KR19990007893A - 중추신경계（ｃｎｓ） 축삭 성장 모듈레이터, 이를 구현 및 사용하는 조성물, 세포 및 방법 - Google Patents

중추신경계（ｃｎｓ） 축삭 성장 모듈레이터, 이를 구현 및 사용하는 조성물, 세포 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경중추 성장을 증진하는 신경교 세포 및 마이린 상에 발견되는 억제 분자의 큐를 극복하는 신경세포접착분자를 투여함에 의하여 포유류 중앙 신경 계의 생체내 신경성장을 증진하는 방법에 관한다. 또한 그들의 활성 분획, 인식자, 협동근, 미믹스,유사물,분비세포 및 용해성 분자와 마찬가지로 그들에 대한 항체 와 그들을 표징하는 것이 가능한 DNA 분자,벡터 및 변형 세포에 관한 것이다.또한 본 발명은 차등 아스트로사이트 내의 신경 접착 분자를 표출하는 전이유전자 마우스 라인 및 그들로부터 유도되는 세포 및 조직을 포함한다.신경 접착 분자의 표출은 그들 전이유전자 마이스롤부터 유도되는 중앙신경계 조직의 축삭 외성장을 증진한다. 본 발명은 또한 CNS 뉴론의 기억을 증진하고 시냅 효율을 증가하기 위한 방법에 있다. 또 신경 접착 분자의 효과를 조정하는 시험약물 및 이러한 방법에 적합한 시금 계의 시금 계의 시험 방법이다.
CNS 축삭 외성장 조정제 및 조성물, 세포 그리고 그 실시 및 사용방법임

Description

중추신경계（ＣＮＳ） 축삭 성장 모듈레이터, 이를 구현 및 사용하는 조성물, 세포 및 방법
축삭을 연상시키는 뉴우런의 능력은 발육(development)중에 뉴우런 커넥션들을 설정하는데 있어 가장 중요하다. 이는 또한 재생(regeneration)중에 병변의 결과로서 파괴되는 연결들을 재절정하는데 요구된다.
축삭은 모든 돌물종의 중추 및 말초신경계 양자 모두에서 발육 중에 풍부하게 신장한다[Cajal(1978) 신경계에서 퇴화 및 재생, 옥스퍼드 대학 출판부, 런던]. 이러한 현상은 축삭 및 수상돌기에서 일어난다. 그러나, 성체(adult)들에서, 중추신경계에서 축삭 및 수상돌기 재성장(regrowth)은 진화진행중에 점증적으로 상실된다.
말초신경계에서, 병변이 가해진 후, 모든 척추동물종의 축삭은 재성장할 수 있다[Cajal(1928); Martini(1994), J. Neurocytol. 23:1-28]. 그러나, 포유돌물에서, 손상에 따른 축삭 재성장은 축삭발육으로 제한된다. 그러나, 뉴우런 프로세스의 재성장은 하등 척추동물 종에서 가능하다[Stuermer 등 (1992) J. Neurobiol, 23:537-550]. 이에 반하여, 중추신경계에서, 전부는 아니지만 대부분의 경우 고등 및 하등 척추동물 성체의 뉴우런은 축삭성장의 잠재성을 갖고 있다[Aguayo(1985) 성제 포유동물 중추신경계에서 손상된 뉴우런으로부터 축생 재생 In: Synaptic Plasticity (Cotman. C.W., ed) New York, The Guilford Press, pp. 457-484].
글리아 세포(glial cell)가 축삭 재성장을 조절하는 결정인자이다. 포유동물 글리아세포는 일반적으로 발육 중에 중추신경계에서 (Silver 등(1982) J. Comp. Neurol. 210:10-29; Miler 등(1985) Develop. Biol. 111:35-41; Pollerberg 등(1985) J. Cell Biol. 101:1921-1929] 그리고 성체 말초신경계에서 [Fawcett 등(1990) Annu. Rev. Neurosci 13:43-60] 축삭발전을 허용한다. 즉, 변병부과시, 성체 포유동물 말초신경계의 글리아 세포들은 그들의 초기 축삭 발전-촉진 잠재성에 동일한 정도로 복귀하여 이들이 재생을 촉진하도록 한다[Kalderon(1988), J. Neurosci Res. 21:501-512; Kliot 등 성체 포유동물 척수 내로 배측근 섬유의 유도재생 In: Current Issues in Neural Regeneration, New York, pp. 311-328; Calstedt 등(1989) Brain Res. Bull. 22:93-102]. 일부 하등 척추동물의 중추신경계의 글리아세포는 성체기에서 축삭 재성장을 여전히 허용한다[Stuermer 등(1992) J. Neurobiol. 23:537-550]. 이와는 달리, 성체 포유동물의 중추신경계의 글리아세포는 변병에 따른 축삭 재성장에 도움을 주지 않는다.
축삭성장의 촉진 및/또는 저해에 기초하는 분자큐(molecular cue)로서 작용하는 몇몇 인식분자들이 확인되어 있다(Martini(1996). 축삭 발전 촉진 인식분자들중에서, 신경세포밀착분자 L1은 축삭발전을 중개하는 주도적인 역할을 한다[Schachner(1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507]. L1-의존 축삭발전은 동종친화성 상호작용(homophilic interaction)에 의해 중개된다. L1은 축삭들 및 시반세포(Schwann cell)를 표현하는 L1상에 그리고 L1 트랜스팩티드 섬유아세포(transfected fibroblast)상에 축삭발전을 향상시킨다[Bixby 등(1982) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84:2555-2559; Chang 등(1987) J. Cell. Biol. 104:355-362: Lagenaur 등(1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84:7753-7757; Seilheimer 등 (1988) J. Cell. Biol. 107:341-351; Kadmon 등 (1990a) J. Cell. Biol. 110:193-208: Williams 등 (1992) J. Cell. Biol 119:883-892]. L1의 표현은 성체 생쥐의 말초신경을 절단 또는 분쇄한 후에 극적으로 향상된다[Nieke 등 (1985) Differentiation 30:141-151; Martini 등(1994a) Glia 10:70-74]. 2일 이내에 L1은 뉴우런이 아니라 시반세포의 세포표면에서 주로 집중되는 뉴우런과 시반세포간의 접촉위치에서 축적한다[Martini 등 (1994a)]. 더욱이, L1의 동종친화성 결합능력은 신경세포 밀착분자 N-CAM과 분자 연합에 의해 향상되어 결합이 동종친화성 조력을 통해 발생하도록 허용한다[Kadmon 등(1990a); Kadmon 등(1990b) J. Cell Biol. 110:209-218 및 110:193-208; Horstkorte 등(1993) J. Cell. Biol. 121:1409-1421]. 그 축삭 발전 촉진 특성이외에도 L1은 또한 세포밀착[Rathjen 등(1983) EMBO J. 3:1-10; Kadmon 등 (1990b) J. Cell. Biol. 110:209-218; Appel 등 (1993) J. Neurosci, 13:4764-4775], 과립세포 마이그레이션[Linder 등(1983) Nature 305:427-430) 및 축삭의 유슈화[Wood 등(1990) J. Neurosci 10:3635-3645]에 기여한다.
L1은 여섯 개의 면역글로블린류 도메인 및 다섯 개의 화이브로넥틴(fibronectin)형 Ⅲ 상동 반복단위(repeat)로 이루어진다. L1은 신호 트랜스듀서로 작용하며, 이에 따라 인식프로세스가 세포내 메신저(intracellular messenger)의 정상상태레벨에 변화를 유도하는 컵플렉스 시리즈의 이벤트들에서 제1단계가 된다. 세포내 메신저는 이노시톨 포스페이트, Ca2+ , pH 및 사이클릭 뉴클레오티드를 포함할 뿐만 아니라[Schuch 등(1990) Neuron 3:13-20; von Bohlen 및 Hallbach 등(1992) Eur. J. Neurosci. 4:896-909: Doherty 등(1992) Curr, Opin. Neurobiol. 2:595-601] 단백질 키나제 C 및 pp60c-src 와 같은 단백질 키나제외 활성의 변화를 포함한다[Schuch 등(1990) Neuron 3:13-20; Atashi 등(1992) Neuron 8:831-842]. L1은 또한 카제인형 Ⅱ 키나제 및 L1을 포스포릴화하는 또하나의 미확인 키나제와 연관이 있다[Sadoul 등 (1989) J. Neurochem 328:251-254]. L1-중개 축삭발전은 L형 Ca2+ 채널의 봉쇄 및 백일해 독소에 민감하다. 이러한 발견들은 L1-중개 축삭발전에서 Ca2+ 와 G 단백질 양자의 중요성을 보여준다[Williams 등 (1992) J. Cell. Biol. 119:883-892]. L1은 또한 배양액에서 증식하는 미숙 성상교세포상에 존재하며, 이러한 세포들에서 축삭발전은 분화된 L1 면역음성 성상교세포 보다 훨씬 더 촉진된다[Saad 등 (1991) J. Cell. Biol. 115:474-484]. 그러나, 생체 내에서, 성상교세포는 배 13일로부터 성체기 까지 시험된 어느 발육단계에서 L1을 표현하는 것이 발견되었다[Bartsch 등 (1989) J. Comp. Neurol 284:451-462: 그리고 미발표 데이터].
축삭 발전을 촉진하는 것이 L1의 능력이라고 가정하면, L1의 성상교세포 표현 및 L1이 속한 면역글로블린 상과의 다른 멤버들이 성체 중추신경계에서 글리아세포 및 미엘린(myelin)에 존재하는 것으로 보고된 억제적인 분자큐를 잠정적으로 극복할 수 있는 지의 여부를 조사하는데 적절하다[Schachner 등, Perspective in Developm. Neurobiol. In Press: Schwab 등(1993) Ann. Rev. Neurosci. 16:565-595]. 이것은 CNS의 신경조직의 기형 또는 상해에 의해 유발되는 무기력(debilitation)을 치료하는데 효과적인 방법과 특별한 관련이 있으며, 이는 본발명이 지향하는 목적과 부합한다.
발명의 개요
본 발명에 의하면 신경성장, 구체적으로는 중추신경계(CNS)의 구획에서 촉진될 수 있는 성장, 특히 유슈화된 신경조직에서 성장을 변조하기 위한 시제 및 방법이 제시된다. 본발명의 시제는 전통적으로 기지의 축삭 발전 인자들의 자극을 촉진하는 성장에 대한 억제작용으로서 관측되어온 환경에서 이러한 신경성장을 촉진하는 능력이 탁월하다. 특히, 이러한 억제환경은 중추신경계에서 글리아세포 및 미엘린에 존재하는 억제 분자큐를 포함한다.
본발명의 시제는 세포밀착분자들, 보다 바람직하게 신경세포밀착분자들의 군에서 광범위하게 선택된다. 가장 바람직하게 본 발명의 시제는 면역글로블린 상과, 특히 Ca2+ -독립 뉴우런 세포 밀착을 중개하는 멤버들의 속하는 분자들의 군에서 선택된다. 이러한 멤버들의 특별한 예가 L1, N-CAM 및 미엘린-연관 당단백이다. CNS 신경성장에 또한 영향을 미칠 수 있는 다른 세포 밀착분자들로는 라미닌, 화이브로넥틴, N-카드헤린, BSP-2(마우스 N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1(악소닌-1) Ng-CAM 및 F3/F11이 있다.
본 발명의 또한 태양에 있어서, 본 발명의 시제는 여기서 신경인식분자들의 l1과로서 칭해지는 새로운 과에 속한다. 이 과는 L1, NgCAM, 뉴로패신, 드로소필라 뉴로글리안, 지브라휘시 L1.1 및 L1.2 등을 포함한다. 이 군의 시제는 모두 L1의 특성인 Ig류 도메인과 FN류 반복단위를 보여주며, 이 커넥션에서 현저한 상결성, HNK-1 카보하이드레이트 구조를 포함하는 고도의 N-글리코시드적으로 링크된 카보하이드레이트, 주요 185 KD 밴드 및 165 및 125 KD의 보다 작은 밴드들을 포함하는 단백질 단편들의 패턴을 나타낸다.
본 발명의 시제는 또한 세포 밀착 분자들 및 동족 분자들의 절편들, 협동작용물(congener) 및 CNS에서 축삭 성장을 변조하는 유사물(mimic)들을 포함한다. 특히 본 시제는 세포외 매트릭스 분자의 구조적 모티프 특성을 내포하는 분자들, 특히 화이브로넥틴 형 Ⅱ 상동 반복단위들 및 면역글로블린류 도메인들을 내포하는 분자들을 포함한다. 바람직하게, 이러한 구조적 모티프들은 화이브로넥틴 형 Ⅲ 상동 반복단위 1-2 및 면역글로블린류 도메인 Ⅰ-Ⅱ, Ⅲ-Ⅳ 및 Ⅴ-Ⅵ와 구조적으로 유사한 것을 포함한다.
본 발명은 생체내에서 신경재생을 촉진 및 향상시키는 방법, 플라스미드, 벡터, 트랜스겐 등과 같은 대응하는 유전자 구조, 약제학적 조성물, 이러한 방법의 목적을 달성하기 위하여 사용되는 모든 것에 미친다. 보다 특별하게, 본 발명의 시제는 벡터 또는 플라스미드로서 제조될 수도 있고, 재생이 필요한 CNS에서 임의 부위에 위치한 신경세포내로 예를 들어 본 발명의 시제의 표현을 유발하고 이에 의해 필수적인 신경 성장을 촉진하기 위한 유전자 요법에 의하여 도입될 수도 있다. 또하나의 방법은 예를 들어 비경구 투여에 의해서, CNS 부위에 유사한 방식으로 직접 운반될 수 있는 조성물 중의 하나 이상의 적절한 시제들의 포뮬레이션을 기대한다. 예를 들어 L1과 같은 특정 시제는 동족친화성 결합을 나타내긴 하지만, 이러한 조성물의 투여는 신경성장을 촉진하는 목적보다는 억제하는 목적으로 작용할 수도 있다. 이러한 효과는 원하지 않는 또는 조절되지 않은 성장이 발생하거나 또는 발생중인 경우와 같은 특별한 경우에 적합할 수도 있으므로 본발명은 이러한 용도에도 미치는 것이다.
이와 유사하게, 동종친화성 결합에 작용하는 본 시제의 능력은 작용약(agonist)으로 작용가능하며 이에 의해 신경 성장 및 재생의 촉진에 참여하는, 항체를 포함하는, 시제에 대한 길항질을 제공한다. 즉, 본 발명은 여기에 제시되는 치료 목적으로 본 시제에 대한 항체를 포함하는 적절한 구조 및 조성물의 제조에 미친다. 또한 다음에 설명되겠지만, 예를 들어 L1에 대한 항체는 본 발명에 따라 활성을 보유하며 진단 및 치료에 이용할 수 있는 또한 시제를 검정하기 위한 의약발견검정 등의 일부로서 활용할 수도 있다. 특히, CHL1, L1 유사체의 분리 및 특성과 관련하여 후술되겠지만, 폴리클론 항체와 같은 항체는 L1 CAM과의 멤버들을 또한 검정하는데 사용될 수 있으므로 본 발명은 이러한 항체의 사용에 의해 분리되는 이러한 CAM 멤버에도 미친다. 본 발명은 또한 진단용도를 포함한다. 예를 들어, 본 시제의 1종 이상의 존재, 양 또는 활성의 검출 및 측정에 의해 CNS 신경성장의 잠재성 또는 실제 발전을 평가하는 것이 바람직할 수도 있다. 이와 마찬가지로, 후술되겠지만, 본 발명은 CNS 신경성장의 변조에서 본 발명 시제의 활성을 이용하는 의약발견검정을 포함하는 검정방법에도 미친다. 예를 들어, 예기되는 의약이 본발명의 시제를 포함하는 검정에 의해 CNS 신경성장 변조를 위하여 시험될 수 있으며, 이와 관련지어 개발된 세포라인 또는 배양액을 검정시스템으로 활용할 수 있다.
간단하게 말해서, 본 발명은 또한 분화된 성상교세포 및 글리아 세포, 여기서 파생된 세포 및 조직에서 신경밀착분자를 표현하는 트랜스게닉(transgenic) 마우스 라인에 특징이 있다. 특히, 신경밀착분자는 L1이다. 아스트로글리알(astroglial) L1 표현은 이러한 트랜스게닉 마우스에서 파생된 중추신경계조직에서 축삭 발전을 향상시킨다.
또한 설명되는 바와 같이, 본 발명은 장기간 CNS 뉴우런의 뉴우런 발전을 향상시키기 위한 방법, 기억을 향상시키기 위한 방법, 상승작용의 안정화에 의해 측정되는 시냅틱 효율(synaptic efficacy)을 증가시키기 위한 방법, 그리고 이와 유사하게 유용한 방법에 특징이 있다. 또한 본발명은 신경밀착분자의 효과를 보조하는 의약 및 기타 조작을 시험하는 방법들, 그리고 이러한 방법들에 적합한 검정 시스템에 특징이 있다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 트랜스게닉 포유동물, 외래의 신경밀착분자를 표현하는 글리아세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 트랜스게닉 포유동물의 글리아세포를 포함하는 세포배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 트랜스게닉 포유동물의 신경계의 병변이 있는 또는 없는 시신경 또는 다른부분을 포함하는 세포배양시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 글리아세포 배양시스템상에 뉴우런을 배양하는 것을 포함하는 CNS 뉴우런의 뉴우런 발전을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 세포배양시스템에 놓인 신경계의 시신경 또는 다른 부분에 대한 뉴우런을 배양하는 것을 포함하는 CNS 뉴우런의 뉴우런 발전을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 이식된 세포에 의한 신경밀착세포의 분비를 포함하는 CNS 뉴우런의 뉴우런 발전을 향상시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 기억향상의 필요시에 포유동물의 뇌에 포유동물의 신경을 향상시키는데 효과적인 글리아세포 배양 시스템의 일정량의 세포를 투여하는 것을 포함하는 기억을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 기억향상의 필요시에 포유동물의 뇌에 포유동물의 기억을 향상시키는데 효과적인 세포배양시스템에 있는 신경계의 시신경 또는 다른 부분의 세포 일정량을 투여하는 것을 포함하는 기억을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 기억향상의 필요시에 포유동물의 뇌의 글리아세포에 글리아세포의 신경밀착분자의 표현을 허용하는 벡터를 전달하는 것을 포함하는 기억을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 이식된 세포에 의한 신경밀착분자의 분비를 포함하는 기억을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 증대시킬 필요가 있을 시에 포유동물의 뇌에 시냅틱 효율을 증가시키기에 효과적인 글리아세포배양시스템의 세포 일정량을 포유동물의 뇌에 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 CNS에서 시냅틱 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 증가시킬 필요가 있을 시에 포유동물의 뇌에 시냅틱 효율을 증가시키기에 효과적인 글리아세포 배양시스템에 있는 신경계의 시신경 또는 다른 부분의 세포 일정량을 포유동물의 뇌에 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 CNS에서 시냅틱 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 향상시킬 필요가 있을 시에 포유동물의 뇌의 글리아세포에 글리아세포의 신경밀착분자의 표현을 허용하는 벡터를 전달하는 것을 포함하는 포유동물의 CNS에서 시냅틱 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 이식된 세포에 의한 신경밀착분자의 분비를 포함하는 포유동물의 CNS에서 시냅틱 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 글리아 세포 배양시스템에 CNS 뉴우런을 부가하고, 세포배양시스템에 시험하에 의약을 부가하고, CNS 뉴우런의 뉴우런 발전의 수준을 측정하고, 신경밀착분자의 활성을 변조하기 위한 의약의 능력에 약이 부가되지 않은 대조 배양액과 비교하여 의약의 존재시에 세포의 뉴우런 발전 수준의 차이를 대비하는 것을 포함하는 신경밀착분자의 활성을 변조하기 위한 의약 또는 다른 존재물의 능력을 시험하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 신경계 세포 배양시스템의 시신경 또는 다른 부분에 CNS 뉴우런을 부가하고, 세포배양시스템에 시험하에 의약을 부가하고, CNS 뉴우런의 뉴우런 발전의 수준을 측정하고, 신경밀착분자의 활성을 변조하기 위한 의약의 능력에 약이 부가되지 않은 대조 배양액과 비교하여 의약의 존재시에 세포의 뉴우런 발전 수준의 차이를 대비하는 것을 포함하는 신경밀착분자의 활성을 변조하기 위한 의약 또는 다른 존재물의 능력을 시험하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 글리아 세포 배양 시스템과 여기에 부가된 CNS 뉴우런을 포함하는 세포밀착분자의 생성을 변조하기 위한 능력에 대하여 의약 및 다른 시제를 집단검진하기 위한 검정 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 의약 또는 시제로 접종된 글리아세포 배양 시스템을 배양하고, 세포배양시스템에 CNS 뉴우런을 부가하고, 의약의 효과를 확인하기 위하여 뉴우런 발전을 시험하는 것을 포함하는 세포밀착분자의 생성을 변조하기 위한 능력에 대하여 의약 및 다른 시제를 집단검진하기 위한 검정 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 의약 또는 시제로 접종된 세포 배양 시스템에 신경계의 시신경 또는 다른 부분을 배양하고, 세포배양시스템에 CNS 뉴우런을 부가하고, 의약의 효과를 확인하기 위하여 뉴우런 발전을 시험하는 것을 포함하는 세포밀착분자의 생성을 변조하기 위한 능력에 대하여 의약 및 다른 시제를 집단검진하기 위한 검정 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또한 목적은 의약 또는 시제로 CNS 뉴우런의 배양액을 접종하고, 가용성 신경밀착분자를 부가하고, 의약의 효과를 확인하기 위하여 뉴우런 발전을 시험하는 것을 포함하는 세포밀착분자의 생성을 변조하기 위한 능력에 대하여 의약 및 다른 시제를 집단검진하기 위한 검정 시스템을 제공하는 것이다.
기타의 목적 및 장점들은 첨부도면을 참조한 다음의 상세한 설명을 검토한 당분야의 전문가에게 명백하게 될 것이다.
본 발명은 일반적으로 중추신경계에서 신경 성장의 변조(modulation)에 과난 것으로, 보다 구체적으로는 중추신경계(CNS) 신경성장을 향상시키기 위한 방법, 관련 시제, 구조(construct) 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이러한 신경성장을 촉진하고 향상시키기 위한 세포밀착분자(cellular adhesion molecule), 보다 바람직하게 L1과 같은 신경세포밀착분자에 관한 것이다.
도1은 GFAP-L1 키머릭 트랜스겐(chimeric transgene)의 지도를 도시한 것이다. Not I 링커를 사용하여 수정된 GFAP 유전자의 엑손(exon) 1에 4.05 kb 마우스 L1 cDNA가 삽입되었다. 이러한 구조에서, L1 cDNA는 SV40 레이트 유전자 스플라이스(V)에 의해 5'에 선행하고 SV40 폴리아데닐화 신호(pA)에 의해 3'에 후속된다. L1 ATG 및 폴리아데닐화 신호의 위치가 표시된다. 축삭은 박스로서 도시되어 있다.
도2는 서로다른 트랜스게닉 라인들로부터 뇌 RNA의 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)을 나타낸 것이다. 완전 성체 뇌의 총 RNA의 10㎍이 각 레인(lane)에 로드되고 마우스 L1 cDNA로 프로브되었다. 노출시간은 3일 이었다. 레인 1-3, 서로다른 트랜스게닉 오프스프링으로부터의 브레인들(레인 1: 라인 3426; 레인 2: 라인 3427; 레인 3: 라인 3418; 레인 4, 비트랜스게닉 제어로부터의 브레인). 트랜스게닉 L1 mRNA의 레벨(화살표)이 세 가지의 트랜스게닉 라인들에 서로 다르다는 것, 즉 라인 3426에서 레벨이 가장 높고, 라인 3427에서 레벨이 중간이며, 라인 3418에서 레벨이 가장 낮음에 주목할 것. 28S와 18S rRNA의 위치는 우측 마진에 보여진다.
도3은 제위치 교잡(in situ hybridization)에 의해 라인 3426의 비-트랜스게닉(A,B 및 E) 및 트랜스게닉 마우스(C 및 D)로부터 성체의 변병이 없는(A, C, E) 그리고 변병이 있는(변병후 15일. B 및 D) 시신경에서 L1 mRNA의 정위를 나타낸것이다. 와일드 타입 동물에 있어서, L1 mRNA는 망막의 뉴우런 세포에서만 검출할 수 있고, 시신경(A 및 B)의 글리아세포에서는 검출할 수 없다. L1 양성세포의 밀도는 신경의 유수화되지 않은 근위부에서 가장 높다. 신경내 L1 mRNA 양성 세포의 밀도는 병변 후에 약간 증가한다(C와 D를 비교할 것). 시신경에서 L1을 표현하는 세포의 분포(C 및 D)는 GFAP를 표현하는 세포의 분포(E)와 유사하다. E에서 스케일 바: 100㎛(A 내지 E의 경우).
도4는 성체 트랜스게닉(라인 3426, A 및 B) 및 와일드 타입(C) 동물로부터의 병변이 없는(A 및 C) 그리고 병변이 있는(병변후 28일, B) 시신경에서 L1(A 및 B)과 GFAP(C)의 이중 형광 현미경적 정위를 나타낸 것이다. 트랜스게닉 동물의 시신경에서 L1 면역반응성은 병변후에 유의적으로 증가된다(A와 B를 비교할 것). 병변이 있는 트랜스게닉 신경에서 L1 면역반응성의 패턴은 병변이 없는 와일드 타입 신경에서 GFAP 면역스테이닝의 패턴과 유사하다. L1 양성 비유수화 망막 세포 갱글리온 액손은 병변이 없는 와일드 타입 신경(A)에 존재한다. C에서 스케일 바: 50㎛(A 내지 C의 경우).
도5는 라인 3426의 트랜스게닉 동물(A, B, C) 및 와일드 타입 동물(D, E, F)의 배양된 성상교세포에서 L1(A 및 D)과 GFAP(B 및 E)의 이중 형광 현미경적 정위를 나타낸 것이다. 트랜스게닉 동물의 세포에서만 L1을 표현하며, 와일드 타입 동물의 성상교세포는 L1 음성임을 주목할 것. F에서 스케일 바: 30㎛(A 내지 F의 경우).
도6은 트랜스게닉 및 와일드 타입 동물의 병변이 있는(병변후 15일) 그리고 병변이 없는 시신경의 (A) 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 병변이 있는(레인 1,3,5) 또는 병변이 없는(레인 2,4,6)의 총 단백질의 25㎍이 로드되고 L1에 대한 어피니티 정제(affinity purified) 폴리클론 항체를 사용하여 검출되었다. 단백질 추출물은 트랜스게닉 라인 3426(레인 1 및 2), 3427(레인 3 및 4)의 마우스와 와일드 타입 동물(레인 5 및 6)에서 얻어졌다. 비-트랜스게닉 대조군과 비교할 때 트랜스게닉 동물에 L1 표현의 증가가 있다. 시신경 병변에 따라, L1의 업-레귤레이션이 트랜스게닉 동물에서 발생되었으나, 와일드 타입 동물에서 L1의 양은 감소되었다. 겉보기 분자량(kD)은 좌측 마진에 제시된다.
도7은 와일드 타입(A 및 B)과 트랜스게닉 동물로부터의 시신경의 저온 절편들에서 배양된 마우스 소뇌 뉴우런으로부터의 축삭 발전의 예들을 도시한 것이다. A 및 C는 병변이 없는 시신경을 나타내고, B 및 D는 병변이 있는 시신경을 나타낸다. D에서 스케일 바: 50㎛(A 내지 D의 경우).
도8은 와일드 타입(WT) 및 트랜스게닉 동물(라인 3426, 3427 및 3418)로부터의 병변이 없는(c) 그리고 병변이 있는(l) 시신경(병변후 28일)의 저온 절편들상에 유지된 소뇌 뉴우런의 축삭 길이를 도시하여 비교한 것이다. 트랜스게닉 동물로부터의 절편상의 축삭의 길이가 와일드타입 동물의 절편상의 것보다 큼을 주목할 것. 트랜스게닉 라인들에서 축삭들은 병변이 없는 신경에서 보다 병변이 있는 신경에서 항상 기나, 와일드 타입 동물의 병변이 없는 신경과 병변이 있는 신경에서 축삭 길이는 유의적인 차이를 보이지 않는다. 축삭 길이는 서로다른 트랜스게닉 라인들에서 L1 표현의 레벨과 양성적으로 상관이 있음을 주목할 것(또한 웨스턴 블롯 데이터를 참조). 하나의 대표 실험(12)으로부터 평균치 ± 평균의 표준오차가 제시된다.
도9는 L1에 대한 어피니티 정제 폴리클론 항체(안티 L1) 및 마우스 리버(liver) 멤브레인에 대한 어피니티 정제 폴리클론 항체(안티 리버)로 단편들의 프리인큐베이션(preincubation) 없이 또는 후에 와일드 타입(WT) 및 트랜스게닉 동물로부터의 병변이 없는(c) 그리고 병변이 있는(l) 시신경(병변후 28일)의 저온 단편들상에 유지된 소뇌 뉴우런의 축삭 길이를 측정한 그래프이다. 임의의 항체에 의한 프리인큐베이션이 없는 신경에서 축삭의 길이를 100%로 설정하였으며, 항체처리후에 얻어진 동일 신경의 단편에서의 축삭 길이는 이 값에 대한 상대값으로 나타내었다. L1 항체에 의한 축삭 길이의 유의적인 감소(60%)가 트랜스게닉 동물의 저온 단편들에서 관찰되었다. 최상부의 수치들은 각 값에 대하여 측정된 신경의 총수를 나타낸다. 평균값±평균의 표준오차는 중복으로 실시한 적어도 4회의 독립적인 실험의 결과로부터 얻은 것이다.
도10은 항체의 부재하에 그리고 L2에 대한 어피니티 정제 폴리클론 항체(안티 L1) 및 마우스 리버 멤브레인에 대한 어피니티 정제 폴리클론 항체(안티 리버)로 단편들의 프리인큐베이션 후에 와일드 타입(WT) 및 트랜스게닉 동물(라인 3426)로부터 준비한 성상교세포 단층들 상의 마우스 소뇌(A) 또는 병아리 DRG(B) 뉴우런의 축삭길이를 도시하여 비교한 것이다. 임의의 항체로 프리인큐베이션이 없는 성상교세포상의 축삭 길이를 100%로 설정하였으며, 항체처리후에 얻어진 성상교세포 단층의 축삭 길이는 이 값에 대한 상대값으로 나타내었다. 축삭 길이의 유의적인 감소(40%)가 L1 항체에 의한 상기 단층의 프리인큐베이션 후의 트랜스게닉 성상교세포에서만 볼 수 있다. 평균값±평균의 표준오차는 4중복으로 실시한 2회의 독립적인 실험에서 적어도 100 뉴우런으부터 얻은 것이다. *는 대조군(항체처리 없는 와일드 타입 또는 트랜스게닉 성상교세포)으로부터 유의적인 차이(p0.05, Mann-Whitney U 테스트)가 있었던 평균을 나타낸다.
도11은 시신경에서 축삭의 생체내 재성장을 나타낸 것이다(0-2000㎛). 6-8주된 GFAP-L1 트랜스게닉 마우스와 와일드 타입 마우스가 오비탈내에서(intraorbitally) 분쇄되었고, 14일 후에 전전(anterograde) 레이블링에 의해 망막 갱글리온 세포 축삭을 마크하기 위하여 형광-레이블된 비오틴 에스테르로 트레이스되었다. 각 점은 하나의 동물을 나타낸다.
도12는 시신경에서 축삭의 생체내 재성장을 나타낸 것이다(0-800㎛). 6-8주된 GFAP-L1 트랜스게닉 마우스와 와일드 타입 마우스가 오비탈내에서 분쇄되었고, 14일 후에 전전 레이블링에 의해 망막 갱글리온 세포 축삭을 마크하기 위하여 형광-레이블된 비오틴 에스테르로 트레이스되었다. 각 점은 하나의 동물을 나타낸다.
도13은 일회시도 수동 회피 임무(one-trial passive avoidance task)에서 회피율(기억의 유지)에 관한 IMHV내 치킨 L1 항체 주사의 효과를 나타낸 것이다. 각 점은 표시된 훈련에 대한 시간에서 L1 항체(안티 L1)(폐쇄 원) 또는 염수(개방 사각)가 주사된 일군의 새들을 나타낸다. 모든 동물은 24시간 후훈련에서 시험되었다(*, 염수와 항체군 간에 p0.05, x2 )
도14는 수동 회피 임무 동안 기억의 유지에 관한 -30분과 +5.5 시간에서 Ig Ⅰ-Ⅳ 및 FN 단편의 주입효과를 묘사하는 두 그래프를 포함한다. 모든 동물을 24시간 후훈련에서 시험되었다. 각 군의 동물 수는 막대그래프로 표시된다. (*p0.05: **p0.005).
도15는 래트 히포캄팔 슬라이스의 CAI 영역에서 피라미드형 뉴우런의 LTP에 관하여 L1에 대한 항체(안티 L1)의 영향을 보여주는 일련의 그래프를 포함한다. a, 항체가 주사되지 않은 대조 부위에서 TBS 전 및 50분 후(화살표)에 기록된 평균(n=4) EPSP's, b, 마우스 L1에 대한 래빗 폴리클론 항체의 존재하에 TBS 전 및 50분 후(화살표)에 기록된 평균(n=4) EPSP's, c, CHO 세포에 재조합으로 표현된 면역글로블린류 도메인 Ⅰ-Ⅳ에 대한 L1 항체(IgG 단편, 6.2mg/ml ○) 또는 폴리클론 항체(Hynes(1992)Cell. 69:11-25)(대략 1gm/ml의 특이 항체를 함유하는 항혈청, ▼)의 존재하에 TBS 전 및 50분 후에 EPSP 초기 기울기의 시간-과정 및 다음의 대조군: (1) 대조 LTP(항체없음, □), (2) 히포캠팔 슬라이스(Linder 등(1983) Nature 305:427-430)와 강하게 반응하는 마우스 리버 멤브레인(3.5mg/ml, ●)에 대한 폴리클론 항체의 IgG 단편의 존재시에, (3) 래빗 비-면역 혈청의 존재시에, 및 (4) TBS에 의한 LTP의 유도 없이 L1 항체의 존재시에(6.2 mg/ml, ○: 또한 e, f 참조). 결과치는 적어도 3 동물로부터 TBS(n=5) 슬라이스 전에 20분 동안 기록된 기준값; L1에 대한 항체에 대하여 p0.001에서 그리고 면역글로블린류 도메인 Ⅰ-Ⅳ에 대한 항체에 대하여 p0.01에서 대조 LTP와 서로다른 L1 항체의 존재하에 LPT's에 대한 값의 EPSP 초기 기울기 퍼센트의 평균±S.E.M.으로 표현된다. d, L1에 대한 폴리클론 항체의 IgG 단편에 의한 LTP에서 감소의 농도의존성(6.2 mg/ml; ○): 2 mg/ml, ●; 0.6 mg/ml, ▲; 0.06 mg/ml, □; p0.0001). 대조로서, 리버 멤브레인에 대한 폴리클론 항체로부터의 결과치가 제시된다(3.5 mg/ml, ■). e. TBS의 부재시에 L1에 대한 폴리클론 항체의 적용 전 및 적용후(화살표) 60분에 기록된 평균 (n=4) EPSP's. f. TBS의 부재시에 L1에 대한 폴리클론 항체의 적용 전 및 적용후(화살표) 60분에 기록된 평균 (n=4) 세포내 흥분 포스트 시냅틱 커렌트(EPSP).
도16은 LTP상에 면역글로블린류 도메인 Ⅰ-Ⅳ, 폴리클론 NCAM 항체 및 올리고만노시딕 글리코펩티드의 영향을 나타낸다. a, 대조 LPT(20mM Tris/HCL pH 7.6내 □)에 대비되는 L1의 면역글로블린 (Ig)-류 도메인 Ⅰ-Ⅳ(216㎍/ml; 3.2mM; 20mM Tris/HCL pH 7.6내 ○; p0.01) 및 화이브로넥틴(FN) 타입 Ⅲ 상동 반복단위 Ⅰ-Ⅴ(225㎍/ml; 3.8mM; 20mM Tris/HCL pH 7.6내 ■; p0.01)의 존재시에 TBS 전 및 후에 EPSP초기 기울기의 시간-과정. b, NCAM에 대한 항체(IgG 단편, 3.9 mg/ml, ▲), 액소닌-1에 대한 항혈청(●) 및 다음 대조군의 존재시에 TBS 전 및 후에 EPSp초기 기울기의 시간-과정: 대조군(1) 비-면역 래빗 혈청(▲), (2) 비-면역 래빗 혈청의 IgG 단편(3.0 mg/ml, ◆), (3) 올리고만노시딕 글리코펩티드(○), 아시아올페투인(asiaolfetuin)에서 파생된 대조 글리코펩티드(●)(양자 공히 100 μM에서)의 존재하에, 그리고 글리코펩티드(□)의 부재하에 TBS 전 및 후의 EPSP 초기 기울기의 시간과정. 결과치는 TBS전 20분 동안 기록된 기준값의 EPSP 기울기 퍼센트의 평균 ± S.E.M.으로 표현된다.
도17은 미리 설정된 LTP에 관한 그리고 MNDA 수용체-중개 시냅스 전달에 관한 L1 항체 및 올리고만노시딕 카보하이드레이트의 영향을 그래프식으로 묘사한 것이다. a. 실험전체에 걸쳐(6.2 mg/ml;○) 또는 TBS후 10분에서 시작하여(6.2 mg/ml;●) 적용된 L1 항체의 존재하에 TBS 전 및 후에 EPSP 초기 기울기의 시간-과정. b, 실험전체에 걸쳐(100μM;○) 또는 TBS후 10분에서 시작하여(100μM;●) 적용된 올리고만노시딕 카보하이드레이트의 존재시에 TBS 전 및 후에 EPSp초기 기울기의 시간-과정. c. 올리고만노시딕 카보하이드레이트의 적용전 및 60분 적용후(화살표)에 CNQX(10μM)의 존재하에 기록된 평균(n=4) NMDA 수용체-의존 EPSP's. a 및 b에서의 결과치는 TBS전 20분 동안 기록된 기준값의 EPSP 기울기 퍼센트의 평균 ± S.E.M.으로 표현된다(적어도 3 동물에서 n=5 슬라이스).
도18은 클론 pX#2의 4.43 kb cDNA 인서트의 뉴클레오티드 배열 및 마우스 CHL1의 추론된 아미노산 배열을 나타낸 것이다. 가장 긴 오픈 리딩 프레임(bp 296 내지 bp 3922)은 TGA 정지 코돈으로 정지하는 1209의 아미노산을 내포한다. 시그널 펩티드(아미노산 1-24) 및 트랜스멤브레인 영역(1082-1204)을 나타내는 두개의 소수성 영역은 믿줄이 쳐있다. 두개의 화살표는 λgt11 라이브러리에서 분리된 클론 311의 5' 및 3' 말단을 가리킨다. 아스파라긴-링크 글리코실화(Hubbard 및 Ivatt, 1981)의 포텐셜 부위는 아미노산 배열 아래 채워진 다이아몬드로 표시된다. 면역글로블린(Ig)-류 도메인들은 보존된 트립토판 아래에 로마숫자 Ⅰ내지 Ⅵ로 번호매겨있다. 특성 시스테인들은 원으로 표시된다. FN-류 반복단위들은 F1 내지 F5 번호매겨있고, 특성 트립토판들(F1에서 생략; F2; W 732, F3; W 830, F4; W 936, F5; W 1053) 및 티토신/페닐알라닌(F1; Y 682, F2; Y 781, F3; F888, F4; Y 989 및 F5에서 생략)은 박스쳐져 있다. 모난 괄호는 RGD 및 DGEA(각각 아미노산 잔기 185-187 및 555-558)을 강조한다. 미해독 배열은 이탤릭체로 번호매겨있다. 배열 데이터는 승인번호 X94310하에 EMBL/Genebank/DDBJ로부터 입수할 수 있다.
도19는 도메인 구조, 박테리아 단백질 단편, 및 마우스 CHL1의 소수성 플롯을 나타낸다. (a) 본 도는 CHL1의 주배열로부터 추론된 구조적 특징을 스케치한 것이다. 번호들은 해독 출발 부위에서 출발하는 아미노산 배열을 가리킨다. Ig-류 도메인 Ⅰ 내지 Ⅵ은 반원으로 표시된다(아미노산 번호는 디설파이드 브리지를 형성하는 시스테인을 기리킨다). FN-류 반복단위 1 내지 5는 박스로 기호화된다(아미노산 번호는 도메인 경계를 가리킨다). N-글리코실화의 포텐셜 부위는 채워진 원으로 표시된다. 신호 펩티드 및 트랜스멤브레인 영역은 에칭된 박스로 표시된다. (b) 바는이. 콜리에서 생산된 재조합 단백질을 인코드하는 cDNA의 위치를 나타낸다. 추론된 아미노산 배열의 소수성 플롯(Kyte 및 Doolittle, 1982)은 가상 소수성 신호 및 트랜스멤브레인 도메인(*)을 갖는 인테그랄 멤브레인 단백질의 특성 특징을 보여준다. 정의 값은 소수성을 나타낸다. 가로좌표의 번호매김은 아미노산 위치를 가리킨다.
도20은 L1 패밀리의 분자들의 세포내 도메인들의 정렬을 보여준다. 가상 트랜스멤브레인 영역 후에 첫번째 아미노산 잔기와 출발하는 세포내 도메인의 배열들은 마우스 CHL1, 마우스 L1, 치킨 Nr-CAM, 치킨 nG-CAM, 치킨 뉴로패신, 드로소필라 뉴로글리아 및 지브라휘시 L1.2에 대하여 정렬되어 있다. 번호들은 CHL1의 아미노산 위치를 가리키고, 회색 박스는 CHL1 배열에 도입된 갭을 나타낸다. 배열의 주부에서 발견되는 동일한 아미노산들은 검정 박스로 표시된다. 세개의 모난 괄호(I, Ⅱ 및 Ⅲ)는 고도로 보호된 스트레치를 가리킨다.
도21은 마우스와 래트의 서로 다른 조직에서 CHL1 및 mRNA의 노던 블롯 분석이다.
(a) 뇌 마이너스 소뇌(레인 1,5), 척수(레인 3,7), 배측근 갱글리아(레인 4,8)로부터의 폴리(A) RNA(2㎍) 및 9일된 마우스의 소뇌(레인 2,8)로부터의 총 RNA(10 ㎍) CHL1(레인 1 내지 4) 또는 L1(레인 5 내지 8) 리보프로브와 교잡되었다. 9일된 마우스의 신장(레인 9), 비장(레인 10), 리버(레인 11) 및 흉선(레인 12)의 폴리(A)* RNA(1㎍)과 장(레인 13) 및 폐(레인 14)의 폴리(A)* RNA(0.5 ㎍)가 CHL1 리보프로브와 교잡되었다.
(a) NGF 유도(레인 1) 및 비유도(레인 2) PC12 세포, COS-1 세포(레인 3)의 총 RNA(20㎍) 및 9일(레인 4) 및 6일(레인 5)된 래트의 소뇌의 총 RNA(30㎍)이 CHL1 리보프로브로 교잡되었다. RNA 표시는 좌측마진에 하였다.
도22는 서로 다른 조직에서 CHL1에 대한 폴리클론 항체의 특이성 및 CHL1의 표현을 나타낸다. (a) CHL1 항체를 사용한 뇌 파생 면역정제 L1(레인 1(2㎍)), N-CAM(레인 2(2㎍)), MAG(레인 3(2㎍)), MAG(레인 3 (2㎍)) 및 재조합 아니온 교환 크로마토그래피 정제 CHL1 단백질 단편(레인 4(0.1㎍))의 웨스턴 블롯 분석. (b) 9일된 마우스의 뇌(레인 1), 리버(레인 2), 폐(레인 3), 신장(레인 4) 및 장(레인 5)으로부터의 원 멤브레인의 정화제 용해질(detergent lysate)의 가용성(S) 및 불용성(M) 단편들의 웨스턴 블롯 분석. 좌측의 번호는 뇌(레인 1) 및 리버(레인 2)의 CHL1 면역반응성 밴드의 분자 질량(molecular mass)을 가리킨다. 분자 질량 표준은 좌측마진(a) 및 우측마진(b)에서 kD로 표시된다.
도23은 일시적으로 트랜스팩션된 COS-1 세포 상에 CHL1의 검출을 보여준다. CHL1-트랜스팩션된(a) 및 모크-트랜스팩션된(c) COS-1 세포의 단층 배양물이 CHL1에 대한 폴리클론 항체로 면역스테인되었다. (b,d)는 (a,c)에 대한 상 대조 마이크로그래프에 각각 대응한다. a 내지 d에 대한 d=30㎛에 바.
도24는 제위치 교잡 분석에 의한 마우스 망막, 시신경 및 소뇌 피질의 단편들에서 CHL1 및 L1 mRNA의 정위를 나타낸 것이다. 7일된 마우스의 망막에서, L1 mRNA는 갱글리온 세포층(a에서 1)에 위치한 갱글리온 세포에서, 그리고 내부 핵층(1에서 2)에 위치한 무축삭 및 수평 세포에서 검출할 수 있다. 망막에서 다른 세포 타입 또는 시신경에서 글리아 세포는 L1 트랜스크립트(a)의 검출가능한 레벨을 내포하지 않는다. CHL1 mRNA는 갱글리온 세포내에서 그리고 내부 핵층(b)의 내부(즉, 비트리드) 마진에 위치한 일부 세포들에서 약하게 검출할 수 있다. 시신경의 근부(즉, 망막-근부) 영역에 위치한 글리아 세포는 CHL1 안티센스 cRNA 프로브에 의해 강하게 레이블되나, 보다 원부 영역에 위치한 글리아 세포는 단지 약하게 레이블된다(b). 2주된 마우스의 소뇌 피질에서, L1 트랜스크립트는 분자층(mol)의 스텔레이트 및 바스킷 세포에서, 그리고 내부 과립층(Igl:d)의 골지 및 과립세포에서 검출할 수 있다. 강한 임의 레이블링이 분자층(b)의 보다 얇은 부분에서 관찰할 수 있다는 것만을 제외하고는 CHL1 트랜스크립트들은 유사한 패턴으로 분포된다. CHL1 센스 cRNA로 교잡된 절편들은 레이블되지 않는다( 7일된 망막 및 시신경에 대하여, c 참조). a-c에 대하여 c=100㎛에서 바: d 및 e에 대하여 e=150㎛에서 바.
도25는 성상교세포의 배양액에서 CHL1의 면역형광 현미경적 정위를 나타낸다. 배양된 마우스 성상교세포의 이중-면역레이블링이 CHL1(a,d)에 대한 폴리클론 항체로 수행되었고, GFAP(b,e),(c 및 f)에 대한 항체는 각각 (a,b 및 d,e)에 대한 대응하는 상 대조 마이크로그래프이다. a-c 및 d-f 각각에 대하여 c 및 F=20㎛에서 바.
도26은 탈글리코실화 CHL1의 웨스턴 블롯 분석이다. 7일된 마우스의 뇌로부터의 원 멤브레인의 정화제 용해물의 가용성(S) 및 불용성(M) 단편들이 N-글리코시다제 F(N), O-글리코시다제(O), 양자의 효소(N+O)와 함께 또는 효소 없이(-)인큐베이트되고, 웨스턴블롯에서 CHL1에 대한 항체로 반응되었다. 글리코실화 및 탈글리코실화 CHL1 단백질 성분의 분자 질량들은 아래 박스에 kD로 표시된다.
도27은 뇌조직으로부터 CHL1 면역침전물에서 MNK-1 카보하이드레이트의 존재를 보여준다. CHL1은 CHL1 항체를 사용하여 9일된 마우스 뇌의 전체 뇌조직의 정화제 용해물로부터 면역침전되었다. 뇌 용해물(레인 1)과 면역침전물(레인 2,3)은 SDS-PAGE에 의해 용해되고, 블롯되고, HNK-1 에피토프에 대한 모노클론 항체(레인 1,2) 또는 CHL1 항체(레인 3)와 함께 인큐베이트되었다. 분자질량 표준은 우측 마진에 kD로 표시된다.
도28: L929 트랜스팩턴트를 갖는 배양물에서 히포캠팔 뉴우런의 축삭 발전.
배 18일의 래트로부터 파생된 히포캠팔 뉴우런이 L929-트랜스팩턴트 또는 부의 L929 세포의 부융합성(subconfluent) 단층에서 배양되었다. 공배양의 11-12h 후에, 세포는 고정되고 모노클론 항체 412(HNK-1 카보하이드레이트 에피토프 인식) 또는 NCAM에 대한 폴리크론 항체로 레이블되었다. 총 축삭길이의 측정을 위하여 각 브랜치당 가장 긴 축삭만이 이들 배양물에서 뉴우런의 고분지화된 특성으로 인해 결정되었다.
(A) 축삭 발전은 CHL1에 의해 촉진되고 항체에 의해 억제할 수 있다. 뉴우런은 CHL1-트랜스팩턴트(CHL1)와 함께 또는 (+AB)과 함께 또는 재조합 CHL1에 대한 폴리클론항체없이(500㎍/ml의 정제 IgG, 이식후에 45분 부가됨) 그리고 L1-트랜스팩턴트 상에서 공배양되었다. 4-5회 독립실험의 평균 총 축삭길이가 제시된다. 오차 바는 평균의 표준 오차이다.
(B) 서로 다른 CHL1 라인들은 L1 보다 더 축삭 발전을 촉진한다. 뉴우런은 두개의 서로 다른 CHL1-트랜스팩턴트(CHL1 라인 1, CHL1 라인 2)상에서 약하게 다른 표현 레벨, 부의 L929 세포(L929) 및 L1 트랜스팩턴트(L1)로 배양되었다. 총축삭길이는 대조로서 L929 세포의 배분율로 주어진다. 오차 바는 평균의 표준오차이다.
(C) 축삭 발전 촉진은 축삭의 모든 길이 종별에 영향을 준다. (+AB)와 함께 또는 (A)에 주어진 항체처리 없이 CHL1-트랜스팩턴트(CHL1 라인 1 및 2) 및 부의 L929 세포(L929)와 공배양된 히포캠팔 뉴우런의 총축삭길이의 누적도수 분포 플롯. 특정 길이 x(수직축)보다 길거나 동일한 축삭을 갖는 뉴우런의 백분율은 축삭 길이 x(수평축)의 함수로서 도시된다. 값들은 하나의 대표실험에서 나온 것이다.
도29: L929 트랜스팩턴트를 갖는 배양물에서 작은 소뇌 뉴우런의 축삭 발전.
6-7일된 마우스로부터 파생된 소뇌 뉴우런이 CHL1-트랜스팩턴트(CHL1), CHL1-트랜스팩티드 비-표현 L929 세포(Mock), 부의 L929 또는 L1-트랜스팩턴트(L1)에 대해 20 h 동안 배양되었다. 세포의 염색은 도7에서 전술된 바와 같이 수행되었다.
(A) CHL1은 작은 소뇌 뉴우런의 축삭 발전을 촉진하다, 세번의 실험의 총 축삭길이의 평균이 제시된다. 오차 바는 평균의 표준오차이다.
(B) CHL1은 L1 보다 더 작은 소뇌 뉴우런의 축삭 발전을 촉진한다. 총 축삭 길이는 대조(ctr)로서 L929 세포의 백분율로 주어진다. 오차 바는 평균의 표준 오차이다.
(C) CHL1에 의한 소뇌 뉴우런의 축삭 발전의 증가는 축삭의 모든 크기 종별에 영향을 미친다. 특정 길이 x(수직축)보다 길거나 동일한 축삭을 갖는 뉴우런의 백분율의 총 축삭 길이의 분포 플롯의 누적도수는 축삭 길이 x(수평축)의 함수로서 도시된다. 하나의 대표실험에서 나온 값이 제시된다.
도30: 가용성 CHL1로 처리된 히포캠팔 뉴우런의 축삭 발전.
히포캠팔 뉴우런은 CHL1-트랜스팩턴트(CHL1), 부의 L929 또는 L1-트랜스팩턴트(L1)의 원 멤브레인 제제의 상징액의 부가로 12h 동안 폴리-L-리신 코티드 커버슬립상에서 배양되었다. 염색 및 축삭길이의 측정은 도7에서 전술한 바와 같이 수행되었다.
(A) L929 트랜스팩턴트로부터의 가용성 CHL1은 가장 긴 것 및 세포당 모든 축삭의 합의 발전을 촉진한다. 가장 긴 축삭의 절대 길이 및 총 축삭 길이가 제시된다. 값들은 세번의 독립 실험의 평균이다. 오차 바는 평균의 표준 오차이다.
(B) 가용성 CHL1은 축삭 수의 약한 증가를 촉진한다. 부의 L929 세포(ctr)로부터 파생된 상징액으로 처리된 히포캠팔 뉴우런의 축삭 길이의 백분율로 나타낸 총 축삭 길이가 도시된다. 값들은 세번의 독립 실험의 평균이다. 오차 바는 평균의 표준 오차이다.
(C) 또한 가용성 CHL1은 모든 길이 종별의 축삭들의 축삭 발전을 촉진한다. 한번의 대표 실험으로부터 총 축삭 길이의 누적도수 분포 플롯이 제시된다.
도31: L929 트랜스팩턴트에서 CHL1- 및 L1-단백질의 정량 집단 분석 및 안정도.
(A) S2 세포 트랜스팩턴트 집단의 정량분석. 집단을 검사하기 위하여 CHL1-(CHL1)(ctr) 및 L1-(L1) 트랜스팩티드 세포를 (+ind)과 함께 또는 CuSO4 에 의한 트랜스겐 표현의 (-ind) 유도 없이 배지에서 18시간 동안 (약 3106 cells/ml의 밀도에서) 배양되었다. 입자수는 인큐배이션의 초기 및 말기에 헤마시토메터(hemacytometer)로 세었다. 집단의 백분율은 인덱스 (i-N/NO)x100에 의해 계산되었다. N18 및 NO는 각각 인큐베이션 말기 및 초기의 입자수를 나타낸다. 값들은 네번 이상의 독립 실험의 평균이다. 오차 바는 표준 편차이다.
(B) L929-트랜스팩턴트 집단의 운동학. CHL1-트랜스팩턴트(CHL1), CHL1-트랜스팩티드 비-표현(Mock), 부의 L929(L929), 및 L1-트랜스팩티드(L1) 세포들이 저농도의 트립신-EDTA로 처리하여 조직배양으로부터 분리되고, 세척된 후, 폴리스티렌 튜브내에서 37℃에서 인큐베이트되었다. 각 시료의 부분표본(aliquot)이 매 30분에서 회수되고, 입자수는 헤카시토메터로 세었다. 그 결과는 (A)에서 기술된 바와 같이 표현된다. 제시된 값들은 세번 이상의 독립 실험의 평균이다. 오차 바는 표준 편차이다.
보다 구체적으로 본 발명은 여기서 CNS 신경성장 모듈레이터로 확인된 특정 시제의 이용에 관한 것이며, 특히 중추신경계(CNS)에서 축삭 성장을 촉진하기 위하여 여기서 한정된 한 클라스의 신경세포 밀착분자에 관한 것이다. 일반적으로 성체 중추신경계에서 뉴우런은 글리아 세포에 존재하는 억제 분자큐로 인해 재성장이 불가능한 것으로 생각되어 왔다. 본 발명의 시제 및 방법은 이러한 억제를 극복하고 CNS 축삭 발전을 촉진하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 시제는 CNS 축삭 발전을 변조 또는 촉진할 수 있는 임의의 세포 밀착 분자를 포함하고 이들로부터 선택될 수 있으며, 특히 면역글로블린 초과에 속하는 분자를 포함한다. 보다 구체적으로 이러한 분자들은 Ca2+ -독립 뉴우런 세포 밀착을 변조하는 면역글로블린 초과의 멤버들로부터 선택되며, L1, N-CAM 및 미엘린-연관 당단백을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 분자들의 단편들, 그 유사물, 동족물, 협동작용물 및 축삭촉진 활성을 갖는 이러한 분자들의 유사물을 예기한다. 이러한 단편 및 유사물에 대한 특히 바람직한 구조적 모티프들은 화이브로넥틴 타입 Ⅲ 상동 반복단위(특히 반복단위 1-2) 및 면역글로블린류 도메인(특히 도메인 Ⅰ-Ⅱ, Ⅲ-Ⅳ, 및 Ⅴ-Ⅵ)과 유사한 도메인들을 포함한다. 본 발명의 시제, 특히 L1 CAM 과의 멤버들은 동족친화성 결합을 나타내기 때문에, 시제 및 그 길항질, 특히 그들의 항체는 시제의 수용체에 대한 아고니스트(agonist)로 활용할 수도 있고, 따라서 시제 자제와 동일 방식으로 그리고 동일한 목적을 위하여 진단 및 치료용도로 사용될 수도 있다. 즉, L1은 수용체로서 작용하며, 그 항체는 여기에 제시된 축삭 발전을 촉진하고 특히 CNS에서 신경재생을 보조하기 위하여 아고니스트로서 사용될 수도 있다. 이러한 능력은 여기서 시제로서 기능할 신경인식 분자의 L1 CAM과의 추가 멤버들의 확인방법에 활용하기 위한 L1에 대한 항체의 능력에서 잘 나타나며, 따라서 본 발명은 이러한 항체에 의해 확인되고, 분리되고 특징 지워지는 분자들에 미친다. 따라서, 이하에서 CNS 신경성장모듈레이터로서 확인된 물질들은 L1 및 그 유사물, 예를 들어 그 가운데서 후술되는 CHL1 과 같은 CAMs에 대한 항체를 포함한다고 사료된다.
본 발명은 한 태양에 있어 CNS 신경 성정 모듈레이터(CNGMs)의 엑토픽(ectopic) 표현 또는 생체내 분화된 성상교세포상의 신경세포 밀착분자들과 관련이 있다. 이러한 분자들은 생체내에서 그리고 트랜스게닉 동물의 시신경 분쇄 실험에서 병변이 없는 그리고 병변이 있는 성체 마우스 시신경의 성상교세포 및 저온 절편들의 단층 배양에서 축삭 발전을 향상시키는 것으로 밝혀져 있다. 증가된 축삭발전-촉진능력은 엑토픽 CNGM 표현 레벨에 비례한다. 이것은 트랜스게닉-인코디드 CNGM의 서로 다른 기초레벨을 표현하는 본발명의 명백한 트랜스게닉 라인들의 비교에 의해, 그리고 시신경의 병변후에 증가된 CNGM 표현이 수반하는 상관관계에 의해 예시된다.
병변이 있거나 없는 시신경이 본발명을 이용하는데 적합하지만, 신경계의 어떤 부분은 뇌 및 척수 부분을 포함하여 마찬가지로 이용될 수 있다는 것을 이해하여야 할 것이다.
축삭발전은 성상교세포에 의한 CNGM 표현의 레벨에 의존하며, 트랜스게닉 동물에서 축삭 발전을 촉진시킴에 있어 CNGM에 의해 발휘되는 특이 효과를 나타낸다. 폴리클론 CNGM 항체에 의한 축삭발전의 억제되나, 그러나 마우스 리버 멤브레인 항체에 의해서는 그렇지 않다는 것은 또한 이러한 특이성을 지지한다. 특히, 이는 양자의 항체가 트랜스게닉 동물의 뉴우런 및 성상교세포의 세포표면과 잘 반응하기 때문에 더욱 그러하다.
바람직한 구현에 있어서, CNGM은 L1이다. L1의 생물학적 효과는 L1항체에 의해 억제될 수 있으며, 이는 L1이 트랜스게닉 성상교세포의 세포표면에서 트랜스 배열에서 동족친화적으로 활성이 있다는 것을 나타낸다. 더욱이, 치킨 배측근 갱글리온 뉴우런과 반응하지 않는 L1 종-특이 항체는 트랜스게닉 성상교세포상의 뉴우런 세포 타입의 축삭 발전을 억제한다. 이러한 발견은 트랜스-작용 활성 분자로서 L1을 명료하게 확인하고, 보통 L1-표현을 유의적으로 부족하게 하는 글리아 세포에 의한 L1의 엑토픽 표현이 생체내에서 축삭 발전을 향상시킴을 보여준다.
생체내에서 통상적으로 L1을 표현하지 않는 글리아 세포상에서 축삭 발전의 트랜스겐-중개 향상은 성체 포유동물 중추신경계의 글리아 세포가 보다 더 축삭 발전에 기여한다는 것을 나타낸다. 따라서, 성숙에 따라 축삭 발전-촉진 글리아-파생 분자들의 손실(Smith 등(1986) J. Comp. Neurol, 251:23-43; Smith 등(1990) Dev. Biol. 138:377-390)은 성체 포유동물 말초신경계에서 글리아세포에 의해 보통 고도로 표현되는 인식분자의 표현에 의해 보상되는 것으로 나타난다(Niecke 등(1985); Bixby 등(1988) J. Cell. Biol. 107:353-362; Seilheimer 등(1988) J. Cell. Biol. 107: 341-351).
본 트랜스게닉 라인들로부터의 성체 성상교세포의 페노타입(phenotyoe)은 병변의 부과 후에 L1을 재표현하는 더욱 시반 세포-관련 능력 쪽으로 수정될 수도 있다. 시반 세포에 의한 L1에서의 증가는 오토크린(autocrine) 메커니즘에 의한 손상 후에 업레귤레이트된 뉴로트로핀들에 의해 유사하게 중개된다(Seilheimer 등(1987) EMBO J. 6:1611-1616). 이와 마찬가지로, 배양에서 성상교세포에 의한 L1 표현은 TGF-β 및 NGF에 의해 업레귤레이트될 수 있다(Saad 등 (1991)). 마우스를 GFAP-L1로 생성시키는 것에 의해, 신경 상해에 응답하는 데 대한 성숙한 성상교세포의 무능력은 축삭 발전 촉진 분자 L1의 업레귤레이션으로 극복된다. L1의 표현은 축삭 성장을 방해하는 몇몇 분자들을 통상적으로 포함하는 중추신경계의 유수화 트랙트들에서 축삭 발전에 특히 유리할 수도 있다(Schachner 등 Perspective in Divelop. Neurobiol, in Press; Schwab 등 (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16:565-595).
본 발명은 아스트로글리아 및 올리고덴드로글리아 세포의 방해 작용은 엑토픽적으로 표현된 L1의 활성에 의해 특별히 예시되는 바와 같이 여기에서 한정된 시제의 축삭 발전 촉진 특성에 의해 적어도 부분적으로 극복될 수 있음을 보여준다. 성상교세포에 의한 L1의 표현은 또한 올리고덴드로 부위에 의해 발휘된 방해효과를 보상하는 것처럼 보인다. 따라서 허용 및 비-허용 분자큐는 축삭 발전을 위한 동일한 세포타입에 정위되는 것이 발생하지 않게 할 수도 있다. 대신에, 이러한 분자큐들이 서로 다른 세포 타입들 중에서 분할될 수도 있다. 따라서, L1 및 다른 축삭 발전 촉진 분자 등의 세포 및 분자 조작은 손상 및 질병을 수반하는 성체 포유동물 중추신경계의 재생능력의 향상을 허용할 수도 있다.
앞서 지적한 바와 같이, 본 발명은 CNS에서 신경성장의 촉진에 미치며, 이러한 성장으로는 상해 또는 질병으로 인해 손상된 구조 뿐만 아니라 불완전 또는 미숙한 형성을 나타내는 구조 및 조직을 재생하는 데 요구되는 성장을 포함한다. 본 발명의 시제는 또한 후술되는 바와 같은 신경보호 또는 신경보존 효과를 나타내며, 예를 들어 신경 퇴화 또는 가변성 병인학의 상실을 억제 또는 반작용하도록 투여될 수 있다.
따라서 본 발명은 유전자 요법 등을 통한 특정 시제의 표현의 촉진에 의해서, 또는 손상된 또는 질병이 있는 CNS 구조를 치료하기 위한 약제학적 조성물에 적절하고 유리한 시제의 투여에 의해서 이든 간에 본 발명의 시제를 포함 또는 전달하는 구조물 또는 조성물에 미친다. 이러한 후자의 커넥션에 있어서, L1 및 N-CAM과 같은 최근에 확인된 그룹이 동족친화적으로 결속되고 따라서 표현에 의해 보다 유용할 것으로 입증할 수도 있다는 것이 인정될지라도, 특정한 시제는 성장촉진 효과를 발휘할 수 있다고 사료된다. 본 발명은 실행가능한 경우 루트 및 프로토콜 양자에 미치는 것으로 의도된다.
본 발명은 CNS에서 신경 발전, 재생 및 신경 재활의 변조를 위한 CNGM-분비 세포의 용도와 관련이 있음을 이해하여야 한다. 마찬가지로, 특정 가용성 CNGMs 및 단면 그리고 그 동족 분자들 또한 본 발명 내에 있다.
본 명세서에서 제시되는 용어는 아래와 같이 정의된다:
용어 시제, CNS 신경성장 모듈레이터, CNGM , 신경인식분자, 인식인자, 인식인자 단백질, 신경밀착분자, 및 특별히 기재하지 않은 임의의 파생어는 본 명세서에서 호환적으로 사용될 수 있고, 본 출원서 및 청구범위 전반에 걸쳐 단일 또는 다중 단백질을 포함하는 단백질성 물질을 지칭하는데 사용되며, 전술한 아미노산 배열 및 본 명세서 및 청구범위에 제시되는 활성의 프로필을 가지는 단백질 까지 확대된다. 상기 용어들은 또한 상기 시제와 유사하게 거동하는 작은 분자들을 포함하여, 이러한 단백질의 단편, 동족, 협동작용물, 아날로그, 모방물 포함한다.
따라서, 실질적으로 균등한 또는 변경된 활성을 발휘하는 단백질들은 마찬가지로 생각된다. 이러한 수정은 예를 들어 부위-지향 돌연변이유발을 통해 얻어지는 수정과 같이 생각될 수도 있고, 컴플렉스 또는 그 명명된 서브유니트의 프로듀서인 숙주에서 돌연변이를 통해 얻어진 것처럼 우연한 것일 수도 있다. 또한, 용어 CNS 신경 성장 모듈레이터, CNGM, 신경 인식 인자, 인식인자, 인식인자 단백질, 및 신경 밀착 분자는 특별히 여기서 재인용된 그 영역 단백질내에 뿐만 아니라 실질적으로 상동인 유사물 및 대립 변종들 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
여기서 설명되는 아미노산 잔기는 L 이성체 형태를 갖는 것이 선호된다. 그러나, 면역글로블린 결합의 바람직한 관능적 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한 D 이성체형 잔기가 임의의 L-아미노산 잔기에 치환될 수도 있다. NH2 는 폴리핍티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노기를 지칭한다. COOH 는 폴리핍티드의 카르복시 말단에 존재하는 자유 카르복시기를 지칭한다. 표준 폴리펩티드 명명법(J. Biol. Chem. 243:3552-59)을 지킴에 있어서, 아미노산 잔기에 대한 약어는 다음의 코레스폰던스 표에 제시된다.
코레스폰던스 표
기 호 아미노산
1-자 3-자
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소류신
L Leu 류신
T Thr 스레오닌
V Val 발린
R Pro 프롤린
K Lys 리신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
W Trp 트립토판
R Arg 아르지닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
C Cys 시스테인
여기서 모든 아미노산 잔기 배열은 좌우 방향이 통상적인 아미노말단에서 카르복시-말단의 방향에 있는 식으로 나타낸다는 것을 주지하여야 한다. 또한, 아미노산 잔기 배열의 시작 또는 끝에서 대시(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 배열에 대한 펩티드 결합을 나타낸다는 것을 주지하여야 한다. 상기 표는 여기서 번갈아 나타날 수 있는 3-자 및 1-자 표현을 연관짓도록 제시된다는 것을 주지하여야 한다.
레플리콘(repricon)은 생체내 DNA 복제의 자율적(autonomus) 단위로서 기능하는, 즉 자기 제어하에 복제할 수 있는 임의의 유전 원소(예, 플라스미드, 크로모솜, 바이러스)이다.
벡터(vector)는 다른 DNA 세그먼트가 부착되어 부착된 세그먼트의 복제를 일으킬 수 있는 플라스미드, 파지(phage) 또는 코스미드(cosmid)와 같은 리플리콘이다.
DNA 분자는 단일-스트랜드형 또는 이중-스트랜드형 헬릭스에서 디옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 폴리머 형태를 지칭한다. 이 용어는 단지 이러한 분자의 1차 및 2차 구조만을 가리키며, 이를 특별한 3차 형태로 제한하지 않는다. 즉, 이 용어는 특히 선형 DNA 분자(예: 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 크로모솜에서 발견되는 이중-스트랜드형 DNA를 포함한다. 특별한 이중-스트랜드형 DNA의 구조를 검토함에 있어서, 배열들은 본 명세서에서 DNA의 비전사 스트랜드(즉, mRNA와 상동인 배열을 갖는 스트랜드)를 따라 5'에서 3' 방향으로의 배열에서만 주어지는 통상의 방법에 따라 설명될 수도 있다.
복제원(origin of replication)은 DNA 합성에 참여하는 상기한 DNA 배열을 지칭한다.
DNA 코드배열(coding sequence)은 적당한 규정 배열의 제어하에 놓일 때 생체내에서 폴리펩티드에 전사 및 해독되는 이중-스트랜드형 DNA이다. 코드 배열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 출발 코돈과 3'(카르복시) 말단에서 정지 코돈에 의해 결정된다. 코드배열은 ,이에 제한되지는 않지만, 프로케리오틱(prokaryotic) 배열, 유케리오틱 mRNA로부터의 cDNA, 유케리오틱(예, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 배열, 및 심지어 합성 DNA 배열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사종결 배열은 보통 코드 배열의 3'에 위치될 것이다.
전사 및 해독 제어 배열은 숙주(호스트) 세포에서 코드 배열의 표현을 제공하는 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐화 신호, 터미네이터 등과 같은 DNA 규정 배열이다,
프로모터 배열은 세포에서 RNA 폴리머라제를 결합하고, 하류(3' 방향) 코드 배열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 규정 영역이다. 본 발명을 정의할 목적으로, 프로모터 배열은 전사 개시 부위에 의해 3' 말단에서 결합되고, 위의 배경을 감지할 수 있는 레벨에서 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 원소의 최소수를 포함하기 위하여 상류(5'방향)로 연장한다. 프로모터 배열내에서 전사개시 부위(통상적으로 뉴클레아제 S1로 도표화하는 것에 의해 한정됨) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합의 원인이 되는 단백질 결합 도메인(일치 배열)이 발견될 것이다. 유캐리오틱 프로모터는 항상은 아니지만 간혹 TATA 박스 및 CAT 박스를 포함한다. 프로캐리오틱 프로모터는 -10 및 -35 일치(consensus) 배열에 더하여 샤인-달가노 배열(Shine-Dalgarno sequence)을 포함한다.
표현 제어 배열은 다른 DNA 배열의 전사 및 해독을 제어 및 조절하는 DNA 배열이다. 코드 배열은 RNA 폴리머라제가 코드배열을 mRNA로 전사할 때 세포내에서 전사 및 해독 제어 배열의 제어하에 있어서, 코드 배열에 의해 인코드된 단백질로 해독된다.
신호 배열(signal sequence)은 코드배열 전에 포함될 수 있다. 이 배열은 폴리펩티드를 세포표면으로 지향시키거나 또는 폴리펩티드를 배지에 분비하도록 하기 위해서 숙주세포와 통신하는 폴리펩티드에 대한 신호 펩티드 N-터미날을 인코드하며, 이 신호 펩티드는 단백질이 세포를 떠나기 전에 숙주세포에 의해 잘려진다. 신호 배열은 프로캐리오트 및 유캐리오트 태생의 단백질 변종과 연합하여 발견될 수 있다.
프로브와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 올리고뉴클레오티드는 둘 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 셋 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 분자로서 정의된다. 그 정확한 크기는 많은 인자들에 의해 좌우되며, 이러한 인자들은 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 및 용도에 좌우된다.
올리고뉴클레오티드와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 프라이머(primer)는 정제된 제한 분해물(digest)에서 처럼 천연의 것이든 합성에 의한 것이든 간에, 핵산 스트랜드에 상보하는 프라이머 연장 생성물의 합성이 뉴클레오티드의 존재 및 DNA 폴리머라제와 같은 유도시제의 존재하에 그리고 적절한 온도 및 pH에서 유도되는 조건하에 놓일 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 단일-스트랜드되거나 이중-스트랜드될 수 있으며, 유도 시제의 존재하에 소망하는 연장생성물의 합성을 주도하기에 충분하게 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 사용을 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 예를 들어, 진단용도의 경우 목표 배열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15-25 또는 그 이상의 뉴클레오티드을 포함하지만, 보다 적은 수의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
여기서 프라이머는 특수한 목표 DNA 배열의 서로 다른 스트랜드에 상보하도록 선택된다. 이것은 프라이머가 각각의 스트랜드와 교잡하기에 충분하게 상보적이어야만 한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 비-상보 뉴클레오티드 단편은 프라이머의 5' 말단에 부착되고, 프라이머 배열의 나머지는 스트랜드에 상보되게 할 수도 있다. 이와는 달리, 프라이머 배열이 스트랜드의 배열과 교잡하여 연장생성물의 합성을 위한 주형(template)을 형성하기에 충분한 상보성을 가진다는 전제하에, 비-상보 염기 또는 보다 긴 배열이 프라이머 내로 산재될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 및 제한 효소는 박테리아 효소들을 지칭하며, 이들 각각은 특이 뉴클레오티드 배열에서 또는 부근에서 이중-스트랜드형 DNA를 절단한다.
외래 또는 이종구조의 DNA가 세포 내부에 도입될 때, 세포는 이러한 DNA에 의해 전형되었다고 한다. 전형 DNA는 세포의 게놈을 구축하는 크로모솜 DNA로 융합(공유적으로 결합)될 수도 있고, 되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 프로캐리오트, 이스트 및 포유동물 세포에 있어서, 전형 DNA는 크로모솜 내로 융합되어 크로모솜 복제를 통해 자세포에 유전된다. 유캐리오틱 세포에 관해서, 안정하게 전형된 세포는 전형 DNA가 크로모솜내로 융합되어 크로모솜 복제를 통해 자세포에 유전된다. 이러한 안정성은 전형 DNA를 함유하는 자세포의 모집단으로 이루어진 세포 라인 또는 클론을 설정하는 유캐리오틱 세포의 능력으로 증명된다. 클론은 유사분열에 의해 단일 세포 또는 공통 모세포로부터 파생된 세포의 모집단이다. 세포라인은 많은 세대에 대하여 시험관내에서 안정한 성장을 할 수 있는 기본 세포의 클론이다.
두개의 DNA 배열이 적어도 75%(바람직하게, 약 80% 이상, 가장 바람직하게 약 90 또는 95% 이상)의 뉴클레오티드가 DNA 배열의 한정된 길이에서 서로 부합할 때 실질적으로 상동이라 한다. 실질적으로 상동인 배열들은 배열 데이터 뱅크에서 입수가능한 표준 소프트웨어를 사용하여 배열들을 비교하는 것에 의해서 , 또는 예를 들어 특별한 시스템에 대하여 한정된 엄밀한 조건하에 서든(Southern) 교잡실험에서 배열들을 비교하는 것에 의해서 확인될 수 있다. 적당한 교잡조건을 한정하는 것은 당분야 공지이다. (참조: Maniatis 등, supra; DNA Cloning, Vols. I II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra).
DNA 구조의 이종구조(heterologus) 영역은 천연에서 대형 분자와 연합하여 발견되지 않는 대형 DNA 분자내에 있는 DNA의 확인가능한 세그먼트이다. 즉, 이종구조 영역이 포유동물 유전자를 인코드할 때, 그 유전자는 원천 유기체의 게놈에서 포유동물 게놈 DNA의 측면에 서지 않는 DNA에 의해 통상적으로 측면에 세워진다. 이종구조 코드 배열의 또다른 예는 코드 배열자체가 천연에서 발견되지 않는 구조이다(예: 게놈 코드 배열이 인트론을 포함하는 cDNA, 또는 태생 유전자 보다 다른 코돈을 가지는 합성 배열). 대립 변종 또는 천연 돌연변이 사건은 여기에서 정의된 DNA의 이종구조 영역을 유발하지 않는다.
항체는 임의의 면역글로블린이며, 특이 에피토프를 결합하는 그 항체 및 단편을 포함한다. 이 용어는 폴리클론, 모노클론 및 키머릭 항체를 포함한다. 맨 나중에 언급된 항체는 미국특허 제4,816,397호 및 4,816,567호에 상세하게 설명되어 있다.
항체 통합 부위(antibody combining site)는 안티겐을 특이적으로 결합하는 중(heavy) 및 경(light) 체인 가변성 및 하이퍼가변성 영역으로 이루어진 항체 분자의 구조적 부분이다.
본 명세서에서 사용되는 다양한 문법적 형태의 구문 항체 분자(antibody molecule)는 무상(無傷) 면역글로블린 분자 및 면역글로블린 분자의 면역학적 활성 부위 양자를 고려한 것이다.
예시의 항체분자들은 무상 면역글로블린 항체, 실질적으로 무상처의 면역글로블린 분자 및 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로블린 분자의 상기한 부위들이며, 이러한 부위들은 당분야에서 Fab, Fab', F(ab')2및 F(v)로서 알려져 있으며, 이러한 부위들은 여기서 설명되는 치료법에 이용하기에 바람직하다.
항체분자들의 Fab 및 F(ab')2부위는 기지의 방법에 의해 실질적으로 무상처의 항체 분자들 상에서 각각 파파인과 펩신의 단백분해반응에 의해 제조된다. 일 예로, 테오필로폴루스(Teofilopolous) 등의 미국특허 제4,342,566호를 참조하면, Fab' 항체분자부위는 또한 잘 알려져 있으며, 이는 두개의 중 사슬 부위들과 메르캅토에탄올을 연결하는 디설파이드 결합의 환원과 결과의 단백질 메르캅탄을 요도아세타미드와 같은 시제로 알킬화하는 것에 의해 F(ab')로부터 제조된다. 여기서 무상 항체분자들을 내포하는 항체가 선호된다.
본 명세서에서 사용되는 다양한 문법적 형태의 구문 모노클론 항체(monoclonal antibody)는 특수한 안티겐과 면역반응할 수 있는 항체결합부위 한 종만을 가지는 항체를 지칭한다. 즉, 모노클론 항체는 전형적으로 면역반응하는 임의의 안티겐에 대하여 단일 결합 친화성을 나타낸다. 따라서, 모노클론 항체는 다수의 항체 결합 부위를 갖되, 각각은 상이한 안티겐에 대하여 면역특이성이 있는, 예를 들어 이특이성(키머릭) 모노클론 항체와 같은 항체분자를 내포할 수도 있다.
구문 약제학적으로 허용 가능한은 생리학적으로 관용될 수 있고, 인간에 투여될 때 배탈, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 성가신 반응을 일으키지 않는 분자 존재물 및 조성물을 지칭한다.
구문 치료적 유효량은 여기서 목표 세포 매스의 S 페이스 활성에서 임상적으로 유의적인 변화 또는 예를 들어 상승된 혈압, 열 또는 그 존재 및 활성에 수반하는 백세포 카운트와 같은 기타 병리적인 증상을 방지, 바람직하게 약 30% 이상 감소, 보다 바람직하게 50% 이상 감소, 가장 바람직하게 90% 이상 감소시키기에 충분한 양을 의미한다.
DNA 배열은 표현 제어 배열이 그 DNA 배열의 전사 및 해독을 제어하고 조절할 때 표현제어배열에 작용적으로 연결된(operatively linked)것이라 한다. 용어 작용적으로 연결된은 DNA 배열의 전방에서 적절한 출발 신호(예, ATG)가 표현되게 하고, 표현 제어 배열의 제어하에 DNA 배열의 표현을 허용하고 그 DNA 배열에 의해 인코드된 소망 생성물의 생성을 허용하기 위하여 정확한 판독 프레임(reading frame)을 유지하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자에 삽입하기 원하는 유전자가 적절한 출발 신호를 내포하지 않으면, 이러한 출발 신호는 그 유전자의 전방에 삽입될 수 있다.
용어 표준 교잡 조건(standard hybridzation condition)은 교잡 및 세정을 위한 5xSSC 및 65℃와 실질적으로 등가의 염 및 온도 조건을 지칭한다.
한 태양에 있어서, 본 발명은 특히 L1에서, 바람직하게 성상교세포에서 CNGN 또는 신경인식분자를 표현하는 트랜스게닉 동물과 관계있다. 이러한 동물들은 중추신경계에서 증대된 신경발전 능력을 갖는다.
본 발명은 또한 CNGM의 신경인식활성을 방해하거나 효력을 더하는 것에 의해서 목표 포유동물 세포의 신경 발전을 변조하는데 유효한 잠재성 의약의 스크린하기 위한 분석 시스템을 포함한다. 신경인식활성(neural recognition activity) 또는 신경밀착활성(neural adhesion activity)는 제2메신저상의 세포내 효과를 포함하는, 다른 분자에 대한 CNGM의 결합의 결과인 임의의 생물학적 효과를 의미한다. 일 예로서, 테스트 의약은 CNS 신경성장 모듈레이터를 활성화시키는 리간드(ligand)를 갖는 세포 샘플, 또는 CNS 신경성장 모듈레이터를 표현하는 트랜스게닉 동물에 투여하여, 임의의 약제 샘플 또는 이 테스트 의약에 대한 모듈레이터의 결합활성에 관한 영향을 대조군과의 비교에 의해 측정할 수 있다. 적어도 하나의 본발명 CNS 신경성장 모듈레이터의, 특히 L1에서, 특성을 식별하는 것은 Ca2+ , pH 및 사이클릭 뉴클레오티드를 포함하는 세포내 메신저의 정상상태 레벨에서의 변화에서의 그 참여이며, 뿐만 아니라 단백질 키나제 C, pp60c-src , 카제인 타입 Ⅱ 키나제 및 포스포릴레이트 L1로 알려진 또다른 키나제와 같은 단백질 키나제의 활성변화에서 그 참여이다.
보다 중요하게, 분석시스템은 시토플라슴에서 또는 핵에서 CNGNs 또는 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 전사능력을 억제 또는 잠재시키는 의약 또는 다른 존재물을 식별하는데 채택될 수 있다. 이러한 분석은 시냅틱 효율에서 신경 발전 또는 증대와 같은 특별한 세포활성에 특이적인 의약이나, 또는 활성의 시간 또는 레벨에서 이러한 활성을 더하는 의약의 개발에 유용하다. 예를 들어, 이러한 의약은 손상에 대응하여 신경 발전을 변조하는데 사용될 수도 있고, 다른 병리현상, 예를 들어 파킨슨씨 병, ALS, 헌팅톤씨 병 및 알츠하이머씨 병과 같은 신경퇴화성 질병을 치료하는데 사용될 수도 있다.
다른 구현에 있어서, 본 발명은 CNS 신경성장 모듈레이터의 활성의 아고니스트 및 길항질을 기대한다. 특히, L1과 같은 CNGM을 인식하는 뉴우런의 능력을 억제하는 시제 및 분자는 신경발전이 금기를 보이는 경우 이러한 발전을 억제하는데 사용될 수 있고, 전술한 바와 같이, 이러한 시제를 포함하는 약제학적 조성물은 목표 부위에 직접 투여될 수도 있다. 또 다른 구현에 있어서, 아고니스트는 특히 화이브로넥틴 타입 Ⅲ 상동 반복단위 2 및 3 사이에서 L1 도메인의 일부의 배열을 가지는 펩티드이거나 또는 이 영역의 항체일 수 있다. 이러한 분자들의 어느 하나는 L1과 같은 특수한 CNGM이 동족친화성 결합을 수행할 능력을 가지는 경우에 잠재적으로 사용될 수 있다(즉, L1은 그 자체에 결합할 수 있고, 따라서 L1에 대한 항체 및 L1 자체의 단편들은 L1에 결합할 수 있다).
본 발명의 진단 용도의 하나는 단백질 키나제 억제자를 스크린하기 위한 분석에서 본 발명 CNGMs의 용도이다. 여기서 기술되는 CNGMs의 활성은 포스포릴화되기 때문에, 이들은 특이 포스파타제에 의해 탈포스포릴화될 수 있는 또는 가정적으로 탈포스포릴화된다. 따라서, 키나제 또는 포스파타제의 봉쇄는 신경인식 단백질의 활성을 변조하는 약제학적 중재의 접근방법이다.
이와 유사하게, 본 발명은 천연에서 일으킨 항체 또는 재조합으로 제조된 항체를 포함하는, CNGMs에 대한 항체의 개발에 미친다. 예를 들어, 본 항체는 CNGMs를 인코드하는 유전자를 얻기 위한 표현 라이브러리를 스크린하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체들은 기지의 유전자 기법에 의해 제조되는 폴리클론 및 모노클론 항체 뿐만 아니라 이-특이성(키머릭) 항체, 그리고 신경 발전을 변조하는 능력과 결합된 추가적인 진단용도에 적합한 다른 기능성을 포함하는 항체를 포함한다.
특히, CNS 신경성장 모듈레이터에 대한 항체들은 선택될 수 있고 단백질에 결합함에 있어서 그 들의 특수한 능력에 대한 본 발명의 영역 내에 포함된다. 즉, 신경성장 모듈레이터의 활성 또는 이에 간혹 연결된다고 생각되는 특이 폴리펩티드의 활성은 적절하게 레이블된 량의 신경성장 모듈레이터 또는 항체 또는 그 유사물의 사용을 통해, 후술되는 분석기법에 의한 결과로서 직접 일어날 수 있다.
즉, CNGMs, 그 유사물, 및 거기에 일으켜질 수 있는 길항질 또는 항체는 예를 들어 방사활성 부가, 소디움 보로하이드라이드에 의한 환원, 또는 방사요오드화(radioiodination)에 의해 레이블된 CNGM에 대한 항체를 사용하여 방사면역분석과 같은 면역분석을 포함하는 다양한 진단기법과 관련지어 사용할 수 있다.
면역분석(immunoassay)에 있어서, 조절된 양의 길항질 또는 항체 등이 제조되고, 효소, 특이 결합 파트너 및/또는 방사활성 원소로 레이블된 다음, 세포 시료에 도입될 수 있다. 레이블된 물질 또는 그 결합 파트너가 시료 내의 부위들과 반응할 기회를 가진 후에, 결과의 매스는 공지의 기법으로 실험될 수 있고, 이는 부착된 레이블의 특성에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, CNGMs에 대한 항체가 전술한 바와 같은 후속의 단백질을 목적으로 선정되어 예시적인 분석 프로토콜에 적절하게 사용될 수 있다.
동위원소, 3H , 14C, 32P, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 가 사용되는 경우 최근에 알려진 집계 방법을 이용할 수 있다. 레이블이 효소인 경우, 검출은 최근에 이용되는 당분야 공지의 칼로리메터 기법, 스펙트로포토메터 기법, 플루오로스펙트로포토메터 기법, 암페로메터 기법 또는 가소메터기법 등에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 신경 성장 모듈레이터의 존의 범위를 정량분석하기 위한, 또는 그 활성을 완화 또는 봉쇄할 수도 있는 의약 또는 다른 시제를 확인하기 위한 테스트 키트의 형태로 제조될 수도 있는 분석 시스템을 포함한다. 이러한 시스템 또는 테스트 키트는 여기서 설명된 방사활성 및/또는 효소기법에 의해 신경성장 모듈레이터, 그 아고니스트 및/또는 길항질, 하나 이상의 부가적인 면역화학 시제를 커플링하여 제조되는 레이블된 성분을 포함한다. 상기 시제중의 적어도 하나는 자유로운 또는 부동의 리간드이며, 레이블된 성분, 그 결합 파트너, 결정된 성분들 중의 하나 또는 그 결합파트너와 결합할 수 있다.
또 다른 구현에 있어서, 본 발명은 CNS 신경성장 모듈레이터, 그 서브유니트, 또는 그 활성단편에 기초하거나, 또는 동일 활성을 보유하는 것으로 판단되는 시제 또는 다른 의약에 기초한 특정 치료법과 관계있다. 첫 번째 치료법은 CNGM, 그 활성 단편, 유사물, 동족물, 협동작용물, 또는 모방물의 존재 및 활성에 결과하는 CNS 신경성장의 촉진과 연관되며, CNGM의 생산 및/또는 활성을 변조할 수 있는 시제를 숙주에 CNS 발전, 재성장 또는 갱신을 촉진하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 반대로, CNGM 또는 단백질에 대한 의약 또는 다른 중화 결합 파트너는 원하지 않는 신경 발전을 억제 또는 방지하기 위하여 투여될 수도 있다. 또한, CNGM 또는 단백질의 포스포릴화 및 탈포스포릴화에 포함되는 특이 키나제 및 포스파타제의 작용의 변조는 CNGM/단백질 활성화에 기초한 치료에 동시에 효과를 더 부여하는 모듈레이터 또는 단백질의 활성을 변조하는 방법을 제공한다.
보다 특별하게, 여기서 칭하는 치료법은 약제학적 조성물에 의해 각종 병인 또는 다른 세포 기능장애 및 디어레인지먼트(dearrangement)의 치료법을 포함한다. 상기 악제학적 조성물은 CNS 성장 모듈레이터 활성의 유효 억제제 또는 촉진제, 또는 예를 들어 본 발명의 한 태양에 따라 제조되고 사용되는 의약 스크린 분석에 의해 개발된 유효 의약을 포함할 수 있다. 예를 들어, CNS 신경성장 모듈레이터 또는 단백질에 대한 의약 또는 다른 결합 파트너가 결합 및 제2 메신저 활성을 억제 또는 효과를 더 부여하기 위하여 투여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 LI CAMs의 전체 패밀리(과)에 미치며, 특이 CHL1로 알려진 L1에 대한 유사물에 미친다. CHL1은 N-말단 신호 배열, 여섯 면역글로블린(Ig)-류 도메인, 4.5 화이브로넥틴 타입 Ⅲ(FN)-류 반복단위, 그리고 C-말단의, 가장 있음직한 약 100 아미노산들의 세포내 도메인을 포함한다. CHL1은 치킨 Ng-CAM에 대한 그 세포외 도메인과 가장 유사하며(약 40% 아미노산 일치), 그 후순위로 유사한 것은 마우스 L1, 치킨 뉴로패신, 치킨 Nr-CAM, 드로소필라 뉴로글리안(Drosophlia neuroglian) 및 지브라휘시 L1.1(각각 37 내지 28% 아미노산 일치), 마우스 F3, 래트 TAG-1 및 래트 BIG-1(약 27% 아미노산 일치)이다. Ig 초과의 다른 멤버들(예: N-CAM, DCC, HLAR, rse) 과의 유사성은 16 내지 11% 이다. 세포내 도메인은 마우스 및 치킨 Nr-CAM, 마우스 및 래트 뉴로패신과 가장 유사하고(약 50% 아미노산 일치), 그 다음으로 유사한 것은 치킨 뉴로패신 및 Ng-CAM, 드로소필라 뉴로글리안 및 지브라휘시 L1.1 및 L1.2(약 40% 아미노산 일치)이다. L1 패밀리의 기인식된 멤버들 중에 고도의 전반적인 상동 및 보존된 모듈라 구조(마우스/인간 L1/래트 NILE: 치킨 Ng-CAM; 치킨/마우스 Nr-CAM; 드로소필라 뉴로글리안: 지브라휘시 L1.1 및 L1.2; 치킨/마우스 뉴로패신/래트 ADGP) 이외에도, L1 특성 기준들이 두개의 인접하는 Ig-류 도메인과 FN-류 반복단위들 내에서 그리고 그들 사이에서 거리를 한정하는 보존된 아미노산 잔기들의 위치들 사이에서 아미노산의 수에 관하여 확인되었다. 이들은 여섯 Ig-류 도메인과 인접하는 네개의 FN-류 반복단위들에서 상결성(colinearity)을 보이며, 이는 F3 서브그룹(마우스 F3/치킨 F11/인간 CNTN1; 래트 BIG-1/마우스 PANG; 래트 TAG-1/마우스 TAX-1/ 치킨 액소닌-1)의 GPI 링크된 형태를 포함하는 이들 모듈(L1 패밀리 카세트를 가리킴)을 내포하는 분자와 L1사이에서 현저하게 보존된다. N-CAM류 분자로서 기도입된 결장직장암 분자(DCC)는 L1 패밀리 카세트와 등형이다. L1 패밀리의 멤버들 간에 공유되는 CHL1의 다른 구조적 특징은 HNK-1 카보하이드레이트 구조를 포함하는 고도의 N-글루코시드적으로 링크된 카보하이드레이트(분자질량의 약 20%) 및 다수 185 kD 밴드 및 소형 단편(100 및 125 kD)을 포함하는 단백질 단편들의 패턴이다. 외부 L1 패밀리 멤버에 관해서 CHL1의 유력한 표현은 신경계 및 나중 발전단계들에서 관측된다.
실시예 1
GFAP-L1 전이유전자 및 전이유전자 마이스의 생산
글리알 섬유 산성 단백(GFAP,앵등(1971)Brain Res.28:351-354)는 마우스 중앙 신경계(랜더리 등.(1990)J.뉴로사이언스.Res. 25:194-203)의 발현의 나중단계에서 성상세포에 의하여 우세적으로 표출되고 있다. 그러므로 GFAP 유전자의 조절 시스 방식은 전이유전자 마이스의 성숙한 성상세포에 신경 세포 접착 분자 L1의 표출을 직접 사용되었다. GFAP-L1 전이유전자(도 1)는 GFAP 유전자의 ATG가 돌연변이되고 L1 코오딩 방식이 변역 중지 및 폴리아데닐화 신호(토가스 등(1994) 네이쳐 367:188-193)에 의하여 3'가 따르기 때문에 다만 신경세포 접착 분자 L1 만을 엔코드한다. 이 구성은 전이유전자 마이스, 표시 3418,3426 및 3427의 3 다른 라인을 확립하기위하여 사용되었다.
마우스 L1 cDNA(Moos 등(1988) 네이쳐 334:701-703)는 앞(토가스 등(1994) 네이쳐 367:188-193)에서 설명한것과 같이 수정된 쥐의 신경교 섬유소 산성 단백(GFAP)유전자의 액손 1 안으로 삽입된다. 단백의 전체 코오딩 방식과 250 3' 비 해독 핵산염을 함유하는 4.05 kb 마우스 L1 cDNA는 수정된 GFAP-L1 전이유전자와 함께 용출된다.
14.5 kb GFAP-L1 전이유전자 는SfiI 으로 소화되고 아가로스 겔으로부터 전기영동 및 전기용출에 의하여 수정된 클론 백터로부터 절제된다. 정제된 DNA 는 T5E0.1(5mM 트리스-HCl,pH 7.4, 0.1 mM EDTA) SO 2 μg/ml의 최종 농도로 희석된다. 희석된 DNA의 약 2 pl은 C57B1/6J 수놈에 짝지워진 CB5F1 암놈(초배란된)으로부터 유도된 시비된 알의 수놈 프로누클루스안으로 미세 주사되었다. 마이크로조작 회생하는 알은 다음 설명하는 방법(호간 등(1986) 마니푸레이팅 마우스 엠브리오, 콜드스프링스 하아버 레보러토리 뉴욕)슈도 임신 포스터 어미의 난관안으로 전이된다.
실시예 2
사우던 블로 분석
마이스를 테일 바이옵시(사우던(1975) J.Mol.Biol. 98:503-517)로부터 분리된 유전자 DNA 의 사우던 블로 분석에 의하여 마우스 게놈 안으로 전이유전자의 일체화를 위하여 분석하였다. 전이유전자 발현자 쥐를 짝지우고 같은 방식으로 새끼를 낳아 스크린되어 전이유전자 라인을 설립하였다. DNA 의 10 μg 시료를 Bam HI 이나 또는 Eco RI 와 Xba으로 소화하고 0.7% 아가로스 겔상 전기영동 분리하고 알카리성 조건하에서 하이본드 N+ 격막(아머샴)으로 이전한다. L1 cDNA 의 3.3 kb Eco R1-분획 또는 SV40 늦은 스프라이스의 330 bp Hind III 분획 및 A1.5 플라즈미드(막스웰 등(1989) 바이오테크닉 7:276-280)로부터 의 정제된 폴리아데닐 부위는 탐침으로서 사용하기위해 랜덤 프라밍에 의하여 32πα-CTP으로 라벨이 붙었다. 예비교잡은 5x SSPE, 5x 덴하르트 용액, 0.5%(w/v)SDS 및 0.1 mg/ml 소닉처리 비 균질 DNA 중에서 1 시간 동안 65℃에서 수행한다. 교잡은 하루밤 수행되었다. 모든 사우든 블로에 대한 최종 엄정한 세척조건은 65 ℃에서 0.1x SSPE 및 0.1%SDS(w/v)로 하였다.
실시예 3
노오던 블로 분석
마취한 성숙한 쥐(12 주 생)를 클로알하이드레이트의 치사 용량에 의하여 희생시키고 뇌를 제거하고 즉시 액체 질소에 냉동한다. 전체 셀룰러 RNA를 액체질소내 조직의 분쇄에 의하여 분리하였다. 4 몰의 구아니디니움 티오시아네이트를 분쇄된 조직에 가하였다. 전체 RNA의 분리는 설명(쵸메진스키 등.(1987) 아날 바이오켐. 162:156-159: 파글리시 등(1989) AMOG.J.Neurosci. Res. 22:113-119)과 같이 수핸한다. RNA 수율은 260 nm에서의 흡수로부터 계측하였다. RNA 10 μg을 노오던 블로 분석(토마스(1980) Proc. Natl.Acad.Sci 미국 77: 201-205)을 위한 1 % 아가로스 포름알데히드 겔상에 분획하였다.
랜덤하게 준비된 L1 cDNA 탐침을 6 kb 의 내인성 L1 mRNA(탁케 등 (1987) 뉴로사이.레터 82: 89-94) 및 4.2 kb의 전이 유전자 유도 L1 mRNA를 동시에 검출하기위하여 사용하였다. 노오던 블로의 밀도적 분석을 이메이지 프로그램(NIH, 리서치 써어비스 브렌치 NIMH)을 사용하여 원래 필름의 탐색 영상(아커스스캐너, 이그파-기베르트)상에서 수행하였다.
전이유전자 동물의 전체 뇌로부터 전체 RNA 의 노우던 블로 분석은 mRNA 전이 유도에 대한 예상된 한 크기(4.2 kb)의 L1 전사로 재현된다(도 2 ). 이들 전사는 포스트미토틱 뉴우론으로부터 유도되며 6 kb 인 내인자 L1 mRNA 로부터 분명하다. 밀도 분석은 전이유전자 유도된 L1 mRNA 의 수준이 내인자 L1 mRNA(비율로 100%)의 수준에 비교하여 라인 3426, 3427 및 3418 내에 각각 34%, 13 % 및 8% 인 것을 나타내다.
실시예 4
동물
크리오스탓 섹션, 면역치토화학 및 그 위치로 교잡 실험의 배양을 위하여 대조군 동물은 나이가 맞는 정상 C57b1/6J 마이스 또는 비전이 유전자 리터메이트의 저장소로부터 택하였다. 소 세레벨라 뉴론의 분리 및 아스트로사이트 배양의 준비를 위하여 6 일 생 ICR 비 전이 유전자 새끼를 사용하였다. 도르살 루트 갱글리온(DRG) 뉴론은 8 일 생 병아리 엠브리오로부터 준비하였다.
실시예 5
인 시튜 교잡
옵틱 시 신경 생체 내. L1 표출 전이유전자 동물의 성상세포를 검증하기위;하여 그 자리에서 교잡에 의하여 분석하였다. 시신경은 그것이 글리아 세포만을 함유하기 때문에 선택 되었고 뉴로널 세포 체로부터 유리되었다. 생체내 성상세포는 어느 개발적 단계에서 L1의 정상적으로 표출이 부족하다( 미 공개 데이터).
산 냉동 뇌 섹션의 크리오스탓트 섹션내 L1 mRNA의 검출을 위하여 시험관내 전사(도리스 등 (1993) 히스토케미스트리 99:251-262)에 의하여 디곡시게닌-라벨된 cRNA를 발생하였다. L1(무스 등 (1988)의 초세포적 부분을 엔코드하는 순서를 p불루스크립트KS+(스트라타게네) 벡터 안으로 서브클론한다. 항 센스 및 센스 cRNA 탐침을 각각 T7 과 T3 프로모터를 사용하여 Xho I 또는 Xba I 으로 수득되는 플라즈미드의 선상화 후에 L1 삽입을 전사함에 의하여 발생되었다. GFAP cRNA 탐침의 발생을 위하여 단백의 N-터미너스를 엔코드하는 GFAP cDNA (류위스등 (1984)Proc. Natl.Acad.Sci. 81:2743-2745; N.J Cowan에 의하여 제시됨)의 1.2 kb 분획을 pBluescript KS+ 벡터 안으로 서브클론되었다. 항 감각 및 감각 cRNA 탐침은 각각 T3 와 T7 프로모터로부터 Eco RI 및 Xho I 으로 선상화 되고 수득 플라즈미드 전이필사에 의하여 발생되었다. 조직 투과를 향상하기위하여 항 센스 및 센스 탐침은 알카리성 가수분해조건 하에서 사이즈되고 약 300 뉴클레오티드의 평균 분획길이를 얻는다. 그위치에서 성(12 주일 생)동물으로부터 준비된 시신경의 섹션상에 교잡은 어느것에나 의하여 설명되는 것과 같이 수행될수 있다(도리스등(1933); 바르트쉬 등, J.Neurosci.,신문에서).
비 전이유전자 제어 L1 전사내는 레티나의 신경세포안에서 만 검출되나 시 신경이 아니고 (도 3 A) 전이나 레전(도 3 B)후에가 아니다. 콘트라스트에 의하여 L1 mRNA는 전이유전자 마이스(도 3C )로부터 시신경의 글리아 세포에 의하여 표출된다. L1 mRNA 양성 세포는 신경의 말초 미엘린 및 근접 비 미엘린화 모두에서 검출할수 있다. 교잡 신호의 강도는 신경의 미엘린화 말단 부에 비하였을 때 비미엘린 접근부에서 더 높다.
양성 세포의 유사 분포와 비미엘린화 와 미엘린 지역 사이에 표지화 강도의 유사한 차이는 GFAP cRNA 탐침(도 3C와 E 비교)를 사용하여 관촬하였다. 그러나 전이 유전자 동물의 시신경내 L1 mRNA 양성세포의 수는 이마도 L1 cRNA 탐침의 더낮은 감도 때문에 GFAP 양성 세포의 수 보다 항상 충분히 더 낮다. 또한 , L1 mRNA 의 검출가능 수준은 GFAP 표출의 높은 수준으로 성상세포내에서만 이루어 질수 있다. 이런 한계효과는 다만 2 kb의 GFAP 5' 플렌킹 순서를 함유하는 GFAP-L1 전이유전자의 설계에 의한다. 시험관내 연구는 전사 적 스타트 부위의 상류 2 와 6 kb 사이에 지역에 C6 세포내(사리드(1991) J. NEUROSCI, 28:217-228)내의 GFAP- 유도 용출 유전자의 표출을 증대하는 순서 부재를 함유한다. 최종적으로 큰 L1 cDNA 의 도입을 포함하는 GFAP 엑손 I 의 수정은 GFAP mRNA 에 비교하여 키머릭 mRNA의 안정성을 감소할수 있으며 수정 개선 지역의 상류 및 하류에 위치하는 조정 GFAP 시켄스에 의하여 변하는 효과를 발휘한다.
시신경손상 후 L1 표출 의 상부 조정은 전이유전자적(도 3D) 그러나 비 전이 유전자적(도 3B)시신경에는 관찰되지않았다. L1 교잡 신호의 강도와 표출되는 L1 인 세포의 수는 같은 전이유전자 적 라인의 다른 개체내에서 같으나 다른 전이유전자 라인을 횡단하여 변화한다. 결과 로서 일정한 것은 노오던 블로 분석에 의하여 얻어진다(위 참조). L1 mRNA 양성세포는 라인 3426에 가장 인접하고 라인 3427 및 최종적으로 3418이 따른다. 전이유전자 표출의 다른 선의 수준은 특히 인자의 수에 관계되며 다른 전이유전자 일체 부위(프라우드푸트(1986)네이쳐 322: 562-565; 리익 등(1987)네이쳐 328:248-251; 사피앤제 등 (1987) 네이쳐 328:251-254)에 접하는 이웃하는 숙주 염색질 지역에 의하여 수준의 영향을 일으킨다.
실시예 6
항체
마우스 L1에 대한 폴리클론 토끼 항체의 생산 및 L1 면역친 칼람 상의 정제(라드젠 등 (1984); 마르티니 등 (1988) 및 마우스 간 멤브린에 대한 폴리클론널 항체(린드너 등 (1983); 폴러베르그 등 (1985)가 설명되어 있다. GFAP 에 대한 마우스 모노클론 항체는 구입하였다(베링거 만하임).
웨스턴 블로 분석을 위하여 폴리클론 및 모노클론 항체는 염소 항-마우스 또는 토끼 항체에 접함하는 호오스라다쉬 퍼옥시다제에 의하여 보이게 하였다(다이아노바, 함부르그 독일). 면역치토화학을 위하여 일차 항체를 형광 이소티오시아네이트- 또는 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트-공액 양 항-토끼 및 양 항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다(다이아노바). 제 위치 교잡을 위한 디고옥시게닌-표지 cRNA 탐침은 디그옥시게닌에 대한 Fab 분획 알카리성 포스페타제-공역에 의하여 가시화 되었다(베링거 만하임).
실시예 7
크리오스탓트 섹션상 뉴론의 유지
전이유전자 동물로부터 시신경이 야생 형 동물로부터 시신경보다 더 뉴라이트 외성장에 더 적당힌지 분석하기위하여 세레벨라 뉴론을 병연 및 교차적 비병변의 시신경의 크리오스탓트 섹션에 유지 시켰다(도 7).
6 내지 16 주 생 쥐들의 시신경을 바르트쉬 등(1989) J.Comp.NEUROL. 284:451-462에 의하여 설명되것과 같이하여 준비하였다. 대략 병변 및 비병변의 시신경은 혈장 유리, 액체질소를 사용하여 호르몬적으로 정의된 매질내에 착상 냉동하였다(피셔(1986b)뉴로사이언스 레터. 28:325-329). 조직 섹션(14μm 두께)을 무균 실내에서 폴리 엘 리신 코티드(시그마, 수중 0.001%) 무균 유리 카버슬립 및 공기 건조 2-3 시간동안 걸어 프리고 커트270-크리오스탓트(정-라이챠르트) 상에 가로로 절단하였다. 매질,6 일 생 ICR 마이스( 100 μl 매질내 6×104세포수)로부터 퍼콜 경사 정제 세레벨라 뉴론(카일하우어 등(1985)네이쳐 316:728-730)을 각 커버슬립에 공급한다. 세포를 양육기에 37℃에서 5% CO2 와 95%공기의 습도화 대기로 유지하였다.
또한 축삭 외성장을 항체의 존재하에서 측정하였다. 섹션을 37℃에서 1 시간 동안 폴리클론 L1 항체 또는 마우스 간 멤브린(100 μg/ml, 배양매질 내 확장 투석 및 희석 )에 대하여 예비 배양하였다. 항체의 제거한후 섹션을 배양 매질로 조심하여 세척하고(실온에서 각 5분간 5 번) 퍼콜 경사처리정제 소 세레벨라 뉴론을 가하였다. 2 일후 저온조 배양으로 실온에서 30 분간 PBS 내 4% 파라포름알대하이드내에 고정하고 축삭 길이를 측정하였다. 측정에서 말단 효과를 피하기 위하여 우리는 카버슬립의 20%로 구성되는 외곽 림에 위치하는 섹션을 평가하지 않았다. 반 자동 컴퓨터 영상 분석 프로그램(IBAS,Kontron,Zeiss)을 사용하여 이들 섹션에서 성장한 모든 뉴라이트의 길이를 측정하고 뉴론 세포체 당 평균 축삭 길이를 측정하였다. 각 실험과 시신경(병변 또는 비병변의)에 대하여 전이유전자 동물의 신경상의 평균 축삭 성장 길이는 대조 동물의 대응값에 대하였다. 12 독립 실험을 적어도 2 전이이유전자 동물을 사용하여 병변 및 교차적 비병변 신경으로 수행하였다.
전이유전자 동물을 위하여 축삭 길이의 증가를 비병변신경과 비교한 병변 상에서 관찰허였다. 야생 형 동물의 병변 및 비병변된 시신경상의 축삭 길이는 대조적으로 충분히 다르지않다(도 8). 전이유전자로부터의 비병변 신경의 배양된 뉴론의 축삭보다 일정적으로 더 길다. 약 300%의 축삭 길이의 최적 증가는 라인 3426으로부터 섹션을 사용하였을 때 관찰되었다. 유사하게 전이유전자 라인의 병변 신경상의 축삭 길이는 야생 동물으로부터 병변 신경으로 비교하였을 때 400%까지 증가하였다.
전이유전자 시신경의 축삭 외성장 증진활성은 L1 표출 의 수준으로 정상으로 서로 관련된다(도 9). 반대로 축삭 길이는 전이유전자 선으로부터 병변의 또는 비병변의 시신경 저온조 섹션이 L1 항체 (도 9)로 예비 보육하였을 때 50% 이상으로 절감된다. 시신경 및 소 소뇌성 뉴론(데이터는 보이지않음)에 강하게 결합하는 간 막에 대한 항체 는 유사한 억제 효과가 보이지 않는다.흥미롭게 앞에서 항체 예비 보육없이 야생동물로부터 병변 신경으로 비교한 축삭 외서장내 증가를 유도한 L1 항체로 야생동물로부터병변시신경의 예비 보육이 된다. 마우스간 막에 대한 항체는 같은조건하에서 충분한 증가가 나타나지않았으며 세포면 반응성 항체의 첨가는 마찬가지로 축삭 외성장을 방해하지않았다.
실시예 8
성상세포의 단층 배양상의 뉴론의 유지
성상세포의 단층을 준비하기위하여 6 일 생 쥐로부터 전뇌를 비뉴론 조직으로부터 유리 소거하고 다음 어느것에서 처럼 해리하였다(슈니져 등 (1981)J.Neuroimmunol, 1:429-456: 피셔 등 (1982a)뉴로시 레터 29:297-302; 카일하우어 등(1985). 세포를 14 내지 21 일간 10% 말 혈장과 2mM 글루타민을 함유하는 BME 매질(기브코)내 폴리엘 리신 코팅된(시그마, 수중 0.001%) 세포배양 플라스크에 유지하였다. 오염되는 올리고덴드로사아트와 뉴론을 매 매질 변경으로 플라스크를 교반하여 제거하고 4 일 간격으로 세포를 보조보육하여 제거하였다. 유지 14 일후 GFAP 에 대한 면역스테이닝은 90% 이상의 세포가 성상세포임을 나타냈다. 배양 14 일후 세포를 트립신화 하고 폴리 엘 리신 코팅 유리 카버슬립상에 5일간 단층으로 유지하였다. 퍼콜 경사처리 정제 소뇌성 뉴론(스니져 등 (1981) 6 일생 마이스와 8 일생 병아리 엠브리오로 부터의 도어살 루트 강거리온(DRG)(세일하이머 등 (1988) J.Cell.Biol. 107:341-351)뉴론을 성상세포 단층 상으로 가하였다. 소뇌성을 위하여 공 배양 6 시간후 및 DRG 뉴론 12 시간후 공 배양물을 PBS 내 2% 파라포름알데히드로 고착하고 축삭길이를 실시예 7에서와 같이 분석하였다.
또한 마우스 소뇌성 또는 병아리 배측 루트 강가리온(DRG) 뉴론 으로 부터의 축삭 외성장은 전이유전자(라인 3426) 또는 비 전이 유전자 대조군(도 10 , 표 1)으로부터 유도되는 서세포의 단층 배양에서 연구하였다.
표 1
소뇌의 및 배측 루트 강가리온(DRG) 뉴론의 축삭 길이는 야생 형 마이스(WT) 및 전이유전자 라인 3426으로부터 준비한 성상세포 단층에 유지하 였다.
소뇌성뉴론 DRG뉴론
WT 65 ± 34mm 90 ± 10mmWT + 항 L1 72 ± 30mm 105 ± 14mmWT + 항 간 57 ± 24mm 07 ± 12mm3426 75 ± 41mm 137 ± 10mm3426+항 L1 45 ± 25mm 88 ± 8mm3426 + 항 간 58 ± 31mm 124 ± 15mm
마우스 간막 (항 간)에 대한 L1(항 L1) 또는 항체 에 대한 다클론 항체와 처리후 또는 어느 항체로 예비 보육없이 성상세포상 축삭 길이를 나타낸다. 평균 값 ± 표준 편차는 적어도 100 뉴론으로부터 4 회로 두 각각의 실험을 수행하여 얻었다.
전이유전자 성상세포상의 소뇌성의 또는 DRG 뉴론의 축삭 길이는 야생 성상세포를 사용하여(표 1 ) 성상세포 길이와 비교할 때 각각 약 15% 또는 50%더 높다. 항 간 막 항체는 야생 형 또는 전이유전자동물(도 10 , 표 1 )으로부터 성상세포 단층위의 축삭 길이에 영향을 주지 않는다. L1 항체와의 성상세포 단층의 예비 보육은 야생 형 동물로부터 세포에 축삭길이에 충분한 영향을 주지 못한다. 반대로 약 40%로 전이유전자 동물로부터 세포상의 소뇌성 또는 DRG 뉴론 성장의 축삭 길이를 감소한다. 이 관점에서 이연구에 사용된 마우스 L1 에 대한 포리클론 항체는 병아리로(마르티니 등 1994a; 데이터는 나타나지않음)부터 뉴론과 반응하지않는 다는 것을 지적한다. 그러나 그것은 면역형광 분석에 의하여 알수있으며 이들 항체는 전이유전자 동물과 마찬가지로 마우스 소 소뇌 뉴론(데이어는 안보임)으로부터 성상세포에 대한 L1 항체로서 효과적으로 결합한다.
실시예 9
면역형광 및 오우리온-GP 면역골드 현미경
야생형 및 전이유전자동물의 신 냉동 횡- 또는 길이단면의 시신경 또는 성상세포 단층의 L1 및 GFAP 면역오염은 설명한것과 같이 수행한다(바르트쉬 등(1989)). 이중 표지를 위하여 우리는 우선 30 분간 4℃에서 L1 항체 와 생 세포로서 제일 배양 성상세포를 배양하였다. 10분간 -20℃에서 70% 메탄올로 세포를 투과성화 후 세포를 30 분간 4℃에서 GFAP 항체와함께 배양하였다.
저온조 배양 시험중 축삭 길이의 정량을 위하여 아우리론 면역 R-Gent 은 증진 스테이닝을 제조자의 처방에 따라 약간 수정하여 사용하였다(오리온 임무노 골드 리아젠트 엔드 악세서리스 커스텀 라벨링 워게닝겐,네덜란드). 대략 배양은 실온에서 10분간 PBS 중 파라포름알데히드내에 고정하고 10분간 PBS 중 50 mM 글리신에 배양후 다음 차폐 완충액(BB, PBS 중 0.5% BSA )중에서 15분간 처리하였다. BB 중 각 5분간 3 세척 후 세포를 실온에서 30분간 BB (2 μg/ml)내 희석한 L1 항체로 배양하였다. 이어서 배양물을 각 5 분간 BB 내에 3 회 세척하고 제 2 항체1:20으로 희석한 것을 실온에서 1 시간 동안 가하였다. 증류수로 3 회 세척후 배양믈을 실온에서 10 분간 PBS 내 2% 글루타알데히드중에 고정하고 증류수로 3 회 세척한다. 엔헨서외 디밸로퍼 1:1 혼합물을 실온에서 가한다. 반응생성물이 나타난후 카버슬립을 증류수로 3회 세척하고 글리세롤중에 장입한다.
비 전이우전자 마이스의 시신경내 L1 면역반응성을 비미엘리화 레티날 겡글리온 세포 악손(바르트쉬 등(1989))에 제한하였다. 전이유전자 동물로부터 비병변성 시신경내 약 L1 면역반응성을 세포 체와 연합하여 발현하고 방사상으로 세포 반응을 배열한다(도 4 A). dl 전이유전자 시신경내 L1 면역반응성의 강도는 병변후(도 4B) 충분히 증가 하고 비병변(도 4 C) 또는 병변(미도시) 야생 형 신경 에 발견된 GFAP 면역반응성에 대한 분포와 유사하였다.
L1 표출은 추가적으로 6 일생 전이유전 동물 의 전뇌로부터 준비된 성상세포의 배양중에 추가적으로 분석되었다. 무 L1 면역반응성은 야생형 동물(도 5 D)로부터 성상세포상에 추적할수 있다. 반대로 L1 양성 세포는 전이유전자 동물(도 5A) 로부터의 배양물중에 존재하다. 이중 면역스테이닝에 의하여 발현된것과 같이 동일한 세포를 세포 표현 L1 이 진실의 성상세포인 것을 지시하는 GFAP(도 5B 및 E)를위한 양서으로 탐증되었다. L1 면역스테이닝이 생세포에 수행되었기 때문에 전이유전자성 동물 L1 은 또한 생체내 성상세포의 세포면에 노출되는 것으로 보인다.
실시예 10
웨스턴 블로 분석
GFAP-L1 전이유전성 마이스내에 L1 표출의 양을 정량하기 위하여 야생 형 및 전이유전자 어른 마이스로부터 비병변 및 병변성(병변 후 15일) 시신경의 호모게네이트의 세제 추출물을 웨스턴 블로(도 6) 상에 분석하였다.
8 주 생 동물으로부터 병변(병변 후 15일) 및 교차적 비병변 시신경을 비뉴론 조직이 없는 청정으로하고 다음 액체 질소내에 냉동한다. 다만 수소 말단만을 조심히 취하고 L1 면역반응성 비수소화 또는 부분 수소화 근접지역이 아닌 신경만을 조심하여 취한다. 신경을 냉동하고 5 분간 4℃에서 브란슨 B15 소닉에이터로 소닉처리하기전에 10 회 해동한다. 다음 그 조직을 균질화 완충액(1% 트라톤 X-100, 2 M 뇨소, 5 mM 벤즈아미딘, 0.1 mM 요도아세트아미드, 1 mM 페닐메탄설포닐 프루오라이드, PBS 중 5 mM Na-p-토실-L-리신클로로-메틸 케톤)중의 다운스 균질화기로 균질화 하였다. 균질물을 15 분간 4 ℃에서 16,000g에서 원심분리에 의하여 청정시켰다. 상징액을 웨셀 등(1984)에 의하여 설명한것과 같이 메탄올/클로로포름으로 처리하여 단백을 침전시겼다. 단백 함량을 상징액(피어스)내에서 측정하였다. 감소조건하에서 7% 슬래브 겔 상 SDS-PAGE 후 단백(25 μg)을 폴리크론 L1 항체(0.4 μg/ml)를 사용하여 웨스턴 블로에 의하여 분석하였다. 호오스레디시 퍼옥시다제-공역 2차 항체( 2 μg/ml)를 ECL 웨스턴 블로 검출 키트(아메르샴)에 의하여 검출한다. 면역 블로의 밀도 분석은 이메지 프로그램(NIH, 리서치 서어비스 브렌치,NIMH)을 사용하여 원 필름의 스캔드 이메지(아커서 스캐너,아그파 가바에르트)상에서 수행하였다.
면역 블로의 밀도적 분석은 전이유전자적 동물의 비병변 시신경내 L1 표출이 야생 형 동물의 비병변 시신경에서 보다 약 40% 와 13%(각각 라인 3426과 3427) 더 높은 것을 나타내다. 병변된 전이유전자 신경내 L1 표출은 ditod 동물의 병변된 신경과 비교하여 310% 와 200%( 각각 라인 3426 및 3427)더 높았다. 야생 형 동물로부터의 손상된 및 교차적 비손상된 시신경 사이의 비교는 손상된 측에 약 40%의 L1 단백 표출내의 감소를 나타냈다. 대비로 라인 3427 과 3426의 병변 신경내 L1 단백의 양은 비병변 교차적 측과 비교하였을 때 약 30% 증가한다. 라인 3426내 L1의 표출수준은 각각 비손상된 손상된 시신경에 대한 라인 3427내에서 보다 약 35% 와 25%더 높았다.
실시예 11
시신경내 축삭의 생체내 재성장
6-8 주생 GFAP-L1 전이유전자 마이스와 야생 형 마이스를 장관내 분쇄하고 14 일후 형광 표지된 비오틴 에스테르로 추적하여 안테로그레이딩 표지에 의하여 망막의 신경절 세포 축삭을 표시한다. 결과를 도 11 과 12에 나타냈다. 각점은 한 동물을 나타낸다.
실시예 12
축삭 외성장 증진과 신호 전입 영역으로서 뉴론 새포 접착 분자 L1 의 2 와 3을 반복하는 섬유넥틴 형 III 균질 반복사이의 연의 동일화
축삭 외성장에 야기되는 뉴론 세포 접착 분자 L1의 영역을 측정하기 위하여 L 1 에 대한 단분지 항체를 발생하고 배양의 소뇌 뉴론의 축삭 외정장상이 그들의 효과를 조사하였다. 11 항체를 기재 로서 다만 항체 557.B6로서 피복하였을 때 아미노산 818 내지 832를 2 와 3을 반복하는 섬유넥틴 형 III균질 반복 2 와 3 사이의 연에서 인지하는 것은 축삭 외부성장내 L1 으로서 역할하는 것으로 Ca2+내세포적 수준의을 증가하고 이노시톨 포스페이트 의 전환을 자극한다. 이들 발견은 이들 제2 메신저내 축삭 외성장과 변경을 서로 상관한다.이러한 상관은 Ca2+-경로 길항제의 능력에 의하여 확인되고 L1과 항체 557.B6 상의 축삭 외향성장을 억제하는 백일해 독소에 의하여 확인 되었다. 이들 관찰은 융기 신호 전입 영역으로서 인식 경우가 깔대기 되어 축삭 외향성장을 유발인자 트리거하는 깔대기가 되어 나타나고 이노시톨 포스페이트의 역할을 증가하고 Ca2+의 교차 수준을 상승시키는 세포 표면 -반향 L1 상의 확실한 부위의 제 1 시간을 지시한다.
실시예 13
재내부향 말초신경내 L2/HNK-1 면역반응성: 이미 모터 축삭 연관 슈반 세포의 양호한 표출
카보하이드레이트 에피토프 L2/HNK-1(이하 L2라 표시함)은 벤트럴 루트 및 근신경의 미엘리화 슈반 세포에 의하여 어른 마우스에 표징되나 드물게 배측 뿌리 또는 피부 신경의 그것에 의하여 표출된다.
배양 운동원의 외향성장을 증진하는 기재 피복 L2 글리콜리피드 때문이나 감각 뉴론은 아닌, L2는 이리하여 생체내 재생 운동원 축삭 에 의하여 근 신경의 양호한 재신경지배에 영향을 준다.
그러므로, 재신경지배된 슈반 세포에 의하여 L2 표출상의 재생 축삭의 영향은 8 주 생 마이스의 피모럴 신경의 근육 및 피부의 가지의 안으로 직접 운동자 또는 감각 축삭에 의하여 분석된다. 피부 지로 부터의 제생 축삭은 근육 또는 피부 신경가지내 면역치토화학적으로 검출가능한 L2 표징을 인도 하지않는다. 근육 가지로 부터의 축삭 재발생은 피부 가지의 약간의 슈반 세포에 의하여 약한 L2 표출로 인도되나 근욱 가지의 많은 슈반 세포에 의하여 강한 L2 표출을 유발한다. 앞에서 운동자 축삭과 연합하는 미엘린화 슈반 세포는 이리하여 앞서 감각으로 축삭 연합되는 수소하는 슈반 세포로부터 운동자 축삭에 의하여 접촉할때 L2 표출에 대한 그들의 능력내에 달라진다. 재인너베이션의 극적 단계 중에 L2 표출의 상향조절은 적합 근육 경로안으로 운동자 축삭 재발생하는 부적합 감각적 통로안으로 이들을 재발생하는 이점으로 제공될수 있다.
실시예 14
병아리내 통과적 회피 임무를 위한 기억의 결합내의 L1
하나의 통과적 회피 임무 상의 훈련 일 생 병아리,이들은 만일 그것이 쓴 맛이나는 메틸안트라아닐에이트내 코팅된 작은 광나는 비드에서 쪼는 경향을 억제하는 것을 배우는 훈련을 하고 시간 종속 작은 방내에 얻어지며 전뇌의 두 분비 영역내 예비- 및 후-접합요소의 재 모델화에 분자 폭포모양의 최고점을 결과 하며 , 중간체 중간 하이퍼스트리아툼 밴트럴(IMHV)와 로부스 파로 펙토리우스(LOP)(로스 (1991)Trends In Neurosciences14: 390-397).카스케이드는 증진된 푸코스 도입에 의하여 증거 된것과 같이 변하는 시간 다음 훈련으로 양 IMHV 와 LPO에서 일어나는 글리코단백 합성의 두 명확한 웨이브를 유발한다. 양 파도는 시험상의 건조 비드로 쪼는 앞선 비터 비드를 피하는 다른것인 건망증이 병아리에 의하여 증거되는 회피임무를 위하여 기억 보유되는 긴 기간(즉 24 시간 플러스)동안 필요하다.
중개하는 세포-세포 접촉내 L1 의 역할을 주는 본 연구는 만일 L1 이 글리코단백 합성의 어느 또는 양 파도내에 역할을 하는 교습-연관 글리코단백의 사이에서 이며 기억 형성을 위하여 필요하다. 만일 그리하면 습득을 위한 적당한 사간 관계로 투여된 L1 에 대한 항체는 긴 기간 기억을 위하여 필요한 시냅틱재 모댈링을 방지하여야하며 그러므로 임무를 위한 건망증을 생성한다. 유사하게 만일 L1 분자의 과봉와 도메인이 인지내의 부분의역활을 하며 시냅틱 재구성 및 안정화를 위하여 필요한 접착을 공정하며, 이공정을 분열할수 있는 내인자 분자에 동성애적으로 결합할 외인성으로 공급되는 과잉셀루러 영역 분획이 공급된다.
항체와 분획
다클론 항체는 면역 친화성 정제한 L1(Ng-CAM, 8D9)으로 면역화함에 의하여 토끼에서 준비하여 다음 면역 과정을 확립한다(라더젠 등 (1984)). L1 은 설립된 과정을 사용하여 다시 8D9 단클론 항체(라게나우어 와 램몬(1987)Proc. Nat'l Acad.Sci. 미국 84:77533-7757) 칼럼을 사용하여 1 일 생 병아리 뇌로부터 분리하였다(라드앤 등 (1984)). 항체를 제조자의 지시에 따라 프로테인 G 세파로스(파마시아LKB)를 사용하여 제 3 면역화 후 얻은 혈장으로부터 분리하였다. 6 면역글로부린-유사(Ig-I-VI)를 나타내는 이 콜리 내의 재조화적으로 표출되는 용출 단백이며 5 피브로낵틴 형 III 균일화 반복(FNi-5)을 압펠 등(1993)에 의하여 설명한것과 같이 제조하였다.
소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 병아리 서브셀루러 분의 면역블로
뇌 호모게네이트로부터, 조 멤브레인으로부터, 가용성 분설으로부터(버르츄라드제 등(1990) BRAIN Res. 535:131-138) 및 후시넵틱 밀도(무라카미 등(1986) J.Neurochem. 46:340-348)으로부터 단백 50μg,모든 일 생 병아리 뇌로부터 모두를 5-15% 폴리아크릴아미드 경사 갤(라엠리(1970) 네이쳐 227: 146-148)상의 감소 조건하에서 SDS-PAGE 에 의하여 분리한 다음 이들을 (번넷트(1981) Anal.Biochem. 112:195-203)의 방법에 의하여 니트로셀루로즈로 전달하였다. pH 7.2 , 5% 탈지 분유를 함유하는 트리스 완충 염수내에 1:1000의 희석에서 L1 항체와 함께 일야 배양후 면역반응성 벤드를 앞에서 설명한 방법(스콜리 등 (1993) 뉴로사이언스 55:499-509)에 따라 검출하였다.
연습과 시험 과정
보육기내에서 보육한 양성의 일 수생 로쓰 쳔키 병아리를 작은 팬내 쌍으로 위;치하고 작은(2.5mm) 백색 비드로 쪼기위하여 예비연습한다음 로쓰너 와 로오즈((1983)J. 뉴로사이언스 41:1357:1363)에 의하여 설명되것과 같이 메틸안트라닐레이트 으로 피복된 더큰 크롬비드(4mm)상에 연습하였다. 새가 쪼은 쪼는 비드는 입체형으로된 혐오스런 반응을 확실히 나타내며,그머리를 심하게 흔들어 그비드로부터 뒤로 무러난다. 24시간이 걸리는 연습이 다르면 각동물운 연습에 사용한 것과 같은 건조 크롬 비드의 제시에 의하여 시험하였다. 아는 것을 피하는 통과의 보류는 동물이 시험 비드를 피하는것을 나타낸다. 이프로토콜을 각 반복에서 24-36 병아리는 연습하고 시험한다. 수련한것의 80%이상 비주사 병아리는 정상적으로 이들 조건하에서 시험의 비드를 피하며 비록 약간은 염수 주시된 새에 피하는 것내에 가벼운 감소가 있었다. 대비로 새들을 시험에 건조비드를 게걸스럽게 쪼는 물을 피복산 비드로 연습한 새들은 그들의 피하는 스코어가 5-10%이상이 드물다. 모든 시험과 연습은 맹 시험자에 의하여 동물의 선행 처리에서와 같이 수행하였다.
주사
L1 항체,FNI-5 및 Ig I-VI 분획을 0.9%염수에 대하여 1 야 투석하고 농축물을 L1에 대해 1 mg/ml 및 분획에 대해 250 μg/ml로 조정하였다. 병아리는 반구 당 10μl L1의 중간 메디얼 하이퍼스트리아툼 밴트랄(IMHV) 안으로 좌우동형의 인트라크니엘 주사를 받으며; 대조동물은 염수의 유사한 주사를 받는다. IMHV 안으로 정확한 인도는 특별히 설계된 머리 홀더의사용으로 받으며 해밀튼 주사기로 슬리브한다(데이비스 등 (1982) Pharm.Biochem. Behav. 17:893-896).
연습 또는 시험에 앞서 염수나 또는 항체의 이 주사 용량을 받은 병아리는 명백한 습관적 영향을 보이지않으며 연습중에 정확하게 비드를 쪼았다. 새롭게 부화한 벼아리의 뇌의 큰 과셀루러 용량은 이 주사의 크기가 잘 되었으며 누설 없이 달성된 것을 의미한다. 앞서의 보고는 시간 다음의 주사에 주사 부위로부터 항체의 느린 확산이 있는것을 의미한다(스콜레이 등(1993)). 주사자리의 정화성은 브레인스 포스트-모르탬의 시각 검사에 의하여 순회적으로 검증된다. 실험의 각 재생에서 염수와 항체의 균형된 그룹 또는 분획 주사된 병아리를 채택하였다. L1 실험에서 벼아리의 그룹은 연습에 대하여 8 회 점의 하나에서 염수 또는 항체를 주사하였으며; 즉 예비 연습2 시간 또는 30분, 또는 + 1 시간,+3 시간, +4 시간, + 5.5시간, +8 시간 또는 +12 시간 으로 후연습. 앞서의 관찰을 기초로하여 어느 영향이 새에서 관찰되는 것이 30 분앞서서 또는 5.5 시간 후 연습으로 주사된 새에서 예견되었으며, 따라서 이들 시간 점에서 복재의 수는 더컸다(항체 주사를 위하여 각각 N=17,28,17,19,18,21,19, 및 18 ). L1 분획 FN1-5 및 Ig I-IV를 -30 분 또는 +5.5 시간에서 주사하고 24 시간에서 보유 시험하였다. 염수 및 L1 - 항체 또는 L1-분획-주사한 병아리의 그룹의 보유를 κ2에 의하여 정체적으로 비교하였다.결과는 도 13 및 14에서 나타냈다.
실시예 15
장 기간 효능의 L1 및 NCAM의 유발
할로탄-호홉단절 수 위스터 레트(180-220그램)로부터 횡 힙포캄펠 슬라이스(400 μg)을 표준기술로 준비한다. 슬라이스를 내접 방에 유지하고 원초적으로 실온에서 하이퍼로몰량(320 mOsm/kg) 인공 세레브로스피날 액(ACSF)에 45 분 동안 재생하기 위하여 둔다. 다음 욕온도를 30℃로 올리고 매질을 NaCl, 124.0; KCl, 2.5; MgSO4, 2.0; CaCl2,2.5;KH2PO4, 1.25; NaHCO3, 26.0; 글루코스 ,10; 과당, 4;를 95%O2/5%CO2(pH 7.4); 과확산 속도: 0.75 ml/min를 함유하는( mM 내 ) 노르모토닉 ACSF(307 mOsm/kg)으로 변경하였다. 샤페르 코라터럴/콤미쑤랄 섬유를 CAl 영역의 방사상층내에 둔 꼰 백금 이리디움 와이어(50μm 지름)에 의하여 자극하였다. 시험 자극은 매 30 초 100 μs 지 속의 모노페이식 박동안에 구성되며 자극 강도는 최적 EPSP 진폭 ( 초진입 포푸레이션 스파이크없이 최적 EPSP )의 30%를 얻기위하여 조정하였다. EPSP의 것은 각 측에 자극 전극으로부터 약 300 μm 떠러져 위치하는 2 유리 마이크로피펫트( 2M NaCl, 1-5 MΩ)의 수단으로 CA1 방사상층으로부터 녹취 기록하였다.
적어도 15 분간의 안정한 래코딩후, 항체 또는 단백 분획을 하나의 기록 전극의 근접(50-75μm)내 CA1 수지상 필드상으로 개선된 미세사출시스템(나노리터 인젝터,WPI)을 사용하여 방출하고 계속적으로 달리 지시가 없는한 실험의 끝까지 매 10초 마다 5 nl을 인도한다. LTP 의 연이은 도입으로 항체의 세정은 분명한 이유로 불가하나 항체가 공급되지않은 제2 극으로부터 기록에 의하여 각 절편 스라이스내에 인도될 수 있는 LTP 인가를 힐수 있다. 비록 방출 마이크로피페트는 슬라이스를 투과 할수 없으나 EPSP 고도내의 작은 감소는 방출이 출발할 때 종종 관측된다. 이 용량 가공품은 방출된 물질의 성질의 독립적인 것이다. 단백은 달리 지적되지않은한 PH 7.4에서 20 mM PBS에 대하여 투석하고 피페트 농축으로 농축하였다.
마이크로방출 개시 후 20 분에, LTP 는 4초로 간격이 되는 3 기차로 구성되는 테타 버스트 항진(TBS) 파리딤으로 도입되었으며; 100 Hz로 5 펄스의 10 고빈도 벌스트로 구성되는 각 트레인과 파열은 200ms( 라이카르트 등.(1991)
Annu.Rev.Neurosci. 14: 531-570)에 의하여 분리되었다. 항진 펄스의 기간은 TBS 동안의 2 배이다. LTP의 유도는 전체적으로 10 μM D(-)-2-아미노-5-포스포노펜타논산(D-AP5; 토크리스)의 용출에 의하여 방지된다. 전체 세포 레코딩은 EPC-9 페치 클램프 증푹기으로 맹목 페치 클램프 법을 사용하여 CA1 뉴론으로부터 얻을수 있다. 욕온도는 30℃이었다. 페치전극은 1.5mm OD 보로실리케이트 유리로부터 당겨지고 3 과 6 MΩ 사이의 저항을 갖는다. 피페트를 화 연마 나 또는 코팅을 않는다. 극을 회진적으로 : 포타슘 굴루코네이트,129;KCl, 5; MgCl2,1; CaCl2, 1; N-(히드록시에틸 )-피페라진-N'- (2-에탄설폰산)(HEPES), 5; 1,2-비스 (2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 5: Na-ATP,10 과 Na-GTP, 0.3을( mM 내 )함유하는용액으로 제출하고 pH를 KOH를 사용하여 7.3으로 조절한다. 일련의 저항은 보상하지않는다. 감응을 4 신호에 대해 3 의 평균으로서 시료채취하고 시각적 분석을 위하여 인쇄하거나 또는 더 분석을 위하여 디스크에 저장한다. 정적 평가를 플랜을한 비교와 대비 분석; 즉 시간은 반복측정의 한수준으로 종속 변수로서 생각하여 변수의 분석에 의하여 수행한다. 항 L1 (라드젠 등(1984)), 항 Ig I-VI(하인스 등(1992) 와 항간 막 항체(린더 등(1983))을 앞에서 설명한것과 같이 생산하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.
Ig- 유사 영역 I-VI 및 FN 형 III 균질 L1-의 I-V 반복을 박테리아 내에서 표출하고 설명과 같이 정제하였다(하인스 등(1992)). NCAM 과 악소닌-1 에 대한 항체를 설명(라르손 등(1986) Scieence 232: 985-988; 베일리 등(1992) 싸이언스 256:645-649)과 같이 생산하였다. 리보뉴클리아제 B 로부터 올리고만노시딕 글리코펩티드의 생산 및 아시알로페투인으로부터의 대조 글리코펩티드의 생산은 설명(라르슨 등 (1986))되어 있다. 결과를 도 16 에 나타냈다.
NMDA 수용기-중간자 EPSP's 를 항체 또는 글리코펩티드의 공급에 앞서 20 분 출발하는 비 NMDA 차단제 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX; 토클리스)의 30
μM 공급에 의하여 분리하였다. 각실험의 끝에서 D(-)-2-아미노-5-포스포노펜타노인산(D-AP5; 30 μM; 토클리스)는 완전히 이들 반응을 억제하는 것으로 판명되었다. 결과를 도 17에 보인다.
실시예 16
L1 은 신경예비보존 효과를 촉발한다.
실험을 춘신경 조직으로 L1 의 활성을 더 용출하기 위하여 수행하였다. 특별히 마우스 메센세파론 세포의 부분표본 시료는 플레이트하고 다음과 같이 준비한 매질을 갖는 4 분리 판에 배양한다: 제 1 대조 프레이트는 폴리-L-리신 단독으로 피복한다; 제 2 플레이트는 폴리-L-리신 과 L1으로 피복한다; 제 3 대조 플레이트는 폴리-L-리신 과 라미닌으로 피복한다; 제 4 플레이트는 폴리-L-리신과 라미닌과 L1으로 피복하였다. 모든 플레이트는 세포의 부분표본 양을 수령하고 동일한 조건 하에서 배양된다. 7 일후 플레이트를 도파민 과 그다음 관찰된것의 존재를 위하여 모두 스테인하였다.L1 으로 피복된 플레이트는 대조군보다 200% 내지 400% 더크게 성장한 것을 나타냈다. 라미닌으로 피복된 플레이트는 더 큰 축삭 성장을 나타냈으나 l1 으로 피복한것보다는 더 세포가 없었다. 그 결과는 L1 이 충분한 신경보전적 효과를 발휘하며 세포 성장의 수에 의하여 측정한 세포생존능은 대조보다 극적으로 증가 되 었다.
실시예 17
가용성 L1 ( L1-Fc)는 기능적으로 활성이며 뉴런 생존의 양성 제제이다.
가용성 L1 은 뉴런 14: 57-66,1995 에 기재된 과정에 의하여 재결합제 L1-Fc 용출 단백으로서 COS 세포 내에 서 만든다. 재결합 단백은 단백 A 친화성 크로마토그라피에 의하여 정제하고 프라스틱 상에 피복된 기재로서 또는 약 1-10 μg/ml에서 배양 매질에 가해지는 가용성 분자로서 사용된다. 축삭 외향성장과 17일 레트 태아로부터 메센세파릭 뉴런의 생존을 시험관내 유지 7 일후 배양에서 시험한다. 도파미너지 뉴런을 도파민-베타-히드록실라제(DBH)를 위한 면역스테이닝에 의하여 화인하고 IBAS 형태량적 장치를 사용하여 정량한다. 배양은 가용성 L1-Fc을 가한 것을 폴리-DL-오르니틴(PORN) 상에 유지하고 기재 피복된 L1-Fc를 앞에서 피복한 PORN( 압펠 등의 J. 뉴로사이언스 13: 4764-4775, 1993 에 설명되는 조건하에서) 의 상부에 가하였다. NCAM-Fc를 대조구로 사용하였다.
표 1
시험관내 7 일후 DBH- 의 생존과 축삭 외향성장
뉴런-의 수 축삭--의 길이
기재- 피복된 L1 129±20 179±40
가용성 L1 98±7 135±27
PORN 단독 (대조) 14±2 37±9
평균 값은 적어도 3 독립 실험±SEM에서부터 이다.
- 수는 단위 필드로부터이다
-- 뉴런 당 모든 축삭의 길이(전체 축삭 길이)를 μm로 측정하였다.
뉴럴 세포중의 인지는 기능 신경 시스템의 발현을 위하여 중요한 예비적합하다. 인지 분자는 세포 표면에서 표출되어 카데린스와 같이 이웃 세포사이에서 중간 작용을 매개한다(타케이치,1991; 루오슬라티, 1988; 하인스, 1992). 인지 분자의 가장 저명한 가족은 면역 글로부린(Ig)- 유사 영역을 구성한다 . Ig- 유사 영역은 면역 글로부린 및 세포 접착 분자의 보통 모세포를 나타내며, 양쪽은 특정 인지 사건내에(에델만, 1970) 유발된다. Ig 수퍼가족 신경 시스템에는 두 타스이상의 확인 분자에 으해 구성된다. 분자를 함유하는 약간의 Ig- 유사 영역은 과잉셀루러 도메인중의 다수의 기능을 가진다: 치토킨을 위한 수용기와 뉴러투로핀은 높은 친화 수용성 기능과 마찬가지로 인식성( 탄나힐 등., 1995:; 풀리오 등 1992)을 가진다.
Ig- 유사 영역의 3 치수적 구조는 FN - 유사 반복( 마인 등 1992; 리이히 등 1992)에 유사하며, 또한 피브로넥틴, 테나신 가족 및 다른것의 일원(윌리엄 과 바아클리 1988: 바론 등 1992; 에릭손 1993)과 같이 몇 과잉셀룰러 기재 분자내 구조적 모티프가 있다. Ig 슈퍼가족의 뉴럴 인식 분자는 일시적 특성, 스파트랠, 및 세포형 특성 에스프레숀 페턴(에댈만 보기 1988; 샤치너, 1991. 1994: 라드젠 및 조셀리, 1991: 루티에하우서 1993)을 갖는다. 이 가족의 인식 분자는 모든 프로모트 세포 접착 및 축삭 외성장에 기능상 덧 싸여 있다. 어떤 인지 분자는 강하게 동종친화성을 가지며, 즉 그들은 Ig-수퍼페미리 또는 과봉와 메트릭스 분자(브룬멘도르프와 라트젠 1993, 1994)의 다른 일원을 구성하는 비자체 피트너에 결합한다. 개체 Ig- 유사 도메인 및/또는 뉴럴 인식 분자의 FN-유사 반복의 기능 성의 현지식은 모두 분명하며 인식, 축삭 외향성장, 및 재 박동의 기능성을 덧 싸는것을 나타낸다( 갠나리니 등 1991; 프렐 등 1992; 테일러 등 1993; 압펠 등 1993; 1995; 페시바 등 1993; 파이센팰드 등 1994; 호임 등 1995).
Ig 슈퍼가족의 뉴럴 인식 분자 중, 뉴럴 인식 분자 L1에 관련되는 분자 가족 은 기능 및 구조내의 현저한 유사성을 나타낸다. 그들은 포텐트 축삭 외향성장 프로모터이며 발현중에 비교적 늦께 표출되며 거의 악소유전자가 일어날 때 상태에서 표출된다. 그들은 뉴런에 의하여 우세적으로 표출되며 비록 L1 가족의 약간의 멤버는 글리아 세포를 증진하는 축삭 외성장에 존재한다( 마르티니 및 샤크너 1986; 빅스비 등 1988; 사일하이머 및 샤크너 1988).
실험에서 따르는 다른 L1 가족의 원은 동일화 되고 특성화 되며, 즉 L1(CHL1)의 닫힌 호모로그를 지시한다. 이것은 6 Ig 같은 영역과 FN-유사 반복을 함유하며 넷은
다른 L1 가족 일원의 FN- 유사 반복에 대하여 높게 균일화 된다. 부분 FN-같은 반복은 분자의 막 인접 영역을 지역화 하고 이것은 L1 관련 분자중 가장 변화가능한 지역이다. L1 가족의 원과 함께 나눠진 CHL1 의 다른 모습은 그의 우세성 및 신경 시스템내 발전적으로 늦은 표출이며 N-글리코실화 의 그높은 수준, HNK-1 카보하이드레이트 의 표출을 포함하는것이다.
실시예 18
재료와 방법
동물
ICR 마이스와 위스타 레트를 조직 준비에 사용하였다 .
항체
CHL1( 아미노 산 499-1063 (도 18과 19)) 및 L1(아미노산 126-1981(압펠 등 1993))의 재조합적으로 표출되는 과 봉와 부분에 대하여 지적되는 다클론 항체는 설명(라트젠과 샤치너 1984)과 같이 토끼에서 상승되었다. 정제 페프리틀의 CHL1 200μg에 대한 항체를 상스을 위하여 토끼에 주사하고 3 주 간격내 100 μg 의 4 의 추가적 주사에 의하여 따른다. L1 항체를 암모늄 설페이트 침전(13.5 mg/ml) 에 의하여 혈장으로부터 농축된다. 모노시오널 레트 항체 412 는 HNK-1 카보하이드레이트 에피토프( 크루스 등 1984)를 동일화 하기위하여 사용되었다. 글리아 섬유소 산성 단백( GFAP )에 대한 단클론 항체는 베에링거로부터 얻었다. O 1 항원에 대한 단클론 항체는 설명되어 있다(솜머와 샤치너 1981).
신경접착 분자의 정제
L1, N-CAM ,과 MAG를 단클론 항체 카럼(라트젠 과 샤치너 1984; 폴스너 등 1985; 폴토락 등 1987)을 사용하여 성 마우스 뇌로부터 조 멤브레인 유분의 세제 추출액으로부터 면역친화성 순수화를 하였다.
cDNA 도서관과 스크리닝
8 일생 마이스로부터 뇌의 폴리(A)+RNA 로부터 유도되는 λgt11 도서관 의제조와 면역친화성 정제된 다클론 L1 항체 로 이 도서관을 검증하느것은 설명(탁케 등 1987)과 같이 수행한다. 더긴 cDNA 클론을 얻기 위하여 새로운 DNA 도서관을 구성하였다: RNA를 구아니디니움 티오시아네이트/산 페놀 법(초메진스키와 삿 키 1987)에 의하여 6-14 일 생 마이스의 뇌로부터 정제하였다. 폴리(A)-RNA를 올리고(dT)-샐루로즈 칼럼(삼루크 등 1989)상 2 연속 통과에 의하여 풍부하게 한다. 폴리(A)+RNA 의 8 마이크로 그램을 cDNA 합성 키트를 사용하여(아메르샴) 올라고(dT)- 프라임드 더블-표준 cDNA의 합성에 사용하였다. 그 cDNA를 크기 선택하고 살사이트(크룩센 등 1992)를 함유하는 DraIII으로 플라즈미드 pXMD1안으로 결찰하였다도서관의 전파와 증폭을 위하여 이.콜리 스트레인 TOP10(인비트로겐,네덜란드)를 사용하였다.검사를 위하여 부분표본을 약 2x104균/필터(138 cm2)의 밀도로 나이론 막(바이오다인TM 팔)상으로 직접 평판도포한다. 37℃에서 리플리커 필터를 1 야 배양한다음 연이어 균을 용해하고(0.5 M NaOH; 1.5M NaCl), 필터를 중화 하고 (3M NaCl; 0.5 M 트리스 - HCl pH 8.0), 2xSSC에서 세척하고 공기건조하고 80℃에서 2 시간 배소한다. 나일론 막을 예비교잡하고 CHL1( λgt11 도서관 으로부터 유도된)의 1kb분획(HincII/KpnI) 으로 교잡하고제조자 프로토콜에 따라 무의도로 프라이밍(베에링거 만하임)에 의하여 래디오라밸하고 42℃에서 높은엄중한조건하에서 세척한다음, 어느것에나 설명(삼루크 등 1989)한것처럼 X 선 필름에 폭로한다. 제한적 멥핑에 의하여 6 양성 클론을 더 특성화하고 표준 푸로투콜에 의하여(샘루크 등 1989) 속발한다. 4.43 kb CHL1 삽입을 포함하는 1 클론(pX#2)을 더 분석함에 사용하였다.
DNA 속발과 속발 분석
핵산 속발을 프라이머로서 합성 올리고핵산 및 T7 DNA 폴리머라제(파마시아)로서 이중 표준DNA를 사용하여 디데옥시-사슬-말단 법으로(상거 등 1977) 측정하였다.
cDNA 속발은 DNASTAR 프로그램으로 (DNASTAR,Inc., 런던 )조립 및 분석하였다. 달리 지시하지않은한 아미노산 속발은 조룬 하인 법(하인 1990)(겝 페널티= 11, 겝 길이 페널티=5,Ktuple=2 )으로 배열하였다.
단백 속발배열의 비교
보존 아미노산 잔사사이의 거리의 비교를 위하여 유사성 인댁스(%)를 계산하기위하여 6 Ig-같은 영역을 함유하는 몇가지 분명한 단백과 적어도 4 FN-유사 반복을 Ig-유사 영역(S-S 가교에 관하는 시스타인스) 및 FN-유사 반복(트립토판 및 티로신/페닐알라닌)내 보존 아미노산 잔사로 배열하였다. 이들 보존 위치 사이의 아미노산 잔사의 수를 측정하였다. 이것은 교감 거리로서 칭한다. 그 거리의 평균 값 즉 L1 가족 간의 교감 거리 및 표준산포(SD)를 계산하였다. SD 값은 다음 인테거로 올려진다.각 단백에 대한 거리는 평균 거리와 비교되고 만일 거리이 평균 값 ± SD(= 교감 거리) 와 같으면 맞는 것으로 생각한다. 19 교감거리에 대한 멧치의 수는 각 개체 단백(유사성 인댁스= 멧치의 수/19 x 100)에 대하여 계산한다. 예를 들면, CHL1 단백 16 거리값에는 교감 거리와 맞으며 반면에 모든 표준의 셋은 맞지않았다. 이것은 16/19 또는 84% CHL1 의 유사성 계수로 인도된다.
실시예 19
세포 배양 및 COS-1 세포 내 CHL1 및 L1 의 표출
클론 pX#2의 4.43 kb 삽입을 살 소화되는 pXMD1 (Kluxen 등 1992; 크룩센과 롭버트 1993 )으로 결찰하였다. 마우스 L1 cDNA(무스 등,1988)의 아분획(EcoRI(플라즈미드 폴리링커)/Pvull bp 4048)을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 pXMD1 (Kluxen 등 1992; 크룩센과 롭버트 1993 )으로 결찰하였다.
COS-1 세포를 5% CO2로 가습한 대기 중 37℃에서 10% (v/v)태아 칼프 혈장으로 보조한 DMEM (0.1% 포도당)중에 유지하였다. DEAE 덱스트란-메디에티드 DNA 전이감염을 약간 수정하여 설명(크룩센 등 1992)과 같이 수행한다. 대략 세포는 약 10,000 셀/㎠ 에서 파종한다. 1 일후 DMEM(0.45% 포도당) 으로 2 회 세척후 매질을 10%(v/v) Nu- 혈장(스위스 백톤 딕킨손), 0.4 mg/ml(w/v) DEAE-덱스트란 (파마시아), 50 ㎛M크롤킨 과 1.25㎍/ml DNA(4ml/10cm 접시) 로 보강한 DMEM 으로 구성된 전염용액에 옮겼다. 세포를 37℃ 와 5% CO2에서 4 시간 배양한다. 다음 매질을 제거하고 세포를 10% 디메틸설폭시드( v/v)를 함유하는 포스페이트 완충염수(pH 7.3)에 2 분 간 배양한다. DMEM(0.45% 포도당) 으로 2 회 세척후, 10%(v/v) 치사 칼프 혈장으로 보조한 DMEM 과 20㎍/ml 겐타마이신을 가하고,세포를 이매질에 배양하였다. 24 시간 후 세포를 37℃에서 5분간 핸크의 바란스 염 용액(HBSS)내 0.01% 트립신과 0.0004% EDTA로 배양에 의하여 떼어내고 , 폴리-L- 리신 코팅 글라스 카버슬립(지름 11mm)를 갖는 24 웰 플레이트 (팔콘) 내 약 20,000 셀/㎠ 의 밀도에서 면역치토화학을 위하여 재플레이트하고 24 시간 더 배양하였다. 웨스터 블로 분석을 위해 세포를 조직 배양 접시상에 재평판고정하고 48 시간 더 배양하였다.
PC 12 세포를 콜라겐 피복조직 배양접시상에 10%(용량) 송아지 태아 혈장 과 5%9용량) 말 혈장과 함께 DMEM에 유지한다. 세포의 유도를 위하여 신경성장 인자(NGF) 로 매질을 약 50% 공류로 단일층 으로부터 제거하고 100 ㎍/ml 7 s-NGF(스위스,시그마)으로 보강한 감소된 혈장 함량(5% 말 혈장)으로 대치한다. 배양 2 일후 세포를 0.1% 트립신과 0.04% EDTA 으로 배양에 의하여 분리하고 수집하여 RNA 추출물에 건다.
성상세포의 일차 배양은 수정된(구나르드 등 1994)맥케이앤드 드 밸리스(1980)법에 의하여 준비하고 시험관내 1-2 주 후 면역 스테이닝에 사용한다. 올리고덴드로사이트의 일차배양물을 라앵 등(1994)법에 의하여 제조하고 12 일간 시험관내 유지한다.
실시예 20
안티센스 RNA의 생산
4.43 kb의 클론 pX#2의 삽입을 살 소화된 pBS II SK(스트라타겐) 안으로 결찰하였다. Apal(백터)/AvrII(bp 3330(도 18)) 분획의 삭제에 의하여 단백(도 18 과 19)의 과봉와 부분을 엔코드하는 CHL1 의 분획 cDNA를 얻는다. L1을 위하여 유사한 구성으로 T4 DNA 폴리머라제로 처리한 L1 cDNA(무스 등 1988) 의 EcoRI( 플라즈미드 폴리린커)/EcoNI( bp 3304 )분획의 결찰에 의하여 제조하고 Smal 소화 pBSII SK-안으로 결찰하였다. 플라즈미드를 튜미으로 소화하고 설명(멜톤 등 1984)과 같이 T7 RNA 폴리머라제와 함께 p-표지된 항감각 RNA 의 합성을 위하여 사용하였다.
노오던 블로 분석
폴리 (A)- mRNA를 제조자 지시에 따르는 올리고텍스 직접 mRNA-법을 사용하여(QIAGEN Inc., 디셀돌프, 독일) 네오나탈과 9 일 생 마이스의 다른 조직으로 제조하였다. 폴리(A)- mRNA 와 RNA 마커(RNA 레더 깁코/BRL)을 0.8% 포름알데히드/한천 겔상에 전기영동하고 이어서 20x SSC 내 모세관 이송에 의하여(사우던 1975) 하이본드-N 막(아메르샴)으로 이송한다. UV 교차결합 후(UV-스트라타링커 1800, ㅅ,ㅌ,라타겐 , 라졸라, 켈리포니아), 막으로 이송 결합되는 RNA 의 양을 메틸렌 블루염(삼브루크 등 1989)에 의하여 조절한다. 65℃에서 2 시간예비교잡하고 막을 65℃에서 교잡 완충액(5xSSC, 2.5x덴하르트 용액, 50% mM Na2PO4(pH 6.5), 0.1% SDS ,1mM EDTA, 2 ㎍/ml 참치 스펌 DNA, 50% 포름아미드)중 CHL1- 과 L1- 특수 32 P-라벨드 항감각 RNA 탐침을 사용하여 1 야 교잡하였다. 다음 필터를 0.1 x SSC, 0.1% SDS 중 65℃에서 1시간동안 3 회 세척하고 X 선 필름상에 노출한다.
실시예 21
이. 콜리 내 리콤비난트 CHL1 의 정제와 표출
제 6 Ig-유사 영역( IgV1) 과 FN-유사 반복 1,4.5(도 18과 19b)을 엔코드하는 CHL1(Mscl; bp 1791(백터 클로닝 부위 및 CHL1 클론 유도된 λgt11 의 단부 5' 로부터 원래인)과 BsmA1;bp 3494) 의 1.7-kb cDNA-분획을 pET-벡터 (스튜디어 와 모파트 1986)의 새로운 BamHI 제한 부위로 서브클론한다. 플라즈미드의 바른 속발을 시리싱에 의하여 확인하였다. 이. 콜리 균주 BL21(DE3)을 이 플라즈미드와 전형하였다. 재조합 단백의 음이온 교환 크로마토그라피에 의하여 표출과 정제를 압펠 등(1993)에 따라 수행하였다. SDS-PAGE와 쿠마씨 염색은 적어도 80%의 전 단백(안보안보임)을 함유하는 예견되는 분자량(70kD)에서 주대역을 보인다.
조직 분획
전체 조직의 세제 용해질은 40mM의 트리스-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 5mM EGTA, 1mM 페닐 메틸설포닐프로라이드(PMSF), 1% 트리톤 X-100내에서 조직의 균질화에 의하여 제조하고 일정한 교반 하에서 3 시간 4℃에서 유지한다. 가용성 분을 100,000으로 원심분리하여 불용분으로부터 분리한다.
막 분획의 세제 분해질의 제조를 위하여 조직을 4℃에서 1 mM NaHCO2(pH 7.9), 0.2 mM CaCl2, 0.2 mM MgCl2, 1 mM 스퍼머딘, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 10 ㎍/ml 대두 트립신 억제제, 1 mM PMSF, 과 0.5 요도아세타미드 중에서 균일화 한다. 다음, 막 과 가용성 분획을 분리하고 막 펠롯을 가용화 완충액(20 mM 트리스- HCl(pH 7.9), 0.15 M NaCl, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5% 트리톤 X- 100, 5 ㎍/ml의 아프로티닌, 10 ㎍/ml의 대두 트립신 억제제, 1mM PMSF, 및 0.5 mM 아세트아미드)중에 재형탁한다.
일시적으로 전염된 COS-1 세포는 HBSS로 두 번 세척하고 37 ℃에서 10 분간 HBSS 중 1 mM EDTA로 배양한다. 다음 세포를 불로 연마한 파스퇴르 피펫으로 떼어내고 4 ℃에서 10 분간 200g 으로 원심분리하여 수집한다. 세포를 20 mM 트리스-HCl(PH 7.4), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 1mM 요도아세트아미드, 1mM PMSF, 및
1% MP-40 과 상징액을 원심분리(13000g)에 의하여 청정화한다. 단백 측정은 브레드포드(1976)에 설명된 법에 의하여 수행한다.
웨스턴 블로 분석
환원조건하에서 8% 또는 10% 슬라브 겔상 SDS-PAGE( 라앰밀 1970)에 의해 분리하고 CHL1 항혈청( ECL 에 대해 1:500, 1:10000 로 희석), L1 다클론 항체( ECL을 위해 1:1000, 1: 15000 으로 희석), 또는 단클론 항체 412 ( ECL 대 1: 1000, 1:10000 로 희석) 및 알카리성 포스페타제-결합 2차 항-토끼 또는 항 레트 IgG을 사용하여화이쓰너 등(1985) 법에 따른 면역검증을 위해 니트로셀루로즈 필터(0.45 마이크로 미터, BA 85; 슈라이쳐 와 슈엘, 다쎌, 독일)으로 전이한다. 반향 항체를 ECL 웨스턴 블로 검출 약제(아메르샴) 과 X 선 필름을 사용하는 제조자의 지시에 따른 향상된 화학루미선스(ECL) 법에 의하여 검출하거나 또는 크로모겐 기재로서 BCIP 및 NBT 사용에 의하여 검출하였다.
실시예 22
효모연결 면역소르밴트 시금
효모결합 면역소르밴트 시금(ELISA)을 100 ng/ml의 농도로 코팅한 단백을 제외하고는 후스만 등 (1992)에 의하여 수행하였다. CHL1 항혈청1:250 내지 1:2X106사이의 몇 희석으로 사용한다.
CHL1 의 디글리코실화
7 일 생 마이스으로부터 뇌조직 호모게네이트(200 μl, 6 mg/ml 단백농도 )의 세제 용해질을 원심분리( 티슈 프렉션 참조)로 용해성 분과 불용성 물질으로 분리하고 0.5 단위 N-글리코시다제 F 또는 2.5 단위 O-글리코시다제 또는 양 효모로 제조자 지시에 (독일 베링거 만하임) 따른 이들 농도에서 배양되었다. 용해질을 10% 겔상 SDS-PAGE로 재용해한다. 단백을 니트로셀루로즈에 이송하고 재조합물 CHL1 단백 분획(도 18 참조) 에 대해 직접하는 CHL1 항혈청(1:500 희석)으로 배양하였다.
면역 침전
9 일 생 마이스( 조직 분획 참조)에서 뇌 조직 균등질(300 μl, 5MG/ml 단백 농도)의 세제분해질의 용해성 분을 1 %NP40 과 30 μl의 G-세파로스(파마시아/LKB)GKADB의 5 ml 완충액(20 mM 트리스-HCl (PH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA )중 5℃에서 1 야 L1 DP 대한 다클론 항체 또는 10 μl의 CHL1 으로 배양하였다.0.1 % NP4O,0.05% SDS를 함유하는 완충액, 다음 20 mM 트리스-HCl (PH 7.4)으로 속발적으로 세척후 세파로스 비즈를 5x 시료 완충액(250 mM 트리스-HCl (PH 6.6), 10 % SDS, 50% 글리세롤 , 0.5% 브로모페놀 불루, 25% B-메르캅토에탄올)내에서 10 분 비등시키고 상징을 10% 겔 상 SDS-PAGE 에 의하여 재용해한다. 단백을 니트로셀루로즈로 이송하고 웨스턴 블로 분석에 의하여 L1, CHL1 항혈청 또는 단클론 항체 412에 대한 다클론 항체로 검출된다.
간접 면역형광물
세포표면 염색을 위하여 (슈니제르와 샤크너 1981) CHL1-, 및 카버슬립상에 목크(백터 만)-전염 COS-1 세포를 플레이트한 것을 10% 배 송아지 혈청,10 mM 헤페스(PH 7.3) 및 0.02%NaN3를 함유하는 DMEM 중 1 차 항체( CHL1 항혈청(1: 100 희석) 또는 L1 다클론 항체(1:200 희석)으로 다음 2 차 항체로 실온에서 30 분간 배양하였다. 면역염색 후 세포를 포스페이트 완충 염수(PH 7.3) 중 4% 파라포름알데히드으로 고정하고 2.5% 포타슘 요다이드를 함유하는 모비올(획스트)중에 장입하였다. 성세포와 올리고댄덴드로코사이트의 2 중 면역형광염색을 위하여 세포면 항원에 대한 1 차 항체의 배양을 전염 COS-1 세포에 대한 설명과 같이 수행한다. 이어서 인터셀룰러 항원에 대한 1 차 항체 호 세포의 배양을 수행후 -20℃에서 메탄올로 세포를 투과성으로 한다.
실시예 23
제 위치 교잡
동일 크기의 디그옥시게닌-표지 항감각 cRNA 탐침을 발생하기위하여 CHL1 과 L1의 대응하는 부분으로부터 노던 블로 분석과 같은 구성으로 시행하엿다. 감각 탑침은 반대 방향내 삽입으로 유사한 구성으로부터 발생한다. 모든 cRNA 탐침을 T7 RNA 폴리메라제를 사용하여 발생시키고 250 뉴클레오타이드의 평균 분획 길이를 얻기를 위하여 알카리성 처리를 이어 하였다. 제 위치 교잡은 바르치 등 1992; 도르리스등 1994)에 설명과 같이 수행하였다.
결과 와 토론
CHL1 cDNA 의 일치화
폴리클론 항체으로 세포 접착 분자 L1을 엔코드하는 cDNA를 위하여 λgt11 표출 도서관의 스크리닝을 클론 311 일치화 한 뇌-유도 면역정제한 L1에 대하여 올린다. 이것은 치토플라즈믹 부분을 포함하는 704 아미노산을 위한 2112 기초 쌍(bp)코딩의 개방 읽기 프레임과 L1( 립만과 페어선(1985)에 따른 34.1%) 에 대한 부분적 cDNA 동등질을 함유한다. 전 길이 cDNA 클론 분리를위해 이 클론의 DNA 분은 다른 CDNA 도서관을 검증하기위하여 사용된다 . 6 독립 클론이 분리되았다. 4.2 와 4.4 kb를 함유한 2 클론 은 L1 의 닿힌 균질의 전체 코드 지역을 구성한다. 4.4 kb 삽입을 함유하는 클론은 더 조사 되었다.
DNA와 아미노산 속발 및 구조적 양태
4.4 kb 삽입은 5' 비해독 영의 295 bp 역,3627 bp의 개방읽기 프레임과 518 bp의 (도18)의 3' 비해독 영역을 암호화 한다. 비록 그기에 그의 3'에서 올리고(A)는 그치고,잇고, 청이 속발의 정 공감각 폴리아데닐레이션 신호 상류는 빠져있다. AUG 출발 코돈(296 위치, 도 18)의 옆구리 속발은 해독(코작, 1987)의 개시를 위한최적 고감속발을 확인 할수 없다. 그러나, 이AUG 는 증거의 두 선을 기초로한 해독의 출발 코돈으로 취한다. 이것은 모든 3 읽기 프레림내 정지 코돈에 의하여 앞선 상류이며 잔사 24 또는 25 후에 예견되는 처소 부위으로 위치 신호 속발에 의하여 따르게 된다(본 헤이즈네(1986)의 알고리즘에 따라 각각 8.65 와 6.40의 스코어)(도 18) .
개방 읽기 프레임의 해독은 134.9kD의 게산된 분자 뭉치로 1209 아미노산의 단백으을 수득하고 일체의 막 글리코프로테인의 양태 특성을 억는다. 추정의 익스트라 셀룰러 영역은 N-글리코실화(도 18 과 19a)를 위한 18 위치적 부위와 60 위치적 O-글리코실화 공감 부위(안보임)(피사노 등 1993)로 1081 아미노산으로 조성되며 카이트 와 두우리틀(1982)(도 19c)에 따르는 하이드로퍼시 분석에 의하여 판단되는 것과 같이, 23 아미노 산 의 전이 믹에 의하여 다룬다. 이 영역은 극성 잔기에 의하여 그 N-말단에서 옆구리에 위치하며 염기성 아미노산에 의해 그 C-말단에서 정지 이전 신호로 유지된다.(도 18). 내세포성 영역은 105 아미노산 잔기로 구성된다.
외세포성 영역은 L1 가족의 특성이 있는 반복되는 영역의 2 구조적 내인을 포함하며: Ig 유사 영역에 대한 동등질로 685 아미노산 스트레치와 FN 유사 반복(도 1 및 2a)에 동 등의 472 아미노산 스트렛치가 있다. 모든 6 Ig 유사 영역은 각각 (도19)에서 분리되는 47-54 아미노산에 위치하는 특성적 시스테인 잔기 쌍을 갖는다. 각 영역(DXGXYXCXAXN)에 제 2 시스테인 잔기주위 보존된 아미노산의 C2-형 클러스터와 접합하는베타 스트렌드 B의 단부에 보존서의 프로린(제 6 Ig 유사 영역 제외 )
는 C2-트(위리암 앤 바아클레이 1988)에 Ig 유사 영역을 양도한다. Ig 유사 영역과 막 스펜닝 영역 사이에는 섬유소낵틴내(코른브리트 등 1985) FN 유사 반복으로 동등질인 4 영역이 있다. 약 100 아미노산의 이들 각 영역들은 각각 N- 및 C- 단AKF 영역에 높게 보존된 트립토판(제1 FN 유사반복을 제외) 과 티로신/페닐알라닌 잔기를 함유한다. 이 제 5 FN 유사 반복은 흥미롭게도 L1 가족의 다른일원으로 대비하여 다만 하나의 루디멘터리 1/2 FN 유사 반복(도 18)이 있다. 이 반의 FN 유사 반복은 몇가지 교호적으로 저며진 형태의 하나를 나타내며 전체 FN 유사 반복을 갖는 하나는 노오던 블로 분석법이 아닌 다른법으로 나머지를 측정하였다. 이 관점에서 주의할 것은 6 독립적으로 분리된 클론(안 보임)의 제한적 분석에 의하여 교호적으로 스프라이스한것에 대한 증거는 없다는 것을 주의 한다. 교호적으로 겹쳐 잇는 제 5 FN 유사 영역은 Nr-CAM/BRAVO에 대해관찰되고 여기에서 cDNA 이성형은 제 5 FN 유사 반복(그루멧 등, 1991; 카이옘 등 1992)부족을 분리한다. 병아리 뉴러페이신내 제 5 FN 유사영역(볼크머 등 1992)의 부존재는 아마 가장 또한 교호적 겹쳐 잇는거 때문이며, 그의 레트 동질 때문에 엔키린-결합 글리코프로테인(ABGP)
(데이비스 등 1993)은 제 5 FN 유사 영역을 함유한다. 따라서 CHL1은 L1 가족에 새로운 구조적 양태를 가하며: 다만 4와 1/2 FN 유사 반복을 표출한다.(도 19).
CHL1의 다른 구조적 모양은 제2 Ig- 유사 영역에(도 18) RGD 속발(아미노산 185-187)의 존재이다. 이 트리펩티드은 원래 피브로넥틴의 10 째 형 III 영역(피에르슈바쳐와 루소라티 1984)내의 세포 부착위치 로서 일치하고 인테그린 결합( 피에르슈바쳐와 루소라티 1987 을 참조) 으로 역활한다. 이 3 차적 구조의 FN 유사 반복의 분석은 RGD 모티프가 베타 스트렌드 F와 G(메인 등 1992) 사이에 국한된다. 또한 이모티프는 다른 L1 가족의 원에도 발견된다. 병아리 Ng-CAM(버군 등 1991) 의 제3 FN-유사 반복 내 및 병아리뉴러파친 동종과 레트 ABGP,RGD 속발은 β 섬유소 F와 G 사이 동일 위치에서 발견되고 또한 RGD 모티프는 L1(L1 마우스와 레트 (NILE)내에 2, 및 인간L1(무우스 등 1988; 흘라빈과 램만 1991; 프린스등 1991)내 1가 발견되었다. 모든 L1 RGD 속발은 제 6 Ig 유사 영역에 발견되나 피브로넥틴의 FN 유사 모듈내 RGDs 보다 다른 아미노산 환경에서 발현된다. 이들 단백내의 RGD 속발인가는 기능적으로 활성인것으로 현재로는 알수 없다. 이에 관련해 TAG-1(펄리 등 1990), B' 인테그린과 L1(펠센펠드 등 1994) 상에 의존히는 제2의 FN 유사 영역내 RGD 모티프를 함유하는 F3/F11 가족의 일원(브레멘도르프와 라트젬 1993, 1994) 에 의하여 유도되는것은 주목할만하다. 이 관찰은 TAG-1 과 β1 인테그린의 제2 FN 유사 반복 사이에 직접 물리적 작용의 가능성을 높인다.
CHL1 은 또한 DGEA 속발(아미노산 555-558)을 제 6 Ig 유사 영역(도 18)의 β 섬유 C 내에 함유한다.
이 속발은 다른L1 가족의원에는 발견되지 않는다. DGEA 속발은 또한 그 모티프를 함유하는( 스탓즈 등 1991) I 형 콜라겐의 인지 인테그린 α2β1 내에 내삽된다.
Ig 초가족의 다른 인지 분자와 CHL1의 구조적 유사성
해독 EMBL 유전자 속발 데타베이스와 CHL1 의 아미노산 속발의 비교는 CHL1 이 109 아미노산 긴 늘림에 87.2% 동일하고 이미 확인한 인간 뇌(소통 번호 HS2431 과 HSXT02610( 아담스등 1992, 1993))내에 이미 도일한 93 아미노산 긴 늘림에 동일한 79.6%이다. 따라서 인간에는 높게 조존되는 CHL1 분자 가 있는 것으로 나타난다. 해독된 EMBL 유전자 속발 데타베이스로부터 취한 마우스, 인간, 및 레트 L1/NILE, 칙큰 Ng-CAM,병아리 Nr-CAM, 지브라피시 L1.1(통기오르기 등 1995), 병아리 뉴로파스친/레트 뮤헤,드로소필라 뉴로글리안9(비에베르 등 1989),마우스 F3/병아리 F1/인간추수1(게나리니 등,1989; 란슈트 1988; 브레멘도르프 등 1989; 베르군드와 란스슈트 1994), 레트 BIG-1/마우스PANG(요시하라등1994; 콘넬리 등, 1994) 등의 속발을 CHL1과 비교하였다. 아래에 표 1에 그 비교를 차린다.
CHL1 과 다른 L1 관련분자의 과소세포 부의 속발 유사성의 비교
CHL1(m) L1(m) ngCAM(c) NrCAM(c) neurofascin(c)
L1(m) 37
NgCAM(c) 39 37
NrCAM(c) 33 43 35
neurofascin(c) 36 36 47 33
L1.1(zf) 28 28 30 26 30
neuroglian(d) 33 36 36 34 34
F3 (m) 27 28 27 26 27
TAG-1(r) 27 27 26 25 25
BIG-1(r) 27 29 27 27 25
DCC(h) 14 14 14 15 14
Ax1(m) 11 12 11 12 12
HLAR(h) 15 15 13 14 13
NCAM(m) 16 15 17 16 15
L1.1(z) neuroglian(d) F3(m) TAG -1 BIG-1(r)
L1(m)
NgCAM(c)
NrCAM(c)
neurofascin(c)
L1.1(zf)
neuroglian(d) 28
F3 (m) 26 24
TAG-1(r) 25 24 51
BIG-1(r) 27 24 44 43
DCC(h) 16 14 16 15 15
Ax1(m) 11 11 13 12 11
HLAR(h) 14 11 13 14 14
NCAM(m) 16 15 15 15 15
L1 가족의 일원의 과 소세포 영역은 각각 비교되고 Ig 초 가족의 다른 뉴럴 세포유착 분자와 비교되었다. 값은 하인(1990)에 따른 정렬 후의 아미노산 동일서의 퍼센트로 나타내다. 종은 괄호에 나타내며: c=병아리, d= 드로소필라,h=인간,m=마우스,r= 레트,이며 zf= 지브러피쉬 임.
L1 관련분자의 내소세포 부분의 속발 유사성의 비교
CHL1(m) L1(m,r,h) NrCAM(m) NrCAM(c) NgCAM(c) ABGP(r)
L1(m,r,h) 57
NrCAM(m) 64 55
NrCAM(c) 62 56 99
NgCAM(c) 43 61 48 43
ABGP(r) 59 54 64 64 38
neurofascin(m) 62 56 64 65 43 100
neurofascin(c) 54 58 58 60 40 87
neuroglian(d) 39 34 41 40 34 40
L1.1 43 61 46 45 50 45
L1.2 36 54 39 28 37 37
DCC(h) 14 12 15 13 18 12
fasciclinⅢ(d) 21 17 20 18 19 16
MAG p72(r) 8 10 11 11 10 10
NCAM180(m) 7 7 7 7 13 5
Po(m) 11 6 12 13 6 15
neurofascin(m) neurofascin(c) neuroglian(d) L1.1(n°) L1.2(n°)
L1(m,r,h)
NrCAM(m)
NrCAM(c)
NgCAM(c)
ABGP(r)
neurofascin(m)
neurofascin(c) 86
neuroglian(d) 43 37
L1.1 48 47 36
L1.2 40 39 22 44
DCC(h) 13 12 11 12 9
fasciclinⅢ(d) 50 17 15 17 15
MAG p72(r) 10 11 11 10 8
NCAM180(m) 5 5 5 13 9
Po(m) 15 15 28 7 3
L1 가족(동종을 포함)의 일원의 내 소세포 영역은 각각 비교되고 Ig 초 가족의 다른 뉴럴 세포 유착 분자와 비교되었다. 값은 하인(1990)에 따른 정렬 후의 아미노산 동일서의 퍼센트로 나타내다. 종은 괄호에 나타내며: c=병아리, d= 드로소필라,h=인간,m=마우스,r= 레트,이며 zf= 지브러피쉬 임. 마우스,레트, 및 인간 L1은 동일하다. 마우스 NrCAM과 뉴로파친은 각각 91 과 86 아미노산 잔기의 부분 속발임.
L1 의 일원과 c2 영역을 함유하는 IG 초가족의다른 일원 사이의 구조적관련
CAMs Ig1 1-2 Ig2 2-3 Ig3 3-4
L1 56 44 51 55 48 42
CHL1 52 44 51 58 48 42
NgCAM 51 44 51 55 46 42
NrCAM 55 44 51 55 48
ABGP 55 44 51 55 48 42
L1.1 7 45 51 56 48 42
neuroglian 52 44 65° 48° 49 43
TAG-1 50 44 52 54 45 42
BIG-1 50 44 52 53 48 42
F3 49 44 53 52 47 42
Average 52 44 51 55 48 42
SD 2.5 0.3 0.7 1.7 1.2 0.3
DCC 56 44 51 49 49 42
HLAR 53 49 51 46 45
rse 53 43 43
NCAM 55 43 50 46 53 42
MAG 58 59 58 44 44 42
neuromusculin 55 45 63 48 54 47
fibronectin(Ⅲ)
CAMs Ig4 4-5 Ig5 5-6 Ig6
L1 50 44 49 42 52
CHL1 49 44 49 42 55
NgCAM 49 44 49 42 49
NrCAM 50 44 49 42 49
ABGP 50 44 49 42 49
L1.1 50 44 49 40 53
neuroglian 50 43 47 42 52
TAG-1 47 45 48 42 57
BIG-1 47 45 48 42 56
F3 39° 45 48 42 59
Average 49 44 49 42 53
SD 1.3 0.6 0.7 0.6 3.6
DCC 48
HLAR
rse
NCAM 56 41 53
MAG 45 40 56
neuromusculin 58 45 46 45 72
fibronectin(Ⅲ)
CAMs Ig6-FN1 FN1 FN1-FN2 FN2 FN2-FN3
L1 44 50 50 49 49
CHL1 41 7 7 49 49
NgCAM 40 50 50 57° 49
NrCAM 51° 50 50 50 49
ABGP 56° 50 50 50 49
L1.1 41 50 50 50 49
neuroglian 40 50 50 52 51
TAG-1 41 53 50 53 49
BIG-1 41 53 50 53 49
F3 41 53 50 53 49
Average 41 51 50 51 49
SD 1.2 1.4 0.0 1.7 0.6
DCC 49 50 46 49
HLAR 46 49 50 48
rse 49 48 49
NCAM 35 56 41
MAG
neuromusculin
fibronectin(Ⅲ) 45 42 46 48
CAMs FN3 FN3-FN4 FN4 siilarity index
L1 58 47 51 84％
CHL1 48 48 53 84％
NgCAM 77° 7 7 74％
NrCAM 58 48 52 95％
ABGP 58 48 51 95％
L1.1 62 47 52 74％
neuroglian 53 7 54 68％
TAG-1 51 48 7 74％
BIG-1 52 48 47 84％
F3 48° 48 47 63％
Average 56 48 51
SD 3.8 0.5 2.6
DCC 51 51 51 50％
HLAR 46 49 53 42％
rse 33％
NCAM 25％
MAG 11％
neuromusculin 13％
fibronectin(Ⅲ) 44 47 44 14％
표는 Ig-유사 영역(S-S 가교내 유발된 시스테인류:Ig1, Ig2,Ig3, Ig4,Ig5 및 Ig6), FN-유사 반복 (제 2 β-사상체의 트립토판 과 제 6 β-사상체의 티로신/페닐알라닌: FN1, FN2, FN 3, 와 FN6)중의 보존된 아미노산 사이 및 이들 영역 (1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 및 5-6; FN1-FN2,FN2-FN3, FN3-FN4)사이의 잔기의 수를 나타내다. 제 6 Ig-유사 영역의 제 2 시스테인과 제1 FN-유사 반복(Ig-6-FN1)의 제1 트립토판의 보존 아미노산 사이의 거리는 Ig-유사 영역과 FN-유사 반복 사이의 거리를 반영한다. L1 관련 분자에 대한 각개 거리의 평균 및 표준 편차(SD)를 나타낸다. DCC, HLAR, rse,NCAM, MAG, 뉴러무스큐린 및 피브로낵틴(III)은 대조군으로서 주어진다. 유사 표시는 정 여백에 주어진다. ? = 비 보존 아미노산, * = 평균과 SD 계산응 위해 사용안됨.
CHL1 은 병아리 Ng-CAM(표 1. 37% 아미노산은 외소세포 영역내에 동등) 및 마우스 Nr-CAM(표 2. 64% 아미노산은 외소세포 영역내에 동등) 에 가장 유사하다. 그러나, 특히 외소포 부분내 동일성의 도는 동종으로서 이들 단백을 고려하기에 충분하지않다. 최근, 마우스 Nr-CAM (모스코소 및 세네스 1995) 의 부분적 cDNA 클론을 확인하였다. 마우스 Nr-CAM 은 거의 치킨 NR-CAM(표2 참조)과 동일(99%)하다. 그러므로 CHL1 은 마우스내 동질 Nr-CAM 비슷하지않다. CHL1 은 L1, Nr-CAM, 뉴러파씬 (모스코소와 TPLSTM 1995) 및 CHL1, 인간( 아담스 등, 1992, 1993) 내 높게 보존되는 동종과함께 마우스내 L1 가족의 제 4 원이다.
병아리와 마우스 Nr-CAM 및 병아리와 마우스 뉴러파씬( 표 2, 각각 99%와 87%)의 내소포 속발의 유사성을 고려하는 것은 , 마우스 L1 과 병아리 Ng-CAM은 동종인 것은 매우 좋지 않으며 ,이는 내소포 영역(표 2)내 0.1% 속발 동일을 보인다.
더욱이, 잘 보존된 내소세포 영역으로 마우스에 L1 가족의 제5 원으로서 의 Ng-CAM 의 존재는 예견된다. 흥미롭게 Ng-CAM 병아리와의 이염색성 작용 상의 마우스 L1는 뉴라이트 외향성장을 증진(렘몬 등 1989)하며, L1 가족의 일원은 서로 작용할 것을 제시한다.
L1 가족 원들의 (표 1 과 표 3) 전체 구성의 유사성에 불구하고 가징 잘보존된 영역은 치토프라즈미 영역( 도 20)내에 확인할수 있다. 이 현저한 상동성은 내 소세포 영역을 함유하는 아주 동일하게 모든 종에 L1 가족의 일원에 대해 증거된다: 즉 L1, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, 뉴러파친,뉴러글리안, 및 지브러피쉬 L1.1과 또한 지브라피쉬 L1.2(통기오르기 등 1995)와 마우스 Nr-CAM 과 뉴러파씬(모스코소와 세인스 1995)(표 2)의 부분적 속발을 포함한다. 이 영역내의 두 신장, 하나는 플라즈마 막 스펜닝 획내의 부분적 으로 및 가까이 위치하고,다른 것은 C-단말( 도 20 내 I, III)는 거의동일하다. L1, Ng-CAM, Nr-CAM, 뉴러파친,L1.1 과 L1.2에 보존된 다른 아미노 산 신장은 그러나 CHL1 ( 표 2 ) 은 교호적 겹쳐짐에 의하여 원래로 하는 RSLE 모티프 ( 도 3 내 II)를 함유하지 않으며 뉴런( 그루메 등 1991; 미우라 등 1991; 폴커머 등 1992)내에만 표출된다. 내 소세포 영역은이들 단백 사이에 가장 크게 보존되므로 모든 L1 족의 일원은 축삭 연장을 활성화 하기 위하여 같은 신호 전도 경로를 사용할수 있다. ABGP, L1 ,Nr-CAM의 치토플라즈미 영역이 치토스케레탈 스카폴드(데이비스 등 1993, 데이비스와 벤네트 1994)에 대한 안키린 연결 세포 인지와의 작용을 나타낼수 있다.
실시예 24
L1 가족의 일원을 분류하는 외소세포내 구조적 요구의 확인
L1 족의 멤버십을 위한 일반적 한계를 연구하기위하여 , 우리는 Ig-유사 영역(S-S 가교에 관한 시스테인)과 Ig 초가족(표3)의 몇가지 원을 위한 FN -유사 반복(트립토판,티로신/페닐알라닌)내 높게 보존된 아미노산 위치를 조사하였다. 6 Ig 유사 영역과 적어도 4 Fn-유사반복 (L1 족과 GPI 연결 F3/F11서브그룹(브렘멘도르프와 라드젠 1993))을 갖는 분자는 매우 이러한 수의 이들 보존된 아미노산을 분리하는 아미노산을 나타낸다. 5 다른 거리 파라미터를 고려하였다:
1) 각 Ig 유사 영역( 표3, 칼럼 Ig1,Ig2,Ig4,Ig5와 Ig6 )의시스타인(S-S) 가교를 형성하는보존된 시시타인을 분리하는 아미노산의 수;
2) 두 인접 Ig 유사 영역( 표3, 칼럼 1-2,2-3,3-4,4-5,5-6)사이의 거리를 나타내는 하나의 Ig-유사 영역의 제 2 시스타인과 다음 Ig-유사 영역의 제 1 의 시스타인사이의 아미노산의 수;
3) Ig-유사 영역-모듈과 FN-유사 반복-모듈(표 3, 칼럼 IgG-FN1) 사이의 거리를 반영하는 제1 FN 유사 반복의 보존된 트립토판과 마지막 보존된 제6의 Ig 유사 영역의 시스타인 사이의 아미노산의수:
4)각 개체 FN 유사 반복(표 3, 카럼 FN1,FN2,FN3 및 FN4)의 보존된 트립토판, 티로신/페닐알라닌 사이의 아미노산의 수:
5) 2 인접 FN 유사 반복(표 3, 카럼 FN1-FN2,FN2-FN3, 및 FN3-FN4)사이의 거리를 반영하는 다음 FN-유사 반복의 트립토판 과 한 FN- 유사 반복의 티로신/페닐알라닌 사이의 아미노산의 수.
L1 유사 분자의 비교를 위한 높은 엄격한 조건을 얻기위해, 우리는 가장 아마도 교호적 겹침 때문에 , 평균 거리와 표준 편차(뉴러글리언: Ig2,2-3:Nr-CAM 과 ABGP : Ig6-FN1;F3: Ig4,FN3;Ng-CAM, FN2,FN3( 표 3, * 표시)의 계산을 위해, 평균으로부터 약간의 확실히 일탈하는 값을 생각하지않는다.반면에 제 1 과 제 6 Ig-유사 영역(Ig1; 표준편차(SD)=3; Ig6: SD=4)의 S-S 가교 사이의 아미노산의 수와 FN 유사반복 3 과 4 ( FN3;SD=4; FN4:SD=3)의 보존된 트립토판과 티로신/페닐알라닌사이의 아미노산의 수는 약하게 변동가능하며 다른 분자(FN1-FN2: SD=0; FN2와 2-3: SD=2(표3)에 대한 모든 다른 거리의 인자는 매우 주목하게 남는다. 이들 표준을 기초로하여 표3 에 목록한 평균값에 대해 몇가지 Ig 유사 분자의 유사성 지수(물질과 방법 참조)를 계산한다. L1,CHL1,Ng-CAM,Nr-CAM, ABGP,L1.1,TAG-1그리고 BIG-1에 대해 74 - 95% 의 유사성 지수를 얻었다.(표3).
드로소필라 신경교질에 대해 약간 더낮은 값이 얻어 졌으며(66%)아마도 이는 가장 척추동물과 곤충 사이의 진화적 거리를 반영하는 것이다. F3 와 그 동종은 보존을 잃었으며, 특히 그 Ig 유사 영역내 그러나 아직63%의 유사성을 나타낸다. 그러나,약간의 보존된 신장은 L1 족에 속하는 F3인것을 지지하는 제 3 FN 유사 반복의 나중 두 β 속 사이의 제 1 FN- 유사 반복(안보임)또는 NxxGxxGPxS의 단부에서
강하게 보존된 동선성(예를 들면, FxVxAxNxxG(8x)S(4x)TxxAxPxxxP )을 받친다.
흥미롭게는 인접 영역 사이(Ig-유사 영역 또는 FN-유사 반복) 사이의 아미노산의수는 훨씬 더 이들 분자 중에 보존되며 각 영역의 사이 거리를 지시하는것은 중요한 구조적 양태이며, 즉,신경 인지 분자( 표 3 , 카럼 1-2. 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2-FN3및 FN3-FN4)이다.
따라서 그 순서(동선성)과 간격잡기의 높은 보존성은 L1 족 일워의 외소세포 영역에 일반적으로 더 확인하기위해 사용할수 있다. 확인된 한계로 이들은 4 FN 유사 반복으로 따르는 N- 말단에 6 Ig 유사 영역의 모듈을포함한다.우리는 이구조적 양태를 L1 가족 카세트라 칭한다.
따라서 L1 가족의 모든 원은 L1 가족 카세트의 특성적 양태를 나눠갖고 추가적으로 높게 보존된 아미노산을 차지한다. 이들 결과는 이들 분자L1 가족 카세트를 함유하는 보통 모계의 L1-유사 분자으로부터 유도되는 것을 시사하며, 더 복잡한 신경계내에 작용하는 개산하는 세포를 위한 요구를 야기하는 그 기능적 위치적 유전자 복제를 통하여 전개된다. 일반적 L1 가족은 따라서 고전적 L1 가족 원으로 기초분배되고(L1, CHL1,Ng-CAM,Nr-CAM, 뉴러파신, 신경교질, L1.1) 이 는 변동가능한 제 5 FN -유사 반복, 전이 막 영역, 및 높게 보존되는 내소세포 , F3/F11 서브그룹(F3/F11/CNTN 1,BIG-1/PANG , TAG-1/Axonin-1/TAX-1), 영역 을 함유하며, RM 일반적 양태는 막에 대해 GPI에 의하여 연결되며 변동가능한 제 5 FN- 유사 반복은 아주 동일하지않다. 양 서브그룹의 외소세포 영역은 L1 족 카세트를 갖는다.
예를 들면 N-CAM은 (컨닝헴 등 1987, 바르탤스 등, 1987),MAG (아르킨트 등 1987; 라이 등 1987; 살조 등 1987), 뉴러머스큐린(칸라 등, 1993) 과 rse(마크 등 1994) 또는 피브로넥틴(코른블리트 등 1985) 등의 다른 Ig-슈퍼 가족원은 L1 가족(표3) 원에 대해 서로 더 적게 관계되는것을 나타내는 분병하게 확인되는 거리 인자를 나타내는 IG-유사 영역 및 FN-유사 반복을 갖는다. 흥미롭게 결장직장 암(피이론 등 1990)내에서 삭제된 종양억제 유전자 생성물(DCC)과 인간 류코사이트 일반 항원 과련 유전자(HLAR)(스트률 등 1988)은 거리 인자( 각각 42% 와 50% 유사성 지표) 에 따르는 L1 가족에 가깝게 관게된다. 보존 아미노산의 검사는 DCC 가 비록 제 5 와 제 6 Ig-유사 영역을 손실한것으로 보이나 피이론(1990)과 피어스올 등(1994)에 의하여 제시된 것과 같이 N-CAM에 보다 L1 가족에 더 가까이 관련되는것이 진실이다. 최근 연구는 DCC가 뇌에서 우세적으로 표출되고 쥐 PC12 세포 의 축삭 외성장은 그세포 표면(피어시알 등 1994) 상의 단백을 표출하는 DCC-RKADUA 섬유소의 기재상에 증진된다. 또한 비록 HLAR 은 L1 가족에 대한 그의 관계이 비교적 높은 유사성을 나타내나 분명하지않다.
실시예 25
CHL1 mRNA 와 단백의 조직 분포
CHL1 이 L1 가족의 다른 일원과의 신경 계에서 우세적 표출을 차지하는가를 조사하기 위하여 mRNA 와 단백 수준에서의 여러가지 조직내 CHL1의 표출을 분석하였다. 노오던 블로 분석에서 CHL1 리보탐침은 L1 탐침(약 6 kb)(탁키 등 1987)으로 검출된mRNA 크기 보다 매우더큰 약 8kbDML 우성 mRNA 밴드와 교잡된다. 더작고 약한 RNA 대 (도 21a, 레인 3)은 리보소멀 RNA 와 교잡 되기때문이다.
8kb RNA는 세레벨룸,뇌 마이너스 세레벨러 및 스파이날 코드에 서 검출되나 도어설 루트 강그리아(DRG)(도 21a)에는 없다. 대비로 L1 리보프로브는 DRG로 부터(도 21a)RNA 와 강한 신호를 나타낸다. 또 CHL1 mRNA 는 9 일생 레트 소세포와 6 일생 레트 스피날 코드에서 검출되나,NFG 와 및 없이 또는 COS-1세포(도 21b)내에는 없다. 모든 다른 분석된 조직에서 (흉선, 폐, 간, 장,비장 및 신)신호가 검출되지않았다.
CHL1 단백을 확인하기 위하여, CHL1 단백의 세균적으로 표출된 분획에 대한 항체를 발생시켰다. 다른 공지의 L1 가족 원에 대한 높은 동질의 제외 영역 예를들면, 전이막―펜닝 또는 내 소세포 영역, 제 6 Ig 유사 영역 및 4 FN 유사 반복(도 18과 19b)의 1.7 kD cDNA 분획을 나타내는 부분을 pET 표출 백터로 클론하였다.수득되는 단백분획의 표출은 음이온 교환 크로마토그라피에 의하여 정제된 SDS-PAGE 후 쿠마슬 불루 염색에 의하여 검색되는 70kD 벤드로 인도 되었다. 웨스턴 블로 분석( 도 22 a)와 ELISA(안보임)은 CHL1 단백 분획과 반응한 2 또끼로부터 항 혈청을 나타내나 정제된 L1, N-CAM,MAG로 정제되지않는다. CHL1 펩티드 또는 CHL1 분획의 분해 감급 생성물로 공정제된 세균성 단백과의 약간의 반응이 관찰되었다. (도 22 a 4레인).
항체의 특수성을 더 시험하기위하여 그리도 이들이 천연 세포 표면 표출된 CHL1을 인지하는가를 측정하기위하여 일시적으로 전염된 COS-1 세포 항체와 함께 시험한다. 면역치토화학은 CHL1 -전염된 세포상의 CHL1 의 세포 표면 표출을 나타내나 백터로 (도 23) 세포 의사전염된 것은아니다. 또한 이들 결과는 추정의 신호 속발이 기능적인 것과 개방 해독 프레임이 옳다는 것을 나타내고 있다.
비록 제1 CHL1 cDNA 클론은 뇌 유도되는 L1에 대해 면역친화성 순수화 폴리 클로널 항체로 검증에 의하여 표출 도서관으로부터 분리되며, CHL1-전이 세포와 L1의 재조합 표출된 Ig 유사 영역에 대해 L1 항체의 다른 준비의 반응은 과찰되지않았다(안보임). 또한 분자( 도 19)의 외소포 부분에 대해 유도된 CHL1 항체 는 L1-전이되는 세포(안보임)와 반응하지 않는다. 그러므로 마찬가지로 표출 도서관을 검사하기위해 사용하는 L1 다클론 항체는 C 말단과 반응성이며 CHL1 과 L1 사이의 가장 동등성인 CHL1 의 내소포 부분과 반응성이었다.
CHL1 항혈청은 몇가지 조직( 9일생 마이스의 뇌, 간, 폐, 신,창자. 도 23b)의 면역 반응성 단백을 확인하기위해 사용되었다. 0.5% 트리톤 X-100내의 가용성 및 불용성 조 막 분획을 웨스턴 블로에 의해 분석하였다. L1 에 대한 다클론 항체를 대조군으로 사용한다. CHL1 항체는 뇌 막의 불용성 및 가용성분획의 185,165, 및 125kD의 3 독특한 벤드로 인식된다. 185kD 벤드만이 가용성 분획에 약하게 검출될뿐이며 125kD 벤드는 불용성 분획내(도 23b, 1 과 2 레인) 덜 현저하며, 아마도 185 kD 벤드 는 CHL1 의 막 반향 형으로 나타나며 반면에 아마도 125와 165 kD 형은 단백가수분해적으로 분열된 분획이다. 면역 반응서 벤드의 유사 형은 CHL1 전염 COS 세포와 전뇌조직(아니보임)의 웨스턴블로 분석 후에 관찰되었다. 유사한 페턴의 벤드는 L1(파이스너 등 1985; 세도울 등 1988), Ng-CAM(구루메 등 1984), 및 Nr-CAM(케이앰 등 1992)에 대해 관찰된다. 제 3 FN- 유사 영역의 (L1;SKR; Ng-CAM,;SRR;Nr-CAM; SRR:Nr-CAM:SRRSKR)내의 단백가수분해 분열을 위한 2염기의 교감 속발은CHL1에 존재하지않는다. 마찬가지로 다른 L1 가족의 원,CHL1은 다만 발전의 후의 단계에서 표출되는 것으로 표출된다. 이것은 웨스턴 블로 분석(안보임)에 의하여 뇌에서 태생 15 일전에 검출할스없다. 50 kD 면역 반응성 벤드는 전 간 조직의 세제 가용성 분획내에서 검출된다. 이 벤드는 가장 아마도 CHL1-특정 mRNA가 간에서 노오던 블로 분석(도 22 a)에 의해 나타나지않으므로 CHL1-관련 단백과의 CHL1 항체의 약간의 교차 반응성이 있기 때문이다. CHL1 면역반응성은 시험한 다른조직(도 23b)에는 검출되지않았다. CNS 내에서 L1 족의 원은 뉴런에 의하여 우세적으로 표출되었다. 그러므로 우리는 만일 CHL1이 L1과 이 페턴의 표출을 차지하는가 이었다. 원위치에 교잡 실험을 젊은 출생후의 마이스의 망막,시신경, 및 소뇌 피질내의 세포 합성 CHL1과 L1을 확인하기 위해 수행하였다. 7일생 마이스의 망막내에서 L1(도 24a),과 CHL1 mRNA(도 24b)는 신경절 세포에 의하여 표출되었다. L1 복사는 내 핵 층(도 24a)내에 위치하는 아마크라인 과 수평 세포에서 추가로 검출할수 있다. CHL1 mRNA 는 대비로 내핵층(도 24b)의 내부(즉 vitread) 끝에 위치하는 약간의 세포내에서만 경우에 따라 검출할수 있다. 시신경의 신경교세포는 L1 전사(도 24a)의 검출가능한 수준을 함유하지 못한다. 큰 대비로 CHL1 mRNA는 시신경(도 24b)의 근접(즉 망막 근처)에 위치하는 신경교 세포에 의하여 강하게 표출되고, CHL1 표출의 낮은 수준은 신경(도 24b)의 더 말단 영역에 위치하는 신경교 세포에 보일수 있었다.
2 주 생 마이스의 소뇌피질에, L1 mRNA는 내부 과립 층( 도 24b)내에 위치하는 입상 세포와 골기내 및 분자 층애에 위치하는 성상 및 바스켓 세포내에 검출할수 있다. 같은 세포 형은 분자 층의 (도 24d와 e 비교)내부에 위치하는 세포에 어렵게 검출할수 있는 CHL1 복사 이것을 제외하고 CHL1 항감각 cRNA 탐침(도 24e)과 교잡한 경우 섹션을 표지하였다. 음의 대조군으로서 섹션을 대응하는 감각 cRNA 탐침괴 교잡하였으며 세포의 표지는 검출되지않는다. (도 24c 참조,CHL1 감각cRNA 탐침으로 망막 및 시신경 교잡). 시험관 내, 기랄 세포가 CHL1 표출을 하는지를 어드레스 하기위해, 정제된 성상 세포 또는 올리고댄드로시트를 출생후의 마이스 또는 레트의 전뇌로부터 준비하였다. 전염된 COS-1 세포의 세포표면에서 특별히 검출한 CHL1인 동일한 다클로널 CHL1 항체를 사용한다. 성세포와 올리고덴드로시트를 각각 O1 항원에대한 항체로 또는 GFAP에 대한 항체로 확인하였다. 성세포 배양물은 다클론 CHL1(도 25a,d)와 단클론널 GFAP(도 25b,e) 항체에 의해 2중 표지되는 약간의 세포를 함유한다. 그러나, 올리고덴드로시트 배양의 분석은 CHL1 과 O1 항원의 공 위치화를 나타내지않으며,인 비트로 성숙한 올리고덴드로시트는 CHL1 의 검출가능한 수준을 표출하지않는 것을 확인하는 것이다. 조합된 관찰은 CHL1과 L1이 겹치는 것을 나타내나 또한 분명한 표출의 페턴을 지시한다. 가장 강하게 CHL1, 그러나 L1 이 아니며,인비보 신경계의 어던 성세포에 의해 표출되는 것은 L1 가족의 다른일원이 다른 기능을 수행하는 것을 제시하는 것이다.
CHL1 글리코단백에 의한 HNK-1 카보하이드레이트의 검출 및 글리코실화의 분석
CHL1(185 kD)의 관측된 분자량은 계산된 분자질량(134.9kD) 보다 더 상당히 크기 때문에 분자량에 대한 카보하이드레이트 기여와 카보하이드레이트 수정의 형을 분석하였다. 7일생 마이스의 조 뇌막으로부터 세제 용해성 및 불용성 분획을 효모적 디글리코실화를 제시하였다. 모든 CHL1 면역반응성 단백의 분자량을 N-글리코시 다제 F-(PNGasoF)처리 분자량을 감소하였다: 185 kD 벤드는 150kD로 변환하고, 165kD 벤드가 135 kD로, 125kD가 110 kD로 변환된다. O-글리코시다제와의 처리,효모로 알려진 부열 세린/트레오닌 결합 갈락토실 베타(1-3)N-아세틸갈락토사미닐 디삭카리드(글라스고우 등, 1977)는 약하게 증가된 운동성을 얻는다: 이 185와 165 kD 벤드는 약 180 과 160 kD로 각각 변환하며 반면에 125 kD 벤드는 변화하지않는다. 이러한 관찰은 대부분의 카보하이드레이트 분자 량이 N-결합 카보하이드레이트 때문이다. 모든 효소와의 처리는 함께(도 26)185에서 145kD로 개별 효소와의 처리와 함께보이는것보다더큰 변환으로 인도하며, 모든글리코실화 부위를 제시하지않은며 아마도 가장 O-글리코실화 부위는 모든 글리코시다제 만에 의하여 소거된다. 이 결과는 CHL1 이 N-글리코시달 결합된 탄수화물으로서 그 부자질량의 약 30%를 갖는 것을 나타낸다.
몇가지 신경 세포 유착 분자는 L1(크루스 등 1984),TAG -1,(EHEM 1988),Nr-CAM(그룸트 1991),F3(게나리니 1989),N-CAM(크루스 등 1984),미엘린 연합 글리코단백 MAG(맥그레이 등 1983; 크루스 등 1984;) 및 Po(볼렌손 과 샤치너 1987)과 같은 HNK-1 탄수화물을 이송한다. 그러므로 우리는 CHL1이 HNK-1 탄수화물을 옮기는 가를 분석한다. CHL1 은 CHL1 항체로 9 일 생 마이스로부터 전체뇌 조직의 세제결찰으로부터 면역침전시켰다. 대조로 L1 은 동일한 뇌 추출물으로부터 다클론 항체으로 유사하게 면역 침전된다. HNK-1 탄수화물 에피토프에 대한 유도된 단클론 항체 412와 웨스턴 블로 분석은 CHL1(도 27) 또는 L1(안보임)을 위하여 예견되는 분자질량에서 단클론 항체 412에 의하여 인식되는 벤드를 함유하는 모든 면역침전물을 나타낸다. HNK-1 탄수화물은 세포 대 세포 유착 및 라미닌(카일하우어 등 1985; 키네문트 등 1988; 호올 등 1993,1995)CHL1, L1 가족의 다른 일원과 같이 결합에 유발하므로 HNK-1 탄수화물을 경유하여 라미닌과 상호작용한다.
결 론
상기 실험은 신경조직의 인식 분자의 L1 가족의 다른 일원으로서 인간,레트, 마우스, 병아리, 지브라피쉬, 및 드로스필라와 같은 이러한 역종에 발혀진 가해진 CHL1을 가지며, 이리하여 뉴런 및 뉴런의 서브세트에 의하여 악소게네시스의 발현으로 형상에 늦게 표출되는 모든것의 계통발생적으로 보존되는 분자의 가족으로 구성된다. 많은 L1 관련 분자가 구조적으로 유사를 위하여 자연의 필요에 존재하는 점이 존재하나 기능적으로 대부분 마차가지로 분명하게 축삭 외성장 증진 분자이며 분자의 그룹으로서 L1 가족의 평가에 대한 것으로 양호한 튜닝의 축삭 경로발견을 측정할수 있다.
다음은 실시예 18-25에 관련된 자료의 목록이다.
Adams, M.D., Dubnick, M., Kerlavage, A.R., Moreno, R., Kelly, J.M., Utterback, T.R., Nagle, J.W., fields, C. and Venter, J.C. (1992) Nature. 355 : 632-634.
Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C. and Venter, J.C. (1993) Nature Genet 4 : 258-267.
Appel, F., Holm, J., Conscience, J.F. and Schachner, M. (1993) J.Neurosci. 13 : 4764-4775.
Appel, F., Holm, J., Conscience, J.-F., von Bohlen und Halbach, F., Faissner, A., James, P. and Schachner, M. (1995) J. Neurobiol. 28 : 297-312.
Arquint, M., Roder. J., Chia, L.-S, Down, J., Wilkinson, D., Bayley, H., Braun, P. and Dunn, R. (1987) Proc. Natl, Acad. Sci. (USA) 84 : 600-604.
Baron, M., Main, A.L., Driscoll, P.C., Mardon, H.J., Boyd, J. and Campbell, I.D. (1992) Biovhem. 31 : 2068-2073.
Bartheis, D., Santoni, M.-J., Wille, W., Ruppert, C., Chaix, J.-C., Hirsch, M.-R., Fontecilla-Champs, J.C. and Goridis, C. (1987) EMBO J. 6 : 907-914.
Bartsch, S., Bartsch, U., Dorries, U., Faissner, A., Weller, A., Ekblom, P., and Schachner, M. (1992) J. Neurosci. 12 : 736-749.
Berglund, E.O. and Ranscht, B. (1994) Genomics 21 : 571-582.
Bieber, A.J., Snow, P.M., Hortsch, M., Patel, N.H., Jacobs, J.R., Traquina, Z.R., Schilling, J. and Goodman, C.S. (1989) Cell 59 : 447-460.
Bixby, J.L., Lilien, J. and Reichardt, L.F. (1988) J. Cell Biol. 107 : 353-362.
Bollenson, E. and Schachner, M. (1987) Newrosci, Lett. 82: 77-82.
Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem 72: 248-254.
Brummendorf, T., Wolff, J.M., Frank, R. and Rathjen, F.G. (1989) Neuron 2:1351-1361.
Brummendorf, T. and Rathjen, F.G. (1993) J. Neurochem. 61 : 1207-1219.
Brummendorf, T. and Rathjen, F.G. (1994) In Sheterlin, P., ed. Protein Profile, Academic Press, London, 951-1058.
Surgoon, M.P., Grumet, M., Mauro, V., Edelman, G.M. and Cunningham, B.A. (1991) J.Cell Biol, 112 : 1017-1029.
Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162: 158-159.
Connelly, M.A., Grady, R.C., Mushinski, J.F. and Marcu, K.B. (1994) Proc. Natl, Acad. Sci. (USA) 91 : 1337-1341.
Cunningham, B.A. Hemperley, J.J., Murray, B.A., Prediger, E.A., Brackenbury, R. and Edelman, G.M. (1987) Science 236 : 799-806.
Davis, J.Q., McLaughlin, T. and Bennett, V. (1993) J. Cell Biol. 121 : 121-133.
Davis, J. and Bennett, V. (1994) J. Biol. Chem. 269 : 27163-27166.
Dodd, J., Morton, S., Karagogeos, D., Yamamoto, M. and Jessell, T. (1988). Neuron 1:105-116
Dorries, U., Bartsch, U., Nolte, C., Roth, J. and Schachner, M. (1993) Histochem. 99:251-262.
Edelman, G.M. (1970) Biochem. 9:3197-3205.
Edelman, G.M. (1988) Biochem. 27:3533-3543.
Erickson, H.P. (1993) Curr. Opin. Cell Bio., 5:869-876.
Faissner, A., Teplow, D.B., Kubler, D., Keilhauer, G., Kinzel, V. and Schachner, M. (1985) EMBO J. 4:3105-3133.
Fearon, E.R., Cho, K.R., Nigro, J.M., Kern, S.E., Simons, J.W., Ruppert, J.M., Hamilton, S.R., Preisinger, A.C., Thomas, G., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. (1990). Scinece 247:49056.
Feisenfeld, D.P., Hynes, M.A., Skolor, K.M., Furley, A.J. and Jessel, T.M. (1994). Neuron 12:675-690.
Frei, T., von Bohlen und Halbach, F., Wille, W. and Schachner, M. (1992). J. Cell Biol. 118:177-194.
Furley, A.J., Morton, S.B., Manalo, D., Karagogeos, D., Dodd, J. and Jessell, T.M. (1990) Cell 61:157-170.
Gennarini, G., Cibelli, G., Rougon, G., Mattei, M.G. and Goridis, C. (1989). J.Cell Biol. 109:775-788.
Gennarini, G., Durbec, P., Bonad, A., Rougon, G. and Gordis, C. (1991). Neuron 6:595-606.
Glasgow, L.R., Paulson, J.C. and Hill, R.L. (1977). J. Biol, Chem. 252:8615-8623.
Grumet, M., Hoffman, S., Chuong, C.M. and Edelamn, G.M. (1984). Proc. Natl, Acad. Sci. USA 81:7989-7993.
Grumet, M., Mauro, V., Burgoon, M.P., Edelamdn, G.M. and Cunningham, B.A. (1991). J.Cell Bio. 113:1399-1412.
Guenard, V., Gwynn, L. and Wood, P. (1994). J. Neurosci. 14:2980-2992.
Hall, H., Liu, L., Schachner, M. and Schmitz, B. (1993). Eur. J. Neurosci. 5:34-42.
Hall, H., Vorherr. T. and Schachner, M. (1995). Glycobiology 5:435-441.
Hasler, T.H., Rader, C., Stoeckli, E.T., Zuellig, R.A. and Sonderegger, P. (1993). Eur. J. Biochem. 211:329-339.
Hein, J. (1990). Meth. Enzymol. 183:628-645.
Heijne von, G. (1986). Nucl. Acids Res. 14:4683-4690.
Hlavin, M.L. and Lemmon, V. (1991). Genomics 11:416-423.
Holm, J., Appel, F. and Schachner, M. (1995). J.Neurosci. Res. 42:9-20.
Hubbard, S.C. and Ivatt, R.J. (1981). Annu. Rev. Biochem. 50:555-583.
Husmann, K., Faissner, A. and Schachner, M. (1992). J.Cell Bio. 116:1475-1486.
Hynes, R.O. (1992). Cell 68:11-25.
Kanla, G.S., Han, P.L., Kim, Y.T., and Bellen, H. (1993). Neuron. 11:673-687.
Kayyam, J.F., Roman, J.M., de la Rosa, E.J. Schwarz, U. and Dreyer, W.J. (1992). J.Cell Bio. 118:1259-1270.
Keilhauer, G., Faissner, A., and Schachner, M. (1986). Nature 316:728-730.
Kluxen, F.W., Bruns, C. and Lubbert, H. (1992). Proc. Natl. Acad. Soc. (USA), 89:4618-4022.
Kluxen, F.W. and Lubbert, H. (1993). Anal. Biochem. 208:352-356.
Kornblihtt. A.R., Umezawa, K. Vibe-Pedersen, K. and Baralle, F.E. (1985). EMBO J. 4:1755-1759.
Kozak, M. (1987). J.Mol, Bio. 196:947-950.
Kruse, J., Mailhammer, R., Wernecke, H., Falssner, A., Sommer, I., Goridis, C. and Schachner, M. (1984). Nature 311:153-155.
Kunemund, V., Jungawala, F.B., Fischer, G. Chou. D.K. H., Keilhauer, G. and Schachner, M. (1988). J. Cell Biol. 106:213-223.
Kyte, J. and Doolittle, R.F. (1982). J.Mol. Bio. 157:105-132.
Laemmil, U.K. (1970). Nature 227:680-685.
Laeng. P., Decimo, D., Pettmann, B. Janet. T. and Labourdette. G. (1994). J.Neurosci. Res. 39:613-633.
Lai, C., Brow, M. A., Nave. K. A. Noronha. A. B., Quarles, R.H., Bloom, F.E., Milner, R. J. and Sutcliffe, J.G. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 84:4337-4341.
Leahy, D. J., Hendrickson, W. A., Aukil, I. and Erickson, H.P. (1992). Science 258:987-991.
Lemmon, V., Farr, K.L. and Lagenaur. C. (1989). Neuron. 2:1597-1603.
Lipman, D.J. and Pearson, W.R. (1985). Science 227:1435-1441.
Main, A.L., Harvey, T.S., Baron, M., Boyd, J. and Campbell, I.D. (1992). Cell 71:671-678.
Mark, M.R., Scadden, D.T., Wan, Z., Gu. O. Goddard, A, and Godowski, P.J. (1994). J.Biol. Chem. 269:10720-10728.
Martini, R. and Schachner, M. (1986). J.Cell Biol. 103:2439-2448.
McCarthy, K.D. and De Vellis J. (1980). J. Cell Biol. B5:890-902.
McGarry, R. C., Helfand, S. L., Quarles, R. H. and Roder, J. C. (1983). Nature 306:376-378.
Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M, A., Maniatis, T., Zinn, K. and Green, M. R. (1984). Nucl. Acids Res. 12:70365-7056.
Miura, M. Kobayasahi, M., Asou, H. and Uyemura, K. (1991). FEBS Lett. 289:91-95.
Moos, M., Tacke, R. Scherer, H., Teplow, D., Fruh, K. and Schachnor, M, (1988). Nature 334:701-703.
Moscoso, L. M. and Sanes, J. R. (1995). J. Comp. Neurol. 352:321-334.
Pesheva, P., Gennarini, G., Goridis, C. and Schachner, M. (1993). Neuron 10:69-82.
Pierceall, W. E., Cho, K.R., Getzenberg, R. H., Roale, M. A., Hedrick, L, Vogelstein, B. and Fearon. E.R. (1994). J. Cell Biol, 124:1017-1027.
Pierschbacher, M. D. and Ruosiahti, E. 91984). Nature 309:30-33.
Pisano, A., Redmond, J.W., Williams, K.L. and Gooley, A. A. (1993). Glycobiol. 3:429-435.
Poltorak, M., Sadoul, R. Kelhauer, G., Landa, C., Faharing, T. and Schachner, M. (1987). J. Cell Biol. 105:1893-1899.
Prince, J. T., Alberti, L., Healy, P. A., Nauman, S. J. and Stallcup. W.B. (1991). J. Neurosci. Res. 30:567-581.
Pulido, D, Campuzano, S., Kida, T., Modolell, J. and Barbacid, M. (1992). EMBO J. 111:391-404.
Ranscht, B. (1988). J. Cell Biol, 107:1561-1573.
Rathjen. F.G. and Schachner, M. (1984). EMBO J. 3:1-10.
Rathjen, F.G. and Jessell, T.M. (1991). Semin. Neurosci. 3:297-307.
Ruoslahtl, E. and Pierschbacher, M.D. (1987). Science 238:491-497.
Ruoslahtl, E. (1988). Biochem. 57:375-413.
Rutlshauser, U. (1993). Curr. Opin. Neurobiol. 3:709-715.
Sadoul, K., Sadoul, R., Faissner, A. and Schachner, M. (1988). J. Neurochem. 50:510-521.
Salzer, J.L. Holmes, W.P. and Colman, D.R. (1987). J. Cell Biol. 104:957-965.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). NY.
Sanger, F.S., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977). Proc. Natl, Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467.
Schachner, M. (1991). In Letourneau, P.C., Kater, S.B. and Macagno, E.R., ed. The Nerve Growth Cone. Raven Press, NY, 237-254.
Schachner, M. (1994). Curr. Opin. Neurobiol. 4:726-734.
Schnitzer, J. and Schachner, M. (1981). Neuroimmunol. 1:429-456.
Seilheimer, B. and Schachner, M. (1988). J. Cell Biol. 107:341-351.
Sommer, I. and Schachner, M. (1981). Dev. Biol. 83:311-327.
Southern, E.M. (1975). J. Mol. Biol. 98:503.
Staatz, W.D., Fok, K.F., Zutter, M.M., Adams, S.P., Rodriguez, B.A. and Santoro, S.A. (1991). J. Biol. Chem. 266:7363-7367.
Streuli, M., Krueger, N.X., Hall, L.R., Schlossman, S.F. and Saito, H. (1988). J. Exp. Med. 168:1523-1530.
Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986). J. Mol, Biol. 189:113-130.
Tacke, R., Moos, M., Teplow, D.B., Fruh, K., Schere, H., Bach, A. and Schachner, M. (1987). Neurosci. Lett. 82:89-94.
Taketchi, M. (1991). Science. 251:449-455.
Tannahill, L., Klein, R. and Schachner, M. (1995). Eur. J. Neurosci. 6:1424-1428.
Taylor, J., Pesheva, P. and Schachner, M. (1993). J. Neurosci. Res. 35:347-362.
Tongiorgi, E., Bernardt, R.R. and Schachner, M. (1995). J. Neurosci. Res. 42:547-561.
Talotra, P.C., Karagogeos, D., Theodorakis, K., Michaelidis, T.M., Modi, W.S., Furley, A.J., Jessell, T.M. and Papamatheakis, J. (1993). Genomics 18:562-567.
Volkmer, H., Hassel, B., Wolff, J.M., Frank, R. and Rathjen, F.G. (1992). J. Cell Biol. 118:149-161.
Williams, A.F. and Barclay, A.N. (1988). Ann. Rev. Immunol. 6:381-405.
Yoshihara, Y., Kawasaki, M. Tani, A., Tamada, A., Nagata, S., Kagamiyama, H. and Mori, K. (1994). Neuron 13: 415-426.

Claims (41)

  1. 포유류에 신경 성장 증진 량의 약제를 투여하며, 상기 약제는 신경 세포유착 분자를 함유하며, 상기 분자는 글리아 세포상에 발현되는 억제 분자 큐를 다스리며 미엘린 및 상기 신경 성장을 증진하는 그의 활성 분획, 그의 인식자, 그의 협동근, 그들의 외태제, 그들의 길항제, 그의 항체, 그들의 동근, 그의 분비 세포, 및 그들의 가용성 분자인 포유류의 중추신경계에 생체내 신경 성장을 증진하는 방법
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 약제는 Ca2+ 독립 신경세포 유착을 조절하는 면역글로부린 초 가족의 일워으로부터 유도되는 것인 방법
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 약제는 섬유소넥틴 형 III 균질 반복 1-2 및 면역글로부린 형 영역에 유사한 구조적 모티프인 분자로부터 인도되는 것인 방법
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 구조적 모티프는구조적으로 섬유소 넥틴 형 III 균등 반복 1-2 및 면역 글로부린 유사 영역 I-II,III-IV, 및 V-VI에 유사한 것인 방법
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 약제는 L1,N-CAM 및 미엘린-연관 글리코단백으로 구성되는 그룹에서 선택되는 방법
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 약제는 라미닌, 피브로넥틴,N-카데린,BSP-2(마우스 N-CAM),D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM,NILE,Nr-CAM, TAG-1(axonin-1),Ng-CAM 및 F3/F11으로 구성되는 그룹에서 선택되는 방법
  7. 제 1-6항의 어느항에서,
    시제 또는 활성 분획, 인식자, 협동근,외태제, 또는 그의 동근,표출 조절 속발과 연관되는 방법에 사용하기 위한 재조합 DNA 분자
  8. 제 7항에 있어서,
    재조합 DNA 분자를 구성하는 벡터
  9. 제 8 항의 벡터를 함유하는 변형 숙주
  10. 제 1-6항의 어느 약제에 대한 상승되는 항체
  11. 다클론 항체로 구성되는 제 10 항의 항체
  12. 단일클론 항체로 구성되는 제 10 항의 항체
  13. 제 10 항의 항체의 신경 성장 조절량 또는 활성 분획, 코그네이트,공게너, 미믹스,동근, 그들의 분비 세포 또는 용해성 분자를 포유류에 투여하는것으로 구성되는 포유류의 중추신경계 중의 신경 성장 조절을 위한 방법.
  14. 제 1 항의 약제의 치료학적으로 효과량과 그의 동근, 그들에 대한 길항제, 그 분획, 그들의 코그네이트, 그 공게너, 의태의제,동근, 그들의 분비 세포 또는 용해성 분자, 및 약제학적 담체로 구성되는 포유류의 중추신경계 중의 신경 성장 조절을 위한 약제 조성물.
  15. 외 유전자 신경 유착 분자를 표출하는 신경교 세포를 함유하는 전이 유전자 포유류
  16. 제 15 항에 있어서, 신경교 세포는 성상세포인 전이유전자 포유류
  17. 제 15 항에 있어서, 신경교 유착 분자는 L1 인 전이유전자 포유류
  18. 제 15-17 항의 하나의 전이유전자의 포유류의 신경교 세포를 함유하는 세포 배양물
  19. 제 15-17 항의 하나의 전이유전자의 중추신경계로부터 조직을 구성하는 세포 배양 계
  20. 제 18 항의 세포 배양계상의 상기 뉴런을 배양하는 것으로 구성하는 CNS 뉴런의 축삭 외성장을 증진하는 방법
  21. 제 19 항의 세포 배양계상의 상기 뉴런을 배양하는 것으로 구성하는 CNS 뉴런의 축삭 외성장을 증진하는 방법
  22. 포유류의 기억을 증진함에 유효한 제 18 항의 세포 배양계의 세포의 량을 이러한 증진이 필요한 포유류의 뇌에 투여하는 것으로 구성되는 기억 증진 방법.
  23. 포유류의 기억을 증진함에 유효한 제 19 항의 세포 배양계의 세포의 량을 이러한 증진이 필요한 포유류의 뇌에 투여하는 것으로 구성되는 기억 증진 방법.
  24. 상기 신경교 세포내 신경조직 유착 분자의 표출을 하여하는 백터, 이러한 증진이 필요한 포유류의 뇌의 신경교 세포에 인도하는 것으로 구성되는 기억 증진 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 L1 인 방법
  26. 포유류의 뇌에 접합 효율을 증가함에 효과 적인 제 18 항의 세포 배양계의 세포의 량을 ,포유류의 뇌에 투여하는 것으로 구성되는 이러한 증가가 필요한 포유류의 CNS 내 신경접합 효율 증가 방법
  27. 포유류의 뇌에 접합 효율을 증가함에 효과 적인 제 19 항의 세포 배양계의 세포의 량을 ,포유류의 뇌에 투여하는 것으로 구성되는 이러한 증가가 필요한 포유류의 CNS 내 신경접합 효율 증가를 위한 방법
  28. 상기 신경교 세포내 뉴럴 유착 분자의 표출을 허락하는 백터를 이러한 증진이 필요한 포유류 뇌의 신경교 세포에 인도하는 것으로 구성되는 이러한 증가가 필요한 포유류의 CNS 내 신경접합 효율 증가 방법
  29. 제 26 항에 있어서,
    접합 효율의 증가는 장 기간 효능화의 안정화에 의하여 나타나는 것인 방법
  30. 제 27 항에 있어서,
    접합 효율의 증가는 장 기간 효능화의 안정화에 의하여 나타나는 것인 방법
  31. 제 28 항에 있어서,
    접합 효율의 증가는 장 기간 효능화의 안정화에 의하여 나타나는 것인 방법
  32. 가. 제 18 항의 세포 배양 계에 CNS 뉴런을 가하는 것
    나. 세포 배양계에 시험하의 약제를 가하는 것;
    다. CNS 뉴런의 뉴러널 외성장을 측정하며;
    라. 뉴럴 유착 분자의 활성을 조절하는 약제의 능력을위하여 약제를 가하지않는 조절 배양에 관련되는 약제의 존재내에 세포의 뉴러널 성장의 수준의 차를 서로관련시키는 것
    으로서 구성되는 뉴럴 유착 분자의 활성을 조절하는 약제 또는 다른 객체의 능력 시험방법
  33. 가. 제 19 항의 세포 배양 계에 CNS 뉴런을 가하는 것
    나. 세포 배양계에 시험하의 약제를 가하는 것;
    다. CNS 뉴런의 뉴러널 외성장을 측정하며;
    라. 뉴럴 유착 분자의 활성을 조절하는 약제의 능력을위하여 약제를 가하지않는 조절 배양에 관련되는 약제의 존재내에 세포의 뉴러널 성장의 수준의 차를 서로관련시키는 것
    으로서 구성되는 뉴럴 유착 분자의 활성을 조절하는 약제 또는 다른 객체의 능력 시험방법
  34. 제 32 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 L1 인 방법
  35. 제 33 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 L1 인 방법
  36. 가. 약물 또는 시제와 접종하는 제 18 항의 세포 배양 계를 배양하는 것
    나. 가) 단계의 세포 배양 계에 CNS 뉴런을 가하는 것
    다. 그들에 약제의 효과를 측정하기 위해 뉴러널 외성장을 측정하는 것
    으로서 구성되는 뉴럴 유착 분자의 생성을 조절하는 능력을 위한 약제 또는 다른 시제를 검증을 위한 시금 시스템
  37. 가. 약물 또는 시제와 접종하는 제 19 항의 세포 배양 계를 배양하는 것
    나. 가) 단계의 세포 배양 계에 CNS 뉴런을 가하는 것
    다. 그들에 약제의 효과를 측정하기 위해 뉴러널 외성장을 측정하는 것
    으로서 구성되는 뉴럴 유착 분자의 생성을 조절하는 능력을 위한 약제 또는 다른 시제를 검증을 위한 시금 시스템
  38. 제 36 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 라미닌, 피브로넥틴, N-카데린,BSP-2(마우스 N-CAM), D-2,224-1, A6-A1, L1-CAM, NILE, Mr-CAM, TAG-1 (악소닌-1), Ng-CAM 및 F3/F11 로 구성되는 그룹에서 선택된 것인 시금 시스템.
  39. 제 36 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 L1 인 시금 시스템
  40. 제 37 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 라미닌, 피브로넥틴, N-카데린,BSP-2(마우스 N-CAM), D-2,224-1, A6-A1, L1-CAM, NILE, Mr-CAM, TAG-1 (악소닌-1), Ng-CAM 및 F3/F11 로 구성되는 그룹에서 선택된 것인 시금 시스템.
  41. 제 37 항에 있어서,
    뉴럴 유착 분자는 L1 인 시금 시스템
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2190418A1 (en) * 1996-11-15 1998-05-15 Zhi-Cheng Xiao Neuron and neural tumor growth regulatory system, antibodies thereto and uses thereof
JPH11507845A (ja) * 1997-02-13 1999-07-13 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 神経細胞付着分子スプライシング変種
US6887844B1 (en) * 1998-09-29 2005-05-03 Lars Christian Ronn NCAM binding compounds
AUPQ614200A0 (en) * 2000-03-10 2000-03-30 Department Of Human Physiology, Flinders University School Of Medicine Method for treating chronic spinal cord injury
WO2001075454A2 (en) * 2000-04-03 2001-10-11 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Diagnosis and treatment of alzheimer's disease
SG121733A1 (en) * 2001-10-03 2006-05-26 Pfizer Prod Inc Nucleic acid molecules polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
AR040778A1 (es) 2002-08-06 2005-04-20 Glaxo Group Ltd Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina).
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment
EP2462444B1 (en) * 2009-08-07 2018-10-03 Affinimark Technologies, Inc. Methods for the immunological identification of cerebrospinal fluid

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990005191A1 (en) * 1988-11-04 1990-05-17 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
WO1993000427A2 (en) * 1991-06-24 1993-01-07 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
AU1091495A (en) * 1993-11-08 1995-05-29 New York University Neuron-glia cell adhesion molecule, ng-cam, in treatment of nerve damage

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Publication number Publication date
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NO974811D0 (no) 1997-10-17
AU718508B2 (en) 2000-04-13
HUP9900060A3 (en) 2001-08-28
CZ330197A3 (cs) 1998-04-15
MX9708127A (es) 1998-06-28
HUP9900060A2 (hu) 1999-04-28

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