CN1926147A - Nogo受体拮抗剂 - Google Patents

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R·布莱克·佩平斯基
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戴恩·S·沃利
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Abstract

本发明公开了具有免疫原性的Nogo受体－1多肽、Nogo受体－1抗体及其抗原结合片段、可溶性Nogo受体及其融合蛋白，以及编码这些物质的核酸。本发明还公开了组合物，其中包含所述Nogo受体抗体、其抗原结合片段、可溶性Nogo受体、其融合蛋白或编码这些物质的核酸，以及制备和使用这些多肽/蛋白质和核酸的方法。

Description

NOGO受体拮抗剂
发明领域
[0001]本发明涉及神经生物学和分子生物学。更为具体的是，本发明涉及具有免疫原性的Nogo受体-1多肽，Nogo受体-1抗体及其抗原结合片段，可溶性Nogo受体及其融合蛋白以及编码上述多肽/蛋白质的核酸。本发明进一步还涉及组合物，其中包含这些Nogo受体抗体或其抗原结合片段、具有免疫原性的Nogo受体-1多肽、可溶性Nogo受体或其融合蛋白或编码上述多肽/蛋白质的核酸，以及制备和使用上述多肽/蛋白质和核酸的方法。
发明背景
[0002]神经元的轴突和树突是自神经元发出的长的细胞延伸。延伸的轴突或者神经突末端包含特化的区域，称为生长锥。生长锥感受局部环境并且指导轴突向神经元的目标细胞生长。生长锥对许多环境信号产生应答，例如表面粘连性、生长因子、神经递质和电场。在生长锥处对生长的指导涉及多种不同类型的粘连分子、细胞间信号以及剌激和抑制生长锥的因子。正在生长的神经突其生长锥以不同的速率生长，但通常是每天一到两mm。
[0003]生长锥为手形，具有宽而扁平的突出(微刺突或者丝状伪足)，以不同方式粘附到胚胎的表面，丝状伪足一直是有活性的，有一些丝状伪足缩回到生长锥内，而其它丝状伪足继续伸长通过基质。不同丝状伪足之间的延伸形成片层足。
[0004]生长锥用其片层足和丝状伪足探查其前方及两侧的区域。当伸长接触到一个不适于生长的表面时，就会缩回。当伸长接触到一个适于生长的表面时，它就会继续延伸并且指引生长锥朝这个方向生长。生长锥可以被基质表面特性的微小变化所指引。当生长锥到达一个适当的目标细胞时就会产生一个突触连接。
[0005]神经细胞的功能受到其临近环境中神经元和其它细胞之间接触的巨大影响(U.Rutishauser，T.M.Jessell，Physiol.Rev.1988，68，p.819)。这些细胞包括特化的神经胶质细胞、中枢神经系统内的少突神经胶质细胞、外周神经系统内的施旺细胞，该细胞用髓鞘(一种多层膜组成的绝缘结构)将神经元的轴突包住(G.Lemke，in An Introduction to MolecularNeurobiology，Z.Hall，Ed.[Sinauer，Sunderland，Mass.，1992]，p.281)。
[0006]尽管中枢神经系统神经元具有损伤之后再生的能力，但是由于在髓鞘中存在抑制蛋白并且很可能由于这些细胞所处的局部环境中通常具有其它类型的分子，神经元的再生受到抑制(Brittis and Flanagan，Neuron 2001，30，pp.11-14；Jones et al.，J.Neurosci.2002，22，pp.2792-2803；Grimpe etal.，J.Neurosci.2002，22，pp.3144-3160)。
[0007]在少突神经胶质细胞中已经鉴别出了许多髓鞘质抑制蛋白，例如NogoA(Chen et al.，Nature，2000，403，434-439；Grandpre et al.，Nature 2000，403，439-444)，髓鞘质相关糖蛋白(MAG，McKerracher et al，Neuron 1994，13，805-811；Mukhopadhyay et al，Neuron 1994，13，757-767)以及少突神经胶质细胞糖蛋白(OM-gp，Mikoi and Stefansson，J.Cel l.Biol.1988，106，1273-1279)。在分别的研究中，发现这些蛋白中每一种都是神经元Nogo受体-1的配体(Wang etal.，Nature 2002，417，941-944；Liu etal.，Science，2002，297，1190-93；Grandpre etal.，Nature 2000，403，439-444；Chen etal.，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi et al.，Neuron，2002，35，283-90)。
[0008]Nogo受体-1是一种GPI-锚定的膜蛋白，它含有8个富含亮氨酸的重复单元(Fournier et al.，Nature 2001，409，341-346)。在与抑制蛋白(例如NogoA，MAG和OM-gp)发生相互作用时，Nogo受体-1复合物转导信号，导致生长锥萎陷且神经突向外生长受到抑制。
[0009]现在迫切需要具有这样的分子，它们能够抑制Nogo受体-1与其配体间的结合，并且能减弱髓鞘质介导的生长锥萎陷和对神经突向外生长的抑制。
发明概述
[0010]本发明涉及可溶性Nogo受体-1多肽和含有这些多肽的融合蛋白，以及针对Nogo受体-1特异性免疫原性区域的抗体及其抗原性片段。本发明还涉及结合本发明抗体的免疫原性Nogo受体-1多肽。本发明还涉及可与能结合Nogo受体-1的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。该多肽尤其可用作免疫原，或者用于筛选抗体鉴定其是否具有与本发明所述抗体类似特异性。本发明进一步还涉及编码本发明所述多肽的核酸、载体和包含这些核酸的宿主细胞，以及制备这些多肽的方法。本发明所述抗体、可溶性受体和受体融合蛋白能拮抗或者阻断Nogo受体-1，可用于抑制Nogo受体-1与其配体的结合、抑制神经元中生长锥萎陷以及降低对神经元内神经突向外生长或者出芽的抑制。
[0011]在一些实施方案中，本发明提供了一种多肽，该多肽选自：AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO：26)；LDLSDNAQLR(SEQ IDNO：27)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO：29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO：30)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO：31)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO：32)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO：33)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO：34)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO：35)；DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：36)；DNAQLR(SEQ ID NO：37)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：41)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：42)；LDLSDNAALRWDPTT(SEQ IDNO：43)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO：44)；和LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO：45)。
[0012]在一些实施方案中，本发明提供了一种编码所述免疫原性多肽的核酸。在一些实施方案中，所述核酸可操作地连接于一表达调控序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明所述核酸的载体。
[0013]在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明所述核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明所述多肽的方法，该方法包括：培养含本发明所述核酸或载体的宿主细胞，以及从宿主细胞或者培养基中回收所述多肽。
[0014]在一些实施方案中，本发明提供了一种制备抗体的方法，该方法包括下述步骤：用选本发明所述多肽或者用含本发明所述核酸或含本发明所述载体的宿主细胞免疫宿主；以及回收该抗体。本发明还提供了用该方法制备的抗体或其抗原结合片段。
[0015]在一些实施方案中，本发明还提供了能特异性结合本发明所述多肽的抗体或其抗原结合片段。其中所述抗体不是杂交瘤细胞系HB 7E11(ATCC保藏号为PTA-4587)制备的单克隆抗体。
[0016]在本发明的一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(a)能抑制神经元内生长锥萎陷；(b)能降低对神经元内神经突向外生长和出芽的抑制；以及(c)能抑制Nogo受体-1与配体间的结合。在一些实施方案中，所述的神经突向外生长和出芽是轴突生长。在一些实施方案中，所述神经元是中枢神经系统神经元。
[0017]在一些实施方案中，本发明所述的抗体是单克隆的。一些实施方案中，本发明所述的抗体是一种鼠的抗体。一些实施方案中，本发明所述的抗体选自人源化抗体、嵌合抗体和单链抗体。[0018]在一些实施方案中，本发明提供了一种抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，该方法包括下述步骤：让Nogo受体-1与本发明所述抗体或其抗原-结合片段接触。一些实施方案中，所述配体选自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。
[0019]在一些实施方案中，本发明提供了一种抑制神经元内生长锥萎陷的方法，该方法包括下述步骤：让所述神经元与本发明所述抗体或其抗原-结合片段接触。
[0020]在一些实施方案中，本发明提供降低对神经元内神经突向外生长或出芽抑制的方法，该方法包含下面的步骤：让神经元与本发明所述抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，所述的神经突生长或者出芽是轴突生长。在一些实施方案中，所述神经元是中枢神经系统神经元。
[0021]一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中包括药物学可接受的载体和本发明所述抗体或其抗原-结合片段。一些实施方案中，所述组合物进一步还含有一种或多种其它治疗剂。
[0022]在一些实施方案中，本发明提供促进濒临死亡的神经元存活的方法，该方法包含下述步骤：让神经元与有效量的本发明所述抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，所述神经元处于体外。在一些实施方案中，所述神经元位于哺乳动物体内。在一些实施方案中，所述哺乳动物表现出多发性硬化、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、亨丁顿氏症(Huntington’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(parkinson’s disease)、糖尿病性神经病、中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤等疾病的体征或者症状。
[0023]在一些实施方案中，本发明提供促进哺乳动物中的濒临死亡的神经元存活的方法，该方法包括(a)提供表达本发明所述抗-Nogo受体-1的抗体或其抗原结合片段的培养的宿主细胞；以及(b)将所述宿主细胞导入该哺乳动物至所述神经元所在位置或其附近。
[0024]在一些实施方案中，本发明提供了促进哺乳动物的濒临死亡的神经元存活的基因治疗方法，该方法包括在神经元或其附近位置施用病毒载体，该载体包含编码本发明所述抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段由该核苷酸序列在哺乳动物中表达而成，其表达量足以促进神经元的存活。
附图简述
[0025]图1是Nogo受体-1结构的示意图，人的sNogoR310包含第26-310位残基，sNogoR344包含第26-344位残基。大鼠的sNogoR310包含第27-310位残基，sNogoR344包含第27-344位残基。
[0026]图2是利用Vector NtiTM软件绘制的Nogo受体-1蛋白的抗原性曲线，大鼠P-617是SEQ ID NO：10，大鼠P-618是SEQ ID NO：11。
[0027]图3A图示的是抗-Nogo受体-1抗体7E11的结合活性。该图显示了7E11浓度对Nogo66与Nogo受体-1结合的影响。图3B图示的是抗-Nogo受体-1抗体1H2的结合活性。该图给出了1H2的浓度对Nogo66与sNogoR344-Fc(在本申请和美国专利申请60/402,866中又称Fc-sNogoR344或者Ig-sNogoR344)的结合的影响。Fc-MAG不与Nogo66竞争结合sNogoR344-Fc。
[0028]图4图示的是抗-Nogo受体-1抗体1H2、3G5和2F7的ELISA结果。实验测定了在固定化抗原的存在下抗体对OD450的影响。所述固定化抗原是sNogoR310-Fc(在本申请和美国专利申请60/402,866中又称Fc-sNogoR310或Ig-sNogoR310)、sNogoR344-Fc、p-617、p-618、p4、p-5以及卵清蛋白和BSA。
[0029]图5图示的是在不同含量的髓鞘质存在的条件下，单克隆抗体7E11对大鼠DRG神经突向外生长的影响。
[0030]图6A图示了在下列竞争剂存在的条件下sNogoR310与125I-Nogo66和125I-Nogo40结合的结果：Nogo66、Nogo40和抗-Nogo受体-1单克隆抗体上清。图6B图示了125I-Nogo66与sNogoR310的结合活性。
[0031]图7图示的是sNogoR310-Fc对125I-Nogo40与sNogoR310间结合的影响。
[0032]图8图示的是sNogoR310-Fc与125I-Nogo40的结合活性。
[0033]图9A给出了在髓鞘质存在或者不存在的情况下，sNogoR310对每个细胞神经突向外生长/细胞的影响，图9B给出了在髓鞘质存在或者不存在的情况下，sNogoR310对神经突向外生长的影响。
[0034]图10A图示了存在或者不存在髓鞘质含量增加的情况下，sNogoR310-Fc对P4大鼠DRG(背根神经节)神经突向外生长的影响。因10B图示的是在使用PBS、PBS+sNogoR310-Fc、20ng髓鞘质以及髓鞘质+sNogoR310-Fc处理之后每个细胞中神经突的数目。
[0035]图11图示了在髓鞘质含量增加的情况下单克隆抗体5B10对DRG神经突向外生长/细胞的影响。
[0036]图12图示了在大鼠脊髓横切模型中诱导损伤之后直至30天时sNogoR310-Fc对于BBB得分的影响。
[0037]图13A和13B给出的是，在野生型或者08或01品系转基因小鼠中进行背部半切断之后，作为时间函数的运动功能BBB得分(locomotorBBB score)。图13C图示的是在野生型或者转基因小鼠损伤之后，作为时间函数的最大承受倾斜角度(maximal tolerated inclined plane angle)。图13D显示了在倾斜格栅爬行试验(inclined grid climbing)中，作为时间函数的后肢错误。在所有这些图中，给出的数据都是每组7-9只小鼠的平均值±s.e.m.。转基因组的数值与野生型小鼠的数值有统计学差异。(两个星号，P＜0.01；Student’s t-检验)。
[0038]图14A显示的是在对经载体或sNogoR310-Fc处理后的动物进行背部半切断后，作为时间函数的运动功能BBB得分，图14B显示的是损伤之后格栅行走(grid walking)中，作为时间函数的后肢错误。图14C显示的是脚印分析，结果表明：与未受损伤或受损伤但给予了sNogoR310-Fc的大鼠相比，对照小鼠表现出步长变小，步宽增大。在所有这些图中，给出的数据都是每组7-9只小鼠的平均值±s.e.m.。转基因组的数值与野生型小鼠的数值有统计学差异(图14A-B)。对照数值与没有脊髓损伤或者脊髓损伤但给予sNogoR310-Fc小鼠的数值有统计学差异(图14C)。(星号，p＜0.05；两个星号，P＜0.01；Student’s t-检验)。
发明详述
定义及一般技术
[0039]除另有定义外，本申请使用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本申请的定义为准。而且，除非上下文有特别说明，单数术语包括复数，复数术语也包括单数。本申请中的所有出版物、专利和参考文献在此全文引入作为参考，用于所有目的。
[0040]尽管在实施或者验证本发明时可以使用与本申请所述类似或等同的材料和方法，但是下文仍然描述了适宜的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是范例性的，其目的并非限制。本发明的其它特点和优点将会在详述和权利要求中显现出来。
[0041]在本说明书和权利要求中，″包含″一词其含义应该被理解为包括特定的一个个体或一组个体，同时也不把任一其它个体或任一组其它个体排除在外。
[0042]本申请中提供以下的术语和定义，以便更详细地阐述本发明。
[0043]本申请所使用的″抗体″是指完整的免疫球蛋白或其抗原结合片段。本发明所述的抗体可以是任一同种型或者任一类(例如M，D，G，E和A)或者是任一亚类(例如G1-4，A1-2)，并且可以具有κ或λ轻链。
[0044]本申请所使用的″Fc″是指通过木瓜蛋白酶降解得到的抗体重链恒定区的那一部分。
[0045]本申请所使用的，″NogoR融合蛋白″是指包含与异源多肽融合的可溶性Nogo受体-1基元的蛋白质。
[0046]本申请所使用的，″人源化抗体″是指抗体中至少一部分的非人序列被人的序列所代替。如何制备人源化抗体的例子可以在美国专利6,054,297，5,886,152和5,877,293中找到。
[0047]本申请所使用的″嵌合抗体″的含义是抗体中含有第一抗体的一个或多个区域以及至少一种其它抗体的一个或多个区域，所述的第一抗体和其它抗体可以来源于相同或者不同的物种。
[0048]本申请和美国专利申请60/402,866中使用的″Nogo受体”，“NogoR”“NogoR-1，”“NgR，”和“NgR-1”都是指Nogo受体-1。
Nogo受体-1多肽
[0049]一方面本发明涉及具有免疫原性的Nogo受体-1多肽。在本发明的一些实施方案中，所述免疫原性的多肽基本上由选自下列的氨基酸序列组成：LDLSDNAQLRWDPTT(大鼠)(SEQ ID NO：1)；LDLSDNAQLRSVDPAT(人)(SEQ ID NO：2)；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO：3)；AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ ID NO：4)；和CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO：5)。
[0050]一些实施方案中，本发明涉及可与能结合Nogo受体-1的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。一些实施方案中，所述多肽可被单克隆抗体7E11识别。一些实施方案中，所述多肽选自：LDLSDNAQLR(SEQ ID NO：28)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO：30)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO：31)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO：32)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO：33)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO：34)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO：35)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO：36)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO：37)；DNAQLR(SEQ ID NO：38)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：42)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：43)；LDLSDNAALRWDPTT(SEQ IDNO：44)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO：45)；或LDLSDNAQLAWDPTT(SEQID NO：46)。
[0051]一些实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO：1-5、26-27、29-37和41-45所示多肽的核酸。在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子与表达调控序列(例如pCDNA(I))相连。
[0052]本发明还涉及载体，其中含有编码本发明所述免疫原性多肽的核酸。在本发明的一些实施方案中，所述载体是克隆载体。在本发明的一些实施方案中，所述载体是表达载体。在本发明的一些实施方案中，所述载体含有至少一种选择性标记。
[0053]本友明还涉及宿主细胞，这些宿主细胞包含上述核酸或载体。
[0054]本发明还涉及制备本发明所述免疫原性多肽的方法，该方法包括培养宿主细胞的步骤。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母。
抗体
[0055]本发明还涉及与本发明所述Nogo受体-1多肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或者抗原结合片段可与一种多肽结合，该多肽基本上由选自SEQ ID NO：1-5、26-27、29-37和41-45的氨基酸序列组成。本发明所述抗体或者抗原结合片段可以在体内或者体外制备，以下讨论所述抗体或其抗原结合片段的制备。
[0056]本发明所述的抗体或其抗原结合片段能抑制Nogo受体-1与配体(例如NogoA，NogoB，NogoC，MAG，OM-gp)的结合并降低髓鞘介导的对神经突向外生长和出芽(特别是轴突生长)的抑制，且能减弱髓鞘介导的生长锥萎陷。
[0057]在一些实施方案中，抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是鼠的。在一些实施方案中，所述Nogo受体-1来自大鼠。在另一些实施方案中，所述Nogo受体-1是人的。在一些实施方案中抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是重组的、工程化的、人源化的和/或嵌合的。
[0058]在一些实施方案中，所述抗体选自：单克隆抗体7E11(ATCC保藏号PTA4587)；单克隆抗体1H2(ATCC保藏号PTA-4584)；单克隆抗体2F7(ATCC保藏号PTA-4585)；单克隆抗体3G5(ATCC保藏号PTA-4586)；以及单克隆抗体5B10(ATCC保藏号PTA-4588)。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体46。
[0059]有代表性的抗原结合片段是Fab、Fab′，F(ab′)2，Fv、Fd、dAb以及含互补决定区(CDR)片段的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和含有至少部分免疫球蛋白的多肽，这部分免疫球蛋白足以赋予该多肽特异性的抗原-结合能力(例如免疫粘附素)。
[0060]在本申请中，Fd是指由VH和CH1结构域构成的片段；Fv是指由抗体单臂的VL和VH结构域构成的片段。dAb是指是由VH结构域构成的片段(Ward et al.，Nature 341：544-546，1989)。本申请中使用的单链抗体(scFv)是指这样一种抗体，其中所述的VL区和VH区通过一合成接头配对形成一种单价分子，该合成接头使得VH区和VL区成为了一个蛋白单链(Bird et al.，Science 242：423-426，1988和Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988)。本申请中使用的双抗体是指双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于多肽单链上，但是由于所使用接头的太短，而不能使所述同一条链上的两个结构域实现配对，这样就迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对从而生成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993，and Poljak，R.J.，et al.，Structure 2：1121-1123，1994)。本申请中使用的可特异性结合目的抗原的免疫粘附素是指其中共价或非共价地引入了一个或多个CDR的分子。
[0061]在一些实施方案中，本发明提供了本发明所述Nogo受体-1抗体的亚单位多肽，其中所述的亚单位多肽选自：(a)重链或其可变区；和(b)轻链或其可变区。
[0062]在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸，该核酸编码本发明所述Nogo受体-1抗体亚单位多肽的重链或其可变区，或者轻链或其可变区。
[0063]在一些实施方案中，本发明提供了本发明所述Nogo受体-1抗体的高变区(CDR)或编码CDR的核酸。
免疫
[0064]本发明所述的抗体可以通过免疫接种合适的宿主(例如脊椎动物，包括人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼、两栖动物以及禽类、爬行动物和鱼的卵中)制得。所述抗体可以是多克隆或者单克隆的。
[0065]在一些实施方案中，使用本发明所述具有免疫原性的Nogo受体-1多肽免疫宿主。在另一些实施方案中，使用与完好或者破裂细胞的细胞膜结合的Nogo受体-1免疫宿主，通过与本发明所述Nogo受体-1多肽的结合来鉴定出本发明所述抗体。
[0066]在一些实施方案中，Nogo受体-1抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。通常除了抗原之外还需要施用佐剂以激发对于抗原的免疫应答，这些佐剂通常是不溶的或者是不能降解的物质，会引发非特异性的炎症，吸引单核巨噬细胞到达免疫接种位置。佐剂的实例包括，但不限于，弗氏佐剂，RIBI(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激复合物)或其片段。
[0067]抗体制备方法的综述，参见例如，Harlow and Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，Yelton，D.E.et al.(1981)；Ann.Rev.ofBiochem.，50，pp.657-80.，and Ausubel et al.(1989)；Current Protocols inMolecular Biology(New York：John Wiley&Sons)。与本发明所述免疫原性Nogo受体-1多肽的免疫反应性的测定，可以使用本领域众所周知的许多方法，包括例如，免疫印迹检测和ELISA。
抗体及生产抗体的细胞系的制备
[0068]本发明的单克隆抗体可以通过如Harlow和Lane(1988)，(同上)中描述的常规方法制备。
[0069]简而言之，在合适时机杀死动物，用本领域熟知的几种技术中的一种使淋巴结和/或脾脏B细胞无限增殖化，这些方法包括，但不限于，转化例如使用EBV或者与无限增殖化的细胞系例如骨髓瘤细胞融合。之后将细胞分为单个的克隆，检测每一个克隆的上清是否产生了特异性针对本发明所述免疫原性Nogo受体-1多肽的抗体。筛选、克隆及扩增杂交瘤的方法是本领域内众所周知的。类似的，测定免疫球蛋白核苷酸和氨基酸序列的方法也是本领域内已知的。
[0070]其它制备本发明所述抗体的适宜方法包括在体外让淋巴细胞与Nogo受体-1接触或者与本发明所述免疫原性多肽接触。另一种方法是在噬菌体或者类似载体中筛选抗体文库，参见Huse et al.，Science，246，pp.1275-81(1989)。本发明使用的抗体可以是经过修饰的或者是没有经修饰的。
[0071]可以将抗原(本申请是指Nogo受体-1或者本发明所述免疫原性多肽)和抗体与可以提供可检测信号的物质进行共价或者非共价连接而对抗原和抗体进行标记，本领域内已有多种不同的标记和偶联技术，可以在实施本发明的实践中使用。适宜的标记物包括，但不限于，放射性核苷酸、酶、底物、辅酶、抑制剂、荧光试剂、化学发光试剂、磁性粒子等等。教导如何使用这些标记物的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，还可以制备重组免疫球蛋白(参见美国专利4,816,567)。
[0072]在本发明的一些实施方案中，所述抗体有多种结合特异性，例如双功能抗体，它可以使用本领域内技术人员知道的众多技术来制备，包括制备杂交瘤、二硫键交换、化学交联、在两个单克隆抗体之间添加多肽连接物、向某一个细胞系中引入二套免疫球蛋白的重链和轻链，等等，更详细的讨论参见下文)。
[0073]本发明所述的抗体还可以是人单克隆抗体，例如那些由无限增殖的人细胞系产生的、由SCID-hu小鼠或者其它能够产生″人″抗体的非人动物产生。
噬菌体展示文库
[0074]可以通过筛选重组联合抗体文库，筛选出本发明所述的抗Nogo受体-1抗体。用于与本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽结合的范例性的联合文库，例如，使用VL和VHcDNA制备的scFv噬菌体展示文库，该cDNA由源自经本发明所述Nogo受体-1多肽免疫后动物的mRNA制得。制备和筛选这种文库的方法是本领域已知的。有商品化的材料和方法可用于制备噬菌体展示文库(例如the Pahrmacia recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；the Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612；and others from MorphoSys)。还有其它可以用于制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂(参见例如Ladner et al.U.S.Pat.No.5,223,409；Kang etal.PCT公开文本WO 92/18619；Dower et al.PCT公开文本WO 91/17271；Winter et al.PCT公开文本WO 92/20791；Markland et al.PCT公开文本WO92/15679；Breitling et al.PCT公开文本WO 93/01288；McCafferty et al.PCT公开文本WO 92/01047；Garrard et al.PCT公开文本WO 92/09690；Fuchs etal.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；McCaffertyetal.，Nature(1990)348：552-554；Griffiths et al.(1993)EMBO J.12：725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson et al.(1991)Nature352：624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nucl.Acids Res.19：4133-4137；and Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：7978-7982)。
[0075]从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离出本发明所述抗-Nogo受体-1抗体之后，可以从展示的噬菌体中(例如从噬菌体基因组中)回收编码所选抗体的核酸，并通过常规的重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体中。如果需要的话，还可以进一步对核酸进行处理，以制备本发明所述的其它抗体形式，如下所述。为了表达通过筛选联合文库分离出的抗体，将编码该抗体重链和轻链或者轻链和重链可变区的DNA克隆入重组表达载体，并将该载体引入哺乳动物宿主细胞，如上所述。
类别转换
[0076]本发明所述抗-Nogo受体-1抗体可以是任一同种型。通过类别转换可以得到任何所需要的抗体同种型。就类别转换而言，使用本领域熟知的方法分离出编码VL或者VH的核酸，其中不合任一CL和CH的编码序列，然后将编码VL或者VH的核酸与编码来自所需类别免疫球蛋白分子的CL或者CH的核苷酸序列可操作地连接在一起。可以通过使用包含CL或CH链的载体或者核酸来实现这种连接，如上所述。例如，可以通过类别转换将最初为IgM的本发明所述抗-Nogo受体-1抗体变为IgG抗体。另外，还可以利用类别转换将一个IgG亚类变为另一个IgG亚类，如从IgG1转变为IgG2。
突变的抗体
[0077]在另一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段可以在重链和/或轻链的可变区结构域发生突变，以改变抗体的结合特性。例如，可以在一个或多个CDR区内进行突变，以升高或者降低抗体对Nogo受体-1的Kd值，升高或降低Koff值，或者改变抗体的结合特异性。定点诱变技术是本领域内众所周知的。参见例如Sambrook et al.和Aumbel et al.，同上。在一个优选实施方案中，将本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体可变区中这样的氨基酸残基突变，已知这样的残基与种系相比已经发生了改变。在一些实施方案中，将本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体可变区中的一个或多个氨基酸残基突变，已知该残基与种系相比已经发生了改变。在另一个实施方案中，在一个或多个框架区域内使编码抗体重链或轻链可变区的核酸发生突变。可以在框架区或恒定区结构域内进行突变以提高半衰期。在框架区或者恒定区结构域内的突变还可以改变抗体的免疫原性，为抗体共价或者非共价结合另一个分子提供一个位点，或者改变补体结合等特性。可以在单一突变抗体的每个框架区、恒定区及可变区中都进行突变。也可以仅在单一突变抗体的框架区、恒定结构域和可变区其中之一进行突变。
融合抗体和免疫粘附素
[0078]在另一个实施方案中，可以制备融合抗体或者免疫粘附素，其中包含与另一多肽相连的本发明所述抗-Nogo受体-1抗体的全部或者一部分。在一些实施方案中，只有抗-Nogo受体-1抗体的可变区与多肽相连。在另一些实施方案中，本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体的VH结构域与第一多肽相连，而该抗体的VL结构域与第二多肽相连，所述第二多肽与第一多肽通过可使VH和VL结构域相互作用形成抗体结合位点的方式连接在一起。在其它实施方案中，VH结构域和VL结构域被一个接头隔开，该接头可使VH和VL结构域相互作用(参见下文的单链抗体部分)。然后将该VH-接头-VL抗体与目标多肽相连。融合抗体用于指导多肽进入表达Nogo受体-1配体的细胞或者组织中。目标多肽可以是治疗剂，例如毒素，或者是诊断剂，例如易于显色的酶，如辣根过氧化物酶。此外，融合抗体还可以利用两条(或者多条)单链抗体相互连接而制得，如果需要在单个多肽链上创建二价或者多价抗体，或者制备双特异性抗体，可以使用该方法。
单链抗体
[0079]本发明包括与本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽结合的单链抗体(scFv)。为了制备scFv，将编码VH-和VL-的DNA与编码柔性接头例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3的DNA可操作地连接在一起，从而可将VH和VL序列表达为一种连续的单链蛋白质，其中所述的VL和VH区由一个柔性接头连接在一起(参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，Nature(1990)348：552-554)。所述单链抗体可以是单价的，如果仅仅使用一个VH和一个VL；所述单链抗体可以是二价的，如果使用两个VH和两个VL；所述单链抗体可以是多价的，如果使用二个以上VH和VL。
嵌合抗体
[0080]本发明还包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其中的一种特异性是针对本发明所述免疫原性Nogo受体-1多肽。在一个实施方案中，可以制备一种嵌合抗体，该抗体通过一个结合结构域与本发明所述Nogo受体-1多肽特异性地结合，而通过第二个结合结构域与第二个分子结合。嵌合抗体可以通过重组分子生物学技术制备，也可以物理地偶联在一起。此外，可以制备一种含一个以上VH和VL的单链抗体，该抗体能特异性地结合本发明所述多肽及另一分子，该分子与减弱髓鞘介导生长锥萎陷以及降低对神经突向外生长和出芽的抑制有关。这种双特异性抗体可以使用众所周知的技术来制备，例如Fanger et al.Immunol Methods 4：72-81(1994)and Wrightand Harris，supra.and in connection with(iii)see e.g.，Traunecker et al.Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)。
[0081]在一些实施方案中，使用本发明所述抗体的一个或多个可变区制备嵌合抗体。在另一个实施方案中，使用所述抗体的一个或多个CDR区制备嵌合抗体。
衍生的及标记的抗体
[0082]可以对本发明所述抗体或其抗原结合片段进行衍生化，或者将其与另一分子(例如另一多肽或蛋白质)连接。通常，抗体及抗原结合片段的衍生化要保证其与本发明所述多肽间的结合不受衍生化或者标记的不利影响。例如，可以将本发明所述抗体或抗体部分功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价偶联或者其它方法)于一个或多个其它分子个体，例如另一抗体(如双特异性抗体或双抗体)、检测试剂、细胞毒性试剂、药物和/或能介导抗体或抗原结合片段与另一分子结合的蛋白质或多肽(例如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)。
[0083]在一些实施方案中，通过交联两种或者多种抗体(属于同一型或不同型，例如，制备双特异性抗体时)得到衍生化抗体，适宜的交联接头包括那些异双功能试剂，即带有被适当的问隔物隔开的两种不同反应基团的物质(例如邻-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或者同双功能试剂(例如二琥珀酰亚胺基辛二酯)。这种接头可以从Pierce Chemical Company，Rockford，Ill获得。
[0084]在一些实施方案中，所述衍生化的抗体是标记后的抗体。例如，用于对本发明所述抗体或抗体部分衍生化的检测试剂是荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗达明，5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯，藻红素，镧系磷光物等。也可以用可检测的酶标记抗体，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。在使用可检测酶标记的实施方案中，通过加入其它试剂检测抗体，酶利用这些试剂产生可检测的反应产物，例如对于辣根过氧化物酶而言，使用过氧化氢和二氨基联苯，还可以使用生物素标记抗体，通过间接测量亲和素和链霉亲和素的结合来检测。还可以使用被第二报告分子(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的、事先确定的多肽表位来标记抗体。[0085]还可以使用放射性标记氨基酸标记抗-Nogo受体-1抗体或者其抗原片段。放射性标记可以用于诊断或者治疗的目的。放射性标记的抗-Nogo受体-1抗体可以在诊断中使用，例如用于测定受试者的Nogo受体-1水平。而且，放射性标记的抗-Nogo受体-1抗体还可以用于治疗，用于治疗脊髓损伤。多肽的标记物的实例包括，但不限于，下列放射性同位素或放射性核苷酸-3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I。
[0086]抗-Nogo受体-1抗体或者其抗原片段还可以通过化学基因，例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或者糖基被衍生化。这些基因对于增强抗体的生物学性质是有用的，例如增加血清的半衰期或者增加对组织的结合。
抗-Nogo受体-1抗体的特性
抗-Nogo受体-1抗体的类和亚类
[0087]可以使用本领域内已知的方法来确定抗-Nogo受体-1抗体的类别和亚类。通常，可以使用对于某个特定抗体类和亚类特异的抗体来确定某个抗体的类和亚类。这类抗体是商品化的。可以使用ELISA、蛋白质印迹以及其它的技术来确定类和亚类。或者可以测定抗体重链和/或轻链恒定结构域的部分或者全部的序列，将它们的氨基酸序列与多种不同类和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，来确定抗体的类和亚类。
抗-Nogo受体-1抗体与Nogo受体-1的结合亲和力
[0088]本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体与本发明的Nogo受体-1多肽的结合亲和力与解离速率可以使用本领域已知的方法来测定。例如可以通过竞争ELISA、RIA、BIAcore或者KinExA技术来测量结合亲和力，也可以用BIAcore或者KinExA技术测量解离速率。通过表面胞质共振，使用例如BIAcore来测量结合亲和力和解离速率。
[0089]经测定，7E11和1H2的Kd分别为1×10-7和2×10-8M。
通过抗-Nogo受体-1抗体抑制Nogo受体-1的活性
[0090]在一些实施方案中，本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体或者其抗原结合片段可抑制Nogo受体-1与配体间的结合。可以通过本领域内已知的方法例如ELISL、RIA或者功能性拮抗作用来测量这种抑制的IC50。在一些实施方案中，所述IC50为0.1-500nM，在一些实施方案中，所述IC50为10-400nM。在另一些实施方案中，所述抗体或者其部分的IC50为60-400nM。在结合试验中，测定的7E11和1H2的IC50分别为400nM和60nM。参见下文表3。
[0091]总之，在本发明的教导下，本领域技术人员能找到很多方法来改变本发明抗体的生物学特性，这些方法包括提高或者降低给定抗体分子的稳定性或半衰期、免疫原性、毒性、亲和力或产量的方法，或者以任何其它方式改变抗体使其更加适合于特定用途。
[0092]下文对含本发明所述抗体的组合物以及本发明所述抗体的用途进行描述
可溶性Nogo受体-1多肽
蛋白质
[0093]全长的Nogo受体-1由信号序列、N-末端区域(NT)、8个富含亮氨酸的重复单元(LRR)、LRRCT区(位于所述8个富含亮氨酸重复单元C末端的富含亮氨酸的重复结构域)、C-末端区(CT)和GPI锚定物组成(参见图1)。
[0094]本发明的一些实施方案提供了可溶性的Nogo受体-1多肽。本发明的可溶性Nogo受体-1多肽包含NT结构域、8个LRR和一个LRRCT结构域，但是没有信号序列和功能性的GPI锚定物(即没有GPI锚定物，或有一个但不能与细胞膜有效结合的GPI锚定物)。
[0095]在一些实施方案中，可溶性Nogo受体-1多肽包含异源的LRR。在一些实施方案中，可溶性Nogo受体-1多肽包含2，3，4，5，6，7或8个异源的LRR。异源LRR是指来自于除Nogo受体-1以外的另一蛋白的LRR。可以得到的获取异源LRR的蛋白质实例有toll-样受体(TLR1.2)；T-细胞活化富含亮氨酸重复单元蛋白；deceorim；OM-gp；胰岛素样生长因子结合蛋白酸性不稳定亚基slit和robo；以及toll-样受体4。
[0096]在一些实施方案中，本发明提供了319个氨基酸长的可溶性Nogo受体-1多肽(可溶性Nogo受体-1344，sNogoR1-344，或sNogoR344)(SEQ ID NO：6和8中的第26-344位残基或者SEQ ID NO：8的第27-344位残基)。在一些实施方案中，本发明提供了285氨基酸长的可溶性Nogo受体-1多肽(可溶性Nogo受体-1310，sNogoR1-310，或sNogoR310)(SEQ IDNO：7和9的第26-310位残基或者SEQ ID NO：9的第27-310位残基)。见图1。
表1.人和大鼠的Nogo受体-1多肽序列
  SEQ ID NO：6(人1-344)   MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA
  SEQ ID NO：7(人1-310)   MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCA
  SEQ ID NO：8(大鼠1-344)   MKRASSGGSRLPTWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSRPQQGLQAVPAGIPASSQRIFLHGNRISYVPAASFQSCRNLTILWLHSNALAGIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLRVVDPTTFRGLGHLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLVPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSGVPSNLPQRLAGRDLKRLATSDLEGCAVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA
  SEQ ID NO：9(大鼠1-310)   MKRASSGGSRLPTWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSRPQQGLQAVPAGIPASSQRIFLHGNRISYVPAASFQSCRNLTILWLHSNALAGIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLRVVDPTTFRGLGHLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLVPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSGVPSNLPQRLAGRDLKRLATSDLEGCA
[0097]在本发明的一些实施方案中，使用本发明的可溶性Nogo受体1多肽抑制配体与Nogo受体-1的结合，充当Nogo受体-1配体的拮抗剂。在本发明的一些实施方案中，使用本发明的可溶性Nogo受体-1多肽来降低对神经元内部神经突向外生长和出芽(例如轴突生长)的抑制，抑制髓鞘介导的神经元内的生长锥萎陷。在本发明的一些实施方案中，所述神经元是中枢神经系统神经元。
[0098]令人惊奇的是，sNogoR310和sNogoR344能够阻断NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp与Nogo受体-1间的结合。
[0099]在一些实施方案中，本发明的可溶性Nogo受体-1多肽是融合蛋白的组分，该融合蛋白还包括异源多肽。在一些实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白的恒定结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定结构域是重链恒定结构域。在一些实施方案中，所述异源多肽是Fc片段。在一些实施中，所述Fc与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽的C末端连接。在一些实施方案中，Nogo受体-1融合蛋白是一种二聚休。
本发明的核酸分子
[0100]本发明提供了编码本发明所述多肽的核酸，所述多肽包括SEQID NO：1-9、26-27、29-37和41-45中的任一多肽。在一些实施方案中，所述核酸编码的多肽选自：SEQ ID NO：6和8所示Nogo受体-1的第26-344位氨基酸残基，或SEQ ID NO：8所示Nogo受体-1的第27-344位氨基酸残基。在一些实施方案中，所述核酸分子编码的多肽选自：SEQ ID NO：7和9所示Nogo受体-1的第26-310位残基或SEQ ID NO：9所示Nogo受体-1的第27-310位残基。本申请所使用的“核酸”指的是基因组DNA、cDNA、mRNA和反义分子，以及以其它骨架为基础的核酸或者包括了天然来源或者合成的其它碱基。在一些实施方案中，所述核酸还包含转录启动子，以及任选的信号序列，它们都可操作地连接于编码本发明多肽的核苷酸序列。
[0101]在一些实施方案中，本发明提供编码本发明所述Nogo受体-1融合蛋白的核酸，包括含有选自下列的多肽的融合蛋白：SEQ ID NO：6和8所示Nogo受体-1的第26-344位氨基酸残基，或SEQ ID NO:8所示Nogo受体-1的第27-344位氨基酸残基；以及SEQ ID NO：7和9所示Nogo受体-1的第26-310位残基，或SEQ ID NO：9所示Nogo受体-1的第27-310位残基。在一些实施方案中，编码Nogo受体-1融合蛋白的核酸还包含转录启动子，以及任选的信号序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列还编码免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区是重链恒定区，在一些实施方案中，所述核苷酸序列还编码与绞链区相连的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，所述核酸还编码Fc。在一些实施方案中，所述Nogo受体-1融合蛋白包含Fc片段。
[0102]本发明的编码核酸还可以被进一步修饰使其包含用于诊断和探测目的的可检测标记物。在本领域内已知有多种这样的标记物，并且可以很容易地用于本申请描述的编码分子。适宜的标记物包括，但不限于，生物素、放射性标记核苷酸等，一个本领域技术人员可以运用本领域内任何已知的标记物得到标记的编码核酸分子。
组合物
[0103]在一些实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物包含选自下列序列的多肽：SEQ ID NO：1-5、26-27、29-37和41-45。
[0104]在一些实施方案中，本发明提供了组合物，它们包含本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，或者可溶性Nogo受体-1多肽或者融合蛋白。
[0105]在一些实施方案中，本发明可以含有适宜的药物学上可接受的载体，包括赋形剂和辅助物(auxiliaries)，它们的作用是促进活性化合物被加工成为可以被作为药物使用递送到作用位点的制剂。适宜的肠胃外给药制剂包括水溶形式活性化合物的水溶液，如可溶于水的盐。此外，还可以施用活性化合物的悬液，如适当的油性注射悬液。适宜的亲脂溶剂或赋形剂包括脂肪油，如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯。含水注射悬液可以含有增强悬液粘稠度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。任选地，所述悬液中还可以包含稳定剂。还可以使用脂质体包裹本发明所述分子用于向细胞内的递送。示例性的″药物可接受载体″是指任一及全部的溶剂、分散介质、包被物、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂、以及生理学相容物、水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等以及上述物质的组合。在一些实施方案中，组合物包含等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。在一些实施方案中，所述组合物包含药物上可接受的物质，例如润湿剂或者少量的辅助物，例如润湿剂、乳化剂，防腐剂或缓冲剂，这些物质延长了保存期或者提高了本发明所述抗体、抗原结合片段、可溶性Nogo受体或者融合蛋白的效力。
[0106]本发明所述的组合物可以多种形式存在，包括例如液态、半固态以及固态剂型，例如液态溶液(如可注射和可灌注的溶液)、分散系或悬液。优选的剂型取决于要采用的给药方式和治疗用途。在一些实施方案中，所述组合物的剂型是可注射和可灌输溶液，与用其它抗体对人进行被动免疫所用的组合物类似。
[0107]所述组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散系、脂质体或其它适于高药物浓度的规则结构。将抗-Nogo受体-1抗体按照要求加入所需量的适当溶剂(溶剂中含有以上列举成分中的一种或组合)中，过滤除菌，制备成为灭菌的注射用溶液。通常，将活性化合物加入灭菌载体制备分散系，该载体中含有碱性的分散介质，以及所需的上述其它成分)。就用于配制灭菌注射溶液用的灭菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冻干，得到活性成分和其它成分的粉末，这些成分均来自事先过滤除菌的溶液。可以通过下列方式保持溶液的合适流动性：让用包衣，例如卵磷脂；对于分散体而言，保持所需的粒径；以及使用表面活性剂。通过在组合物中加入延缓吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶来延长注射组合物的吸收。
[0108]在一些实施方案中，可以在配制活性化合物时加入能防止化合物迅速释放的载体，例如控制释放制剂，包括植入体、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的、生物亲和的多聚物，例如乙烯乙酸树腊、聚酸肝、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。许多制备这种制剂的方法已获专利保护并且通常已为本领域技术人员所知。参见例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
[0109]还可以在组合物中引入补充性的活性化合物。在一些实施方案中，本发明所述的Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段、或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白可以与一种或多种其它治疗剂共同配制和/或共同给药。
[0110]本发明的药物组合物可以含有″治疗有效量″或者″预防有效量″的本发明所述抗体、抗原结合片段、多肽或融合蛋白。″治疗有效量″是指在所需剂量和时间内能有效实现预期治疗效果的量。Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段、或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白的治疗有效量可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而有所不同。治疗有效量还指能确保所述抗体、抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽或者Nogo受体融合蛋白获得的治疗有益效果超过任何毒副作用的量。″预防有效量″是指在所需剂量和时间内有效实现预期预防效果的量，通常因为给对象使用预防剂量是在发病以前或者发病的早期，所以预防有效量要低于治疗有效量。
[0111]可以调整给药剂量以提供最佳的预期反应(例如治疗或预防反应)。例如可以快速灌注，或者一定时间内分剂量施用，或者可以治疗情况的迫切程度按比例减少或增加剂量。将肠胃外组合物配制为剂量单位形式是非常有利的，使药物的给服变得不费力。本申请使用的剂量单位形式的均一性是指适于作为治疗哺乳动物受试者单位剂量的物理学上的独立单位，每个单位含有经计算可产生预期治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明所述剂量单位形式的具体规格直接取决于(a)抗体、抗原结合片段、可溶性受体-1多肽或Nogo受体融合蛋白的独特性质以及需要达到的特定的治疗或预防效果，和(b)用于个体过敏反应(sensitivity)治疗时配合所述抗体、抗原结合片段、可溶性受体1多肽或Nogo受体融合蛋白的固有限制。在一些实施方案中，所述Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量范围是0.1-4mg/千克体重/天。在一些实施方案中，所述Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量范围是0.2-4mg每千元体重/天，在一些实施方案中，所述Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量范围是0.2mg每千元体重/天。
抗体、抗原、结合片段、可溶性抗体和融合蛋白的用途
[0112]在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的哺乳动物施用所述抗-Nogo受体-1抗体、该抗体的抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽或含所述多肽的融合蛋白，抑制Nogo受体-1活性的方法。
[0113]在一些实施方案中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，该方法包含下面的步骤：让Nogo受体-1与本发明所述抗体或抗原结合片段接触。在一些实施方案中，配体选自：NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。
[0114]在一些实施方案中，本发明提供了抑制神经元内生长锥萎陷的方法，该方法包含下述步骤：让神经元与本发明所述抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，本发明提供了降低对神经元内神经突向外生长或出芽抑制的方法，该方法包含下述步骤：让神经元与本发明所述抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，所述神经元是中枢神经系统神经元。在一些实施方案中，所述神经突向外生长或出芽是轴突生长。
[0115]在一些实施方案中，本发明提供了促进哺乳动物濒临死亡神经元存活的方法，该方法包含下述步骤：a)提供一种培养的宿主细胞，该细胞表达(i)抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，或(ii)可溶性Nogo受体-1多肽；以及(b)将宿主细胞引入哺乳动物神经元所在的位置或者其附近。Almudena Ramon-Cueto，M Isabel Cordero，Fernando F Santos-Benito andJesus Avila(2000)Functional recovery of paralegic rats and motor axonregneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells.Neuron25，425-435。
[0116]在一些实施方案中，本发明提供了促进哺乳动物濒临死亡神经元存活的基因治疗方法，该方法包含下述步骤：在神经元所在的位置或者其附近施用病毒载体，该载体包含编码(a)抗Nogo受体-1抗体或者其抗原结合片段；或(b)可溶性Nogo受体-1多肽的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受体-1抗体，抗原结合片段或可溶性Nogo受体-1多肽由乳动物体内的核苷酸序列表达，其表达量足以促进神经元的存活。病毒载体和这些方案可使用方法的描述见，例如Noel et al.，Human Gene Therapy，13，1483-93(2002)。
[0117]在一些实施方案中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，该方法包含下述步骤：让配体与本发明所述可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白接触。
[0118]在一些实施方案中，本发明提供了调节Nogo受体-1配体活性的方法，该方法包含下述步骤：让Nogo受体-1配体与本发明所述可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白接触。
[0119]在一些实施方案中，本发明提供了抑制神经元内生长锥萎陷的方法，该方法包含下述步骤：让Nogo受体-1配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或者Nogo受体-1融合蛋白接触。在一些实施方案中，本发明提供了降低神经元内神经突向外生长或出芽的抑制的方法，该方法包含下述步骤：让Nogo受体1配体与本发明的可溶性Nogo受体-1多肽或Nogo受体-1融合蛋白接触。在一些实施方案中，所述神经元是中枢神经系统神经元。在一些实施方案中，所述配体选自：NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。在一些实施方案中，所述的神经突向外生长或出芽是轴突生长。
[0120]在本申请描述的任一类型的抗体或者受体都可以用于治疗。在一些实施方案中，所述抗-Nogo受体-1抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类患者。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段施用于表达Nogo受体-1的非人哺乳动物(例如灵长类，树猴或恒河猴)，所述抗体与表达的Nogo受体-1发生交叉反应，用于兽医的目的或者作为人类疾病的动物模型。这种动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效果。
[0121]在一些实施方案中，施用抗-Nogo受体-1抗体或抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白，用于治疗脊髓损伤，促进损伤部位的轴突生长。
[0122]本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体或抗原结合片段，或可溶性Nogo受体-1多肽或融合蛋白可以单独提供，或者联合使用，或者与其它调节特定病理过程的药剂相继联合使用。例如，在中风之后可以同时给服抗炎药，以阻止进一步的神经元损伤和对轴突再生的抑制。在本申请中，所述Nogo受体-1抗体、抗原结合片段、可溶性Nogo受体1和Nogo受体融合蛋白，与一种或多种其它治疗剂联合使用，二者可以同时、连续或者单独施用。
[0123]本发明所述的抗-Nogo受体-1抗体，抗原结合片段，可溶性Nogo受体-1多肽、Nogo受体-1融合蛋白可以通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹腔、透皮、吸入或者口腔含化等途径给药。例如可以通过微灌输在损伤部位局部给药。通常的给药位置包括，但不限于，损伤导致的脊髓受损区域。给药剂量取决于年龄、健康状况、接受注射者的体重、同时进行的治疗的种类以及治疗频率(如果有的话)，预期效果的特性。
[0124]本发明所述化合物可以体内应用，一般用于哺乳动物，例如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠或者体外应用。
本发明的载体
[0125]在一些实施方案中，本发明提供了含有编码序列的重组DNA分子(rDNA)。本申请中，rDNA分子是指经过分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法在本领域内是众所周知的，例如参见Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning -A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press。在一些rDNA分子中，编码DNA序列可操作地连接于表达调控序列和载体序列。
[0126]在一些实施方案中，本发明提供了包含编码本发明多肽的核酸的载体，与本发明所述核酸可操作连接的载体和表达调控序列的选择，直接取决于所需的功能特性(例如蛋白表达，以及待转化的宿主细胞)，这是本领域内众所周知的。本发明所述载体至少可以指导复制或者向宿主染色体的插入，优选能够指导rDNA分子内包含的结构基因的表达。
[0127]用于调控可操作连接蛋白编码序列表达的表达调控元件是本领域内已知的，包括但不限于，诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其它调控元件。优选地，诱导型启动子是很容易控制的，例如对宿主细胞培养基内的营养物质产生应答。
[0128]在一个实施方案中，含有编码核酸分子的载体含有原核复制子，即一段DNA序列，它能够指导自我复制并且维持重组DNA分子位于被该DNA分子转化了的原核宿主细胞(例如细菌宿主细胞)的染色体之外，这种复制子在本领域内是众所周知的。此外，包含有原核复制子的载体还可以包含一种基因，该基因的表达使载体具有可检测或可筛选的标记，例如药物抗性，通常的细菌药物抗性基因是那些使载体具有氨苄青霉素或四环素抗性的基因，
[0129]包含原核复制子的载体还可以包含能够指导编码基因序列在细菌宿主细胞(如大肠杆菌)内表达(转录和翻译)的原核或细菌噬菌体启动子。启动子是由DNA序列组成的表达调控元件，它可以与RNA聚合酶结合并启动转录。与细菌宿主相容的启动子序列通常由质粒载体提供，该质粒载体含有适宜的限制性位点，可以方便插入本发明所述DNA片段。这种载体质粒的实例有pUC8，pUC9，pBR322和pBR329(Bio-RadLaboratories)，pPL和pKK223(Pharmacia)。任何适宜的原核宿主都可以用来表达编码本发明所述蛋白质的重组DNA分子。
[0130]另外还可以使用与真核细胞相容的表达载体，优选那些与脊椎动物细胞相容的载体，用于形成含编码序列的rDNA分子。真核细胞表达载体是本领域众所周知的，可以从许多商业来源获得。通常提供的这种载体含有适宜的限制性位点可以方便地插入目的DNA片段。这种载体的实例有pSVL and pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1，pML2d(InternationalBiotechnologies)，pTDTl(ATCC31255)以及其它真核表达载体。
[0131]用于构建本发明的rDNA分子的真核细胞表达载体还包括在真核细胞中有效的选择标记，优选药物抗性选择标记。优选的药物抗性标记是其表达产生新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸基转移酶(neo)基因，(Southern et al.，(1982)J.Mol.Anal.Genet.1，327一341)。或者选择标记物位于另外一个质粒上，两个载体通过共转染入宿主细胞，通过在针对所选标记物的合适药物中培养来筛选转染子。
[0132]为表达本发明所述的抗体或抗体部分，将编码部分或者全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，从而使该基因可操作地连接于转录和翻译调控序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、EBV衍生的附加体等。将抗体基因连入载体内，使载体内的转录和翻译序列行使它们预定的功能，调控抗体基因的转录和翻译。表达载体和表达调控序列的选择要与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入不同的载体中。在一些实施方案中，二者被插入同一表达载体中。使用常规方法(例如抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或者没有限制性位点时使用平端连接)将抗体基因插入到表达载体中。
[0133]便利的载体应编码功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，通过基因工程引入适当的限制性位点，这样可以很容易地插入和表达任一VH或VL序列，如前所述。在这种载体中，拼接通常发生在被插入的J区中的拼接供体位点和人C区之前的拼接受体位点之间，以及在人CH外显子的拼接区域内。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体也可以编码信号肽，信号肽有助于抗体链从宿主细胞中分泌出来。可以将抗体链基因克隆入载体，使得信号肽与抗体链基因的氨基端以正确的阅读框相连，信号肽可以是免疫球蛋白的信号肽或者异源信号驮(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0134]除了本发明所述免疫原性多肽、Nogo受体-1抗体、抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白之外，本发明的重组表达载体还携带有控制这些蛋白在宿主细胞内表达的调控序列。本领域的技术人员应该理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，取决于多种因素如选择的待转化宿主细胞，预期的蛋白质表达水平等等。对于哺乳动物宿主细胞表达，优选的调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如衍生自逆转录病毒长末端重复序列(LTR)的启动子和/或增强子、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40的启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒以及哺乳动物强启动子，如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调控元件的进一步描述及其序列，参见Stinski的美国专利5,168,062，Bell等人的美国专利4,510,245和Schaffner等人的美国专利4,968,615。
[0135]除了异源基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带其它序列，例如调控载体在宿主细胞内复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已经带有载体的宿主细胞(参见Axelet等人的美国专利例如4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，所述选择性标记基因通常能赋予已导入载体的宿主细胞药物抗性，例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞内氨甲喋呤的筛选/扩增)以及neo基因(用于G418筛选)。
重组制备本发明所述蛋白的宿主细胞和方法
[0136]编码本发明所述抗-Nogo受体-1抗体、免疫原性多肽、可溶性Nogo受体-1多肽、可溶性Nogo受体-1融合蛋白的核酸和包含这些核酸分子的载体可以用于转化适宜的宿主细胞。转化可以使用任何已知的向宿主细胞内引入多核苷酸的方法。向哺乳动物细胞内引入异源多核苷酸的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体包裹多核苷酸以及直接将DNA微注射入细胞核内。此外，还可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。
[0137]通过本领域众所周知的方法，用本发明的rDNA分子转化适当的细胞宿主，这些方法通常取决于所使用的载体类型和宿主系统。对于原核宿主细胞的转化，可以使用电穿孔和盐处理的方法(参见例如，Sambrook etal.，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press；Cohen et al.，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110-2114)。对于用含有rDNA的载体转化脊椎动物细胞，可以使用电穿孔、阳离子脂质或者盐处理的方法(参见例如Graham et al.，(1973)Virology52，456-467；Wigler et al.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1373-1376)。
[0138]可以通过众所周知的技术，包括对选择标记物的筛选，鉴定出成功转化后的细胞，即含有本发明所述rDNA分子的细胞。例如，可以对引入了本发明所述rDNA的细胞进行克隆，得到单细胞集落。收获这些集落，裂解并使用Southern，(1975)J.Mol.Biol.98，503-517描述的方法检查它们的DNA中是否存在所述rDNA，或者用免疫学方法对该细胞产生的蛋白质进行检测。
[0139]可作为表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域是众所周知的，包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系。这些细胞系包括，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO，SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞瘤细胞(例如Hep G2)，A549细胞和一系列其它细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来筛选特别优选的细胞系。其它可以使用的细胞系有昆虫细胞系，如Sf9细胞。当将编码本发明所述免疫原性多肽、Nogo受体-1抗体或抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体1融合蛋白的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足够长的时间来制备这些物质，该时间足以使所述抗体、多肽和融合蛋白能表达于所述宿主细胞，或者更优选，本发明所述免疫原性多肽、Nogo受体-1抗体或抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白能被分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以使用常规的蛋白质纯化方法从培养基中回收本发明所述的免疫原性多肽、Nogo受体-1抗体或抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白。
[0140]另外，可以使用一系列已知的技术提高本发明所述免疫原性多肽、Nogo受体-1抗体或抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和可溶性Nogo受体-1融合蛋白(或其的其它部分)在制备细胞系中的表达。例如谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些特定条件下提高表达的常用方法。GS系统在欧洲专利0216846，0256055，和0323997以及欧洲专利申请89303964.4中有完整或部分的讨论。
宿主细胞
[0141]本发明还提供了由核酸分子转化的宿主细胞，该核酸分子编码本发明所述Nogo受体-1抗体、抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和/或可溶性Nogo受体-1融合蛋白。宿主细胞可以是原核或者真核的。用于表达本发明蛋白质的真核细胞没有限制，只要该细胞系与细胞培养方法、与表达载体的扩增、与基因产物表达相兼容即可。优选的真核宿主细胞包括，但不限于，酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，例如来自小鼠、大鼠、猴或人的细胞系。有用的真核宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，该细胞系可以从ATCC获得，编号为CCL61；NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3，其ATCC编号为CRL1658；幼仓鼠肾细胞(BHK)，以及真核组织培养细胞系。
使用rDNA分子制备重组蛋白质
[0142]本发明还提供了使用本申请描述的核酸分子，制备本发明所述的Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段、可溶性Nogo受体-1多肽和/或可溶性Nogo受体-1融合蛋白的方法。通常，重组形式蛋白质的制备通常包括以下的步骤：
[0143]首先，获得编码本发明蛋白质的核酸分子。如果编码序列中没有内含子，则该编码序列可以直接用于任何宿主中的表达。
[0144]任选地，将所述核酸分子与适宜的调控序列可操作性地连接，如上所述，生成含所述蛋白质开放阅读框的表达单元。使用该表达单元转化合适的宿主，将转化后的宿主在允许重组蛋白质产生的条件下培养。任选地，从培养基或者从细胞中分离重组蛋白；在可以允许一些杂质存在条件下，可不必对该蛋白质进行回收和纯化。
[0145]上述每一步骤都可以通过多种方式完成。例如，所需的编码序列可以从基因组片段中获得，并且直接用于适当的宿立。利用适当的复制子和调控序列，完成多种宿主中可操作的表达载体的构建，如上所述。调控序列、表达载体和转化方法取决于用于表达基因的宿主细胞的类型，上文已有详细讨论。如果原来没有的话，可以在编码序列的两端添加适宜的限制性位点，从而得到一种可插入这些载体的可切割基因。本领域技术人员可以容易地对本领域已知的任一宿主/表达系统进行调整，与本发明所述核酸分子一起用于制备重组蛋白质。
[0146]为了更好的理解本发明，给出以下实施例。这些实施例的目的仅仅是举例说明，而不应该被理解为以任何方式对本发明的范围的限制。
实施例1
小鼠抗-Nogo受体-1单克隆抗体的制备
[0147]使用以下的方法和步骤制备与本发明所述免疫原性Nogo受体-1多肽特异性结合的抗-Nogo受体-1抗体。
免疫
[0148]使用两种免疫方式：
1.使用含有Nogo受体-1(NogoR-1)的COS-7细胞或细胞膜作为免疫原
[0149]将大鼠Nogo受体-1基因(GenBankTM登录号AF462390)克隆入含CMV启动子和药物筛选用的遗传霉素抗性基因的表达载体PEAG1256(Biogen)。使用Superfect(Qiagen)将重组质粒转染入COS-7细胞。使用遗传霉素(GibcoTM，2mg/ml)筛选转染子，克隆，然后通过FACS法验证Nogo受体-1蛋白在细胞表面的表达。按[Wang et al.，J.Neurochem.，75：1155-1161(2000)]描述的步骤制备COS-7细胞膜，两次漂洗，以1mg/ml(蛋白浓度)浓度保存于10％甘油中，-70℃储存。
[0150]用含50μg大鼠Nogo受体-1-COS-7细胞膜或表面表达Nogo受体-1的COS-7全细胞和50μlRIBI MPL+TDM+CWS佐剂(SigmaChemicalCO.，St.Louis，MO)的乳剂，通过腹膜内途径免疫8周龄的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序为每两周一次(Lipman et al.，1992)。分别在第一次免疫前、第二次免疫后7天、第三次免疫后7天和第三次免疫后38天采集免疫小鼠的血清，使用以下描述的ELISA测量抗-Nogo受体-1抗体的滴度。
2.用特异性Nogo受体-1多肽作为免疫原
[0151]使用Vector NtiTM软件对大鼠Nogo受体-1基因序列进行了抗原性分析(图2)。使用常用的戊二醛法将在分析中鉴定出的抗原性多肽与钥孔血兰蛋白(KLH)偶联，
[0152]使用含50μgKLH偶联多肽及50μl完全弗氏佐剂(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的乳剂通过腹腔内途径免疫8周龄的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序为每两周一次。分别在第一次免疫前、第二次免疫后一周、第三次免疫后一周天采集免疫小鼠的血清，测量抗-Nogo受体-1抗体的滴度。第三次免疫以后加强免疫一次。这次加强免疫后三天，开始融合实验。
杂交瘤的制备和筛选
[0153]采自经Nogo受体-1抗原性多肽免疫后小鼠的血清用ELISA筛选，而采自经表达Nogo受体-1的COS-7细胞免疫后小鼠的血清用流式细胞仪筛选。使用流式细胞仪鉴别出产生特异性结合Nogo受体-1-COS-7细胞的抗体的小鼠，宰杀。此前描述方法(Kennett et al.，1993.MonoclonalAntibodies：A New Dimension in Biological Analysis.Plenum Press，NewYork)，分离脾细胞并与FL653骨髓瘤(Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠骨髓瘤的APRT衍生物，维持液是含有10％胎牛血清、4500mg/升葡萄糖、4mML-谷氨酰胺和20mg/ml8-氮鸟嘌呤的DMEM)融合，将获得的融合细胞接种在24孔或48孔细胞培养板(Corning Glass Works，Corning，NY)中，培养基中添加腺嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(AAT)。通过ELISA或流式仪，筛选出可与Nogo受体-1-COS-7细胞或与Nogo受体-1抗原性多肽结合的AAT抗性培养物，如下描述。阳性孔中的细胞通过有限稀释法进一步亚克隆。
[0154]为了筛选与Nogo受体-1抗原性多肽结合的抗体，将用作免疫原的肽与BSA偶联。向96孔MaxiSorpTM  细胞培养板(NuncTM)的每一孔中加入50μl含0.5mg偶联多肽的0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH9.0。然后，将该平板在37℃孵育1小时或者4℃孵育16小时，用含0.1％BSA、0.1％卵清蛋白，0.1％blotto和0.001％叠氮化物的25mM HEPES，pH7.4封闭液封闭非特异性位点，加入杂交瘤上清，在25℃孵育1小时。使用PBS漂洗三次之后，在每一孔中加入50μl1∶10000稀释后的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Inc.)，继续孵育1小时。漂洗两次后，使用TMB (Pierce)显色，然后用2M硫酸中止显色，使用分光光度计测量450nm处颜色浓度。
[0155]使用以下方法筛选可与全长Nogo受体-1结合的抗体。根据销售商提供的方法，使用0.1μM Cell TrackerTM Green CMFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)标记COS-7细胞。在用抗Nogo受体-1待测血清孵育之前，将Cell TrackerTM标记的对照细胞与漂洗过的Nogo受体-1-COS-7细胞等体积混和。取50μl细胞混合物均匀分散至96孔V型底聚苯乙烯板(Costar3877，Corning，NY)的每一孔中，加入100μl的杂交瘤上清或对照用抗Nogo受体-1抗体，在4℃孵育半小时后，漂洗细胞，加入溶于50μlPBS的R-藻红蛋白偶联的亲和纯F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG Fcγ特异性二抗(1∶200稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratory，West Grove，PA)。在孵育结束时，使用PBS漂洗细胞两次，用含有1％胎牛血清的200μlPBS重悬细胞，进行FACS分析。或者，将Nogo受体1-COS-7细胞与杂交瘤上清混和，然后使用R-藻红蛋白偶联的山羊抗小鼠二抗处理，之后直接进行常规FACS分析。
[0156]我们使用多种不同的免疫原制备了25种抗-Nogo受体-1抗体。我们使用对应于大鼠Nogo受体-1第110-125位残基的多肽序列作为免疫原，制备了两种抗体，7E11和5B10。我们使用从经全长大鼠Nogo受体-1转染后COS7细胞制备的细胞膜作为免疫原，制备了3种抗体，1H2、3G5和2F7。我们使用sNogoR310-Fc作为免疫原，制备了13种抗体(1D9.3、1E4.7、1B4.3、2C4.3、1F10.3、2H1.4、1H3.3、1G4.1、1E4.1、2G7.1、2C4.1、2F11.1、和1H4.1)，使用与大鼠Nogo受体-1第423-434位残基对应的多肽序列作为免疫原，制备了7种抗体(2E8.1，2G11.2，和1B5.1)。
单克隆抗体7E11和5B10的序列分析
[0157]我们使用QiagenRNeasymini试剂盒提取了总RNA，并且从分离的RNA得到cDNA。我们使用引物5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′(SEQ ID NO：12)和5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(SEQ ID NO：25)，PCR扩增出轻链的序列；我们使用引物5′-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3′(SEQ ID NO：13)和5′-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3′(SEQ ID NO：14)，PCR扩增出重链的序列。这些引物包含下列简并核苷酸：S代表G或C；M代表A或C，R代表G或A；W代表A或T；K代表G或T；以及Y代表T或C。我们将PCR片段克隆入测序载体中，利用双脱氧终止法，使用测序载体特异引物测定了CDR区的DNA序列。我们从理论上翻译了该DNA序列，单克隆抗体7E11和5B10的重链及轻链CDR区的部分氨基酸序列显示于表2。表2中，下划线部分为来自单克隆抗体重链和轻链的三个CDR区。7E11和5B10的轻链间具有94％的氨基酸序列同一性，重链间具有91％的氨基酸序列同一性。单克隆抗体7E11、5B10和1H2是IgG1同种型，单克隆抗体3G5和2F7是IgG2a同种型。这5种单克隆抗体都具有κ同种型轻链。我还用这种方法对其它单克隆抗体进行了分析。
表2单抗7E11和5B10的氨基酸序列
  序列   SEQIDNO：
  7E11轻链   MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFC SQSTHVPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSISHH   15
  5B10轻链   MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQSLVHSNGYTYLHWYLQRPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVDAEDLGVYFC SQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSISHH   16
  7E11重链   VQLQESGAELVMPGASVKMSCKASGYTFT DYWMHWVKQRPGQGLEWIG AIDPSDSYSSYNQNFKGKATLTVDGSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR RITEAGAWFAYWGQGTTVT   17
  5B10重链   LQXSGAEIVMPGTAVTMSCKASGYTFT DFWMHWVKQRPGQGLEWIG AIDPSDSYSRINQKFKGKATLTVDESSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR RITEAGAWFAYWGQGTTVT   18
单克隆抗体7E11的表位图谱
[0158]Mab 7E11与大鼠及人的NgR1都能结合。为了测定对负责7E11结合的表位进行检测，我们制备了大鼠NgR1的片段及合成肽，测试了它们与7E11间的结合情况。
[0159]将含全部8个LRR结构域和N-及C-末端帽子(sNgR310)的重组大鼠NgR1片段，用酸或溴化氰(CNBr)处理，然后通过凝胶电泳分离出该片段。未经处理的sNgR310迁移的表观分子量为42kDa。酸处理sNgR310得到两种主要切割产物，15kDa(aa 27-aa 122)和30kDa(aa 123-aa 310)。CNBr处理得到三种片段，33/35kDa双带(aa 27-aa 229)，可能是异源糖基化片段，10kDa产物(aa 241-aa 310)，以及11个氨基酸残基的片段(aa230-aa 240)，这个片段没有停留在凝胶上。用7E11对凝胶的western印迹进行探测，结果显示它可与完整大鼠NgR1(aa 27-aa 310)、15kDa的酸处理片段(aa 27-aa 122)以及35kDa的CNBr处理片段(aa 27-aa 229)结合。7E11不能结合30kD的酸处理片段(aa 123-aa 310)或10kDa CNBr处理片段(aa241-aa 310)。15kDa酸处理片段和35kDa CNBr处理片段都包含序列LDLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO：1)，这一点与7E11结合NgR1上的单个表位相一致。
[0160]通过测试sNgR310的胰蛋白酶消化产物肽，对7E11结合位点作了进一步分析。HPLC分析显示数个片段，这表明在NgR1序列中存在着数个胰蛋白酶-敏感的赖氨酸及精氨酸残基。7E11只与一种胰蛋白酶消化产物肽结合，这为7E11结合NgR1上的单个表位提供了证据。随后的质谱分析(MS)和序列分析鉴定这种被结合的肽为AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO：26)。
[0161]对肽LDLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO：1)进行进一步图谱分析。该肽经胰蛋白酶消化后，产生两种主要片段LDLSDNAQLR(SEQ IDNO：27)和VVDPTT(SEQ ID NO：28)，然后对7E11与它们结合的能力进行了测试。MS分析表明该抗体结合的肽为LDLSDNAQLR(SEQ ID NO：27)，因此，这种肽含有7E11的结合表位。在这种肽级分内，详细的MS分析鉴定出几种乱序的肽，它们也能与7E11结合，包括在Asn115和Gln117上脱氨基的肽，在112或113位上添加了丙氨酸的肽，或者在114位上添加了丝氨酸的肽(表3)。这些数据表明：位于这种肽片段上的几个残基对于7E11结合不是关键性的。
表3.被7E11结合的肽变体
  被结合肽   氨基酸序列
脱氨基的野生型片段   LDLSDNAQLR    (SEQ ID NO：27)LDLSDDAELR    (SEQ ID NO：29)
脱氨基的乱序的片段#1   LDLASDNAQLR   (SEQ ID NO：30)LDLASDDAELR   (SEQ ID NO：31)
脱氨基的乱序的片段#2   LDALSDNAQLR   (SEQ ID NO：32)LDALSDDAELR   (SEQ ID NO：33)
脱氨基的乱序的片段#3   LDLSSDNAQLR   (SEQ ID NO：34)LDLSSDEAELR   (SEQ ID NO：35)
[0162]另外，还对肽LDLSDNAQLRVVDPTT进行了内切蛋白酶Asp-N消化，并测试了与7E11的结合情况。内切蛋白酶Asp-N将这种肽切割为3种肽片段，L、DLS和DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO：36)。这些产物中，7E11能与肽DNAQLRVVDPTT结合。综合考虑，胰蛋白酶和Asp-N切割数据进一步将7E11结合表位定位为它们之间共有序列上DNAQLR(SEQID NO：37)。
[0163]对来自不同物种的NgR1、NgR2和NgR3的氨基酸序列进行分析，7E11结合大鼠及人的NgR1但不结合小鼠NgR1、人NgR2或小鼠NgR3的观察结果，推测7E11结合表位中的关键残基。序列对齐结果表明大鼠NgR1的第110-125位与人NgR1相应序列完全相同，小鼠NgR1序列仅有第119位上的一个氨基酸不同(大鼠和人NgR1中为Arg119，小鼠NgR1中为His119；表4)。
表4.来自不同物种的NgR间的序列对齐
  蛋白质   第110-119位序列  SEQ ID NO：
  大鼠和人NgR1   LDLSDNAQLR   27
  小鼠NgR1   LDLSDNAQLH   38
  大鼠和人NgR2   LDLGDNRHLR   39
  大鼠，人和小鼠NgR3   LDLGDNRQLR   40
[0164]NgR1上的Arg119在7E11结合中发挥作用，因为它能很好地结合大鼠和人的NgR1但几乎不与小鼠NgR1结合。类似地，由于7E11不能很好地结合NgR3，所以Ala116参与了该表位的构成，这是因为在DNAQLR序列(SEQ ID NO：38)内，NgR3与NgR1之间的差别仅在于在相应序列上为精氨酸。在DNAQLR序列内，NgR2的6个残基中的4个与大鼠NgR1相同。Ala116和Gln117被分别取代为精氨酸和组氨酸。该结果证实了Ala116是在7E11结合中发挥作用的重要氨基酸残基，但是并不排除Gln117的参与。
[0165]为了验证这些接触位点，制备了几种包含LDLSDNAQLR肽(SEQ ID NO：27)内点突变的肽，测试与7E11间的结合情况。将所述肽固定在MaxiSorpTM平板(NuncTM)上，加入系列稀释后的7E11。得到的EC50值列于表5。7E11与变体Leu110Ala和Asp111Ala结合，这些变体具有与原始肽近似的EC50值。对Gln117Ala进行测试时，EC50提高了30-倍，对Arg119His进行测试时，EC50提高了25-倍。当Arg119突变为丙氨酸时，观察到EC50变化最为显著。
表5.7E11可与具有不同EC50的肽变体结合
肽内变化 序列   EC50   SEQ IDNO：
  无变化   LDLSDNAQLRVVDPTT   0.55   1
  L110A   ADLSDNAQLRVVDPTT   0.62   41
  D111A   L ALSDNAQLRVVDPTT   0.31   42
  Q117A   LDLSDNA ALRVVDPTT   16   43
  R119H   LDLSDNAQL HVVDPTT   12   44
  R119A   LDLSDNAQL AWDPTT   88   45
[0166]另外还在新近测定的晶体结构中，对7E11结合表位的位置进行了测定。正如所料，该结构表明7E11表位暴露于分子表面。残基Arg119、Gln117、Ala116和Asp114突出于该结构之外，而Leu118和Asn115位于该结构之内。该表位落到该结构凹表面内的酸性区域的上部，碱性表面正对着其中的一个侧面。
用单克隆抗-Nogo受体-1抗体抑制配体与可溶性Nogo受体-1间的结合
[0167]对用上述方法制得的抗-Nogo受体-1单克隆抗体进行测试，测定其是否能抑制配体与Nogo受体-1间的结合。
[0168]按下述方法制备包含大鼠Nogo受体-1第26-344位氨基酸残基和大鼠IgG1分子的铰链区及Fc区的可溶性Nogo受体-1融合蛋白(sNogoR344-Fc)，取0.5μg固定于250μg偶联了蛋白-A或wheatgermagglutinin的SPA微珠(Amersham Pharmacia Biotech)，25℃作用2小时。向每一加样孔加入50μgl HEPES-缓冲的孵育介质(10mM HEPES，pH 7.4，0.1％牛血清白蛋白，0.1％卵白蛋白，2mM MgCl2，2mM CaCl2和蛋白酶抑制剂)，其中含偶联了Fc-sNogoR-1、抗-Nogo受体-1mAb及1μl125I-Nogo66的SPA微珠(Amersham，2000Ci/mmol，1nM)。16小时后，使用TopCount(Packard)一式四份测定放射性强度。从曲线拟合分析中计算出IC50值(图3)(PRISM，GraphPad Software，NJ)。一些实施方案中，我们还使用AP-配体偶联物(例如，AP-Nogo66)，通过监测丙氨酸磷酸酶活性检测结合情况。我们还对mAbs阻断配体MAG-Fc及AP-OM-gp与Nogo-受体-1间结合的能力进行了测试。
[0169]单克隆抗体7E11、5B10、1H2、3G5和2F7都能抑制Nogo66、MAG和OM-gp与sNogoR344-Fc间的结合。Nogo66与7E11和1H2计算得的IC50值分别为400nM和60nM。用ELISA对mAb-介导抑制这三种配体与Nogo受体-1间结合情况进行监测，得到的数据概括于表6。
表6.能抑制Nogo66、MAG和OM-gp与Nogo受体-1间结合的单克隆抗体
  mAb   MAG+sNogoR344-Fc   Nogo66+sNogoR344-Fc   OM-gp+sNogoR344-Fc
  7E11   30nM(60％)EC50＝0.5μM   EC50＝1.7μM   EC50＝150nM
  1H2   30nM(60％)   ND   ND
  3G5   30nM(60％)   EC50＝9nM   ND
  2F7   30nM(55％)   EC50＝10nM   EC50＝5nM
  1D9.3   30nM(70％)EC50＝2.7nM   EC50＝13nM   EC50＝5.2nM
  2G7.1   30nM(84％)   EC50＝18nM   EC50＝1nM
  1E4.1   30nM(75％)EC50＝2.8nM   -   EC50＝9.1nM
  1G4.1   30nM(90％)EC50＝9.9nM   -   EC50＝8.2nM
  2C4.1   30nM(50％)   -   ND
  2F11.1   30nM(45％)   ND   ND
  1H4.1   -   ND   ND
  2E8.1   30nM(87％)EC50＝9.2nM   EC50＝1.5nM   EC50＝42.9nM
  2G11.2   30nM(80％)   ND   ND
  1B5.1   30nM(0％)   ND   ND
显示的取代百分比是在30nM抗体时的，用所述曲线拟合分析测定某些单克隆抗体的EC50。“-”表示无可检测活性，“ND”表示未检测。
实施例2
Fab-噬菌体抗-Nogo受体-1抗体的制备
[0170]与本发明所述免疫原性Nogo受体-1多肽特异性结合的抗-Nogo受体-1Fab-噬菌体抗体，也是通过如下筛选Fab-噬菌体文库制备的。
[0171]使用重组大鼠可溶性sNogoR310-Fc蛋白和表达大鼠Nogo受体-1的COS7细胞筛选MorphoSys Fab-噬菌体文库HuCALGOLD，纯化和鉴定出与Nogo受体-1特异性结合的Fab-噬菌体。14D5的重链衍生自VH2基因，其轻链衍生自VK1基因。这些Fab-噬菌体中的一个，14D5，其重链和轻链的CDR的氨基酸序列示于表7。
表7.14D5的CDR的氨基酸序列
  氨基酸序列  SEQ ID NO：
  重链CDR1   GFSLSTSGGSVG   19
  重链CDR2   LIYSNDTKYYSTSLKT   20
  重链CDR3   SRFWTGEYDV   21
  轻链CDR1   RASQNIAITLN   22
  轻链CDR2   LASSLQS   23
  轻链CDR3   QQYDNYPL   24
[0172]14D5的单价和二价两种形式都能与大鼠Nogo受体-1结合。此外，14D5还与小鼠和人的Nogo受体-1以及人的Nogo受体-2结合，但是不与小鼠的Nogo受体-3结合。
实施例3
用抗-Nogo受体-1单克隆抗体免疫沉淀Nogo受体1。
[0173]为了进行免疫沉淀，在分别有30μl蛋白A或G和1-2μg抗体存在情况下，将100μl裂解的细胞或者50μl PiPLC处理的细胞分别与400或450μl的提取缓冲液[10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.5％Tween-20TM，0.2mMPMSF]或者RIPA缓冲液混合。将混合物置于振荡器中，在4℃孵育16小时。
[0174]轻轻离心样品使偶联蛋白A或G的微珠沉淀，洗涤微珠两次，每次用1ml洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.1％Tween-20)。最后一次用10％体积的初始洗涤缓冲液洗涤。
[0175]将微珠重悬于100μl含10％β-巯基乙醇的2x SDS上样缓冲液。样品在室温下孵育，然后在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE凝胶电泳。SDS-PAGE凝胶电泳的结果显示，单克隆抗体3G5和2F7可以免疫沉淀Nogo受体-1。
实施例4
ELISA测定抗体特异性
[0176]为了测定实施例1和2中制备的单克隆抗体和Fab-噬菌体抗体的特异性，我们使用了一组Nogo受体-1多肽进行ELISA实验。该组多肽由以下多肽组成：sNogoR310-Fc(包含大鼠Nogo受体-1的26-310位氨基酸和大鼠Fc片段的融合蛋白)、sNogoR344-Fc(见上文)，多肽p-617(SBQ IDNO：1)，多肽p-618(来自大鼠Nogo受体-1LRR7区的19个氨基酸的多肽；图2；SEQ ID NO：11)和多肽p-4及p-5(分别来自Nogo受体-1的LRR5和LRRCT区的多肽)。使用卵清蛋白和BSA作为对照。如图4所示，单克隆抗体1H2、3G5和2F7都能与sNogoR344-Fc特异性结合。在类似的实验中，那些抗体还能与由大鼠Nogo受体-1(SEQ ID NO：3)的310-344个氨基酸残基组成的多肽特异性结合，单抗7E11和5B10与多肽p-617(SEQ ID NO：1)特异性结合。
[0177]sNogoR310-Fc免疫制备抗体中的10种抗体(1D9.3，1E4.7，1B4.3，2C4.3，1F10.3，2H1.4，1H3.3，1G4.1，1E4.1，和2G7.1)在结合方面可以互相替代，表明它们识别sNogoR310上的相似或重叠的抗原表位。另外三种sNogoR310-Fc免疫制得的抗体(2C4.1，2F 11.1，和1H4.1)识别位于26-310位氨基酸残基上的不同表位。
[0178]我们还使用Fab-噬菌体14D5进行了ELISA结合实验。让配体AP-Nogo66，AP-OM-gp和MAG-Fc与固定化的sNogoR344-Fc结合，1μM的14D5完全抑制了Nogo与MAG间的结合。完全抑制OM-gp与sNogoR344-Fc间的结合则需要10μM的14D5。
实施例5
神经突向外生长实验
[0179]为了检测上面产生的单抗和Fab-噬菌体抗体在减轻CNS髓鞘对神经元抑制方面的能力，用0.1mg/ml多聚-D-赖氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培养用载玻片(4孔)。将CNS髓鞘或PBS按每滴3μl滴样。在髓鞘或PBS中加入荧光微球(Polysciences)，用于后面步骤中的液滴鉴定(Grandpreet al，Nature 4032000)。然后润洗Lab-Tek载片，用10μg/ml的层粘连蛋白(GibcoTM)包被，用1mg/ml的1型胶原酶(Worthington)解离P3-4SPrague Dawley大鼠幼仔的背根神经节(DRG′s)，用火-磨光的巴氏吸管吹打，为增加神经元细胞预铺板，最终以23000个细胞/孔的密度接种到事先包被好的Lab-Tek培养载片中。培养基是含有5％热灭活供体马血清、5％热灭活胎牛血清和50ng/ml小鼠神经生长因子的F12，在37℃和5％CO2条件下孵育6小时。铺板后立即加入15μg/ml的单抗7E11。
[0180]使用含20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定载玻片20分钟，用经1∶500稀释后的抗β-III-微管蛋白抗体(CoVance TUJ1)染色。将二抗抗-小鼠Alexa Fluor594(Molecular Probes)作1∶300倍稀释，然后用Gel/MountTM(BiemedaTM)覆盖载玻片，使用OpenLabTM软件获得放大5倍的数码图像，并使用MetaMorph软件对神经突向外生长进行定量分析。
[0181]单抗7E11保护DRG神经元免遭髓磷质介导的对神经突向外生长的抑制。用单抗1H2和3G5观察到了类似的结果。
[0182]在神经突向外生长保护实验中，将大鼠的P7DRG神经元培养在CNS髓磷质基质上，二价的14D5也能有效促进神经突的生长。
实施例6
在转染了Nogo受体-1的细胞上用7E11进行免疫组织化学分析
[0183]为了进一步鉴定实施例1中描述制备的抗-Nogo受体-1单抗的结合特性，我们对其与固定的或者活的表达大鼠或人Nogo受体-1的COS-7细胞或293细胞间结合的结合情况进行了对比。
固定了的细胞
[0184]将经过和未经过Nogo受体-1转染的细胞接种于8孔Lab-Tek培养载玻片上，用4％多聚甲醛固定15分钟，用含有10％正常山羊血清和0.1％Triton X-100的PBS封闭1小时。在封闭液中加入15μg/ml和1.5μg/ml的单抗7E11室温孵育2小时；用封闭液1∶300稀释Alexa-偶联的抗小鼠二抗(Molecular Probes)，孵育1小时。在二抗中加入5μg/ml的DAPI，以标记所有的细胞核。
活的细胞
[0185]将经过和未经过Nogo受体-1转染的细胞接种于8孔的Lab-Tek培养载玻片，用FACS缓冲液(含有4％供体马血清)4℃封闭30分钟，用含15μg/ml和1.5μg/ml 7E11的FACS缓冲液，4℃孵育1小时，润洗后，用二抗抗-小鼠-Alexa(用FACS缓冲液1∶300稀释后的)，4℃孵育30分钟。
[0186]免疫组织化学染色实验证明了所有的单抗都与表达大鼠Nogo受体-1的细胞结合。单抗7E11，2G7.1和2C4.1与表达人Nogo受体-1的固定细胞和活细胞都能结合。
实施例7
脊髓挫伤小鼠模型
[0187]为了检测实施例1中制备的抗-Nogo受体-1单抗对神经元的体内作用，我们使用一个脊髓挫伤小鼠模型。
[0188]用止痛剂和抗生素药剂预防性地处理雌性小鼠(18-22克体重)。麻醉小鼠，将其置于立体定位仪中，在立体显微镜下固定脊柱。使用重物-下落打击法(M.Li et al.，Functional role and therapeutic implications ofneuronal caspase-1and-3in a mouse model of traumatic spinal cord injury.Neuroscience Vol.99，pp.333-342，2000)的改良方法致脊髓损伤。
[0189]简而言之，实施T9和T10椎板切除术，用一对小鼠横夹固定脊柱，从两旁支撑T9和T10的横切作用。将直径为1.4mm、重量为2克的不锈钢冲击棒至于硬脊膜上方2.5厘米处，且向下落在脊髓的T10节段上。在手术中将小鼠至于37℃保温的毯子上，且术后每只小鼠均皮下注射1ml热的灭菌盐水以防止脱水，每天一次人工将膀胱内的尿液挤出，直至对膀胱的反射控制恢复。
[0190]所有动物术后每8-12小时麻醉止痛一次，术后每天接受两次抗生素治疗连续7天。在研究过程中动物可以自由摄食和饮水。通过髓鞘内注射将抗-Nogo受体-1抗体递送至损伤部位，连续28天，见下面描述的大鼠脊髓横切模型。
实施例8
可溶性Nogo受体-1融合蛋白的特性
[0191]为了研究可溶性Nogo受体-1多肽(sNogoR-1)和融合蛋白(Fc-sNogoR-1)的特性，我们进行了下面的实验。
[0192]将3μg的可溶性Nogo受体(sNogoR310-Fc和sNogoR344-Fc)固定在250μg的WGA-SPA微珠上，加入0.5μL的放射性配体(终浓度为0.5nM)，终体积为100μl结合缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4，2mM Ca，2mM Mg，0.1％BSA，0.1％卵清蛋白和蛋白酶抑制剂)。配体包括10μM Nogo66，10μM125I-Nogo40(NogoA的1-40位氨基酸)，对每一配体组用10μl抗Nogo受体-1抗体的上清。Nogo40上的三个酪氨酸分别作碘标记，分别命名为Nogo40-A、-B和-C。三份平行样的平均值用标准化的结合放射性百分比表示(图6、7和8)。误差柱表示的是平均标准误差(SEM)。在数据标准化时，将没有抑制剂时的结合放射性作为100％，而将在10μM Nogo40存在时的最低结合放射性作为0％。
实施例9
对配体与可溶性Nogo受体-1融合蛋白间结合的抑制
[0193]使用与实施例8中的结合实验类似的结合实验，检测实施例1中制备的两种单抗抑制125I-Nogo66与sNogoR344-Fc间结合的能力。单抗2F7和3G5抑制了125I-Nogo66与sNogoR344-Fc之间的结合。
实施例10
神经突向外生长实验
[0194]用0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培养载玻片(4孔)，将CNS髓鞘或其与sNogoR310混合物、与sNogoR310-Fc融合蛋白混合物、与单抗5B10混合物或与对照PBS混合物，按每滴3μl分别点样于载玻片上，在髓鞘或PBS中加入荧光微球(Polysciences)，用于后面步骤中的液滴鉴定(Grandpre et al，Nature 403，2000)。然后润洗Lab-Tek载片，用10μg/ml的层粘连蛋白(GibcoTM)包被。
[0195]用1mg/ml的1型胶原酶(Worthington)解离P3-4SPrague Dawley大鼠幼仔的背根神经节(DRG′s)，用火-磨光的巴氏吸管吹打，为增加神经元细胞预铺板，最终以23000个细胞/孔的密度接种到事先包被好的Lab-Tek培养载片中。培养基是含有5％热灭活供体马血清、5％热灭活胎牛血清和50ng/ml小鼠神经生长因子的F12，在37℃和5％CO2条件下孵育6小时。
[0196]使用含20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定载玻片20分钟，用经1∶500稀释后的抗β-III-微管蛋白抗体(CoVance TUJ1)染色。将二抗抗-小鼠Alexa Fluor594(Molecular Probes)作1∶300倍稀释，然后用Gel/MountTM(BiemedaTM)覆盖载玻片，使用OpenLabTM软件获得放大5倍的数码图像，并使用MetaMorph软件对神经突向外生长进行定量分析。
[0197]sNogoR310，sNogoR310-Fc和单抗5B10都能保护DRG神经元免遭髓鞘质介导的对神经突向外生长的抑制(图9-11)。在一个类似的使用鸡神经元的实验中，发现sNogo310有保护效果。
[0198]另外我们还通过在有或无层粘连蛋白存在情况下的细胞生长试验，对可溶性Nogo受体的神经元保护作用进行了测试。在没有层粘连蛋白的培养基中神经元细胞生长得很不好，模拟了神经元的应激生长条件(stresscondition)。
[0199]从出生后6-7天的大鼠幼仔(P6-7)中分离出背根神经节，解离为单个细胞，平铺到预先用多聚-D-赖氨酸包被过的96孔培养板，如上所述。向一些孔中加入2μg/ml的层粘连蛋白孵育2-3小时，冲洗后铺入细胞。孵育18-20小时后，培养板用4％的多聚甲醛固定，用经1∶500稀释过的兔抗β-III-微管蛋白抗体(Covance)和经1∶100稀释过的抗-Huc/D(MolecularProbes)染色，加入1∶200稀释的荧光二抗(Molecular Probes)。使用ArrayscanII(Cellomics)获得放大5倍的数码图像，通过使用神经突向外生长应用，将神经突向外生长定量为平均神经突向外生长/神经元/孔。对从每一条件下3个孔得到的9张5倍图像进行了分析。
[0200]在一些实验中，使用了PC12细胞(NeuroscreenTM)的亚克隆(cellomics)。所述NeuroscreenTM细胞用200ng/ml的神经生长因子预分化7天，脱壁并重新接种到事先用多聚-D-赖氨酸包被的96孔培养板中。向一些孔中加入5μg/ml的层粘连蛋白孵育2-3小时，冲洗后铺入细胞。孵育2天后，培养板用4％的多聚甲醛固定，用经1∶500稀释过的兔抗β-III-微管蛋白抗体(Covance)和Hoechst(细胞核染色)染色。使用ArrayscanII对神经突向外生长进行定量，如在DRG细胞中一样。
[0201]在进行细胞铺板时，将sNogoR344-Fc或大鼠IgG以溶液形式添加至P6-7DRG神经元和分化后的NeuroscreenTM细胞。
[0202]当P6DRG神经元培养于无层粘连蛋白条件下时，观察到1μM和10μM的sNogoR344-Fc具有神经元保护作用。神经突向外生长的定量实验显示，随着sNogoR344-Fc的加入，神经突向外生长呈现出剂量依赖性增长。向生长在层粘连蛋白基质中的DRG神经元中加入相同浓度的sNogoR344-Fc，不产生任何异常结果，这表明sNogoR344-Fc只是在受应激的细胞中才有活性。对于NeuroscreenTM细胞，没有层粘连蛋白时，相同浓度的sNogoR344-Fc也具有神经元保护作用。
实施例11
Fc-sNogoR-1融合蛋白的制备和纯化
[0203]将编码大鼠Nogo受体-1的1-310位氨基酸的cDNA构建体与位于哺乳动物表达载体中的大鼠IgG1Fc融合，用电穿孔将该载体转入中国仓鼠卵巢(CHO)(DG44)细胞。该细胞在含有10％透析过的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素及抗霉菌剂的α-MEM培养基中维持。转染后两天，收获条件培养基，在还原条件下用蛋白印迹分析。使用多克隆兔抗-Nogo受体-1抗体检测到一个约60KD的蛋白条带。使用偶联有R-PE的山羊抗大鼠IgG抗体对细胞进行扩增和分选。在第二次分选后，将细胞平板到96孔培养板中，平板密度为每孔一个细胞。使用夹心ELISA检测和比较每一个孔中分泌出的可溶性Nogo受体-1蛋白水平，用山羊抗大鼠IgG Fcκ特异性抗体包被ELISA平板。加入条件培养基。用偶联有HRP的驴抗大鼠IgG Fab、Fc-特异性抗体对结合后的可溶性Nogo受体-1蛋白进行检测。克隆4C12具有最高的分泌水平。4C12在旋转培养瓶中的CHO-M7培养基中扩增和生长。37℃时的分泌水平约为10mg/L。
[0204]大规模培养表达sNogoR310-Fc融合蛋白的CHO细胞。从10L的生物反应器获得1.7L浓缩的条件培养基。加入1/10体积的pH8.9的1.0MTris-HCl调高pH值。加入固态氯化钠和甘氨酸至浓度分别为3.0M和1.5M。准备60mL蛋白A-SepharoseTM层析柱，用10mM Tris-HCl，3M NaCl，1.5M甘氨酸，pH8.9平衡。将上述浓缩条件培养基上柱，使用蠕动泵控制上样速度为1.5ml/分钟。用300ml 10mM Tris-HCl，3M氯化钠，1.5M甘氨酸，pH8.9洗涤柱体，然后再用120ml 5mM Tris-HCl，3M NaCl pH8.9洗柱。用25mM磷酸钠、100mM NaCl，pH2.8溶液洗脱蛋白。在每支装有1.0ml 1.0M HEPES，pH8.5的试管中收集10ml洗脱级分。混和蛋白质洗脱级分，每次用2L 5mM磷酸钠，300mM NaCl，pH7.4透析，共三次。
实施例12
脊髓横切实验
[0205]为了检测其促进体内功能性恢复的能力，使用大鼠脊髓横切实验检测了sNogoR-1融合蛋白。
[0206]用当日新鲜配制的待测溶液(sNogoR310-Fc溶于PBS)充满Alzet渗透压泵。装载浓度计算为5和50μM，在移植入动物之前，泵在37℃提前运转40小时以上。雌性Long Evans大鼠在术前给服止痛药和镇静剂，并使用异氟烷(以3％混入氧气中)麻醉。
[0207]将大鼠置于立体定向架中，暴露运动皮质，用于向脊髓两侧灌输示踪物BDA(分子量为10,000)。然后对大鼠实施T5-T6段脊髓背部半切断，然后植入髓鞘内导管和泵系统，用于递送待测化合物(每组11只大鼠)。
[0208]让大鼠恢复和存活至术后第28天。记录使用BBB系统的行为得分，直至诱导损伤后的28天，即本研究中的存活期结束之前。灌注和固定之后，取出脊髓，冷冻保存，切片，染色，进行轴突计数。
[0209]对小鼠和大鼠在损伤后进行BBB(Basso-Beattie-Bresnaharl)(Basso et al.，1996，Neurotrauma 13，343-359)运动评分、斜板试验和倾斜格栅行走试验(Li and Strittmatter，2003，J Neurosci.2003，23，4219-27)。对于斜板试验(inclined plane test)，我们测量了小鼠停留5秒钟不滑下时，50厘米×60厘米板能够倾斜的最大角度，对于倾斜格栅行走试验(inclined grid walking)，训练小鼠爬上倾斜45度的线格栅(wire grid)(35厘米长，2.54平方厘米的方格)。每次从下到上爬行的过程中计数后爪落在栅格板以下的次数。使用BBB运动功能评分(BBB locomotor scale)、格栅行走和脚印分析对大鼠进行行为学检测。对于格栅行走，训练大鼠爬上线格栅(70厘米长，2.54平方厘米的方格)，计数后爪落在栅格板以下的次数。对于脚印分析，用墨水记录大鼠在连续运动经过90厘米长的跑道时后爪的行走模式，计算每侧的步幅长度和步幅宽度(Metz et al.，2000，Brain Res.，883，165-177)。所有这些行为学测验至少由两个人来完成。在手术、行为学测验和组织分析的全过程中，研究者不知道迷你泵中的化合物是什么。
[0210]sNogoR310-Fc促进了功能的恢复(图12)。
实施例13
大鼠脊髓挫伤实验
[0211]用大鼠脊髓挫伤实验检测可溶性Nogo受体-1多肽和融合蛋白对体内神经元的作用。
[0212]使用止痛剂和抗生素预防性处理头有大囊的Long Evans雌性大鼠(体重170-190g)。手术前10分钟，通过腹腔注射咪达唑仑2.5mg/公斤体重使动物镇静，然后用异氟烷(以2-3％混于氧气中)使动物麻醉。然后将大鼠的毛刮掉，用乙醇和聚维酮碘擦拭，在眼部施用眼润滑剂。接下来沿着中线切开，暴露T7到T12段椎骨。
[0213]在T91/2和T10段脊椎处进行背部椎板切除术，暴露脊髓。将大鼠安放在冲击器上。首先将T7和T8节段夹住，然后将T11和T12节段固定在冲击器尾侧的夹子上。在大鼠的胸部下方放一块柔软的材料。将冲击棒设置在0的位置，将电地线夹连在伤口边缘，然后将冲击棒抬高到25mm，调节其位置至它恰巧正好在暴露的脊髓之上。然后释放冲击棒击中脊髓，之后立即抬起冲击棒。
[0214]然后将大鼠从冲击器上放下，在伤口处抹上Gelfoam。缝合伤口之上的肌肉，切口通过手术胶带封合。将动物置于一个温箱内直至它们从麻醉中苏醒。需要为大鼠提供抗生素、止痛剂和盐水。此后每天早晚挤压膀脱，直至功能恢复。
[0215]如上所述，通过髓鞘内向上述的大鼠脊髓横切模型施用可溶性受体-1融合蛋白(例如sNogoR310-Fc)。术后一天进行BBB评分，之后每周一次，直至4到6周。
实施例14
sNogoR310在转基因小鼠中的表达
[0216]我们制备了表达可溶性Nogo受体-1蛋白的转基因小鼠，以检测可溶性Nogo受体-1蛋白在体内表达时的作用。
[0217]我们将小鼠的sNogoR310cDNA(对应于Nogo受体-1的1-310位氨基酸；SBQ ID NO：28)克隆入C-3123载体的NotI位点。在该载体中，sNogoR310的表达是在神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)基因的调控序列的控制下的，这样可以产生高水平表达，并且表达产物可以从损伤部位的活性星形胶质细胞中分泌出来。接下来我们将得到的载体依次用AatII和SfiI消化，分离出位于3.4kb片段上的gfap∷sNOPE310构建体。我们将该片段微注射入胚胎中产生转基因小鼠。我们通过PCR证实了转基因已经整合并且鉴定出了5个新建品系(founder line)。我们将表达水平最高的两个杂合雄性新建品系与雌性C57BL/6J小鼠交配。我们使用抗Nogo受体-1的抗体，进行蛋白质印迹分析，证实在杂合的转基因小鼠中，GFAP阳性的细胞表达和分泌了sNogoR310。
[0218]我们将皮质和脊髓在含有蛋白酶抑制剂(Rode)的Tris盐缓冲盐溶液中匀浆，将匀浆产物在4℃40,000rpm条件下离心20分钟。取上清用4％多聚甲醛处理20分钟以提高抗体的特异性，并在免疫印迹之前进行透析，我们通过在RIPA缓冲液(含1％TritonX-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS的PBS)中用超声波处理匀浆微粒级分，将得到的匀浆产物离心，同上处理此上清(去污剂-可溶性微粒级分)。我们使用1∶2000稀释的Nogo受体-1的兔抗血清，通过免疫印迹分析了20微克的大脑或脊髓蛋白质。在与AP偶联的抗兔IgG和NBT/BCIP AP底物孵育之后，我们观察到了免疫反应性。
[0219]我们检测到，在两个转基因品系Tg08和Tg01的皮质和脊髓的不含去污剂的可溶性提取物中有分泌型37kD sNogoR310，但是在同窝野生型(WT)小鼠中不存在大小为37KD或81KD的任何可溶性Nogo受体-1蛋白(若有也很少)。对微粒级分的检查证明了在野生型和转基因小鼠中都存在相当水平的内源Nogo受体-1。
实施例15
损伤之后在转基因小鼠中表达sNogoR310
[0220]通过背部过半切断损伤，检测中枢神经系统损伤对sNogoR310在转基因小鼠中表达的影响。我们通过如实施例14中描述的方法将杂合雄性与C57/BL6雌性交配，获得sNogoR310转基因动物和非转基因对照动物。
[0221]我们深度麻醉成年雌性杂合转基因或同窝野生型小鼠(10-16周龄)，实施完全椎板暴露手术，将背部脊髓T6和T7段完全暴露。我们对T6段脊髓实施背部过半切断，使用30号针和显微手术剪将背部和背外侧皮质脊髓束(CTS)完全分开。我们用做了记号的针多次穿过脊髓的背段，以确认损伤的深度为1.0mm。我们缝合椎板暴露手术上方的肌肉层，使用手术胶带将背部皮肤封合。为了跟踪皮质脊髓束，我们在脊髓损伤后14天在大脑皮质上方的右侧向颅骨内钻了一个骨窗.我们在皮质表面以下0.7mm深的四个位置注射示踪物BDA(分子量10000，浓度为10％溶于PBS)(MolecularProbes，Eugene，OR)。损伤后四周，小鼠心脏灌注PBS，然后用4％多聚甲醛固定。用于sNogoR310表达实验的小鼠不注射任何示踪物。
[0222]用于蛋白印迹分析的小鼠，损伤之后14天，不进行灌注，收集在T3和L3段之间的脊髓。用于Nogo受体-1免疫组织化学染色的小鼠在半切后10天用4％多聚甲醛灌注，取出受损的脊髓进行切片。使用固定于立体定位装置(David Kopf，Tujunga，CA)中的11号解剖刀的刀刃对转基因和野生型小鼠实施皮质针刺损伤，以检查sNogoR310在受损脑部中的表达。在前囱后0.5mm、距离中线侧1.5mm处作一个4mm长的副矢状切割，切割为3.5mm深。
[0223]损伤10天以后，我们在转基因小鼠的脊髓可溶性提取物中检测到sNogoR310表达的提高，但是在野生型小鼠中没有检测到。这与损伤后在损伤部位周国GFAP的水平升高是一致的。为了证明这不是由于NogoA补偿性上调造成的，我们检测了NogoA的表达，发现其在野生型或转基因小鼠中完整未损的或者受损的皮质和脊髓中表达是类似的。
[0224]我们使用Nogo受体-1抗体和GAFP抗体，通过对受损的脑和含有受损区域的脊髓进行免疫染色，检查了在受损CNS中sNogoR310的细胞表达。有反应活性的星形胶质细胞的神经胶质在野生型和转基因小鼠中没有形态学差异，但是在gfap∷sNogoR310转基因小鼠中的细胞内和细胞外间隙中，Nogo受体-1的染色强度明显高于野生型小鼠，这表明在转基因小鼠的损伤部位周围，sNogoR310的表达升高。Nogo受体-1蛋白和星形胶质细胞标记GFAP仅在转基因小鼠中共定位。在转基因样本中，存在明显增强的非细胞染色扩散，这与细胞外间隙中的sNogo310R是一致的。在野生型和转基因小鼠中都检测到了神经元细胞体的Nogo受体-1染色。
实施例16
分泌的sNogoR310诱导转基因小鼠中CSF出芽
[0225]我们对转基因小鼠中损伤部位周围的sNogoR310表达升高是否能引发受损轴突再生进行了测试。
[0226]我们Li and Strittmatter，2003，J.Neurosci.，23，4219-27一文中描述的方法，通过在右侧运动皮质中注射顺向(anterograde)示踪物生物素葡聚糖胺(BDA)对下行皮质脊髓束(CSF)的完整性进行了检验。在同窝野生型小鼠中，突出的背部皮质脊髓束紧紧绑缚于损伤部位的头向(rostral)，在同侧只能看到少数背外侧CST纤维。少量的BDA标记的短侧芽伸向灰质，特别是在腹侧脊髓中，但是出芽主要局限于与示踪物注射对侧的脊髓中。但是在sNogoR310转基因小鼠的背部半切断位置头向的切片中显示了明显不同的BDA标记分布。在所有的转基因小鼠品系Tg08或Tg01中，突出的背部皮质脊髓束以外都观察到了高密度的BDA标记的CST纤维。异位纤维遍布灰质区域，而一些纤维到达了外侧和背外侧的白质中。在脊髓的对侧(示踪物注射点的同侧)可见许多纤维(每个横切中4-12个芽)。侧芽的微量光密度测量表明在sNogoR310转基因小鼠中出芽密度大约增加了10倍。与同窝野生型小鼠不同，对sNogoR310转基因小鼠距离损伤处1到4mm的副矢状面纵切切片进行检查发现，dCST纤维向腹侧灰质区域伸出大量分支芽。通常，在转基因小鼠中，在损伤位置的头向出芽的形式和程度与全身使用Nogo受体-1拮抗肽NEP1-40治疗的小鼠中观察到的类似(Li和Strutmatter，2003)。
[0227]这些结果表明分泌的sNogoR310能诱导转基因小鼠中CST出芽。
实施例17
在sNogoR310转基因小鼠中，CST轴突再生越过损伤部位进入远端脊髓
[0228]我们从转基因小鼠中分离出从损伤部位起头向4mm和尾向4mm的脊髓(总共8mm长)，将其包埋于戊二醛聚合的白蛋白基质中，在振动切片机上作副矢状(30μm厚)切割。我们收集从损伤部位起头向5-7mm和尾向5-7mm的脊髓横切(50μm)。对于大鼠中的sNogoR310-Fc注射实验，从损伤部位起头向10mm且尾向10mm延伸的脊髓，在振动切片机上作副矢状切割(50μm厚)，收集从损伤部位起头向11-16mm且尾向11-16mm脊髓的横切。将切片与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物共同温育，使用镍增强的二氨基联苯胺HPR反应(Grandpre，2002，Nature，417，547-551)来显现BDA示踪物。我们使用了间接免疫荧光技术，对一些切片进行了5-羟色胺组织化学(抗-5-HT抗体)处理。为了观察受损的区域，我们用针对GFAP的抗体(Sigma，St.Louis，MO)对一些切片进行了双染色。我们对切片进行了封固、脱水，并用封固介质覆盖切片。
[02291我们对受损后转基因小鼠表达的sNogoR310诱导出的纤维是否能穿越受损区域进入尾向脊髓实现功能恢复进行了测试。
[0230]在显微镜描图器中描绘的跨越损伤部位的连续副矢状切片显示损伤部位周围几个mm处的再生CST纤维呈全面分布。野生型小鼠的切片显示没有从受损部位处伸出的CST纤维。sNogo310转基因小鼠的类似切片显示：有大量CST纤维跨越横切区域，以高度分支方式伸向远端的灰质和白质区域。在半切部位头向的近邻区域，起源于突出的dCST的、高密度的BDA标记的CST出芽伸入受损区域，但是大多数CST出芽不能穿越疤痕形成和组织空洞大量存在的横切区域。小量但是非常显著的一部分再生轴突，通过腹侧和腹外侧灰质和白质的残余组织桥，绕过受损部位。此外，少量CST纤维自身通过受损的背侧和背外侧脊髓跨过横切区域，进入远端区域。在损伤的附近，再生纤维的行进路线通常是曲折的，与头向CST中正常平直的纤维明显不同。在远端脊髓的灰质区域中经常见到的是平行纤维和树枝状纤维。重建表明：在所有转基因小鼠中，从损伤部位起尾向1-4mm的任何水平，5-15个BDA-标记的再生纤维沿着头-尾向轴向行进。所有转基因小鼠中，从背部半切断部位起尾向的5-7mm的横切切片中，在灰质和白质区域都可以观察到BDA标记的CST轴突。转基因小鼠的纤维计数提示，在矢状切片中的近端水平上有大致相近数目的BDA标记的CST纤维。
[0231]除了CST纤维以外，其它下行传导束，例如缝核脊髓纤维(raphespinal fiber)，也在小鼠的运动功能中起作用。在这种小鼠背部过半切断模型中，横切损伤了大部分5-羟色胺能纤维，使腹角中的这些纤维的密度降低了大约80％。对尾向脊髓腹角中5-羟色胺能纤维的分析表明：在转基因小鼠中这些纤维的数目比野生型小鼠中的多，显示sNogoR310在转基因小鼠中的生长促进作用并不只限于一条轴突下行路径。
实施例18
转基因表达sNogoR310促进运动功能的恢复
[0232]CST轴突示踪和5-羟色胺能纤维分析表明：在转基因小鼠中，星形胶质细胞释放的sNogoR310刺激脊髓中受损的下行轴突广泛的解剖学再生。我们进行了几项行为学实验，如实施例12所示，以确定这些再生的纤维是否有益于功能恢复。
[0233]BBB实验给出的结果，野生型小鼠在4周的存活期内部分地恢复了运动功能。在损伤后4周时，大多数野生型小鼠的功能恢复到了这样一个水平：持续负重的跖肌步行，但是它们仅仅表现出偶尔到经常的前后肢协调，在刚刚接触测试表面时出现优势爪位置的旋转。与此相反，在7-28天的观察期内，sNogoR310转基因小鼠的两个品系Tg08和Tg01的BBB得分显著高于对照组(图13A和13B)。损伤后28天，大多数转基因小鼠表现出持续的前后肢协调，而且优势爪位置与身体平行，
[0234]我们又进行了另外两项行为学实验进一步鉴定sNogoR310转基因小鼠的表现。首先我们测量了小鼠能够在5秒钟之内不滑下的最大平板倾斜角度。在背部半切断损伤之前，转基因和野生型小鼠都能够在平板倾角为55度时保持它们的姿势。在损伤后7-28天内，对于所有的小鼠，可以经受的倾角都有所缩小，但是转基因小鼠的可经受的倾角明显大于对照组小鼠(图13C)，在另一个行为实验中，小鼠攀爬与垂直方向至45度角的格栅，并计数爬行途中后肢落在格栅的平面以下的次数(Metz et al.，2000)。在损伤之前的训练中，所有的小鼠都没有在该实验中出现这样的错误。在损伤后2-6周期间，野生型小鼠出现大量的脚印错误，且只有极微小的改善。与此相反，在本申请中，sNogoR310转基因小鼠在爬格栅实验中表现出进行性改善，主要的改善出现在损伤后1-3周之间(图13D)。因此，从星形胶质细胞分泌sNogoR310的转基因小鼠在胸髓(thoracic spinal)半切断之后表现出CST再生，缝核脊髓(raphespinal)出芽和运动功能的增强。
实施例19
髓鞘内施用sNogoR310-Fc蛋白诱导CST出芽
[0235]作为第二个检测可溶性Nogo受体1在脊髓外伤之后有促生长益处的实验，我们髓鞘内施用纯化的蛋白。
[0236]我们将大鼠Nogo受体-1的配体结合结构域(27-310)与大鼠IgG1Fc结构域相融合，以提高稳定性，有助于纯化。我们从稳定转染的CHO细胞中纯化蛋白。正如此前进行的小鼠sNogoR310-Myc His试验(Fournier etal.，2002，J Neurosci.，22，8876-8883；Liu et al.，2002，Science，297，1190-1193)那样，这种蛋白能阻断Nogo-66、MAG和髓鞘在体外的作用。我们通过渗透压迷你泵，将sNogoR310-Fc蛋白髓鞘内施用至受到中胸背部半切断损伤的小鼠。在损伤后4周的存活期内，每只大鼠局部注射1.2mg sNogoR310-Fc蛋白。在接受载体处理(1.2mg大鼠IgG)的大鼠中，半切断位置头向的切片显示：在损伤部位上方有紧紧绑缚的突出背部CST和极少的异位BDA标记的CST纤维。接受sNogoR310-Fc蛋白的损伤大鼠，其损伤位置头向的切片显示了完全不同的标记分布模式，从横切和副矢状切片中可以观察到大量从BDA标记的CST上发出的异位纤维。有些情况下，突出越过了临近中线的dCST区域，到达脊髓的周围，与背外侧的CST混和在一起。出芽的轴突在灰质中的扩展比在白质中的扩展程度要大。测量显示，在经sNogoR310-Fc处理过的大鼠中，与dCST邻近的异位出芽纤维(在横切中≥100μm；在矢状切面中≥200μm)增加得更多。
实施例20
在sNogoR310-Fc治疗的大鼠中，CST轴突再生进入远端脊髓
[0237]我们对雌性Sprague Dawley大鼠(体重190-250g)实施深度麻醉，在T6-7段脊髓处实施胸椎暴露术，暴露脊髓。我们切开脊髓背部一半，使用30号针和显微剪刀将背部CSGT束分开，并用11号手术刀的锋利的刀刃通过髓的背部一半(Grandpre et al.，2002，Nature，417，547-551)以确保损伤的深度(1.8mm)。渗透压迷你泵((Abet2ML4，2ml容积，2.5μl/小时，28天递送)中充满含1.2mg大鼠IgG的PBS或者含1.2mg sNogoR310-Fc融合蛋白的PBS，将泵缝在动物背部皮肤下的肌肉中。与迷你的出口相连的导管，通过一个硬脊膜上的小洞，被插入到T7-8段脊髓的髓鞘内空隙。
[0238]灌输Nogo受体-1拮抗剂蛋白在大鼠半切断位置头向诱导出大量出芽，但是更为关键的问题是出芽的CST纤维是否伸向远端脊髓且是否有助于运动功能恢复。从载体处理大鼠获取贯穿损伤部位的纵向切片，切片显示：在损伤水平处以下没有任何可检测的或者仅能检测到极少数目的BDA标记的腹侧CST纤维(GrandPre et al.，2002；Weidner et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，3513-3518>。取自经sNogoR310-Fc治疗后的大鼠的类似切片显示：有许多BDA-标记的纤维通过腹例和腹外侧脊髓的桥梁组织绕过了横切部位伸向脊髓的尾向。对星形胶质细胞标记GFAP的免疫染色显示，横切到达的深度深过脊髓的中央管区。与突出的背部CST中头向纤维的线形走势不同，再生的CST纤维在远端脊髓中通常呈现高度分支的形式，灰质区内尤其如此。在脊髓的许多区域内都检测到了这些纤维，但是这些纤维在脊髓中央和背部那一半更容易看到。矢状切片中的CST纤维计数显示：在每一只经sNogoR310-Fc治疗过的大鼠中，损伤部位后面1-2mm处有大约20个BDA-标记的轴突；且在损伤部位远端7-8mm处有15个标记轴突。
[0239]通常，这些纤维的分支形式与NEP1-40肽局部处理过的动物中出现的分支形式相似，但是使用sNogoR310-Fc蛋白处理后的切片中可以看到每一个芽体中有更多侧向分支。对从远端脊髓发出的芽进行测量表明：经sNogoR310-Fc处理的动物中每一个芽的总侧向长度是经NEP 1-40处理的动物中的两倍。脊髓尾向1-10mm内芽体(长度≥200μm)的数目，在两组Nogo受体-1拮抗剂处理的大鼠中都比对照组大20-40倍。与局部使用NEP1-40处理相比，经sNogoR310-Fc处理的大鼠中可以看到更多的出芽(NEP1-40组中每只大鼠约25个出芽，sNogoR310-Fc组中每只大鼠约50个出芽)，但是这种区别在统计上不显著(p＝0.1713，t检验)
[0240]在接受sNogoR310-Fc治疗的大鼠半切断部位尾向11-15mm处的脊髓横切切片中，可以见到正在再生的CST轴突。这些纤维在脊髓的灰质和白质中都可以检测到，与白质相比，在灰质中检测到的纤维通常具有更多的侧向分支。与此相反，赋形剂处理组的横切切片中，在腹侧白质区域中，只能偶尔看到BDA-标记，这与未损伤组的腹侧CST轴突一致。在远端脊髓的这一水平上，两种Nogo受体-1拮抗剂(sNogoR310-Fc和NEP1-40)处理组中BDA-标记的CST纤维的平均数目是载体处理大鼠的大约20倍。两种Nogo受体拮抗剂sNogoR310-Fc蛋白和NEP1-40肽，都能使远端脊髓中出现明显的CST轴突再生，但是前者诱导的出芽呈现出更高度的分支模式。
实施例21
局部施用sNogoR310-Fc诱导受损大鼠脊髓中红核脊髓和5-羟色胺能轴突出芽
[0241]半切断后14天，在后肢感觉运动皮质上方颅骨每一侧钻一个骨窗，以示踪CST纤维。在各侧硬脊膜下深度为1.5mm的7个注射部位注射顺向的神经元示踪物BDA(溶于PBS中，浓度为10％，每个皮质3.5μl)(Grandpre，2002)。对于大鼠中红核脊髓束的示踪而言，将示踪物BDA(分子量10,000，溶于PBS中，浓度为10％，1μl)注射入左侧的红核内(前囱前5.8mm，距离颅骨表面外侧0.7mm，腹侧7.0mm)。BDA注射后两周，依次使用PBS和4％多聚甲醛灌注动物，收集组织，用于组织学分析。
[0242]脊髓损伤之后功能改善是由于受损红核脊髓束(RST)纤维的修复(Liu et al.，1999，J.Neurosci.，19，4370-4387)。Nogo受体-1在CNS神经元内的广泛分布使得下列事件成为可能：Nogo受体-1被其拮抗剂抑制导致受损后RST轴突的再生。为了检测sNogoR310-Fc对受损RST的作用，使用BDA注射入左侧红核，示踪该途径的完整性。在脊髓水平上，RST纤维一般位于脊髓的背外侧白质区，且被本研究中的背部半切断横切开。在对照组大鼠中，损伤部位头向11-15mm处的横切切片显示，在突出的RST和背角灰质之间可以看到少量的BDA-标记的短纤维。在同一水平的sNogoR310-Fc处理的切片中，在RST主干和背角灰质之间呈现有许多连接纤维。载体处理的大鼠中，距离SCI远端11-15mm处的横切切片未见BDA-标记的RST纤维。与此相反，接受sNogoR310-Fc处理的同一水平的切片中显示，在示踪物注射对侧的灰质和白质中有大量的BDA-标记的RST纤维，在与BDA注射同侧的灰质中可见一些具有分支模式的出芽。
[0243]在经sNogoR310-Fc处理的脊髓损伤大鼠中还检查了红核脊髓束纤维。免疫染色表明：在载体处理组和sNogoR310-Fc处理组中，损伤部位头向11-15mm处的5-羟色胺能纤维密度大致相同。在损伤部位下面11-15mm处的切片中，sNogoR310-Fc处理的大鼠的5-羟色胺纤维的数目是对照组的两倍。这些结果表明：sNogoR310-Fc蛋白对Nogo受体-1的抑制作用的反应不止限于CST纤维，而且其它下行束，例如红核脊髓束和5-羟色胺能轴突，也对Nogo受体-1拮抗作用有反应。
实施例22
局部施用sNogoR310-Fc促进大鼠功能恢复
[0244]髓鞘内施用sNogoR310-Fc蛋白，能促进外伤性脊髓损伤后许多下行途径中轴突的再生。另外，我们还对该蛋白是否能促进受损脊髓功能恢复进行了测试。
[0245]半切断后两周，赋形剂处理的大鼠的运动功能BBB得分达到了稳定的12分水平(图14A)。在损伤后4周，大多数对照(7个中有6个)具有频密-连续的负重跖肌步行以及频密-连续的前后肢协调，但是它们在初次接触测试表面时，优势爪位置有旋转。与此相反，接受sNogoR310-Fc蛋白处理的大鼠中，运动功能评分在损伤后2到4周内持续升高。损伤后4周时，所有9只sNogoR310-Fc处理的动物都具有持续的前后肢协调，并且爪在首次接触测试表面时是平行的。
[0246]已有人使用格栅行走试验评价脊髓损伤后下行(descending)精细运动控制中的缺陷(Metz et al.，2000)。格栅行走需要前后肢的协调和腹外侧纤维、皮质脊髓纤维和红核脊髓束纤维介导的自主运动控制。在损伤之前的训练中，所有的大鼠都能准确地将它们的后肢放在格子的边框上。损伤后2-4周，对照大鼠在每次行走中会出现8-9次错误，并且一段时间后仅有极小程度的改善。与此相反，使用sNogoR310-Fc处理后的大鼠在格栅行走时表现出进行性改善，出现错误明显减少(平均每次行走4-7次错误)。改善主要出现在损伤后的2-3周。对照组后爪脚印分析显示：与未受到损伤大鼠或者接受sNogoR310-Fc处理后的受损大鼠相比，对照组大鼠半切断后4周时步幅的长度明显减小且步幅宽度增加(图14C)。因此，这些多项行为学测试表明：局部注射拮抗剂蛋白对Nogo受体-1功能的阻断，能够促进损伤后运动功能的恢复。
生物保藏
[0247]将杂交瘤HB 7E11(ATCC保藏号PTA-4587)，HB 1H2(ATCC保藏号PTA4584)，HB 3G5(ATCC保藏号PTA-4586)，HB 5B10(ATCC保藏号PTA-4588)以及HB 2F7(ATCC保藏号PTA-4585)在2002年8月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)中，地址为10801Universityboulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。
[0248]本领域技术人员显然明白，在不脱离本发明的本质精神的前提下，可以对优选实施方案作多方面的改动和调整。所有改动后的方案均在本发明范围之内。

Claims (29)

1.一种多肽，该多肽选自：AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ IDNO：26)；LDLSDNAQLR(SEQ ID NO：27)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO：29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO：30)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO：31)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO：32)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO：33)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO：34)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO：35)；DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：36)；DNAQLR(SEQ ID NO：37)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO：41)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ IDNO：42)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO：43)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO：44)；和LDLSDNAQLAWDPTT(SEQ ID NO：45)。
2.一种编码权利要求1所述多肽的核酸。
3.权利要求2所述的核酸，其可操作地连接于表达调控序列。
4.一种载体，其中含有权利要求2或3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其中包含权利要求2或3所述的核酸或者包含权利要求4所述的载体。
6.一种制备权利要求1所述多肽的方法，该方法包括下述步骤：
(a)培养权利要求5所述的宿主细胞；以及
(b)从该宿主细胞或者培养基中回收所述多肽。
7.一种制备抗体的方法，该方法包括下述步骤：
(a)用权利要求1所述多肽或权利要求5所述宿主细胞免疫宿主；以及
(b)回收所述抗体。
8.一种用权利要求7所述方法制备的抗体或该抗体的抗原结合片段。
9.一种抗体或其抗原结合片段，其能与权利要求1所述多肽特异性结合。
10.权利要求8或9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的抗体
(a)能抑制神经元的生长锥萎陷；
(b)能够降低对神经元内神经突向外生长和出芽的抑制；以及
(c)能抑制Nogo受体-1与配体间的结合。
11.权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的神经突向外生长和出芽是轴突生长。
12.权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的神经元是中枢神经系统神经元。
13.权利要求8或9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的抗体是单克隆抗体。
14.权利要求8或9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的抗体是小鼠抗体。
15.权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体选自人源化抗体、嵌合抗体和单链抗体。
16.一种用于抑制Nogo受体-1与配体间结合的方法，该方法包括下述步骤：让Nogo受体-1与权利要求10所述的抗体或抗原结合片段接触。
17.权利要求16所述的方法，其中所述的配体选自NogoA、NogoB、NogoC、MAG和OM-gp组成的组。
18.一种用于抑制神经元内生长锥萎陷的方法，该方法包括下述步骤：让所述神经元与权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段接触。
19.一种降低对神经元内神经突向外生长或者出芽抑制的方法，该方法包括下述步骤：让所述神经元与权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段接触。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的神经突向外生长或者出芽是轴突生长。
21.权利要求18或者19所述的方法，其中所述的神经元是中枢神经系统神经元。
22.一种组合物，其中包括药物学上可接受的载体和权利要求8或9所述的抗体或其抗原-结合片段。
23.权利要求22所述的组合物，该组合物进一步还包括一种或多种其它治疗剂。
24.一种用于促进有死亡危险的神经元存活的方法，该方法包含下述步骤：让神经元与有效量的权利要求8或9所述的抗-Nogo受体-1抗体或抗原结合片段接触。
25.权利要求24所述的方法，其中所述的神经元处于体外。
26.权利要求24所述的方法，其中所述的神经元是哺乳动物的。
27.权利要求26所述的方法，其中所述的哺乳动物表现出多发性硬化、ALS、亨丁顿氏症、阿尔茨海默病、帕金森氏症、糖尿病性神经病、中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤的体征或者症状。
28.一种用于促进哺乳动物中的有死亡危险的神经元存活的方法，该方法包括：
(a)提供表达权利要求8或9所述的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的培养的宿主细胞；以及
(b)将所述宿主细胞导入该哺乳动物至所述神经元所在位置或其附近。
29.一种用于促进哺乳动物中的有死亡危险的神经元存活的基因治疗方法，该方法包括：在神经元或其附近位置施用病毒载体，该载体包含编码权利要求8或9所述抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段由该核苷酸序列在哺乳动物中表达而成，其表达量足以促进神经元的存活。
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