JP2007501612A - Nogo受容体アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、神経生物学および分子生物学に関する。さらに具体的には、本発明は、免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチド、Nogo受容体−1抗体、その抗原結合断片、可溶性Nogo受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸に関する。本発明はさらに、このようなNogo受容体抗体、その抗原結合断片、免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチド、可溶性Nogo受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を含む組成物、さらには、このようなNogo受容体抗体、その抗原結合断片、免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチド、可溶性Nogo受容体およびその融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸を作成し、使用するための方法に関する。
ニューロンの軸索および樹状突起は、ニューロンからの長い細胞の伸張である。伸張途中の軸索または神経突起の先端部には、成長円錐として知られている特殊な領域が含まれている。成長円錐は、局所環境を感知し、ニューロンの標的細胞に向かっての軸索の成長を導く。成長円錐は、いくつかの環境による合図、例えば、表面接着、成長因子、神経伝達物質、および電場に反応する。円錐での成長の誘導には、種々のクラスの接着分子、細胞内シグナル、さらには、成長円錐を刺激し阻害する因子が関与している。成長途中にある神経突起の成長円錐は種々の速度で前進するが、通常は、1日あたり1から2ミリメートルの速度で前進する。
本発明は、可溶性Nogo受容体−1ポリペプチドおよびそれを含む融合タンパク質、ならびに、Nogo受容体−1の特異的な免疫原性領域に対する抗体およびその抗原性断片に関する。本発明はまた、本発明の抗体に結合する免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチドにも関する。本発明はまた、Nogo受容体−1に結合するモノクローナル抗体によって結合されるNogo受容体−1ポリペプチドにも関する。このようなポリペプチドは、特に、免疫原として、または、本発明の抗体に対して同様の特異性を有している抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用することができる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにペプチドを作成する方法に関する。本発明の抗体、可溶性受容体、および受容体融合タンパク質は、Nogo受容体−1をアンタゴナイズするかまたはブロックし、そしてそのリガンドに対するNogo受容体−1の結合を阻害すること、ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害すること、およびニューロンにおける神経突起成長または萌芽(sprouting)の阻害を減少させることについて有用である。
(定義および一般的な技術)
他の場所で定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、本出願が含む定義が支配する。また、他の方法で状況によって必要とされない限りは、単数形の用語に複数形が含まれ、複数形の用語に単数形が含まれる。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、全ての目的についてそれらの全体が引用によって本明細書中に組み入れられる。
1つの態様においては、本発明は、免疫原性であるNogo受容体−1ポリペプチドに関する。本発明のいくつかの実施形態においては、免疫原性ポリペプチドは、LDLSDNAQLRVVDPTT(ラット)(配列番号1);LDLSDNAQLRSVDPAT(ヒト)(配列番号2);AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(ラット)(配列番号3);AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(ヒト)(配列番号4);およびCRLGQAGSGA(マウス)(配列番号5)からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的には構成される。
本発明はさらに、本発明のNogo受容体−1ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。いくつかの実施形態においては、抗体または抗原結合断片は、配列番号1〜5、26〜27、29〜37、および41〜45からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的には構成されるポリペプチドに結合する。本発明の抗体または抗原結合断片は、生体内または生体外で産生することができる。抗体または抗原結合断片の産生については以下で議論される。
本発明の抗体は、適切な宿主(例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類を含む脊椎動物、ならびに、鳥類、爬虫類、および魚類の卵の中)の免疫化によって作成することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Harlow and Lane(1988)前出に記載されているような標準的な手順によって行うことができる。
本発明の抗Nogo受容体−1抗体は、組み換えの組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例示的な組み合わせライブラリーは、本発明の免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチドに対する結合のためのものであり、例えば、本発明の免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチドで免疫化した動物に由来するmRNAから調製されたVLおよびVH cDNAを使用して調製されたscFvファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーを調製しスクリーニングするための方法論は当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーを作成するための方法および材料は市販されている(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,カタログ番号27−9400−01;Stratagene SurfZAP(登録商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612;およびMorphoSysによる他のもの)。抗体ディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングすることにおいて使用することができる方法および試薬は、他にも存在する(例えば、Ladner et al.,米国特許第5,223,409号;Kang et al.,PCT公開番号WO92/18619;Dower et al.,PCT公開番号WO91/17271;Winter et al.,PCT公開番号WO92/20791;Markland et al.,PCT公開番号WO92/15679;Breitling et al.,PCT公開番号WO93/01288;McCafferty et al.,PCT公開番号WO93/01047;Garrard et al.,PCT公開番号WO92/09690;Fuchs et al.,(1991)Bio/Technology 9:1370−1372;Hay et al.,(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85;Huse et al.,(1989)Science 246:1275−1281;McCafferty et al.,Nature(1990)348:552−554;Griffiths et al.,(1993)EMBO J.12:725−734;Hawkins et al.,(1992)J.Mol.Biol.,226:889−896;Clackson et al.,(1991)Nature 352:624−628;Gram et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576−3580;Garrad et al.,(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Hoogenboom et al.,(1991)Nucl.Acids Res.19:4133−4137;およびBarbas et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978−7982を参照のこと)。
本発明の抗Nogo受容体−1抗体は任意のイソ型であり得る。任意の所望されるイソ型の抗体は、クラススイッチによって産生することができる。クラススイッチのためには、CLまたはCHをコードするヌクレオチド配列のいずれをも含まない、VLまたはVHをコードする核酸が、当該分野で周知の方法を使用して単離される。VLまたはVHをコードする核酸は、その後、免疫グロブリン分子の所望されるクラスに由来するCLまたはCHをコードするヌクレオチド配列に対して動作可能であるように連結させられる。これは、ベクターと、上記のようなCLまたはCH鎖を含む核酸を使用して行うことができる。例えば、もともとIgMであった本発明の抗Nogo受容体−1抗体は、IgGへとクラススイッチさせることができる。さらに、クラススイッチを、1つのIgGサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、IgG1からIgG2へと変換させるために使用することもできる。
他の実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合断片は、重鎖および/または軽鎖の種々のドメインにおいて変異させることができ、それによって、抗体の結合特性を変化させることができる。例えば、変異は、1つ以上のCDR領域中に作成することができ、これによって、Nogo受容体−1についての抗体のKdを増大または低下させることができ、Koffを増大または低下させることができ、あるいは、抗体の結合特異性を変化させることができる。部位特異的変異誘発における技術は、当該分野で周知である。例えば、Sambrook et al.,およびAusubel et al.,(前出)を参照のこと。好ましい実施形態においては、変異は、本発明の抗Nogo受容体−1抗体の可変領域中の生殖系と比較して異なっていることが知られているアミノ酸残基に作成される。いくつかの実施形態においては、変異は、本発明の抗Nogo受容体−1抗体の可変領域中の生殖系と比較して異なっていることが知られている1つ以上のアミノ酸残基に作成される。別の実施形態においては、抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコードする核酸が、1つ以上のフレームワーク領域の中で変異させられる。変異は、半減期が長くなるように、フレームワーク領域または定常ドメインに作成される場合もある。フレームワーク領域または定常ドメイン中の変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるように作成される場合もあり、これによって、別の分子に対する共有結合または非共有結合のための部位が提供されるか、あるいは、補体結合のような特性が変化する。変異は、1つの変異抗体中のフレームワーク領域、定常ドメイン、および可変領域のそれぞれに作成することができる。あるいは、変異は、1つの変異抗体中の1つのフレームワーク領域の中だけに、複数の可変領域の中だけに、または定常ドメインの中だけに作成される場合もある。
別の実施形態においては、別のポリペプチドに連結させられた本発明の抗Nogo受容体−1抗体の全てまたは一部を含む、融合抗体または免疫接着体が作成される場合もある。いくつかの実施形態においては、抗Nogo受容体−1抗体の可変領域だけが、ポリペプチドに連結させられる。他の実施形態においては、本発明の抗Nogo受容体−1抗体のVHドメインが、第1のポリペプチドに連結させられ、一方では、VHドメインとVLドメインとが抗体結合部位を形成するように互いに相互作用できるような様式で、抗体のVLドメインが、第1のポリペプチドと会合する第2のポリペプチドに対して連結させられる。他の実施形態においては、VHドメインは、VHドメインとVLドメインとが互いに相互作用できるように、リンカーによってVLドメインから間隔を空けられる(下記の単鎖抗体の項を参照のこと)。VH−リンカー−VL抗体は、その後、目的のポリペプチドに連結させられる。融合抗体は、Nogo受容体−1リガンドを発現する細胞または組織に対してポリペプチドを向けるために有用である。目的のポリペプチドは、治療薬、例えば、毒素である場合も、また、診断薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような、容易に視覚化させることができる酵素である場合もある。さらに、「融合抗体」は、2つ(またはそれ以上)の単鎖抗体が互いに連結されるように作成され得る。これは、1本のポリペプチド鎖の上に二価または多価の抗体を作成することが望まれる場合、あるいは、二重特異的抗体を作成することが望まれる場合に、有用である。
本発明には、本発明のNogo受容体−1ポリペプチドに結合する単鎖抗体(scFv)が含まれる。ScFvを産生するためには、VH−、およびVL−をコードするDNAが、可撓性リンカー、例えば、アミノ酸配列(Gly4−Ser)3(配列番号10)をコードするDNAに対して動作可能であるように連結させられる。その結果、VHおよびVL配列は、可撓性リンカーによって連結させられたVLおよびVH領域を有している連続する1本鎖のタンパク質として発現させられ得る(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423−426;Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879−5883;McCafferty et al.,Nature(1990)348:552−554を参照のこと)。単鎖抗体は、VHとVLが1つだけ使用される場合には一価であり、また、VHとVLが2つ使用される場合には二価であり、また、2つ以上のVHとVLが使用される場合には多価である場合もある。
本発明にはさらに、二重特異的抗体またはその抗原結合断片が含まれる。これらにおいては、1つの特異性は本発明のNogo受容体−1ポリペプチドに対する特異性である。1つの実施形態においては、1つの結合ドメインを通じて本発明のNogo受容体−1ポリペプチドに特異的に結合し、第2の結合ドメインを通じて第2の分子に特異的に結合するキメラ抗体が作成され得る。キメラ抗体は、組み換え分子生物学の技術によって産生することができ、また、両方を物理的に結合させることもできる。さらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、ミエリンによって媒介される成長円錐の崩壊、ならびに神経突起成長および萌芽の阻害を弱めることに関係している別の分子にも特異的に結合する、1つ以上のVHおよびVLを含む単鎖抗体を作成することができる。このような二重特異的抗体は、周知の技術、例えば、Fanger et al.,Immunol Methods 4:72−81(1994)およびWright and Harris(前出)を使用して、そして、(iii)と組み合わせて作成することができる(例えば、Traunecker et al.,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51−52(1992)を参照のこと。
本発明の抗体または抗原結合断片は、別の分子(例えば、別のペプチドまたはタンパク質)になるように誘導することができ、また、別の分子に連結させることもできる。一般的には、抗体または抗原結合断片は、本発明のポリペプチドに対する結合が、誘導または標識によって悪影響を受けないように誘導される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、1つ以上の他の分子構成要素、例えば、別の抗体(例えば、二重特異的抗体またはダイアボディー)、検出試薬、細胞傷害性因子、薬剤、および/あるいは別の分子との抗体もしくは抗原結合断片の会合を媒介することができるタンパク質またはペプチド(例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ)に対して、機能するように連結させられ得る(化学結合、遺伝子融合、非共有結合などによる)。
(抗Nogo受容体−1抗体のクラスおよびサブクラス)
抗Nogo受容体−1抗体のクラスおよびサブクラスは、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的には、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的である抗体を使用して決定することができる。このような抗体は市販によって入手することができる。クラスおよびサブクラスは、ELISA、ウェスタンブロット、さらに他の技術によっても決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全てまたは一部を配列決定し、免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列に対してそれらのアミノ酸配列を比較し、そして抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することもできる。
本発明のNogo受容体−1ポリペプチドに対する本発明の抗Nogo受容体−1抗体の結合親和性および解離速度は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、結合親和性は、競合ELISA、RIA、BIAcore、またはKinExA技術によって測定することができる。解離速度も、また、BIAcoreまたはKinExA技術によって測定することができる。結合親和性と解離速度は、例えば、BIAcoreを使用して、表面プラスモン共鳴によって測定される。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗Nogo受容体−1抗体またはその抗原結合断片は、リガンドに対するNogo受容体−1の結合を阻害する。このような阻害のIC50は、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、ELISA、RIA、または機能的拮抗によって、測定することができる。いくつかの実施形態においては、IC50は、0.1から500nMの間である。いくつかの実施形態においては、IC50は10から400nMの間である。さらに他の実施形態においては、抗体またはその一部は、60nMから400nMの間のIC50を有する。7E11および1H2のIC50は、結合アッセイにおいて、それぞれ、400nMおよび60nMであることが決定された。下の表3を参照のこと。
(タンパク質)
全長のNogo受容体−1は、シグナル配列、N末端領域(NT)、8個のロイシンを多く含む反復(LRR)、LRRCT領域(8個のロイシンを多く含む反復のC末端のロイシンを多く含む反復ドメイン)、C末端領域(CT)、およびGPIアンカーから構成されている(図1を参照のこと)。
本発明により、配列番号1〜9、26〜27、29〜37、および41〜45のいずれか1つのポリペプチドを含む、本発明のポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態においては、核酸は、配列番号6および8に示されるNogo受容体−1のアミノ酸残基26〜344、または配列番号8に示されるNogo受容体−1のアミノ酸残基27〜344からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態においては、核酸分子は、配列番号7および9に示されるNogo受容体−1のアミノ酸残基26〜310、または配列番号9に示されるNogo受容体−1のアミノ酸残基27〜310からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合は、「核酸」は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、およびアンチセンス分子、さらに、自然界の供給源に由来するかまたは合成されたかにはかかわらず、別の骨格をベースとするかまたは別の塩基を含む核酸を意味する。いくつかの実施形態においては、核酸にはさらに、転写プロモーターおよび状況に応じたシグナル配列を含む。これらのそれぞれは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能であるように連結される。
いくつかの実施形態においては、本発明により、配列番号1〜5、26〜27、29〜37、および41〜45からなる群より選択されるポリペプチドを含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態においては、本発明により、抗Nogo受容体−1抗体、そのような抗体の抗原結合断片、可溶性Nogo受容体−1ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを含む融合タンパク質を、それを必要としている哺乳動物に投与することによって、Nogo受容体−1活性を阻害するための方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、本発明により、コード配列を含む組み換えDNA分子(rDNA)が提供される。本明細書中で使用される場合は、rDNA分子は、分子操作が行われたDNA分子である。rDNA分子を作成するための方法は当該分野で周知である。例えば、Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。いくつかのrDNA分子においては、コードDNA配列は、発現制御配列およびベクター配列に動作可能であるように連結される。
本発明の抗Nogo受容体−1抗体、免疫原性ペプチド、可溶性Nogo受容体−1ポリペプチド、可溶性Nogo受容体−1融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によって行うことができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当該分野で周知である。これには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチド(単数または複数)のカプセル化、および核へのDNAの直接のマイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子を、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる場合もある。
本発明により、さらに、本発明のNogo受容体−1抗体、抗原結合断片、可溶性Nogo受容体−1ポリペプチド、および/または可溶性Nogo受容体−1融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、原核生物である場合も、また真核生物である場合もある。細胞株が細胞培養方法と適合しており、発現ベクターの増幅、および遺伝子産物の発現と適合している限りは、本発明のタンパク質の発現に有用である真核生物細胞は限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル、またはヒト細胞株のような脊椎動物細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。有用な真核生物細胞の例として、CCL61としてATCC(登録商標)から入手することができるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CRL1658としてATCCから入手することができるNIH Swissマウス胚性細胞NIH−3T3、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、同様の真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
本発明により、さらに、本発明のNogo受容体−1抗体もしくは抗原結合断片、可溶性Nogo受容体−1ポリペプチド、および/または可溶性Nogo受容体−1融合タンパク質を、本明細書中に記載される核酸分子を使用して産生するための方法が提供される。一般的な用語においては、組み換え形態のタンパク質の産生には、通常、以下の工程が含まれる:
最初に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。コード配列にイントロンが間に挟まっていない場合は、これはいずれの宿主での発現にも適している。
(マウスモノクローナル抗Nogo受容体−1抗体の産生)
本発明の免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチドに特異的に結合する抗Nogo受容体−1抗体を、以下の方法および手順を使用して作成した。
2つの免疫化アプローチを使用した:
(1.免疫原としてのNogo受容体−1(NogoR−1)を含むNOS−7細胞または細胞膜)
ラットNogo受容体−1遺伝子(GenBank(登録商標)No.AF462390)を、CMVプロモーターと薬剤選択のためのゲネチシン耐性遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターpEAG1256(Biogen(登録商標))にサブクローニングした。組み換えプラスミドを、Superfect(Qiagen(登録商標))を使用してCOS−7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントをゲネチシン(Gibco(登録商標)、2mg/mL)を使用して選択し、クローニングし、そしてNogo受容体−1タンパク質の表面での発現についてFACSによって確認した。COS−7膜を、記載されている手順にしたがってこれらの細胞から調製し(Wang et al.,J.Neurochem.,75:1155−1161(2000))、2回洗浄し、1mg/mL(タンパク質濃度)で10%のグリセロール中で−70℃で保存した。
ラットNogo受容体−1遺伝子配列を、Vector NTi(登録商標)ソフトウェアを使用して抗原性分析した(図2)。分析において同定した抗原性ペプチドを、標準的なグルタルアルデヒド手順を使用してキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合させた。
抗原性Nogo受容体−1ペプチドで免疫化したマウスに由来する血清をELISAによってスクリーニングし、一方、Nogo受容体−1を発現するCOS−7細胞で免疫化したマウスに由来する血清は、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。Nogo受容体−1−COS−7細胞に特異的に結合した抗体についてポジティブであるマウスをフローサイトメトリーによって同定し、屠殺した。脾細胞をマウスから単離し、記載されている(Kennett et al.,1993、Monoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological Analysis.Plenum Press,New York)ように、FL653骨髄腫(Ig−/HGPRT−Balb/cマウス骨髄腫のAPRT誘導株、10%のFBS、4500mg/Lのグルコース、4mMのL−グルタミン、および20mg/mLの8−アザグアニンを含むDMEM中で維持した)に融合させた。融合させた細胞を、24ウェルまたは48ウェルプレート(Corning Glass Works,Corning,NY)にプレートし、アデニン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培地を供給した。AAT耐性培養物を、ELISAまたはフローサイトメトリーによって、Nogo受容体−1−COS−7細胞、またはNogo受容体−1抗原性ペプチドのいずれかに対する結合について、下記のようにスクリーニングした。ポジティブであるウェルの細胞を、限界希釈によってさらにサブクローニングした。
本発明者らは、Qiagen(登録商標)RNeasy(登録商標)ミニキットを使用して全RNAを抽出し、単離したRNAからcDNAを作成した。本発明者らは、プライマー5’−TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG−3’(配列番号12)および5’−AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG−3’(配列番号25)を使用してPCRによって、軽鎖配列を増幅した。本発明者らは、プライマー5’−GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG−3’(配列番号13)および5’−GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA−3’(配列番号14)を使用してPCRによって重鎖配列を増幅した。これらのプライマーには、以下のような縮重ヌクレオチドが含まれている:SはGまたはCを示し;MはAまたはCを示し;RはGまたはAを示し;WはAまたはTを示し;KはGまたはTを示し;そしてYはTまたはCを示す。本発明者らは、PCR断片を配列決定ベクターにクローニングし、配列決定ベクターに特異的なプライマーを使用して、ジデオキシ鎖終結によってCDRのDNA配列を決定した。本発明者らは、DNA配列を概念的に翻訳し、モノクローナル抗体7E11および5B10の重鎖および軽鎖のCDR領域の部分的なアミノ酸配列を表2に示す。mAbの重鎖および軽鎖に由来する3個のCDRには、表2の中で下線を付けて示す。7E11および5B10の軽鎖は、94%のアミノ酸配列同一性を有しており、重鎖は91%のアミノ酸配列同一性を有している。mAb 7E11、5B10、と1H2は、IgG1イソ型であり、mAb 3G5と2F7は、IgG2aイソ型である。これらの5個のmAbのそれぞれは、κイソ型の軽鎖を有している。本発明者らは、このアプローチによって他のモノクローナル抗体の配列を分析した。
Mab 7E11は、ラットNgR1およびヒトNgR1の両方に結合する。7E11の結合に関与しているエピトープを決定するために、本発明者らは、ラットNgR1の断片と合成ペプチドを作成し、7E11への結合についてそれらを試験した。
上記のように産生した抗Nogo受容体−1モノクローナル抗体を、これらがNogo受容体−1に対するリガンドの結合を阻害するかどうかを決定するために試験した。
(Fab−ファージ抗Nogo受容体−1抗体の産生)
本発明の免疫原性Nogo受容体−1ポリペプチドに特異的に結合する抗Nogo受容体−1Fabファージ抗体をもまた、以下のように、Fab−ファージライブラリーをスクリーニングすることによって作成した。
(抗Nogo受容体−1モノクローナル抗体によるNogo受容体−1の免疫沈降)
免疫沈降を行うために、100μLの溶解させた細胞、または50μLのPiPLCで処理した細胞を、400または450μLの抽出緩衝液(10mMのTris−HCl(pH7.2)、0.5%のTween−20(登録商標)、0.2mMのPMSF)、またはRIPA緩衝液と、それぞれ、30μLのプロテインAまたはG、および1〜2μgの抗体の存在下で、混合した。混合物を、4℃で16時間、震盪装置の中でインキュベートした。
(ELISAによる抗体特異性の決定)
実施例1および2で産生したモノクローナル抗体およびFab−ファージ抗体の特異性を決定するために、本発明者らは、Nogo受容体−1ポリペプチドのパネルを使用してELISAを行った。パネルは、sNogoR310−Fc(ラットNogo受容体−1のアミノ酸26〜310とラットFc断片を含む融合タンパク質)、sNogoR344−Fc(上記を参照のこと)、ポリペプチドp−617(配列番号1)、ポリペプチドp−618(a19〜ラットNogo受容体−1のLRR7領域に由来するアミノ酸ポリペプチド;図2;配列11)、ならびに、ポリペプチドp−4およびp−5(それぞれ、Nogo受容体−1のLRR5およびLRRCT領域に由来するポリペプチド)から構成された。オボアルブミンおよびBSAを対照として使用した。図4に示すように、mAb 1H2、3G5、および2F7は全て、sNogoR344−Fcに特異的に結合した。同様の実験においては、これらの抗体は、ラットNogoレセプター−1のアミノ酸310〜344からなるポリペプチド(配列番号3)にも特異的に結合し、mAb 7E11および5B10はポリペプチドp−617(配列番号1)に特異的に結合した。
(神経突起成長についてのアッセイ)
ニューロンに対するCNSミエリンの阻害作用を弱める、上記で産生したモノクローナル抗体およびFab−ファージ抗体の能力を試験するために、Lab−Tek(登録商標)培養スライド(4ウェル)を、0.1mg/mLのポリ−D−リジン(Sigma(登録商標)))でコーティングした。CNSミエリンまたはPBSを、3μLの液滴としてスポットした。蛍光ミクロスフェア(Polyscience)を、ミエリン/PBSに添加して、後で液滴が同定できるようにした(Grandpre et al.,Nature 403,2000)。その後、Lab−Tek(登録商標)スライドをリンスし、10μg/mLのラミニン(Gibco(登録商標))でコーティングした。P3−4 Sprague Dawleyラットの子供から後根神経節(DRG)を取り出し、1mg/mLのコラゲナーゼ1型(Worthington)で解離させ、炎磨きパスツールピペット(fire−polished Pasteur pipette)で粉末状にし、ニューロン細胞を多く含むように予めプレーティングし、最後に予めコーティングしたLab−Tek(登録商標)培養スライド上に23,000細胞/ウェルでプレートした。培養培地は、5%の熱不活化ドナーウマ血清、5%の熱不活化ウシ胎児血清、および50ng/mLのmNGFを含むF12とし、37℃、5%のCO2で6時間インキュベートした。15μg/mLのmAb 7E11を、プレーティングの直後に添加した。
(Nogo受容体−1でトランスフェクトした細胞についての7E11を用いた免疫組織化学)
実施例1に記載したように産生した抗Nogo受容体−1 mAbの結合特性をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ラットNogo受容体−1またはヒトNogo受容体−1を発現する、固定されたおよび生存しているCOS−7または293細胞の両方に対する結合を比較した。
Nogo受容体−1でトランスフェクトした細胞と、トランスフェクトしていない細胞を、8ウェルLab−Tek(登録商標)培養スライド中にプレートし、PBS中の、4%のパラホルムアルデヒドで15分間固定し、10%の正常なヤギの血清、0.1%のTriton X−100で1時間ブロックした。Mab 7E11を、ブロッキング溶液中で15μg/mL、および1.5μg/mLで添加し、室温で2時間インキュベートした。Alexa(登録商標)結合二次抗体抗マウス(Molecular Probes)を、ブロッキング溶液中で1:300希釈で1時間インキュベートし、DAPIを全ての核種を標識するために二次抗体に対して5μg/mLで添加した。
トランスフェクトした細胞と、トランスフェクトしていない細胞を、8ウェルLab−Tek(登録商標)培養スライド中にプレートし、FACS緩衝液(4%のドナーウマ血清を含む)で、4℃で30分間ブロックし、FACS緩衝液中の15μg/mL、および1.5μg/mLの7E11とともに、4℃で1時間インキュベートし、リンスし、二次抗体抗マウス−Alexa(登録商標)(FACS緩衝液中で1:300希釈)とともに4℃で30分間インキュベートした。
(脊髄挫傷のマウスモデル)
生体内でのニューロンに対する実施例1で産生した抗Nogo受容体−1 mAbの効果を試験するために、本発明者らは、マウスの脊髄挫傷モデルを使用した。
(可溶性Nogo受容体−1融合タンパク質の特徴づけ)
可溶性Nogo受容体−1ポリペプチド(sNogoR−1)および融合タンパク質(Fc−sNogoR−1)を特徴付けるために、本発明者らは以下の実験を行った。
(可溶性Nogo受容体−1融合タンパク質に対するリガンドの結合の阻害)
実施例8の結合アッセイと同様の結合アッセイを、実施例1で産生した2つのmAbの、sNogoR344−Fcに対する125I−Nogo66の結合を阻害する能力を試験するために使用した。Mab 2F7および3G5は、sNogoR344−Fcに対する125I−Nogo66の結合を阻害した。
(神経突起成長アッセイ)
Lab−Tek(登録商標)培養スライド(4ウェル)を、0.1mg/mLのポリ−D−リジン(Sigma(登録商標)))でコーティングした。CNSミエリンのみ、あるいは、sNogoR310、sNogoR310−Fc融合タンパク質、mAB 5B10、または対照としてのPBSと混合したCNSミエリンを、3μLの液滴として別々にスポットした。蛍光ミクロスフェア(Polyscience)を、ミエリン/PBSに添加して、後で液滴が同定できるようにした(Grandpre et al.,Nature 403,2000)。その後、Lab−Tek(登録商標)スライドをリンスし、10μg/mLのラミニン(Gibco(登録商標))でコーティングした。
(Fc−sNogoR−1融合タンパク質の産生および精製)
ラットNogo受容体−1のアミノ酸1〜310をコードするcDNA構築物を、哺乳動物発現ベクター中に含まれるラットIgG1 Fcに融合させ、このベクターをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)(DG44)細胞にエレクトロポレーションした。細胞を、10%の透析したウシ胎児血清、2mMのグルタミン、および抗生抗かび剤を補充したα−MEM中で維持した。トランスフェクションの2日後、馴化培地を回収し、還元条件下でのウェスタンブロットによって分析した。約60kDaのタンパク質のバンドを、ポリクローナルウサギ抗Nogo受容体−1抗体を使用して検出した。細胞を増殖させ、R−PE結合ヤギ坑ラットIgG抗体を使用して分類した。2回目の分類の後、細胞を、96ウェルプレートに1細胞/ウェルの密度でプレーティングした。個々のウェルから分泌された可溶性Nogo受容体−1タンパク質のレベルを試験し、サンドイッチELISAを使用して比較した。ELISAプレートを、ヤギ坑ラットIgG Fcκ特異的抗体を用いてコーティングした。馴化培地をアプライした。結合した可溶性Nogo受容体−1タンパク質を、HRP結合ロバ抗ラットIgG Fab、Fc特異的抗体によって検出した。クローン4C12は最も高い分泌レベルを有していた。4C12を、スピナーフラスコの中のCHO−M7培地中で拡大、増殖させた。分泌レベルは、37℃で約10mg/Lであった。
(脊髄離断アッセイ)
生体内で機能回復を促進するそれらの能力を試験するために、sNogoR−1融合タンパク質を、ラットの脊髄離断アッセイにおいて試験した。
(ラットの脊髄挫傷アッセイ)
生体内でのニューロンに対する可溶性Nogo受容体−1ポリペプチドおよび融合タンパク質の作用を、ラットの脊髄挫傷アッセイにおいて試験した。
(トランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の発現)
本発明者らは、生体内で発現させた場合のその効果を試験するために、可溶性Nogo受容体−1タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作成した。
(損傷の後のトランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の発現)
本発明者らは、背部の全片側切断(over−hemisection)損傷を行うことにより、トランスジェニックマウスにおけるsNogoR310の発現に対するCNS損傷の影響を試験した。本発明者らは、実施例14に記載したようにヘテロ接合型の雄をC57/BL6雌と交配させることによって、sNogoR310トランスジェニックマウスと、トランスジェニックではない対照動物を得た。
(分泌されたsNogoR310はトランスジェニックマウスにおいてCSTの萌芽を誘導する)
本発明者らは、トランスジェニックマウスにおける病変の周辺でのsNogoR310の発現の増大が損傷を受けた軸索の再生を生じるかどうかを試験した。
(sNogoR310トランスジェニックマウスにおいては、CST軸索の再生により病変部位を回避して脊髄の先端へとバイパスする)
本発明者らは、トランスジェニックマウスから、病変部位に対して吻側4mmから尾側4mmの脊髄(合計8mm長)を単離した。これを、グルタルアルデヒド重合アルブミンマトリックスに包埋し、ビブラトーム(vibratome)(30μmの厚み)の上で傍矢状に切断した。本発明者らは、損傷部位に対して吻側5〜7mm、尾側5〜7mmの脊髄から、横断切片(50μm)を回収した。ラットにおけるsNogoR310−Fcの注射実験のために、病変部位から、吻側10mmから尾側10mmまでまたがる脊髄を、バイブレーションミクロトーム上で傍矢状(50μm)に切断した。横断切片を、損傷部位に対して吻側11〜16mmから尾側11〜16mmの脊髄から回収した。本発明者らは、これらの切片を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、ニッケル増強ジアミノベンジジンHRP反応によってBDAトレーサーを視覚化した(Grandpre,2002,Nature,417,547−551)。本発明者らは、間接的な免疫蛍光によって、セロトニン免疫組織化学(抗−5−HT抗体)のためにいくつかの切片を処理した。病変の領域を視覚化するために、本発明者らは、いくつかの切片を、GFAPに対する抗体(Sigma(登録商標)St.Louis,MO)で二重染色した。本発明者らは、封入剤で切片を封入し、脱水し、保護した。
(sNogoR310のトランスジェニックでの発現は運動機能の回復を改善する)
CST軸策の追跡およびセロトニン作動性線維の分析は、トランスジェニックマウスにおいて星状細胞から分泌されたsNogoR310が、脊髄の損傷をうけた下行軸索の広範囲の解剖学的再生を刺激することを示している。本発明者らは、これらの再生した線維が機能の回復に利点をもたらすかどうかを決定するために、実施例12に記載したいくつかの行動試験を行った。
(sNogoR310−Fcタンパク質の髄腔内投与によりCSTの萌芽が誘導される)
脊髄の外傷後の可溶性Nogo受容体−1の成長促進の利点についての第2の試験として、本発明者らは、精製したタンパク質を髄腔内投与した。
(sNogoR310で処置したラットにおいて、CST軸索は脊髄の先端へと再生する)
本発明者らは、雌のSprague−Dawleyラット(190〜250g)に深く麻酔をかけ、T6〜7の脊髄レベルで椎弓切除術を行い、脊髄を露出させた。本発明者らは、脊髄の背部の半分を、30ゲージ針と一対のマイクロシザーズで切断し、CSGT経路の背部を完全に切断し、11番手術用メスの鋭い部分を脊髄の背部の半分を横断させることにより、病変の深さ(1.8mm)を確保した(Grandpre et al.,2002,Nature,417,547−551)。PBS中の1.2mgのラットIgG、またはPBS中の1.2mgのsNogoR310−Fc融合タンパク質を充填した浸透圧ミニポンプ(Alzet(登録商標)、2ML4、2mLの容量、2.5μL/h、28日間の投与)を、動物の背中の皮膚の下の筋肉に埋め、縫合した。ミニポンプの出口に接続したカテーテルを、硬膜の中の小さな穴を通じてT7〜8のレベルで脊髄の髄腔内空間に挿入した。
(局所sNogoR310−Fcは、損傷を受けたラットの脊髄において赤核脊髄およびセロトニン作動性軸索の萌芽を誘導する)
片側切断の14日後、バーホールを、CST線維の軌跡をたどるために、下肢の感覚運動皮質に重なる頭蓋骨のそれぞれの側に空けた。順行性のニューロンのトレーサーであるBDA(PBS中に10%、3.5μL/皮質)を、それぞれの側の硬膜から1.5mmの深さの7個の注射部位に注射した(Grandpre,2002)。ラットにおいて赤核脊髄路の軌跡をたどるために、トレーサーBDA(1μL:MW 10,000;PBS中10%
)を、左側の赤核(ブレグマの前方5.8mm、0.7mm側方、頭蓋骨表面に対して7.0mm腹部側)に注射した。BDAの注射の2週間後、これらの動物にBPSを潅流させ、その後、4%のパラホルムアルデヒドを潅流させ、組織を組織学のために採取した。
(sNogoR310−Fcでの局所処置によりラットにおける機能回復が改善する)
sNogoR310−Fcタンパク質の髄腔内投与により、外傷性脊髄損傷後にいくつかの下方路において軸索の再生が刺激される。本発明者らは、このタンパク質により、損傷を受けた脊髄における機能回復もまた改善されるかどうかを試験した。
ハイブリドーマHB 7E11(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4587)、HB 1H2(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4584)、HB 3G5(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4586)、HB 5B10(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4588)、およびHB 2F7(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4585)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(「ATCC(登録商標)」、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209,USAに、2002年8月9日に寄託した。
Claims (29)
- AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(配列番号26);LDLSDNAQLR(配列番号27);LDLSDDAELR(配列番号29);LDLASDNAQLR(配列番号30);LDLASDDAELR(配列番号31);LDALSDNAQLR(配列番号32);LDALSDDAELR(配列番号33);LDLSSDNAQLR(配列番号34);LDLSSDEAELR(配列番号35);DNAQLRVVDPTT(配列番号36);DNAQLR(配列番号37);ADLSDNAQLRVVDPTT(配列番号41);LALSDNAQLRVVDPTT(配列番号42);LDLSDNAALRVVDPTT(配列番号43);LDLSDNAQLHVVDPTT(配列番号44);およびLDLSDNAQLAVVDPTT(配列番号45)からなる群より選択される、ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
- 発現制御配列に動作可能に連結された、請求項2に記載の核酸。
- 請求項2または3に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項2または3に記載の核酸を含むか、あるいは、請求項4に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリペプチドを産生する方法であって、以下の工程:
(a)請求項5に記載の宿主細胞を培養する工程;および
(b)該宿主細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する工程
を含む、方法。 - 抗体を産生する方法であって、以下の工程:
(a)請求項1に記載のポリペプチドまたは請求項5に記載の宿主細胞で、宿主を免疫化する工程;および
(b)該抗体を回収する工程
を含む、方法。 - 請求項7に記載の方法によって産生された抗体、または、該抗体の抗原結合断片。
- 請求項1に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体は、ハイブリドーマ細胞株HB 7E11(ATCC(登録商標)登録番号PTA−4587)によって産生されるモノクローナル抗体ではない、抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項8または9に記載の抗体または抗原結合断片であって、該抗体は、
(a)ニューロンの成長円錐の崩壊を阻害する;
(b)ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させる;ならびに
(c)リガンドに対するNogo受容体−1の結合を阻害する、
抗体または抗原結合断片。 - 前記神経突起成長および萌芽が軸索成長である、請求項10に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記ニューロンが中枢神経系ニューロンである、請求項10に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項8または9に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記抗体がマウス抗体である、請求項8または9に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体からなる群より選択される、請求項8または9に記載の抗体。
- リガンドへのNogo受容体−1の結合を阻害する方法であって、Nogo受容体−1を請求項10に記載の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 前記リガンドが、NogoA、NogoB、NogoC、MAG、およびOM−gpからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- ニューロンにおける成長円錐の崩壊を阻害するための方法であって、該ニューロンを請求項10に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- ニューロンにおける神経突起成長および萌芽の阻害を減少させるための方法であって、該ニューロンを請求項10に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 前記神経突起成長または萌芽が軸索成長である、請求項19に記載の方法。
- 前記ニューロンが中枢神経ニューロンである、請求項18または19に記載の方法。
- 薬学的に許容される担体と、請求項8または9に記載の抗体または抗原結合断片とを含む、組成物。
- 1つ以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法であって、該ニューロンを、有効量の請求項8または9に記載の抗Nogo受容体−1抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 前記ニューロンがインビトロにある、請求項24に記載の方法。
- 前記ニューロンが哺乳動物中にある、請求項24に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、多発性硬化症、ALS、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、脳卒中、外傷性脳損傷、または脊髄損傷の兆候または症状を呈する、請求項26に記載の方法。
- 哺乳動物において死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する方法であって、
(a)請求項8または9に記載の抗Nogo受容体−1抗体またはその抗原結合断片を発現する培養された宿主細胞を提供する工程;および
(b)該ニューロンの部位またはその付近において、哺乳動物中に宿主細胞を導入する工程
を含む、方法。 - 哺乳動物中にある死滅の危険性があるニューロンの生存を促進する遺伝子治療方法であって、請求項8または9に記載の抗Nogo受容体−1抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを、該ニューロンの部位またはその付近に投与する工程を含み、該抗Nogo受容体−1抗体または抗原結合断片は、該哺乳動物中のヌクレオチド配列から、該ニューロンの生存を促進するために十分な量で発現される、方法。
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