ES2088838T3 - Secuencias kozak de consenso totalmente alteradas destinadas a la expresion en los mamiferos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN AQUI SECUENCIAS KOZAK DE CONSENSO COMPLETAMENTE DETERIORADO QUE SON MAS TIPICAMENTE EMPLEADAS CON MARCADORES SELECCIONABLES DOMINANTES DE CINTAS TRANSCRIPCIONALES QUE SON UNA PARTE DE UN VECTOR DE PRESENTACION. ESTOS VECTORES SE EMPLEAN MAS TIPICAMENTE EN LA PRESENTACION DE PROTEINAS EN SISTEMAS DE PRESENTACION MAMIFERO. AQUI, SE DEFINE, DESCRIBE Y RECLAMA, UNA SECUENCIA "KOZAK DE CONSENSO COMPLETAMENTE DETERIORADO" QUE COMPRENDE LA SECUENCIA (I), DONDE: "X" ES UN NUCLEOTIDO SELECCIONADO ENTRE UN GRUPO QUE CONSISTE EN ADENINA (A), GUANINA (G), CITOSINA (C) O TIMINA (T) / URACILO (U); "PY" ES UN NUCLEOTIDO DE PIRIMIDINA, ES DECIR C O TU; "ATG" ES UN CODON CODIFICADO POR METIONINA DE ACIDO AMINO, EL LLAMADO CODON ESTRELLA; Y -3 Y +1 SON PUNTOS DE REFERENCIA DIRECCIONALES RESPECTO A ATG, ES DECIR -3 INDICA TRES NUCLEOTIDOS CORRIENTE ARRIBA DEL ATG Y +1 INDICA UN NUCLEOTIDO CORRIENTE ABAJO DEL ATG. ADEMAS SE DESCRIBEN LOS MARCADORES SELECCIONABLES DOMINANTES QUE COMPRENDEN ADEMAS REGIONES DE INSERCION INTRONICA ARTIFICIALES.

Description

Secuencias Kozak de consenso totalmente alteradas destinadas a la expresión en los mamíferos.

Secuencia de marcador selectivo dominante alterada y estrategia de insercción de intrones para potenciar la expresión de un producto génico en sistemas de vector de expresión que comprenden dicha secuencia.

Notificación 37 C.F.R. \NAK 1.74 (d)/(e) Copyrignt

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Solicitudes relacionadas

Esta patente es una continuación en parte del documento de Estados Unidos Nº de Serie 07/977.691 presentado el 13 de noviembre de 1992, en trámite. Esta patente está relacionada con ``THERAPEUTIC APPLICATION OF CHIMERIC ANTIBODY TO HUMAN B LYMPHOCYTE RESTRICTED DIFFERENTIATION ANTIGEN FOR TREATMENT OF B CELL LYMPHOMA'', (``Aplicación terapéutica de anticuerpos quiméricos a un antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos para el tratamiento de linfomas de células B'') que tiene el documento de Estados Unidos con el Nº de Serie 07/978.891, presentado el 13 de noviembre de 1992 (en trámite) y ``APLICACIÓN TERAPÉUTICA DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS Y RADIOMARCADOS AL ANTÍGENO DE DIFERENCIACIÓN RESTRINGIDO A LINFONCITOS B HUMANOS PARA EL TRATAMIENTO DE LINFOMA DE CÉLULAS B'' que tiene el Nº de Serie de Estados Unidos presentado simultáneamente con éste documento. Esta Patente se refiere al documento de Estados Unidos concedido comúnmente, con el Nº de Serie 07/912.292 y titulado ``ANTICUERPOS RECOMBINANTES PARA TERAPIA HUMANA'' presentada el 10 de julio de 1992. Estos documentos se incorporan aquí como referencia.

Como se ha indicado, la llegada de la industria de la biotecnología ha permitido la producción de grandes cantidades de proteínas. Las proteínas son los constituyentes esenciales de todas las células vivas y las proteínas comprenden combinaciones de los 20 aminoácidos naturales; cada molécula de aminoácidos se define (``codifica'') por agrupamientos (``codones'') de tres moléculas de ácido desoxirribonucleico (``ADN''); una cadena de moléculas de ADN (``macromolécula de ADN''), proporciona, esencialmente, una plantilla para la producción de secuencias de aminoácidos específicas especificadas por esa plantilla. En este proceso está implicado íntimamente el ácido ribonucleico (``ARN''); tres tipos de ARN (ARN mensajero; ARN de transferencia; y ARN ribosómico) convierten la información codificada por el ADN por ejemplo, en una proteína. De esta manera, la información genética generalmente se transfiere como se indica a continuación: ADN \rightarrow ARN \rightarrow proteína.

De acuerdo con una estrategia típica que implica la tecnología de ADN recombinante, una secuencia de ADN que codifica un material proteico deseado (``ADNc'') se identifica y se aísla a partir de una fuente natural o se produce sintéticamente. Manipulando esta pieza de material genético, sus extremos se adaptan para unirse ``ajustarse'' a una sección de una pequeña molécula circular de ADN de doble cadena. Esta molécula circular típicamente se denomina ``vector de expresión de ADN'' o simplemente ``vector''. La combinación del vector y el material genético puede denominarse ``plásmido'' y el plásmido pueden replicarse en un hospedador procariota (es decir, de naturaleza bacteriana) como una molécula de ADN circular autónoma según se replica el hospedador procariota. Posteriormente, el plásmido de ADN circular puede aislarse y producir un hospedador eucariota (es decir de naturaleza de mamífero) y se seleccionan las células hospedadoras que han incorporado el ADN plasmídico. Aunque algunos vectores plasmídicos se replicarán como una molécula de ADN circula autónoma en células de mamífero (por ejemplo plásmidos que comprenden vectores basados en el virus de Epstein Barr (``EBV'') y en el virus del Papiloma Bovino (``BPV'')), la mayoría de los plásmidos, incluyendo vectores de ADN y todos los plásmidos que incluyen vectores retrovirales de ARN, se integran en el ADN celular de tal forma que cuando se replica el ADN celular de la célula hospedadora eucariota, el ADN plasmídico también se replicará. Por consiguiente, según crecen y se dividen las células ecuariotas, hay un aumento correspondiente en las células que contienen el plásmido integrado que conduce a la producción (``expresión'') del material proteico de interés. Sometiendo las células hospedadoras que contienen el plásmido a condiciones de crecimiento favorables, se producen cantidades significativas del hospedador, y por lo tanto de la proteína de interés. Típicamente, la línea de células de ovario de hámster chino (``CHO'') se utiliza como una célula hospedadora eucariota, mientras que E. coli se utiliza como una célula hospedadora procariota.

El vector juega un papel crucial en lo indicado anteriormente - la manipulación del vector puede facilitar la variabilidad en cuanto a donde se inserta el ADNc, medios para determinar si el ADNc, de hecho, se había insertado de manera apropiada dentro del vector, las condiciones en las que se producirá o no se producirá la expresión del material genético, etc. Sin embargo, la mayoría de las manipulaciones del vector se dirigen a una sola expresión creciente deseada de un producto génico deseado, es decir, la proteína de interés. De nuevo, como se ha indicado, la mayoría de las manipulaciones del vector se realiza de forma que un vector ``mejorado'' permita la producción de un producto génico a niveles significativamente superiores en comparación con un vector ``no mejorado''. De esta forma, aunque ciertos rasgos/aspectos/características de un vector pueden parecer similares a los rasgos/aspectos/características de otro vector, a menudo es necesario examinar el resultado del objetivo total de la manipulación - una mejor producción de un producto génico de interés.

Aunque un vector ``mejorado'' puede comprender características que son deseables para una serie de circunstancias, estas características pueden no ser deseables necesariamente en otras circunstancias. Sin embargo, hay una características que es deseable para todos los vectores: una mayor eficacia, es decir, la capacidad de aumentar la cantidad de proteína de interés producida mientras que al mismo tiempo se reduce el número de células hospedadoras a seleccionar que no generan una cantidad suficiente de esta proteína. Tal mayor eficacia tendría varias ventajas deseables, incluyendo la reducción de los costes de fabricación y la reducción del tiempo empleado por los técnicos en la selección de colonias viables que están expresando la proteína de interés. Por consiguiente, lo que sería deseable y lo que mejoraría significativamente el estado de la técnica son vectores de expresión con tales características de eficacia.

Sumario de la invención

La invención descrita en este documento, satisface estas y otras necesidades. Por consiguiente, la presente invención proporciona un vector de expresión para expresar una proteína de interés por técnica de ácido desoxirribonucleico recombinantes, comprendiendo dicho vector al menos un marcador selectivo dominante, donde el sitio de inicio de la traducción de dicho marcador comprende la siguiente secuencia:

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y se selecciona entre el grupo compuesto por TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx; y TxxATGTxx; donde ``Py'' es un nucleótido de pirimidina; ``x'' es un nucleótido; y las designaciones numéricas se refieren al codón ``ATG'', con la condición de que el codón ``Txx'' cadena abajo del codón ATG no codifica un codón stop y donde una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés está unida a dicho marcador selectivo dominante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un marcador selectivo dominante codificado por una secuencia de ácido nucleico, donde el sitio de inicio de la traducción de dicho marcador selectivo dominante se selecciona entre el grupo compuesto por TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx; y TxxATGTxx, donde ``x'' es un nucleótido, con la condición de que ``Txx'' cadena abajo del codón ATG no codifique con codón stop.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión incluido dentro de la American Type Culture Collection con el número de depósito 69120 o el número de depósito ATCC 69118.

En este documento se describen secuencias Kozak consenso alteradas que se usan más típicamente con marcadores selectivos dominantes de cassettes de transcripción que son una parte de un vector de expresión; preferiblemente, el marcador selectivo dominante comprende una región de inserción intrónica natural o una región de inserción de intrónica artificial y al menos un producto génico de interés se codifica por un ADN localizado dentro de tal región de inserción.

Como se usa en este documento, un ``marcador selectivo dominante'' es una secuencia génica o una proteína codificada por esa secuencia génica; la expresión de la proteína codificada por el marcador selectivo dominante asegura que una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica el marcador selectivo dominante sobrevivirá a un proceso de selección que de otra forma destruiría a la célula hospedadora que no contiene esta proteína. Como se usa en este documento, un ``cassette de transcripción'' es un ADN que codifica para un producto proteico (por ejemplo un marcador selectivo dominante) y los elementos genéticos necesarios para la producción del producto proteico en una célula hospedadora (es decir promotor; sitio de inicio de la transcripción; región de poliadenilación; etc). Lo más preferiblemente es que estos vectores se utilicen en la expresión de proteínas en sistemas de expresión de mamíferos en los que se produce la integración del vector en el ADN de la célula hospedadora. De forma beneficiosa, el uso de tales secuencias Kozak consenso totalmente alteradas mejora la eficacia de la expresión de proteínas reduciendo significativamente el número de colonias viables mientras que al mismo tiempo se aumenta significativamente la cantidad de proteína expresada por tales colonias viables. Como se usa en este documento, una ``región de inserción intrónica natural'' es una región de ADN presente de forma natural dentro de un gen, en este caso, típicamente un marcador selectivo dominante, que puede utilizarse para la inserción de ADN que codifica un producto génico de interés; una ``región de inserción intrónica artificial'' es una región de ADN que se crea selectivamente en un gen (de nuevo, más típicamente, un marcador selectivo dominante), que puede utilizarse para la inserción del ADN que codifica un producto génico de interés. En Abrams, J.M. et al., ``Intronic Positioning Maximizes Co-expression and Co-amplification of Nonselectable Heterologous Genes''. J. Bio. Chem., 264124:14016 (1989), y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.043.270 se describe información con respecto a la colocación de intrones.

Como se define o describe y reivindica en este documento, una ``Kozak consenso totalmente alterada'' comprende las siguiente secuencia:

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donde: ``x'' es un nucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por adenina (A), guanina (G), citosina (c) o timina (T)/uracilo (U); ``Py'' es un nucleótido de pirimidina, es decir C o T/U; ``ATG'' es un codón que codifica para el aminoácido metionina, el denominado codón ``de iniciación'': y 3- y +1 son puntos de referencia direccionales con respecto a ATG, se entiende que -3 indica 3 nucleótidos cadena arriba de ATG y +1 se indica que indica un nucleótido cadena abajo de ATG.

Preferiblemente, la secuencia Kozak consenso totalmente alterada forma parte de un codón de iniciación de metionina que inicia la traducción de una porción de un marcador selectivo dominante de un cassette de transcripción de forma parte de un vector de expresión. Los marcadores selectivos dominantes preferidos incluyen, pero sin limitación: timidina, quinasa del virus del herpes simple; adenosina de desaminasa; asparagina sintetasa; gel his D de Salmonella; xantina guanina fosforribosil transferasa; higromicina B fosfotransferasa; y neomicina fosfotransferasa. Más preferiblemente, el marcador selectivo dominante es neomicina fosfotransferasa.

En realizaciones particularmente preferidas de la invención, al menos un codón de iniciación fuera de fase (es decir ATG) está localizado cadena arriba de codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado, sin que esté localizado un codón stop en fase entre el codón de iniciación cadena arriba y el codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado. Como se usa en este documento, el término ``codón stop'' se entiende que indica un codón que codifica un aminoácido de tal forma que se termine la traducción del material codificado. Esta definición incluye, en particular, los codones stop tradicionales TAA, TAG y TGA. Como se usa en este documento, las expresiones ``en fase'' y ``fuera de fase'' se refieren al codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado. A modo de ejemplo, en la siguiente secuencia:

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la porción subrayada de la secuencia representativa de una secuencia Kozak consenso totalmente alterada (donde ``x'' representa un nucleótido) y los codones GAC, CAT y GCC son codones ``en fase'' con respecto al codón de inicio ATG. Los nucleótidos subrayados anteriormente representan un codón de inicio ``fuera de fase'' que está cadena arriba de codón de inicio Kozak consenso totalmente alterado. Preferiblemente, el codón de inicio fuera de fase está dentro de aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio Kozak consenso totalmente alterado, más preferiblemente dentro de aproximadamente 350 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio Kozak consenso totalmente alterado, y aún más preferiblemente dentro de aproximadamente 50 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio Kozak consenso totalmente alterado. Preferiblemente, el codón de inicio fuera de fase es una parte de una Kozak consenso. A modo de ejemplo, la secuencia indicada anteriormente satisface estos criterios: el nucleótido-5 es una purina (G); el nucleótido -6, -7 y -8 codifica un codón de inicio fuera de fase (ATG); y el nucleótido -11 es una purina (A).

Adicionalmente, la utilización de una secuencia Kozak consenso totalmente alterada dentro de una estructura secundaria (es decir, una denominada ``tallo-bucle'' o ``orquilla'') es beneficiosamente viable a la alteración de la translocación de la proteína codificada por el número selectivo dominante. En tal realización, el codón de iniciación de la secuencia Kozak consenso totalmente alterada y más preferiblemente se localiza dentro de un tallo-bucle.

Los vectores de expresión particularmente preferidos que incorporan estos aspectos de la invención descritos en este documento se denominan vectores ``TCAE'' y ``ANEX'' y ``NEOSPLA''; los vectores particularmente preferidos se denominan ANEX 1, ANEX 2 y NEOSPLA3F.

Estos y otros aspectos de la invención descritos en este documento se subrayarán o se indicarán con más detalle en las secciones indicadas a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1, proporciona la porción relevante de una secuencia Kozak consenso y varias secuencias Kozak consenso totalmente alteradas particularmente preferidas;

La figura 2, proporciona un representación mediante un diagrama de los vectores TCAE 5.2 y ANEX 1 (TCAE 12) diseñados para la expresión de inmunoglobulina quimérica de ratón/humana, donde los genes de inmunoglobulina se disponen en una configuración en tándem usando neomicina fosfotransferasa como marcador selectivo dominante;

La figura 3 es un histograma que compara los niveles de expresión de proteínas con los vectores TCAE 5.1 y ANEX 1;

La figura 4 proporciona una representación mediante un diagrama del vector ANEX 2 diseñado para la expresión de inmunoglobulina quimérica de ratón/humano, donde los genes de inmunoglobulina son disposiciones en una configuración en tándem usando neomicina fosfotransferasa como marcador selectivo dominante;

La figura 5, es un histograma que compara los niveles de expresión de proteínas con los vectores TCAE 5.2, ANEX 1 y ANEX 2;

La figura 6 proporciona una representación esquemática de un vector NEOSPLA diseñado para la expresión de una inmunoglobulina quimérica de ratón/humana; y

Las figuras 7A, 7B y 7C son histogramas que comparan los niveles de expresión de proteínas con los vectores TCAE 5.2 frente a NEOSPLA 3F (7A). ANEX 2 frente a NEOSPLA3F (7B); y GK-NEOSPLA3F frente a NEOSPLAF (7C).

Descripción detallada de realizaciones preferidas

En este documento se describen disposiciones de secuencia de ácido nucleico que afectan a la traducción e iniciación de, más preferiblemente, marcadores selectivos dominantes incorporados en vectores de expresión de mamíferos y que, preferiblemente, pero no necesariamente, se unen a una secuencia que codifica para un producto génico de interés. Preferiblemente, el marcador selectivo dominante comprende al menos una región de inserción intrónica natural o artificial, y al menos un producto génico de interés se codifica por el ADN localizado dentro de al menos uno de tales intrones. Tales disposiciones tienen el efecto de aumentar la eficacia de la expresión del producto génico de interés, entre otras cosas, reduciendo el número de colonias viables obtenidas a partir de una cantidad equivalente de ADN plasmídico transfectado por células, mientras que aumenta la cantidad del producto génico expresado en cada clon.

Con fines de brevedad y eficacia de presentación, el foco de esta sección de la descripción de Patente se dirigirá principalmente a un marcador selectivo dominante específico, neomicina fosfotransferasa, que se incorpora en un vector de expresión de inmunoglobulina quimérica de ratón/humano. Sin embargo, debe entenderse que la invención descrita en este documento no pretende, ni debe considerarse limitada a estos sistemas particulares. Por el contrario, la invención descrita es aplicable a sistemas de expresión de mamífero in toto, donde el ADN del vector se integra en el ADN de la célula hospedadora.

Uno de los métodos más preferidos utilizados por los especialistas en la técnica para producir una línea de células de mamífero que produzcan un alto nivel de la una proteína (es decir, ``línea celular de producción'') implica la integración aleatoria del ADN que codifica para el producto génico deseado (es decir ``ADN exógeno'') por medio del uso, típicamente, de un gen resistente a fármacos, denominado ``marcador selectivo dominante'' que permite la selección de células que han integrado el ADN exógeno. Como se ha indicado, de nuevo, las células que incorporan apropiadamente el ADN exógeno incluyendo, por ejemplo, el gen resistente al fármaco, mantendrán la resistencia al fármaco correspondiente. Lo más típico que esto esté seguido por una coamplificación del ADN que codifica para el producto génico deseado en la célula transfectada por la amplificación de un gen adyacente que también codifica para la resistencia al fármaco (``gen de amplificación''), por ejemplo resistencia a metotrexato (MTX) en el caso del gen de la deshidrofolato reductasa (DHFR). El gen de amplificación puede ser el mismo que el gen marcador selectivo dominante, o puede ser un gen distinto. (Como los que se aprecian en la técnica, ``transfección'' se utiliza típicamente para describir el proceso o indicar la introducción de un plásmido en una célula hospedadora de mamífero, mientras que ``transformación'' típicamente se utiliza para describir el proceso o indicar la introducción de un plásmido en una célula hospedadora bacteriana).

Los especialistas en la técnica típicamente emplean dos estrategias de amplificación. En la primera, se amplifica la población entera de células transfectadas y resistentes a fármaco (comprendiendo cada célula al menos una integración del gen que codifica la resistencia al fármaco); en la segunda, se amplifican clones individuales derivados de una sola célula. Tal estrategia tiene ventajas únicas.

Con respecto a la primera estrategia, es algo ``más fácil'' amplificar la población entera (denominada típicamente estrategia de ``disparo de pistola'', una descripción apropiada) en comparación con los clones individuales. Esto se debe a que la amplificación de los clones individuales inicialmente implica, entre otras cosas, la selección de cientos de colonias de mamífero aisladas (cada una de ellas derivada de una sola célula, siendo la mayoría de ellas integrantes de una sola copia del plásmido de expresión) con la intención de aislar una o dos colonias de ``grava'' que secretan el producto génico deseado a un nivel ``alto'', es decir a un nivel que es (típicamente) de tres ordenes de magnitud mayor que el menor nivel de expresión detectable. A menudo, se ha descubierto que estas células también tienen solo una sola integración de copia del plásmido de expresión. Además, la amplificación de clones individuales ocasionan la producción de líneas celulares que contienen menos copias del gen amplificado en comparación con la amplificación de todas las células transfectadas (típicamente, 10-20 frente a 500-1000).

Con respecto a la segunda estrategia, las líneas de células de producción derivadas de la amplificación de clones individuales, típicamente se obtienen en menores niveles del fármaco usado para seleccionar las colonias que comprenden el gen de resistencia de fármacos y el producto génico exógeno (es decir, en el caso del metotrexato y DHFR, 5 nM frente a 1 \muM). Además, los clones individuales típicamente pueden aislarse en un periodo de tiempo más corto (3-6 meses frente a 6-9 meses).

Idealmente, deben combinarse los efectos beneficiosos tangibles de las dos estrategias. A un nivel práctico, esto implicaría la reducción del número de colonias a seleccionar y el aumento de la cantidad de producto secretado por esta colonias. La presente invención realiza esta tarea.

La posición en la que el ADN del marcador selectivo dominante del ADN plasmídico se integra dentro del ADN celular de la célula hospedadora determina el nivel de expresión de la proteína marcadora selectiva dominante, como se reconoce por los especialistas en la técnica. Se supone que la expresión de un gen que codifica una proteína de interés que está unida o colocada cerca del ADN del marcador selectivo es proporcional a la expresión de la proteína marcadora selectiva dominante. Aunque no se desea limitación por ninguna teoría particular, el inventor ha postulado que si el gen usado para seleccionar la integración del ADN exógeno en la célula de mamífero (es decir, el marcador selectivo dominante) se diseñó de tal forma que se alterara la traducción de ese marcador selectivo dominante, entonces sólo sobrevivirían los plásmidos que solucionasen tal alteración por la sobreproducción del producto génico del marcador selectivo dominante, por ejemplo, el proceso de selección de fármaco. Asociando el ADN exógeno con el marcador selectivo dominante, entonces, una sobre producción a fiorti del producto génico del marcador selectivo dominante también produciría una sobreproducción del producto génico derivado del ADN exógeno asociado. De acuerdo con esta estrategia postulada, la alteración de la traducción del gen marcador selectivo dominante sería necesaria, y un camino para tal alteración sería la porción Kozak consenso del gen.

Comparando varios cientos de ARNm de vertebrados, Marilyn Kozak en ``Possible role of flanking nucleotides in recognition of the AUG initiator codon by eukaryotic ribosomes, ''Nuc. Acids Res. 9: 5233-5252 (1981) y ``Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs'' Nuc. Acids Res. 12: 857-872 (1984), propuso la siguiente secuencia ``consenso'' para el inicio de la traducción en eucariotas superiores:

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(Como se apreciará en la técnica, uracilo, U, reemplaza al desoxinucleótido timina, T, en el ARN). En esta secuencia, denominada ``Kozak consenso'', los nucleótidos más conservados son la purinas, A y G, mostradas en letras mayúsculas indicadas anteriormente; el análisis mutacional confirmó que estas dos posiciones tienen la mayor influencia sobre la iniciación. Véase, por ejemplo, Kozak, M. ``Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation of eukaryotic ribosomes.'' Mol. Cell Bio. 7/10: 3438-3445 (1987). Kozak determinó adicionalmente que las alteraciones en la secuencia cadena arriba de la secuencia Kozak consenso pueden efectuar la traducción. Por ejemplo, en ``Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes'', PNAS 83: 2850-2854 (1986) Kozak describe ``la introducción artificial'' de una región de estructura de orquilla secundaria cadena arriba de la secuencia Kozak consenso en varios plásmidos que codificaban preproinsulina; y se determinó experimentalmente que una estructura de tallo-bucle estable inhibía la traducción del gen de la preproinsulina, reduciendo el rendimiento de proinsulina en un 85- 95%.

Sorprendentemente, se descubrió por el inventor que cambiando las purinas A(-3 con respecto al codón de iniciación ATG) y G(+1) por pirimidinas, la alteración de la traducción era significativa: cuando la secuencia Kozak consenso para el gen de neomicina fosfotransferasa se sometió a tales alteraciones (como se indicará con más detalle más adelante), el número de colonias resistentes a G418 se redujo significativamente; sin embargo, hubo un aumento significativo en la cantidad de producto génico expresado por los clones resistentes a G418 individuales. Como reconocerán los especialistas en la técnica, esto tiene el efecto de aumentar la eficacia del sistema de expresión - hay menos colonias a seleccionar y la mayoría de las colonias que son viables producen significativamente más producto que el que se obtendría habitualmente. De esta manera, se determinó experimentalmente la confirmación de la teoría postulada por el inventor.

Como se ha indicado, para los fines de este documento de patente una secuencia ``Kozak consenso'' comprende las siguientes secuencias:

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una ``secuencia Kozak consenso particularmente alterada'' comprende la siguiente secuencia

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y una ``secuencia Kozak consenso'' totalmente alterada comprende la siguiente secuencia:

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donde: ``x'' es un nucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T), (uracilo, U, en el caso del ARN); ``P'' es una purina, es decir, A o G, ``Py'' es una piridina, es decir C o T/U; ATG es un codón de iniciación convencional que codifica para el aminoácido metionina (Met); las designaciones numéricas se refieren al codón ATG, es decir, un número negativo indica ``cadena arriba'' de ATG y un número positivo indica ``cadena abajo'' de ATG, y para la secuencia Kozak consenso particularmente alterada, es aplicable la siguiente condición – - solo uno de los nucleótidos -3 o + 1 es una piridina, por ejemplo, si -3 es una piridina, entonces +1 debe ser una purina o si -3 es una purina, entonces +1 debe ser una piridina. Más preferiblemente, la secuencia Kozak consenso totalmente alterada está asociada con el sitio de inicio de la traducción de un marcador selectivo dominante que preferiblemente (pero no necesariamente) está unido al ADN exógeno que codifica para un producto génico de interés. Como se usa en este documento, se entiende que ``nucleótido'' incluye desoxi y ribonucleótidos naturales y sintéticos, así como desoxi y ribonucleótidos modificados, es decir, donde la base 3' OH 5' OH, azúcar y/o heterocíclica está modificada, así como la modificación del esqueleto de fosfato, por ejemplo, metil fosfatos, fosforotioatos y fosforamiditas.

Sin embargo, preferiblemente se conoce la información con respecto a la secuencia génica del marcador selectivo dominante; sin embargo a la luz de la secuencia entera, deberá conocerse la información con respecto a la secuencia de ácido nucleicos (o secuencia de aminoácidos) en el sitio de inicio de la traducción del marcador selectivo dominante. De nuevo, para realizar un cambio en la secuencia consenso o en la secuencia Kozak consenso parcialmente alterada, se debe conocer su secuencia. El cambio de la secuencia consenso o las secuencia Kozak consenso parcialmente alterada a una secuencia Kozak consenso totalmente alterada puede realizarse por una diversidad de estrategias bien conocidas para los especialistas en la técnica incluyendo, pero sin limitación, mutagénesis de localización dirigida y mutación por amplificación basada en cebadores (por ejemplo PCR); lo más preferible es que tal cambio se realice por mutación por amplificación basada en cebadores. Esta preferencia se basa principalmente en la ``facilidad'' comparativa en la realización de la tarea, junto con la eficacia asociada con la misma. Para facilitar la presentación, se proporcionará una descripción de los medios más preferidos para idealizar el cambio a una secuencia Kozak consenso totalmente alterada.

En esencia, la mutación por amplificación basada en cebadores se basa en el poder del proceso de amplificación por sí mismo - como la PCR se utiliza rutinariamente, el enfoque se dirigirá a la misma. Sin embargo, son aplicables otras técnicas de amplificación basadas en cebadores (por ejemplo, reacción de cadena de la ligasa, etc). Uno de los dos cebadores de PCR (``cebador mutacional'') incorpora una secuencia que asegurará que el producto de ADN amplificado resultante incorporará la secuencia Kozak consenso totalmente alterada dentro del cassette de transcripción que incorpora el marcador selectivo dominante de interés. El otro cebador de PCR es complementario a otra región del marcador selectivo; un cassette transcripcional que incorpora el marcador selectivo dominante; o un vector que comprende el cassette de transcripción. A modo de ejemplo, el complemento a un marcado selectivo dominante que incluye una secuencia Kozak consenso podría tener la siguiente secuencia. (SEC ID Nº: 1):

3'-tagctaggTccTACCcc-5'

Para crear una secuencia Kozak consenso totalmente alterada, el cebador mutacional podría tener la siguiente secuencia (SEC ID Nº:2) (por conveniencia, la SEC ID Nº:1 se pone sobre el cebador mutacional con fines comparativos):

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Como es evidente, en el cebador se carece de complementariedad (véanse los símbolos ``*''). Utilizando un exceso de cebador mutacional en la reacción de PCR, cuando se amplifica la secuencia que incluye la secuencia Kozak consenso, los productos de ADN amplificados resultantes incorporarán las mutaciones, de tal forma que los productos de ADN amplificados se amplifiquen a su vez, las mutaciones predominarán de tal forma que se incorpore una secuencia Kozak consenso totalmente alterada en el producto de amplificación.

Se requieren dos criterios para el primer cebador mutacional, la longitud debe ser suficiente de tal forma que se obtenga la hibridación con la diana. Como se apreciará, el cebador mutacional no será complementario al 100% con la diana. De esta forma, se requiere un número suficiente de bases complementarias para asegurar la hibridación requerida. Preferiblemente, la longitud del cebador mutacional está comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 60 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 18 y aproximadamente 40 nucleótidos, aunque son viables longitudes más largas y más cortas. (En la medida en la que el cebador mutacional también se utiliza para incorporar un codón de iniciación fuera de fase o estructura secundaria, la longitud del cebador mutacional puede aumentar de forma correspondiente). En segundo lugar, la relación entre el cebador mutacional y la diana debe estar en un exceso suficiente como para ``forzar la mutación''. Preferiblemente, la relación entre el cebador mutacional y la diana está comprendida entre aproximadamente 250:1 y aproximadamente 5000:1, más preferiblemente, entre aproximadamente 400:1 y aproximadamente 2500:1 y aún más preferiblemente entre aproximadamente 500:1 y aproximadamente 1000:1.

Como los parámetros de una reacción de PCR se consideran dentro del nivel de experiencia de los especialistas en la técnica, en este documento no se indican los detalles con respecto a las particularidades de esta reacción; el especialista en la técnica se acredita fácilmente con el reconocimiento de la manera en la que puede realizarse este tipo de mutación usando técnicas de PCR - lo anterior se proporciona como un medio para proporcionar el esclarecimiento en lugar de la construcción detallada.

Como se ha indicado, lo más preferido es que la secuencia Kozak consenso totalmente alterada esté asociada con el sitio de inicio de la traducción de un marcador selectivo dominante incorporado en un cassette de transcripción que constituye una parte de un vector de expresión. Los marcadores selectivos dominantes preferidos incluyen, pero sin limitación: timidina quinasa del virus del herpes simple; adenosina desaminasa; asparagina sintetasa; gel his D de Salmonella, xantina guanina fosforribosil transferasa (``XGPRT''); higromicina B fosfotransferasa; y neomicina fosfotransferasa (``NEO''). Lo más preferible es que el marcador selectivo dominante sea NEO.

Se ha notificado que la timidina quinasa del virus del herpes simple como marcador selectivo dominante tiene la siguiente secuencia Kozak consenso parcialmente alterada:

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Véase, Heller, S. ``Insertional Activities of a Promotorless Thymidine Kinase Gene'' Mol. & Cell. Bio. 8/8:3218-3302, figura 4, nucleótido 764. Al cambiar la purina +1 (G) por una pirimidina (C o T/U), se genera una secuencia Kozak totalmente alterada como se define en este documento (la posición -3 de la timidina quinasa del virus del herpes simple es una pirimidina). El cambio de la purina +1 por una pirimidina también tiene el efecto de cambiar el aminoácido codificado de alanina (GCT) a prolina (CCT) o serina (TCT); se prefiere obtener cambios de aminoácidos conservadores a partir de los cambios en los nucleótidos. De esta manera, se prefiere que el cambio a TCT se realice porque el cambio de alanina a serina es un cambio de aminoácidos más conservativo en el cambio de alanina a prolina.

La histidinol deshidrogenasa es otro marcador selectivo dominante. Véase, Hartmen, S.C. y Mulligan, R.C. ``Two dominant acting selectable markers for gene transfer studies in mmalian cells'', PNAS 85:8047-8051 (1988). Este gen his D de Salmonella typhimunium tiene la siguiente secuencia Kozak consenso parcialmente alterada:

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Como -3 es una purina, el cambio de -3 a una pirimidina (C o T/U) produce una secuencia Kozak consenso totalmente alterada; como se aprecia, como estos nucleótidos están cadena arriba del codón de iniciación, no se obtiene ningún impacto sobre la traducción de aminoácidos a partir de este cambio.

La higromicina B fosfotransferasa es otro marcador selectivo dominante; la secuencia presentada para el gen hph (véase, Gritz, L. y Davies, J. ``Plasmid encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expressing in Escherichia coli y Succharomyces cerevisiae'' Gene 25:179-188, 1983) indica que la secuencia Kozak consenso es:

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Tanto -3 como +1 son purinas; de esta forma, el cambio de -3 y +1 a pirimidinas produce una secuencia Kozak consenso totalmente alterada (esto produce los siguientes aminoácidos codificados +1 a C - glutamina; +1 a T codón stop). Como este codón está cadena abajo del codón de iniciación, no debería realizarse el cambio al codón stop TAA).

XGPRT es otro marcador selectivo dominante. La secuencia Kozak consenso parcialmente alterada presentada en XGPRT tiene la siguiente secuencia:

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Véase Mulligan, R.C. y Berg, P. ``Factors governing the expression of a bacterial gene in mammalian cells'' Mol. & Cell Bio. 1/5:449-459 (1981), figura 6. Al cambiar la purina +1 a una pirimidina, se crea una secuencia Kozak consenso totalmente alterada; el efecto sobre el aminoácido codificado (AGC-serina) es el siguiente: CGC-arginina; TGC-cisteína.

También puede utilizarse la adenosina desaminasa (ADA) como un marcador selectivo dominante. La secuencia Kozak consenso presentada para la adenosina desaminasa es:

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Véase, Yeung, C.Y. et al., ``Identification of functional murine adenosine deaminase cDNA clones by complementation in Echerichia coli'', J. Bio. Chem. 260/18:10299-10307 (1985), figura 3. Al cambiar las purinas tanto -3 como +1 a pirimidinas, se obtienen secuencias Kozak consenso totalmente alteradas. El aminoácido codificado correspondiente a GCC (alanina) se cambia a prolina (CCC) o serina (TCC), prefiriéndose el cambio a serina, debido a la naturaleza conservativa de este cambio.

La secuencia Kozak consenso parcialmente alterada presentada para la asparagina sintetasa es la siguiente:

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Véase, Andrulis, I.L. et al., ``Isolation of human cDNAs for asparagine synthetase and expression in Jensen rat sarcoma cells'', Mol. Cell. Bio. 7/7:2435-2443 (1987). El cambio de la purina +3 a una pirimidina produce una secuencia Kozak consenso totalmente alterada.

La secuencia Kozak consenso parcialmente alterada para la neomicina fosfotransferasa (que incluye un codón de iniciación cadena arriba fuera de fase), es la siguiente:

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El cambio de la purina +1 a una pirimidina tiene el efecto de crear una secuencia Kozak consenso totalmente alterada (los cambios a los aminoácidos codificados isoleucina, ATT son los siguientes: CTT - leucina y TTT- fenilalanina, prefiriéndose el cambio a la leucina, debido a la naturaleza conservativa de este cambio.

Lo anterior no pretende o no debe considerarse limitante; en su lugar, en el contexto de la invención descrita, lo anterior se presenta en un esfuerzo por proporcionar ejemplos equivalentes de cambios en las secuencias Kozak consenso presentadas o secuencias Kozak consenso parcialmente alteradas de varios marcadores selectivos dominantes bien conocidos.

Como se ha indicado, un marcador selectivo dominante más preferido es NEO. Las secuencias consenso totalmente alteradas particularmente preferidas para NEO son las siguientes:

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Txx ATG Ctt (SEC ID Nº: 3)\cr  Cxx ATG Ctt (SEC ID Nº: 4)\cr  Txx
ATG Ttt (SEC ID Nº: 5)\cr  Cxx ATG Ttt (SEC ID Nº:
6)\cr}

donde x son los nucleótidos. La SEC ID Nº 3 es la más preferida; y xx es preferiblemente CC.

Otros cassettes de transcripción, que pueden o pueden no incluir una secuencia Kozak consenso totalmente alterada, pueden incorporarse en un vector que incluye cassettes de transcripción que contienen la secuencia Kozak consenso descrita y reivindicada totalmente alterada; tales ``otros cassettes de transcripción'' típicamente se utilizan para permitir la ``potenciación'', ``amplificación'', o ``regulación'' de la expresión del producto génico. Por ejemplo es ilustrativa la cotransfección del ADN exógeno con el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Al aumentar los niveles del fármaco antifolato metotrexato (MTX), un inhibidor competitivo del DHFR, presentado a tales células, puede producirse un aumento en la producción de DHFR mediante la amplificación del gen de DHFR. De forma beneficiosa, también se amplificarán grandes cantidades de ADN exógeno flanqueante; por lo tanto, también se sobre-expresará el ADN exógeno insertado de forma colineal con un gen de DHFR expresable. Además, se dispone de cassettes de transcripción que permiten la regulación de la expresión. Por ejemplo, se han descrito células COS sensibles a la temperatura obtenidas poniendo el gen del antígeno T grande del mutante SV40ts bajo la dirección del LTR del virus de sarcoma de Rous (insensible a la represión de retroalimentación por el antígeno T). Véase, 227 Science 23- 28 (1985). Estas células soportan la replicación del ori de SV40 a 33ºC, pero no a 40ºC y permite la regulación del número de copias de los vectores que contienen ori de SV40 transfectados. Lo anterior no pretende, ni debe considerarse limitante; en su lugar, lo anterior pretender ser ilustrativo de los tipos de cassettes que pueden incorporarse en vectores de expresión que comprenden la secuencia Kozak consenso totalmente alterada. El especialista en la técnica posee la capacidad de determinar el tipo específico de otros cassettes de la transcripción, con respecto al objetivo del sistema de expresión, que son aplicables y que pueden explotarse de forma ventajosa.

Como se ha indicado anteriormente, en realizaciones particularmente preferidas de la invención, al menos un codón de iniciación fuera de fase (ATG) está localizado cadena arriba del codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado, sin que un codón stop esté localizado entre el codón de iniciación fuera de fase y el codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado. El objetivo del codón de iniciación fuera de fase es, en efecto, alterar adicionalmente la traducción del marcador selectivo dominante.

Como se usa en este documento, la expresión ``codón stop'' pretende indicar un ``codón sin sentido'', es decir, un codón que no codifica uno de los 20 aminoácidos naturales de tal forma que la traducción del material codificado termine en la región del codón stop. Esta definición incluye, en particular, los codones stop tradicionales TAA, TAG y TGA.

Como se usa en este documento, la expresión ``fuera de fase'' se refiere al codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado. Como apreciarán los especialistas en la técnica, en cualquier macromolécula de ADN (o macromolécula de ARN), para todas las secuencias en fase, hay dos secuencias fuera de fase. De esta manera, por ejemplo, con respecto a la siguiente secuencia que incorpora una secuencia Kozak consenso totalmente alterada:

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los codones en fase están separados por tripletes, por ejemplo, gcA, TGc, cAT y Ggc; los codones fuera de fase incluirían, por ejemplo, cAT, ATG, Gcc, ccA, ATG y TGg. De esta manera, dos codones de iniciación (en letras mayúsculas y subrayados) están fuera de fase con respecto al codón de iniciación de la secuencia Kozak consenso totalmente alterada.

Cuando se utiliza tal codón de iniciación fuera de fase, se prefiere que este dentro de aproximadamente 1000 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado, más preferiblemente dentro de aproximadamente 350 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado, y aún más preferiblemente dentro de aproximadamente 50 nucleótidos del codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado.

Como se aprecia, la secuencia cadena arriba puede manipularse para conseguir la colocación de al menos una secuencia fuera de fase cadena arriba del codón de iniciación Kozak consenso totalmente alterado usando (más preferiblemente) un cebador de mutación usado en el tipo de protocolo de amplificación descrito anteriormente,

La utilización de un codón de iniciación de secuencia Kozak consenso totalmente alterada localizado dentro de una estructura secundaria (es decir, un ``tallo-bucle'' u ``orquilla'') es beneficiosamente viable para alterar la traducción de la proteína codificada por el marcador selectivo dominante. En tal realización, se prefiere que este codón de iniciación se localice dentro del tallo de una estructura secundaria de tallo-bucle. A modo de ejemplo esquemático, en tal realización, el codón de iniciación de la secuencia Kozak consenso totalmente alterado se coloca como se indica a continuación:

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(También se representa un codón de iniciación fuera de fase que no forma parte de la estructura secundaria). Como se apreciará, dentro del tallo-bucle, la complementariedad a lo largo del tallo es, por definición, como se requiere típicamente. Para la metodologías ilustrativas con respecto, entre otras cosas, a la introducción de tales estructuras secundarias en la secuencia, así como a la información con respecto a la estabilidad de la estructura secundaria, véase, Kozak, PNAS, 1986, supra.

Como se ha indicado, se prefiere que se utilice un marcador selectivo dominante con una región de inserción intrónica natural o una región de inserción intrónica creada artificialmente y que al menos se inserte un producto génico de interés dentro de esta región. Aunque no se desea limitación por ninguna teoría particular, el inventor postula que tal disposición aumenta la eficacia de la expresión debido al número de colonias viables que sobreviven al proceso de selección frente a la reducción del marcador selectivo dominante; las colonias que sobreviven al proceso de selección, por definición, habrán expresado la proteína necesaria para la supervivencia, y junto con esta, el producto génico de interés tendrá una mayor tendencia a expresarse. Como se postula adicionalmente, el ARN que se transcribe a partir de producto génico de interés dentro de la región de inserción intrónica interfiere con la terminación de la transcripción (alargamiento del ARN) del marcador selectivo dominante; por lo tanto, la posición en la que el marcador selectivo dominante se integra dentro del ADN celular probablemente será una posición en la que se transcriban inicialmente una mayor cantidad de ARN.

Como se aprecia, las proteínas procariotas típicamente no incluyen uniones e intrones. Sin embargo, la mayoría de los marcadores selectivos dominantes que se prefieren para la tecnología del vector de expresión proceden de sistemas procariotas. De esta manera, cuando se utilizan marcadores selectivos dominantes derivados de procariotas, como es preferido, a menudo es necesario generar una unión artificial dentro del gen para crear una localización para la inserción de un intrón que comprenda el producto génico de interés. Debe indicarse que aunque se proporcionan la siguientes reglas para la selección de un sitio de empalme en genes procariotas, pueden aplicarse fácilmente a genes eucariotas.

Un mecanismo general para la unión de ARN mensajero en células eucariotas se indica y resume en Sharp, Philip A. ``Splicing of Messenger RNA Precursors'' Science, 235: 736-771 (1987) (véase, en particular, figura 1). Basándose en Sharp, hay cuatro criterios mínimos en la secuencia de ácido nucleico que son necesarios para un empalme: (a) donador del empalme 5'; (b) aceptor del empalme 3'; (c) punto de ramificación y (d) tracto de polipirimidina. La secuencia consenso para el donante del empalme 5' se presenta como

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y para el aceptor del empalme 3', NCAG/G (donde un símbolo ``/'' indica el sitio de empalme); véase, Mount, S.M. ``A Catalogue of Splice Junction Sequences'' Nuc. Acids. Res. 10/2:459-472 (1992). La secuencia consenso para el punto de ramificación, es decir, la localización de la formación de lazo con el donador del empalme 5', se presenta como PyNPyPAPy; y el sitio de ramificación preferido presentado para el empalme del ARN de mamífero es TACTAAC (Zhuang, Y. et al., ``UACUAAC is the preferred branch site for mammalian mRNA splicing'' PNAS 86: 2752-2756 (1989). Típicamente, el punto de ramificación está localizado al menos a una distancia de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 pares de bases desde el donador del empalme 5' (no hay ningún limite superior definido para esta distancia). El tracto de polipirimidina típicamente tiene de aproximadamente 15 aproximadamente 30 pares de bases y más típicamente está unido por el punto de ramificación y el aceptor del empalme 3'. Lo anterior es descriptivo del criterio impuesto por la naturaleza en mecanismos de empalme que se producen de forma natural. Como no hay ningún limite superior exacto sobre el número de pares de bases entre el donador del empalme 5' y el punto de ramificación, se prefiere que el producto génico de interés se inserte dentro de esta región en situaciones en las que existe un intrón natural dentro del marcador selectivo dominante. Sin embargo, como se ha indicado, tales intrones no existen dentro de la mayoría de los marcadores selectivos dominantes preferidos; como tales, la utilización de intrones artificiales preferiblemente se utiliza con estos marcadores.

Para generar un intrón artificial, debe localizarse un sitio ``donador de empalme: aceptor de empalme'' dentro de la región codificante del marcador selectivo dominante. Basándose en Sharp y Mount, es más preferido que la siguiente secuencia funcione como sitio donador de empalme: aceptor de empalme - - CAGG (produciéndose la unión artificial en la región GG). Una secuencia preferida es AAGG.

Centrándonos en la secuencia más preferida CAGG, los siguientes codones y aminoácidos pueden localizarse dentro de la región codificante del marcador selectivo dominante para la generación de la región de inserción intrónica artificial:

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(Como se apreciará, puede utilizarse la misma estrategia para determinar restos aminoacídicos viables para la secuencia preferida de AAGG). El grupo de codones más preferido para la derivación del sitio donador de empalme: aceptor de empalme es el grupo A. Una vez localizadas estas secuencias de aminoácidos, puede definirse un punto viable para la generación de una región de inserción intrónica artificial.

Centrándonos en el marcador selectivo dominante NEO preferido, los restos aminoacídicos Gln Asp (grupo de codones A) están localizados en las posiciones 51 y 52 de NEO y los restos aminoacídicos Ala Arg (grupo de codones C) están localizados en las posiciones 172 y 173 (como se aprecia, pueden utilizarse múltiples regiones de inserción intrónica artificiales). Fijando la atención en los restos 50-53 de NEO, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos son las siguientes:

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Por consiguiente, puede generarse una región de inserción intrónica artificial entre los restos 51 y 52 de NEO. Más preferiblemente, esta región comprende un punto de ramificación, un tracto de polipirimidina y, preferiblemente, una región para la inserción de un producto génico de interés, es decir una región susceptible de digestión enzimática.

Para la región de inserción intrónica artificial son importantes dos criterios: los dos primeros restos de ácido nucleico del sitio de empalme 5' (por ejemplo, CAG colindante) son preferiblemente, GT y los dos primeros restos de ácido nucleico del sitio de empalme 3' (por ejemplo, G colindantes) son preferiblemente AG.

Usando los criterios definidos anteriormente, una región de inserción intrónica artificial estaba entre los restos aminoacídicos 51 y 52 de NEO:

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(En la sección de ejemplos presentada más adelante se muestran detalles con respecto a la metodología para crear esta región de inserción intrónica artificial. El sitio Not I se creó como la región en la que puede incorporarse el producto génico de interés. Por lo tanto, tras la incorporación, el producto génico de interés está localizado entre los restos aminoacídicos 51 y 52 de NEO, de tal forma que durante la transmisión de NEO, el producto génico de interés ``se empalmará''.

Lo más preferible es que la línea de células hospedadoras sea de origen de mamífero; los especialistas en la técnica creen en la capacidad de determinar preferentemente líneas de células hospedadoras particulares que son adecuadas para la expresión del producto génico deseado. Las líneas de células hospedadoras ilustrativas incluye, pero sin limitación, DG44 y DXB11 (Líneas de Ovario de hámster Chino, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CV1 (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CV1 con el antígeno T SV40), R1610 (fibroblastos de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocitos humanos) y 293 (riñón humano). Las líneas de células hospedadoras están disponible típicamente en servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o a partir de la bibliografía publicada.

Preferiblemente, la línea de células hospedadoras es DG44 o SP2/O. Véanse, Urland, G. et al., ``Effect of gamma rays and the dihidrofolato reductase locus: deletions and inversions''. Som. Cell & Mol. Gen. 12/6:555- 566 (1986) y Shulman, M. et al., ``A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.'', Nature 276:269 (1978), respectivamente. Más preferiblemente, la línea de células hospedadoras es DG44. La transfección de plásmido en la célula hospedadora puede realizarse por cualquier técnica disponible para los especialistas en la técnica. Esto incluye, pero sin limitación, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión celular con ADN con envuelta, microinyección e infección con virus intactos. Véase Ridgway, A.A.G. ``Mammalian Expression Vectors.'' Capítulo 24.2, páginas 470-472 Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988). Más preferiblemente, la introducción del plásmido en el hospedador se realiza por medio de electroporación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no pretenden ni deben considerarse limitantes de la invención; los ejemplos pretenden demostrar la aplicabilidad de una realización de la invención descrita en este documento. La secuencia Kozak consenso totalmente alterada descrita pretende aplicarse ampliamente como se ha indicado anteriormente. Sin embargo, para eficacia de presentación, se utilizan usos ilustrativos de realizaciones particularmente preferidas de secuencias Kozak consenso totalmente alteradas junto con vectores de expresión de anticuerpos quiméricos en tándem (también denominados en este documento vectores de expresión de anticuerpos) como se describe más adelante.

I. Vector de expresión de anticuerpos quiméricos en tándem (``TCAE'')

Los linfócitos de células B proceden de células madre pluripotentes y avanzan a través de la autogenia a células plasmáticas que secretan anticuerpos totalmente maduros. El antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humano Bp35, denominado en la técnica ``CD20'' es una fosfoproteína no glicosilada de la superficie celular de 35.000 Daltons; CD20 se expresa durante el desarrollo previo de células B temprano justo antes de la expresión de cadenas pesadas \mu citoplásmicas. CD20 se expresa consistentemente hasta la fase de diferenciación celular en plasma. La molécula CD20 regula una etapa en el proceso de activación que se requiere para el inicio del ciclo celular y la diferenciación. Como CD20 se expresa en células B neoplásticas, CD20 proporciona un objetivo prometedor para la terapia de linfomas de células B y leucemias. El antígeno CD20 es especialmente adecuado como diana para la terapia mediada con anticuerpos anti-CD20 debido a la accesibilidad y sensibilidad de los tumores hematopoyéticos a la lisis mediante mecanismos efectores inmunes. La terapia mediada por anticuerpos anti-CD20, inter alia, se describe en el documento en trámite junto con el presente, con el Nº de Serie 07/978.891 y Nº de Serie ............ presentado simultáneamente con éste. Los anticuerpos utilizados son anticuerpos anti-CD20 quiméricos de ratón/humano expresados a altos niveles en células de mamífero (anti-CD20 quimérico). Este anticuerpo se obtuvo usando vectores descritos en este documento, a saber: TCAE 5.2; ANEX 1; ANEX 2; GKNEOSPLA3F y NEOSPLA3F (también se utilizó un vector adicional, TCAE 8, para obtener el anticuerpo quimérico/anti- CD20 - - TCAE 8 es idéntico a TCAE 5.2 con la excepción de que el sitio de inicio de la traducción de NEO es una secuencia Kozak consenso parcialmente alterada. TCAE 8 se describe en el documento de patente en trámite junto con el presente presentado con éste).

En el documento de Estados Unidos concedido comúnmente con el Nº de Serie 07/912.292, se describen, entre otros, anticuerpos quiméricos de humano/mono del Viejo Mundo; una realización descrita en este documento son anticuerpos quiméricos de humano/macaco anti-CD4 en el vector TCAE 6 (véase, la figura 6 del Nº de Serie 07/912.292, y la discusión correspondiente). TCAE 6 es sustancialmente idéntico a TCAE 5.2; TCAE 6 contiene la región constante lambda humana, mientras que TCAE 5.2 contiene la región constante kappa humana. TCAE 5.2 y ANEX 1 (a los que se hace referencia en este documento de patente como TCAE 12) se describen como vectores que pueden utilizarse junto con anticuerpos quiméricos de humano/mono del Viejo Mundo. Los datos comparativos indicados en el documento Nº de Serie 07/912.292 con respecto a TCAE 5.2 y ANEX 1 son relativos a la expresión del anticuerpo anti-CD20 quimérico.

TCAE 5.2 se obtuvo a partir del vector CLDN, un derivado del vector RLDN10b (véase 253 Science 77-91, 1991). RLDN10b es un derivado del vector TND (véase, 7DNA 651-661, 1988). Es decir, la ``línea de familia'' del vector es la siguiente: TDN \rightarrow RLDN10b \rightarrow CLDN \rightarrow TCAE 5.2\rightarrow ANEX 1\rightarrow (el uso del símbolo ``\rightarrow'' no pretende ni debe considerarse como una indicación del esfuerzo necesario para conseguir los cambios de un vector al siguiente; por ejemplo, al contrario, el número y complejidad de las etapas necesarias para generar TCAE 5.2 a partir de CLDN fueron grandes).

TND se diseñó para las expresiones de alto nivel del activador de plasminógeno tisular humano. RLDN10b difiere de TND en los siguientes puntos: el cassette de transcripción de la dihidrofolato reductasa (``DHFR'') (que comprende el promotor, el ADNc de DHFR murino y la región de poliadenilación) se puso entre el cassette del activador de plasminógeno tisular (``cassette de expresión t-PA'') y la neomicina fue fosfotransferasa (``NEO cassette'') de forma que los tres cassettes estuvieran en tándem y en la misma orientación de transcripción. El vector TND permitió la selección con G418 de las células que llevaban los genes DHFR, NEO y t-PA antes de la selección con respecto a la amplificación del gen DHFR en respuesta a metotrexato, MTX. El promotor delante del gen DHFR se cambio por el promotor principal de la beta globina de ratón (véase, 3 Mol. Cell Bio. 1246-1254, 1983). Finalmente, el ADNc de t-PA se reemplazó por un poliengarce de tal forma que pudieran insertarse diferentes genes de interés en el poliengarce. Los tres cassettes de transcripción eucariota (t-PA, DHFR, NEO) del vector TND pueden separarse del ADN de plásmido bacteriano (derivado de pUC19) por digestión con la endonucleasa de restricción Not I.

CLDN difiere de RLDN10b de los siguientes puntos: El LTR Rous, colocado delante del poliengarce, se reemplazó por el potenciador del promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (``CMV'') (véase, 41 Cell 521, 1985) a partir del sitio Spe I en -581 hasta el sitio Sst I en -16 (estos números son de la referencia Cell).

Como indica el nombre, los vectores TCAE se diseñaron para expresiones de alto nivel del anticuerpo quimérico. TCAE 5.2 difiere de CLDN en los siguientes puntos:

A: TCAE 5.2 comprende cuatro (4) cassettes de transcripción, en lugar de tres (3), y estos están en orden en tándem, es decir, una cadena ligera de inmunoglobulina humana excepto una región variable; una cadena pesada de inmunoglobulina humana excepto una región variable; DHFR; y NEO. Cada cassette de transcripción contiene su propio promotor eucariota y señal de poliadenilación (se hace referencia a la figura 2 que es una representación mediante un diagrama del vector TCAE 5.2). El promotor/potenciador de CMV delante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una versión truncada el promotor/potenciador delante de la cadena ligera, desde el sitio Nhe I a -350 hasta el sitio Sst I a -16 (los números proceden de la referencia Cell, supra).

Específicamente,

1) se obtuvo una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana mediante la amplificación de ADNc por una reacción de PCR. En TCAE 5.2, esta era la región constante kappa de cadena ligera de inmunoglobulina humana (numeración kabat, aminoácidos 108-214, alotipo Km 3), y la región constante gamma 1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana (numeración de aminoácidos de kabat 114-478, alotipo GmIa, Gmlz). La cadena ligera se aisló a partir de sangre humana (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, CA); el ARN de la misma se usó para sintetizar un ADNc que después se amplificó usando técnicas de PCR (los cebadores se obtuvieron en relación con las secuencias Kabat consenso). La cadena pesada se aisló (usando técnicas de PCR) a partir del ADNc preparado a partir de ARN que a su vez procedía de células transfectadas con un vector IgG1 humano (véase, 3 Prot. Eng. 531, 1990, vector pN_{\gamma 1}62). Se cambiaron dos aminoácidos en la igG1 humana aislada para corresponder a la secuencia de aminoácidos consenso en kabat, a saber: el aminoácido 225 se cambio de valina a alanina (GTT a GCA), y el aminoácido 287 se cambio de metionina a lisina (ATG a AAC);

2) Los cassettes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana contiene secuencias señal sintéticas para la secreción de las cadenas de inmunoglobulina;

3) Los cassettes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana contienen sitios de restricción de ADN específicos que permiten la inserción de regiones variables ligera y pesada de inmunoglobulina que mantienen la fase de lectura de transición y no alteran los aminoácidos encontrados normalmente en las cadenas de inmunoglobulina;

4) El cassette DHFR contenía su propio promotor eucariota (promotor principal de beta globina de ratón ``BETA'') y la región de poliadenilación (poliadenilación de hormona de crecimiento bovina ``BGH''); y

5) El cassette NEO contenía su propio promotor eucariota (BETA) y región de poliadenilación (poliadenilación temprana de SV40, ``SV'').

Con respecto a TCAE 5.2 y al cassette NEO, la región Kozak era una secuencia Kozak consenso (que incluía un sitio Cla I cadena arriba, SEC ID Nº: 7):

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ANEX 1 (previamente denominado TCAE 12 en el caso mencionado) es idéntico a TCAE 5.2 con la excepción de que en el cassette NEO, la región Kozak estaba totalmente alterada (SEC ID Nº: 8):

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Como se describe en el caso mencionado asignado comúnmente, el impacto de la utilización de la secuencia Kozak consenso totalmente alterada era soprendente: con respecto a TCAE 5.2, había una reducción significativa (8 veces) en el número de colonias resistentes a ANEX 1 G418 (258 de dos electroporaciones frente a 98 de seis electroporaciones) de la misma cantidad de ADN plasmídico transfectado por célula; y había un aumento significativo en la cantidad de producto génico unido expresado en cada una de los clones ANEX 1. Haciendo referencia al histograma de la figura 3 (figura 16 del caso mencionado asignado comúnmente), 258 colonias procedían de dos electroporaciones de 25 \mug de ADN que contenía un gen de neomicina fosfotransferasa con una secuencia Kozak consenso en el sitio de inicio de la traducción. Doscientas una (201) de esta colonias no expresaban ningún producto génico detectable (menos de 25 ng/ml de inmunoglobulina quimérica), y sólo 8 colonias expresaban más de 100 ng/ml. De nuevo, haciendo referencia a la figura 3, se obtuvieron 98 colonias de seis electroporaciones para ANEX 1 de 25 \mug de ADN que contenía un gen de neomicina fosfotransferasa con una secuencia Kozak consenso totalmente alterada en el sitio de inicio de la traducción (se utilizaron 6 electroporaciones para generar valores estadísticamente comparativos); esto se debía, en promedio, a que cada electroporación para ANEX 1 producía aproximadamente 16 colonias, en lugar de aproximadamente 129 colonias por electroporación para TCAE 5.2). Ocho (8) de las colonias ANEX no expresaban ningún producto génico detectable (menos de 25 ng/ml), mientras que 62 de estas colonias expresaban más de 100 ng/ml; de estas 62 colonias, casi 23 expresaban más 250 ng/ml (23%), expresando 6 más de 1000 ng/ml (6%).

Lo anterior demuestra, entre otras cosas, lo siguiente: 1) como la diferencia entre TCAE 5.2 y ANEX 1 estaba limitada al sitio de inicio de la traducción de Kozak del gen NEO, y como el producto génico de interés (anticuerpo anti- CD20 quimérico) estaba unido al gen NEO, una conclusión a extraer es que estas diferencias en los resultados se atribuyen únicamente a las diferencias en el sitio de inicio de la traducción Kozak; 2) experimentalmente, se confirmó que la utilización de una secuencia Kozak consenso totalmente alterada junto con un número selectivo dominante producía colonias significativamente menos viables; 3) experimentalmente se confirmó que la utilización de una secuencia Kozak consenso totalmente alterada junto con un marcador selectivo dominante unido a un producto génico deseado aumentaba significativamente la cantidad de producto génico expresado. De esta manera el número de colonias a seleccionar se redujo mientras que aumentaba la cantidad de producto génico expresado.

II. Impacto de la secuencia de inicio fuera de fase

Conceptualmente, podría conseguirse una alteración adicional del inicio de la traducción del marcador selectivo dominante de ANEX 1 por la utilización de al menos un codón de iniciación ATG fuera de fase cadena arriba del codón de iniciación de neomicina fosfotransferasa. Considerando esta estrategia una etapa adicional, la utilización de una estructura secundaria (``orquilla'') que incorporaba el codón de iniciación NEO dentro del tallo de la misma, se supondría que inhibe adicionalmente el inicio de la traducción. De esta manera, cuando se consideraba el codón de inicio fuera de fase/la secuencia Kozak consenso totalmente alterada, esta región se diseñó de tal forma que se aumentara la posibilidad de tales estructuras secundarias.

Como se ha indicado previamente, la región Kozak para el codón de iniciación NEO en el vector ANEX 1 es:

TTGGGAGCTTGG ATCGAT CC Tcc ATG Ctt

La secuencia deseada para un vector idéntico a ANEX 1 pero que incorpora los cambios identificados anteriormente con respecto al codón de iniciación NEO, denominado ANEX 2, es como se indica a continuación (SEC ID Nº: 9):

CCA GCA TGGG AGG A ATCGAT CC Tcc ATG Ctt

(El codón de iniciación fuera de fase esta subrayado). La secuencia Kozak consenso totalmente alterada de ANEX 2 es idéntica a la de ANEX 1. La diferencia principal es la inclusión del codón de iniciación fuera de fase cadena arriba. Una posible diferencia es la formación de una estructura secundaria que implica esta secuencia, propuesta como se indica a continuación:

24

La secuencia en negrita, ATG, es el codón de iniciación, fuera de fase cadena arriba; la porción de ``bucle'' de la estructura secundaria es el sitio Cla I; y la secuencia entre la ``T'' y ``C'' (itálicas y negrita) es el codón de iniciación (subrayado) de la secuencia Kozak consenso totalmente alterada.

Para realizar este cambio, se clonó un fragmento PCR en anti-CD20 en ANEX 1 desde Xho I (5520) a Cla I (5901), véase la figura 4. Los cebadores fueron los siguientes:

Cebador 3' 489 (SEC ID Nº: 10):

25

La porción con una línea encima del cebador 489 es un sitio Cla I; la porción subrayada es el sitio de inicio de la traducción de la secuencia Kozak consenso totalmente alterada.

Cebador 5' 488 (SEC ID Nº: 11):

26

La porción con una línea por encima del cebador 485 es un sitio Xho I.

Estos cebadores se prepararon usando un sintetizador de ADN ABI 391 PCR MATE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las fosforamiditas se obtuvieron en Cruachem (Glasgow, Scotland): dA(bz)- Nº de Prod. 20-8120- 21; dG(ibu) - Nº de Prod. 20-8110-21; dC(bz) - Nº de Prod. 20-8130-21; T- Nº de Prod. 20-8100-21.

Las condiciones para la reacción de PCR usando estos cebadores fueron las siguientes: se mezclaron 2 \lambda (``microlitros'') de anti-CD20 en TCAE 5.2 en un plásmido desarrollado en la cepa GM48 de E. coli (obtenida en la ATCC) con 77 \lambda de agua desionizada; 2 \lambda de cebador 488 (64 pmoles) y 4 \lambda de cebador 489 (56 pmoles). Esto se continuó por una etapa de desnaturalización (94ºC, 5 minutos) y una etapa de renaturalización (54ºC, 5 minutos). Posteriormente, se añadieron 4 \lambda de dNTPS 5 mn (Promega, Madison, WI:dATP Nº de Prod. U1201, dCTP, Nº de Prod. U1221, dGTP, Nº de Prod. U1211; dTTp, Nº de Prod. U1231), 1 \lambda de ADN polimerasa de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA Nº de Prod. 600135, 2,5 U/ml) y 50 \lambda de una capa de aceite mineral, seguido de 30 ciclos, comprendiendo cada ciclo lo siguiente: 72ºC, 2 minutos; 94ºC, 1 minuto, 54ºC 1 minuto. Diez microlitros (10 \lambda) de esta mezcla se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (resultados no mostrados); y se encontró una sola banda aproximadamente 400 pares de bases.

El producto de PCR y el vector se prepararon para la unión como se indica a continuación: el anti-CD20 en el plásmido ANEX 1 desarrollado en la cepa bacteriana GM48 de E. coli de digirió con Cla I y Xho 1 como se indica a continuación: se mezclaron 20 \lambda de anti-CD20 en ANEX 1 con 10 \lambda de tampón 10XNEB4 (New England Biolabs, Beverly MA; en lo sucesivo, NEB): 5 \lambda de Cla I (NEB, Nº de Prod. 197 S, 60u); y 64 \lambda de agua desionizada. Esta mezcla se incubó durante una noche a 37ºC, seguido de la adición de 5 \lambda de Xho 1 (NEB, Nº de Prod. 146 S, 100 u) e incubación a 37ºC durante 2 horas. El material resultante se denomina en este documento ``ANEX 1 cortado con Cla 1/Xho 1''. El fragmento de PCR de aproximadamente 400 pares de bases se preparó y se digirió con Cla 1 y Xho 1 como se indica a continuación: se mezclaron 90 \lambda del fragmento de PCR con 10 \lambda de NaOAc 3 M, 1 \lambda de dodecil sulfato sódico al 10% (SDS); y 90 \lambda de fenil/CHCl_{3}/isoamilo. Esta mezcla se agitó vorticialmente durante 30 segundos seguido de una centrifugación de 1 minuto (1700 RPM). La fase acuosa se sometió a una columna giratoria que produjo 85 \lambda de mezcla total. A esta mezcla se añadieron 10 \lambda de 10XNEB4; 1 \lambda de albúmina de suero bovino (BSA, 100 X; NEB), 2 \lambda de Cla 1 (24 u) y 2 \lambda de Xho 1 (40 u). Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 2 horas. El material resultante se denomina en este documento PCR 488/489 cortado con Cla 1/Xho 1. Tanto el ANEX 1 cortado con Cla 1/Xho 1 como PCR 488/489 cortado con Cla 1/Xho 1 se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y las bandas resultantes se observaron a la misma localización relativa en el gel (resultados no mostrados).

La unión de PCR 488/489 cortado con Cla 1/Xho 1 y ANEX 1 cortado con Cla 1/Xho 1 se realizó como se indica a continuación: se mezclaron 1 \lambda de ARNt (Sigma, St. Louis, MO, Nº de Prod. R-8508) con 1 \lambda de SDS al 10%;

\hbox{10  \lambda }

de NaOAc 3 M; 45 \lambda de PCR 488/489 cortado con Cla 1/Xho 1 (aproximadamente 22,5 ng); una dilución 1:4 (

\hbox{0,25   \lambda }

) de ANEX 1 cortado con Cla 1/Xho 1 (aproximadamente 32 ng) en 0,75 \lambda de ácido tris-hidroximetil aminometano etilendiamina tetraacético (TE); y 42 \lambda de TE. A esta mezcla se le añadieron 90 \lambda de fenil/CHCl_{3}/isoamilo, seguido de una agitación vorticial de 30 segundos y una centrifugación de 1 minuto (1700 RPM). La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo, seguido de la adición de 270 \lambda de EtOH al 100% (-20ºC), y se centrifugó durante 10 minutos (13.000 RPM) seguido de la adición de otros 270 \lambda de EtOH al 100% (-20ºC) y otra centrifugación de un minuto (13.000 RPM). Esta mezcla se secó en un SpeedVAC™ y se resuspendió en 17 \lambda de TE, 2 \lambda de tampón de ligasa (Promega, kit de ADN Ligasa de T4, Nº de Prod. M180) y 1 \lambda de ligasa (kit Ligasa de Promega). Esta mezcla de unión se incubó a 14ºC durante una noche. Veinte microlitros (20 \lambda) de la mezcla de unión se mezclaron con 10 \lambda de NaOAc 3 M, 1 \lambda de SDS al 10%, 69 \lambda de TE y 90 \lambda de fenil/CHCl_{3}/isoamilo. Esta mezcla se agitó vorticialmente durante 30 segundos, seguido de una centrifugación de 1 minuto (1700 RPM). La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se añadieron 270 \lambda de EtOH al 100% (-20ºC), seguido de una centrifugación de 10 minutos (1700 RPM). Esta mezcla se secó en un SpeedVAC™ y se resuspendió en 20 \lambda de TE. Se utilizaron diez microlitros de la mezcla resuspendida para transformar E. coli X-L1 blue™ (Stratagene, La Jolla, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en Caldo LB (Gibco BRL, Grand Island, NY, Nº de Prod. N27950B) que incluía ampicilina (50 \mug/ml; Sigma, Nº de Prod. A-9393). Se aislaron plásmidos a partir de los diez cultivos con un sistema de purificación de ADN Promega (Nº de Prod. PR-A7100), siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el vector ANEX 2, dependiendo de la suficiencia de lo anterior.

ANEX 2 incluye un sitio Hinf I (``GAATC'') cadena arriba del sitio de inicio neo (de -9 a -13 con respecto al codón de inicio neo); ANEX 1 no incluye este sitio Hinf I. Los plásmidos purificados que comprenden el supuesto ANEX 2 y el patrón de ANEX 1 previamente purificado, se sometieron a digestión con Hinf 1 como se indica a continuación: se mezclaron 2 \lambda de cada aislado con 8 \lambda de tampón de digestión Hinf I (15 \lambda de 10 x tampón NEB2, 15 \lambda de Hinf I (NEB, Nº de Prod. 155S, 10u/\lambda); y 90 \lambda de H_{2}O). Esta mezcla se incubó durante 3 horas a 37ºC y cada aislado se analizó por electroforesis en gel de agarosa (resultados no mostrados); nueve (9) de las bandas fueron sustancialmente idénticas al patrón ANEX 1, una (1) mostró una ligera diferencia en el modelo de bandas. Para este único aislado, las dos primeras bandas estaban a 1691 y 670 kB; para el producto de ANEX 1 digerido con Hinf I, las tres primeras tandas estuvieron a 1691, 766 y 670 kB. La banda que faltaba a 766 kB para el único aislado se atribuyó a la presencia del sitio Hinf I en la misma, indicando que se había incorporado el cambio deseado en ANEX 1 en este vector. Este vector se denominó ``anti-CD20 en ANEX 2 (G1, K)'' y generalmente se denomina por el inventor ANEX 2.

La electroporación de anti-CD20 en ANEX 2 se realizó como se indica a continuación: se mezclaron doscientos cuarenta microlitros (240 \lambda) del anti-CD20 en el ADN de ANEX 2 (400 \mug) con 100 \lambda de 10 X tampón NBE2; 100 \lambda de Stu I (NEB, Nº de Prod. 187S, 1000 u); y 560 \lambda de TE, y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Esta mezcla después se puso en 8 columnas giratorias (de 125 \lambda cada una), seguido de la adición de 110\lambda de 10 X tampón Not I (NEB); 10 \lambda de 100X BSA; y 20 \lambda de Not I (NEB, Nº de Prod. 1895, 800 u). Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 3 horas, seguido de la adición de 120 \lambda de NaOAc 3 M y 12 \lambda de SDS al 10%. La mezcla se transfirió a dos tubos vorticiales y a cada uno se le añadieron 500 \lambda de fenil/CHCl_{3}/isoamilo, seguido de una agitación vorticial de 30 segundos y una centrifugación de 1 minuto (1700 RPM). La fase acuosa se retiró de los tubos y se segregó en 3 tubos, seguido de la adición a cada tubo de ETOH al 100% a - 20ºC, seguido de una centrifugación de 10 minutos (13.000 RPM). Posteriormente, a cada tubo se le añadió ETOH al 70% a -20ºC, seguido de una centrifugación de 1 minuto (13.000 RPM). Los tubos después se pusieron en un Speed VAC^{TM} para el secado, seguido de la resuspensión del contenido en 100 \lambda de TE en una campana estéril. Cinco microlitros (5 \lambda) del ADN resuspendido se mezclaron con 995 \lambda de agua desionizada (dilución 1:200). Se tomó una lectura de densidad óptica (DO=260) y se calculó que la cantidad de ADN presente era de 0,75 \mug/\lambda. Para utilizar 25 \mug de ADN para la electroporación, se utilizaron 32 \lambda de la dilución 1:200 del ADN (se utilizaron 25 \mug ya que esta era la cantidad de ADN utilizada para TCAE 5.2 y ANEX 1 en el ejemplo 1 anterior). La dilución 1:200 del ADN se denominó formalmente ``anti-CD20 en ANEX 2 cortado con Stu 1/Not I (25 \mug) en TE'' y generalmente se denomina (``anti-CD20 en ANEX 2''.

La célula hospedadora utilizada fue DG44 CHO (``CHO'') (véase, Urlaub, G. Somatic Cell, 1986, supra). Cien mililitros de 6,6 x 10^{5} células/ml (84%) se sometieron a una centrifugación de 2 minutos a 100 RPM. Se lavaron con 50 ml de solución tamponada con sacarosa, seguido de una centrifugación de 5 minutos a 1000 RPM; el material después se resuspendió en 4,5 ml de la solución tamponada con sacarosa. Posteriormente, las células se contaron y se mezclaron 0,4 ml de células CHO (4,0 x 10^{6} células) con 32 \lambda del anti- CD20 en ANEX 2 en cubetas de electroporación desechables estériles BTX. Los parámetros de la electroporación fueron los siguientes: 210 voltios, 400 microfaradios de capacitancia; resistencia 13 ohmios, usando un manipulador de electrocélulas BTX 600™ (BTX, San Diego, CA). Se realizaron nueve (9) electroporaciones; los voltajes reales suministrados en los tiempos reales fueron los siguientes: 1-199V, 4,23 mseg; 2-188V, 4,57 mseg; 3-189V, 4,24 mseg, 4-200V; 4,26 mseg, 5-200V, 4,26 mseg; 6-199V, 4,26 mseg, 7-189V, 4,59 mseg; 8-189V, 4,57 mseg; 9- 201V, 4,24 mseg. (Como se indica en el ejemplo I, la diferencia en el número de electroporaciones realizadas se atribuyó a la necesidad de conseguir un número estadísticamente significativo de colonias viables para cada una de las tres condiciones, TCAE 5.2, ANEX 1 y ANEX 2; la cantidad de ADN usado para cada electroporación (25 \mug) fue el mismo para cada una, y se sometieron a electroporación el mismo número de células.

Posteriormente, el material de electroporación se mezcló con 20 ml de medio de crecimiento G418 (CHO-S-SFM II menos hipoxantina y timidina (Gibco, Grand Island, NT, Nº de Form 91-0456PK) que incluía hipoxantina 50 \muM y timidina 8 \muM). La mezcla se agitó suavemente, seguido de cultivo de 200 \mul de la mezcla por pocillo en placas de 96 pocillos, una placa para cada electroporación (nueve). Comenzando el día 2 después de la electroporación, hasta el día 17, se retiraron 150 \mul de cada pocillo, y se añadieron 150 \mul de medio de crecimiento G418 reciente que contenía 400 \mug/ml de G418. Las colonias se analizaron en el día 25.

Ciento veintiuna (121) colonias expresaron el anticuerpo anti-CD20 (es decir, 13 colonias por electroporación). De éstas, 63 (52%) expresaron más de 250 \mug/ml de proteína; de las 63, 20 de las colonias (16,5%) expresaron más de 1000 \mug/ml de proteína. Sólo 5 de las 121 colonias (4,1%) expresaron menos de 25 \mug/ml de proteína. La figura 5 proporciona un histograma que compara la expresión de la proteína por colonias procedentes de los vectores TCAE 5.2, ANEX 1 y ANEX 2.

Los datos anteriores indican que, entre otras cosas, como entre ANEX 1 y ANEX 2, el uso de al menos un codón de inicio fuera de fase cadena arriba de una secuencia Kozak consenso totalmente alterada asociada con la iniciación de la traducción de un marcador selectivo dominante, reduce el número de colonias fiables que expresan el producto génico unido y aumenta significativamente la cantidad de producto génico unido expresado.

III. Impacto de la inserción del producto génico de interés dentro de al menos una región de unserción intrónica artificial de un marcador selectivo dominante

Adicionalmente sobre el vector ANEX 2, se generó un empalme artificial entre los restos aminoacídicos 51 y 52 de la región codificante de NEO de ANEX 2, seguido de la inserción de la región codificante de anti-CD20. Se generaron dos de tales vectores: el primero, que comprendía una secuencia Kozak consenso para el codón de iniciación de la traducción de NEO y que no comprendía un codón de inicio fuera de fase, se denomina ``GKNEOSPLA3F''; y el segundo, que comprendía una secuencia Kozak consenso totalmente alterada y un codón de inicio fuera de fase, se denomina ``NEOSPLA3F''.

Tanto GKNEOSPLA3F como NEOSPLA3F contienen la siguiente secuencia de intrones artificiales entre los restos aminoacídicos 51 y 52 de NEO:

27

La porción subrayada representa una secuencia susceptible a la digestión con la enzima Not I; la región que codifica para anti-CD20 entre otras, se insertó dentro de esta región.

Aunque no se desea limitación por ninguna teoría particular, el inventor postula que durante la expresión, la inclusión de un producto génico de interés dentro de una región de inserción intrónica artificial de un marcador selectivo dominante (por ejemplo el gen NEO) debe reducir significativamente el número de colonias viables que producen, en el caso de los vectores GKNEOSPA3F y NEOSPLA3F descritos, anticuerpos anti-CD20. Esto se basa en dos puntos: en primer lugar, sólo los vectores que pueden transcribir y empalmar correctamente la región codificante del anticuerpo y traducir correctamente NEO serán resistentes a G418; en segundo lugar, como cada cassette de anticuerpos tiene su propio promotor y región de poliadenilación, la transcripción y traducción del anticuerpo es independiente de la traducción de NEO.

Los vectores GKNEOSPLA3F y NEOSPLA3F se construyeron de la siguiente manera:

Anti-CD20 en ANEX 2 se digirió con Not I y Xho I para aislar el fragmento de ADN del cassette NEO de 1503 pb (véase la figura 4 entre ``Not I 7023'' y ``Xho I 5520'') como se indica a continuación: se mezclaron 10 \mul de anti- CD20 en ANEX 2 con 6 \mul de H_{2}O desionizada (``dH_{2}O''); 1 \mul de enzima Not I (NEB, Nº de Prod. 189S); 2 \mul de tampón de digestión 10X Not I (NEB; proporcionado con enzima); y 1\mul de enzima Xho I (Promega, Madison, WS, Nº de Prod. R4164). Esta mezcla de digestión se incubó durante una noche a 37ºC. El ADN digerido resultante se fraccionó por tamaños por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y el fragmento deseado que migraba a 1503 se aisló mediante el método GlassMAX™ (Gibco, BRL, Grand Island, NY, Nº de Prod. 15590-011) para la inserción en el ADN del plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).

pBluescript SK (-) se preparó previamente para la aceptación del cassette NEO por digestión doble con Not I y Xho I usando la mismas condiciones que se han indicado anteriormente para anti-CD20 en ANEX 2. Después se recogió pBluescript SK (-) digerido por precipitación con etanol por la adición de 70 \mul de dH_{2}O; 2 \mul de ARNt (Sigma, St. Louis, MO, Nº de Prod. R- 8508); 10 \mul de NaOAc 3 M; y 300 \mul de ETOH al 100% (-20ºC). Esto se continuó por una centrifugación de 10 minutos (13.000 RPM), decantando el sobrenadante, aclarando con ETOH al 70%, decantando el líquido, secando en un SpeedVAC™ y resuspendiendo en 20 \mul de 1 x TE.

La unión del fragmento de ADN del cassette NEO en el vector pBluescript SK (-) preparado se realizó como se indica a continuación: se mezclaron 10 \mul de ADN del fragmento NEO con 6 \mul de dH_{2}O; 1 \mul de ADN del vector pBluescript SK (-) cortado; 2 \mul de 10 x tampón de unión (Promega, suministrado con la enzima); y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (Promega, Nº de Prod. M1801) seguido de incubación a 14ºC durante una noche. El ADN unido se recogió por precipitación con etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación del ADN del vector pBluescript SK (-).

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN unido resuspendido para transformar E. coli y XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL, Nº de Prod. N27950B) que incluía ampicilina (50 \mul/ml; Sigma Nº de Prod. A- 9393). Se aislaron plásmidos a partir de los diez cultivos con un sistema de purificación de ADN de Promega (Nº de Prod. PR-A7100), siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado BlueNEO+ dependiendo de la suficiencia de lo anterior (BlueNEO+ se confirmó debido a la suficiencia del siguiente procedimiento).

BlueNEO+ contiene una secuencia de reconocimiento de restricción Not I reformada tras la unión del ADN del fragmento del cassette NEO al vector pBluescript SK (-). Este sitio se destruyó por lo siguiente: se mezcló 1 \mul de BlueNEO+ ADN con 16 \mul de dH_{2}O; 2 \mu de 10 x tampón de digestión Not I (NEB); y 1 \mul de enzima Not I (NEB). Esto se continuó por incubación a 37ºC durante 2 horas. Este ADN digerido después se purificó por fraccionación en columna giratoria dando como resultado un volumen final de 15 \mul. Estos 15 \mul de ADN digerido con Not I se transformaron en ADN de ``extremos romos'' mezclando con 4 \mul de 5 x tampón de Klenow (Tris HCl 20 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 100 mM) y 1 \mul del fragmento grande (Klenow) de la ADN polimerasa I (Promega, Nº de Prod. M2201). Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El ADN de extremos romos se purificó por fraccionación en columna giratoria proporcionando un volumen final de 15 \mul.

La unión del ADN de extremos romos se realizó de una forma análoga a la unión del ADN del fragemnto del cassette NEO al vector pBluescript SK (-) con la excepción de que el ADN final se resuspendió en 17 \mul de 1 x TE.

Después de la unión, el ADN se sometió a una segunda digestión de restricción con Not I mezclando los 17 \mul de ADN con 2 \mul de tampón de digestión 10 X Not I y 1 \mul de enzima Not I (NEB). Se dejó que la digestión procediera a 37ºC durante 60 minutos. Después de la digestión, la mezcla se purificó por fraccionación en columna giratoria obteniéndose un volumen final de 15 \mul.

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN purificado para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL) incluyendo ampicilina (50 \mug/ml; Sigma). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN Promega siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado BlueNEO- dependiendo de la suficiencia de lo anterior. (BlueNEO- se confirmó debido a la suficiencia del siguiente procedimiento).

BlueNEO- contiene un solo sitio de restricción Pst I que abarca los codones para los restos aminoacídicos 51 y 52. BlueNEO- se digirió con Pst I como se indica a continuación: se formó una mezcla que contenía 15 \mul de dH_{2}O; 1 \mul de ADN BlueNEO-, 2 \mul de tampón de digestión 3 (NEB) y 2 \mul de enzima Pst I (NEB, Nº. de Prod. 140S). Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 3 horas. El ADN digerido después se purificó por fraccionación en columna giratoria. Después se unió el siguiente oligonucleótido sintético a los extremos cohesivos Pst I de BlueNEO-:

5' GGTAAGTGCGGCCGCTACTAACTCTCTCCTCCCTCCTTTTTCCTGA 3' (SEC ID Nº: 12)

y su secuencia complementaria:

5' GGAAAAAGGAGGGAGGAGAGAGTTAGTAGCGGCCGCACTTACCTGCA 3' (SEC ID Nº: 13)

La inserción de este engarce crea un sitio donante de empalme 5' consenso (por unión), seguido de un sitio Not I, seguido de un punto de ramificación de empalme consenso, seguido de un tracto de polipirimidina sintético, seguido de un sitio aceptor de empalme con 3' consenso, como se ha indicado anteriormente.

La unión se realizó como se ha descrito anteriormente para la unión del cassette de NEO en pBluescript SK (-) con la excepción de que se usaron 2 \mul de ADN de BlueNEO- linealizado con Pst I y 14 \mul (175 pmoles) de oligonucleótidos complementarios templados.

Los oligonucleótidos sintéticos anteriores (y siguientes) se sintetizaron químicamente usando un sintetizador de ADN Applied Biosystems 391 PCR MATE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos los reactivos para la síntesis se adquirieron en Applied Biosystems.

El ADN unido se recogió por precipitación con etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación del ADN del vector pBluescript SK (-).

Diez (10) \mul del ADN unido resuspendido se utilizaron para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL) que incluían ampicilina (50 \mug/ml; Sigma). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado NEOSPLA y/o NEOSPLA- dependiendo de la suficiencia de lo anterior y de la orientación de la inserción de los oligonucleótidos.

La determinación de la orientación del engarce de unión de empalme se realizó por secuenciación de ácidos nucleicos usando el kit de secuenciación de ADN Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical, Cleveland, OH, Número de Prod. 70770) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la determinación de la orientación del engarce dentro de seis aislados de plásmido independientes, se realizó la identificación de NEOSPLA de tal forma que las secuencias de unión de empalme insertadas estén en la orientación de avance correcta con respecto a la dirección de la transcripción de NEO.

NEOSPLA se digirió con Xho I por la formación de una mezcla de 15 \mul de dH_{2}O; 1 \mul de ADN de NEOSPLA; 2 \mul de 10 x tampón de digestión D (Promega, suministrado con enzima); y 2 \mul de enzima Xho I (Promega, Número de Prod R6161). Esta mezcla se digirió a 37ºC durante 3 horas seguido de la purificación de ADN por fraccionación en columna giratoria. En este sitio se unió un oligonucleótido sintético autocomplementario que tenía la siguiente secuencia: 5' TCGATTAATTAA 3' (SEC ID Nº: 14). La inserción de esta secuencia cambia eficazmente el sitio Xho I a un sitio de restricción Pac I (subrayado en la SEC ID Nº: 14).

La unión se realizó como se ha descrito anteriormente para la unión del cassette NEO en pBluscript SK (-) con la excepción de que se usaron 2 \mul de ADN de NEOSPLA linealizado con Xho I y 14 \mul (175 pmoles) de oligonucleótidos complementarios templados.

El ADN unido se recogió por precipitación con etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación de ADN del vector pBluescript SK (-).

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN unido resuspendido para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL) que incluían ampicilina (50 \mug/ml; Sigma). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN de Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado NEOSPLA3 dependiendo de la suficiencia de lo anterior. (NEOSPLA3 se confirmó debido a la suficiencia del siguiente procedimiento.)

El anti-CD20 en ANEX 2 (G1, K) contiene los cassettes de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera de anti-CD20 y un cassette DHFR unido por un sitio Not I al extremo 5' y un sitio Xho I en el extremo 3'. El anti- CD20 en ANEX 2 (G1, K) se digirió con Xho I formando una mezcla de 15 \mul dH_{2}O., 1 \mul de anti-CD20 en el ADN de ANEX 2 (G1, K), 2 \mul de 10 x tampón de digestión D (Promega, suministrado con enzima) y 2 \mul de enzima Xho I (Promega, número de Prod. R6161). Esta mezcla se digirió a 37ºC durante 3 horas seguido de la purificación del ADN por fraccionación en columna giratoria. En este sitio se unió un oligonucleótido sintético autocomplementario de la siguiente secuencia: 5' TCGAAGCGGCCGCT 3' (SEC ID Nº: 15). La inserción de esta secuencia cambia eficazmente el sitio Xho I a un sitio de restricción Not I (subrayado en la SEC ID Nº: 15).

La unión se realizó como se ha descrito anteriormente para la unión del cassette NEO en pBluscript SK (-) con la excepción de que se usaron 2 \mul de anti-CD20 en ADN de ANEX 2 linealizado con Xho I y 14 \mul (175 pmoles) de oligonucleótidos complementarios templados.

El ADN unido se recogió por precipitación con etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación de ADN del vector pBluescript SK (-).

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN unido resuspendido para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL, Nº de Prod. M27950B) que incluían ampicilina (50 \mug/ml; Sigma, Número de Prod. A- 9393). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN de Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado anti-CD20 en ANEX 2 (G1, K) A dependiendo de la suficiencia de lo anterior. (Esto se confirmó debido a la suficiencia del siguiente procedimiento).

Se digirió anti-CD20 en ANEX 2 (G1, K) con Not I y Xho I formando una mezcla de 6 \mul de dH_{2}O, 10 \mul de anti-CD20 en ANEX 2 (G1, K); 2 \mul de 10 x tampón de digestión Not I (NEB, suministrado con enzima Not I); y 1 \mul de enzima Not I (NEB). Esta mezcla se digirió a 37ºC durante 3 horas seguido de fraccionación por tamaños por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento deseado que emigraba a 5515 pares de bases se aisló mediante el método GlassMAX para la inserción en NEOSPLA3.

NEOSPLA3 se había preparado previamente para la aceptación del cassette anti-CD20 por digestión de 1\mul de ADN con Not I usando una mezcla que comprendía 16 \mul de dH_{2}O; 2 \mul de 10 x tampón de digestión Not I (NEB); 1 \mul de enzima Not I (NEB); seguido de incubación a 37ºC durante 2 horas. Este ADN digerido después se purificó por fraccionación en columna giratoria obteniéndose un volumen final de 15 \mul.

La unión del fragmento de ADN anti-CD20 al vector NEOSPLA3 preparado se realizó como se indica a continuación: se mezclaron 10 \mul de ADN del fragmento anti-CD20 con 6 \mul de dH_{2}O; 1 \mul de ADN del vector NEOSPLA cortado; 2 \mul de 10 x tampón de unión (Promega suministrado con enzima); y 1\mul de ADN ligasa de T4 (Promega); seguido de incubación a 14ºC durante una noche. El ADN unido se recogió por precipitación con etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación del ADN del vector pBluescript SK(-).

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN unido resuspendido para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL) que incluían ampicilina (50 \mug/ml; Sigma). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN de Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado anti- CD20 en NEOSPLA3F y anti-CD20 en NEOSPLA3R dependiendo de la suficiencia de lo anterior y la orientación relativa del fragmento insertado con respecto a la transcripción de NEO.

La determinación de la orientación de la inserción del cassette anti-CD20 se realizó por digestión doble con Kpn I y Spe I (NEB, Nº de Prod. 1335) en tampón NEB 1 más BSA acetilado como se indica a continuación: se formó una mezcla que comprendía 4 \mul de ADN; 2 \mul de tampón NEB 1; 1 \mul de Kpn I; 1 \mul de Spe I; 2 \mul de BSA; y 10 \mul de dH_{2}O. La mezcla se digirió a 37ºC durante 2 horas, seguido de fraccionación por tamaños en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Tras determinar la orientación del inserto anti-CD20 en seis aislados de plásmidos independientes, se realizó la identificación de anti-CD20 en NEOSPLA3F de tal forma que las secuencias insertadas estén en la orientación de avance con respecto a la dirección de la transcripción de NEO.

El fragmento anti-CD20 de 5515 pb contiene el origen de SV40, un cassette de transcripción de cadena ligera de inmunoglobulina humana de ratón quimérica, un cassette de transcripción de cadena pesada de inmunoglobulina humana de ratón quimérica, y un cassette de transcripción de dihidrofolato reductasa murina (véase la figura 4).

El anti-CD20 en NEOSPLA3F se digirió de forma doble con Kpn I y Spe I creando la mezcla que constaba de 14 \mul de dH_{2}O, 1 \mul de anti-CD20 en NEOSPLA3F, 2 \mul de 10 x tampón de digestión I (NEB), suministrado con enzima, 2 \mul de 10 x BSA acetilado (NEB suministrado con la enzima) Kpn I, 1 \mul de enzima Kpn I, 1 \mul de enzima Stu I (NEB, Nº de Prod. 142S y 187S respectivamente). Esta mezcla se digirió a 37ºC durante 3 horas seguido por fraccionación por tamaños por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento deseado que emigraba a 9368 pares de bases se aisló mediante el método GlassMAX.

Se generó un fragmento de PCR de ADN a partir de TCAE 5.2. En la reacción de PCR se usaron los dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos siguientes:

28

La porción subrayada de la SEC ID Nº: 16 representa un sitio Kpn I, la porción subrayada de la SEC ID Nº: 17 representa un sitio Stu I.

El producto de PCR se digirió con Kpn I y Ste I y después se unió a anti- CD20 preparado en NEOSPLA3F.

La unión del fragmento de 627 pb en anti-CD20 preparado en NEOSPLA3F se realizó como se indica a continuación: se mezclaron 2 \mul de anti- CD20 en NEOSPLA3F; 1\mul de SDS; 1\mul de ARN (Sigma); 11 \mul de acetato sódico 3 M (pH 4,5). Después de la extracción de la mezcla en fenol/cloroformo/isoanilo, el ADN se precipitó en la fase acuosa por la adición de 270 \mul de etanol (enfriado con hielo) y esto se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos. Después de un lavado con EtOH al 70%, el ADN se resuspendió en 16 \mul de TE 10 \mul de ADN del fragmento de PCR se mezclaron con 6 \mul de dH_{2}O, 1 \mul de anti-CD20 del ADN del vector NEOSPLA3F cortado, 2 \mul de 10 x tampón de unión (Promega suministrado con enzima) y 1 \mul de ADN ligasa de T-4 (Promega) seguido de incubación a 14ºC durante una noche. El ADN unido se recogió por precipitación en etanol como se ha descrito anteriormente para la preparación del ADN del vector pBluescript SK (-).

Se utilizaron diez (10) \mul del ADN unido resuspendido para transformar E. coli XL-1 Blue™ (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inocularon diez (10) colonias bacterianas en caldo LB (Gibco BRL, Nº de Prod. M27950B) que incluían ampicilina (50 \mug/ml; Sigma, Nº de Prod. A- 9393). Se aislaron plásmidos a partir de los 10 cultivos con un sistema de purificación de ADN de Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante; estos plásmidos pueden comprender el plásmido denominado anti-CD20 en GKNEOSPLA3F dependiendo de la suficiencia de lo anterior. (La confirmación se basó en la determinación de la secuencia de diferentes regiones de GKNEOSPLA\cdotF frente a NEOSPLA3F).

El nuevo plásmido difiere de anti-CD20 en NEOSPLA3F en su secuencia Kozak para el gen NEO que es:

29

para anti-CD20 en GKNEOSPLA3F, y

30

para anti-CD20 en NEOSPLA3F.

Un análisis comparativo de la expresión de anti-CD20 en el vector TCAE 5 (que comprende NEO con la secuencia Kozak consenso); el vector ANEX 2 (que comprende NEO con la secuencia Kozak totalmente alterada y una secuencia de inicio fuera de fase cadena arriba); NEOPLA3F (anti-CD20 insertado a través de una región de inserción intrónica artificial entre los aminoácidos 51 y 52 de NEO; NEO tiene la secuencia Kozak totalmente alterada y una secuencia de inicio fuera de fase cadena arriba); y GKNEOSPLA3F (anti-CD20 insertado mediante una región de inserción intrónica artificial entre los aminoácidos 51 y 52 de NEO; NEO tiene una frecuencia Kozak consenso).

Se sometieron veinticinco (25) \mug de cada plásmido (digerido como se indica a continuación: anti-CD20 en TCAE5 y ANEX2-Not I; anti-CD20 en NEOSPLA3F - Pac I; anti-CD20 en GKNEOSPLA3F - Pac I y Kpn I) a electroporación en 4 x 10^{6} células CHO; estas digestiones se utilizaron para separar los genes expresados en células de mamífero del ADN usado para desarrollar el plásmido en bacterias. Después de la digestión, la precipitación con EtOH del ADN y el secado de la misma, el ADN se resuspendió en TE a una concentración de 1 \mug/\mul. Las condiciones de electroporación fueron como se describen en el ejemplo II, con la excepción de que se utilizaron 230 voltios y, después de la electroporación, la mezcla de células y ADN se mantuvo durante 10 minutos a temperatura ambiente en la cubeta de electroporación estéril desechable.

Después de la electroporación, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos como se muestra más adelante en la tabla 1, basándose en la frecuencia esperada de colonias resistentes a G418 (obtenidas a partir de experimentos preliminares; datos no mostrados):

TABLA I Expresión comparativa

Plásmido	Nº de	Nº de células	Nº de placas
	transfecciones	cultivadas	96 pocillos
TCAE 5	1	4 x 10^{5}	5
ANEX 2	1	2 x 10^{6}	5
GKNEOSPLA3F	1	2 x 10^{6}	5
NEOSPLA3F	5	2 x 10^{7}	5

TABLA 1 (continuación)

Plásmido \quad	\quad No. de colonias \quad	\quad Frecuencia de colonias
\quad	\quad resistentes a G418 \quad	\quad resistentes a G418 por
\quad	\quad	\quad célula transfectada
TCAE 5 \quad	\quad 16 \quad	\quad 1 en 20.000
ANEX 2 \quad	\quad 16 \quad	\quad 1 en 100.000
GKNEOSPLA3F \quad	\quad 16 \quad	\quad 1 en 100.000
NEOSPLA3F \quad	\quad 16 \quad	\quad 1 en 1.000.000

(Las células se alimentaron con medio que contenía G418 en los días 2, 5, 7, 9, 12, 14, 18, 22, 26, 30 y 34; el sobrenadante de las colonias se ensayó con respecto a la producción de inmunoglobulina y las colonias se volvieron confluentes en los pocillos en los días 18, 22, 26, 30 y 34).

Las figuras 7A a 7C proporcionan resultados de histograma y evidencia del porcentaje de colonias a un nivel particular de expresión.

Los ejemplos proporcionados aquí no deben considerarse limitados a los vectores específicos, secuencias Kozak consenso totalmente alteradas, marcadores selectivos dominantes, cassettes de transcripción y/o proteínas expresadas. La secuencia Kozak consenso totalmente alterada y su utilización no deben considerarse limitadas a los vectores ANEX 1 y ANEX 2. De forma similar, las secuencias Kozak consenso totalmente alteradas y vectores preferidos no constituyen de forma alguna una admisión ni real ni implícita, de que sean las únicas secuencias o vectores a los que tiene derecho el inventor. El inventor tiene derecho a la amplitud completa de protección bajo las leyes de patentes aplicables. El inventor ha identificado vectores preferidos que incorporan secuencias Kozak consenso totalmente alteradas en ANEX 1 y ANEX 2 para reivindicar estos vectores diseñando plásmidos que comprendan estos vectores y anti-CD20 que se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, bajo las provisiones del tratado de Budapest para el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para fines de procedimientos de patentes. Los plásmidos se ensayaron por la ATCC el 9 de noviembre de 1992 y se determinó que eran viables en esa fecha. La ATCC ha asignado a estos plásmidos los siguientes números de depósito ATCC 69120 (anti-CD20 en TCAE 12 (ANEX 1)) y 69118 (anti-CD20 en ANEX 2 (Gl, K)); para este depósito, estos plásmidos se utilizaron para transformar E. coli.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Reff, Mitchell E.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de Marcador Selectivo dominante Alterada y Estrategias de Inserción de Intrones para Potenciar la Expresión de un Producto Génico y Sistemas de Vectores de Expresión que Comprenden Dicha Secuencia

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: IDEC Parmaceuticals Corporation

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 11011 Torreyana Road

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Diego

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

ZIP: 92121

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco, 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Macintosh

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS.DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Microsoft Word 5.0

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN :

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TÉLEFONO: (619) 550-8500

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FAX: (619) 550 8750

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TAG CTA GGT CCT ACC CC

\hfill

17

\vskip0.666000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATC GAT CCT GGA TGC GG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TNN ATG CTT

\hfill

9

\vskip0.666000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla, incluyendo muesca

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CNN ATG CTT

\hfill

9

\vskip0.666000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TNN ATG TTT

\hfill

9

\vskip0.666000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CNN ATG TTT

\hfill

9

\vskip0.666000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTG GGA GCT TGG ATC GAT

\hfill

18

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCA CCA TGG TT

\hfill

11

\vskip0.666000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTG GGA GCT TGG ATC GAT

\hfill

18

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCT CCA TGC TT

\hfill

11

\vskip0.666000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCA GCA TGG AGG AAT CGA TCC

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCC ATG CTT

\hfill

9

\vskip0.666000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGA GGA TCG ATT CCT CCA TGC TGG

\hfill

24

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAC AAC TAT GTC AGA AGC AAA TGT GAG C

\hfill

28

\vskip0.666000\baselineskip

(12) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID no: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTG GGG CTC GAG CTT TGC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(13) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no62

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGT AAG TGC GGC CGC TAC TAA CTC TCT CCT

\hfill

30

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCC TCC TTT TTC CTG GA

\hfill

17

\vskip0.666000\baselineskip

(14) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGA AAA AGG AGG GAG GAG AGA GTT AGT AGC GGC

\hfill

33

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGC ACT TAC CTG CA

\hfill

14

\vskip0.666000\baselineskip

(15) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCG ATT AAT TAA

\hfill

12

\vskip0.666000\baselineskip

(16) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCG AAG CGG CCG CT

\hfill

14

\vskip0.666000\baselineskip

(17) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCA TGC GGT ACC GGA TCC ATC GAG CTA

\hfill

27

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTA GCT TTG C

\hfill

10

\vskip0.666000\baselineskip

(18) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(iv) ANTI-SENTIDO: no

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTG ACT AGG CCT AGA GCG GCC GCA CTT ACC

\hfill

30

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGC AGT TCA TCC AGG GC

\hfill

17

Claims (28)

1. Un vector de expresión para expresar una proteína de interés por técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinantes, comprendiendo dicho vector al menos un marcador selectivo dominante, donde el sitio de inicio de la traducción de dicho marcador comprende la siguiente secuencia:

1

y se selecciona entre el grupo compuesto por TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx; y TxxATGTxx; donde ``Py'' es un nucleótido de pirimidina; ``x'' es un nucleótido; y las designaciones numéricas se refieren al codón ``ATG'' con la condición de que el codón ``Txx'' cadena abajo del codón ATG no codifique un codon stop y donde una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés está unida a dicho marcador selectivo dominante.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicho marcador selectivo dominante se selecciona entre el grupo compuesto por: timidina quinasa del virus del herpes simple; adenosina desaminasa, asparagina sintetasa, gen his D de Salmonella, xantina guanina fosforribosil transferasa, higromicina B fosfotransferasa y neomicina fosfotransferasa.

3. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción es TxxATGCxx, donde ``x'' es un nucleótido.

4. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción es TCCATGCTT.

5. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción está localizada dentro de una estructura secundaria.

6. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 1000 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 1000 nucleótidos.

7. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 350 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 350 nucleótidos.

8. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 50 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 50 nucleótidos.

9. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, donde dicho codón de inicio fuera de fase forma parte de una secuencia Kozak consenso, comprendiendo la secuencia Kozak consenso la siguiente secuencia:

1

donde P es un nucleótido de purina, x es un nucleótido, y las designaciones numéricas son relativas al codón ``ATG''.

10. El vector de expresión de la reivindicación 8, donde dicho codón de inicio fuera de fase y dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción se incluyen como parte de una estructura secundaria.

11. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, donde dicha secuencia de sitio de inicio de la traducción forma parte de una estructura secundaria y dicho codón de inicio fuera de fase no forma parte de dicha estructura secundaria.

12. Un marcador selectivo dominante codificado por una secuencia de ácido nucleico, donde el sitio de inicio de la traducción de dicho marcador selectivo dominante se selecciona entre el grupo compuesto por TxxATGCxx; CxxATGCxx; CxxATGTxx; y TxxATGTxx, donde ``x'' es un nucleótido, con la condición de que ``Txx'' cadena abajo del codón ATG no codifique un codón stop.

13. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicho marcador selectivo dominante se selecciona entre el grupo compuesto por timidina quinasa del virus del herpes simple; adenosina desaminasa, asparagina sintetasa, gen his D de Salmonella, xantina guanina fosforribosil transferasa, higromicina B fosfotransferasa y neomicina fosfotransferasa.

14. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia de sitio de inicio de la traducción es TxxATGCxx, donde ``x'' es un nucleótido.

15. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción es TCCATGCTT.

16. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción está localizada dentro de una estructura secundaria.

17. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 1000 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 1000 nucleótidos.

18. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 350 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 350 nucleótidos.

19. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción comprende además al menos un codón de inicio fuera de fase dentro de aproximadamente 50 nucleótidos del codón de inicio ATG de dicho sitio de inicio, con la condición de que ningún codón stop en fase esté localizado dentro de dichos 50 nucleótidos.

20. El marcador selectivo dominante de cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 ó 19, donde dicho codón de inicio fuera de fase forma parte de una secuencia Kozak consenso, comprendiendo la secuencia Kozak consenso la siguiente secuencia:

1

donde P es un nucleótido de purina, x es un nucleótido, y las designaciones numéricas son relativas al codón ``ATG''.

21. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 19, donde dicho codón de inicio fuera de fase y dicha secuencia de sitio de inicio de la traducción se incluyen como parte de una estructura secundaria.

22. El marcador selectivo dominante de cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 ó 19, donde dicha secuencia del sitio de inicio de la traducción forma parte de una estructura secundaria y dicho codón de inicio fuera de fase no forma parte de dicha estructura secundaria.

23. Un vector de expresión incluido dentro de la American Type Culture Collection con el número de depósito 69120 o el número de depósito ATCC 69118.

24. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, donde el vector de expresión es un plásmido.

25. El vector de expresión de la reivindicación 24, integrado dentro del ácido desoxirribonucleico celular de una célula hospedadora de mamífero.

26. El vector de expresión de la reivindicación 25, donde dicha célula hospedadora se selecciona entre el grupo compuesto por DG44, DXB11, CV1, COS, R1610, SP2/0, P3x633-Ag8.653, BFA-1c1BPT, RAJI y 293.

27. El vector de expresión de la reivindicación 1, que comprende además una región de inserción intrónica artificial dentro de dicho marcador selectivo dominante, donde una secuencia codificante para una proteína de interés está localizada dentro de dicha región de inserción.

28. El marcador selectivo dominante de la reivindicación 12, que comprende además una región de inserción intrónica artificial.