BRPI0707276B1 - Polipeptídeo de fusão antagonista de receptor nogo - Google Patents

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Daniel H. S. Lee
Dingyi Wen
R. Blake Pepinsky
Jane K. Relton
Xinzhong Wang
Alexey A. Lugovskoy
Werner Meier
Ellen Garber
Laura Silvian
Paul H. Weinreb
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Biogen Ma Inc
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Abstract

polipeptídeo antagonistas de receptor nogo. a presente invenção refere-se a polipeptídeos de receptor nogo-1 imunogênicos, anticorpos de receptor nogo-1, fragmentos de ligação de antígeno desses, receptores nogo solúveis e proteínas de fusão desses e ácidos nucléicos que codificam os mesmos. também são descritos polinucleotídeos antagonistas de receptor nogo. também são descritas composições que compreendem, e métodos para fazer e usar, tais anticorpos de receptor nogo, fragmentos de ligação de antígeno desses, receptores nogo solúveis, e proteínas de fusão desses, ácidos nucléicos que codificam os mesmos e polinucleotídeos antagonistas.

Description

Campo da Invenção
[0001] Essa invenção se refere a neurobiologia e biologia molecular. Mais particularmente, essa invenção se refere a polipeptídeos imunogênicos de receptor Nogo-1 (NgR1), anticorpos de receptor No- go-1, fragmentos de ligação de antígeno desses, receptores Nogo solúveis e proteínas de fusão desses e ácidos nucléicos que codificam os mesmos. Essa invenção ainda se refere a polinucleotídeos antagonistas de receptor Nogo-1. Essa invenção ainda se refere a composições que compreendem, e métodos para fazer e usar tais anticorpos de receptor Nogo, fragmentos de ligação de antígeno desses, polipeptídeos imunogênicos de receptor Nogo-1, receptores Nogo solúveis e proteínas de fusão desses, ácidos nucléicos que codificam os mesmos e polinucleotídeos antagonistas,
Antecedentes da Invenção
[0002] Axônios e dendritos de neurônios são longas extensões ce lulares dos neurônios. A extremidade distal de um axônio ou neurito em extensão compreende uma região especializada, conhecida como o cone de crescimento. Cones de crescimento sentem o ambiente local e direcionam o crescimento axonal em direção a célula alvo do neurônio. Cones de crescimento respondem a vários sinais ambientais, por exemplo, adesividade de superfície, fatores de crescimento, neurotransmissores e campos elétricos. A orientação de crescimento no cone envolve várias classes de moléculas de adesão, sinais inter- celulares assim como fatores que estimulam e inibem os cones de adesão. O cone de adesão de um neurito em crescimento avança em várias proporções, mas tipicamente na velocidade de um a dois milímetros por dia.
[0003] Cones de crescimento têm o formato de mãos, com uma ampla expansão achatada (microespinhos ou filopódios) que se aderem diferenciadamente às superfícies no embrião. Os filopódios são continuamente ativos, alguns filopódios se retraem para dentro do cone de crescimento, enquanto outros continuam a alongar através do substrato. Os alongamentos entre filopódios diferentes formam lameli- pódios.
[0004] O cone de crescimento explora a área que está à frente de le e de cada lado com seus lamelipódios e filopódios. Quando um alongamento entra em contato com uma superfície que não é favorável para crescimento, ele retrocede. Quando um alongamento entra em contato com uma superfície favorável para crescimento, ele continua a se estender e direciona o cone de crescimento naquela direção. O cone de crescimento pode ser guiado por pequenas variações nas propriedades de superfície dos substratos. Quando um cone de crescimento atinge uma célula-alvo apropriada, uma conexão sináptica é criada.
[0005] A função de células nervosas é grandemente influenciada pelo contato entre o neurônio e outras células no seu ambiente imediato (U. Rutishauser, T. M. Jessell, Physiol. Rev. 68:819 (1988)). Essas células incluem células gliais especializadas, oligodendrócitos no sistema nervoso central (CNS), e células de Schwann no sistema nervoso periférico (PNS), que cobrem o axônio neuronal com mielina (uma estrutura isolante de membranas de múltiplas camadas) (G. Lemke, em An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed. (Sinauer, Sunderland, Mass.), p. 281 (1992)).
[0006] Embora neurônios do CNS tenham a capacidade de rege neração após lesão, eles são inibidos de fazê-lo devido à presença de proteínas inibidoras presentes na mielina e possivelmente também por outros tipos de moléculas normalmente encontradas no seu ambiente local (Brittis & Flanagan, Neuron 50:11-14 (2001); Jones et al, J. Neu- rose. 22:2792-2803 (2002); Grimpe et al, J. Neurosci. 22:3144-3160 (2002)).
[0007] Várias proteínas inibidoras da mielina que são encontradas em oligodendrócitos foram caracterizadas, por exemplo, NogoA (Chen et al, Nature 403:434-439 (2000); Grandpre et al, Nature 403:439- 444 (2000)), glicoproteína associada à mielina (MAG, McKerracher et al, Neuron 13:805-811 (1994); Mukhopadhyay et al, Neuron 13:151-161 (1994)) e glicoproteína de oligodendrócitos (OM-gp, Mikol & Stefans- son, J. Cell. Biol. 106:1213-1219 (1988)). Cada uma dessas proteínas foi mostrada separadamente como sendo um ligante para o receptor Nogo-1 neuronal (Wang et al., Nature 417:941-944 (2002); Liu et al, Science 297:1190-93 (2002); Grandpre et al, Nature 403:439-444 (2000); Chen et al, Nature 403:434-439 (2000); Domeniconi et al, Neuron 35:283-90 (2002)).
[0008] O receptor Nogo-1 é uma proteína de membrana ancorada à GPI que contém oito repetições ricas em leucina (Fournier et al, Nature 409:341-346 (2001)). Ao interagir com uma proteína inibidora (por exemplo, NogoA, MAG e OM-gp), o complexo do receptor Nogo-1 transduz sinais que levam ao colapso do cone de crescimento e inibição do crescimento de neuritos.
[0009] Há uma necessidade urgente de moléculas que inibam a ligação do receptor Nogo-1 aos seus ligantes e atenuem o colapso do cone de crescimento mediado pela mielina e inibição do crescimento de neuritos.
Sumário da Invenção
[00010] A presente invenção é direcionada ao uso de antagonistas de receptor Nogo-1 para promover o crescimento de neuritos, sobrevivência axonal, e regeneração axonal em neurônios do CNS. A invenção apresenta moléculas e métodos úteis para inibir a inibição do crescimento de neuritos, promover sobrevivência neuronal, e/ou pro- mover regeneração axonal em neurônios do CNS.
[00011] A invenção também refere-se a polipeptídeos solúveis de receptor Nogo-1 e proteínas de fusão que os compreendem, e anticorpos e fragmentos antigênicos desses direcionados contra regiões imu- nogênicas específicas do receptor Nogo-1. A invenção ainda refere-se a polipeptídeos imunogênicos de receptor Nogo-1 que se ligam aos anticorpos da invenção. A invenção também refere-se a polipeptídeos de receptor Nogo-1 que são ligados por um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor Nogo-1. Tais polipeptídeos podem ser usados, inter alia, como imunógenos ou para rastreamento de anticorpos para identificar aqueles com especificidade similar a um anticorpo da invenção. A invenção ainda refere-se a ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos dessa invenção, vetores e células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucléicos e métodos de fazer os peptídeos. Os anticorpos, receptores solúveis e proteínas de fusão de receptor dessa invenção antagonizam ou bloqueiam o receptor Nogo-1 e são úteis para inibir a ligação do receptor Nogo-1 aos seus ligantes, inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio e diminuir a inibição de crescimento ou brotamento de neurito em um neurônio.
[00012] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um poli- peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em AAAF- TGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LD ALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVV- DPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44); e LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).
[00013] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades, o ácido nucléico é operativamente ligado a uma seqüên- cia de controle de expressão. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um vetor que compreende um ácido nucléico da invenção.
[00014] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma célula hospedeira que compreende um ácido nucléico ou que compreende o vetor da invenção. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de produzir um polipeptídeo da invenção que compreende cultivar a célula hospedeira que compreende um ácido nucléico ou vetor da invenção e recuperar o polipeptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura.
[00015] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de produzir um anticorpo compreendendo as etapas de imunizar um hospedeiro com um polipeptídeo da invenção ou uma célula hospedeira que compreende um ácido nucléico ou que compreende o vetor da invenção e recuperar o anticorpo. A invenção também proporciona um anticorpo produzido pelo método ou um fragmento de ligação de antígeno desse.
[00016] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno desse que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção, em que o anticorpo não é o anticorpo monoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma HB 7E11 (No. de acesso da ATCC PTA-4587).
[00017] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurônio; (b) diminui a inibição do crescimento e brota- mento de neurito em um neurônio; e (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante. Em algumas modalidades, o crescimento e bro- tamento de neurito é crescimento axonal. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do sistema nervoso central.
[00018] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo de murino. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um anticorpo de cadeia única.
[00019] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um mé todo de inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapa de colocar o receptor Nogo-1 em contato com um anticorpo da invenção ou fragmento de ligação de antígeno desse. Em algumas modalidades o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp.
[00020] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar o neurônio em conato com um anticorpo da invenção ou fragmento de ligação de antígeno desse.
[00021] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para diminuir a inibição de crescimento ou brotamento de neurito em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar o neurônio em contato com um anticorpo da invenção ou fragmento de ligação de antígeno desse. Em algumas modalidades, o crescimento ou brotamento de neurito é crescimento axonal. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do sistema nervoso central.
[00022] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma composição que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e um anticorpo da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno desse. Em algumas modalidades, a composição ainda compreende um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[00023] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de promover sobrevivência de um neurônio em risco de morrer, compreendendo colocar o neurônio em contato com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção ou fragmento de ligação de antígeno desse. Em algumas modalidades o neurônio está in vitro. Em algumas modalidades, o neurônio está em um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero apresenta sinais e sintomas de esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, lesões cerebrais traumáticas, ou lesão da medula espinhal.
[00024] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de promover sobrevivência de um neurônio em um mamífero, cujo neurônio está em risco de morrer, compreendendo (a) fornecer uma célula hospedeira cultivada que expressa um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno desse; e (b) introduzir a célula hospedeira no mamífero no local, ou próximo ao local do neurônio.
[00025] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de terapia gênica de promover sobrevivência de um neurônio em risco de morrer, cujo neurônio está em um mamífero, compreendendo administrar no local, ou próximo do local do neurônio, um vetor viral que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno desse, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno desse é expresso a partir da seqüência de nucleotídeo no mamífero em uma quantidade suficiente para promover a sobrevivência do neurônio.
[00026] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um poli- peptídeo isolado de 60 resíduos ou menos que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: aminoácidos 309 a 335 de SEQ BD NO:49; aminoácidos 309 a 336 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 337 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 338 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 339 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 340 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 341 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 342 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 343 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 345 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 346of SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 347 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 349 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 350 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 300 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 301 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 302 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 303 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 304 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 305 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 306 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 307 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 308 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 335 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 334 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 333 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 332 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 331 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 330 a 344 de SEQ H) NO:49; aminoácidos 329 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 328 a 344 de SEQ EO NO:49; aminoácidos 327 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 326 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 325 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 324 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 323 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 322 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 321 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 320 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 319 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 318 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 317 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 316 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 315 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 314 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 313 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 312 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 311 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 345 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 346 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 347 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 349 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 350 de SEQ ID NO:49; variantes ou derivados de qualquer um dos ditos fragmentos de polipeptídeo, e uma combinação de pelo menos dois de qualquer um dos ditos fragmentos de polipeptídeo; exceto por até três substituições de aminoácido.
[00027] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: 311 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 323 a 328 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 339 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 378 a 414 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 27 a 38 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 39 a 61 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 257 a 267 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 280 a 292 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 301 a 323 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 335 a 343 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 326 a 328 de SEQ ID NO:49; variantes ou derivados de qualquer um dos ditos fragmentos de polipeptídeo, e uma combinação de pelo menos dois de qualquer um dos ditos fragmentos.
[00028] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos x a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 309 a y de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos x a y de SEQ ID NO:49, em que x é qualquer número inteiro de 305 a 326, e y é qualquer número inteiro de 328 a 350; e em que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácidos individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos x' a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 309 a y' de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos x' a y' de SEQ ID NO:49, onde x' é qualquer número inteiro de 300 a 326, e y' é qualquer número inteiro de 328 a 360, e em que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 350 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 300 a 344 de SEQ ID NO:49; e aminoácidos 315 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49.
[00029] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo da invenção que é cíclico. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo cíclico ainda compreende uma primeira molécula ligada na terminação-N e uma segunda molécula ligada na terminação-C; em que a primeira molécula e a segunda molécula são unidas uma a outra para formar a dita molécula cíclica. Em algumas modalidades, a primeira e segunda moléculas são selecionadas a partir do grupo que consiste em: uma molécula de biotina, um resíduo de cisteína e um resíduo de cisteína acetilado. Em algumas modalidades, a primeira molécula é uma molécula de biotina ligada à terminação-N e a segunda molécula é um resíduo de cisteína ligado à terminação-C do polipeptídeo de invenção. Em algumas modalidades, a primeira molécula é um resíduo de cisteína acetilado ligado à terminação-N e a segunda molécula é um resíduo de cisteína ligado à terminação-C do polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades, a cisteína C-terminal tem uma porção NH2 ligada.
[00030] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira molécula de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 25 até 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450; em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é sele-cionada a partir do grupo que consiste em (a) aminoácidos c até 445 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 27 até d de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos c até d de SEQ ID NO:49, em que c é qualquer número inteiro de 25 a 35, e d é qualquer número inteiro de 300 a 450; e em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 e (b) aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 e (b) aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 ou em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 ou em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49.
[00031] Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o primeiro fragmento de polipeptídeo está situado à montante do segundo fragmento de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona um ligante de peptídeo situado entre o primeiro fragmento de polipeptídeo e o segundo fragmento de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o ligante de peptídeo compreende SEQ ID NO:65 (G4S)3. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o ligante de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:66 (G4S)2.
[00032] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo da invenção em que pelo menos um resíduo de cisteína é substituído por um aminoácido heterólogo. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de cisteína é C266. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de cisteína é C309. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de cisteína é C335. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de cisteína é C336. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de cisteína é substituído por um aminoácido de substituição selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, serina e treonina. Em algumas modalidades, o aminoácido de substituição é alanina.
[00033] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência exceto que pelo menos um resíduo de cisteína da dita seqüência de aminoácido de refe rência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (iii) aminoácidos 27 a b de SEQ ID NO:49, e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 25 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 a 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C266 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C309 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C335 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C266 e C309 da dita seqüência de aminoácido de referência são substituídos por aminoácidos diferentes. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C309 e C335 da dita seqüência de aminoácido de referência são substituídos por aminoácidos diferentes. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o aminoácido diferente é alanina.
[00034] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49,(ii) aminoácidos 27 a b de SEQ ID NO:49, e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 25 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 a 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo; em que dito po- lipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[00035] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos a até 305 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 1 a b de SEQ ID NO:49, and (c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 1 to 27, e b é qualquer número inteiro de 264 a 309; e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos c a 332 de SEQ ID NO:60, (b) aminoácidos 275 a d de SEQ ID NO:60, e (c) aminoácidos c a d de SEQ ID NO:60, em que c é qualquer número inteiro de 265 to 306, e d é qualquer número inteiro de 308 a 340; e em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em certas modalidades, a primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49; e (b) aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49. Em certas modalidades, a segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 275 a 311 de SEQ ID NO:60; (b) aminoácidos 275 a 332 de SEQ ID NO:60; (c) aminoácidos 306 a 311 de SEQ ID NO:60; (d) aminoácidos 306 a 308 de SEQ BD NO:60; e (e) amino- ácidos 306 a 309 de SEQ ID NO:60. Em uma modalidade, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 275 a 311 de SEQ ID NO:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 275 a 332 de SEQ ID NO:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 311 de SEQ LD NO:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 308 de SEQ BD NO:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 309 de SEQ ID NO:60. Em algumas modalidades pelo menos um aminoácido adicional é adicionado à terminação-C do segundo fragmento de polipeptídeo. Em uma modalidade, o pelo menos o aminoácido adicional é triptofano. Em algumas modalidades, A269 do primeiro fragmento de polipeptídeo é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Em uma modalidade, o aminoácido diferente é triptofano.
[00036] Em algumas modalidades a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais; e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 311 a 318 de SEQ ID NO:60, exceto por até cinco substituições de aminoácido individuais; e em que dito polipeptídeo inibe a ini- bição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[00037] Em algumas modalidades a invenção ainda proporciona que o polipeptídeo heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) albumina sérica, (b) uma região Fc, (c) um peptídeo de sinal, (d) um sinalizador de polipeptídeo, e (e) uma combinação de dois ou mais dos ditos polipeptídeos heterólogos. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma região Fc de IgA; uma região Fc de IgD; uma região Fc de IgG, uma região Fc de IgE; e uma região Fc de IgM. Em uma modalidade, a região Fc é uma região Fc de IgG. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a o ligante de peptídeo está situado ente a seqüência de aminoácido e a região Fc de IgG. Em uma modalidade, o ligante de peptídeo compreende SEQ ID NO:66 (G4S)2 Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinalizador VSV-G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinalizador de c-Myc.
[00038] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptídeo da invenção ligado a uma ou mais porções de polialquileno glicol. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietile- no glicol (PEG). Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo da invenção ligado a 1 a 5 porções de PEG.
[00039] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um poli- nucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a seqüência de nucleotídeo é operativamente ligada a um elemento de controle de expressão (por exemplo, um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um sinal de secreção). Modalidades adicionais incluem um ve- tor que compreende um polinucleotídeo isolado da invenção e uma célula hospedeira que compreende o dito vetor.
[00040] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polinucleotídeo isolado selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um polinucleotídeo anti-sentido; (ii) uma ribozima; (iii) um pequeno RNA de interferência (siRNA); e (iv) um pequeno RNA em forma de grampo (shRNA).
[00041] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo anti-sentido que compreende pelo menos 10 bases complementares à porção codificante do mRNA de NgR1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é uma ribozima.
[00042] Em modalidades adicionais, o polinucleotídeo é um siRNA ou um shRNA. Em algumas modalidades, a invenção proporciona que este siRNA ou o shRNA inibe a expressão de NgR1. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o siRNA ou shRNA é pelo menos 90% idêntico à seqüência de nucleotídeo que compreende: CUACUUCUCCCGCAGGCG ou CCCGGACCGACGUCUUCAA ou CUGACCACUGAGUCUUCCG. Em outras modalidades, a seqüência de nucleotídeo do siRNA ou shRNA é CUACUUCUCCCGCAGGCG ou CCCGGACCGACGUCUUCAA ou CUGACCACUGAGUCUUCCG.
[00043] Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a seqüência de nucleotídeo do siRNA ou do shRNA é complementar ao mRNA produzido pela seqüência de nucleotídeo GATGAAGAGGGCGTCCGCT ou GGGCCTGGCTGCAGAAGTT ou GACTGGTGACTCAGAGAAGGC.
[00044] Modalidades adicionais da invenção incluem composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores ou células hospedeiras da invenção, e em certas modalidades, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, a composição compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO: 7 e um agente antiinflamatório. Em outras modalidades, a composição compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO: 9 e um agente antiinflamatório. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o agente antiinflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste em um agente antiinflamatório esteroidal e um agente antiinflamatório não-esteroidal. Em certas modalidades, agente antiinflamatório esteroidal é selecionado a partir do grupo que consiste em hidro- cortisona, 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amci- nonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona, bu- desonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobe- tasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticostero- na, cortisona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona, de- xametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, flua- zacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona, fluocinonida, acetonida de fluorocinolona, butil fluocortin, fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednidano, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinoni- da, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocorti- sona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, 21-succinato de sódio de hidrocortisona, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilpredniso- lona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, predniso- lona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de sódio de pred- nisolona, succinato de sódio de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato de sódio de prednisolona, 21-estearoglicolato de sódio de prednisolona, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, predniso- na, prednival, prednilidano, 21-dietilaminoacetato de prednilidano, ti- xocortol, triancinolona, acetonida de triancinolona, benetonida de triamcinolona e hexacetonida de triancinolona. Em uma modalidade particular, o agente antiinflamatório esteroidal é metilprednisolona. Em outras modalidades, o agente antiinflamatório não-esteroidal é selecionado a partir do grupo que consiste em alminoprofeno, benoxaprofe- no, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, na- proxeno, oxaprozin, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiapro- fênico, tioxaprofeno, indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidana- co, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco, furofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina, zido- metacina, zomepiraco, ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico, ácido tolfênamico, diflunisal, flufenisal, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam, ácido acetil salicílico, sul- fasalazina, apazona, bezpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbu- tazona e fenilbutazona.
[00045] Modalidades adicionais incluem composições onde os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO: 7 ou 9 são fundidos a um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é Fc.
[00046] Modalidades da invenção também incluem métodos para promover o crescimento de neurito, que compreendem colocar um neurônio em contato com um agente que inclui polipeptídeos, polinu- cleotídeos, ou composições da invenção, em que o dito agente inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo-1.
[00047] Modalidades adicionais incluem um método para inibir a transdução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1, compreendendo colocar um neurônio em contato com uma quantidade eficaz de um agente que inclui polipeptídeos, polinucleotídeos ou composições da invenção, em que o dito agente inibe a transdução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1.
[00048] Outras modalidades incluem um método para tratar uma doença, distúrbio, ou lesão do sistema nervoso central (CNS) em um mamífero, que compreende administrar a um mamífero que necessita de tratamento, uma quantidade eficaz de um agente que inclui polipeptídeos, polinucleotídeos ou composições da invenção, em que o dito agente inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo-1. Em certas modalidades, a doença, distúrbio ou lesão é selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, lesões cerebrais traumáticas, lesão da medula espinhal, neurite óptica, glaucoma, perda de audição, e leucodistrofia adrenal.
[00049] Em algumas modalidades a invenção ainda proporciona que o polipeptídeo está fundido a um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é albumina sérica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é uma região Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um sinalizador de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma região Fc de IgA; uma região Fc de IgD; uma região Fc de IgG; uma região Fc de IgE; e uma região Fc de IgM. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinalizador VSV- G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinalizador de c-Myc.
Breve Descrição dos Desenhos
[00050] A Figura 1 é uma representação esquemática da estrutura do receptor Nogo-1 humano. sNogoR310 humano contém os resíduos 26 a 310 de SEQ ID NO:7 e sNogoR344 contém dos resíduos 26 a 344 de SEQ ID NO:6. sNogoR310 de rato contém os resíduos 27 a 310 de SEQ ID NO:9 e sNogoR344 contém os resíduos 27 a 344 de SEQ ID NO:8.
[00051] A Figura 2 representa um gráfico de antigenicidade para a proteína do receptor Nogo-1 usando o programa Vector Nti™. P-617 de rato é SEQ ID NO: 10 e P-618 de rato é SEQ ID NO: 11. P-617 de humano é SEQ ID NO:47 e P-618 de humano é SEQ ID NO:48.
[00052] A Figura 3A é um gráfico representando a atividade de ligação do anticorpo anti- receptor Nogo-1, 7E11. O gráfico mostra o efeito da concentração de 7E11 sobre a ligação de Nogo66 ao receptor No- go-1. A Figura 3B representa a atividade de ligação do anticorpo antiReceptor Nogo-1, 1H2. O gráfico mostra o efeito da concentração de 1H2 sobre a ligação de Nogo66 a sNogoR344-Fc (também referido aqui e no pedido de patente dos Estados Unidos 60/402.866 como Fc- sNogoR344 ou Ig-sNogoR344). Fc-MAG não competiu com Nogo66 pela ligação a sNogoR344-Fc.
[00053] A Figura 4 representa os resultados de um ELISA para anticorpos anti-Nogo-R-1 1H2, 3G5 e 2F7. O efeito dos anticorpos sobre a OD450 na presença de antígenos imobilizados foi determinada. Os antígenos imobilizados foram sNogoR310-Fc (também referido aqui e no pedido de patente dos Estados Unidos 60/402.866 como Fc- sNogoR310 ou Ig-sNogoR310), sNogoR344-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 e ovalbumina e BSA.
[00054] A Figura 5 é um gráfico representando os efeitos do anticorpo monoclonal, 7E11, sobre o crescimento de neurito de DRG de rato na presença de quantidades variadas de mielina.
[00055] A Figura 6A é um gráfico representando o efeito da ligação de sNogoR310 a 125I-Nogo66 e 125I-Nogo40 na presença dos seguintes competidores: Nogo66, Nogo40 e sobrenadante de anticorpo mono clonal anti-Receptor Nogo-1. A Figura 6B representa a atividade de ligação de 125I-Nogo66 a sNogoR310.
[00056] A Figura 7 é um gráfico representado o efeito de sNo- goR310-Fc sobre a ligação de 125I-Nogo40 a sNogoR310.
[00057] A Figura 8 é um gráfico representado a atividade de ligação de sNogoR310-Fc a 125I-Nogo40.
[00058] A Figura 9A é um gráfico do efeito de sNogoR310 sobre o crescimento de neurito /célula na presença ou ausência de mielina. A Figura 9B é um gráfico do efeito de sNogoR310 sobre o crescimento de neurito na presença ou ausência de mielina.
[00059] A Figura 10A é um gráfico representado o efeito de sNo- goR310-Fc sobre o crescimento de neurito de DRG de rato P4 na presença ou ausência de quantidades crescentes de mielina. A Figura 10B representa o número de neuritos/célula após tratamento com PBS, PBS + sNogoR310-Fc, 20ng de mielina e mielina + sNogoR310- Fc.
[00060] A Figura 11 é um gráfico representado o efeito do anticorpo monoclonal 5B10 sobre o crescimento de neurito /célula na presença de quantidades crescentes de mielina.
[00061] A Figura 12 é um gráfico representando o efeito de sNo- goR310-Fc sobre o score de BBB até 30 dias após a indução de lesão em um modelo de transecção de medula espinhal de rato.
[00062] As Figuras 13A e 13B relatam o score de BBB locomotor como uma função de tempo após hemissecção dorsal nos camundongos WT ou transgênicos da Linhagem 08 ou Linhagem 01. A Figura 13C representa graficamente o ângulo do plano inclinado tolerado máximo como uma função do tempo após lesão para camundongos WT e transgênicos. A Figura 13D mostra erros dos membros traseiros durante subida em grade inclinada como uma função do tempo após a lesão. Em todos os gráficos, médias ± s.e.m. de 7 a 9 camundongos em cada grupo são relatadas. Os valores do grupo transgênico são diferentes estatisticamente dos camundongos WT, (dois asteriscos, P < 0,01; teste de t-Student).
[00063] A Figura 14A mostra o score de BBB locomotor como uma função do tempo após hemissecção dorsal em animais tratados com veículo ou sNogoR310-Fc. A Figura 14B mostra erros dos membros traseiros durante caminhada em grade como uma função do tempo após a lesão. A Figura 14C mostra análises de pegadas revelando um menor comprimento de passada e uma maior largura de passada em camundongos de controle do que em ratos não-lesionados ou lesionados + sNogoR310-Fc. Em todos os gráficos, médias ± s.e.m. de 7 a 9 ratos em cada grupo são relatadas. Os valores do grupo sNogoR310- Fc são estatisticamente diferentes do controle (Figuras 14A-B). Os valores de controle são estatisticamente diferentes dos ratos sem SCI ou SCI + sNogoR310-Fc na Figura 14C. (asterisco, p< 0,05; dois asteriscos, p < 0,01; teste de t-Student).
[00064] A Figura 15 mostra um modelo de ligação do anticorpo anti- rNgR1, 1D9, ao fragmento solúvel de NgR1 de rato (srNgR310).
[00065] A Figura 16A mostra a seqüência de nucleotídeo do cDNA do receptor Nogo humano. Os códons de início e de parada estão sublinhados. As regiões-alvo do RNAi selecionado estão em itálico. RNAi- 1 e RNAi-3 atingem especificamente o gene de NgR humano, RNAi-2 foi desenhado para atingir os genes de NgR de ser humano, camundongo e rato. A Figura 16 B mostra as seqüências de nucleotídeo dos oligonucleotídeos de DNA usados para a construção de RNAi de NgR no vetor de expressão pU6.
[00066] A Figura 17 descreve os resultados do teste de transfecção transitória de atenuação (knockdown) por RNAi em células L de camundongo.
[00067] A Figura 18 mostra a transfecção do vetor de expressão de NgR humano em células SKN e 293.
[00068] A Figura 19 representa o teste de transfecção transitória de atenuação por RNAi em células SKN humanas.
[00069] A Figura 20 mostra uma representação esquemática de um vetor lentiviral de RNAi. O cassete de expressão de RNAi pode ser inserido no sítio de PacI ou no sítio de EcoRI. LTR-repetições terminais longas; RRE-elementos de resposta Rev; cPPT-trato de polipurina central; CBA-beta actina de galinha; WPRE-elemento regulatório pós- transcricional de vírus da Hepatite da Marmota; SIN LTR-LTR auto- inativante.
[00070] A Figura 21 mostra uma análise de Western blot usando o anticorpo 7E11 para demonstrar inibição de NgR1 em células NeuroScreen clonadas.
[00071] A Figura 22 mostra um resumo da expressão de NgR em células NeuroScreen clonadas transduzidas com RNAi de LV (clone # 3G9, 1E5 1E9 IE10), LV-NgR ou células naives. Os resultados dos si nais de NgR e GAPDH no Western blot foram quantificados por densi- tometria.
[00072] A Figura 23 mostra quatro clones de célula NeuroScreen que foram estabelecidos com diferentes níveis atenuação de NgR. A expressão de NgR é mostrada como a porcentagem da proporção dos sinais de NgR:GAPDH em células de NeuroScreen naives.
[00073] As Figuras 24A-B mostram o efeito do ectodomínio do NgR1 de rato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e metilprednisolona (MP) sobre a inibição de crescimento de neurito induzida por mielina em gânglios da raiz dorsal (DRGs) de pintos in vitro. (A) Neurônios de DRG de embrião de pintos de 13 dias dissociados foram plaqueados sobre salina tamponada com fosfato (PBS) ou mielina (400 ng/cavidade) na presença de NgR(310)ecto-Fc ou MP. (B) Quantificação de crescimento de neurito por célula (^-3) expressa como uma porcentagem do controle com PBS ± SEM (^-3). Barra de graduada, 200μm. P < 0,05 comparado com controle com PBS.
[00074] As Figuras 25A-E mostram o efeito do ectodomínio do NgR1 de rato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e metilprednisolona (MP) sobre recuperação funcional após lesão da medula espinhal (SCI). (A) Score de BBB foi registrado semanalmente por 4 semanas. (B) O score de BBB em ratos tratados com MP 2 dias após SCI. (C) Escores de BBB normalizados para o dia 2 para animais individuais. (D) Freqüência de coordenação de pisada plantar consistente e de membros anteriores-posteriores, ilustrando a proporção de ratos em cada grupo que atingiram um score de 14 ou mais 3 e 4 semanas após SCI. (E) Distância média entre passos nos grupos tratados com NgR(310)ecto-Fc- e MP + NgR(310)ecto-Fc- em comparação com controles.
[00075] As Figuras 26A-B mostram o efeito do tratamento com ectodomínio do NgR1 de rato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e metilprednisolona (MP) sobre o número de axô- nios no sentido caudal à lesão da medula espinhal.
[00076] A Figura 27 mostra o efeito do ecto-domínio de NgR1 de rato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e tratamento com metilprednisolona (MP) sobre o número de axônios marcados com biotina dextran amina (BDA) em contato com neurônios motores no corno ventral.
Descrição Detalhada da Invenção Definições e Técnicas Gerais
[00077] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado entendido geralmente por um versado na técnica à qual essa invenção pertence. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições regulará. Ainda, a menos que requerido de outra forma pelo contexto, termos no singular devem incluir os plurais e termos no plural devem incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas por referência na sua totalidade para todas as finalidades.
[00078] Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não são pretendidos como limitantes. Outras características e vantagens da invenção ficarão claras a partir da descrição detalhada e das reivindicações.
[00079] Ao longo desse relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreende" ou variações, tais como, "compreendem" ou "compreendendo", devem ser entendidas por implicar a inclusão de um inteiro ou grupo de inteiros estabelecido, mas não a exclusão de nenhum inteiro ou grupo de inteiros.
[00080] A fim de definir ainda mais essa invenção, os seguintes termos e definições são fornecidos aqui.
[00081] Deve ser observado que o termo "um" ou "uma" entidade, refere-se a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, "uma molécula de imunoglobulina", é entendida como representando uma ou mais moléculas de imunoglobulina. Dessa forma, os termos "o(a)" (ou "um(a)"), "um(a) ou mais" e "pelo menos um(a)" podem ser usados aqui intercambiavelmente.
[00082] Como usado aqui, o termo "consiste em" ou variações, tal como, "consistem em ou consistindo em", como usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de número inteiros citados, mas que nenhum inteiro ou grupo de números inteiros adicional pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificada.
[00083] Como usado aqui, o termo "consiste essencialmente em", ou variações, tal como, "consistem essencialmente em" ou "consistin- do essencialmente em", como usado ao longo da especificação e reivindicações, indica a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros citado, e a inclusão opcional de qualquer inteiro ou grupo de inteiros que não altera substancialmente as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composição especificada.
[00084] Como usado aqui, "anticorpo" significa uma imunoglobulina intacta, ou um fragmento de ligação de antígeno dessa. Anticorpos dessa invenção podem ser de qualquer isotipo ou classe (por exemplo, M, D, G, E e A) ou qualquer subclasse (por exemplo, G1 a G4, A1 a A2) e podem ter tanto uma cadeia leve kappa (K) como lambda (X).
[00085] Como usado aqui, "Fc" significa uma porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um ou mais domínios da região constante da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Por exemplo, uma porção da região constante da cadeia pesada de um anticorpo que é obtenível por digestão com papaína.
[00086] Como usado aqui, "proteína de fusão de NogoR" significa uma proteína que compreende uma porção do receptor Nogo-1 solúvel fundida a um polipeptídeo heterólogo.
[00087] Como usado aqui, "anticorpo humanizado" significa um anticorpo no qual pelo menos uma porção das seqüências não humanas é substituída por seqüências humanas. Exemplos de como fazer anticorpos humanizados podem ser encontrados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293.
[00088] Como usado aqui, "anticorpo quimérico" significa um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um primeiro anticorpo e uma ou mais regiões de pelo menos outro anticorpo. O primeiro anticorpo e os anticorpos adicionais podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes.
[00089] Como usado aqui e no Pedido de Patente dos Estados Unidos 60/402.866, "receptor Nogo", "NogoR", "NogoR-1", "NgR", "NgR- 1", "NgR1" e "NGR1" significam cada, Receptor Nogo-1.
[00090] Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" é pretendido para abranger um único "polipeptídeo" assim como vários "polipeptídeos", e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Dessa forma, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido" ou qualquer outro termo usado para referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado ao invés de, ou intercambiavelmente com, qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo" também é pretendido para referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo incluindo sem limitação, glicosila- ção, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos pro- tetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma seqüência de ácido nucléico designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por síntese química.
[00091] Um polipeptídeo da invenção pode ter um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tri-dimensional definida, embora eles não tenham necessariamente tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tri-dimensional definida são referidos como enovelados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tri-dimensional definida, mas ao invés disso, po dem adotar um grande número de conformações diferentes, são referidos como desenovelados. Como usado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de carboidrato que está ligada à proteína através de uma cadeia lateral que contém oxigênio ou que contém nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
[00092] Por um polipeptídeo "isolado", ou um fragmento, variante ou derivado desse é pretendido um polipeptídeo que não está no seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente natural ou nativo. Polipeptídeos produzidos de forma recombinan- te e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção, já que são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou purificados parcialmente ou substancialmente por qualquer técnica adequada.
[00093] Na presente invenção, um "fragmento de polipeptídeo" refere- se a uma seqüência de aminoácido curta de um polipeptídeo maior. Fra-gmentos de proteína podem ser "independentes" ou podem estar compreendidos dentro de um polipeptídeo maior do qual o fragmento forma uma parte da região. Exemplos representativos de fragmentos de polipeptídeo da invenção incluem, por exemplo, fragmentos que compreendem cerca de 5 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos, e cerca de 100 aminoácidos ou mais de extensão.
[00094] Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando se referindo a um polipeptídeo da presente invenção incluem qualquer polipeptídeo que retém pelo menos alguma atividade biológica. Polipeptídeos descritos aqui podem incluir fragmentos, variantes ou moléculas derivadas deles sem limitações, contanto que o polipeptídeo ainda sirva para sua função. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da presente invenção podem incluir fragmentos pro- teolíticos, fragmentos de deleção, e em particular, fragmentos que atingem mais facilmente o sítio de ação quando dados a um animal. Fragmentos de polipeptídeo ainda incluem qualquer porção do polipeptídeo que compreende um epitopo antigênico ou imunogênico do polipeptídeo nativo, incluindo epitopos lineares assim como tridimensionais. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da presente invenção podem compreender regiões variantes, incluindo fragmentos descritos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácido alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácido. Variantes podem ocorrem naturalmente, tal como uma variante alélica. Por "variante alélica" são pretendidas formas alteradas de um gene que ocupam um dado lócus em um cromossomo de um organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985). Variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese conhecidas. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da invenção podem compreender substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas, deleções ou adições. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da presente invenção também podem incluir moléculas derivadas. Polipeptídeos variantes também podem ser referidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Como usado aqui, um "derivado" de um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo em questão que tem um ou mais resíduos derivatizados quimicamente por reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" estão aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos comuns. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por proli- na; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.
[00095] Como usado aqui, o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissulfeto com um segundo grupo tiol.
[00096] Como usado aqui, "proteína de fusão" significa uma proteína que compreende um primeiro polipeptídeo conectado linearmente, através de ligações peptídicas, a um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo podem ser idênticos ou diferentes, e eles podem ser conectados diretamente ou conectados através de ligante de peptídeo (veja abaixo).
[00097] O termo "polinucleotídeo" é pretendido para abranger um único ácido nucléico assim como vários ácidos nucléicos, e refere-se a uma molécula ou constructo de ácido nucléico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA de plasmídio (pDNA). Um polinucleotídeo pode conter uma seqüência de nucleotídeos da seqüência de cDNA de extensão completa, incluindo as seqüências 5' e 3' não traduzidas, as seqüências codificantes. Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação de amida, tal como encontrado em ácidos peptídeo nucléicos (PNA)). O polinucleotídeo pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, polinucleotídeos podem ser compostos de DNA filamento simples ou duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e dupla, RNA de filamento simples e duplo, e RNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e duplo, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de filamento simples, ou mais tipicamente, de filamento duplo, ou uma mistura de regiões de filamento simples e duplo. Além disso, os polinucleotídeos podem ser compostos de regiões de filamento triplo que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Polinucleotídeos também podem conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas principais de RNA e DNA modificados por razões de estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiadas, e bases incomuns tal como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA; dessa forma, "polinucleotídeo" abrange formas modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente.
[00098] O termo "ácido nucléico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmento de DNA ou RNA presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico ou polinucleotídeo "isolado" é pretendida uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR da invenção contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinan- tes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucléicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucléico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório tal como um promotor, sítio de ligação de ribossomo, ou um terminador de transcrição.
[00099] Como usado aqui, uma "região codificante" é uma porção de ácido nucléico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como sendo parte de uma região codificante, mas quaisquer seqüências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação de ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons e semelhantes, não são parte de uma região codificante. Duas ou mais regiões codificantes da presente invenção podem estar presentes em um único constructo de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em constructos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um único vetor pode codificar separadamente uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nu- cléico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, tanto fundidas como não fundidas a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR da presente invenção. Regiões codificantes heterólogas incluem sem limitação, elementos ou motivos especializados, tal como um peptídeo de sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo.
[000100] Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucléico é DNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo que compreende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operativamente associados com uma ou mais regiões codificantes. Uma associação operável é quando uma região codificante para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada com uma ou mais seqüências regulatórias de forma a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) seqüência(s) re- gulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificante de polipeptídeo e um promotor associado a ela) estão "operativamente associados" se a indução da função do promotor resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a habilidade das seqüências regulatórias de expressão direcionarem a expressão do produto gênico ou interferir com a habilidade do molde de DNA ser transcrito. Dessa forma, uma região promotora estaria opera-tivamente associada com um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucléico. O promotor pode ser um promotor célula-específico que direciona transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição, podem estar operativamente associados com o polinucleotídeo para direcionar transcrição célula-específica. Promotores e outras regiões de controle de transcrição adequadas conhecidas são descritas aqui.
[000101] Várias regiões de controle de transcrição são conhecidas dos versados na técnica. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tal como, mas não limitado a, segmentos de promotores e intensificadores de citomega- lovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovírus (tal como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tal como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, assim como outras seqüências capazes de controlas a expressão gênica em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensificadores tecido-específicos, assim como promotores induzíveis por linfocina (por exemplo, promotores indu- zíveis por interferons ou interleucinas).
[000102] De forma semelhante, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida daqueles versados na técnica. Eles incluem, mas não são limitados a, sítios de ligação de ribossomos, có- dons de início e terminação de tradução, e elementos derivados de pircornavírus (particularmente um sítio interno de entrada do ribosso- mo, ou IRES, também referido como uma seqüência CITE).
[000103] Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).
[000104] Regiões codificantes de polinucleotídeo e ácido nucléico da presente invenção podem estar associadas com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos secretórios ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamífero têm um peptídeo de sinal ou seqüência líder secretória que é clivada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente através do retículo endoplasmático rugoso tiver iniciado. Aqueles versados na técnica sabem que polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo de sinal fundido à terminação-N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo completo ou de "extensão completa" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobu- lina é usado, ou um derivado funcional dessa seqüência que retém a habilidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está operativamente associado com ele. Alternativamente, um peptídeo de sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional desse, pode ser usado. Por exemplo, a seqüência líder selvagem pode ser substituída pela seqüência líder de ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou de β-glicuronidase de camundongo.
[000105] Como usado aqui, o termo "manipulado" inclui manipulação de moléculas de ácido nucléico ou polipeptídeo por meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou combinações dessas técnicas).
[000106] Como usado aqui, os termos "ligado", "fundido" e "fusão" são usados intercambiavelmente. Esses termos referem-se à união de dois ou mais elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão in-frame" refere-se à união de duas ou mais fases abertas de leitura (ORFs) de polinucleotídeo para formar uma ORF mais comprida contínua, de uma maneira que mantenha a fase de leitura traducional correta das ORFs originais. Dessa forma, uma proteína de fusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos normalmente não estão unidos na natureza). Embora a fase de leitura seja tornada contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem estar separados fisicamente ou espacialmente, por exemplo, por uma seqüência ligante in-frame.
[000107] Uma seqüência "ligante" é uma sucessão de um ou mais aminoácidos que separa duas regiões codificantes de polipeptídeo em uma proteína de fusão. Um ligante típico compreende pelo menos 5 aminoácidos. Ligantes adicionais compreendem pelo menos 10 ou pelo menos 15 aminoácidos. Em certas modalidades, os aminoácidos de um ligante de peptídeo são selecionados para que o ligante seja hidro- fílico. O ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (G4S)3 (SEQ ID NO:65) é um ligante preferido que é amplamente aplicável a vários anticorpos já que ele fornece flexibilidade suficiente. Outros ligantes incluem (Gly-Gly- Gly-Gly-Ser)2 (G4S)2 (SEQ BD NO: 66), Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:67), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQ ID NO:68), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr GIn (SEQ ID NO:69), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (SEQ ID NO:70), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (SEQ ID NO:71), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu GIn Leu Ala GIn Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID NO:72), e Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID NO:73). Exemplos de ligantes mais curtos incluem fragmentos dos ligantes acima, e exemplos de ligantes mais longos incluem combinações de fragmentos dos ligantes acima, e combinações dos ligantes acima com fragmentos dos ligantes acima.
[000108] No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma "seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma direção amino para carbóxi terminal na qual os resíduos ao lado um do outro na seqüência são contíguos na estrutura primaria do polipeptídeo.
[000109] O termo "expressão" como usado aqui refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula incluindo, sem limitação, atenuação ("knockdown") de gene, assim como, expressão transitória e expressão estável. Ele inclui, sem limitação, a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), pequeno RNA em forma de grampo (shRNA), pequeno RNA de interferência (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução de tal mRNA em polipeptídeo(s), assim como qualquer outro processo que regula a transcrição ou a tradução. Se o produto final desejado for um bioquí-mico, expressão inclui a criação daquele bioquímico e quaisquer precursores. Expressão de um gene produz um "produto gênico". Como usado aqui, um produto gênico pode tanto ser um ácido nucléico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, como um polipeptídeo que é traduzido a partir de um transcrito. Produtos gênicos descritos aqui ainda incluem ácidos nucléicos com modificações pós-trancricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações traducionais, por exemplo, metilação, glicosi- lação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.
[000110] O termo "interferência de RNA" ou "RNAi" refere-se ao si- lenciamento ou diminuição de expressão gênica por siRNAs. É o processo de silenciamento gênico pós-transcricional, seqüência- específico em animais e plantas, iniciado pelo siRNA que é homólogo na sua região de dúplex à seqüência do gene silenciado. O gene pode ser endógeno ou exógeno ao organismo, integrado em um cromossomo, ou presente em um vetor de transfecção que não está integrado ao genoma. A expressão do gene é completamente ou parcialmente inibida. RNAi também pode ser considerada para inibir a função de um RNA alvo; a função do RNA alvo pode ser completa ou parcial.
[000111] Como usados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se a medidas de tratamento terapêuticas e profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou reduzir (retardar) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejado, tal como a progressão de esclerose múltipla. Resultados benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, que não piora), atraso ou retardo da progressão da doença, melhora ou paliação do estado de doença, e remissão (quer parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar prolongamento da sobrevida quando comparada com a sobre- vida esperada sem receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio, assim como, aqueles com tendência a ter a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser prevenida.
[000112] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero", entende-se qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Indivíduos mamíferos incluem, mas não são limitados a, seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda, animais de zoológico, animais de esportes, animais de estimação tais como cachorros, gatos, porquinhos-da-india, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas; primatas tais como símios, macacos, orangotangos e chimpanzés; canídeos tais como cachorros e lobos; felídeos tais como gatos, leões, e tigres; eqüinos tais como cavalos, burros, e zebras; animais que servem de alimento tais como vacas, porcos, e carneiro; ungulados tais como cervos e girafas; roedores tais como camundongos, ratos, hamster, e porcos da guiné; e assim por diante. Em certas modalidades, o mamífero é um indivíduo humano.
[000113] Como usado aqui, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Um resultado terapêutico pode ser, por exemplo, diminuição dos sintomas, sobrevida prolongada, mobilidade melhorada, e semelhantes. Um resultado terapêutico não precisa ser uma "cura".
[000114] Como usado aqui, uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz em dosagens e por períodos de tempo necessários para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, já que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[000115] A invenção é direcionada a certos antagonistas de NgR1 que promovem sobrevivência neuronal, crescimento de neuritos e regeneração axonal de neurônios, por exemplo, neurônios do CNS. Por exemplo, a presente invenção proporciona polipeptídeos e fragmentos de polipep- tídeo, anticorpos e fragmentos desses, e polinucleotídeos de NgR1 que estimulam o crescimento axonal sob condições nas quais o crescimento axonal é normalmente inibido. Dessa forma, antagonistas de NgR1 da invenção são úteis no tratamento de lesões, doenças ou distúrbios que podem ser aliviadas por promover sobrevivência neuronal, ou pela estimulação de crescimento ou regeneração axonal no CNS.
[000116] Doenças, distúrbios ou lesões do CNS exemplares incluem, mas não são limitadas a, esclerose múltipla (MS), leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielinólise pontina central (CPM), adrenoleucodistrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), Leucodistrofia de Célula Globóide (doença de Krabbe) e Degeneração Walleriana, neurite óptica, mielite transversa, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, lesão pós-radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascular cerebral, neuropatia óptica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, síndrome de deficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava- Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, e paralisia de Bell. Dentre essas doenças, MS é a mais prevalente, afetando aproximadamente 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo.
Polipeptídeos de Receptor Nogo-1
[000117] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos de receptor Nogo-1 que são imunogênicos. Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo imunogênico consiste essencialmente em uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em LDLSDNAQLRVVDPTT (rato) (SEQ ID NO: 1); LDLSDNAQLRSVDPAT (humano) (SEQ ID NO: 2); AVASG- PFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (rato) (SEQ ID NO: 3); AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA (humano) (SEQ ID NO: 4); e CRLGQAGSGA (camundongo) (SEQ ID NO: 5).
[000118] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a polipeptídeos de receptor Nogo-1 que são ligados por um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor Nogo-1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é reconhecido pelo anticorpo monoclonal 7E11. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDD AELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ" ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLS- DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVD- PTT (SEQ ID NO: 44); e LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 46).
[000119] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NOs: 1 a 5, 26 a 27, 29 a 37 e 41 a 45. Em algumas modalidades da invenção, a molécula de ácido nucléico é ligada a uma seqüência de controle de expressão (e.g., pCDNA(I)).
[000120] A presente invenção também refere-se a um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades da invenção, o vetor é um vetor de clonagem. Em algumas modalidades da invenção, o vetor é um vetor de expressão. Em algumas modalidades da invenção, o vetor contém pelo menos um marcador selecionável.
[000121] A presente invenção também se refere a células hospedeiras que compreendem o ácido nucléico ou vetor descrito acima.
[000122] A presente invenção também se refere a um método de produzir um polipeptídeo imunogênico da invenção compreendendo a etapa de cultivas uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é procariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é de levedura.
[000123] A presente invenção também está direcionada para certos polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de Receptor Nogo-1 úteis, por exemplo, para promover crescimento de neurito, promover sobrevivência neuronal, promover sobrevivência axonal ou inibir a transdução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1. Tipicamente, os polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo da invenção agem para bloquear a inibição mediada por NgR1 da sobrevivência neuronal, crescimento de neurito, ou regeneração axonal dos neurônios do sistema nervoso central (CNS).
[000124] O polipeptídeo de NgR1 humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:49.
[000125] NgR1 humano de extensão completa (SEQ ID NO:49): MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPA ASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQ LRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFR DLGNT.THLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRJDLGRLMTLYLF ANNLSALPTEAI.APLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQR LAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPG RPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTS GPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVL GPC
[000126] O polipeptídeo de NgR1 de rato é mostrado abaixo como SEQ ID NO:50.
[000127] NgR1 de rato de extensão completa (SEQ ID NO:50) |βl2Sl MK-RASSCiGSRELAWVLWLQAWRVA'njCPGACVCYN'EPKVlTSCPQQGLQAVP TGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQL HVVDPllFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLT HLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEV ^MPLRSLQYLRENDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKREAASDLEG CAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNG SGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGAS GTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC
[000128] O polipeptídeo de NgR1 de camundongo é mostrado abaixo como SEQ ID NO:51.
[000129] NgR1 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:51) TGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQL HWDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGJLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLT HCFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEV LMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEG CAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNG SGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRJKNRTRSHCREGQAGSGAS GTGDAEGSGALPALACSLÁPLGLALVLWTVLGPC
Anticorpos
[000130] A presente invenção ainda se refere a um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente a um polipeptídeo de Receptor Nogo-1 da invenção. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno deste, se liga a um polipeptídeo que consiste essencialmente em uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 5, 26 a 27, 29 a 37 e 41 a 45. O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente invenção pode ser produzido in vivo ou in vitro. A produção do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é discutida abaixo.
[000131] Um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, da invenção inibe a ligação do Receptor Nogo-1 a um ligante (por exemplo, NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) e diminui a inibição mediada por mielina de crescimento e brotamento de neuritos, particularmente crescimento axonal, e atenua o colapso do cone de crescimento mediado pela mielina.
[000132] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Receptor Nogo- 1, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, é de murino. Em algumas modalidades, o Receptor Nogo-1 é de rato. Em outras modalidades, o Receptor Nogo-1 é humano. Em algumas modalidades, o an- ticorpo anti-Receptor Nogo-1, ou fragmento de ligação de antígeno deste, é recombinante, manipulado, humanizado e/ou quimérico.
[000133] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: 7E11 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4587); 1H2 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4584); 2F7 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4585); 3G5 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA- 4586); e 5B10 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4588). Em algumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo policlonal 46.
[000134] Fragmentos de ligação de antígeno exemplares são, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb, e fragmentos que contêm fragmentos de regiões de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única, (scFv), anticorpos quiméricos, e diacorpos e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ao polipeptídeo ligação a um antígeno específico (por exemplo, imunoadesinas).
[000135] Como usado aqui, Fd significa um fragmento que consiste nos domínios VH e CHI; Fv significa um fragmento que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e dAb significa um fragmento que consiste em um domínio VH (Ward et al, Nature 341:544-546 (1989)). Como usado aqui, anticorpo de cadeia única (scFv) significa um anticorpo no qual, uma região VL e uma região VH são pareadas para formar moléculas monovalentes através de um ligante sintético que permite que eles sejam formados como uma única cadeia de proteína (Bird et al, Science 242:423-426 (1988) e Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Como usado aqui, diacorpo significa um anticorpo biespecífico no qual os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim que os domí- nios pareiem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (veja, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) e Poljak, R. J., et al, Structure 2:1121-1123 (1994)). Como usado aqui, imunoadesina que se liga especificamente a um antígeno de interesse, significa uma molécula na qual uma ou mais CDRs podem estar incorporadas, tanto covalentemente como não-covalentemente.
[000136] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma su- bunidade de polipeptídeo de um anticorpo de receptor Nogo-1 da invenção, em que a subunidade de polipeptídeo é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma cadeia pesada ou uma região variável desta; e (b) uma cadeia leve ou uma região variável desta.
[000137] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou a região variável desta, ou a cadeia leve e a região variável desta, de um subunidade de polipeptídeo de um anticorpo de Receptor Nogo-1 da invenção.
[000138] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma região hipervariável (CDR) de um anticorpo de receptor Nogo-1 da invenção ou um ácido nucléico que codifica uma CDR.
Imunização
[000139] Anticorpos da invenção podem ser gerados por imunização de um hospedeiro adequado (por exemplo, vertebrados, incluindo seres humanos, camundongos, ratos, carneiros, cabras, porcos, gado, cavalos, répteis, peixes, anfíbios, e em ovos de pássaros, répteis, e peixe). Tais anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.
[000140] Em algumas modalidades, o hospedeiro é imunizado com um polipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção. Em outras modalidades, o hospedeiro é imunizado com o receptor Nogo-1 associado com a membrana celular de uma célula intacta ou rompida e anticorpos da invenção são identificados pela ligação a um polipeptí- deo de receptor Nogo-1 da invenção.
[000141] Em algumas modalidades, o antígeno de receptor Nogo-1 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes freqüentemente precisam ser administrados em adição ao antígeno a fim de criar uma resposta imune ao antígeno. Esses adjuvantes são geralmente substâncias insolúveis ou não-degradáveis que promovem inflamação inespecífica, com recrutamento de fagócitos mononucleares no local da imunização. Exemplos de adjuvantes in-cluem, mas não são limitados a, adjuvante de Freund, RIBI (dipeptí- deos de muramil), ISCOM (complexos de imunoestimulação) ou fragmentos destes.
[000142] Para uma revisão de métodos para fazer anticorpos, veja, por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Yelton, D.E. et al, Ann. Rev. of Biochem. 50:657-80. (1981); e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Nova Iorque: John Wiley & Sons) (1989). A determinação de imunorreatividade com um polipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção pode ser feita por qualquer um de vários métodos bem-conhecidos, incluindo, por exemplo, ensaio de imunoblot e ELISA.
[000143] Produção de Anticorpos e Linhagens Celulares Produtoras de Anticorpo
[000144] Anticorpos monoclonais da invenção podem ser feitos por procedimentos comuns descritos, por exemplo, em Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), supra.
[000145] Resumidamente, em um momento apropriado o animal é sacrificado e as células- B esplênicas e/ou de linfonodos são imortalizadas por qualquer um de vários métodos que são bem-conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados, a transformação, tal como com EBV ou fusão com uma linhagem celular imortalizada, tal como células de mieloma. Após isso, as células são separadas clonalmente e os sobrenadantes de cada clone testados quanto à produção de um anticorpo específico para um polipeptídeo imunogênico de receptor Nogo- 1 da invenção. Métodos de selecionar, clonar e expressar hibridomas são bem-conhecidos na técnica. De forma semelhante, métodos para identificar a seqüência de nucleotídeo e aminoácido dos genes de imunoglobulina são conhecidos na técnica.
[000146] Outras técnicas adequadas para produzir um anticorpo da invenção envolvem exposição in vitro de linfócitos ao receptor Nogo-1 ou a um polipeptídeo imunogênico da invenção, ou alternativamente, seleção de bibliotecas de anticorpos em vetores de fago ou similares. Veja, Huse et al, Science, 246:1275-81 (1989). Anticorpos úteis na presente invenção podem ser empregados com ou sem modificação.
[000147] Antígenos (nesse caso receptor Nogo-1 ou um polipeptídeo imunogênico da invenção) e anticorpos podem ser marcados pela ligação, covalentemente ou não-covalentemente, de uma substância que fornece um sinal detectável. Vários marcadores e métodos de conjugação são conhecidos na técnica, e podem ser empregados na prática da invenção. Marcadores adequados incluem, mas não são limitados a, radionuclídeos, enzimas, substratos, co-fatores, inibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhantes. Patentes que ensinam o uso de tais marcadores incluem as Patentes U.S. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241. Ainda, imunoglobulinas recombi- nantes podem ser produzidas (veja Patente U.S. 4.816.567).
[000148] Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo têm múltiplas especificidades de ligação, tal como um anticorpo bifuncional preparado por qualquer um de vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo a produção de hibridomas híbridos, troca de dissulfeto, reticulação química, adição de ligantes de peptídeo entre dois anticorpos monoclonais, e introdução de dois grupos de ca- deias pesadas e leves de imunoglobulina em uma linhagem celular particular, e assim por diante (veja abaixo para discussão mais detalhada).
[000149] Os anticorpos dessa invenção também podem ser anticorpos monoclonais humanos, por exemplo, aqueles produzidos por células imortalizadas humanas, por camundongos SCID-hu ou outros animais não-humanos capazes de produzir anticorpos "humanos".
Bibliotecas de Apresentação em Fago
[000150] Anticorpos anti-receptor Nogo-1 dessa invenção podem ser isolados por rastreamento de uma biblioteca combinatória de anticorpo recombinante. Bibliotecas combinatórias exemplares são para ligação a um polipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção, tal como biblioteca de apresentação em fago de scFv, preparada usando cDNAs de VL e VH preparados a partir de mRNA derivado de um animal imunizado com um polipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção. Metodologias para preparar e rastrear tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Há métodos e materiais disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de apresentação em fago (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 279400-01; o kit de apresentação em fago Stratagene SurfZAP™, catálogo no. 240612; e outros e MorphoSys). Também há outros métodos e reagentes que podem ser usados para gerar e rastrear bibliotecas de apresentação de anticorpo (veja, por exemplo, Ladner et al. Pat. U.S. No. 5.223.409; Kang et al. Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter et al Publicação PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al, Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; (1992) Huse et al, Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al, EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991); Gram et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al, Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al, Nucl. Acids Res. 19:4133-4137 (1991); e Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:7978-7982 (1991).
[000151] Após o rastreamento e isolamento de um anticorpo antiReceptor Nogo-1 da invenção a partir de uma biblioteca de apresentação de imunoglobulina recombinante, o ácido nucléico que codifica o anticorpo selecionado pode ser recuperado a partir do conjunto de apresentação (por exemplo, do genoma do fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante comuns. De desejado, o ácido nucléico ainda pode ser manipulado adicionalmente para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo isolado por rastreamento de uma biblioteca combinatória, DNA que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo ou as regiões variáveis destas, é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma célula hospedeira de mamífero, como descrito acima.
Troca de classe
[000152] Anticorpos anti-receptor Nogo-1 da invenção podem ser de qualquer isotipo. Um anticorpo de qualquer isotipo desejado pode ser produzido por troca de classe. Para a troca de classe, ácidos nucléicos que codificam VL ou VH, que não incluem nenhuma seqüência de nu- cleotídeo que codifica CL ou CH, são isolados usando métodos bem- conhecidos na técnica. Os ácidos nucléicos que codificam VL ou VH são então operativamente ligados a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma CL ou CH de uma classe desejada de molécula de imunoglobulina. Isso pode ser obtido usando um vetor ou ácido nucléi- co que compreende uma cadeia de CL ou CH, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti- receptor Nogo-1 da invenção que era originalmente IgM pode ter a classe trocada para uma IgG. Além disso, a troca de classe pode ser usada para converte uma subclasse de IgG em outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2.
Anticorpos mutados
[000153] Em outras modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, da invenção podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir o Kd do anticorpo para o receptor Nogo-1, para aumentar ou diminuir Koff, ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. Métodos em mutagênese sítio-direcionada são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Nova Iorque: John Wiley & Sons) (1989). Em uma modalidade preferida, mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação à linhagem germinativa em uma região variável de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção. Em algumas modalidades, as mutações são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido que são conhecidos por ser alterados quando comparados à linhagem germinativa em uma região variável de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção. Em outra modalidade, um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve de anticorpo é mutado em uma ou mais das regiões de estrutura principal. Uma mutação pode ser feita em uma região de estrutura principal ou domínio constante para aumentar a meia-vida. Uma mutação em uma região de estrutura principal ou domínio constante também pode ser feita pa ra alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para ligação covalente ou não-covalente a outra molécula, ou para alterar tais propriedades como fixação do complemento. Mutações podem ser feitas em cada uma das regiões de estrutura principal, do domínio constante, e das regiões variáveis em um único anticorpo mutado. Alternativamente, mutações podem ser feitas em apenas uma das regiões de estrutura principal, das regiões variáveis ou do domínio constante em um único anticorpo mutado.
Anticorpos de Fusão e Imunoadesinas
[000154] Em outra modalidade, pode ser feito um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti-Receptor Nogo-1 da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, apenas a região variável do anticorpo antireceptor Nogo-1 é ligada ao polipeptídeo. Em outras modalidades, o domínio VH de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 dessa invenção é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto que o domínio VL do anticorpo é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa com o primeiro polipeptídeo de uma maneira que permite que os domínios VH e VL interajam um com o outro para formar um sítio de ligação de anticorpo. Em outras modalidades, o domínio VH é separado do domínio VL por um ligante que permite que os domínios VH e VL interajam um com o outro (veja abaixo sob Anticorpos de Cadeia Única). O anticorpo VH -ligante- VL é então ligado a um polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo para uma célula ou tecido que expressa um ligante de receptor Nogo-1. O polipeptídeo de interesse pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, ou pode ser um agente de diagnóstico, tal com uma enzima que pode ser facilmente visualizada, tal como peroxidase de rábano silvestre. Além disso, podem ser criados anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados um ao outro. Isso é útil quando deseja-se criar um anticorpo divalente ou polivalente em uma única cadeia de polipeptídeo, ou quando deseja-se criar um anticorpo bies- pecífico.
Anticorpos de Cadeia Única
[000155] A presente invenção inclui um anticorpo de cadeia única (scFv) que se liga a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção. Para produzir o scFv, DNA codificante de VH e VL é operativamente ligado a um DNA que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 10), tal que as seqüências de VH e VL possam ser expressas como uma prote-ína de cadeia única contígua, com as regiões de VL e VH unidas pelo ligante flexível (veja, por exemplo, Bird et al, Science 242:423-426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990)). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única VH e VL forem usadas, bivalente se duas VH e VL forem usadas, ou polivalente, se mais do que duas VH e VL forem usadas.
Anticorpos Quiméricos
[000156] A presente invenção ainda inclui um anticorpo biespecífico, ou fragmento de ligação de antígeno deste, no qual uma especificidade é para um polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção. Em uma modalidade, pode ser gerado um anticorpo quimérico que se liga especificamente a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. O anticorpo quimérico pode ser produzido através de técnicas de biologia molecular recombinante, ou pode ser conjugado fisicamente. Além disso, pode ser gerado um anticorpo de cadeia única que contém mais do que uma VH e VL que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção e a outra molécula que está associada com o colapso do cone de crescimento mediado pela mielina e inibição de crescimento e brotamento de neurito. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem-conhecidas, por exemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 7281 (1994) e Wright & Harris, supra, e em conjunto com (iii) veja por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992).
[000157] Em algumas modalidades, os anticorpos quiméricos são preparados usando uma ou mais das regiões variáveis de um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, o anticorpo quimérico é preparado usando uma ou mais regiões de CDR do dito anticorpo.
Anticorpos Derivatizados e Marcados
[000158] Um anticorpo, ou um fragmento de ligação deste, da invenção pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Em geral, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, é derivatizado tal que a ligação a um polipeptídeo da invenção não é afetada adversamente pela derivatização ou marcação. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser ligada funcionalmente (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo com outra molécula (tal como região central de estreptavidina ou um sinalizador de polihistidina).
[000159] Em algumas modalidades, um anticorpo derivatizado é produzido por reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, que têm dois grupos reativos distintamente separados por um espaça- dor apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de di- succinimidila). Tais ligantes estão disponíveis por Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
[000160] Em algumas modalidades, o anticorpo derivatizado é um anticorpo marcado. Agentes de detecção exemplares com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser derivatizada são compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluores- ceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeri- trina, lantanídeo fosforoso e semelhantes. Um anticorpo também pode ser marcado com enzimas que são úteis para detecção, tal como peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e semelhantes. Em modalidades que são marcadas com uma enzima detectável, o anticorpo é detectado por adicionar reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, peroxidase de rábano silvestre com peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina. Um anticorpo também pode ser marcado com biotina, e detectado através de medida indireta da ligação de avidina e estreptavidina. Um anticorpo também pode ser marcado com um epito- po de polipeptídeo predeterminado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal e sinalizadores de epitopo).
[000161] Um anticorpo anti-receptor Nogo-1, ou fragmento de ligação de antígeno deste, também pode ser marcado com um aminoácido radiomarcado. O radiomarcador pode ser usado tanto para fins de diagnóstico como terapêuticos. O anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomarcado pode ser usado diagnosticamente, por exemplo, para determinar os níveis de receptor Nogo-1 em um indivíduo. Além disso, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomarcado pode ser usado terapeu-ticamente para tratar lesão da medula espinhal. Exemplos de marca- dores para polipeptídeos incluem, mas não são limitados, aos seguintes radioisótopos ou radionuclídeos - - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
[000162] Um anticorpo anti-receptor Nogo-1, ou fragmento de ligação de antígeno deste, também pode ser derivatizado com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo de carboidrato. Esses grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida sérica ou para aumentar a ligação ao tecido.
Caracterização de Anticorpos Anti-Receptor Nogo-1 Classe e subclasse de Anticorpos Anti-Receptor Nogo-1
[000163] A classe e a subclasse de anticorpos anti-receptor Nogo-1 podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse particular de anticorpo. Tais anticorpos são disponíveis comercialmente. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA, Western blot, assim como outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas por seqüenciamento de todo ou de uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando suas seqüências de aminoácido a seqüências de aminoácido conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.
Afinidade de ligação de anticorpo anti-receptor Nogo-1 a receptor Nogo-1
[000164] A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser medida por ELISAs competitivos, RIAs, BIAcore ou tecnologia KinExA. A taxa de dissociação também pode ser medida por BIAcore ou tecnologia KinExA. A afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas por ressonância de plasma de superfície, usando, por exemplo, BIAcore. A Kd de 7E11 e 1H2 foram determinados como sendo 1 x 10-7 M e 2 x 10-8 M, respectivamente.
Inibição da atividade de receptor Nogo-1 por anticorpo anti-receptor Nogo-1
[000165] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-receptor No- go-1, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, da invenção inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante. A IC50 de tal inibição pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por ELISA, RIA, ou Antagonismo Funcional. Em algumas modalidades, a IC50 está entre 0,1 e 500 nM. Em algumas modalidades, a IC50 está entre 10 e 400 nM. Em outras modalidades ainda, o anticorpo ou porção deste tem uma IC50 entre 60 nM e 400 nM. A IC50 de 7E11 e 1H2 foram determinadas como sendo 400 nM e 60 nM, respectivamente, em um ensaio de ligação. Veja também, tabela 3, infra.
[000166] Em algumas modalidades, a presente invenção também inclui anticorpos específicos de NgR1, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados que são antagonistas da atividade de NgR1. Por exemplo, a ligação de certos anticorpos de NgR1 a NgR1 bloqueia a inibição mediada por NgR1 da sobrevivência neuronal, crescimento de neurito ou regeneração axonal de neurônios do sistema nervoso central (CNS).
[000167] Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, que se liga especificamente ou preferivelmente a pelo menos um epitopo de NgR1, onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos cerca de quatro a cinco aminoácidos de SEQ ID NO:49, pelo menos sete, pelo menos nove, ou entre pelo menos 15 a cerca de 30 aminoácidos de SEQ ID NO:49. Os aminoácidos de um dado epitopo de SEQ ID NO:49 como descrito, podem ser, mas não precisam ser, contíguos ou lineares. Em certas modalidades, o pelo menos um epitopo de NgR1 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um epitopo não linear formado pelo domínio extracelular de NgR1 quando expresso sobre a superfície de uma célula ou como um fragmento solúvel, por exemplo, fundido a uma região Fc de IgG. Dessa forma, em certas modalidades o pelo menos um epitopo de NgR1 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, entre cerca de 15 a cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:49, onde aminoácidos não-contíguos formam um epitopo através do enovelamento da proteína.
[000168] Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, que se liga especificamente ou preferivelmente a pelo menos um epitopo de NgR1, onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, além de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contíguos ou não contíguos de SEQ ID NO: 49, como descrito acima, uma porção adicional que modifica a proteína, por exemplo, uma porção de carboidrato que pode ser incluída de modo que o anticorpo de NgR1 se ligue com maior afinidade a proteína- alvo modificada do que a uma versão não modificada da proteína. Alternativamente, o anticorpo de NgR1 não se liga à versão não modificada da proteína-alvo.
[000169] Em certas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, da invenção se liga especificamente a pelo menos um epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acima, isto é, se liga a tal epitopo mais facilmente do que se ligaria a um epitopo não relacionado, ou aleatório; se liga preferivelmente a pelo menos um epitopo de NgR1, ou fragmento ou variante descrito acima, isto é, se liga a tal epitopo mais facilmente do que se ligaria a um epitopo relacionado, similar, homólogo ou análogo; inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de referência, que por si só, se liga especificamente ou preferivelmente a um certo epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acima; ou se liga a pelo menos um epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acima com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação KD menor do que cerca de 5 x 10-2 M, cerca de 10-2 M, cerca de 5 x 10-3 M, cerca de 10-3 M, cerca de 5 x 10-4 M, cerca de 10-4 M, cerca de 5 x 10-5 M, cerca de 10-5 M, cerca de 5 x 10-6 M, cerca de 10-6 M, cerca de 5 x 10-7 M, cerca de 10-7 M, cerca de 5 x 10-8 M, cerca de 10-8 M, cerca de 5 x 10-9 M, cerca de 10-9 M, cerca de 5 x 10-10 M, cerca de 10-10 M, cerca de 5 x 10-11 M, cerca de 10-11 M, cerca de 5 x 10-12 M, cerca de 10-12 M, cerca de 5 x 10-13 M, cerca de 10-13 M, cerca de 5 x 10-14 M, cerca de 10-14 M, cerca de 5 x 10-15 M, ou cerca de 10-15 M. Em um aspecto particular, o anticorpo, ou fragmento deste, se liga preferivelmente a um polipeptídeo de NgR1 humano, ou fragmento deste, em relação a um polipeptídeo de NgR1 de murino, ou fragmento deste.
[000170] Como usado no contexto das constantes de dissociação de ligação de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nos métodos utilizados para medir afinidade de anticorpo. Por exemplo, dependendo do nível de precisão da instrumentação usada, erro padrão baseado no número de amostras medidas, e erro de arredondamento, o termo "cerca de 10-2 M" poderia incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
[000171] Em modalidades específicas, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa de dissociação (off rate) (k(off)) menor ou igual a 5 X 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 X 10-3 seg-1 ou 10-3 seg-1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado deste, da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 X 10-5 seg-1, ou 10-5 seg-1, 5 X 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 X 10-7 seg-1 ou 10-7 seg-1.
[000172] Em outras modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação, variante ou derivado deste, da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa de associação (k(on)) maior ou igual a 103 M-1 seg-1, 5 X 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 ou 5 X 104 M-1 seg-1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa de associação (k(on)) maior do que ou igual a 105 M-1 seg-1, 5 X 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, ou 5 X 106 M-1 seg-1 ou 107 M-1 seg-1.
[000173] Em uma modalidade, um antagonista de NgR1 para uso nos métodos da invenção é uma molécula de anticorpo, ou um fragmento imunoespecífico deste. A menos que seja especificamente observado, como usado aqui, um "fragmento deste" em relação a um anticorpo refere-se a um fragmento imunoespecífico, isto é, um fragmento de ligação de antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo da in-venção, é uma molécula de ligação, polipeptídeo de ligação, ou anticorpo biespecífico, por exemplo, um anticorpo, minicorpo, anticorpo com um domínio deletado ou proteína de fusão biespecífica, que tem especificidade de ligação por mais do que um epitopo, por exemplo, mais do que um antígeno ou mais do que um epitopo no mesmo antí- geno. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico tem pelo menos um domínio de ligação específico para pelo menos um epitopo em ngR1. Um anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo tetravalente que tem dois domínios de ligação ao alvo específicos para um epitopo de NgR1 e dois domínios de ligação ao alvo específicos para um segundo alvo. Dessa forma, um anticorpo biespecífico tetravalente pode ser bivalente para cada especificidade.
[000174] Certas modalidades da presente invenção compreendem a administração de um anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento imunoespecífico deste, no qual pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios de região constante foram deletados ou alterados de outra maneira de modo a fornecer características bioquímicas desejadas, tais como funções efetoras reduzidas, a habilidade de dimerizar não- covalentemente, habilidade aumentada de se localizar em um local de um tumor, meia-vida sérica reduzida, ou meia-vida sérica aumentada quando comparado com um anticorpo inteiro, inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, certos anticorpos para uso nos métodos de tratamento descritos aqui são anticorpos com domínio deletado que compreendem uma cadeia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que não têm pelo menos uma porção de um ou mais dos domínios da cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, um domínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será deletado, por exemplo, todo ou parte do domínio CH2 será deletado.
[000175] Em certos anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imunoespecíficos destes, para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui, a porção Fc pode ser mutada para alterar, por exemplo, aumentar, diminuir ou modular a função efetora usando metodologias conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constan te pode reduzir ou alterar a ligação do receptor Fc do anticorpo modificado circulante aumentando assim a localização do tumor. Em outros casos, pode ocorrer que modificações da região constante compatíveis com a presente invenção diminuem a ligação do complemento e assim reduzem a meia-vida sérica e associação inespecífica de uma citotoxi- na conjugada. Outras modificações ainda da região constante podem ser usadas para modificar ligações de dissulfeto ou porções de oligos- sacarídeo que permitem localização intensificada devido a especificada de antígeno aumentada ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico resultante, a biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tal como localização do tumor, biodistribuição e meia- vida sérica, podem ser facilmente medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem-conhecidas sem experimentação excessiva.
[000176] Formas modificadas de anticorpos ou fragmentos imunoes- pecíficos destes, para uso nos métodos diagnósticos e terapêuticos descritos aqui podem ser feitos a partir de anticorpos precursores ou parentais inteiros usando metodologias conhecidas na técnica. Metodologias exemplares são discutidas aqui em mais detalhes.
[000177] Em certas modalidades ambas as regiões variável e constante de anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imunoespe- cíficos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui são completamente humanos. Anticorpos completamente humanos podem ser feitos usando metodologias que são conhecidas na técnica e conforme descrito aqui. Por exemplo, anticorpos completamente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados por administrar o antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a estímulo antigênico, mas cujos loci antigêni- cos foram desativados. Técnicas exemplares que podem ser usadas para fazer tais anticorpos são descritas nas Patentes U.S. 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Outras metodologias são conhecidas na técnica. Anticorpos completamente humanos podem igualmente ser produzidos por várias tecnologias de apresentação, por exemplo, apresentação em fago, ou outros sistemas de apresentação, como descrito em mais detalhes em outro local neste documento.
[000178] Anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imunoes- pecíficos destes, para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos aqui podem ser feitos ou manufaturados usando metodologias que são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, moléculas de anticorpo ou fragmentos destas, são "produzidas recombinante- mente", isto é, são produzidas usando tecnologia de DNA recombinante. Técnicas exemplares para fazer moléculas de anticorpo ou fragmentos destas são discutidos em mais detalhes em outro local neste documento.
[000179] Anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos imunoes- pecíficos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo tal que a ligação covalente não impeça que o anticorpo se ligue especificamente ao seu epitopo cognato. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amida- ção, derivatização ou por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. qualquer uma de várias modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química especifica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tuni- camicina, etc. adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.
[000180] Em modalidades preferidas, um anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento imunoespecífico deste, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui, não farão surgir uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um ser humano. Em uma modalidade, anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imuno- específicos destes para uso nos métodos de tratamento descritos aqui podem ser modificados para reduzir sua imunogenicidade usando metodologias conhecidas na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser humanizados, primatizados, desimunizados, ou anticorpos quiméricos podem ser feitos. Esses tipos de anticorpos são derivados de um anti-corpo não-humano, tipicamente um anticorpo de murino ou primata, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo parental, mas que é menos imunogênico em humanos. Isso pode ser obtido por vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não-humanos inteiros em regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões de determinação de comple-mentaridade (CDRs) não-humanas em um estrutura principal e regiões constantes humanas com ou sem retenção de resíduos críticos do estrutura principal; ou (c) transplantar os domínios variáveis não- humanos inteiros, mas "ocultando" os mesmos com uma seção semelhante a uma humana por substituição de resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci 81:6851-6855 (1984); Morrison et al, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), e Pat. U.S. Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.190.370, todos os quais estão por meio deste incorporados por referência na sua totalidade.
[000181] Desimunização também pode ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Como usado aqui, o termo "desi- munização" inclui alteração de um anticorpo para modificar epitopos de célula T (veja, por exemplo, WO9852976A1, WO0034317A2). Por exemplo, seqüências de VH e VL do anticorpo inicial são analisadas e um epitopo de célula T humano "mapeado" de cada região V mostrando a localização de epitopos em relação às regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chave dentro da seqüência. Epitopos de célula T individuais do mapa de epitopos de célula T são analisados a fim de identificar substituições de aminoácido alternativas com baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma gama de seqüências de VH e VL alternativas é desenhada, compreendendo combinações de substituições de aminoácido e essas seqüências são subseqüentemente incorporadas em uma gama de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos imunoespecíficos destes, para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos aqui, que são então testados quanto à função. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados. Genes de cadeia pesada e leve completos compreendendo regiões V modificadas e C humanas são então clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subseqüentes introduzidos em linhagens celulares para a produção do anticorpo inteiro. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e a variante ótima é identificada.
[000182] Anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes, para uso nos métodos da presente invenção podem ser gerados por qualquer método adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlo- nais podem ser produzidos por vários procedimentos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, um fragmento imunoespecífico de NgR1 pode ser administrado a vários animais hospedeiros incluindo, mas não limitados, a coelhos, camundongo, ratos, etc. para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antígeno. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imuno- lógica, dependendo da espécie de hospedeiro, e incluem, mas, não são limitados a, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais, tal como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície, tal como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas de keyhole limpet, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes também são bem-conhecidos na técnica.
[000183] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma grande variedade de metodologias conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinantes e de apresentação em fago, ou uma combinação destas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando metodologias de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (as ditas referências incorporadas por referência nas suas totalidades). O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui, não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não ao método pelo qual ele é produzido. Dessa forma, o termo "anticorpo monoclonal" não é limitado a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma grande variedade de metodologias conhecidas na técnica incluindo o uso de tecnologia de hibridoma, recombinante e de apresentação em fago.
[000184] Usando protocolos reconhecidos na técnica, em um exem plo, anticorpos são criados em mamíferos por injeções subcutâneas ou intraperitoneais do antígeno relevante (por exemplo, antígenos de NgR1 purificados ou células ou extratos celulares contendo tais antígenos) e um adjuvante. Essa imunização faz surgir tipicamente uma resposta imune que compreende a produção de anticorpos reativos para o antígeno de esplenócitos e linfócitos ativados. Enquanto os anticorpos resultantes podem ser colhidos do soro dos animais para fornecer preparações policlonais, é freqüentemente desejado isolar linfócitos individuais do baço, nodos linfáticos ou sangue periférico para fornecer preparações homogêneas de anticorpos monoclonais (MAbs). Preferivelmente, os linfócitos são obtidos do baço.
[000185] Nesse processo bem-conhecido (Kohler et al, Nature 256:495 (1975)) os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais, de um mamífero que foi injetado com o antígeno são fundidos com uma linhagem celular tumoral imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma), produzindo assim células híbridas ou "hibridomas" que são imortais e capazes de produzir anticorpo codificado geneticamente da célula B. os híbridos resultantes são segregados em estirpes genéticas únicas por seleção, diluição, e recultivo com cada estirpe individual compreendendo genes específicos para a formação de um único anticorpo. Elas produzem anticorpos que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em relação a sua porcentagem genética pura, são chamamos "monoclonais".
[000186] Células de hibridoma preparadas dessa forma são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento e sobrevivência de células de mieloma não-fundidas, parentais. Aqueles versados na técnica avaliarão que reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, seleção e crescimento dos hibridomas são disponíveis comercialmente a partir de várias fontes e protocolos padroniza- dos são bem estabelecidos. Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. Preferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, tal como, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorven- te ligado à enzima (ELISA). Após terem sido identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos usuais (Go- ding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Ainda será avaliado que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentos de purificação convencionais, tais como, por exemplo, proteína-A, cromatografia em hidroxila- patita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[000187] Fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.
[000188] Aqueles versados na técnica também avaliarão que DNA que codifica anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sítios de ligação de antígeno) também pode ser derivado de bibliotecas de fago de anticorpo. Em uma particular, tal fago pode ser utilizado para apresentar domínios de ligação de antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpo combinatória (por exemplo, humana ou de murino). Fagos que expressam um domínio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno de interesse podem ser selecionados ou identificados com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou esfera (bead). Fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo domínios de ligação fd e M13 expressos a partir de fagos com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizados por dissulfeto fundidos de forma recombinante à proteína do gene III ou do gene VIII do fago. Métodos exemplares são descritos, por exemplo, em EP 368 684 B1; patente U.S. 5.969.108, Hoogenboom, H.R. & Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al. Nat. Med. 8:801 (2002); Huie et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:2682 (2001); Lui et al., J. Mol. Biol. 315:1063 (2002), cada um dos quais está incorporado aqui por referência. Várias publicações (por exemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) descreveram a produção de anti corpos humanos de alta afinidade por embaralhamento de cadeia, assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir grandes bibliotecas de fagos. Em outras modalidades, apresentação ribossomal pode ser usada para substituir bacteriófagos como a plataforma de apresentação (veja, por exemplo, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:3750 (2001); ou Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). Ainda em outra modalidade, bibliotecas de superfície de célula podem ser rastreadas por anticorpos (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 10701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Tais procedimentos fornecem alternativas às técnicas de hibridoma tradicionais para o isolamento e subseqüente clonagem de anticorpos monoclonais.
[000189] Em métodos de apresentação em fago, domínios de anticorpos funcionais são apresentados sobre a superfície das partículas de fago que carregam as seqüências de polinucleotídeo que as codifi- cam. Em particular, seqüências de DNA que codificam regiões de VH e VL são amplificadas de bibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA de tecidos linfóides de humano ou murino) ou bibliotecas de cDNA sintéticas. Em certas modalidades, o DNA que codifica as regiões de VH e VL são unidos juntos por um ligante de scFv por PCR e clonados em um vetor de fagomídeo (por exemplo, p CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado em E. coli e a E. coli é infectada com um fago auxiliar. Fagos usados nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 e as regiões de VH e VL são geralmente fundidas de forma recombinante ao gene III ou ao gene VIII de fago. Fagos que expressam um domínio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno de interesse (isto é um polipeptídeo de NgR1 ou um fragmento deste) podem ser selecionados ou identificados com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou esfera.
[000190] Exemplos adicionais de métodos de apresentação em fago que podem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles descritos em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 752:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al, Eur. J. Immunol 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Pedido PCT No. PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Pat. U.S. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais está incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[000191] Como descrito nas referências acima, após a seleção dos fagos, as regiões codificantes de anticorpo dos fagos podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos hu- manos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células de planta, leveduras e bactérias. Por exemplo, técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 também podem ser empregados usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles descritos na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al, BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai et al, AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al, Science 240: 10411043 (1988) (as ditas referências estão incorporadas por referência nas suas totalidades).
[000192] Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritos nas Pat. U.S. Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al, Methods in Enzymology 205:46-88 (1991); Shu et al, PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al, Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro , pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de espécies animais diferentes, tal como anticorpos que têm uma região variável derivada um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al, J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); Pat. U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816397, que estão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades. Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não- humanas que se ligam ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) das espécies não-humanas e regiões de estrutura principal de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, resíduos de estrutura principal nas regiões de estrutura principal humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente, melhorar, a ligação ao antígeno. Essas substituições no estrutura principal são identificadas por métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações da CDR e resíduos do estrutura principal para identificar resíduos do estrutura principal importantes para a ligação ao antígeno e comparação de seqüência para identificar resíduos de estrutura principal incomuns em posições particulares (veja, por exemplo, Queen et al, Pat. U.S. No. 5.585.089; Riechmann et al, Nature 332:323 (1988), que estão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades). Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de metodologias conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; publicação PCT WO 91/09967; Pat. U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), "veneering" ou "resurfacing" (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al, Protein Engneering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al, PNAS 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeia (Pat. U.S. No. 5.565.332).
[000193] Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de apresentação em fago descritos acima usando bibliotecas de anticorpo derivadas de seqüências de imunoglobulina humana. Veja também, Pat. U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais está incorporada aqui por referência na sua totalidade.
[000194] Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imu- noglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo. Alternativamente, a região variável humana, região constante, e região de diversidade podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de camundongo em adição aos genes humanos de cadeia pesada e leve. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem ser tornados não- funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpo endógeno. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são então cruzados para produzir prole homozigota que expressa anticorpos humanos. Os camundongos quiméricos são então imunizados no modo normal com um antígeno selecionado, por exemplo, toda ou uma porção de um polipeptídeo-alvo desejado. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir do camundongo transgênico imunizado usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana carregados pelos camundongos transgênicos sofrem rearranjo durante a diferenciação de células-B, e sub- seqüentemente sofrem troca de classe e mutação somática. Dessa forma, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para um resumo dessa tecnologia para produzir anticorpos humanos, veja, Lonberg & Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, veja, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Pat. U.S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598 que estão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades. Além disso, empresas tais como Ab- genix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
[000195] Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção guiada". Nessa abordagem, um anticorpo monoclonal não-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo (Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988)). Veja também, Patente U.S. No. 5.565.332.
[000196] Em outra modalidade, DNA que codifica anticorpos monoclonais desejados podem ser facilmente isolados e seqüenciados usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos muri- nos). As células de hibridoma isoladas e subclonadas servem como uma fonte preferida do tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas tais como células de E. coli , células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem imunoglobulinas de outra maneira. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético conforme descrito aqui) pode ser usado para clonar seqüências da região constante e variável para os anticorpos produzidos conforme descrito em Newman et al., Pat. U.S. No. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que está incorporada aqui por referência. Basicamente, isso exige a extração de RNA das células selecionadas, conversão para cDNA, e amplificação por PCR usando iniciadores específicos de Ig. Iniciadores adequados para essa finalidade também são descritos na Pat. U.S. 5.658.570. Como será discutido em mais detalhes abaixo, células transformadas que expressam os anticorpos dese-jados podem ser cultivadas em quantidades relativamente grandes para fornecer suprimentos clínicos e comerciais da imunoglobulina.
[000197] Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácido dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as seqüências das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) por métodos que são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por comparação a seqüências de aminoácido conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de seqüência. Usando técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs podem ser inseridas dentro de regiões de estrutura principal, por exemplo, dentro de regiões de estrutura principal humanas para humanizar um anticorpo não-humano. As regiões de estrutura principal podem ser regiões de estrutura principal que ocorrem naturalmente ou consenso, e preferivelmente regiões de estrutura principal humanas (veja, por exemplo, Chothia et al, J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) para umas listagem de regiões de estrutura principal humanas). Preferivelmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura principal e CDRs codifica um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epitopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, NgR1. Preferivelmente, uma ou mais substituições de aminoácido po-dem ser feitas dentro das regiões de estrutura principal, e preferivelmente as substituições de aminoácido melhoram a ligação do anticor- po ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer substituições ou deleções de aminoácido de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam em uma ligação de dissulfeto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que não têm uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alterações ao polinucleotídeo são abrangidas pela presente invenção e estão dentro do conhecimento da técnica.
[000198] Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855 (1984); Neuberger et al, Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al, Nature 314:452-454 (1985)) por combinar genes de uma molécula de anticorpo de camundongo de especificidade de antígeno apropriada junto com genes de uma molécula de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada podem ser usadas. Como usado aqui, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual di-ferentes porções são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados.
[000199] Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Pat. U.S. No. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:58795883 (1988); e Ward et al, Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são formados por ligar os fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ligação de aminoácido, resultando em um anticorpo de cadeia única. Técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli também podem ser usadas (Skerra et al, Science 242:1038-1041 (1988)).
[000200] Anticorpos antagonistas de NgR1 também pode ser anti- corpos humanos ou substancialmente humanos gerados em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são incapazes de produzir imunoglobulina endógena (veja Pat. U.S. Nos. 6.075.181. 5.939.598. 5.591.669 e 5.589.369 cada uma das quais está incorporada aqui por referência). Por exemplo, foi descrito que a deleção homo- zigota da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes de linhagem germinativa e quiméricos resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência de um conjunto de genes de imunoglobulina humana para tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante estimulo antigênico. Outro meio preferido de gerar anticorpos humanos usando camundongos SCI D é descrito na Pat. U.S. No. 5.811.524 que está incorporada aqui por referência. Será avaliado que o material genético associado com esses anticorpos humanos também pode ser isolado e manipulado como descrito aqui.
[000201] Outro meio altamente eficaz para gerar anticorpos recombi- nantes é descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, essa técnica resulta na geração de anticorpos prima- tizados que contêm domínios variáveis de macaco e seqüências constantes humanas. Essa referência está incorporada por referência aqui na sua totalidade. Além disso, essa técnica também é descrita nas Pat. U.S. Nos. 5.658.570. 5.693.780 e 5.756.096 designadas em co mum, cada uma das quais está incorporada que por referência.
[000202] Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados por micromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, células mononucleares de sangue periférico podem ser isoladas de um mamífero imunizado e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser rastreadas por IgGs específicas que satisfazem os critérios do rastreamento. As células de cavidades positivos podem ser isoladas. Células B produtoras de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou por identificação delas em um ensaio de placa de hemó- lise mediada pelo complemento. Células B produtoras de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genes de VH e VL podem ser amplificados usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes de VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpo e transfec- tadas em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.
[000203] Alternativamente, linhagens celulares produtoras de anticorpo podem ser selecionadas e cultivadas usando metodologias bem- conhecidas do versado na técnica. Tais metodologias são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. Com relação a isso, técnicas adequadas para uso na invenção, conforme descrito abaixo, são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates & Wiley- InterScience, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1991) que está aqui incorporada por referência na sua totalidade, incluindo suplementos.
[000204] Anticorpos para uso nos métodos terapêuticos aqui contidos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpo, em particular, por síntese química, ou preferivelmente, por técnicas de expressão recombinante descritas aqui.
[000205] Será avaliado ainda que o escopo dessa invenção ainda abrange todos os alelos, variantes e mutações de seqüências de DNA de ligação de antígeno.
[000206] Como é sabido, RNA pode ser isolado das células de hibri- doma originais ou de outras células transformadas por técnicas usuais, tal como extração e precipitação com isotiocianato de guanidínio seguido por centrifugação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA pode ser isolado a partir do RNA total por técnicas usuais tal como cromatografia em oligo dT celulose. Técnicas adequadas são conhecidas na técnica.
[000207] Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo podem ser feitos, tanto simultaneamente como separadamente, usando transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo com métodos bem-conhecidos. PCR pode ser iniciado por iniciadores consenso da região constante ou por iniciadores mais específicos baseados nas seqüências publicadas de DNA e aminoácido das cadeias pesada e leve. Como discutido acima, PCR também pode ser usado para isolar clones de DNA que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo. Nesse caso as bibliotecas podem ser rastreadas por iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores tais como sondas de região constante de camundongo.
[000208] DNA, tipicamente DNA de plasmídeo, pode ser isolado das células usando metodologias conhecidas na técnica, mapeado por restrição e seqüenciado de acordo com técnicas usuais, bem-conhecidas descritas em detalhes, por exemplo, nas referências anteriores relacionadas a técnicas de DNA recombinante. Logicamente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise subseqüente.
[000209] Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo deste, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que é um antagonista de NgR1, requer a construção de um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma porção desta (preferivelmente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando metodologias bem-conhecidas na técnica. Dessa forma, métodos para preparar uma proteína por expressar um poli- nucleotídeo que contém uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo são descritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contêm seqüências codificantes de anticorpo e sinais de controle transcricional e traducional apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, dessa forma, proporciona vetores replicáveis que compreendem uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve desta, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operativamente ligada a um promotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante da molécula de anticorpo (veja, por exemplo, Publicação PCT WO 86/05807; Publicação PCT WO 89/01036; e Pat. U.S. No. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para expressão na cadeia pesada ou leve nativa.
[000210] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo para isso nos métodos descritos aqui. Dessa forma, a invenção inclui células hospedeiras que contêm um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve deste, operativamente ligado a um promotor heterólogo. Em modalidades preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores que codificam ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina completa, como detalhado abaixo.
[000211] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão em hospedeiro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para uso nos métodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão em hos pedeiro representam veículos pelos quais as seqüências codificantes de interesse podem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou infectadas com as seqüências codificantes de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, mas não são limitados, a microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófago, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo recombinante contendo seqüências codificantes de anticorpo; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo seqüências codificantes de anticorpo; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo seqüências codificantes de anticorpo; sistemas de células de planta infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo seqüências codificantes de anticorpo; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) carregando constructos de expressão recombinante que contêm promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus da vacínia de 7,5K). Preferivelmente, células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais particularmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante inteira, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero, assim como, células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento do promotor de gene precoce intermediário principal de citomegaloví- rus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foe- cking et al, Gene 45:101 (1986); Cockett et al, Bio/Technology 8:2 (1990)).
[000212] Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma tal proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são facilmente purificados podem ser desejá-veis. Tais vetores incluem, mas não são limitados, ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al, EMBO J. 2: 1791 (1983)), no qual a seqüência codificante do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor in frame com a região codificante de lacZ para que a proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas das células li- sadas por adsorção e ligação a uma matriz de esferas de glutationa- agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são desenhados para incluir sítios de clivagem de protease trombina ou fator Xa para que o produto do gene alvo clonado possa ser liberado da porção de GST.
[000213] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugperda. A seqüência codificante de anticorpo pode ser clonada individualmente em região não-essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob o controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).
[000214] Em células hospedeiras de mamífero, vários sistemas de expressão a base de vírus podem ser utilizados. Nos casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a seqüência codificante do anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e seqüência líder tripartida. Esse gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não-essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, veja Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:355-359 (1984)). Sinais de início específicos podem também ser necessários para tradução eficaz de seqüências codificantes inseridas. Esses sinais incluem o códon de início ATG e seqüências adjacentes. Além disso, o códon de inicio deve estar in phase com a fase de leitura da seqüência codificante desejada para garantir a tradução do inserto inteiro. Esses sinais de controle traducional exógenos e có- dons de início podem ser de uma variedade de origens, tanto natural como sintética. A eficácia de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, ter- minadores de transcrição, etc. (veja Bittner et al, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).
[000215] Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeira que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa o produto gênico da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-traducional e modificação de proteínas e produtos gênicos. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estranha expressa. Para essa finalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto gênico podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, mas não são limitadas a CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e em particular, linhagens celulares de câncer de mama tal como, por exemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e linhagem celular de glândula mamária normal tal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.
[000216] Para produção de proteínas recombinantes a longo prazo e com alto rendimento, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Ao invés de usar vetores que expressão que contêm origens de replicação virais, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, seqüências promotoras, intensificadoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc). e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, células manipuladas podem ser deixadas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são passadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem estavelmente ao plasmídeo nos seus cromossomos e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Esse método pode ser usado vantajosamente para manipular linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo.
[000217] Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, mas não limitados aos genes de timidina quinase do vírus do herpes simples (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosfori- bosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci USA 48:202 (1992)), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 1980) podem ser usados nas células-tk, -hgprt ou aprt, respectivamente. Ainda, resistência a antimetabólitos pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu & Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan & Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-211 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (maio, 1993); e hygro, que confere resistência a higro- micina (Santerre et al, Gene 30:147 (1984). Métodos comumente usados na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que estão aqui incorporados por referência nas suas totalidades.
[000218] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, veja Beb- bington & Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Aca demic Press, Nova Iorque, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema do vetor que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível do inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Já que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Cel. Biol. 3:257 (1983)).
[000219] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser usado um único vetor que codifica tanto os polipeptídeos de cadeia pesada como de cadeia leve. Em tais situações, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia peada para evitar excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). As seqüências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA ou DNA genômico.
[000220] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sito expressa recombinantemente, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, croma- tografia de troca de íon, afinidade, particularmente por afinidade pelo antígeno específico após com Proteína A, e cromatografia de coluna por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica usual para a purificação de proteínas. Alternativamente, um método preferido para aumentar a afinidade de anticorpos da invenção é descrito em US 2002 0123057 A1.
[000221] Em uma modalidade, uma molécula de ligação ou molécula de ligação de antígeno para uso nos métodos da invenção compreende uma região constante sintética em que um ou mais domínios são parcialmente ou completamente deletados ("anticorpos com domínio deleta- do"). Em certas modalidades, anticorpos modificados compatíveis compreenderão constructos com domínio deletado ou variantes em que todo o domínio CH2 foi removido (constructos ΔCH2). Para outras modalidades um pequeno peptídeo de conexão pode ser substituído pelo domínio deletado para fornecer flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Aqueles versados na técnica observarão que tais constructos são particularmente preferidos devido às propriedades regulatórias do domínio CH2 sobre a taxa catabólica do anticorpo.
[000222] Em certas modalidades, anticorpos modificados para uso nos métodos descritos aqui são minicorpos. Minicorpos podem ser feitos usando métodos descritos na técnica (veja, por exemplo, patente U.S. 5.837.821 ou WO 94/09817A1).
[000223] Em outra modalidade, anticorpos modificados para uso nos métodos descritos aqui são anticorpos com domínio CH2 deletado que são conhecidos na técnica. Constructos com domínio deletado podem ser derivados usando um vetor (por exemplo, de Biogen IDEC Incorporated) que codificam um domínio constante humano de IgG1 (veja, por exemplo, WO 02/060955 A2 e WO 02/096948A2). Esse vetor exemplar foi manipulado para deletar o domínio CH2 e fornecer um vetor sintético que expressa uma região constante de IgG1 com domínio deletado;
[000224] Em uma modalidade, um anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento deste, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui, compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina que tem deleção ou substituição de alguns ou mesmo um único aminoácido contanto que ela permita a associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e assim aumentar a localização do tumor. Similarmente, pode ser desejá vel simplesmente deletar aquela parte de um ou mais domínios da região constante que controlam a função efetora (por exemplo, ligação de complemento) a ser modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar características selecionadas do anticorpo (meia-vida sérica) enquanto deixam outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante em questão intacto. Além disso, como mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos descritos podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos, o que aumenta o perfil do constructo resultante. Em relação a isso, pode ser possível prejudicar a atividade fornecida por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação de Fc) enquanto se mantém substancialmente a configuração e perfil imunogênico do anticorpo modificado. Outras modalidades ainda compreendem a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para aumentar as características desejáveis, tal como, função efetora ou fornecer mais ligação de citocina ou carboidrato. Em tais modalidades pode ser desejável inserir ou replicar seqüências específicas derivadas de domínios de regiões constantes selecionados.
[000225] A presente invenção também fornece o uso de anticorpos que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) descritas aqui, cujos anticorpos ou fragmentos deste se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo de NgR1. Metodologias usuais conhecidas daqueles versados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula de ligação, in-cluindo, mas não limitadas a, mutagênese sítio-direcionada e muta- gênese mediada por PCR, o que resulta em substituições de aminoácido. Preferivelmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos do que 50 substituições aminoácidos, menos do que 40 substituições de aminoácido, menos do que 30 substituições de aminoácido, menos do que 25 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituições de aminoácido, ou menos do que 2 substituições de aminoácido em relação à região VH de referência, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, região VL, VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias dos resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou uma parte da seqüência codificante, tal como por mutagênese por satu-ração, e os mutantes resultantes podem ser rastreados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade.
[000226] Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiões de estrutura principal ou apenas em regiões de CDR de uma molécula de anticorpo. Mutações introduzidas podem ser silenciosas ou mutações de sentido invertido neutras, isto é, não têm efeito, ou têm pouco efeito sobre uma habilidade de um anticorpo se ligar ao antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códon, ou me lhorar a produção de anticorpo do hibridoma. Alternativamente, mutações de sentido invertido não neutras podem alterar a habilidade de um anticorpo se ligar ao antígeno. A localização da maioria das mutações silenciosas ou neutras é provavelmente nas regiões de estrutura principal, enquanto que a localização da maioria das mutações de sentido invertido não-neutras é provavelmente nas CDRs, embora essa não seja uma condição absoluta. Um versado na técnica seria capaz de desenhar e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas, tal como, nenhuma alteração na atividade de ligação de antígeno ou alteração na ati-vidade de ligação (por exemplo, aumento na atividade de ligação de antígeno ou alteração na especificidade do anticorpo). Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa rotineiramente e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada por ser determinada usando metodologias descritas aqui ou por metodologias de modificação rotineiras conhecidas na técnica.
[000227] Em resumo, um versado na técnica, munido com os ensinamentos dessa invenção, tem disponível uma variedade de métodos que podem ser usados para alterar as propriedades biológicas dos anticorpos dessa invenção, incluindo métodos que podem aumentar ou diminuir a estabilidade ou meia-vida, imunogenicidade, toxicidade, afinidade ou rendimento de uma dada molécula de anticorpo, ou alterá-la de qualquer outra forma que possa torná-la mais adequada para uma aplicação particular.
[000228] Composições que compreendem, e usos dos anticorpos da presente invenção são descritos abaixo.
Polipeptídeos Solúveis de Receptor Nogo-1 Proteína
[000229] O receptor Nogo-1 de extensão completa consiste em uma seqüência de sinal, uma região N-terminal (NT), oito repetições ricas em leucina (LRR), uma região LRRCT (um domínio de repeti ção rico em leucina C-terminal das oito repetições ricas em leucina), uma região C-terminal (CT) e uma âncora de GPI (veja a Figura 1).
[000230] As denominações dos domínios de NgR usadas aqui estão definidas abaixo como o seguinte: Tabela 1. Exemplos de domínios de NgR
Figure img0001
[000231] Algumas modalidades da invenção proporcionam um polipep tídeo de receptor Nogo-1 solúvel. Polipeptídeos de receptor Nogo-1 solúveis da invenção compreendem um domínio NT; 8 LRRs e um domínio LRRCT e não têm uma seqüência de sinal e uma âncora de GPI funcional (isto é, não tem âncora de GPI ou uma têm âncora de GPI que não possui habilidade de se associar eficientemente a uma membrana celular).
[000232] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de receptor No- go-1 solúvel compreende uma LRR heteróloga. Uma LRR heteróloga significa uma LRR obtida de uma proteína diferente do receptor Nogo- 1. Proteínas exemplares a partir das quais uma LRR heteróloga pode ser obtida são receptor toll-like (TLR1.2); proteína rica em repetições de leucina ativadora de célula T; deceorina; OM-gp; subunidade slit e robo ácido-lábil da proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante a insulina; e receptor 4 tipo controle ("toll-like receptor").
[000233] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um poli- peptídeo de receptor Nogo-1 solúvel de 319 aminoácidos (receptor Nogo-1 solúvel 344, sNogoR1-344, ou sNogoR344) (resíduos 26 a 344 de SEQ ID NOs: 6 e 8 ou resíduos 27 a 344 de SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a invenção proporciona receptor Nogo-1 solúvel de 285 aminoácidos (receptor Nogo-1 solúvel 310, sNogoR1-310, ou sNogoR310) (resíduos 26 a 310 de SEQ ID NOs: 7 e 9 ou resíduos 27 a 310 de SEQ ID NO: 9). Veja Fig. 1. Tabela 1. Seqüências de Polipeptídeos de Receptor Nogo-1 de Humano e de Rato
Figure img0002
[000234] Em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos de receptor Nogo-1 solúveis da invenção são usados para inibir a ligação de um ligante a um receptor Nogo-1 e agem como um antagonista de ligantes de receptor Nogo-1. Em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos de receptor Nogo-1 solúveis da invenção são usados para diminuir a inibição de crescimento e brotamento de neurito em um neurônio, tal como crescimento axonal, e para inibir o colapso do cone de crescimento mediado por mielina em um neurônio. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do CNS.
[000235] sNogoR310 e sNogoR344, surpreendentemente, bloqueiam a ligação de Nogo A, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp ao Receptor Nogo-1.
[000236] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos x a 344 de SEQ ID NO:49, (b) ami-noácidos 309 a y de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos x a y de SEQ ID NO:49, em que x é qualquer número inteiro de 305 a 326, e y é qualquer número inteiro de 328 a 350; e em que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácidos individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos x' a 344 de SEQ ID NO:49, (b) ami- noácidos 309 a y' de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos x' a y' de SEQ ID NO:49, onde x' é qualquer número inteiro de 300 a 326, e y' é qualquer número inteiro de 328 a 360, e em que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000237] Por "uma seqüência de aminoácido de referência de NgR1" ou "seqüência de aminoácido de referência" entende-se a seqüência especificada sem a introdução de nenhuma substituição de aminoácidos. Como um versado na técnica pode compreender, se não há substituições, o "polipeptídeo isolado" da invenção compreende uma seqüência de aminoácido que é idêntica à seqüência de aminoácido de referência.
[000238] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas ou três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 350 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 300 a 344 de SEQ EO NO:49; e aminoácidos 315 a 344 de SEQ ID NO:49.
[000239] Em uma modalidade, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49.
[000240] Em uma modalidade, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49.
[000241] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência exceto que o pelo menos um resíduo de cisteína da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (ii) aminoácidos 27 a b de SEQ BD NO:49, e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 25 até 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000242] Substituições de aminoácido exemplares para fragmentos de polipeptídeo de acordo com essa modalidade incluem substituições de resíduos de cisteína individuais nos polipeptídeos de invenção por aminoácidos diferentes. Qualquer aminoácido diferente pode ser substituído por uma cisteína nos polipeptídeos da invenção. Que aminoácido diferente é usado depende de vários critérios, por exemplo, do efeito da substituição sobre a conformação do fragmento de polipeptídeo, da carga do fragmento de polipeptídeo, ou da hidrofilicidade do fragmento de polipeptídeo. Substituições de aminoácido para os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção e da seqüência de aminoácido de referência podem incluir aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeia laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Aminoácidos típicos para substituir por cisteínas no aminoácido de referência incluem alanina, serina, treonina, em particular, alanina. Fazer tais substituições através de mani-pulação de um polinucleotídeo que codifica o fragmento de polipeptídeo está dentro da habilidade de um versado na técnica.
[000243] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado da invenção em que pelo menos um resíduo de cisteína é substituído por um aminoácido diferente. Resíduos de cisteína que podem ser substituídos em NgR1 humana incluem C27, C31, C33, C43, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455 e C473. Resíduos de cisteína que podem ser substituídos em NgR1 de rato incluem C27, C31, C33, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455 e C473. Resíduos de cisteína que podem ser substituídos em NgR1 de camundongo incluem C27, C31, C33, C43, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455 e C473.
[000244] A presente invenção ainda proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica aos aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49, exceto que: C309 é substituído, C335 é substituído, C336 é substituído, C309 e C335 são substituídos, C309 e C336 são substituídos, C335 e C336 são substituídos, ou C309, C335, e C336 são substituídos.
[000245] Os resíduos de cisteína nos polipeptídeos da invenção podem ser substituídos por qualquer aminoácido heterólogo. Em certas modalidades, a cisteína é substituída por um pequeno aminoácido não carregado que menos provavelmente alteraria a conformação tridimensional do polipeptídeo, por exemplo, alanina, serina, treonina, preferivelmente alanina.
[000246] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de receptor Nogo- 1 solúvel da invenção é um componente de uma proteína de fusão que ainda compreende um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um domínio constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o domínio constante de imunoglobulina é um domínio constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um fragmento Fc. Em algumas modalidades, o fragmento Fc é unido à extremidade C-terminal do polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel da invenção. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor Nogo-1 é um dímero. A invenção ainda abrange variantes, análogos, ou derivados de fragmentos de polipeptídeos descritos acima.
[000247] Em algumas modalidades a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (ii) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO:49, e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 1 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado são os aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, em que R269 e A310 são substituídos por um aminoácido diferente. Aminoácidos exemplares que podem ser substituídos no polipeptídeo incluem ami- noácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, gli- cina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias late-rais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em uma modalidade, o aminoácido diferente é triptofano.
[000248] Uma proteína de fusão NgR-Fc solúvel exemplar é NgRl(319)-Fc humana que compreende Fc unido à extremidade C- terminal dos aminoácidos 1 a 319 de SEQ ID NO:49.
[000249] Proteínas de fusão NgR-Fc solúveis exemplares com substituições de cisteína são Ala-Ala- humano(h)NgR1(310)-Fc que compreende Fc unido à extremidade C-terminal de um polipeptídeo solúvel com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:58, Ala-Ala- rato(r)NgR1(310)-Fc que compreende Fc unido à extremidade C- terminal de um polipeptídeo solúvel com a seqüência de aminoácido de SEQ BD NO:59 e Ala-Ala-humano(h)NgRl(344)-Fc que compreen-de Fc unido à extremidade C-terminal de um polipeptídeo solúvel com a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:64.
[000250] Na presente invenção, um polipeptídeo pode ser composto de aminoácidos unidos um ou outro por ligações peptídicas ou ligações pep- tídicas modificadas, isto é, isosteres de peptídeo, e pode conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes (por exemplo, aminoácidos que não ocorrem naturalmente). Os polipeptídeos da presente invenção podem ser modificados tanto por processos naturais, tal como processamento pós-traducional, como por metodologias de modificação química que são bem-conhecidas na técnica. Tais modificações estão descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma volumosa literatura de pesquisa. Modificações podem ocorrer em qualquer local no polipeptídeo, incluindo o estrutura principal do peptídeo, as cadeias laterais dos aminoácidos, e nas terminações amino ou carbóxi. Será avaliado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou em graus variados em vários locais em um dado polipeptídeo. Ainda, um dado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Polipeptídeos podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados, e ramificados cíclicos podem resultar de processos naturais ou podem ser feitos por métodos sintéticos. Modificações incluem, mas não são limitadas a, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou um derivado de lipídio, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticula- ção, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de pi- roglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, ra- cemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, tal como, arginilação, e ubiquitinação (veja, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2a Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman & Company, Nova Iorque (1993); Post- translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
[000251] Polipeptídeos descritos aqui podem ser cíclicos. Ciclização dos polipeptídeos reduz a liberdade conformacional de peptídeos lineares e resulta em uma molécula mais restrita estruturalmente. Muitos métodos de ciclização de peptídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo, ciclização "estrutura principal a estrutura principal" pela formação de uma ligação de amida entre os resíduos de aminoácido N- terminais e C-terminais do peptídeo. O método de ciclização "estrutura principal a estrutura principal" inclui a formação de ligações de dissulfeto entre dois resíduos de a-tio aminoácidos (por exemplo, cisteína, homocisteína). Certos peptídeos da presente invenção incluem modifi-cações na terminação-N e -C do peptídeo para formar um polipeptídeo cíclico. Tais modificações incluem, mas não são limitadas a, resíduos de cisteína, resíduos de cisteína acetilados, resíduos de cisteína com uma porção de NH2 e biotina. Outros métodos de ciclização de peptídeos são descritos em Li & Roller, Curr. Top. Med. Chem. 3:325341 (2002) e Publicação de Patente U.S. 2005-0260626 A1, que estão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades.
[000252] Em métodos da presente invenção, um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção pode ser administrado diretamente como um polipeptídeo pré-formado, ou indiretamente através de um vetor de ácido nucléico. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção é administrado em um método de tratamento que inclui: (1) transformar ou transfectar uma célula hospedeira implantável com um ácido nucléico, por exemplo, um vetor, que expressa um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção; e (2) implantar a célula hospedeira transformada em um mamífero, no local de uma doença, distúrbio ou lesão. Por exemplo, a célula hospedeira transformada por ser implantada no local de uma lesão crônica do MS. Em algumas modalidades da invenção, a célula hospedeira implantável é removida de um mamífero, cultivada temporariamente, transformada ou transfectada com um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção, e implantada de volta no mesmo mamífero do qual ela foi removida. A célula pode ser, mas não precisa ser, removida do mesmo local no qual ela é implantada. Tais modalidades, algumas vezes conhecidas como terapia gênica ex vivo, podem fornecer um suprimento contínuo do polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção, localizado no local de ação, por um período limitado de tempo.
[000253] Polipeptídeos de NgR exemplares adicionais da invenção e métodos e matéria para obter estas moléculas para praticar a presente invenção são descritos abaixo.
Proteínas de fusão e polipeptídeos conjugados
[000254] Algumas modalidades da invenção envolvem o uso de um polipeptídeo de NgR1 que não é a proteína NgR1 de extensão completa, por exemplo, fragmentos de polipeptídeo de NgR1, fundidos a uma porção de um polipeptídeo heterólogo para formar uma proteína de fusão. Tais proteínas de fusão podem ser usadas para atingir vários objetivos, por exemplo, meia-vida sérica aumentada, biodisponibilidade melhorada, direcionamento in vivo para um órgão ou tipo de tecido específico, eficácia de expressão recombinante melhorada, secreção da célula hospedeira melhorada, facilidade de purificação, e maior avidez. De-pendendo do(s) objetivo(s) a ser(em) atingido(s), a porção heteróloga pode ser inerte ou biologicamente ativa. Ainda, ela pode ser escolhida para ser estavelmente fundida à porção do polipeptídeo de NgR1 da invenção ou para ser clivável, in vitro ou in vivo. Porções heterólogas para atingir esses outros objetivos são conhecidas na técnica.
[000255] Em algumas modalidades da invenção, um fragmento de polipeptídeo de NgR1 pode ser fundido a outro fragmento de polipeptídeo de NgR, por exemplo, um fragmento de polipeptídeo de NgR2 ou NgR3 junto com Fc.
[000256] O polipeptídeo de NgR2 de humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:60.
[000257] NgR2 de humano de extensão completa (SEQ ID NO:60): MLPGLRRLLQ APASACLLLMLLALPLAAPS CPMLCTCYSS PPTVSCQANN FSSVPLSLPP STQRLFLQNN LIRTLRPGTF GSNLLTLWLF SNNLSTIYPG TFRHLQALEE LDLGDNRHLR SLEPDTFQGL ERLQSLHLYR CQLSSLPGNIFRGLVSLQYL YLQENSLLHL QDDLFADLAN LSHLFLHGNR LRLLTEHVFR GLGSLDRLLL HGNRLQGVHR AAFRGLSRLTILYLFNNSLA SLPGEALADL PSLEFLRLNA NPWACDCRAR PLWAWFQRAR VSSSDVTCAT PPERQGRDLR ALREADFQAC PPAAPTRPGS RARGNSSSNH LYGVAEAGAP PADPSTLYRD LPAEDSRGRQ GGDAPTEDDY WGGYGGEDQR GEQMCPGAAC QAPPDSRGPA LSAGLPSPLL CLLLLVPHHL .
[000258] O polipeptídeo de NgR2 de camundongo é mostrado abaixo como SEQ ID NO:61.
[000259] NgR2 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:61): MLPGLRRLLQ GPASACLLLT LLALPSVTPS CPMLCTCYSS PPTVSCQANN FSSVPLSLPP STQRLFLQNN LIRSLRPGTF GPNLLTLWLF SNNLSTIHPG TFRHLQALEE LDLGDNRHLR SLEPDTFQGL ERLQSLHLYR CQLSSLPGNI FRGLVSLQYL YLQENSLLHL QDDLFADLAN LSHLFLHGNR LRLLTEHVFR GLGSLDRLLL HGNRLQGVHR AAFHGLSRLT ILYLFNNSLA SLPGEALADL PALEFLRLNA NPWACDCRAR PLWAWFQRAR VSSSDVTCAT PPERQGRDLR ALRDSDFQAC PPPTPTRPGS RARGNSSSNH LYGVAEAGAP PADPSTLYRD LPAEDSRGRQ GGDAPTEDDY WGGYGGEDQR GEQTCPGAAC QAPADSRGPA LSAGLRTPLL CLLPLALHHL
[000260] O polipeptídeo de NgR3 de humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:62.
[000261] NgR3 de humano de extensão completa (SEQ ID NO:62): MLRKGCCVEL LLLLVAAELP LGGGCPRDCV CYPAPMTVSC QAHNFAAIPE GBPVDSERVF LQNNRIGLLQ PGHFSPAMVT LWIYSNNTTYIHPSTFEGFV HLEELDLGDN RQLRTLAPET FQGLVKLHAL YLYKCGLSAL PAGVFGGLHS LQYL YLQDNHIEYLQDDIFV DLVNLSHLFL HGNKLWSLGP GTFRGLVNLD RLLLHENQLQ WVHHKAFHDL RRLTTLFLFN NSLSEI.QGEC LAPLGALEFL RLNGNPWDCG CRARSLWEWL QRFRGSSSAV PCVSPGLRHG QDLKLLRAED FRNCTGPASP HQIKSHTLTT TDRAARKEHH SPHGPTRSKG HPHGPRPGHR KPGKNCTNPR NRNQISKAGA GKQAPELPDY APDYQHKFSF DIMPTARPKR KGKCARRTPIRAPSGVQQAS SASSLGASLL AWTLGLAVTL R
[000262] O polipeptídeo de NgR3 de camundongo é mostrado abaixo como SEQ ID NO:63.
[000263] NgR3 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:63): MLRKGCCVEL LLLLLAGELP LGGGCPRDCV CYPAPMTVSC QAHNFAAIPE GIPEDSERTF LQNNRTTFLQ QGHFSPAMVT LWIYSNNITF IAPNTFEGFV HLEELDLGDN RQLRTLAPET FQGLVKLHAL YLYKCGLS AL PAGIFGGLHS LQ YL YLQDNH IEYLQDDIFV DLVNLSHLFL HGNKLWSLGQ GIFRGLVNLD RLLLHENQLQ WVHHKAFHDL HRLTTLFLFN NSLTELQGDC LAPL VALEFL RLNGNAWDCG CRARSLWEWL RRFRGSSSAV PCATPELRQG QDLKLLRVED FRNCTGPVSP HQIKSHTLTT SDRAARKEHH PSHGASRJDKG HPHGHPPGSR SGYKKAGKNC TSHRNRNQIS KVSSGKELTE LQDYAPDYQH KFSFDIMPTA RPKRKGKCAR RTPIRAPSGV QQASSGTALG AJPLLAWILGL AVTLR
[000264] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que con-siste em: (a) aminoácidos a até 305 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 1 até b de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 1 a 27, e b é qualquer número inteiro de 264 a 309; e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individu-ais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em (a) aminoácidos c a 332 de SEQ ID NO:60, (b) aminoácidos 275 a d de SEQ ID NO:60, e (c) aminoácidos c a d de SEQ ID NO:60, em que c é qualquer número inteiro de 265 a 306, e d é qualquer número inteiro de 308 a 340; e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito media- da pelo receptor Nogo.
[000265] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 275 a 311 de SEQ ID NO:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000266] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 275 a 332 de SEQ ID NO:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000267] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 306 a 311 de SEQ ID NO:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000268] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 306 a 309 de SEQ ID NO:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em outra modalidade, pelo menos um aminoácido adicional é adicionado à terminação-C do segundo fragmento de polipeptídeo. Aminoácidos exemplares que podem ser adicionados ao polipeptídeo incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, me- tionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em uma modalidade, o aminoácido adicionado é triptofano. Em uma modalidade adicional, a arginina na posição 269 de SEQ ID NO:49 é substituída por triptofano.
[000269] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais; e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 311 a 318 de SEQ ID NO:60 exceto por até uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido individuais; e em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
[000270] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da invenção compreendem ainda um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um domínio constante de imuno- globulina. Em algumas modalidades, o domínio constante de imuno- globulina é um domínio constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é um fragmento Fc. Em algumas modalidades o Fc é unido à extremidade C-terminal dos polipeptídeos da invenção. Em algumas modalidades a fusão é um dímero. A invenção ainda abrange variantes, análogos, ou derivados de fragmentos de polipeptídeo conforme descrito acima.
[000271] Como uma alternativa para expressão de uma proteína de fusão, uma porção heteróloga escolhida podem ser pré-formada e conjugada quimicamente à porção de polipeptídeo de NgR da invenção. Na maioria dos casos, uma porção heteróloga escolhida funcionará similarmente, quer fundida ou conjugada à porção do polipeptídeo de NgR. Portanto, na discussão a seguir de seqüências de aminoácido heterólogas, a menos que observado de outra maneira, deve ser en-tendido que a seqüência heteróloga pode ser unida à porção de polipeptídeo de NgR na forma de uma proteína de fusão ou como um conjugado químico.
[000272] Aptâmeros e anticorpos de NgR1 e fragmentos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui também podem ser fundidos recombinantemente a um polipeptídeo heterólogo na terminação -N ou -C ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, e fragmentos destes podem ser fundidos ou conjugadas recombinantemente a moléculas úteis como marcadores em ensaios de detecção e moléculas efetoras tal como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionu- clídeos, ou toxinas. Veja, por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Patent No. 5.314.995; e EP 396.387.
[000273] Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, e fragmentos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui incluem derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula tal que a ligação covalente não impeça que o polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo iniba a função biológica de NgR1. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, e fragmentos destes da presente invenção podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosfilação, fosforila- ção, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. qualquer uma de várias modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[000274] Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, e fragmentos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui podem ser compostos de aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isosteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes. Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, e fragmentos destes, podem ser modificados por processos naturais, tal como processamento pós- traducional, ou por metodologias de modificação química que são bem-conhecidas na técnica. Tais modificações estão descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma volumosa literatura de pesquisa. Modificações podem ocorrem em qualquer local no polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, incluindo no estrutura principal do peptídeo, nas cadeias laterais dos aminoácidos e nas terminações amino ou carboxila, ou em porções tais como carboidratos. Será avaliado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou em graus variados em vários locais em um dado polipeptídeo, aptâme- ro ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes. Ainda, um dado polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, podem conter vários tipos de modificações. Polipeptídeos, aptâmeros ou anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos, aptâmeros ou anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes cíclicos, ramificados e ramificados cíclicos podem resultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser feitos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acila- ção, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, cicliza- ção, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglu- tamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, tal como arginilação, e ubiquitinação. (Veja, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties , T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque 2a Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
[000275] O polipeptídeo heterólogo ao qual o polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, é fundido é útil terapeuticamente ou é útil para direcionar o polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes. Proteínas de fusão, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes, podem ser usados para atingir vários objetivos, por exemplo, meia-vida sérica aumentada, biodisponibilidade melhorada, direcionamento in vivo para um órgão ou tipo de tecido específico, eficácia de expressão recombinante melhorada, secreção da célula hospedeira melhorada, facilidade de purificação, e maior avidez. Dependendo do(s) objetivo(s) a ser(em) atingido(s), a porção heteróloga pode ser inerte ou biologicamente ativa. Ainda, ela pode ser escolhida para ser estavelmente fundida ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, ou para ser clivável, in vitro ou in vivo. Porções heterólogas para atingir esses outros objetivos são conhecidas na técnica.
[000276] Como uma alternativa para expressão de polipeptídeo de fusão, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, uma porção heteróloga escolhida pode ser preformada e conjugada quimicamente ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista. Na maioria dos casos, uma porção heteróloga escolhida funcionará da mesma maneira, quer fundida ou conjugada ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes. Portanto, na seguinte discussão de seqüências de aminoácido heterólogas, a menos que observado de outra maneira, deve ser entendido que a seqüência heteróloga pode ser unida ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, na forma de uma proteína de fusão ou como um conjugado químico.
[000277] Polipeptídeos farmacologicamente ativos, tais como polipeptídeos, aptâmeros ou anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes, podem exibir rápida depuração in vivo, precisando de grandes doses para atingir concentrações terapeuticamente eficazes no corpo. Além disso, polipeptídeos menores do que cerca de 60 kDa potencialmente sofrem filtração glomerular, o que algumas vezes leva à nefrotoxicidade. Fusão ou conjugação de polipeptídeos relativamente pequenos, tais como fragmentos de polipeptídeo do domínio de sinalização de NgR pode ser empregada para reduzir ou evitar o risco de tal nefrotoxicidade. Várias seqüências de aminoácido heterólogas, isto é, porções de polipeptídeo ou "veículos", para aumentar a estabilidade in vivo, isto é, meia-vida sérica, de polipeptídeos terapêuticos, são conhecidas. Exemplos incluem albuminas séricas, como por exemplo, albumina sérica bovina (BSA) ou albumina sérica humana (HSA).
[000278] Devido a sua longa meia-vida, ampla distribuição in vivo, e falta de função enzimática ou imunológica, principalmente albumina sérica humana de extensão completa (HSA), ou um fragmento de HSA, é comumente usada como uma porção heteróloga. Através da aplicação de métodos e materiais tais como aqueles ensinados em Yeh et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1904-08 (1992) e Syed et al, Blood 89:3243-52 (1997), HSA pode ser usada para formar uma prote-ína de fusão ou conjugado de polipeptídeo que apresenta atividade farmacológica, devido ao polipeptídeo de NgR, enquanto apresenta estabilidade significativamente aumentada in vivo, por exemplo, 10 vezes a 100 vezes maior. A terminação-C da HSA pode ser fundida à terminação-N da porção de NgR. Já que HSA é uma proteína secreta- da naturalmente, a seqüência de sinal de HSA pode ser utilizada para se obter a secreção da proteína de fusão no meio de cultura da célula quando a proteína de fusão é produzida em um sistema eucariótico, por exemplo, de mamífero.
[000279] Em certas modalidades, polipeptídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorpos destes, para uso nos métodos da presente invenção ainda compreendem uma porção de direcionamento. Porções de direcionamento incluem uma pro teína ou peptídeo que direciona a localização para determinada parte do corpo, por exemplo, para o cérebro, ou compartimentos dele. Em certas modalidades, polipeptídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorpos destes, para isso nos métodos da presente invenção são ligados ou fundidos a uma porção de direcionamento para o cérebro. As porções de direcionamento para o cérebro são ligadas covalentemente (por exemplo, ligação direta, por fusão traducional, ou por ligação química, diretamente ou através de uma molécula espaçadora, que pode ser opcionalmente clivável) ou ligadas não-covalentemente (por exemplo, através de interações reversíveis, tal como, avidina:biotina, proteína A:IgG, etc.). Em outras modalidades, polipeptídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorpo destes, para uso nos métodos da presente invenção são ligados a uma ou mais porções de direcionamento para o cérebro. Em modalidades adicionais, a porção de direcionamento para o cérebro está ligada a uma pluralidade de polipeptídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorpo destes, para uso nos métodos da presente invenção.
[000280] Uma porção de direcionamento para o cérebro associada com um polipeptídio, aptâmero, anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento de anticorpo destes, aumenta a liberação cerebral do tal polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo deste. Foram descritos vários polipeptídeos que quando fundidos a uma proteína ou agente terapêutico, libera a proteína ou agente terapêutico através da barreia hemato-encefálica (BBB). Exemplos não limitantes incluem o anticorpo de domínio único FC5 (Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, um anticorpo monoclonal para o receptor de insulina humano (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807 816); os peptídeos B2, B6 e B8 que se ligam ao receptor de transferri- na humano (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Virol. 74, 11359-11366); o anti- corpo monoclonal OX26 para o receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); conjugados de toxina diftérica (veja, por exemplo, Gaillard et al., International Congress Series 1277:185-198 (2005); e SEQ ID NOs: 1-18 da Patente U.S. No. 6.306.365. Os conteúdos das referências acima são incorporados aqui por referência nas suas totalidades.
[000281] Liberação cerebral aumentada de uma composição de NgR1 é determinada por vários meios bem estabelecidos na técnica. Por exemplo, administrar a um animal um polipeptídeo, aptâmero, anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento de anticorpo deste, marcado radioativamente, ligado a uma porção de direcionamento cerebral; determinar a localização no cérebro; e comparar a localização com um polipeptídeo, aptâmero, anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento de anticorpo deste, marcado radioativamente correspondente, que não está associado com uma porção de direcionamento cerebral. Outros meios de determinar direcionamento aumentado são descritos nas referências acima.
[000282] Algumas modalidades da invenção empregam uma porção de polipeptídeo de NgR fundida a uma região de dobradiça e uma Fc, isto é, a porção C-terminal de uma região constante de cadeia pesada de Ig. Em algumas modalidades, aminoácidos na região de dobradiça podem ser substituídos por aminoácidos diferentes. Substituições de aminoácido exemplares para a região de dobradiça de acordo com essas modalidades incluem substituições de resíduos de cisteína individuais na região de dobradiça por aminoácidos diferentes. Qualquer aminoácido diferente pode ser substituído por uma cisteína da região de dobradiça. Substituições de aminoácidos para os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção e a seqüência de aminoácido de referência podem incluir aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leuci- na, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Aminoácidos típicos para substituir por cisteínas no aminoácido de referência incluem, alanina, serina, treonina, em particular, se-rina e alanina. Fazer tais substituições através de manipulação de um polinucleotídeo que codifica o fragmento de polipeptídeo é bem- conhecido dentro da habilidade de rotina de um versado na técnica.
[000283] Potenciais vantagens de um polipeptídeo NgR-Fc de fusão incluem solubilidade, estabilidade in vivo, e multivalência, por exemplo, dimerização. A região Fc usada pode ser uma região Fc (dobradiça- CH2-CH3) de IgA, IgD, ou IgG. Alternativamente, ela pode ser uma região Fc (dobradiça-CH2-CH3-CH4) de IgE ou IgM. Uma região Fc de IgG é geralmente usada, por exemplo, uma região Fc de IgG1 ou uma região Fc de IgG4. Materiais e métodos para construir e expressar DNA que codifica fusões de Fc são conhecidos na técnica e podem ser aplicados para obter fusões sem experimentação excessiva. Algumas modalidades da invenção empregam uma proteína de fusão tal como aquela descrita em Capon et al, Patente U.S. Nos. 5.428.130 e 5.565.335.
[000284] A seqüência de sinal é um polinucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido que inicia o transporte de uma proteína através da membrana do reticulo endoplasmático. Seqüências de sinal úteis para construir uma imunofusina incluem seqüências de sinal de cadeia leve do anticorpo, por exemplo, anticorpo 14.18 (Gillies et al, J. Immunol. Meth., 125:191-202 (1989)), seqüências de sinal de cadeia pesada do anticorpo, por exemplo, a seqüência de sinal da cadeia pe- sada do anticorpo MOPC141 (Sakano et al, Nature 286:5774 (1980)). Alternativamente, outras seqüências de sinal podem ser usadas. Veja, por exemplo, Watson, Nucl Acids Res. 12:5145 (1984). O peptídeo de sinal é geralmente clivado no lúmen do retículo endoplasmático por peptidases de sinal. Isso resulta na secreção de uma proteína de imu- nofusina contendo a região Fc e a porção do polipeptídeo de NgR.
[000285] Em algumas modalidades, a seqüência de DNA pode codificar um sítio de clivagem proteolítica entre o cassete de secreção e a porção do polipeptídeo de NgR. Tal sítio de clivagem pode gerar, por exemplo, a clivagem proteolítica da proteína de fusão codificada, separando assim o domínio Fc da proteína-alvo. Sítios de clivagem proteolítica úteis incluem seqüências de aminoácido reconhecidas por enzimas proteolíticas tais como tripsina, plasmina, trombina, fator Xa, ou enteroquinase K.
[000286] O cassete de secreção pode ser incorporado em um vetor de expressão replicável. Vetores úteis incluem ácidos nucléicos lineares, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos e semelhantes. Um vetor de expressão é pdC, no qual a transcrição do DNA de imunofusina é colocado sob o controle de intensificador e promotor do citomegalovírus humano. Veja, por exemplo, Lo et al, Biochim. Biophys. Acta 1088:112 (1991); e Lo et al, Protein Engneering 17:495-500 (1998). Uma célula hospedeira apropriada pode ser transformada ou transfectada com um DNA que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção e usada para a expressão e secreção do polipeptídeo. Células hospedeiras que são tipicamente usadas incluem células imortais de hibridoma, células de mieloma, células 293, células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, e células COS.
[000287] Regiões Fc selvagens completamente intactas apresentam funções efetoras que normalmente são desnecessárias e indesejadas em uma proteína de fusão de Fc usada nos métodos da presente in venção. Portanto, certos sítios de ligação de Fc são tipicamente dele- tados da região Fc durante a construção do cassete de secreção. Por exemplo, já que a co-expressão com a cadeia leve é desnecessária, o sítio de ligação para a proteína de ligação da cadeia pesada, Bip (Hendershot et al, Immunol. Today 8:111-14 (1987)), é deletado do domínio CH2 da região Fc de IgE, tal que esse sítio não interfira com a secreção eficaz da imunofusina. Seqüências do domínio transmem- brana, tais como aquelas presentes em IgM, também são geralmente deletadas.
[000288] A região Fc de IgG1 é a mais freqüentemente usada. Alternativamente, a região Fc das outras subclasses de imunoglobulina gama (gama-2, gama-3, e gama-4) pode ser usada no cassete de secreção. A região Fc de IgG1 de imunoglobulina gama-1 é geralmente usada no cassete de secreção e inclui pelo menos parte da região de dobradiça, a região CH2, e a região CH3. Em algumas modalidades, a região Fc de imunoglobulina gama-1 é uma Fc com CH2 deletada, que inclui parte da região de dobradiça e a região CH3, mas não a região CH2. Uma Fc com CH2 deletada foi descrita por Gillies et al, Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990). Em algumas modalidades, a região Fc de uma dentre IgA, IgD, IgE, ou IgM, é usada.
[000289] Proteínas de fusão NgR-polipeptídeo-porção-Fc podem ser construídas em várias configurações diferentes. Em uma configuração a terminação-C da porção do polipeptídeo de NgR é fundida diretamente à terminação-N da porção de dobradiça de Fc. Em uma configuração um pouco diferente, um polipeptídeo curto, por exemplo, 2 a 10 aminoácidos, é incorporado na fusão entre a terminação-N da porção do polipeptídeo de NgR e a terminação-C da porção de Fc. Em uma configuração alternativa, o polipeptídeo curto é incorporado na fusão entre a terminação-C da porção do polipeptídeo de NgR e a termina- ção-N da porção de Fc. Uma modalidade exemplar dessa configura ção é NgR1(310)-2XG4S-Fc, que são os aminoácidos 26 a 310 de SEQ ID NO:49 ligados a (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO:66) que é ligado a Fc. Tal ligante fornece flexibilidade conformacional o que pode melhorar a atividade biológica em algumas circunstâncias. Se uma porção suficiente da região de dobradiça for mantida na porção Fc, a fusão NgR-polipeptídeo-porção-Fc dimerizará, formando assim uma molécula divalente. Uma população homogênea de fusões de Fc mo- noméricas produzirá dímeros bivalentes monoespecíficos. Uma mistura de duas fusões de Fc monoméricas cada uma tendo uma especificidade diferente produzira dímeros bivalentes biespecíficos.
[000290] Qualquer um dentre vários reticuladores que contêm um grupo amino-reativo e grupo um tiol-reativo correspondente pode ser usado para ligar um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção à albumina sérica. Exemplos de ligantes adequados incluem reticuladores de amina reativa que inserem uma maleimi- da tiol-reativa, por exemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, e GMBS. Outros ligantes adequados inserem um grupo haloacetato tiol-reativo, por exemplo, SBAP, SIA, SIAB. Ligantes que fornecem um tiol protegido ou não-protegido para reação com grupos sulfidrila para produzir uma ligação reduzível incluem SPDP, SMPT, SATA, e SATP. Tais reagentes são disponíveis comercialmente (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL).
[000291] Conjugação não precisa envolver a terminação-N de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção ou a porção tiol em albumina sérica. Por exemplo, fusões de polipeptídeo de NgR-albumina podem ser obtidas usando técnicas de manipulação genética, em que a porção de polipeptídeo de NgR é fundida ao gene da albumina sérica na sua terminação-N, terminação-C ou ambas.
[000292] Polipeptídeos de NgR da invenção podem ser fundidos a um sinalizador de polipeptídeo. O termo "sinalizador de polipeptídeo" como usado aqui, é entendido por significar qualquer seqüência de aminoácidos que pode ser unida a, ou conectada a, ou ligada a um polipeptídeo de NgR e que pode ser usada para identificar, purificar, concentrar ou isolar o polipeptídeo de NgR. A ligação do sinalizador de polipeptídeo ao polipeptídeo de NgR pode ocorrer, por exemplo, por construir uma molécula de ácido nucléico que compreende: (a) seqüência de ácido nucléico que codifica o sinalizador de polipeptídeo, e (b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de NgR. Sinalizadores de polipeptídeo exemplares incluem, por exemplo, seqüências de aminoácido que são capazes de ser modificadas pós- traducionalmente, por exemplo, seqüências de aminoácido que são biotiniladas. Outros sinalizadores de polipeptídeo exemplares incluem, por exemplo, seqüências de aminoácido que são capazes de ser reconhecidas e/ou ligadas por um anticorpo (ou fragmento deste) ou outro reagente de ligação específico. Sinalizadores de polipeptídeo que são capazes de ser reconhecidos por um anticorpo (ou fragmento deste) ou outro reagente de ligação específico incluem, por exemplo, aqueles que são conhecidos na técnica como "sinalizadores de epitopo". Um sinalizador de epitopo pode ser um sinalizador de epitopo natural ou artificial. Sinalizadores de epitopo naturais e artificiais são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo epitopos artificiais tais como, peptí- deos FLAG, Strep, ou polihistidina. Peptídeos FLAG incluem a seqüência Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:74) ou Asp- Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:75) (Einhauer, A. & Jungbauer, A., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 1-3:455-465 (2001)). O epitopo Strep tem a seqüência Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:76). O epitopo VSV-G também pode ser usado e tem a seqüência Tyr-Thr-Asp-He-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys (SEQ ID NO:77). Outro epitopo artificial é uma seqüência de poli-His que tem seis resíduos de histidina (His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 78)). Epitopos que ocorrem naturalmente incluem a seqüência da hemaglu- tinina (HA) do vírus influenza Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-He- Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 79) reconhecida pelo anticorpo monoclonal 12CA5 (Murray et al, Anal. Biochem. 229:170-179 (1995)) e a seqüência de onze aminoácidos de c-myc (Myc) humano reconhecida pelo anticorpo monoclonal 9E10 (Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp- Leu-Asn (SEQ ID NO:80) (Manstein et al, Gene 162:129-134 (1995)). Outro epitopo útil é o tripeptídeo Glu-Glu-Phe que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal YL 1/2. (Stammers et al. FEBS Lett. 283:298- 302(1991)).
[000293] Em certas modalidades, o polipeptídeo de NgR e o sinalizador de polipeptídeo podem ser ligados através de uma seqüência de aminoácido de ligação. Como usado aqui, uma "seqüência de aminoácido de ligação" pode ser uma seqüência de aminoácido que é capaz de ser reconhecida e/ou clivada por uma ou mais proteases. Seqüências de aminoácido que podem ser reconhecidas e/ou clivadas por uma ou mais proteases são conhecidas na técnica. Seqüências de aminoácido exemplares são aquelas que são reconhecidas pelas seguintes proteases: fator VIIa, fator, IXa, fator Xa, APC, t-PA, u-PA, trip- sina, quimiotripsina, enteroquinase, pepsina, catepsina B, H, L, S, D, catepsina G, renina, enzima conversora de angiotensina, metaloproteases de matriz (colagenases, estromelisinas, gelatinases), elastase de macrófago, Cir, e Cis. As seqüências de aminoácido que são reconhecidas pelas proteases mencionadas acima são conhecidas na técnica. Seqüências exemplares reconhecidas por certas proteases podem ser encontradas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.811.252.
[000294] Sinalizadores de polipeptídeo podem facilitar a purificação usando meios cromatográficos disponíveis comercialmente.
[000295] Em algumas modalidades da invenção, um constructo de fusão de polipeptídeo de NgR é usado para aumentar a produção de uma porção de polipeptídeo de NgR em bactérias. Em tais constructos, uma proteína bacteriana, normalmente expressa e/ou secretada em um alto nível, é empregada como uma parceiro de fusão N- terminal de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de 1 NgR1 da invenção. Veja, por exemplo, Smith et al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al, Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallie et al, Biotechnology 11:187 (1993).
[000296] Por fundir uma porção de polipeptídeo de NgR às terminações amino e carbóxi de um parceiro de fusão adequado, formas bivalentes ou tetravalentes de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 podem ser obtidas. Por exemplo, uma porção de polipeptídeo de NgR pode ser fundida às terminações amino e carbóxi de uma porção de Ig para produzir um polipeptídeo monomérico bivalente que contêm duas porções de polipeptídeo de NgR. Mediante dimeriza- ção de dois desses monômeros, devido à porção de Ig, uma forma tetravalente de um polipeptídeo de NgR é obtida. Tais formas multivalentes podem ser fundidas para se obter afinidade de ligação aumentada pelo alvo. Formas multivalentes de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR da invenção também podem ser obtidas por colocar porções de polipeptídeo de NgR aleatoriamente para formar con- catâmeros, que podem ser empregados sozinhos ou fundidos a um parceiro de fusão tal como Ig ou HSA.
Polímeros Conjugados (exceto polipeptídeos)
[000297] Algumas modalidades da invenção envolvem um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção em que um ou mais polímeros são conjugados (ligados covalentemente) ao polipeptídeo de NgR. Exemplos de polímeros adequados para tal conjugação incluem polipeptídeos (discutidos acima), polímeros de açúcar e cadeias de polialquileno glicol. Tipicamente, mas não necessariamente, um polímero é conjugado ao polipeptídeo ou fragmento de polipeptí- deo de NgR1 da invenção com o propósito de melhorar um ou mais dentre o seguinte: solubilidade, estabilidade ou biodisponibilidade.
[000298] A classe de polímero geralmente usada para conjugação a um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção é um polialquileno glicol. Polietileno glicol (PEG) é o mais freqüentemen- te usado. Porções de PEG, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 polímeros de PEG, podem ser conjugadas a cada polipeptídeo de NgR para aumentar a meia-vida sérica, quando comparado ao polipeptídeo de NgR sozinho. Porções de PEG são não-antigênicas e essencialmente inertes biologicamente. Porções de PEG usadas na prática da invenção podem ser ramificadas ou não ramificadas.
[000299] O número de porções de PEG ligadas ao polipeptídeo de NgR e o peso molecular das cadeias de PEG individuais podem variar. Em geral, quanto maior o peso molecular do polímero, menores as cadeias de polímeros ligadas ao polipeptídeo. Geralmente, a massa total de polímero ligada a um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR é de 20 kDa a 40 kDa. Assim, se uma cadeia de polímero está ligada, o peso molecular da cadeia é geralmente de 20 a 40 kDa. Se duas cadeias de polímero estão ligadas, o peso molecular de cada cadeia é geralmente de 10 a 20 kDa. Se três cadeias estão ligadas, o peso molecular é geralmente de 7 a 14 kDa.
[000300] O polímero, por exemplo, PEG, pode estar ligado ao polipeptídeo de NgR através de qualquer grupo reativo adequado exposto sobre o polipeptídeo. O(s) grupo(s) reativo(s) exposto(s) pode(m) ser, por exemplo, um grupo amino N-terminal ou o grupo amino épsilon de um resíduo interno de lisina ou ambos. Um polímero ativado pode reagir e se ligar covalentemente em qualquer grupo amino livre sobre o polipeptídeo de NgR. Grupos carboxílicos livres, grupos carbonila adequadamente ativados, hidroxila, guanidila, imidazol, porções de carboidrato oxidado e grupos mercapto do polipeptídeo de NgR (se dis- poníveis) também podem ser usados como grupos reativos para ligação de polímero.
[000301] Em uma reação de conjugação, de cerca de 1,0 a cerca de 10 moles de polímero ativado por mol de polipeptídeo, dependendo da concentração de polipeptídeo, é tipicamente empregado. Geralmente, a proporção escolhida representa um equilíbrio entre maximizar a reação enquanto se minimiza as reações colaterais (geralmente inespecí- ficas) que podem prejudicar a atividade farmacológica desejada da porção de polipeptídeo de NgR. Preferivelmente, pelo menos 50% da atividade biológica (como demonstrado, por exemplo, em qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidos na técnica) do polipeptídeo de NgR é mantida e mais preferivelmente aproximadamente 100% é mantida.
[000302] O polímero pode ser conjugado ao polipeptídeo de NgR usando química convencional. Por exemplo, uma porção de polialquileno glicol pode ser acoplada a um grupo amino épsilon de lisina do polipeptídeo de NgR. A ligação a uma cadeia lateral de lisina pode ser realizada com um éster ativo de N-hidroxilsuccinimida (NHS) tal como succinimidil succinato (SS-PEG) e succinimidil propionato (SPA-PEG) de PEG. Porções de polialquileno glicol adequadas incluem, por exemplo, carboximetil-NHS e norleucina-NHS, SC. Esses reagentes estão comercialmente disponíveis. Ligantes de PEG de amina reativa adicionais podem ser substituídos pela porção succinimidila. Esses incluem, por exemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos (PNP), epó- xidos, carbonatos de benzotriazol, SC-PEG, tresilato, aldeído, epóxido, carbonilimidazol e carbonato de PNP. As condições são geralmente otimizadas para maximizar a seletividade e a extensão da reação. Tal otimização de condições de reação está dentro do conhecimento do versado na técnica.
[000303] A PEGuilação pode ser executada por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992 e pedidos de patente europeus EP 0 154 316 e EP 0 401 384. A PEGuilação pode ser executada usando uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa (ou um polímero análogo solúvel em água reativo).
[000304] PEGuilação por acilação geralmente envolve reagir um derivado de éster ativo de polietileno glicol. Qualquer molécula de PEG reativa pode ser empregada na PEGuilação. PEG esterificado para N- hidroxissuccinimida (NHS) é um éster de PEG ativado freqüentemente usado. Como usado aqui, "acilação" inclui, sem limitação, os seguintes tipos de ligações entre a proteína terapêutica e um polímero solúvel em água tal como PEG: amida, carbamato, uretano e semelhantes. Veja, por exemplo, Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Os parâmetros da reação são geralmente selecionados para evitar condições de temperatura, solvente e pH que possam danificar ou inativar o polipeptídeo de NgR.
[000305] Geralmente, a ligação de conexão é uma amida e tipicamente pelo menos 95% do produto resultante é mono-, di- ou triPEGui- lado. Entretanto, algumas espécies com graus mais elevados de PEGuilação podem ser formadas em quantidades que dependem das condições específicas de reação usadas. Opcionalmente, espécies PEGuiladas purificadas são separadas da mistura, particularmente espécies não reagidas, por métodos convencionais de purificação, incluindo, por exemplo, diálise, precipitação por salificação, ultrafiltração, cromatografia de troca de íon, cromatografia de filtração em gel, cro-matografia de troca hidrofóbica e eletroforese.
[000306] PEGuilação por alquilação geralmente envolve reagir um derivado de aldeído terminal de PEG com um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção na presença de um agen- te redutor. Além disso, pode-se manipular as condições de reação para favorecer a PEGuilação substancialmente apenas no grupo amino N- terminal do polipeptídeo de NgR, isto é, uma proteína mono- PEGuilada. Em cada um dos casos de mono-PEGuilação ou poli- PEGuilação, os grupos de PEG estão tipicamente ligados à proteína através de um grupo -CH2-NH-. Com referência particular ao grupo - CH2-, este tipo de ligação é conhecida como uma ligação "alquila".
[000307] Derivatização através de alquilação redutiva para produzir um produto monoPEGuilado N-terminalmente direcionado explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o terminal-N) disponíveis para derivatização. A reação é realizada em um pH que permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre os grupos épsilon-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo amino N-terminal da proteína. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reativo, tal como um aldeído, a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente na terminação-N da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino das cadeias laterais de lisina.
[000308] As moléculas de polímero usadas tanto nas abordagens de acilação como de alquilação são selecionadas entre polímeros solúveis em água. O polímero selecionado é tipicamente modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilação ou um aldeído para alquilação, tal que o grau de polimerização pode ser controlado conforme fornecido nos presentes métodos. Um aldeído de PEG reativo exemplar é propionaldeído de polietileno glicol, que é estável em água, ou derivados mono C1-C10 alcóxi ou arilóxi deste (veja, por exemplo, Harris et al, Pat. U.S. No. 5.252.714). O polímero pode ser ramificado ou não-ramificado. Para as reações de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) tem(têm) tipicamente um único grupo de éster reativo. Para alquilação redutiva, o(s) polímero(s) selecionado(s) tem(têm) tipicamente um único grupo aldeído reativo. Geralmente, o polímero solúvel em água não será selecionado a partir dos resíduos de glicosila que ocorrem naturalmente, porque esses são geralmente feitos mais convenientemente por sistemas de expressão recombinante de mamíferos.
[000309] Métodos para preparar polipeptídeos de NgR PEGuilados da invenção geralmente incluem as etapas de (a) reagir um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção com polietileno glicol (tal como um éster ou aldeído reativos derivados de PEG) sob condições pelas quais a molécula se torna ligada a um ou mais grupos de PEG e (b) obter o(s) produto(s) de reação. Em geral, as condições ótimas de reação para as reações de acilação serão determinadas caso a caso com base em parâmetros conhecidos e o resultado desejado. Por exemplo, uma maior proporção de PEG para proteína geralmente leva a um percentual maior de produto poli-PEGuilado.
[000310] Alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogênea de monopolímero/polipeptídeo de NgR geralmente inclui as etapas de: (a) reagir um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção com uma molécula de PEG reativa sob condições de alquilação redutiva, em um pH adequado para permitir a modificação seletiva do grupo amino N-terminal de NgR; e (b) obter o(s) produto(s) de reação.
[000311] Para uma população substancialmente homogênea de mono-polímero/polipeptídeo de NgR, as condições de reação da alquilação redutiva são aquelas que permitem a ligação seletiva da porção solúvel em água do polímero à terminação-N de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção. Tais condições de reação geralmente fornecem diferenças de pKa entre os grupos amino da cadeia lateral de lisina e o grupo amino N-terminal. Para os propósitos da presente inven- ção, o pH é geralmente na faixa de 3 a 9, tipicamente 3 a 6.
[000312] Polipeptídeos de NgR da invenção podem incluir um sinalizador, por exemplo, uma porção que pode ser subseqüentemente liberada por proteólise. Assim, a porção de lisina pode ser modificada seletivamente primeiro, por reagir um sinalizador de His (His-tag) modificado com um ligante de baixo peso molecular, tal como, reagente de Traut (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) que reagirá com a lisina e com a terminação-N e então liberar o sinalizador de His. O polipeptídeo conterá então um grupo SH livre que pode ser seletivamente modificado com um PEG contendo um grupo cabeça tiol-reativo tal como um grupo de maleimida, um grupo vinilsulfona, um grupo haloa- cetato ou uma SH livre ou protegida.
[000313] O reagente de Traut pode ser substituído por qualquer ligante que ativar um sítio específico para a ligação de PEG. Por exemplo, o reagente de Traut pode ser substituído por SPDP, SMPT, SATA ou SATP (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Similarmente, pode-se reagir a proteína com um ligante de amina reativa que insere uma maleimida (por exemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, ou GMBS), um grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) ou um grupo vinilsulfona e reagir o produto resultante com um PEG que contém uma SH livre.
[000314] Em algumas modalidades, a porção de polialquileno glicol está acoplada um grupo de cisteína do polipeptídeo de NgR. O acoplamento pode ser efetuado usando, por exemplo, um grupo maleimida, um grupo vinilsulfona, um grupo haloacetato ou um grupo tiol.
[000315] Opcionalmente, o polipeptídeo de NgR é conjugado à porção de polietileno glicol através de uma ligação lábil. A ligação lábil pode ser clivada, por exemplo, em hidrólise bioquímica, proteólise ou clivagem de sulfidrila. Por exemplo, a ligação pode ser clivada sob condições in vivo (fisiológicas).
[000316] As reações podem ocorrer por qualquer método adequado usado para reagir materiais biologicamente ativos com polímeros inertes, geralmente em pH de cerca de 5 a 8, por exemplo, pH 5, 6, 7 ou 8, se os grupos reativos estão sobre o grupo alfa amino na terminação-N. Geralmente o processo envolve preparar um polímero ativado e depois reagir a proteína com o polímero ativado para produzir a proteína solúvel adequada para a formulação.
[000317] Os polipeptídeos de NgR da invenção, em certas modalidades, são polipeptídeos solúveis. Métodos para fazer um polipeptídeo solúvel ou melhorar a solubilidade de um polipeptídeo são bem- conhecidos na técnica.
Moléculas de Ácido Nucléico da Presente Invenção
[000318] A presente invenção proporciona um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção, incluindo os polipeptídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 a 9, 26 a 27, 29 a 37 e 41 a 45. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 344 do receptor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 6 e 8 ou resíduos de aminoácido 27 a 344 do receptor Nogo-1 como mostrado na SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 310 do receptor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 7 e 9 ou resíduos de aminoácido 27 a 310 do receptor Nogo-1 como mostrado na SEQ ID NO: 9. Como usado aqui, "ácido nucléico" significa DNA genômico, cDNA, mRNA e moléculas anti-sentido, assim como ácidos nucléicos baseados em estruturas principais alternativos ou que incluem bases alternativas tanto derivados de fontes naturais quanto sintetizados. Em algumas modalidades, o ácido nucléico ainda compreende um promotor transcricional e opcionalmente uma seqüência de sinal, cada qual operativamente ligado à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo da invenção.
[000319] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção, incluindo uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 344 do receptor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 6 e 8 ou resíduos de aminoácido 27 a 344 de SEQ ID NO:8 e resíduos de aminoácido 26 a 310 do receptor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 7 e 9 ou resíduos de aminoácido 27 a 310 de SEQ ID NO:9. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 que compreende polipeptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 26 a 27, 29 a 37 e 41 a 45. Em algumas modalidades, o ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 ainda compreende um promotor transcricional e opcionalmente uma seqüência de sinal. Em algumas modalidades, a seqüência de nucleotídeos ainda codifica uma região constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a região constante de imunoglobulina é uma região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a seqüência de nucleotídeos ainda codifica uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina ligada a uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, o ácido nucléico ainda codifica Fc. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão do receptor Nogo-1 compreendem um fragmento de Fc.
[000320] Os ácidos nucléicos codificantes da presente invenção podem ainda ser modificados a fim de conter um marcador detectável para fins de diagnóstico e sonda. Uma variedade de tais marcadores são conhecidos na técnica e podem ser facilmente empregados com as moléculas codificantes descritas aqui. Marcadores adequados incluem, mas não são limitados a biotina, nucleotídeos radiomarcados e semelhantes. O versado ma técnica pode empregar qualquer um dos marcadores co nhecidos na técnica para obter uma molécula de ácido nucléico marcada.
[000321] A presente invenção também inclui polinucleotídeos que hibridizam sob condições moderadamente estringentes ou de alta es- tringência à filamento não codificante, ou complemento, de um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos polipeptídeos da invenção. Condições estringentes são conhecidas daqueles versados na técnica e podem ser encontradas em CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
[000322] O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:81.
[000323] O receptor Nogo-1 humano de extensão completa é codificado pelo nucleotídeo 166 ao nucleotídeo 1587 de SEQ ID NO:81: agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg c9999a9ac9 ggcgcccgcc ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccc cgcccaaccc ctacgatgaa gagggcgtcc gctggaggga gccggctgct ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggaagcc ccatgcccag gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccag cagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcat cttcctgcac ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttccgtg cctgccgcaa cctcaccatc ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccga attgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc ctcctggagc agctggacct cagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca ttccacggcc tgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctg ggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgca ggacaacgcg ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggca acctcacaca cctcttcctg cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgag cgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac cgtctcctac tgcaccagaa ccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt ggccgcctca tgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggcc ctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctg ggtgtgtgac tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttcc gcggctcctc ctccgaggtg ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggc cgtgacctca aacgçctagc tgccaatgac ctgcagggct gcgctgtggc caccggccct taccatccca tctggaccgg cagggccacc gatgaggagc cgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctca gtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacg cgtgccgccc ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctggc ccacggcaca tcaatgactc accctttggg actctgcctg gctatgctga gcccccgctc actgcagtgc ggcccgaggg ctccgagcca ccagggttcc ccacctcggg ccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc cgcagccact gccgtctggg ccaggcaggc agcgggggtg gcgggactgg tgactcagaa ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcct ggcgctggtg ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccag.cggaca caagagcgtg ctcagcagcc aggtgtgtgt acatacgggg tctctctcca cgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg tggggcaggc caggccaggt cctccctgat ggacgcctg
[000324] O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 de rato é mostrado abaixo como SEQ ID NO:82 e tem número de acesso NM_053613 no GenBank. aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct acaatgagcc caaggt-caca acaagccgcc cccagcaggg cctgcaggct gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag agaatcttcc tgcacggeaa ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt ccagtcatgc cggaatctca ccatcctgtg gctgαactca aatgcgctgg cαgggattga tgccgcggαc ttcactggtc tgaccctcct ggagcaacta gatcttagtg acaatgcaca gctccgtgtα gtggacccca ccacgttccg tggcctgggc cacctgcaca cgctgcacct agaccgatgc ggcctgcagg agctggggcc tggcctattc cgtgggctgg cagαtctgca gtacctctac ctacaagaca acaacctgca ggcacttccc gacaacacct tccgagacct gggcaacctc acgcatctct ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc ctgagcacgc tttccgtggc ttgcacagtc ttgaαcgtct cctcttgcac cagaaccatg tggctcgtgt gcacccacat gccttccggg accttggccg actcatgacc ctctacctgt ttgccaacaa cctctccatg ctccccgcag aggtcctagt gcccctgagg tctctgcagt acctgcgact caatgacaac ccctgggtgt gtgactgcag ggcacgtccg ctctgggcct ggctgcagaa gttccgaggt tcctcatccg gggtgcccag caacctaccc caacgcctgg caggccgtga tctgaagcgc ctggctacca gtgacttaga gggttgtgct gtggcttcgg ggcccttccg tcccttccag accaatcagc tcactgaega ggagctgctg ggcctcccca agtgctgcca gccggatgct gcagacaagg cctcagtact ggaacccggg aggccggcgt αtgttggaaa tgcactcaag ggacgtgtgc ctcccggtga cactecacca ggcaatggct caggcccacg gcacatcaat gactctccat ttgggacttt gcccggctct gcagagcccc cactgactgc cctgcggcct gggggttccg agcccccggg actgcccacc acgggccccc gcaggaggcc aggttgttcc agaaagaacc gcacccgtag ccactgccgt ctgggccagg caggaagtgg gagcagtgga aαtggggatg cagaaggttc gggggccctg cctgccctgg cctgcagccfc tgctcctctg ggccttgcac tggtactttg gacagtgαtt gggccctgct ga
[000325] O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 de camundongo é ID NO:83 e tem número de acesso NM_022982 no GenBank. agccgcagcc cgcgagccca gcccggcccg gtagagcgga gcgccggagc ctcgtcccgc ggccgggccg ggaccgggcc ggagcagcgg cgcctggatg cggacccggc cgcgcgcaga cgggcgcccg ccccgaagcc gcttccagtg cccgacgcgc cccgctcgac cccgaagatg aagagggcgt cctccggagg aagcaggctg ctggcatggg tgttatggct acaggcctgg agggtagcaa caccatgccc tggegcttgt gtgtgctaca atgagcccaa ggtaacaaca agctgccccc agcagggtct gcaggctgtg cccactggca tcccagccec tagccagcga atcttcctgc atggcaaccg aatctcccac gtgccagctg cgagcttcca gtcatgccga aatctcacta tcctgtggct gcactctaat gcgctggctc ggatcgatgc tgccgccttc actggtctga ccctcctgga gcaactagat cttagtgata atgcacagct tcatgtcgtg gaccctacca cgttccacgg' cctgggccac ctgcacacac tgcacctaga ccgatgtggc ctgcgggagc tgggtcccgg cctattccgt ggactagcag ctctgcagta cctctaccta caagacaaca atctgcaggc aceccctgac aacacctttc gagacctggg caacctcacg catctctttc tgcatggcaa ccgtatcccc agtgtgcctg agcacgcttt ccgtggcctg caaagtcttg accgcctcct cttgcaccag aaccatgtgg ctcgtgtgca cccacatgcc ttccgggacc ttggccgcct caegaccctc tacctgtttg ccaacaacct ctccatgctg cctgcagagg tcctaatgcc cctgaggtct ctgcagtacc tgcgactcaa tgacaacccc tgggtgtgtg actgccgggc acgtccactc tgggcctggc tgcagaagtt ccgaggttcc tcatcagagg tgccctgcaa cctgccccaa cgcctggcag accgtgatct taagcgcctc gctgccagtg acctagaggg ctgtgctgtg gcttcaggac ccttccgtcc catccagacc agtcagctca ctgatgagga gctgctgagc ctccccaagt gctgccagcc agaegctgca gacaaagcct cagtactgga acccgggagg ccagcecctg ccggaaacgc cctcaaggga cgtgtgccta ccggtgacac tccaccaggc aaeggctcag gccctcggca catcaatgac tctccatttg gaactttgcc cagctctgca gagcccccac tgactgccct gcggcctggg ggttccgagc caccaggact' tcccaccact ggtccccgca ggaggccagg ttgttcccgg aagaatcgca cccgcagcca ctgccgtctg ggccaggcgg gaagtggggc cagtggaaca
[000326] O polinucleotídeo do receptor Nogo-2 humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:84 e é o número de acesso BK001302 no GenBank. atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcct cctgctgatg ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgc tctgcacctg ctactcatcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac ttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc agcactcagc gactcttcct gcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt gggtccaacc tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggc Iactttccgcc acttgcaagc actggaggag ctggacctcg gtgacaaccg gcacctgcgc tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgc agtαgctgca tttgtacagc tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatc ttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc tacctccagg agaacagcct gctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacc tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgc ggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcaggg cgtgcaccgc gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacc tgttcaacaa cagcctggcc tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctg ccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct aacccctggg cgtgcgactg ccgcgcgcgg ccgctcüggg cctggttcca gcgcgcgcgc gtgtccagct ccgacgtgac ctgagccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgc gcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcg gccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacgggg tggccgaggc cggggcgccc ccagccgatc cctccaccct ctaccgagat ctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcctactga ggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga ggggagcaga tgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcg ctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgcc ccaccacctc tga
[000327] O polinucleotídeo do receptor Nogo-2 de camundongo é mostrado abaixo como SEQ ID NO:85 e é o número de acesso NM_199223 no GenBank. atgctgcccg ggctccggcg cctgctgcaa ggtcctgcct cagcctgcct actgctgaca ctcctggccc ttccttccgt gacccccagc tgtcctatgc tctgcacctg ctactcctcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac ttctcctcag tgccgctgtc cttgccaccc agtacacaga gactcttctt gcagaacaac ctcatccgct cactgcggcc aggcaccttt gggcccaacc tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ccaccctggc accttccgcc acctgcaggc cctagaagaa ctggacctcg gtgacaaccg gcacctgcgc tccctggagc ccgacacctt ccagggtctg gagaggctgc a9tcactaca cctgtatcgt tgccagctca gcagcctgcc tggcaacatt ttccgaggct tggtcagcct acagtacctc tacctccagg agaacagcct gctccatcta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacc tcttcctcaa cgggaaccgc ctgcggctgc tcacggagca cgtgttccgc ggcttgggca gcctggaccg. gctgttgctg cacgggaacc ggctgcaggg cgtgcaccgc gcggctttcc acggcctcag ccgcctcacc atcctctacc tgttcaacaa cagcctggcc tcgctgccgg gagaggcgct ggccgacctg ccggcgctcg agttcctgcg gctcaacgcc aacccctggg cgtgcgactg ccgcgctcgg ccgctctggg cttggttcca gcgcgcgcgg gtgtccagct ccgacgtgac ctgcgccacc ccgcccgagc gccagggccg ggacctgcgc gcgctgcgcg actccgattt ccaagcgtgc ccgccgccca cgcccacgcg gccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ttccaaccac ctgtacggcg tggccgaggc tggcgctcαc cccgcagacc cgtccacgct ctaccgagat cizgcccgccg aggactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcccaccga ggacgactac tgggggggct acggcggcga ggatcagcgg ggcgagαaga cgtgtcccgg ggccgcgtgc caggαgcccg cagactcgcg tggccccgcg ctctcggccg ggctgcgcac ccctctgctc tgcctcttgc ccctggcgct ccatcacctctga
[000328] O polinucleotídeo do receptor Nogo-3 humano é mostrado abaixo como SEQ ID NO:86 e é o número de acesso BK001305 no GenBank. atgcttcgca aagggtgctg tgtggagttg ctgctgctgt tggtagctgc ggagctgccc ctgggtggtg gctgcccacg ggactgtgtg tgctacccgg cgcccatgac ggtcagatgc caggcgcaca actttgcagc catcccggag ggcatcccag tggacagcga gcgcgtcttc ctgcagaaca accgcatcgg cctcctccag cccggccact tcagccccgc catggtcacc ctgtggatat actcgaacaa catcacctac atccacccca gcaccttcga gggcttcgtg cacctggagg agctggacct cggcgacaac cggcagctgc ggacgctggc acccgagacc ttccagggcc tggtgaagct tcacgccctc tacctctaca agtgtgggct cagcgccttg ccggccggcg tctttggcgg cctgcacagc ctgcagtacc tctacctgca ggacaaccac atcgagtacc tccaggacga catcttcgtg gacctggtca acctcagcca cctgtttctc cacggcaaca agctgtggag tctgggcccg ggcaccttcc ggggcctggt gaacctggac cgtcttttgc tgcacgagaa ccagctgcag tgggtccacc acaaggcatt ccàcgacctc cgcaggctga ccaccctctt cctcttcaac aacagcctct cggagctgca gggtgagtgc ctggccccgc tgggggccct ggagttcctc cgcctcaatg gcaacccctg ggactgtggt tgtcgcgcgc gctccctgtg ggaatggctg cagaggttcc ggggctccag ctccgctgtc ccctgtgtgt cccctgggct gcggcacggc caggacctga agctgctgag ggccgaggac ttccggaact gcacgggacc agagtccccg caccagatca agtcacacac gctcaccace accgacaggg ccgcccgcaa ggaacaccac tcaccccacg gααccaccag gagcaagggc caaccgcacg gcccccggcc cggccacagg aagccgggga agaactgcac caaccccagg aaccgcaatc agatctctaa ggcgggcgcc gggaaacagg cccccgagct gccagactat gcaccagact accagcacaa gttcagtttt gacatcatgc ctacggcccg gcccaagagg aagggcaagt gtgcccgcag gacccccatc cgtgccccca gcggggtgca gcaggcctcc tcggccagtt αcctgggggc ctccctcctg gactggacac tsrasactggc ggtcactctc cgctga
[000329] O polinucleotídeo do receptor Nogo-3 de camundongo é mostrado abaixo como SEQ ID NO:87 e é o número de acesso BK001304 no GenBank. atgcttcgca aagggtgctg tgtggaattg ctgctgttgc tgctcgatgg agagctacct ctgggtggtg gttgtcctcg agactgtgtg tgctaccctg cgcccatgac tgtcagctgc caggcacaca actttgctgc catcccggag ggcatcccag aggacagtga gcgcatcttc ctgcagaaca atcgcatcac cttcctccag cagggccact tcagccccgc catggtcacc ctctggatct actccaacaa catcactttc attgctccca acaccttcga gggctttgtg catctggagg agctagacct tggagacaac cgacagctgc gaacgctggc acccgagacc ttccaaggcc tggtgaagct tcacgcactc tacctctata agtgtggact gagcgccctg cccgcaggca tctttggtgg cctgcacagc ctgcagtatc tctacttgca ggacaaccat atcgagtacc tccaagatga catcttt9t9 gacctggtca atctcagtca cttgtttctc catggtaaca agctatggag catgggccaa ggcatcttcc ggggcctggt gaacctggac cggttgctgc tgcatgagaa ccagctacag tgggttcacc acaaggcttt ccatgacctc cacaggctaa ccaccctctt tctcttcaac aacagcctca ctgagctgca gggtgactgt ctggcccccc tggtggcctt ggagttcctt cgcctcaatg ggaatgcttg ggactgtggc tgccgggcac gttccctgtg 99aa-^-9Sc'-9 cgaaggttcc gtggctctag ctctgctgtc ccctgcgcga cccccgagct gcggcaaggc caggatctga agctgctgag ggtggaggac ttccggaact gcacaggacc agtgtctcct caccagatca agtctcacac gcttaccacc tctgacaggg ctgcccgcaa ggagcaccat ccgtcccatg gggccúccag ggacaaaggc cacccacatg gccatccgcα tggαtccagg ecaggttaca agaaggcagg caagaactgc aαcagccaca ggaaccggaa ccagatctet aaggtgagct ctgggaaaga gcttaccgaa ctgcaggack atgccccαga ctatcagcac aagttcagct ttgacatcat gcccaccgca cgacccaaga ggaagggcaa gtgtgctcgc aggaccccca tccgtgcccc cagtggggtg cagcaggcat cctcaggcac ggαccttggg gccccactcc tggcctggat actggggctg gcagtcactc tccgctga
Antagonistas do Polinucleotídeo de NgR1
[000330] Modalidades específicas compreendem antagonistas do polinucleotídeo de NgR1 que impedem a expressão de NgR1 (atenuação). Antagonistas do polinucleotídeo de NgR1 incluem, mas não são limitados a moléculas anti-sentido, ribozimas, siRNA, shRNA e RNAi. Tipicamente tais moléculas de ligação são administradas separadamente ao animal (veja, por exemplo, O'Connor, J. Neurochem. 56:560 (1991), mas tais moléculas de ligação também podem ser expressas in vivo a partir de nucleotídeos absorvidos por uma célula hospedeira e expressos in vivo. Veja também Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988).
[000331] A expressão do gene de NgR pode, em algumas modalidades, ser inibida pelo uso de interferência de RNA ("RNAi"). RNAi refere- se a expressão de um RNA que interfere com a expressão do mRNA alvo. RNAi é um fenômeno no qual a introdução de um RNA duplo- filamento (dsRNA) em uma célula causa a degradação do mRNA homólogo. Descoberto primeiramente no nematódio Caenorhabditis elegans, foi descoberto então que RNAi ocorre em uma ampla variedade de organismos. Um "ácido nucléico de RNAi" como usado aqui é uma seqüência de ácido nucléico geralmente menor do que 50 nucleotídeos de extensão que causa o silenciamento gênico ao nível do mRNA.
[000332] Por exemplo, em células de mamíferos, a introdução de um dsRNA longo (> 30 nucleotídeos) pode iniciar uma resposta antiviral potente, exemplificada pela inibição inespecífica de síntese de proteína e degradação de RNA. Interferência de RNA fornece um mecanismo de silenciamento gênico ao nível de mRNA. Recentemente, RNAi tornou-se uma técnica de silenciamento gene-específica endógena e potente que usa RNAs duplo-filamento (dsRNA) para marcar um transcrito particular para degradação in vivo. Ela também oferece uma abordagem eficiente e amplamente aplicável para repressão (knock-out) gênica. Além disso, a tecnologia de RNAi pode ser usada para fins terapêuticos. Por exemplo, RNAi direcionado para apoptose mediada por Fas mostrou proteger ca-mundongos de hepatite fulminante. A tecnologia de RNAi foi descrita em várias publicações, tais como Pat. U.S. Nos. 5.919.619, 6.506.559 e Pu-blicações PCT Nos. WO99/14346, WO01/70949, WO01/36646, WO00/63364, WO00/44895, WO01/75164, WO01/92513, WO01/68836 e WO01/29058.
[000333] Especificamente, o RNAi silencia um gene alvo através de interação com o mRNA específico (por exemplo NgR1) através de um siRNA (pequeno RNA de interferência). O complexo de dsRNA é então marcado para degradação pela célula. Moléculas de RNAi adicionais incluem pequeno RNA em forma de grampo (shRNA); também pequeno RNA em forma de grampo de interferência (short interfering hairpin). A molécula de shRNA contém seqüências senso e anti-sentido de um gene alvo conectadas por um loop. O shRNA é transportado do núcleo para o citoplasma, é degradado junto com o mRNA. Promotores Pol III ou U6 podem ser usados para expressar RNAs para RNAi. Uma seqüência capaz de inibir a expressão gênica por interferência de RNA pode ter qualquer extensão. Por exemplo, a seqüência pode ter pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100 ou mais nucleotídeos consecutivos. A seqüência pode ser dsRNA ou qualquer outro tipo de polinucleotídeo, contanto que a seqüência possa formar um complexo de silenciamento funcional para degradar o transcrito de mRNA alvo.
[000334] RNAi é mediada por moléculas de RNA de duplo filamento (dsRNA) que têm homologia seqüência-específica aos seus mRNAs "alvos" (Caplen et al, Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001). Estudos bioquímicos em lisados livres de célula de Drosophila indicam que os mediadores do silenciamento gênico dependente de RNA são dúpleces de RNA "de interferência pequeno" (siRNAs) de 18 a 25 nucleotídeos. Conseqüentemente, moléculas de siRNA podem ser vantajosamente usadas nos métodos da presente invenção. siRNAs podem ser produzidos endogenamente pela degradação de moléculas de dsRNA mais longas por uma nuclease relacionada à RNase III chamada Dicer. (Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001). siRNAs tam bém podem ser introduzidos em uma célula exogenamente ou por transcrição de um constructo de expressão. Uma vez formados, os siRNAs unem-se a complexos de proteína em complexos que contêm endorribonuclease conhecidos como complexos de silenciamento induzidos por RNA (RISCs). Uma desespiralização do siRNA gerada por ATP ativa os RISCs, que por sua vez atingem o transcrito de mRNA complementar por pareamento de base de Watson-Crick. Sem desejar estar preso a nenhuma teoria em particular, acredita-se que um RISC é guiado para um mRNA alvo, onde o dúplex de siRNA interage de forma seqüência-específica para mediar a clivagem de uma forma catalítica (Bernstein et al, Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al, Curr Biol J 11:1776-1780, 2001). A clivagem do mRNA ocorre próximo do meio da região ligada pela filamento de siRNA. Essa degradação de mRNA seqüência-específica resulta no silenciamento gênico.
[000335] RNAi tem sido usada para analisar a função gênica e para identificar genes essenciais em células de mamíferos (Elbashir et al, Methods 26: 199-213, 2002; Harborth et al, J Cell Sci 114:4557-4565, 2001), incluindo como forma de exemplos não limitantes os neurônios (Krichevsky et al, Proc Natl Acad Sci USA 99:11926-11929, 2002). RNAi também está sendo avaliada para modalidades terapêuticas, tal como inibir ou bloquear infecção, replicação e/ou crescimento de vírus, incluindo sem limitação, poliovírus (Gitlin et al, Nature 418:379-380, 2002) e HIV (Capodici et al, J Immunol 169:5196-5201, 2002), e reduzir a expressão de oncogenes (por exemplo, o gene bcr-abl; Scherr et al, Blood 26 Set. epub ahead of print, 2002). RNAi foi usada para modular a expressão gênica em embriões de mamíferos (camundongo) e anfíbios (Xenopus) (respectivamente, Calegari et al, Proc Natl Acad Sci USA 99:14236-14240, 2002; e Zhou, et al, Nucleic Acids Res 30:1664-1669, 2002), e em camundongos após o nascimento (Lewis et al, Nat Genet 32:107-108, 2002) e para reduzir a expressão de transgene em camundongos transgênicos adultos (McCaffrey et al, Nature 418:38-39, 2002). Foram descritos métodos para determinar a eficácia e especificidade de siRNAs em cultura celular e in vivo (veja, por exemplo, Bertrand et al, Biochem Biophys Res Commun 296: 10001004, 2002; Lassus et al, Sci STKE 2002(147):PL13, 2002; e Leirdal et al, Biochem Biophys Res Commun 295:744-748, 2002).
[000336] Moléculas que mediam RNAi, incluindo sem limitação siRNA, podem ser produzidas in vitro por síntese química (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), hidrólise de dsRNA (Yang et al, Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), por transcrição in vitro com RNA polimerase T7 (Donzeet et al, Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al, Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002) e por hidrólise de RNA de duplo filamento usando uma nuclease tal como RNase III de E. coli (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002).
[000337] Moléculas de siRNA também podem ser formadas pelo anelamento de dois oligonucleotídeos um ao outro, tendo tipicamente a seguinte estrutura geral, que inclui tanto porções de duplo filamento como de filamento simples:
Figure img0003
[000338] Em que N, X e Y são nucleotídeos; X pontes de hidrogênio a Y; ":" significa uma ponte de hidrogênio entre duas bases; x é um número inteiro natural que tem um valor entre 1 e cerca de 100; e m e n são números inteiros que têm, independentemente, valores entre 0 e cerca de 100. Em algumas modalidades, N, X e Y são, independentemente A, G, C e T ou U. Bases e nucleotídeos que não ocorrem naturalmente podem estar presentes, particularmente no caso de siRNA sintético (isto é, o produto de anelamento de dois oligonucleotídeos). A seção central de filamento dupla é chamada "núcleo" e tem pares de bases (bp) como unidades de medida; as porções de filamento simples são projeções que tem nucleotídeos (NT) como unidades de medida. As projeções mostradas são projeções 3', mas moléculas com projeções 5' também estão dentro do escopo da invenção. Dentro do escopo da invenção também estão moléculas de siRNA sem projeções (isto é, m = 0 e n = 0) e aquelas que tem uma projeção de um lado do centro mas não do outro (por exemplo, m = 0 e n > 1 ou vice-versa).
[000339] Inicialmente, a tecnologia de RNAi não pareceu ser facilmente aplicável a sistemas de mamíferos. Isso por que, em mamíferos, dsRNA ativa a proteína quinase (PKR) ativada por dsRNA resultando em cascata apoptótica e morte celular (Der et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3279-3283, 1997). Além disso, há muito se sabe que dsRNA ativa a cascata de interferon em células de mamíferos, o que também pode levar a fisiologia celular alterada (Colby et al., Annu. Rev. Microbiol. 25:333, 1971; Kleinschmidt et al., Annu. Rev. Biochem. 41:517, 1972; Lampson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58-.L782, 1967; Lomniczi et al., J. Gen. Virol. 8:55, 1970; e Younger et al, J. Bac- teriol. 92:862, 1966). Entretanto, a ativação mediada por dsRNA da PKR e cascatas de interferon requer dsRNAs maiores do que cerca de 30 pares de bases. Em contraste, dsRNAs menores do que 30 pares de bases de extensão demonstraram causar RNAi em células de ma míferos (Caplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747, 2001). Assim, é esperado que efeitos indesejáveis, inespecíficos associados com moléculas de dsRNA mais longas possam ser evitados pelo preparo de RNA curto que é substancialmente livre de dsRNAs mais longos.
[000340] Referências que se referem a siRNA: Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al, Curr Biol 11:1776-1780, 2001; Cullen, Nat Immunol. 3:597-599, 2002; Caplen et al, Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001; Hamilton et al, Science 286:950-952, 1999; Nagase et al, DNA Res. 6:63-70, 1999; Napoli et al, Plant Cell 2:279289, 1990; Nicholson et al, Mamm. Genome 13:67-73, 2002; Parrish et al, Mol Cell 6:1077-1087, 2000; Romano et al, Mol Microbiol 6:33433353, 1992; Tabara et al, Cell 99:123-132, 1999; e Tuschl, Chembio- chem. 2:239-245, 2001.
[000341] Paddison et al (Genes & Dev. 16:948-958, 2002) usaram pequenas moléculas de RNA dobradas em forma de grampo como um meio de realizar RNAi. Conseqüentemente, tais pequenas moléculas de RNA em forma de grampo (shRNA) também são vantajosamente usadas nos métodos da invenção. A extensão da haste e loop de shRNAs varia: as extensões da haste (stem) podem variar em qualquer lugar entre cerca de 25 a cerca de 30 nt e o tamanho da loop pode variar entre 4 a cerca de 25 nt sem afetar a atividade de silencia- mento. Apesar de não desejar estar preso a nenhuma teoria em particular, acredita-se que esses shRNAs se pareçam com os produtos de dsRNA da RNase DICER e, em qualquer evento, tenham a mesma capacidade de inibir a expressão de um gene específico.
[000342] Em algumas modalidades, a invenção proporciona que siRNA ou shRNA inibe a expressão de NgR1. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o siRNA ou shRNA é pelo menos 80%, 90%, ou 95% idêntico à seqüência de nucleotídeos que compreende: CUACUUCUCCCGCAGGCG (SEQ DD NO: 52) ou CCCGGACCGACGUCUUCAA (SEQ ID NO: 54) ou CUGACCACU- GAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56). Em outras modalidades, a seqüência de nucleotídeos de siRNA ou shRNA é CUACUUCUCCCGCAGGCG (SEQ ID NO: 52) ou CCCGGACCGACGUCUUCAA (SEQ ID NO: 54) ou CUGACCACUGAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56).
[000343] Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a seqüência de nucleotídeo do siRNA ou shRNA é complementar ao mRNA produzido pela seqüência de nucleotídeo GATGAAGAGGGCGTCCGCT (SEQ ID NO: 53) ou GGGCCTGG- CTGCAGAAGTT (SEQ ID NO: 55) ou GACTGGTGACTCAGAG AAGGC (SEQ ID NO: 57).
[000344] Em algumas modalidades da invenção, o shRNA é expresso a partir de um vetor lentiviral como descrito no Exemplo 26.
[000345] Sintetizar quimicamente moléculas de ácido nucléico com modificações (base, açúcar e/ou fosfato) pode impedir sua degradação por ribonucleases séricas, o que pode aumentar sua potência (veja, por exemplo, Eckstein et al, Publicação Internacional No. WO 92/07065; Perrault et al, Nature 344:565 (1990); Pieken et al, Science 253:314 (1991); Usman & Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17:334 (1992); Usman et al, Publicação Internacional No. WO 93/15187; e Rossi et al, Publicação Internacional No. WO 91/03162; Sproat, Pat. U.S. No. 5.334.711; Gold et al,. Pat U.S.. No. 6.300.074; e Burgin et al, supra; todas as quais estão incorporadas aqui por referência). Todas as referências acima descrevem várias modificações químicas que podem ser feitas às porções de base, fosfato e/ou açúcar das moléculas de ácido nucléico descritas aqui. Modificações que aumentam sua eficácia nas células e remoção de bases de moléculas de ácido nucléico para encurtar os tempos de síntese de oligonucleotídeos e reduzir as necessidades químicas são desejadas.
[000346] Existem vários exemplos na técnica que descrevem modificações no açúcar, base e fosfato que podem ser introduzidas em moléculas de ácido nucléico com aumento significativo de sua estabilidade e eficácia de nuclease. Por exemplo, oligonucleotídeos são modificados para aumentar a estabilidade e/ou aumentar a atividade biológica pela modificação com grupos resistentes a nuclease, por exemplo, 2'-amino, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'-H modificações de base de nucleotídeo (para uma revisão veja Usman & Cedergren, TIBS. 17:34 (1992); Usman et al, Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163 (1994); Burgin et al, Biochemistry 35:14090 (1996)). Modificações de açúcar de moléculas de ácido nucléico têm sido amplamente descritas na técnica (veja Eckstein et al, Publicação Internacional PCT No. WO 92/07065; Perrault et al, Nature 344: 565-568 (1990); Pieken et al, Science 253: 314-317 (1991); Usman & Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17: 334-339 (1992); Usman et al, Publicação Internacional PCT No. WO 93/15187; Sproat, Pat. U.S. No. 5.334.711 e Beigelman et al, J. Biol. Chem. 270:25702 (1995); Beigelman et al, Publicação Internacional PCT No. WO 97/26270; Beigelman et al, Pat. U.S. No. 5.716.824; Usman et al, Pat. U.S. No. 5.627.053; Woolf et al, Publicação Internacional PCT No. WO 98/13526; Karpeisky et al, 1998, Tetrahedron Lett. 39:1131 (1998); Earnshaw & Gait, Biopolymers (Nucleic Acid Scienc es) 48:39-55 (1998); Verma & Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99134 (1998); e Burlina et al, Bioorg. Med. Chem. 5:1999-2010 (1997); todas as referências estão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades). Tais publicações descrevem métodos e estratégias gerais para determinar a localização de incorporação de modificações de açúcar, base e/ou fosfato e semelhantes em moléculas de ácido nucléico sem modular a catálise e estão incorporadas aqui por referência. Considerando tais ensinamentos, modificações similares podem ser usadas como descrito aqui para modificar as moléculas de ácido nucléico de siRNA da presente invenção contanto que a habilidade de siRNA de estimular RNAi em células não seja significativamente inibida.
[000347] A invenção apresenta moléculas de siRNA modificadas, com modificações na estrutura principal de fosfato que compreendem uma ou mais substituições de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfo- nato, fosfotriester, morfolino, amidato, carbamato, carboximetila, ace- tamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tio- formacetal e/ou alquisila. Para uma revisão de modificações do estrutura principal de oligonucleotídeos veja Hunziker & Leumann, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995), e Mesmaeker et al, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994).
[000348] Embora modificação química de ligações internucleotídeo de oligonucleotídeos com ligações de fosforotioato, ligações de fosforotioato e/ou 5'-metilfosfonato melhore a estabilidade, modificações químicas excessivas podem causar alguma toxicidade ou atividade diminuída. Portanto, quando se projeta moléculas de ácido nucléico, a quantidade dessas ligações internucleotídeo deve ser minimizada. A redução na concentração dessas ligações deve diminuir a toxicidade, resultando em eficácia aumentada e maior especificidade dessas moléculas.
[000349] Moléculas de siRNA que têm modificações químicas que mantêm ou aumentam a atividade são fornecidas. Tal ácido nucléico também é geralmente mais resistente a nucleases do que um ácido nucléico não modificado. Conseqüentemente, a atividade in vitro e/ou in vivo não deve ser significativamente diminuída. Em casos nos quais a modulação é a meta, moléculas terapêuticas de ácido nucléico liberadas exogenamente devem ser otimamente estáveis dentro da célula até que a tradução do RNA alvo tenha sido modulada o suficiente para reduzir os níveis da proteína indesejável. Esse período de tempo varia entre horas a dias dependendo do estado de doença. Melhoras na síntese química de RNA e DNA (Wincott et al, Nucleic Acids Res. 23:2677 (1995); Caruthers et al, Methods in Enzymotogy 211:2-19 (1992) (incorporados aqui por referência) expandiram a habilidade de modificar moléculas de ácido nucléico pela introdução de modificações de nucleotídeo para aumentar sua estabilidade a nuclease, como descrito acima.
[000350] Polinucleotídeos da presente invenção podem incluir um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais) nucleotídeos "G-clamp". Um nucleotídeo "G-clamp" é um análogo de citosina modificado no qual as modificações conferem ao hidrogênio a habilidade de se ligar tanto às faces Watson-Crick e Hoogsteen de uma guanina complementar dentro de um dúplex, veja, por exemplo, Lin & Matteucci, J. Am. Chem. Soc. 120:8531- 8532 (1998). Uma única substituição de análogo "G-clamp" dentro de um oligonucleotídeo pode resultar pode resultar em estabilidade térmica helicoidal substancialmente aumentada e discriminação de não pareamentos quando hibri- dizado a oligonucleotídeos complementares. A inclusão de tais nucleotídeos em polinucleotídeos da invenção resulta em afinidade e especificidade aumentadas a alvos, seqüências complementares ou filamentos molde de ácidos nucléicos. Polinucleotídeos da presente invenção também podem incluir um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais) nucleotídeos de "ácido nucléico bloqueado" LNA tal como um nucleotídeo 2',4'-C metileno biciclo (veja, por exemplo, Wengel et al, Publicação Internacional PCT No. WO 00/66604 e WO 99/14226).
[000351] A presente invenção também apresenta conjugados e/ou complexos de moléculas de siRNA da invenção. Tais conjugados e/ou complexos podem ser usados para facilitar a liberação de moléculas de siRNA em um sistema biológico, tal como uma célula. Os conjugados e complexos fornecidos pela presente invenção podem conferir atividade terapêutica por transferir compostos terapêuticos através das membranas celulares, alterando a farmacocinética e/ou modulando a localização das moléculas de ácido nucléico da invenção. A presente invenção abrange o desenho e a síntese de novos conjugados e complexos para a liberação de moléculas, incluindo, mas não limitadas a pequenas moléculas, lipídios, fosfolipídios, nucleosídeos, nucleotí- deos, ácidos nucléicos, anticorpos, toxinas, polímeros negativamente carregados e outros polímeros, por exemplo, proteínas, peptídeos, hormônios, carboidratos, polietileno glicóis ou poliaminas, através das membranas celulares. Em geral, os transportadores descritos são projetados para serem usados tanto individualmente quanto como parte de um sistema de múltiplos componentes, com ou sem ligantes degradáveis. Espera-se que esses compostos melhorem a liberação e/ou localização de moléculas de ácido nucléico da invenção em vários tipos de células que se originam de diferentes tecidos, na presença ou ausência de soro (veja Sullenger & Cech, Pat. U.S. No. 5.854.038). Conjugados das moléculas descritas aqui podem ser ligadas a moléculas biologicamente ativas através de ligantes que são biodegradáveis, tal como moléculas ligantes de ácido nucléico biodegradáveis.
[000352] Polinucleotídeos terapêuticos (por exemplo, moléculas de siRNA) liberadas exogenamente são otimamente estáveis dentro das células até que a transcrição reversa do RNA tenha sido modulada o suficiente para reduzir os níveis do transcrito de RNA. As moléculas de ácido nucléico são resistentes às nucleases a fim de funcionar como agentes terapêuticos intracelulares eficazes. As melhorias na síntese química de moléculas de ácido nucléico descritas na presente invenção e na técnica expandiram a habilidade de modificar moléculas de ácido nucléico pela introdução de modificações de nucleotídeos para aumentar sua estabilidade a nuclease como descrito acima.
[000353] A presente invenção também proporciona moléculas de siRNA que têm modificações químicas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática de proteínas envolvidas em RNAi. Tais ácidos nucléicos também são mais resistentes às nucleases do que ácidos nucléicos não modificados. Assim, a atividade in vitro e/ou in vivo não deve estar significativamente diminuída.
[000354] O uso das moléculas baseadas no polinucleotídeo da invenção levará a um tratamento melhor da progressão de doença por fornecer a possibilidade de terapias de combinação (por exemplo, múltiplas moléculas de siRNA direcionadas para genes diferentes; moléculas de ácido nucléico acopladas com moduladores de pequenas moléculas conhecidos; ou tratamento intermitente com combinações de moléculas, incluindo motivos diferentes e/ou outras moléculas químicas ou biológicas). O tratamento de indivíduos com moléculas de siRNA também pode incluir combinações de tipos diferentes de moléculas de ácido nucléico, tal como moléculas enzimáticas de ácido nucléico (ribozimas), alozimas, anti-sentido, 2,5-A oligoadeniladas, "decoys", aptâmeros, etc.
[000355] Em outro aspecto, uma molécula de siRNA da invenção pode compreender uma ou mais estruturas 5'- e/ou 3'-cap, por exemplo apenas sobre a filamento de siRNA senso, filamento de siRNA anti-sentido ou em ambas as filamentos de siRNA.
[000356] Por "estrutura cap" entende-se modificações químicas, que foram incorporadas em qualquer terminação do oligonucleotídeo (veja, por exemplo, Adamic et al, Pat. U.S. No. 5.998.203, incorporada aqui por referência). Essas modificações terminais protegem a molécula de ácido nucléico da degradação por exonuclease e pode auxiliar na liberação e/ou localização dentro de uma célula. O cap pode estar presen te na terminação 5' (5'-cap) ou na terminação 3' (3'-cap) ou pode estar presente em ambas as terminações. Em exemplos não limitantes: 5'- cap é selecionado a partir do grupo que compreende um resíduo abá- sico invertido (porção); 4',5'-metileno nucleotídeo; 1-(beta-D- eritrofuranosil) nucleotídeo, 4'-tio nucleotídeo; nucleotídeo carbocíclico; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeos; alfa-nucleotídeos; nucleotídeo com base modificada; ligação de fosforoditioato; treo- pentofuranosil nucleotídeo; 3',4'-sec nucleotídeo acíclico; 3,4- diidroxibutil nucleotídeo acíclico; 3,5-diidroxipentil nucleotídeo acíclico, 3'-3'-porção de nucleotídeo invertida; 3'-3'-porção abásica invertida; 3'- 2'-porção de nucleotídeo invertida; 3'-2'-porção abásica invertida; fosfato de 1,4-butanodiol; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; fosfato de amino- exila; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato; ou porção de metilfos- fonato ligante ou não ligante.
[000357] O 3'-cap pode ser selecionado a partir do grupo que compreende 4',5'-metileno nucleotídeo; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleotídeo; 4'-tio nucleotídeo, nucleotídeo carbocíclico; 5'-amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propil fosfato; 3-aminopropil fosfato; 6-aminoexil fosfato; 1,2-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeo; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo com base modificada; fosforoditioato; treo-pentofuranosil nucleotídeo; 3',4'-seco nucleotídeo acíclico; 3,4-diidroxibutil nucleotídeo; 3,5-diidroxipentil nucleotídeo, 5'-5'-porção de nucleotídeo invertida; 5'-5'- porção abásica invertida; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; 5'-fosforamidato ligante e/ou não ligante, fosforotioato e/ou fosforoditioato, metilfosfonato ligante ou não ligante e porções 5'- mercapto (para maiores detalhes veja Beaucage & Iyer, Tetrahedron 49:1925 (1993); incorporado aqui por referência).
[000358] Várias modificações à estrutura de ácido nucléico de siRNA podem ser feitas para aumentar a utilidade dessas moléculas. Tais modificações aumentarão a vida útil, meia-vida in vitro, estabilidade e facilidade de introdução de tais oligonucleotídeos no sítio alvo, por exemplo, para aumentar a penetração de membranas celulares e conferir habilidade de reconhecer e se ligar a células alvo.
[000359] A tecnologia anti-sentido pode ser usada para controlar a expressão gênica através de DNA ou RNA anti-sentido ou através da formação de tripla hélice. Técnicas anti-sentido são discutidas, por exemplo, em Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). A formação de tripla hélice é discutida, por exemplo, em Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); e Dervan et al, Science 257:1300 (1991). Os métodos são baseados na ligação de um polinucleotídeo a um DNA ou RNA complementar.
[000360] Por exemplo, a porção codificante 5' de um polinucleotídeo que codifica NgR1 pode ser usada para desenhar um oligonucleotídeo de RNA anti-sentido de cerca de 10 a 40 pares de bases de extensão. Um oligonucleotídeo de DNA é designado para ser complementar a uma região do gene envolvido na transcrição impedindo dessa forma a transcrição e a produção da proteína-alvo. O oligonucleotídeo de RNA anti-sentido hibridiza com o mRNA in vivo e bloqueia a tradução da molécula de mRNA no polipeptídeo alvo.
[000361] Em uma modalidade, ácidos nucléicos anti-sentido específicos para o gene de NgR1 são produzidos intracelularmente pela transcrição a partir de uma seqüência exógena. Por exemplo, um vetor, ou uma porção deste, é transcrito produzindo um ácido nucléico anti-sentido (RNA). Tal vetor pode permanecer epissomal ou se tornar integrado ao cromossomo, contanto que ele possa ser transcrito para produzir o RNA anti-sentido desejado. Tais vetores podem ser construídos por métodos de tecnologia de DNA recombinante usuais na técni- ca. Vetores podem ser plasmídeo, viral ou outros conhecidos na técnica, usados para replicação e expressão em células de vertebrados. A expressão da molécula anti-sentido pode ser por qualquer promotor conhecido na técnica para atuar em células de vertebrados, preferivelmente células humanas, tais como aquelas descritas aqui em outro lugar.
[000362] Complementaridade absoluta de uma molécula anti-sentido, apesar de preferida, não é necessária. Uma seqüência complementar a pelo menos uma porção de um RNA que codifica NgR1, significa uma seqüência que tem complementaridade suficiente para ser capaz de hibridizar com o RNA, formando um dúplex estável; ou a formação de tríplex pode ser testada. A habilidade de hibridizar dependerá do grau de complementaridade e da extensão do ácido nucléico anti- sentido. Geralmente, quanto maior o ácido nucléico hibridizante, mais pareamentos de base errados ele pode conter e ainda formar um dúplex estável (ou tríplex se for o caso). O versado na técnica pode determinar um grau tolerável de pareamentos errados pelo uso de procedimentos padronizados para determinar o ponto de fusão do com-plexo hibridizado.
[000363] Oligonucleotídeos que são complementares à extremidade 5' de um RNA mensageiro, por exemplo, à seqüência 5' não traduzida até, e incluindo, o códon de início AUG, deveriam funcionar de forma mais eficaz na inibição da tradução. Entretanto, seqüências complementares às seqüências 3' não traduzidas de mRNAs também se mostraram eficazes na inibição da tradução de mRNAs. Veja, Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994). Assim, oligonucleotídeos complementares a qualquer uma das regiões 5' ou 3' não-traduzidas, não-codificantes poderiam ser usados em uma abordagem anti-sentido para inibir a tradução de NgR1. Oligonucleotídeos complementares à região 5' não- traduzida do mRNA devem incluir o complemento do códon de início AUG. Oligonucleotídeos anti-sentido complementares às regiões codi-ficantes de mRNA são inibidores menos eficazes da tradução mas poderiam ser usados de acordo com a invenção. Ácidos nucléicos anti- sentido devem ter pelo menos seis nucleotídeos de extensão e são preferivelmente oligonucleotídeos que variam de cerca de 6 a cerca de 50 nucleotídeos de extensão. Em aspectos específicos, o oligonucleotídeo tem pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 17 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos ou pelo menos 50 nucleotídeos.
[000364] Polinucleotídeos para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui, incluindo os aptâmeros descritos abaixo, podem ser de DNA ou RNA ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destes, de filamento simples ou filamento duplo. O oligonucleotídeo pode ser modificação na porção de base, porção de açúcar ou estrutura principal de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, hibridização, etc. O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos anexos tais como peptídeos (por exemplo, para atingir receptores de células hospedeiras in vivo), ou agentes que facilitam o transporte através da membrana celular (veja, por exemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:6553-6556 (1989); Lemaitre et al, Proc. Natl. Acad. Sci 84:648-652 (1987)); publicação PCT No. WO88/09810, publicada em 15 de dezembro de 1988) ou da barreira hemato-encefálica (veja, por exemplo, publicação PCT No. WO89/10134, publicada em 25 de abril de, 1988), agentes de clivagem ativados pela hibridização, (veja, por exemplo, Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)) ou agentes intercalantes. (Veja, por exemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539- 549(1988)). Para essa finalidade, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, um peptídeo, agente de reticula- ção ativado por hibridização, agente de transporte, agente de clivagem ativado por hibridização, etc.
[000365] Um oligonucleotídeo anti-sentido para uso nos métodos te- rapêuticos descritos aqui pode compreender pelo menos uma porção de base modificada que é selecionada a partir do grupo que inclui, mas não é limitado a, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5- iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosine, 5-(carboxiidroxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometi- luracil, diidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N-6- isopenteni- ladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2- metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N-6- adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil- 2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5- metoxiuracil, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5- oxiacético (v), vibutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5- metil-2-tiouracil, 2- tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilester de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracil, 3(3-amino-3-N2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina.
[000366] Um oligonucleotídeo anti-sentido para uso nos métodos te-rapêuticos descritos aqui também pode compreender pelo menos uma porção de açúcar modificada que é selecionada a partir do grupo que inclui, mas não é limitado a arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose.
[000367] Ainda em outra modalidade, um oligonucleotídeo anti- sentido para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui compreende pelo menos um estrutura principal de fosfato modificado selecionado a partir do grupo que inclui, mas não é limitado a, um fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, um fosforamidato, um fosforodi- amidato, um metilfosfonato, um alquil fosfotriester e um formacetal ou análogos desses.
[000368] Ainda em outra modalidade, um oligonucleotídeo anti- sentido para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui é um oligonucleotídeo a-anomérico. Um oligonucleotídeo a-anomérico forma hí- bridos de filamento dupla específicos com RNA complementar nos quais, ao contrário da situação comum, as filamentos se encontram paralelas umas as outras (Gautier et al., Nucl. Acids Res. 75:6625- 6641(1987)). O oligonucleotídeo é um 2'-0-metilrribonucleotídeo (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148(1987)), ou um análogo quimérico de RNA-DNA (Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330(1987)).
[000369] Polinucleotídeos da invenção, incluindo aptâmeros podem ser sintetizados por métodos usuais conhecidos na técnica, por exemplo, pelo uso de um sintetizador automático de DNA (tal como são comercialmente disponibilizados por Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser sintetizados pelo método de Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), oligonucleotídeos de metilfosfonato podem ser preparados pelo uso de suportes de polímero de vidro com poro controlado (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:7448-7451(1988)), etc.
[000370] Composições de polinucleotídeo para uso nos métodos te-rapêuticos descritos aqui incluem ainda RNA catalítico ou uma ribozi- ma (veja, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em 4 de outubro de 1990; Sarver et al., Science 247:12221225 (1990). O uso de ribozimas em forma de "cabeça de martelo" é preferido. Ribozimas em cabeça de martelo clivam mRNAs em localizações ditadas pelas regiões flanqueadoras que formam pares de bases complementares com o mRNA alvo. O único requisito é que o mRNA alvo tenha a seguinte seqüência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e a produção de ribozimas em cabeça de martelo são bem- conhecidas na técnica e estão descritas mais completamente em Haseloff & Gerlach, Nature 334:585-591 (1988). Preferivelmente, a ri- bozima é manipulada tal que o sítio de reconhecimento de clivagem está localizado próximo da terminação 5' do mRNA; isto é, para aumentar a eficiência e minimizar o acúmulo intracelular de transcritos não funcionais de mRNA.
[000371] Como na abordagem anti-sentido, ribozimas para uso nos métodos de diagnóstico e terapêuticos descritos aqui podem ser compostas por oligonucleotídeos modificados (por exemplo, para melhorar a estabilidade, direcionamento, etc.) e podem ser liberadas a células que expressam NgR1 in vivo. Constructos de DNA que codificam a ribozima podem ser introduzidos na célula da mesma maneira descrita acima para a introdução de DNA anti-sentido codificante. Um método preferido de liberação envolve usar um constructo de DNA "codificante" da ribozima sob o controle de um promotor constitutivo forte, tal como, por exemplo, promotor de pol III ou pol II, tal que as células transfectadas produzirão quantidades suficientes da ribozima para destruir mensagens de NgR1 endógenas e inibir a tradução. Como as ribozimas, ao contrário das moléculas anti-sentido, são catalíticas, é necessária uma menor concentração para eficácia.
Aptâmeros
[000372] Em outra modalidade, o antagonista de NgR1 para uso nos métodos da presente invenção é um aptâmero. Um aptâmero pode ser um nucleotídeo ou polipeptídeo que tem uma seqüência única, tem a propriedade de se ligar especificamente a um alvo desejado (por exemplo, um polipeptídeo) e é um ligante específico de um dado alvo. Aptâmeros de nucleotídeo da invenção incluem moléculas de DNA de filamento dupla e RNA de filamento simples que se ligam a NgR1.
[000373] Aptâmeros de ácido nucléico são selecionados usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através do processo Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SE- LEX). SELEX é um método para evolução in vitro de moléculas de ácido nucléico com ligação altamente específica a moléculas alvo, como descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.475.096, 5.580.737, 5.567.588, 5.707.796, 5.763.177, 6.011.577 e 6.699.843, incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Outro método de rastreamento para identificar aptâmeros é descrito na Pat. U.S. No. 5.270.163 (também incorporada por referência). O processo SELEX é baseado na capacidade de ácidos nucléicos para formar uma variedade de estruturas bi- e tridimensionais, assim como na versatilidade química disponível dentro dos monômeros de nucleotídeo para agir como ligantes (formar pares de ligação específicos) sem virtualmente nenhum composto químico, seja monomérico ou polimérico, incluindo outras moléculas de ácido nucléico e polipeptídeos. Moléculas de qualquer tamanho ou composição podem servir como alvos.
[000374] O método SELEX envolve a seleção a partir de uma mistura de oligonucleotídeos candidatos e repetições em etapas de ligação, separação e amplificação, usando o mesmo esquema geral de seleção, para se obter a afinidade e a seletividade de ligação desejadas. Partindo de uma mistura de ácidos nucléicos, preferivelmente compreendendo um segmento de uma seqüência randomizada, o método SELEX inclui as etapas de colocar a mistura em contato com o alvo sob condições favoráveis para ligação; separar os ácidos nucléicos não-ligados daqueles ácidos nucléicos que se ligaram especificamente às moléculas alvo; dissociar ao complexos de ácido nucléico-alvo; amplificar ao ácidos nucléicos dissociados dos complexos de ácido nu- cléico-alvo para se obter uma mistura enriquecida de ligantes de ácidos nucléicos. As etapas de ligação, separação, dissociação e amplifi-cação são repetidas por tantos ciclos quanto desejado para gerar ligantes de ácidos nucléicos altamente específicos com alta afinidade à molécula alvo.
[000375] Aptâmeros de nucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como ferramentas de diagnóstico ou como inibidores específicos para cortar as vias de sinalização e transporte intracelular (James (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1:540-546). As alta afinidade e especifi- cidade de aptâmeros de nucleotídeos fazem deles bons candidatos para a descoberta de fármacos. Por exemplo, antagonistas de aptâmero para a toxina ricina foram isolados e têm valores de IC50 na faixa de nanomolar (Hesselberth JR et al. (2000) J Biol Chem 275:4937-4942). Aptâmeros de nucleotídeos podem ser usados também contra doença infecciosa, malignidade e proteínas de superfície viral para reduzir a infectividade celular.
[000376] Aptâmeros de nucleotídeos para uso nos métodos da presente invenção podem ser modificados como descrito aqui para outros polinucleotídeos (por exemplo, pela modificação do estrutura principal ou de bases ou conjugado a peptídeos).
[000377] Usando a estrutura da proteína de NgR1, o rastreamento de aptâmeros que atuam sobre NgR1 usando o processo SELEX pode permitir a identificação de aptâmeros que inibem processos mediados por NgR1 (por exemplo, inibição da regeneração axonal mediada por NgR1).
[000378] Aptâmeros de polipeptídeos para uso nos métodos da presente invenção são peptídeos aleatórios selecionados por sua habilidade de se ligar e dessa maneira bloquear a ação de NgR1. Aptâmeros de polipeptídeos podem incluir um pequeno domínio de peptídeo variável acoplado a ambas as extremidades de uma estrutura de proteína. Essa limitação estrutural dupla aumenta grandemente a afinidade de ligação do aptâmero de peptídeo em níveis comparáveis aos de um anticorpo (faixa de nanomolar). Veja, por exemplo, Hoppe-Seyler F et al. (2000) J Mol Med 78(8):426-430. A extensão do peptídeo variável curto é de tipicamente cerca de 10 a 20 aminoácidos e a estrutura pode ser qualquer proteína que tenha boas propriedades de solubilidade e compacidade. Um exemplo não limitante de uma estrutura de proteína é a proteína bacteriana Tioredoxin-A. Veja, por exemplo, Cohen BA et al. (1998) PNAS 95(24): 14272- 14277.
[000379] Aptâmeros de polipeptídeo são peptídeos ou pequenos po-lipeptídeos que agem como inibidores dominantes da função da proteína. Aptâmeros de peptídeo se ligam especificamente a proteínas-alvo, bloqueando suas habilidades funcionais (Kolonin et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14.266-14.271). Aptâmeros de peptídeo que se ligam com alta afinidade e especificidade a uma proteína-alvo podem ser isolados por uma variedade de técnicas conhecidas. Aptâmeros de peptídeo podem ser isolados a partir de bibliotecas de peptídeo aleatórias pelo rastreamento de duplo-híbrido em levedura (Xu, C.W., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci 94:12.473-12.478) ou por apresentação de ribossomo (Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937 4942). Eles também podem ser isolados de bibliotecas de fagos (Hoo- genboom, H.R., et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20) ou de bibliotecas de peptídeo geradas quimicamente. Adicionalmente, aptâmeros de polipeptídeo podem ser selecionados usando a seleção de Aptâmeros de Peptídeo Regulados por Ligante (Ligand Regulated Peptide Aptamers (LiRPAs)). Veja, por exemplo, Binkowski BF et al., (2005) Chem & Biol 12(7): 847-855, incorporado aqui por referência. Embora a dificuldade dos meios pelos quais os aptâmeros de peptídeo são sintetizados torne seu uso mais complexo do que os aptâmeros de polinucleotídeo, eles têm diversidade química ilimitada. Aptâmeros de polinucleotídeo são limitados porque eles utilizam apenas as quatro bases de nucleotídeo enquanto que aptâmeros de peptídeo podem ter um repertório muito maior (isto é, 20 aminoácidos).
[000380] Aptâmeros de peptídeo usados nos métodos da presente invenção podem ser modificados (por exemplo, conjugados a polímeros ou fundidos a proteínas) conforme descrito aqui para outros polipeptídeos.
Composições
[000381] Em algumas modalidades, a invenção proporciona compo- sições que compreendem um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-5, 26-27, 29-37 e 41-45.
[000382] Em algumas modalidades, a invenção proporciona composições que compreendem um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de ligação de antígeno deste, ou um polipeptídeo solúvel ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente invenção.
[000383] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma com-posição que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.
[000384] Em algumas modalidades, a invenção proporciona composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção e um agente antiinflamatório.
[000385] Em algumas modalidades, a presente invenção pode conter veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis que compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para liberação no local de ação. Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Além disso, suspensões dos compostos ativos como suspensões injetáveis oleosas apropriadas podem ser administradas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, por exemplo, oleato de eti- la ou triglicerídeos. Suspensões aquosas injetáveis podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e dextran. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes. Liposso- mas também podem ser usados para encapsular as moléculas dessa invenção para liberação dentro da célula. Exemplares de "veículos farmaceuticamente aceitáveis" são todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis, água, salina, salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, assim como combinações destes. Em algumas modalidades, a composição compreende agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como mani- tol, sorbitol ou cloreto de sódio. Em algumas modalidades, as composições compreendem substâncias farmaceuticamente aceitáveis tais como umectantes ou pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou a eficácia dos anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno, receptores solúveis ou proteínas de fusão de Nogo da invenção.
[000386] As composições da invenção podem estar em uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis ou para infusão), dispersões ou suspensões. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e aplicação terapêutica. Em uma modalidade, as composições estão na forma de soluções injetáveis ou para infusão, tais como composições similares àquelas usadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos.
[000387] A composição pode ser formulada como uma solução, mi- croemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporar um anticorpo anti-receptor Nogo- 1 na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes ne- cessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração da mesma. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho da partícula requerido no caso de uma dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[000388] Em algumas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protegerá o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microen- capsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal como, acetato de etileno vinil, polianidridos, ácido poliglicó- lico, colágeno, poli-ortoésteres e ácido polilático. Vários métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, See e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1978).
[000389] Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Em algumas modalidades, um anticorpo do receptor Nogo-1 ou um fragmento de ligação de antígeno deste, ou polipeptídeos solúveis ou proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção são co-formulados com e/ou co-administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, por exemplo, um agente antiinflamatório. Em uma modalidade, o agente antiinflamatório é um agente antiinflamatório não esteroidal. Em outra modalidade, o agente antiinflamatório é agente antiinflamatório esteroidal. Em uma modalidade particular, o agente antiinflamatório é metilprednisolona.
[000390] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para o uso de um antagonista do receptor Nogo em combinação com um agente antiinflamatório não esteroidal (NSAID), ésteres de pró- fármaco ou sais farmaceuticamente aceitáveis desses. Exemplos de NSAIDs que são bem-conhecidos na técnica incluem derivados do ácido propiônico (por exemplo, alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofe- no, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozin, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofenico e tioxaprofeno), derivados do ácido acético (por exemplo, indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanaco, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco, furofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco, su- lindaco, tiopinaco, tolmetina, zidometacina e zomepiraco), derivados do ácido fenâmico (por exemplo, ácido flufenâmico, ácido meclofenâ- mico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcarboxílico (por exemplo, diflunisal e flufenisal), oxicams (por exemplo, isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxicam), salicilatos (por exemplo, ácido acetil salicílico e sulfasalazina) e as pi- razolonas (por exemplo, apazona, bezpiperilona, feprazona, mofebuta- zona, oxifenbutazona e fenilbutazona). NSAIDs estruturalmente relaci-onados que têm propriedades analgésicas e antiinflamatórias similares aos NSAIDs também são pretendidos para ser englobados por esse grupo.
[000391] Em outra modalidade, a presente invenção é direcionada para o uso de um antagonista do receptor Nogo em combinação com qualquer um ou mais agentes antiinflamatórios não esteroidais tais como corticosteróides, ésteres de pró-fármaco ou sais farmaceutica- mente aceitáveis destes. Exemplos não limitantes de tais agentes este- roidais incluem hidrocortisona e compostos derivados de hidrocortiso- na, tais como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametaso- na, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corti- costerona, cortisona, cortivazol, deflazacona, desonida, desoximera- sona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxo- lona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, flucinolona acetonida, fluocinonida, fiuorocinolona acetonida, fluocortin butila, fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednidene, fluprednisolona, flurandenolide, formocortal, halcino- nida, halometasona, acetato de halopredona, hidroc'ortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, hidrocortisona 21- succinato de sódio, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilpredniso- lona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, predniso- lona, prednisolona 21-diedriaminoacetato, prednisolona fosfato de sódio, prednisolona succinato de sódio, prednisolona 21-m-sulfobenzoato de sódio, prednisolona 21-estearoglicolato de sódio, tebutato de prednisolona, prednisolona 21 -trimetilacetato, prednisona, prednival, pred- nilideno, 21- dietilaminoacetato de prednilideno, tixocortol, triamcinolo- na, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida e triamcinolona hexacetonida. Corticosteróides estruturalmente relacionados que têm propriedades analgésicas e antiinflamatórias similares também são pretendidos serem englobados por esse grupo. Em uma modalidade particular, o antagonista do receptor Nogo é usado em combinação com metilprednisolona.
[000392] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "uma quantidade profila- ticamente eficaz" de um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo(s) ou proteína de fusão da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo para o receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste, polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo pode variar de acordo com fatores tais como estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, como uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[000393] Regimes de dosagens podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, uma massa única pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade da forma de dosagem unitária como usado aqui refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos mamíferos a ser tratados, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de dosagem unitária da invenção são ditadas e dependem diretamente de (a) características únicas do anticorpo, fragmento de ligação de antígeno e polipeptídeo solúvel do receptor 1 ou proteína de fusão do receptor Nogo e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser obtido, e (b) as limitações inerentes na técnica de combinar tal anticorpo, fragmento de ligação de antígeno e polipeptídeo solúvel do receptor 1 ou proteína de fusão do receptor Nogo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. Em algumas modalidades, uma faixa de dose terapeuticamente eficaz para anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno destes é de 0,2-4 mg/kg por dia. Em algumas modalidades, uma faixa de dose te-rapeuticamente eficaz para anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno destes é de 0,2 mg/kg por dia.
[000394] Nos métodos da invenção, os antagonistas de NgR1 são geralmente administrados diretamente no sistema nervoso central, in- tracerebroventricularmente ou intratecalmente, por exemplo, em uma lesão crônica de MS. Composições para administração de acordo com os métodos da invenção podem ser formuladas tal que uma dosagem de 0,001-10 mg/kg de peso corporal por dia do antagonista de NgR1 seja administrada. Em algumas modalidades da invenção, a dosagem é de 0,01-1,0 mg/ kg de peso corporal por dia. Em algumas modalidades, a dosagem é de 0,001-0,5 mg/ kg de peso corporal por dia.
[000395] Para o tratamento com um antagonista de NgR1 da invenção, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais comumente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, l mg/kg, 2 mg/kg, etc.) do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg, preferivelmente pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas acima também são pretendidas para estar dentro do escopo da invenção. Indivíduos podem ser tratados com tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro esquema determinado por análise empírica. Um tratamento exemplar envolve a administração em múltiplas dosagens durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Regimes de tratamento exemplares adicionais envolvem a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 ou 6 meses. Esquemas de dosagem exemplares incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente.
[000396] Em alguns métodos, dois ou mais antagonistas de NgR1 são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada antagonista administrado está dentro das faixas indicadas. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições usadas nos métodos da invenção. Por exemplo, um antagonista de NgR1 pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente antiinflamatório, por exemplo, metilprednisolona.
[000397] A invenção abrange qualquer método de liberação adequado para um antagonista de NgR1 a um tecido alvo selecionado, incluindo injeção em bolo de uma solução aquosa ou implante de um sistema de liberação controlada. O uso de um sistema de liberação controlada reduz a necessidade de injeções repetidas.
[000398] Os antagonistas de NgR1 usados nos métodos da invenção podem ser infundidos diretamente no cérebro. Vários implantes para infusão cerebral direta de compostos no cérebro são conhecidos e são eficazes na liberação de compostos terapêuticos a pacientes humanos que sofrem de distúrbios neurológicas. Esses incluem a infusão crônica no cérebro usando uma bomba, estereotaticamente implantada, cate- teres intersticiais temporários, implantes de cateter intracraniano permanente e implantes biodegradáveis implantados cirurgicamente. Veja, por exemplo, Gill et al, supra; Scharfen et al, "High Activity Io- dine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-91 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-82 (1999); capítulo 66, páginas 577-580, Bellezza et al, "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," em Gildenberg et al, Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); e Brem et al, "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. NeuroOncology 26:111-23 (1995).
[000399] As composições também podem compreender um antagonista de NgR1 da invenção disperso em um material transportador bio- compatível que funciona como um sistema de liberação ou suporte adequado para os compostos. Exemplos adequados de veículos de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímero na forma de objetos moldados tais como supositórios ou cápsulas. Matrizes de liberação sustentada implantáveis ou microcapsulares incluem polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.319; EP 58 481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), etileno vinil acetato (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) ou ácido poli-D-(-)-3hidroxibutirico (EP 133.988).
[000400] Em algumas modalidades, um antagonista de NgR1 da invenção é administrado a um paciente por infusão direta em uma região apropriada do cérebro. Veja, por exemplo, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003). Técnicas alternativas estão disponíveis e podem ser aplicadas para administrar um antagonista de NgR1 de acordo com a invenção. Por exemplo, a colocação estereotáxica de um cateter ou implante pode ser conseguida usando a unidade de Riechert-Mundinger e a unidade localizadora multi funcional ZD (Za- morano-Dujovny). Uma tomografia computadorizada intensificada por contraste (CT), injetando 120 ml de omnipaque, 350 mg/ml de iodo, com corte de 2 mm de espessura podem permitir o planejamento do tratamento multiplanar tridimensional (STP, Fischer, Freiburg, Alemanha). Esse equipamento permite o planejamento com base nos estudos de imagem de ressonância magnética, unindo as informações de CT e MRI para a confirmação clara do alvo.
[000401] O sistema estereotáxico de Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para uso com um scanner GE CT (General Electric Company, Milwaukee, WI) assim como o sistema estereotáxico de Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) podem ser usados para esse propósito. Assim, na manhã do implante, o aro de base circular da estrutura estereotáxica BRW pode ser fixado ao crânio do paciente. Cortes seriados de CT podem ser obtidos em intervalos de 3 mm por toda a região (tecido alvo) com uma placa de localização com hastes de grafite fixada na base. Um programa de planejamento de tratamento computadorizado pode ser executado em um computador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) usando as coordenadas de CT das imagens da haste de grafite para mapear entre o espaço de CT e o espaço de BRW.
[000402] Usos dos Anticorpos, Fragmentos de Ligação de Antígeno, Receptores Solúveis, Proteínas de Fusão, Polinucleotídeos e Composições
[000403] Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para inibir a atividade do receptor Nogo-1 pela administração de anticorpos anti-receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de antigeno de tais anticorpos, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1 ou proteínas de fusão que compreendem tais polipeptídeos a um mamífero que necessite dos mesmos.
[000404] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapa de colocar o receptor Nogo-1 em conato com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dessa invenção. Em algumas modalidades o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp.
[000405] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar o neurônio em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dessa invenção. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para diminuir a inibição do crescimento ou brotamento de neuritos em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar o neurônio em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dessa invenção. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do CNS. Em alguns desses métodos, o crescimento ou brotamento ou de neurito é crescimento axonal.
[000406] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para promover a sobrevivência de um neurônio em um mamífero, cujo neurônio está em risco de morrer, compreendendo (a) fornecer uma célula hospedeira cultivada que expressa (i) um anticorpo antireceptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste; ou (ii) um polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1; e (b) introduzir a célula hospedeira no mamífero no local, ou próximo do local, do neurônio. Al- mudena Ramon-Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F Santos-Benito & Jesus Avila (2000) Functional recovery of paralegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells. Neuron 25, 425-435.
[000407] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de terapia gênica de promover a sobrevivência de um neurônio em risco de morrer, cujo neurônio está em um mamífero, compreendendo administrar no local, ou próximo do local, do neurônio um vetor viral que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste; ou (b) um polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação de antígeno ou polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel é expresso a partir da seqüência de nucleotídeos no mamífero em uma quantidade suficiente para promover a sobrevivência do neurônio. Vetores virais e métodos úteis para essas modalidades estão descritos em, por exemplo, Noel et al, Human Gene Therapy, 13:1483-93 (2002).
[000408] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapa de colocar o ligante em contato com o polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção.
[000409] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para modular uma atividade de um ligante do receptor Nogo-1, compreendendo a etapa de colocar o ligante do receptor Nogo- em contato com um polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção.
[000410] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar um ligante do receptor Nogo-1 em contato com um polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 dessa invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para diminuir a inibição do crescimento ou brotamento de neuritos em um neurônio, compreendendo a etapa de colocar um ligante do receptor Nogo-1 em contato com o polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou a proteína de fusão do receptor Nogo-1 dessa invenção. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do CNS. Em algumas modalidades o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp. Em algumas modalidades, o crescimento ou brotamento de neurito é crescimento axonal.
[000411] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para promover o crescimento de neuritos que compreende colocar um neurônio em contato com um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou uma composição da invenção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo, polinucleotídeo ou composição inibe a inibição do crescimento de neurito. Em algumas modalidades, o neurônio é de um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[000412] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para inibir a tradução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1, compreendendo colocar um neurônio em contato com uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou uma composição da invenção. Em algumas modalidades, o neurônio é de um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[000413] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para tratar uma doença, distúrbio ou lesão do sistema nervoso central (CNS) em um mamífero, que compreende administrar a um mamífero que precisa de tratamento uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou uma composição da presente inven- ção. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou lesão é esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, lesões traumáticas do cérebro, lesão da medula espinhal, neurite óptica, glaucoma, perda de audição e leucodistrofia adrenal.
[000414] Qualquer um dos tipos de anticorpos ou receptores descritos aqui pode ser usado terapeuticamente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um paciente humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste é administrado a um mamífero não-humano que expressa um receptor No- go-1 com o qual o anticorpo faz reação cruzada (por exemplo, um primata, um macaco cinomolgus ou rhesus) com propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos dessa invenção.
[000415] Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste, ou polipeptídeo solúvel ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 é usada para tratar uma lesão de medula espinhal para facilitar o crescimento neuronal por todo o local lesado.
[000416] Os anticorpos anti-receptor Nogo-1, ou fragmentos de ligação de antígeno destes, ou polipeptídeos solúveis ou proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da presente invenção podem ser fornecidos sozinhos ou em combinação, ou em combinação seqüencial com outros agentes que modulam um processo patológico em particular. Por exemplo, agentes antiinflamatórios podem ser co-administrados após acidente vascular cerebral como um meio para bloquear o dano neuronal adicional e inibição de regeneração axonal. Como usado aqui, os anticorpos do receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de antígeno destes, polipeptídeos solúveis ou proteínas de fusão do receptor No- go-1 são ditos serem administrados em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais quando os dois são administrados simultaneamente, consecutivamente ou independentemente.
[000417] Os anticorpos de receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de antígeno destes, polipeptídeos solúveis de receptor Nogo-1 ou proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da presente invenção podem ser administrados pelas vias parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, por inalação ou bucal. Por exemplo, um agente pode ser administrado localmente em um local de lesão através de microinfusão. Locais típicos incluem, mas não são limitados a áreas danificadas da medula espinhal resultando de lesão. A dosagem administrada será dependente da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se houver, freqüência de tratamento e natureza do efeito desejado.
[000418] Os compostos dessa invenção podem ser utilizados in vivo, comumente em mamíferos, tais como humanos, ovelhas, cavalos, gado, porcos, cães, gatos, ratos e camundongos ou in vitro.
Vetores da Invenção
[000419] Em algumas modalidades, a invenção propociona moléculas de DNA recombinante (rDNA) que contêm uma seqüência codificante. Como usado aqui, uma molécula de rDNA é uma molécula de DNA que foi submetida a manipulação molecular. Métodos para gerar moléculas de rDNA são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, veja Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Em algumas moléculas de rDNA, uma seqüência codificante de DNA é operativamente ligada a seqüências de controle de expressão e seqüências de vetores.
[000420] Em algumas modalidades, a invenção proporciona vetores que compreendem ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos da invenção. A escolha do vetor e das seqüências de controle de expressão às quais os ácidos nucléicos dessa invenção são operativamente ligados depende diretamente, como é bem-conhecido na técnica, das propriedades funcionais desejadas (por exemplo, expressão de proteína e a célula hospedeira a ser transformada). Um vetor da presente invenção pode ser capaz pelo menos de direcionar a replicação ou inserção no cromossomo hospedeiro e, preferivelmente, também a expressão, do gene estrutural incluído na molécula de rDNA.
[000421] Elementos de controle de expressão que são usados para regular a expressão de uma seqüência codificante de proteína operativamente ligada são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, promotores induzíveis, promotores constitutivos, sinais de secreção e outros elementos reguladores. Preferivelmente, o promotor induzível é facilmente controlado, tal como sendo responsivo a um nutriente no meio da célula hospedeira.
[000422] Em uma modalidade, o vetor que contém uma molécula de ácido nucléico codificante incluirá um replicon procariótico, isto é, uma seqüência de DNA que tem a habilidade de direcionar a replicação autônoma e a manutenção da molécula de DNA recombinante extra- cromossomicamente em uma célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com ele. Tais replicons são bem-conhecidos na técnica. Além disso, vetores que incluem um replicon procariótico também podem incluir um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecionável tal como resistência a fárma- co. Genes típicos de resistência bacteriana a fármacos são aqueles que conferem resistência a ampicilina ou tetraciclina.
[000423] Vetores que incluem um replicon procariótico podem incluir ainda um promotor procariótico ou de bacteriófago capaz de direcionar a expressão (transcrição e tradução) das seqüências gênicas codificantes em uma célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli . Um promotor é um elemento de controle de expressão formado por uma seqüência de DNA que permite a ligação da RNA polimerase e a ocorrência de transcrição. Seqüências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos são tipicamente fornecidas em vetores de plas- mídeo que contêm os sítios de restrição convenientes para inserção de um segmento de DNA da presente invenção. Exemplos de tais vetores de plasmídeo são pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 (Bio-Rad® Laboratories), pPL e pKK223 (Pharmacia). Qualquer hospedeiro pro- cariótico adequado pode ser usado para expressar uma molécula de DNA recombinante que codifica a proteína da invenção.
[000424] Vetores de expressão compatíveis com células eucarióti- cas, preferivelmente aqueles compatíveis com células de vertebrados, também podem ser usados para formar moléculas de rDNA que contêm uma seqüência codificante. Vetores de expressão de célula euca- riótica são bem-conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores são fornecidos contendo sítios de restrição convenientes para a inserção do segmento de DNA desejado. Exemplos de tais vetores são pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC® 31255) e outros vetores de expressão eucarióticos.
[000425] Vetores de expressão de células eucarióticas usados para construir as moléculas de rDNA da presente invenção podem ainda incluir um marcador selecionável que é eficaz em uma célula eucarióti- ca, preferivelmente um marcador de seleção de resistência a fármaco. Um marcador de resistência a fármaco preferido é o gene cuja expressão resulta em resistência a neomicina, isto é, o gene de neomicina fosfotransferase (neo). (Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982)). Alternativamente, o marcador selecionável pode estar presente em um plasmídeo separado, os dois vetores introduzidos por co- transfecção da célula hospedeira e os transfectantes selecionados pe lo cultivo no fármaco apropriado para o marcador selecionável.
[000426] Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpo da invenção, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de extensão completa são inseridos em vetores de expressão tal que os genes sejam operativamente ligados a seqüências de controle trans- cricional e traducional. Vetores de expressão incluem plasmídeos, re- trovírus, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV e semelhantes. O gene do anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricional ou traducional dentro do vetor realizam sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidos para ser compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em algumas modalidades, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos usuais (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega, se sítios de restrição não estiverem presentes).
[000427] Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina de CH ou CL humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados manipulados de forma que qualquer seqüência de VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. Em tais vetores, o "splicing" geralmente ocorre entre o sítio doador de splice na região J inserida e o sítio receptor de splice anterior à região C humana e também nas regiões de splice que ocorrem dentro dos exons de CH humanos. Poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em sítios cromossômicos nativos a jusante das regiões codificantes. O vetor de expressão recombinante também po- de codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado em um vetor de forma que o peptídeo de sinal esteja ligado in frame com a terminação amino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não imunoglobulina).
[000428] Além dos polipeptídeos imunogênicos, anticorpos antireceptor Nogo-1, fragmentos de ligação antígeno, polipeptídeos de receptor de Nogo-1 solúveis e proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente invenção, os vetores de expressão da invenção carregam seqüências regulatórias que controlam sua expressão em um célula hospedeira. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão da proteína desejada, etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão em célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), promotores de polioma e fortes de mamíferos tais como promotores de imunoglobulina nativa e actina. Para descrição adicional de elementos regulatórios virais e seqüências desses, veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.168.062 por Stinski, Pat. U.S. No. 4.510.245 por Bell et al e Pat. U.S. No. 4.968.615 por Schaffher et al.
[000429] Em uma modalidade, um vetor de expressão de propriedade de Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (Patente U.S. 6.159.730) pode ser usado. Esse vetor contém o promo- tor/intensificador de citomegalovírus, o promotor principal de beta glo- bina de camundongo, a origem de replicação de SV40, a seqüência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino, éxon 1 e éxon 2 de neomicina fosfotransferase, o gene e a seqüência líder de diidrofolato redutase. Foi descoberto que esse vetor resulta em um nível de expressão muito alto após a transfecção em células CHO, seguida por seleção em meio contendo G418 e amplificação com metotrexato. Logicamente, qualquer vetor de expressão que é capaz de produzir expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não são limitados aos plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, e pZeoSV2 (disponibilizados por Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponibilizado por Promega, Madison, WI). Vetores de expressão de células eucarióticas adicionais são conhecidos na técnica e são disponíveis comercialmente. Tipicamente, tais vetores contêm sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de DNA desejado. Vetores exemplares incluem pSVL e pKSV- 10 (Pharmacia), pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC 31255), vetor de expressão retroviral pMIG e pLL3.7, vetor "shuttle" de adeno- vírus pDC315 e vetores AAV. Outros sistemas de vetor exemplares estão descritos, por exemplo, na Pat. U.S. 6.413.777.
[000430] Outras modalidades da invenção usam um vetor lentiviral para expressão dos polinucleotídeos da invenção, por exemplo, polinucleotídeos antagonistas de NgR, por exemplo moléculas de siRNA. Lentivírus podem infectar células que não estão ciclando e células pós-mitóticas, e também fornecem a vantagem de não serem silenciados durante o desenvolvimento permitindo a geração de animais transgênicos através de infecção de células tronco embrionárias. Mi- lhavet et al., Pharmacologcal Rev. 55:629-648 (2003). Outros vetores virais que expressam polinucleotídeo podem ser construídos baseados, mas se limitando a, vírus adenoassociados, retrovírus, adenovírus ou alfavírus.
[000431] A transcrição de polinucleotídeos da invenção, por exemplo, seqüências de moléculas de siRNA pode ser direcionada por um promotor para RNA polimerase I (pol I), RNA polimerase II (pol II) ou RNA polimerase III (pol III) eucarióticas. Transcritos dos promotores pol II ou pol III são expressos em níveis elevados em todas as células; os níveis de um dado promotor de pol II em um dado tipo de célula depende da natureza das seqüências regulatórias do gene (intensificado- res, silenciadores, etc.) presentes ao lado. Promotores procarióticos de RNA polimerase também são usados, fazendo com que a enzima RNA polimerase procariótica seja expressa nas células apropriadas (Elroy- Stein & Moss, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:6743-7 (1990); Gao & Huang, Nucleic Acids Res. 21:2867-72 (1993); Lieber et al, Methods Enzymol. 217:47-66 (1993); Zhou et al, Mol Cell. Biol. 10:4529-37 (1990)). Vários investigadores demonstraram que polinucleotídeos expressos a partir de tais promotores podem funcionar em células de mamíferos (por exemplo, Kashani-Sabet et al, Antisense Res. Dev. 2:3-15 (1992); Ojwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 10802-6 (1992); Chen et al., Nucleic Acids Res. 20:4581-9 (1992); Yu et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6340-4 (1993); L'Huillier et al, EMBO J. 11:4411-8 (1992); Lisziewicz et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 90:8000-4 (1993); Thompson et al, Nucleic Acids Res. 23:2259 (1995); Sullenger & Cech, Science 262:1566 (1993)). Mais especificamente, unidades de transcrição tais como aquelas derivadas de genes que codificam U6 nuclear pequena (snRNA), RNA de transferência (tRNA) e VA RNA de adenovírus são úteis na geração de altas concentrações das moléculas de RNA desejadas, tal como siRNA, em células (Thom- pson et al, supra; Couture & Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al, Nucleic Acid Res. 22:2830 (1994); Noonberg et al, Pat U.S.. No. 5.624.803; Good et al, Gene Ther. 4:45 (1997); Beigelman et al, Publicação Internacional PCT No. WO 96/18736. As unidades de transcrição de siRNA podem ser incorporadas em uma variedade de vetores para introdução em células de mamíferos, incluindo mas não restritos a vetores de DNA de plasmídeo, vetores de DNA viral (tais como adenovírus ou vetores de vírus adenoassociado), ou vetores de RNA viral (tais como vetores retrovirais ou de alfavírus) (para revisão veja Couture & Stinchcomb, 1996, supra).
[000432] Além dos genes heterólogos e seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor tenha sido introduzido (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nos 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel et al). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo (para seleção com G418).
Células Hospedeiras e Métodos Para Produzir Proteína da Invenção Recombinantemente
[000433] Moléculas de ácido nucléico da invenção que codificam anticorpos anti-receptor Nogo-1, peptídeos imunogênicos, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 dessa invenção e vetores que compreendem essas moléculas de áci do nucléico podem ser usados para transformação de uma célula hospedeira adequada. A transformação pode ser por qualquer um método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem-conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextran, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsu- lação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além disso, moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamíferos por vetores virais.
[000434] A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma molécula de rDNA da presente invenção é obtida por métodos bem-conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vetor usado e do sistema de hospedeiro empregado. Com relação à transformação de células hospedeiras procarióticas, a eletroporação e métodos de tratamento com sal podem ser empregados (veja, por exemplo, Sam- brook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Cohen et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 69:2110- 2114 (1972)). Com relação a transformação de células de vertebrados com vetores que contêm rDNA, eletroporação, métodos de tratamento com lipídeo catiônico ou sal podem ser empregados (veja, por exemplo, Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376 (1979)).
[000435] Células transformadas com sucesso, isto é, células que contêm uma molécula de rDNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem-conhecidas incluindo a seleção por um marcador selecionável. Por exemplo, células que resultam da introdução de um rDNA da presente invenção podem ser clonadas para produzir colônias únicas. Células destas colônias podem ser coletadas, lisadas e seu conteúdo de DNA examinado quanto a presença do rDNA usando um método tal como o descrito por Southern, J. MoI. Biol. 98:503-517 (1975) ou as proteínas produzidas pela célula podem ser testadas por um método imunológico.
[000436] Células hospedeiras para expressão de um polipeptídeo ou anticorpo da invenção para uso em um método da invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas. Linhagens celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem várias linhagens celulares imortalizadas disponibilizadas pela American Type Culture Collection (ATCC®). Essas incluem, inter alia, célula de ovário de hamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de hepatocarcinoma humano (por exemplo, Hep G2), células A549 e diversas outras linhagens celulares. Linhagens celulares de preferência particular são selecionadas através da determinação de quais linhagens celulares têm altos níveis de expressão. Outras células hospedeiras eucarióticas úteis incluem células de planta. Outras linhagens celulares que podem ser usadas são linhagens celulares de inseto, tais como as células Sf9. Células hospedeiras exemplares procarióticas são E. coli e Streptomyces.
[000437] Quando vetores de expressão recombinante que codificam os polipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, eles são produzidos pelo cultivo de células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo, polipeptídeo e polipeptídeo de fusão nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção dos polipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor No- go-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Polipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padronizados de purificação de proteína.
[000438] Além disso, polipeptídeos imunogênicos de expressão, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção (ou outras porções deles) a partir de produção em linhagens celulares podem ser aumentados usando inúmeras técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene de glutamina sintetase (o sistema GS) é uma abordagem comum para aumentar a expressão sob certas condições. O sistema GS está descrito como um todo ou em parte nas Patentes Européias Nos. 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 e Pedido de Patente Europeu No. 89303964.4.
Células Hospedeiras
[000439] A presente invenção ainda proporciona células hospedeiras transformadas com uma molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação de antígeno, po-lipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. Células eucarióticas úteis para expressão de uma proteína da invenção não são limitadas, contanto que a linhagem celular seja compatível com os métodos de cultura e compatíveis com a propagação do vetor de expressão e expressão do produto gênico. Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem, mas não são limitadas a levedura, célula de inseto e mamíferos, preferivelmente células de vertebrados como aquelas de camundongo, rato, macaco ou linhagem celular humana. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) disponibilizadas pela ATCC® como CCL61, células de embrião de camundongo NIH suíço NIH-3T3 disponibilizadas pela ATCC® como CRL 1658, células de rim de filhote de hamster (BHK) e as linhagens celulares de cultura de tecido eucariótico semelhantes.
[000440] Outras linhagens celulares eucarióticas úteis incluem células de planta. Outras linhagens que podem ser usadas são linhagens celulares de inseto, tais como células Sf9. Células hospedeiras pro- carióticas exemplares são E. coli e Streptomyces.
Produção de Proteínas Recombinantes usando uma Molécula de rDNA
[000441] A presente invenção ainda proporciona métodos para produção de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção usando moléculas de ácido nucléico descritas aqui . Em termos gerais, a produção de uma forma recombinante de uma proteína envolve tipicamente as seguintes etapas:
[000442] Primeiro, é obtida uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína da invenção. Se a seqüência codificante não for interrompida por introns, ela é diretamente adequada para expressão em qualquer hospedeiro.
[000443] A molécula de ácido nucléico é então opcionalmente colocada em ligação operativa com seqüências de controle adequadas, como descrito acima, para formar uma unidade de expressão que contém a fase aberta de leitura da proteína. A unidade de expressão é usada para transformar um hospedeiro adequado e o hospedeiro transformado é cultivado sob condições que permitem a produção da proteína recombinante. Opcionalmente, a proteína recombinante é isolada do meio ou das células; a recuperação e purificação pode não ser necessária em alguns casos onde algumas impurezas podem ser toleradas.
[000444] Cada uma das etapas anteriores pode ser feita por uma variedade de maneiras. Por exemplo, as seqüências codificantes desejadas podem ser obtidas a partir de fragmentos genômicos e usadas diretamente nos hospedeiros apropriados. A construção de vetores de expressão que são operáveis em uma variedade de hospedeiros é obtida usando replicons e seqüências de controle apropriadas, conforme descrito acima. As seqüências de controle, vetores de expressão e métodos de transformação dependem do tipo de célula hospedeira usada para expressar o gene e foram discutidos em detalhes anteriormente. Sítios de restrição adequados podem, se não disponíveis normalmente, ser adicionados às extremidades da seqüência codificante a fim de fornecer um gene removível para inserir nesses vetores. Um versado na técnica pode facilmente adaptar qualquer sistema de hospedeiro/expressão conhecido na técnica para uso com as moléculas de ácido nucléico da invenção para produzir proteína recombinante.
[000445] Ficará imediatamente claro para um versado nas técnicas relevantes que outras modificações e adaptações adequadas aos métodos e aplicações descritas aqui são óbvias e podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção ou de qualquer modalidade desta. Com o objetivo de que essa invenção possa ser melhor compreendida, são descritos os seguintes exemplos. Esses exemplos têm o propósito apenas de ilustração e não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção de qualquer maneira.
EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-RECEPTOR NOGO-1 DE MURINO
[000446] Anticorpos anti-receptor Nogo-1 que se ligam especificamente a um polipeptídeo imunogênico do receptor Nogo-1 da invenção foram feitos usando os seguintes métodos e procedimentos.
Imunizações:
[000447] Duas abordagens de imunização foram usadas:
1. Células ou Membranas Celulares de COS-7 Contendo o Receptor Nogo-1 (NogoR-1) como o Imunógeno
[000448] O gene do receptor Nogo-1 de rato (GenBank™ No. AF 462390) foi subclonado no vetor de expressão de mamífero pE- AG1256 (Biogen®) que continha o promotor de CMV e o gene de resistência à geneticina para seleção por fármaco. O plasmídeo recombinante foi transfectado em células COS-7 usando Superfect (Qiagen®). Os transfectantes foram selecionados usando geneticina (Gibco™, 2 mg/ml), clonados e verificados quanto à expressão de proteína de receptor Nogo-1 de superfície por FACS. Membranas de COS-7 foram preparadas a partir dessas células de acordo com procedimentos des-critos [Wang et al., J. Neurochem. 75:1155-1161 (2000)] com duas lavagens e armazenados a 1 mg/ml [concentração de proteína] em glice- rol 10% a -70°C.
[000449] Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmen- te com uma emulsão contendo 50 μg de membranas de COS-7- receptor Nogo-1 ou com células COS-7 inteiras expressando receptor Nogo-1 sobre a superfície e 50 μl de adjuvante RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez a cada duas semanas (Lipman et al, 1992). Soros dos camundongos imunizados foram coletados antes da primeira imunização, 7 dias após a segunda e terceira imunizações e 38 dias após a terceira imunização e os títulos de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos por ELISA como descrito abaixo.
2. Peptídeos de receptor Nogo-1 Específicos como o Imunógeno
[000450] A seqüência do gene do receptor Nogo-1 de rato foi submetida a análises de antigenicidade usando o programa Vector NTi™ (Fig. 2). Peptídeos antigênicos identificados nas análises foram conjugados com Hemocianina de Keyhole Limpet (KLH) usando procedimentos com glutaraldeído usuais.
[000451] Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmen- te com uma emulsão contendo 50 μg de peptídeos conjugados com KLH e 50 μl de adjuvante de Freund completo (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez a cada duas semanas.
[000452] Soro dos camundongos imunizados foi coletado antes da primeira imunização e 1 semana após a segunda e terceira imunizações e os títulos de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos. Uma dose de reforço foi dada após a terceira imunização. Três dias após a dose de imunização de reforço, os experimentos de fusão foram iniciados.
Produção e rastreamento de Hibridoma
[000453] Soros de camundongos imunizados com peptídeos antigênicos de receptor Nogo-1 foram rastreados por ELISA enquanto que soros de camundongos imunizados com células COS-7 expressando receptor Nogo-1 foram rastreadas por citometria de fluxo. Camundongos que eram positivos para anticorpos que se ligavam especificamente a células COS-7-receptor Nogo-1 foram identificados por citometria de fluxo e foram sacrificados. Esplenócitos foram isolados dos camundongos e fundidos ao mieloma FL653 (um derivado de APRT de um mieloma de camundongo Balb/c Ig-/HGPRT-, mantido em DMEM contendo 10% de FBS, glicose 4500 mg/L, L-glutamina 4 mM e 8- azaguanina 20 mg/ml) como descrito (Kennett et al, Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biologcal Analysis, Plenum Press, Nova Iorque (1993)). As células fundidas foram plaqueadas em placas de 24 ou 48 cavidades (Corning Glass Works, Corning, NY), e nutridas com meio e cultura contendo adenina, aminopterina e timidina. Culturas resistentes a AAT foram rastreadas por ELISA ou citometria de fluxo quanto à ligação a células COS-7-receptor Nogo-1 ou ao peptídeo an- tigênico de receptor Nogo-1, conforme descrito abaixo. As células nas cavidades positivas foram ainda subclonadas por diluição limitante.
[000454] Para rastrear a ligação do anticorpo a um peptídeo antigê- nico de receptor Nogo-1, os peptídeos que foram usados como imunó- genos foram conjugados com BSA. 0,5 μg de peptídeo conjugado em 50 μl de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9.9 foram adicionados a cada cavidade de uma placa MaxiSorp™ de 96 cavidades (Nunc™). A placa foi então incubada a 37°C por 1 hora ou 4°C por 16 horas e os sítios de ligação inespecífica foram bloqueados usando HEPES 25 mM, pH 7.4 contendo BSA 0,1%, ovalbumina 0,1%, blotto 0,1% e azida 0,001%. O sobrenadante do hibridoma foi adicionado e incubado a 25°C por 1 hora. Após lavar três vezes com PBS, 50 μl de uma diluição 1:10.000 de anticorpo secundário de cabra anti- camundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Jackson ImrnunoResearch Inc.) foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora adicional. Após três lavagens, a coloração foi desenvolvida por TMB (Pierce) e paralisada com ácido sulfúrico 2M. A intensidade da cor foi monitorada em um espectrofotômetro a 450 nm.
[000455] Os anticorpos foram rastreados quanto à ligação ao receptor Nogo-1 de extensão completa como segue. Células COS-7 foram marcadas com CellTracker™ Green CMFDA 0,1 uM (Molecular Probes, Eugene, OR) como descrito pelo fornecedor. Volumes iguais de células de controle marcadas com CellTracker™ foram misturados com células COS-7-receptor Nogo-1 lavadas antes da incubação com soros de teste anti-receptor Nogo-1. Cinqüenta microlitros da mistura de célula foram dispensados em cada cavidade de uma placa de poliestire- no de 96 cavidades com fundo em V (Costar® 3877, Corning, NY) e 100 μl de sobrenadante de hibridoma ou de anticorpo anti-receptor Nogo-1 de controle foram adicionados. Após a incubação a 4°C por 30 minutos, as células foram lavadas e incubadas com 50 μl de anticorpo secundário gama-específico de fragmento F(ab')2 purificado por afinidade de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com ficoeri- trina (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) em PBS. No final da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e suspensas em 200 μl de PBS contendo FBS 1% e submetidas a análise por FACS. Alternativamente, células COS-7-receptor Nogo-1 foram misturadas com sobrenadante de hibridoma e tratadas com anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com R-ficoeritrina e submetidos diretamente a análises de FACS usuais.
[000456] Foram gerados 25 anticorpos anti-receptor Nogo-1 usando uma variedade de imunógenos. Foram gerados, dois anticorpos, 7E11 e 5B10, usando uma seqüência de peptídeo correspondendo aos resíduos 110-125 de receptor Nogo-1 de rato como o imunógeno. Foram gerados três anticorpos, 1H2, 3G5 e 2F7, usando membranas preparadas de células COS-7 transfectadas com receptor Nogo-1 de extensão completa de rato como o imunógeno. Foram gerados 13 anticorpos usando sNogoR310-Fc como o imunógeno (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1 .4, 1H3.3, 1G4.1. 1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2F11.1, e 1H4.1) e 7 anticorpos usando uma seqüência de peptídeo que corresponde aos resíduos 423-434 de receptor Nogo-1 de rato como o imunógeno (2E8.1, 2G11.2, e 1B5.1).
Análise da Seqüência de Anticorpos Monoclonais 7E11 e 5B10
[000457] Foi extraido o RNA total usando o mini kit Qiagen® RNeasy® e geramos cDNA do RNA isolado. Foi amplificada a seqüência da cadeia leve por PCR usando os iniciadores 5'- TGAGGAGACGGTGAC- CGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID NO: 12) e 5'- AGGTS- MARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID NO: 25). Foi amplificada a seqüência da cadeia pesada por PCR usando os iniciadores 5'- GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ IDNO: 13) e 5'- GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3 ' (SEQ ID NO: 14). Esses iniciadores compreendem nucleotídeos dege-nerados como segue: S representa G ou C; M representa A ou C, R representa G ou A; W representa A ou T; K representa G ou T; e Y representa T ou C. Foram clonados os fragmentos de PCR em um vetor de seqüenciamento e determinados a seqüência de DNA das CDRs por terminação de cadeia didesóxi usando iniciadores específicos para o vetor de seqüenciamento. Foram traduzidos conceitualmente as se qüências de DNA e as seqüências parciais de aminoácidos das regiões de CDR das cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais 7E11 e 5B10 como mostrado na Tabela 2. As 3 CDRs das cadeias pesada e leve dos mAbs estão sublinhadas na Tabela 2. As cadeias le ves de 7E11 e 5B10 têm 94% de identidade de seqüência de aminoácido e as cadeias pesadas têm 91% de identidade de seqüência de aminoácido. mAbs 7E11, 5B10, e 1H2 são do isotipo de IgG1 e mBbs 3G5 e 2F7 são do isotipo de IgG2a. Cada um desses cinco mAbs tem uma cadeia leve do isotipo kappa. Foi analisada a seqüência dos outros anticorpos monoclonais por essa abordagem. TABELA 2. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE MABS 7E11 E 5B10
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Mapeamento de Epitopo de Anticorpo Monoclonal 7E11
[000458] mAb 7E11 se liga tanto a NgR1 de rato como de humano. Para determinar o epitopo responsável pela ligação de 7E11, foram gerados fragmentos e peptídeos sintéticos de NgR1 de rato e testados quanto à ligação a 7E11.
[000459] Um fragmento recombinante de NgR1 de rato que contém todos os 8 domínios de LRR e os caps N e C terminais (sNgR310) foi tratado com ácido ou com brometo de cianogênio (CNBr) e os fragmentos separados por eletroforese em gel. sNgR310 não-tratado migra com um peso molecular aparente de 42 kDa. O tratamento com ácido de sNgR310 produziu dois produtos de clivagem principais de 15 kDa (aa 27-aa 122) e 30 kDa (aa 123-aa 310). O tratamento com CNBr gerou três fragmentos, um par de 33/35 kDa (aa 27-aa 229), que pode representar fragmentos com glicosilação heterogênea, um produto de 10 kDa (aa 241-aa 310) e um fragmento com 11 aminoácidos (aa 230- aa 240), que não é retido no gel. Um western blot do gel foi testado por marcação com 7E11 e demonstrou que ele se ligou a NgR1 de rato intacto (aa 27-aa 310), ao fragmento de ácido de 15 kDa (aa 27- aa 122) e ao fragmento de CNBr de 35 kDa (aa 27- aa 229). 7E11 não se ligou ao fragmento de ácido de 30 kDa (aa 123- aa 310) nem ao fragmento de 10 kDa de CNBr (aa 241-aa 310). Tanto o fragmento de ácido de 15 kDa como o fragmento de CNBr de 35 kDa continham a seqüência LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1), em concordância com a ligação de 7E11 a um único epitopo sobre NgR1.
[000460] O sítio de ligação de 7E11 foi analisado ainda por testar os digestos de peptídeo tríptico de sNgR310. A análise por HPLC mostrou vários fragmentos, indicando que havia vários resíduos de lisina e arginina sensíveis à tripsina na seqüência de NgR1. 7E11 ligou-se apenas a um único digesto de peptídeo tríptico, fornecendo evidência adicional de que 7E11 se liga a um único epitopo sobre NgR1. Espec- troscopia de massa subseqüente (MS) e análises de seqüência identificaram o peptídeo ligado como sendo AAAFTGLTLLEQLDLSD- NAQLR (SEQ ID NO: 26).
[000461] O peptídeo LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1) foi submetido à análise de mapeamento adicional. O peptídeo foi digerido com tripsina, o que gerou dois fragmentos principais, LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27) e WDPTT (SEQ ID NO: 28), e habilidade de 7E11 de se ligar a eles foi testada. A análise de MS revelou que o anticorpo se ligou ao peptídeo LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27) e, portanto, esse peptídeo contém o epitopo de ligação para 7E11. Dentro dessa fração de peptídeo, a análise de MS detalhada identificou vários peptídeos misturados que também se ligaram a 7E11, incluindo peptídeos com desaminação em Asn 115 e Gln 117, adição de Alanina em 112 ou 113 ou adição de Serina em 114 (Tabela 3). Esses dados indicam que vários resíduos de aminoácido localizados nesse fragmento de peptídeo podem não ser críticos para a ligação de 7E11. TABELA 3. PEPTÍDEOS MUTANTES LIGADOS POR 7E11
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[000462] O peptídeo LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ED NO:1) também foi digerido com a endoprotease Asp-N e a ligação de 7E11 foi testada. A endoprotease Asp-N clivou o peptídeo em 3 fragmentos de peptídeo, L, DLS e DNAQLRWDPTT (SEQ ED NO: 36). Desses produtos, 7E11 ligou-se ao peptídeo DNAQLRWDPTT (SEQ DD NO: 36). Tomados juntos, os dados de clivagem com tripsina e Asp-N ainda localizaram o epitopo de ligação de 7E11 na seqüência compartilhada entre eles, DNAQLR (SEQ ED NO: 37).
[000463] As seqüências de aminoácidos de NgRl, NgR2, e NgR3 de várias espécies foram analisadas para prever os resíduos críticos no epitopo de ligação de 7E11 com base na observação de que 7E11 se ligou a NgR1 de rato e de humano mas não a NgR1 de camundongo, NgR2 humano e NgR3 de camundongo. Alinhamento de seqüência revelou que os aminoácidos 110-125 de NgR1 de rato e a seqüência correspondente de NgR1 humano são idênticos e que a seqüência de NgR1 de camundongo difere apenas em um aminoácido na posição 119 (Arg 119 em NgR1 de rato e humano e His 119 em NgR1 de camundongo; Tabela 4). TABELA 4. ALINHAMENTO DE SEQÜÊNCIA DE NGRS DE DIFERENTES ESPÉCIES
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[000464] Arg119 em NgR1 contribui para a ligação de 7E11 porque ele se liga bem a NgR1 de rato e humano mas fracamente a NgR1 de camundongo. Similarmente, como 7E11 não se liga bem a NgR3, Ala 116 está envolvida no epitopo por que dentro da seqüência DNAQLR (SEQ ID NO: 37) NgR3 difere de NgR1 apenas por uma Arginina na seqüência correspondente. Dentro da seqüência DNAQLR (SEQ ID NO: 37), 4 dos 6 resíduos em NgR2 são idênticos aos de NgR1 de rato. Ala116 e Gln117 são substituídos por Arginina e Histidina, respectivamente. Isso confirma que Ala116 é um resíduo de aminoácido importante que contribui para a ligação de 7E11 mas não necessariamente exclui o envolvimento de Gln117.
[000465] Para verificar esses pontos de contato, diversos peptídeos contendo mutações pontuais dentro da seqüência LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27) foram gerados e testados para a ligação com 7E11. Os peptídeos foram imobilizados em uma placa MaxiSorp™ (Nunc™) e diluições seriadas de 7E11 foram aplicadas. Os valores de EC50 resultantes estão mostrados na Tabela 5. 7E11 se ligou aos mutantes Leu110Ala e Asp111Ala com valores de EC50 similares aos do peptídeo original. Quando Gln117Ala foi testado, a EC50 aumentou 30 vezes e quando Arg119His foi testadp, a EC50 aumentou 25 vezes. A alteração mais significativa na EC50 foi observada quando Arg119 foi mutada para Alanina. TABELA 5. 7E11 SE LIGA A PEPTÍDEOS MUTANTES COM EC50 DI-FERENTE
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[000466] A posição do epitopo de ligação de 7E11 também foi determinada na estrutura cristalina recentemente determinada de sNgR310. Como esperado, a estrutura mostra que o epitopo de 7E11 está exposto sobre a superfície da molécula. Os resíduos Arg119, Gln117, Ala116 e Asp114 projetam-se para fora da estrutura enquanto que Leu118 e Asn115 estão localizados internamente. O epitopo se localiza em cima de uma área ácida dentro da superfície côncava da estrutura e uma superfície básica que está de frente para um dos lados.
Inibição da Ligação do Ligante ao Receptor Nogo-1 Solúvel pelo Anticorpo Monoclonal anti-receptor Nogo-1
[000467] Anticorpos monoclonais anti-receptor Nogo-1 produzidos como descrito acima foram testados para determinar se eles inibiram a ligação do ligante ao receptor Nogo-1.
[000468] 0,5 μg de uma proteína de fusão de receptor Nogo-1 solú vel compreendendo os resíduos de aminoácido 26-344 do receptor Nogo-1 de rato e a dobradiça e região Fc da molécula de IgG1 de rato (sNogoR344-Fc) produzida como descrito abaixo foram imobilizados em 250 μg de esferas de SPA conjugadas com proteína A ou aglutini- na de germe de trigo (Amersham Pharmacia Biotech) por 2 horas a 25°C. Esferas de SPA acopladas com Fc-sNogoR-1, mAb anti-receptor Nogo-1 e 1 μl de 125I-Nogo66 (Amersham, 2000 Ci/mmol, 1nM) em 50 μl de meio de incubação tamponado com HEPES (HEPES 10 mM, pH 7.4, albumina sérica bovina 0,1%, ovalbumina 0,1%, MgCh 2 mM, CaCl2 2 mM e inibidores de protease) foram adicionadas a cada cavidade de amostra. Após 16 horas, a radioatividade foi medida em amostras quadruplicadas usando um TopCount® (Packard). Valores de IC50 foram calculados a partir de uma análise de ajuste de curva (Fig. 3) (PRISM, GraphPad Software, NJ). Em alguns experimentos, foram também usados conjugados de AP-ligante (por exemplo, AP-Nogo66) e detectados a ligação pelo monitoramento da atividade de fosfatase alcalina. Foi também testada a habilidade dos mAbs de bloquear a ligação dos ligantes MAG-Fc e AP-OM-gp ao receptor Nogo-1.
[000469] Todos os anticorpos monoclonais 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 e 2F7 inibiram a ligação de Nogo66, MAG e OM-gp a sNogoR344-Fc. A IC50 calculada de Nogo66 para 7E11 e 1H2 foi de 400 nM e 60 nM, respectivamente. Os dados de ELISAs que monitoraram a inibição da ligação mediada por mAb dos três ligantes ao receptor Nogo-1 estão resumidos na Tabela 6. TABELA 6. MABS INIBEM A LIGAÇÃO DE NOGO66, MAG E OM-GP
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[000470] O percentual de deslocamento é mostrado com anticorpo em 30 nM e a EC50 para certos mAbs determinada por análise de ajuste de curva como descrito. " — " indica nenhuma atividade detectável e "ND" indica não determinado.
EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-RECEPTOR NOGO-1 FAB- FAGO
[000471] Anticorpos anti-receptor Nogo-1 Fab-fago que se ligam es-pecificamente a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 imunogênico da invenção também foram feitos por rastreamento de uma biblioteca de Fab-fago como segue.
[000472] A biblioteca de Fab-fago MorphoSys HuCAL® GOLD foi ras- treada contra proteína recombinante solúvel de rato sNogoR310-Fc e células COS-7 expressando o receptor Nogo-1 de rato. Fab-fagos que se ligaram especificamente ao receptor Nogo-1 foram purificados e caracterizados. A cadeia pesada de 14D5 é derivada do gene VH2 e a cadeia leve é derivada do gene VK1. As seqüências de aminoácidos das CDRs da cadeia pesada e cadeia leve de um desses fagos Fab- fagos, 14D5, são mostradas na Tabela 7. TABELA 7. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE CDRS DE 14D5
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[000473] 14D5 se liga ao receptor Nogo-1 de rato tanto nas formas monovalente como bivalente. Além disso, 14D5 se liga ao receptor Nogo-1 de camundongo e humano e ao receptor Nogo-2 de humano, mas não ao receptor Nogo-3 de camundongo.
EXEMPLO 3 IMUNOPRECIPITAÇÃO DE RECEPTOR NOGO-1 POR ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-RECEPTOR NOGO-1
[000474] Para realizar a imunoprecipitação, 100 μl de células lisadas ou 50 μl de células tratadas com PiPLC foram misturados com 400 ou 450 μl de tampão de extração [Tris-HCl 10 mM, pH 7.2, Tween-20™ 0,5%, PMSF 0,2 mM] ou tampão RIPA, respectivamente na presença de 30 μl de Proteína A ou G e 1-2 μg de anticorpo. A mistura foi incubada em um agitador a 4°C por 16 horas.
[000475] Amostras foram cuidadosamente centrifugadas para precipitar as esferas acopladas com Proteína A ou G. As esferas foram lavadas três vezes com 1 ml de tampão de lavagem (Tris-HCl 10 mM, pH 7.2, Tween-20™ 0,1%). A lavagem final foi realizada usando 10% do tampão de lavagem original.
[000476] As esferas foram ressuspensas em 100 μl de SDS 2X com beta-mercaptoetanol 10%. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente antes de serem corridas em um gel de Tris-Glicina 420% para SDS-PAGE. Como determinado pela análise em gel de SDS-PAGE, os anticorpos monoclonais 3G5 e 2F7 imunoprecipitaram o receptor Nogo-1.
EXEMPLO 4 DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DO ANTICORPO POR ELISA
[000477] Para determinar a especificidade dos anticorpos monoclonal e Fab-fago produzidos nos Exemplos 1 e 2, foi realizado um ELISA usando um painel de polipeptídeos de receptor Nogo-1. O painel consistiu em sNogoR310-Fc (uma proteína de fusão que compreende os aminoácidos 26-310 do receptor Nogo-1 de rato e um fragmento Fc de rato), sNogoR344-Fc (veja acima), polipeptídeo p-617 (SEQ ID NO:1), polipeptídeo p-618 (um polipeptídeo de 19 aminoácidos da região LRR7 do receptor Nogo-1 de rato; Fig. 2; SEQ ID NO:11) e os polipeptídeos p-4 e p-5 (polipeptídeos das regiões LRR5 e LRRCT do receptor Nogo-1, respectivamente). Ovalbumina e BSA foram usados como controles. Como mostrado na Fig.4, mAbs 1H2, 3G5 e 2F7 se ligaram especificamente a sNogoR344-Fc. Em experimentos similares, estes anticorpos também se ligaram especificamente a um polipeptídeo que consiste nos aminoácidos 310-344 de receptor Nogo-1 de rato (SEQ ID NO: 3) e mAbs 7E11 e 5B10 se ligaram especificamente ao polipeptídeo p-617 (SEQ ID NO:1).
[000478] Dez dos anticorpos 1D9,3, 1E4,7, 1B4,3, 2C4,3, 1F10,3, 2H1,4, 1H3,3, 1G4,1, 1E4,1, e 2G7,1) da imunização com sNogoR310- Fc deslocaram uns aos outros pela ligação, indicando que eles reconhecem epitopos similares ou superpostos sobre sNogoR310-Fc. Os outros três anticorpos da imunização com sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1, e 1H4.1) reconheceram epitopos diferentes localizados nos resíduos de aminoácido 26-310.
[000479] Foram também realizados ensaios de ligação ELISA usando o Fab-fago 14D5. Onde os ligantes AP-Nogo66, AP-OM-gp e MAG- Fc foram deixados se ligar a sNogoR344-Fc imobilizado, 1 μM de 14D5 inibiu completamente a ligação de Nogo e MAG. Foram necessários 10 μM de 14D5 para inibir completamente a ligação de OM-gp a sNogoR344-Fc.
EXEMPLO 5 ENSAIO DE CRESCIMENTO DE NEURITO
[000480] Para testar a habilidade dos anticorpos monoclonal e Fab- fago produzidos acima em diminuir o efeito inibitório de mielina do CNS sobre neurônios, lâminas para cultura Lab-Tek® (4 cavidades) foram revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Mielina do CNS ou PBS foi colocada como gotas de 3 μl. Microesferas fluorescentes (Polysciences) foram adicionadas à mielina/PBS para permitir a identificação posterior das gotas (Grandpre et al, Nature 403:439-444 (2000)). As lâminas Lab-Tek® foram então enxaguadas e cobertas com 10 μg/ml de laminina (Gibco™). Gânglios da raiz dorsal (DRGs) de filhotes de ratos Sprague Dawley P3-4 foram dissociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington), triturados com pipetas Pasteur com ponta polida a fogo, pré-plaqueados para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueados em 23.000 células/cavidade sobre as lâminas para cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura foi F12 contendo 5% de soro de cavalo doador inativado por calor, 5% de soro fetal bovino inativado por calor e 50 ng/ml de mNGF e incubação a 37°C e 5% de CO2 por 6 horas. Quinze μg/ml de mAb 7E11 foram adicionados imediatamente após o plaqueamento.
[000481] As lâminas foram fixadas por 20 minutos com paraformal- deído 4% contendo sacarose 20% e coradas para o marcador neuronal anti-beta-III tubulina (Covance TUJ1) diluído 1:500. Como anticorpo secundário anticamundongo Alexa Fluor® 594 (Molecular Probes) foi diluído a 1:300 e as lâminas foram cobertas com Gel/Mount™ (Bi0meda™). Imagens digitais com ampliação de 5x foram obtidas com o programa OpenLab™ e analisadas pelo uso do programa MetaMorph® para quantificação do crescimento de neuritos.
[000482] MAb 7E11 protegeu os neurônios de DRG da inibição mediada por mielina do crescimento de neurito (Fig. 5). Resultados similares foram observados com mAbs 1H2 e 3G5.
[000483] Em um ensaio de proteção de crescimento de neurito onde neurônios de DRG de rato P7 foram cultivados em um substrato de mielina de CNS, 14D5 bivalente também promoveu o crescimento de neurito de forma eficaz.
EXEMPLO 6 IMUNOHISTOQUÍMICA COM 7E11 EM CÉLULAS TRANSFECTADAS COM RECEPTOR NOGO-1
[000484] Para caracterizar adicionalmente as propriedades de ligação de mAbs anti-receptor Nogo-1 produzidos como descrito no Exemplo 1, nós comparamos a ligação às células COS-7 ou 293 fixadas e vivas expressando receptor Nogo-1 de rato ou humano.
Células Fixadas
[000485] Células transfectadas ou não-transfectadas com receptor Nogo-1 foram plaqueadas em lâminas para cultura Lab-Tek® de 8 cavidades, fixadas com paraformaldeído 4% por 15 minutos, bloqueadas com soro de cabra normal 10%, Triton X-100 0,1% em PBS por 1 hora. mAb 7E11 foi adicionado a 15 μg/ml e 1,5 μg/ml em solução bloquea- dora e incubado por 2 horas em temperatura ambiente; anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com Alexa® (Molecular Probes) foi incubado em uma diluição de 1:3000 em solução bloqueadora por 1 hora; DAPI foi adicionado a 5 μg/ml ao anticorpo secundário para marcar todos os núcleos.
Células Vivas:
[000486] Células transfectadas e não-transfectadas foram plaqueadas em lâminas para cultura Lab-Tek de 8 cavidades, bloqueadas com tampão de FACS (contendo soro de cavalo doador 4%) por 30 minutos a 4°C, incubadas com 15 μg/ml de 7E11 e 1,5 μg/ml de tampão de FACS por 1 hora a 4°C, enxaguadas e incubadas com anticorpo secundário anti-camundongo Alexa® (1:300 em tampão de FACS) por 30 minutos a 4°C.
[000487] Experimentos de mancha imunohistoquímica demonstraram que todas os mAbs se ligaram a células expressando o receptor Nogo- 1 de rato. mAbs 7E11, 2G7.1 e 2C4.1 se ligaram tanto às células fixadas como às vivas expressando o receptor Nogo-1 humano.
EXEMPLO 7
[000488] MODELO DE CAMUNDONGO DE LESÃO CONTUSA DA MEDULA ESPINHAL
[000489] Para testar o efeito de mAbs anti-receptor de Nogo-1 produzidos no Exemplo 1 sobre neurônios in vivo, foi usado um modelo de camundongo de lesão contusa da medula espinhal.
[000490] Camundongos fêmeas (18-22 g) são tratados profilaticamente com analgésicos e agentes antibióticos. Os camundongos são anestesiados e colocados em um equipamento estereotáxico com fixação na coluna vertebral sob um estereomicroscópico. O trauma à medula espinhal é introduzido por uma versão modificada do método de queda de peso (M. Li et al, Neuroscience 99:333-342 (2000).
[000491] Resumidamente, uma laminectomia de T9 e T10 é feita e a coluna vertebral é estabilizada usando um par de pinças transversais para camundongo dando suporte aos processos transversos de T9- T10 bilateralmente. Uma haste de impacto de aço inoxidável com um diâmetro de 1,4 mm e peso de 2 g, é elevada a 2,5 cm acima da dura e deixada cair sobre a medula espinhal no nível de T10. Durante a cirurgia, os camundongos são mantidos sobre uma manta aquecida a 37°C e 1 ml de solução salina estéril aquecida é administrado subcu- taneamente a cada camundongo após a cirurgia para evitar a desidratação. A bexiga é manualmente esvaziada uma vez por dia até que o controle reflexo da bexiga seja readquirido.
[000492] Todos os animais recebem analgesia pós-operatória a cada 8-12 horas após a cirurgia e tratamento com antibiótico duas vezes por dia por 7 dias após o procedimento. Os animais têm livre acesso a alimento e água durante o estudo. Anticorpos anti-receptor Nogo-1 são liberados no local da lesão através de injeção intratecal por 28 dias como descrito abaixo para o modelo de transecção de medula espinhal de rato.
EXEMPLO 8 CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO SOLÚVEIS DE RECEPTOR NOGO-1
[000493] Para caracterizar polipeptídeos solúveis de receptor Nogo-1 (sNogoR-1) e proteínas de fusão (Fc-sNogoR-1) foi realizado o seguinte experimento.
[000494] Três μg de receptores Nogo solúveis (sNogoR310-Fc e sNogoR344-Fc) foram imobilizados sobre 250 μg de esferas WGA- SPA e receberam 0,5 μL de ligante radioativo (concentração final de 0,5 nM) em um volume final de 100 μL de tampão de ligação (HEPES 20 mM, pH 7.4, Ca 2mM, Mg 2mM, BSA 0,1%, ovalbumina 0,1% e inibidores de protease). Os ligantes incluíram Nogo66 10 μM, 125I- No- go40 10 μM (aminoácidos de 1-40 de Nogo A) e 10 μl de sobrenadan- te de anticorpo anti-receptor de Nogo-1 para cada grupo de ligantes. As três tirosinas de Nogo40 foram separadamente iodadas e designadas como Nogo40-A, -B e -C respectivamente. Os valores médios de triplicatas estão apresentados como % de radioatividade ligada normalizada (Figs. 6, 7 e 8). Barras de erro indicam SEM. A radioatividade ligada na ausência de inibidores foi tomada como 100% e a radioatividade ligada mais baixa na presença de 10 μM de Nogo40 foi tomada como 0% para os dados de normalização.
EXEMPLO 9 INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DO LIGANTE DE PROTEÍNA DE FUSÃO SOLÚVEL DE RECEPTOR NOGO-1
[000495] Um ensaio de ligação similar ao ensaio de ligação do Exemplo 8 foi usado para testar a habilidade de dois mAbs produzidos no Exemplo 1 inibirem a ligação de I25I-Nogo66 a sNogoR344-Fc. Mabs 2F7 e 3G5 inibiram a ligação de I25I-Nogo66 a sNogoR344-Fc.
EXEMPLO 10 ENSAIO DE CRESCIMENTO DE NEURITO
[000496] Lâminas para cultura Lab-Tek® (4 cavidades) foram revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Mielina de CNS sozinha ou misturada com sNogoR310, proteína de fusão sNogo310-Fc, mAb 5B10 ou PBS de controle foram separadamente colocadas como gotas de 3 μl. Microsferas fluorescentes (Polysciences) foram adicionadas à mielina/PBS para permitir a identificação posterior das gotas (Grandpre et al, Nature 403:439-444 (2000)). Lâminas Lab- Tek® foram então enxaguadas e cobertas com 10 μg/ml de laminina (Gibco™).
[000497] Gânglios da raiz dorsal (DRGs) de filhotes de ratos Sprague-Dawley P3-4 foram dissociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington), triturados com pipetas Pasteur com ponta polida a fogo , pré-plaqueados para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueados em 23.000 células/cavidade sobre as lâminas para cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura foi F12 contendo 5% de soro de cavalo doador inativado pelo calor, 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 50 ng/ml de mNGF e incubação a 37°C e 5% de CCkpor 6 horas.
[000498] As lâminas foram fixadas por 20 minutos com paraformal- deído 4% contendo sacarose 20% e coradas para o marcador neuronal anti-beta-III tubulina (Covance TUJl) diluído em 1:500. Como anticorpo secundário anticamundongo Alexa Fluor® 594 (Molecular Pro bes) foi diluído em 1:300 e as lâminas foram cobertas com Gel/Mount™ (Bi0meda™). Imagens digitais com amplificação de 5x foram obtidas com o programa OpenLab™ e analisadas pelo uso do programa MetaMorph para quantificação de crescimento de neurito.
[000499] sNogoR310, sNogoR310-Fc e mAb 5B10 protegeram os neurônios de DRG da inibição mediada por mielina de crescimento de neurito (Fig. 9-11). sNogoR310 foi usado em um ensaio similar usando neurônios de pinto e foi descoberto como sendo protetor.
[000500] Foi também testado o efeito neuro-protetor de receptores Nogo solúveis pela realização de experimentos com cultivo de células na presença e ausência de laminina. O crescimento celular neuronal nos meios sem laminina é pobre e reproduz condições de estresse neuronal.
[000501] DRGs foram dissecados de filhotes de rato com 6-7 dias pós-nascimento (P6-7), dissociados em células isoladas e plaqueados em placas de 96 cavidades pré-revestidas com poli-D-lisina como descrito acima. Em algumas cavidades, 2 μg/ml de laminina foram adicionados por 2-3 horas e enxaguados antes das células serem plaquea- das. Após uma incubação de 18-20 horas as placas foram fixadas com paraformaldeído 4%, coradas com anticorpo anti-Beta-III-tubulina de coelho diluído a 1:500 (Covance®) e anti-HuC/D diluído em 1:100 (Molecular Probes) e anticorpos secundários fluorescentes (Molecular Probes) foram adicionados em uma diluição 1:200. ArrayScan® II (Cel- lomics®) foi usado para capturar imagens digitais com ampliação de 5x e para quantificar o crescimento de neurito como a média de crescimento de neurito/neurônio por cavidade, pelo uso do aplicativo para crescimento de neurito. Nove imagens de 5x de 3 cavidades/condição foram analisadas.
[000502] Em alguns experimentos, um sub-clone de células PC12 (Neuroscreen™) foi usado (Cellomics®). As células Neuroscreen™ foram pré-diferenciadas por 7 dias com 200 ng/ml de NGF, desprendidas e re-plaqueadas em placas de 96 cavidades pré-cobertas com poli-D- lisina. Em algumas cavidades, 5 μg/ml de laminina foram adicionados por 2-3 horas e enxaguados antes das células serem plaqueadas. Após 2 dias de incubação, as placas foram fixadas com paraformaldeído 4%, coradas com anticorpo anti-Beta-III-tubulina de coelho diluído a 1:500 (Covance®) e Hoescht (mancha nuclear). ArrayScan® π foi usado para quantificar o crescimento de neurito da mesma forma que nas células de DRG.
[000503] sNogoR344-Fc ou IgG de rato foram adicionados em solução a neurônios de DRG P6-7 e às células Neuroscreen™ diferenciadas no momento do plaqueamento.
[000504] O efeito neuroprotetor de sNogoR344-Fc foi observado com 1 μM e 10 μM quando neurônios de DRG P6 foram cultivados na ausência de laminina. A quantificação do crescimento de neurito mostrou um aumento dependente da dose com a adição de sNogoR344-Fc. A adição de sNogoR344-Fc nas mesmas concentrações a neurônios de DRG cultivados sobre um substrato de laminina, não produziu nenhum efeito incomum, indicando que sNogoR344-Fc é ativo apenas sobre células estressadas. O efeito neuro-protetor de sNogoR344-Fc nas mesmas concentrações na ausência de laminina também foi visto com células Neuroscreen™.
EXEMPLO 11 PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA DE FUSÃO FC- SNOGOR-1
[000505] Um constructo de cDNA codificando os aminoácidos 1-310 de receptor Nogo-1 de rato foi fundido com uma Fc de IgG1 de rato contido em um vetor de expressão de mamífero e esse vetor foi ele- troporado em células de ovário de hamster chinês (CHO) (DG44). As células foram mantidas em alfa-MEM suplementado com soro fetal bovino dialisado 10%, glutamina 2 mM e reagentes antibióticos- antimicóticos. Dois dias após a transfecção, o meio condicionado foi coletado e analisado por Western blot sob condições redutoras. Uma banda de proteína de cerca de 60 kDa foi detectada usando um anticorpo policlonal anti-receptor Nogo-1 de coelho. As células foram ex-pandidas e classificadas usando um anticorpo de cabra anti-IgG de rato conjugado com R-PE. Após a segunda classificação, as células foram plaqueadas com uma densidade de uma célula/cavidade em placas de 96 cavidades. Os níveis secretados de proteína solúvel de receptor Nogo-1 de cavidades individuais foram testados e comparados usando um ELISA sanduíche. A placa de ELISA foi coberta com anticorpo de cabra específico anti-Fck de IgG de rato. O meio condicionado foi aplicado. A proteína solúvel de receptor Nogo-1 ligada foi detectada por anticorpo de jumento anti- Fab de IgG de rato Fc- específico conjugado com HRP. O clone 4C12 teve o nível de secreção mais alto. 4C12 foi expandido e cultivado em meio CHO-M7 em frasco rotatório. O nível de secreção foi de cerca de 10 mg/L a 37°C.
[000506] Células CHO expressando a proteína de fusão sNogoR310- Fc foram cultivadas larga escala. 1,7 L de meio condicionado concentrado foram obtidos a partir de um cultivo em um biorreator de 10L. O pH foi elevado pela adição de um décimo de volume de Tris-HCl 1,0 M, pH 8.9. Cloreto de sódio sólido e glicina foram adicionados em 3,0 M e 1,5 M, respectivamente. Uma coluna de proteína A-Sepharose™ de 60 mL equilibrada com Tris-HCl 10 mM, cloreto de sódio 3 M, glicina 1,5 M, pH 8.9 foi preparada. Meio condicionado concentrado foi aplicado à coluna em 1,5 ml/min usando uma bomba peristáltica. A coluna foi lavada com 300 ml de Tris-HCl 10 mM, cloreto de sódio 3M, glicina 1,5 M, pH 8.9, seguido por 120 ml de Tris-HCl 5 mM, cloreto de sódio 3M, pH 8.9. A proteína foi eluída com fosfato de sódio 25 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 2.8. Frações de 10 ml foram coletadas em tubos contendo 1,0 ml de HEPES 1,0 M, pH 8.5. Frações de proteína foram reunidas e dialisadas contra 3 x 2 L de fosfato de sódio 5mM, NaCl 300 mM, pH 7.4.
EXEMPLO 12 ENSAIO DE TRANSECÇÃO DE MEDULA ESPINHAL
[000507] Para testar sua habilidade em promover a recuperação funcional in vivo, uma proteína de fusão de sNogoR-1 foi testada em um ensaio de transecção de medula espinhal de rato.
[000508] Bombas osmóticas Alzet® foram carregadas com solução de teste (sNogoR310-Fc em PBS) feita recentemente no dia do uso. A concentração de carga foi calculada para ser 5 e 50 μM. As bombas foram condicionadas para uso por >40 horas a 37°C antes do implante nos animais. Ratos fêmeas Long Evans receberam analgesia pré- operatória e tranqüilizantes e foram anestesiados com isoflurano (3% em O2).
[000509] Os ratos foram colocados em uma estrutura estereotáxica e o córtex motor foi exposto para infusão do agente traçador BDA (10.000 MW) bilateralmente. Os ratos foram então submetidos a he- missecção dorsal da medula espinhal em T5-T6 seguida pelo implante de cateter intratecal e do sistema de bomba para liberar o composto de teste (n=11 por grupo).
[000510] Os ratos foram deixados se recuperar e sobreviver por até 28 dias após a cirurgia. A avaliação comportamental usando o sistema BBB foi registrada por 28 dias após a indução da lesão, pouco antes do término da fase "em vida" do estudo. Depois da perfusão e fixação, as medulas espinhais foram removidas, crio-protegidas, secionadas, coradas e as contagens de axônios realizadas.
[000511] A escala de classificação locomotora de Basso-Beattie- Bresnahan (BBB) (Basso et al., Neurotrauma 13:343-359 (1996)), o teste do plano inclinado e o teste de caminhada sobre grade inclinada (Li & Strittmatter, J Neurosci. 23:4219-27 (2003)) foram monitorados em ratos e camundongos após a lesão. Para o teste do plano inclinado, foi medido o ângulo máximo no qual uma placa de 50 cm x 60 cm poderia ser inclinada por 5 seg sem que o camundongo escorregasse. Para a caminhada sobre grade inclinada, os camundongos foram treinados a escalar uma grade de arame (35 cm de comprimento com quadrados de 2,54 cm) em uma inclinação de 45 graus. O número de vezes nas quais a pata traseira caiu abaixo do plano da grade foi registrado para cada excursão da base ao topo. Para o teste comporta- mental do rato, a escala locomotora de BBB, caminhada na grade e análise de impressão plantar foram realizadas. Para a caminhada na grade, os ratos foram treinados a andar sobre uma grade de arame (70 cm de comprimento com quadrados de 2,54 cm) e o número de vezes nas quais a pata traseira caiu abaixo do plano da grade foi contado. Para análise de impressão plantar, os padrões de marcha das patas traseiras do rato foram registrados com tinta durante uma locomoção contínua ao longo de uma pista de 90 cm e o comprimento da passada de cada lado e a largura da passada foram calculados (Metz et al, Brain Res. 883:165-177 (2000)). Todos esses testes comporta- mentais foram realizados em pelo menos dois indivíduos. Durante toda a cirurgia, teste comportamental e análise histológica, os pesquisadores não estavam a par da identidade do composto na minibomba.
[000512] sNogoR310-Fc promoveu recuperação funcional (Fig. 12).
EXEMPLO 13 ENSAIO DE CONTUSÃO DE MEDULA ESPINHAL DE RATO
[000513] O efeito de polipeptídeos e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 sobre os neurônios in vivo são testados em um ensaio de contusão de medula espinhal de rato.
[000514] Ratos fêmeas Long Evans hooded (170-190 g) são tratados profilaticamente com agentes analgésicos e antibióticos. Dez minutos antes da cirurgia, os animais são tranqüilizados com 2,5 mg/kg de Midazolam i.p. e anestesiados com isoflurano 2-3% em O2. Os ratos são então raspados, limpos com álcool e betadina e um lubrificante ocular é aplicado aos seus olhos. Depois, uma incisão é feita abaixo da linha média e as vértebras de T7 a T12 são expostas.
[000515] Uma laminectomia dorsal é realizada em T9 % e T10 para expor a medula. O rato é colocado sobre o Impactor. Os segmentos de T7 e T8 são primeiro pinçados e então os segmentos T11 e T12 são ligados à pinça caudal. Um material macio é colocado debaixo do tórax do rato. A haste do Impactor é ajustada na posição zero e o grampo de aterramento elétrico é ligado na borda da lesão. A haste do Impactor é então elevada para 25,0 mm e ajustada apropriadamente para uma posição diretamente acima da medula espinhal exposta. A seguir, a haste do Impactor é liberada para atingir a medula exposta e a haste do Impactor é imediatamente elevada.
[000516] O rato é então retirado do aparalho e Gelfoam® é colocado sobre a lesão. O músculo sobre a lesão é suturado e a incisão é fechada cirurgicamente. Os animais são colocados em uma incubadora até que eles se recuperem da anestesia. São dados antibióticos, analgésicos e solução salina, se necessário, aos ratos. As bexigas são esvaziadas a cada manhã e tarde até que a função seja recuperada.
[000517] Proteína de fusão solúvel do receptor Nogo-1 (por exemplo, sNogoR310-Fc) é administrada intratecalmente como descrito no modelo de transecção de medula espinhal de rato acima. A avaliação de BBB é realizada um dia após a cirurgia, e então a cada semana até 4 a 6 semanas.
EXEMPLO 14 EXPRESSÃO DE SNOGOR310 EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS
[000518] Foram produzidos camundongos transgênicos que expressam a proteína de receptor Nogo-1 solúvel para testar seu efeito quando expressa in vivo.
[000519] Foi clonado o cDNA sNogoR310 de camundongo (correspondendo aos aminoácidos de 1-310 do receptor Nogo-1) no sítio de NotI do vetor C-3123. Nesse vetor, a expressão de sNogoR310 está sob o controle dos elementos regulatórios do gene da proteína ácida fibrilar da glia (gfap), que permitem alto nível de expressão com secre ção aumentada dos astrócitos reativos no local da lesão. Foi digerido o vetor resultante seqüencialmente com AatII e Sfil e o constructo gfap::sNogoR310 em um fragmento de 3,4 kb. Foi microinjetado esse fragmento em embriões para gerar camundongos transgênicos. Foi verificado por PCR que o transgene tinha se integrado e identificados cinco linhagens originais. Foram cruzados machos heterozigotos das duas linhagens originais com os níveis mais altos de expressão com fêmeas de camundongos C57BL/6J. Foi confirmado que as células positivas para GFAP expressam e secretam sNogoR310 em camundongos transgênicos heterozigotos por análise de Western blot usando o anticorpo criado contra o receptor Nogo-1.
[000520] Foi homogeneizado o córtex e a medula espinhal em solução salina tamponada com Tris suplementada com inibidores de protease (Roche) e centrifugado o material homogeneizado a 40.000 rpm por 20 min a 4°C. Foi tratado o sobrenadante com paraformaldeído 4% por 20 min para aumentar a especificidade do anticorpo e dialisado antes do immunoblotting. Foi homogeneizada a fração particulada por sonicação em tampão RIPA (Triton® X-100 1%, desoxicolato de sódio 0,5%, SDS 0,1% em PBS), centrifugado o material homogeneizado resultante e tratados esse sobrenadante (fração particulada solúvel em detergente) como acima. Foram analisados 20 μg de proteína de cérebro ou medula espinhal por immunoblot usando anti-soro de coelho criado contra o receptor Nogo-1 em diluição de 1:2000. Foi visualizada a imunorreatividade pela incubação com IgG anti-coelho conjugada com AP e substratos de AP NBT/BCIP.
[000521] Foi detectada sNogoR310 de 37 kDa secretada nos extratos solúveis livres de detergente de córtex e medula espinhal de duas linhagens transgênicas Tg08 e Tg01, mas pouca proteína de receptor de Nogo-1 solúvel com 37 ou 81 kDa está presente nos camundongos selvagens (WT) da prole. O exame das frações particuladas demons trou que havia níveis comparáveis de receptor Nogo-1 endógeno em ambos os camundongos WT e transgênico.
EXEMPLO 15 EXPRESSÃO DE SNOGOR310 EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS APÓS LESÃO
[000522] Foi testado o efeito da lesão do CNS sobre a expressão de sNogoR310 em camundongos transgênicos pela realização de uma lesão de hemissecção dorsal. Nós obtivemos animais transgênicos e não-transgênicos para sNogoR310 de controle pelo cruzamento de machos heterozigotos com fêmeas C57/BL6 como descrito no Exemplo 14.
[000523] Foram anestesiados profundamente camundongos fêmeas adultas trasngênicas heterozigotas ou WT da prole (10-16 semanas de idade) e realizamos uma laminectomia completa, expondo completamente a parte dorsal da medula espinhal nos níveis de T6 e T7. Foi realizada uma hemissecção dorsal em T6 com uma agulha de 30 gauge e um par de microtesouras para separar completamente os tratos corticoespinhais (CSTs) dorsal e dorsolateral. Foi passada uma agulha marcada por toda a parte dorsal da medula espinhal diversas vezes para assegurar que a lesão estava em uma profundidade de 1,0 mm. Foram suturadas as camadas musculares sobre as laminectomias e fechadas a pele do dorso com grampos cirúrgicos. Para sinalizar os tratos corticoespinhais, foi feita uma trepanação sobre o córtex cerebral do lado direito do crânio 14 dias após a lesão da medula espinhal. Foi aplicado o traçador BDA (MW 10.000, PBS 10%) (Molecular Probes, Eugene, OR) em 4 sítios de injeção em uma profundidade de 0,7 mm a partir da superfície cortical. Quatro semanas após a lesão, os camundongos foram perfundidos transcardialmente com PBS, seguido por paraformaldeído 4%. Camundongos usados para experimentos de expressão de sNogoR310 não receberam nenhuma injeção de traça- dor.
[000524] Para os camundongos usados na análise de Western blot, a medula espinhal no nível entre T3 e L3 foi coletada sem perfusão 14 dias após a lesão. Camundongos usados para coloração imunohistoquímica de receptor Nogo-1 foram perfundidos com paraformaldeído 4% 10 dias após a hemissecção e a medula espinhal lesada foi removida para realização de cortes. Para examinar a expressão de sNo- goR310 no cérebro lesado de camundongos transgênicos e WT, uma lesão perfurante no córtex foi realizada com uma lâmina de bisturi número 11 presa em um aparelho estereotáxico (David Kopf, Tujunga, CA). Um corte parassagital de 4 mm foi feito, 0,5 mm posterior ao Bregma, 1,5 mm lateralmente à linha média e com profundidade de 3,5 mm.
[000525] Foram detectados níveis aumentados de sNogoR310 em extratos solúveis de medulas espinhais dez dias após a lesão em camundongos transgênicos mas não em camundongos WT, de forma compatível com a regulação positiva após a lesão de GFAP em torno da lesão. Para confirmar que isso não era devido à regulação positiva compensatória de Nogo-A, foi testada sua expressão e descoberto que ela era similar no córtex e medula espinal intactos ou lesionados tanto de camundongos transgênicos como WT.
[000526] Foi examinada a expressão celular de sNogoR310 no CNS lesionado por imunomanchamento do cérebro e medula espinhal lesionados contendo a área de lesão com anticorpos contra receptor No- go-1 e GFAP. A morfologia geral da glia astrocítica não difere entre camundongos WT e transgênicos, mas a densidade corada para o receptor Nogo-1 nos espaços intra e extracelular é acentuadamente maior nos camundongos transgênicos para gfap::sNogoR310 do que em camundongos WT, indicando expressão aumentada de sNo- goR310 em torno da lesão em camundongos transgênicos. A proteína do receptor Nogo-1 está co-localizada com o marcador astrocítico de GFAP apenas em camundongos transgênicos. Também há uma coloração não-celular difusa bastante aumentada nas amostras transgêni- cas, o que é compatível com sNogoR310 no espaço extracelular. A coloração do receptor Nogo-1 do corpo da célula neuronal é detectada tanto nos camundongos WT como transgênicos.
EXEMPLO 16 SNOGOR310 SECRETADO INDUZ BROTAMENTO DE CST EM CA-MUNDONGOS TRANSGÊNICOS
[000527] Foi testado se a expressão aumentada de sNogoR310 em torno da lesão em camundongos transgênicos resulta na regeneração de axônios lesados.
[000528] Foi investigada a integridade dos tratos corticoespinhais descendentes (CST) por injetar traçador anterógrado biotina dextran amina (BDA) no córtex motor direito como descrito em Li & Strittmatter, J. Neurosci. 23:4219-27 (2003). Em camundongos WT da prole, o CST dorsal (dCST) proeminente está bem compactado em sentido rostral à lesão e algumas fibras dorsolaterais do CST são visíveis ipsilateral- mente. Um pequeno número de brotos colaterais curtos marcados com BDA projeta-se na matéria cinzenta. Particularmente, na medula ventral, mas o brotamento é amplamente confinado ao lado da medula contralateral à injeção do traçador. Entretanto, os cortes da hemissecção rostral até dorsal de camundongos transgênicos sNogoR310 lesionados indicam um padrão de marcação com BDA muito diferente. Uma grande densidade de fibras de CST rotuladas com BDA é observada do lado de fora do dCST proeminente em todos os camundongos transgênicos da linhagem Tg08 ou linhagem Tg01. Fibras ectópicas estendem-se através da área da substância cinzenta e algumas fibras alcançam a substância branca lateral e dorsolateral. Várias fibras (4-12 brotamentos por corte transversal) são vistas sobre o lado oposto da medula espinhal (ipsilateral ao sítio de injeção do traçador). Medida microdensitométrica dos brotamentos colaterais indica um aumento de aproximadamente dez vezes na densidade de brotamento em camundongos transgênicos sNogoR310. O exame de cortes longitudinais pa- rasagitais de 1 a 4 mm rostral à lesão revela que as fibras de dCST estendem em um grande número de brotamentos ramificados para dentro da área da substância cinzenta ventral em camundongos transgênicos sNogoR310, ao contrário dos animais WT da prole. Geralmente, o padrão e a extensão de brotamento rostral à lesão em camundongos transgênicos são similares àqueles observados nos camundongos tratados sistemicamente com o peptídeo antagonista de receptor Nogo-1 NEP1-40 (Li & Strittmatter, J. Neurosci, 23:4219-27 (2003)).
[000529] Esses resultados demonstram que sNogoR310 secretado induz brotamento no CST em camundongos transgênicos.
EXEMPLO 17 REGENERAÇÃO DE AXÔNIOS DE CST CONTORNANDO O SÍTIO DA LESÃO NA MEDULA ESPINHAL DISTAL EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS SNOGOR310
[000530] Foi isolada medula espinhal 4 mm rostral e 4 mm caudal ao sítio da lesão (8 mm de extensão no total) de camundongos transgênicos e incluída em uma matriz de albumina polimerizada com glutaral- deído e cortada parasagitalmente em um vibrátomo (espessura de 30 μm). Foram coletados cortes transversais (50 μm) da medula espinhal entre 5-7 mm rostral e 5-7 mm caudal ao local da lesão. Para experimentos de injeção de sNogoR310-Fc em ratos, a medula espinhal que se estende de 10 mm rostral a 10 mm caudal ao local da lesão foi cortada parasagitalmente (50 μm) em um micrótomo vibratório. Cortes transversais foram coletados da medula espinhal entre 11-16 mm rostral e 11-16 mm caudal ao local da lesão. Foram incubados os cortes com complexo avidina-biotina-peroxidase e visualizados o traçador BDA por uma reação de HRP com diaminobenzidina intensificada por níquel (Grandpre, Nature 417:547-551 (2002)). Foram processados alguns cortes para imunohistoquímica para serotonina (anticorpo anti- 5-HT) por imunofluorescência indireta. Para visualizar a área de lesão, foram corados duplamente alguns cortes com anticorpos direcionados contra GFAP (Sigma®, St. Louis, MO). Foram montados, desidratados e cobertos os cortes com meio de montagem.
[000531] Foi testado se as fibras induzidas por sNogoR310 expresso em camundongos transgênicos após a lesão (veja Exemplo 16) cruzam a área de lesão na medula espinhal caudal para fornecer recuperação funcional.
[000532] Cortes parasagitais consecutivos ao longo do local da lesão delineadas em câmera lúcida apresentam o padrão de distribuição global das fibras de CST em regeneração a alguns milímetros da lesão. Cortes provenientes de camundongos WT não mostram fibras de CST se estendendo além do local da lesão. Cortes similares provenientes de camundongos transgênicos sNogoR310 apresentam várias fibras de CST que cruzam a área de corte transversal e se projetam para dentro das áreas de substância cinzenta e branca distais em um padrão altamente ramificado. Imediatamente rostral à hemiseção, uma alta densidade de brotamentos de CST marcados com BDA originados de dCST proeminente projeta-se na área de lesão, mas a maioria dos brotos de CST não conseguem passar pela área do corte transversal onde a formação de cicatriz e cavitação tecidual são importantes. Uma fração pequena, mas altamente significativa de axônios em regeneração ultrapassa o local da lesão através de pontes de tecido remanescente das substâncias cinzenta e branca ventrais e ventrolaterais. Além disso, algumas fibras de CST parecem cruzar a área de corte transversal em si através da medula espinhal lesionada dorsal e dorsolateral para dentro de regiões distais. Nas proximidades da lesão, o curso de fibras em regeneração era tipicamente tortuoso e muito distinto das fibras retas normais no CST rostral. Fibras colaterais e arborizadas são mais freqüentemente vistas na área da substância cinzenta da medula espinhal distal. As reconstruções demonstram 5 a 15 fibras em regeneração marcadas com BDA passando no eixo rostral- caudal em qualquer nível 1 a 4 mm caudal à lesão em cada camundongo transgênico. Para os cortes transversais 5-7 mm caudal à hemi- seção dorsal, axônios de CST marcados com BDA são vistos tanto nas áreas de substância cinzenta como de substância branca em cada camundongo transgênico.
EXEMPLO 18 EXPRESSÃO TRANSGÊNICA DE SNOGOR310 MELHORA A RE-CUPERAÇÃO LOCOMOTORA
[000533] A análise com traçador e da fibra serotoninérgica de axônios de CST indica que o sNogo310 liberado dos astrócitos em camundongos transgênicos estimula intensa regeneração anatômica de axônios descendentes lesionados na medula espinhal. Nós realizamos vários testes de comportamento como descrito no Exemplo 12 para determinar se essas fibras regeneradas beneficiam a recuperação funcional.
[000534] Como avaliado pelo teste de BBB, os camundongos WT recuperam parcialmente a função locomotora durante um período de sobrevivência de 4 semanas. 4 semanas após a lesão, a maioria dos camundongos WT se recuperou a um nível caracterizado por passada plantar regular com suporte de peso consistente, mas eles exibiam coordenação dos membros dianteiros e traseiros apenas ocasional a fre- qüente, com uma rotação da posição predominante da pata ao fazer o contato inicial com a superfície. Ao contrário, os escores de BBB de camundongos transgênicos sNogoR310 de ambas as linhagens Tg08 e Tg01 são significativamente maiores do que o grupo de controle ao longo de um período de observação de 7 a 28 dias (Figs. 13A e 13B). 28 dias após a lesão, a maioria dos camundongos transgênicos mostra coordenação dos membros dianteiros e traseiros consistente e o posicionamento predominante da pata é paralelo ao corpo.
[000535] Foram empregados mais dois testes de comportamento para caracterizar adicionalmente o desempenho de camundongos transgênicos sNogoR310. Primeiro, foi medido o ângulo máximo no qual uma placa poderia ser inclinada sem que um camundongo perdesse sua firmeza dentro de 5 seg. Antes da lesão de hemiseção dorsal, tanto os camundongos transgênicos como WT podem sustentar sua postura sobre uma placa inclinada em 55 graus. Nos dias 7 a 28 após a lesão, o ângulo sustentável está reduzido em todos os camundongos, mas os ângulos sustentáveis pelos camundongos transgênicos são significativamente maiores do que aqueles para o grupo de controle (Fig. 13C). No outro teste de comportamento, os camundongos escalaram uma grade colocada em um ângulo de 45 graus com a vertical e as excursões dos membros posteriores abaixo do plano da grade foram contadas (Metz et al., Brain Res. 883:165-177 (2000)). Nenhum camundongo cometeu erros nesse teste durante o treinamento pré- lesão. Há vários erros de falha da colocação do pé com melhora apenas mínima em camundongos WT durante o período de 2 a 6 semanas após a lesão. Ao contrário, os camundongos transgênicos sNo- goR310 exibem uma melhora progressiva na escalada da grade durante esse período, com a maior parte da melhoria ocorrendo entre 1 a 3 semanas após a lesão (Fig. 13D). Assim, camundongos transgênicos que secretam sNogoR310 de astrócitos exibem regeneração de CST, brotamento da rafe espinhal e função motora melhorada após hemiseção de medula espinhal torácica.
EXEMPLO 19 ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE PROTEÍNA SNOGOR310-FC INDUZ BROTAMENTO DE CST
[000536] Como um segundo teste do benefício de promoção de crescimento de receptor Nogo-1 solúvel após trauma espinhal, a proteína purificada intratecalmente foi administrada.
[000537] O domínio de ligação do ligante (27 a 310) de receptor No- go-1 de rato com o domínio de Fc de IgG1 de rato foi fundido para promover a estabilidade e purificação. A proteína foi transfectada a partir de células CHO estavelmente transfectadas. Essa proteína bloqueia Nogo-66, MAG e a ação da mielina in vitro, como mostrado anteriormente para sNogoR310-Myc His de camundongo (Fournier et al., J Neurosci. 22:8876-8883 (2002); Liu et al, Science 297:1190- 1193 (2002)). A proteína sNogoR310-Fc foi liberada intratecalmente a ratos com uma lesão de hemissecção dorsal médio-torácica através de uma minibomba osmótica. Durante um período de sobrevivência de quatro semanas após a lesão, 1,2 mg de proteína sNogoR310-Fc foram administrados localmente em cada rato. Nos ratos que recebem tratamento com veículo (1,2 mg de IgG de rato), os cortes rostrais à hemi- seção mostram o CST dorsal proeminente bem compactado e muito poucas fibras de CST ectópicas marcadas com BDA acima do local da lesão. Os cortes rostrais à lesão de ratos lesionados que recebem a proteína sNogoR310-Fc exibem um padrão bem diferente de marcação. Várias fibras ectópicas brotando do CST marcado com BDA são observadas a partir de cortes transversais e parassagitais. Em alguns casos, as projeções cruzam a área do dCST próxima a linha média até a circunferência da medula, tornando-se entremeadas com o CST dorsolateral. Os brotamentos axonais se estendem através da substância cinzenta por uma extensão maior do que na substância branca. Uma medida de brotamentos de fibras ectópicas (>100 μm em cortes transversais, >200 μm em cortes sagitais) adjacentes ao dCST revela um grande aumento nos ratos tratados com sNogoR310-Fc.
EXEMPLO 20 AXÔNIOS DE CST SE REGENERAM NA MEDULA ESPINHAL DORSAL EM RATOS TRATADOS COM SNOGOR310-FC
[000538] Os ratos Sprague-Dawley fêmeas foram anestesiados pro-fundamente (190 a 250 g) e conduzidos laminectomias nos níveis medulares de T6 a T7, expondo a medula espinhal. A metade dorsal da medula espinhal foi cortada com uma agulha de 30 gauge e um par de microtesouras para separar as partes dorsais dos tratos de CSGT e garantiu-se a profundidade da lesão (1,8 mm) pela passagem da parte afiada de uma lâmina número 11 ao longo da metade dorsal da medula (Grandpre et al, Nature 417:547-551 (2002)). Uma minibomba os- mótica (Alzet® 2ML4, volume de 2 ml, 2,5 μl/h, liberação por 28 dias), que foi preenchida com 1,2 mg de IgG de rato em PBS ou 1,2 mg de proteína de fusão sNogoR310-Fc em PBS, foi suturada aos músculos sob a pele no dorso dos animais. Um cateter conectado à saída da minibomba foi inserido no espaço intratecal da medula espinhal no nível de T7 a T8 através de um pequeno orifício na dura máter.
[000539] A infusão da proteína antagonista de receptor Nogo-1 induziu intenso brotamento rostral a uma hemiseção de rato, mas uma questão mais crítica é se as fibras de CST brotando projetam-se para a medula espinhal distal e contribuem para a recuperação locomotora. Cortes longitudinais através do local da lesão de ratos tratados com veículo não apresentam ou apresentam um número muito pequeno de fibras ventrais de CST marcadas com BDA abaixo do nível da lesão (Grandpre et al, Nature 417:547-551 (2002); Weidner et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:3513-3518 (2001)). Os cortes similares de ratos tratados com sNogoR310-Fc demonstram muitas fibras marcadas com BDA contornando o local de transecção e se projetando para a medula espinhal caudal amplamente através de pontes teciduais de medula espinhal ventral e ventrolateral. A imunocoloração para o marcador astrocítico GFAP mostra que a extensão da transecção chegou mais fundo do que a área do canal central. Diferente do perfil linear das fibras rostrais no CST dorsal proeminente, as fibras regeneradas do CST geralmente seguem uma trajetória altamente ramificada na medula espinhal distal, particularmente na área da substância cinzenta. Essas fibras são detectadas em diversas regiões da medula espinhal, mas elas são mais facilmente vistas na parte central e na metade dorsal da medula espinhal por toda a medula espinhal. Contagens de fibras de CST dos cortes sagitais indicam aproximadamente 20 axônios marcados com BDA 1 a 2 mm caudal à lesão e 15 axônios traçados 7 a 8 mm distal à lesão de cada rato tratado com sNogoR310-Fc.
[000540] Geralmente, o padrão de ramificação dessas fibras é similar àquele observado nos animais tratados com o peptídeo NEP 1-40 local, mas mais ramificações colaterais em cada brotamento são vistas a partir dos cortes tratadas com a proteína sNogoR310-Fc. Uma medida dos brotamentos da medula espinhal distal demonstra que o comprimento colateral total de cada brotamento em ratos tratados com sNo- goR310-Fc é duas vezes maior do que aquele dos animais tratados com NEP 1-40. O número de brotamentos (>200 μm de comprimento) localizados 1 a 10 mm caudal à medula espinhal em ambos os grupos tratados com antagonista de receptor Nogo-1 é aproximadamente 20 a 40 vezes maior do que nos grupos de controle. Mais brotamentos são vistos em ratos tratados com sNogoR310-Fc do que com o tratamento local com NEP 1-40 (~50 vs. 25 brotamentos /rato), mas essa diferença não é estatisticamente significativa (p=0,1713, teste-t).
[000541] Axônios de CST em regeneração são observados em cortes transversais de medula espinhal 11 a 15 mm caudal à hemiseção em ratos que recebem tratamento com sNogoR310-Fc. Essas fibras são detectadas tanto na substância cinzenta como na substância branca da medula espinhal. As fibras detectadas na substância cinzen- ta exibem freqüentemente mais ramificações colaterais do que na área da substância branca. Em contraste, em cortes transversais do grupo tratado com veículo, marcações com BDA apenas ocasionais são vistas na área da substância branca ventral, de forma compatível com os axônios de CST ventral não lesionados. No nível mais distal da medula espinhal, o número médio de fibras do CST marcadas com BDA em ambos os grupos tratados com antagonista de receptor Nogo-1 [sNo- goR310-Fc e NEP 1-40] é aproximadamente 20 vezes maior do que o de ratos tratados com veículo. Tomados juntos, ambos os antagonistas de receptor Nogo, proteína sNogoR310-Fc e peptídeo NEP 1-40, resultam em regeneração dramática de axônios do CST na medula espinhal distal, mas o brotamento induzido pelos anteriores exibe um padrão mais altamente ramificado.
EXEMPLO 21 SNOGOR310-FC LOCAL INDUZ BROTAMENTO DE AXÔNIOS RU- BROESPINHAIS E SEROTONINÉRGICOS EM MEDULA ESPINHAL NÃO LESIONADA DE RATO
[000542] Quatorze dias após a hemiseção, foi feita uma trepanação de cada lado do crânio sobre o córtex senso-motor dos membros inferiores para sinalizar fibras do CST. O traçador neuronal anterógrado BDA (10% em PBS, 3,5 μl por córtex) foi aplicado em sete sítios de injeção em uma profundidade de 1,5 mm da dura máter de cada lado (Grandpre et al., Nature 417:547-551 (2002)). Para o traçamento do trato rubroespinhal em ratos, o traçador BDA (1 μl; MW 10.000; 10% em PBS) foi injetado no núcleo rubro do lado esquerdo (5,8 mm posterior ao bregma, 0,7 mm lateral, 7,0 mm ventral à superfície do crânio). Duas semanas após a injeção de BDA, esses animais foram perfundidos com PBS, seguido por paraformaldeído 4% e o tecido foi coletado para histologia.
[000543] O reparo das fibras lesadas do trato rubroespinhal (RST) contribui para melhorias funcionais após lesão de medula espinhal (Liu et al., J. Neurosci., 19:4370-4387 (1999)). A distribuição disseminada de receptor Nogo-1 em neurônios do CNS (Wang et al., J. Neurosci. 22:5505-5515 (2002)) torna possível que a inibição de receptor Nogo-1 com seu antagonista possa resultar em crescimento de axônios de RST após lesão. Para testar os efeitos de sNogoR310-Fc sobre RST lesionado, a integridade dessa via foi traçada por injetar BDA no núcleo rubro esquerdo. No nível da medula espinhal, as fibras de RST estão localizadas normalmente na área da substância branca dorsolateral da medula espinhal e são cortadas transversalmente pelas hemi- seções dorsais desse estudo. Nos cortes transversais 11 a 15 mm rostral à lesão dos ratos de controle, um pequeno número de fibras curtas marcadas com BDA é visto entre RST proeminente e a substância cinzenta do corno dorsal. Cortes no mesmo nível em ratos tratados com sNogoR310-Fc exibem muitas fibras de ligação entre o RST principal e a substância cinzenta do corno dorsal. Cortes transversais 11 a 15 mm distal ao SCI, não exibem fibras de RST marcadas com BDA em ratos tratados com veículo. Em contraste, cortes no mesmo nível recebendo tratamento com sNogoR310-Fc apresentam várias fibras de RST marcadas com BDA tanto na substância cinzenta como branca contralateral à injeção do traçador. Alguns brotamentos com um padrão de ramificação são vistos na substância cinzenta ipsilateral à injeção de BDA.
[000544] Fibras rufe-espinhais também foram examinadas em ratos com medula lesionada tratados com sNogoR310-Fc. Imunomancha- mento demonstrou que a densidade de fibras serotoninérgicas 11 a 15 mm rostral à lesão é similar entre grupos tratados com veículo e com sNogoR310-Fc. Nos cortes 11 a 15 mm abaixo da lesão, as fibras serotoninérgicas em ratos tratados com sNogoR310-Fc são duas vezes mais numerosas do que aquelas do grupo de controle. Esses resultados demonstram que a responsividade à inibição do receptor Nogo-1 pela proteína sNogoR310-Fc não é limitada à fibras de CST e que outros tratos descendentes, tais como os axônios rubroespinhais e sero- toninérgicos, também são responsivos ao antagonismo do receptor Nogo-1.
EXEMPLO 22 TRATAMENTO LOCAL COM SNOGOR310-FC MELHORA A RECU- PERÇÃO FUNCIONAL EM RATOS
[000545] Administração intratecal de proteína sNogoR310-Fc estimula a regeneração de axônios em várias vias descendentes após lesão traumática da medula espinhal. Foi testado se a proteína também melhora a recuperação funcional na medula espinhal lesada.
[000546] Duas semanas após a hemiseção, a avaliação locomotora de BBB em ratos tratados com veículo atinge um nível estável de 12 (Fig. 14A). Quatro semanas após a lesão, a maioria dos controles (6 de um total de 7) tem passos plantares com suporte de peso de fre- qüência regular e coordenação de membros anteriores e posteriores de freqüência regular, mas eles têm uma rotação do posicionamento predominante da pata ao fazer o contato inicial com a superfície. Ao contrário, em ratos que estavam receberendo tratamento com proteína sNogoR310-Fc, a avaliação locomotora continua a melhorar mesmo entre 2 a 4 semanas após o trauma. Quatro semanas após a lesão, todos os 9 animais tratados com sNogoR310-Fc tinham uma coordenação de membros anteriores e posteriores regular e um posicionamento das patas paralelo no contato inicial com a superfície do teste.
[000547] Caminhada na grade foi usada para avaliar os déficits no controle motor fino descendente após lesão da medula espinhal (Metz et al, Brain Res. 883:165-177 (2000)). Esse desempenho requer coordenação dos membros anteriores e posteriores e controle de movimento voluntário mediado pelas fibras ventrolaterais, corticoespinhais e rubroespinhais. Durante o treinamento pré-lesão, todos os ratos co- locaram seus membros posteriores corretamente sobre as barras da grade. 2 a 4 semanas após a lesão, os ratos de controle fazem 8 a 9 erros por sessão com apenas uma melhora mínima com o tempo. Ao contrário, os ratos tratados com sNogoR310-Fc exibem uma melhora progressiva ao caminhar na grade e fazem significativamente menos erros (4 a 7 por sessão em média). A maioria da melhora ocorre 2 a 3 semanas após a lesão. Análise das pegadas das patas traseiras no grupo de controle mostra que a distância entre os passos é significativamente reduzida e a largura dos passos é aumentada 4 semanas após a hemi-seção, em comparação com ratos não lesados ou animais lesados que estavam recebendo tratamento com sNogoR310-Fc (Fig 14C). Portanto, esses múltiplos testes comportamentais demonstram que o bloqueio da função do receptor Nogo-1 com a injeção local de proteína antagonista melhora a recuperação locomotora após lesão.
EXEMPLO 23 LIGAÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-NGR1, 1D9, AO RECEPTOR NOGO 310 (SNGR310) SOLÚVEL DE RATO
[000548] Análises estruturais realizadas no complexo co-cristalino do Fab de 1D9 e um fragmento solúvel de NgR1 de rato (srNgR310) mostra que esse anticorpo se liga próximo à junção do cap N-terminal e domínio de repetição rica em leucina em NgR1 de rato. Figura 15. 1D9 se liga a NgR1 de rato e não reconhece NgR1, NgR2 nem NgR3 de humano ou camundongo. Para cristalização de srNgR310-Fc com Fab de 1D9, cada macromoléecula foi clivada com papaína e purificada a partir da porção Fc e armazenada em Hepes 10mM, ph 7, NaCl 50mM. O complexo foi preparado a 80μM cada, e misturados em uma proporção de volume de 2:1 com uma solução de reserva consistindo em 14% de Peg3350, Acetato de Zinco 0,4M, Cloreto de Magnésio 0,1M. A solução foi incubada a 20°C por 1 hr e centrifugada a 12.000 x g por 3 minutos para remover o precipitado. Os cristais foram formados por colocar 3-5 μL do sobrenadante sobre cavidades contendo 50% a 100% da solução de reserva a 20°C. Finos cristais semelhantes a uma placa foram formados durante um período de 1 semana a 20 °C. Os cristais foram crioprotegidos por transferi-los rapidamente para Acetato de Zinco 0,2M, 8% de Peg3350, 25% de etileno glicol por 2 min. e então congelados por transferência rápida para nitrogênio líquido.
[000549] Cristais com aproximadamente 10 μm de espessura difrata- ram para 3,2Â em linha de luz X25 na Fonte Nacional de Luz Síncro- ton (Upton, NY). Processamento dos dados com o pacote de programas HKL v. 1.97 (Otwinowski, Z., & Minor, W., Methods Enzymol 276:307-326 (1997)) revelou que os cristais pertencem a um grupo espacial P21212 e têm dimensões de célula aproximadas iguais a a=90,6 Â, b= 188,6Â, c=125,5Â e α=β=y=90, de forma compatível com 2 complexos Fab-NgR1 por unidade assimétrica.
[000550] A estrutura cristalina foi solucionada pela utilização da informação em experimentos de substituição isomórfica múltipla em cristais saturados para identificar sítios de mercúrio comuns ligados ao NgR junto com substituição molecular. O grupo espacial foi identificado por inspeção de mapas de Patterson de diferença isomórfica do mercúrio e do ouro nos quais um pico de 5 sigma consistente foi identificado na construção de Harker de w=0. Substituição molecular com MOLREP (Vagin, A., & Teplyakov, A., J. Appl. Cryst. 30:1022-1025 (1997)) utilizando um modelo de homologia de NgR de rato baseado na estrutura de NgR1 humano (código de pdb 1OZN) (He, X.L. et al, Neuron 38:111 (2003)) e um modelo de homologia para Fab de 1D9 levou a localização de uma molécula de NgR1, uma de Fab e uma se-gunda de NgR1 com um fator-R resultante de 48% e densidade clara para as regiões de CDR do FAb. A localização do modelo foi confirmada pelo mapeamento dos sítios de mercúrio identificados a partir de diferenças nos mapas de Patterson sobre posições equivalentes em ambas as moléculas de NgR1 próximo de Asp138 e His182. Nenhum fragmento Fab adicional foi claramente identificado na densidade. O refinamento dos dois NgR1 e 1 Fab usando CNX (Brunger, A. T. et al., Acta Crystattogr D Biol Crystallogr 54:905-921 (1998)) para uma resolução de 3,2 A ocorreu com um fator-R corrente de 42% e Rlivre de 46%.
[000551] A tabela 8 mostra os contatos entre Fab de 1D9 e NgR1 de rato. Os contatos nos quais os átomos de Fab estão dentro de uma distância de 3,9 A dos átomos em NgR1 de rato estão listados e aqueles contatos que poderiam formar uma ponte de hidrogênio com a cadeia principal ou com a cadeia lateral têm um asterisco associado (*). Tabela 8
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* indica interações de ponte de H
EXEMPLO 24 RASTREAMENTO DE RNAI DE NGR POR TRANSFECÇÃO TRAN SITÓRIA
[000552] Três constructos de RNAi foram desenhados contra o transcrito de NogoR1 humano (Figura 16A). RNAi-1 e RNAi-3 atingem especificamente o gene de NgR humano. RNAi-2 foi desenhado para atingir os genes de NgR de humano, camundongo e rato. Pares de oligonucleotídeos DNA foram sintetizados e construídos em um vetor de expressão de RNAi baseado no promotor de PolIII, pU6 que continha o promotor de U6 humano, o gene de resistência kar, e um sítio de clonagem PacI. Nogor 2m foi desenhado para carregar dois parea- mentos errados à seqüência alvo e serve como um controle negativo. As seqüências de nucleotídeo desses oligonucleotídeos são mostradas na Figura 16B.
[000553] Os constructos de RNAi foram rastreados inicialmente por co-transfectar o vetor de expressão de NgR humano junto com os plasmídeos de expressão de RNAi (phU6NgR-RNAi-1 , 2 e 3) em células L de camundongo. Células L de camundongo foram plaqueadas em placas de cultura de 6 cavidades e então transfectadas com plasmídeo repórter de GFP de controle sozinho ou com vetor de RNAi contra GFP, pU6GFPRNAi (raias 2 e 3). A expressão de GFP foi monitorada como um controle para o silenciamento do gene de GFP. Células L de camundongo foram transfectadas com 0,5, 1 ou 2 μg de vetor de expressão de hNgR (raias 4 a 6). A quantidade de DNA em cada cavidade foi ajustada para um total de 4 μg de DNA por adicionar plasmí- deo pUC19. A proporção RNAi:alvo foi de 4:1. Cinco microgramas de vetor de hNgR foram co-transfectados com 2 μg de plasmídeo de RNAi-1, 2, 3 ou 2m de NgR (raias 7 a 10). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas em tampão de corrida de SDS e submetidas à SDS-PAGE. A expressão de hNgR foi analisada por Western blot usando soro de coelho contra anticorpo de hNgR policlo- nal R150 (painel A) ou anticorpo monoclonal 7E11 (painel B).
[000554] Silenciamento eficaz da expressão de NgR foi observado em células transfectadas com phU6NgR-RNAi-1 e -2 e, Western blot usando os anticorpos de NgR 7E11 (monoclonal) e R150 (policlonal de coelho). Os resultados são mostrados na figura 17. a expressão de NgR foi reduzida para níveis basais em células transfectadas com RNAi -1 e -2 de NgR. Em contraste, RNAi-3 de NgR não mostrou nenhuma redução significativa de NgR, o que foi semelhante ao controle, RNAi-2m de NgR mutante. Portanto, RNAi-1 e -2 de NgR são eficazes no silenciamento do gene de hNgR. Os resultados de transfecção transitória demonstraram >90% de inibição da expressão de NgR.
EXEMPLO 25 CONFIRMAÇÃO DO SILENCIAMENTO DE NGR HUMANO
[000555] Embora os sinais detectados sejam específicos para hNgR (apenas em células transfectadas com cDNA de hNgR) com dois tipos de anticorpos (Figura 17), o MW aparente das bandas detectadas (~50 kD) foi menor do que o esperado. Apesar de não estar preso pela teoria, isso é provavelmente devido à glicosilação alterada de NgR humano em células L de camundongo. A fim de confirmar a observação sobre a discrepância no MW de NgR, transfecção de cDNA de hNgR foi realizada novamente em células SKN humanas e células 293 usando Lipofectina. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas em tampão de corrida de SDS e submetidas as SDS- PAGE. A expressão de NgR foi detectada por Western blot usando tanto 7E11 como R150, como descrito acima. Nenhum sinal específico de hNgR foi detectado nas células SKN ou 293 parentais e o MW aparente de hNgR detectado com R150 é o esperado em ambas as células SKN e 293, > 65kD (Figura 18).
[000556] O silenciamento de hNgR mediado por RNAi foi confirmado em células SKN. As células SKN foram plaqueadas em placas de cultura de 6 cavidades e então transfectadas com plasmídeo repórter de GFP de controle sozinho ou com vetor de RNAi contra GFP, pU6GFPRNAi (raias 2 e 3). A expressão de GFP foi monitorada como um controle para o silenciamento do gene de GFP. Células SKN foram transfectadas com 2 μg de vetor de expressão de hNgR (raia 4). A quantidade de DNA em cada cavidade foi ajustada para um total de 4 μ de DNA por adicionar DNA de plasmídeo pUC19. 0,5 μg de vetor de hNgR foi co-transfectado com 2 μg de plasmídeo de RNAi-1, 2, 3 ou 2m de NgR (raias 5 a 8). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas em tampão de corrida de SDS e submetidas a SDS-PAGE. A expressão de hNgR foi analisada por Western blot usando soro de coelho contra R150 de hNgR. Novamente, mais do que 90% de inibição de NgR foi demonstrada em todos os RNAi- 1 e 2 de NgR, mas menos eficiente de RNAi-3 e 2m de NgR (Figura 19).
EXEMPLO 26 ATENUAÇÃO DE NGR EM CÉLULAS NEUROSCREEN
[000557] Células NeuroScreen expressando NgR foram obtidas de Cellomics Inc. para análise de função de NgR. A fim de obter atenuação estável de NgR em células NeuroScreen, todos os constructos de RNAi foram convertidos em vetores lentivirais em estruturas principais de beta-gal ou de GFP. Uma representação esquemática do vetor len- tiviral é mostrada na Figura 20. Vetores lentivirais foram gerados por transecção de células 293 com plasmídeos de empacotamento (Invi- trogen). Para construir o vetor lentiviral para expressão estável de RNAi de NgR1, os cassetes de RNAi consistindo no promotor hU6 que direciona a expressão das moléculas em forma de grampo (isto é, No- go-1, Nogo-2, Nogo-2m, e Nogo-3) foram retirados do vetor phU6 (descrito no Exemplo 24) por digestão com PacI e clonados no único sítio de PacI de plasmídeos SSM007. Veja, por exemplo, métodos descritos em Robinson et al, Nature Genetics 33:401-406 (2003). Para sinalizar a transdução do vetor lentiviral, um cassetete de expressão de CBA-GFP ou um cassete de expressão de CMV-LacZ foram inseridos no plasmídeo SSM007 no sítio de XbaI, e os constructos resultantes foram chamados SSM007-BFGW e SSM007-BFZW, respectivamente.
[000558] Após converter os constructos de RNAi de NgR1 em estrutura principal de SSM007-BFGW e SSM007-BFZW, os vetores foram co-transfectados com plasmídeos de empacotamento, pLPl, pLP2 e pLP/VSVG em células FT293 para produção do vetor lentiviral (Viro- power kit, Invitrogen). pLPl é um constructo de 8889bp que contém a seqüência gag/pol de HIV-1 e o elemento de resposta rev (RRE) expressos a partir de um promotor de CMV e com uma poli-A de β- globina; pLP2 é um constructo de 4180 bp que expressa Rev a partir do promotor de RSV e com uma poli A de HIV-1 para terminar o transcrito; pLP/VSVG é um plasmídeo de 5821 bp e expressa glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular a partir do promotor de CMV e poli A de β-globina.
[000559] Devido ao efeito auto-limitante da interferência de RNAi ao título lentiviral, todas as titulações dos estoques virais eram menores do que os vetores lentivirais regulares, na faixa de 4 a 5x105 unidades de transdução no meio de cultura. Lentivetores de RNAi de NgR (RNAi LV-NgR) foram usados para transduzir células NeuroScreen em moi (multiplicidade de infecção) de 1. A eficiência da transdução foi de cerca de 1% como indicado por expressão de GFP ou marcação de beta- galactosidase.
[000560] Devido ao fato de RNAi-2 de NgR ter demonstrado ser eficaz no silenciamento de NgR e atingir todos os NgR de humano, camundongo e rato, RNAi-2 LV-NgR foi escolhido para transduzir as células NeuroScreen. As células transduzidas foram clonadas por diluição limitada em placas de 96 cavidades. Clones positivos para betagalactosidase ou GFP foram identificados e expandidos para análise de expressão de NgR adicional.
[000561] Cerca de 20 linhagens celulares clonadas foram analisadas quanto à expressão de NgR por Western blot usando o anticorpo monoclonal 7E11. O resultado de um Western blot típico é mostrado na Figura 21. GAPDH foi usado como controle para normalização da quantidade aplicada. A expressão de NgR em todos os clones foi quantificada por densitometria das bandas de NgR no western blot e normalizados para os níveis de GAPDH. A razão de NgR vs. GAPDH foi usada para medir os níveis de expressão de NgR. Dos 12 clones rastreados, 11 deles diminuíram a expressão de NgR (usando o clone que expressa menos NgR em células transduzidas com LV-GFP, 1E9, como referência). Ao contrário, todos os 4 clones que transduziram LV-GFP têm níveis de NgR comparáveis às células NeuroScreen nai- ves. Figura 22. Os resultados demonstram que linhagens celulares estáveis foram estabelecidas com expressão de NgR reduzida.
EXEMPLO 27 ANÁLISE FUNCIONAL DE CÉLULAS COM RNAI DE LV-NGR
[000562] Quatro clones a partir das células transduzidas com RNAi de LV-NgR para análises de função foram selecionados. Usando os níveis de NgR de células NeuroScreen naives como referência, os níveis de NgR desses quatro clones são de aproximadamente 10% para 3c12b, 20% para 3c4b, 30% para 5d12 e 60% para 4a12 das células naives, respectivamente (Figura 23).
EXEMPLO 28 MUTAÇÕES DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-NGR1, 1D9, PERMITEM O RECONHECIMENTO DE NGR1 HUMANO
[000563] Por modelagem computacional foi mostrado que mutações no anticorpo 1D9 permitem o reconhecimento de NgR1 humano. N56 da cadeia pesada de 1D9, através de modelagem computacional, pode ser mutado para serina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou gluta- mina para interagir com R78 de NgR1 humano. Além disso, R33 da cadeia leve pode ser mutada através de modelagem computacional para alanina ou serina para evitar os impactos eletrostáticos e estéri- cos com R95 de NgR1 humano.
EXEMPLO 29 ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO (27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DE RATO MAS NÃO A METILPREDNISOLONA REVERTEU O EFEITO INIBIDOR DO CRESCIMENTO DE NEURITO DA MIELINA EM CÉLULAS DO GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL
[000564] Ao investigar o tratamento combinado com metilprednisolona (MP) e NgR(310)ecto-Fc para lesão da medula espinhal (SCI), foi buscado verificar se esses reagentes têm mecanismos independentes de ação. Resumidamente, mielina foi seca durante a noite em placas pré-revestidas com poli-L-lisina (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) a 80 ou 400 ng/cavidade (2,5 e 12,7 ng/mm2, respectivamente). As cavidades foram então revestidas com 10 μg/ml de laminina (Calbio- chem, La Jolla, CA, USA) por 1 hora a temperatura ambiente (22 a 24°C). Neurônios do gânglio da raiz dorsal de embriões de pintos com 13 dias foram dissociados e plaqueados por 6 a 8 horas conforme descrito anteriormente (GrandPre et al., 2000; Fournier et al, 2001). Os neurônios foram tratados com NgR(310)ecto-Fc 8 μM na presença ou ausência de MP (Pharmacia, Kalamazoo, MI, USA) 10 μg/nl por todo o período de crescimento. Os neurônios foram então fixados e corados com anticorpo para βIII tubulina (Covance, Princeton, NJ, USA) e o crescimento dos neuritos foi quantificado usando um sistema automatizado de aquisição de imagem celular e análise (Axon Instrument, Union City, CA, USA). O crescimento dos neuritos por célula foi normalizado para a média de cavidades de controle em duplicata para cada experimento (n=3). A atividade de NgR(310)ecto-Fc se baseia na sua capacidade de reverter a inibição do crescimento axonal pela mielina. Figuras 24 A-B. Em contraste, MP sozinho não teve efeito sobre o crescimento de neuritos dos neurônios do gânglio da raiz dorsal sobre um substrato de mielina e a presença de MP não alterou o estímulo de crescimento dos axônios por NgR(310)ecto-Fc. Esses dados indicam que MP não influenciou diretamente a inibição do crescimento de neurito induzida por mielina e que MP e NgR(310)ecto-Fc têm ações inde-pendentes. Esses dados in vitro suportam a hipótese de que MP e NgR(310)ecto-Fc aumentarão a recuperação de SCI de uma forma seqüencialmente eficaz.
EXEMPLO 30 TRATAMENTO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR DE RATO (27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPREDNISOLONA TIVERAM UM EFEITO TEMPORALMENTE DISTINTO SOBRE A RECUPERAÇÃO FUNCIONAL APÓS TRANSECÇÃO DA MEDULA ESPINHAL
[000565] Ambos os tratamentos com MP e NgR(310)ecto-Fc tiveram um efeito temporalmente distinto sobre a recuperação funcional após transecção de medula espinhal. Resumidamente, ratos Long Evans fêmeas (7 semanas de idade; Charles River, Wilmington, MA, USA) foram anestesiados usando midazolam 25 mg/kg i.p. (Abort Laboratories, Chicago, IL, USA) e 2-3% de fluotano (Baxter, Deerfield, IL, USA) em O2 e uma laminectomia dorsal realizada no nível espinhal de T6 e T7. Anestesia geral foi mantida em 1,5-2% de fluotano em O2. Uma hemiseção dorsal foi realizada interrompendo completamente os com-ponentes do trato corticoespinhal (CST) dorsomedial maior e dorsolateral menor. Um microbisturi foi usado para cortar transversalmente estereotaxicamente a medula em uma profundidade de 1,8 mm a partir da superfície da medula. Imediatamente após a transecção de CST, um cateter intratecal foi inserido no espaço subaracnóide em T7 e conectado a uma minibomba osmótica condicionada inserida no espaço subcutâneo. As minibombas osmóticas liberaram proteína de controle isotípico de IgG de rato ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 mg/ml, n=8) ou NgR(310)ecto-Fc (50μM, n=19) em uma taxa de 0,25 μL/h. Uma coorte de ratos tratados com NgR(310)ecto-Fc (n=8) foi tratada também com MP (Pharmacia; 30 mg/kg iv) e uma coorte separada tratada apenas com MP (30 mg/kg iv) imediatamente após a lesão e novamente 4 e 8 horas depois. A recuperação funcional foi avaliada usando o método de avaliação de campo aberto de BBB (Basso et al, J. Neurotrauma 12:1-21 (1995)) no dia seguinte e semanalmente a partir disso. Os animais de controle recuperaram a função dos membros posteriores ao longo do curso do estudo atingindo um score de BBB médio de 12 ± 0,87 após 4 semanas. Escores de BBB médios para os grupos tratados no mesmo ponto de tempo foram MP, 14,9 ± 0,23; NgR(310)ecto-Fc, 14,8 ± 0,24 e NgR(310)ecto-Fc mais MP, 15,63 ± 0,18. Todos os grupos de tratamento mostraram escores de BBB melhorados em comparação com os controles ao longo do curso do estudo. P < 0/05 vs controle, ANOVA bidirecional para medidas repetidas com teste post-hoc de Tukey. (Figura 25A). Um aumento estatisticamente significativo no score de BBB foi observado em ratos tratados com MP e MP mais NgR(310)ecto-Fc um dia após a cirurgia em comparação com animais de controle ou animais tratados apenas com NgR(310)ecto-Fc. O score de BBB foi significativamente melhorado em ratos tratados com MP 2 dias após SCI. P < 0/05 vs controle, ANOVA bi-direcional para medidas repetidas com teste post-hoc de Tukey (Figura 25B). Essa observação indicou em efeito precoce do tratamento com MP sobre a recuperação. Dado esse efeito muito precoce de MP, os escores de BBB foram normalizados para o dia 2 para subtrair esse efeito precoce de MP (Figura 25C) ilustrando assim o início mais tardio do efeito de NgR(310)ecto-Fc. Os escores de BBB normalizados para o dia 2 para animais individuais ilustram uma melhora significativa na recuperação funcional em ratos tratados com NgR(310)ecto-Fc ± MP 2, 3 e 4 semanas após SCI. P < 0/05 vs controle, ANOVA bi-direcional para medidas repetidas com teste post-hoc de Tukey (Figura 25C). No grupo de tratamento de combinação os escores de BBB normalizados anularam o efeito intensificador de MP sobre o tratamento com NgR(310)(ecto)-Fc ilustrando que (i) no grupo de tratamento combinado o efeito de MP ocorreu precocemente após SCI e (ii) por subtrair esse efeito a taxa e extensão de recuperação funcional no grupo de tratamento combinado e no grupo de NgR(310)ecto-Fc foram idênticos e mais pronunciados do que o tratamento com MP sozinho.
[000566] Um ponto de discriminação no score de BBB é um score de 14, correspondendo a passos plantares com suporte de peso consistente e coordenação consistente de membros anteriores e posteriores. Freqüência de passada plantar consistente e coordenação de membros anteriores e posteriores, ilustrando a proporção de ratos em cada grupo que atingiram um score de 14 ou mais 3 e 4 semanas após SCI. Conseqüentemente, os resultados foram expressos como a freqüência com a qual os ratos atingiram um score de 14 ou mais; 50% de ratos de controle atingiram um score de 14 ou mais por 4 semanas após a lesão (Figura 25D). O tratamento combinado com NgR(310)ecto-Fc e MP melhorou significativamente a taxa de recuperação funcional. P < 0/05 vs controle, teste exato de Fischer. Todos os ratos (100%) trata- dos com NgR(310)ecto-Fc ou MP ou terapia combinada demonstraram passada plantar consistente e movimento coordenado por 4 semanas. A terapia de combinação aumentou a taxa de recuperação de função coordenada já que uma proporção significativamente maior desse grupo de tratamento atingiu um score de 14 ou mais por 3 semanas em comparação com controles ou NgR(310)ecto-Fc ou tratamento apenas com MP (Figura 25D). Recuperação funcional melhorada também foi demonstrada como comprimento de passada significativamente melhorado nos grupos tratados com NgR(310)ecto-Fc e NgR(310)ecto-Fc mais MP em comparação com os controles (Figura 25E). O tratamento com MP não melhorou significativamente o comprimento da passada medido 4 semanas após SCI. P < 0/05, ANOVA unidirecional com teste post-hoc de Dunnett.
EXEMPLO 31 TRATAMENTO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO (27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPREDNISOLONA AUMENTOU A PLASTICIDADE/REGENERAÇÃO AXONAL APÓS TRANSECÇÃO DE MEDULA ESPINHAL
[000567] O tratamento com NgR(310)ecto-Fc ou tratamento combinado com MP e NgR(310)ecto-Fc aumentou a plasticida- de/regeneração axonal após transecção de medula espinhal. Resumidamente, para traçamento histológico dos CSTs, 2 semanas após a transecção de CST os animais foram re-anestesiados e foi feita uma incisão no escalpo. A área em volta da incisão na pele foi injetada com um anestésico local, o córtex senso-motor esquerdo foi exposto através de craniotomia e 7 μL de biotina dextran amina (BDA; 10,000 MW; Molcular Probes, Eugene, OR, USA) 10% em PBS injetados usando um injetor de nanolitros e um micro controlador em 12 pontos 0 a 3,5 mm posterior ao Bregma e 0 a 2,5 mm lateral à linha medial em uma profundidade de 1 mm abaixo da superfície do córtex. Em alguns ca- sos, o CST foi marcado bilateralmente usando o mesmo procedimento.
[000568] 28 dias após a transecção de CST, os ratos foram aneste siados com inactina (100-110 mg/kg i.p.) e perfundidos transcardial- mente com solução salina heparinizada (100 ml, 10 iu de heparina) seguido por paraformaldeído 4% (150 ml). As medulas espinhais foram removidas, pós-fixadas em paraformaldeído 4% e então impregnadas com sacarose 30% por 48 horas; comprimentos de 25 mm de medula espinhal, 10 mm rostral e 15 mm caudal do local de transecção, foram incluídos em composto de temperatura de corte ótima (OCT) com segmentos transversais de medula tomados 10 a 15 mm rostral e 15 a 20 mm caudal à lesão.
[000569] Cortes congelados (50 μm) foram cortados seriadamente e corados com AlexaFluor-594 (1:200; Molecular Probes) conjugada com estreptavidina para visualizar os axônios de CST. As contagens dos axônios foram realizadas em cortes transversais tirados 10 e 15 mm caudal ao local de transecção. Todas as medidas foram realizadas de forma cega. Cada oitavo corte, isto é, cortes 400 μm distantes, foi contado para cada animal em cada nível da medula e os valores foram expressos como o número médio de axônios por corte.
[000570] Tratamento com NgR(310)ecto-Fc ou tratamento combinado com MP e NgR(310)ecto-Fc resultou em números significativamente maiores de axônios marcados com biotina dextran amina (BDA) contados 15 mm caudal ao local da lesão (Figura 26A). Axônios marcados com BDA pareceram brotar a partir das colunas dorsais para dentro da substância cinzenta do corno dorsal e CDT ventral poupado, projetando-se para dentro da substância cinzenta ventral. As contagens de axônios em regiões distintas da medula revelaram o maior aumento no número de axônios na substância cinzenta. O maior aumento nos números de axônios foi observado na matéria substância (GM) em comparação com a substância branca ventral (vWM) e subs tância branca dorsal (dWM) (Figura 26B). P < 0/05, ANOVA unidirecio- nal com teste post-hoc de Dunnett. Esses dados sugerem que o tratamento com NgR(310)ecto-Fc com ou sem MP promove plasticidade na medula espinhal após lesão.
EXEMPLO 32 TRATAMENTO COMBINADO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO (27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPRED- NISOLONA AUMENTOU O NÚMERO DE CONEXÕES AXONAIS ENTRE FIBRAS DO TRATO CORTICOESPINHAL MARCADAS COM BIOTINA DEXTRAN AMINA E NEURÔNIOS MOTORES LOMBARES
[000571] Anticorpo antitransportador de glutamato vesicular 1 (vGLUT1) (diluição 1:2500) foi usado para marcar corpos celulares neuronais e neurônios a- e Y-motores em lâmina 9 e foram identificados por seu tamanho e morfologia. O número de axônios em contato com neurônios a- ou Y- motores foi significativamente aumentado no grupo tratado com MP + NgR(310)ecto-Fc em comparação com animais de controle, com o efeito mais acentuado e significante observado em animais recebendo tratamento combinado com NgR(310)ecto-Fc e MP (Figura 27). P < 0/05, ANOVA unidirecional com teste post-hoc de Dunnett.
Depósitos biológicos
[000572] Hibridomas HB 7E11 (No. de Acesso ATCC® PTA-4587), HB 1H2 (No. de Acesso ATCC® PTA-4584), HB 3G5 (No. de Acesso ATCC® PTA-4586), HB 5B10 (No. de Acesso ATCC® PTA- 4588) e HB 2F7 (No. de Acesso ATCC® PTA-4585) foram depositados na American Type Culture Collection ("ATCC®"), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, em 9 de agosto de 2002.
[000573] Como aqueles versados na técnica perceberão, várias alterações e modificações podem ser feitas às modalidades preferidas da invenção sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Pretende- se que todas as variações estejam dentro do escopo da invenção.

Claims (10)

1. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: (i) uma sequência de aminoácidos correspondendo à se-quência começando em uma posição selecionada a partir do aminoá- cido 25 até 35 da SEQ ID NO: 49 e terminando na posição 445 da SEQ ID NO: 49, (ii) uma sequência de aminoácidos correspondendo à se-quência começando no aminoácido 27 e terminando em uma posição selecionada do aminoácido 300 até 450 da SEQ ID NO: 49, e (iii) uma sequência de aminoácidos correspondendo à se-quência começando em uma posição selecionada do aminoácido 25 a 35 e terminando em uma posição selecionada do aminoácido 300 a 450 da SEQ ID NO: 49, em que pelo menos um resíduo de cisteína das referidas sequências de aminoácidos é substituído por alanina; e (b) um polipeptídeo heterólogo; em que o polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediado pelo receptor nogo; em que um ou mais resíduos de cisteína a serem substituídos são selecionados a partir de: um resíduo de cisteína correspondente ao resíduo de cisteína encontrado no aminoácido 266 (C266) da SEQ ID NO: 49; um resíduo de cisteína correspondente ao resíduo de cisteína encontrado no aminoácido 309 (C309) da SEQ ID NO: 49; um resíduo de cisteína correspondente ao resíduo de cisteína encontrado no aminoácido 335 (C335) da SEQ ID NO: 49; ou combinações dos mesmos; em que o referido polipeptídeo heterólogo é selecionado a partir do grupo consistindo em: (c) albumina sérica, (d) uma região Fc, (e) um peptídeo sinal, (f) um sinalizador de polipeptídeo, e (g) uma combinação de dois ou mais dos referidos poli- peptídeos heterólogos.
2. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de cisteína correspondente ao resíduo de cisteína encontrado no aminoácido C266 e C309 da SEQ ID NO: 49 são substituídos por alanina.
3. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de cisteína correspondente ao resíduo de cisteína encontrado no aminoácido C309 e C335 da SEQ ID NO: 49 são substituídos por alanina.
4. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo é uma região Fc.
5. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região Fc é selecionada a partir do grupo consistindo em uma região Fc de IgA, uma região Fc de IgD, uma região Fc de IgG, uma região Fc de IgE e uma região Fc de IgM.
6. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de IgG.
7. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um sinalizador FLAG, um sinali zador Strep, um sinalizador de polihistidina, um sinalizador VSV-G, um sinalizador de hemaglutinina (HA) do vírus influenza e um sinalizador de c-Myc.
8. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma ou mais porções de polialquileno glicol são ligadas ao polipeptídeo.
9. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as ditas uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietileno glicol (PEG).
10. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que 1 a 5 porções de PEG são ligadas ao polipeptídeo.
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