JP2013048638A - Nogoレセプターアンタゴニスト - Google Patents

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Abstract

【課題】Nogoレセプターアンタゴニストの提供。
【解決手段】免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体、その抗原結合断片、その可溶性Nogoレセプターおよび融合タンパク質ならびにこれらをコードする核酸を開示する。また、Nogoレセプターアンタゴニストポリヌクレオチドを開示する。また、かかるNogoレセプター抗体、その抗原結合断片、その可溶性Nogoレセプターおよび融合タンパク質、これらをコードする核酸ならびにアンタゴニストポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにその作製および使用方法を開示する。
【選択図】なし

Description

(発明の分野)
本発明は、神経生物学および分子生物学に関する。より詳しくは、本発明は、免疫原性Nogoレセプター−1(NgR1)ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体、その抗原結合断片、その可溶性Nogoレセプターおよび融合タンパク質ならびにこれらをコードする核酸に関する。本発明は、さらに、Nogoレセプター−1アンタゴニストポリヌクレオチドに関する。本発明は、さらに、かかるNogoレセプター抗体、その抗原結合断片、免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチド、その可溶性Nogoレセプターおよび融合タンパク質、これらをコードする核酸ならびにアンタゴニストポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
(発明の背景)
ニューロンの軸索および樹状突起は、ニューロンからの長い細胞性伸長部である。伸長した軸索または神経突起の遠位先端部は、成長円錐として知られる特殊な領域を含む。成長円錐は、局所環境を感知し、軸索の成長を、ニューロンの標的細胞へと誘導する。成長円錐は、いくつかの環境刺激、例えば、表面接着性、成長因子、神経伝達物質および電場に応答する。成長円錐での成長の誘導は、種々の類型の接着分子、細胞間シグナル、ならびに成長円錐を刺激および阻害する因子を伴う。成長している神経突起の成長円錐は種々の速度で進行するが、典型的には、1日で1〜2ミリメートルの速度である。
成長円錐は、手のような形状をしており、胚内の表面に種々に付着する広く平坦な拡張部(微細棘状部すなわち糸状仮足)を有する。糸状仮足は継続的に活発であり、一部の糸状仮足は、収縮して成長円錐内に戻るが、一部は下層を通り抜けて伸張し続ける。この異なる糸状仮足間の伸張により、葉状仮足が形成される。
成長円錐により、その前方の葉状仮足および糸状仮足を有するいずれかの側面である領域が探究されている。伸張部は、成長に望ましくない表面と接触すると、後退する。伸張部が成長の都合のよい表面と接触すると、伸張し続け、成長円錐をおその方向に誘導する。成長円錐は、下層の表面特性の小さな変動によって誘導され得る。成長円錐が適切な標的細胞に達すると、シナプス結合がもたらされる。
神経細胞の機能は、その直の環境内でのニューロンと他の細胞間の接触によって大きく影響される(非特許文献1)。このような細胞としては、中枢神経系(CNS)のとくしゅなグリア細胞、オリゴ樹状細胞、および末梢神経系(PNS)のシュヴァン細胞(ニューロンの軸索をミエリンで覆う)(多層膜の絶縁構造)が挙げられる(非特許文献2)。
CNSのニューロンは、損傷後に再生する能力を有するが、ミエリン内に存在する阻害性タンパク質の存在のため、また、おそらく、その局所環境に通常見られる他の型の分子のため再生の実行は阻害される(非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5)。
オリゴ樹状細胞上に見られるいくつかのミエリン阻害性タンパク質、例えば、NogoA(非特許文献6;非特許文献7)、ミエリン会合糖タンパク質(非特許文献8;非特許文献9)およびオリゴ樹状細胞糖タンパク質(非特許文献10)がキャラクタライズされている。これらのタンパク質は、各々個々に、ニューロンのNogoレセプター−1のリガンドであることが示されている(非特許文献11;非特許文献12;非特許文献7;非特許文献6;非特許文献13)。
Nogoレセプター−1は、8ロイシンリッチリピートを含有するGPIアンカー膜タンパク質である(非特許文献14)。阻害性タンパク質(例えば、NogoA,MAGおよびOM−gp)と相互作用すると、Nogoレセプター−1複合体は、成長円錐の虚脱および神経突起伸長の阻害をもたらすシグナルを伝達する。
U.Rutishauser,T.M.Jessell,Physiol.Rev.1988年,第68巻,p.819 G.Lemke,An Introduction to Molecular Neurobiology,Z.Hall編(Sinauer,Sunderland,Mass.)、1992年、p.281 BrittisおよびFlanagan,Neuron,2001年,第30巻,p.11−14 Jonesら、J.Neurosc.2002年,第22巻,p.2792−2803 Grimpeら、J.Neurosci.2002年,第22巻,p.3144−3160 Chenら、Nature,2000年,第403巻,p.434−439 Grandpreら、Nature,2000年,第403巻,p.439−444 MAG、McKerracherら、Neuron,1994年,第13巻,p.805−811 Mukhopadhyayら、Neuron,1994年,第13巻,p.757−767 OM−gp、MikolおよびStefansson、J.Cell.Biol.1988年,第106巻,p.1273−1279 Wangら、Nature,2002年,第417巻,p.941−944 Liuら、Science、2002年,第297巻,p.1190−93 Domeniconiら、Neuron,2002年,第35巻p.283−90 Fournierら、Nature,2001年,第409巻,p.341−346
Nogoレセプター−1のそのリガンドへの結合を阻害し、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱および神経突起伸長の阻害を減弱させる分子の早急な必要性が存在する。
(発明の概要)
本発明は、CNSのニューロンの神経突起伸長、ニューロンの生存および軸索の再生を促進させるためのNogoレセプター−1アンタゴニストの使用に関する。本発明は、CNSのニューロンの神経突起伸長抑制の阻害ニューロンの生存の促進および/または軸索の再生の促進に有用な分子および方法を扱うものである。
本発明はまた、これらを含む可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび融合タンパク質、ならびにNogoレセプター−1の特異的免疫原性領域に指向される抗体およびその抗原性断片に関する。本発明はまた、本発明の抗体に結合する免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドに関する。本発明はまた、Nogoレセプター−1に結合するモノクローナル抗体に結合されるNogoレセプター−1ポリペプチドに関する。かかるポリペプチドは、とりわけ、免疫原として、または抗体をスクリーニングして本発明の抗体と同様の特異性を有するものを同定するために使用され得る。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該ペプチドの作製方法に関する。本発明の抗体、可溶性レセプターおよびレセプター融合タンパク質は、Nogoレセプター−1に拮抗するか、または該レセプターをブロックし、Nogoレセプター−1のそのリガンドへの結合の阻害、ニューロン内での成長円錐虚脱(collapse)の阻害、およびニューロン内での神経突起伸長もしくは出芽(sprouting)の抑制の低減に有用である。
一部のある実施形態において、本発明は、AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(配列番号26);LDLSDNAQLR(配列番号27);LDLSDDAELR(配列番号29);LDLASDNAQLR(配列番号30);LDLASDDAELR(配列番号31);LDALSDNAQLR(配列番号32);LDALSDDAELR(配列番号33);LDLSSDNAQLR(配列番号34);LDLSSDEAELR(配列番号35);DNAQLRVVDPTT(配列番号36);DNAQLR(配列番号37);ADLSDNAQLRVVDPTT(配列番号41);LALSDNAQLRVVDPTT(配列番号42);LDLSDNAALRVVDPTT(配列番号43);LDLSDNAQLHVVDPTT(配列番号44);およびLDLSDNAQLAVVDPTT(配列番号45)からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は発現制御配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸を含む、または本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養すること、および本発明のポリペプチドを宿主細胞または培養培地から回収することを含む、本発明のポリペプチドの作製方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、宿主を本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸もしくはベクターを含む宿主細胞で免疫処置する工程、および本発明の抗体を回収する工程を含む、抗体の作製方法を提供する。本発明はまた、該方法によって作製される抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、ハイブリドーマ細胞株HB 7E11(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4587)によって産生されるモノクローナル抗体ではない抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明の一部のある実施形態において、該抗体または抗原結合断片は、(a)ニューロンの成長円錐の虚脱を抑制する;(b)ニューロンにおける神経突起の伸長および出芽の抑制を低減させる;ならびに(c)リガンドへのNogoレセプター−1の結合を阻害する。一部のある実施形態において、神経突起の伸長および出芽は軸索の成長である。一部のある実施形態において、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
一部のある実施形態において、本発明の抗体はモノクローナルである。一部のある実施形態において、本発明の抗体はマウス抗体である。一部のある実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体および単鎖抗体からなる群より選択される。
一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、リガンドへのNogoレセプター−1の結合を阻害する方法を提供する。一部のある実施形態において、リガンドは、NogoA、NogoB、NogoC、MAGおよびOM−gpからなる群より選択される。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。一部のある実施形態において、ニューロンは中枢神経系のニューロンである。
一部のある実施形態において、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアおよび本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を提供する。一部のある実施形態において、該組成物は、さらに、1種類以上のさらなる治療用薬剤を含む。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、有効量の本発明の抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはインビトロである。一部のある実施形態では、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物は、多発性硬化症、ALS、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷または脊髄損傷の徴候または症状を示している。
一部のある実施形態において、本発明は、(a)本発明の抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片を発現する培養宿主細胞を提供すること;および(b)宿主細胞を哺乳動物内のニューロン部位またはその付近に導入することを含む、哺乳動物において死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロン部位またはその付近に、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを投与することを含み、ここで、該抗Nogoレセプター−1抗体または抗原結合断片は、哺乳動物において該ヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するのに充分な量で発現される、死滅するリスクのあるニューロンであって哺乳動物のものであるニューロンの生存を促進させる方法である遺伝子療法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号49のアミノ酸309〜335;配列番号49のアミノ酸309〜336;配列番号49のアミノ酸309〜337;配列番号49のアミノ酸309〜338;配列番号49のアミノ酸309〜339;配列番号49のアミノ酸309〜340;配列番号49のアミノ酸309〜341;配列番号49のアミノ酸309〜342;配列番号49のアミノ酸309〜343;配列番号49のアミノ酸309〜344;配列番号49のアミノ酸309〜345;配列番号49のアミノ酸309〜346;配列番号49のアミノ酸309〜347;配列番号49のアミノ酸309〜348;配列番号49のアミノ酸309〜349;配列番号49のアミノ酸309〜350;配列番号49のアミノ酸300〜344;配列番号49のアミノ酸301〜344;配列番号49のアミノ酸302〜344;配列番号49のアミノ酸303〜344;配列番号49のアミノ酸304〜344;配列番号49のアミノ酸305〜344;配列番号49のアミノ酸306〜344;配列番号49のアミノ酸307〜344;配列番号49のアミノ酸308〜344;配列番号49のアミノ酸336〜344;配列番号49のアミノ酸335〜344;配列番号49のアミノ酸334〜344;配列番号49のアミノ酸333〜344;配列番号49のアミノ酸332〜344;配列番号49のアミノ酸331〜344;配列番号49のアミノ酸330〜344;配列番号49のアミノ酸329〜344;配列番号49のアミノ酸328〜344;配列番号49のアミノ酸327〜344;配列番号49のアミノ酸326〜344;配列番号49のアミノ酸325〜344;配列番号49のアミノ酸324〜344;配列番号49のアミノ酸323〜344;配列番号49のアミノ酸322〜344;配列番号49のアミノ酸321〜344;配列番号49のアミノ酸320〜344;配列番号49のアミノ酸319〜344;配列番号49のアミノ酸318〜344;配列番号49のアミノ酸317〜344;配列番号49のアミノ酸316〜344;配列番号49のアミノ酸315〜344;配列番号49のアミノ酸314〜344;配列番号49のアミノ酸313〜344;配列番号49のアミノ酸312〜344;配列番号49のアミノ酸311〜344;配列番号49のアミノ酸310〜344;配列番号49のアミノ酸336〜344;配列番号49のアミノ酸336〜345;配列番号49のアミノ酸336〜346;配列番号49のアミノ酸336〜347;配列番号49のアミノ酸336〜348;配列番号49のアミノ酸336〜349;配列番号49のアミノ酸336〜350;前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および前記ポリペプチド断片のいずれかの少なくとも2種類の組合せ;(3個までのアミノ酸置換を除く)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、60残基以下の単離されたポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号49のアミノ酸311〜344;配列番号49のアミノ酸310〜348;配列番号49のアミノ酸323〜328;配列番号49のアミノ酸339〜348;配列番号49のアミノ酸378〜414;配列番号49のアミノ酸27〜38;配列番号49のアミノ酸39〜61;配列番号49のアミノ酸257〜267;配列番号49のアミノ酸280〜292;配列番号49のアミノ酸301〜323;配列番号49のアミノ酸335〜343;配列番号49のアミノ酸310〜335;配列番号49のアミノ酸326〜328;前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および前記ポリペプチド断片のいずれかの少なくとも2種類の組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、60残基以下の単離されたポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸x〜344、(b)配列番号49のアミノ酸309〜y、および(c)配列番号49のアミノ酸x〜y(ここで、xは305〜326の任意の整数であり、yは328〜350の任意の整数である)からなる群より選択され、Nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸x’〜344、(b)配列番号49のアミノ酸309〜y’、(c)配列番号49のアミノ酸x’〜y’(式中、x’は300〜326の任意の整数であり、y’は328〜360の任意の整数である)からなる群より選択されるポリペプチド断片であって、Nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜335;配列番号49のアミノ酸309〜344;配列番号49のアミノ酸310〜335;配列番号49のアミノ酸310〜344;配列番号49のアミノ酸309〜350;配列番号49のアミノ酸300〜344;および配列番号49のアミノ酸315〜344からなる群より選択されるポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜344であるポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜335であるポリペプチド断片を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、環状である本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該環状ポリペプチドは、さらに、N末端に結合された第1の分子およびC末端に結合された第2の分子を含み、該第1の分子および前記第2の分子が互いに連結されて前記環状分子が形成されている。一部のある実施形態において、第1および第2の分子は、ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群より選択される。一部のある実施形態において、第1の分子は、本発明のポリペプチドのN末端に結合されたビオチン分子であり、第2の分子は、C末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、第1の分子は、本発明のポリペプチドのN末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、第2の分子は、C末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドの第1の分子は、N末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、第2の分子は、C末端に結合されたシステイン残基である。一部のある実施形態において、C末端システインは、結合されたNH2部分を有する。
一部のある実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸a〜445、(b)配列番号49のアミノ酸27〜b、および(c)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは25〜35の任意の整数であり、bは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択され、前記第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸c〜445、(b)配列番号49のアミノ酸27〜d、および(c)配列番号49のアミノ酸c〜d(ここで、cは25〜35の任意の整数であり、dは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択される、Nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第1の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸27〜310および(b)配列番号49のアミノ酸27〜344からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第2の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸27〜310および(b)配列番号49のアミノ酸27〜344からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、第1のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜310を含み、第2のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜310を含むか、または第1のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜344を含み、第2のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜310を含むか、または第1のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜344を含み、第2のポリペプチド断片が配列番号49のアミノ酸27〜344を含む、ポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第1のポリペプチド断片が第2のポリペプチド断片の上流に存在するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、第1のポリペプチド断片と第2のポリペプチド断片の間に存在するペプチドリンカーを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ペプチドリンカーが配列番号65(G4S)を含むものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ペプチドリンカーが配列番号66(G4S)を含むものを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、少なくとも1つのシステイン残基が、異種アミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該少なくとも1つのシステイン残基はC266である。一部のある実施形態において、該少なくとも1つのシステイン残基はC309である。一部のある実施形態において、該少なくとも1つのシステイン残基はC335である。一部のある実施形態において、該少なくとも1つのシステイン残基はC336に存在する。一部のある実施形態において、該少なくとも1つのシステイン残基は、代替アミノ酸アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるで置換されている。一部のある実施形態において、該代替アミノ酸はアラニンである。
一部のある実施形態において、本発明は、(a)参照アミノ酸配列の少なくとも1つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は前記参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配、ここで、前記参照アミノ酸配列は、(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、(iii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは25〜35の任意の整数であり、bは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択される;ならびに(b)異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のC266が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のC309が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のC335が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のC266とC309が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、前記参照アミノ酸配列のC309とC335が異なるアミノ酸で置換されているものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該異なるアミノ酸がアラニンであるものを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、(a)20個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、ここで、前記参照アミノ酸配列は、(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、(ii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは25〜35の任意の整数であり、bは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択される;および(b)異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸a〜305、(b)配列番号49のアミノ酸1〜b、および(c)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは1〜27の任意の整数であり、bは264〜309の任意の整数である)からなる群より選択され、前記第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号60のアミノ酸c〜332、(b)配列番号60のアミノ酸275〜d、および(c)配列番号60のアミノ酸c〜d(ここで、cは265〜306の任意の整数であり、dは308〜340の任意の整数である)からなる群より選択されるポリペプチドであって、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。特定のある実施形態において、第1の参照アミノ酸配列は、(a)配列番号49のアミノ酸1〜274;および(b)配列番号49のアミノ酸1〜305からなる群より選択される。特定のある実施形態において、第2の参照アミノ酸配列は、(a)配列番号60のアミノ酸275〜311;(b)配列番号60のアミノ酸275〜332;(c)配列番号60のアミノ酸306〜311;(d)配列番号60のアミノ酸306〜308;および(e)配列番号60のアミノ酸306〜309からなる群より選択される。一実施形態において、第1のポリペプチド断片は配列番号49のアミノ酸1〜274を含み、第2のポリペプチド断片はアミノ酸配列番号60のアミノ酸275〜311を含む。一部のある実施形態において、第1のポリペプチド断片は配列番号49のアミノ酸1〜274を含み、第2のポリペプチド断片は配列番号60のアミノ酸275〜332を含む。一部のある実施形態において、第1のポリペプチド断片は配列番号49のアミノ酸1〜305を含み、第2のポリペプチド断片は配列番号60のアミノ酸306〜311を含む。一部のある実施形態において、第1のポリペプチド断片は配列番号49のアミノ酸1〜305を含み、第2のポリペプチド断片は配列番号60のアミノ酸306〜308を含む。一部のある実施形態において、第1のポリペプチド断片は配列番号49のアミノ酸1〜305を含み、第2のポリペプチド断片は配列番号60のアミノ酸306〜309を含む。一部のある実施形態において、少なくとも1つのさらなるアミノ酸が第2のポリペプチド断片のC末端に付加されている。一実施形態において、該少なくとも1つのさらなるアミノ酸はトリプトファンである。一部のある実施形態において、第1のポリペプチド断片のA269が異なるアミノ酸で置換されている。一実施形態において、該異なるアミノ酸はトリプトファンである。
一部のある実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号49のアミノ酸1〜310からなり、前記第2のポリペプチド断片が、5個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号60のアミノ酸311〜318からなる、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該異種ポリペプチドが、(a)血清アルブミン、(b)Fc領域、(c)シグナルペプチド、(d)ポリペプチドタグ、および(e)前記異種ポリペプチドの2種類以上の組合せからなる群より選択されるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択されるものを提供する。一実施形態において、Fc領域はIgGのFc領域である。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、ペプチドリンカーが、該アミノ酸配列とIgGのFc領域の間に存在するものを提供する。一実施形態において、該ペプチドリンカーは配列番号66(G4S)を含む。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択されるものを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、1つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている本発明のポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該1つ以上のポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール(PEG)部分であるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、1〜5個のPEG部分に結合されている本発明のポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ヌクレオチド配列が発現制御エレメント(例えば、誘導型プロモーター、構成的プロモーター、または分泌シグナル)に作動可能に連結されているものを提供する。さらなる実施形態には、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞が含まれる。
一部のある実施形態において、本発明は、(i)アンチセンスポリヌクレオチド;(ii)リボザイム;(iii)低分子干渉RNA(siRNA);および(iv)スモールヘアピン型RNA(shRNA)からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部のある実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは、NgR1 mRNAのコード部分に相補的な少なくとも10塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである。一部のある実施形態において、該ポリヌクレオチドはリボザイムである。
さらなる実施形態において、該ポリヌクレオチドはsiRNAまたはshRNAである。一部のある実施形態において、本発明は、該siRNAまたはshRNAがNgR1発現を阻害するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、siRNAまたはshRNAが、CUACUUCUCCCGCAGGCGまたはCCCGGACCGACGUCUUCAAまたはCUGACCACUGAGUCUUCCGを含むヌクレオチド配列と少なくとも90%同一であるものを提供する。他の実施形態において、siRNAまたはshRNAヌクレオチド配列は、CUACUUCUCCCGCAGGCGまたはCCCGGACCGACGUCUUCAAまたはCUGACCACUGAGUCUUCCGである。
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、siRNAまたはshRNAヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列GATGAAGAGGGCGTCC GCTまたはGGGCCTGGCTGCAGAAGTTまたはGACTGGTGACTCAGAGAAGGCによって生成されるmRNAに相補的であるものを提供する。
本発明のさらなる実施形態には、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と、特定のある実施形態では、薬学的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が含まれる。特定のある実施形態において、該組成物は、配列番号7のアミノ酸27〜310と抗炎症剤を含むものである。他の実施形態において、該組成物は、配列番号9のアミノ酸27〜310と抗炎症剤を含むものである。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、炎症剤がステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択されるものを提供する。特定のある実施形態において、ステロイド系抗炎症剤は、ヒドロコルチゾン、21−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン(desoximerasone)、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロン(flucinolone)アセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン21−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21−ジエドライ(diedry)アミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、21−m−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、21−ステアロ(stearo)グリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、21−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、21−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される。特別な一実施形態において、ステロイド系抗炎症剤はメチルプレドニゾロンである。他の実施形態において、非ステロイド系抗炎症剤は、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ(bucloxic)酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される。
さらなる実施形態には、配列番号7または9のアミノ酸27〜310が異種ポリペプチドに融合された組成物が含まれる。一部のある実施形態において、該異種ポリペプチドがFcである。
また、本発明の実施形態には、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってNogoレセプター1媒介性神経突起伸長抑制を阻害する薬剤と接触させることを含む、神経突起伸長を促進させるための方法が含まれる。
さらなる実施形態には、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってNgR1シグナル伝達複合体によりシグナル伝達を阻害する薬剤の有効量と接触させることを含む、NgR1シグナル伝達複合体によりシグナル伝達を阻害する方法が含まれる。
他の実施形態には、処置を必要とする哺乳動物に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を含む薬剤であってNogoレセプター1媒介性神経突起伸長抑制を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、哺乳動物において中枢神経系(CNS)の疾患、障害または損傷を処置するための方法が含まれる。特定のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症、ALS、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症からなる群より選択される。
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドが、異種ポリペプチドに融合されているものを提供する。一部のある実施形態において、該異種ポリペプチドは血清アルブミンである。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはFc領域である。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはシグナルペプチドである。一部のある実施形態では、該異種ポリペプチドはポリペプチドタグである。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択されるものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、該ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択されるものを提供する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、該参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸x〜344;および
(b)配列番号49のアミノ酸309〜y;
からなる群より選択され、
ここで、xが、305〜326の任意の整数であり、yが、328〜350の任意の整数であり;そして
該ポリペプチド断片が、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド断片。
(項目2)
xが、300〜326の任意の整数であり、yが、328〜360の任意の整数である、項目1に記載のポリペプチド断片。
(項目3)
前記参照アミノ酸配列が、
(i)配列番号49のアミノ酸309〜335;
(ii)配列番号49のアミノ酸309〜344;
(iii)配列番号49のアミノ酸310〜335;
(iv)配列番号49のアミノ酸310〜344;
(v)配列番号49のアミノ酸309〜350;
(vi)配列番号49のアミノ酸300〜344;および
(vii)配列番号49のアミノ酸315〜344;
からなる群より選択される、項目2に記載のポリペプチド断片。
(項目4)
前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜335である、項目3に記載のポリペプチド断片。
(項目5)
前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜344である、項目3に記載のポリペプチド断片。
(項目6)
配列番号49のアミノ酸x〜yを含む、60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、
ここで、xが、300〜310の任意の整数であり、yが、340〜360の任意の整数であり;
該ポリペプチド断片が、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド断片。
(項目7)
前記ポリペプチドが、環状である、項目1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記環状ポリペプチドが、N末端に結合された第1の分子およびC末端に結合された第2の分子をさらに含み、該第1の分子および該第2の分子が、互いに連結されて該環状分子が形成されている、項目7に記載のポリペプチド。
(項目9)
前記第1の分子および前記第2の分子が、ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群より選択される、項目8に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記第1の分子が、前記N末端に結合されたビオチン分子であり、前記第2の分子が、前記ポリペプチドのC末端に結合されたシステイン残基である、項目9に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記第1の分子が、前記N末端に結合されたアセチル化システイン残基であり、前記第2の分子が、前記ポリペプチドのC末端に結合されたシステイン残基である、項目9に記載のポリペプチド。
(項目12)
前記C末端システインが、結合されたNH 部分を有する、項目10または項目11に記載のポリペプチド。
(項目13)
第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第1の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸a〜445;
(b)配列番号49のアミノ酸27〜b;および
(c)配列番号49のアミノ酸a〜b;
からなる群より選択され、
ここで、aが、25〜35の任意の整数であり、bが、300〜450の任意の整数であり;
該第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第2の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸c〜445;
(b)配列番号49のアミノ酸27〜d;および
(c)配列番号49のアミノ酸c〜d;
からなる群より選択され、
ここで、cが、25〜35の任意の整数であり、dが、300〜450の任意の整数であり;そして該ポリペプチドが、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド。
(項目14)
前記第1の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸27〜310;および
(b)配列番号49のアミノ酸27〜344;
からなる群より選択される、項目13に記載のポリペプチド。
(項目15)
前記第2の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸27〜310;および
(b)配列番号49のアミノ酸27〜344;
からなる群より選択される、項目13に記載のポリペプチド。
(項目16)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜310を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜310を含む、項目13に記載のポリペプチド。
(項目17)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜344を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜310を含む、項目13に記載のポリペプチド。
(項目18)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜344を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸27〜344を含む、項目13に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記第1のポリペプチド断片が、前記第2のポリペプチド断片の上流に存在する、項目13に記載のポリペプチド。
(項目20)
前記第1のポリペプチド断片と前記第2のポリペプチド断片との間に存在するペプチドリンカーをさらに含む、項目13に記載のポリペプチド。
(項目21)
前記ペプチドリンカーが、配列番号65(G4S) を含む、項目20に記載のポリペプチド。
(項目22)
前記参照アミノ酸配列、前記第1の参照アミノ酸配列または前記第2の参照アミノ酸配列のうちの少なくとも1つのシステイン残基が、異なるアミノ酸で置換されている、項目1〜21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目23)
前記少なくとも1つのシステイン残基が、C266である、項目22に記載のポリペプチド。
(項目24)
前記少なくとも1つのシステイン残基が、C309である、項目22に記載のポリペプチド。
(項目25)
前記少なくとも1つのシステイン残基が、C335である、項目22に記載のポリペプチド。
(項目26)
前記少なくとも1つのシステイン残基が、C336に存在する、項目22に記載のポリペプチド。
(項目27)
前記異なるアミノ酸が、アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、項目22に記載のポリペプチド。
(項目28)
前記異なるアミノ酸が、アラニンである、項目27に記載のポリペプチド。
(項目29)
異種ポリペプチドに融合された、項目1〜28のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目30)
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンである、項目29に記載のポリペプチド。
(項目31)
前記異種ポリペプチドが、Fc領域である、項目29に記載のポリペプチド。
(項目32)
前記異種ポリペプチドが、シグナルペプチドである、項目29に記載のポリペプチド。
(項目33)
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドタグである、項目29に記載のポリペプチド。
(項目34)
前記Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択される、項目31に記載のポリペプチド。
(項目35)
前記ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択される、項目33に記載のポリペプチド。
(項目36)
前記ポリペプチドが、1つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目1〜35のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目37)
前記1つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール(PEG)部分である、項目36に記載のポリペプチド。
(項目38)
前記ポリペプチドが1〜5個のPEG部分に結合されている、項目37に記載のポリペプチド。
(項目39)
(a)参照アミノ酸配列の少なくとも1つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は該参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配であって、該参照アミノ酸配列は、
(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、
(iii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および
(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b、
からなる群より選択され、
ここで、aが、25〜35の任意の整数であり、bが、300〜450の任意の整数である、アミノ酸配;ならびに(b)異種ポリペプチド;を含む単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド。
(項目40)
前記参照アミノ酸配列のC266が、異なるアミノ酸で置換されている、項目38に記載のポリペプチド。
(項目41)
前記参照アミノ酸配列のC309が、異なるアミノ酸で置換されている、項目39に記載のポリペプチド。
(項目42)
前記参照アミノ酸配列のC335が、異なるアミノ酸で置換されている、項目39に記載のポリペプチド。
(項目43)
前記参照アミノ酸配列のC266およびC309が、異なるアミノ酸で置換されている、項目39に記載のポリペプチド。
(項目44)
前記参照アミノ酸配列のC309およびC335が、異なるアミノ酸で置換されている、項目39に記載のポリペプチド。
(項目45)
前記異なるアミノ酸が、アラニンである、項目39〜44のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目46)
前記異種ポリペプチドが、
(a)血清アルブミン、
(b)Fc領域、
(c)シグナルペプチド、
(d)ポリペプチドタグ、および
(e)該異種ポリペプチドの2種類以上の組合せ、
からなる群より選択される、項目39に記載のポリペプチド。
(項目47)
前記Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択される、項目46に記載のポリペプチド。
(項目48)
前記Fc領域が、IgGのFc領域である、項目47に記載のポリペプチド。
(項目49)
前記ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択される、項目46に記載のポリペプチド。
(項目50)
前記ポリペプチドが、1つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目39〜49いずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目51)
前記1つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール(PEG)部分である、項目50に記載のポリペプチド。
(項目52)
前記ポリペプチドが、1〜5個のPEG部分に結合されている、項目51に記載のポリペプチド。
(項目53)
(a)20個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列であって、ここで該参照アミノ酸配列は、
(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、
(ii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および
(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b、
からなる群より選択され、
ここで、aが、25〜35の任意の整数であり、bが、300〜450の任意の整数である、アミノ酸配列;ならびに(b)異種ポリペプチド;を含む単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド。
(項目54)
前記異種ポリペプチドが、
(a)血清アルブミン、
(b)Fc領域、
(c)シグナルペプチド、
(d)ポリペプチドタグ、および
(e)該異種ポリペプチドの2種類以上の組合せ、
からなる群より選択される、項目53に記載のポリペプチド。
(項目55)
前記Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択される、項目54に記載のポリペプチド。
(項目56)
前記Fc領域が、IgGのFc領域である、項目55に記載のポリペプチド。
(項目57)
前記アミノ酸配列および前記IgGのFc領域の間に存在するペプチドリンカーをさらに含む、項目56に記載のポリペプチド。
(項目58)
前記ペプチドリンカーが、配列番号66(G4S) を含む、項目57に記載のポリペプチド。
(項目59)
前記ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択される、項目54に記載のポリペプチド。
(項目60)
前記ポリペプチドが、1つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目53〜59のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目61)
前記1つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール(PEG)部分である、項目60に記載のポリペプチド。
(項目62)
前記ポリペプチドが、1〜5個のPEG部分に結合されている、項目61に記載のポリペプチド。
(項目63)
第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第1の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸a〜305、
(b)配列番号49のアミノ酸1〜b、および
(c)配列番号49のアミノ酸a〜b
からなる群より選択され、
ここで、aが、1〜27の任意の整数であり、bが、264〜309の任意の整数であり;そして該第2のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第2の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号60のアミノ酸c〜332、
(b)配列番号60のアミノ酸275〜d、および
(c)配列番号60のアミノ酸c〜d
からなる群より選択され、
ここで、cが、265〜306の任意の整数であり、dが、308〜340の任意の整数であり;
該ポリペプチドが、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する;
単離されたポリペプチド。
(項目64)
前記第1の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号49のアミノ酸1〜274;および
(b)配列番号49のアミノ酸1〜305;
からなる群より選択される、項目63に記載のポリペプチド。
(項目65)
前記第2の参照アミノ酸配列が、
(a)配列番号60のアミノ酸275〜311;
(b)配列番号60のアミノ酸275〜332;
(c)配列番号60のアミノ酸306〜311;
(d)配列番号60のアミノ酸306〜308;および
(e)配列番号60のアミノ酸306〜309;
からなる群より選択される、項目63に記載のポリペプチド。
(項目66)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸1〜274を含み、前記第2のポリペプチド断片が、アミノ酸配列番号60のアミノ酸275〜311を含む、項目63に記載のポリペプチド。
(項目67)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸1〜274を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号60のアミノ酸275〜332を含む、項目63に記載のポリペプチド。
(項目68)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸1〜305を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号60のアミノ酸306〜311を含む、項目63に記載のポリペプチド。
(項目69)
前記第1のポリペプチド断片が、配列番号49のアミノ酸1〜305を含み、前記第2のポリペプチド断片が、配列番号60のアミノ酸306〜309を含む、項目63に記載のポリペプチド。
(項目70)
少なくとも1つのさらなるアミノ酸が、前記第2のポリペプチド断片のC末端に付加されている、項目69に記載のポリペプチド。
(項目71)
前記少なくとも1つのさらなるアミノ酸が、トリプトファンである、項目70に記載のポリペプチド。
(項目72)
前記第1のポリペプチド断片のA269が、異なるアミノ酸で置換されている、項目71に記載のポリペプチド。
(項目73)
前記異なるアミノ酸が、トリプトファンである、項目72に記載のポリペプチド。
(項目74)
第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、該第1のポリペプチド断片が、20個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号49のアミノ酸1〜310からなり、該第2のポリペプチド断片が、5個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号60のアミノ酸311〜318からなり;そして該ポリペプチドが、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害する、単離されたポリペプチド。
(項目75)
異種ポリペプチドに融合された、項目63〜74のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目76)
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンである、項目75に記載のポリペプチド。
(項目77)
前記異種ポリペプチドが、Fc領域である、項目75に記載のポリペプチド。
(項目78)
前記異種ポリペプチドが、シグナルペプチドである、項目75に記載のポリペプチド。
(項目79)
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドタグである、項目75に記載のポリペプチド。
(項目80)
前記Fc領域が、IgAのFc領域;IgDのFc領域;IgGのFc領域、IgEのFc領域;およびIgMのFc領域からなる群より選択される、項目77に記載のポリペプチド。
(項目81)
前記ポリペプチドタグが、FLAGタグ;Strepタグ;ポリヒスチジンタグ;VSV−Gタグ;インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)タグ;およびc−Mycタグからなる群より選択される、項目79に記載のポリペプチド。
(項目82)
前記ポリペプチドが、1つ以上のポリアルキレングリコール部分に結合されている、項目63〜81のいずれか1項に記載のポリペプチド。
(項目83)
前記1つ以上のポリアルキレングリコール部分が、ポリエチレングリコール(PEG)部分である、項目82に記載のポリペプチド。
(項目84)
前記ポリペプチドが、1〜5個のPEG部分に結合されている、項目83に記載のポリペプチド。
(項目85)
項目1〜84のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
(項目86)
前記ヌクレオチド配列が、発現制御エレメントに作動可能に連結されている、項目85に記載のポリヌクレオチド。
(項目87)
前記発現制御エレメントが、誘導型プロモーター;構成的プロモーター;および分泌シグナルからなる群より選択される、項目86に記載のポリヌクレオチド。
(項目88)
(i)アンチセンスポリヌクレオチド;
(ii)リボザイム;
(iii)低分子干渉RNA(siRNA);および
(iv)スモールヘアピン型RNA(shRNA)
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
(項目89)
前記ポリヌクレオチドが、NgR1 mRNAのコード部分に相補的な少なくとも10塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、項目88に記載のポリヌクレオチド。
(項目90)
前記ポリヌクレオチドが、リボザイムである、項目88に記載のポリヌクレオチド。
(項目91)
前記ポリヌクレオチドが、siRNAである、項目88に記載のポリヌクレオチド。
(項目92)
前記ポリヌクレオチドが、shRNAである、項目88に記載のポリヌクレオチド。
(項目93)
前記siRNAまたは前記shRNAが、NgR1発現を阻害する、項目91または92に記載のポリヌクレオチド。
(項目94)
前記siRNAまたは前記shRNAが、CUACUUCUCCCGCAGGCG(配列番号52)を含むヌクレオチド配列と少なくとも90%同一である、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目95)
前記siRNAまたは前記shRNAが、ヌクレオチド配列CUACUUCUCCCGCAGGCG(配列番号52)を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目96)
前記siRNAまたは前記shRNAが、配列GATGAAGAGGGCGTCCGCT(配列番号53)を含むポリヌクレオチドによって生成されるmRNAに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目97)
前記siRNAまたは前記shRNAが、CCCGGACCGACGUCUUCAA(配列番号54)を含むヌクレオチド配列と少なくとも90%同一である、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目98)
前記siRNAまたは前記shRNAが、ヌクレオチド配列CCCGGACCGACGUCUUCAA(配列番号54)を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目99)
前記siRNAまたは前記shRNAが、配列GGGCCTGGCTGCAGAAGTT(配列番号55)を含むポリヌクレオチドによって生成されるmRNAに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目100)
前記siRNAまたは前記shRNAが、CUGACCACUGAGUCUUCCG(配列番号56)を含むヌクレオチド配列と少なくとも90%同一である、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目101)
前記siRNAまたは前記shRNAが、ヌクレオチド配列CUGACCACUGAGUCUUCCG(配列番号56)を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目102)
前記siRNAまたは前記shRNAが、配列GACTGGTGACTCAGAGAAGGC(配列番号57)を含むポリヌクレオチドによって生成されるmRNAに相補的なヌクレオチド配列を含む、項目93に記載のポリヌクレオチド。
(項目103)
項目85〜102のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目104)
項目103に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目105)
項目1〜84のいずれか1項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
(項目106)
項目85〜102のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
(項目107)
項目103に記載のベクターまたは項目104に記載の宿主細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
(項目108)
配列番号7のアミノ酸27〜310および抗炎症剤を含む、組成物。
(項目109)
前記抗炎症剤が、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択される、項目108に記載の組成物。
(項目110)
前記ステロイド系抗炎症剤が、ヒドロコルチゾン、21−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン21−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、21−m−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、21−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、21−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、21−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される、項目109に記載の組成物。
(項目111)
前記ステロイド系抗炎症剤が、メチルプレドニゾロンである、項目110に記載の組成物。
(項目112)
前記非ステロイド系抗炎症剤が、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される、項目109に記載の組成物。
(項目113)
配列番号9のアミノ酸27〜310および抗炎症剤を含む、組成物。
(項目114)
前記抗炎症剤が、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤からなる群より選択される、項目113に記載の組成物。
(項目115)
前記ステロイド系抗炎症剤が、ヒドロコルチゾン、21−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン21−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、21−m−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、21−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、21−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、21−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドからなる群より選択される、項目114に記載の組成物。
(項目116)
前記ステロイド系抗炎症剤がメチルプレドニゾロンである、項目115に記載の組成物。
(項目117)
前記非ステロイド系抗炎症剤が、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン,ゾメピラック、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、アセチルサリチル酸、スルファサラジン、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾンからなる群より選択される、項目114に記載の組成物。
(項目118)
前記配列番号7または9のアミノ酸27〜310が、異種ポリペプチドに融合されている、項目108〜117のいずれか1項に記載の組成物。
(項目119)
前記異種ポリペプチドが、Fcである、項目118に記載の組成物。
(項目120)
ニューロンを、
(a)項目1〜84のいずれか1項に記載のポリペプチド;
(b)項目85〜102のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド;および
(c)項目108〜119のいずれか1項に記載の組成物;
からなる群より選択される薬剤と接触させる工程を含む、神経突起伸長を促進させる方法であって;
該薬剤が、神経突起伸長抑制を阻害する、方法。
(項目121)
前記ニューロンが、哺乳動物のものである、項目120に記載の方法。
(項目122)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目121に記載の方法。
(項目123)
ニューロンを、
(a)項目1〜84のいずれか1項に記載のポリペプチド;
(b)項目85〜102のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド;および
(c)項目108〜119のいずれか1項に記載の組成物;
からなる群より選択される薬剤の有効量と接触させる工程を含む、NgR1シグナル伝達複合体によるシグナル伝達を阻害する方法。
(項目124)
前記ニューロンが、哺乳動物のものである、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目124に記載の方法。
(項目126)
哺乳動物において中枢神経系(CNS)の疾患、障害または損傷を処置する方法であって、処置を必要とする哺乳動物に、
(a)項目1〜84のいずれか1項に記載のポリペプチド;
(b)項目85〜102のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド;および
(c)項目108〜119のいずれか1項に記載の組成物;
からなる群より選択される薬剤の有効量を投与する工程を含む、方法。
(項目127)
前記疾患、障害または損傷が、多発性硬化症、ALS、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症からなる群より選択される、項目126に記載の方法。
図1は、Nogoレセプター−1の構造の概略図である。ヒトNogoR310は、配列番号7の残基26〜310を含み、sNogoR344は、配列番号6の残基26〜344を含む。ラットsNogoR310は、配列番号9の残基27〜310を含み、sNogoR344は、配列番号8の残基27〜344を含む。 図2は、Vector NtiTMソフトウェアを用いた、Nogoレセプター−1タンパク質の抗原性プロットを示す。ラットP−617は配列番号10であり、ラットP−618は配列番号11である。ヒトP−617は配列番号47であり、ヒトP−618は配列番号48である。 図3Aは、抗Nogoレセプター−1抗体である7E11の結合活性を示すグラフである。このグラフは、Nogoレセプター−1へのNogo66の結合に対する7E11濃度の効果を示す。図3Bは、抗Nogoレセプター−1抗体である1H2の結合活性を示す。このグラフは、sNogoR344−Fc(本明細書および米国特許出願第60/402,866号において、Fc−sNogoR344またはIg−sNogoR344ともいう)へのNogo66の結合に対する1H2濃度の効果を示す。Fc−MAGは、sNogoR344−Fcへの結合に関してNogo66と競合しなかった。 図4は、抗Nogo−R−1抗体である1H2、3G5および2F7に関するELISAの結果を示す。固定化した抗原の存在下でのOD450に対する該抗体の効果を測定した。固定化した抗原はsNogoR310−Fc(本明細書および米国特許出願第60/402,866号において、Fc−sNogoR310またはIg−sNogoR310ともいう)、sNogoR344−Fc、p−617、p−618、p−4、p−5およびオボアルブミンならびにBSAであった。 図5は、種々の量のミエリンの存在下での、ラットDRG神経突起伸長に対するモノクローナル抗体7E11の効果を示すグラフである。 図6Aは、以下の競合物質:Nogo66、Nogo40および抗Nogoレセプター−1モノクローナル抗体上清みの存在下での、125I−Nogo66および125I−Nogo40へのsNogoR310の結合の効果を示すグラフである。図6Bは、sNogoR310への125I−Nogo66の結合活性を示す。 図7は、sNogoR310への125I−Nogo40結合に対するsNogoR310−Fcの効果を示すグラフである。 図8は、125I−Nogo40に対するsNogoR310−Fcの結合活性を示すグラフである。 図9Aは、ミエリンの存在下または非存在下での、神経突起伸長/細胞に対するsNogoR310の効果のグラフである。 図9Bは、ミエリンの存在下または非存在下での、神経突起伸長に対するsNogoR310の効果のグラフである。 図10Aは、漸増量のミエリンの存在下または非存在下での、P4ラットDRG神経突起伸長に対するsNogoR310−Fcの効果を示すグラフである。 図10Bは、PBS、PBS+sNogoR310−Fc、20ngミエリンおよびミエリン+sNogoR310−Fcでの処理後の神経突起の数/細胞を示す。 図11は、漸増量のミエリンの存在下での、DRG神経突起伸長/細胞に対するモノクローナル抗体5B10の効果を示すグラフである。 図12は、ラット脊髄離断モデルにおいて損傷の誘導後30日までの、BBBスコアに対するsNogoR310−Fcの効果を示すグラフである。 図13Aおよび13Bに、WTマウスまたはトランスジェニックマウスにおける第08線(Line 08)または第01線からの背側半側切除後、運動機能(locomotor)BBBスコアを時間の関数として報告する。図13Cは、WTマウスおよびトランスジェニックマウスの損傷後の最大許容斜面角度を時間の関数としてグラフで示す。図13Dは、傾斜グリッドよじ登り(inclined grid climbing)中の後肢異常(error)を損傷後の時間の関数として示す。すべてのグラフにおいて、各群の7〜9匹のマウスの平均±s.e.m.を報告する。トランスジェニック群の値はWTマウスと統計学的に異なる(二重アスタリスク、P<0.01;スチューデントのt−検定)。 図14Aは、ビヒクルまたはsNogoR310−Fcで処置した動物における背側半側切除後の運動機能BBBスコアを時間の関数として示す。図14Bは、グリッド歩行中の後肢異常を損傷後の時間の関数として示す。図14Cは、非損傷または損傷+sNogoR310−Fcラットよりも対照マウスにおいて一股(stride)長さが短く、一股幅が大きいことを示すフットプリント解析を示す。すべてのグラフにおいて、各群の7〜9匹のラットの平均±s.e.m.を報告する。sNogoR310−Fc群の値は、対照と統計学的に異なる(図14A〜B)。対照の値は、図14CのSCIなしまたはSCI+sNogoR310−Fcラットと統計学的に異なる(アスタリスク、p<0.05;二重アスタリスク、p<0.01;スチューデントのt−検定)。 図15は、ラットNgR1の可溶性断片(srNgR310)への抗rNgR1抗体である1D9の結合のモデルを示す。 図16Aは、ヒトNogoレセプターcDNAのヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび終止コドンに下線を付す。選択したRNAi標的領域をイタリック体で示す。RNAi−1およびRNAi−3はヒトNgR遺伝子を特異的に標的化するものであり、RNAi−2は、ヒト、マウスおよびラットのNgR遺伝子を標的化するように設計した。 図16Bは、発現ベクターpU6内でのNgR RNAiの構築に用いたDNAオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。 図17は、マウスL細胞におけるRNAiノックダウンの一過性トランスフェクション試験の結果を示す。 図18は、SKN細胞および293細胞内でのヒトNgR発現ベクターのトランスフェクションを示す。 図19は、ヒトSKN細胞におけるRNAiノックダウンの一過性トランスフェクション試験を示す。 図20は、RNAiレンチウイルスベクターの概略図を示す。RNAi発現カセットは、PacI部位またはEcoRI部位に挿入され得る。LTR−長い末端反復配列;RRE−Rev応答エレメント;cPPT−中央ポリプリントラクト;CBA−ニワトリβアクチン;WPRE−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント;SIN LTR−seld相互作用LTR。 図21は、クローンNeuroScreen細胞におけるNgR1ノックダウンを示す、7E11抗体を用いたウエスタンブロット解析を示す。 図22は、LV(クローン番号3G9、1E5 1E9 1E10)、LV−NgR RNAiで形質導入されたクローンNeuroScreen細胞または未処理細胞におけるNgR発現の概要を示す。ウエスタンブロット上のNgRおよびGAPDHシグナルの結果をデンシトメトリー走査によって定量した。 図23は、異なるレベルのNgRノックダウンで樹立された4種類のNeuroScreen細胞クローンを示す。NgR発現は、未処理NeuroScreen細胞におけるNgR:GAPDHシグナル比のパーセンテージとして示す。 図24A〜Bは、インビトロでの幼鳥の脊髄神経節(DRG)における、神経突起伸長のミエリン誘導性阻害に対する、ラットIgGに融合されたラットNgR1(27〜310)のエクトドメイン[NgR(310)エクト−Fc]およびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)解離した第13日胚の幼鳥のDRGニューロンを、NgR(310)エクト−FcまたはMPの存在下、リン酸干渉生理食塩水(PBS)またはミエリン(400ng/ウェル)上にプレーティングした。(B)細胞(η−3)あたりの神経突起伸長の定量(PBS対照パーセンテージ±SEM(η−3)として示す。スケールバー200μm。PBS対照と比べてP<0/05。 図24A〜Bは、インビトロでの幼鳥の脊髄神経節(DRG)における、神経突起伸長のミエリン誘導性阻害に対する、ラットIgGに融合されたラットNgR1(27〜310)のエクトドメイン[NgR(310)エクト−Fc]およびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)解離した第13日胚の幼鳥のDRGニューロンを、NgR(310)エクト−FcまたはMPの存在下、リン酸干渉生理食塩水(PBS)またはミエリン(400ng/ウェル)上にプレーティングした。(B)細胞(η−3)あたりの神経突起伸長の定量(PBS対照パーセンテージ±SEM(η−3)として示す。スケールバー200μm。PBS対照と比べてP<0/05。 図25A〜Eは、脊髄損傷(SCI)後の機能の回復に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)BBBスコアは、毎週4週間記録した。(B)SCIの2日後のMP処置ラットのBBBスコア。(C)個々の動物について第2日目に対して標準化したBBBスコア。(D)一貫性の足底ステップ(plantar stepping)の頻度および後肢−前肢協調、SCIの3週間後および4週間後に14以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。(E)対照と比較した、NgR(310)エクト−Fc−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置群における平均一股長さ。 図25A〜Eは、脊髄損傷(SCI)後の機能の回復に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)BBBスコアは、毎週4週間記録した。(B)SCIの2日後のMP処置ラットのBBBスコア。(C)個々の動物について第2日目に対して標準化したBBBスコア。(D)一貫性の足底ステップ(plantar stepping)の頻度および後肢−前肢協調、SCIの3週間後および4週間後に14以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。(E)対照と比較した、NgR(310)エクト−Fc−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置群における平均一股長さ。 図25A〜Eは、脊髄損傷(SCI)後の機能の回復に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)BBBスコアは、毎週4週間記録した。(B)SCIの2日後のMP処置ラットのBBBスコア。(C)個々の動物について第2日目に対して標準化したBBBスコア。(D)一貫性の足底ステップ(plantar stepping)の頻度および後肢−前肢協調、SCIの3週間後および4週間後に14以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。(E)対照と比較した、NgR(310)エクト−Fc−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置群における平均一股長さ。 図25A〜Eは、脊髄損傷(SCI)後の機能の回復に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)BBBスコアは、毎週4週間記録した。(B)SCIの2日後のMP処置ラットのBBBスコア。(C)個々の動物について第2日目に対して標準化したBBBスコア。(D)一貫性の足底ステップ(plantar stepping)の頻度および後肢−前肢協調、SCIの3週間後および4週間後に14以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。(E)対照と比較した、NgR(310)エクト−Fc−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置群における平均一股長さ。 図25A〜Eは、脊髄損傷(SCI)後の機能の回復に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)の効果を示す。(A)BBBスコアは、毎週4週間記録した。(B)SCIの2日後のMP処置ラットのBBBスコア。(C)個々の動物について第2日目に対して標準化したBBBスコア。(D)一貫性の足底ステップ(plantar stepping)の頻度および後肢−前肢協調、SCIの3週間後および4週間後に14以上ののスコアを達成した各群のラットの割合を示す。(E)対照と比較した、NgR(310)エクト−Fc−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置群における平均一股長さ。 図26A〜Bは、尾部から脊髄までの病変の軸索の数に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)処置の効果を示す。 図26A〜Bは、尾部から脊髄までの病変の軸索の数に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)エクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)処置の効果を示す。 図27は、前角内の運動ニューロンと接触するビオチンデキストランアミン(BDA)標識軸索の数に対する、ラットIgG[NgR(310)エクト−Fc]に融合されたラットNgR1(27〜310)のエクトドメインおよびメチルプレドニゾロン(MP)処置の効果を示す。
(発明の詳細な説明)
(定義および一般手法)
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、その定義を記載する本出願書類に支配される。また、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形のものを含むものとし、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および他の参考文献は、あらゆる目的のために、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。発明の他の特徴および利点は、該詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
本明細書全体および特許請求の範囲において、語句「含む(comprise)」または「含む(comprises)」または「含むこと(comprising)」などの変形型は、記載の整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことが示唆されることは理解されよう。
本発明をさらに規定するため、以下の用語および定義を本明細書に示す。
冠詞「a」または「an」を伴う用語存在体(存在体)は、1つ以上の該存在体をいうことに留意されたい。例えば、「免疫グロブリン分子」(an immunoglobulin molecule)は、1つ以上の免疫グロブリン分子表すと理解されたい。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つ(種類)以上の」および「少なくとも1つ(種類)の」は、本明細書において互換的に使用され得る。
本明細書で用いる場合、用語「からなる(consists of)」または「からなる(consist of)」または「からなる(consisting of)」などの変形型は、本明細書全体および特許請求の範囲において用いる場合、任意の記載の整数または整数の群を含むが、さらなる整数または整数の群は、指定した方法、構造または組成に付加され得ないことを示す。
本明細書で用いる場合、用語「本質的に〜からなる(は、から本質的になる。)」または「consist essentially of」または「consisting essentially of」などの変形型は、本明細書全体および特許請求の範囲において用いる場合、任意の記載の整数または整数の群を含み、指定した方法、構造または組成の基本的または新規な特性を実質的に変化させない任意選択の任意の記載の整数または整数の群を含むことを示す。
本明細書で用いる場合、「抗体」は、完全な免疫グロブリンまたはその抗原結合断片を意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス(例えば、M、D、G、EおよびA)もしくは任意のサブクラス(例えば、G1−4、A1−2)のものであり得、カッパ(κ)またはラムダ(λ)軽鎖のいずれかを有するものであり得る。
本明細書で用いる場合、「Fc」は、1つ以上の重鎖定常領域ドメインCH1、CH2およびCH3を含む免疫グロブリン重鎖の一部分を意味する。例えば、抗体の重鎖定常領域の一部分は、パパイン消化によって得られ得る(that is obtainable)。
本明細書で用いる場合、「NogoR融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合された可溶性Nogoレセプター−1部分を含むタンパク質を意味する。
本明細書で用いる場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部分がヒト配列で置き換えられた抗体を意味する。ヒト化抗体をどのようにして作製するかの例は、米国特許第6,054,297号、同第5,886,152号および同第5,877,293号を見るとよい。
本明細書で用いる場合、「キメラ抗体」は、第1の抗体由来の1つ以上の領域および少なくとも1つの他の抗体由来の1つ以上の領域を含む抗体を意味する。第1の抗体およびさらなる抗体は、同じまたは異なる種に由来するものであり得る。
本明細書および米国特許出願第60/402,866号で用いる場合、「Nogoレセプター」、「NogoR」、「NogoR−1」、「NgR」、「NgR−I」、「NgR1」および「NGR1」は、各々、Nogoレセプター−1を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって線形に連結されたモノマー(アミノ酸)で構成された分子をいう。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸の任意の1つまたは複数の鎖をいい、特定の長さの生成物をいうのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2つ以上のアミノ酸の1つもしくは複数の鎖を示すのに用いられる任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに互換的に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾の生成物を示すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するもの、または組換え手法により作製されるものであり得るが、必ずしも、指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、任意の様式で、例えば化学合成によって作製されるものであり得る。
本発明のポリペプチドは、大きさが、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のものであり得る。ポリペプチドは、規定の3次元構造を有するものであり得るが、必ずしもかかる構造を有するものでない。規定の3次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングされているといい、規定の3次元構造を有するのではなく、多数の異なるコンホメーションが採用され得るポリペプチドは、変性されているという。本明細書で用いる場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも1つの糖質部分にカップリングされたタンパク質をいい、該糖質は該タンパク質に、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖によって結合されている。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体により、その天然の環境状態にないポリペプチドが意図される。具体的な精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然の環境または自然環境から取り出されたものであり得る。宿主細胞内で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適当な手法によって分離、分別、または一部もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドであるため、本発明の目的(目的d)のために単離されているとみなす。
本発明において、「ポリペプチド断片」は、大きなポリペプチドの短いアミノ酸配列をいう。タンパク質断片は、「独立したもの(free−standing)」または該断片が一部の領域を構成するより大きなポリペプチド内に含まれたものであり得る。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、例えば、約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約60アミノ酸、約70アミノ酸、約80アミノ酸、約90アミノ酸、および約100アミノ酸長以上を含む断片が挙げられる。
用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類縁体」には、本発明のポリペプチドに言及する場合、少なくとも一部の生物学的活性を保持している任意のポリペプチドが含まれる。本明細書に記載のポリペプチドには、限定されないが、依然としてその機能が果たされる限り該ポリペプチドの断片、バリアントまたは誘導体分子が含まれ得る。本発明のNgR1ポリペプチドおよびポリペプチド断片には、タンパク質分解断片、欠失断片および、特に、動物に送達する場合、より容易に作用部位に達する断片が含まれ得る。ポリペプチド断片には、さらに、天然のポリペプチドの抗原性または免疫原性のエピトープ(例えば、線形で3次元のエピトープ)を含むポリペプチドの任意の部分が含まれる。本発明のNgR1ポリペプチドおよびポリペプチド断片は、バリアント領域を含むもの、例えば、上記の断片、また、アミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。バリアントは、天然に存在するもの、例えば、対立遺伝子バリアントなどであり得る。「対立遺伝子バリアント」により、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の択一的形態が意図される。Genes II Lewin,B.編、John Wiley & Sons、New York(1985)。天然に存在しないバリアントは、当該技術分野で知られた変異誘発手法を用いて作製され得る。本発明のNgR1ポリペプチドおよびポリペプチド断片は、同類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含むものであり得る。また、本発明のNgR1ポリペプチドおよびポリペプチド断片には、誘導体分子が含まれ得る。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類縁体」と称することもある。本明細書で用いる場合、ポリペプチドまたはポリペプチド断片の「誘導体」は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化された1つ以上の残基を有する主題のポリペプチドをいう。また、「誘導体」として、20個の標準アミノ酸の1つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例えば、4−ヒドロキシプロリンはプロリンの代わりに使用され得る;5−ヒドロキシリシンは、リシンの代わりに使用され得る;3−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに使用され得る;ホモセリンはセリンの代わりに使用され得る;およびオルニチンはリシンの代わりに使用され得る。
本明細書で用いる場合、用語「ジスルフィド結合」には、2つのイオウ原子間で形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインはチオール基を含み、これにより、第2のチオール基とのジスルフィド結合または橋絡が形成され得る。
本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」は、第1のポリペプチドがペプチド結合によって第2のポリペプチドに線形に連結されて構成されたタンパク質を意味する。第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、同一であっても異なっていてもよく、直接連結されていても、ペプチドリンカー(下記参照)によって連結されていてもよい。
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸の分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)をいう。ポリヌクレオチドは、非翻訳5’および3’配列、コード配列を含む、完全長cDNA配列のヌクレオチド配列を含有するものであり得る。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合を含むもの、または非通常でない結合(例えば、アミド結合、例えばペプチド核酸(PNA)に見られる)を含むものであり得る。該ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されたものであり得、これらは、未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、単鎖および二本鎖DNA、単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるDNA、単鎖および二本鎖RNA、ならびに単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるRNA、単鎖またはより典型的には二本鎖もしくは単鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子で構成されたものであり得る。また、該ポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域で構成されたものであり得る。また、ポリヌクレオチドは、安定性のため、または他の理由で、1つ以上の修飾塩基または修飾されたDNAもしくはRNA主鎖を含有するものであり得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基(例えば、イノシンなど)が挙げられる。さまざまな修飾がDNAおよびRNAに対して行なわれ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態が包含される。
用語「核酸」は、任意の1つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド内に存在するDNAまたはRNA断片をいう。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドにより、その天然の環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAが意図される。例えば、ベクター内に含有された、本発明のNgRポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されているとみなす。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中の(一部もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたRNA分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに、合成により作製されるかかる分子が含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどを含むもの、または含まないものであり得る。
本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)は、アミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなされ得るが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。2つ以上の本発明のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物内(例えば、単一のベクター上)、または別々のポリヌクレオチド構築物内(例えば、別々の(異なる)ベクター上)に存在することがあり得る。さらにまた、任意のベクターは、単一のコード領域を含むものであり得るか、または2つ以上のコード領域を含むものであり得、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることがあり得る。また、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のNgRポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする核酸に融合された、または融合されていないのいずれかである異種コード領域をコードするものであり得る。異種コード領域としては、限定されないが、特別なエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどが挙げられる。
特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つ以上のコード領域と作動可能に結合されたプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むものであり得る。作動可能な結合は、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)のコード領域が1つ以上の調節配列が、遺伝子産物の発現が調節配列(1つまたは複数)の影響または制御下に置かれるような様式で結合している場合に存在する。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびこれと結合しているプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写がもたらされる場合、および2つのDNA断片間の連結の性質によって、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指令する能力が妨げられない、もしくはDNA鋳型が転写される可能性が妨げられない場合、「作動可能に結合」されている。したがって、プロモーター領域は、該プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合、該核酸と作動可能に結合されていることになる。プロモーターは、所定の細胞内のみでDNAの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルが該ポリヌクレオチドと作動可能に結合され、細胞特異的転写が指令され得る。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。
さまざまな転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス(最初期プロモーター、イントロン−Aと連結)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、およびレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスなど)に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどが挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子に由来するもの(例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギ β−グロビン)、ならびに真核生物細胞内で遺伝子発現を制御し得る他の配列などが挙げられる。さならる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導型プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導され得るプロモーター)が挙げられる。
同様に、さまざまな翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント(特に、内部リボソーム侵入部位、またはIRES(CITE配列とも称される))が挙げられる。
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態のRNAである。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌またはシグナルペプチドをコードし、かつ本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドの分泌を指令するさらなるコード領域と結合されていることがあり得る。このシグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、これは、粗製小胞体を超えて成長しているタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者には、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、該ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これは、完全なまたは「完全長」ポリペプチドから切断され、該ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態が生成されることは認識されよう。特定のある実施形態では、天然のシグナルペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド)、またはそれと作動可能に結合され、該ポリペプチドの分泌を指令する能力を保持している配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能性誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換され得る。
本明細書で用いる場合、用語「操作された」には、合成手段(例えば、組換え手法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリングまたはこれらの手法のいくつかの組合せ)による核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「結合された」、「融合された」および「融合」は互換的に用いる。これらの用語は、どのような手段であれ(例えば、化学的結合体化または組換え手段)、2つ以上の(two more)要素または成分が互いに連結されていることをいう。「インフレーム融合」は、2つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)が、元のORFの正しい翻訳リーディングフレームが維持される様式で連結されて、より長い連続的なORFが形成されていることをいう。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORFにコードされたポリペプチドに対応する2つ以上の(two ore more)セグメント(該セグメントは、通常、自然界ではこのように連結されていない)を含む単一のタンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体において連続的となるが、該セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分断されていてもよい。
「リンカー」配列は、融合タンパク質内の2つのポリペプチドコード領域を分断する一連の1つ以上のアミノ酸である。典型的なリンカーは少なくとも5個のアミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも10または少なくとも15個のアミノ酸を含むものである。特定のある実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸は、該リンカーが親水性となるように選択される。リンカー(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)(G4S)(配列番号65)は、充分な柔軟性をもたらすため、好ましいリンカーであり、多くの抗体に広く適用可能である。他のリンカーとしては、
Figure 2013048638
が挙げられる。より短いリンカーの例としては、上記のリンカーの断片が挙げられ、より長いリンカーの例としては、上記のリンカーの組合せ、上記のリンカーの断片の組合せ、および上記のリンカーと上記のリンカーの断片との組合せが挙げられる。
ポリペプチドとの関連において、「線形配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、ここで、該配列内で互いに隣接する残基は、そのポリペプチドの一次構造において連続している。
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、遺伝子により生化学物質、例えば、RNAまたはポリペプチドがもたらされるプロセスをいう。該プロセスとしては、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕現、例えば、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現と安定な発現の両方などが挙げられる。これには、限定されないが、遺伝子が、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、スモールヘアピン型RNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)または任意の他のRNA産物に転写されること、およびかかるmRNAがポリペプチド(1種類または複数種)に翻訳されること、ならびに転写または翻訳のいずれかが調節される任意のプロセスが含まれる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現には、該生化学物質および任意の前駆物質の作出が含まれる。遺伝子の発現により「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書で用いる場合、遺伝子産物は、核酸(例えば、遺伝子の転写によってもたらされるメッセンジャーRNA)、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、さらに、転写後修飾(例えば、ポリアデニル化)を有する核酸、または翻訳後修飾(例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解的切断)を有するポリペプチドなどが包含される。
用語「RNA干渉」または「RNAi」は、siRNAによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少をいう。これは、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、その二本鎖領域においてサイレンシングされた遺伝子の配列に相同なsiRNAによって開始される。該遺伝子は、その生物体に対して内因性および外因性であり得、染色体内に組み込まれたものであり得るか、またはゲノム内に組み込まれていないトランスフェクションベクター内に存在させ得る。遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または一部阻害されるかのいずれかである。RNAiはまた、標的RNAの機能を阻害すると考えられ得、標的RNAの機能は完全または一部であり得る。
本明細書で用いる場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的(prophylactic/preventative)手段の両方をいい、ここで、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害(例えば、多発性硬化症の進行など)を妨げるか、または遅滞(低減)させることである。有益な、または所望の臨床的成果としては、限定されないが、症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅滞または遅延、疾患状態の改善または待期、および寛解(一部または完全のいずれも)(検出可能なもの、または検出可能でないものいずれも)が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測される生存と比べたときの生存の延長を意味し得る。処置を必要とする対象としては、既に該状態または障害を有する対象、ならびに該状態または障害を有する傾向にある対象、または該状態または障害が予防されるべき対象が挙げられる。
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、診断、予後または治療が所望される任意の被験体、特に哺乳動物被験体が意図される。哺乳動物被験体としては、限定されないが、ヒト、家畜、飼養動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなど);霊長類(例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど);イヌ科(例えば、イヌおよびオオカミなど);ネコ科(例えば、ネコ、ライオンおよびトラなど);ウマ科(例えば、ウマ、ロバおよびシマウマなど);食用動物(例えば、ウシ、ブタおよびヒツジなど);有蹄動物(例えば、シカおよびキリンなど);齧歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなど);などが挙げられる。特定のある実施形態において、哺乳動物はヒト被験体である。
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。治療成果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療成果は「治癒」である必要はない。
本明細書で用いる場合、「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被験体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
本発明は、ニューロンの生存、神経突起伸長およびニューロン(例えば、CNSのニューロン)の軸索の再生を促進させるある種のNgR1アンタゴニストに関する。例えば、本発明は、NgR1ポリペプチドならびにそのポリペプチド断片、抗体および断片、ならびに軸索の成長が通常阻害される条件下で軸索の成長を刺激するポリヌクレオチドを提供する。したがって、本発明のNgR1アンタゴニストは、ニューロンの生存を促進させることにより、またはCNSにおける軸索の成長もしくは再生の刺激によって軽減され得る損傷、疾患または障害の処置に有用である。
例示的なCNSの疾患、障害または損傷としては、限定されないが、多発性硬化症(MS)、進行性多病巣性白質脳障害(PML)、脳脊髄炎(EPL)、橋中央ミエリン溶解(CPM)、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病(PMZ)、球様細胞白質萎縮症(クラッベ病)およびウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後損傷、化学療法の神経病の合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンE欠乏症、孤立性ビタミンE欠乏症候群、AR、バッセン‐コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ‐ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ならびにベル麻痺が挙げられる。これらの疾患のうち、MSは最も広範に見られ、世界中でほぼ250万人が罹患している。
Nogoレセプター1ポリペプチド
一態様において、本発明は、免疫原性であるNogoレセプター−1ポリペプチドに関する。本発明の一部のある実施形態において、該免疫原性ポリペプチドは、本質的に、LDLSDNAQLRVVDPTT(ラット)(配列番号1);LDLSDNAQLRSVDPAT(ヒト)(配列番号2);AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(ラット)(配列番号3);AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(ヒト)(配列番号4);およびCRLGQAGSGA(マウス)(配列番号5)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1に結合するモノクローナル抗体に結合されるNogoレセプター1ポリペプチドに関する。一部のある実施形態において、該ポリペプチドは、7E11モノクローナル抗体によって認識される。一部のある実施形態において、該ポリペプチドは、LDLSDNAQLR(配列番号27);LDLSDDAELR(配列番号29);LDLASDNAQLR(配列番号30);LDLASDDAELR(配列番号31);LDALSDNAQLR(配列番号32);LDALSDDAELR(配列番号33);LDLSSDNAQLR(配列番号34);LDLSSDEAELR(配列番号35);DNAQLRVVDPTT(配列番号36);DNAQLR(配列番号37);ADLSDNAQLRVVDPTT(配列番号41);LALSDNAQLRVVDPTT(配列番号42);LDLSDNAALRVVDPTT(配列番号43);LDLSDNAQLHVVDPTT(配列番号44);およびLDLSDNAQLAVVDPTT(配列番号46)からなる群より選択される。
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号1〜5、26〜27、29〜37および41〜45のポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明の一部のある実施形態において、該核酸分子は、発現制御配列(例えば、pCDNA(I))に連結されている。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。本発明の一部のある実施形態において、該ベクターは、クローニングベクターである。本発明の一部のある実施形態において、該ベクターは発現ベクターである。本発明の一部のある実施形態では、該ベクターは、少なくとも1種類の選択可能マーカーを含有するものである。
本発明はまた、上記の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の免疫原性ポリペプチドの作製方法に関する。一部のある実施形態において、宿主細胞は原核生物のものである。一部のある実施形態では、宿主細胞は真核生物のものである。一部のある実施形態において、宿主細胞は酵母である。
本発明はまた、例えば、神経突起伸長の促進、ニューロンの生存の促進、軸索の生存の促進、またはNgR1シグナル伝達複合体によるシグナル伝達の阻害のために有用な、ある種のNogoレセプター−1ポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。典型的には、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片は、ニューロンの生存、神経突起伸長または中枢神経系(CNS)ニューロンの軸索の再生のNgR1媒介性阻害をブロックする機能を果たす。
ヒトNgR1ポリペプチドを以下に配列番号49として示す。
完全長ヒトNgR1(配列番号49):
Figure 2013048638
ラットNgR1ポリペプチドを以下に配列番号50として示す。
完全長ラットNgR1(配列番号50):
Figure 2013048638
マウスNgR1ポリペプチドを以下に配列番号51として示す。
完全長マウスNgR1(配列番号51):
Figure 2013048638
(抗体)
本発明は、さらに、本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。一部のある実施形態において、該抗体または抗原結合断片は、本質的に、配列番号1〜5、26〜27、29〜37および41〜45からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する。本発明の該抗体または抗原結合断片は、インビボまたはインビトロで作製され得る。抗体または抗原結合断片の作製を、以下に論考する。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、リガンド(例えば、NogoA、NogoB、NogoC、MAG、OM−gp)へのNogoレセプター−1の結合を阻害し、神経突起の伸長および出芽(特に、軸索の成長)のミエリン媒介性阻害を低減させ、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱を減衰させる。
一部のある実施形態において、抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片は、マウスのものである。一部のある実施形態では、Nogoレセプター−1はラット由来のものである。他の実施形態では、Nogoレセプター−1はヒトのものである。一部のある実施形態において、抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片は、組換えられた、操作された、ヒト化された、および/またはキメラのものである。
一部のある実施形態において、該抗体は、モノクローナル7E11(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4587);モノクローナル1H2(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4584);モノクローナル2F7(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4585);モノクローナル3G5(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4586);およびモノクローナル5B10(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4588)からなる群より選択される。一部のある実施形態において、該抗体は、ポリクローナル抗体46である。
例示的な抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb、および相補性決定領域(CDR)断片を含有する断片、単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、ダイアボディならびにポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに充分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む該ポリペプチド(例えば、イムノアドヘシン)である。
本明細書で用いる場合、Fdは、VおよびCH1ドメインからなる断片を意味し、Fvは、抗体の単一のアームのVおよびVドメインからなる断片を意味し、dAbは、Vドメインからなる断片を意味する(Wardら、Nature 341:544−546(1989))。本明細書で用いる場合、単鎖抗体(scFv)は、V領域とV領域が対合し、これらが単一のタンパク質の鎖となることを可能にする合成リンカーによって一価の分子を形成している抗体を意味する(Birdら、Science 242:423−426(1988)およびHustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883(1988))。本明細書で用いる場合、ダイアボディは、VおよびVドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーが使用されており、それにより、該ドメインが強制的に別の鎖相補的なドメインと対合され、2つの抗原結合部位が作出された二重特異性抗体を意味する(例えば、Holliger,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)およびPoljak、R.J.ら、Structure 2:1121−1123(1994)を参照のこと)。本明細書で用いる場合、目的の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンは、1つ以上のCDRが共有結合または非共有結合のいずれかにより組み込まれたものであり得る分子を意味する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のNogoレセプター−1抗体のサブユニットポリペプチドであって、(a)重鎖またはその可変領域;および(b)軽鎖またはその可変領域からなる群より選択されるサブユニットポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のNogoレセプター−1抗体のサブユニットポリペプチドの重鎖もしくはその可変領域、または軽鎖およびその可変領域をコードする核酸を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のNogoレセプター−1抗体の超可変領域(CDR)またはCDRをコードする核酸を提供する。
(免疫処置)
本発明の抗体は、適当な宿主(例えば、脊椎動物、例えば、ヒト、マウス 、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類、ならびに鳥類、爬虫類および魚類の卵)の免疫処置によって生成され得る。かかる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
一部のある実施形態において、宿主は、本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドで免疫処置される。他の実施形態では、宿主は、完全な細胞または破砕細胞の細胞膜と会合したNogoレセプター−1で免疫処置され、本発明の抗体は、本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドへの結合によって同定される。
一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1抗原は、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに投与される。アジュバントは、多くの場合、抗原への免疫応答を惹起するために抗原に加えて投与する必要がある。このようなアジュバントは、通常、非特異的炎症を促進させて免疫処置の部位に単核食細胞を漸増させる不溶性または非分解性の物質である。アジュバントの例としては、限定されないが、フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)、ISCOM(免疫賦活複合体)またはその断片が挙げられる。
抗体の作製方法の概説については、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies,A Laboratory Manual(1988);Yelton,D.E.ら、Ann.Rev.of Biochem.50:657−80.(1981);ならびにAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology(New York:John Wiley & Sons)(1989)を参照のこと。本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドとの免疫反応性の測定は、当該技術分野でよく知られた任意のいくつかの方法、例えば、イムノブロットアッセイおよびELISAによって行われる。
(抗体の作製および抗体産生細胞株)
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(上掲)に記載のような標準的な手順によって作製され得る。
簡単には、適切な期間で動物を致死させ、リンパ節および/または脾臓B細胞を、当該技術分野でよく知られたいくつかの手法の任意の1つ、例えば限定されないが、EBVなどでの形質転換または骨髄腫細胞などの不死化細胞株との融合によって不死化させる。その後、該細胞をクローン毎に分離し、各クローンの上清みを、本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドに特異的な抗体の産生について試験する。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび拡大培養の方法は、当該技術分野でよく知られている。同様に、免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同定の方法も、当該技術分野で知られている。
本発明の抗体を作製するための他の適当な手法は、Nogoレセプター−1または本発明の免疫原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロ曝露、あるいはまた、ファージまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーの選択を伴う。Huseら、Science,246:1275−81(1989)を参照のこと。本発明に有用な抗体は、修飾を伴って、またはなしで使用され得る。
抗原(この場合、本発明のNogoレセプター−1または免疫原性ポリペプチド)および抗体は、検出可能なシグナルをもたらす物質に、共有結合または非共有結合のいずれかによって連結することにより標識され得る。種々の標識および結合体化手法が当該技術分野で知られており、本発明の実施に使用され得る。好適な標識としては、限定されないが、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光因子、化学発光因子、磁気粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;同第4,275,149号および同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが作製され得る(米国特許第4,816,567号参照)。
本発明の一部のある実施形態において、抗体は多重結合特異性を有するものであり、二機能性抗体などは、当業者に知られたいくつかの手法(ハイブリッドハイブリドーマの作製、ジスルフィド交換、化学的架橋、2つのモノクローナル抗体間へのペプチドリンカーの付加、特定の細胞株内への2組の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の導入など(より詳細な論考については下記参照))の任意の1つによって調製される。
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体、例えば、不死化ヒト細胞、SCID−huマウスまたは「ヒト」抗体を産生し得る他の非ヒト動物によって産生されるものであり得る。
(ファージディスプレイライブラリー)
本発明の抗Nogoレセプター−1抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例示的なコンビナトリアルライブラリーは、本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドに対する結合に関するものである(例えば、scFvファージディスプレイライブラリーなど、本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドで免疫処置した動物由来のmRNAから調製されるVおよびVのcDNAを用いて調製される)。かかるライブラリーの調製およびスクリーニングのための方法論は、当該技術分野で知られている。ファージディスプレイライブラリーの作製のための方法および材料には市販のものがある(例えば、Pharmacia
Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27−9400−01;Stratagene SurfZAPTMファージディスプレイキット、カタログ番号240612;およびMorphoSys製の他のもの)。また、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに使用され得る方法および試薬が他にもある(例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号;KangらのPCT公開公報WO 92/18619;DowerらのPCT公開公報WO 91/17271;WinterらのPCT公開公報WO 92/20791;MarklandらのPCT公開公報WO 92/15679;BreitlingらのPCT公開公報WO 93/01288;McCaffertyらのPCT公開公報WO 92/01047;GarrardらのPCT公開公報WO 92/09690;Fuchsら、Bio/Technology 9:1370−1372(1991);Hayら、Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85;(1992)Huseら、Science 246:1275−1281(1989);McCaffertyら、Nature 348:552−554(1990);Griffithsら、EMBO J.12:725−734(1993);Hawkinsら、J.Mol.Biol.226:889−896(1992);Clacksonら、Nature 352:624−628(1991);Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576−3580(1992);Garradら、Bio/Technology 9:1373−1377(1991);Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.7P:4133−4137(1991);およびBarbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:7978−7982(1991)を参照のこと。
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの本発明の抗Nogoレセプター−1抗体のスクリーニングおよび単離後、選択した抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージ(例えば、ファージゲノム)から回収され、他の発現ベクター内に、標準的な組換えDNA手法によってサブクローニングされ得る。所望の場合には、該核酸は、本発明の他の抗体形態(後述)を作出するために、さらに操作され得る。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離された抗体を発現させるため、抗体の重鎖および軽鎖またはその可変領域をコードするDNAを、組換え発現ベクター内にクローニングし、上記のような哺乳動物宿主細胞内に導入される。
(クラススイッチング)
本発明の抗Nogoレセプター−1抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。任意の所望のアイソタイプの抗体が、クラススイッチングによって作製され得る。クラススイッチングには、VまたはVをコードする核酸であって、CまたはCをコードするヌクレオチド配列をなんら含まない核酸が、当該技術分野でよく知られた方法を用いて単離される。VまたはVをコードする核酸は、次いで、所望のクラスの免疫グロブリン分子由来のCまたはCをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、上記のようなCまたはC鎖を含むベクターまたは核酸を用いてなされ得る。例えば、元はIgMであった本発明の抗Nogoレセプター−1抗体が、IgGにクラススイッチングされ得る。さらに、クラススイッチングを用いて、1つのIgGサブクラスが別のものに、例えば、IgGlかIgG2に変換され得る。
(変異抗体)
他の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、抗体の結合特性を改変するために、重鎖および/または軽鎖の可変ドメインが変異されたものであり得る。例えば、Nogoレセプター−1に対する抗体のKを大きくまたは小さくするため、Koffを大きくまたは小さくするため、抗体の結合特異性を改変するために、変異は1つ以上のCDR領域に行われ得る。部位特異的変異誘発の手法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning−A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology(New York:John Wiley & Sons)(1989)を参照のこと。好ましい実施形態において、変異は、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体の可変領域内の生殖細胞系と比べて変化されることがわかっている1つのアミノ酸残基において行われる。一部のある実施形態において、変異は、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体の可変領域内の生殖細胞系と比べて変化されることがわかっている1つ以上のアミノ酸残基において行われる。別の実施形態において、抗体重鎖または軽鎖可変領域をコードする核酸は、1つ以上のフレームワーク領域において変異される。半減期を増大させるため、変異がフレームワーク領域または定常ドメイン内に行われ得る。フレームワーク領域または定常ドメイン内の変異はまた、抗体の免疫原性を改変するため、別の分子への共有もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体結合などの特性を改変するために行われ得る。変異は、単一の変異抗体内のフレームワーク領域、定常ドメインおよび可変領域の各々に行われ得る。あるいはまた、変異は、単一の変異抗体内のフレームワーク領域、可変領域または定常ドメインのうちの1つのみに行われ得る。
(融合抗体およびイムノアドヘシン)
別の実施形態において、別のポリペプチドに連結された本発明の抗Nogoレセプター−1抗体の全部または一部を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。一部のある実施形態では、抗Nogoレセプター−1抗体の可変領域のみが、該ポリペプチドに連結されている。他の実施形態では、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体のVドメインが第1のポリペプチドに連結されており、一方、該抗体のVドメインは、VおよびVドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成することを可能にする様式で第1のポリペプチドと会合している第2のポリペプチドに連結されている。他の実施形態において、VドメインはVドメインと、VおよびVドメインが互いに相互作用することを可能にするリンカーによって分断されている(下記の単鎖抗体を参照のこと)。次いで、V−リンカー−V抗体を、目的のポリペプチドに連結させる。融合抗体は、ポリペプチドを、Nogoレセプター−1リガンドを発現する細胞または組織に指向させるのに有用である。目的のポリペプチドは、治療用薬剤(毒素など)であり得るか、または診断用薬剤、例えば、容易に可視化され得る酵素(ホースラディッシュペルオキシダーゼなど)であり得る。また、2つ(またはそれ以上)の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体が作出され得る。これは、単一のポリペプチド鎖で二価もしくは多価の抗体の作出が望まれる場合、または二重特異性抗体の作出が望まれる場合に有用である。
(単鎖抗体)
本発明には、本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドに結合する単鎖抗体(scFv)が含まれる。ScFvを作製するために、V−およびV−コードDNAを、フレキシブルリンカーをコードするDNAに(例えば、アミノ酸配列(Gly−Ser)(配列番号10)をコードするDNSに)、VおよびV配列が、該VおよびV領域がフレキシブルリンカーによって連結された隣接単鎖タンパク質として発現され得るように作動可能に連結させる(例えば、Birdら、Science 242:423−426(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85:5879−5883(1988);McCaffertyら、Nature 348:552−554(1990)を参照のこと)。単鎖抗体は、単独のVおよびVが使用される場合は一価であり得、2種類のVおよびVが使用される場合は二価であり得、または2種類以上のVおよびVLが使用される場合は多価であり得る。
(キメラ抗体)
本発明には、さらに、一方の特異性が本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドに対するものである二重特異性抗体またはその抗原結合断片が含まれる。一実施形態において、1つの結合ドメインを介して本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドに、および第2の結合ドメインを介して第2の分子に特異的に結合するキメラ抗体が作製され得る。キメラ抗体は、組換え分子生物学的手法により作製されたものであり得るか、または互いに物理的に結合体化させたものであり得る。また、1種類より多くのVおよびVを含有し、本発明のポリペプチドと、ミエリン媒介性成長円錐の虚脱の減弱ならびに神経突起の伸長および出芽の阻害と関連する別の分子とに特異的に結合する単鎖抗体が作製され得る。かかる二重特異性抗体は、よく知られた手法(例えば、Fangerら、Immunol Methods 4:72−81(1994)ならびにWrightおよびHarris(上掲))を用いて作製され得、(iii)に関しては、例えば、Trauneckerら Int.J.Cancer(増補版)7:51−52(1992)を参照のこと。
一部のある実施形態において、キメラ抗体は、本発明の抗体由来の1つ以上の可変領域を用いて調製される。別の実施形態では、キメラ抗体は、前記抗体由来の1つ以上のCDR領域を用いて調製される。
(誘導体化抗体および標識された抗体)
本発明の抗体または抗原結合断片は、誘導体化されたもの、または別の分子(例えば、別のペプチドまたはタンパク質)に連結されたものであり得る。一般に、該抗体または抗原結合断片は、本発明のポリペプチドへの結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように誘導体化される。例えば、本発明の抗体または抗体の一部は、1つ以上の他の分子存在体、例えば、別の抗体(例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ)、検出剤、細胞傷害剤、医薬用薬剤および/または該抗体または抗原結合断片と別の分子(ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど)との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドなどに、機能的に連結され得る(化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他)。
一部のある実施形態において、誘導体化抗体は、2種類以上の抗体(同じ型または異なる型のもの、例えば、二重特異性抗体を作出するため)を架橋することにより作製される。好適な架橋剤としては、ヘテロ二機能性であって、適切なスペーサーによって分断された2つの異なる反応性基を有するもの(例えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、またはホモ二機能性のもの(例えば、ジスクシンイミジルスベレート)が挙げられる。かかるリンカーは、Pierce Chemical Company、ロックフォード、Illから入手可能である。
一部のある実施形態において、誘導体化抗体は標識された抗体である。本発明の抗体または抗体の一部が誘導体化され得る例示的な検出剤は、蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などである。抗体はまた、検出に有用な酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識されたものであり得る。検出可能な酵素で標識された実施形態において、抗体は、検出可能な反応生成物をもたらすために該酵素によって利用されるさらなる試薬を添加することにより検出される。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼとともに過酸化水素およびジアミノベンジジン。抗体はまた、ビオチンで標識され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定により検出され得る。抗体はまた、第2のレポーター(例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識され得る。
また、抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原−断片は、放射能標識アミノ酸で標識され得る。放射能標識は、診断目的および治療目的の両方に使用され得る。放射能標識された抗Nogoレセプター−1抗体は、例えば、被験体においてNogoレセプター−1レベルを測定するために診断的に使用され得る。さらに、放射能標識された抗Nogoレセプター−1抗体は、脊髄損傷を処置するために治療的に使用され得る。ポリペプチド用の標識の例としては、限定されないが、以下:H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131Iの放射性同位体または放射性ヌクレオチドが挙げられる。
また、抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原−断片は、ポリエチレングリコール(PEG)、メチルもしくはエチル基、または糖鎖基などの化学基で誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、血清半減期を増大させるため、または組織結合を増大させるために有用であり得る。
(抗Nogoレセプター−1抗体の特徴付け)
(抗Nogoレセプター−1抗体のクラスおよびサブクラス)
抗Nogoレセプター−1抗体のクラスおよびサブクラスは、当該技術分野で知られた任意の方法によって決定され得る。一般に、該抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定され得る。かかる抗体は市販されている。該クラスおよびサブクラスは、ELISA、ウエスタンブロットならびに他の手法によって決定され得る。あるいはまた、クラスおよびサブクラスは、該抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定し、そのアミノ酸配列を免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知アミノ酸配列と比較し、該抗体のクラスおよびサブクラスを決定することにより決定され得る。
Nogoレセプター−1に対する抗Nogoレセプター−1抗体の結合親和性
本発明のNogoレセプター−1ポリペプチドに対する本発明の抗Nogoレセプター−1抗体の結合親和性および解離速度は、当該技術分野で知られた任意の方法によって測定され得る。例えば、結合親和性は、競合的ELISA、RIA、BIAcoreまたはKinExA手法によって測定され得る。また、解離速度は、BIAcoreまたはKinExA手法によって測定され得る。結合親和性および解離速度は、表面プラズモン共鳴によって(例えば、BIAcoreのものを使用)測定される。7E11および1H2のKは、それぞれ、1×10−7Mおよび2×10−8Mであると測定された。
抗Nogoレセプター−1抗体によるNogoレセプター−1活性の阻害
一部のある実施形態において、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片は、リガンドへのNogoレセプター−1の結合を阻害する。かかる阻害のIC50は、当該技術分野で知られた任意の方法によって、例えば、ELISA、RIA、または機能的拮抗(Functional Antagonism)によって測定され得る。一部のある実施形態において、IC50は0.1〜500nMである。一部のある実施形態では、IC50は10〜400nMである。また他の実施形態において、該抗体またはその一部分は、60nM〜400nMのIC50を有する。7E11および1H2のIC50は、それぞれ、結合アッセイにおいて400nM〜60nMであると測定された。表3(下記)も参照のこと。
一部のある実施形態において、本発明にはまた、NgR1活性のアンタゴニストであるNgR1特異的抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれる。例えば、NgR1へのある種のNgR1抗体の結合により、ニューロンの生存、神経突起伸長または中枢神経系(CNS)ニューロンの軸索の再生のNgR1媒介性阻害が遮断される。
他の実施形態において、本発明には、NgR1の少なくとも1つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれ、ここで、該エピトープは、配列番号49の少なくとも約4〜5個のアミノ酸、配列番号49の少なくとも7、少なくとも9または少なくとも約15〜約30個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的になるか、または該アミノ酸からなるものである。上記の配列番号49の所与のエピトープアミノ酸は、隣接または線形であり得るが、そうである必要はない。特定のある実施形態において、NgR1の少なくとも1つのエピトープは、細胞表面上に発現されるか、または例えば、IgGのFc領域に融合された可溶性断片として発現されるNgR1の細胞外ドメインによって形成された非線形エピトープを含むか、該エピトープから本質的になるか、または該エピトープからなるものである。したがって、特定のある実施形態において、NgR1の少なくとも1つのエピトープは、配列番号49の少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、約15〜約30個、または少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100個の隣接するまたは隣接しないアミノ酸(ここで、隣接しないアミノ酸は、タンパク質フォールディングによりエピトープを構成する)を含むか、該アミノ酸から本質的になるか、または該アミノ酸からなるものである。
他の実施形態において、本発明には、NgR1の少なくとも1つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれ、ここで、該エピトープは、上記の配列番号49の1、2、3、4、5、6個またはそれ以上の隣接するまたは隣接しないアミノ酸に加えて、該タンパク質を修飾するさらなる部分(例えば、糖質部分を、NgR1抗体が、該タンパク質の未修飾異形に結合するよりも高い親和性で修飾標的タンパク質に結合するように含め得る)を含むか、該部分から本質的になるか、または該部分からなるものである。あるいはまた、NgR1抗体は、標的タンパク質の未修飾異形には全く結合しないものである。
特定のある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、上記のNgR1または断片もしくはバリアントの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、無関連またはランダムなエピトープに結合するよりも容易に結合する、上記のNgR1または断片もしくはバリアントの少なくとも1つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、関連の類似した同族または類縁のエピトープに結合するよりも容易に結合する;それ自体が上記のNgR1または断片もしくはバリアントのある特定のエピトープに特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する;あるいは、上記のNgR1または断片もしくはバリアントの少なくとも1つのエピトープに、約5×10−2M、約10−2M、約5×10−3M、約10−3M、約5×10−4M、約10−4M、約5×10−5M、約10−5M、約5×10−6M、約10−6M、約5×10−7M、約10−7M、約5×10−8M、約10−8M、約5×10−9M、約10−9M、約5×10−10M、約10−10M、約5×10−11M、約10−11M、約5×10−12M、約10−12M、約5×10−13M、約10−13M、約5×10−14M、約10−14M、約5×10−l5M、または約10−15M未満の解離定数KDを特徴とする親和性で結合する。特別な一態様において、該抗体またはその断片は、マウスNgR1ポリペプチドまたはその断片と比べ、ヒトNgR1ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
抗体結合解離定数との関連で用いる場合、用語「約」は、抗体親和性の測定に用いた方法に固有の変動の程度を許容する。例えば、使用する器具類の制度のレベル、測定対象の試料の数に基づく標準誤差および丸め誤差に応じて、用語「約10−2M」は、例えば0.05M〜0.005Mを包含し得る。
具体的なある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、NgR1ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、5×10−2−1、10−2−1、5×10−3−1または10−3−1以下のオフレート(off rate)(k(off))で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、NgR1ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、5×10−4−1、10−1、5×10−5−1または10−5−1 5×10−6−1、10−6−1、5×10−7−1または10−7−1以下のオフレート(k(off))で結合する。
他の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、NgR1ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、10−1−1、5×10−1−1、10−1−1または5×10−1−1以上のオンレート(on rate)(k(on))で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、NgR1ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、10−1−1、5×10−1−1、10−1−1または5×10−1−1または10−1−1以上のオンレート(k(on))で結合する。
一実施形態において、本発明の方法における使用のためのNgR1アンタゴニストは、抗体分子またはその免疫特異的断片である。特に記載のない限り、本明細書で用いる場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片をいう。一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、または抗体(例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体)、または1つより多くのエピトープ(例えば、1つより多くの抗原もしくは同じ抗原上の1つより多くのエピトープ)に対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性抗体は、NgR1上の少なくとも1つのエピトープに特異的な少なくとも1つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、NgR1のエピトープに特異的な2つの標的結合ドメインおよび第2の標的に特異的な2つの標的結合ドメインを有する四価抗体であり得る。したがって、四価の二重特異性抗体は、各特異性に対して二価のものであり得る。
特定のある実施形態において(In certain embodiments of)、本発明は、定常領域ドメインの1つ以上の少なくとも一画分が、所望の生化学的特性、例えば、エフェクター機能の低減、非共有結合により二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力の増大、血清半減期の減少、またはほぼ同じ免疫原性の完全体の非改変抗体と比べた場合の血清半減期の増大などがもたらされるように欠失あるいは改変されたNgR1アンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片の投与を含む。例えば、本明細書に記載の処置方法における使用のためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含むが、1つ以上のその重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、修飾抗体の定常領域の1つのドメイン全体が欠失しており、例えば、CH2ドメインの全部または一部が欠失している。
本明細書に記載の治療方法における使用のためのある種のNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片において、Fc部分が、当該技術分野で知られた手法を用いて、エフェクター機能が改変(例えば、増大、低減またはモジュレート)されるように変異され得る。例えば、定常領域ドメインの(点変異もしくは他の手段による)欠失または不活化により、循環修飾抗体のFcレセプター結合が低減され、それにより、腫瘍局在が増大され得る。他の場合では、本発明と整合する該定常領域の修飾により、補体結合がモジュレートされ、したがって、結合体化細胞毒素の血清半減期および非特異的会合が低減され得る。定常領域のまた他の修飾が、抗原特異性または抗体柔軟性の増大による局在の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分の修飾に使用され得る。該修飾で得られる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば、腫瘍局在、生体分布および血清半減期などは、必要以上の実験を行なうことなく、よく知られた免疫学的手法を用いて容易に測定および定量され得る。
本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片の修飾形態は、完全体の前駆体または親抗体から当該技術分野で知られた手法を用いて作製され得る。例示的な手法を、本明細書においてより詳細に論考する。
特定のある実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の可変領域および定常領域の両方が完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られた手法を用いて、および本明細書に記載のようにして作製され得る。例えば、ある特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、該抗原を、抗原刺激に応答してかかる抗体を産生するように変更されているが、その内因性遺伝子座は障害されているトランスジェニック動物に投与することにより作製され得る。かかる抗体を作製するために使用され得る例示的な手法は、米国特許第6,150,584号;同第6,458,592号;同第6,420,140号に記載されている。他の手法が当該技術分野で知られている。完全ヒト抗体は、種々のディスプレイ手法、例えば、本明細書の他の箇所により詳細に記載しているようなファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイ系によって同様に作製され得る。
本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で知られた手法を用いて作製または製造され得る。特定のある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えにより作製」されたもの、すなわち、組換えDNA手法を用いて作製されたものである。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な手法は、本明細書の他の箇所でより詳細に論考している。
本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片には、例えば、該抗体がその類縁(cognate)エピトープに特異的に結合するのが妨げられないような該抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。例えば、なんら限定されないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が挙げられる。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は1つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
好ましい実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、処置対象の動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を惹起しない。一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で認められた手法を用いて、その免疫原性が低減されるように修飾され得る。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫処置(deimmunize)されたものであり得るか、またはキメラ抗体が作製され得る。これらの型の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法、例えば、(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフティングしてキメラ抗体を作製すること;(b)非ヒト相補性決定領域(CDR)の1つ以上の少なくとも一部を、必須フレームワーク残基を保持している、もしくは保持していないヒトフレームワークおよび定常領域内にグラフティングすること;または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってこれをヒト様部分で「覆う(cloak)」ことによって得られ得る。かかる方法は、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Morrisonら、Adv.Immunol.44:65−92(1988);Verhoeyenら、Science 239:1534−1536(1988);Padlan、Molec.Immun.28:489−498(1991);Padlan、Molec.Immun.31:169−217(1994)、ならびに米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号および同第6,190,370号(これらはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されている。
脱免疫処置はまた、抗体の免疫原性を減少させるために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「脱免疫処置」には、T細胞エピトープを修飾するための抗体の改変が含まれる(例えば、WO9852976A1、WO0034317A2を参照のこと)。例えば、出発抗体由来のVHおよびVL配列を解析し、ヒトT細胞エピトープを各V領域から「マッピング」し、該配列内の相補性決定領域(CDR)および他の重要な残基と関連するエピトープの位置を示す。T細胞エピトープマップの個々のT細胞エピトープを、最終の抗体の活性を改変するリスクの少ない選択的アミノ酸置換を同定するために解析する。アミノ酸置換の組合せを含む一連の選択的VHおよびVL配列を設計し、このような配列を、続いて、一連の結合ポリペプチド、例えば、本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片内に組み込み、次いで、機能について試験する。典型的には、12〜24種のバリアント抗体を作製し、試験する。次いで、修飾されたV領域およびヒトC領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を、発現ベクター内にクローニングし、続いて、そのプラスミドを細胞株内に導入すると、完全体の抗体が産生される。次いで、該抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。
本発明における方法のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその断片は、当該技術分野で知られた任意の適当な方法によって作製され得る。ポリクローナル抗体は、当該技術分野でよく知られた種々の手順によって作製され得る。例えば、NgR1免疫特異的断片は、種々の宿主動物、例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどに投与され、該抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成が誘導され得る。宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントが使用され得、限定されないが、フロイント(完全および不完全)、無機質ゲル(例えば水酸化アルミニウムなど)、表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなど)、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびCorynebacterium parvumなどが挙げられる。かかるアジュバントもまた、当該技術分野でよく知られている。
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマ、組換え手法およびファージディスプレイ手法、またはその組合せの使用により作製され得る。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ手法を用いて作製され得、該手法としては、当該技術分野で知られ、例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版(1988);Hammerlingら、in:Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas Elsevier、N.Y.、563−681(1981)(前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に教示されたものなどが挙げられる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、ハイブリドーマ手法により作製された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、単一のクローン(例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローン)に由来する抗体をいい、その作製方法をいうのではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ手法により作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマおよび組換え手法およびファージディスプレイ手法を用いて作製され得る。
当該技術分野で認められたプロトコルを用い、一例において、抗体は哺乳動物において、関連する抗原(例えば、精製NgR1抗原またはかかる抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物)およびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成させる。この免疫処置により、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答が惹起される。生じた抗体を動物の血清から回収してポリクローナル調製物を得てもよいが、多くの場合、リンパ球を脾臓、リンパ節または末梢血から単離し、モノクローナル抗体(MAb)の均一な調製物を得るすることが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得る。
このよく知られた方法(Kohlerら、Nature 256:495(1975))では、抗原が注射された哺乳動物由来の比較的短寿命または致死性のリンパ球を、不死化腫瘍細胞株(例えば、骨髄腫細胞株)と融合させ、したがって、不死化され、かつB細胞の遺伝子コード抗体産生能を有するハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」が生成される。得られたハイブリッドは、選択、希釈および再培養(regrowth)によって単一の遺伝子系統に分離され、個々の各系統は特定の遺伝子を含み、単一の抗体が形成される。これは、純粋な親遺伝子と関連して所望の抗原に対して均一な抗体を産生し、「モノクローナル」と呼ばれる。
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合骨髄腫親細胞の増殖または生存を阻害する1種類以上の物質を含有する適当な培養培地に播種し、培養する。当業者には、ハイブリドーマの形成、選択および培養のための試薬、細胞株および培地がいくつかの供給元から市販されており、標準化されたプロトコルが充分確立されていることが認識されよう。一般的に、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生成についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素免疫測定法(ELISA)などによって測定される。所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準的な方法(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、Academic Press、pp59−103(1986))によって培養され得る。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から慣用的な精製手順、例えば、例えば、プロテイン−A、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって分離され得ることはさらに認識されよう。
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法によって作製され得る。例えば、FabおよびF(ab’)2断片は、パパイン(Fab断片を作製するため)またはペプシン(F(ab’)2断片を作製するため)などの酵素を使用し、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって作製され得る。F(ab’)2断片は、可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
当業者にはまた、抗体または抗体断片(例えば、抗原結合部位)をコードするDNAが、抗体ファージライブラリーからも誘導され得ることが認識されよう。特に(In a particular)、かかるファージを利用し、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトもしくはマウス)から発現される抗原結合ドメインをディスプレイさせ得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えば、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換えにより融合させたFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されるfdおよびM13結合ドメインである。例示的な方法は、例えば、EP 368 684 B1;米国特許第5,969,108号、Hoogenboom、H.R.およびChames、Immunol.Today 21:371(2000);NagyらNat.Med.8:801(2002);Huieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:2682(2001);Luiら、J.Mol.Biol.315:1063(2002)(その各々は、引用により本明細書に組み込まれる)に示されている。いくつかの刊行物(例えば、Marksら、Bio/Technology 10:779−783(1992))には、大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の作製、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。別の実施形態において、リポソームディスプレイが、ディスプレイ基盤としてバクテリオファージの代わりに使用され得る(例えば、Hanesら、Nat.Biotechnol.18:1287(2000);Wilsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750(2001);またはIrvingら、J.Immunol.Methods 248:31(2001)を参照のこと)。また別の実施形態において、細胞表面ライブラリーが、抗体についてスクリーニングされ得る(Boderら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10701(2000);Daughertyら、J.Immunol.Methods 243:211(2000))。かかる手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ手法の代替法を提供する。
ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、これをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、VHおよびVL領域をコードするDNA配列が、動物cDNAライブラリー(例えば、リンパ系組織のヒトもしくはマウスcDNAライブラリー)または合成cDNAライブラリーから増幅される。特定のある実施形態において、VHおよびVL領域をコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーによって互いに連結し、ファージミドベクター(例えば、p CANTAB 6またはpComb 3 HSS)内にクローニングする。該ベクターを大腸菌内にエレクトロポレーションし、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。このような方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えばfdおよびM13であり、VHまたはVL領域は、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換えにより融合される。目的の抗原(すなわち、NgR1ポリペプチドまたはその断片)に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。
抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例としては、Brinkmanら、J.Immunol.Methods 182:41−50(1995);Amesら、J.Immunol.Methods 184:177−186(1995);Kettleboroughら、Eur.J.Immunol.24:952−958(1994);Persicら、Gene 187:9−18(1997);Burtonら、Advances in Immunology 57:191−280(1994);PCT出願番号PCT/GB91/01134;PCT公開公報WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;および米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908号;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;同第5,733,743号および同第5,969,108号(これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されたものが挙げられる。
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、完全体の抗体(例えば、ヒト抗体)または任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の所望の宿主、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌内で発現させ得る。例えば、Fab、FabおよびF(ab’)2断片を組換えにより作製するための手法もまた、当該技術分野で知られた方法、例えば、PCT公開公報WO92/22324;Mullinaxら、BioTechniques 12(6):864−869(1992);およびSawaiら、AJRI 34:26−34(1995);およびBetterら、Science 240:1041−1043(1988)(前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示された方法などを用いて採用され得る。
単鎖のFvおよび抗体を作製するために使用され得る手法の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら、Methods
in Enzymology 203:46−88(1991);Shuら、PNAS
90:7995−7999(1993);およびSkerraら、Science 240:1038−1040(1988)に記載のものが挙げられる。一部の用途、例えば、ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイでは、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を使用することが好ましいことがあり得る。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が異なる動物種に由来している分子、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。キメラ抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Morrison、Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechniques 4:214(1986);Gilliesら、J.Immunol Methods 125:191−202(1989);米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号;および同第4,816397号(これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変するため、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体由来の対応する残基で置換される。このようなフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデル設計により抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列比較により特定の位置の非通常フレームワーク残基を同定することにより同定される(例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号;Riechmannら、Nature 332:323(1988)(これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。抗体は、当該技術分野で知られたさまざまな手法、例えば、CDR−グラフティング(EP 239,400;PCT公開公報WO91/09967;米国特許第5,225,539号;同第5,530,101号および同第5,585,089号)、ベニア化(veneering)または再表面処理(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan、Molecular Immunology
28(4/5):489−498(1991);Studnickaら、Protein Engineering 7(6):805−814(1994);Roguska.ら、PNAS 91:969−973(1994))、ならびに鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)を用いてヒト化され得る。
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、当該技術分野で知られたさまざまな方法、例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法によって作製され得る。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号;ならびにPCT公開公報WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735およびWO91/10741(これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)もまた参照のこと。
ヒト抗体はまた、機能性内因性免疫グロブリンを発現する能力を持たないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、マウス胚性幹細胞内に無作為に、または相同組換えによって導入され得る。あるいはまた、ヒト可変領域、定常領域および多様な領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞内に導入され得る。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは独立して、または同時に非機能性とされ得る。特に、JH領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生が抑制される。修飾された胚性幹細胞を拡大培養し、胚盤胞内にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスを通常の様式で、選択した抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部分を用いて免疫処置する。該抗原に対して指向されるモノクローナル抗体は、免疫処置したトランスジェニックマウスから、慣用的なハイブリドーマ手法を用いて得られ得る。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化中に再配列され、続いて、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、かかる手法を用い、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの手法の概説については、LonbergおよびHuszar, Int.Rev.Immunol.13:65−93(1995)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの手法ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコルの詳細な論考については、例えば、PCT公開公報WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735;米国特許第5,413,923号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,569,825号;同第5,661,016号;同第5,545,806号;同第5,814,318号;および同第5,939,598号(これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと。また、Abgenix,Inc.(Freemont、Calif.)およびGenPharm(San Jose、Calif.)などの企業は、上記のものと類似した手法を用い、選択した抗原に対して指向されるヒト抗体の提供に従事することがあり得る。
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導(guided)選択」と呼ばれる手法を用いて作製され得る。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用し、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される(Jespersら、Bio/Technology 12:899−903(1988))。米国特許第5,565,332号もまた参照のこと。
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするDNAが、慣用的な手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離され、配列決定され得る。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源として供される。単離したら、該DNAは発現ベクター内に配置され得、次いで、これを、他の場合では免疫グロブリンを産生しない原核生物または真核生物の宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞内などにトランスフェクトする。より詳しくは、単離されたDNA(これは、本明細書に記載のような合成のものであり得る)を用い、Newmanら、米国特許第5,658,570号(1995年1月25日に出願)(これは、引用により本明細書に組み込まれる)に記載のようにして、抗体の製造のために、定常および可変領域の配列をクローニングし得る。本質的に、これは、選択した細胞からのRNAの抽出、cDNAへの変換、およびIg特異的プライマーを用いたPCRによる増幅を必然的に伴う。この目的に好適なプライマーもまた、米国特許第5,658,570号に記載されている。以下により詳細に論考するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、臨床用および市販用の免疫グロブリン供給物を提供するために比較的大量に培養され得る。
具体的な一実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して配列が超多様性の領域を決定することにより調べ、相補性決定領域(CDR)の配列が同定され得る。常套的な組換えDNA手法を使用し、1つ以上のCDRがフレームワーク領域内に、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域内に挿入され得る。フレームワーク領域は、天然に存在するものであっても、コンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である(例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧についてはChothiaら、J.Mol.Biol.278:457−479(1998)を参照のこと)。好ましくは、フレームワーク領域とCDRの組合せによって作製されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド(例えば、NgR1)の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、1つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内において行われ得、好ましくは、該アミノ酸置換により、該抗体のその抗原に対する結合が改善される。さらに、かかる方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製し、1つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子が作製され得る。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明に包含され、当該技術分野の技量の範囲内である。
また、「キメラ抗体」の作製のために開発された、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる手法(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:851−855(1984);Neubergerら、Nature 312:604−608(1984);Takedaら、Nature 314:452−454(1985))が使用され得る。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの(例えば、ヒト化抗体など)である。
あるいはまた、単鎖抗体の作製について記載された手法(米国特許第4,694,778号;Bird、Science 242:423−442(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883(1988);およびWardら、Nature 334:544−554(1989))を適合させて、単鎖抗体を作製してもよい。単鎖抗体は、Fv領域の重鎖および軽鎖断片をアミノ酸橋絡を介して連結して単鎖抗体をもたらすことにより形成される。また、大腸菌内での機能性Fv断片の合成のための手法も使用され得る(Skerraら、Science 242:1038−1041(1988))。
NgR1アンタゴニスト抗体はまた、内因性免疫グロブリンを産生する能力を持たないトランスジェニック動物(例えば、マウス)において生成されたヒト抗体または実質的にヒト抗体であり得る(例えば、米国特許第6,075,181号、同第5,939,598号、同第5,591,669号および同第5,589,369号(これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異型マウスにおける抗体の重鎖連結領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系変異型マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原刺激されるとヒト抗体の産生がもたらされる。SCIDマウスを用いてヒト抗体を作製する別の好ましい手段は、米国特許第5,811,524号(これは、引用により本明細書に組み込まれる)に開示されている。このようなヒト抗体と関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載のようにして単離および操作され得ることは認識されよう。
組換え抗体を作製するためのまた別の非常に効率的な手段が、Newman、Biotechnology 10:1455−1460(1992)に開示されている。具体的には、この手法により、サル可変ドメインとヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成がもたらされる。この参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この手法はまた、同一出願人による米国特許第5,658,570号、同第5,693,780号および同第5,756,096号(これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる)にも記載されている。
別の実施形態では、リンパ球を顕微操作によって選択し、種々の遺伝子を単離し得る。例えば、免疫処置した哺乳動物から末梢血単核細胞を単離し、約7日間インビトロで培養し得る。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的IgGについてスクリーニングされ得る。陽性ウェルの細胞が単離され得る。個々のIg産生B細胞は、FACSによって、または該細胞を補体媒介型溶血斑形成法において同定することにより単離され得る。Ig産生B細胞はチューブ内で顕微操作され得、VHおよびVL遺伝子は、例えばRT−PCRを用いて増幅され得る。VHおよびVL遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングされ、発現のために細胞(例えば、真核生物または原核生物の細胞)内にトランスフェクトされ得る。
あるいはまた、抗体産生細胞株は、当業者によく知られた手法を用いて選択および培養され得る。かかる手法は、さまざまな実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。これとの関連において、後述の本発明における使用に適した手法は、Current Protocols in Immunology、Coliganら編、Green
Publishing Associates and Wiley−Interscience、John Wiley and Sons、New York(1991)(これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)(増補版を含む)に記載されている。
本明細書に開示された治療方法における使用のための抗体は、抗体合成のための当該技術分野で知られた任意の方法によって、特に、化学合成または好ましくは本明細書に記載の組換え発現手法によって作製され得る。
本発明の範囲には、さらに、抗原結合DNA配列のあらゆる対立遺伝子、バリアントおよび変異が包含されることはさらに認識されよう。
よく知られているように、RNAは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から、標準的な手法、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿の後、遠心分離またはクロマトグラフィーを行なうことなどによって単離され得る。所望の場合は、mRNAは全RNAから標準的な手法によって、例えば、オリゴdTセルロース上でのクロマトグラフィーなどによって単離され得る。好適な手法は当該技術分野で熟知されている。
一実施形態において、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、よく知られた方法に従い、逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを用いて同時または別々のいずれかで作製される。PCRは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公表された重鎖および軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、PCRはまた、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離するために使用され得る。この場合、そのライブラリーが、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ(例えば、マウス定常領域プローブなど)によってスクリーニングされ得る。
DNA、典型的にはプラスミドDNAは、細胞から当該技術分野で知られた手法を用いて単離され、例えば、組換えDNA手法に関する前述の参考文献に詳細に示された標準的なよく知られた手法に従って制限マッピングされ、配列決定され得る。もちろん、該DNAは、単離プロセスまたはその後の解析中の任意の時点で本発明に従って合成されたものであってもよい。
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類縁体、例えば、NgR1アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要とされる。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその一部分(好ましくは、該重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する)をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の産生のためのベクターが、当該技術分野でよく知られた手法を用い、組換えDNA手法によって作製され得る。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法を本明細書に記載する。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築され得る。このような方法としては、例えば、インビトロ組換えDNA手法、合成手法およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードし、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。かかるベクターには、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ得(例えば、PCT公開公報WO86/05807;PCT公開公報WO89/01036;および米国特許第5,122,464号を参照のこと)、重鎖または軽鎖全体の発現のために、該抗体の可変ドメインがかかるベクター内にクローニングされ得る。
該発現ベクターは宿主細胞に、慣用的な手法によって導入され、次いで、トランスフェクト細胞を慣用的な手法によって培養し、本明細書に記載の方法における使用のための抗体を産生させる。したがって、本発明は、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードし、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するようにして、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において共発現され得る。
さまざまな宿主−発現ベクター系が、本明細書に記載の方法における使用のための抗体分子を発現させるために利用され得る。かかる宿主−発現系とは、目的のコード配列が作製され、続いて精製され得る媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現する細胞も表す。このようなものとしては、限定されないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌など(例えば、大腸菌、B.subtilis);抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia);抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物のウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)が挙げられる。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核生物の細胞(特に、完全体の組換え抗体分子の発現用)が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと合わせたものは、抗体の有効な発現系である(Foeckingら、Gene 45:101(1986);Cockettら、Bio/Technology 8:2(1990))。
細菌系において、いくつかの発現ベクターが、発現される抗体分子の意図される用途に応じて好都合に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のため、大量のかかるタンパク質が産生されるべきである場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指令するベクターが望ましいことがあり得る。かかるベクターとしては、限定されないが、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO J.2:1791(1983))(これは、抗体コード配列が個々にベクター内に、融合タンパク質が産生されるようにlacZコード領域とインフレームにライゲートされたものであり得る);pINベクター(Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.13:3101−3109(1985);Van Heeke & Schuster、J.Biol.Chem.24:5503−5509(1989));などが挙げられる。また、pGEXベクターは、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合の後、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るようにトロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして典型的に使用される。該ウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞内で増殖する。その抗体コード配列は、該ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)内に個々にクローニングされ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置される。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合配列、例えば、後期プロモーターおよび三連(tripartite)リーダー配列にライゲートされ得る。このキメラ遺伝子は、次いで、アデノウイルスゲノム内にインビトロまたはインビボ組換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)内への挿入により、感染宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現する能力をもつ組換えウイルスがもたらされる(例えば、Logan & Shenk、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355−359(1984)を参照のこと)。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要とされ得る。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらにまた、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ(in phase)でなければならない。このような外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方のさまざまな起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る(Bittnerら、Methods in Enzymol.153:51−544(1987)を参照のこと)。
また、挿入配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質生成物のかかる修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)は、該タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングならびにタンパク質および遺伝子産物の修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするため、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のため、一次転写物の適正なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、特に、乳癌細胞株(例えば、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47Dなど)、ならびに正常乳腺細胞株(例えば、CRL7030およびHs578Bstなど)が挙げられる。
長期間で抗収率の組換えタンパク質の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株は、操作されたものであり得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択可能なマーカーによって制御され得るDNAで形質転換させ得る。外来DNAの導入後、操作された細胞を1〜2日間、富化培地中で培養し得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体内にプラスミドを安定に組み込み、培養されて増殖巣を形成するのを可能にし、次いで、該増殖巣をクローニングおよび拡大培養して細胞株とし得る。この方法は、細胞株を操作して抗体分子を安定に発現させるのに好都合に使用され得る。
いくつかの選択系、例えば限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))が使用され得、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、Cell 22:817 1980)遺伝子は、それぞれ、tk−、hgprt−またはaprt−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子:dhfr、これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する(Wiglerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hareら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));gpt、これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する(Mulligan & Berg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));neo、これは、アミノグリコシドG−418に対する耐性を付与するClinical Pharmacy 12:488−505;WuおよびWu、Biotherapy 3:87−95(1991);Tolstoshev、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596(1993);Mulligan、Science 260:926−932(1993);ならびにMorganおよびAnderson、Ann.Rev.Biochem.62:191−217(1993);TIB TECH 11(5):155−215(1993年5月);ならびにhygro、これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Santerreら、Gene 30:147(1984)の選択の根拠として使用され得る。使用され得る組換えDNA手法の一般に当該技術分野で知られた方法は、Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1993);Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY(1990);ならびにDracopoliら(編)、Current Prolocols
in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY(1994)の第12章および第13章;Colberre−Garapinら、J.Mol.Biol.150:1(1981)(これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る(概説については、BebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、Academic Press、New York、第3巻(1987)を参照のこと)。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は抗体遺伝子と関連しているため、該抗体の産生もまた増大する(Crouseら、Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクターである重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターでコトランスフェクトされ得る。該2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むものであってもよい。あるいはまた、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰の毒性の遊離重鎖を回避するため、軽鎖は重鎖の前に好都合には配置される(Proudfoot、Nature 322:52(1986);Kohler、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980))。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを構成するものであり得る。
本発明の抗体分子が組換えにより発現されたら、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインAおよびサイズ排除(sizing)カラムクロマトグラフィー後の特異的抗原に対する親和性により)、遠心分離、差示的(differential)可溶性、または任意の他のタンパク質の標準的な精製手法によって精製され得る。あるいはまた、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、US2002 0123057 A1に開示されている。
一実施形態において、本発明における方法のための結合分子または抗原結合分子は、1つ以上のドメインが部分的または完全に欠失した合成の定常領域を含む(「ドメイン欠失抗体」)。特定のある実施形態において、適合性の修飾抗体は、CH2ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物(ΔC2構築物)またはバリアントを含む。他の実施形態では、短鎖の連結ペプチドが該欠失ドメインで置換され、可変領域に対して柔軟性および運動の自由度がもたらされたものであり得る。当業者には、かかる構築物は、抗体の異化作用の割合に対するCH2ドメインの調節特性のため、特に好ましいことが認識されよう。
特定のある実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で報告された方法を用いて作製され得る(例えば、米国特許第5,837,821号またはWO94/09817A1を参照のこと)。
別の実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体は、当該技術分野で知られたCH2ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、IgG1ヒト定常ドメインをコードするベクター(例えば、Biogen IDEC Incorporated製)(例えば、WO 02/060955A2およびWO02/096948A2を参照のこと)を用いて誘導され得る。この例示的なベクターは、CH2ドメインが欠失され、ドメイン欠失IgG1定常領域を発現する合成ベクターが得られるように操作された。
一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニスト抗体またはその断片は、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または単量体サブユニット間の会合が許容される限り1個ですらあるアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、CH2ドメインの選択した領域において、単一のアミノ酸の変異が、実質的にFc結合を低減し、それにより腫瘍局在を増大させるのに充分であり得る。同様に、モジュレートする対象のエフェクター機能(例えば、相補鎖結合)を制御する1つ以上の定常領域ドメインの当該部分を単純に欠失させることが望ましい場合があり得る。定常領域のかかる部分の欠失により、被験体定常領域ドメインと関連する他の望ましい機能はそのままで、抗体の選択した特性(血清半減期)が改善され得る。さらに、上記において示唆したように、開示した抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを向上させる1つ以上のアミノ酸の変異または置換による合成のものであり得る。これに関して、修飾抗体の立体配置および免疫原性のプロフィールを実質的に維持したまま、保存された結合部位(例えば、Fc結合)によってもたらされる活性を破壊することが可能であり得る。また他の実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を増強するため、またはより多くの細胞毒素もしくは糖鎖結合をもたらすための、定常領域への1つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態において、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製させることが望ましい場合があり得る。
本発明はまた、NgR1ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはその断片である本明細書に記載の抗体分子(例えば、VH領域および/またはVL領域)のバリアント(誘導体を含む)を含む、本質的に該バリアントからなる、またはバリアントからなる抗体の使用を提供する。当業者に知られた標準的な手法、例えば、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびPCR媒介型変異誘発を用いて、変異が、結合分子をコードするヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、該バリアント(誘導体を含む)は、参照VH領域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL領域、VLCDR1、VLCDR2またはVLCDR3に対して50アミノ酸未満の置換、40アミノ酸未満の置換、30アミノ酸未満の置換、25アミノ酸未満の置換、20アミノ酸未満の置換、15アミノ酸未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸置換、または2アミノ酸未満の置換をコードするものである。「同類アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン,システイン)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。あるいはまた、変異は、コード配列の全部または一部に沿って無作為に、例えば、飽和突然変異誘発などによって導入され得、得られた変異型は、活性を保持している変異型を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングされ得る。
例えば、フレームワーク領域内のみ、または抗体分子のCDR領域内のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントまたは中性のミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能力に対する効果を全くまたはほとんど有しない。このような型の変異は、コドン使用頻度を最適化するため、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいはまた、非中性のミスセンス変異により、抗体の抗原結合能力が改変され得る。最もサイレントで中性のミスセンス変異の位置は、おそらくフレームワーク領域内であり、一方、最も非中性のミスセンス変異の位置は、おそらくCDR内であるが、これは絶対要件ではない。当業者であれば、所望の特性(例えば、抗原結合活性の改変がない、または結合活性の改変がない(例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変更)など)を有する変異体分子を設計し、試験することができよう。変異誘発後、コードタンパク質を常套的に発現させ得、該コードタンパク質の機能的および/または生物学的活性は、本明細書に記載の手法を用いて、または当該技術分野で知られた手法を常套的に変形することにより測定され得る。
まとめると、当業者は、本発明の教示が提供されると、本発明の抗体の生物学的特性を改変するため(例えば、所与の抗体分子の安定性または半減期、免疫原性、毒性、親和性または収率を増大または低減させ得る方法)、または特定の適用用途により適したものとし得る任意の他の様式で計変するために使用され得るさまざまな方法が利用可能となろう。
本発明の抗体を含む組成物およびその使用を以下に記載する。
(可溶性Nogoレセプター1ポリペプチドタンパク質)
完全長のNogoレセプター−1は、シグナル配列、N末端領域(NT)、8ロイシンリッチリピート(LRR)、LRRCT領域(8ロイシンリッチリピートのロイシンリッチリピートドメインC末端)、C末端領域(CT)およびGPIアンカーからなる(図1参照)。
本明細書で用いるNgRドメインの表示を、以下のとおりに規定する。
(表1.NgRドメインの例)
Figure 2013048638
本発明の一部のある実施形態は、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドを提供する。本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、NTドメイン;8 LRRおよびLRRCTドメインを含み、シグナル配列および機能性GPIアンカーを欠く(すなわち、GPIアンカーがないか、GPIアンカーが効率的に細胞膜と結合する能力を欠く)。
一部のある実施形態において、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、異種LRRを含む。一部のある実施形態において、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、2、3、4、5、6、7または8個の異種LRRを含む。異種LRRは、Nogoレセプター−1以外のタンパク質から得られるLRRを意味する。異種LRRが得られ得る例示的なタンパク質は、toll様レセプター(TLR1.2);T細胞活性化ロイシン反復配列高含有タンパク質;デセオリン(deceorin);OM−gp;インスリン様成長因子結合タンパク質酸性不安定性サブユニットスリットおよびロボ(robo);ならびにtoll様レセプター4である。
一部のある実施形態において、本発明は、319アミノ酸の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド(可溶性Nogoレセプター−1 344、sNogoR1−344、またはsNogoR344)(配列番号6と8の残基26〜344または配列番号8の残基27〜344)を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、285アミノ酸の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド(可溶性Nogoレセプター−1 310、sNogoR1−310、またはsNogoR310)(配列番号7と9の残基26〜310または配列番号9の残基27〜310)を提供する。図1を参照のこと。
表1.ヒトおよびラットのNogoレセプター−1ポリペプチドの配列
Figure 2013048638
本発明の一部のある実施形態において、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、Nogoレセプター−1へのリガンドの結合を阻害し、Nogoレセプター−1リガンドのアンタゴニストとして作用させるために使用される。本発明の一部のある実施形態において、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、ニューロンにおける神経突起の伸長および出芽(例えば、軸索の成長など)の阻害を減少させるため、およびニューロンにおけるミエリン媒介性成長円錐の虚脱を阻害するために使用される。一部のある実施形態において、ニューロンはCNSのニューロンである。
sNogoR310およびsNogoR344は、驚くべきことに、Nogoレセプター−1へのNogo A、NogoB、NogoC、MAGおよびOM−gpの結合をブロックする。
別の実施形態において、本発明は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸x〜344、(b)配列番号49のアミノ酸309〜y、および(c)配列番号49のアミノ酸x〜y(ここで、xは305〜326の任意の整数であり、yは328〜350の任意の整数である)からなる群より選択される、Nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸x’〜344、(b)配列番号49のアミノ酸309〜y’、および(c)配列番号49のアミノ酸x’〜y’(ここで、x’は300〜326の任意の整数であり、y’は328〜360の任意の整数である)からなる群より選択される、Nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチド断片を提供する。
「NgR1参照アミノ酸配列、」または「参照アミノ酸配列」により、なんらアミノ酸置換の導入がない指定された配列が意図される。当業者には理解されようが、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むものである。
一部のある実施形態において、本発明は、1、2または3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜335;配列番号49のアミノ酸309〜344;配列番号49のアミノ酸310〜335;配列番号49のアミノ酸310〜344;配列番号49のアミノ酸309〜350;配列番号49のアミノ酸300〜344;および配列番号49のアミノ酸315〜344からなる群より選択されるポリペプチド断片を提供する。
一実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜344であるポリペプチド断片を提供する。
一実施形態において、本発明は、3個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む60残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、前記参照アミノ酸配列が、配列番号49のアミノ酸309〜335であるポリペプチド断片を提供する。
一実施形態において、本発明は、(a)参照アミノ酸配列の少なくとも1つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている以外は前記参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配、ここで、前記参照アミノ酸配列は、(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、(ii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは25〜35の任意の整数であり、bは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択される:および(b)異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
この実施形態によるポリペプチド断片に対する例示的なアミノ酸置換としては、本発明のポリペプチドの個々のシステイン残基の異なるアミノ酸での置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸が、本発明のポリペプチドのシステインの代わりに使用され得る。どの異なるアミノ酸が使用されるかは、いくつかの基準、例えば、該ポリペプチド断片に対するコンホメーションに対する置換の効果、該ポリペプチド断片の電荷、または該ポリペプチド断片の親水性に依存する。本発明のポリペプチドおよび参照アミノ酸配列のアミノ酸に対するアミノ酸置換としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられ得る。参照アミノ酸のシステインの代わりに使用される典型的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニンが挙げられ、特にアラニンである。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの操作によりかかる置換を行うことは、充分、当業者の常套的な専門知識の範囲内である。
別の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている単離された本発明のポリペプチドを提供する。ヒトNgR1において置換され得るシステイン残基としては、C27、C31、C33、C43、C80、C140、C264、C266、C287、C309、C335、C336、C419、C429、C455およびC473が挙げられる。ラットNgR1において置換され得るシステイン残基としては、C27、C31、C33、C80、C140、C264、C266、C287、C309、C335、C336、C419、C429、C455およびC473が挙げられる。マウスNgR1において置換され得るシステイン残基としては、C27、C31、C33、C43、C80、C140、C264、C266、C287、C309、C335、C336、C419、C429、C455およびC473が挙げられる。
本発明は、さらに、40残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、C309が置換されている、C335が置換されている、C336が置換されている、C309およびC335が置換されている、C309およびC336が置換されている、C335およびC336が置換されている、またはC309、C335、およびC336が置換されていること以外は配列番号49のアミノ酸309〜344と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を提供する。
本発明のポリペプチドのシステイン残基は、任意の異種アミノ酸で置換され得る。特定のある実施形態において、該システインは、該ポリペプチドの3次元コンホメーションを最も改変しにくい小さな非荷電アミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、好ましくはアラニンで置換されている。
一部のある実施形態において、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、異種ポリペプチドさらに含む融合タンパク質の一構成成分である。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドは免疫グロブリン定常ドメインである。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常ドメインは重鎖定常ドメインである。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドはFc断片である。一部のある実施形態において、Fcは、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドのC末端に連結されている。一部のある実施形態において、融合Nogoレセプター−1タンパク質は二量体である。本発明には、さらに、上記のようなポリペプチド断片のバリアント、類縁体または誘導体が包含される。
一部のある実施形態において、本発明は、(a)20個までの個々のアミノ酸置換以外は参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、前記参照アミノ酸配列が、(i)配列番号49のアミノ酸a〜445、(ii)配列番号49のアミノ酸27〜b、および(iii)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは1〜35の任意の整数であり、bは300〜450の任意の整数である)からなる群より選択される;および(b)異種ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。一部のある実施形態において、該単離されたポリペプチドは、配列番号49のアミノ酸1〜310であり、R269およびA310が異なるアミノ酸で置換されている。該ポリペプチドにおいて置換され得る例示的なアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。一実施形態において、該異なるアミノ酸はトリプトファンである。
例示的な可溶性NgR−Fc融合タンパク質はヒトNgR1(319)−Fcであり、これは、配列番号49のアミノ酸1〜319C末端に連結されたFcを含む。
システイン置換を有する例示的な可溶性NgR−Fc融合タンパク質は、Ala−Ala−ヒト(h)NgR1(310)−Fc(これは、配列番号58のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのC末端に連結されたFcを含む)、Ala−Ala−ラット(r)NgR1(310)−Fc(これは、配列番号59のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのC末端に連結されたFcを含む)、およびAla−Ala−ヒト(h)NgR1(344)−Fc(これは、配列番号64のアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチドのC末端に連結されたFcを含む)である。
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものであり得、遺伝子にコードされた20種類のアミノ酸以外のアミノ酸(例えば、天然に存在しないアミノ酸)を含有するものであり得る。本発明のポリペプチドは、天然プロセス(例えば、翻訳後プロセッシングなど)または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法のいずれかによって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ポリペプチド内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端に行なわれ得る。所与のポリペプチドにおいて、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のポリペプチドは多くの型の修飾を含むものであり得る。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝鎖のものであり得、また、分枝を伴う、または伴わない環状のものであり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる(例えば、Proteins−Structure And Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、New York(1993);Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、Academic Press、New York、第1〜12頁(1983);Seifterら、Meth Enzymol 182:626−646(1990);Rattanら、Ann NY
Acad Sci 663:48−62(1992)を参照のこと)。
本明細書に記載のポリペプチドは環状であり得る。該ポリペプチドの環化により、線状ペプチド立体配座の自由度が低減され、構造的により拘束された分子がもたらされる。多くのペプチド環化方法が当該技術分野で知られている。例えば、ペプチドのN末端とC末端のアミノ酸残基間のアミド結合の形成による「主鎖対主鎖」環化。「主鎖対主鎖」環化方法としては、2つのα−チオアミノ酸残基(例えば、システイン、ホモシステイン)間のジスルフィド結合の形成が挙げられる。本発明のある種のペプチドは、そのペプチドのN−およびC−末端上に環状ポリペプチドを形成するための修飾を含むものである。かかる修飾としては、限定されないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、NH2部分を有するシステイン残基およびビオチンが挙げられる。他のペプチド環化方法は、Li & Roller.Curr,Top.Med.Chem.3:325−341(2002)および米国特許出願公開公報U.S.2005−0260626 A1(引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本発明の方法において、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、予め形成されたポリペプチドとして直接、または核酸ベクターにより間接的に投与され得る。本発明の一部のある実施形態において、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、(1)移植可能な宿主細胞を、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片を発現する核酸(例えば、ベクター)で形質転換またはトランスフェクトすること;および(2)形質転換された宿主細胞を哺乳動物に、その疾患、障害または損傷の部位に移植することを含む処置方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞は、MSの慢性病変部位に移植され得る。本発明の一部のある実施形態において、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトし、取り出された同じ哺乳動物に移植し戻す。該細胞は、移植されたのと同じ部位から取り出されるのがよいが、そうである必要はない。かかる実施形態は、場合によってはエキソビボ遺伝子療法として知られるものであり、限定的な期間、作用部位に限局的に、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片の連続供給をもたらし得る。
本発明を実施するためのさらなる例示的な本発明のNgRポリペプチドならびに、このような分子を得るための方法および材料を以下に記載する。
(融合タンパク質および結合体化ポリペプチド)
本発明の一部のある実施形態は、完全長NgR1タンパク質でないNgR1ポリペプチドの使用、例えば、異種ポリペプチド部分に融合されて融合タンパク質を形成するNgR1のポリペプチド断片の使用を伴う。かかる融合タンパク質は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的(1つまたは複数)に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性であり得る。また、これは、本発明のNgR1ポリペプチド部分に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。これら他の目的を達成するための異種部分は、当該技術分野で知られている。
本発明の一部のある実施形態において、NgR1ポリペプチド断片は、別のNgRポリペプチド断片、例えばNgR2またはNgR3ポリペプチド断片にFcとともに融合され得る。
ヒトNgR2ポリペプチドを以下に配列番号60として示す。
完全長ヒトNgR2(配列番号60):
Figure 2013048638
マウスNgR2ポリペプチドを以下に配列番号61として示す。
完全長マウスNgR2(配列番号61):
Figure 2013048638
ヒトNgR3ポリペプチドを以下に配列番号62として示す。
完全長ヒトNgR3(配列番号62):
Figure 2013048638
マウスNgR3ポリペプチドを以下に配列番号63として示す。
完全長マウスNgR3(配列番号63):
Figure 2013048638
一部のある実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号49のアミノ酸a〜305、(b)配列番号49のアミノ酸1〜b、および(c)配列番号49のアミノ酸a〜b(ここで、aは1〜27の任意の整数であり、bは264〜309の任意の整数である)からなる群より選択され、前記第2のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が、(a)配列番号60のアミノ酸c〜332、(b)配列番号60のアミノ酸275〜d、および(c)配列番号60のアミノ酸c〜d,(ここで、cは265〜306の任意の整数であり、dは308〜340の任意の整数である)からなる群より選択される、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が配列番号49のアミノ酸1〜274であり、前記第2のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が配列番号60のアミノ酸275〜311である、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が配列番号49のアミノ酸1〜274であり、前記第2のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が配列番号60のアミノ酸275〜332である、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が配列番号49のアミノ酸1〜305であり、前記第2のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が配列番号60のアミノ酸306〜311である、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含むを含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第1の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第1の参照アミノ酸配列が配列番号49のアミノ酸1〜305であり、前記第2のポリペプチド断片は、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外は第2の参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2の参照アミノ酸配列が配列番号60のアミノ酸306〜309である、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。別の実施形態において、少なくとも1つのさらなるアミノ酸は第2のポリペプチド断片のC末端に付加されている。該ポリペプチドに付加され得る例示的なアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。一実施形態において、付加されたアミノ酸はトリプトファンである。さらなる一実施形態において、配列番号49の269位のアルギニンがトリプトファンで置換されている。
一実施形態において、本発明は、第1のポリペプチド断片および第2のポリペプチド断片を含む単離されたポリペプチドであって、前記第1のポリペプチド断片が、1、2、3、4、10または20個までの個々のアミノ酸置換以外はからなり、配列番号49のアミノ酸1〜310、前記第2のポリペプチド断片が、1,2、3、4または5個までの個々のアミノ酸置換以外は配列番号60のアミノ酸311〜318からなる、nogo−レセプター媒介性神経突起伸長抑制を阻害するポリペプチドを提供する。
一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドは、さらに異種ポリペプチドを含む。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドは免疫グロブリン定常ドメインである。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常ドメインは重鎖定常ドメインである。一部のある実施形態において、異種ポリペプチドはFc断片である。一部のある実施形態において、Fcは、本発明のポリペプチドのC末端に連結されている。一部のある実施形態において、該融合体は二量体である。本発明には、さらに、上記のようなポリペプチド断片のバリアント、類縁体または誘導体が包含される。
融合タンパク質の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、本発明のNgRポリペプチド部分に化学的に結合体化することができる。ほとんどの場合、選択した異種部分は、NgRポリペプチド部分に融合されたもの、結合体化されたもの、いずれも同様に機能する。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列は、NgRポリペプチド部分に融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として連結され得ることを理解されたい。
また、本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、N−もしくはC末端で異種ポリペプチドに組換えにより融合されたもの、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合体化されたもの(共有結合性および非共有結合性結合体化を含む)であり得る。例えば、NgR1アンタゴニストアプタマーおよび抗体ならびにその断片は、検出アッセイにおける標識およびエフェクター分子として有用な分子(例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素など)に、組換えにより融合されたもの、または結合体化されたものであり得る。例えば、PCT公開公報WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;米国特許第5,314,995号;およびEP396,387を参照のこと。
本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片としては、修飾された誘導体、すなわち、NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー復は抗体がNgR1の生物学的機能を阻害することが妨げられないような共有結合により任意の型の分子が結合された修飾誘導体が挙げられる。例えば、限定を意図しないが、本発明のNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化(phosphylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されたものであり得る。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は1つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
本明細書に開示された処置方法における使用のためのNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸、すなわちペプチド同配体で構成されたものであり得、20種類の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含むものであり得る。NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体ならびにその断片は、天然のプロセッシング(例えば、翻訳後プロセッシングなど)または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法によって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端、または糖鎖などの部分に行われ得る。所与のNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片において、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片は多くの型の修飾を含むものであり得る。NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片は、例えば例えばユビキチン化の結果として分枝鎖のものであり得、また、分枝を伴う、または伴わない環状のものであり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーand抗体またはその断片は、天然の翻訳後プロセッシングにより生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる(例えば、Proteins−Structure And Molecular Properties、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、New York 第2版(1993);Posttranslational Covalent Modification
Of Proteins、B.C.Johnson編、Academic Press、New York、第1〜12頁(1983);Seifterら、Meth Enzymol 182:626−646(1990);Rattanら、Ann NY Acad Sci 663:48−62(1992))を参照のこと。
NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片が融合される異種ポリペプチドは、治療上有用なもの、あるいはNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片を標的化するのに有用なものである。NgR1アンタゴニスト融合タンパク質、アプタマー and抗体またはその断片は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的(1つまたは複数)に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性であり得る。また、これは、NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。これら他の目的を達成するための異種部分は、当該技術分野で知られている。
NgR1アンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、該アンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に化学的に結合体化することができる。ほとんどの場合において、選択した異種部分は、NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に融合されていようと、結合体化されていようと、同様に機能する。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列はNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片に、融合タンパク質の形態で、または化学的結合体として結合体化されたものであり得ることを理解されたい。
NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはその断片などの薬理学的に活性なポリペプチドは、多くの場合、急速なインビボクリアランスを示し、体内で治療有効濃度を達成するためには、大用量が必要とされる。また、約60kDaより小さなポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは、場合よっては腎臓毒性をもたらす。NgRシグナル伝達ドメインのポリペプチド断片などの比較的小さいポリペプチドの融合または結合体化は、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避するために使用され得る。種々の異種アミノ酸配列、すなわち、治療用ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち血清半減期を増大させるためのポリペプチド部分または「キャリア」が知られている。例としては、血清アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはヒト血清アルブミン(HSA)が挙げられる。
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素的もしくは免疫学的機能の欠如のため、本質的に完全長のヒト血清アルブミン(HSA)またはHSA断片が異種部分として一般に使用される。Yehら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1904−08(1992)およびSyedら、Blood 89:3243−52(1997)に教示されたものなどの方法および材料の適用により、HSAは、NgRポリペプチド部分のおかげで薬理学的活性を示すとともに、有意に増大したインビボ安定性(例えば、10倍〜100倍高い)を示す融合タンパク質またはポリペプチド結合体を形成するために使用され得る。HSAのC末端は、NgRポリペプチド部分のN末端に融合され得る。HASは天然に分泌されるタンパク質であるため、HSAシグナル配列は、該融合タンパク質を真核生物(例えば、哺乳動物)の発現系において産生させる場合に、細胞培養培地中への該融合タンパク質の分泌を得るために利用され得る。
特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のためのNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体およびその抗体断片は、さらに、標的化部分を含む。標的化部分としては、身体のある特定の部分、例えば、脳またはその内部の区画への局在化を指向するタンパク質またはペプチドが挙げられる。特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のためのNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片は、脳標的化部分に結合または融合されている。脳標的化部分は、共有結合により(例えば、翻訳による直接融合、または直接もしくはスペーサー分子(これは、任意選択的に切断可能であり得る)を介してのいずれかによる化学的連結によって結合されるか、または非共有結合により(例えば、可逆的相互作用、例えば、アビジン:ビオチン、タンパク質A:IgGなどによって)結合される。他の実施形態において、本発明の方法における使用のためのNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片は、1つ以上の(one more)脳標的化部分に結合される。さらなる実施形態において、脳標的化部分は、本発明の方法における使用のための複数のNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片に結合される。
NgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片に結合された脳標的化部分により、かかるNgR1アンタゴニストポリペプチド、抗体またはその抗体断片の脳送達が増強される。タンパク質または治療用薬剤に融合させると、血液脳関門(BBB)を通過して該タンパク質または治療用薬剤を送達するいくつかのポリペプチドが報告されている。非限定的な例としては、単一ドメイン抗体FC5(Abulrobら(2005)J.Neurochem.95,1201−1214);ヒトインスリンレセプターに対するモノクローナル抗体であるmAB 83−14(Pardridgeら(1995)Pharmacol.Res.12,807−816);ヒトトランスフェリンレセプター(hTfR)に結合するB2、B6およびB8ペプチド(Xiaら(2000)J.Virol.74,11359−11366);トランスフェリンレセプターに対するOX26モノクローナル抗体(Pardridgeら(1991)J.Pharmacol.Exp.Ther.259,66−70);ジフテリア(diptheria)毒素結合体(例えば、Gaillardら,International Congress Series 1277:185−198(2005);および米国特許第6,306,365号の配列番号1〜18)が挙げられる。上記の参考文献の内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
NgR1組成物の脳送達の増強は、当該技術分野で充分確立されたいくつかの手段によって測定される。例えば、脳標的化部分に連結された放射性標識されたNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片を、動物に投与すること;脳局在化を調べること;および局在化を、脳標的化部分に結合されていない対応の放射性標識されたNgR1アンタゴニストポリペプチド、アプタマー、抗体またはその抗体断片と比較すること。標的化の増強の他の測定手段は、上記の参考文献に記載されている。
本発明の一部のある実施形態では、ヒンジ領域およびFc領域、すなわち、Ig重鎖定常領域のC末端部分に融合されたNgRポリペプチド部分が使用される。一部のある実施形態では、ヒンジ領域内のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されていてもよい。このような実施形態によるヒンジ領域に対する例示的なアミノ酸置換としては、ヒンジ領域内の個々のシステイン残基の異なるアミノ酸での置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸が、ヒンジ領域内のシステインの代わりに使用され得る。本発明のポリペプチドおよび参照アミノ酸配列のアミノ酸に対するアミノ酸置換としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられ得る。参照アミノ酸のシステインの代わりに使用される典型的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニンが挙げられ、特にセリンおよびアラニンである。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの操作によりかかる置換を行うことは、充分、当業者の常套的な専門知識の範囲内である。
NgR−ポリペプチド−Fc融合体の潜在的な利点としては、可溶性、インビボ安定性および多価性(例えば、二量体化)が挙げられる。使用されるFc領域は、IgA、IgDまたはIgG Fc領域(ヒンジ−CH2−CH3)であり得る。あるいはまた、IgEまたはIgM Fc領域(ヒンジ−CH2−CH3−CH4)であり得る。IgG Fc領域、例えば、IgG1 Fc領域またはIgG4 Fc領域が一般的に使用される。Fc融合体をコードするDNAを構築するため、および発現させるための材料および方法は当該技術分野で知られており、必要以上の実験を行なうことなく、融合体を得るために適用され得る。本発明の一部の実施形態では、Caponら、米国特許第5,428,130号および同第5,565,335号に記載のものなどの融合タンパク質が使用される。
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体(immunofusin)の構築に有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体14.18(Gilliesら、J.Immunol.Meth.,125:191−202(1989))、抗体重鎖シグナル配列、例えば、MOPC141抗体重鎖シグナル配列(Sakanoら、Nature 286:5774(1980))が挙げられる。あるいはまた、他のシグナル配列が使用され得る。例えば、Watson、Nucl.Acids Res.12:5145(1984)を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔内で切断される。これにより、Fc領域およびNgRポリペプチド部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌がもたらされる。
一部のある実施形態において、該DNA配列は、分泌カセットとNgRポリペプチド部分の間のタンパク質分解的切断部位をコードするものであり得る。かかる切断部位により、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解的切断がもたらされ得、したがってFcドメインが標的タンパク質から分離され得る。有用なタンパク質分解的切断部位としては、タンパク質分解性酵素、例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Xa因子またはエンテロキナーゼKなどによって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込まれ得る。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはpdCであり、これは、免疫融合体のDNAの転写がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれたものである。例えば、Loら、Biochim.Biophys.Acta 1088:712(1991);およびLoら、Protein Engineering 11:495−500(1998)を参照のこと。適切な宿主細胞が、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするDNAで形質転換またはトランスフェクトされ得、該ポリペプチドの発現および分泌のために使用され得る。典型的に使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Hela細胞およびCOS細胞が挙げられる。
完全にインタクトな野生型Fc領域は、本発明の方法に使用されるFc融合タンパク質において通常は不必要であり、望ましくないエフェクター機能を示す。したがって、典型的には、分泌カセットの構築の際に特定の結合部位をFc領域から欠失させる。例えば、軽鎖との共発現は不必要であるため、重鎖結合タンパク質の結合部位であるBip(Hendershotら、Immunol.Today 8:111−14(1987))を、IgEのFc領域のCH2ドメインから欠失させ、その結果、この部位により免疫融合体の効率的な分泌が妨げられない。膜貫通ドメイン配列(例えば、IgM内に存在するものなど)もまた一般的に、欠失されている。
IgG1 Fc領域は、ほとんどの場合で使用される。あるいはまた、免疫グロブリンγのその他のサブクラス(γ−2、γ−3およびγ−4)のFc領域が、分泌カセットに使用され得る。免疫グロブリンγ−1のIgG1 Fc領域は、分泌カセットに一般的に使用され、ヒンジ領域の少なくとも一部分、CH2領域およびCH3領域を含む。一部のある実施形態において、免疫グロブリンγ−1のFc領域はCH2欠失Fcであり、これは、ヒンジ領域の一部分とCH3領域を含むが、CH2領域は含まない。CH2欠失Fcは、Gilliesら、Hum.Antibod.Hybridomas 1:47(1990)に記載されている。一部のある実施形態において、IgA、IgD、IgEまたはIgMのうちの1つのFc領域が使用される。
NgR−ポリペプチド部分−Fc融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築され得る。立体配置の一例では、NgRポリペプチド部分のC末端がFcヒンジ部分のN末端に直接融合されている。わずかに異なる立体配置では、短鎖ポリペプチド(例えば2〜10個のアミノ酸)が融合体内のNgRポリペプチド部分のN末端とFc部分のC末端の間に組み込まれる。択一的な立体配置では、該短鎖ポリペプチドは、融合内のNgRポリペプチド部分のC末端とFc部分のN末端の間に組み込まれる。この立体配置の例示的な実施形態はNgR1(310)−2XG4S−Fcであり、これは、Fcに連結された(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)(配列番号66)に連結された配列番号49のアミノ酸26〜310である。かかるリンカーにより立体配座の柔軟性がもたらされ、これにより、状況によっては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の充分な部分がFc部分において保持されている場合、NgRポリペプチド部分−Fc融合体は二量体化し、したがって2価の分子が形成される。単量体Fc融合の均一な集団では、単一特異性の二価二量体が得られる。各々が異なる特異性を有する2種類の単量体Fc融合体の混合物では、二重特異性の二価二量体が得られる。
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する任意のいくつかの架橋剤を用い、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片を血清アルブミンに連結させ得る。適当なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えば、SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUSおよびGMBSが挙げられる。他の適当なリンカー、例えば、SBAP、SIA、SIABは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。保護または非保護チオールをスルフヒドリル基との反応に提供して還元可能な連結を生成させるリンカーとしては、SPDP、SMPT、SATAおよびSATPが挙げられる。かかる試薬は市販されている(例えば、Pierce Chemical Company、ロックフォード,IL)。
結合体化は、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片のN末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴うものである必要はない。例えば、NgRポリペプチド−アルブミン融合体は遺伝子操作手法を用いて得られ得、この場合、NgRポリペプチド部分は、血清アルブミン遺伝子に、そのN末端、C末端または両方で融合される。
本発明のNgRポリペプチドは、ポリペプチドタグに融合され得る。用語「ポリペプチドタグ」は、本明細書で用いる場合、NgRポリペプチドに結合、接続または連結され得る任意のアミノ酸配列、およびNgRポリペプチドを同定、精製、濃縮または単離するために使用され得る任意のアミノ酸配列を意味することが意図される。NgRポリペプチドへのポリペプチドタグの結合は、例えば、(a)ポリペプチドタグをコードする核酸配列、および(b)NgRポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することにより行われ得る。例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、翻訳後修飾され得るアミノ酸配列、例えば、ビオチン化されるアミノ酸配列が挙げられる。他の例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、抗体(もしくはその断片)または他の特異的結合試薬によって認識および/または結合され得るアミノ酸配列が挙げられる。抗体(もしくはその断片)または他の特異的結合試薬によって認識され得るポリペプチドタグとしては、例えば、当該技術分野「エピトープタグ」として知られるものが挙げられる。エピトープタグは、天然または人工のエピトープタグであり得る。天然または人工のエピトープタグは、当該技術分野で知られており、例えば、FLAG、Strepまたはポリヒスチジンペプチドなどの人工エピトープが挙げられる。FLAGペプチドは、配列Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(配列番号74)またはAsp−Tyr−Lys−Asp−Glu−Asp−Asp−Lys(配列番号75)を含む(Einhauer,A.およびJungbauer,A.,J.Biochem.Biophys.Methods 49:1−3:455−465(2001))。Strepエピトープは、配列Ala−Trp−Arg−His−Pro−Gln−Phe−Gly−Gly(配列番号76)を有する。VSV−Gエピトープもまた使用され得、配列Tyr−Thr−Asp−Ile−Glu−Met−Asn−Arg−Leu−Gly−Lys(配列番号77)を有する。別の人工エピトープは、6つのヒスチジン残基(His−His−His−His−His−His(配列番号78)を有するポリHis配列である。天然に存在するエピトープとしては、モノクローナル抗体12CA5によって認識されるインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)配列Tyr−Pro−Tyr−Asp−Val−Pro−Asp−Tyr−Ala−Ile−Glu−Gly−Arg(配列番号79)(Murrayら、Anal.Biochem.229:170−179(1995))およびモノクローナル抗体9E10によって認識されるヒトc−myc(Myc)由来11アミノ酸配列(Glu−Gln−Lys−Leu−Leu−Ser−Glu−Glu−Asp−Leu−Asn(配列番号80)(Mansteinら、Gene 162:129−134(1995))が挙げられる。別の有用な エピトープはトリペプチドGlu−Glu−Pheであり、これは、モノクローナル抗体YL 1/2によって認識される(Stammersら FEBS Lett.283:298−302(1991))。
特定のある実施形態において、NgRポリペプチドとポリペプチドタグは、連結アミノ酸配列によって接続され得る。本明細書で用いる場合、「連結アミノ酸配列」は、1種類以上のプロテアーゼによって認識および/または切断され得るアミノ酸配列であり得る。1種類以上のプロテアーゼによって認識および/または切断され得るアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている。例示的なアミノ酸配列は、以下のプロテアーゼ:第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、APC、t−PA、u−PA、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンB、H、L、S、D、カテプシンG、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ(コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ)、マクロファージエラスターゼ、Cir、およびCisによって認識されるものである。上記のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている。特定のプロテアーゼによって認識される例示的な配列は、例えば、米国特許第5,811,252号を見るとよい。
ポリペプチドタグにより、市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製が容易になり得る。
本発明の一部のある実施形態において、NgRポリペプチド融合構築物は、細菌内でのNgRポリペプチド部分の産生を増強するために使用される。かかる構築物には、通常、高レベルで発現および/または分泌される細菌タンパク質が、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片のN末端融合パートナーとして使用される。例えば、Smithら、Gene 67:31(1988);Hoppら、Biotechnology
6:1204(1988);La Vallieら、Biotechnology 11:187(1993) を参照のこと。
NgRポリペプチド部分を適当な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させることにより、2価または4価の形態の本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片が得られ得る。例えば、NgRポリペプチド部分をIg部分のアミノ末端およびカルボキシ末端を融合させると、2つのNgRポリペプチド部分を含む2価の単量体ポリペプチドが生成され得る。Ig部分のおかげでこのような単量体の2つが二量体化すると、4価形態のNgRポリペプチドが得られる。かかる多価形態は、標的に対する結合親和性の増大を達成するために使用され得る。多価形態の本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片はまた、NgRポリペプチド部分をタンデムに配置してコンカテマーを形成することにより得られ得、これは、単独で、または融合パートナー(例えば、IgもしくはHSAなど)と融合させて使用され得る。
(結合体化されるポリマー(ポリペプチド以外))
本発明の一部のある実施形態では、1つ以上のポリマーをNgRポリペプチドに結合体化(共有結合により連結)させた本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片を伴う。かかる結合体化に適したポリマーの例としては、ポリペプチド(上記)、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的には、必ずしもそうではないが、ポリマーは、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片に、以下:可溶性、安定性またはバイオアベイラビリティの1つ以上を改善する目的で結合体化させる。
本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片への結合体化に一般的に使用されるポリマーの類型は、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール(PEG)は、最も高頻度に使用される。NgRポリペプチド単独と比べて血清半減期を増大させるため、PEG部分、例えば、1、2、3、4または5つのPEGポリマーを、各NgRポリペプチドに結合体化させ得る。PEG部分は、非抗原性で本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるPEG部分は分枝鎖または非分枝鎖であり得る。
NgRポリペプチドに結合されるPEG部分の数および個々のPEG鎖の分子量は種々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少ない。通常、NgRポリペプチドまたはポリペプチド断片に結合させるポリマーの総質量は20kDa〜40kDaである。したがって、1つのポリマー鎖を結合させる場合、その鎖の分子量は、一般的に20〜40kDaである。2つの鎖を結合させる場合、各鎖の分子量は、一般的に10〜20kDaである。3つの鎖を結合させる場合、分子量は、一般的に7〜14kDaである。
該ポリマー、例えばPEGはNgRポリペプチドに、該ポリペプチド上の任意の適当な露出した反応性基を介して連結され得る。露出した反応性基(1つまたは複数)は、例えば、N末端アミノ基もしくは内部リシン残基のεアミノ基または両方であり得る。活性化ポリマーは、NgRポリペプチド上の任意の遊離アミノ基と反応し、これに共有結合によって連結され得る。NgRポリペプチドの遊離カルボン酸基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化糖鎖部分およびメルカプト基(利用可能な場合)もまた、ポリマー結合のための反応性基として使用され得る。
結合体化反応では、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド1モルあたり約1.0〜約10モルの活性化ポリマーが、典型的に使用される。通常、選択される比率は、反応の最大化と、NgRポリペプチド部分の所望の薬理学的活性を障害し得る副反応(多くの場合、非特異的)の最小化との均衡を示すものである。好ましくは、NgRポリペプチドの少なくとも50%の生物学的活性(例えば、任意の本明細書に記載のアッセイまたは当該技術分野で知られたアッセイにおいて示される)が保持され、最も好ましくは、ほぼ100%が保持されるものである。
ポリマーはNgRポリペプチドに、慣用的な化学反応を用いて結合体化させ得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、NgRポリペプチドのリシンのεアミノ基にカップリングさせ得る。リシン側鎖への連結は、N−ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)活性エステル、例えば、PEGスクシンイミジルスクシネート(SS−PEG)およびスクシンイミジルプロピオネート(SPA−PEG)などにより行なわれ得る。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−NHSおよびノルロイシン−NHS、SCが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性PEGリンカーが、スクシンイミジル部分の代わりに使用され得る。このようなものとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート(PNP)、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、SC−PEG、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびPNPカーボネートが挙げられる。条件は、通常、反応の選択性および程度が最大限となるように最適化される。かかる反応条件の最適化は、当業者の技量の範囲内である。
PEG化は、当該技術分野で知られた任意のPEG化反応によって行なわれ得る。例えば、Focus on Growth Factors,3:4−10(1992)、ならびに欧州特許出願EP 0154316およびEP 0401384を参照のこと。PEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子(もしくは類縁の反応性水溶性ポリマー)によるアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行なわれ得る。
アシル化によるPEG化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を伴う。任意の反応性PEG分子がPEG化に使用され得る。N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)にエステル化されたPEGは、高頻度に使用される活性化PEGエステルである。本明細書で用いる場合、「アシル化」には、限定されないが、以下の型:治療用タンパク質と水溶性ポリマー、例えば、PEG:アミド、カルバメート、ウレタンなどとの連結が含まれる。例えば、Bioconjugate Chem.5:133−140、1994を参照のこと。反応パラメータは、一般的に、NgRポリペプチドを損傷または不活化し得る温度、溶媒およびpH条件が回避されるように選択される。
一般的に、連結結合部はアミドであり、典型的には、生じる生成物の少なくとも95%がモノ−、ジ−またはトリ−PEG化されている。しかしながら、より高度にPEG化された種が一部、使用した具体的な反応条件に応じた量で形成され得る。任意選択で、精製PEG化種は混合物から、特に未反応種から慣用的な精製方法、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動などによって分離される。
アルキル化によるPEG化は、一般的に、還元剤の存在下での、PEGの末端アルデヒド誘導体と本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片との反応を伴う。また、PEG化が、実質的にNgRポリペプチドのN末端アミノ基においてのみ好都合となるように(すなわち、モノPEG化タンパク質)、反応条件を操作してもよい。モノPEG化またはポリPEG化いずれの場合も、PEG基は、典型的には該タンパク質に−CH2−NH−基によって結合される。特に−CH2−基に関して、この型の結合は「アルキル」結合として知られている。
N末端標的化モノPEG化生成物を作製するための還元的アルキル化による誘導体化では、誘導体化に利用可能な種々の型の一次アミノ基(リシン対N末端)差示的反応性が利用される。該反応は、リシン残基のε−アミノ基と該タンパク質のN末端アミノ基とのpKaの差を利用することが可能なpHで行なわれる。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーの該タンパク質への結合が制御される、すなわち、該ポリマーとの結合体化が主として該タンパク質のN末端で起こり、他の反応性基(例えば、リシン側鎖のアミノ基など)の有意な修飾は起こらない。
アシル化およびアルキル化両方のアプローチに使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、典型的には、本発明の方法に提供された場合に重合度が制御され得るように、単一の反応性基(例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド)を有するように修飾されたものである。例示的な反応性PEGアルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水安定性であるか、またはモノC1〜C10アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である(例えば、Harrisら、米国特許第5,252,714号を参照のこと)。該ポリマーは分枝鎖または非分枝鎖であり得る。アシル化反応では、選択されるポリマー(1つまたは複数)は、典型的には単一の反応性エステル基を有する。還元性アルキル化では、選択されるポリマー(1つまたは複数)は、典型的には単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性ポリマーは、これらが、通常、哺乳動物組換え発現系によってより簡便に作製されるため、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
PEG化された本発明のNgRポリペプチドの作製方法は、一般的に、(a)本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片をポリエチレングリコール(例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など)と、該分子が1つ以上のPEG基に結合された状態になる条件下で反応させる工程、および(b)反応生成物(1種類または複数種)を得る工程を含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知パラメータおよび所望される結果に基づいて個別に決定される。例えば、タンパク質に対するPEGの比率が大きいと、一般的に、より高いパーセンテージでポリPEG化生成物がもたらされる。
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー/NgRポリペプチドを作製するための還元的アルキル化は、一般的に、(a)本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片を反応性PEG分子と、還元性アルキル化条件下、NgRのN末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したpHで反応させる工程;および(b)反応生成物(1種類または複数種)を得る工程を含む。
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー/NgRポリペプチドのためには、還元性アルキル化反応条件は、本発明のNgR1ポリペプチドまたはポリペプチド断片のN末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。かかる反応条件は、一般的に、リシン側鎖アミノ基と該N末端アミノ基の間にpKaの差をもたらすものである。本発明の目的には、pHは、一般的に3〜9、典型的には3〜6の範囲である。
本発明のNgRポリペプチドは、タグ、例えば、後にタンパク質分解によって放出され得る一部分を含むものであり得る。したがって、リシン部分は、まず、低分子量リンカー(例えば、トラウト試薬(Pierce Chemical Company、ロックフォード、IL)、これは、リシンおよびN末端の両方と反応する)で修飾されたHis−タグ反応させ、次いで、該Hisタグを放出させることにより選択的に修飾され得る。その結果、該ポリペプチドは、チオール反応性頭部(head)基(例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護SH)を含有するPEGで選択的に修飾され得る遊離SH基を含むことになる。
トラウト試薬は、PEG結合のための特異的部位を設定する任意のリンカーで置き換えられ得る。例えば、トラウト試薬は、SPDP、SMPT、SATAまたはSATP(Pierce Chemical Company、ロックフォード、IL)で置き換えられ得る。同様に、該タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー(例えば、SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUSもしくはGMBS)、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー(SBAP、SIA、SIAB)、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、得られた生成物を遊離SHを含有するPEGと反応させ得る。
一部のある実施形態では、ポリアルキレングリコール部分を、NgRポリペプチドのシステイン基にカップリングさせる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて行なわれ得る。
任意選択で、NgRポリペプチドはポリエチレン−グリコール部分に、不安定結合を介して結合体化させる。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断にて切断され得る。例えば、該結合は、インビボ(生理学的)条件下で切断されるものであり得る。
該反応は、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとの反応に使用される任意の適当な方法によって、一般的にはpH約5〜8で、例えば、pH5、6、7または8のpH(反応性基がN末端のαアミノ基上に存在する場合)で行なわれ得る。一般的に、該方法は、活性化ポリマーの調製すること、およびその後、タンパク質を該活性化ポリマーと反応させて製剤化に適した可溶性タンパク質を作製することを伴う。
本発明のNgRポリペプチドは、特定のある実施形態では、可溶性ポリペプチドである。ポリペプチドを可溶性にするための方法、またはポリペプチドの可溶性を改善するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
(本発明の核酸分子)
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば、配列番号1〜9、26〜27、29〜37および41〜45の任意の1つのポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は、配列番号6および8のNogoレセプター−1のアミノ酸残基26〜344または配列番号8に示すNogoレセプター−1のアミノ酸残基27〜344からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。一部のある実施形態において、該核酸分子は、配列番号7および9に示すNogoレセプター−1のアミノ酸残基26〜310または配列番号9に示すNogoレセプター−1のアミノ酸残基27〜310からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。本明細書で用いる場合、「核酸」は、ゲノムDNA、cDNA、mRNAおよびアンチセンス分子、ならびに択一的主鎖を主とする核酸または択一的塩基を含む核酸(天然の供給源由来または合成のものいずれも)を意味する。一部のある実施形態において、該核酸は、さらに、転写プロモーターおよび任意選択でシグナル配列を含み、これらは各々、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のNogoレセプター−1融合タンパク質コードする核酸、例えば、配列番号6および8に示すNogoレセプター−1のアミノ酸残基26〜344、または配列番号8のアミノ酸残基27〜344および配列番号7および9に示すNogoレセプター−1のアミノ酸残基26〜310または配列番号9のアミノ酸残基27〜310からなる群より選択されるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一部のある実施形態において、該核酸は、配列番号26〜27、29〜37および41〜45からなる群より選択されるポリペプチドを含むNogoレセプター−1融合タンパク質をコードする。一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1融合タンパク質をコードする核酸は、さらに、転写プロモーターおよび任意選択でシグナル配列を含む。一部のある実施形態において、該ヌクレオチド配列は、さらに、免疫グロブリン定常領域をコードする。一部のある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は重鎖定常領域である。一部のある実施形態では、該ヌクレオチド配列は、さらに、ヒンジ領域に連結された免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする。一部のある実施形態では、該核酸は、さらにFcをコードする。一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1融合タンパク質はFc断片を含む。
本発明のコード核酸は、診断目的およびプローブ目的のための検出可能な標識を含むようにさらに修飾されたものであり得る。さまざまなかかる標識が当該技術分野で知られており、本明細書に記載のコード分子に容易に使用され得る。好適な標識としては、限定されないが、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドなどが挙げられる。当業者は、標識されたコード核酸分子を得るために、当該技術分野で知られた任意の標識を使用することができよう。
本発明にはまた、適度にストリンジェントな条件ならびに高ストリンジェンシー条件下で、本発明のポリペプチドの任意の1つをコードするポリヌクレオチドの非コード鎖または相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。ストリンジェントな条件は当業者に知られており、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons,N.Y.(1989)、6.3.1〜6.3.6を見るとよい。
ヒトNogoレセプター−1ポリヌクレオチドを以下に配列番号81として示す。
完全長ヒトNogoレセプター−1は、配列番号81のヌクレオチド166〜ヌクレオチド1587にコードされている。
Figure 2013048638
ラットNogoレセプター−1ポリヌクレオチドを以下に配列番号82として示し、Genbankの受託番号はNM_053613である。
Figure 2013048638
マウスNogoレセプター−1ポリヌクレオチドを以下に配列番号83として示し、Genbankの受託番号はNM_022982である。
Figure 2013048638
ヒトNogoレセプター2−ポリヌクレオチドを以下に配列番号84として示し、Genbankの受託番号はBK001302である。
Figure 2013048638
マウスNogoレセプター2−ポリヌクレオチドを以下に配列番号 85として示し、Genbankの受託番号はNM_199223である。
Figure 2013048638
ヒトNogoレセプター−3 ポリヌクレオチドを以下に配列番号86として示し、Genbankの受託番号はBK001305である。
Figure 2013048638
マウスNogoレセプター−3 ポリヌクレオチドを以下に配列番号87として示し、Genbankの受託番号はBK001304である。
Figure 2013048638
(NgR1ポリヌクレオチドアンタゴニスト)
具体的なある実施形態は、NgR1の発現を抑制(ノックダウン)するNgR1ポリヌクレオチドアンタゴニストを含む。NgR1ポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、限定されないが、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、shRNAおよびRNAiが挙げられる。典型的には、かかる結合分子は、動物に別々に投与される(例えば、O’Connor、J.Neurochem.56:560(1991)を参照のこと)、が、かかる結合分子はまた、宿主細胞に取り込ませ、インビボで発現させたポリヌクレオチドからもインビボで発現させ得る。Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、ボーカラトーン、FL(1988)もまた参照のこと。
NgR遺伝子の発現は、一部のある実施形態では、RNA干渉(「RNAi」)を用いて阻害され得る。RNAiは、標的mRNAの発現に干渉するRNAの発現をいう。RNAiは、細胞内への二本鎖RNA(dsRNA)の導入により、相同mRNAの分解が引き起こされる現象である。最初に線虫Caenorhabditis elegansにおいて発見されたが、RNAiは、それ以来、広範な生物体において作用することがわかっている。「RNAi核酸」は、本明細書で用いる場合、一般に50ヌクレオチド長より短い核酸配列であって、mRNAレベルで遺伝子サイレンシングを引き起こすものである。
例えば、哺乳動物細胞では、長鎖dsRNA(>30ヌクレオチド)の導入により、強力な抗ウイルス性応答が開始され得る(タンパク質合成およびRNA分解の非特異的阻害によって例示される)。RNA干渉は、mRNAレベルでの遺伝子サイレンシングの機構を提供する。近年、RNAiは、内因性の強力な遺伝子特異的サイレンシング手法となっており、二本鎖RNA(dsRNA)を用いてインビボでの分解について特定の転写物をマークする。また、これは、遺伝子ノックアウトのための効率的で広く適用可能なアプローチを提供する。また、RNAi手法は治療目的に使用され得る。例えば、RNAi標的化Fas媒介性アポトーシスにより、マウスが劇症肝炎から保護されることが示されている。RNAi手法は、数多くの刊行物、例えば、米国特許第5,919,619号、同第6,506,559号およびPCT公開公報WO99/14346、WO01/70949、WO01/36646、WO00/63364、WO00/44895、WO01/75164、WO01/92513、WO01/68836およびWO01/29058などに開示されている。
具体的には、RNAiにより、標的化遺伝子は、siRNA(短鎖干渉RNA)を介した特定のmRNA(例えば、NgR1)との相互作用によってサイレンシングされる。該dsRNA複合体は、次いで、細胞による分解のために標的化される。さらなるRNAi分子としては、ショートヘアピン型RNA(shRNA)(またショート干渉ヘアピン)が挙げられる。shRNA分子は、ループによって連結された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含む。shRNAは、核から細胞質内に輸送され、mRNAとともに分解される。RNAiのRNAを発現させるためには、Pol IIIまたはV6プロモーターが使用され得る。RNA干渉によって遺伝子発現を阻害し得る配列は、任意の長さを有するものであり得る。例えば、該配列は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、100個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有するものであり得る。該配列は、dsRNAまたは任意の他の型のポリヌクレオチドであり得るが、標的mRNA転写物を分解する機能性サイレンシング複合体を形成し得るものとする。
RNAiは、その「標的」mRNAに対して配列特異的相同性を有する二本鎖RNA(dsRNA)分子によって媒介される(Caplenら、Proc Natl Acad
Sci USA 98:9742−9747、2001)。ショウジョウバエの細胞無含有ライセートにおける生化学的研究により、RNA依存性遺伝子サイレンシングのメディエイターは、18〜25ヌクレオチドの「低分子干渉」RNA二本鎖(siRNA)であることが示されている。したがって、siRNA分子は、本発明の方法に好都合に使用される。siRNAは、Dicerと称されるRNアーゼIII関連ヌクレアーゼによるより長鎖のdsRNAの分解によって内因的に生成され得る(Bernsteinら、Nature 409:363−366、2001)。また、siRNAは、細胞内に外来的に、または発現構築物の転写によって導入され得る。形成されると、siRNAはタンパク質成分とともに、RNA誘導サイレンシング複合体RNA Induced Silencing Complex)(RISC)として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に集結される。siRNAのATP生成型巻き戻しにより、RISCが活性化され、これにより、ワトソン−クリック塩基対合によって相補mRNAの転写物が標的化される。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、RISCは標的mRNAに誘導され、そこでsiRNA二本鎖が配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられる(Bernsteinら、Nature 409:363−366、2001;Boutlaら、Curr Biol 11:1776−1780、2001)。mRNAの切断は、siRNA鎖が結合した領域の中央付近で起こる。この配列特異的mRNA分解により、遺伝子サイレンシングがもたらされる。
RNAiは、遺伝子機能を解析するため、および哺乳動物細胞の必須遺伝子を同定するために使用されている(Elbashirら、Methods 26:199−213、2002;Harborthら、J Cell Sci 114:4557−4565、2001)(非限定的な一例として、ニューロンが挙げられる(Krichevskyら、Proc Natl Acad Sci USA 99:11926−11929、2002)。RNAiはまた、治療モダリティ、例えば、ウイルス、例えば限定されないが、ポリオウイルス(Gitlinら、Nature 418:379−380、2002)およびHIV(Capodiciら、J Immunol 169:5196−5201、2002)の感染、複製および/または増殖の阻害または阻止、ならびに癌遺伝子(例えば、bcr−abl遺伝子;Scherrら、Blood Sep 26(出版前に電子公開(epub ahead of print)),2002)の発現の低減について評価されている。RNAiは、哺乳動物(マウス)および両生類(ツメガエル)の胚における遺伝子発現をモジュレートするため(それぞれ、Calegariら、Proc
Natl Acad Sci USA 99:14236−14240、2002;およびZhouら、Nucleic Acids Res 30:1664−1669、2002)、ならびに生後のマウスにおける遺伝子発現をモジュレートするため(Lewisら、Nat Genet 32:107−108、2002)、ならびに成体トランスジェニックマウスにおいて導入遺伝子発現を低減するため(McCaffreyら、Nature 418:38−39、2002)に使用されている。細胞培養物中およびインビボでのsiRNAの有効性および特異性を測定するための方法が報告されている(例えば、Bertrandら、Biochem Biophys Res Commun 296:1000−1004、2002;Lassusら、Sci STKE 2002(147):PL13、2002;およびLeirdalら、Biochem Biophys Res Commun 295:744−748、2002を参照のこと)。
RNAiを媒介する分子、例えば限定されないが、siRNAは、インビトロでの化学合成(Hohjoh、FEBS Lett 521:195−199、2002)、dsRNAの加水分解(Yangら、Proc Natl Acad Sci USA 99:9942−9947、2002)、T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写(Donzeetら、Nucleic Acids Res 30:e46、2002;Yuら、Proc Natl Acad Sci USA 99:6047−6052、2002)、および大腸菌RNアーゼIIIなどのヌクレアーゼを用いた二本鎖RNAの加水分解(Yangら、Proc Natl Acad Sci USA 99:9942−9947、2002)によって作製され得る。
siRNA分子はまた、2つのオリゴヌクレオチドの互いへのアニーリングによっても形成され得、典型的には、二本鎖部分と単鎖部分の両方を含む以下の一般構造を有する。
Figure 2013048638
式中、N、XおよびYはヌクレオチドである;XはYに水素結合する;「:」は、2つの塩基間の水素結合を意味する;xは、1〜約100の値を有する自然数の整数である;ならびにmおよびnは独立して、0〜約100の値を有する自然数の整数である。一部のある実施形態において、N、XおよびYは独立して、A、G、CおよびTまたはUである。天然に存在しない塩基およびヌクレオチドが、特に合成siRNAの場合に存在し得る(すなわち、2つのオリゴヌクレオチドのアニーリング産物)。二本鎖の中央部分は、「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対(bp)を有する。単鎖部分は突出端であり、測定単位としてヌクレオチド(nt)を有する。図示された突出端は3’突出端であるが、5’突出端を有する分子もまた本発明の範囲内である。また、突出端のないsiRNA分子(すなわち、m=0およびn=0)、ならびにコアの一方側には突出端を有するが他端にはないもの(例えば、m=0およびn>1、またはその逆)も本発明の範囲内である。
最初は、RNAi手法は、哺乳動物系に容易に適用可能であるとは思われていなかった。これは、哺乳動物では、dsRNAがdsRNA活性化プロテインキナーゼ(PKR)を活性化し、アポトーシスカスケードおよび細胞死がもたらされるためである(Derら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3279−3283、1997)。また、以前から、dsRNAが哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化し、また、それにより細胞生理機能の改変がもたらされ得ることが知られている(Colbyら、Annu.Rev.Microbiol.25:333、1971;Kleinschmidtら、Annu.Rev.Biochem.41:517、1972;Lampsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 58L782、1967;Lomnicziら、J.Gen.Virol.8:55、1970;およびYoungerら、J.Bacteriol.92:862、1966)。しかしながら、PKRおよびインターフェロンカスケードのdsRNA媒介型活性化には、約30塩基対より長いdsRNAが必要とされる。対照的に、30塩基対未満の長さのdsRNAは、哺乳動物細胞においてRNAiを引き起こすことが知られている(Caplenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9742−9747、2001)。したがって、長鎖dsRNAを実質的に含まない短鎖RNAを作製することにより、長鎖dsRNA分子に伴う望ましくない非特異的効果が回避され得ることが予測される。
siRNAに関する参考文献:Bernsteinら、Nature 409:363−366、2001;Boutlaら、Curr Biol 11:1776−1780、2001;Cullen、Nat Immunol.3:597−599、2002;Caplenら、Proc Natl Acad Sci USA 98:9742−9747、2001;Hamiltonら、Science 286:950−952、1999;Nagaseら、DNA Res.6:63−70、1999;Napoliら、Plant Cell 2:279−289、1990;Nicholsonら、Mamm.Genome 13:67−73、2002;Parrishら、Mol Cell 6:1077−1087、2000;Romanoら、Mol Microbiol
6:3343−3353、1992;Tabaraら、Cell 99:123−132、1999;およびTuschl、Chembiochem.2:239−245、2001。
Paddisonら(Genes & Dev.16:948−958、2002)により、ヘアピン状にフォールディングされた低分子RNA分子が、RNAiを行なうための手段として使用された。したがって、かかるショートヘアピン型RNA(shRNA)分子もまた、本発明の方法に好都合に使用される。機能性shRNAの幹部およびループの長さは種々である。幹の長さは、約25〜約30ntの任意の範囲であり得、ループの大きさは、4〜約25ntの範囲であり得、サイレンシング活性に影響しない。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなshRNAは、DICER RNアーゼのdsRNA産物と類似しており、任意の事象において、特定の遺伝子の発現の阻害に対して同じ能力を有すると考えられる。
一部のある実施形態において、本発明は、siRNAまたはshRNAがNgR1発現を阻害するものを提供する。一部のある実施形態において、本発明は、さらに、siRNAまたはshRNAが、CUACUUCUCCCGCAGGCG(配列番号52)またはCCCGGACCGACGUCUUCAA(配列番号54)またはCUGACCACUGAGUCUUCCG(配列番号56)を含むヌクレオチド配列と少なくとも80%、90%または95%同一であるものを提供する。他の実施形態において、siRNAまたはshRNAヌクレオチド配列は、CUACUUCUCCCGCAGGCG(配列番号52)またはCCCGGACCGACGUCUUCAA(配列番号54)またはCUGACCACUGAGUCUUCCG(配列番号56)である。
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、siRNAまたはshRNAヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列GATGAAGAGGGCGTCC GCT(配列番号53)またはGGGCCTGGCTGCAGAAGTT(配列番号55)またはGACTGGTGACTCAGAG AAGGC(配列番号57)によって生成するmRNAに相補的であるものを提供する。
本発明の一部のある実施形態において、shRNAは、実施例26に記載のように、レンチウイルスベクターから発現される。
修飾を有する(塩基、糖鎖および/またはリン酸基)核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによるその分解が抑制され得、その効力が増大され得る(例えば、Ecksteinら、国際特許公開公報WO92/07065;Perraultら、Nature 344:565(1990);Piekenら、Science 253:314(1991);UsmanおよびCedergren,Trends in Biochem.Sci.77:334(1992);Usmanら、国際特許公開公報WO93/15187;およびRossiら、国際特許公開公報WO91/03162;Sproat,米国特許第5,334,711号;Goldら、米国特許第6,300,074号;およびBurginら(上掲)(これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。上記の参考文献はすべて、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸基および/または糖鎖部分に対して行われ得る種々の化学的修飾を記載したものである。細胞内でのその有効性を増強し、核酸分子からの塩基の除去を増強するオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学的要件を低減する修飾が望ましい。
当該技術分野では、そのヌクレアーゼの安定性および有効性の有意な増強を伴って核酸分子内に導入され得る糖鎖、塩基およびリン酸基の修飾を示すいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、安定性を増強するため、および/または生物学的活性を増強するために、ヌクレアーゼ抵抗性基、例えば、2’−アミノ、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−H、ヌクレオチド塩基修飾による修飾によって修飾される(概説については、UsmanおよびCedergren、TIBS.17:34(1992);Usmanら、Nucleic Acids Symp.Ser.31:163(1994);Burginら、Biochemistry 35:14090(1996)を参照のこと)。核酸分子の糖鎖の修飾は、当該技術分野において広く報告されている(Ecksteinら、国際特許PCT公開公報番号WO92/07065;Perraultら、Nature 344:565−568(1990);Piekenら、Science 253:314−317(1991);UsmanおよびCedergren、Trends in Biochem.Sci.17:334−339(1992);Usmanら、国際特許PCT公開公報番号WO93/15187;Sproat、米国特許第5,334,711号およびBeigelmanら、J.Biol.Chem.270:25702(1995);Beigelmanら、国際特許PCT公開公報番号WO97/26270;Beigelmanら、米国特許第5,716,824号;Usmanら、米国特許第5,627,053号;Woolfら、国際特許PCT公開公報WO98/13526;Karpeiskyら、1998、Tetrahedron Lett.39:1131(1998);EarnshawおよびGait、Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48:39−55(1998);VermaおよびEckstein、Annu.Rev.Biochem.67:99−134(1998);およびBurlinaら、Bioorg.Med.Chem.5:1999−2010(1997)(該参考文献はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。かかる刊行物には、触媒作用をモジュレートすることなく核酸分子内への糖、塩基および/またはリン酸基の修飾などの組込みの位置を調べるための、一般的な方法およびストラテジーが記載されており、引用により本明細書に組み込まれる。かかる教示に鑑み、細胞内での(is cells)siRNAがRNAiを促進する能力が有意に阻害されない限り、同様の修飾を本明細書に記載のようにして使用し、本発明のsiRNA核酸分子が修飾され得る。
本発明は、リン酸基主鎖の修飾が、1つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび/またはアルキルシリル置換を含む、修飾されたsiRNA分子を扱う。オリゴヌクレオチド主鎖修飾の概説については、HunzikerおよびLeumann、Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in Modern Synthetic Methods、VCH、331−417(1995)、ならびにMesmaekerら、Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications in Antisense Research、ACS、24−39(1994)を参照のこと。
ホスホロチオエート、ホスホロチオエートおよび/または5’−メチルホスホネート連結によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結の化学的修飾によって、安定性が改善されるが、過剰な修飾は、いくらかの毒性または活性の低下をもたらし得る。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間連結の量は、最小限にとどめるのがよい。このような連結の濃度の低減により、毒性が低下し、これらの分子の有効性の増大およびより高い特異性がもたらされるはずである。
活性を維持または増強する化学的修飾を有するsiRNA分子が提供される。また、かかる核酸は、一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して抵抗性である。したがって、インビトロおよび/またはインビボ活性は、有意に低下しないはずである。モジュレーションが目的である場合、体外から送達される治療用核酸分子は、不要なタンパク質のレベルを低下させるのに充分長期間、標的RNAの翻訳がモジュレートされるまで、細胞内で最適に安定であるのがよい。この期間は、疾患状態に応じて数時間〜数日間の間で種々である。RNAおよびDNAの化学合成の改善(Wincottら、Nucleic Acids Res.23:2677(1995);Caruthersら、Methods in Enzymotogy 211:3−19(1992)(引用により本明細書に組み込まれる))により、上記のようなヌクレアーゼ安定性を増強するためにヌクレオチド修飾を導入することにより核酸分子を修飾できる可能性が拡大された。
本発明のポリヌクレオチドは、1個以上(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上)のG−クランプヌクレオチドを含むものであり得る。G−クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類縁体であって、該修飾により、二本鎖内の相補グアニンのワトソン−クリック面とフーグスティーン面の両方に水素結合する能力が付与されたものである(例えば、LinおよびMatteucci、J.Am.Chem.Soc.120:8531−8532(1998)を参照のこと)。オリゴヌクレオチド内の単一のG−クランプ類縁体置換は、相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたとき、相当ならせんの熱安定性の増強およびミスマッチの識別をもたらし得る。かかるヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチド内に含めることにより、核酸標的、相補配列または鋳型鎖に対する親和性と特異性の両方の向上がもたらされる。本発明のポリヌクレオチドはまた、1個以上(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上)のLNA「ロックト核酸」ヌクレオチド、例えば、2’,4’−Cミチレン(mythylene)ビシクロヌクレオチドなど(例えば、Wengelら、国際特許PCT公開公報WO00/66604およびWO99/14226を参照のこと)を含むものであり得る。
本発明はまた、本発明のsiRNA分子の結合体および/または複合体を扱う。かかる結合体および/または複合体は、生物学的系(例えば、細胞)内へのsiRNA分子の送達を助長するために使用され得る。本発明によって提供される結合体および複合体は治療用化合物を、細胞膜を越えて移送し、本発明の核酸分子の薬物動態を改変および/または局在をモジュレートすることにより、治療活性を提供し得るものである。本発明には、分子、例えば限定されないが、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負電荷を有するポリマーおよび他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、糖質、ポリエチレングリコールまたはポリアミンを、細胞膜を越えて送達するための新規な結合体および複合体の設計および合成が包含される。一般に、記載の輸送体は、個々に、または多成分系の一部として分解性リンカーとともにもしくはなしでのいずれかで使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織由来のいくつかの細胞への本発明の核酸分子の送達および/または局在化を改善することが予測される(SullengerおよびCech、米国特許第5,854,038号を参照のこと)。本明細書に記載の分子の結合体は生物学的に活性な分子に、生分解性であるリンカー、例えば、生分解性の核酸リンカー分子によって結合され得る。
体外から送達される治療用ポリヌクレオチド(例えば、siRNA分子)は、RNA転写物のレベルを低下させるのに充分長期間、RNAの逆転写がモジュレートされるまで、細胞内で最適に安定である。該核酸分子は、有効な細胞内治療用薬剤としての機能を果たすため、ヌクレアーゼに対して抵抗性である。本明細書に記載および当該技術分野で報告された核酸分子の化学合成の改善により、上記のようなヌクレアーゼ安定性を増強するためにヌクレオチド修飾を導入することにより核酸分子を修飾できる可能性が拡大された。
本発明はまた、RNAiに関与するタンパク質の酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有するsiRNA分子を提供する。また、かかる核酸は、一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して抵抗性である。したがって、インビトロおよび/またはインビボ活性は、有意に低下しないはずである。
本発明のポリヌクレオチド系分子の使用は、併用療法(例えば、異なる遺伝子に標的化される多数のsiRNA分子;既知の小分子モジュレータとカップリングさせた核酸分子;あるいは分子(例えば、異なるモチーフおよび/または他の化学的もしくは生物学的分子)の組合せによる断続的処置)の可能性を提供することにより、疾患進行のより良好な処置をもたらす。また、siRNA分子での被検体の処置としては、異なる型の核酸分子、例えば、酵素的核酸分子(リボザイム)、アロザイム、アンチセンス、2,5−Aオリゴアデニレート、おとり(decoy)、アプタマーなどの組合せが挙げられ得る。
別の態様において、本発明のsiRNA分子は、1つ以上の5’および/または3’−キャップ構造を、例えば、センスsiRNA鎖のみ、アンチセンスsiRNA鎖のみまたは両方のsiRNA鎖に含むものであり得る。「キャップ構造」により、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学的修飾が意図される(例えば、Adamicら、米国特許第5,998,203号(引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。これらの末端修飾により、核酸分子がエキソヌクレアーゼ分解から保護され、細胞内での送達および/または局在化が補助され得る。キャップは、5’末端(5’−キャップ)もしくは3’末端(3’−キャップ)に存在させ得るか、または両方の末端に存在させ得る。非限定的な例において、5’−キャップは、逆位無塩基残基(部分);4’,5’−メチレンヌクレオチド;1−(β−D−エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド;炭素環式ヌクレオチド;1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L−ヌクレオチド;α−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’,4’−セコヌクレオチド;非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3’−3’−逆位ヌクレオチド部分;3’−3’−逆位無塩基部分;3’−2’−逆位ヌクレオチド部分;3’−2’−逆位無塩基部分;1,4−ブタンジオールホスフェート;3’−ホスホルアミデート;ヘキシルホスフェート;アミノヘキシルホスフェート;3’−ホスフェート;3’−ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;または橋絡もしくは非橋絡メチルホスホネート部分を含む群から選択される。
3’−キャップは、4’、5’−メチレンヌクレオチド;l−(β−D−エリトロフラノシル)ヌクレオチド;4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;5’−アミノ−アルキルホスフェート;1,3−ジアミノ2−プロピルホスフェート;3−アミノプロピルホスフェート;6−アミノヘキシルホスフェート;1,2−アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L−ヌクレオチド;α−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート;トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’,4’−セコヌクレオチド;3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5’−5’−逆位ヌクレオチド部分;5’−5’−逆位無塩基部分;5’−ホスホルアミデート;5’−ホスホロチオエート;1,4−ブタンジオールホスフェート;5’−アミノ;橋絡および/または非橋絡5’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび/またはホスホロジチオエート、橋絡または非橋絡メチルホスホネートまたは5’−メルカプト部分を含む群から選択され得る(さらなる詳細については、BeaucageおよびIyer、Tetrahedron 49:1925(1993)(引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
このような分子の有用性を向上させるため、核酸siRNA構造に対して種々の修飾が行われ得る。かかる修飾により、貯蔵寿命、インビトロ半減期、安定性、および標的部位へのかかるオリゴヌクレオチドの導入し易さが向上し、例えば、細胞膜の透過性が向上し、標的化細胞を認識して結合する能力が付与される。
アンチセンス手法は、アンチセンスDNAもしくはRNAにより、または三重らせんの形成により遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス手法は、例えば、Okano、J.Neurochem.56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、ボーカラトーン、FL(1988)に論考されている。三重らせんの形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research 6:3073(1979);Cooneyら、Science
241:456(1988);およびDervanら、Science 251:1300(1991)に論考されている、該方法は、相補的なDNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づくものである。
例えば、NgR1をコードするポリヌクレオチドの5’コード部分を用いて、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドが設計され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それにより標的タンパク質の転写および産生が妨げられるように設計される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはmRNAにインビボでハイブリダイズし、標的ポリペプチドへのmRNA分子の翻訳を阻止する。
一実施形態において、NgR1遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分が転写され、アンチセンス核酸(RNA)が生成される。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAをもたらす限り、エピソームのまま維持されていてもよく、染色体に組み込まれた状態であってもよい。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えDNA手法方法によって構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または脊椎動物細胞での複製および発現に使用される当該技術分野で知られたその他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物(好ましくはヒト細胞)において作用する当該技術分野で知られた任意のプロモーター(例えば、本明細書の他の箇所に記載のものなど)によるものであり得る。
アンチセンス分子の絶対的な相補性は、好ましいが必要ではない。NgR1をコードするRNAの少なくとも一部分に相補的な配列は、該RNAとハイブリダイズして安定な二本鎖が形成され得るか、または三重らせん形成がアッセイされ得るのに充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、内包され得る塩基ミスマッチが多くなるが、依然として安定な二本鎖(または場合によっては三重らせん)が形成され得る。当業者には、標準的な手順を使用してハイブリダイズ複合体の融解点を測定することにより、許容されるミスマッチの程度を確認することができよう。
メッセンジャーRNAの5’末端、例えば、AUG開始コドン(該コドンを含む)までの5’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害において最も効率的に機能を果たすはずである。しかしながら、mRNAの3’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、mRNAの翻訳の阻害に有効ことが示されている。一般的には、Wagner,R.、Nature 372:333−335(1994)を参照のこと。したがって、5’または3’いずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが、NgR1の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。mRNAの5’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補鎖を含むものであるのがよい。mRNAコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率性の低い翻訳阻害因子であるが、本発明に従って使用され得る。アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチド長であるのがよく、好ましくは、6〜約50ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的なある態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。
本明細書に開示された治療方法における使用のためのポリヌクレオチド、例えば、後述するアプタマーは、DNAもしくはRNAもしくはキメラ混合物もしくは誘導体、またはその修飾異形、単鎖または二本鎖であり得る。該オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖鎖部分またはリン酸主鎖が修飾されたものであり得る。該オリゴヌクレオチドは、他の懸垂基、例えば、ペプチド(例えば、宿主細胞レセプターのインビボでの標的化のため)、または細胞膜を超える輸送を助長する薬剤(例えば、Letsingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553−6556(1989);Lemaitreら、Proc.Natl.Acad.Sci.84:648−652(1987));PCT公開公報番号WO88/09810(1988年12月15日公開)を参照のこと)もしくは血液脳関門を越える輸送を助長する薬剤(例えば、PCT公開公報番号WO89/10134(1988年4月25日公開)を参照のこと)、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤(例えば、Krolら、BioTechniques 6:958−976(1988)を参照のこと)またはインターカレート剤などを含むものであり得る(例えば、Zon、Pharm.Res.5:539−549(1988)を参照のこと)。この目的のため、該オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などに結合体化させ得る。
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基部分を含むものであり得、該修飾塩基部分は、限定されないが、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルケオシン、イノシン、N−6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2、2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N−6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルケオシン、5’メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N−6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3(3−アミノ−3−N2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンを含む群から選択される。
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも1つの修飾糖鎖部分を含むものであり得る。
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類縁体を含む群から選択される少なくとも1つの修飾リン酸主鎖を含むものである。
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成するが、この場合、通常の状況とは逆に、鎖は互いに平行である(Gautierら、Nucl.Acids Res.15:6625−6641(1987))。該オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルリボヌクレオチド(Inoueら、Nucl.Acids Res.15:6131−6148(1987))、またはキメラRNA−DNA類縁体(Inoueら、FEBS Lett.215:327−330(1987))である。
本発明のポリヌクレオチド、例えば、アプタマーは、当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、自動DNA合成装置(例えば、Biosearch、Applied Biosystemsから市販されたものなど)の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinら、Nucl.Acids Res.16:3209(1988)の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールド・ポア・ガラスポリマー支持体の使用によって作製され得る(Sarinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448−7451(1988))などである。
本明細書に開示された治療方法における使用のためのポリヌクレオチド組成物は、さらに、触媒性RNAまたはリボザイムを含む(例えば、PCT国際特許公開公報WO90/11364(1990年10月4日公開);Sarverら、Science 247:1222−1225(1990)を参照のこと)。ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはmRNAを、標的mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置で切断する。唯一の要件は、標的mRNAが2つの塩基の以下の配列:5’−UG−3’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は当該技術分野でよく知られており、HaseloffおよびGerlach、Nature 334:585−591(1988)により充分に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的mRNAの5’末端付近に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能的mRNA転写物の細胞内蓄積が最小限となるように操作される。
アンチセンスアプローチの場合ように、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のためのリボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド(例えば、安定性、標的化の改善のためなど)で構成されたものであり得、NgR1をインビボで発現する細胞に送達され得る。リボザイムをコードするDNA構築物は、アンチセンスコードDNAの導入について上記と同様にして細胞内に導入され得る。好ましい送達方法は、強力な構成的プロモーター(例えば、pol IIIまたはpol IIプロモーターなど)の制御下にあるリボザイム「コード」DNA構築物の使用を伴い、その結果、トランスフェクト細胞は、充分な量のリボザイムを産生し、内因性NgR1メッセージが破壊され、翻訳が阻害される。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるため、効率性に必要とされる細胞内濃度はより低い。
(アプタマー)
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのNgR1アンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、特殊な配列を有し、所望の標的(例えば、ポリペプチド)に対する特異的結合特性を有し、所与の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。本発明のヌクレオチドアプタマーとしては、NgR1に結合する二本鎖DNAおよび単鎖RNA分子が挙げられる。
核酸アプタマーは、当該技術分野で知られた方法を用いて、例えば、試験管内人工進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(SELEX)法によって選択される。SELEXは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、米国特許第5,475,096号、同第5,580,737号、同第5,567,588号、同第5,707,796号、同第5,763,177号、同第6,011,577号および同第6,699,843号(引用によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第5,270,163号(これも、引用により本明細書に組み込まれる)に記載されている。SELEX法は、さまざまな2次元および3次元構造を形成する核酸の能力、ならびに実質的に任意の化合物(モノマーまたはポリマーいずれも)、例えば、他の核酸分子およびポリペプチドのリガンドとして作用する(特異的結合対を形成する)ためのヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的多能性に基づく。任意の大きさまたは組成の分子が標的として供され得る。
SELEX法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分離および増幅の段階的相互作用を伴ない、所望の結合親和性および選択性を得るための同じ一般的な選択スキームを使用する。核酸の混合物(好ましくは、無作為配列のセグメントを含む)から開始し、SELEX法は、該混合物を標的と結合に好都合な条件下で接触させる工程;未結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸と分離する工程;核酸−標的複合体を解離させる工程;核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅し、リガンド高含有核酸混合物を得る工程を含む。結合、分離、解離および増幅の工程は、標的分子に対する高度に特異的な高親和性核酸リガンドを得るのに所望されるだけ多くのサイクル反復される。
ヌクレオチドアプタマーは、例えば、診断用ツールとして、または細胞内シグナル伝達および輸送経路を分析するための特異的インヒビターとして使用され得る(James(2001)Curr.Opin.Pharmacol.1:540−546)。ヌクレオチドアプタマーは、その高い親和性および特異性により、創薬のための良好な候補となる。例えば、毒素リシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離されており、ナノモル範囲のIC50値を有する(Hesselberth JRら(2000)J Biol Chem 275:4937−4942)。ヌクレオチドアプタマーはまた、感染性疾患、悪性腫瘍およびウイルス表面タンパク質に対して、細胞感染性を低下させるために使用され得る。
本発明の方法における使用のためのヌクレオチドアプタマーは、他のポリヌクレオチドについて本明細書に記載のようにして修飾されたものであり得る(例えば、主鎖もしくは塩基の修飾またはペプチドへの結合体化によって)。
NgR1のタンパク質構造を使用し、SELEX法を用いたNgR1に作用するアプタマーのスクリーニングにより、NgR1媒介性プロセス(例えば、軸索の再生のNgR1媒介性阻害)を阻害するアプタマーの同定が可能となる得る。
本発明の方法における使用のためのポリペプチドアプタマーは、NgR1に結合し、それによりその作用をブロックする能力について選択されたランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端がタンパク質骨格に結合された短い可変ペプチドドメインを含むものであり得る。この二重構造の拘束により、ペプチドアプタマーの結合親和性が、抗体に匹敵するレベル(ナノモル範囲)まで大きく増大する。例えば、Hoppe−Seyler Fら(2000)J Mol Med 78(8):426−430を参照のこと。該短い可変ペプチドの長さは、典型的には、約10〜20アミノ酸であり、その骨格は、良好な可溶性と小型化特性を有する任意のタンパク質であり得る。骨格タンパク質の非限定的な一例は、細菌タンパク質チオレドキシン−Aである。例えば、Cohen BAら(1998)PNAS 95(24):14272−14277を参照のこと。
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能のドミナント阻害因子としての機能を果たすペプチドまたは小ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その機能性能力をブロックする(Koloninら(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:14、266−14、271)。高い親和性および特異性で標的タンパク質に結合するペプチドアプタマーは、当該技術分野で知られたさまざまな手法によって単離され得る。ペプチドアプタマーは、ランダムペプチドライブラリーから酵母ツーハイブリッドスクリーニング(Xu、C.W.、ら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:12、473−12、478)またはリボソームディスプレイ(Hanesら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937−4942)によって単離され得る。該アプタマーはまた、ファージライブラリー(Hoogenboom,H.R.、ら(1998)Immunotechnology 4:1−20)または化学的に作製されたペプチドライブラリーから単離され得る。さらに、ポリペプチドアプタマーは、リガンド調節型ペプチドアプタマー(Ligand Regulated Peptide Aptamers)(LiRPA)選択を用いて選択され得る。例えば、Binkowski BFら、(2005)Chem & Biol 12(7):847−855(引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。ペプチドアプタマーは、合成手段が難しいことから、その使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑となっているが、無限の化学的多様性を有する。ポリヌクレオチドアプタマーは限定的である、それは、4種類のヌクレオチド塩基しか使用されないが、ペプチドアプタマーでは、ずっと広いレパートリー(すなわち、20種類のアミノ酸)を有し得るからである。
本発明の方法における使用のためのペプチドアプタマーは、本明細書の他の箇所で他のポリペプチドについて記載のようにして修飾(例えば、ポリマーに結合体化またはタンパク質に融合)されたものであり得る。
(組成物)
一部のある実施形態において、本発明は、配列番号1〜5、26〜27、29〜37および41〜45からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明の抗Nogoレセプター−1抗体もしくはその抗原結合断片または可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび抗炎症剤を含む組成物を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、活性化合物を調製物に加工処理するのを助長し、作用部位への送達のために医薬として使用され得る適当な薬学的に許容され得るキャリア(賦形剤および助剤など)を含有するものであり得る。非経口投与に好適な製剤としては、水溶性形態(例えば、水溶性の塩)の活性化合物の水性液剤が挙げられる。また、活性化合物の懸濁剤、適宜、油性の注射用懸濁剤が投与され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油(例えば、ゴマ油)、または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド)が挙げられる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁剤の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含有するものであり得る。任意選択で、懸濁剤は、安定剤もまた含有するものであり得る。また、リポソームを用いて、細胞内への送達用の本発明の分子を封入してもよい。例示的な「薬学的に許容され得るキャリア」は、生理学的に適合性の任意すべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組合せである。一部のある実施形態において、該組成物は、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール(マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなど)を含む。一部のある実施形態において、該組成物は、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの、本発明の抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプターまたは融合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を向上させる薬学的に許容され得る物質を含む。
本発明の組成物は、さまざまな形態、例えば、液状、半固形および固形投薬形態、例えば、液状の液剤(例えば、注射用および浸剤用の液剤)、分散剤または懸濁剤などであり得る。好ましい形態は、意図される投与様式および適用治療に依存する。一実施形態において、組成物は、注射用または浸剤用の液剤、例えば、他の抗体でのヒトの受動免疫処置に使用されるものと同様の組成物の形態である。
該組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の整列構造体として剤化され得る。滅菌注射用液剤は、必要量の抗Nogoレセプター−1抗体を適切な溶媒中に、必要に応じて、上記の成分のうちの1種類または組合せとともに組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基剤分散媒体および必要な他の成分(上記のもの)を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、先に滅菌濾過した液剤から活性成分+任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。液剤の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
一部のある実施形態において、活性化合物は、該化合物を急速放出から保護するキャリアとともに調製され得、例えば、制御放出製剤、例えば、埋入物、経皮パッチ剤およびマイクロカプセル封入送達系などである。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などが使用され得る。かかる製剤の調製のための多くの方法が特許を受けており、一般的に当業者に知られている、例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R.Robinson編、Marcel Dekker、Inc.、New York(1978)を参照のこと。
また、補助的活性化合物を該組成物に組み込んでもよい。一部のある実施形態において、本発明のNogoレセプター−1抗体もしくはその抗原結合断片または可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたは融合タンパク質は、1種類以上のさらなる治療用薬剤、例えば、抗炎症剤などとともに共製剤化および/または共投与される。一実施形態において、抗炎症剤は非ステロイド系抗炎症剤である。別の実施形態において、抗炎症剤はステロイド系抗炎症剤である。特別な一実施形態において、抗炎症剤はメチルプレドニゾロンである。
一実施形態において、本発明は、非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に許容され得る塩との組合せでのNogoレセプターアンタゴニストの使用に関する。当該技術分野でよく知られたNSAIDの例としては、プロピオン酸誘導体(例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン)、酢酸誘導体(例えば、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパク、オキシピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシンおよびゾメピラック)、フェナム酸誘導体(例えば、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸およびトルフェナム酸)、ビフェニルカルボン酸誘導体(例えば、ジフルニサルおよびフルフェニサル)、オキシカム系(例えば、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカムおよびテノキシカム)、サリチル酸系(例えば、アセチルサリチル酸およびスルファサラジン)ならびにピラゾロン系(例えば、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾンおよびフェニルブタゾン)が挙げられる;同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有するNSADDと構造的に関連するNSAIDもまた、この群に包含されることが意図される。
別の実施形態において、本発明は、任意の1種類以上のステロイド系抗炎症剤(コルチコステロイドなど)、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に許容され得る塩などとの組合せでNogoレセプターアンタゴニストに関する。かかるステロイド系薬剤の非限定的な例としては、ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンから誘導される化合物、例えば、21−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタル、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン21−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリソン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21−ジエドライアミノ酢酸塩、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、21−m−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、21−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、21−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、21−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドが挙げられる。同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するコルチコステロイドもまた、この群に包含されることが意図される。特別な一実施形態において、Nogoレセプターアンタゴニストは、メチルプレドニゾロンとの組合せで使用される。
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗体、抗原結合断片、ポリペプチド(1種類または複数種)または融合タンパク質を含むものであり得る。「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。Nogoレセプター−1抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター融合タンパク質の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの要素に従って異なり得る。治療有効量はまた、抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター融合タンパク質の任意の毒性効果または有害効果よりも治療上有益な効果が上回るものである。「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被験体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
投薬レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療的または予防的応答)がもたらされるように調整され得る。例えば、単独ボーラスで投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、用量を、治療状況の要件によって示されるとおりに比例的に減少または増加させてもよい。非経口組成物を、容易な投与のために単位投薬形態で製剤化することは、特に好都合であり、単位投薬形態の均一性は、本明細書で用いる場合、処置対象の哺乳動物被検体のための単回の投薬に適した物理的に分離された単位であって、各々が、必要とされる医薬用キャリアと共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含む単位をいう。本発明の単位投薬形態の仕様は、は、(a)抗体、抗原結合断片および可溶性レセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター融合タンパク質の特殊な特性と、達成されるべき具体的な治療効果または予防効果、ならびに(b)個体における感受性の処置のためにかかる抗体、抗原結合断片および可溶性レセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター融合タンパク質を配合することの当該技術分野における固有の制限によって決定され、これらに直接的に依存性である。一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は、0.1〜4mg/Kg/日の範囲である。一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は、0.2〜4mg/Kg/日の範囲である。一部のある実施形態において、Nogoレセプター−1抗体またはその抗原結合断片の治療有効用量は0.2mg/Kg/日である。
本発明の方法において、NgR1アンタゴニストは、一般的に、直接神経系に脳室内(intracerebroventricularly)、または髄腔内、例えば、MSの慢性病変内に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、0.001〜10mg/kg体重/日の投薬量のNgR1アンタゴニストが投与されるように製剤化され得る。本発明の一部のある実施形態において、投薬量は0.01〜1.0mg/kg体重/日である。一部のある実施形態では、投薬量は0.001〜0.5mg/kg体重/日である。
本発明のNgR1アンタゴニストでの処置のためには、投薬量は、例えば約0.0001〜100mg/kg、より通常では0.01〜5mg/kg(例えば、0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、lmg/kg、2mg/kgなど)(宿主の体重1kg)の範囲であり得る。例えば、投薬量は、1mg/kg体重もしくは10mg/kg体重または1〜10mg/kgの範囲内、好ましくは少なくとも1mg/kgであり得る。上記の範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内であることが意図される。被験体検体には、かかる用量が、毎日、1日毎、毎週または経験的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、ある期間にわたる(例えば、少なくとも6ヶ月間)反復投与での投与を含む。さらなる例示的な処置レジメンは、2週間に1回、または1ヶ月に1回または3〜6ヶ月に1回の投与を含む。例示的な投薬スケジュールとしては、1〜10mg/kgまたは15mg/kgを連続毎日、30mg/kgを1日毎または60mg/kgを毎週が挙げられる。
一部の方法では、2種類以上のNgR1アンタゴニストが同時に投与され、その場合、投与される各アンタゴニストの投薬量は、示した範囲内である。また、補助的活性化合物も、本発明の方法で使用される組成物内に組み込まれ得る。例えば、NgR1アンタゴニストは、抗炎症剤(例えば、メチルプレドニゾロン)などの1種類以上のさらなる治療用薬剤とともに共製剤化および/または共投与され得る。
本発明には、選択した標的組織へのNgR1アンタゴニストの任意の適当な送達方法、例えば、水性液剤のボーラス注射または制御放出系の埋入が包含される。制御放出埋入物の使用により、反復注射の必要性が低減される。
本発明の方法に使用されるNgR1アンタゴニストは、直接脳内に注入される。化合物を直接脳内に注入するための種々の埋入物が知られており、神経障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。このようなものとしては、ポンプを用いた脳内への長期注入、定位固定移植、一時的介在的カテーテル、永続的頭蓋内カテーテル埋入、および外科的移植生分解性埋入物が挙げられる。例えば、Gillら(上掲);Scharfenら、「High Activity Iodine−125 Interstitial Implant For Gliomas」、Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4):583−591(1992);Gasparら、「Permanent 1251 Implants for Recurrent Malignant Gliomas」、Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5):977−982(1999);第66章、第577〜580頁、Bellezzaら、「Stereotactic Interstitial Brachytherapy」、Gildenbergら、Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery、McGraw−Hill(1998);およびBremら、「The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU−Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas:Phase I Trial」、J.Neuro−Oncology 26:111−23(1995)を参照のこと。
該組成物はまた、化合物の適当な送達または支持体系としての機能を果たす生体適合性のキャリア材料中に分散された本発明のNgR1アンタゴニストを含むものであり得る。徐放性キャリアの好適な例としては、坐剤またはカプセル剤などの成形体の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋入可能なマイクロカプセル型徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド(米国特許第3,773,319号;EP58,481)、L−グルタミン酸とγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidmanら、Biopolymers 22:547−56(1985));ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、エチレン酢酸ビニル(Langerら、J.Biomed.Mater.Res.15:167−277(1981);Langer、Chem.Tech.12:98−105(1982))またはポリ−D−(−)−3ヒドロキシ酪酸(EP133,988)が挙げられる。
一部のある実施形態において、本発明のNgR1アンタゴニストは患者に、脳の適切な領域への直接注入によって投与される。例えば、Gillら、「Direct brain infusion of glial cell line−derived neurotrophic factor in Parkinson disease」、Nature Med.9:589−95(2003)を参照のこと。択一的な手法が利用可能であり、本発明によるNgRアンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、カテーテルまたは埋入物の定位固定配置は、Riechert−MundingerユニットおよびZD(Zamorano−Dujovny)多目的局在化ユニットを用いて行われ得る。コントラスト増強コンピュータ連動断層撮影(CT)スキャン(120mlのオムニペイクの注入、350mgのヨウ素/ml、2mm切片厚)により、3次元多面処理計画(STP、Fischer、Freiburg、Germany)が可能となり得る。この装置によって、磁気共鳴画像法による試験に基づく計画によって明白な標的の立体配置のためのCTおよびMRI標的情報を併合することが可能となる。
GE CTスキャナー(General Electric Company、ミルウォーキー、WI)での使用のために改良されたLeksell定位固定システム(Downs Surgical、Inc.、ジケーター、GA)ならびにBrown−Roberts−Wells(BRW)定位固定システム(Radionics、Burlington、MA)は、この目的のために使用され得る。したがって、埋入物をモニタリングする際、BRW定位固定フレームの環状のベースリングが患者の頭蓋に装着され得る。ベースプレートに挟持されたグラファイトロッドローカライザーフレームにより、連続CT切片が(標的組織)領域全体に3mm間隔で得られ得る。コンピュータ処理された計画プログラムが、グラファイトロッド画像のCT座標を用いて、VAX 11/780コンピュータ(Digital Equipment Corporation、Maynard、Mass.)にて実行され、CT空間とBRW空間の間がマッピングされ得る。
(抗体、抗原結合断片、可溶性レセプター、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび組成物の使用)
一部のある実施形態において、本発明は、抗Nogoレセプター−1抗体、かかる抗体の抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド、またはポリペプチドかかるを含む融合タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、Nogoレセプター−1活性を阻害するための方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1を本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、リガンドへのNogoレセプター−1の結合を阻害する方法を提供する。一部のある実施形態において、リガンドは、NogoA、NogoB、NogoC、MAGおよびOM−gpからなる群より選択される。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体または抗原結合断片接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを本発明の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはCNSのニューロンである。一部のこのような方法では、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。
一部のある実施形態において、本発明は、(a)(i)抗Nogoレセプター−1抗体もしくはその抗原結合断片;または(ii)可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供すること;および(b)宿主細胞を哺乳動物内のニューロン部位またはその付近に導入することを含む、哺乳動物において死滅するリスクのあるニューロンの生存を促進させる方法を提供する。Almudena Ramon−Cueto、M Isabel Cordero、Fernando F Santos−BenitoおよびJesus Avila(2000)Functional recovery of paralegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells.Neuron 25、425−435。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロン部位またはその付近に、(a)抗Nogoレセプター−1抗体もしくはその抗原結合断片;または(b)可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを投与することを含み、ここで、該抗Nogoレセプター−1抗体、抗原結合断片または可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドは、哺乳動物において該ヌクレオチド配列から、ニューロンの生存を促進するのに充分な量で発現される、死滅するリスクのあるニューロンであって、哺乳動物のものであるニューロンの生存を促進させる方法である遺伝子療法を提供する。このような実施形態に有用なウイルスベクターおよび方法は、例えば、Noelら、Human Gene Therapy、73:1483−93(2002)に記載されている。
一部のある実施形態において、本発明は、リガンドを、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター−1融合タンパク質と接触させる工程を含む、リガンドへのNogoレセプター−1の結合を阻害する方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1リガンドを、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター−1融合タンパク質を接触させる工程を含む、Nogoレセプター−1リガンドの活性をモジュレートする方法を提供する。
一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1リガンドを、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター−1融合タンパク質と接触させる工程を含む、ニューロンにおける成長円錐の虚脱を抑制するための方法を提供する。一部のある実施形態において、本発明は、Nogoレセプター−1リガンドを、本発明の可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたはNogoレセプター−1融合タンパク質と接触させる工程を含む、ニューロンにおける神経突起の伸長または出芽の抑制を低減させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンはCNSのニューロンである。一部のある実施形態において、リガンドは、NogoA、NogoB、NogoC、MAGおよびOM−gpからなる群より選択される。一部のある実施形態において、神経突起の伸長または出芽は軸索の成長である。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物と接触させることを含む、神経突起伸長を促進させるための方法を提供する。一部のある実施形態において、該ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、神経突起伸長抑制を阻害する。一部のある実施形態において、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
一部のある実施形態において、本発明は、ニューロンを、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物と接触させることを含む、NgR1シグナル伝達複合体によりシグナル伝達の阻害方法を提供する。一部のある実施形態において、ニューロンは哺乳動物のものである。一部のある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
一部のある実施形態において、本発明は、処置を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む、哺乳動物において中枢神経系(CNS)疾患、障害または損傷の処置方法を提供する。一部のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症、ALS、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、緑内障、難聴、および副腎白質萎縮症である。
本明細書に記載の任意型の抗体またはレセプターが、治療的に使用され得る。一部のある実施形態において、抗Nogoレセプター−1抗体はヒト抗体である。一部のある実施形態において、哺乳動物ヒト患者である。一部のある実施形態において、該抗体またはその抗原結合断片は、該抗体と交差反応するNogoレセプター−1を発現する非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類、カニクイザル(cynomologous)またはアカゲザル)に、獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして投与される。かかる動物モデルは、本発明の抗体治療有効性の評価に有用であり得る。
一部のある実施形態において、抗Nogoレセプター−1抗体もしくは抗原結合断片または可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたは融合タンパク質の投与は、脊髄損傷を処置し、損傷部位全体における軸索の成長を促進するために使用される。
本発明の抗Nogoレセプター−1抗体もしくは抗原結合断片または可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドまたは融合タンパク質は、単独、または特定の病理学的プロセスをモジュレートする他の薬剤との組合せ、もしくは逐次的組合せで提供され得る。例えば、抗炎症剤は、脳卒中後に、さらなるニューロンの損傷および軸索の再生抑制を阻止するための手段として共投与され得る。本明細書で用いる場合、Nogoレセプター−1抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1 and Nogoレセプター融合タンパク質は1種類以上のさらなる治療用薬剤と、両者が同時、連続的または独立して投与される場合、組合せて投与されるという。
本発明の抗Nogoレセプター−1抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド、Nogoレセプター−1融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入または口腔内経路によって投与され得る。例えば、薬剤は、マイクロインジェクションによって損傷部位に局所投与され得る。典型的な部位としては、限定されないが、損傷による脊髄損傷領域が挙げられる。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用処置(あれば)の種類、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存性である。
本発明の化合物は、インビボで、通常、哺乳動物、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどにおいて、またはインビトロで利用され得る。
(本発明のベクター)
一部のある実施形態において、本発明は、コード配列を含む組換えDNA分子(rDNA)を提供する。本明細書で用いる場合、rDNA分子は、分子操作に供されたDNA分子である。rDNA分子の作製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照のこと。一部rDNA分子では、コードDNA配列は、発現制御配列およびベクター配列に作動可能に連結されている。
一部のある実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明の核酸と作動可能に連結されるベクターおよび発現制御配列は、当該技術分野でよく知られているように、所望される機能的特性(例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞)に直接依存する。本発明のベクターは、rDNA分子内の構造遺伝子の宿主の染色体内での複製または挿入を少なくとも指令し、また、好ましくは発現も指令する能力を有するものであり得る。
作動可能に連結されたタンパク質コード配列の発現の調節に使用される発現制御エレメントは当該技術分野で知られており、限定されないが、誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられる。好ましくは、誘導型プロモーターは、容易に制御されるのも、例えば、宿主細胞の培地中の栄養分に対して応答性のものである。
一実施形態において、コード核酸分子を含有するベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、該ベクターで形質転換された細菌宿主細胞(細菌宿主細胞など)において自律複製および染色体外での組換えDNA分子の維持を指令する能力を有するDNA配列を含むものである。かかるレプリコンは当該技術分野でよく知られている。また、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現により薬物耐性などの検出可能なマーカーが付与される遺伝子も含むものであり得る。細菌の薬物耐性遺伝子の典型的な例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
原核生物レプリコンを含むベクターは、さらに、細菌宿主細胞(大腸菌など)内でのコード遺伝子配列の発現(転写および翻訳)を指令し得る原核生物またはバクテリオファージ系プロモーターを含むものであり得る。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写の実行を可能にするDNA配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合性であるプロモーター配列は、典型的には、本発明のDNAセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するプラスミドベクターにおいて提供される。かかるプラスミドベクターの例は、pUC8、pUC9、pBR322およびpBR329(Bio−Rad(登録商標)Laboratories)、pPLおよびpKK223(Pharmacia)である。任意の適当な原核生物宿主を用いて、本発明のタンパク質をコードする組換えDNA分子を発現させ得る。
真核生物細胞と適合性である発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合性であるものもまた、コード配列を含むrDNA分子を形成するのに使用され得る。真核生物細胞発現ベクターは、当該技術分野でよく知られており、いくつかの市販供給元から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、所望のDNAセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含むように提供される。かかるベクターの例は、pSVLおよびpKSV−10(Pharmacia)、pBPV−1、pML2d(International Biotechnologies)、pTDT1(ATCC(登録商標)31255)ならびに他の真核生物系の発現ベクターである。
本発明のrDNA分子を構築するために使用される真核生物細胞発現ベクターは、さらに、真核生物細胞において有効な選択可能マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカーを含むものであり得る。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性がもたらされる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子である(Southernら、J.Mol.Anal.Genet.1:327−341(1982))。あるいはまた、選択可能マーカーは、別のプラスミド上に存在していてもよく、この2種類のベクターは、宿主細胞のコトランスフェクションによって導入され得、形質転換体は、選択可能マーカーに適切な薬物中で培養することにより選択され得る。
本発明の抗体または抗体の一部分を発現させるため、一部または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを発現ベクター内に、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように挿入する。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソームなどが挙げられる。該抗体遺伝子はベクター内に、該ベクター内の転写および翻訳制御配列が、該抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を発揮するようにライゲートされる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されていてもよい。一部のある実施形態において、両方遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。該抗体遺伝子は発現ベクター内に、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑端ライゲーション)によって挿入される。
簡便なベクターは、機能的完全なヒトCまたはC免疫グロブリン配列をコードし、上記のような任意のVまたはV配列が容易に挿入され発現され得るように操作された適切な制限部位を有するものである。かかるベクターでは、通常、スプライシングが、挿入J領域内のスプライスドナー部位とヒトC領域の前のスプライスアクセプター部位との間で起こり、ヒトCエキソン内のスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位で起こる。また、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの該抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドもコードするものであり得る。抗体鎖遺伝子はベクター内に、シグナルペプチドが該抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対してインフレームに連結されるようにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。
本発明の免疫原性ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質に加え、本発明の組換え発現ベクターも、宿主細胞内でのその発現を制御する調節配列をを有する。当業者には、発現ベクターの設計(例えば、調節配列の選択)は、形質転換する宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどの要素に依存し得ることが認識されよう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞においてにおいて高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス系エレメント、例えば、レトロウイルスのLTR由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)由来(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)由来(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス由来(例えば、アデノウイルス主要(major)後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマおよび強力哺乳動物系プロモーター(天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなど)が挙げられる。ウイルス系の調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、米国特許第5,168,062号(Stinskiによる)、米国特許第4,510,245号(Bellらによる)および米国特許第4,968,615号(Schaffnerらによる)を参照のこと。
一実施形態において、NEOSPLAと称されるBiogen IDEC,Inc.のプロプライエタリ発現ベクター(米国特許第6,159,730号)が使用され得る。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、SV40複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン1およびエキソン2、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、CHO細胞にトランスフェクションした後、G418含有培地中で選択し、メトトレキサート増幅すると、非常に高レベル発現をもたらすことがわかっている。もちろん、真核生物細胞内での発現を誘発し得る任意の発現ベクターが、本発明において使用され得る。好適なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER−HCMV、pUB6/V5−His、pVAX1およびpZeoSV2(Invitrogen、サンディエゴ、CAから入手可能)、ならびにプラスミドpCI(Promega、マディソン、WIから入手可能)が挙げられる。さらなる真核生物細胞系発現ベクターは当該技術分野で知られており、市販されている。典型的には、かかるベクターは、所望のDNAセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有する。例示的なベクターとしては、pSVLおよびpKSV−10(Pharmacia)、pBPV−1、pml2d(International Biotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、レトロウイルス系発現ベクターpMIGおよびpLL3.7、アデノウイルスシャトルベクターpDC315、ならびにAAVベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第6,413,777号に開示されている。
本発明の他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、NgRアンタゴニストポリヌクレオチド(例えば、siRNA分子)の発現のために、レンチウイルスベクターが使用される。レンチウイルスは、非周期(noncycling)分裂後期細胞に感染することができ、また、発生中にサイレンシングされず、胚性幹細胞の感染によるトランスジェニック動物の作製を可能にするという利点を提供し得る。Milhavetら、Pharmacological Rev.55:629−648(2003)。ウイルスベクターを発現する他のポリヌクレオチドは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスを主体として構築され得る。
本発明のポリヌクレオチド、例えば、siRNA分子配列の転写は、真核生物のRNAポリメラーゼI(pol I)、RNAポリメラーゼII(pol II)、またはRNAポリメラーゼIII(pol III)のためのプロモーターから誘導され得る。pol IIまたはpol IIIプロモーターからの転写物は、あらゆる細胞内で高レベルで発現され、所与の細胞における所与のpol IIプロモーターのレベルは、近傍に存在する遺伝子調節配列の性質(エンハンサー、サイレンサーなど)に依存する。真核生物系RNAポリメラーゼプロモーターもまた使用されるが、適切な細胞において原核生物系RNAポリメラーゼ酵素が発現されものとする(Elroy−SteinおよびMoss、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6743−7(1990);GaoおよびHuang,Nucleic Acids Res.21:2867−72(1993);Lieberら、Methods Enzymol.217:47−66(1993);Zhouら、Mol.Cell.Biol.10:4529−37(1990))。何人かの研究者らにより、かかるプロモーターから発現されるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞において機能し得ることが示されている(例えば、Kashani−Sabetら、Antisense Res.Dev.2:3−15(1992);Ojwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10802−6(1992);Chenら、Nucleic Acids Res.20:4581−9(1992);Yuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6340−4(1993);L’Huillierら、EMBO J.11:4411−8(1992);Lisziewiczら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A
90:8000−4(1993);Thompsonら、Nucleic Acids
Res.23:2259(1995);Sullenger & Cech,Science 262:1566(1993))。より具体的には、U6核内低分子(snRNA)、トランスファーRNA(tRNA)およびアデノウイルスVA RNAをコードする遺伝子由来のものなどの転写単位が、高濃度の所望のRNA分子(siRNAなど)細胞内で生成させるのに有用である(Thompsonら(上掲);CoutureおよびStinchcomb,1996(上掲);Noonbergら、Nucleic Acid Res.22:2830(1994);Noonbergら、米国特許第5,624,803号;Goodら、Gene Ther.4:45(1997);Beigelmanら、国際特許PCT公開公報WO96/18736)。siRNA転写単位は、哺乳動物細胞内への導入用のさまざまなベクター内に、例えば、限定されないが、プラスミドDNAベクター、ウイルス系DNAベクター(アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクターなど)、またはウイルス系RNAベクター(レトロウイルスもしくはアルファウイルス系ベクター)内に組み込まれ得る(概説については、CoutureおよびStinchcomb,1996(上掲)を参照のこと)。
異種遺伝子および調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子などを有するものであり得る。選択可能マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる(例えば、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号および同第5,179,017号(すべてAxelらによる)を参照のこと)。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、薬物(G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート)に対する耐性を付与するものである。好ましい選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅を用いたdhfr宿主細胞における使用のため)およびneo遺伝子(G418選択用)が挙げられる。
(宿主細胞および本発明のタンパク質の組換えによる作製方法)
本発明の抗Nogoレセプター−1抗体、免疫原性ペプチド、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド、可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適当な宿主細胞の形質転換ために使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当該技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド(1種または複数種)の封入、および核内へのDNAの直接マイクロインジェクションが挙げられる。また、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入され得る。
本発明のrDNA分子による適切な宿主細胞の形質転換は、よく知られた方法によって行われ、該方法は、典型的には、使用するベクターおよび使用する宿主系の型に依存する。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理法が使用され得る。(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning−A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110−2114(1972)を参照のこと)。rDNAを含有するベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、カチオン系脂質または塩処理法が使用され得る。(例えば、Grahamら、Virology 52:456−467(1973);Wiglerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7(6:1373−1376(1979)を参照のこと)。
成功裏に形質転換される細胞、すなわち、本発明のrDNA分子を含有する細胞は、よく知られた手法、例えば、選択可能マーカーに関する選択によって同定され得る。例えば、本発明のrDNAの導入により得られる細胞をクローニングし、単一のコロニーを生成させ得る。該コロニー由来の細胞を、回収し、溶解させ、Southern,J.Mol.Biol.98:503−517(1975)になどの記載のものなどの方法を用いてそのDNA含量をrDNAの存在について調べるか、または該細胞から産生されたタンパク質が免疫学的方法によってアッセイされ得る。
本発明の方法における使用のための本発明のポリペプチドまたは抗体の発現のための宿主細胞は、原核生物系または真核生物系であり得る。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野でよく知られており、American Type Culture Collection(ATCC(登録商標))から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。このようなものとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、およびいくつかの他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを調べることにより選択される。他の有用な真核生物宿主細胞としては、植物細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Sf9細胞などである。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスである。
本発明の免疫原性ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体または抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入すると、これらは、宿主細胞を、該宿主細胞内での抗体、ポリペプチドおよび融合ポリペプチドの発現を可能にするのに充分な期間培養することにより産生され、または、より好ましくは、本発明の免疫原性ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体または抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質が、宿主細胞が培養された培養培地中に分泌される。本発明の免疫原性ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体または抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質は培養培地から、標準的なタンパク質精製法を用いて回収され得る。
さらに、産生細胞株からの本発明の(of the invention of the invention)免疫原性ポリペプチド、Nogoレセプター−1抗体または抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質(またはこれらの由来する他の部分)の発現は、いくつかの既知の手法を用いて増強され得る。例えば、グルタミンシンテターゼ(GS)系は、ある種の条件下での発現を増強するための一般なアプローチである。例えば、欧州特許第0216846号、同第0256055号および同第0323997号ならびに欧州特許出願第89303964.4号を参照のこと。
(宿主細胞)
本発明は、さらに、本発明のNogoレセプター−1抗体、抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび/または可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核生物系または真核生物系のいずれかであり得る。本発明のタンパク質の発現に有用な真核生物細胞は、その細胞株が細胞培養法と適合性であり、発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現と適合性である限り、限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、限定されないが、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは、脊椎動物細胞(マウス、ラット、サルまたはヒト細胞株に由来するものなど)が挙げられる。有用な真核生物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ATCC(登録商標)からCCL61として入手可能)、NIHスイスマウス胚細胞NIH−3T3(ATCCからCRL1658として入手可能)、乳児ハムスター腎臓細胞(BHK)など、真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
他の有用な真核生物宿主細胞としては、植物細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Sf9細胞などである。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスである。
(rDNA分子を用いた組換えタンパク質の作製)
本発明は、さらに、本明細書に記載の核酸分子を用いた、本発明のNogoレセプター−1抗体または抗原結合断片、可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび/または可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質の作製方法を提供する。一般的に、タンパク質の組換え形態の作製は、典型的には、以下の工程を伴う。
まず、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を得る。コード配列がイントロンによって分断されていない場合は、これは、任意の宿主での発現にそのまま適する。
次いで、該核酸分子を、任意選択で、上記のような適当な制御配列と作動可能な連結状態に配置し、タンパク質オープンリーディングフレームを含有する発現単位を形成する。発現単位を用いて適当な宿主を形質転換し、形質転換宿主を、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。任意選択で、組換えタンパク質を培地または細胞から単離する。タンパク質の回収および精製は、いくらかの不純物が許容範囲であり得る場合は、必要でないことがあり得る。
前述の工程の各々は、さまざまな様式で行なわれ得る。例えば、所望のコード配列は、適切な宿主内で、ゲノム断片から得られ、直接使用され得る。さまざまな宿主において作動可能な発現ベクターの構築は、上記のような適切なレプリコンおよび制御配列を用いて行なわれる。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、使用する遺伝子発現宿主細胞の型に依存性であり、先に詳細に論考した。好適な制限部位は、通常入手可能ではなかもしれないが、コード配列末端に、このようなベクター内に挿入される切断可能な遺伝子が提供されるように付加され得るものである。当業者は、当該技術分野で知られた任意の宿主/発現系を、組換えタンパク質を作製するための本発明の核酸分子での使用のために容易に適合させることができよう。
当業者には、本明細書に記載の方法および適用に対する他の適当は修正および適合は、自明であり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなく行なわれ得ることが容易にわかるであろう。本発明がより良好に理解され得るように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示目的にすぎず、本発明の範囲をなんら限定するものと解釈されるべきでない。
(実施例1)
(マウスモノクローナル抗Nogoレセプター−1抗体の作製)
本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドに特異的に結合する抗Nogoレセプター−1抗体を、以下の方法および手順を用いて作製した。
免疫処置
2通りの免疫処置アプローチを使用した。
(1.免疫原としてNogoレセプター−1(NogoR−1)を含むCOS−7細胞または細胞膜)
ラットNogoレセプター−1遺伝子(GenBankTM番号AF462390)を、CMVプロモーターおよび薬物選択のためのジェネティシン耐性遺伝子を含有する哺乳動物発現ベクターpEAG1256(Biogen(登録商標))内にサブクローニングした。組換えプラスミドをCOS−7細胞内に、Superfect(Qiagen(登録商標))を用いてトランスフェクトした。形質転換体を、ジェネティシン(GibcoTM、2mg/ml)を用いて選択し、クローニングし、FACS によりNogoレセプター−1タンパク質の表面発現について確認した。この細胞から既報[Wangら、J.Neurochem.75:1155−1161(2000)]の手順に従ってCOS−7膜を調製し、2回洗浄し、1mg/ml[タンパク質濃度]で10%グリセロール中に−70℃にて保存した。
8週齢の雌RBFマウス(Jackson Labs、バー・ハーバー、ME)を、50μgのラットNogoレセプター−1−COS−7膜を含有するエマルジョン、またはNogoレセプター−1をその表面上に発現する完全体COS−7細胞のいずれか、および50μlのRIBI MPL+TDM+CWSアジュバント(Sigma(登録商標)Chemical Co.、セントルイス、MO)で、2週間に1回腹腔内免疫処置した(Lipmanら、1992)。免疫処置マウスの血清を、最初の免疫処置前、2回目および3回目の免疫処置の7日後、ならびに3回目の免疫処置の38日後に回収し、抗Nogoレセプター−1抗体力価を、ELISAによって後述のようにして測定した。
(2.免疫原としての特異的Nogoレセプター−1ペプチド)
ラットNogoレセプター−1遺伝子配列を、Vector NTiTMソフトウェアを用いた抗原性解析に供した(図2)。この解析で同定された抗原性ペプチドを、標準的なグルタルアルデヒド手順を用いて、スカシガイヘモシアニン(KLH)に結合体化させた。
8週齢の雌RBFマウス(Jackson Labs、バー・ハーバー、ME)を、50μgのKLH−結合体ペプチドおよび50μlの完全フロイントアジュバント(Sigma(登録商標)Chemical Co.、セントルイス、MO)を含有するエマルジョンで、2週間に1回腹腔内免疫処置した。免疫処置マウスの血清を、最初の免疫処置前ならびに2回目および3回目の免疫処置1週間後に回収し、抗Nogoレセプター−1抗体力価を測定した。3回目の免疫処置後に追加免疫用量を与えた。この追加免疫用量免疫処置の3日後、融合実験を開始した。
(ハイブリドーマの作製およびスクリーニング)
抗原性Nogoレセプター−1ペプチドで免疫処置したマウスの血清をELISAによってスクリーニングし、一方、Nogoレセプター−1を発現するCOS−7細胞で免疫処置したマウスの血清はフローサイトメトリーによってスクリーニングした。Nogoレセプター−1−COS−7細胞に特異的に結合する抗体について陽性であったマウスをフローサイトメトリーによって同定し、致死させた。脾細胞をマウスから単離し、FL653骨髄腫(Ig−/HGPRT−Balb/cマウス骨髄腫のAPRT−誘導体、10%FBS、4500mg/Lのグルコース、4mM L−グルタミンおよび20mg/mlの8−アザグアニンを含有するDMEM中で維持)に、既報(Kennettら、Monoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological解析、Plenum Press、New York(1993))のようにして融合させた。融合細胞を24−または48ウェルプレート(Corning Glass Works、コーニング、NY)内にプレーティングし、アデニン、アミノプテリンおよびチミジン含有培養培地を供給した。AAT耐性培養物をELISAまたはフローサイトメトリーにより、Nogoレセプター−1−COS−7細胞またはNogoレセプター−1抗原性のペプチドのいずれかに対する結合に関して、後述のようにしてスクリーニングした。陽性ウェル内の細胞を、限界希釈法によって、さらにサブクローニングした。
Nogoレセプター−1抗原性のペプチドに対する抗体結合に関してスクリーニングするため、免疫原として使用するペプチドをBSAに結合体化させた。0.5μgの結合体ペプチドを含有する50μlの0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.0を、96ウェルMaxiSorpTMプレート(NuncTM)の各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃で1時間または4℃で16時間インキュベートし、非特異的結合部位を、0.1%BSA、0.1%オボアルブミン、0.1%ブロット(blotto)および0.001%アジドを含有する25mM HEPES、pH7.4を用いてブロックした。ハイブリドーマ上清みを添加し、25℃で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合体化ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson ImrnunoResearch Inc.)の1:10,000希釈物50μlを、各ウェルに添加し、さらに1時間インキュベートした。3回洗浄後、TMB(Pierce)によって発色させ、2M硫酸で停止させた。発色強度を分光光度計にて450nmでモニターした。
抗体を、完全長Nogoレセプター−1に対する結合について以下のようにしてスクリーニングした。COS−7細胞を0.1 uM CellTrackerTM Green CMFDA(Molecular Probes、Eugene、OR)で販売元によって示されたようにして標識した。等容量のCellTrackerTM標識対照細胞を、洗浄Nogoレセプター−1−COS−7細胞を混合した後、抗Nogoレセプター−1試験血清とともにインキュベーションした。50マイクロリットルの細胞混合物を、96ウェルV字底ポリスチレン製プレート(Costar(登録商標)3877、コーニング、NY)の各ウェル内に分注し、100μlのハイブリドーマ上清みまたは対照抗Nogoレセプター−1抗体を添加した。4℃で30分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、50μlのR−フィコエリトリン−結合体化親和性純粋F(ab’)2断片ヤギ抗マウスIgG Fc γ特異的二次抗体(1:200、Jackson ImmunoResearch Laboratory、ウエストグルーブ、PA)とともにPBS中でインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、200μlの1%FBS含有PBS中に懸濁し、FACS解析に供した。あるいはまた、Nogoレセプター−1−COS−7細胞をハイブリドーマ上清みと混合し、次いで、R−フィコエリトリン−結合体化ヤギ抗マウス二次抗体で処理し、直接、標準的なFACS解析に供した。
本発明者らは、さまざまな免疫原を用いて、25種類の抗Nogoレセプター−1抗体を作製した。本発明者らは、ラットNogoレセプター−1残基110〜125に対応するペプチド配列を免疫原として使用し、2種類の抗体7E11および5B10を作製した。本発明者らは、完全長ラットNogoレセプター−1でトランスフェクトしたCOS7細胞から調製した膜を免疫原として使用し、3種類の抗体1H2、3G5および2F7を作製した。本発明者らは、sNogoR310−Fcを免疫原として用いて13種類の抗体(1D9.3、1E4.7、1B4.3、2C4.3、1F10.3、2Hl.4、1H3.3、1G4.1.1E4.1、2G7.1、2C4.1、2F11.1、および1H4.1)を作製し、ラットNogoレセプター−1残基423〜434に対応するペプチド配列を免疫原として用いて7種類の抗体(2E8.1、2Gl1.2および1B5.1)作製した。
(モノクローナル抗体7E11および5B10配列解析)
本発明者らは、Qiagen(登録商標)RNeasy(登録商標)ミニキットを用いて全RNAを抽出し、単離したRNAからcDNAを作製した。本発明者らは、PCRにより、プライマー5’−TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG−3’(配列番号12)および5’−AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG−3’(配列番号25)を用いて軽鎖配列を増幅した。本発明者らは、PCRにより、プライマー5’−GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG−3’(配列番号13)および5’−GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA−3’(配列番号14)を用いて重鎖配列を増幅した。これらのプライマーは、以下のように縮重するヌクレオチドを含む。Sは、GまたはCを表す;Mは、AまたはCを表す、Rは、GまたはAを表す;Wは、AまたはTを表す;Kは、GまたはTを表す;およびYは、TまたはCを表す。本発明者らは、PCR断片を配列決定ベクター内にクローニングし、ジデオキシ鎖終結法により、配列決定ベクターに特異的なプライマーを用いてCDRのDNA配列を決定した。本発明者らは、該DNA配列を理論的に翻訳し、モノクローナル抗体7E11および5B10の重鎖および(of)軽鎖のCDR領域の部分アミノ酸配列をを表2に示す。表2において、該mAbの重鎖および軽鎖の3つのCDRに下線を付す。7E11および5B10の軽鎖は94%のアミノ酸配列同一性を有し、重鎖は91%のアミノ酸配列同一性を有する。mAb 7E11、5B10および1H2はIgG1アイソタイプであり、mAb 3G5および2F7はIgG2aアイソタイプである。これらの5種類のmAbは各々、κアイソタイプの軽鎖を有する。本発明者らは、その他のモノクローナル抗体の配列をこのアプローチによって解析する。
(表2.Mab 7E11および5B10のアミノ酸配列)
Figure 2013048638
(モノクローナル抗体7E11のエピトープマッピング
mAb 7E11は、ラットNgR1およびヒトNgR1の両方に結合する。7E11結合を担うエピトープを決定するため、本発明者らは、ラットNgR1の断片および合成ペプチドを作製し、7E11結合について試験した。
8個すべてのLRRドメインならびにN−およびC−末端キャップ(sNgR310)を含有するラットNgR1の組換え断片を酸または臭化シアン(CNBr)のいずれかで処理し、ゲ電気泳動によって断片を分離した。未処理sNgR310は、見かけ分子量42kDaを有するように泳動する。sNgR310の酸処置により、15kDa(aa27〜aa122)および30kDa(aa123〜aa310)の主に2つの切断生成物がもたらされた。CNBr処置により、3つの断片、33/35kDa二重項(aa27〜aa229)が生成し、これらは、不均質グリコシル化を有する断片、10kDa生成物(aa241〜aa310)、および11−アミノ酸断片(aa230〜aa240)(これは、ゲル上に保持されない)を表している可能性がある。ゲルのウエスタンブロットを、7E11を用いてプローブ検索すると、これは、完全ラットNgR1(aa27〜aa310)、15kDa酸断片(aa27〜aa122)および35kDa CNBr断片(aa27〜aa229)に結合することが示された。7E11は、30kDa酸断片(aa123〜aa310)または10kDa CNBr断片(aa241〜aa310)に結合しなかった。15kDa酸断片および35kDaCNBr断片はともに、配列LDLSDNAQLRVVDPTT(配列番号1)を含むものであり、NgR1上の単一のエピトープに対する7E11結合と整合する。
7E11結合部位を、sNgR310のトリプシンペプチド消化物を試験することによりさらに解析した。HPLC解析によりいくつかの断片が示され、これは、いくつかのトリプシン感受性のリシンおよびアルギニン残基がNgR1配列内に存在することを示した。7E11は単一のトリプシン消化物ペプチドのみに結合し、7E11がNgR1上の単一のエピトープに結合するというさらなる証拠を提供した。続く質量分析(MS)および配列解析により、結合ペプチドはAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(配列番号26)であると同定された。
LDLSDNAQLRVVDPTTペプチド(配列番号1)をさらなるマッピング解析に供した。該ペプチドをトリプシンで消化すると、主に2つの断片LDLSDNAQLR(配列番号27)およびWDPTT(配列番号28)がもたらされ、7E11がこれらに結合する能力を試験した。MS解析により、該抗体がペプチドLDLSDNAQLR(配列番号27)に結合し、したがって、このペプチドは7E11に対する結合エピトープを含有することが示された。このペプチド画分内で、詳細なMS解析により、同様に7E11に結合するいくつかの混交ペプチド(例えば、Asnl l5およびGln 117に脱アミノ化、112位もしくは113位にアラニンの付加、または114位にセリンの付加を有するペプチド)が同定された(表3)。これらのデータは、このペプチド断片内に存在するいくつかのアミノ酸残基は7E11結合に重要でない可能性があることを示す。
(表3.7E11によって結合される変異型ペプチド)
Figure 2013048638
また、LDLSDNAQLRVVDPTT(配列番号1)ペプチドをエンドプロテアーゼAsp−Nで消化し、7E11結合を試験した。エンドプロテアーゼAsp−Nは、該ペプチドを3つのペプチド断片、L、DLSおよびDNAQLRVVDPTT(配列番号36)に切断した。これらの生成物のうち、7E11は、DNAQLRVVDPTT(配列番号36)ペプチドに結合した。総合すると、トリプシンおよびAsp−N切断データにより、7E11結合エピトープは、これらの間に共有される配列DNAQLR(配列番号37)にさらに位置限定される。
種々の種由来のNgR1、NgR2およびNgR3のアミノ酸配列を解析し、7E11がラットおよびヒトNgR1に結合したが、マウスNgR1、ヒトNgR2またはマウスNgR3には結合しなかったという観察結果に基づき、7E11結合エピトープ内の重要な残基を予測した。配列アラインメントにより、ラットNgR1アミノ酸110〜125と対応するヒトNgR1配列が同一であること、およびマウスNgR1配列は、119位の1つのアミノ酸(ラットおよびヒトNgR1のArgl l9、ならびにマウスNgR1のHis 119;表4)のみが異なることが示された。
(表4.種々の種由来のNgR配列アラインメント)
Figure 2013048638
NgR1上のArg 119は、ラットおよびヒトNgR1に充分結合するが、マウスNgR1に対しては不十分なため、7E11結合に寄与する。同様に、7E11はNgR3に充分結合しないため、DNAQLR配列(配列番号37)内ではNgR3はNgR1と対応する配列のアルギニンのみが異なることから、Ala 116はエピトープに関与している。DNAQLR(配列番号37)配列内では、NgR2内の6個の残基のうち4個がラットNgR1と同一である。Ala 116およびGln 117は、それぞれ、アルギニンおよびヒスチジンで置き換えられる。これにより、Ala ll6は、7E11結合に寄与する重要なアミノ酸残基であるが、Gln 117の関与を必ずしも除外しないことが確認される。
これらの接触点を確認するため、LDLSDNAQLR配列(配列番号27)内に点変異を含有するいくつかのペプチドを作製し、7E11結合について試験した。ペプチドをMaxiSorpTMプレート(NuncTM)上に固定化し、7E11の連続希釈物を適用した。得られたEC50値を表5に示す。7E11は、変異型 Leu110AlaおよびAsp111Alaに、元のペプチドと同様のEC50値で結合した。Gln 117Alaを試験すると、EC50は30倍増大しており、Arg119Hisを試験すると、EC50は25倍増大していた。EC50おける最も有意な変化は、Arg 119がアラニンに変異された場合に観察された。
(表5.7E11は、種々のEC50を有する変異型ペプチドに結合する)
Figure 2013048638
また、7E11結合エピトープの位置を、最近解像(resolve)されたsNgR310の結晶構造において決定した。予測どおり、構造は、7E11 エピトープが分子表面上に露出していることを示す。残基Arg 119、Gln 117、Ala 116およびAsp 114は、該構造から外方に突出しているが、Leu 118およびAsn 115は、内方に存在している。エピトープは、該構造の陥凹表面内の酸性斑および両側面の一方と対向する塩基性表面の上面に存在する。
(モノクローナル抗Nogoレセプター−1抗体による可溶性Nogoレセプター−1に対するリガンドの阻害)
上記のようにして作製した抗Nogoレセプター−1 モノクローナル抗体を、Nogoレセプター−1に対するリガンド結合を阻害するか否かを調べるために試験した。
ラットNogoレセプター−1のアミノ酸残基26〜344ならびにラットIgG1分子(sNogoR344−Fc)のヒンジ領域およびFc領域を含む0.5μgの可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質(後述のようにして作製)を、250μgのプロテインA−または小麦胚芽凝集素−結合体化SPAビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)上に、25℃で2時間固定化した。Fc−sNogoR−1、抗Nogoレセプター−1 mAbおよび1μlの125I−Nogo66(Amersham、2000Ci/mmol、1nM)とカップリングさせたSPAビーズを50μlのHEPES緩衝インキュベーション培地(10mM HEPES、pH7.4、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%オボアルブミン、2mM MgCl、2mM CaClおよびプロテアーゼインヒビター)を、各試料ウェルに添加した。16時間後、放射能を、4連の試料においてTopCount(登録商標)(Packard)を用いて測定した。IC50値を曲線フィット解析(図3)(PRISM、GraphPad
Software、NJ)から算出した。一部の実験では、本発明者らは、AP−リガンド結合体(例えば、AP−Nogo66)もまた使用し、アルカリホスファターゼ活性をモニタリングすることにより結合を検出した。また、本発明者らは、該mAbが、Nogoレセプター−1に対するリガンドMAG−FcおよびAP−OM−gpの結合をブロックする能力をアッセイした。
モノクローナル抗体7E11、5B10、1H2、3G5および2F7はすべて、sNogoR344−Fcに対するNogo66、MAGおよびOM−gpの結合を阻害した。7E11および1H2に対するNogo66の算出IC50は、それぞれ400nMおよび60nMであった。Nogoレセプター−1に対する該3つのリガンドの結合のmAb媒介性阻害をELISAモニタリングしたデータを表6にまとめる。
(表6.mAbは、Nogoレセプター−1に対するNogo66、MAGおよびOM−gpの結合を阻害する)
Figure 2013048638
置換(displacement)パーセントは、抗体30nMおよび記載の曲線フィット解析から測定された特定のmAbのEC50でのものを示す。「−」は、検出可能な活性がないことを示し、「ND」は測定不可を示す。
実施例2
(FABファージ抗−Nogoレセプター−1抗体の作製)
また、本発明の免疫原性Nogoレセプター−1ポリペプチドに特異的に結合する抗Nogoレセプター−1 Fab−ファージ抗体を、以下のようにしてFab−ファージライブラリーをスクリーニングすることにより作製した。
MorphoSys Fab−ファージライブラリーHuCAL(登録商標)GOLDを、組換えラット可溶性sNogoR310−Fcタンパク質およびラットNogoレセプター−1を発現するCOS7細胞に対してスクリーニングした。Nogoレセプター−1に特異的に結合したFab−ファージを精製し、キャラクタライズした。14D5の重鎖はV2遺伝子に由来のものであり、軽鎖はV1遺伝子に由来ものである。これらのFab−ファージの1つである14D5の重鎖および軽鎖のCDRのアミノ酸配列を表7に示す。
(表7.14D5のCDRのアミノ酸配列)
Figure 2013048638
14D5は、一価形態および二価形態どちらでもラットNogoレセプター−1に結合する。また、14D5は、マウスおよびヒトのNogoレセプター−1ならびにヒトNogoレセプター−2に結合するが、マウスNogoレセプター−3には結合しない。
(実施例3)
(抗Nogoレセプター−1モノクローナル抗体によるNogoレセプター−1の免疫沈降)
免疫沈降を行なうため、100μlの細胞溶解液または50μlのPiPLC処理細胞を、400または450μlの抽出緩衝液[10mM Tris−HCl、pH7.2、0.5%Tween−20TM、0.2mM PMSF]またはRIPA緩衝液と、それそれ、30μlのプロテインAまたはGおよび1〜2μgの抗体の存在下で混合した。混合物を振とう機内で、4℃にて16時間インキュベートした。
試料を穏やかにスピンし、プロテインAまたはGカップリングビーズをペレット化した。ビーズを1mlの洗浄緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.2、0.1%Tween−20TM)で3回洗浄した。最後の洗浄は、オリジナルの10%の洗浄緩衝液を用いて行なった。
ビーズを100μlの2×SDS(10%β−メルカプトエタノール含有)中に再懸濁した。試料を室温でインキュベートした後、SDS−PAGEのための4〜20%Tris−グリシンゲル上で泳動させた。SDS−PAGEゲル解析から測定されるように、モノクローナル抗体3G5および2F7は、Nogoレセプター−1を免疫沈降させた。
(実施例4)
(ELISAによる抗体特異性の測定)
実施例1および2で作製したモノクローナルおよびFab−ファージ抗体の特異性を調べるため、本発明者らは、一連のNogoレセプター−1ポリペプチドを用いてELISAを行なった。この一連のものは、sNogoR310−Fc(ラットNogoレセプター−1のアミノ酸26〜310ラットFc断片を含む融合タンパク質)、sNogoR344−Fc(上掲参照)、ポリペプチドp−617(配列番号1)、ポリペプチドp−618(ラットNogoレセプター−1のLRR7 領域由来の19−アミノ酸ポリペプチド;図2;配列番号11)ならびにポリペプチドp−4およびp−5(それぞれ、Nogoレセプター−1のLRR5およびLRRCT領域由来のポリペプチド)からなるものであった。オボアルブミンおよびBSAを対照として使用した。図4に示されるように、mAb 1H2、3G5および2F7はすべて、sNogoR344−Fcに特異的に結合した。同様の実験では、該抗体は、ラットNogoレセプター−1のアミノ酸310〜344からなるポリペプチド(配列番号3)にも特異的に結合し、mAb 7E11および5B10は、ポリペプチドp−617(配列番号1)に特異的に結合した。
sNogoR310−Fc免疫処置した抗体のうち10種類(1D9.3、1E4.7、1B4.3、2C4.3、1F10.3、2H1.4、1H3.3、1G4.1、1E4.1および2G71.1)は、結合に関して互いに置換され、これは、sNogoR310−Fc上の同様または重複するエピトープ認識することを示す。sNogoR310−Fc免疫処置したその他の3種類の抗体(2C4.1、2F11.1および1H4.1)は、アミノ酸残基26〜310に存在する異なるエピトープを認識する。
本発明者らはまた、Fab−ファージ14D5を用いてELISA結合アッセイを行なった。AP−Nogo66、AP−OM−gpおよびMAG−Fcリガンドを固定化sNogoR344−Fcに対して結合させた場合、1μM 14D5は、NogoおよびMAGの結合を完全に阻害した。sNogoR344−Fcに対するOM−gpの結合を完全に阻害するためには、10μMの14D5が必要とされた。
(実施例5)
(神経突起伸長のアッセイ)
上記のようにして作製した該モノクローナルおよびFab−ファージ抗体が、ニューロンに対するCNSミエリンの阻害効果を弱める能力を試験するため、Lab−Tek(登録商標)培養スライド(4ウェル)に、0.1mg/mlのポリ−D−リシン(Sigma(登録商標))をコートした。CNSミエリンまたはPBSを3μlの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフィア(Polysciences)をミエリン/PBSに添加し、後に該液滴が同定されるようにした(Grandpreら、Nature 403:439−444(2000))。次いで、Lab−Tek(登録商標)スライドをリンス処理し、10μg/mlのラミニン(GibcoTM)をコートした。P3−4 Sprague Dawleyラットの幼獣由来の脊髄神経節(DRG)を、1mg/mlの1型コラゲナーゼ(Worthington)を用いて解離させ、火炎研磨したPasteurピペットを用いて摩砕し、予備プレーティングしてニューロン細胞を富化させ、最後に、23,000細胞/ウェルで、プレコートしたLab−Tek(登録商標)培養スライド上にプレーティングした。培養培地は、5%の熱不活化ドナーウマ血清、5%の熱不活化ウシ胎仔血清および50ng/mlのmNGFを含有するF12とし、37℃および5%COで6時間インキュベートした。15μg/mlのmAb 7E11を、プレーティングの直後に添加した。
スライドを20分間、4%パラホルムアルデヒド(20%スクロース含有)で固定し、ニューロンマーカー抗β−III−チューブリン(Covance TUJl)(1:500希釈)について染色した。二次抗体として、抗マウスAlexa Fluor(登録商標)594(Molecular Probes)を1:300に希釈し、スライドをGel/MountTM(BiomedaTM)とともにカバーガラスで覆った。OpenLabTMソフトウェアにより5×デジタル画像を取得し、MetaMorph(登録商標)ソフトウェアを使用することにより神経突起伸長の定量について解析した。
MAb 7E11は、DRGニューロンをミエリン媒介性神経突起伸長の阻害から保護した(図5)。同様の結果がmAb 1H2および3G5で観察された。
ラットP7 DRGニューロンをCNSミエリン基質上で培養した神経突起伸長保護アッセイでは、二価の14D5もまた、神経突起伸長を効率的に促進した。
(実施例6)
(Nogoレセプター−1でトランスフェクトした細胞における7E11を用いた免疫組織化学)
実施例1に記載のようにして作製した抗Nogoレセプター−1 mAbの結合特性をさらに特性評価するため、本発明者らは、ラットまたはヒトNogoレセプター−1を発現するCOS−7または293固定細胞および生細胞両方に対する結合を比較した。
固定細胞:
Nogoレセプター−1トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞を、8ウェルLab−Tek(登録商標)培養スライドにプレーティングし、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、10%正常ヤギ血清、0.1%Triton X−100含有PBS中で1時間ブロックした。Mab 7E11を、ブロック溶液中15μg/mlおよび1.5μg/mlで添加し、室温で2時間インキュベートした。抗マウスAlexa(登録商標)結合体化二次抗体(Molecular Probes)を、ブロック溶液中1:300希釈で1時間インキュベートした。DAPIを5μg/mlで、該二次抗体に添加し、すべての核を標識した。
生細胞:
トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞を8ウェルLab−Tek培養スライドにプレーティングし、FACS緩衝液(4%ドナーウマ血清含有)で4℃にて30分間ブロックし、15μg/mlおよび1.5μg/mlの7E11とともにFACS緩衝液中、4℃で1時間インキュベートし、リンス処理し、二次抗体抗マウス−Alexa(登録商標)(FACS緩衝液中1:300)とともに4℃で30分間インキュベートした。
免疫組織化学的染色実験により、すべてのmAbがラットNogoレセプター−1発現細胞に結合することが示された。mAb 7E11、2G7.1および2C4.1は、ヒトNogoレセプター−1を発現する固定細胞および生細胞の両方に結合した。
(実施例7)
(脊髄挫傷性損傷のマウスモデル)
実施例1で作製した抗Nogoレセプター−1 mAbのインビボでのニューロンに対する効果を試験するため、本発明者らは、マウス脊髄挫傷損傷モデルを使用する。
雌マウス(18〜22g)を鎮痛剤および抗生物質で予防的に処置する。マウスを麻酔し、定位装置内に配置し、脊柱を実体顕微鏡下に固定する。変形ウェイト−ドロップ(weight−drop)法(M.Liら、Neuroscience PP:333−342(2000)によって、外傷を脊髄に導入する。
簡単には、T9およびT10椎弓切除術を行ない、T9−T10横突起を左右に支持する1対ののマウス用横断鉗子を用いて脊柱を安定させる。直径1.4mmおよび重量2gのステンレス鋼打撃ロッドを硬膜の上部2.5cmに上昇させ、脊髄のT10レベルに落下させる。外科処置中、マウスを37℃の加温ブランケット上に維持し、脱水を回避するため、外科処置後、各マウスに1mlの加温滅菌生理食塩水を皮下投与する。膀胱を、反射性膀胱制御が回復するまで、手作業で1日1回露出させる。
すべての動物に、外科処置後8〜12時間毎に術後無痛法を、その後7日間、1日2回、抗生物質処置を施す。動物には、試験期間中、自由に食餌および水を摂取させる。抗Nogoレセプター−1抗体を損傷部位に、髄腔内注射によって28日間、以下のラット脊髄離断モデルに記載のようにして送達する。
(実施例8)
(可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質の特徴付け)
可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチド(sNogoR−1)および融合タンパク質(Fc−sNogoR−1)をキャラクタライズするため、本発明者らは、以下の実験を行なった。
3μgの可溶性Nogoレセプター(sNogoR310−FcおよびsNogoR344−Fc)を、250μgのWGA−SPAビーズ上に固定化し、0.5μLの放射性リガンド(終濃度0.5nM)を、最終容量100μLの結合緩衝液(20mM HEPES、pH7.4、2mM Ca、2mM Mg、0.1%BSA、0.1%オボアルブミンおよびプロテアーゼインヒビター)中で与えた。リガンドには、各リガンドの組に対して、10μM Nogo66、10μM 125I−Nogo40(Nogo Aのアミノ酸1〜40)および10μLの抗Nogoレセプター−1抗体上清みを含めた。Nogo40上の3つのチロシンを別々にヨウ素化し、それぞれNogo40−A、−Bおよび−Cと命名した。3連の平均値を標準化結合放射能%として示す(図6、7および8)。エラーバーはSEMを示す。データ標準化では、インヒビター非存在下での結合放射能を100%とし、10μM Nogo40の存在下での最小結合放射能を0%とした。
(実施例9)
(可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質に対するリガンド結合の阻害)
実施例8の結合アッセイと同様の結合アッセイを用い、実施例1で作製した2種類のmAbが、sNogoR344−Fcに対する125I−Nogo66結合を阻害する能力を試験した。mAb 2F7および3G5は、sNogoR344−Fcに対する125I−Nogo66結合を阻害した。
(実施例10)
(神経突起伸長のアッセイ)
Lab−Tek(登録商標)培養スライド(4ウェル)に0.1mg/mlのポリ−D−リシン(Sigma(登録商標))をコートした。CNSミエリンを、単独またはsNogoR310、sNogoR310−Fc融合タンパク質、mAb 5B10もしくは対照PBSと混合して、別々に、3μlの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフィア(Polysciences)をミエリン/PBSに添加し、後に該液滴が同定されるようにした(Grandpreら、Nature 403:439−444(2000))。次いで、Lab−Tek(登録商標)スライドをリンス処理し、10μg/mlのラミニン(GibcoTM)をコートした。
P3−4 Sprague Dawleyラット幼獣由来の脊髄神経節(DRG)を、1mg/mlの1型コラゲナーゼ(Worthington)を用いて解離させ、火炎研磨したPasteurピペットを用いて摩砕し、予備プレーティングしてニューロン細胞を富化させ、最後に、23,000細胞/ウェルで、プレコートしたLabtek培養スライド上にプレーティングした。培養培地は、5%熱不活化ドナーウマ血清、5%熱不活化ウシ胎仔血清および50ng/mlのmNGFを含有するF12とし、37℃および5%COで6時間インキュベートした。
スライドを20分間、4%パラホルムアルデヒド(20%スクロース含有)で固定し、ニューロンマーカー抗β−III−チューブリン(Covance TUJl)(1:500希釈)について染色した。二次抗体として、抗マウスAlexa Fluor(登録商標)594(Molecular Probes)を1:300に希釈し、スライドをGel/MountTM(BiomedaTM)とともにカバーガラスで覆った。OpenLabTMソフトウェアにより5×デジタル画像を取得し、MetaMorph(登録商標)ソフトウェアを使用することにより神経突起伸長の定量について解析した。
sNogoR310、sNogoR310−FcおよびmAb 5B10はすべて、DRGニューロンをミエリン媒介性神経突起伸長の阻害から保護した(図9〜11)。sNogoR310を、幼鳥のニューロンを用いた同様のアッセイにおいて使用すると、保護性であることがわかった。
本発明者らはまた、ラミニンの存在下および非存在下での細胞培養を伴う実験を行なうことにより、可溶性Nogoレセプターの神経保護効果を試験した。ラミニンなしの培地中でのニューロン細胞の成長は不充分であり、ニューロンストレス条件のモデルとなる。
DRGを生後第6〜7日のラット幼獣(P6−7)から切開し、単一の細胞に解離させ、上記のようにしてポリ−D−リシンをプレコートした96ウェルプレート上にプレーティングし、一部のウェルには、2μg/mlのラミニンを2〜3時間添加し、リンス処理した後、細胞をプレーティングした。18〜20時間のインキュベーション後、プレートを4%パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗β−III−チューブリン抗体(1:500に希釈)(Covance(登録商標))および抗HuC/D(1:100に希釈)(Molecular Probes)で染色し、蛍光二次抗体(Molecular Probes)を1:200の希釈度で添加した。ArrayScan(登録商標)II(Cellomics(登録商標))を用いて5×デジタル画像を取得し、神経突起伸長アプリケーションを使用することにより、神経突起伸長を平均神経突起伸長/ニューロン/ウェルとして定量した。3ウェル/条件で9枚の5×画像を解析した。
一部の実験では、PC12細胞(NeuroscreenTM)のサブクローンを使用した(Cellomics(登録商標))。NeuroscreenTM細胞を7日間、200ng/mlのNGFで予備分化させ、剥がし、ポリ−D−リシンをプレコートした96ウェルプレート上に再プレーティングした。一部のウェルでは、5μg/mlのラミニンを2〜3時間添加し、リンス処理した後、細胞をプレーティングした。2日間のインキュベーション後、プレートを4%パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗β−III−チューブリン抗体(1:500に希釈)(Covance(登録商標))およびHoechst(核染色)で染色した。ArrayScan(登録商標)IIを用いて神経突起伸長をDRG細胞の場合のようにして定量した。
sNogoR344−FcまたはラットIgGを溶液状態で、P6−7 DRGニューロンおよび分化NeuroscreenTM細胞に、プレーティング時に添加した。
P6 DRGニューロンをラミニンの非存在下で培養した場合のsNogoR344−Fcの神経保護効果を1μMおよび10μMで観察した。神経突起伸長の定量により、sNogoR344−Fcの添加によって、用量依存的増大が示された。ラミニン基質上で培養中のDRGニューロンへの同濃度でのsNogoR344−Fcの添加では、なんら非通常の効果はもたらされず、これは、sNogoR344−Fcがストレス細胞においてのみ活性であることを示す。また、ラミニンの非存在下での同濃度のsNogoR344−Fcの神経保護効果は、NeuroscreenTM細胞でも見られた。
(実施例11)
(FC−sNogoR−1融合タンパク質の作製および精製)
ラットNogoレセプター−1のアミノ酸1〜310をコードするcDNA構築物を、哺乳動物発現ベクター内に含有されるラットIgG 1Fcに融合させ、このベクターを、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)(DG44)細胞にエレクトロポレーションした。細胞を、10%透析ウシ胎仔血清、2mMグルタミンおよび抗生物質−抗真菌剤試薬を補給したα−MEM中に維持した。トランスフェクションの2日後、馴化培地を回収し、還元条件下でウエスタンブロットにより解析した。約60kDaのタンパク質バンドが、ポリクローナルウサギ抗Nogoレセプター−1抗体を用いて検出された。細胞を拡大培養し、R−PE結合体化ヤギ抗ラットIgG抗体を用いて分取した。2回目の分取後、細胞を1細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート内にプレーティングした。個々のウェルの分泌された可溶性Nogoレセプター−1タンパク質レベルを、サンドイッチELISAを試験および比較した。ELISAプレートには、ヤギ抗ラットIgG Fcκ特異的抗体をコートした。馴化培地を供給した。結合された可溶性Nogoレセプター−1タンパク質を、HRP結合体化ロバ抗ラットIgG Fab、Fc特異的抗体によって検出した。クローン4C12は、最大分泌レベルを有した。4C12を拡大培養し、スピナーフラスコ内のCHO−M7培地中で培養した。分泌レベルは、37℃で約10mg/Lであった。
sNogoR310−Fc融合タンパク質を発現するCHO細胞を大規模で培養した。1.7Lの濃縮馴化培地を、10Lバイオリアクター稼動から得た。pHを、10分の1容量の1.0M Tris−HCl(pH8.9)の添加によって上昇させた。固形塩化ナトリウムおよびグリシンを、それぞれ、3.0Mおよび1.5Mで添加した。10mM
Tris−HCl、3M塩化ナトリウム、1.5Mグリシン(pH8.9)で平衡化した60mL容のプロテインA−セファロースTMカラムを調製した。濃縮馴化培地をカラムに、蠕動ポンプを用いて1.5mL/分で適用した。カラムを、300mLの10mM
Tris−HCl、3M塩化ナトリウム、1.5Mグリシン(pH8.9)で洗浄した後、120mL 5mM Tris−HCl、3M塩化ナトリウム(pH8.9)で洗浄した。タンパク質を25mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム(pH2.8)で溶出した。10mLの画分を、1.0mLの1.0M HEPES(pH8.5)を入れたチューブ内に回収した。タンパク質画分をプールし、3×2Lの5mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl(pH7.4)に対して透析した。
(実施例12)
(脊髄離断アッセイ)
機能回復をインビボで促進する能力を試験するため、sNogoR−1 融合タンパク質をラット脊髄離断アッセイにおいて試験した。
Alzet(登録商標)浸透圧ポンプに、使用当日に新たに作製した試験溶液(sNogoR310−Fc含有PBS)を負荷した。負荷濃度は、5および50μMと算出された。ポンプに>40時間37℃で呼び水を入れた後、動物に埋入した。雌Long Evansラットに術前無痛法および精神安定薬を与え、イソフルラン(O中3%)を用いて麻酔した。
ラットを定位フレーム内に配置し、路のトレース剤BDA(10,000 MW)を左右方向に注入するために運動皮質を露出させた。次いで、ラットに脊髄のT5−T6に背側半側切除を行なった後、試験化合物を送達するための髄腔内カテーテルおよびポンプシステムを埋入した(n=11/群)。
外科処置後、28日間までラットを回復および生存させた。BBBシステムを用いた挙動スコアリングを、損傷誘導後28日間、該試験中の生存期間の終了直前まで記録した。灌流および固定後、脊髄を取り出し、凍結保護し、切片化し、染色し、軸索計数を行なった。
Basso−Beattie−Bresnahan(BBB)運動機能評定尺度(Bassoら、Neurotrauma 13:343−359(1996))、斜面試験および傾斜グリッド歩行試験(LiおよびStrittmatter、J Neurosci.25:4219−27(2003))を、損傷後のラットおよびマウスにおいてモニターした。斜面試験では、本発明者らは、5秒間マウスが滑り落ちることなく50cm×60cmのボードを傾けることができる最大角度を測定した。傾斜グリッド歩行では、マウスを、45度の角度のワイヤグリッド(35cm長さで2.54平方cm)をよじ登るように訓練した。後足がグリッド平面より下に落ちた場合の数を、下から上までの各偏倚運動についてスコアリングした。ラット挙動試験では、BBB運動機能尺度、グリッド歩行およびフットプリント解析を行なった。グリッド歩行では、ラットを、ワイヤグリッド(70cm長さで2.54平方cm)上を歩行するように訓練し、後足がグリッド平面より下に落ちた場合の数を計数した。フットプリント解析では、ラット後足の歩行パターンを、90cmの通路での連続移動運動中、インクで記録し、両側での一股長さおよび一股幅を算出した(Metzら、Brain Res.883:165−177(2000))。これらの挙動試験はすべて、少なくとも2匹の個体で行なった。外科処置、挙動試験および組織学的解析全体を通して研究者らは、ミニポンプ内の化合物の実体について知らされていなかった。
sNogoR310−Fcは機能回復を回復した(図12)。
(実施例13)
(RAT脊髄挫傷アッセイ)
インビボでのニューロンに対する可溶性Nogoレセプター−1ポリペプチドおよび融合タンパク質の効果を、ラット脊髄挫傷アッセイにおいて試験する。
雌Hooded型Long Evansラット(170〜190g)を鎮痛剤および抗生物質で予防的に処置する。外科処置の10分前、動物を2.5mg/kgの腹腔内ミダゾラム沈静させ、2〜3%のイソフルラン含有Oで麻酔する。次いで、ラットを剃毛し、アルコールおよびベタジンで隅々まで拭き、眼用潤滑剤を目に適用する。次に、切開を正中切開で行ない、T7からT12までの脊椎を露出させる。
背側椎弓切除術をT9 1/2およびT10において行ない、該索部を露出させる。ラットを衝撃部材上に置く。T7およびT8セグメントをまず、鉗子で把持し、次いで、T11およびT12セグメントを尾側鉗子に結合する。軟質物質をラットの胸部の下部に配置する。衝撃部材ロッドをゼロの位置に設定し、電気アースクリップを損傷端に結合する。次いで、衝撃部材ロッドを25.0mmまで上昇させ、露出脊髄のすぐ上部の位置に適切に調整する。次に、衝撃部材ロッドを放して露出させた索に当て、衝撃部材ロッドをすぐに持ち上げる。
次いで、ラットを台から下ろし、Gelfoam(登録商標)を創傷部に配置する。創傷部上部の筋肉を縫合し、切開部を外科的に閉じる。動物を、麻酔から回復するまでインキュベータ内に配置する。ラットに抗生物質、鎮痛剤および生理食塩水を必要に応じて与える。その後、機能が回収されるまで膀胱を毎朝晩露出させる。
可溶性Nogoレセプター−1融合タンパク質(例えば、sNogoR310−Fc)を、上記のラット脊髄離断モデルで記載のようにして髄腔内投与する。BBBスコアリングを、外科処置の1日後、次いで、その後は毎週4〜6週間まで行う。
(実施例14)
(トランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の発現)
本発明者らは、インビボで発現されたときの効果を試験するため、可溶性Nogoレセプター−1タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
本発明者らは、マウスsNogoR310 cDNA(Nogoレセプター−1のアミノ酸1〜310に対応)をC−3123ベクターのNotl部位内にクローニングした。このベクターでは、sNogoR310発現は、グリア線維性酸性タンパク質(gfap)遺伝子調節エレメントの制御下にあり、これにより、損傷部位の反応性星状細胞からの分泌の増強を伴う高レベル発現が可能になる。本発明者らは、得られたベクターを、逐次AatIIおよびSfiIで消化し、3.4kb断片においてgfap::sNogoR310構築物を単離した。本発明者らは、胚内へのこの断片のマイクロインジェクションを行ない、トランスジェニックマウスを作製した。本発明者らは、PCRにより、導入遺伝子が組み込まれたことを確認し、5つの創始系統を同定した。本発明者らは、最大発現レベルを有する2つの創始系統のヘテロ接合型雄を雌C57BL/6Jマウスと交配させた。本発明者らは、ヘテロ接合型トランスジェニックマウスにおいて、GFAP陽性細胞がsNogoR310を発現および分泌することを、Nogoレセプター−1に対して生成させた抗体を用いたウエスタンブロットにより解析確認した。
本発明者らは、皮質および脊髄を、プロテアーゼインヒビター(Roche)を補給したTris緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、ホモジネートを40,000rpmで20分間4℃にて遠心分離した。本発明者らは、上清みを4%パラホルムアルデヒドで20分間処理して抗体特異性を増強し、イムノブロッティング前に透析した。本発明者らは、微粒状画分を、RIPA緩衝液(1%Triton(登録商標)X−100、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、PBS中0.1%SDS)中での超音波処理によってホモジナイズし、得られたホモジネートを遠心分離し、この上清み(デタージェント可溶性微粒状画分)を上記のようにして処理した。本発明者らは、20μgの脳または脊髄タンパク質を、Nogoレセプター−1に対して生成させたウサギ抗血清(1:2000希釈)を用いたイムノブロットによって解析した。本発明者らは、免疫反応性を、AP−結合体化抗ウサギIgGおよびNBT/BCIP AP基質とのインキュベーションによって可視化した。
本発明者らは、分泌された37kDaのsNogoR310を、2つのトランスジェニック系統Tg08およびTg01由来の皮質および脊髄のデタージェント無含有可溶性抽出物を検出したが、同腹子野生型(WT)マウスでは、37または81kDaの可溶性Nogoレセプター−1タンパク質は、存在するとしてもごくごく少量である。微粒状画分を調べると、WTマウスおよびトランスジェニックマウスの両方で、同等レベルの内因性Nogoレセプター−1が存在することが示された。
(実施例15)
(損傷後のトランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の発現)
本発明者らは、背側過半側切除損傷を行うことにより、トランスジェニックマウスにおけるsNogoR310発現に対するCNS損傷の効果を試験した。本発明者らは、実施例14に記載のようにして、ヘテロ接合型雄をC57/BL6雌と交配することにより、sNogoR310トランスジェニック動物および非トランスジェニック対照動物を得た。
本発明者らは、成体雌ヘテロ接合型トランスジェニックマウスまたは同腹子WTマウス(10〜16週齢)に深く麻酔し、完全椎弓切除術を行ない、T6およびT7レベルの脊髄の背側部分を完全に露出させた。本発明者らは、T6において、30ゲージ針および1本のマイクロ剪刀を用いて背側過半側切除を行ない、背側と側背の皮質脊髄路(CST)を完全に分断した。本発明者らは、市販の針を脊髄の背側部分に数回通し、病変部が1.0mmの深さであることを確実にした。本発明者らは、椎弓切除術上部の筋肉層を縫合し、外科用ステープルで背部の皮膚を閉じた。皮質脊髄路をトレースするため、本発明者らは、脊髄損傷14日後、重層している大脳皮質の右側に頭蓋内までギザギザの(burr)穴を開けた。本発明者らは、トレーサーBDA(MW 10,000、PBS中10%)(Molecular Probes、ユージーン、OR)を4つの注射部位に、該皮質表面から0.7mmの深さで適用した。損傷4週間後、マウスに噴門経由で(transcardially)PBSを、その後4%パラホルムアルデヒドを灌流した。sNogoR310発現実験に使用したマウスには、トレーサー注射をなんら行なわなかった。
ウエスタンブロット解析に使用したマウスでは、損傷後14日間灌流せずに、T3とL3の間のレベルの脊髄を回収した。Nogoレセプター−1免疫組織化学的染色に使用したマウスには、半側切除後、4%パラホルムアルデヒドを10日間灌流し、損傷脊髄を取り出して切片化した。トランスジェニックマウスおよびWTマウスの損傷脳においてsNogoR310発現を調べるため、皮質の穿刺損傷を、定位装置(David Kopf、タハンガ、CA)に保持した11番ブレードを用いて行なった。4mmの傍矢状断面で、ブレグマの後方0.5mm、正中切開部の側方1.5mmおよび3.5mm深さの切開を行なった。
本発明者らは、トランスジェニックマウスにおいて、損傷10日後、脊髄の可溶性抽出物においてsNogoR310のレベルの増大を検出したが、WTマウスでは検出されず、病変部周辺のGFAPの損傷後上方調節と整合する。これがNogo−Aの代償性上方調節のためでないことを確認するため、本発明者らは、その発現を試験した。WTマウスおよびトランスジェニックマウスのいずれかに由来の完全な皮質または損傷皮質および脊髄いずれにおいても同様であることを見出した。
本発明者らは、損傷CNSにおけるsNogoR310の細胞発現を、損傷脳および病変領域を含む脊髄を、Nogoレセプター−1およびGFAPに対する抗体で免疫染色することにより調べた。反応性星状細胞グリアの一般的な形態は、WTマウスとトランスジェニックマウス間で異ならないが、Nogoレセプター−1について染色された密度は、細胞内空間および細胞外空間いずれにおいても、WTマウスよりもgfap::sNogoR310トランスジェニックマウスで著しく高く、これは、トランスジェニックマウスにおける病変部周辺でのsNogoR310発現の増大を示す。Nogoレセプター−1タンパク質は、トランスジェニックマウスにおいてのみ、星状細胞マーカーGFAPと共局在する。また、トランスジェニック試料では、広範な非細胞染色の大きな増強が見られ、細胞外空間におけるsNogoR310と整合する。ニューロン細胞体Nogoレセプター−1染色は、WTマウスおよびトランスジェニックマウス両方において検出される。
(実施例16)
(分泌sNogoR310は、トランスジェニックマウスにおいてCST出芽を誘導する)
本発明者らは、トランスジェニックマウスの病変周囲でのsNogoR310の発現の増大により損傷軸索の再生がもたらされるか否かを試験した。
本発明者らは、順行性トレーサービオチンデキストランアミン(BDA)を、LiおよびStrittmatter、J.Neurosci.23:4219−27(2003)に記載のようにして右運動皮質内に注射することにより、下行皮質脊髄路(CST)の完全性を調べた。同腹子WTマウスにおいて、明白な背側CST(dCST)が病変の吻側に密に結束し、少量の側背CST線維が同側に見られる。少数の短いBDA標識側副枝出芽部が灰白質内、特に前索内に突出しているが、出芽部は、大部分が、トレーサー注射の反対側の索側に限定される。しかしながら、損傷sNogoR310トランスジェニックマウスの背側半側切除の吻側の切開面は、全く異なるBDA標識パターンを示す。高密度のBDA標識CST線維が、すべてのトランスジェニックマウスにおいて、ライン(line)Tg08またはラインTg0lから明白なdCSTの外側に観察される。異所性線維が灰白質領域を貫けて伸張し、一部の線維は、側方および側背白質内に達している。いくつかの線維(4〜12の出芽部/横断面)が反対側の脊髄(トレーサー注射部位と同側)に見られる。側副枝出芽部のマイクロデンシトメトリー測定は、sNogoR310トランスジェニックマウスにおいて、ほぼ10倍の出芽密度の増加を示す。病変の吻側の1〜4mmの長軸方向の傍矢状断面を調べると、sNogoR310トランスジェニックマウスでは、同腹子WT動物とは対照的に、dCST線維によって、多数の分岐出芽部が腹側灰白質領域内に伸張していることが示される。一般的に、トランスジェニックマウスにおける病変の吻側の出芽のパターンおよび程度は、Nogoレセプター−1アンタゴニストペプチドNEP1−40で全身性処置されたマウスで観察されるものと同様である(LiおよびStrittmatter、J.Neurosci、23:4219−27(2003))。
これらの結果は、該トランスジェニックマウスにおいて分泌sNogoR310がCST出芽を誘導することを示す。
(実施例17)
(sNogoR310トランスジェニックマウスにおいて、CST軸策の再生により、遠位脊髄内への病変部位の進入が回避される)
本発明者らは、病変部位の吻側4mmおよび尾側4mm(計8mmの長さ)の脊髄をトランスジェニックマウスから単離し、グルタルアルデヒド重合アルブミンマトリックス中に包埋し、ビブラトームにおいて傍矢状断面に沿って切断した(30μm厚)。本発明者らは、損傷部位の吻側5〜7mmおよび尾側5〜7mmの脊髄から横断面(50μm)を回収した。ラットにおけるsNogoR310−Fc注射実験のため、病変部位の吻側10mmおよび尾側10mmに伸張している脊髄を、振動型ミクロトームにおいて側矢状平面に沿って切断した。(50μm)横断面を損傷部位の吻側11〜16mmおよび尾側11〜16mm脊髄から回収した。本発明者らは、該切片をアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、BDAトレーサーをニッケル増強型ジアミノベンジジンHRP反応によって可視化した(Grandpre、Nature 417:547−551(2002))。本発明者らは、一部の切片を、間接的な免疫蛍光によるセロトニン免疫組織化学検査(抗5−HT抗体)のために加工処理した。病変領域を可視化するため、本発明者らは、一部の切片をGFAPに指向される抗体(Sigma(登録商標)、セントルイス、MO)で二重染色した。本発明者らは、該切片をマウント培地にマウントし、脱水し、被覆した。
本発明者らは、損傷後のトランスジェニックマウス(実施例16を参照のこと)において発現されたsNogoR310によって誘導される線維が、病変領域を尾側脊髄内に交差(cross)させ、機能回復をもたらすか否かを試験した。
カメラルーシダ内に誘導した損傷部位における連続的な側矢状平面は、病変から数ミリメートルに再生CST線維の全体的分布パターンを示す。WTマウス由来の切片は、損傷部位を越えて伸張するCST線維を示さない。sNogoR310トランスジェニックマウス由来の同様の切片は、離断領域と交差し、高度に分岐したパターンで遠位灰白質および白質領域内に突出する数多くのCST線維を示す。半側切除のすぐ吻側では、明白なdCST由来の高密度のBDA標識CST出芽が病変領域内に突出しているが、大部分のCST出芽部は、瘢痕形成および組織空洞化が明白である離断領域を超えなかった。少量だが高度に有意な割合の再生軸索により、灰白質および白質の腹側および腹側外側の残留組織橋絡部を通って病変部位を迂回させる。また、CST線維は、病変部の背側および側背脊髄によって離断領域それ自体と交差し、遠位領域に進入することはほとんどないようである。病変部近傍では、再生線維の進路は、典型的には蛇行性であり、吻側CSTにおける通常の直線状の線維とは全く異なっていた。側副枝および分岐線維は、遠位脊髄の灰白質領域において最も高頻度で見られる。この再構成により、各トランスジェニックマウスにおいて、病変部の尾側1〜4mmにおいて任意のレベルで吻側−尾側軸に進行している5〜15のBDA標識再生線維が示される。背側半側切除の尾側5〜7mmの横断面では、各トランスジェニックマウスにおいて、BDA標識CST軸索が灰白質領域および白質領域の両方で見られる。トランスジェニックマウスの線維計数は、矢状断面における近位レベルとほぼ同数のBDA標識CST線維を示す。
CST線維に加え、その他の下行路、例えば縫線脊髄線維などもまた、マウスの運動機能に寄与する。このマウス背側過半側切除モデルにおいて、離断により、大部分のセロトニン作動性線維が損傷され、この線維の密度は前角において、ほぼ80%減少する。尾側脊髄の前角におけるセロトニン線維の全長の解析は、トランスジェニックマウスでは、WT群よりもこの線維の数がずっと多いことを示し、トランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の成長促進効果は、1つの軸索下行経路に限定されないことを示す。
(実施例18)
(sNogoR310の遺伝子導入発現により運動機能回復が改善される)
CST軸索のトレースおよびセロトニン作動性線維解析は、トランスジェニックマウスの星状細胞から放出されるsNogoR310が、脊髄において損傷下行軸索の広範な解剖学的再生を刺激することを示す。本発明者らは、これらの再生線維が機能回復に有益であるか否かを調べるため、実施例12に記載のようないくつかの挙動試験を行った。
BBB試験によって評価されたように、WTマウスでは、一部、4週間の生存期間の間に運動機能が回復される。損傷4週間後、ほとんどのWTマウスは、一貫性の体重支持を伴う一貫性の足底ステップを特徴とするレベルを回復するが、偶発的ないし高頻度しか前肢−後肢協調を示さず、表面と最初に接触したとき、主な足の位置が回転する。対照的に、ラインTg08およびTg01両方のsNogoR310トランスジェニックマウスのBBBスコアは、7〜28日間の観察期間を通して対照群よりも有意に高い(図13Aおよび13B)。損傷28日後、ほとんどのトランスジェニックマウスは、一貫性の前肢−後肢協調を示す。主な足の位置は身体と平行である。
本発明者らは、sNogoR310トランスジェニックマウスの動作の特徴を調べるため、さらに2つの挙動試験を使用した。まず、本発明者らは、5秒以内にマウスがその握力を弱めないボードの最大傾斜角度を測定した。背側半側切除損傷前は、トランスジェニックマウスおよびWTマウスはともに、55度の角度をなすボード上で、その姿勢を維持することができる。損傷7〜28日後、維持可能な角度は、すべてのマウスにおいて減少するが、トランスジェニックマウスが維持可能な角度は、対照群よりも有意に大きい(図13C)。別の挙動試験では、マウスに、垂直線に対して45度の角度に配置されたグリッドよじ登らせ、グリッドの水平面より下の後肢の偏倚運動を計数した(Metzら、Brain Res.883:165−177(2000))。マウスは、損傷前訓練中のこの試験では、後肢異常を示さなかった。WTマウスでは、損傷後2〜6週間の期間で、数多くのフットフォールト(foot fault)後肢異常が認められ、改善は最小限にすぎない。対照的に、sNogoR310トランスジェニックマウスは、この期間、グリッドよじ登りにおいて進行性の改善を示し、大部分の改善は、損傷後1〜3週間の間に起こる(図13D)。したがって、星状細胞からsNogoR310を分泌するトランスジェニックマウスは、脊柱胸部半側切除後にCST再生、縫線脊髄出芽および運動機能改善を示す。
(実施例19)
(sNogoR3310−FCタンパク質の髄腔内投与によりCST出芽が誘導される)
脊椎外傷性損傷後の可溶性Nogoレセプター−1の成長促進有益性の第2の試験として、本発明者らは、精製した該タンパク質を髄腔内投与した。
本発明者らは、安定性および精製を向上させるため、ラットNogoレセプター−1のリガンド結合ドメイン(27〜310)をラットIgG1Fcドメイン融合した。本発明者らは、安定にトランスフェクトされたCHO細胞由来のタンパク質を精製した。このタンパク質は、以前にマウスsNogoR310−Myc Hisについて示されているように(Fournierら、J Neurosci.22:8876−8883(2002);Liuら、Science 297:1190−1193(2002))Nogo−66、MAGおよびミエリン作用をインビトロでブロックする。本発明者らは、sNogoR310−Fcタンパク質を、中央胸郭背側半側切除損傷を有するラットの髄腔内に、浸透圧ミニポンプによって送達した。損傷後4週間の生存期間中、1.2mgのsNogoR310−Fcタンパク質を、各ラットに局所投与した。ビヒクル処置(1.2mgのラットIgG)を受けたラットでは、半側切除の吻側の切開面は、病変部位上部に、密に結束した明白な背側CSTおよび非常に少ない異所性BDA標識CST線維を示す。sNogoR310−Fcタンパク質を受けた損傷ラットの病変の吻側の切開面は、全く異なるパターンの標識を示す。BDA標識CSTからの無数の異所性線維出芽が、横断面から傍矢状断面に観察される。場合によっては、該突出部は、正中切開部付近のdCST領域から該索部の周縁部まで交差しており、側背CSTと交絡状態となっている。出芽軸索は、灰白質を通過して大部分の白質まで伸張している。dCSTに隣接した異所性出芽線維の測定(横断面では≧100μm、矢状断面では≧200μm)は、sNogoR310−Fc処置ラットにおけるより大きな増加を示す。
(実施例20)
(sNogoR310−FC処置ラットにおいて、CST軸索は遠位脊髄内に再生する)
本発明者らは、雌Sprague−Dawleyラット(190〜250g)を深く麻酔し、脊椎レベルT6〜7で椎弓切除術を行ない、脊髄を露出させた。本発明者らは、脊髄の背側半分を、30ゲージ針および1本のマイクロ剪刀で切断してCSGT路の背側部分を切断し、11番ブレードの鋭利な部分を該索部の背側半分に沿って通過させることにより病変部の深さ(1.8mm)を確保した(Grandpreら、Nature 417:547−551(2002))。浸透圧ミニポンプ(Alzet(登録商標)2ML4、2ml容積、2.5μl/h、28日間送達)に1.2mgのラットIgG含有PBSまたは1.2mgのsNogoR310−Fc融合タンパク質含有PBSを充填し、これを、動物の背部の皮下の筋肉に縫い付けた。ミニポンプの排出口に接続したカテーテルをT7〜8レベルの脊髄の髄腔内に、硬膜にあけた小さな穴から挿入した。
Nogoレセプター−1アンタゴニストタンパク質の注入により、ラット半側切除部の吻側で広範な出芽が誘導されたが、より重要な問題は、出芽CST線維が遠位脊髄まで突出し、運動機能回復に寄与するか否かである。ビヒクル処置ラットの病変部位おける長軸方向の切片は、病変部レベル未満で検出可能なBDA標識腹側CST線維をを示さないか、数が非常に少ない(Grandpreら、Nature 417:547−551(2002);Weidnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3513−3518(2001))。sNogoR310−Fc処置ラットの同様の切片は、多くのBDA標識線維が離断部位を回避し、尾側脊髄に、腹側および腹側外側の脊髄の橋絡組織部全体に広く突出していることを示す。星状細胞マーカーGFAPの免疫染色は、離断の程度は、中心の管状領域よりも深く達したことを示す。明白な背側CSTにおける吻側線維の線形プロフィールとは異なり、再生CST線維は、通常、遠位脊髄、特に灰白質領域において高度に分岐軌道に従う。このような線維は、脊髄の多くの領域において検出されるが、脊髄全体の中心部分および脊髄の背側半分でより容易に見られる。矢状断面からのCST線維の計数は、各sNogoR310−Fc処置ラットの病変部の尾側1〜2mmでほぼ20個のBDA標識軸索、および病変部の遠位7〜8mmで15個のトレース軸索を示す。
一般的に、このような線維の分岐パターンは、局所NEP 1−40ペプチド処置動物で観察されるものと同様であるが、sNogoR310−Fcタンパク質で処置した切片では、各出芽部において、より多くの側副枝分岐が見られる。遠位脊髄からの出芽部の測定は、sNogoR310−Fc処置ラットにおける各出芽部の側副枝の全長は、NEP
1−40処置動物より2倍大きいことを示す。両方のNogoレセプター−1アンタゴニスト処置群では、脊髄の尾側1〜10mmの出芽部(≧200μmの長さ)の数は、対照群よりほぼ20〜40倍多い。sNogoR310−Fc処置ラットでは、局所NEP
1−40処置よりも多くの出芽部が見られる(約50個に対して25個の出芽部/ラット)が、この差は統計学的に有意ではない(p=0.1713、t−検定)。
CST軸索の再生は、sNogoR310−Fc処置を受けたラットにおいて、半側切除部の尾側11〜15mmの脊髄の横断面に観察される。このような線維は、脊髄の灰白質および白質の両方で検出される。灰白質で検出される線維は、多くの場合、白質領域よりも多くの側副枝分岐を示す。対照的に、ビヒクル処置群の横断面では、偶発的BDA標識物のみが腹側白質領域で見られ、非損傷腹側CST軸索と整合する。このレベルの遠位脊髄では、両方のNogoレセプター−1アンタゴニスト処置群[sNogoR310−FcおよびNEP 1−40]のBDA標識CST線維の平均数は、ビヒクル処置ラットよりほぼ20倍多い。総合すると、両方のNogoレセプターアンタゴニストsNogoR310−Fcタンパク質およびNEP 1−40ペプチドは、遠位脊髄において劇的なCST軸索再生をもたらすが、前者によって誘導される出芽は、より高度に分岐したパターンを示す。
(実施例21)
(局所sNogoR3310−FCは、損傷ラット脊髄において赤核脊髄(rubropinal)およびセロトニン作動性軸索の出芽を誘導する)
半側切除の14日後、下肢の感覚運動皮質を被覆する頭蓋の各側面に、ギザギザの穴を開け、CST線維をトレースした。順行性ニューロントレーサーBDA(PBS中10%、3.5μl/皮質)を7つの注射部位に、硬膜から1.5mmの深さで各側面に適用した(Grandpreら、Nature 417:547−551(2002))。ラットにおける赤核脊髄路のトレースのため、トレーサーBDA(1μl;MW 10,000;PBS中10%)を左側の赤核内に注射した(ブレグマの後方5.8mm、側方0.7mm、頭蓋表面の腹側7.0mm)。BDA注射の2週間後、これらの動物にPBSを灌流した後、4%パラホルムアルデヒドを灌流し、組織学検査のために組織を採取した。
損傷赤核脊髄路(RST)線維の修復は、脊髄損傷後の機能改善に寄与する(Liuら、J.Neurosci.、19:4370−4387(1999))。CNSのニューロン内のNogoレセプター−1の広範な分布(Wangら、J.Neurosci.22:5505−5515(2002))により、Nogoレセプター−1のそのアンタゴニストによる阻害により、RST軸索損傷後の再成長をもたらし得ることが可能になる。損傷RSTに対するsNogoR310−Fcの効果を試験すうるため、この経路の完全性を、BDAを左赤核内に注射することによってトレースした。脊髄レベルでは、RST線維は、通常、脊髄の側背白質領域に存在するが、この試験では、背側半側切除によって離断する。対照ラットの病変の吻側11〜15mmの横断面では、少数のBDA標識短線維が、明白なRSTと背側角状灰白質の間に見られる。sNogoR310−Fcで処置した同じレベルの切片は、主要RSTと背側角状灰白質の間に多くの連結線維を示す。SCIの遠位11〜15mmの横断面では、ビヒクル処置ラットにおいてBDA標識RST線維は見られない。対照的に、sNogoR310−Fc処置を受けた同じレベルの切片は、トレーサー注射と反対側の灰白質および白質の両方において多くのBDA標識RST線維を示す。分岐パターンを有する一部の出芽部が、BDA注射と同側の灰白質に見られる。
Ruphespinal脊髄線維もまた、sNogoR310−Fc処置脊髄損傷ラットにおいて調べた。免疫染色は、ビヒクル群とsNogoR310−Fc処置群間と同様である病変の吻側11〜15mmのセロトニン作動性線維の密度を示す。病変より下方11〜15mmの切片では、sNogoR310−Fc処置ラットにおけるセロトニン線維は、対照群よりも2倍数が多い。これらの結果は、sNogoR310−Fcタンパク質によるNogoレセプター−1阻害に対する応答性がCST線維に限定されないこと、およびその他の下行路、例えば、赤核脊髄およびセロトニン作動性の軸索などもまた、Nogoレセプター−1拮抗作用に応答性であることを示す。
(実施例22)
(ラットにおいてsNogoR310−FCでの局所処置により機能回復が改善される)
sNogoR310−Fcタンパク質の髄腔内投与により、外傷性脊髄損傷後、いくつかの下行経路において軸索再生が刺激される。本発明者らは、該タンパク質がまた、損傷脊髄において機能回復を改善するか否かを試験した。
半側切除の2週間後、ビヒクル処置ラットの運動機能BBBスコアは安定レベル12に達する(図14A)。病変4週間後、ほとんどの対照(7匹中6匹)は、高頻度の一貫性体重支持足底ステップおよび高頻度の一貫性の前肢−後肢協調を有するが、表面と最初に接触したとき、主な足の位置の回転を有する。対照的に、sNogoR310−Fcタンパク質処置を受けたラットでは、運動機能スコアは、外傷後2〜4週間の間で継続して改善される。損傷4週間後、9匹のsNogoR310−Fc処置動物はすべて、試験表面と最初に接触したとき、一貫性の前肢−後肢協調および平行な足の位置を有した。
グリッド歩行を用い、脊髄損傷後の下行細かい運動制御における欠陥を評価した(Metzら、Brain Res.883:165−177(2000))。この動作は、腹側外側の皮質脊髄線維および赤核脊髄線維によって媒介される前肢−後肢協調および随意運動制御を必要とする。損傷前訓練中、ラットはすべて、後肢をグリッドバー上に正確に置く。損傷2〜4週間後、対照ラットは、8〜9例の後肢異常/セッションを示し、経時的な改善は最小限にすぎない。対照的に、sNogoR310−Fcで処置したラットは、グリッド歩行において進行性の改善を示し、示される後肢異常は有意に少ない(平均4〜7例/セッション)。改善の大部分は、損傷の2〜3週間後に起こる。対照群における後足フットプリントの解析は、半側切除4週間後、非損傷ラットまたはsNogoR310−Fc処置を受けた損傷動物と比べ、一股長さが有意に減少し、姿勢(stance)幅が増加していることを示す(図14C)。したがって、これらの多数の挙動試験は、アンタゴニストタンパク質の局所注射によるNogoレセプター−1機能のブロックによって、損傷後の運動機能回復が改善されることを示す。
(実施例23)
(可溶性ラットNogoレセプター310(srNgR310)に対するモノクローナル抗NgR1抗体1D9の結合)
ラットNgR1(srNgR310)の1D9 Fabおよび可溶性断片の共結晶複合体において行った構造解析は、この抗体が、ラットNgR1上のN末端キャップとロイシンリッチリピートドメインの連結部付近に結合することを示す。図15。1D9は、ラットNgR1のみに結合し、ヒトまたはマウスのNgR1もNgR2もNgR3も認識しない。ラットsrNgR310−Fcと1D9 Fabとの結晶化のため、各巨大分子をパパインで切断し、Fc部分から精製し、10mM Hepes pH7、50mM NaCl中に保存した。該複合体は各々80μMで調製し、2:1の容量測定比で、14%Peg3350、0.4M酢酸亜鉛、0.1M塩化マグネシウムからなるレザーバー溶液と混合した。溶液を20℃で1時間インキュベートし、12、000×gで3分間遠心分離して、沈殿物を除去した。3〜5μLの上清みを、50%〜100%のレザーバー溶液(20℃)を入れたウェ上上に入れることにより結晶を成長させた。薄いプレート様結晶が、20℃で1週間にわたって成長した。この結晶を、速やかに0.2M酢酸亜鉛、8%Peg3350、25%エチレングリコール中に移して2分間凍結保護し、次いで、速やかに液体窒素中に移して凍結させた、
結晶は、ほぼ10μm厚であり、National Synchrotron Light Source(Upton、NY)の光線X25で3.2Å回折した。HKLプログラムパッケージv.1.97(Otwinowski,Z.、およびMinor,W.、Methods Enzymol 276:307−326(1997))によるデータ処理により、結晶は、P21212空間群に属すること、およびおよその細胞寸法a=90.6Å、b=188.6Å、c=125.5Å、およびα=β=γ=90が示され、2 Fab−NgRI複合体非対称ユニットと整合した。
NgRに結合する共通の水銀部位を同定するための浸漬結晶における多数の同型の置き換え実験ならびに分子交換に関する情報を利用することにより結晶構造を分解(solve)した。該空間群は、一貫した5つのσピークがw=0ハーカー(harker)セクションに同定された水銀および金の同型差のパターソンマップを調べることにより同定した。ヒトNgR1構造(pdbコード1OZN)(He,X.L.ら、Neuron 38:111(2003))に基づくラットNgR相同モデル、および1D9 Fabに対する相同モデルを用いるMOLREP(Vagin,A.およびTeplyakov,A.、J.Appl.Cryst.30:1022−1025(1997))との分子交換により、第1のNgR1、第1のFabおよび第2のNgR1分子の交換がもたらされ、得られたR−因子は48%であり、FabのCDR領域は明らかに密であった。この交換モデルは、相違パターソンマップから同定された水銀部位を、両方のNgR1分子上のAsp 138およびHis 182付近の対応する位置にマッピングすることにより確認した。さらなるFab断片は、密に明白に同定されなかった。この2つのNgR1および1つのFabを、CNX(Brunger,A.T.ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54:905−921(1998))を用いて3.2Å分解能まで精製すると、現状ではR因子は42%、R無含有は46%となった。
表8は、1D9 FabとラットNgR1間の接触部を示す。Fab由来の原子が、ラットNgR1内の原子からの距離3.9Å以内である接触部を示し、主鎖または側鎖のいずれかと水素結合を形成し得る接触部にアスタリスク()を付す。
(表8)
Figure 2013048638
は、H結合相互作用を示す
(実施例24)
(一過性トランスフェクションによるNgR RNAiスクリーニング)
ヒトNogoR1(図16A)転写物に対して3種類のRNAi構築物を設計した。RNAi−1およびRNAi−3は、ヒトNgR遺伝子を特異的に標的化する。RNAi−2は、ヒト、マウスおよびラットNgR遺伝子を標的化するように設計した。DNAオリゴヌクレオチド対を合成し、PolIIIプロモーター系RNAi発現ベクターpU6(これは、ヒトU6プロモーター、kar耐性遺伝子およびPacIクローニング部位を含有する)内に構築した。Nogor 2mは、標的配列に対して2つのミスマッチを有し、陰性対照として供されるように設計した。このようなオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を図16Bに示す。
最初に、RNAi構築物を、マウスL細胞においてヒトNgR発現ベクターをRNAi発現プラスミド(phU6NgR−RNAi−1、2および3)と一緒にコトランスフェクトすることによりスクリーニングした。マウスL細胞を6ウェル培養プレート内にプレーティングし、次いで、対照GFPレポータープラスミド単独またはGFPに対するRNAiベクターpU6GFPRNAiでトランスフェクトした(レーン2および3)。GFP遺伝子サイレンシングの対照としてGFPの発現をモニターした。マウスL細胞を0.5、1または2μgのhNgR発現ベクターでトランスフェクトした(レーン4〜6)。各ウェル内のDNA量を、pUC19プラスミドを添加することにより合計4μgのDNAに調整した。RNAi:標的比は4:1であった。5マイクログラムのhNgRベクターを2μgのNgR RNAi−1、2、3、または2mプラスミドとともにコトランスフェクトした(レーン7〜10)。トランスフェクションの48時間後、細胞をSDS負荷緩衝液中に回収し、SDS−PAGEに供した。hNgRの発現を、ポリクローナルhNgR抗体R150に対するウサギ血清(パネルA)またはモノクローナル抗体7E11(パネルB)を用いてウエスタンブロットにより解析した。
有効なNgR発現サイレンシングが、phU6NgR−RNAi−1および−2でトランスフェクトされた細胞で、NgR抗体7E11(モノクローナル)およびR150(ウサギポリクローナル)を用いたウエスタンブロットにおいて観察された。結果を図17に示す。NgRの発現は、NgR RNAi−1および−2でトランスフェクトされた細胞では基底レベルまで低減された。対照的に、NgR RNAi−3では、NgRの有意な低減はなんら示されず、対照変異型NgR KNAi−2mと同様であった。したがって、NgR RNAi−1および−2は、hNgR遺伝子サイレンシングに有効である。
一過性トランスフェクションの結果により、NgR発現の>90%阻害が示された。
(実施例25)
(ヒトNgRサイレンシングの確認)
検出されたシグナルは、2つの型の抗体で、hNgRに特異的であるが(hNgR cDNAトランスフェクト細胞でのみ)(図17)、検出されたバンドの見かけMW(約50kD)は、予測よりも小さかった。理論に拘束されることを望まないが、これは、おそらく、マウスL細胞におけるヒトNgRのグリコシル化の改変のためである。NgR MWの矛盾に関する観察結果を確認するため、hNgR cDNAトランスフェクションを、再度ヒトSKN細胞および293細胞において、リポフェクションを用いて行った。トランスフェクションの48時間後、細胞をSDS負荷緩衝液中に回収し、SDS−PAGEに供した。NgRの発現を、7E11およびR150の両方を用い、上記のようにしてウエスタンブロットにより検出した。親SKNまたは293細胞では、hNgR特異的シグナルは検出されず、R150で検出されたhNgRの見かけMWは、SKNおよび293細胞の両方において予測どおり>65kDである(図18)。
RNAi媒介性hNgRサイレンシングを、SKN細胞において確認した。SKN細胞を6ウェル培養プレート内にプレーティングし、次いで、対照GFPレポータープラスミド単独またはGFPに対するRNAiベクターpU6GFPRNAiでトランスフェクトした(レーン2および3)。GFPの発現をGFP遺伝子サイレンシングの対照としてモニターした。SKN細胞を2μgのhNgR発現ベクターでトランスフェクトした(レーン4)。pUC19プラスミドDNAを添加することにより、各ウェル内のDNA量を合計4μgのDNAに調整した。0.5μgのhNgRベクターを2μgのNgR RNAi−1、2、3または2mプラスミドとともにコトランスフェクトした(レーン5〜8)。トランスフェクションの48時間後、細胞をSDS負荷緩衝液中に回収し、SDS−PAGEに供した。hNgRの発現を、hNgR R150に対するウサギ血清を用いてウエスタンブロットにより解析した。この場合も、90%より多いNgRノックダウンがNgR RNAi−1および−2のすべてにおいて示されたが、NgR RNAi−3および−2mでは効率が低かった(図19)。
(実施例26)
(NeuroScreen細胞におけるNgRノックダウン)
NgR機能解析のため、NgRを発現するNeuroScreen細胞をCellomics Inc.から入手した。NeuroScreen細胞において安定なNgRノックダウンを達成するため、すべてのRNAi構築物を、レンチウイルスベクター内のβ−galまたはGFP主鎖のいずれかに変換した。レンチウイルスベクターの概略図を図20に示す。レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミド(Invitrogen)による293細胞のトランスフェクションによって作製した。安定なNgR1 RNAiの発現のためのレンチウイルスベクターを構築するため、ヘアピン型(すなわち、Nogo−1、Nogo−2、Nogo−2mおよびNogo−3)の発現を駆動するhU6プロモーターからなるRNAiカセットを、phU6ベクター(実施例24に記載)からPacI消化によって切り出し、SSM007プラスミドの特殊なPacI部位内にクローニングした。例えば、Robinsonら、Nature Genetics 3.3:401−406(2003)に記載の方法を参照のこと。レンチウイルスベクター形質導入を追跡するため、CBA−GFP発現カセットまたはCMV−LacZ発現カセットをSSM007プラスミド内のXbaI部位に挿入し、得られた構築物を、それぞれ、SM007−BFGWおよびSSM007−BFZWと命名した。
すべてのNgR1 RNAi構築物をSSM007−BFGWおよびSSM007−BFZW主鎖に変換した後、該ベクターを、パッケージングプラスミドpLP1、pLP2およびpLP/VSVGとともにFT293細胞内にコトランスフェクトし、レンチウイルスベクターを生成させた(Viropowerキット、Invitrogen)。pLP1は、HIV−I gag/pol配列およびCMVプロモーターから発現されるrev応答エレメント(RRE)をb−グロビンポリAとともに含有する8889bp構築物であり、pLP2は、RSVプロモーターからRevを発現し、転写物を終結させるためのHIV−1ポリAを有する4180bp構築物であり、pLP/VSVGは、5821bpプラスミドであり、CMVプロモーターから水疱性口内炎ウイルス糖プロテインGを発現し、β−グロビンポリAを有する。
レンチウイルス力価に対するRNAi干渉の自己制限的効果のため、すべてのウイルスストック力価は、培養培地中で4〜5×10形質導入単位の範囲である通常のレンチウイルスベクターより低いようであった。NgR RNAiレンチベクター(LV−NgR
RNAi)を使用し、moi(multiplicity of infection:感染多重度)1で、NeuroScreen細胞を形質導入した。形質導入効率は約1%であった(GFP発現またはβ−ガラクトシダーゼ染色によって表示)。
NgR RNAi−2はNgRサイレンシングに有効であり、ヒト、マウスおよびラットのNgRすべてを標的化することが示されたため、LV−NgR RNAi−2をNeuroScreen細胞の形質導入に選択した。形質導入細胞は、96ウェルプレート内での限界希釈によってクローニングした。β−ガラクトシダーゼ陽性またはGFP陽性クローンを同定し、さらなるNgR発現解析のために拡大培養した。
約20のクローニング細胞株をNgR発現について、7E11モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。典型的なウエスタンブロットの結果を図21に示す。GAPDHを負荷標準化の対照として使用した。すべてのクローンにおけるNgR発現を、ウエスタンブロット上のNgRバンドのデンシトメトリー走査によって定量し、GAPDHレベルに対して標準化した。NgR対GAPDHの比を用いてNgR発現レベルを測定した。スクリーニングした12個のクローンのうち、その11個でNgR発現が低下した(LV−GFP形質導入細胞の最少NgR発現クローン1E9を参照として使用)。対照的に、4つのLV−GFP形質導入されクローンはすべて、天然NeuroScreen細胞と同等のNgRレベルを有する。図22。これらの結果は、NgR発現が低下した安定な細胞株が樹立されたことを示す。
(実施例27)
(LV−NgR RNAi細胞の機能解析)
本発明者らは、機能解析のため、LV−NgR RNAi形質導入細胞から4つのクローンを選択した。天然NeuroScreen細胞のNgRレベルを参照として使用すると、これらの4つのクローンのNgRレベルは、それぞれ、天然細胞の3c12bでほぼ10%、3c4bで20%、5d12で30%および4a12で60%である(図23)。
(実施例28)
(モノクローナル抗NgR1抗体1D9の変異によりヒトNgR1の認識が可能になる)
コンピュータモデル設計により、1D9抗体における変異により、ヒトNgR1の認識が可能になることが示された。1D9重鎖のN56は、ヒトNgR1のR78と相互作用するように、コンピュータモデル設計によってセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグルタミンに変異され得る。また、軽鎖のR33は、ヒトNgR1のR95との静電気的および立体的衝突が回避されるように、コンピュータモデル設計によってアラニンまたはセリンに変異され得る。
(実施例29)
(ラットIgGに融合されているがメチルプレドニゾロンに融合されていないラットNGR1のエクトドメイン(27〜310)は、脊髄神経節細胞においてミエリンの神経突起伸長阻害効果を保持した)
脊髄損傷(SCI)のためのメチルプレドニゾロン(MP)とNgR(310)エクト−Fcでの併用処置の調査において、本発明者らは、これらの試薬が独立した作用機序を有することの確認を模索した。簡単には、ミエリンを一晩、ポリ−L−リシンプレコートプレート(Becton Dickinson、Bedford、MA、USA)内で、80または400ng/ウェル(それぞれ、2.5および12.7ng/mm)にて乾燥させた。次いで、ウェルに10μg/mlのラミニン(Calbiochem、ラ・ホーヤ、CA、USA)を1時間室温(foom temperature)(22〜24℃)でコートした。第13日胚の幼鳥の脊髄神経節ニューロンを、既報(GrandPreら、2000;Fournierら、2001)のようにして解離し、6〜8時間プレーティングした。ニューロンを、10μg/nl MP(Pharmacia、カラマズー、MI、USA)の存在下または非存在下、8μM NgR(310)エクト−Fcで全伸長期間中処理した。次いで、ニューロンを固定し、βIIIチューブリン抗体(Covance、プリンストン、NJ、USA)で染色し、神経突起伸長を、自動細胞画像形成解析システム(Axon Instrument、ユニオンシティー、CA、USA)を用いて定量した。細胞あたりの神経突起伸長を、各実験(n=3)について2連対照ウェルの平均に対して標準化した。NgR(310)エクト−Fcの活性は、ミエリンによる軸索成長の阻害を逆転させるその能力に基づく。図24A〜B。対照的に、MP単独は、ミエリン基材上の脊髄神経節ニューロンからの神経突起伸長に対して効果がなく、MPの存在によってNgR(310)エクト−Fcによる軸索成長刺激は改変されなかった。これらのデータは、MPがミエリン誘導性神経突起伸長抑制に直接影響を及ぼさないこと、およびMPとNgR(310)エクト−Fcが独立した作用を有することを示す。これらのインビトロデータは、MPおよびNgR(310)エクト−FcがSCI回復を逐次的有効な様式で増強するという仮説を支持する。
(実施例30)
(ラットIgGとメチルプレドニゾロンと融合させたラットNgRのエクトドメイン(27〜310)での処置は、脊髄離断後の機能回復に対して一時的に明白な効果を有した)
MPおよびNgR(310)エクト−Fc処置はともに、脊髄離断後の機能回復に対して一時的に明白な効果を有した。簡単には、雌Long Evansラット(7週齢;Charles River、Wilmington、MA、USA)に、25mg/kg腹腔内ミダゾラム(Abort Laboratories、シカゴ、IL、USA)および2〜3%のフローセン(Baxter、ディアフィールド、IL、USA)含有Oを用いて麻酔し、背側椎弓切除術を脊椎レベルT6およびT7において行なった。全身麻酔を1.5〜2%フローセン含有Oで維持した。背側半側切開を行ない、主要背内側と小(mino)側背(dorsplateral)皮質脊髄路(CST)成分とを完全分断した。顕微鏡(microscapel)を用い、該索部の表面から1.8mmの深さで定位的に(sterotaxically)該索部を離断した。CST離断直後、髄腔内カテーテルをクモ膜下腔内のT7に挿入し、皮下空間内に挿入したミニ浸透圧ポンプ(呼び水を入れた)に連結した。ミニ浸透圧ポンプにより、ラットIgGアイソタイプ対照タンパク質またはリン酸干渉生理食塩水(PBS)(5mg/ml、n=8)またはNgR(310)エクト−Fc(50μM、n=19)を0.25μL/時の速度で送達した。また、NgR(310)エクト−Fc処置ラット(n=8)のコホートをMP(Pharmacia;30mg/kg iv)で処置し、別のコホートをMP単独(30mg/kg iv)で、損傷直後ならびに4および8時間後に再度処置した。機能回復を、BBBオープンフィールドスコアリング法(Bassoら、J.Neurotrauma 12:1−21(1995))を用いて、翌日およびその後毎週評価した。対照動物は、試験期間の過程で後肢機能を回復し、4週間後に平均BBBスコア12±0.87に達した。同じ時点での処置群の平均BBBスコアは、MP、14.9±0.23;NgR(310)エクト−Fc、14.8±0.24およびNgR(310)エクト−Fc+MP、15.63±0.18であった。すべての処置群は、試験期間の過程で、対照と比べてBBBスコアの改善を示した。P<0/05(対照に対して)、Tukeyのpost hoc検定による二元配置反復測定ANOVA(図25A)。BBBスコアの統計学的に有意な増加が、外科処置後の日、対照動物またはNgR(310)エクト−Fc単独で処置した動物と比べて、MP−およびMP+NgR(310)エクト−Fc処置ラットにおいて観察された。BBBスコアは、SCIの2日後、MP処置ラットにおいて有意に改善された。P<0/05(対照に対して)、Tukeyのpost hoc検定による二元配置反復測定ANOVA(図25B)。この観察結果により、回復に対するMP処置の早期効果が示された。MPのこの非常に早期効果を考慮し、BBBスコアを第2日目に対して標準化してMPのこの早期効果を差し引くと(図25C)、NgR(310)エクト−Fcの効果のずっと遅い発現が示された。BBBスコアを個々の動物について第2日目に対して標準化すると、SCIの2、3および4週間後、NgR(310)エクト−Fc処置ラット±MPにおいて機能回復の有意な改善示される。P<0/05(対照に対して)、Tukeyのpost hoc検定による二元配置反復測定ANOVA(図25C)。併用処置群では、標準化BBBスコアにより、NgR(310)(ecto)−Fc処置に対するMPの効果の増強が消去され、これは、(i)併用処置群では、MPの効果は、SCI後、早期に生じた、および(ii)この効果を差し引くことにより、併用処置群およびNgR(310)エクト−Fc群における機能回復の速度および程度が同一であり、MP処置単独よりも顕著であったことを示す。
BBBスコアにおける差別(discriminating)点は、一貫性の体重支持足底ステップおよび一貫性の後肢−前肢協調に対応するスコア14である。一貫性の足底ステップおよび後肢−前肢協調の頻度は、SCIの3〜4週間後に14以上のスコアに達した各群のラットの割合を示す。したがって、結果を、ラットが14以上のスコアに達した頻度として示し、対照ラットの50%は、損傷後4週間までに14以上のスコアに達した(図25D)。NgR(310)エクト−FcおよびMPでの併用処置により、機能回復の速度が有意に改善された。P<0/05(対照に対して)、フィッシャーの正確確率検定。NgR(310)エクト−FcもしくはMPまたは併用療法で処置したラットはすべて(100%)、4週間までに一貫性の足底ステップおよび協調移動を示した。併用療法により、対照またはNgR(310)エクト−FcもしくはMP処置単独のいずれかと比べて、この処置群の有意に高い割合が3週間までに14以上のスコアに達したため、協調機能の回復の速度が増大した(図25D)。また、機能回復の改善は、対照と比べ、NgR(310)エクト−FcおよびNgR(310)エクト−Fc+MP処置群において有意に改善された平均一股長さとしても示された(図25E)。MP処置単独では、SCI4週間後に測定された一股長さは有意に改善されなかった。P<0/05、Dunnettのpost hoc検定による一元配置ANOVA。
(実施例31)
(ラットIgGおよびメチルプレドニゾロンに融合させたラットNgR1のエクトドメイン(27〜310)での処置により、脊髄離断後の軸索の形成性(plasticity)/再生が増大した)
NgR(310)エクト−Fcでの処置またはMPとNgR(310)エクト−Fcでの併用処置により、脊髄離断後の軸索の形成性/再生が増強された。簡単には、CSTの組織学的トレースのため、CST離断の2週間後、動物に再度−麻酔し、頭皮において切開を行った。皮膚切開部周辺の領域に、局所麻酔剤を注射し、左の感覚運動皮質を開頭術によって露出させ、7μLの10%ビオチンデキストランアミン(BDA;10,000
MW;Molcular Probes、ユージーン、OR、USA)含有PBSを、ナノリットル容注射器およびmicro4コントローラを用い、ブレグマの後方0〜3.5mm、正中切開部の側方0〜2.5mmおよび皮質表面の下方1mmの深さの12点に注射した。場合によっては、CSTを、同じ手順を用いて左右対称に標識した。
CST離断後28日目、ラットにイナクチン(100〜110mg/kg i.p.)を麻酔し、噴門経由でヘパリン加生理食塩水(100ml、10iuヘパリン)を、その後4%パラホルムアルデヒド(150ml)を灌流した。脊髄を取り出し、4%パラホルムアルデヒド中で後固定し、次いで、30%スクロースを48時間含浸させた。離断部位の吻側10mmおよび尾側15mmの25mm長の脊髄を、至切断温度化合物(OCT)中に包埋し、索の横断切片を、病変の吻側10〜15mmおよび尾側15〜20mmから採取した。
凍結切片(50μm)を滅菌的に切断し、ストレプトアビジン−結合体化AlexaFluor−594(1:200;Molecular Probes)で染色して標識CST軸索を可視化させた。軸索計数を離断部位の尾側10〜15mmから採取した横断面において行なった。すべての測定は盲検的に行った。8切片ごとに、すなわち、セクション 400μmずつ離れた切片を各動物について各レベルの該索部で計数し、値を軸索/切片の平均数として示した。
NgR(310)エクト−Fcでの処置またはMPとNgR(310)エクト−Fcでの併用処置により、損傷部位の尾側15mmで、ビオチンデキストランアミン(BDA)標識軸索の有意に大きな計測数がもたらされた(図26A)。BDA標識軸索は、後柱から背側角状灰白質内、および空間の開いた腹側CST内の両方に出芽し、腹側灰白質内に突出するようであった。該索部の個々の領域における軸索計数により、灰白質において軸索数の最大の増加が示された。この軸索数の最大の増加は、腹側白質(vWM)および背側白質(dWM)と比べると、灰白質(GM)において観察された(図26B)。P<0/05、Dunnettのpost hoc検定による一元配置ANOVA。これらのデータは、MPとともに、またはなしでのNgR(310)エクト−Fcでの処置により、脊髄損傷後の形成性が促進されることを示唆する。
(実施例32)
(ラットIgGおよびメチルプレドニゾロンに融合させたラットNgR1のエクトドメイン(27〜310)での併用療法により、ビオチンデキストランアミン標識皮質脊髄路線維と腰椎運動ニューロン間の軸索接続の数が増大した)
抗小胞性グルタミン酸輸送体1(vGLUTl)抗体(希釈度度1:2500)を用いてニューロン細胞体を染色し、第9髄板におけるα−およびγ−運動ニューロンを、その大きさおよび形態によって同定した。α−またはγ−運動ニューロンと接触している軸索の数は、対照動物と比べてMP+NgR(310)エクト−Fc−処置群において有意に増加し、最も顕著で有意な効果は、NgR(310)エクト−FcおよびMPでの併用処置を受けた動物において観察された(図27)。P<0/05、Dunnettのpost hoc検定による一元配置ANOVA。
(生物寄託)
ハイブリドーマHB 7E11(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4587)、HB 1H2(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4584)、HB 3G5(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4586)、HB 5B10(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4588)およびHB 2F7(ATCC(登録商標)受託番号PTA−4585)は、2002年8月9日、American Type Culture Collection(「ATCC(登録商標)」)、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110−2209、USAに寄託した。
当業者には認識されるように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に対して数多くの変更および修正が行われ得る。かかる変形型はすべて、本発明の範囲に包含されることが意図される。
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Claims (16)

  1. 製造方法であって、該方法は、NogoRバリアントをコードするヌクレオチドを発現させる工程を包含し、該NogoRバリアントのアミノ酸配列は、
    (a)配列番号49のアミノ酸1〜310を含むsNogoR310ポリペプチド;または
    (b)sNogoR310ポリペプチドのフラグメントであって、該フラグメントは配列番号49のアミノ酸a〜bを含み、aは25〜35の任意の整数であり、bは310である、フラグメント
    において、20個までの個々のアミノ酸置換を有し、(a)または(b)と、C27、C31、C33、C43、C80、C140、C264、C266、およびC287から選択される少なくとも1つのシステイン残基がシステイン以外の残基に置換されていることによって異なり、該発現が、該NogoRバリアントが産生されるように行われる、方法。
  2. 配列番号49のアミノ酸1〜310を含む前記sNogoR310ポリペプチドは、配列番号7を含む、請求項1に記載の方法
  3. 前記sNogoR310ポリペプチドは、配列番号49のフラグメントを含み、aが26である、請求項1または2に記載の方法
  4. 前記sNogoR310ポリペプチドは、配列番号49のフラグメントを含み、aが27である、請求項1または2に記載の方法
  5. 前記NogoRバリアントのC266がシステイン以外のアミノ酸で置換されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法
  6. 前記NogoRバリアントのC309がシステイン以外のアミノ酸で置換されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法
  7. 前記NogoRバリアントのC266およびC309がシステイン以外のアミノ酸で置換されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法
  8. 前記システイン以外のアミノ酸が、セリン、トレオニンおよびアラニンからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法
  9. 前記システイン以外のアミノ酸が、アラニンである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法
  10. 前記NogoRバリアントがFc領域をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法
  11. 前記Fc領域は、IgA Fc領域、IgD Fc領域、IgG Fc領域、IgE Fc領域、およびIgM Fc領域からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
  12. 前記Fc領域は、IgG Fc領域である、請求項11に記載の方法。
  13. 前記Fc領域は、C末端に存在する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法
  14. 前記発現させる工程が細胞内で発現させる工程を包含する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記ポリヌクレオチドがRNAを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記発現させる工程がベクターからRNAを発現させる工程を包含する、請求項15に記載の方法。
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