica (por exemplo, transdérmica ou ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, retal ou parenteral.
[00303] O termo parenteral conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracraniana, intratecal, intraocular, periocular, infraorbital, intra-sinovial e intraperitoneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão similar. A composição também pode ser, por exemplo, uma suspensão, uma emulsão, uma formulação de liberação gradual, um creme, um gel ou um pó. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais tais como triglicerídeos.
[00304] Em um exemplo, a formulação farmacêutica é uma formulação líquida, por exemplo, uma solução aquosa, tamponada, isotônica. Em outro exemplo, a composição farmacêutica tem um pH que é fisiológico, ou próximo ao fisiológico. Em outros exemplos, a formulação aquosa tem
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102/162 uma osmolaridade e uma salinidade fisiológicas ou próximas às fisiológicas. Pode conter cloreto de sódio e/ou acetato de sódio.
[00305] Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc utilizada nos métodos da presente invenção é formulada em uma composição farmacêutica compreendendo:
(a) a proteína quimérica; (b) um ou mais agentes estabilizantes selecionados entre sacarose, trealose, rafinose, arginina, ou mistura dos mesmos; (c) cloreto de sódio (NaCI); (d) L-histidina; (e) cloreto de cálcio; e (f) polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende: (a) 50 Ul/ml a 2500 Ul/ml da proteína quimérica; (b) 10 mg/ml a 25 mg/ml de sacarose; (c) 8,8 mg/ml a 14,6 mg/ml de cloreto de sódio (NaCI); (d) 0,75 mg/ml a 2,25 mg/ml de Lhistidina; (e) 0,75 mg/ml a 1,5 mg/ml de di-hidrato de cloreto de cálcio; e (f) 0,08 mg/mi a 0,25 mg/ml de polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica utilizada nos métodos da presente invenção é liofilizada.
[00306] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não compreende uma célula imune. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não compreende uma célula.
[00307] Em determinadas modalidades, o ser humano tratado usando os métodos da presente invenção desenvolveu previamente uma resposta imune inibitória de FVIII. Em algumas modalidades, a resposta inibitória de FVIII previamente desenvolvida, se desenvolveu em resposta a um FVIII recombinante. Em algumas modalidades, a resposta inibitória de FVIII previamente desenvolvida, se desenvolveu em resposta a um produto de FVIII selecionado entre o grupo consistindo em: ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA/REFACTO
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AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI®, AFSTYLA®, e HYATE:C®.
[00308] Em algumas modalidades, assim que é atingida tolerização de acordo com títulos de anticorpos inibitórios diminuídos, o nível sérico do fator de coagulação é mantido a partir de cerca de 100 UI/dL a cerca de 200 UI/dL. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida antes do início do regime de redução gradual de dose de modo a manter um nível sérico do fator de coagulação a partir de cerca de 100 UI/dL a cerca de 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 175 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz de composição ou a proteína quimérica é reduzida a cerca de 150 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 125 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 100 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 75 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composição ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 50 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL. Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz da composi
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104/162 ção ou da proteína quimérica é reduzida a cerca de 25 Ul/kg/dia se o nível sérico do fator de coagulação for maior do que ou igual a 200 UI/dL.
[00309] Determinados aspectos da presente invenção referem-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 200 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada a cada dois dias. Em outras modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
[00310] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 202 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
[00311] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 150 Ul/kg de uma composição ou a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
[00312] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 130 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
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105/162 [00313] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 115 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada a cada dois dias.
[00314] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 100 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente. Em outras modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada três vezes por semana.
[00315] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 102 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada a cada dois dias.
[00316] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 96 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
[00317] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, com
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106/162 preendendo a administração ao ser humano de cerca de 85 UI/ kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada diariamente.
[00318] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos de Indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo a administração ao ser humano de cerca de 50 UI/ kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em determinadas modalidades, a composição ou a proteína quimérica é administrada três vezes por semana.
[00319] Determinados aspectos da presente invenção referem-se a métodos de indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, compreendendo (1) administração ao ser humano de cerca de 200 Ul/kg de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a composição ou a proteína quimérica induz tolerância imune no ser humano; e (2) depois da indução de tolerância imune, administração ao ser humano de um regime de redução gradual de dose da composição ou da proteína quimérica.
II.A.2 Fc [00320] Em algumas modalidades, as composições, proteínas quimérlcas, e/ou os fatores de coagulação da invenção incluem um domínio Fc ou uma porção do mesmo que se liga a um receptor Fc (FcR; por exemplo, FcRn). Em algumas modalidades, o domínio Fc é fundido ao fator de coagulação, por exemplo, como parte de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em outras modalidades, o domínio Fc é fundido a um polipeptídeo diferente do fator de coagulação, em que a composição compreende (1) um fator de coagulação e (2) uma proteína quimérica compreendendo um domínio Fc e um poli
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107/162 peptídeo adicional· O domínio Fc ou uma porção do mesmo pode aprimorar as propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas da proteína quimérica. Em determinadas modalidades, o domínio Fc ou uma porção da mesma prolonga uma meia-vida de uma molécula fundida ao domínio Fc ou a uma porção do mesmo.
[00321] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo domínio Fc ou região Fc conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa parceiros de ligação ao FcR funcional (por exemplo, FcRn), a menos que especificado de modo diverso. O domínio Fc é a porção de um polipeptídeo que corresponde ao domínio Fc de Ig nativa, isto é, conforme formado pela associação dimérica dos domínios Fc respectivos de suas duas cadeias pesadas. Um domínio Fc nativo forma um homodímero com outro domínio Fc. Em contraste, o termo região Fc geneticamente fundida ou região Fc de cadeia única (região scFc), conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, refere-se a uma região Fc dimérica sintética compreendendo os domínios Fc geneticamente ligados dentro de uma única cadeia polipeptídica (isto é, codificada em uma única sequência genética contígua).
[00322] Em uma modalidade, a região Fc refere-se à porção de uma única cadeia pesada de Ig iniciando na região de articulação logo a montante do sítio de clivagem de papaína (isto é, resíduo 216 em IgG, tomando o primeiro resíduo da região constante de cadeia pesada como sendo 114) e terminando no término carbóxi do anticorpo. Por conseguinte, um domínio Fc completo compreende no mínimo um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3.
[00323] A região Fc de uma região constante de Ig, dependendo do isotipo de Ig pode incluir os domínios CH2, CH3, e CH4, bem como a região de articulação. Proteínas quiméricas compreendendo uma região Fc
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108/162 de uma lg transmitem várias propriedades desejáveis a uma proteína quimérica incluindo aumento da estabilidade, aumento da meia-vida sérica (vide Capon et al., 1989, Nature 337:525) bem como ligação a receptores Fc tais como o receptor Fc neonatal (FcRn) (Patente U.S. Nos. 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), as quais são incorporadas aqui, a este pedido de patente, por melo de referência em suas totalidades.
[00324] O receptor FcRn foi isolado a partir de várias espécies de mamíferos incluindo seres humanos. As sequências do FcRn humano, FcRn de macaco, FcRn de rato, e FcRn de camundongo são conhecidas (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). O receptor FcRn liga IgG (mas não outras classes de Ig tais como IgA, IgM, IgD, e IgE) em pH relativamente baixo, transporta ativamente a IgG de modo transcelular em uma direção luminal a serosal, e em seguida libera a IgG em pH relatlvamente maior encontrado nos fluidos intersticiais. É expresso em tecido epitelial do adulto (Patente U.S. Nos. 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; Patente WO 03/077834; Pedido de Patente US No. 2003-0235536A1) incluindo o epitélio pulmonar e intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) o epitélio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) bem como o epitélio nasal, as superfícies vaglnais, e as superfícies da árvore biliar.
[00325] Regiões Fc úteis na presente invenção englobam moléculas que podem se ligar especificamente a um FcR, incluindo IgG inteira, o fragmento Fc de IgG, e outros fragmentos que incluem a região de ligação completa de um FcR. A região da porção Fc de IgG que se liga a, por exemplo, o receptor FcRn foi descrita com base em cristalografia de raios- X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). A principal área de contato do Fc com o FcRn é próxima à junção dos domínios CH2 e CH3. Os
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109/162 contatos de Fc-FcRn estão todos dentro de uma única cadeia pesada de Ig. As regiões Fc incluem toda a IgG, o fragmento Fc de IgG, e outros fragmentos de IgG que incluem a região de ligação completa de FcRn. Os principais sítios de contato incluem os resíduos de aminoácidos 248, 250 a 257, 272, 285, 288, 290 a 291,308 a 311, e 314 do domínio CH2 e os resíduos de aminoácidos 385 a 387, 428, e 433 a 436 do domínio CH3. Referências feitas a numeração de aminoácidos de Igs ou fragmentos de Igs, ou regiões, são todas baseadas em Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.
[00326] Especificamente ligadas refere-se a duas moléculas formando um complexo que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica é caracterizada por uma alta afinidade e uma capacidade baixa a moderada distinguindo-se de ligação inespecífica a qual geralmente tem uma baixa afinidade com uma capacidade moderada a alta. Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a constante de afinidade KA é maior do que 106 M'1, ou maior do que 108 M'1. Caso necessário, ligação inespecífica pode ser reduzida sem afetar substancialmente ligação específica variando as condições de ligação. As condições de ligação apropriadas, tais como concentração das moléculas, força iônica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, concentração de um agente de bloqueio, por exemplo, albumina sérica, caseína do leite), etc., podem ser otimizadas por um versado usando técnicas de rotina.
[00327] Em determinadas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende uma ou mais regiões Fc truncadas que não obstante são suficientes para conferir propriedades de ligação a FcR para a região Fc. Por exemplo, a porção de uma região Fc que se liga a FcRn
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110/162 (isto é, a porção de ligação de FcRn) compreende cerca dos aminoácidos 282 a 438 de lgG1, numeração da União Européia (com os sítios de contato primário sendo os aminoácidos 248, 250 a 257, 272, 285, 288, 290 a 291,308 a 311, e 314 do domínio CH2 e os resíduos de aminoácidos 385 a 387, 428, e 433 a 436 do domínio CH3. Deste modo, uma região Fc da invenção pode compreender ou consistir em uma porção de ligação de FcRn.
[00328] Porções de ligação de FcR podem ser derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo, incluindo IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4. Em uma modalidade, é utilizada uma porção de ligação de FcR de um anticorpo do isotipo humano lgG1. Em outra modalidade, é utilizada uma porção de ligação de FcR de um anticorpo do isotipo humano lgG4.
[00329] Em outra modalidade, a região Fc inclui uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc ou derivada de um domínio Fc. Em determinadas modalidades, uma região Fc compreende no mínimo um entre: um domínio de articulação (por exemplo, região de articulação superior, média, e/ou inferior) (cerca dos aminoácidos 216 a 230 de uma região Fc de anticorpo de acordo com a numeração da União Européia), um domínio CH2 (cerca dos aminoácidos 231 a 340 de uma região Fc de anticorpo de acordo com a numeração da União Européia), um domínio CH3 (cerca dos aminoácidos 341 a 438 de uma região Fc de anticorpo de acordo com a numeração da União Européia), um domínio CH4, ou uma variante, porção, ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades, uma região Fc compreende um domínio Fc completo (isto é, um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3). Em algumas modalidades, uma região Fc compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um domínio de articulação (ou uma porção da mesma) fundido a um domínio CH3 (ou a uma porção do mesmo), um domínio de articu
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111/162 lação (ou a uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH2 (ou a uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou a uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou a uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou a uma porção do mesmo) fundido tanto a um domínio de articulação (ou a uma porção do mesmo) quanto a um domínio CH3 (ou a uma porção do mesmo). Em ainda outras modalidades, uma região Fc carece de no mínimo uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em uma modalidade particular, uma região Fc compreende ou consiste em aminoácidos correspondentes aos números 221 a 447 da União Européia.
[00330] As regiões Fc denotadas como F, F1, ou F2 aqui, neste pedido de patente, podem ser obtidas a partir de uma série de fontes diferentes. Em uma modalidade, uma região Fc do polipeptideo é derivada a partir de uma Ig humana. No entanto, deve ser entendido que uma região Fc pode ser derivada a partir de uma Ig de outras espécies de mamíferos, incluindo por exemplo, um roedor por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, ou um porquinho da índia) ou uma espécie de primata não humano, por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, o polipeptideo dos domínios Fc ou porções dos mesmos podem ser derivados a partir de qualquer classe de Ig, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo de Ig, incluindo IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4. Em outra modalidade, é utilizado o isotipo humano IgG 1.
[00331] Em determinadas modalidades, a variante de Fc confere uma modificação em no mínimo uma função efetora conferida por uma região Fc compreendendo o domínio Fc selvagem (por exemplo, uma melhora ou redução na capacidade da região Fc para se ligar a receptores de Fc (por exemplo, melhora ou redução na ligação a FcyRI, FcyRII, ou FcyRIII), a proteínas do complemento, por exemplo, C1q), ou a outros
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112/162 parceiros de ligação do Fc (por exemplo^ DC-SIGN), ou para acionar citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose, ou citotoxicidade dependente do complemento (CDCC)). Em outras modalidades, a variante de Fc proporciona um resíduo de cisteína manipulado.
[00332] As regiões Fc da invenção podem empregar variantes de Fc reconhecidas na técnica as quais são conhecidas por conferirem uma modificação (por exemplo, um aumento ou uma redução) na função efetora e/ou ligação de FcR ou FcRn. Especificamente, uma molécula de ligação da invenção pode incluir, por exemplo, uma modificação (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais das posições de aminoácidos reveladas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional PCT Nos.: W088/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1,
WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WOOO/32767A1, WG00/42072A2, WO02/44215A2, W002/060919A2, WO03/074569A2, W004/016750A2, WO04/ 029207A2,
WO04/035752A2, W004/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, W005/040217A2, WO04/044859, WO05/ 070963A1, W005/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, W006/019447A1, W006/047350A2, e WO06/085967A2; Publicação de Pedido de Patente U.S. Nos. US2007/0231329, US2007Z 0231329, US2007/0237765,
US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188,
US2007/0248603, US2007/0286859, US2008Z 0057056; ou Patentes US Nos.: 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956, e 7.317.091. Em uma modalidade, a modificação específica (por exemplo, a substituição específica de um ou mais aminoácidos revelados na técnica) pode ser feita em uma ou mais das posições de aminoácidos reveladas. Em outra modalidade,
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113/162 pode ser feita uma modificação diferente em uma ou mais das posições de aminoácidos reveladas (por exemplo, a substituição diferente de uma ou mais posições de aminoácidos reveladas na técnica).
[00333] A região Fc pode ser modificada de acordo com procedimentos reconhecidos de modo geral tais como mutagênese dirigida ao sítio e similares para produzir fragmentos Fc modificados ou porções dos mesmos que vão ser ligadas por FcyRIIB e/ou DC-SIGN. As referidas modificações incluem modificações remotas dos sítios de contato de FcyRIIB e/ou DC-SIGN bem como modificações dentro dos sítios de contato que preservam ou mesmo reforçam a ligação ao FcyRIIB e/ou DC-SIGN. Por exemplo, os seguintes resíduos de aminoácidos únicos de Fc de lgG1 humana (Fc y1) podem ser substituídos sem perda significativa da afinidade de ligação de Fc para FcyRIIB e/ou DC-SIGN: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, e K447A, onde, por exemplo, P238A representa prolina selvagem substituída por alanina na posição de número 238. A título de exemplo, uma modalidade específica incorpora a mutação N297A, removendo um sítio de Nglicosilação altamente conservado. Além de alanina, outros aminoácidos
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114/162 podem ser substituídos pelos aminoácidos selvagens nas posições especificadas acima. Mutações podem ser introduzidas isoladamente em Fc dando origem a mais de uma centena de regiões Fc distintas do Fc nativo. Adicionalmente, combinações de duas, três, ou mais destas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, dando origem a mais centenas de regiões Fc. Além do mais, uma da região Fc de um constructo da invenção pode ser mutada e a outra região Fc do constructo não mutada de modo algum, ou ambas podem ser mutadas, porém com diferentes mutações.
[00334] Algumas das mutações acima podem conferir nova funcionalidade sobre a região Fc ou o parceiro de ligação de FcRn. Por exemplo, uma modalidade incorpora N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. O efeito desta mutação é reduzir a imunogenicidade, deste modo reforçando a meia-vida circulante da região Fc, e tornar a região Fc incapaz de se ligar a FcyRI, FcyRHA, FcyRIIB, e FcyRIIIA, sem comprometer a afinidade por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como um exemplo adicional de nova funcionalidade originária de mutações descritas acima, a afinidade por FcRn pode ser aumentada além da afinidade da selvagem em alguns casos. Esta afinidade aumentada pode refletir uma taxa ligada (on) aumentada, uma taxa desligada (o/Γ) diminuída ou tanto uma taxa ligada aumentada quanto uma taxa desligada diminuída. Exemplos de mutações que se acredita que confiram um aumento da afinidade por FcRn incluem, mas não estão limitados a, T256A, T307A, E380A e N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
[00335] Adicionalmente, no mínimo três gama receptores de Fc humano parecem reconhecer um sítio de ligação sobre IgG dentro da menor
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115/162 região de articulação, geralmente os aminoácidos 234 a 237. Portanto, outro exemplo de nova funcionalidade e potencial diminuição da imunogenicidade pode surgir a partir de mutações desta região, como, por exemplo, por substituição dos aminoácidos 233 a 236 da lgG1 humana ELLG para a sequência correspondente de lgG2 PVA (com deleção de um aminoácido). Foi mostrado que FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, os quais mediam várias funções efetoras, não se ligam a lgG1 quando as mutações referidas foram introduzidas. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 e Armour et ai. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
[00336] Em uma modalidade, o domínio Fc ou uma porção do mesmo é um polipeptídeo incluindo a SEQ ID NO: 3 da Patente U.S. No. 5.739.277 e opcionalmente incluindo adicionalmente uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 11, 1, 2, e 31 da Pat. U.S. No. 5.739.277.
[00337] Em determinadas modalidades, o domínio Fc ou uma porção do mesmo é hemiglicosilado. Por exemplo, a proteína quimérica compreendendo duas regiões Fc pode conter uma primeira região Fc glicosilada (por exemplo, uma região CH2 glicosilada) e uma segunda região Fc aglicosilada (por exemplo, uma região CH2 aglicosilada). Em uma modalidade, um encadeador pode ser interposto entre as regiões Fc glicosilada e aglicosilada. Em outra modalidade, a região Fc é totalmente glicosilada, isto é, todas as regiões Fc são glicosiladas. Em outras modalidades, a região Fc pode ser aglicosilada, isto é, nenhuma das porções Fc são glicosiladas.
[00338] Em determinadas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende uma substituição de aminoácido para um domínio Fc ou uma porção do mesmo (por exemplo, variantes de Fc), a qual alte
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116/162 ra as funções efetoras do domínio Fc, independentes do antígeno, em particular a meia-vida circulante da proteína.
[00339] As proteínas referidas apresentam ou ligação aumentada ou diminuída a FcR quando comparadas com proteínas carecendo destas substituições e, portanto, têm uma meia-vida aumentada ou diminuída no soro, respectivamente. Variantes de Fc com afinidade aprimorada para FcR são previstas como tendo meias-vidas séricas mais longas, e as referidas moléculas têm aplicações úteis em métodos de tratamento de mamíferos onde se deseja uma meia-vida longa do polipeptídeo administrado, por exemplo, para tratar uma doença crônica ou um distúrbio crônico (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos.: 7.348.004, 7.404.956, e 7.862.820). Em contraste, espera-se que variantes de Fc com atividade de ligação ao FcR diminuída tenham meias-vidas mais curtas, e as moléculas referidas também são úteis, por exemplo, para administração a um mamífero onde um tempo de circulação encurtado pode ser vantajoso, por exemplo, para diagnóstico por imagiologia in vivo ou em situações onde o polipeptídeo de partida tem efeitos colaterais tóxicos quando presente na circulação por períodos prolongados. Variantes de Fc com afinidade de ligação ao FcRn diminuída também têm menos probabilidade de cruzar a placenta e, portanto, também são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios em mulheres grávidas. Além disso, outras aplicações nas quais pode ser desejável afinidade de ligação ao FcRn reduzida incluem as aplicações nas quais é desejável localização no cérebro, rim e/ou fígado. Em uma modalidade de exemplo, a proteína quimérica da invenção apresentou transporte reduzido através do epitélio dos glomérulos renais a partir da vasculatura. Em outra modalidade, a proteína quimérica da invenção apresentou transporte reduzido através da barreira hematoencefálica (BHE) a partir do cérebro, para dentro do espaço vas
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117/162 cular. Em uma modalidade, uma proteína com ligação ao FcR alterada compreende no mínimo uma região Fc (por exemplo, uma ou duas regiões Fc) tendo uma ou mais substituições de aminoácidos dentro do loop de ligação ao FcR de uma região constante de Ig. O loop de ligação ao FcR, em uma modalidade, consiste nos resíduos de aminoácidos 280 a 299 (de acordo com a numeração da União Européia) de uma região Fc selvagem e de comprimento total. Em outras modalidades, uma região constante de Ig ou uma porção da mesma em uma proteína quimérica da invenção tendo atividade de ligação ao FcR alterada compreende no mínimo uma região Fc tendo uma ou mais substituições de aminoácidos dentro da zona de contato do FcR de 15 Á. Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo zona de contato do FcRn de 15 Á inclui resíduos nas seguintes posições de uma porção Fc selvagem e de comprimento total: 243 a 261, 275 a 280, 282 a 293, 302 a 319, 336 a 348, 367, 369, 372 a 389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (numeração da União Européia). Em outras modalidades, um domínio Fc ou uma porção do mesmo da invenção tendo atividade de ligação ao FcR alterada compreende no mínimo uma região Fc tendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de aminoácido correspondente a qualquer uma das seguintes posições da União Européia: 256, 277 a 281, 283 a 288, 303 a 309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por exemplo, N434A ou N434K), e 438. Exemplos de substituições de aminoácidos as quais alteraram a atividade de ligação ao FcR são revelados na Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO05/047327 a qual é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
[00340] Uma região Fc utilizada na invenção também pode compreender uma substituição de aminoácido reconhecida na técnica a qual altere a glicosilação da proteína quimérica. Por exemplo, a região Fc da proteí
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118/162 na quimérica ligada a uma proteína FVIII pode compreender uma região Fc tendo uma mutação levando a redução da glicosilação (por exemplo, glicosilação ligada a N ou a O) ou pode compreender uma glicoforma alterada da porção Fc selvagem (por exemplo, um glicado de baixo teor de fucose ou livre de fucose).
[00341 ] Em uma modalidade, uma proteína quimérica não processada da invenção pode compreender uma região Fc fundida geneticamente (isto é, região scFc) tendo duas ou mais de sua região constante de Ig constituinte ou uma porção da mesma selecionada de modo independente entre a região constante de Ig ou uma porção da mesma descrita aqui, neste pedido de patente. Em uma modalidade, as regiões Fc de uma região Fc dimérica são as mesmas. Em outra modalidade, no mínimo duas das regiões Fc são diferentes. Por exemplo, as regiões Fc das proteínas da invenção compreendem o mesmo número de resíduos de aminoácidos ou podem diferir em comprimento por um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, por cerca de 5 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1,2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácidos), cerca de 10 resíduos, cerca de 15 resíduos, cerca de 20 resíduos, cerca de 30 resíduos, cerca de 40 resíduos, ou cerca de 50 resíduos). Em ainda outras modalidades, as regiões Fc da proteína da invenção podem diferir em sequência em uma ou mais posições de aminoácidos. Por exemplo, no mínimo duas das regiões Fc podem diferir em cerca de 5 posições de aminoácidos (por exemplo, 1,2, 3, 4, ou 5 posições de aminoácidos), cerca de 10 posições, cerca de 15 posições, cerca de 20 posições, cerca de 30 posições, cerca de 40 posições, ou cerca de 50 posições).
[00342] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende mais de uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende
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119/162 duas cadeias polipeptídicas. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende um fator de coagulação e uma primeira região Fc, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região Fc. Em determinadas modalidades, a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas por uma ligação covalente. Em uma modalidade, a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas por uma ligação peptídica. Em outra modalidade, a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas por uma ligação de dissulfeto.
[00343] Em uma modalidade particular, a proteína quimérica compreende uma porção do fator VIII e uma porção do fator von Willebrand factor (VWF), em que a porção FVIII compreende um polipeptídeo FVIII ou um fragmento da mesma, em que a porção VWF compreende um polipeptídeo VWF ou um fragmento da mesma, em que a porção FVIII é ligada a uma primeira região Fc, em que a porção VWF é ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc são associadas uma com a outra. Em determinadas modalidades, a porção VWF compreende os domínios D’ e D3 de VWF. Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo, ou tanto o primeiro polipeptídeo quanto o segundo polipeptídeo adicionalmente compreendem uma ou mais porções de prolongamento da meia-vida.
[00344] Uma região Fc ou uma porção da mesma para produção de uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção pode ser obtida a partir de uma série de fontes diferentes. Em algumas modalidades, uma região Fc ou uma porção da mesma é derivada a partir de uma Ig humana. No entanto, deve ser entendido que a região Fc ou uma porção da mesma pode ser derivada a parir de uma Ig de outra espécie de mamífero, incluindo por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, um porquinho da índia) ou espécies de prima
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120/162 tas não humanos, por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, a região Fc ou uma porção da mesma pode ser derivada a partir de qualquer classe de Ig, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE, e qualquer isotipo de Ig, incluindo IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4. Em uma modalidade, é utilizado o isotipo humano lgG1.
[00345] Uma variedade das sequências genéticas de região Fc (por exemplo, variedade das sequências de Fc humano) estão disponíveis sob a forma de depósitos publicamente acessíveis. Podem ser selecionadas sequências de Fc tendo uma função efetora particular (ou carecendo de uma função efetora particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Foram publicadas muitas sequências de anticorpos e genes codificando anticorpos e sequências de regiões Fc adequadas podem ser derivadas a partir destas sequências usando técnicas reconhecias na técnica. O material genético obtido usando qualquer um dos métodos precedentes pode ser em seguida alterado ou sintetizado para obter as proteínas quiméricas utilizadas nos métodos da presente invenção. Será adicionalmente reconhecido que o âmbito desta invenção engloba alelos, variantes e mutações de sequências de DNA de região constante.
[00346] As sequências do Fc ou uma porção das mesmas podem ser clonadas, por exemplo, usando a reação de cadeia polimerase e primers os quais são selecionados para amplificar o domínio de interesse. De modo a clonar uma sequência da região Fc ou uma porção da mesma de um anticorpo, mRNA pode ser isolado a partir de hibridoma, baço, ou células linfáticas, transcrito reverso em DNA, e genes de anticorpos amplificados por PCR. Métodos de amplificação por POR são descritos em detalhes na Patentes U.S. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; e em, por exemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applica
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121/162 tions Innis et al· eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al· 1989. Gene 77:51; Horton et al· 1993. Methods Enzymol. 217:270). PCR pode ser iniciada por primers de regiões constantes de consenso ou por primers mais específicos baseados nas sequências de DNA de cadeias pesada e leve e de aminoácidos publicadas. Conforme discutido acima, PCR também pode ser utilizado para isolar clones de DNA codificando as cadeias leves e pesadas de anticorpo. Neste caso as bibliotecas podem ser tríadas por primers de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de regiões constantes de camundongo. Numerosos conjuntos de primers adequados para amplificação de genes de anticorpos são conhecidos na técnica (por exemplo, 5' primers baseados na sequência N-terminal de anticorpos purificados (Benhar e Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); rápida amplificação de extremidades de cDNA (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); sequências líderes de anticorpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). A clonagem de sequências de anticorpos é adicionalmente descrita em Newman et al., Patente U.S. No. 5.658.570, registrada em 25 de janeiro de 1995, a qual é incorporada por meio de referência aqui, a este pedido de patente.
II.B. Porções de prolongamento da meia-vida [00347] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção ainda compreende uma ou mais porções de proiongamento da meia-vida. A meia-vida de um fator de coagulação pode ser determinada por qualquer método de conhecimento dos versados na técnica, por exemplo, testes da atividade de FVIII (ensaio cromogênico ou teste de aPTT de coagulação de uma fase) para detectar os níveis de atividade plasmátíca de FVIII ou ELISA de FVIII para detectar o nível de antígeno de FVIII plasmático. Em uma modalidade particu
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122/162 lar, a meia-vida da atividade de coagulação de um fator de coagulação é determinada por teste de coagulação de uma fase. Em uma modalidade mais particular, a meia-vida da atividade de coagulação de um fator de coagulação é determinada em camundongos, quer camundongos HemA ou camundongos de duplo nocaute (DKO) de FVIII e do Fator de von Willebrand.
[00348] Em determinados aspectos, uma porção heteróloga a qual aumenta a meia-vida do fator de coagulação da invenção compreende, sem limitação, um polipeptídeo heterólogo tal como albumina, uma região Fc de imunoglobulina, uma sequência XTEN, o peptídeo do terminal carbóxi (CTP) da subunidade β de gonadotropina coriônica humana, uma sequência PAS, uma sequência HAP, uma transferrina, porções de ligação a albumina, ou quaisquer fragmentos, derivados, variantes, ou combinações destes polipeptídeos. Em outros aspectos relacionados, uma porção de prolongamento da meia-vida pode incluir um sítio de fixação para uma porção não polipeptídica tal como polietileno glicol (PEG), hidroxietil amido (HES), ácido poli-siálico, ou quaisquer derivados, variantes, ou combinações destas porções. Em determinadas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação a albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido poli-siálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida não compreende uma XTEN. Em outras modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida compreende uma XTEN.
[00349] Em outras modalidades, uma proteína quimérica da invenção é conjugada a um ou mais polímeros. O polímero pode ser hidrossolúvel
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123/162 ou não solúvel em água. O polímero pode ser fixado de modo covalente ou não covalente ao fator de coagulação, o Fc, ou a outras porções conjugadas ou ao fator de coagulação ou ao Fc. Exemplos não limitantes do polímero podem ser poli(alquileno óxido), poli(vinil pirrolidona), poli(vinil álcool), polloxazolina, ou poli(acriloilmorfolina). Tipos adicionais de, por exemplo, FVIII conjugado a polímero são revelados na Patente U.S. No. 7.199.223, a qual é revelada por meio de referência em sua totalidade.
[00350] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica da invenção pode compreender uma, duas, três ou mais porções de prolongamento da meia-vida, as quais podem ser cada uma as mesmas ou moléculas diferentes.
(1) Em algumas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida é fundida ao término amlno ou ao término carbóxi da proteína quimérica. Em algumas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida é fundida ao término amino ou ao término carbóxi do fator de coagulação. Em algumas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida é fundida ao término amino ou ao término carbóxi do Fc. Em determinadas modalidades, a porção de prolongamento da meia-vida é inserida dentro do fator de coagulação da proteína quimérica.
(2) Em algumas modalidades, a proteina quimérica compreende FVIII ou uma porção da mesma, e a porção de prolongamento da meia-vida é inserida dentro do FVIII em uma ou mais posições reveladas na Publicação do Pedido de Patente dos U.S. No. 2015-0158929 A1 e/ou Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2015106052 A1, as quais são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade. Em uma modalidade particular, a porção de prolongamento da meia-vida é inserida dentro do domínio B (ou um fragmento do mesmo) do FVIII. Em uma modalidade particular, a porção de
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124/162 prolongamento da meia-vida é inserida dentro do FVIII imediatamente a jusante do resíduo de aminoácido 745 de FVIII maduro.
II.B.1. Albuminas [00351] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um polipeptídeo albumina ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Albumina sérica humana (HSA, ou HA), uma proteína de 609 aminoácidos em sua forma de comprimento total, é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e também funciona como um veículo de ligantes endógenos e exógenos. O termo albumina conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, inclui albumina de comprimento total ou um fragmento funcional, variante, derivado, ou análogo da mesma. Exemplos de albumina ou dos fragmentos ou variantes da mesma são revelados na Publicação do Pedido de Patente US Nos. 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ou 2008/0153751 A1 ou na Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Nos. 2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ou 2007/021494 A2, as quais são incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em suas totalidades.
[00352] Os pollpeptídeos de ligação a albumina (ABPs) podem comprometer, sem limitação, domínios de ligação a albumina bacteriana, peptídeos de ligação a albumina, ou fragmentos de anticorpos de ligação a albumina que podem se ligar a albumina. O domínio 3 de proteína G de estreptococos, conforme revelado por Kraulis et at, FEBS Lett. 378:190194 (1996) e Linhult et at, Protein Sci. 11:206-213 (2002) é um exemplo de um domínio de ligação a albumina bacteriana. Exemplos de peptídeos de ligação a albumina são revelados em Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Exemplos de fragmentos de anticorpos
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125/162 de ligação a albumina são revelados em Muller e Kontermann, Curr. Opln. Mol. Then 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), e Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008), os quais são incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em suas totalidades.
[00353] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um sítio de fixação para uma pequena molécula não polipeptídíca, variante, ou derivado que pode ligar a albumina da mesma. Por exemplo, a proteína quimérica pode incluir uma ou mais porções de ligação a albumina orgânica. Um exemplo de similares porções de ligação a albumina é 2-(3maleimidopropanamído)-6-(4-(4-iodofenil) butanamido)hexanoato (marcador Albu) conforme revelado por Trussel et at, Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).
II.B.2. XTENs [00354] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um polipeptídeo XTEN ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Conforme utilizado aqui sequência XTEN refere-se a polípeptídeos de comprimento prolongado com sequências substancial mente não repetitivas e que não ocorrem naturalmente que são compostas essencialmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequência tendo um baixo grau ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas. Como um parceiro da proteína quimérica, XTENs podem servir como um veículo, conferindo determinadas propriedades farmacocinéticas, fisicoquímicas e farmacêuticas desejáveis, por exemplo, quando fundidos com ou Inseridos dentro do fator de coagulação da proteína quimérica. As propriPetição 870190050918, de 30/05/2019, pág. 168/210
126/162 edades desejáveis referidas incluem, mas não estão limitadas a parâmetros farmacocinéticos e características de solubilidade reforçados.
[00355] Uma sequência XTEN fundida com ou inserida dentro do fator de coagulação da proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção pode conferir à proteína quimérica uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, aumento da solubilidade aquosa, alto grau de resistência a protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação a receptores de mamíferos, ou aumento dos raios hidrodinâmicos (ou Stokes). Em determinados aspectos, uma sequência XTEN pode aumentar as propriedades farmacocinéticas tais como meiavida mais longa (por exemplo, meia-vida in viva) ou aumento da área sob a curva (AUC), de modo que a proteína quimérica permanece in vivo e tem atividade pró-coagulante por um período de tempo aumentado comparada com a proteína quimérica sem a XTEN.
[00356] Exemplos de sequências XTEN que podem ser inseridas dentro de proteínas FVIII recombinantes da invenção são revelados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/ 0046061 A1, 2011/0077199 A1, ou 2011/0172146 A1, ou na Publicação do Pedido de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, ou WO 2015106052 A1, cada uma das quais é incorporada por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade.
H.B.3. VWF ou um Fragmento do Mesma [00357] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um polipeptídeo VWF ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. VWF (também
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127/162 conhecido como F8VWF) é uma grande glicoproteína multimérica presente no plasma sanguíneo e produzida constitutivamente no endotélio (nos corpos de Weibel-Palade), nos megacariócitos (grânulos-α das plaquetas), e no tecido conjuntivo subendotelial. O monômero VWF básico é uma proteína de 2813 aminoácidos. Todo monômero contém uma série de domínios específicos com uma função específica, o domínio D7D3 (o qual se liga ao Fator VIII), o domínio A1 (o qual se liga a GPIb-receptor plaquetário, heparina, e/ou possivelmente colágeno), o domínio A3 (o qual se liga a colágeno), o domínio C1 (no qual o domínio RGD se liga a integrina plaquetária αΙΙόβ3 quando esta está ativada), e o domínio de nó de cisteína na extremidade do terminal carbóxi da proteína (o qual VWF partilha com fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformante β (ΤΟΡβ) e β-gonadotropina coriônica humana (pHCG)).
[00358] Em uma modalidade, o polipeptídeo VWF é um fragmento de VWF. O termo um fragmento de VWF conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, inclui, mas não está limitado a, fragmentos de VWF funcionais compreendendo um domínio D’ e um domínio D3, os quais são capazes de inibir a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em uma modalidade, a proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende um fator de coagulação, uma região Fc, e um fragmento de VWF, em que o fator de coagulação compreende FVIII, e em que o fragmento de VWF se liga à proteína FVIII. Em outra modalidade, o fragmento de VWF bloqueia o sítio de ligação de VWF sobre a proteína FVIII, deste modo inibindo a interação da FVIII proteína com VWF endógeno. Os fragmentos de VWF incluem derivados, variantes, mutantes, ou análogos que conservam estas atividades de VWF. Em determinadas moda
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128/162 lidades, o fragmento de VWF compreende o domínio D’ e o domínio D3 de VWF.
[00359] A sequência de aminoácidos monomérica 2813 para VWF humano é reportada como Número de Acesso __NP__000543.2__no Genbank. A sequência de nucleotídeos codificando o VWF humano é reportada como Número de Acesso__NM__000552.3_ no Genbank.
[00360] Em determinadas modalidades, a proteína VWF útil aqui, neste pedido de patente, pode ser adicionalmente modificada para melhorar sua interação com FVIII, por exemplo, para melhorar a afinidade de ligação a FVIII. Em outras modalidades, as proteínas VWF úteis para a invenção podem ter outras modificações, por exemplo, a proteína pode ser peguilada, glicosilada, hesilada, ou polisialilada. Exemplos de sequências de VWF úteis nos métodos da presente invenção são proporcionados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nos. US 2015/0023959 Al, US 2015/0266943 A1, e US 2015/0158929. Em determinadas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida a ou coadmínistrada com um parceiro de ligação de FcRn. Em algumas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida a um Fc ou coadministrada com um Fc ou um polipeptídeo compreendendo um Fc. Em algumas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida a uma albumina ou coadministrada com uma albumina ou um polipeptídeo compreendendo uma albumina.
H.B.4. CTP [00361] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade β de gonadotropina coriônica humana ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Peptídeos CTP são conhecidos por aumentarem a meia-vida daquela proteína. Vide, por exemplo, a
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Patente U.S. No. 5.712.122, incorporada por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade. Exemplos não limitantes de peptídeos CTP são revelados na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2009/0087411 A1, incorporada por meio de referência.
II.B.5. PAS [00362] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um peptídeo PAS ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Um peptídeo PAS ou uma sequência PAS, conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, significa uma sequência de aminoácidos compreendendo principalmente resíduos de alanina e serina ou compreendendo principalmente resíduos de alanina, serina, e prolina, a sequência de aminoácidos formando conformação espiralada aleatória sob condições fisiológicas. Por conseguinte, a sequência PAS é um bloco de construção, um polímero de aminoácido, ou um cassete de sequência compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em alanina, serina, e prolina o qual pode ser utilizado como uma parte da porção heteróloga na proteína quimérica. Um polímero de aminoácido também pode formar conformação espiralada aleatória quando resíduos diferentes de alanina, serina, e prolina são adicionados como um constituinte menor na sequência PAS. Por constituinte menor se indica que aminoácidos diferentes de alanina, serina, e prolina podem ser adicionados na sequência PAS até um certo grau, por exemplo, até cerca de 12%, isto é, cerca de 12 de 100 aminoácidos da sequência PAS, até cerca de 10%, até cerca de 9%, até cerca de 8%, cerca de 6%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, isto é, cerca de 2%, ou cerca de 1%, dos aminoácidos. Os aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser selecionados entre o grupo consistindo em: Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Thr,
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Trp, Tyr, e Vai. Sob condições fisiológicas, um peptídeo PAS forma uma conformação espiralada aleatória e deste modo pode mediar uma estabilidade aumentada in viva e/ou in vitro para uma proteína recombinante da invenção, e tem atividade pró-coagulante.
[00363] Exemplos não limitantes dos peptídeos PAS são revelados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2010/0292130 A1; na Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2008/155134 A1; e na patente Européia concedida No. EP2173890.
//.5.6. HAP [00364] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um peptídeo homoaminoácido polímero (HAP) ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Um peptídeo HAP pode compreender uma sequência repetitiva de glicina, a qual tem no mínimo 50 aminoácidos, no mínimo 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos, ou 500 aminoácidos de comprimento. Uma sequência HAP é capaz de prolongamento da meiavida de uma porção fundida a ou ligada à sequência HAP. Exemplos não limitantes da sequência HAP incluem, mas não estão limitados a (Gly)n, (Gly4Ser)n ou S(Gly4Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20. Em uma modalidade, n é 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40. Em outra modalidade, n é 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200. Vide, por exemplo, Schlapschy M et at, Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).
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I LB. 7. Transferring [00365] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um peptídeo transferrina ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Qualquer transferring pode ser fundida com a proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção. Como um exemplo, Tf humana selvagem (Tf) é uma proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 kDa (não contabilizando glicosilação), com dois domínios principais, N (cerca de 330 aminoácidos) e C (cerca de 340 aminoácidos), os quais parecem se originar de uma duplicação genética. Vide os números de acesso no GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 e S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov), todos os quais são aqui, a este pedido de patente, incorporados por meio de referência em sua totalidade.
[00366] Transferrina transporta ferro através de endocitose mediada por receptores de transferrina (TfR)-. Depois do ferro ser liberado dentro do compartimento endossômico e o complexo Tf-TfR ser reciclado para a superfície celular, o Tf é liberado de volta para o espaço extracelular para o próximo ciclo de transporte de ferro. Tf possui uma meia-vida longa que está em excesso de 14 a 17 dias (Li et al., Trends Pharmacol. ScL 23:206-209 (2002)). Proteínas de fusão de transferrina foram estudadas para extensão da meia-vida, liberação direcionada para terapias do câncer, liberação oral e ativação gradual de pró-insulina (Brandsma et al., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:7292-7296 (2005); Kim et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang et al., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)).
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I LB. 8. PEG [00367] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um sítio de fixação para uma porção heteróloga não polipeptídica ou fragmento, variante, ou derivado da mesma. Por exemplo, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção pode incluir uma ou mais porções de polietileno glicol (PEG) anexadas a um ou mais resíduos de aminoácidos no fator de coagulaçâo e/ou na região Fc.
[00368] A pEGuilação de uma proteína pode se referir a um conjugado formado entre a proteína e no mínimo uma molécula de polietileno glicol (PEG). PEG está disponível comercialmente em uma grande variedade de pesos moleculares e faixas de pesos moleculares médios. Exemplos típicos de faixas de pesos moleculares médios de PEG incluem, mas não estão limitados a, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 600, cerca de 1000, cerca de 1300 a 1600, cerca de 1450, cerca de 2000, cerca de 3000, cerca de 3000 a 3750, cerca de 3350, cerca de 3000 a 7000, cerca de 3500 a 4500, cerca de 5000 a 7000, cerca de 7000 a 9000, cerca de 8000, cerca de 10000, cerca de 8500 a 11500, cerca de 16000 a 24000, cerca de 35000, cerca de 40000, cerca de 60000, e cerca de 80000 Daltons. Estes pesos moleculares médios são proporcionados somente como exemplos e não se destinam de modo algum a serem limitantes.
[00369] Uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção pode ser PEGuilada para incluir porções de mono- ou poli-(por exemplo, 2 a 4) PEG. Pode ser realizada PEGuilação por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Métodos para preparar um produto de proteína PEGuilada geralmente vão incluir (i) reação de um polipeptideo com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou
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133/162 derivado de aldeído de PEG) sob condições por meio das quais o peptídeo da invenção se torna anexado a um ou mais grupos de PEG; e (ii) obtenção do produto ou produtos da reação. Em geral, as condições de reação ótimas para as reações vão ser determinadas caso a caso com base nos parâmetros conhecidos e no resultado desejado.
[00370] Existe uma série de métodos de fixação de PEG disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, Malik F et aí, Exp. Hematoí 20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); Publicação de Patente Européia Nos. EP0401384, EP0154316, e EP0401384; e Publicação do Pedido de Patente Internacional Nos. WO92/16221 e WO95/34326. Como um exemplo não limitante, variantes de FVIII podem conter substituições de cisteina, e as cisteínas podem ser adicionalmente conjugadas ao polímero de PEG. Vide Mei et aí, Blood 116:270-279 (2010) e a Patente U.S. No. 7.632.921, os quais são incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em suas totalidades.
II.B.9. HES [00371] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um polímero de hidroxietil amido (HES). HES é um derivado de amilopectina que ocorre naturalmente e é degradado por alfa-amilase no corpo. HES apresenta vantajosas propriedades biológicas e é utilizado como agente de reposição do volume sanguíneo e em terapia de hemodiluição nas clínicas. Vide, por exemplo, Sommermeyer et aí, Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); e Weidler et aí, Arznelm.~Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991).
[00372] HES é essencialmente caracterizado pela distribuição de peso molecular e pelo grau de substituição. HES tem um peso molecular médio
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134/162 (média de peso) de a partir de 1 a 300 kD, a partir de 2 a 200kD, a partir de 3 a 100 kD, ou a partir de 4 a 70kD. Hidroxietil amido pode adicionalmente apresentar um grau molar de substituição de a partir de 0,1 a 3, a partir de 0,1 a 2, a partir de 0,1 a 0,9, ou a partir de 0,1 a 0,8, e uma proporção entre substituição C2:C6 dentro de uma faixa de a partir de 2 a 20 com respeito aos grupos de hidroxietilo. HES com um peso molecular médio de cerca de 130 kD é VOLUVEN® da Fresenius. VOLUVEN® é um colóide artificial, empregado, por exemplo, para reposição de volume utilizada na indicação terapêutica para terapia e profilaxia de hipovolemia. Existe uma série de métodos de fixação de HES disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, os mesmos métodos de fixação de PEG descritos acima.
II.B.10. PSA [00373] Em determinados aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção compreende no mínimo um polímero de ácido poli-siálico (PSA). PSAs são polímeros de ácido siálico não ramificados que ocorrem naturaimente produzidos por determinadas cepas bacterianas e em mamíferos em determinadas células. Vide, por exemplo, Roth J. et al. (1993) em Poly-sialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (BirkhâuserVeriag, Basel, Switzerland), pp. 335-348. PSAs podem ser produzidos em vários graus de polimerização a partir de η ~ cerca de 80 ou mais resíduos de ácido siálico para baixo até n ~ 2 por hídrolise ácida limitada ou por digestão com neuraminidases, ou por fracionamento das formas do polímero naturais, derivadas bacterianamente. Existe uma série de métodos de fixação de PSA disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, os mesmos métodos de fixação de PEG descritos acima. Em determinados aspectos, um PSA ativado também pode ser anexado a um resíduo de aminoácido cis
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135/162 teína dentro do fator de coagulação, por exemplo, sobre FVIII, ou dentro da região Fc. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.846.951.
II. B.11. Receptores de Clearance [00374] Em determinados aspectos, a meia-vida de uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente invenção pode ser prolongada onde o fator de coagulação da proteína quimérica compreende FVIII e no mínimo um fragmento de um receptor de clearance de FVIII ou fragmento de ligação a FVIII, variante, ou derivado do mesmo. A inserção de formas adequadas de receptores de clearance, tais como o receptor de proteínas relacionadas com lipoproteínas de baixa densidade LRP1, ou fragmentos dos mesmos, pode bloquear a ligação de FVIII a receptores de clearance e deste modo prolongar sua meia-vida, por exemplo, sua meia-vida in vivo. LRP1 é uma proteína de membrana integral de 600 kDa que está implicada no clearance mediado por receptores de uma variedade de proteínas, incluindo FVIII. Vide, por exemplo, Lenting et al., Haemophilia 16:616 (2010). Outros receptores de clearance de FVIII adequados são, por exemplo, LDLR (receptor de lipoproteínas de baixa densidade), VLDLR (receptor de lipoproteínas de muito baixa densidade), e megalina (LRP2), ou fragmentos dos mesmos. Vide, por exemplo, Bovenschen et aí, Blood 106:906-912 (2005); Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010); Martinelli et aí, Blood 116:5688-5697 (2010).
III. Polinucleotídeos, Vetores, E Células Hospedeiras [00375] Em alguns aspectos, a presente invenção proporciona um método de tolerância imune em um ser humano, compreendendo a administração ao ser humano de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo ou um conjunto de polinucleotídeos codificando um fator de coagulação e/ou uma região Fc, por exemplo, codificando uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o ser
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136/162 humano falhou em responder a uma ou mais terapias de tolerância imune prévias. Em algumas modalidades, o polinucleotideo ou o conjunto de polinucleotídeos está dentro de um vetor de expressão ou um conjunto de vetores de expressão. Em determinadas modalidades, o vetor de expressão ou o conjunto de vetores de expressão está dentro de uma ou mais células hospedeiras.
[00376] O polinucleotideo codificando um fator de coagulação e/ou uma região Fc, por exemplo, codificando uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, utilizada nos métodos da presente invenção pode ser uma única sequência de nucleotídeos, duas sequências de nucleotídeos, três sequências de nucleotídeos, ou mais. Em uma modalidade, uma única sequência de nucleotídeos codifica uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação (por exemplo, um polipeptídeo FVIII) e uma região Fc. Em outra modalidade, o polinucleotideo compreende duas sequências de nucleotídeos, a primeira sequência de nucleotídeos codificando um fator de coagulação (por exemplo, um FVIII) e a segunda sequência de nucleotídeos codificando uma região Fc. Em outra modalidade, o polinucleotideo compreende duas sequências de nucleotídeos, a primeira sequência de nucleotídeos codificando um fator de coagulação (por exemplo, um FVIII) e uma região Fc e a segunda sequência de nucleotídeos codificando uma segunda região Fc. Em determinadas modalidades, os domínios Fc codificados formam uma ligação covalente depois de expressão.
[00377] Em algumas modalidades, o polinucleotideo é otimizado por códon.
[00378] Conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, um vetor de expressão refere-se a qualquer constructo de ácido nucleico o qual contém os elementos necessários para a transcrição e a translação de uma
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137/162 sequência codificante inserida, ou no caso de um vetor de RNA viral, os elementos necessários para replicação e translação, quando introduzido dentro de uma célula hospedeira apropriada. Vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagomídios, vírus, e derivados dos mesmos.
[00379] Uma sequência de controle da expressão genética conforme utilizado aqui, neste pedido de patente, é qualquer sequência de nucleotídeos regulatória, tal como uma sequência de promotor ou combinação de promotor-reforçador, a qual facilita a eficiente transcrição e translação do ácido nucléico codificante ao qual é ligado operacionalmente. A sequência de controle da expressão genética pode ser, por exemplo, um promotor de mamífero ou viral, tal como um promotor constitutivo ou indutível. Promotores de mamífero constitutivos incluem, mas não estão limitados a, os promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), adenosina desaminase, piruvato quinase, promotor de beta-actina, e outros promotores constitutivos. Exemplos de promotores virais os quais funcionam constitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do citomegalovírus (CMV), do vírus símio (por exemplo, SV40), do vírus do papiloma, do adenovirus, do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus do sarcoma de Rous, do citomegalovírus, as repetições terminais longas (LTR) do vírus da leucemia de Moloney, e de outros retrovirus, e o promotor de timidina quinase do vírus herpes simplex. Outros promotores constitutivos são de conhecimento dos versados na técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão genética da invenção também incluem promotores indutíveis. Promotores indutíveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor de metalotioneína é induzido para promover transcrição e translação na presença de determinados íons metálicos.
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Outros promotores indutíveis são de conhecimento dos versados na técnica.
[00380] Para os fins desta invenção, podem ser empregados numerosos sistemas de vetor de expressão. Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico hospedeiro. Vetores de expressão podem incluir sequências de controle da expressão incluindo, mas não limitadas a, promotores (por exemplo, promotores associados naturalmente ou heterólogos), reforçadores, sequências de sinal, sinais de emenda, elementos reforçadores, e sequências de terminação de transcrição. De modo preferencial, as sequências de controle da expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Vetores de expressão também podem utilizar elementos de DNA os quais são derivados de vírus animais tais como o vírus do papiloma bovino, o vírus polioma, o adenovirus, o vírus vaccinia, o baculovírus, retrovirus (RSV, MMTV ou MOMLV), citomegalovírus (CMV), ou vírus SV40. Outros envolvem a utilização de sistemas policistrônicos com sítios de ligação ao ribossoma internos.
[00381] Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção (por exemplo, resistência a ampicilina, resistência a higromicina, resistência a tetracidina ou resistência a neomicina) de modo a permitir a detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (vide, por exemplo, Itakura et aí, Patente U.S. No. 4.704.362). Células as quais têm o DNA integrado dentro de seus cromossomas podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores os quais permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode proporcionar prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência
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139/162 a biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como cobre. O gene marcador selecionável pode ser ou ligado diretamente às sequências de DNA para ser expresso, ou introduzido dentro da mesma célula por cotransformação.
[00382] Um exemplo de um vetor útil para expressão otimizada das proteínas quiméricas utilizado nos métodos da presente invenção é NEOSPLA (Patente U.S. No. 6.159.730). Este vetor contém o promotor/reforçador do citomegalovírus, o promotor maior da beta globina do camundongo, a origem de replicação SV40, a sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino, éxon 1 e éxon 2 da fosfotransferase da neomicina, o gene da di-hidrofolato redutase e sequência líder. Foi visto que este vetor resulta em um nível muito elevado de expressão de anticorpos depois da incorporação de genes de regiões variáveis e constantes, transfecção em células, seguida por seleção em meio contendo G418 e amplificação por metotrexato. Sistemas vetoriais também são ensinados nas Patentes U.S. Nos. 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais é incorporada por meio de referência em sua totalidade aqui, a este pedido de patente. Este sistema proporciona altos níveis de expressão, por exemplo, > 30 pg/ célula/ dia. Outros sistemas vetoriais de exemplo são revelados, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.413.777.
[00383] Em outras modalidades os polipeptídeos da presente invenção são expressos usando constructos policistrônicos. Nestes sistemas de expressão, podem ser produzidos múltiplos produtos genéticos de interesse tais como múltiplos polipeptídeos de proteína de ligação de multímero a partir de um único constructo policistrônico. Estes sistemas vantajosamente usam um sítio interno de entrada do ribossoma (IRES) de modo a proporcionar níveis relativamente elevados de polipeptídeos em células hospedeiras eucarlóticas. Sequências de sítios internos de entrada
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140/162 do ribossoma compatíveis são reveladas na Patente US No. 6.193.980, a qual também é incorporada aqui, a este pedido de patente.
[00384] De maneira mais geral, assim que tenha sido preparado o vetor ou a sequência de DNA codificando um polipeptídeo, o vetor de expressão pode ser introduzido dentro de uma célula hospedeira apropriada. Isto é, as células hospedeiras podem ser transformadas. A introdução do plasmídeo dentro da célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas de conhecimento geral dos versados na técnica, conforme discutido acima. As células transformadas são cultivadas sob condições apropriadas para a produção da proteína quimérica, e testadas para síntese de proteínas quiméricas. Exemplos de técnicas de teste incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise por sortidor celular ativado por fluorescência (FACS), imunohistoquímica, e similares.
[00385] Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais plenamente entendida por meio de referência aos exemplos que se seguem, os quais são incluídos com a mesma para fins de ilustração somente e não se destinam a limitar a invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 [00386] Hemofilia A (deficiência do fator VIII [FVIII]) é um transtorno hemorrágico raro e o tipo mais comum de hemofilia. A mais grave complicação do tratamento para os pacientes com hemofilia A é o desenvolvimento de anticorpos IgG inibidores para FVIII. Os inibidores resultam em rápido clearance de FVIII infundido e notável redução ou ausência de eficácia. Agentes de bypassing de inibidores de FVIII são utilizados para tratar sangramento agudo em pacientes com inibidores, mas a erradicação de inibidores é o objetivo do manejo de longo termo.
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141/162 [00387] Terapia de indução de tolerância imune (ITI) usando administração frequente de altas doses de FVIII é a única estratégia que foi demonstrado que atinge tolerância antígeno-específica. Geralmente é tentada a ITI para eliminar alta responsa de inibidores de FVIII (título > 5 BU). Vários estudos investigaram a eficácia de diferentes produtos de FVIII para obter ITI bem-sucedida com diferentes doses e frequências de injeção e recomendações de consenso internacional foram emitidas para corroborar abordagens de ITI na prática clínica. Em um Estudo de ITI Internacional, os pacientes do ramo de Alta Dose (HD) (200 LJI/Kg/dia) obtiveram um título negativo e uma recuperação normal significativamente mais rapidamente do que os pacientes do ramo de Baixa Dose (LD). Hay and DiMichele, Blood 119(6): 1335-44 (2012). Pacientes HD também experimentaram significativamente menos sangramentos do que pacientes LD, e por este motivo, o quadro de monitoramento de segurança de dados (DSMB) recomendou o término do estudo porque identificaram sangramento como um problema de segurança. A alta dose de 200 UI/Kg/dia é a dose recomendada nos pacientes de alto risco (definidos como os com título de pico histórico >200BU, título pré ITI >10 UB e/ou >5 anos desde diagnóstico de inibidores). Existe um crescente interesse na investigação da utilização do rFVIIIFc de Meia-Vida Prolongada (EHL (N.T.: em inglês, Extended Half-Life)) em ITI. rFVIIIFc foi aprovado nos EUA em 2014 com o nome de ELOCTATE® e na Europa em 2015 com o nome de ELOCTA®.
[00388] rFVIIIFc é produzido em uma linhagem celular humana (ΉΕΚ293) como um fator VIII deletado o domínio B recombinante (BDD) fundido ao domínio Fc de IgG humana. Proteínas produzidas por HEK têm modificações pós-translacionais similares às proteínas humanas nativas, em contraste com proteínas produzidas em linhagens celulares
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142/162 de outras espécies, tais como hamsters (por exemplo, células CHO). Em similares proteínas, glicanos não humanos (tais como o ácido Nglicolilneuramínico, NGNA e galactose-alfa-1,3-galactose, alfa-Gal) resultantes das modificações pós-translacionais podem ser potencialmente imunogênicos. Nem NGNA, nem alfa-Gal é encontrado em rFVIHFc. Modelos em camundongo também mostraram que rFVIHFc induz respostas de células T regulatórias para FVHI (Vide Batsuli Haemophilia (2016), 22 (Suppl. 5), 31-35), o que sugeriu a alguns pesquisadores que rFVIHFc pode proporcionar ITI mais eficaz, especificamente ITI mais curto, do que rFVIII.
Objetivas [00389] O objetivo primário do presente estudo é descrever o tempo para tolerância com rFVIHFc nos pacientes depois de tratamento com ITI. O estudo também visa descrever o resultado do tratamento com ITI; descrever a taxa de recidiva durante um período de tempo depois de ITI bem-sucedida realizada com rFVIHFc; descrever o sangramento intercorrente durante a ITI e durante o período depois da ITI bem sucedida realizada com rFVIHFc; descrever a segurança e a tolerabilidade de rFVIHFc quando utilizada para ITI; descrever as questões de qualidade de vida (QoL) específicas; e demonstrar o consumo de rFVHIFc.
EXEMPLO 2 [00390] O presente estudo visa descrever a utilização de rFVIHFc para ITI em pacientes com hamofilia A grave com inibidores que falharam em terapias com ITI prévias. Especificamente, o objetivo primário deste estudo é descrever o resultado de tratamento de ITI realizado com rFVIHFc em pacientes que falharam em tentativas prévias de tolerização, incluindo o utilização de imunossupressores, depois de tratamento com ITI. Objetivos secundários e seus desfechos incluem: (1) descrever o tempo para
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143/162 tolerização de ITI realizada com rFVIHFc em pacientes que falharam em tentativas prévias de tolerização, incluindo o utilização de imunossupressores, com um desfecho de tempo para o sucesso da ITI; (2) descrever a taxa de recidiva depois de ITI bem sucedida realizada com rFVHIFc, com um desfecho de ocorrência de recidiva; (3) descrever o sangramento intercorrente durante ITI e durante o período depois da ITI bem sucedida realizada com rFVIHFc, com um desfecho da taxa de sangramento rate;
(4) descrever a segurança e a tolerabilidade de rFVIHFc quando utilizado para ITI, com desfechos de eventos adversos e/ou reações do local da injeção; e (5) descrever o consumo de rFVIHFc em ITI realizada com ELOCTA®, com um desfecho de rFVHIFc.
EXEMPLO 3 [00391] Neste estudo, indivíduos do sexo masculino de todas as idades com hemofilia A severa e alto título de inibidores (pico histórico >5 Unidades Bethesda [UB]/mL) vão receber proteína de fusão de fator de coagulação recombinante VIII Fc (rFVIHFc) para serem submetidos pela primeira vez a terapia de indução de tolerância imune (ITI), para erradicação e neutralização de aloanticorpos antifator de coagulação VIII (FVIII).
[00392] Os participantes vão receber rFVHIFc em uma dose de 200 unidades internacionais (UI)/ quilograma (kg) como injeções uma vez ao dia ou divididas em várias injeções por dia a critério do Pesquisador, iniciando na visita de linha basal até um máximo de 48 Semanas no Período de indução de tolerância imune (ITI). Os participantes que satisfizerem os critérios para sucesso da indução de tolerância imune (ITI) vão entrar no período de redução gradual de dose e vão receber rFVHIFc (como pó para injeção administrado por via Intravenosa) em uma dose ajustada de acordo com o critério do Pesquisador (50 ou 100 Ul/kg) uma vez ao dia
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144/162 da semana 1 à semana 6 e a cada dois dias depois disso até a Semana 16.
[00393] A medida de resultados primários deste estudo é descrever o tempo para tolerização com rFVIIIFc durante um período de tempo de até 12 meses. Tolerização é definida como títulos de inibidores <0,6 UB/ml, recuperação de FVIII > 66%, e ti/2 de > 7 horas.
[00394] Uma medida de resultados secundários é o número de participantes com sucesso da indução de tolerância imune (ITI). O sucesso da indução de tolerância imune (em inglês, ITI Success) vai ser definido como: título negativo para inibidor de menos de (<) 0,6 UB/mL pelo teste Bethesda modificado por Nijmegen; recuperação incrementai de FVIII (RI) >1,3 unidades internacionais por decilitro (UI/dL) por Ul/kg em 2 determinações consecutivas representando 66% da RI esperada 2 UI/dL por Ul/kg; meia-vida (t-1/2) >7 horas. O sucesso da indução de tolerância imune vai ser monitorado durante um período de tempo de até 48 semanas.
[00395] Outra medida de resultados secundários é o número de participantes que experimentaram recidiva. Será avaliada a percentagem de participantes com sucesso da ITI que atingem os critérios para recidiva (definidos como títulos de inibidores > 0,6 UB/mL ou recuperação anormal depois de ser atingida tolerância). A recidiva vai ser monitorada durante um período de tempo de até 48 semanas.
[00396] Outra medida de resultados secundários é o número de episódios de sangramento. Um episódio de sangramento se iniciou a partir do primeiro sinal de um sangramento e terminou não mais de 72 horas depois do último tratamento para o sangramento, dentro do qual quaisquer sintomas de sangramento na mesma localização ou injeções com menos de ou igual a 72 horas de intervalo, foi considerado o mesmo episódio de
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145/162 sangramento. Os episódios de sangramento vão ser monitorados durante urn periodo de tempo de até a semana 104.
[00397] Outra medida do resultado secundário é o número de participantes com eventos adversos emergentes do tratamento (EAs) e eventos adversos graves emergentes do tratamento (EAGs). Um EA é qualquer ocorrência médica desagradável que não tem necessariamente uma relação causal com este tratamento. Um EAG é qualquer ocorrência médica desagradável que em qualquer dose: resulta em óbito; na visão do Pesquisador, coloca o participante em risco imediato de óbito (um evento que apresente risco de vida); requer internação hospitalar ou prolongamento de hospitalização existente; resulta em deficiência/incapacidade persistente ou importante; resulta em uma anomalia congênita/um defeito de nascença; qualquer outro evento medicamente importante que, na opinião do Pesquisador, pode comprometer o participante ou pode requerer intervenção para evitar um dos outros resultados listados na definição. Os EAs e os EAGs serão medidos por um período de tempo de cerca de 2 anos.
[00398] Outra medida de resultados secundários é o número de dias afastado do trabalho ou da escola. O número de dias perdidos da escola ou do trabalho será resumido descritivamente, durante um período de tempo de até a semana 104.
[00399] Outra medida de resultados secundários é o número de dias de hospitalização. O número de dias de hospitalização vai ser resumido descritivamente e monitorado durante um período de tempo de até a semana 104.
[00400] Outra medida de resultados secundários é a aderência ao regime de tratamento, a qual é definida como percentagem de doses admi
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146/162 nistradas versus doses planejadas, e a qual é monitorada durante um periodo de tempo de até a semana 104.
[00401] Outra medida de resultados secundários é o consumo de rFVIHFc. O consumo vai ser avaliado com base na quantidade de tratamento do estudo administrado, e o consumo vai ser monitorado durante um período de tempo de até a semana 104.
[00402] O presente estudo será direcionado para participantes do sexo masculino de qualquer idade diagnosticados com hemofilia A severa (conforme confirmado pelo registro médico). O indivíduo vai ter sido diagnosticado com alto título de inibidores (pico histórico maior do que ou igual a (>) 5 unidades biológicas por mililitro (UB/mL), de acordo com os registros médicos), e os indivíduos vão ter sido previamente tratados com qualquer FVIII derivado do plasma ou recombinante convencional ou de Meia-Vida Prolongada. Os critérios de exclusão incluem indivíduos que tenham qualquer outro ou quaisquer outros distúrbios da coagulação além de hemofilia A; qualquer terapia de indução de tolerância Imune (ITI) prévia; um histórico de hipersensibilidade ou anafilaxia associada com qualquer administração de fator de coagulação recombinante VIII Fc (rFVIHFc); qualquer função renal anormal (creatinina sérica maior do que 2,0 miligramas por decilitro [mg/dL]) conforme avaliado pelo laboratório local; e/ou alanina aminotransferase ou aspartato aminotransferase sérica > 5 x limite superior do normal (ULN) conforme avaliado pelo laboratório local.
EXEMPLO 4 [00403] Uma revisão de gráficos retrospectiva e não intervencional de ITI com rFVIHFc em pacientes com hemofilia A severa e alto título de inibidores (HTI; >5 UB) foi conduzida em 10 locais nos Estados Unidos e no Canada entre 1o. de julho de 2014, e 11o. de junho de 2017. Foram inclu
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147/162 idos pacientes do sexo masculino de todas as idades, com hemofilia A severa com HTI, os quais tinham iniciado tratamento com rFVIIIFc para ITI, quer como terapia primária quer de resgate, independente da resposta.
[00404] Depois de aprovação regulatória institucional, informação clínica de-identificada foi coletada por meio de uma pesquisa eletrônica. Os pacientes tratados pela primeira com ITI foram considerados em alto risco para fracasso da ITI de acordo com os critérios listados anteriormente. Título Bethesda negativo foi definido como <0,6 UB. Tolerização foi definida como título Bethesda negativo e recuperação de FVIII (>66%) e meia-vida (>6 horas) normais. O objetivo primário deste estudo foi reportar as características clínicas e os resultados de ITI usando rFVIIIFc. Os resultados estão resumidos usando estatística descritiva; não foi conduzida análise estatística Inferenclal.
Resultados
População do Estudo [00405] Foram identificados dezenove pacientes. Destes, sete estavam recebendo ITI pela primeira vez e 12 estavam sendo submetidos a ITI de resgate (Tabelas 1 e 2). A idade média no início da ITI com rFVIIIFc foi 1,3 anos (faixa de: 0,8 a 4,3 anos) para ITI pela primeira vez e 6,4 anos (faixa de: 1,6 a 12,6 anos) para pacientes com ITI de resgate.
[00406] Os pacientes de ITI pela primeira vez tiveram um título de inibidores histórico de pico mediano (pré-ITI) de 151 UB (faixa de: 11 a 1126 UB); o titulo de inibidores mediano no início de ITI de rFVIIIFc foi de 52 UB (faixa de: 3 a 1126 UB). No início da ITI, seis de sete pacientes de ITI pela primeira vez tiveram títulos >10 UB; quatro destes seis tiveram títulos >50 UB. O tempo mediano do diagnóstico de inibidores até o início da ITI de rFVIIIFc foi de 4,4 semanas (intervalo de: 0 a 41 semanas).
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148/162 [00407] Para padentes com ITI de resgate, o número médio de cursos de ITI anteriores com outros produtos de FVIil fol de 2,6 (faixa de: 1 a 5) e o tempo mediano do diagnóstico de inibidores até o início da ITI de rFVHIFc foi de 5,5 anos (faixa de: 0,8 a 12 anos). Os genótipos de FVIil para 18 dos 19 pacientes são mostrados nas Tabelas 1 e 2.
Resultados dos pacientes de ITI pela primeira Vez [00408] Por ocasião da coleta de dados, quatro dos sete pacientes que estavam sendo submetidos a ITI pela primeira vez (Tabela 1) foram tolerizados e fizeram a transição para profilaxia com rFVHIFc. Três destes quatro pacientes atingiram um título Bethesda negativo e recuperação e meia-vida de FVIil normais; deste modo, eles atenderam à definição padrão de tolerização em 5, 7, e 9 meses. O quarto paciente foi considerado toierizado pelo médico responsável pelo tratamento em 14,8 meses com base em um título de inibidores negativo e fazendo a transição para profilaxia; por ocasião da coleta de dados aquele paciente tinha 13 meses pós conclusão de ITI de rFVHIFc e continuou a ter um inibidor negativo em profilaxia com rFVHIFc. Também foi reportada uma meia-vida normal naquela ocasião.
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Tabela 1: Pacientes recebendo ITI pela primeira vez.
Paciente Genótipo Pico histórico dos tituios de inibidores (UB/mL) Títulos de inibidores pré-ITi de rFVIIIFc (UB/mL) Tempo do título Bethesda positivo até 0 início da ITI (semanas)
11 missense 51,7 51,7 10,9
2 Frameshift 150,9 106,9 13,0
3 NR 1126 1126 1,1
4 I-22 11 11 4,4
15 I-22 388 32 41,0
6 I-22 378,7 378,1 1,0
173 I-22 30 3 0,0
Tabela 1: -continuação-
Paciente Genótipo Regime de ITI de rFVIIIFc Títuio atual (UB/mL) Tempo para títuio Bethesda negativo (semanas) Tempo para Tolerização (semanas) Estado atuai
1 missense 85 Ul/kg diariamente <0,6 4 21 Profilaxia com rFVIIIFc
2 Frameshift 100 Ul/Kg diariamente <0,6 24 29 Profilaxia com rFVIIIFc
3 NR 200 Ul/kg diariamente <0,6 31 38 Profilaxia com rFVIIIFc
4 I-22 50 Ul/kg 3x/wk <0,6 64 64 Profilaxia com rFVIIIFc
5 I-22 102 Ul/kg EOD 18 NA N/A ITI com rFVIIIFc
6 I-22 96 Ul/kg diariamente 23 NA N/A ITI com rFVIIIFc
7a I-22 83 Ul/kg diariamente 16 NA N/A ITI com rFVIIIFc
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150/162 [UB, unidades Bethesda; EOD, a cada dois dias; 1-22, inversão do intron 22; ITI, indução de tolerância imune; NR, não reportado; N/A, não aplicável; rFVIHFc, proteína de fusão de fator VIII recombinante Fc. Tempo para tolerização com base no relatório médico, título Bethesda resolvido, recuperação e meia-vida normais. O paciente 4 nâo teve informações sobre recuperação e meia-vida disponíveis, mas foi reportado como tolerizado pelo médico e trocado para profilaxia com rFVIHFc. aRecebeu rituximab. Entre os quatro pacientes, o tempo mediano para atingir um título Bethesda negativo foi de 27,7 semanas (faixa de: 4,1 a 64 semanas). O regime de ITI para três dos quatro pacientes tolerizados consistiu de rFVIHFc diariamente (85 a 200 Ul/kg) comparado com dosagem três vezes por semana (50 Ul/kg) para o quarto paciente (Tabela 1). O tempo mediano para tolerização reportada foi de 33,9 semanas (7,8 meses; faixa de: 21 a 64 semanas) para todos os quatro pacientes. Para os três pacientes tratados com rFVIHFc diariamente (85 a 200 Ul/kg), a tolerização tomou 29 semanas (6,7 meses; faixa de: 20,6 a 38 semanas), no entanto o quarto paciente tratado com 50 Ul/kg três vezes por semana tolerizou em 64 semanas (14,8 meses).
[00409] Dos pacientes restantes (n=3), dois tiveram uma diminuição no título Bethesda (de 32 para 18 UB e 378 para 23 UB depois de 18 e 58 semanas de ITI, respectivamente). Por ocasião desta revisão, um paciente teve um aumento no título Bethesda (de 3 para 16 UB depois de 15 semanas de ITI); este paciente esteve em tratamento e sem tratamento ITI e teve interrupções do rFVIHFc e baixa aderência de acordo com o relatório do médico responsável pelo tratamento (Tabela 1). Todos os sete pacientes com ITI pela primeira vez continuam em ITI de rFVIHFc ou profilaxia.
Resultados de pacientes de ITI de resgate [00410] Sete de 12 pacientes que estavam sendo submetidos a ITI de resgate (Tabela 2) inicialmente atingiram negatividade de Bethesda
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151/162 com ITI de rFVIIIFc. O tempo para atingir um título negativo foi de 14,1 semanas (faixa de: 3 a 67,6 semanas). Três destes sete pacientes permanecem negativos para Bethesda e continuam em ITI de rFVIIIFc ou em desmame de rFVIIIFc para profilaxia. Os outros quatro pacientes os quais inicialmente obtiveram um título negativo posteriormente desenvolveram um título >0,6 UB. Destes, dois continuam em ITI de rFVIIIFc e dois foram transferidos para ITI com outros fatores (Tabela 2).
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Tabela 2: Pacientes recebendo ITI de resgate.
Paciente Genótipo Número de tratamentos com ITI prévios Pico histórico de títulos de mibidores(UB/mL) Títulos de inibidores antes de ITI de rFVIIIFc (UB/mL)
8 i-22 5 250 9
9 i-22 2 67 4
10 Grande deleção 2 70 35
11 I-22 1 178 1
12a I-22 2 460 200
13 I-22 3 41,8 22
14a Non-sense 2 306 129
15 i-22 1 35 36
16 i-22 3 11 1
17 i-22 2 8 0,6
18 Grande deleção 4 1024 237
19 Non-sense 4 409 26
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Tabela 2: -continuação-
Paciente Genótipo Regime de ITI de rFVIIIFc Título atual (UB/mL) Tempo para título Bethesda negativob (semanas) Estado atual
8 i-22 202 Ul/kg diariamente <0,6 28 Desmame da ITI de rFVIIIFc
9 i-22 150 Ul/kg diariamente <0,6 3 OutralTI
10 Grande deleção 200 Ul/kg EOD <0,6 31 ITI de rFVIIIFc
11 i-22 100 Ui/kg 3x/semana <0,6 14 ITI de rFVIIIFc
12a i-22 150 Ul/kg diariamente 2 13 Outra ITI
13 I-22 130 Ul/kg diariamente 16 68 ITI de rFVIIIFc
14a Non-sense 100 Ul/kg diariamente 23 13 ITI de rFVIIIFc
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Paciente Genótipo Regime de IT! de rFVIHFc Título atuai (UB/mL) Tempo para título Bethesda negativo* (semanas) Estado atual
15 I-22 200 Ul/kg EOD 22 NA ITI de rFVIIIFc
16 I-22 100 Ul/kg EOD 0,9 NA ITI de rFVIIIFc
17 I-22 115 Ul/kg EOD 1,2 NA ITI de rFVIIIFc
18 Grande deleção 100 Ul/kg diariamente 1024 NA ITI de rFVIIIFc
19 Non-sense 100 Ul/kg diariamente 166 NA Terapia de bypass
UB, unidades Bethesda; EOD, a cada dois dias; 1-22, inversão do intron 22; ITI, indução de tolerância imune; rFVIHFc, proteína de fusão de fator VIII recombinante Fc; wk, semana. aRecebeu rituximab; bTempo para título Bethesda nega tivo representa tempo a partir do início de ITI de rFVIHFc até primeiro relatório de título negativo; título atual >0,6
UB/mL pode representar recidiva.
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154/162 [00411] Dos sete pacientes que atingiram negatividade Bethesda, três também obtiveram recuperação de FVIII normal em 3, 14, e 65 semanas e um quarto paciente atingiu meia-vida de FVIII normal em 27 semanas. Recuperação e meia-vida não estavam disponíveis em outros (Tabela 2). Dos cinco pacientes restantes, um teve uma diminuição no título Bethesda (de 36 para 22 UB depois de 10 semanas) e quatro tiveram o título Bethesda ou permaneceram inalterado ou aumentado enquanto em ITI (Tabela 2). Destes cinco pacientes, quatro continuam em ITI de rFVIIIFc e um foi removido da ITI e colocado em terapia de bypass isolada.
Resultados da dosagem, utilização de agente de bypass, e status do tratamento atual [00412] A população de pacientes avaliada neste estudo recebeu uma ampla gama/timing de doses (Tabelass 1 e 2). Foi vista uma tendência para rápidos títulos de inibidores negativos com maiores doses administradas diariamente. Cinco de cinco pacientes (uma ITI pela primeira vez e quatro ITI de resgate) os quais receberam uma dose de rFVIIIFc diária de >130 Ul/kg atingiram um título Bethesda negativo em uma mediana de 28 semanas. Dezoito de 19 pacientes usaram agentes de bypass concomitantemente com ITI de rFVIIIFc; quatorze estavam essencialmente em profilaxia (9 com aPCCs e 5 com rFVIIa) e quatro foram tratadas sob demanda com rFVIIa.
[00413] Do total, 16 de 19 pacientes permaneceram em rFVIIIFc (profilaxia ou ITI) por ocasião da coleta de dados (Tabelass 1 e 2).
Segurança [00414] Não foram reportados eventos adversos, incluindo nenhum tromboembolismo. Foram realizadas seis cirurgias, todas as quais sem interrupção da ITI de rFVIIIFc (sinovectomia do joelho, evacuação neurocirúrgica intracraniana, e quatro substituições do tipo Port-A-Cath).
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Terapia de bypass foi utilizada em todas. Os títulos de inibidores durante as cirurgias não foram coletados para este estudo.
Conclusões [00415] Coletivamente, estes resultados mostram que é possível ΙΤΙ com rFVIIIFc e pode resultar em erradicação de inibidores e ΙΤΙ bemsucedida em muitos pacientes (alto risco para fracasso do ITI) que estavam sendo submetidos a ΙΤΙ pela primeira vez e em alguns pacientes que estavam sendo submetidos a ITI de resgate. Além disso, ΙΤΙ de rFVIIIFc demonstrou uma rápida diminuição nos títulos Bethesda e um rápido tempo para tolerização na maior parte dos pacientes recebendo ITI pela primeira vez apesar de seu perfil de risco. Para ITI de resgate, é mais difícil tirar conclusões uma vez que a maioria destes pacientes ainda estavam sendo submetidos a ITI com rFVIIIFc por ocasião da coleta de dados. No entanto, alguns pacientes recebendo tratamento de resgate não pareceram obter benefício terapêutico pelo fato de que ou atingiram negatividade Bethesda ou apresentaram quedas significativas nos títulos de inibidores. Este foi particularmente o caso quando foi administrada diariamente maior dosagem de rFVIIIFc (>130 Ul/kg). EXEMPLO 5 [00416] A principal complicação da terapia de reposição com fator em hemofilia A é a formação de inibidores (anticorpos antifator VIII neutralizantes) em ~30% dos pacientes com hemofilia A severa. O desenvolvimento de inibidores impacta a eficácia do tratamento, bem como a qualidade de vida dos indivíduos afetados. O entendimento adicional de como o sistema imune responde ao fator III recombinante (rFVIII) é um esforço em andamento da pesquisa sobre hemofilia para erradicar inibidores de modo eficaz. A proteína de fusão rFVIII Fc de meia-vida prolongada (rFVIIIFc) é uma terapia eficaz e bem tolerada para prevenir e controlar episódios de sangramento. A região Fc desta molécula não somente é responsável por aumentar a meia-vida da rFVIII, mas
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156/162 pode promover tolerância antígeno-específica, conforme mostrado em um modelo animal pré-clínico (Krishnamoorthy S, et al., Ce// Immunol. 301:30-39 (2016)) e conforme sugerido por relatórios de casos de indução de tolerância imune (Groomes CL, et al., Pediatr Blood Cancer 63(5)-.922-24 (2016); Malec LM, et al., Haemophilia 22(6):e552-e554 (2016); Ragni MV, et al., Haemophilia 22(5):e462-e464 (2016)).
Métodos [00417] APCs humanas derivadas do sangue periférico ou células monocíticas THP-1 foram utilizadas para investigar os efeitos de rFVIIIFc sobre a ligação de FcyR, internalização, sinalização e produção de citocinas, e modificações na expressão genética, bem como interações subsequentes e efeitos sobre células T in vitro (FIG. 1). Resultados [00418] A diminuição da expressão superficial celular de FcyR indica internalização depois de tratamento com rFVIIIFc (FIGs. 2A a 2C). Macrófagos derivados de monócitos e células dendríticas foram tratados com complexos imunes de peroxidase de raiz forte (HRP-IC) como controle positivo, imunoglobulina G1 humana (lgG1) como controle negativo, e com fator VIII recombinante (rFVIII) ou proteína de fusão rFVIII Fc (rFVIIIFc) em concentrações equimolares (200 nM) por 24 horas. A expressão superficial celular dos receptores Fey (FcyR) CD16 (FIG. 2A), CD32 (FIG. 2B), e CD64 (FIG. 2C) foi medida por citometria de fluxo (n=3; **P<0,01, ***P<0,005, significância para HRP-IC para outros tratamentos não mostrada). O tratamento com rFVIIIFc se correlacionou com diminuição da expressão superficial celular de CD16 (FIG. 2A), CD32 (FIG. 2B), e CD64 (FIG. 2C), em comparação com expressão superficial depois de tratamento com rFVIII.
[00419] rFVIIIFc engata FcyR e induz sinalização em monócitos e macrófagos, sem produção de citocinas pró-inflamatórias subsequente (FIGs. 3A a 3C). A linhagem celular monocítica THP-1, monócitos,
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157/162 macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, e células dendríticas derivadas de monócitos do sangue periférico foram tratados com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc por 15 minutos (FIG. 3A). A fosforilação de Syk foi medida em lisados celulares usando a plataforma MSD (n=3 a 7, *P<0,05). A fosforilação de Syk foi medida depois do tratamento de macrófagos com rFVIIIFc (WT), com rFVIIIFc mutante que é incapaz de ligar ao receptor Fc neonatal (FcRn mutante), ou com rFVIIIFc mutante que é incapaz de ligar ao FcyR (FcyR mutante) (n-4, *P<0,05) (FIG. 3B). A produção de citocinas pró-inflamatórias dos macrófagos tratados por vinte e quatro-hora foi medida por MSD ELISA (n=4, significância não mostrada) (FIG. 3C).
[00420] rFVIIIFc fosforila moléculas que fazem parte na imunorregulação, ao invés de moléculas que têm função na ativação e produção de citocinas pró-inflamatórias (Tabela 3 e FIG. 4). Proteínas fosforiladas em lisados de macrófagos derivados de monócitos tratados com rFVIIIFc por quinze minutos foram consultadas usando as matrizes Proteome Profiler de fosfo-quinases e fosfo-imunorreceptores. Uma lista de moléculas fosforiladas em macrófagos tratados com rFVIIIFc identificadas pelos testes Proteome Profiler é mostrada na Tabela 3. A fosforilação de fosfatases responsáveis por sinalização inibitória foi medida usando a plataforma MSD (n=3; **P<0,01, ***P<0,005) (FIG. 4).
Tabela 3: Moléculas fosforiladas em macrófagos tratados com rFVIIIFc identificados por alguns testes Proteome Profiler.
Proteínas Fosforiladas
Imimorreceptores ILT6/CD85e NKp46/NCR1 FCH5/IRTA2 ω ω «3 G □ <0 SRC STAT5
KIR2DL4 SiglecS Siglec2/CD22 CREB eJun
SLAMF8 SLAMF4 CDCIR/CLEC4a pRAS40 p53
FcyRHIA/B FcyRIIA DECTIN-1/CLEC7a ERK1/2 WNK1
PECAM/CD31 FCRH4/IRTA1 KNKp44/NCR2 HSP27 p70S6
CLEC-2 SHP2 Siglec7 JNK.1/2/3 FAK
TREM2 ILT2/CD85] SLAMF5 ΑΜΡΚα2 GSK-3g/B
SHP1 ILT3/CD85k Sigiec3/CD33 STAT2 RSK1/2/3
TREML1/TLT-1 ILT4/CD85d Siglecõ STAT6 p53
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158/162 [00421] rFVIIIFc induz padrão de expressão genética característico de macrófagos tolerogênicos (FIGs. 5A a 5G). Sequenciamento de RNA exploratório foi realizado sobre macrófagos derivados de monócitos tratados com lgG1, rFVIII, ou rFVIIIFc por seis horas (n=3) para genes que foram significativamente sub-regulados (FIG. 5A) e para genes que foram significativamente supra-regulados (FIG. 5B), e uma análise de via foi realizada sobre os genes supra-regulados com rFVIIIFc para investigar as vias moleculares representadas seletivamente nestas células, comparadas com células tratadas com rFVIII (Tabela 4). Foi visto que vários genes das vias de NRF2 e PPARgama estão supra-regulados, bem como vários outros imunorreguladores (FIG. 5H). Genes selecionados das vias de NRF2 e do metabolismo dos lipídeos foram validados por Q-PCR (n-8; *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,005) (FIGs. 5C a 5G). Além disso, foi visto que macrófagos educados com rFVIIIFc apresentam um fenótipo similar a M2 característico (FIGs. 5i a 5M). Em particular, macrófagos tratados com rFVIIIFc tiveram maior expressão de CD206 relativa do que células tratadas com rFVIII depois de 6 horas (FIG. 5I) e depois de 24 horas (FIG. 5J), e macrófagos tratados com rFVIIIFc tiveram maior expressão de ARG1 relativa do que células tratadas com rFVIII depois de 24 horas (FIG. 5M).
Tabela 4: Análise das vias de operação sobre os genes supraregulados com rFVIIIFc para investigar as vias moleculares representadas seletivamente nestas células, comparadas com células tratadas com rFVIII.
Nome da Via Tamanho do Conjunto Candidatos Contidos F-valor q-valor
Via NRF2 142 10 (7,0%) 4,07e-06 0,000273
metabolismo de lipoproteínas 68 7 (10,3%) 1,01e-05 0,000338
Digestão, mobilização, e transporte de lipídeos 110 8 (7,3%) 3,06e-05 0,000684
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Nome da Via Tamanho do Conjunto Candidatos Contidos P-valor q-valor
Metabolismo de cisteína e metionina-Homo sapien (humano) 45 5 (11,1%) 0,00013 7 0,00229
Rede de fator de transcrição C-MYB 86 6 (7,0%) 0,00038 9 0,00521
Meta-vía de receptores nucleares 316 11 (3,5%) 0,00081 3 0,00908
[00422] Células de apresentação antigênica tratadas com rFVIIIFc influenciam a diferenciação de células T regulatórias que requer contato APC-célula T-célula (FIGs. 6A a 6C). Macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico foram tratados com lgG1, rFVIII, ou rFVIIIFc, em seguida colocados em cocultura com células T CD4 positivas naive isoladas a partir do sangue periférico do mesmo doador. Depois de seis dias em cocultura (FIG. 6A), a percentagem de células T regulatórias (CD4+ CD25+ FoxP3+) foi quantificada usando citometria de fluxo (n=4) (FIG. 6B). A percentagem de células T regulatórias também foi quantificada quando células T naive foram cultivadas nos meios condicionado de APCs pré-tratadas com lgG1, rFVIII, ou rFVIIIFc (n=4) (FIG. 6C).
Conclusão [00423] rFVIIIFc parece ligar e induzir internalização e sinalização através de receptores Fcy sobre APCs. Esta sinalização não se traduz em produção de citocinas pró-inflamatórias e não ativa as APCs (dados não mostrados). Eventos de sinalização imunomoduladora são iniciados depois de tratamento com rFVIIIFc. Estes eventos parecem dirigir a diferenciação de macrófagos para um fenótipo similar a M2 caracterizado pela supra-regulação de vias de NRF2 e PPARy (FIG. 5H), bem como a supra-regulação de moléculas de CD206 e de arginase 1. Vários outros imunorreguladores também apresentaram expressão aumentada, ao passo que no mínimo a subunidade beta solúvel da guanilato ciclase 1 (2GUCY1B2), a protoporfirinogênio oxidase
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160/162 (PPOX), e o supressor de sinalização de citocinas 3 (SOCS3) apresentaram expressão diminuída em células tratadas com rFVHIFc (FIG. 5H). Estes macrófagos podem executar os efeitos imunológicos benéficos previamente reportados, tais como diferenciação de células T regulatórias, tolerização a FVIil, e redução de inibidores anti-FVIII (FIG. 7). EXEMPLO 6 [00424] Dados precoces pré-clínicos e clínicos indicam que rFVHIFc pode permitir um tempo relativamente curto para título de inibidores negativos quando utilizado para tratamento de ITI, possivelmente devido a efeitos imunomoduladores atribuídos ao domínio Fc da molécula. De modo a obter dados clínicos mais robustos, foi desenvolvido um protocolo padronizado. O esquema do estudo é apresentado aqui.
[00425] RelTIrate (NCT03103542), um estudo aberto, prospective, intervencional, multicêntrico, visa registrar 20 pacientes com inibidores e HA severa, de todas as idades, que falharam em tentativas de ITI prévias. A finalidade primária do estudo é descrever o resultado de ITI realizada com rFVHIFc dentro de um frame de tempo de 60 semanas. O desfecho primário será o sucesso da ITI; e os desfechos secundários avaliados durante o tratamento com ITI vão incluir tempo para sucesso da ITI, ocorrência de recidiva, número de sangramentos, consumo de rFVHIFc, dias de absenteísmo na escola ou no trabalho, hospitalizações e aderência. O tratamento com ITI vai compreender rFVHIFc a 200 Ul/kg/dia (uma vez ao dia ou dividido em duas doses diárias) por um máximo de 60 semanas. Depois de ter sido atingida tolerância, segue-se um período de redução gradual de dose de 16 semanas e um seguimento de 32 semanas com rFVHIFc administrado profilaticamente. Os critérios de sucesso vão incluir título de inibidores negativo (<0,6 Unidade Bethesda), recuperação incrementai >66% da esperada, e meia-vida terminal de >7 horas.
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161/162 [00426] A FIG. 8 mostra os efeitos propostos de rFIXFc sobre macrófagos. rFVIllFc parece ligar e induzir internalizaçâo e sinalização através dos receptores Fcy sobre APCs. Esta sinalização não se traduz em produção de citocinas pró-inflamatórias e não ativa as APCs. Ao contrário, eventos de sinalização imunomoduladora são iniciados depois de tratamento com rFVIHFc. Estes eventos parecem acionar a diferenciação de macrófagos para um fenótipo ‘semelhante a Mox/M2’ caracterizado pela supra-regulação das vias de NRF2 e PPARy.
[00427] A descrição precedente das modalidades especificas vai revelar tão plenamente a natureza geral da invenção que outras pessoas, aplicando conhecimento dentro da habilidade da técnica, podem prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações as modalidades específicas referidas, sem indevida experimentação, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, pretende-se que as adaptações e modificações referidas estejam dentro do significado e do alcance de equivalentes das modalidades reveladas, com base nos ensinamentos e na orientação apresentados aqui, neste pedido de patente. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui, neste pedido de patente, é para fins de descrição e não de limitação, de tal modo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação deve ser interpretada pelo versado à luz dos ensinamentos e orientação.
[00428] Outras modalidades da invenção vão ser evidentes para os versados na técnica a partir de consideração da especificação e da prática da invenção revelada aqui, neste pedido de patente. Pretendese que a especificação e os exemplos sejam considerados como exemplares somente, com o verdadeiro âmbito e espírito da invenção sendo indicado pelas seguintes reivindicações.
[00429] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente revelados aqui, neste pedido de patente, são incorporados por meio de re
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162/162 ferência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por meio de referência.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Utilização de uma proteína quimérica, caracterizada pelo fato de que compreende um fator de coagulação e uma região Fc em um método para indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, em que (1) uma quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada ao ser humano por um período suficiente para induzir tolerância imune, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc induz tolerância imune no ser humano; e (2) depois da indução de tolerância imune, um regime de redução gradual de dose da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrado ao ser humano.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é cerca de 50 Ul/kg a cerca de 300 Ul/kg.
  3. 3. Utilização de uma proteína quimérica, caracterizada pelo fato de que compreende um fator de coagulação e uma região Fc em um método para indução de tolerância imune em um ser humano com hemofilia, em que cerca de 200 Ul/kg da proteína quimérica é administrado ao ser humano por um período suficiente para induzir tolerância imune, e em que o ser humano tenha desenvolvido um inibidor contra o fator de coagulação e tenha falhado em responder a uma ou mais terapias de tolerância imune prévias contra o fator de coagulação.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que depois de tolerância imune, é administrado ao ser humano um regime de redução gradual de dose da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.
    Petição 870190129016, de 06/12/2019, pág. 6/209
    2/4
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc compreende o Fator VIII-Fc (FVIII-Fc) ou o Fator IX-Fc (FIXFc).
  6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é administrada até ser observada tolerância imune, em que é observada tolerância imune quando o título dos anticorpos inibitórios no ser humano é menos de cerca de 0,6 UB.
  7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, e 4 a 6, caracterizada pelo fato de que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose de cerca de 50 Ul/kg a cerca de 100 Ul/kg da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.
  8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, e 4 a 7, caracterizada pelo fato de que a dose de redução gradual de dose é administrada uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, ou três vezes por semana.
  9. 9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, e 4 a 8, caracterizada pelo fato de que a dose de redução gradual de dose é administrada por no mínimo cerca de 1 semana, no mínimo cerca de 2 semanas, no mínimo cerca de 3 semanas, no mínimo cerca de 4 semanas, no mínimo cerca de 5 semanas, no mínimo cerca de 6 semanas, no mínimo cerca de 7 semanas, no mínimo cerca de 8 semanas, no mínimo cerca de 9 semanas, no mínimo cerca de 10 semanas, no mínimo cerca de 11 semanas, no mínimo cerca de 12 semanas, no mínimo cerca de 13 semanas, no mínimo cerca de 14 semanas, no mínimo cerca de 15
    Petição 870190129016, de 06/12/2019, pág. 7/209
    3/4 semanas, no mínimo cerca de 16 semanas, no mínimo cerca de 17 semanas, no mínimo cerca de 18 semanas, no mínimo cerca de 19 semanas, no mínimo cerca de 20 semanas, no mínimo cerca de 21 semanas, no mínimo cerca de 22 semanas, no mínimo cerca de 23 semanas, no mínimo cerca de 24 semanas, no mínimo cerca de 25 semanas, no mínimo cerca de 26 semanas, no mínimo cerca de 27 semanas, no mínimo cerca de 28 semanas, no mínimo cerca de 29 semanas, no mínimo cerca de 30 semanas, no mínimo cerca de 31 semanas, ou no mínimo cerca de 32 semanas.
  10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, e 4 a 9, caracterizada pelo fato de que o regime de redução gradual de dose compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc de cerca de 50 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune ou a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 100 Ul/kg uma vez ao dia da semana 1 até a semana 6 depois de tolerância imune.
  11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o regime de redução gradual de dose adicionalmente compreende a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 6 até a semana 12 depois de tolerância imune, e/ou a administração de uma dose de redução gradual de dose da proteína quimérica de cerca de 50 Ul/kg ou cerca de 100 Ul/kg uma vez a cada dois dias da semana 12 até a semana 16.
  12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, e 4 a 11, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende
    Petição 870190129016, de 06/12/2019, pág. 8/209
    4/4 a administração de uma dose profilática da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc depois do regime de redução gradual de dose.
  13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 12, caracterizada pelo fato de que o tempo para tolerância é menos de cerca de 24 semanas, menos de cerca de 23 semanas, menos de cerca de 22 semanas, menos de cerca de 21 semanas, menos de cerca de 20 semanas, menos de cerca de 19 semanas, menos de cerca de 18 semanas, menos de cerca de 17 semanas, menos de cerca de 16 semanas, menos de cerca de 15 semanas, menos de cerca de 14 semanas, menos de cerca de 13 semanas, menos de cerca de 12 semanas, menos de cerca de 11 semanas, menos de cerca de 10 semanas, menos de cerca de 9 semanas, menos de cerca de 8 semanas, menos de cerca de 7 semanas, menos de cerca de 6 semanas, menos de cerca de 5 semanas, menos de cerca de 4 semanas, menos de cerca de 3 semanas, menos de cerca de
    2 semanas, ou menos de cerca de 1 semana.
  14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 13, caracterizada pelo fato de que o FVIII compreende um FVIII com o domínio B deletado.
  15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a administração da proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc resulta em um menor tempo para tolerância no ser humano em comparação com o tempo para tolerância em um ser humano depois de tratamento com um fator de coagulação isolado.
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