DE669986T1 - Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung. - Google Patents

Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.

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DE669986T1 DE0669986T DE94901599T DE669986T1 DE 669986 T1 DE669986 T1 DE 669986T1 DE 0669986 T DE0669986 T DE 0669986T DE 94901599 T DE94901599 T DE 94901599T DE 669986 T1 DE669986 T1 DE 669986T1
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Claims (30)

EP 94 90,599.4 Q669 Patentansprüche
1. Expressionsvektor zur Expression eines interessierenden Proteins durch rekombinante Desoxyribonucleinsäuretechniken, wobei der Vektor wenigstens einen dominanten Selektionsmarker aufweist, in dem die Translations-Initiationsstelle des Markers die folgende Sequenz aufweist:
-3 +1
Pyxx ATG Pyxx ,
worin "Py" ein Pyrimidin-Nucleotid ist; "x" ein Nucleotid; und sich die zahlenmäßige Zuordnung auf das Kodon "ATG" bezieht.
2, Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäuresequenz, die für das interessierende Protein codiert, mit dem genannten dominanten Selektionsmarker mitverknüpft ist (colinked).
0
3. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der dominante Selektionsmarker aus der Gruppe bestehend aus: Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase, Adenosindeaminase, Asparaginsynthetase, Salmonella-his-D-Gen, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase und Neomycin-Phosphotransferase ausgewählt ist.
4. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die Translationsinitiations-Startsequenz aus der Gruppe bestehend aus TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx und TxxATGTxx ausgewählt ist, wobei "x" ein Nucleotid ist, mit der Maßgabe, daß das Kodon "Txx" abwärts des ATG-Kodons kein Stopkodon codiert.
5.'" Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die Translationsinitiations-Startsequenz TxxATGCxx ist, wobei "x" ein Nucleotid " ist.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Translationsinitiations-Startsequenz TCCATGCTT ist.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Translationsinitiations -Start sequenz innerhalb einer Sekundärstruktur lokalisiert ist.
5
■8. Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Translationsinitiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von etwa 1000 Nucleotiden vom ATG Startkodon der genannten Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß innerhalb dieser 1000 Nucleotide kein innerhalb des Leserahmens liegendes (inframe) Stopkodon lokalisiert ist.
9. Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Translationsinitiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von etwa 35 0 Nucleotiden vom ATG-Startkodon der genannten Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß kein innerhalb des .Leserahmens liegendes (in-frame) Stopkodon innerhalb dieser Nucleotide gelegen ist.
10. Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die Translationsinitiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von etwa 5 0 Nucleotiden vom ATG-Startkodon der genannten Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß kein innerhalb des Leserahmens liegendes (in-frame) Stopkodon innerhalb dieser 5 0 Nucleotide gelegen ist.
11. Expressionsvektor nach Ansprüchen 8, 9 und 10, wobei das außerhalb des Leserahmens liegende (out-of-frame) Startkodon Teil einer Kozak-Konsensussequenz ist.
12. Expressionsvektor nach Anspruch-10, worin das außerhalb des Leserahmens liegende (out-of-frame) Startkodon und die TransIationsinitiations-Startsequenz beide als Teil in eine Sekundärstruktur eingebunden sind.
13. Expressionsvektor nach Ansprüchen 8, 9, 10, worin die Translationsinitiations-Startsequenz Teil einer Sekundärstruktur ist und das außerhalb des Leserahmens liegende (out-offrarae) Startkodon nicht Teil dieser Sekundärstruktur ist."
14. Dominanter Selektionsmarker, codiert durch eine Nucleinsäuresequenz, worin die Translations-Initiationssteile des dominanten Selektionsmarkers aus der Gruppe bestehend aus TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx und TxxÄTGTxx ausgewählt ist, wobei "x" ein Nucleotid ist, mit der Maßgabe, daß "Txx" abwärts des ATG-Kodons kein Stopkodon codiert.
15. Material nach Anspruch 14, worin der dominante Selektionsmarker aus der Gruppe bestehend aus Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase, Adenosindeaminase, Asparaginsynthetase, Salmonellahis-D-Gen, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase und Neomycin-Phosphotransferase, ausgewählt ist.
16. Material nach Anspruch 14, worin die Translations-
' initiations-Startsequenz TxxATGCxx ist, wobei "x" ein Nucleotid ist.
17. Material nach Anspruch 14, worin die Translationsinitiations-Startsequenz TCCATGCTT ist.
18. Material nach Anspruch 14, worin die
Translationsinitiations-Startsequenz innerhalb einer Sekundärstruktur lokalisiert ist.
30
19. Material nach Anspruch 14, worin die -Translationsinitiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von 10 00 Nucleotiden vom ATG-Startkodon der Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß kein innerhalb des Leserahmens liegendes (in-frame) Stopkodon innerhalb dieser 1000 Nucleotide gelegen ist.
20. Material nach Anspruch 14, worin die Translationsinitiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von etwa 35 0 Nucleotiden vom ATG-Startkodon der genannten" Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß kein innerhalb des Leserahmens liegendes (ih-frame) Stopkodon innerhalb dieser Nucleotide gelegen ist.
21. Material nach Anspruch 14, worin die Translations-
initiations-Startsequenz zusätzlich wenigstens ein außerhalb des Leserahmens liegendes (out-of-frame) Startkodon innerhalb von etwa 5 0 Nucleotiden vom ATG-Startkodon der genannten Startposition aufweist, mit der Maßgabe, daß kein innerhalb des Leserahmens liegendes (in-frame) Stopkodon innerhalb dieser 50 Nucleotide gelegen ist.
22. Material nach Ansprüchen 19, 20 und 21, worin das außerhalb des Leserahmens liegende (out-of-frame) Startkodon Teil einer Kozak-Konsensussequenz ist.
23. Material nach Anspruch 21, worin das außerhalb des Leserahmens liegende (out-of-frame) Startkodon und die Translationsinitiations-Startsequenz beide als Teil in eine Sekundärstruktur eingeschlossen sind.
24. Material nach Ansprüchen 19, 20, 21, worin die Translationsinitiations-Startsequenz Teil einer Sekundärstruktur ist und das außerhalb des Leserahmens liegende (out-offrame) Startkodon nicht Teil derselben Sekundärstruktur ist.
25. Expressionsvektor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ANEX 1 (enthalten in American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 69120) und ANEX 2 (enthalten in ATCC Hinterlegungsnummer 69118) .
26. Plasmid, das den Expressionsvektor nach Anspruch 1 auf-
" weist, worin die Nucleinsäuresequenz, die für das interessie-
rende Protein codiert, mit dem genannten dominanten Selektionsmarker mitverbunden (co-linked) ist.
27. Plasitdd nach Anspruch 26, integriert in der zellulären Desoxyribonucleinsäure einer Säuger-Wirtszelle.
28. Plasmid nach Anspruch 27, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe bestehend aus DG44, DXBIl, CVl, COS, R1610, SP2/0, P3x633-Ag8.653, BFA-IcIBPT, RAJI und 293 ausgewählt ist.
29. Expressionsvektor nach Anspruch 1, der zusätzlich einen künstlichen intronischen Insertionsbereich innerhalb des dominanten Selektionsmarkers enthält, wobei eine codierende Sequenz für ein interessierendes Protein innerhalb des genannten Insertionsbereiches lokalisiert ist.
30. Dominanter Selektionsmarker nach Anspruch 14, der zusätzlich einen künstlichen intronischen Insertionsbereich aufweist.
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