KR20060129503A - 이온 채널 - Google Patents

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KR20060129503A
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니콜라 브라이스
마크 칼튼
존 딕슨
이사벨 마린지
디크 잔
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Abstract

본 발명은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 및 그의 상동체, 변이체 및 유도체를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드를 개시한다. Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 핵산, 특히 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열을 포함한 것이 개시된다.
Figure 112006068989022-PCT00003
Kv9.2, 서브유니트, 이온 채널, 핵산, 폴리펩타이드, 작용제, 길항제

Description

이온 채널{Ion channel}
본 발명은 신규하게 확인된 핵산, 그에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 및 그의 제조 및 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 핵산 및 폴리펩타이드는 이하 "Kv9.2"로 표기된 이온 채널 서브유니트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 핵산 및 폴리펩타이드 작용의 억제 또는 활성화에 관한 것이다.
이온 채널은 세포의 기능 작용시 중요한 역할을 하는 다수-서브유니트 막 결합 단백질이다. 이들은 세포막을 교차하여 나트륨, 칼륨, 염화물 및 칼슘을 포함한 많은 이온의 통과를 조절한다. 이온이 전하를 지니는 경우 이온 채널은 세포 휴지 전위를 포함한 기본 세포 전기성의 중요한 매개체이다. 이들의 기능 부전 및 결함은 간질, 고혈압 및 낭포성섬유증을 포함한 많은 질환 및 증후에 관련된다.
칼륨 채널은 세포의 표면막 내에 분포되어 있고 칼륨 이온을 이를 통해 선택 적으로 통과시키고, 세포의 막 전위를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 고려된다. 특히, 신경 및 근육 세포에서 이는 활동 전위의 빈도, 지속성 등을 조절함으로서 중추 및 말초 신경의 신경전달, 심장의 속도 조정, 근유의 수축에 기여한다. 더욱이 이는 호르몬의 분비, 세포 부피의 조정, 세포의 증식 등에도 관여되는 것으로 나타났다.
칼륨 채널 유전자 패밀리는 가장 크고 가장 다양한 이온 채널 패밀리로 판단된다. 이들은 예를 들어 2, 4 또는 6개 도메인과 같은 막횡단 도메인의 수에 기반하여 많은 하위 패밀리로 분류되었다. 2개의 도메인을 지닌 것은 높게 보존된 미공 도메인을 지닌 GIRK, IRK, CIR 및 ROMK를 포함한다. TREK, TASK-1 및 2 및 TRAAK와 함께 Twik-1 및 Twik-유사 채널은 4개의 막횡단 도메인을 지니고 막을 교차하여 항정 상태 칼륨 이온 전위를 유지시키는데 관련된다. Shaker-유사 및 eag 형태 채널은 6개 도메인을 지니고 가장 큰 하위-패밀리이다. Shaker 형태는 현저하게 높은 다양성을 지닌 패밀리이고 Kv1, Kv2, Kv3 및 Kv4의 하위 패밀리로 더욱 분류될 수 있다. 한편, eag 형태는 eag, eag-관련 유전자 및 elk에 의해 구성되고 관련된 유전자는 KAT 유전자 군집에 상응하는 과다분극 활성화 형태 칼륨 채널 및 환형 뉴클레오타이드에 의해 활성화되는 양이온 채널을 포함한다.
Kv 채널을 인코드하는 첫 번째 완전한 뉴클레오타이드 서열은 Shaker 채널(Kv1)의 클로닝에 의해 1987년에 보고되었다. Shaker cDNA로의 낮은-스트린전 시 선별은 K+ 채널 cDNA Shab(Kv2) Shaw(Kv3) 및 Shal(Kv4)의 분리를 유도하였고 3개의 별개의 유전자로부터 유래된다. 서열은 ∼40% 동일성을 지닌, Shaker에 대해 상동적이다. 중심 영역 내에서 Shaker에 대해 ∼60% 상동성을 지닌 Kv1 패밀리는 적어도 7개 이상의 멤버를 지닌 가장 큰 채널 패밀리이다. Shaker, Shab, Shal 및 Shaw에 관련한 4개의 포유류 하위 패밀리에 더하여 5개의 추가 하위 패밀리(Kv5-9)도 기술되었다. 현재 30개 이상의 Kv 채널이 클론되었고 이형적 발현 시스템 내에서 발현되었다. 이들 채널은 종종 전압 민감도, 전류 동력학 및 항정-상태 활성화 및 불활성화에서 차이를 나타낸다.
Kv 채널은 결합되어 기능적 채널을 형성하는 4개의 6-막횡단-스패닝(spanning)-서브유니트에 의해 형성된 사합체로서 존재한다. 시험관 내 및 생체 내 모두에서 동일한 서브유니트가 결합하여 기능적 채널을 형성할 수 있을 뿐만 아니라 별개의 서브유니트가 결합하여 기능적 이형상 채널을 형성할 수 있다. 이들 이형성 채널은 상응하는 상동성 채널의 관찰된 성질의 혼성을 나타내는 독특한 성질을 지닌다. 더욱이 일부 Kv-서브유니트는 단독으로 발현시 기능적이지 않다. 예를 들어 포유류 Kv 패밀리의 가장 최근에 확인된 멤버인 Kv9.3 서브유니트는 그 자체로 기능적인 상동성 채널을 형성하지 않는 반면 변화된 전압 민감도 및 동력학을 부여하는 이형성 복합체에서만 작용한다.
부속 서브유니트는 Kv 서브유니트와 결합하여 더욱 더 많은 다양성을 Kv 채 널 기능에 부가시킬 수 있다. 현재 4개의 Kv 서브유니트 유전자 패밀 리가 기술되어 있다. 이들 모두는 보존된 중심 서열 및 변이가능한 NH2 말단을 지닌 ∼40 kDa 질량의 세포질 단백질이다. Kv 서브유니트는 빠르고 느린 불활성화 모두, 변화된 전압 민감도 및 지연된 불활성화를 포함한 서브유니트 상에 기능적 효과를 부여하는 것으로 나타났다. 더욱이 서브유니트는 이형성 발현 시스템 내에서 Kv4.2 채널 상에 O2 민감도를 부여하기 때문에 세포 산화환원반응 센서로서 작용한다.
칼륨 전압-차단 채널, 지연된-정류기, 하위 패밀리 S, 멤버-2(Kv9.2) mRNA는 췌장섬에서 발현되는 것으로 나타났으나 인슐린과 동시에 위치하지 않는 것으로 나타났고, 이는 인슐린 분비 조절에 관련되지 않음을 나타내었다(Yan, L., Diabetes 2004. 53. 597-607)
본 발명자는 Kv9.2 칼륨 채널이 혈당의 유지에 중요함을 발견하였다. Kv9.2 넉아웃 동물에서 혈당 수치가 야생형 동물과 유의적인 차이(즉, 더 낮음)를 나타내었다. 따라서 본 유전자는 당 및 지방의 대사의 제어 및 조절을 지닌다.
요약
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명자는 Kv9.2 유전자가 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물을 제공한다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 Kv9.2 유전자 또는 그의 일부가 결실되었다. 바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 하기 표현형의 어느 하나 또는 그의 결합을 표시한다: 야생형 대비 (a) 감소된 혈당 수치; (b) 바람직하게는 오픈 필드시험(Open Field Test) 및/또는 플러스 미로 시험(Plus Maze Test)으로 측정시 증가된 불안.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 상기 동물의 Kv9.2 유전자의 적어도 일부 또는 전부가 또다른 동물, 바람직하게는 또다른 종, 더욱 바람직하게는 인간의 Kv9.2 유전자로부터의 서열로 대치된 형질전환 비-인간 동물이 제공된다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 마우스이다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 기능적으로 분열된 Kv9.2 유전자, 바람직하게는 Kv9.2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 Kv9.2 유전자는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다.
본 발명의 세 번째 관점에 따라 본 발명자는 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 관점에 따른 비-인간 형질전환 동물로부터 분리된 세포 또는 조직이 제공한다.
본 발명의 네 번째 관점에 따라 기능적으로 분열된 내인성 Kv9.2 유전자를 지닌 세포가 제공되고, 상기 Kv9.2 유전자는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다.
본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 본 발명자는 불안 또는 당뇨병에 대한 모델로서 기술된 바와 같은 형질전환 비-인간 동물, 기술된 바와 같은 세포 또는 조직 또는 기술된 바와 같은 세포의 이용이 제공된다.
여섯 번째 관점에 있어서, 본 발명은 Kv9.2 관련 질환에 대한 모델로서 기술된 바와 같은 형질전환 비-인간 동물, 기술된 바와 같은 세포 또는 조직 또는 기술된 바와 같은 세포의 이용을 제공한다.
본 발명의 일곱 번째 관점에 따라 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서 기술된 바와 같은 형질 전환 비-인간 동물, 기술된 바와 같은 세포 또는 조직 또는 기술된 바와 같은 세포의 이용이 제공된다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 따라 본 발명자는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법을 제공하고, 상기 방법은 후보 화합물을 동물, 바람직하게는 야생형 동물 또는 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 하기 표현형의 어느 하나의 변화를 측정하는 단계를 포함한다: (a) 혈당 수치; (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험 및/또는 플러스 미로 시험으로 측정시 불안.
바람직하게는 본 방법은 상기 동물이 표현형 (a)-(b)의 어느 하나에서의 증가를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제를 확인시킨다.
대안으로, 또는 이에 추가하여 본 방법은 상기 동물이 표현형 (a)-(b)의 어느 하나를 나타내게 하거나 이러한 표현형을 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제를 확인시킨다.
본 발명자는 본 발명의 아홉 번째 관점에 따라 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법을 제공하고, 상기 방법은 후보 화합물을 세포 또는 조직, 바람직하게는 야생형 세포 또는 조직 또는 기술된 바와 같은 세포 또는 조직 또는 기술된 바와 같은 세포에 투여하는 단계 및 세포 또는 조직의 세포의 전도성 또는 동력학 상의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 본 방법은 세포의 전도성 또는 동력학을 증가시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제를 확인시킨다.
대안으로, 또는 이에 추가하여 본 방법은 세포의 전도성 또는 동력학을 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제를 확인시킨다.
본 발명의 열 번째 관점에 따라 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료 또는 완화에 적당한 화합물의 확인 방법이 제공되고, 상기 방법은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 Kv9.2 폴리펩타이드를 후보 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 열한 번째 관점에서 본 발명자는 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료를 위한 그의 작용제 또는 길항제의 확인시 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 이용을 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 열두 번째 관점에서 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료를 위한 그의 작용제 또는 길항제의 확인시 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 이용을 제공한다.
본 발명의 열세 번째 관점에 따라 본 발명자는 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료 방법에서 이용하기 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제를 제공한다.
본 발명의 열네 번째 관점에 따라 개체 내에서 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환에 대한 약제 조성물의 제조를 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제의 이용이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 열다섯 번째 관점에 따라 불안 또는 당뇨병 증세를 나타내고, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환 증세를 나타내는 개체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 Kv9.2의 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 열여섯 번째 관점에 따라 본 발명자는 개체 내에서의 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체 또는 그의 세포 또는 조직 내 Kv9.2의 발현, 농도 또는 활성 상의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 Kv9.2 관련 질환은: 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증 및 저혈당증, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는), 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
대안으로, 또는 이에 추가하여 Kv9.2 관련 질환은 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장 애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증, 불안장애, 불안-관련 행동 및 범불안장애, 광장공포증, 급성 스트레스 장애 및 DSM-IV에 기입된 공황장애 및 우울증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 열일곱 번째 관점에 따라 본 발명자는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 열여덟 번째 관점에 따라 본 발명의 열여덟 번째 관점에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 제공한다.
바람직하게는 이러한 핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한다.
본 발명의 실시는 특별히 나타내지 않는 한 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내에 존재한다. 이러한 기술은 하기 문헌에 설명되어 있다. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James OD. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson Immunocytochemistry: Theory and Practice, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); Immunochemical Protocols, vol 80, in the series: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons) 참조. 이들 문헌은 참고문헌으로 포함되어 있다.
Kv9.2 서브유니트
본 발명은 당뇨병 또는 불안을 포함한 Kv9.2 관련 질환의 치료, 완화 또는 진단시 이온 채널 및 그의 서브유니트 특히, 전압 차단된 칼륨 채널의 Kv9.2 서브유니트뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 또는 유도체의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 이들 또는 다른 실시태양은 하기에 더욱 상세히 설명된다.
Kv9.2 서브유니트의 발현 프로파일
실시예에 나타난 바와 같이 Kv9.2 cDNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 전립선, 간, 생식 기관, 근육 및 뇌를 포함한 많은 기관에서 다양한 정도로 Kv9.2의 발현을 검출한다.
BLASTN에 의한 인간 EST 데이터 출처 검색을 위한 서열번호: 1의 Kv9.2 cDNA의 이용시 동일성이 cDNA 라이브러리 내에서 발견되었다. 이는 Kv9.2이 이들 정상 또는 비정상 조직내에서 발현됨을 나타낸다.
U69192 인간 태아 뇌
AA776703 인간 고환
A1681499 인간 폐
AW292826 인간 난소
따라서 Kv9.2 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드가 이들 또는 다른 조직 내 Kv9.2 서브유니트의 과-, 저- 및 비정상 발현과 관련된 질환의 검출, 진단, 치료 및 다른 분석에 유용하다.
Kv9.2 서브유니트 관련 질환
여기에 기술된 방법 및 조성물에 따라 Kv9.2 서브유니트는 광범위한 질환을 치료하고 진단하는데 유용하다. 이들 질환은 편의상 Kv9.2 관련 질환으로 표기된다.
본 발명자는 인간 Kv9.2이 호모 사피엔스 염색체 8q22에 지도화됨을 증명하였다. 따라서 특정한 실시태양에서 Kv9.2 서브유니트가 이러한 좌위, 염색체 밴드, 구역, 팔(arm) 또는 동일한 염색체에 지도화된 질환을 치료하거나 진단하는데 사용된다. Kv9.2 서브유니트의 염색체 위치(즉, 호모 사피엔스 염색체 8q22)와 동일한 좌위, 염색체 밴드, 구역, 팔 또는 염색체에 결합된 것으로 측정된 알려진 질환은 신세뇨관산증-골화석증 증후군, 디하이드로피리미딘뇨증, 코헨 증후군 및 후두 기형을 지닌 클리펠-페일 증후군을 포함한다.
Kv9.2 결함 넉아웃 마우스는 실시예에 증명된 바와 같이 광범위한 표현형을 나타낸다.
특히, 하기 실시예 5는 Kv9.2 넉아웃 마우스에서의 혈당 수치가 상응하는 야생형 마우스보다 유의적으로 높음을 증명하였다. 따라서 Kv9.2 활성의 결함은 혈당 수치의 감소와 상호관련된다.
따라서 본 발명자는 바람직하게는 당뇨병 치료를 위한 개체 내에서의 혈당 수치 저항 방법을 개시하고, 본 방법은 개체 내 Kv9.2의 수치 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 주지된 바와 같이 이는 Kv9.2 발현의 하향-조절 또는 Kv9.2에 대한 길항제의 이용에 의해 달성될 수 있다.
특히 이러한 방법에 의한 혈당 조절은 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증을 포함하나 이에 한정적이지 않은 질환의 치료 및 저혈당증의 치료에 사용된다. 또한 이는 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는), 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양 및 알코올 유도성 저혈당증의 치료에 사용된다. 따라서 Kv9.2 넉아웃 마우스는 이들 질환의 어느 하나에 대한 모델로서 이용된다.
더욱이 실시예 6은 Kv9.2 넉아웃 마우스가 야생형보다 더 불안함을 나타내는 오픈 필드 시험을 기술한다. 따라서 Kv9.2 활성의 결함이 스트레스 증가와 상호관련된다.
따라서 본 발명자는 개체 내 스트레스 또는 불안 또는 이 둘 모두의 저하 방법을 개시하고, 상기 방법은 개체 내 Kv9.2의 수치 및 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 주지된 바와 같이 이는 Kv9.2의 발현을 상향-조절함으로서 또는 Kv9.2의 작용제를 이용함으로서 달성될 수 있다.
Kv9.2 및 Kv9.2 길항제를 포함한 Kv9.2 활성 조절제는 스트레스 및 불안이 특징인 질환 또는 증후군을 치료하거나 완화하는데 사용된다. 이러한 질환은 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증을 포함한다. 따라서 Kv9.2 넉아웃 마우스는 이들 질환의 어느 하나에 대한 모델로서 이용된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 관련 질환은 스트레스 및 불안이 증상인 질환을 포함한다. 더욱 바람직한 실시태양에서 Kv9.2 질환은 상기 목록의 불안 및 스트레스 관련 질환을 포함한다.
더욱이 상기 유전자는 불안, 불안장애, 불안-관련 행동 및 범불안장애, 공황장애, 광장공포증, 사회 공포증, 강박반응성 장애, 외상후 스트레스 장애, 급성 스트레스 장애 및 DSM-IV에 기입된 공황장애 및 우울증을 포함한 신경 장애에 효과를 지니는 것으로 판명되었다.
주지된 바와 같이 Kv9.2 서브유니트는 여기서 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 이들 특정한 질환의 진단 및/또는 치료에 사용된다.
특히, 본 발명자는 상기 기입된 특정 질환의 치료 또는 진단을 위한 Kv9.2 핵산 및 Kv9.2 핵산, 폴리펩타이드 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 벡터, Kv9.2 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함한 약제 조성물, 숙주 세포 및 형질전환 동물의 이용을 조사하였다. 더욱이 본 발명자는 상기 기술된 특정 질환의 진단 및 치료시 Kv9.2과 상호작용하거나 그에 결합하는 것이 가능한 화합물, 바람직하게는 본 채널의 동력학 또는 전도성을 조절하는 것이 가능한 화합물, Kv9.2 서브유니트에 대한 항체의 이용뿐만 아니라 이들의 제조 또는 확인 방법을 조사하였다. 특히, 본 발명자는 특정 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 제조시 이들 화합물, 조성물, 분자 등의 이용을 포함하였다. 또한 본 발명자는 개체 내 특정 질환의 검출을 위한 진단 키트를 개시한다.
Kv9.2 서브유니트의 이용에 의해 치료 가능하거나 진단 가능한 이러한 또는 또다른 특정 질환을 확인하기 위한 연관 지도화 방법은 당분야에 알려져 있고 본 출원서에 기술되어 있다.
불안 및 스트레스
불안 및 스트레스뿐만 아니라 Kv9.2 관련 질환을 포함한 이들이 나타내는 장애는 당분야에 잘 알려져 있다. 요약 설명은 하기와 같다:
불안 및 스트레스는 근심, 긴장, 초조 및 염려와 같은 것으로도 표현된다. 스트레스는 개체가 좌절감, 분노 또는 근심을 느끼게 하는 상황 또는 생각으로부터 유래될 수 있다. 한 사람에게 스트레스가 많은 것이 다른 사람에게도 항상 그런 것은 아니다.
불안은 염려 또는 공포의 감정이다. 이러한 걱정의 근원은 항상 알려지거나 인식되는 것은 아니고, 이는 개인 감정을 고통스럽게 수 있다.
스트레스는 생활의 정상적인 부분이다. 적은 정도의 스트레스는 유익하다 - 이는 개인에게 동기부여를 할 수 있고 더욱 생산적이게 할 수 있다. 그러나 너무 많은 스트레스 또는 스트레스에 대한 강한 반응은 유해하다. 이는 일반적으로 건강을 해치게 할 뿐만 아니라 감염, 심장질환 또는 우울증과 같은 특정한 신체적 또는 정신적 질병을 유발할 수 있다. 지속적인 스트레스는 불안 및 과식과 같은 건강에 해로운 행동 및 알코올 또는 약물의 남용을 유발한다.
비통 또는 우울증과 같은 감정적인 스트레스 또는 과활성 갑상선, 낮은 혈당 또는 심장발작과 같은 건강 이상은 스트레스를 유발할 수 있다.
불안은 경련 또는 전율, 근육 긴장, 두통, 발한, 건조 구강, 삼키기 어려움, 복통(특히 유아의 경우 스트레스의 유일한 증후임)을 포함한 신체적 증후가 동반된다.
일부 다른 증후는 불안을 동반한다: 현기증, 빠르거나 불규칙한 심장박동수, 빠른 호흡, 설사 또는 빈뇨, 피로, 평정심 상실을 포함한 흥분성, 불면증 및 악몽, 집중력 감소 및 성적 문제.
Kv9.2 및 그의 조절제는 이들 증후를 치료하거나 완화하는데 사용된다.
불안 장애는 과도한 불안을 포함한 정신의학적 이상의 그룹이다. 이들은 범불안장애, 특정 공포증, 강박반응성 장애 및 사회 공보증을 포함한다. Kv9.2 관련 질환은 상기에 기술되어 있다.
기분적환용 및 의약용 모두를 포함한 특정한 약물은 약물의 부장용 또는 투여 중지에 의한 불안 증후를 유발할 수 있다. 이러한 약물은 카페인, 알코올, 니코틴, 감기약, 소염제, 천식용 기관지확장제, 삼환계 항우울제, 코카인, 암페타민, 체중 감량제, ADHD 약물 및 갑상선 약물을 포함한다. 본 발명자는 스트레스 및/또는 불안 유도 효과를 완화하기 위해 이러한 약물과 결합된 Kv9.2 및 그의 조절제의 이용을 개시한다.
불충분한 식이는 스트레스 또는 불안을 유발할 수 있다 - 예를 들어 낮은 수치의 비타민 B12. 불안 이행은 시험 수행 또는 대중 앞에서의 발표와 같은 특정한 상황과 관련된다. 외상-후 스트레스 장애(PTSD)는 전쟁, 신체적 또는 성적 폭행 또는 자연 재해와 같은 외상 사고 후 발병된 스트레스 장애이다.
매우 드문 경우에 부신 종양(크롬친화세포종)은 불안의 원인이다. 이는 불안한 감정 또는 증후에 중요한 호르몬의 과생산 때문에 발생한다.
(Medline Plus로부터 변경됨,
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003211.htm)
Kv9.2 서브유니트의 동일성 및 유사성
Kv9.2는 인간 Kv9.2를 암호화하는 증폭된 cDNA 생성물의 서열분석 결과에 나타난 바와 같이 이온 채널 패밀리의 또다른 단백질에 구조적으로 관련된다. 서열번호: 1의 cDNA 서열은 서열번호: 3에 나타난 1104개 아미노산의 폴리펩타이드를 인코드하는 오픈 리딩 프레임(서열번호: 2, 뉴클레오타이드 수 41∼3352)를 포함한다. 인간 Kv9.2는 호모 사피엔스 염색체 8q22에서 지도화된 것으로 판명되었다.
pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)의 HMM 구조 예측 소프트웨어를 이용한 Kv9.2 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석은 Kv9.2 펩타이드가 이온 채널 서브유니트임을 확인시켰다.
인간 Kv9.2 서브유니트의 마우스 상동체가 클론되었고 그의 핵산 서열 및 아미노산 서열이 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 5에 나타나 있다. 서열번호: 4의 마우스 Kv9.2 서브유니트 cDNA는 인간 Kv9.2 서브유니트(서열번호: 2)와 높은 정도의 동일성을 나타내고, 마우스 Kv9.2 서브유니트의 아미노산 서열(서열번호: 5)은 인간 Kv9.2 서브유니트(서열번호: 3)와 높은 정도의 동일성 및 유사성을 나타낸다. 따라서 인간 및 마우스 Kv9.2 이온 채널 서브유니트는 큰 이온 채널 패밀리의 멤버이다.
Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드
여기에 사용된 "Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드"는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 나타낸다. 바람직하게는 폴리펩타이드는 서열번호: 3에 나타난 서열의 상동체, 변이체 또는 유도체이거나 이를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 서로 펩타이드 결합 또는 변형 펩타이드 결합 즉, 펩타이드 동배체에 의해 서로 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로 표기되는 짧은 사슬 및 일반적으로 단백질로 표기되는 긴 사슬 모두를 나타낸다. 폴리펩타이드는 20개 이상의 유전자-인코드된 아미노산을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 번역-후 과정과 같은 자연적 과정 또는 당분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 기본 교본에 잘 기술되어 있고 모노그래프뿐만 아니라 많은 연구 문헌에 더욱 상세히 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 백본, 아미노산 측면-사슬 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩타이드 내 어떠한 장소에서도 발생할 수 있다. 동일한 형태의 변형이 제공된 폴리펩타이드 내 일부 사이트에서 동일하거나 다른 정도로 존재함이 인식될 것이다. 또한 제공된 폴리펩타이드는 여러 형태의 변형을 포함한다.
폴리펩타이드는 편재화(ubiquitination) 결과로 분지되거나 분지 없이 환형이 된다. 환형, 분지형 및 분지화 환형 폴리펩타이드는 번역후 자연적 과정으로부터 유발하거나 합성 방법에 의해 생성된다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-라이보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합성 부착, 헴 모이어티의 공유결합성 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합성 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합성 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유결합서 부착, 교차-결합, 고리화, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유결합성 교차-결합 형성, 시스테인 형성, 프로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 고정 형성, 수화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 세레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가 및 편재화를 포함한다. Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan et aL, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 참조.
본 출원서에서 사용된 "변이체", "상동체", "유도체" 또는 "단편"이라는 용어는 서열로부터 또는 이에 대한 하나(또는 그 이상의) 아미노산의 치환, 변이, 변형, 대치, 결실 또는 삽입을 포함한다. 다른 경우를 인정하지 않는 한 "Kv9.2", "Kv9.2 서브유니트" 및 "Kv9.2 이온 채널"에 대한 언급은 Kv9.2의 변이체, 상동체, 유도체 및 단편의 언급을 포함한다.
바람직하게는 Kv9.2에 적용시 수득된 아미노산 서열은 발현되어 상동성 채널을 형성하거나 다른 Kv 패밀리 멤버와 결합하여 이형성 채널을 형성할 때 이온 채널 활성을 지닌다. 바람직하게는 수득된 핵산은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 Kv9.2 이온 채널 서브유니트와 동일한 활성(또는 나타난 바와 같은 다른 채널과 결합시 활성에 대한 전위)을 지닌다.
특히 "상동체"라는 용어는 나타난 바와 같이 다른 채널과 결합시 수득된 아미노산 서열이 이온 채널 활성, 바람직하게는 Kv9.2 이온 채널 활성을 지니는 경우 구조 및/또는 기능에 대한 동일성을 포함한다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 Kv9.2 서브유니트 핵산 서열의 대립유전성 변이인 아미노산 유래의 폴리펩타이드를 포함한다.
Kv9.2 포함 이온 채널과 같은 이온 채널의 "채널 활성" 또는 "생물학적 활성"의 표현에 있어서 이들 용어는 유사한 활성 또는 개선된 활성 또는 바람직하지 않은 부작용이 감소된 활성을 포함한 Kv9.2 포함 이온 채널의 대사성 또는 생리적 기능을 나타낸다. 또한 Kv9.2 포함 이온 채널의 항원성 및 면역원성 활성도 포함된다. 이온 채널 활성의 예 및 이들 활성을 분석하고 정량화하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 본 출원서에 상세히 기술되어 있다.
여기서 사용된 "결실"은 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화로 한정된다. 여기서 사용된 "삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적 물질과 비교시 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 유발하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화이다. 여기서 사용된 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로의 대치로부터 유발된다.
또한 여기서 한정된 Kv9.2 폴리펩타이드는 무증후 변화를 생성하고 기능적으로 동일한 아미노산 서열을 유발하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지닌다. 인공 아미노사 치환은 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 상의 유사성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수서을 지닌 하전되지 않은 극성 두부(polar head group)를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
예를 들어 보존적 치환은 하기에 따라 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내 동일한 줄 내의 아미노산은 서로 치환된다:
Figure 112006068989022-PCT00001
Kv9.2 폴리펩타이드는 일반적으로 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 이형성 아미노산 서열을 더욱 포함한다. 이형성 서열은 세포내 또는 세포외 단백질 타겟팅에 영향을 미치는 서열(리더 서열과 같은)을 포함한다. 또한 이형성 서열은 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키고/또는 폴리펩타이드의 식별, 추출 및/또는 정제를 촉진시키는 서열을 포함한다. 특히 바람직한 또다른 이형성 서열은 바람직하게는 N-말단인 폴리히스티딘과 같은 폴리아미노산 서열이다. 적어도 10개 이상, 바람직하게는 적어도 17개 이상의 아미노산이나 50개 이하의 아미노산의 폴리히스티딘 서열이 특히 바람직하다.
Kv9.2 폴리펩타이드는 "성숙" 단백질의 형태이거나 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부이다. 분비 또는 리더 사열, 전(pro)-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제 촉진 서열 또는 재조합 생성동안 안정성에 대한 추가 서열을 포함한 추가 아미노산 서열을 포함한다.
Kv9.2 폴리펩타이드는 알려진 기술을 이용한 재조합 방법에 의해 유리하게 이루어진다. 그러나 또한 이는 고형상 합성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 합성 방법에 의해 이루어진다. 여기서 기술된 폴리펩타이드는 예를 들어 추출 및 정제를 촉진시키는 융합 단백질로서 제조되기도 한다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 이는 트롬빈 분열 사이트와 같이 융합 단백질 파트너와 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하는 목적 단백질 서열 사이의 단백질 분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 목적 서열의 단백질 기능을 저해하지 않을 것이다.
Kv9.2 폴리펩타이드는 실질적으로 분리된 형태이다. 이러한 용어는 자연 상태로부터 인공적인 변화를 나타낸다. "분리된" 조성물 또는 물질이 자연적으로 발생하는 경우 그의 본래 환경으로부터 변화되거나 제거되었다. 예를 들어 생존 동물 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니나 그의 자연 상태의 동시 존재 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 여기서 사용된 용어와 같이 "분리된" 것이다.
그러나 Kv9.2 이온 채널 단백질이 단백질의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합되고 실질적으로 분리되는 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 여기서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된 형태이고, 이러한 경우 일반적으로 90% 이상, 예를 들어 제제 내 단백질의 95%, 98% 또는 99%가 Kv9.2 폴리펩타이드인 제제 내 단백질을 포함한다.
또한 본 발명자는 Kv9.2 폴리펩타이드의 일부를 포함한 펩타이드를 기술한다. 따라서 Kv9.2 서브유니트의 단편 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 포함된다. 펩타이드는 2∼200개 길이의 아미노산, 바람직하게는 4∼40개 길이의 아미노산이다. 펩타이드는 예를 들어 트립신과 같은 적당한 효소로의 분해에 의해 여기서 사용된 Kv9.2 폴리펩타이드로부터 유래된다. 대안으로 펩타이드, 단편 등은 재조합 방법으로 제조되거나 합성적으로 합성된다.
"펩타이드"라는 용어는 레트로인벌소(retroinverso) D 펩타이드와 같은 당분야에 알려진 다양한 합성 펩타이드 변이를 포함한다. 펩타이드는 항원 결정소 및/또는 T-세포 에피토프이다. 펩타이드는 생체 내에서 면역원이다. 바람직하게는 펩타이드는 생체 내 중화 항체를 유도하는 것이 가능하다.
다른 종으로부터의 Kv9.2 서브유니트를 정렬시킴으로서 어떤 아미노산 서열 구역이 다른 종간에 보존되는지("상동성 구역") 및 어떤 구역이 다른 종간에 변화하는지("이형성 구역")를 측정하는 것이 가능하다.
따라서 Kv9.2 폴리펩타이드는 상동성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 상동성 구역은 적어도 2종간의 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 예를 들어 상동성 구역은 여기서 기술된 시험을 이용하여 아미노산 수치의 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 상동성 구역에 상응하는 서열을 포함한 펩타이드는 하기 더욱 상세히 설명된 치료 전략 내에서 사용된다. 대안으로 Kv9.2 서브유니트 펩타이드는 이형성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 이형성 구역은 적어도 2종간의 낮은 정도의 상동성을 나타낸다.
Kv9.2 폴리뉴클레오타이드 및 핵산
또한 본 발명자는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 Kv9.2 폴리뉴클레오타이드, Kv9.2 뉴클레오타이드 및 Kv9.2 핵산, 그의 제조방법 및 이용을 개시한다.
"Kv9.2 폴리뉴클레오타이드", "Kv9.2 뉴클레오타이드" 및 "Kv9.2 핵산"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리뉴클레오타이드/핵산을 나타낸다. 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드/핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 가장 바람직하게는 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열을 포함하거나 이의 상동체, 변이체 또는 유도체이다.
또한 이들 용어는 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 즉, Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 핵산 서열을 포함한다. 따라서 Kv9.2 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 Kv9.2 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한 없이 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 포함하나 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 특정 염기를 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 이루어지고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 자연 내에서 일반적으로 발견되는 폴리펩타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드로 표기되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 퇴화 결과로 동일한 폴리펩타이드를 인코드할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 나타난 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 올리고뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합에 관계없이 이중-나선 또는 단일-나선인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA이다. 뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 재조합 DNA 기술(예를 들어 재조합 DNA)의 이용에 의해 제조된다.
바람직하게는, "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", 유도체" 또는 단편"이라는 용어는 Kv9.2 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 그에 대한 하나의(또는 그 이상의) 핵산의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "Kv9.2" 및 "Kv9.2 서브유니트"에 대한 표기는 Kv9.2의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 수득된 뉴클레오타이드 서열은 이온 채널 활성, 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 이온 채널과 적어도 동일한 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드한다. 바람직하게는 "상동체"라는 용어는 구조 및/또는 기능에 대해 동일성을 포함하여 수득된 뉴클레오타이드 서열이 이온 채널 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하게 된다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 서열의 대립유전자 변이를 포함한다.
서열 상동성의 계산
따라서 여기서 제공된 서열에 대한 서열 동일성은 다른 서열이 예를 들어 서열에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지니는지 여부를 관찰하기 위한 하나 이상의 서열을 또다른 서열과의 단순한 "안구" 비교(즉, 엄격 비교)에 의해 측정될 수 있다.
또한 상대 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 동일성을 측정하기 위한 적당한 알고리즘을 이용한 2 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수 있는 통상적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 일반적인 예는 CLUSTAL이다. 2 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 다른 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12:387) 및 FASTA(Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410)을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
% 상동체는 인접 서열에 대해 계산된다 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내 각 아미노산은 다른 서열 내 상응하는 아미노산과 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일정한 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍이 아닌 경우 하나의 삽입 또는 결실이 하기 아미노산 잔기를 정렬에서 제거하게 하고 따라서 전제 정렬이 수행될 때 % 상동성 상의 큰 감소를 잠재적으로 유발한다는 점을 고려하지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점을 부당하게 패널티를 과하지 않기 위해 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 가능한 적은 갭을 지닌 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 서열 정렬은 - 2개의 비교 서열 사이의 더 큰 관련성을 반영 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 매우 높은 비용을 부과하고 갭 내의 부차적 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부가하는데 일반적으로 "아핀(affine) 갭 비용"이 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교시 이러하 소프트웨으를 사용할 때 디폴트 수치를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지 사용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려할 때 최적 정렬의 생성을 먼저 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tool이나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al 1999, 7-58 내지 7-60 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전부가 아닌(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 득점을 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다. 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 디폴트 수치에 맞춰진 파라미터를 지닌 BLAST 알고리즘이 사용된다. BLAST 알고리즘은 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 상세히 기술되어 있고 이는 참고문헌에 포함되어 있다. 검색 파라미터는 한정될 수 있고 한정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 맞춰질 수 있다.
대안으로, BLAST에 의한 평가시 "실질적인 동일성"은 적어도 약 7 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 이상, 가장 바람직하게는 적어도 10 이상의 EXPECT 수치로 매치된 서열과 동등하다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견적 검색 알고리즘이고; 이들 프로그램은 적은 증강으로 Karlin and Altschul(Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html 참조)의 통계법을 이용하여 그들의 발견에 대한 유의성을 유추한다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동체를 확인하기 위해 서열 유사성 검색을 위해 주문 제작된다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색 내 기본적인 이슈의 논의를 위해 Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129 참조.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 구입가능한 5개 BLAST 프로그램은 하기 태스크를 수행한다: blastp - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 아미노선 사열 비교; blastn - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열을 비교; blastx - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열(양쪽 나선 모두)의 6-프레임 개념 번역 생성물을 비교; tblastn - 모든 6개 리딩 프레임(양쪽 나선 모두) 내에서 역동적으로 번역된 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 단백질 서열을 비교; tblastx - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열의 6-프레임 번역을 비교.
BLAST는 하기 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM(막대그래프) - 각각의 검색에 대한 득점의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참조).
DESCRIPTIONS(설명) - 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션이다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참조).
EXPECT(예상) - 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에 대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참조).
CUTOFF(컷오프) - 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 득점을 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 득점을 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참조). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
ALIGNMENTS(정렬) - 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참조).
MATRIX(매트릭스) - BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유용한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) - TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) - Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참조)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미 있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, "NNNNNNNNNNNNN"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, "XXXXXXXXX") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해마스크된 어떤 것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발한다.
가장 바람직하게는 서열비교는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 수행된다. 일부 실시태양에서 서열 동일성 측정시 어떠한 갭 패널티도 사용되지 않는다.
하이브리디제이션
또한 본 출원서는 여기서 제공된 서열 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 상기 서열의 상보체에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하이브리디제이션은 "염기 짝짓기를 통해 핵산 나선이 상보적 나선과 결합하는 과정"(Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) 뿐만 아니라 Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)에 개시된 중합효소 연쇄 반응 기술로 수행된 증폭 과정을 의미한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 25개 또는 30개 이상, 예를 들어 적어도 40개, 60개, 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드 구역에 있어서 여기서 제공된 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동성일 것이다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2 또는 4에 대해 상동적인, 바람직하게는 상기 서열 중의 하나에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동적인 구역을 포함할 것이다.
"선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한"이라는 용어는 프로브로 사용된 뉴클레오타이드 서열이 타겟 뉴클레오타이드 서열이 배경 수준보다 유의적으로 상위의 수준에서 프로브에 하이브리다이즈하는 것으로 나타나는 조건 하에서 사용됨을 의미한다. 배경 하이브리디제이션은 예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 선별시 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열로 인해 발생한다. 이러한 경우 배경은 타겟 DNA에서 관찰되는 특이적 상호작용에 비해 10배 이하, 바람직하게는 100배 이하의 강도인 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버와 프로브 사이의 상호작용을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 프로브 즉, 32P를 방사선표지함으로서 측정된다.
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브 Tm의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 Tm의 5℃∼10℃ 이하에서; 중간 스트린전시는 Tm의 10℃∼20℃ 이하에서; 및 낮은 스트린전시는 Tm의 20℃∼25℃ 이하에서 발생한다. 당업자에 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있고 중간(또는 낮은) 스트린전시 하이브리디제이션은 유사하거나 관련된 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명자는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 하나 이상의 Kv9.2 서브유니트 이온 채널 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 뉴클레오타이드 서열이 이중-나선인 경우 이중 나선의 두 스트랜드 모두, 개별적으로 또는 결합된 형태 모두 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-나선인 경우 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열도 이용됨이 이해된다.
또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 유사하게 본 발명은 상기 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열의 형태는 변이체 뉴클레오타이드 서열의 예이다. 이러한 관점에서 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
Kv9.2 서브유니트 및 상동체의 클로닝
본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 상기 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 상기 서열은 다른 생물체 내의 유사한 서브유니트 서열을 확인하고 클론하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 인간 및 쥐, 돼지, 양 등의 다른 종으로부터의 Kv9.2, 그의 상동체 및 다른 구조적으로 또는 기능적으로 관련된 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 적당한 라이브러리로부터 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하기 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4에 포함된 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 충분히 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편이 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리디제이션 프로브로서 사용된다. 또한 이러한 프로브는 Kv9.2 유전자에 대해 서열 유사성, 바람직하게는 높은 서열 유사성을 지닌 다른 유전자(인간 이외의 종으로부터의 상동체 및 오르쏠로그(orthologue)를 포함)의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는데 사용된다. 하이브리디제이션 선별, 클로닝 및 서열분석 기술은 당업자에게 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(상동)에 기술되어 있다.
일반적으로 프로브로 사용하기 적당한 뉴클레오타이드 서열은 대상 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 일반적으로 프로브는 적어도 15개 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는 이러한 프로브는 적어도 30개 뉴클레오타이드를 지닐 것이고 적어도 50개 뉴클레오타이드를 지닌다. 특히 바람직한 프로브는 150∼500개, 더욱 특별하게는 약 300개 뉴클레오타이드 범위일 것이다.
하나의 실시태양에서 인간 이외의 종으로부터 상동체 및 오르쏠로그를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 트린전트 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 그의 단편을 지닌 표지된 프로브로 적당한 라이브러리를 선별하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 하이브리디제이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 스트린전트 조건은 상기 한정된 바와 같거나 대안으로 50% 포름아마이드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5XDenhardt 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 ㎍/ml 변성 절단 연어 정자 DNA를 포함한 용액 내에서 42℃에서의 밤새 인큐베이션한 후 약 65℃에서 0.1XSSC 내에서 필터를 세척하는 조건이다.
Kv9.2 포함 이온 채널의 기능적 분석
클론된 추정 Kv9.2 이온 채널 폴리뉴클레오타이드는 서열 분석 또는 기능적 분석에 의해 증명된다. 특히 상기와 같이 트랜스펙트된 제노푸스(Xenopus) 난모세포의 전도성은 하기 기술된 선별 분석에 유용한 Kv9.2 활성의 측정 및 정량화 방법으로 검출된다. 이러한 전도성 분석은 편의를 위해 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"으로 표기된다.
추정 Kv9.2 이온 채널 서브유니트 또는 상동체는 하기 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"에서의 활성에 대해 분석된다. Kv9.2 cDNA를 인코드하는 선형화 플라스미드 주형으로부터의 캡결합된(capped) RNA 전사체가 표준 절차에 따라 RNA 중합효소로 시험관 내에서 합성된다. 시험관 내에서 전사체는 0.2 mg/ml의 최종 농도로 물에 현탁된다. 난소엽은 성체 암컷 두꺼비로부터 제거되고, 단계 Ⅴ 탈난포화 난모세포가 수득되고 RNA 전사체(10 ng/난모세포)가 현미주사 기구를 이용하여 50 nl 환약으로 주입된다. 2개의 전극 전압 클램프가 작용제 노출에 대한 제노푸스 난모세포 개체로부터 전류를 측정하는데 사용된다. 전류 기록은 상온에서 (mM 농도로) NaCl 115, KCl 2.5, CaCl2 1.8, NaOH-HEPES 10, pH 7.2로 구성된 표준 배지 내에서 이루어진다. 또한 제노푸스 시스템은 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 알려진 리간드 및 리간드 활성화용 조직/세포 추출물을 선별하는데 사용된다.
대안적인 기능적 분석은 세포의 막 전압을 조사하기 위한 전압 민감성 염료의 이용을 포함하여 패취 클램프 전기생리학, Rb 유동, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석 및 FLIPR 분석을 포함한다. FLIPR 분석은 Whiteaker et al. J Biomol Screen. 2001 Oct;6(5):305-1에 기술되어 있고, FRET 기반 분석은 Falconer et al. J Biomol Screen. 2002 Oct;7(5):460-5에 기술되어 있다.
특히, 본 발명자는 Kv9.2의 작용제 및 길항제를 확인하기 위해 Rb 유동뿐만 아니라 Rb 유동 내 변화를 감지하는 선별을 검출하는 분석을 개시한다. 방사선 동위원소 표지된 Rb 유동의 측정방법은 J Biomol Screen. 2004 Oct;9(7):588-97에 기술되어 있고, 방사선 동위원소 표지되지 않은 Rb 유동 분석은 Assay Drug Dev Technol. 2004 Oct;2(5):525-34에 기술되어 있다. 바람직하게는 % Rb 유출은 본 분석으로 측정된다.
이러한 기능적 분석은 "Kv9.2의 기능적 분석(Rb 유동)"으로 본 출원서에 표기되어 있다.
특히, 본 발명자는 Kv9.2의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 % Rb 유출을 저하시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 % Rb 유출은 Kv9.2의 길항제 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 Kv9.2의 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 % Rb 유출을 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 % Rb 유출은 Kv9.2의 작용제 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다.
세포로부터 분비된 Rb+ 유출의 동력학 분석은 하기 방정식을 이용하여 잔존 백분율로 표현될 수 있다:
R=[Rblysate/(Rbsupern+Rblysate)]x100
다른 시간 시점에서의 탈분극 및 작용제-자극된 Rb+ 유출(Rs)은 하기에 따라 측정될 수 있다:
Rs=(I -[(Rtot-R-Rbasal)/-Rbasal])xl00
또한 Kv9.2 폴리펩타이드는 그의 동력학에 대해 분석되고 이는 활성화, 비활성화, 불활성화를 포함한다. 활성화 시간은 표준 조건 하에서 전체 전류가 Kv9.2 포함 채널을 교차하여 수립되는데 소요되는 시간이고, 비활성화 시간은 표준 조건 하에서 전체 전류가 0이되는데 소요되는 시간이다. Kv9.2 동력학의 조절, 증가 또는 감소에 대한 참고가 이루어지는 경우 바람직하게는 Kv9.2 활성화 시간 또는 Kv9.2 비활성화 시간 또는 이 둘 모두의 조절, 증가 또는 감소에 대해 참고되어야 한다.
바람직한 실시태양에서 활성화 시간 상수는 활성화 시간 측정시 사용되고, 비활성화 시간 상수는 비활성화 시간의 측정시 사용된다. Kv9.2 포함 채널에 대한 일반적인 활성화 시간 상수는 21 ms이다. 반-불활성화 V1/2 inact의 일반적 전위는 -33 mV이고, V1/2 inact는 불활성화의 또다른 또는 대안적 동력학 파라미터로서 분석된다.
Kv9.2 포함 채널의 개방제, 작용제, 차단제 및 길항제와 같은 조절제는 Kv9.2 포함 채널의 동력학, 바람직하게는 활성화 시간, 불활성화 시간, 비활성화 시간, 비활성화 동력학, 반-불활성화에 대한 전위 등을 변화시키는 즉, 증가시키거나 감소시키는 것이 가능하다.
특히, 작용제 및 개방제는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간(바람직하게는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간 상수)을 감소시키고, 바람직하게는 예를 들어 활성화 시간을 20 ms, 18 ms, 16 ms 또는 15 ms 이하로 감소시킴으로서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 감소시키는 것이 가능한 분자이다.
유사하게는 Kv9.2의 길항제 또는 차단제는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간을 증가시키고, 바람직하게는 예를 들어 활성화 시간을 22 ms, 25 ms 또는 27 ms 이상으로 증가시킴으로서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 증가시키는 것이 가능하다.
상세하게는 동력학 및 활성화 시간은 바람직하게는 전류의 시간 경과를 기록하고 전체 전류가 수립되는데 소요되는 시간을 수립하는 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다. 유사하게는 불활성화 시간은 전류의 시간 경과를 기록하고 전체 전류가 0으로 떨어지는데 소요되는 시간을 수립하는 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
대안으로, 채널이 예비-펄스(즉, 500 ms 동안 +50 MV) 후 재분극 펄스(즉, -40 mV까지) 후 비활성화되는데 소요되는 시간을 측정하는 비활성화 동력학이 분석된다. Kv9.2 포함 채널의 비활성화 동력학에 대한 일반적 수치는 44 ms이다.
Kv9.2에 대한 발현 분석
Kv9.2 관련 질환을 치료하기에 유용한 치료제를 고안하기 위해 Kv9.2(야생형 또는 특정 돌열변이)의 발현 프로파일을 측정하는 것이 유용하다. 따라서 당분야에 알려진 방법은 Kv9.2이 발현되는 기관, 조직 및 세포 형태를 측정하는데 이용된다. 예를 들어 통상의 또는 "전자적" 노던(Northern)이 수행된다. 또한 역-전사효소 PCR(RT-PCR)는 Kv9.2 유전자 또는 돌연변이체의 발현을 분석하는데 이용된다. Kv9.2의 발현 프로파일의 더욱 민감한 측정 방법은 당분야에 알려진 바와 같이 RNAse 보호 분석을 포함한다.
노던 분석은 유전자의 전사체의 존재를 검출하는데 이용되는 실험 기술이고 특정 세포 형태 또는 조직으로부터의 RNA가 결합된 멤브레인으로의 표지된 뉴클레오타이드 서열의 하이브리디제이션을 포함한다(Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, F. M. et al. supra, ch. 4 and 16). BLAST를 적용하는 유사한 컴퓨터 기술("전자적 노던")은 GenBank 또는 LIFESEQ 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals)와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이스와 동일하거나 관련된 분자를 검색하는데 이용된다. 이러한 형태의 분석은 다수의 멤브레인-기반 하이브리디제이션보다 더 빠르다는 점에서 유리하다. 더욱이 컴퓨터 검색의 민감도는 어떠한 특정 매치가 정확하거나 상동성인 것으로 분류되는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 프로브를 포함하여 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 동물 및 인간 질환의 치료 및 진단의 발견을 위한 연구 시약 및 재료로서 이용된다.
Kv9.2 폴리펩타이드의 발현
또한 본 발명자는 Kv9.2 폴리펩타이드의 제조 방법을 개시한다. 본 방법은 일반적으로 적당한 조건(즉, Kv9.2 폴리펩타이드가 발현되는 조건) 하에서 다른 Kv 패밀리 멤버의 존재시 또는 부재시 Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
생물학적으로 활성인 Kv9.2 포함 이온 채널을 발현하기 위해 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 적당한 발현 벡턱 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 또는 번역을 위해 필요한 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구축하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내에서의 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내에서의 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J. et al.(1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) 및 Ausubel, F. M. et al.(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템은 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열을 포함하고 발현시키는데 사용된다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(즉, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터(즉, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 사용되는 숙주 세포의 특성은 문제가 되지 않는다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역되는 구역이다(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 구역). 이러한 요소는 그의 강도 및 특이성이 다양하다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 달리 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 적당한 전사 및 번역 요소가 사용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내에서 클로닝시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(GIBCO/BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 사용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포에 사용된다. 식물 세포의 게놈 유래(즉, 열충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스 유래(즉, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열) 프로모터 또는 인핸서가 벡터 내로 클론된다. 포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자 유래 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터가 바람직하다. Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열의 다수 카피를 포함한 세포주를 생성할 필요가 있는 경우 SV40 또는 EBV 기반 벡터가 적당한 선택성 마커와 함께 사용된다.
박테리아 시스템에서 많은 발현 벡터는 Kv9.2 서브유니트에 대한 용도에 따라 다르게 선택된다. 예를 들어 많은 양의 Kv9.2 서브유니트가 항체 유도를 위해 필요한 경우 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 지시하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 다기능성 E. coli 클로닝 및 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열에 인프레임으로 벡터 내로 라이게이트되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등과 같은 발현 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 글루타티온 부재시 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 프로테아제 분열 사이트를 포함하도록 고안되어 클론된 목적 폴리펩타이드는 GST 모이어티로부터 유리될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레시비에(Saccharomyces cerevisiae)에서 알파 인자, 알코올 산화제 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 많은 벡터가 사용된다. Ausubel (상동) 및 Grant et al.(1987; Methods Enzymol. 153:516-544) 참조.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해서도 작동된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 결합하여 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로 RUBISCO의 작은 서브유니트와 같은 식물 프로모터 또는 열충격 프로모터가 사용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적인 DNA gudrainage asphalt 또는 병원균-매개 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 많은 이용 가능한 문헌에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한 곤충 시스템이 Kv9.2 서브유니트를 발현시키는데 사용된다. 예를 들어 이러한 시스템 내에서 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충 내 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 구역 내로 클론되고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. Kv9.2 서브유니트의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성이 되게 하고 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 재조합 바이러스는 예를 들어 Kv9.2 포함 채널이 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포에서 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 사용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열은 후반 프로모터 3부 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 감염된 숙주 세포 내에서 Kv9.2 서브유니트를 발현할 수 있는 생존 가능한 바이러스를 수득하기 위해 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 구역 내로의 삽입이 이용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서는 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 사용된다.
따라서 예를 들어 Kv9.2 포함 채널은 인간 진핵성 신장 293(HEK293) 세포 또는 점착성 CHO 세포에서 발현된다. 발현을 최대화하기 위해 일반적으로 모든 5' 및 3' 비번역 구역(UTR)이 pCDN 또는 pCDNA3 벡터 내로의 삽입 전에 수용체 cDNA로부터 제거된다. 세포는 리포펙션(lipofection)에 의해 개체 cDNA으로 트랜스펙트되고 400 mg/ml G418의 존재하에서 선택된다. 선택 3주 후 개체 클론이 채취되고 또다른 분석을 위해 확장된다. 벡터 단독으로 트랜스펙트된 HEK293 또는 CHO 세포는 음성 대조군으로 작용한다. 개체 이온 채널을 안정하게 발현하는 세포주를 분리하기 위해 일반적으로 약 24개 클론이 선택되고 노던 블럿 분석에 의해 분석된다. 채널 mRNA는 일반적으로 분석된 G4-18-저항성 클론의 약 50%로 검출 가능하다.
또한 인간 인공 염색체(HAC)는 플라스미드 내에서 포함되고 발현될 수 있는 것보다 더 큰 DNA 단편을 전달하는데 이용된다. 약 6∼10 kb의 HAC가 구축되고 치료를 목적으로 통상의 전달 방법(리포솜, 다양이온 아미노 폴리머 또는 소포)을 통해 전달된다.
또한 특이적 개시 신호는 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열의 더욱 효율적인 번역을 달성하는데 사용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우 추가적인 전사 또는 번역 조절 신호는 필요하지 않다. 그러나 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 안전하게 하기 위해 정확한 리딩 프레임 내에 존재해야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원이고 자연적 및 합성적인 것 모두가 된다. 발현의 효율은 문헌에서 기술된 바와 같이 사용된 특정 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 형태로 발현된 단백질을 처리하는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 분열시키는 후-번역 처리도 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 촉진시키는데 사용된다. 후-번역 활성에 대한 특이적 세포 가동기구 및 특성적 메커니즘을 지닌 다른 숙주 세포(즉, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)는 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)로부터 구입 가능하고 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 안전하게 하도록 선택된다.
재조합 단백질의 장기간의 높은 수율 제조를 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 Kv9.2 상동성 또는 이형성 이온 채널을 안정하게 발현하는 것이 가능한 세포주는 동일하거나 별개의 벡터 상에 복제의 바이러스 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택성 배지로 교체되지 전 영양강화 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택 가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환 세포주를 회수하는데 사용된다. 이들은 각각 tk- 또는 arp- 세포에서 사용될 수 있는 단순포진바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택에 대한 근거로서 사용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉세이트(methotrexate)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)에 저항성을 부여하고; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노스티신(phosphinotricin) 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 예를 들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD와 같은 추가적인 선택 가능한 유전자가 기술되었다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 시각적으로 표시되는 마커의 이용이 대중적이 되고 있다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 의한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 목적 유전자도 존재함을 나타내더라도 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입된 경우 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열을 포함한 형질전환 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열과 일렬로 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 일반적으로 일렬 유전자의 발현을 나타낸다.
대안으로 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 핵산 서열을 포함하고 Kv9.2 서브유니트를 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 처리에 의해 확인된다. 이들 처리는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화에 대한 멤브레인, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 단백질 생물학적 검정 또는 면역측정 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 프로브 또는 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 단편들을 이용한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 또는 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석은 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위한 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열을 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
단백질에 대해 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 사용한 Kv9.2 서브유니트의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소면역측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광표지세포세포분리(FACS)를 포함한다. Kv9.2 서브유니트 상에 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론-기반 면역측정법이 바람직하나 경합성결합분석법도 이용된다. 이들 및 다른 분석은 예를 들어 Hampton, R. et al.(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 Maddox, D. E. et al.(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)과 같이 당분야에 잘 알려져 있다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용된다. Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리디제이션 또는 PCR 프로브의 제조 방법은 올리고표지, 틈(nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 제조용 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고 통상적으로 구입 가능하고 T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용된다. 이들 처리는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), GE Healthcare(UK) 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 구입된 것과 같은 다양한 통상적으로 구입 가능한 키트를 사용하여 수행된다. 검출에 용이하게 이용되는 적당한 수용체 분자 또는 표지는 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 핵원체뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터의 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환 세포에 의해 생성된 단백질은 세포막에 위치하고 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내적으로 분비되거나 포함된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 Kv9.2 서브유니트의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구성은 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩타이드 도메인을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시키는데 이용된다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash)에 사용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제 도메인과 Kv9.2 서브유니트 인코딩 서열 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 분열가능 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 촉진시키는데 이용된다. 이러한 발현 벡터는 타이오레독신 또는 엔테로키나제 분열 사이트 바로 앞에 Kv9.2 서브유니트 및 6개 히스티딘 잔기를 인코드하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상에서의 정제를 촉진시키고, 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 Kv9.2 서브유니트의 정제 방법을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에 제공되어 있다.
Kv9.2 서브유니트의 단편은 재조합 제조뿐만 아니라 고형상 기술을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 제조된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화된 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. Kv9.2 서브유니트의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
생체센서
Kv9.2 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 생체센서로서(또는 그의 제조에) 유용하다.
Aizawa (1988), Anal. Chem. Symp. 17: 683에 따라 생체센서는 예를 들어 고정된 항체 또는 Kv9.2와 같은 채널을 지닌 선택층과 같은 분자 인식용 수용체 및 측정된 수치를 전송하기 위한 변환기의 특정한 결합으로 한정된다. 일군의 이러한 생체센서는 수용체의 주변 매체와의 상호작용에 의한 표면층의 광학적 성질에 기인한 변화를 감지할 것이다. 이러한 기술 중에서 특히 엘립소-메트리(ellipso-metry) 및 표면 플라스몬 공명이 논의된다. Kv9.2를 도입시킨 생체센서는 Kv9.2 리간드의 존재 또는 수치를 검출하는데 사용된다. 이러한 생체센서의 구축은 당분야에 잘 알려져 있다.
따라서 Kv9.2를 발현하는 세포주는 [3H]이노시톨 포스페이트 또는 다른 2차 메신저의 수용체-촉진 형성을 통한 ATP와 같은 리간드의 검출을 위한 수용체 시스템으로서 사용된다(Watt et al., 1998, J Biol Chem May 29;273(22):14053-8). 또한 수용체-리간드 생체센서는 Hoffman et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A Oct 10;97(21):11215-20에 기술되어 있다. 또한 Kv9.2를 포함한 광학적 및 다른 생체센서는 예를 들어 Figler et al, 1997, Biochemistry Dec 23;36(51):16288-99 및 Sarrio et al., 2000, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(14):5164-74)에 기술된 바와 같이 G-단백질 및 다른 단백질과의 상호작용의 수준 또는 존재를 검출하는데 사용된다. 생체센서용 센서 유니트는 예를 들어 미국특허 제5,492,840호에 기술되어 있다.
선별 분석
천연 또는 재조합에 관계없이 상동체, 변이체 및 유도체를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드는 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널에 결합하고 Kv9.2의 활성화를 활성화시키거나(작용제) 억제하는(길항제 또는 차단제) 화합물의 선별 방법에 사용된다. 따라서 이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 세포, 무-세포 제제, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물 내의 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용된다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 또는 리간드이거나 구조적 또는 기능적 모방물질이다. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991) 참조.
Kv9.2 이온 채널 폴리펩타이드는 많은 병리학을 포함한 많은 생물학적 기능에 중요하다. 따라서 한편으로는 Kv9.2 포함 이온 채널을 자극하고 다른 한편으로는 Kv9.2 이온 채널의 기능을 억제할 수 있는 화합물 및 약물을 발견하는 것이 바람직하다. 일반적으로 작용제 및 길항제는 불안, 스트레스, 우울증 또는 당뇨병과 같은 이상에 대한 치료 또는 예방 목적으로 사용된다.
Kv9.2 이온 채널 단백질과 상호작용하는 것이 가능한 후보 화합물의 추론적 고안은 폴리펩타이드의 분자 형태의 구조적 연구에 기반한다. 어떤 사이트가 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 여부를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 구조 측정 즉, X-선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 어떤 아미노산 잔기가 분자적 접촉 구역을 형성하는지에 대한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조적 측정의 상세한 설명을 위해 Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York 참조.
추론적 고안의 대안으로 일반적으로 표면 상에 Kv9.2 이온 채널 폴리펩타이드를 발현하는 적당한 세포를 생성하는 단계를 포함한 선별 절차를 이용하는 것이다. 이러한 세포는 동물, 효모, 초파리(Drosophila) 또는 E. coli 유래의 세포를 포함한다. 이후 Kv9.2를 발현하는 세포(또는 발현된 단백질을 함유하는 세포막)는 결합 또는 기능적 반응의 자극 또는 억제를 관찰하기 위해 시험 화합물에 접촉된다. 예를 들어 하기 상세히 설명된 바와 같이 제노푸스 난모세포는 Kv9.2 mRNA 또는 폴리펩타이드이 주입되고 시험 화합물로의 노출에 의해 유도된 전류는 전압 클램프를 사용하여 측정된다.
Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널로 각각의 후보 화합물을 개별적으로 시험하는 대신 후보 리간드의 라이브러리 또는 뱅크가 유리하게 제조되고 선별된다. 따라서 예를 들어 200개 이상의 추정 리간드의 뱅크가 선별을 위해 수집되었다. 상기 뱅크는 이온 채널을 통해 작용하는 것으로 알려진 전달물, 호르몬 및 케모카인; 이온 채널에 대한 추정 작용제인 자연 발생적 화합물, 포유류 대응물이 아직 확인되지 않은 비-포유류 생물학적 활성 펩타이드; 및 자연상태에서 발견되지 않으나 알려지지 않은 천연 리간드로 이온 채널을 활성화시키는 화합물을 포함한다.
이러한 뱅크는 다른 문헌에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 기능적 분석(즉, Rb 유동 분석, FRET 분석, FLIPR 분석, 전체 세포 전기생리학, 난모세포 전기생리학 등) 뿐만 아니라 결합 분석을 이용하여 알려진 리간드에 대해 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널을 선별하는데 사용된다. 그러나 아직 동족 활성화 리간드(작용제) 또는 불활성화 리간드(길항제)가 없는 것으로 남아 있는 많은 포유류 수용체가 존재한다. 따라서 이들 수용체에 대한 활성화 리간드는 현재 확인된 리간드 뱅크 내에 포함되지 않는다. 따라서 Kv9.2도 천연 리간드를 확인하기 위해 조직 추출물에 대해 기능적으로 선별된다(난모세포 전기생리학 등을 이용, 기능적 선별). 양성 기능적 반응을 생성하는 추출물은 활성화 리간드가 분리되고 확인될 때까지 여기서 기술된 바와 같이 분석되는 분획으로 연속적으로 하위분획화될 수 있다.
또다른 방법은 Kv9.2 포함 이온 채널의 억제 또는 자극을 측정함으로서 이온 채널 억제제를 선별하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 세포 표면 상에 이온 채널을 발현하기 위해 등가상가유전성 채널을 형성하도록 Kv9.2 서브유니트 단독으로 또는 이가상가유전성 채널을 형성하도록 다른 Kv 채널 서브유니트로 진핵세포를 트랜스펙트하는 단계를 포함한다. 이후 세포는 Kv9.2 포함 이온 채널의 존재 하에 잠재적인 길항제에 노출된다. 세포는 전도성 또는 전류의 동력학 상의 변화를 측정하기 위해 전체 세포 전기생리학을 이용하여 시험될 수 있다.
Kv9.2의 작용제 또는 길항제를 검출하기 위한 또다른 방법은 참고문헌에 포함된 미국특허 제5,482,835호에 기술된 효모 기반 기술이다.
바람직한 실시태양에서 선별은 Kv9.2의 작용제 및 길항제를 선별하기 위해 전도성의 변화의 검출을 이용한다. 특히 본 발명자는 Kv9.2의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 전도성을 저하시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 전도성은 Kv9.2의 길항제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 저하된다. 바람직하게는 전도성은 Kv9.2의 길항제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 Kv9.2의 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 전도성을 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 전도성은 Kv9.2의 작용제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다. 바람직하게는 전도성은 Kv9.2의 작용제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 증가된다.
또다른 바람직한 실시태양에서 선별은 Kv9.2의 작용제 및 길항제를 선별하기 위해 방사성 동위원소 표지된 Rb 유동, 바람직하게는 % Rb 유출 변화의 검출을 이용한다. 바람직하게는 선별은 상기에 나타난 바와 같이 "Kv9.2의 기능적 분석(Rb 유동)"하에서 기능 분석을 이용한다.
특히 본 발명자는 Kv9.2의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 % Rb 유출을 저하시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 % Rb 유출은 Kv9.2의 길항제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 Kv9.2의 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 % Rb 유출을 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 % Rb 유출은 Kv9.2의 작용제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다.
후보 화합물이 단백질, 특히 항체 또는 펩타이드인 경우 후보 화합물의 라이브러리는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선별된다. 파지 디스플레이는 재조합 박테리오파지를 이용하는 분자적 선별 프로토콜이다. 본 기술은 후보 화합물의 라이브러리로부터의 하나의 화합물을 인코드하는 유전자로 박테리오파지를 형질전환시켜 각각의 파지 또는 파지미드가 특정 후보 화합물을 발현하게 하는 단계를 포함한다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 지지대에 고정된)는 적당한 후보 화합물을 발현하고 그의 파지 외부 상에 이를 디스플레이한다. Kv9.2 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 결합하는 것이 가능한 특정 후보 화합물은 친화성 상호작용에 기반한 선택 전략에 의해 강화된다. 이후 성공적인 후보 약제가 특성화된다. 파지 디스플레이는 표준 친화성 리간드 선별 기술보다 유리하다. 파지 표면은 그의 자연 발생적 입체형태와 더욱 밀접하게 유사한 3차원 입체형태로 후보 약제를 디스플레이한다. 이는 선별 목적에 있어서 더욱 특이적이고 더욱 높은 친화성 결합을 가능하게 한다.
화합물 라이브러리를 선별하는 또다른 방법은 화합물 라이브러리를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 이러한 생존 가능하거나 고정된 형태의 세포는 표준 결합-파트너 분석에 사용될 수 있다. 세포 반응을 검출하는 민감성 반응을 기술한 Parce et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87;4007-4011을 참조. 화합물 라이브러리를 발현하는 세포가 125I-항체와 같은 Kv9.2 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려진 표지된 항체 및 결합 조성물에 대한 결합 친화력이 측정된 후보 화합물과 같은 시험 표본과 접촉되거나 인큐베이트되는 경우 경합 분석은 특히 유용하다. 이후 상기 폴리펩타이드에 대해 결합되고 자유 표지된 결합 파트너가 분리되어 결합 정도를 평가한다. 결합된 시험 표본의 양은 폴리펩타이드에 결합한 표지된 항체의 양에 역비례한다.
많은 기술 중 어느 하나도 결합 정도를 평가하기 위해 자유 결합 파트너로부터 결합된 것을 분리시키는데 이용될 수 있다. 이러한 분리 단계는 일반적으로 필터로의 부착 후 세척, 플라스틱으로의 부착 후 세척 또는 세포막의 원심분리와 같은 처리를 포함한다.
또다른 접근은 예를 들어 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포로부터 추출된 용해되고 정제되지 않거나 용해되고 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 능력 및 높은 약물 시험 작업 처리량의 이점으로 "분자적" 결합 분석을 가능하게 한다.
후보 화합물 선별을 위한 또다른 기술은 적당한 즉, Kv9.2 폴리펩타이드에 대한 결합 친화성을 지닌 신규한 화합물에 대한 높은 처리 작업량의 선별을 제공하는 접근을 포함하고, 1984년 9월 13일 공보된 국제특허출원 WO 84/03564(Commonwealth Serum Labs.)에 상세히 기술되어 있다. 먼저, 많은 다른 작은 펩타이드 시험 화합물이 고형 기질 즉, 플라스틱 핀 또는 일부 다른 적당한 표면 상에서 합성된다; Fodor et al.(1991) 참조. 이후 모든 핀은 합성된 Kv9.2 폴리펩타이드와 반응되고 세척된다. 다음 단계는 결합된 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함한다. 따라서 상기 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 화합물이 확인될 것이다.
리간드 결합 분석은 약물학의 직접적인 확인 방법을 제공하고 높은 작업 처리량 포맷으로 개조 가능하다. 정제된 리간드는 결합 조사를 위해 높은 특이적 활성(50∼2000 Ci/mmol)으로 방사선표지된다. 이후 방사선표지 과정이 그의 타겟에 대한 리간드 활성을 감소시키지 않도록 측정이 이루어진다. 완충액, 이온, pH 및 뉴클레오타이드와 같은 다른 조절제에 대한 분석 조건은 멤브레인과 전체 세포 수용체 또는 이온 채널 근원에 대한 잡음 비율에 대한 작업 가능한 신호를 수립하도록 최적화된다. 이들 분석을 위해 특정한 결합은 총 결합 방사성에서 과도한 표지되지 않은 경합 리간드의 존재시 측정된 방사성을 감하는 것으로 한정된다. 가능한 경우 하나 이상의 경합 리간드가 잔여 비특이적 결합을 한정하는데 사용된다.
분석은 수용체 또는 이온 채널을 지닌 세포에 대한 부착이 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 후보 화합물의 간단한 결합 시험이거나 다른 분석의 경우 표지된 경쟁자와 경합시키는 단계를 포함한다. 또한 이들 분석은 그의 표면에서 타겟을 지닌 세포에 적당한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 타겟의 활성에 의해 생성된 신호를 유발하는지 여부를 시험한다. 활성화 억제제는 일반적으로 알려진 길항제의 존재시 분석되고 후보 화합물의 존재시 작용제에 의한 활성화의 효과가 관찰된다.
또한 분석은 후보 화합물을 Kv9.2 폴리펩타이드를 포함한 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계, 혼합물 내의 Kv9.2 포함 이온 채널 활성을 측정하는 단계 및 혼합물의 Kv9.2 이온 채널 활성을 표준물질과 비교하는 단계를 간단하게 포함한다.
또한 Kv9.2 서브유니트 cDNA, 단백질, 단백질에 대한 항체는 세포 내 Kv9.2 서브유니트 mRNA 및 단백질의 생성 상의 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 방법을 형성하는데 사용된다. 예를 들어 당분야에 알려진 표분 방법에 의해 단일클론 및 폴리클론 항체를 이용하여 Kv9.2 서브유니트 단백질의 분비 수치 또는 세포 결합 수치를 측정하기 위해 ELISA가 구축되고, 이는 적당하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 Kv9.2 서브유니트의 생성을 억제하거나 증가시키는 약제(또한 각각 길항제 또는 작용제로 명명됨)를 발견하는데 이용될 수 있다. 선별 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 당분야에서 잘 이해된다.
잠재적 Kv9.2 이온 채널 길항제 및 차단제의 예는 항체 또는 일부의 경우 퓨린 및 퓨린 아날로그를 포함한 뉴클레오타이드 및 그의 아날로그, Kv9.2 포함 이온 채널의 리간드와 밀접하게 관련된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 즉, 리간드의 단편 또는 이온 채널에 결합하나 반응을 유도하지 않아서 채널의 활성이 방지되는 소분자를 포함한다.
따라서 본 발명자는 Kv9.2 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물을 제공한다.
"화합물"이라는 용어는 생물학적 대분자(즉, 핵산, 단백질, 비-펩타이드 또는 유기 분자)와 같은 화학적 화합물(자연 발생적 또는 합성) 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유류)의 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 제조된 추출물 또는 무기 원소 또는 분자를 나타낸다. 바람직하게는 화합물은 항체이다.
이러한 선별이 수행되는데 필요한 물질은 선별 키트로 포장된다. 이러한 선별 키트는 Kv9.2 폴리펩타이드 또는 Kv9.2 이온 채널 폴리펩타이드의 생성을 감소시키거나 증가시키는 화합물에 대한 작용제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소 등을 확인하는데 유용하다. 선별 키트는: (a) Kv9.2 폴리펩타이드; (b) Kv9.2 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포; (c) Kv9.2 폴리펩타이드를 발현하는 세포막; 또는 (d) Kv9.2 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다. 선별 키트는 선택적으로는 사용 지침을 포함한다.
형질전환 동물
또한 본 발명자는 정상적인 발현 수준과 비교시 정상적이거나 증가되거나 감소된 수준으로 천연 또는 재조합 Kv9.2 서브유니트 및/또는 Kv9.2 포함 이온 채널 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 발현하는 것이 가능한 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 형질전환 동물은 돼지, 양 또는 설치류와 같은 비-인간 포유류이다. 가장 바람직하게는 형질전환 동물은 마우스 또는 래트이다.
본 발명자는 고유의 Kv9.2 유전자의 전부 또는 일부가 또다른 생물체로부터의 Kv9.2 서열로 대치된 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 생물체는 또다른 종, 가장 바람직하게는 인간이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 전체 Kv9.2 유전자가 인간 Kv9.2 유전자로 실질적으로 대치된 마우스를 개시한다. 이러한 형질전환 동물뿐만 아니라 Kv9.2에 대한 야생형 동물이 Kv9.2 작용제 및/또는 길항제를 선별하는데 이용된다.
예를 들어 이러한 분석은 야생형 또는 형질전환 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 형질전환 동물의 세포, 조직 또는 기관을 후보 물질에 노출시키는 단계 및 통증 및 스트레스와 같은 Kv9.2 관련 표현형을 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 동력학 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다.
또한 본 발명자는 본 출원서에 개시된 Kv9.2의 하나 이상의 기능이 부분적으로 또는 전체적으로 제거된, 기능적으로 분열된 Kv9.2 유전자를 포함한 형질전환 동물을 개시한다. Kv9.2 유전자의 결실을 포함한 하나 이상의 돌연변이 기능 손실의 결과로 기능적 Kv9.2 포함 이온 채널을 발현하지 않는 형질전환 동물("Kv9.2 넉아웃")이 포함된다.
또한 예를 들어 Kv9.2 유전자의 선택된 부분이 결실된 일부 기능-손실 돌연변이체 즉, 불완전 넉아웃이 포함된다. 이러한 동물은 예를 들어 기능적으로 중요한 단백질 도메인과 같은 Kv9.2 서열의 관련 부분을 선택적으로 대치하거나 결실함으로서 생성된다.
이러한 기능의 완전 또는 일부 손실 돌연변이체는 Kv9.2 관련 질환, 특히 통증 또는 스트레스 관련 질환을 위한 모델로서 유용하다. 일부-기능-손실을 나타내는 동물은 후보 물질에 노출되어 표현형을 증가시키는 즉, 통각감퇴 또는 관찰되는 스트레스 수준 표현형의 감소를 증가시키는(Kv9.2의 경우) 물질을 확인한다. 또한 전도성 감소 또는 세포내 칼슘 수준의 감소와 같은 다른 파라미터는 본 출원서에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
또한 일부 및 완전 넉아웃은 Kv9.2의 선택적 작용제 및/또는 길항제를 확인하는데 이용된다. 예를 들어 작용제 및/또는 길항제는 야생형 및 Kv9.2 결함 동물(넉아웃)에 투여된다. Kv9.2의 선택적 작용제 및/또는 길항제는 야생형 동물에는 효과적이나 Kv9.2 결함 동물에는 그렇지 않은지에 대해 관찰될 것이다. 더욱 상세하게는 Kv9.2 포함 이온 채널의 부재시 생리적 반응을 생성하는지 여부를 측정하기 위해 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)을 평가하도록 특정 분석이 고안된다. 이는 상기 기술된 바와 같이 형질전환 동물에 약물을 투여한 후 특정 반응에 대해 동물을 분석함으로서 달성된다. 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 동력학 상의 효과를 분석하는 유사한 세포-기반 방법도 수행된다. 또한 이러한 동물은 본 출원서에 기술된 선별에 의해 확인된 약물의 효능을 시험하는데 이용된다.
또다른 실시태양에서 일부 기능-손실 표현형을 지닌 형질전환 동물이 선별을 위해 이용된다. 이러한 실시태양에서 선별은 야생형 표현형으로의 일부 또는 완전 복구 또는 복귀에 대해 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 동력학 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다. 이와 같이 가능한 것으로 판별된 후보 화합물은 Kv9.2 작용제 또는 아날로그로 간주될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 통증과 같은 자극에 대한 민감도를 복구시키거나 증가시키고 또는 개체 내 스트레스를 증가시키는데 사용된다.
바람직한 실시태양에서 형질전환 Kv9.2 동물, 특히 Kv9.2 넉아웃(완전 기능 손실)은 실시예에 나타난, 바람직하게는 여기에 나타난 시험에 의해 측정된 표현형을 나타낸다. 따라서 Kv9.2 동물, 특히 Kv9.2 넉아웃은 바람직하게는 하나 이상의 하기를 나타낸다: 감소된 혈당 수치, 증가된 불안.
매우 바람직한 실시태양에서 형질전환 Kv9.2 동물, 특히 Kv9.2 넉아웃은 상응하는 야생형 마우스와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상 더 높거나 더 낮은 측정된 파라미터를 나타낸다. 따라서 예를 들어 실시예에 나타난 오픈 필드 분석으로 측정시 Kv9.2 결함 마우스는 바람직하게는 야생형 마우스와 비교시 통계적으로 증가된 부동성 또는 감소된 보행 시간 및/또는 증가된 주변구역 불변 시간을 지닌다. 총 이동 거리의 감소도 나타났다.
Kv9.2의 기능-손실에 대한 유사한 효과를 유발하는 화합물을 검출하기 위해 Kv9.2 결함 형질전환 동물에 대해 현재 개시된 표현형이 야생형 동물을 이용한 선별에 유용하게 이용됨이 명백해질 것이다. 즉, Kv9.2 기능의 조절제 특히 길항제를 확인하기 위해 야생형 동물이 후보 화합물에 노출되고 불안 수준, 혈당 수치 등과 같은 Kv9.2 관련 표현형 상의 변화가 관찰된다. 또한 전도성의 감소 또는 동력학 상의 변화 또는 감소와 같은 세포성 표현형이 본 출원서 내에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
이러한 선별에 의해 확인된 화합물은 특히 Kv9.2 관련 질환의 치료 또는 경감을 위해 Kv9.2의 길항제 즉, 진통제 또는 스트레스 경감제로서 사용될 수 있다.
상기 기술된 선별은 행동적, 생리적 또는 생화학적 반응과 같은 적당한 파라미터의 관찰을 포함한다. 바람직한 반응은 생리적 반응을 포함하고 하나 이상의 하기를 포함한다: 질병 저항성 변화; 변화된 염증성 반응; 변화된 종양 감수성; 혈압 변화; 신혈관생성; 식이 행동 변화; 체중 변화; 골밀도 변화; 체온 변화; 인슐린 분비; 식샘자극호르몬 분비; 비강 및 기관지 분비; 혈관수축; 기억 상실; 불안; 변화된 불안 상태; 반사감퇴 또는 반사이상항진; 통증 또는 스트레스 반응.
또한 전도성 또는 동력학 상의 변화와 같은 생화학적 파라미터가 이용된다. 바람직하게는 전도성은 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정되고 동력학(활성화 및/또는 비활성화 시간, 바람직하게는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간 상수)은 해당 섹션에 기술된 바와 같이 측정된다. 이는 세포-기반 선별에 특히 유용하다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 작용제에 노출된 세포의 전도성(예를 들어 야생형 또는 일부 기능-상실 세포)은 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 +30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상까지 증가된다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 작용제에 노출된 세포(예를 들어 야생형 또는 일부 기능-상실 세포)의 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간, 바람직하게는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간 상수는 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 +30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상까지 증가된다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 작용제에 노출된 야생형 또는 Kv9.2 일부 넉아웃 동물의 혈당 수치는 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 +30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상까지 증가된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2의 길항제는 이러한 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-상실 동물이 적어도 부분적으로 Kv9.2 일부 또는 완전 기능-상실 돌연변이체와 적어도 일부 표현형 동일성을 나타내게 한다. 즉, 바람직한 길항제는 불안의 증가, 혈당 수치의 감소 또는 전도성 감소 또는 동력학의 변화 또는 감소 또는 상기의 결합을 유발하는 것이다. 바람직하게는 관련된 표현형은 Kv9.2 넉-아웃 동물과 동일한 정도로 발현된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 전도성은 Kv9.2 결함 세포의 전도성의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 동력학 즉, 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간, 바람직하게는 활성화 시간 및/또는 비활성화 시간 상수는 Kv9.2 결함 세포의 동력학(또는 관련 시간)의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "Kv9.2(전기생리학)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 Kv9.2 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 혈당 수치는 Kv9.2 결함 형질전환 동물의 혈당 수치의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다.
Kv9.2 넉아웃 동물 유래의 조직은 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)이 Kv9.2에 결합하는지 여부를 측정하기 위한 결합 분석에 사용된다. 이러한 분석은 Kv9.2 포함 이온 채널 제조시 결함이 있도록 설계된 형질전환 동물로부터 첫 번째 이온 채널 제제를 수득하고 어떠한 확인된 Kv9.2 리간드 또는 화합물에 결합하는 것으로 알려진 원료로부터 두 번째 이온 채널 제제를 수득함으로서 수행될 수 있다. 일반적으로 첫 번째 및 두 번째 이온 채널 제제는 수득되는 원료를 제외하고 모든 면에서 유사할 것이다. 예를 들어 형질전환 동물로부터의 뇌 조직(상기 및 하기 기술된 바와 같은)이 분석에 사용되는 경우 정상(야생형) 동물로부터의 비교 가능한 뇌 조직은 두 번째 이온 채널 제제의 원료로서 사용된다. 각각의 이온 채널 제제는 단독 및 후보 리간드 또는 화합물의 존재시 모두에 대해 Kv9.2 포함 이온 채널에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 인큐베이트된다. 바람직하게는 후보 리간드 또는 화합물은 일부 다른 농도에서 조사될 것이다.
알려진 리간드에 의한 결합이 시험 화합물에 의해 표시되는 정도는 첫 번째 및 두 번째 이온 채널 제제 모두에 대해 측정된다. 형질전환 동물 유래의 조직은 분석에 직접 사용되거나 조직은 그 자체로 분석에 사용되는 막 또는 막 단백질을 분리하도록 처리된다. 바람직한 형질전환 동물은 마우스이다. 리간드는 결합 분석에 적합한 방법을 이용하여 표지된다. 이는 방사선, 효소, 형광 또는 화학발광 표지(뿐만 아니라 상기 더욱 상세히 설명된 다른 표지 기술)를 포함하나 한정적인 것은 아니다.
더욱이 Kv9.2 또는 Kv9.2 포함 이온 채널의 길항제는 후보 화합물 등을 기능적 Kv9.2을 발현하는 동물 및 Kv9.2 기능의 감소되거나 제거된 발현과 관련된 표현형적 특성을 나타내는 것으로 확인된 동물에 투여함으로서 확인된다.
비-인간 형질전환 동물을 생성하는 상세한 방법은 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 형질전환 유전자 컨스트럭트는 동물의 생식계 내로 도입되어 형질전환 포유류를 생성할 수 있다. 예를 들어 하나 또는 일부의 컨스트럭트 카피가 표준 형질전환 기술에 의해 포유류 배아의 게놈 내로 도입된다.
예시적 실시태양에서 형질전환 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식계 내로 트랜스유전자를 도입시킴으로서 생성된다. 다양한 발달 단계의 배아성 타겟 세포는 트랜스유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배아성 타겟 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법이 이용된다. 동물의 특정 계통(들)이 일반적인 우수한 건강, 우수한 배아 산출량, 우수한 배아내 전핵 가시도 및 우수한 재생 적합성에 대해 선택된다. 더욱이 일배체형은 유의적인 인자이다.
트랜스유전자의 배아 내로의 도입은 예를 들어 현미주사, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션과 같은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 컨스트럭트 카피가 발달 포유류(들)의 세포 내에서 유지되게 하기 위해 포유류 수정란의 전핵 내로 컨스트럭트의 현미주사에 의해 Kv9.2 트랜스유전자가 포유류 내로 도입될 수 있다. 수정란 내로 트랜스유전자 컨스트럭트의 도입 후 수정란은 다양한 시간 동안 시험관 내에서 인큐베이트되거나 대리 숙주 내로 재이식되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 시험관 내의 성숙을 위한 인큐베이션도 수행된다. 일반적인 하나의 방법에서 종에 따라 다르게 약 1∼7일간 시험관 내에서 배아를 인큐베이트한 후 대리 숙주 내로 이를 재이식한다.
형질전환적으로 조작된 배아의 자손은 조직 세그먼트의 서던 블럿 분석에 의해 컨스트럭트의 존재에 대해 시험되었다. 하나 이상의 외인성 클론된 컨스트럭트 카피가 이러한 형질전환 배아의 게놈 내로 안정하게 도입되어 유지되는 경우 형질전환적으로 첨가된 컨스트럭트를 지닌 영구적 형질전환 포유류 계통을 수립하는 것이 가능하다.
형질전환적으로 변화된 포유류 자손은 자손의 게놈 내로의 컨스트럭트 도입에 대해 출생 후 분석되었다. 바람직하게는 이러한 분석은 자손으로부터의 염색체 물질 상에 원하는 재조합 단백질 생성물 또는 그의 세그먼트를 코드하는 DNA 서열에 상응하는 프로브를 하이브리다이즈함으로서 달성된다. 그의 게놈 내에 적어도 하나 이상의 컨스트럭트 카피를 포함한 것으로 나타난 이들 포유류 자손은 생장하여 성숙된다.
본 출원서의 목적으로, 접합자는 완전한 생물체 내로 발달하는 것이 가능한 이배체 세포의 형태이다. 일반적으로 접합자는 생식세포 또는 생식세포들로부터의 2개의 반수체 핵의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함한 난으로 구성될 것이다. 따라서 생식세포 핵은 자연적으로 적합한 것 즉, 분화를 착수하고 기능적 생물체로 발달하는 것이 가능한 생존 가능한 접합자를 유발하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수체 접합자가 바람직하다. 이수배수체 접합자가 수득되는 경우 염색체 수는 기원된 생식세포 생물체의 정배수체 수에 있어서 하나 이상까지 차이가 나지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 더하여 물리적인 고찰도 접합자의 핵 또는 접합자 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양(즉, 부피)을 제어한다. 어떠한 유전 물질도 제거되지 않은 경우 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 분열되지 않고 흡수되는 양으로 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가의 물리적 효과는 접합자의 생존율을 물리적으로 분열시키는 정도로 크지 않아야 한다. 수득되는 접합자의 외인성 유전 물질을 포함한 유전 물질은 접합자의 기능적 생물체로의 분화 및 발달을 생물학적으로 개시하고 유지시키는 것이 가능하여야 하기 때문에 DNA 서열의 수 및 종류의 생물학적 제한 특정한 접합자 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라 달라질 것이고 당업자에게 용이하게 명백화될 것이다.
접합자에 첨가되는 트랜스유전자 컨스트럭트의 카피 수는 첨가되는 외인성 유전 물질의 총량에 따라 달라지고 유전적 형질전환을 발생하게 할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로는 하나의 카피만이 필요하다; 그러나 일반적으로 하나의 카피가 기능적임을 보증하기 위해 예를 들어 트랜스유전자 컨스트럭트의 1,000∼20,000개 카피와 같은 많은 카피가 사용된다. 외인성 DNA 서열의 표현형적 발현을 증가시키기 위해 삽입된 외인성 DNA 서열 각각의 하나 이상의 기능성 카피를 지니는 것이 종종 유리하다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전성 구조물을 파괴하지 않는 한 외인성 유전 물질의 핵 유전 물질 내로의 첨가를 가능하게 하는 어떠한 기술도 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 현미주사에 의해 핵 유전 물질 내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 현미주사는 알려져 있고 당분야에 이용된다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 달성된다. 일반적으로 대리 숙주가 마취되고 배아가 난관 내로 삽입된다. 특정 숙주 내로 이식된 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이나 일반적으로 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수에 비교 가능할 것이다.
대리 숙주의 형질전환 자손은 적당한 방법에 의해 트랜스유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 선별된다. 선별은 종종 적어도 일부의 트랜스유전자에 상보적인 프로브를 이용한 서던 블럿 또는 노던 블럿 분석에 의해 달성된다. 트랜스유전자에 의해 인코드되는 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석이 트랜스유전자 생성물의 존재에 대한 대안적 또는 추가적 선별 방법으로 이용된다. 일반적으로 DNA는 꼬리 조직으로부터 준비되고 트랜스유전자에 대한 서던 블럿 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안으로 어떠한 조직 또는 세포 형태도 본 분석에 사용되나 최대 수준으로 트랜스유전자를 발현하는 것으로 판단되는 조직 또는 세포가 서던 분석 또는 PCR을 이용하여 트랜스유전자의 존재 및 발현에 대해 시험된다.
트랜스유전자의 존재를 평가하는 대안적 또는 추가적 방법은 효소 및/또는 면역 분석과 같은 적당한 생화학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유속 세포분석 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 혈액 분석이 혈액 내 트랜스유전자 생성물의 존재를 검출할 뿐만 아니라 다양한 형태의 혈액 세포의 수준 및 다른 혈액 구성물 상의 트랜스유전자의 효과를 조사하는데 유용하다.
형질전환 동물의 자손은 적당한 파트너와의 형질전환 동물의 교미 또는 형질전환 동물로부터 수득된 난자 및/또는 정자의 시험관 내 수정에 의해 수득된다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우 파트너는 형질전환 및/또는 넉아웃이거나 그렇지않고; 형질전환인 경우 동일하거나 다른 트랜스유전자 또는 이 둘 모두를 포함한다. 대안으로 파트너는 모계이다. 시험관 내 수정이 이용되는 경우 수정된 배아는 대리 숙주 내로 이식되거나 시험관 내에서 인큐베이트되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 이들 방법을 이용하여 자손은 상기 기술된 방법 또는 다른 적당한 방법을 이용하여 트랜스유전자의 존재에 대해 조사된다.
여기서 기술된 방법에 따라 생성된 형질전환 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 상기 나타난 바와 같이 외인성 유전 물질은 특정한 실시태양에서 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널의 생성을 유발하는 DNA 서열이다. 또한 이러한 실시태양에서 서열은 바람직하게는 특정한 형태의 세포 내에서 트랜스유전자 생성물의 발현을 가능하게 하는 전사 조절 요소 즉, 프로모터에 부착될 것이다.
또한 레트로바이러스 감염이 비-인간 동물 내로 트랜스유전자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 발달하는 비-인간 배아는 시험관 내에서 배반포 단계로 배양될 수 있다. 이러한 기간 동안 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 타겟이 될 수 있다(Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 유효 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)). 트랜스유전자를 도입시키는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스유전자를 운반하는 복제-결함 레트로바이러스이다(Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스-생산 세포의 단일층 상에 할구를 배양함으로서 용이하고 효과적으로 수득된다((Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). 대안으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포가 포배강 내로 주입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 도입이 형질전환 비-인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조물질은 트랜스유전자의 모자이크가 될 것이다. 또한 시조물질은 일반적으로 자손에서 격리되는 게놈 내 다른 위치에서 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스성 삽입을 포함한다. 더욱이 미드게스테이션(midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 생식 계열 내로 트랜스유전자를 도입시키는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982) 상동).
트랜스유전자 도입을 위한 타겟 세포의 세 번째 형태는 배아줄기세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양되고 배아와 융합된 이식-전 배아로부터 수득된다(Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448). 트랜스유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 유효하게 도입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는 이후 비-인간 동물로부터의 배반포와 결합될 수 있다. 이후 ES 세포는 배아를 집락화하고 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다. Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474 참조.
또한 본 발명자는 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널 기능에 대한 모델로서 변화된 Kv9.2 유전자를 지님으로서 특성화된 비-인간 형질전환 동물 제공한다. 유전자의 변화는 결실 또는 기능 손실 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이화된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 도입, 다른 종으로부터의 외인성 유전자의 도입 또는 그의 결합을 포함한다. 형질전환 동물은 변이에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다. 이로부터 유래된 동물 및 세포는 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널 기능을 조절하는 생물학적으로 활성인 약제를 선별하는데 유용하다. 선별 방법은 혈당의 조절, 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항을 포함한 질환, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증의 치료 및 저혈당증의 치료, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는), 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증의 치료 및 불안, 불안장애, 불안-관련 행동 및 범불안장애, 공황장애, 광장공포증, 사회 공포증, 강박반응성 장애, 외상후 스트레스 장애, 급성 스트레스 장애 및 DSM-IV에 기입된 공황장애 및 우울증을 포함한 신경성 장애의 치료를 위한 잠재적 치료제의 특이성 및 작용을 측정하는데 특히 유용하다.
동물은 뇌, 심장, 비장 및 간과 같은 정상 조직 및 기관 내에서의 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널의 역할 및 그의 기능 상의 효과를 조사하는 모델로서 유용하다.
또다른 관점은 기능적으로 분열된 내인성 Kv9.2 유전자를 지니고 그의 게놈 내에서 운반되고 이형성 Kv9.2 단백질(즉, 또다른 종으로부터의 Kv9.2)를 인코드하는 트랜스유전자를 발현하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다. 바람직하게는 동물은 마우스이고 이형성 Kv9.2은 인간 Kv9.2이다. 인간 Kv9.2로 재구성된 동물 또는 이러한 동물 유래의 세포주는 생체 내 및 시험관 내에서 인간 Kv9.2을 억제하는 약제를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 인간 Kv9.2을 통해 신호전달을 유도하는 자극은 시험되는 약제의 존재 및 부재시 동물 또는 세포주에 투여될 수 있고, 동물 또는 세포주의 반응이 측정될 수 있다. 생체 내 및 시험관 내에서 인간 Kv9.2를 억제하는 약제는 약제의 부재시 반응 대비 약제의 존재시 반응을 감소시키는지에 따라 확인될 수 있다.
또한 본 발명자는 Kv9.2 결함 형질전환 비-인간 동물("Kv9.2 서브유니트 넉-아웃")을 제공한다. 이러한 동물은 바람직하게는 내인성 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널 게놈 서열이 분열되거나 결실됨으로서 저하되거나 전혀 없는 Kv9.2 서브유니트 또는 Kv9.2 포함 이온 채널 활성을 발현하는 것이다. 바람직하게는 이러한 동물은 이온 채널 활성을 발현하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 동물은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 Kv9.2 포함 이온 채널의 활성을 발현하지 않는다. Kv9.2 이온 채널 넉-아웃은 하기 더욱 상세히 기술된 바와 같이 당분야에 알려진 다양한 방법으로 생성된다.
또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 Kv9.2 유전자를 기능적으로 분열시키기 위한 핵산 컨스트럭트에 관한 것이다. 핵산 컨스트럭트는: a) 비-상동성 대치 부분; b) 첫 번째 Kv9.2 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지닌, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 c) 두 번째 Kv9.2 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연 발생적 내인성 Kv9.2 유전자 내의 첫 번째 Kv9.2 유전자의 다운스트림 위치를 지닌, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역. 더욱이 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입시 첫 번째 및 두 번째 상동성 구역은 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포 내 내인성 Kv9.2 유전자 사이의 상동적 재조합에 충분한 길이다. 바람직한 실시태양에서 비-상동성 대치 부분은 바람직하게는 lacZ 및 양성 선택 발현 카세트를 포함하고, 바람직하게는 조절 요소(들)에 실시 가능하게 결합되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한 발현 수용체를 포함한다.
바람직하게는 첫 번째 및 두 번째 Kv9.2 유전자 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체로부터 유래한다.
또다른 관점은 상기 기술된 핵산 컨스트럭트가 도입되는 재조합 벡터에 관한 것이다. 또다른 관점은 핵산 컨스트럭트가 도입되어 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포의 내인성 Kv9.2 유전자 사이의 상동적 재조합을 가능하게 하여 내인성 Kv9.2 유전자의 기능적 분열을 유발하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 간, 뇌, 비장 또는 심장 또는 마우스 배아줄기세포와 같은 다기능성 세포로부터의 Kv9.2를 정상적으로 발현하는 포유류 세포가 될 수 있다. 또한 핵산 컨스트럭트가 도입되고 내인성 Kv9.2 유전자로 상동적으로 재조합된 배아줄기세포의 발달은 배아줄기세포로부터 유전되고 따라서 그의 게놈 내에 Kv9.2 유전자를 운반하는 세포를 지닌 형질전환 비인간 동물을 생성한다. 이후 그의 생식 계열 내에 Kv9.2 유전자 분열을 운반하는 동물이 선택되고 모든 체세포 또는 생식 세포 내 Kv9.2 유전자 분열을 지닌 동물이 번식될 수 있다. 이후 이러한 마우스가 Kv9.2 유전자 분열에 대한 동형접합성으로 번식될 수 있다.
항체
본 출원서의 목적에 있어서, "항체"라는 용어는 상세한 기술이 없는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 단편은 타겟 물질에 대한 결합 활성을 보유한 전체 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')2 단편뿐만 아니라 단일 사슬 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질을 포함한다. 항체 및 그의 단편은 예를 들어 EP-A-23900에 기술된 바와 같은 인간화 항체이다. 더욱이 예를 들어 미국특허 제5,545,807호 및 6,075,181호에 기술된 바와 같이 전체 인간 변이가능 구역(또는 그의 단편)을 지니 항체도 이용된다. 중화 항체 즉, 아미노산 서열 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단제 및 치료제로서 특히 바람직하다.
항체는 면역법 또는 파지 디스플레이 라이브러리의 이용과 같은 표준 기술에 의해 생성된다.
폴리펩타이드 또는 펩타이드는 알려진 기술에 의해 항체를 발달시키는데 사용된다. 이러한 항체는 Kv9.2 단백질 또는 상동체, 단편 등에 특이적으로 결합하는 것이 가능하다.
폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 Kv9.2 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한 면역원성 조성물로 면역된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄과 같은 Freund 미네랄 겔 및 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루론산 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 전신 방어를 자극하는 목적으로 면역학적으로 절충된 개체에 투여되는 아미노산 서열 물질을 정제시 이용되는 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.
면역된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. Kv9.2 폴리펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 포함한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함하는 경우 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이러한 항체가 제조되기 위해서는 본 발명자는 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용하기 위한 또다른 아미노산 서열로 합텐화된(haptenised) Kv9.2의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 Kv9.2 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 항체가 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 영구적 항체-생성 세포주는 세포 융합 및 발암성 DNA로의 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 에브스타인-바 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체의 패널은 다양한 특성 즉, 동형 및 에피토프 친화성에 대해 선별될 수 있다.
단일클론 항체는 배양액 내 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술도 이용하여 제조된다. 이는 Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
더욱이 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위해 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술, 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454). 대안으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 설명된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정 단일 사슬 항체 물질을 생성하도록 개조될 수 있다.
Kv9.2 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 단일클론 항체 및 폴리클론 항체 모두 진단에 특히 유용하고, 중화된 것은 수동 면역화에 유용하다. 특히 단일클론 항체는 항-유전형 항체를 유발하는데 사용된다. 항-유전형 항체는 보호가 바람직한 물질 및/또는 약제의 "내부 이미지"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-유전형 항체를 유발하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이들 항-유전형 항체는 치료에도 유용하다.
또한 항체는 림프구 집단 내에서 생체 내 생성을 유도하거나 Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 Winter G and Milstein C(1991; Nature 349:293-299)에 개시된 매우 특이적 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 선별함으로서 생성된다.
또한 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이적 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리가 구축되어 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 한다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281).
또한 단일 사슬 항체의 생성 기술(미국특허 제4,946,778호)이 Kv9.2 폴리펩타이드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한 형질전환 마우스 또는 다른 포유류를 포함한 다른 생물체가 인간화 항체를 발현시키는데 사용된다.
상기-기술된 항체는 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하기 위해 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하기 위해 사용된다.
또한 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드에 대한 항체는 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항을 포함한 질환, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증의 치료 및 저혈당증, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는), 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증의 치료를 위해 혈당을 조절하는데 이용될 수 있다.
진단 분석
또한 본 발명은 진단 시약으로서의 진단 또는 유전자 분석에 이용하기 위한 Kv9.2 서브유니트 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 및 유도체)의 이용에 관한 것이다. 또한 Kv9.2 서브유니트 핵산에 상보적이거나 이에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 핵산(상동체, 변이체 및 유도체 포함)뿐만 아니라 Kv9.2 폴리펩타이드에 대한 항체가 이러한 분석에 유용하다.
기능장애와 관련된 Kv9.2 서브유니트 유전자의 돌연변이화된 형태의 검출은 Kv9.2 서브유니트의 저-발현, 과-발현 또는 변화된 발현으로부터 유발된 질병의 진단 또는 감수성의 진단에 첨가되거나 이를 한정할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. Kv9.2 서브유니트 유전자(대조군 서열을 포함) 내 돌연변이를 지닌 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출된다.
예를 들어 DNA는 환자로부터 분리되고 Kv9.2의 DNA 다형성 패턴이 측정된다. 확인된 패턴은 Kv9.2의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 대조군과 비교된다. 이후 Kv9.2 관련 질환과 관련된 유전자 다형성 패턴을 발현하는 환자가 확인된다. Kv9.2 서브유니트의 유전자 분석은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행된다. 예를 들어 개체는 RFLP 또는 SNP 분석 등에 의해 Kv9.2 대립유전자의 DNA 서열을 측정함으로서 선별된다. 환자는 Kv9.2에 대한 유전자 서열 또는 그의 발현을 조절하는 어떠한 서열 내 DNA 다형성의 존재를 검출함으로서 Kv9.2의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환에 대한 유전자 소인을 지닌 것으로 확인된다.
이후 이렇게 확인된 환자는 Kv9.2 관련 질환의 발생을 예방하도록 또는 더욱 적극적으로는 Kv9.2 관련 질환의 초기 단계에서 질환의 발생 또는 발달을 예방하도록 치료될 수 있다. Kv9.2 관련 질환은 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증 및 저혈당증, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는) 및 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증, 불안, 불안장애, 불안-관련 행동 및 범불안장애, 공황장애, 광장공포증, 사회 공포증, 강박반응성 장애, 외상후 스트레스 장애, 급성 스트레스 장애 및 DSM-IV에 기입된 공황장애 및 우울증을 포함한 신경성 장애를 포함한다.
또한 본 발명자는 Kv9.2 관련 질환과 관련된 환자의 유전자 다형성 패턴의 확인용 키트를 개시한다. 상기 키트는 DNA 표본 수집기 및 환자의 Kv9.2 관련 질환에 대한 감수성을 측정하기 위해 대조군 표본에 비교되는 유전자 다형성 패턴을 측정하는 기구를 포함한다. 또한 Kv9.2 폴리펩타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드(또는 그의 단편)에 대한 항체를 포함한 Kv9.2 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 생검 또는 부검 조직 물질과 같은 피험자의 세포로부터 수득된다. 바람직한 실시태양에서 DNA는 환자의 손가락을 찔러 흡수지 상에서 수집된 혈액으로부터 수집된 혈액 세포로부터 수집된다. 또다른 바람직한 실시태양에서 혈액은 AmpliCard.TM.(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF) 상에서 수집될 것이다.
DNA는 검출을 위해 직접적으로 이용되거나 분석 전 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용함으로서 효소적으로 증폭된다. 목적 유전자 내 특정 다형성 DNA 구역을 타겟하는 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머가 제조되어 타겟 서열의 PCR 반응 증폭이 달성되게 된다. 또한 RNA 또는 cDNA는 유사한 형태로 주형으로 사용된다. 이후 주형 DNA으로부터 증폭된 DNA 서열이 제한효소를 이용하여 분석되어 증폭된 서열 내에 존재하는 유전자 다형성을 측정하여 환자의 유전자 다형성 프로파일을 제공한다. 제한 단편 길이는 겔 분석에 의해 확인된다. 대안으로 또는 그와 결합하여 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 분석과 같은 기술이 이용된다.
결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교시 증폭된 생성물 크기 상의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 Kv9.2 서브유니트 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈시킴으로서 확인될 수 있다. 완벽하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 분해 온도 상의 차이에 의해 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 또한 DNA 서열 차이는 변성제와 함께 또는 변성제 없이 겔 내에서의 DNA 단편의 전기영동 이동 상의 변화 또는 직접적인 DNA 서열분석에 의해 검출된다. Myers et al, Science (1985)230:1242 참조. 특정 위치에서의 서열 변화는 RNAse 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 분열방법에 의해 판명된다. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401 참조. 또다른 실시태양에서 Kv9.2 서브유니트 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 포함한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이가 구축되어 유전자 돌연변이의 유효한 선별을 수행할 수 있게 한다. 어레이 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적인 적용 가능성을 지니고 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함한 다양한 분자유전학 상의 의문을 설명하는데 사용될 수 있다(예를 들어 M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996) 참조).
단일 나선 구조 다형성(SSCP)은 돌연변이와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동 상의 차이를 검출하는데 이용된다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, see also Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 표본 및 대조군 핵산의 단일-나선 DNA 단편은 변성되고 복원을 가능하게 한다. 단일-나선 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다르고 결과적인 전기영동 이동 상의 차이는 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편은 표지되거나, 표지된 프로브로 검출된다. 분석 민감도는 RNA(DNA 보다는)를 이용하여 증가되고, 2차 구조는 서열 변화에 더욱 민감하다. 바람직한 실시태양에서 주된 방법은 전기영동 이동 상의 변화를 기반으로 이중 나선 이질이중나선 분자를 분리하는 이질이중나선 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
진단 분석은 기술된 방법에 의한 Kv9.2 서브유니트 유전자 돌연변이의 검출을 통해 이러한 불안 또는 당뇨병과 같은 질환에 대한 감수성을 진단하거나 측정하는 방법을 제공한다.
Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드 및 핵산의 존재는 표본 내에서 검출된다. 따라서 상기 기입된 감염 및 질병은 피험자 유래의 표본으로부터 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준의 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드 또는 Kv9.2 서브유니트 mRNA를 측정하는 단계를 포함한 방법에 의해 진단될 수 있다. 표본은 증가되거나 감소되거나 비정상적인 Kv9.2 서브유니트 발현과 관련된 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체로부터의 세포 또는 조직 표본을 포함한다. 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체의 Kv9.2 발현 수준 또는 패턴은 질환의 진단에 의해 정상 생물체 내 발현 수준 또는 패턴과 유용하게 비교된다.
따라서 일반적으로 본 발명자는 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 표본을 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한 표본 내 Kv9.2 서브유니트 핵산을 포함한 핵산 존재의 검출 방법을 개시한다. 예를 들어 핵산 프로브는 Kv9.2 서브유니트 핵산 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하고 그 둘 사이의 결합이 검출되고; 복합체 자체의 존재도 검출된다. 더욱이 본 발명자는 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 항체에 세포 표본을 접촉시키고 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터함으로서 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이는 항체와 폴리펩타이드 사이에 형성된 복합체의 존재를 모니터하거나 폴리펩타이드와 항체 사이의 결합을 모니터함으로서 편리하게 달성된다. 두 실체 사이의 결합의 검출 방법은 당분야에 알려져 있고 FRET(형광 공명 에너지 전달), 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
감소되거나 증가된 발현은 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNAse 보호, 노던 블럿팅 및 다른 하이브리디제이션 방법과 같은 폴리뉴클레오타이드의 정량화를 위한 당분야에 잘 알려진 어떠한 방법을 이용하여도 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주 유래의 표본 내 Kv9.2 서브유니트와 같은 단백질 수준을 측정하는데 이용되는 분석 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석 방법은 방사면역측정법, 경합-반응분석, 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA 분석을 포함한다.
또한 본 발명자는 예를 들어 불안 또는 당뇨병과 질병(감염을 포함) 또는 이러한 질병에 대한 감수성용 진단 키트를 개시한다. 진단 키트는 Kv9.2 서브유니트 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편; 상보성 뉴클레오타이드 서열; Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다.
염색체 분석
또한 Kv9.2 뉴클레오타이드 서열은 염색체 확인에 유용하다. 상기 서열은 인간 개체 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 타겟되고 이와 하이브리다이즈할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 인간 Kv9.2 서브유니트는 호모 사피엔스 염색체 8q22에 지도화된 것으로 나타났다.
염색체로의 관련 서열의 지도화는 이들 서열을 유전자 관련 질환과 연관시키는 중요한 첫 번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 상호관련될 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어 V. McKusick, Mendelian heritance in Man(온라인 상의 Johns Hopkins University Welch Medical Library에서 이용 가능)에 나타나 있다. 이후 동일한 염색체 구역으로 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계는 계통 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인된다.
또한 영향 받은 개체와 영향 받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열 상의 차이가 측정될 수 있다. 돌연변이가 영향 받은 개체의 일부 또는 전부에서 관찰되나 정상 개체에서는 관찰되지 않는 경우 돌연변이는 질병의 유발 요인으로 간주된다.
예방 및 치료 방법
또한 본 발명자는 과도하고 불충분한 양의 Kv9.2 서브유니트 활성 모두에 관련한 비정상적 이상의 치료 방법을 제공한다.
Kv9.2 서브유니트 활성이 과도한 경우 일부 접근이 이용 가능하다. 하나의 접근은 상기 기술된 억제제 화합물(길항제)을 Kv9.2 서브유니트에 대한 리간드의 결합을 차단하거나 두 번째 신호를 억제하여 비정상적 이상을 완화시킴으로서 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 약제적으로 수용 가능한 담체와 함께 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 Kv9.2 서브유니트와 경합하는 리간드에 결합하는 것이 가능한 용해성 형태의 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드가 투여된다. 이러한 경합제의 일반적인 실시태양은 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드의 단편을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 Kv9.2 서브유니트를 인코드하는 유전자의 발현이 발현 차단 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 알려진 기술은 내부적으로 생성되거나 별도로 투여되는 안티센스 서열의 이용을 포함한다. 예를 들어 O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988) 참조. 대안으로 유전자와 함께 삼중 헬릭스를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 보충될 수 있다. Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360 참조. 이들 올리고머는 그 자체로 투여될 수 있거나 관련 올리고머가 생체 내에서 발현될 수 있다.
Kv9.2 서브유니트의 저-발현 및 그의 활성과 관련한 비정상적 이상을 치료하기 위해 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 Kv9.2 포함 이온 채널을 활성화시키는 화합물 즉, 상기 기술된 작용제를 약제적으로 수용 가능한 담체와 결합하여 피험체에 투여하여 비정상적 이상을 완화시키는 것을 포함한다. 대안으로, 피험체 내의 관련 세포에 의한 Kv9.2 서브유니트의 내인성 생성에 효과를 나타내지 위해 유전자 치료가 이용된다. 예를 들어 Kv9.2 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 바와 같이 복제 결함 레트로바이러스 벡터 내 발현을 위해 설계된다. 이후 레트로바이러스 발현 컨스트럭트가 분리되고 Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 RNA를 포함한 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 팩키징 세포 내로 도입되어 팩키징 세포가 목적 유전자를 포함한 감염성 바이러스 입자를 생성하게 된다. 이들 생산자 세포는 생체 내 세포의 설계 및 생체 내 폴리펩타이드의 발현을 위해 피험체에 투여된다. 유전자 치료의 개요를 위해 Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,(및 참고문헌) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 참조.
포뮬레이션 및 투여
용해성 형태의 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드와 같은 펩타이드 및 작용제 및 길항제 펩타이드 또는 소분자가 적당한 약제적 담체와 결합하여 포뮬레이트된다. 이러한 포뮬레이션은 치료적으로 효과적인 양의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 포뮬레이션은 투여 형태를 만족시켜야 하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 본 발명은 하나 이상의 상기 기술된 조성물 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함한 약제적 팩 및 키트에 관한 것이다.
Kv9.2 폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 이용된다.
약제적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복막내와 같은 다른 경로 주사도 이용될 수 있다. 전신 투여의 대안적 수단은 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세정제를 포함한다. 더욱이 창자용 또는 캡슐화된 포뮬레이션으로 적당히 포뮬레이트되는 경우 구강 투여도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국부적이 되고/또는 집중화된다.
필요한 투여량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 경로, 포뮬레이션 성질, 피험체 조건의 특성 및 주치의의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 투여량은 피험체의 0.1∼100 ㎍/kg의 범위이다. 그러나 유용한 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 다른 효율의 견지에서 필요한 투여량 내의 광범위한 변화가 예측된다. 예를 들어 구강 투여는 정맥주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량을 요구한다. 이들 투여량 수준 상의 차이는 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 최적조건을 위한 표준 경험상 관례를 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 사용되는 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 "유전자 치료"로 표기되는 치료 양상으로 피험체 내에서 내인적으로 생성될 수 있다. 따라서 예를 들어 피험체 유래의 세포는 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터의 이용에 의해 생체 외에서 폴리펩타이드를 인코드하기 위해 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다. 이후 세포는 피험체 내로 도입된다.
약제적 조성물
또한 본 발명자는 약제적으로 효과적인 양의 Kv9.2 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 벡터 또는 그의 항체 및 선택적으로는 약제적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합을 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 개시한다.
약제적 조성물은 인간 및 가축 약물에서 인간 또는 동물 용도가 되고 일반적으로 하나 이상의 약제적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료제로서 수용 가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도된 경로 및 표준 약제적 실습에 따라 선택될 수 있다. 약제적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약제적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르빈산, p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/포뮬레이션 필요조건이 존재한다. 예로서 여기서 기술된 약제적 조성물은 조성물이 미니-펌프를 이용하거나 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능 용액에 의해 또는 조성물이 전달을 위해 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주사형태로 포뮬레이트된 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 대안으로 포뮬레이션은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 고안된다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통과하는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질 분해성 분해에 저항적이고 산 pH에 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리 형태로 흡입에 의해, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말 형태 및 피부 패취의 이용에 의해 국부적으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 포함한 정제 형태 또는 캡슐 또는 오불(ovule) 단독 또는 부형제와 결합된 형태 또는 향미제 또는 착색제를 함유한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액 형태로 투여될 수 있거나, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하와 같은 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 예를 들어 혈액과 등장액을 생성기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 함유한 멸균 수용액 형태로 사용되는 것이 최상이다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 편리한 형태로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge) 형태로 투여된다.
백신
또다른 실시태양은 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증 및 저혈당증, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는) 및 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증에 의한 것이나 이에 한정적이지 않은 결과로서 비정상적 혈당 수치로부터 상기 동물을 보호하기 위해 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기에 충분한 Kv9.2 서브유니트 폴리펩타이드 또는 그의 단편으로 포유류를 접종시키는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 질병으로부터 상기 동물을 보호하도록 이러한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 Kv9.2 서브유니트 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 Kv9.2 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 Kv9.2 폴리펩타이드 또는 Kv9.2 유전자를 포함한 조성물이 포유류 숙주 내로 도입시 Kv9.2 폴리펩타이드에 대해 포유류 내에서 면역 반응을 유도하는 면역적/백신 포뮬레이션(조성물)에 관한 것이다. 백신 포뮬레이션은 적당한 담체를 더욱 포함한다.
Kv9.2 폴리펩타이드가 위에서 분해되기 때문에 바람직하게는 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 피내 등의 주사를 포함) 투여된다. 비경구적 투여에 적당한 포뮬레이션은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 포뮬레이션이 수용체의 혈액과 등장성을 이루게 하는 용질을 함유한 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 농화제를 포함한 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위-투여 또는 다중-투여 용기로 제공되고, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체의 첨가가 필요한 동결-건조 조건으로 보관된다. 또한 백신 포뮬레이션은 오일-인 워터 시스템 및 당분야에 알려진 다른 시스템과 같은 포뮬레이션의 면역원성을 증가시키기 위한 보강 시스템을 포함한다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이고 일반 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
백신은 하나 이상의 Kv9.2 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 제조된다.
활성 성분(들)로서 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 펩타이드(들)을 포함한 백신의 제조는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 똔느 현탁액과 같은 주사제로서 제조되고; 주사 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태로도 제조된다. 또한 제제는 에멀젼화되거나 리포솜 내에 캡슐화된 단백질이다. 활성 면역원성 성분은 약제적으로 수용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 유효성을 증가시키는 보조제와 같은 최소량의 보조 물질을 포함한다. 효과적인 보조제의 예는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 표기), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴록시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 표기), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 내에 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디마이콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함한 RIBI.
보조제 및 다른 약제의 또다른 예는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄(백반), 황산베릴리움, 실리카, 카올린, 탄소, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 무라밀 디펩타이드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르붐(프로피오노박테리움 아크네스(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오타이드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포솜, 레바미솔, DEAE-덱스트란, 차단된 코폴리머 또는 다른 합성 보조제를 포함한다. 이러한 보조제는 예를 들어 Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는 Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)와 같은 다양한 원료로부터 상업적으로 구입 가능하다.
일반적으로 Amphigen(오일-인-워터), Alhydrogel(수산화알루미늄) 또는 Amphigen과 Alhydrogel의 혼합물과 같은 보조제가 사용된다. 수산화알루미늄만이 인간 용도로 승인된다.
면역원 및 보조제의 비율은 효과적인 양으로 존재하는 한 광범위한 범위로 변화될 수 있다. 예를 들어 수산화알루미늄은 백신 혼합물의 약 0.5%의 양으로 존재할 수 있다(Al2O3 기초). 편리하게는 백신은 0.2∼200 ㎍/ml, 바람직하게는 5∼50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 15 ㎍/ml 범위의 최종농도의 면역원을 포함하도록 포뮬레이트된다.
포뮬레이션 후 백신은 멸균 용기에 포함된 후 밀봉되고 예를 들어 4℃와 같은 저온에서 보관되거나 동결-건조된다. 동결건조는 안정한 형태로 장기간 보관을 가능하게 한다.
백신은 통상적으로 피하로 또는 근육내로 같은 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약을 포함하고, 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
환자로의 구강 투여를 위한 캡슐, 정제 및 환약은 예를 들어 Eudragit "S", Eudragit "L", 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함한 장 코팅제와 함께 제공된다.
Kv9.2 폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 포뮬레이트된다. 약제적으로 수용 가능한 염은 산 첨가 염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)을 포함하고 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 수산, 주석산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된다. 또한 자유 카르복실기로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래된다.
투여
일반적으로 의사는 피험 개체에 가장 적당한 실질적인 투여량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 하기 투여량은 평균 사례의 예이다. 물론 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 적당한 개인적 경우도 존재한다.
여기서 기술된 약제적 및 백신 조성물은 직접 주입에 의해 투여된다. 조성물은 비경구적, 점막, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내 또는 경피성 투여를 위해 포뮬레이트된다. 일반적으로 각각의 단백질은 체중의 0.01∼30 mg/kg, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg의 투여량을 투여된다.
"투여된"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스성 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜 리포펙틴, 양이온 안면 양친매성물질(CFA) 및 이들의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메커니즘의 경로는 점막, 비강, 구강, 비경구, 위장, 국부 또는 설하 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투여된"이라는 용어는 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취 용액과 같은 점막 경로; 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주입 가능 형태에 의해 전달되는 비경구 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여된"이라는 용어는 예를 들어 Kv9.2 폴리펩타이드 및 보조제와 같은 추가 실체 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역체계의 필요한 조절이 달성되게 하는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 보조제가 동일한 순간 및 동일한 사이트에 투여되는 경우 폴리펩타이드를 보조제와 다른 시간 및 다른 사이트에 투여하는 것보다 이점이 있다. 폴리펩타이드 및 보조제는 동일한 전달 운반체 내에서 전달되고 - 폴리펩타이드 및 항원은 결합되고/또는 결합되지 않고/또는 유전적으로 결합되고/또는 결합되지 않는다.
Kv9.2 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 그의 항체 및 선택적으로는 보조제는 단일 투여 또는 다수 투여로 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
백신 조성물 및 약제적 조성물은 주입(비경구, 피하 및 근육내 주입), 비강내, 점막, 구강, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 많은 다른 경로에 의해 투여된다.
여기서 기술된 백신 및 약제적 조성물은 통상적으로 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약 및 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
또다른 관점
본 발명의 또다른 관점 및 실시태양은 하기 항에 나타나 있고; 본 발명이 이들 관점을 포함함이 이해되어야 한다.
1항. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드
2항. 1항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
3항. 2항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
4항. 1항에 따른 폴리펩타이드의 단편을 포함한 폴리펩타이드
5항. 3항에 있어서, 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 상동적인 하나 이상의 구역을 포함하거나 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 이형적인 하나 이상의 구역을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드
6항. 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
7항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산을 포함한 벡터
8항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 숙주 세포
9항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 형질전환 비-인간 동물
10항. 9항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
11항. Kv9.2 서브유니트와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드의 이용
12항. Kv9.2 서브유니트와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 9항 또는 10항에 따른 형질전환 비-인간 동물의 이용
13항. 후보 화합물에 Kv9.2를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 채널의 동력학 및 전도성이 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Kv9.2 포함 이온 채널 길항제의 확인 방법
14항. 후보 화합물에 Kv9.2 포함 이온 채널을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함한 채널의 전도성 수준을 증가시키는 것이 가능하거나 채널의 전류 동력학을 조절하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
15항. 후보 화합물에 Kv9.2 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계 및 후보 화합물이 Kv9.2 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
16항. 11항 내지 15항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물
17항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물
18항. 항체의 제조 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산의 이용
19항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 또는 그의 일부
20항. 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 하나 이상의 하기를 포함한 약제적 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
21항. 하나 이상의 하기를 포함한 백신 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
22항. 하나 이상의 하기를 포함한 질병 또는 질병 감수성에 대한 진단 키트: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
23항. 환자에게 Kv9.2 포함 이온 채널의 길항제를 투여하는 단계를 포함한 증가된 Kv9.2 포함 이온 채널 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
24항. 환자에게 Kv9.2 포함 이온 채널의 작용제를 투여하는 단계를 포함한 감소된 Kv9.2 포함 이온 채널 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
25항. 23항 또는 24항에 있어서, 상기 Kv9.2 서브유니트는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 방법
26항. 하나 이상의 하기를 환자에게 투요하는 단계를 포함한 환자의 질병을 치료하고/또는 예방하는 방법: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 19항에 따른 항체; 20항에 따른 약제적 조성물; 및 20항에 따른 백신
27항. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 이용하기 위한 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체를 포함한 약제
28항. 질병의 치료 또는 예방용 약제적 조성물의 제조시 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체의 이용
29항. 형질전환 동물이 변화된 Kv9.2 유전자를 포함함을 특징으로 하는 비-형질전환 동물
30항. 29항에 있어서, 상기 변화는 Kv9.2의 결실, 기능 손실을 유발하는 Kv9.2의 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이를 포함한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 Kv9.2 내로의 도입, 또다른 종으로부터의 외인성 유전자의 Kv9.2 내로의 도입 및 이들의 결합으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물
31항. 형질전환 동물이 그의 게놈 내에서 이형성 Kv9.2 단백질을 인코드하는 트랜스유전자를 포함하고 발현하는, 기능적으로 분열된 내인성 Kv9.2 유전자를 지닌 비-인간 형질전환 동물
32항. (a) 비-상동성 대치 부분; (b) 첫 번째 Kv9.2 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 (c) 두 번째 Kv9.2 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연발생적 내인성 Kv9.2 유전자 내에서 첫 번째 Kv9.2 유전자 서열의 다운스트림 위치를 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함한, 숙주 세포 내 Kv9.2 유전자를 기능적으로 분열시키는 핵산 컨스트럭트
33항. Kv9.2 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산이 발현되는 조건 하에서 8항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 제조 방법
34항. 표본을 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 존재의 검출 방법
35항. 표본을 19항에 따른 항체에 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 존재의 검출 방법
36항. Kv9.2의 증가되거나 감소되거나 비정상적인 발현에 의해 유발되거나 이에 관련된 질환의 진단 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 동물 내에서의 Kv9.2 발현 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
도 1은 Kv9.2 결함 마우스를 생성하기 위한 넉아웃 벡터를 나타낸 도표이다.
도 2는 인간 RT-PCR 선별로부터의 Kv9.2 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 혈당 수치(mmol/L) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 넉아웃 플라스미드 벡터의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 오픈 필드 시험의 결과 분석을 나타낸 그래프이다; 도 5A는 주변(좌측) 및 중심(우측) 지역에서 이동한 총 거리를 나타내고(흑색 막대 넉아웃 동물); 도 5B는 주변(좌측) 및 중심(우측) 지역에서 이동한 시간을 나타내고(흑색 막대 넉아웃 동물); 도 5C는 필드 구역에 출입한 횟수를 나타낸다(흑색 막대 넉아웃 동물).
도 6은 미로의 폐쇄된 팔 및 개방된 팔에서 소요된 시간을 나타내는 플러스 미로 시험의 결과 분석을 나타낸 그래프이다(흑색 막대 넉아웃 동물 및 빗금친 막대 야생형 동물).
서열목록
서열번호: 1은 인간 Kv9.2의 cDNA 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 서열번호: 1 유래의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 3은 인간 Kv9.2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 4는 마우스 Kv9.2의 cDNA의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 5는 마우스 Kv9.2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 6-18은 넉아웃 플라스미드 구축시 사용된 유전형 프라이머를 나타낸다. 서열번호: 19는 넉아웃 플라스미드 벡터 서열을 나타낸다.
(실시예 1) 형질전환 Kv9.2 넉-아웃 마우스: Kv9.2 유전자 타겟 벡터의 구축
Kv9.2 유전자는 게놈 데이터베이스의 상동성 검색을 이용하여 생물-정보학적으로 확인된다. 226 kb 갭된 게놈 인접은 다양한 데이터베이스로부터 집합되었다. 이러한 인접은 상동성 팔의 고안이 타겟 벡터 내로 클론될 수 있게 하는 충분한 측면 서열 정보를 제공하였다.
쥐과 Kv9.2 유전자는 1개 인접 엑손을 지닌다. 타겟 전략은 코딩 서열 대부분을 제거하도록 고안된다. 구역의 측면에 위치한 1.7 kb 5'상동성 팔 및 4.0 kb 3' 상동성 팔은 PCR에 의해 증폭되고 단편은 타겟 벡터 내로 클론된다. 팔을 증폭시키는데 사용되는 각 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단은 절단이 드문 제한 효소에 대한 다른 인식 사이트를 포함하고 벡터 폴리링커의 클로닝 사이트와 양립 가능하고 팔 자체가 결손되도록 합성된다. Kv9.2의 경우 프라이머는 AgeI/NotI의 5' 팔 클로닝 사이트 및 AscI/FseI의 3' 팔 클로닝 사이트(관련 제한 효소를 포함한 사용된 타겟 벡터의 구조가 도 1에 나타나 있다)를 지니고 하기 프라이머 표에 기입된 바와 같이 고안된다.
팔 프라이머쌍(5'armF/5'armR) 및 (3'armF/3'armR)에 더하여 Kv9.2 좌위에 대해 특이적인 또다른 프라이머가 하기 목적으로 고안된다: 분리된 추정 타겟 클론 내에서 타겟된 좌위의 서던 분석을 가능하게 하기 위해 각 팔 외부 및 그 이상으로 연장된 비-반복 게놈 DNA의 2개의 짧은 150∼300 bp 단편을 증폭시키는 5' 및 3' 프로브 프라이머쌍(5'prF/5'prR 및 3'prF/3'prR); 벡터 특이적 프라이머, 이러한 경우에는 Asc403과 함께 다중 PCR에 사용시 야생형, 이형접합성 및 동형접합성 마우스 사이의 구별을 가능하게 마우스 유전형 프라이머쌍(hetF 및 hetR); 및 마지막으로 벡터(TK5IBLMNL)의 3' 말단에 특이적인 프라이머, 이러한 경우 DR1과 쌍을 이룰 때 5' 팔 구역 말단의 업스트림을 어닐하고(anneal) 타겟 이벤트 특이적 2.0 kb 증폭기를 생성하는 타겟 선별 프라이머(5'scr). 바람직한 게놈 변화가 발생하고 무작위로 통합된 벡터 카피를 포함한 클론 배경으로부터 정확히 타겟된 세포의 확인을 가능하게 하는 경우 이러한 증폭기는 세포 유래의 주형 DNA로부터 유래될 수 있다. 타겟 전략에 사용된 이들 프라이머의 위치 및 Kv9.28 좌위 구역의 게놈 구조가는 서열번호: 19에 나타나 있다.
상동성 팔의 위치는 Kv9.2 유전자를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 타겟 벡터는 결실되는 Kv9.2 구역이 Kv9.2 유전자와 동일한 방향으로 배열된 촉진된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내인성 유전자 발현 수용체(프레임 독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 대치되도록 제조된다.
5' 및 3' 상동성 팔이 타겟 벡터 TK5IBLMNL 내로 클론되면(도 4 참조) 표준 분자생물학 기술을 이용하여 크고 매우 순수한 DNA 제제가 제조된다. 신선하게 준비된 무-내독소 DNA 20 ㎍이 암피실린 저항성 유전자와 박테리아의 복제 기원 사이의 벡터 백본 내에 특정 사이트에 존재하는 또다른 절단이 드문 제한효소 PmeI로 제한된다. 이후 선형화된 DNA가 침전되고 일렉트로포레이션을 위해 100 ㎕의 인산 완충 식염수 내에 재현탁된다.
일렉트로포레이션 24시간 후 트랜스펙트된 세포는 200 ㎍/ml 네오마이신을 함유한 배지 내에서 9일간 배양된다. 상동성 재조합이 내인성 Kv9.2 유전자와 타겟 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 클론은 96웰 플레이트 내로 수집되고 PCR(상기 기술된 프라이머 5'prF 및 DR1을 사용하여)에 의해 선별되기 전에 복제되고 팽창된다. 양성 클론은 1∼5%의 비율로 확인될 수 있다. 이들 클론은 팽창되어 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 이용하여(Russ et al, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99) 제조된 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 복사체가 동결되고 충분히 우수한 질의 DNA게 제조될 수 있게 한다. 진단 제한효소로 분해된 DNA의 서던 블럿이 외부 프로브와 하이브리다이즈되면 상동적으로 타겟된 ES 세포 클론은 돌연변이 밴드뿐만 아니라 변화되지 않은 야생형 밴드의 존재에 의해 증명된다. 예를 들어 AFlII로 분해된 야생형 게놈 DNA는 5' 외부 프로브와 하이브리다이즈시 6.26 kb의 밴드를, 3' 외부 프로브와 하이브리다이즈시 7.0 kb의 밴드를 산출할 것이고, 유사하게 분해된 타겟된 대립유전자를 포함한 게놈 유전자는 이에 더하여 ∼17 kb 넉아웃 특이적 밴드를 산출할 것이다.
(실시예 2) 형질전환 Kv9.2 넉-아웃 마우스: Kv9.2 GPCR 결함 마우스의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포가 임신 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포 당 주입되고 7∼8개 배반포가 가임신된 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 일부 높은 수준(100%까지)의 아구티 수컷(아구티 외피색은 타렛된 클론으로부터 유전된 세포의 분포를 나타냄)을 포함하여 태어난다. 이들 수컷 키메라는 암컷 MF1 및 129 마우스와 교미되고 생식계열 전달은 각각 아구티 외피색 및 PCR 유전형에 의해 측정된다.
PCR 유전형분석은 세 번째 벡터 특이적 프라이머(Asc403)와 함께 프라이머 hetF 및 hetR을 이용하여 용해된 꼬리 클립 상에서 수행된다. 이러한 다중 PCR은 241 bp 밴드를 제공하는 프라이머 hetF 및 hetR로부터 야생형 좌위(존재하는 경우)로부터의 증폭을 가능하게 한다. hetF에 대한 사이트는 넉아웃 마우스 내에서 결실되고, 따라서 이러한 증폭은 타겟된 대립유전자로부터 실패될 것이다. 그러나 Asc403 프라이머는 3' 팔의 바로 내부의 구역을 어닐하는 hetR 프라이머와 결합하여 타겟된 좌위로부터 434 bp 밴드를 증폭시킬 것이다. 따라서 이러한 다중 PCR은 하기와 같은 새끼의 유전형을 나타낸다: 야생형 표본은 단일 241 bp 밴드를 나타내고; 이형접합성 DNA 표본은 241 bp 및 434 bp의 2개 밴드를 산출하고; 동형접 합성 표본은 타겟 특이적 434 bp 밴드만을 나타낼 것이다.
Figure 112006068989022-PCT00002
(실시예 3) 생물학적 데이터: 유전자 발현 패턴(인간 RT-PCR)
RT-PCR을 이용하여 유전자 발현이 폐, 뇌, 비장 내에 나타났고, 전립선, 간, 생식 기관 및 근육 내에는 적은 정도로 나타나 있다.
이는 도 2에 나타나 있다.
(실시예 4) 생물학적 데이터: 유전자 발현 패턴(Lac Z 염색된 구조)
LacZ 염색
해부된 조직의 X gal 염색이 하기 방식으로 수행된다.
대표 조직 조각은 큰 기관으로 이루어진다. 전체 소기관 및 관은 잘려서 개방되어 고정제 및 착색제가 침투될 것이다. 혈액 또는 내장 내용물을 제거하기 위해 조직은 PBS(인산 완충 식염수)로 세척된다. 조직은 고정제(2% 포름알데하이드, 0.2% 글루타르알데하이드, 0.02% NP40, 1 mM MgCl2, 데옥시콜산나트륨 0.23 mM을 함유한 PBS) 내에 30∼45분간 놓인다. PBS로 5분간 3회 세척 후 조직은 Xgal 염색 용액(PBS 내 4 mM K 페로시아니드, 4 mM K 페리시아니드, 2 mM MgCl2, 1 mg/mlX-gal) 내에 30℃에서 18시간 동안 놓인다. 조직은 PBS로 3회 세척되고 4% 포름알데하이드 내에서 24시간 동안 후고정되고 70% 에탄올에 보관되기 전에 다시 PBS로 세척된다.
Xgal 염색된 조직을 확인하기 위해 탈수된 조직은 왁스로 매몰되었고 7 um 섹션으로 절단되었고 0.01% 사프라닌으로 대조염색되었다(9∼10분).
LacZ 염색을 이용하여 Kv9.2는 뇌 특히 대뇌피질, 해마, 칼레하후각소도, 벤테이트 팔리둠(ventate pallidum) 중심편도핵(CeL), 시상핵 및 피질 내에서 발현되는 것으로 판명되었다. 더욱이 염색 증거는 심장, 비장, 폐 및 고환에서도 나타났다.
(실시예 5) 생물학적 데이터: 생리학/생화학(혈당)
혈당은 밤새(14∼16시간) 금식된 동물의 꼬리 정맥으로부터 채취된 혈액 표본으로부터 기록되었다. 혈당은 혈당 모니터를 이용하여 측정되었다.
Kv9.2 넉아웃된 동물은 조사되고 넉아웃되지 않은(야생형)과 교미된 새끼와 비교되었다. 넉아웃 동물은 야생형의 경우 4.69±0.38 mmol/l인데 반해 3.24±2.1 mmol/l의 혈당 수치를 지녔다. 따라서 Kv9.2 넉아웃 동물은 야생형 동물과 비교시 감소된 혈당 수치를 나타낸다.
결과는 도 3에 나타나 있다.
(실시예 6) 생물학적 데이터: 행동 분석(오픈 필드 시험)
넉아웃 및 야생형 대조군 마우스는 오픈 필드 시험으로 시험된다. Carola, V., F. D'Olimpio, et al.(2002) "Evaluation of the elevated plus-maze and open-field for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice" 참조.
간단하게는 마우스는 투명한 측면을 지닌 Perspex 상자 중앙에 놓이고 시간 경과에 따른 마우스의 이동이 비디오 상에 기록된다. 대조군 동물은 일반적으로 대부분의 시간을 활동무대 변두리 주변을 움직이는데 보낸다. 이러한 정상 패턴으로부터의 변화, 특히 대부분의 시간을 활동무대 중앙에서 보내는 변화가 기록되고, 이의 증가는 동물이 덜 불안함을 의미할 수 있다.
마우스의 시간 경과에 따른 이동이 비디로 상에 기록되고 분석된다. 결과는 넉아웃 마우스가 야생형 대조군과 동일한 양으로 움직이는 것으로 나타났다(WT 1161±170.8 cm; KO 636.84±193.62 p=0.05 ANOVA)(도 5A).
이러한 데이터의 분석은 넉아웃 마우스가 주변부 구역 및 중심 구역 모두에서 이동하는데 더 적은 시간을 소비하였다 즉, 야생형 대조군 마우스의 이동과 비교시 굳어있는 경향으로 더 오랫동안 움직이지 않았다(도 5B). 따라서 Kv9.2 넉아웃 마우스는 증가된 부동성을 나타낸다.
중심 구역 내 이동 소요 시간은 WT 56.2±12.7s; KO 23.3±8.5s p=0.01이고, ANOVA, 시험 총 시간은 300s이고, 주변부 구역내 이동 소요 시간은 WT 44.3±4.4; KO 24.7±7.9이었다. 따라서 Kv9.2 넉아웃 마우스는 증가된 주변부 불변 시간과 함께 감소된 보행 시간을 더욱 나타낸다.
또한 주변부 및 중심 구역 내 진입 전체 횟수 즉, 마우스가 오픈 필드를 교차하여 이동하는 횟수는 넉아웃 마우스에서 가장 많이 감소되었다(WT 7.3±2; KO 2±1 p<0.01 ANOVA)(도 5C).
(실시예 7) 생물학적 데이터: 행동 분석(플러스 미로)
넉아웃 및 야생형 대조군 마우스가 플러스 미로로 시험되었다.
간단하게는 증가된 플러스 미로 및 비디오 추적을 이용하여 마우스의 불안이 측정되었다. 이러한 시험은 추가된 높이 및 개방성의 요소와 함께 마우스의 밝게 불이 밝혀진 오픈 필드에 대한 회피성 대비 새로운 환경을 개척하려는 경향을 적정시키는 상충을 이용한다. 2개의 교차 팔이 매우 어두운 벽으로 폐쇄되고 2개의 다른 것은 개방된다. 마우스는 폐쇄된 팔을 선호하나 개방된 곳으로 과감히 들어갈 것이다. Pellow et al. 'Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as measure of anxiety in the rat'(1985) 참조.
넉아웃 마우스가 대조군 마우스와 비교시 유사한 거리를 이동하는 것으로 기록되더라도 데이터 분석은 이들이 폐쇄된 팔(안전한 곳으로 간주된)에서 유의적으로 더 오랫동안 머물고 대조군 마우스와 비교시 개방 팔(불안전한 곳으로 간주된) 내로 덜 진입하는 것으로 나타났다.
이는 Kv9.2 넉아웃 마우스가 불안 표현형을 지니고 따라서 Kv9.2가 불안 장애에 관련됨을 증명한다.
심사중인 출원 및 특허를 포함하여 본 출원서에 기술된 출원 및 특허 및 상기 출원 및 특허에 인용된 문헌 및 출원 및 특허에 인용되거나 기술된 제품의 제조사 지침서 또는 카탈로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서에 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 본 명세서 내에 인용되거나 기술된 모든 제품의 제조사 지침서가 참고문헌에 포함된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않고 이에 대한 많은 변형 및 추가가 본 발명의 범위 내에서 이루어짐이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 청구범위 내에 존재한다. 더욱이 하기 종속의 특징의 다양한 결합은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 독립항의 특징으로 이루어질 수 있다.
<110> PARADIGM THERAPEUTICS LIMITED <120> ION CHANNEL <150> GB 0409504.8 <151> 2004-04-28 <150> US 60/575,626 <151> 2004-05-28 <150> GB 0422290.7 <151> 2004-10-07 <150> US 60/617,870 <151> 2004-10-12 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5195 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcctctctgg gtgggtgagg ggcgcgcgga tccggagagg gggctccggg agcggcggga 60 ccacgcagcc acctgtgagc cttcggcagc tgcgggcggc ggcggcgtac ccggcccgag 120 acgggaggag acgctcggcg gcccccgccc gccggcccgc cgggcgcaca cactcgcacc 180 cgcgcacgca ccgccagcag gcagcggcca ccgccgcgat gctcgcccgc gggttgggga 240 agtttcccgc cggcctcggc cgcgggcacc cgtgctccca ggtgtagcgc ccccgcgcgg 300 cgcgggcggc cggcgcctcc agcatgaccg gccagagcct gtgggacgtg tcggaggcta 360 acgtcgagga cggggagatc cgcatcaatg tgggcggctt caagaggagg ctgcgctcgc 420 acacgctgct gcgcttcccc gagacgcgcc tgggccgctt gctgctctgc cactcgcgcg 480 aggccattct ggagctctgc gatgactacg acgacgtcca gcgggagttc tacttcgacc 540 gcaaccctga gctcttcccc tacgtgctgc atttctatca caccggcaag cttcacgtca 600 tggctgagct atgtgtcttc tccttcagcc aggagatcga gtactggggc atcaacgagt 660 tcttcattga ctcctgctgc agctacagct accatggccg caaagtagag cccgagcagg 720 agaagtggga cgagcagagt gaccaggaga gcaccacgtc ttccttcgat gagatccttg 780 ccttctacaa cgacgcctcc aagttcgatg ggcagcccct cggcaacttc cgcaggcagc 840 tgtggctggc gctggacaac cccggctact cagtgctgag cagggtcttc agcatcctgt 900 ccatcctggt ggtgatgggg tccatcatca ccatgtgcct caatagcctg cccgatttcc 960 aaatccctga cagccagggc aaccctggcg aggaccctag gttcgaaatc gtggagcact 1020 ttggcattgc ctggttcaca tttgagctgg tggccaggtt tgctgtggcc cctgacttcc 1080 tcaagttctt caagaatgcc ctaaacctta ttgacctcat gtccatcgtc cccttttaca 1140 tcactctggt ggtgaacctg gtggtggaga gcacacctac tttagccaac ttgggcaggg 1200 tggcccaggt cctgaggctg atgcggatct tccgcatctt aaagctggcc aggcactcca 1260 ctggcctccg ctccctgggg gccactttga aatacagcta caaagaagta gggctgctct 1320 tgctctacct ctccgtgggg atttccatct tctccgtggt ggcctacacc attgaaaagg 1380 aggagaacga gggcctggcc accatccctg cctgctggtg gtgggctacc gtcagtatga 1440 ccacagtggg gtacggggat gtggtcccag ggaccacggc aggaaagctg actgcctctg 1500 cctgcatctt ggcaggcatc ctcgtggtgg tcctgcccat caccttgatc ttcaataagt 1560 tctcccactt ttaccggcgc caaaagcaac ttgagagtgc catgcgcagc tgtgactttg 1620 gagatggaat gaaggaggtc ccttcggtca atttaaggga ctattatgcc cataaagtta 1680 aatcccttat ggcaagcctg acgaacatga gcaggagctc accaagtgaa ctcagtttaa 1740 atgattccct acgttagccg ggaggacttg tcaccctcca ccccacattg ctgagctgcc 1800 tcttgtgcct ctggcacagc ccaggcacct tatggttatg gtgtaaggag tatgcccagc 1860 ccctgagggg agagatgcat gggatatgca cccaggtttc ttttacagtt tttagaatcg 1920 tttttagagg gtggtgtgtc tgacaccatg cctttgcacc tttccatgaa atgacactca 1980 ctggtctttg catcgtgggc ataaaatgtt cacctttttg ccagatgagt acacccagaa 2040 tgctaatttt tctgtccatc gtgtacgcta ttctagtgct tgtggcccag tactgtctat 2100 gagttgtcgt gctcctgttt ctgaggttgt cgtgtgagtt ctgtacaaaa agcccccaca 2160 agtcgtccag tagaaatgca tctatgaggt cagcaaggat atgatgagat tttgctcaca 2220 gtcatgtgaa aacaaaatct cagctcttta tccattgctt tcacttagtt ttagtaccaa 2280 aacaaagaga atgcaaagtt aagcagactt gaccaatgca agtctctaag ttgtttttat 2340 aaatgatctg tagttccgtg gcttgcatgg gtgcaccaat catctttaga acgatgtaca 2400 ctgatgttca tctcataaat gtcactcttt agagaatgtt acttagttaa acatgcagtg 2460 aagatcgaat ttttttccca agaacagatg tgttagggag aggggcttca gctaaatagt 2520 ccaaacccta gggtgcttaa agccaagtta gtgcaggctg agccccttgg ttcacagtca 2580 agcctccttg tttcctaggg tgactgtaga gaaatgtatt tccggatgag gtttctgatc 2640 taggccattt gaccaaactt tgctgtgtct aagatattag catgtttttg aaatatttat 2700 tttttaagat gtttaggagt aaggtcgtgt tgtcttcctc aactaaaaag aagtttactg 2760 ttgtatcgtc tccctgaggt gaacgttgtt gggttgctag caagggcagt agcttaaata 2820 cttttgttgc ctactctgaa agctcatcaa atgagagccc ttttatttcc aagcagaatt 2880 tagtcagata attttgcttc taggatatag tatgttgtat atgatgctgt gattgccctg 2940 gagttcctgc catgacatgg aaacctggtg gtatggaagc atgtactcaa aatatagacg 3000 tgcacgatgg tggtgtggct tacccaggat ggaaacactg cagttcttac ttgcattccc 3060 actgcctttc atggggggtg actgggtaga ggccaggaga aaggaaagag ttgtaaaata 3120 aaaaactgct agttcataaa atgtcataaa aaattgtaaa cttgaaaagc ttaatgctat 3180 tcaaaagacc ttcaagcttc caaacttgta ttgaagggag acgactgttt cctcctccaa 3240 aatgctcctg ctcctcttgt tcggttaacc agcacataac attgtgatgg ggaacctggg 3300 ttcctctata agataattct tctccatcat ctttaaggta atctgatggt tttccaggtg 3360 gctttcatta ttgttccatc tttgaaaagg caatagaacc caggggtctg agcatggagc 3420 tatccagggt tttcatccaa aggttgggcc tcttcttaag aggtcctttt gtgtttcagt 3480 tgattgaaga tgatacttac ctcattggag gtgtggcaag gatcttatca gaaggctttg 3540 tgttcttgta gttgtcatgg ctactacagt gtgggtgatt tattgaatga attcactagc 3600 cacttgtgtc ctggagcccc cagttcaaat ctttccattg gactggaggc ttgtgggagg 3660 ctgggaggtg gctgtctcct agtgtctaca tccgtgtctc tgaagcatca ggaaaagtga 3720 gatgacttag aggcaactgg gcactgaatc agaggagcag agttattttt cagaatttgc 3780 acatggaaca cttagatttg gctggtgctt ccagccctgg aaggcataac atttacggac 3840 tcatccccag ctgcactgaa ggcaggtggt ggtacagact tatgaggacg gatcagtttg 3900 ccaaggctga tggtattggg tcactgagcc tggtatccat ggccgctgac caggaagctt 3960 atgcaaagtg gaagcaagga acaaggcaga ataactcagt cactttcatg aagatttttc 4020 taaacaagaa ggcttaccac caaaaaagag gtaccctagt ggttaccctt tgcagatgtg 4080 aaagctggaa aacttgactt ttctttttgg taatgacttg catttatctg gtgcctttcg 4140 ttggaggaat cccaacgtgc tttagagact atctttttaa catctcttgt acatacatat 4200 atacttatat aaaatattat cttgcccaac tggaccttta ctcacttctg agcatgagaa 4260 tgtcccaata gcattgagtt tttcaagtgg tggtttcaga taagtgggag aaagaacaac 4320 ccggctggct taaaccctgg agctaattcc cacaaggaat gtagactgaa tggtgaccca 4380 gggagaaata atcttcctct cccctaaagt ctcactaagg tttgaagttt acaggtgctc 4440 tccactgggt ctttgatcga ccttgctaga taacatctaa ctaaaagcag tttcttttag 4500 tccctgaagc taaccaggga gagtcaggtt aattttctgt aaaaatatga ggtgacatct 4560 ttggcaacca ggctgtcaga ctgacctgta aacctccttt agggggacag agtagaaact 4620 ggagatgact tgtttccagc tgtgagcttg agagaagtgt cactcccagc atttgaaggt 4680 tattgttttc aatgccagtg ggccaaatat atgggccagg ctttgatatc tgtgatgtgc 4740 attttggaag tgctgggttg ggaagtgaca cgtctgttgc acaaatgcat attggttata 4800 ggtttgtgtt ttctgccaaa cccccacatt tctcgggttt gtgagtgagg aagggcatgt 4860 tgtaatgcca agctgatttg tagctcgtaa ggtagtaatt ggtatttaac atttgcattt 4920 gttatttcta cttatcttag cactcaaata attgaactac ctgctaattc ttgccgcatt 4980 tcaaagaaaa taagttgtta tgcactttgg gatagtggtg atctgtacag gctgtgtgtt 5040 agctacttga aggcgtaact ggtatttctt gtgtgtttta acagcatgac ttcttacaga 5100 gctgtaattt ttaaaattga ggatgccata tttgagatgt cagttttaac actcattaac 5160 acactactgt gcaagcattg acacaggctg cactg 5195 <210> 2 <211> 1434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaccggcc agagcctgtg ggacgtgtcg gaggctaacg tcgaggacgg ggagatccgc 60 atcaatgtgg gcggcttcaa gaggaggctg cgctcgcaca cgctgctgcg cttccccgag 120 acgcgcctgg gccgcttgct gctctgccac tcgcgcgagg ccattctgga gctctgcgat 180 gactacgacg acgtccagcg ggagttctac ttcgaccgca accctgagct cttcccctac 240 gtgctgcatt tctatcacac cggcaagctt cacgtcatgg ctgagctatg tgtcttctcc 300 ttcagccagg agatcgagta ctggggcatc aacgagttct tcattgactc ctgctgcagc 360 tacagctacc atggccgcaa agtagagccc gagcaggaga agtgggacga gcagagtgac 420 caggagagca ccacgtcttc cttcgatgag atccttgcct tctacaacga cgcctccaag 480 ttcgatgggc agcccctcgg caacttccgc aggcagctgt ggctggcgct ggacaacccc 540 ggctactcag tgctgagcag ggtcttcagc atcctgtcca tcctggtggt gatggggtcc 600 atcatcacca tgtgcctcaa tagcctgccc gatttccaaa tccctgacag ccagggcaac 660 cctggcgagg accctaggtt cgaaatcgtg gagcactttg gcattgcctg gttcacattt 720 gagctggtgg ccaggtttgc tgtggcccct gacttcctca agttcttcaa gaatgcccta 780 aaccttattg acctcatgtc catcgtcccc ttttacatca ctctggtggt gaacctggtg 840 gtggagagca cacctacttt agccaacttg ggcagggtgg cccaggtcct gaggctgatg 900 cggatcttcc gcatcttaaa gctggccagg cactccactg gcctccgctc cctgggggcc 960 actttgaaat acagctacaa agaagtaggg ctgctcttgc tctacctctc cgtggggatt 1020 tccatcttct ccgtggtggc ctacaccatt gaaaaggagg agaacgaggg cctggccacc 1080 atccctgcct gctggtggtg ggctaccgtc agtatgacca cagtggggta cggggatgtg 1140 gtcccaggga ccacggcagg aaagctgact gcctctgcct gcatcttggc aggcatcctc 1200 gtggtggtcc tgcccatcac cttgatcttc aataagttct cccactttta ccggcgccaa 1260 aagcaacttg agagtgccat gcgcagctgt gactttggag atggaatgaa ggaggtccct 1320 tcggtcaatt taagggacta ttatgcccat aaagttaaat cccttatggc aagcctgacg 1380 aacatgagca ggagctcacc aagtgaactc agtttaaatg attccctacg ttag 1434 <210> 3 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Glu Ala Asn Val Glu Asp 1 5 10 15 Gly Glu Ile Arg Ile Asn Val Gly Gly Phe Lys Arg Arg Leu Arg Ser 20 25 30 His Thr Leu Leu Arg Phe Pro Glu Thr Arg Leu Gly Arg Leu Leu Leu 35 40 45 Cys His Ser Arg Glu Ala Ile Leu Glu Leu Cys Asp Asp Tyr Asp Asp 50 55 60 Val Gln Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Pro Glu Leu Phe Pro Tyr 65 70 75 80 Val Leu His Phe Tyr His Thr Gly Lys Leu His Val Met Ala Glu Leu 85 90 95 Cys Val Phe Ser Phe Ser Gln Glu Ile Glu Tyr Trp Gly Ile Asn Glu 100 105 110 Phe Phe Ile Asp Ser Cys Cys Ser Tyr Ser Tyr His Gly Arg Lys Val 115 120 125 Glu Pro Glu Gln Glu Lys Trp Asp Glu Gln Ser Asp Gln Glu Ser Thr 130 135 140 Thr Ser Ser Phe Asp Glu Ile Leu Ala Phe Tyr Asn Asp Ala Ser Lys 145 150 155 160 Phe Asp Gly Gln Pro Leu Gly Asn Phe Arg Arg Gln Leu Trp Leu Ala 165 170 175 Leu Asp Asn Pro Gly Tyr Ser Val Leu Ser Arg Val Phe Ser Ile Leu 180 185 190 Ser Ile Leu Val Val Met Gly Ser Ile Ile Thr Met Cys Leu Asn Ser 195 200 205 Leu Pro Asp Phe Gln Ile Pro Asp Ser Gln Gly Asn Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Pro Arg Phe Glu Ile Val Glu His Phe Gly Ile Ala Trp Phe Thr Phe 225 230 235 240 Glu Leu Val Ala Arg Phe Ala Val Ala Pro Asp Phe Leu Lys Phe Phe 245 250 255 Lys Asn Ala Leu Asn Leu Ile Asp Leu Met Ser Ile Val Pro Phe Tyr 260 265 270 Ile Thr Leu Val Val Asn Leu Val Val Glu Ser Thr Pro Thr Leu Ala 275 280 285 Asn Leu Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Arg Leu Met Arg Ile Phe Arg 290 295 300 Ile Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Thr Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ala 305 310 315 320 Thr Leu Lys Tyr Ser Tyr Lys Glu Val Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu 325 330 335 Ser Val Gly Ile Ser Ile Phe Ser Val Val Ala Tyr Thr Ile Glu Lys 340 345 350 Glu Glu Asn Glu Gly Leu Ala Thr Ile Pro Ala Cys Trp Trp Trp Ala 355 360 365 Thr Val Ser Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Val Val Pro Gly Thr 370 375 380 Thr Ala Gly Lys Leu Thr Ala Ser Ala Cys Ile Leu Ala Gly Ile Leu 385 390 395 400 Val Val Val Leu Pro Ile Thr Leu Ile Phe Asn Lys Phe Ser His Phe 405 410 415 Tyr Arg Arg Gln Lys Gln Leu Glu Ser Ala Met Arg Ser Cys Asp Phe 420 425 430 Gly Asp Gly Met Lys Glu Val Pro Ser Val Asn Leu Arg Asp Tyr Tyr 435 440 445 Ala His Lys Val Lys Ser Leu Met Ala Ser Leu Thr Asn Met Ser Arg 450 455 460 Ser Ser Pro Ser Glu Leu Ser Leu Asn Asp Ser Leu Arg 465 470 475 <210> 4 <211> 1434 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 atgacccgcc agagcctgtg ggatgtgtcc gataccgacg tcgaggatgg agagatccgc 60 atcaatgtgg gtggcttcaa gagacggctg cgttcccata cgctgctgcg cttccctgag 120 acacgcctgg gccgtctgct cctctgccac tcgcgagagg ccattctgga actctgcgat 180 gactacgatg acgttcagcg tgagttctac ttcgaccgta accccgagct cttcccctat 240 gtgttgcatt tctaccacac cggcaagctt cacgtcatgg ctgagctgtg cgtcttctcc 300 ttcagccagg agatcgagta ctggggtatc aatgagttct tcatcgactc ttgctgcagc 360 tatagctatc acggccgcaa agtggaacct gagcaggaga aatgggacga gcagagtgac 420 caggaaagca ccacttcctc cttcgatgag atcttggcct tctataatga tgcttccaag 480 ttcgatgggc aacccctggg caacttccgc aggcagctgt ggctggcgtt ggacaaccca 540 ggctactcag tcctaagcag ggtcttcagt gtcctttcca tcttggtggt gttgggctcc 600 atcatcacca tgtgcctcaa tagcctgcca gacttccaaa tccctgatag ccagggtaac 660 cccggtgaag accccaggtt cgaaattgtg gagcactttg gcattgcttg gttcacattt 720 gagttggtgg ccaggtttgc tgtggcccct gactttctta agttcttcaa gaatgctcta 780 aaccttattg atctcatgtc cattgtccca ttttacataa ctctagtggt gaacctggtg 840 gtggagagtt ctcctacctt ggctaacttg ggcagggtgg ctcaagtcct gaggctaatg 900 aggatcttcc gaattctcaa gctggccaga cactccactg gcctccgctc cttgggagcc 960 accctgaagt acagctacaa ggaagtgggg ttgctcttgc tctacctctc agtggggatt 1020 tccatcttct ctgtggtggc ctacaccatt gaaaaggagg agaacgaagg cctggccacc 1080 atccctgcct gctggtggtg ggccactgtc agtatgacca cagttgggta cggagatgtg 1140 gtcccaggga caacagctgg gaagttgact gcctctgcct gcatcttggc aggcatcctg 1200 gtggtggtct tgcccatcac tttgatcttc aataagttct cccatttcta tcggcgccaa 1260 aagcaacttg agagtgctat gcgcagctgt gactttggag atggaatgaa agaggtccct 1320 tcggtcaatt taagggacta ctatgctcat aaagttaagt ccctcatggc aagtctgaca 1380 aacatgagta ggagttcacc tagtgaactg agtttagatg attctctaca ttag 1434 <210> 5 <211> 477 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Thr Arg Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Asp Thr Asp Val Glu Asp 1 5 10 15 Gly Glu Ile Arg Ile Asn Val Gly Gly Phe Lys Arg Arg Leu Arg Ser 20 25 30 His Thr Leu Leu Arg Phe Pro Glu Thr Arg Leu Gly Arg Leu Leu Leu 35 40 45 Cys His Ser Arg Glu Ala Ile Leu Glu Leu Cys Asp Asp Tyr Asp Asp 50 55 60 Val Gln Arg Glu Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Pro Glu Leu Phe Pro Tyr 65 70 75 80 Val Leu His Phe Tyr His Thr Gly Lys Leu His Val Met Ala Glu Leu 85 90 95 Cys Val Phe Ser Phe Ser Gln Glu Ile Glu Tyr Trp Gly Ile Asn Glu 100 105 110 Phe Phe Ile Asp Ser Cys Cys Ser Tyr Ser Tyr His Gly Arg Lys Val 115 120 125 Glu Pro Glu Gln Glu Lys Trp Asp Glu Gln Ser Asp Gln Glu Ser Thr 130 135 140 Thr Ser Ser Phe Asp Glu Ile Leu Ala Phe Tyr Asn Asp Ala Ser Lys 145 150 155 160 Phe Asp Gly Gln Pro Leu Gly Asn Phe Arg Arg Gln Leu Trp Leu Ala 165 170 175 Leu Asp Asn Pro Gly Tyr Ser Val Leu Ser Arg Val Phe Ser Val Leu 180 185 190 Ser Ile Leu Val Val Leu Gly Ser Ile Ile Thr Met Cys Leu Asn Ser 195 200 205 Leu Pro Asp Phe Gln Ile Pro Asp Ser Gln Gly Asn Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Pro Arg Phe Glu Ile Val Glu His Phe Gly Ile Ala Trp Phe Thr Phe 225 230 235 240 Glu Leu Val Ala Arg Phe Ala Val Ala Pro Asp Phe Leu Lys Phe Phe 245 250 255 Lys Asn Ala Leu Asn Leu Ile Asp Leu Met Ser Ile Val Pro Phe Tyr 260 265 270 Ile Thr Leu Val Val Asn Leu Val Val Glu Ser Ser Pro Thr Leu Ala 275 280 285 Asn Leu Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Arg Leu Met Arg Ile Phe Arg 290 295 300 Ile Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Thr Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ala 305 310 315 320 Thr Leu Lys Tyr Ser Tyr Lys Glu Val Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu 325 330 335 Ser Val Gly Ile Ser Ile Phe Ser Val Val Ala Tyr Thr Ile Glu Lys 340 345 350 Glu Glu 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<220> <223> Oligonucleotide primer <400> 16 gtgctagaac cacaagcagc agatcag 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 17 cagccgaact gttcgccagg ctcaagg 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 catgccgcct gcgccctatt gatcatg 27 <210> 19 <211> 16000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knockout plasmid construct <400> 19 aatctagagc cagaacacct ctcaattcag gtggcaccct tagagccaca tatgaagaat 60 gtgtttctcg tggttgcact gtttttcctg agtctggagc ttagatctcg gtcttgtgga 120 gagttaagtc caccgtggga atctcggtgt atacttctta cacaaagagc accaacgtga 180 caaaaaggac tcagacctcg caccttataa gaactgtcct attacttctg accaagacat 240 gaggacacca gctctctgct aacaatgcat gccacagtct gaaaatgagg accatgtatt 300 gtggaatatt cttgacagga taatgaagac tggttctgta ctcctgtggt cgagagacga 360 ttgttacgta cggtgtcaga cttttactcc tggtacataa tgctcagaga ccagggggat 420 accaaggaat aagggtctat ttcttggctt ggccaatatg agggccctat gtcttatgat 480 tgggaattct gtgctgaagt acgagtctct ggtcccccta tggttcctta ttcccagata 540 aagaaccgaa ccggttatac tcccgggata cagaatacta acccttaaga cacgacttca 600 cagtgtttat acagcacaca gtttctcaca ctgtatgcac ataccacact aatgcatgtc 660 cagatcctca tacatggcac actgtatgca tcttcgcatc gtcacaaata tgtcgtgtgt 720 caaagagtgt gacatacgtg tatggtgtga ttacgtacag gtctaggagt atgtaccgtg 780 tgacatacgt agaagcgtag catcagaaga catatttgtc aatactttac acagattttg 840 ggtagtccta ctcctcagat tgcacacacg cacagaactc caagtactcc tctgaagctc 900 gtagtcttct gtataaacag ttatgaaatg tgtctaaaac ccatcaggat gaggagtcta 960 acgtgtgtgc gtgtcttgag gttcatgagg agacttcgag acacactaca ctggcttgta 1020 catacacggt atcatgcaga gttctcaaac agaactccat tactcctccc catgccaaca 1080 ggacctgtgc acacacccaa tgtgtgatgt gaccgaacat gtatgtgcca tagtacgtct 1140 caagagtttg tcttgaggta atgaggaggg gtacggttgt cctggacacg tgtgtgggtt 1200 gctcctgccc cacccatatc cctgccacag ctcaacctca gtcttctctg acagctccca 1260 ttttccgata accccatttc caggtatagg aaacttttct cgaggacggg gtgggtatag 1320 ggacggtgtc gagttggagt cagaagagac tgtcgagggt aaaaggctat tggggtaaag 1380 gtccatatcc tttgaaaaga tcaggtttct aaaagaggaa gccgaagccg gtagatcatt 1440 ccgttgctgc cctatccgcc ctatacataa aagccatcct tcattctcca gtctgtttcc 1500 agtccaaaga ttttctcctt cggcttcggc catctagtaa ggcaacgacg ggataggcgg 1560 gatatgtatt ttcggtagga agtaagaggt cagacaaagg tacagacccg gcgagggagg 1620 aaagtcactg taagcaaccc tctgtctgag ccctgggggt gctgacaata acagctgtcc 1680 ctggaggatg ccgagggagg atgtctgggc cgctccctcc tttcagtgac attcgttggg 1740 agacagactc gggaccccca cgactgttat tgtcgacagg gacctcctac ggctccctcc 1800 gggaaaaggt gtcagctccg tgcaaagctg gggggcgccc gaagaacaga atgatgctcc 1860 ggaacgtctc aagagtctgg gcggcgactg tgccccgggc cccttttcca cagtcgaggc 1920 acgtttcgac cccccgcggg cttcttgtct tactacgagg ccttgcagag ttctcagacc 1980 cgccgctgac acggggcccg tggcgcgctc ggagctgtcc gttcagcacc accgcgcagc 2040 accaggctca aggccctctg caaggcgcac cggctcggtt cccgcccccg ctccacgggc 2100 accgcgcgag cctcgacagg caagtcgtgg tggcgcgtcg tggtccgagt tccgggagac 2160 gttccgcgtg gccgagccaa gggcgggggc gaggtgcccg gcctgcggcg tgggctcctg 2220 cctctcgtgg tgggtgaggg gcgcgcagat cggaagaggg gggctccacg agcgtcgggg 2280 ccacgcagcc acctgtgagc cggacgccgc acccgaggac ggagagcacc acccactccc 2340 cgcgcgtcta gccttctccc cccgaggtgc tcgcagcccc ggtgcgtcgg tggacactcg 2400 ctctcgcgga tgtgggcggt ggtgtgtgcg gccggagact gaaggaggcg cacggtggac 2460 cccgcctgcc cggtggcggg gcacacagac aagcactcac gagagcgcct acacccgcca 2520 ccacacacgc cggcctctga cttcctccgc gtgccacctg gggcggacgg gccaccgccc 2580 cgtgtgtctg ttcgtgagtg atctacatcc tcgcacccgc gcgcactcgc gcagccagcc 2640 aacggcgtcc accgcggtga tgcttgccag caggtcgggg aagtttcccg ccggcctctg 2700 tagatgtagg agcgtgggcg cgcgtgagcg cgtcggtcgg ttgccgcagg tggcgccact 2760 acgaacggtc gtccagcccc ttcaaagggc ggccggagac ccgcgggctc ccgtgcaccc 2820 aggtaagcgc ttttagaacg cgcaaggcga gctccgggaa ggcgcagcgc acgcggccgg 2880 ggagcacggc gccagaaggg ggcgcccgag ggcacgtggg tccattcgcg aaaatcttgc 2940 gcgttccgct cgaggccctt ccgcgtcgcg tgcgccggcc cctcgtgccg cggtcttccc 3000 cgcgggggtg 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tctggggtcc aagctttaac acctcgtgaa accgtaacga accaagtgta 5580 aactcaacca ccggtccaaa gctgtggccc ctgactttct taagttcttc aagaatgctc 5640 taaaccttat tgatctcatg tccattgtcc cattttacat aactctagtg gtgaacctgg 5700 cgacaccggg gactgaaaga attcaagaag ttcttacgag atttggaata actagagtac 5760 aggtaacagg gtaaaatgta ttgagatcac cacttggacc tggtggagag ttctcctacc 5820 ttggctaact tgggcagggt ggctcaagtc ctgaggctaa tgaggatctt ccgaattctc 5880 aagctggcca gacactccac accacctctc aagaggatgg aaccgattga acccgtccca 5940 ccgagttcag gactccgatt actcctagaa ggcttaagag ttcgaccggt ctgtgaggtg 6000 tggcctccgc tccttgggag ccaccctgaa gtacagctac aaggaagtgg ggttgctctt 6060 gctctacctc tcagtgggga tttccatctt ctctgtggtg accggaggcg aggaaccctc 6120 ggtgggactt catgtcgatg ttccttcacc ccaacgagaa cgagatggag agtcacccct 6180 aaaggtagaa gagacaccac gcctacacca ttgaaaagga ggagaacgaa ggcctggcca 6240 ccatccctgc ctgctggtgg tgggccactg tcagtatgac cacagttggg tacggagatg 6300 cggatgtggt aacttttcct cctcttgctt ccggaccggt ggtagggacg gacgaccacc 6360 acccggtgac agtcatactg gtgtcaaccc atgcctctac tggtcccagg gacaacagct 6420 gggaagttga ctgcctctgc ctgcatcttg gcaggcatcc tggtggtggt cttgcccatc 6480 actttgatct tcaataagtt accagggtcc ctgttgtcga cccttcaact gacggagacg 6540 gacgtagaac cgtccgtagg accaccacca gaacgggtag tgaaactaga agttattcaa 6600 ctcccatttc tatcggcgcc aaaagcaact tgagagtgct atgcgcagct gtgactttgg 6660 agatggaatg aaagaggtcc cttcggtcaa tttaagggac gagggtaaag atagccgcgg 6720 ttttcgttga actctcacga tacgcgtcga cactgaaacc tctaccttac tttctccagg 6780 gaagccagtt aaattccctg tactatgctc ataaagttaa gtccctcatg gcaagtctga 6840 caaacatgag taggagttca cctagtgaac tgagtttaga tgattctcta cattagctgg 6900 atgatacgag tatttcaatt cagggagtac cgttcagact gtttgtactc atcctcaagt 6960 ggatcacttg actcaaatct actaagagat gtaatcgacc accccgactt acattgctga 7020 tctgctgctt gtggttctag cacaatcagg gcaattttag ggctgtggca taagaaatca 7080 tccctgccct agagggagag tggggctgaa tgtaacgact agacgacgaa caccaagatc 7140 gtgttagtcc cgttaaaatc ccgacaccgt attctttagt agggacggga tctccctctc 7200 ctgcatggga 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aagggcaata aatccttatt ccggcacgac agaaagagga ggtgaccttc 8940 ttcaaacaca aaacaacaga aacactccat tcgtgacagt ccaacgaccg ttcccgttat 9000 gcttaaatat tttcttgcct gctctaaaag cccataaaat gaatgttctt ttgtttctga 9060 gcagagtttc ctttaggtag ttttgcttct aggacacagg cgaatttata aaagaacgga 9120 cgagattttc gggtatttta cttacaagaa aacaaagact cgtctcaaag gaaatccatc 9180 aaaacgaaga tcctgtgtcc atagtgtatg tatagtgttt gattgccttg agttcctgcc 9240 ttggcatgga aacctggtag tgcagagcat attcaagatg cagacatgca tgaaggcagg 9300 tatcacatac atatcacaaa ctaacggaac tcaaggacgg aaccgtacct ttggaccatc 9360 acgtctcgta taagttctac gtctgtacgt acttccgtcc tggcttaccc agggtggaaa 9420 cactgtagct tttatttcca ttgcaattgc aatggggttt gggggacagg ggtagaagtc 9480 aaaagaaaag agttataaag accgaatggg tcccaccttt gtgacatcga aaataaaggt 9540 aacgttaacg ttaccccaaa ccccctgtcc ccatcttcag ttttcttttc tcaatatttc 9600 ccaaaaacta ctttataaga tataaataac tgtgagcttc tttaaaagct taaaactagt 9660 aaaatagaaa acaaaaacaa caaacaaccc tttcaaccat ggtttttgat gaaatattct 9720 atatttattg acactcgaag aaattttcga attttgatca ttttatcttt tgtttttgtt 9780 gtttgttggg aaagttggta taagctgtgt tgaagggtta cctctatttc cttttccaac 9840 acactgttca gttaacacaa aacattatga aggggcacct gggccccctt taagaaaatt 9900 attcgacaca acttcccaat ggagataaag gaaaaggttg tgtgacaagt caattgtgtt 9960 ttgtaatact tccccgtgga cccgggggaa attcttttaa ctttcccatc attgtctaag 10020 taatctgatg gttttccagt ggctttcatt attgttgagt ctttggcaag gctatagaat 10080 ccagggatcc aaatacggag gaaagggtag taacagattc attagactac caaaaggtca 10140 ccgaaagtaa taacaactca gaaaccgttc cgatatctta ggtccctagg tttatgcctc 10200 ataaacaggc ttttaatcca aagtttgggc ctactcttaa ttggtccatt ttgtgtttta 10260 gtcagttaag gacaatccac acttcacagg ggtgtggaat tatttgtccg aaaattaggt 10320 ttcaaacccg gatgagaatt aaccaggtaa aacacaaaat cagtcaattc ctgttaggtg 10380 tgaagtgtcc ccacacctta ggatcttctc agagggctct gtgtactagt ggttgccatg 10440 gtgactacag tgtgggcgat ttgttggatg aatgcactga ccatttaatg cccttgagcc 10500 cctagaagag tctcccgaga cacatgatca ccaacggtac cactgatgtc acacccgcta 10560 aacaacctac ttacgtgact ggtaaattac gggaactcgg tccagttcag atctttcatc 10620 agactggaga ctgatgaggg gcagaaggtg gcaacctcct agtgcctacg tgcagacaca 10680 tctatgtcta ttattccaaa aggtcaagtc tagaaagtag tctgacctct gactactccc 10740 cgtcttccac cgttggagga tcacggatgc acgtctgtgt agatacagat aataaggttt 10800 gcagcaggaa tgtgaggttg acttcaagga accccgcctg tgaatcagaa gacaggagtt 10860 ggttttggga gtttgcatat ggaactcttg ttgttggctg cgtcgtcctt acactccaac 10920 tgaagttcct tggggcggac acttagtctt ctgtcctcaa ccaaaaccct caaacgtata 10980 ccttgagaac aacaaccgac gtatcttcag cactagaaga ccaaggatgt ataaaactgt 11040 tcccagttgc actgaaggca ggggacagcc taacctgtga ggactgtttg gtttgctgag 11100 catagaagtc gtgatcttct ggttcctaca tattttgaca agggtcaacg tgacttccgt 11160 cccctgtcgg attggacact cctgacaaac caaacgactc gctgatggta taccataact 11220 gggcatgaat tgcatggtca ctgaccatga agctgatgga aagaagaaaa gaggagatgc 11280 agagtaactt agccactctc cgactaccat atggtattga cccgtactta acgtaccagt 11340 gactggtact tcgactacct ttcttctttt ctcctctacg tctcattgaa 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gacacaaagc ctctgactag 12240 tcaagtcaga taatgtctcc catggtagtt tctcctccag gagagagcag attcattttc 12300 tcaagtgttc aggacctagt ctgtgtttcg gagactgatc agttcagtct attacagagg 12360 gtaccatcaa agaggaggtc ctctctcgtc taagtaaaag tgccgtgttc ttgggagtaa 12420 aggctaccaa gatgaagtgg actcatagat gatcaaggta gcctgtacaa tcctttcttg 12480 gggaacacag tagatgcagg acggcacaag aaccctcatt tccgatggtt ctacttcacc 12540 tgagtatcta ctagttccat cggacatgtt aggaaagaac cccttgtgtc atctacgtcc 12600 ctcattcata cccagctggt agctaaagag caactccact cttggcattt gacctgttca 12660 gtattactgg gtcaaataca tgggccaagc tttgtcatag gagtaagtat gggtcgacca 12720 tcgatttctc gttgaggtga gaaccgtaaa ctggacaagt cataatgacc cagtttatgt 12780 acccggttcg aaacagtatc catgcagggt gggcatttgg aactgacaca cgtttatggc 12840 acagatacat tagtctgggg ctgtgtttcc catccaagtt ctgcatttcc caggttggct 12900 gtacgtccca cccgtaaacc ttgactgtgt gcaaataccg tgtctatgta atcagacccc 12960 gacacaaagg gtaggttcaa gacgtaaagg gtccaaccga gctgaggagg ggcgtgtaga 13020 atgctgagcc tatgcctagc tcatcaggta gtaattgatg tttaatattt gggtttgtta 13080 ttgctactta ctgtagctct cgactcctcc ccgcacatct tacgactcgg atacggatcg 13140 agtagtccat cattaactac aaattataaa cccaaacaat aacgatgaat gacatcgaga 13200 caaagcactg agcgacctgt taattcctgc tttgtttcaa tggaaatgat ttgttctgca 13260 ctttgggata tcggcggtag agaccacagg cagtgtggtc gtttcgtgac tcgctggaca 13320 attaaggacg aaacaaagtt acctttacta aacaagacgt gaaaccctat agccgccatc 13380 tctggtgtcc gtcacaccag tctacttgaa agcttaactg gtatttcttg tatgttttaa 13440 cagcatgact tgttccaggg ttgtaatttt aaacatcgag aatactgtat ttgcgatgtc 13500 agatgaactt tcgaattgac cataaagaac atacaaaatt gtcgtactga acaaggtccc 13560 aacattaaaa tttgtagctc ttatgacata aacgctacag agttttaaca ctcattaaca 13620 cactactgtg ccagcgtcct ggcggctcct gcgccattac atcgctgctg tgcttgagtt 13680 tcttgtgcct cgactccaga tcaaaattgt gagtaattgt gtgatgacac ggtcgcagga 13740 ccgccgagga cgcggtaatg tagcgacgac acgaactcaa agaacacgga gctgaggtct 13800 atgaggcaca tgactgacat actcaggatg ccagccttgc aaatatgcag attaaacaga 13860 agataattat ttcacttccc taaggtccct caattacaca tactccgtgt actgactgta 13920 tgagtcctac ggtcggaacg tttatacgtc taatttgtct tctattaata aagtgaaggg 13980 attccaggga gttaatgtgt tggagtggca gagataagga cattgggaag caagggattg 14040 gactgcccaa gaaaggctga actggtgttt tgctttgttt tgttttgttt tgttttgttt 14100 acctcaccgt ctctattcct gtaacccttc gttccctaac ctgacgggtt ctttccgact 14160 tgaccacaaa acgaaacaaa acaaaacaaa acaaaacaaa gtttttgttt ttggggattt 14220 tttgttttgt tttgtttttt ggttgtttat ggtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 14280 tgtgtgtgtg tgtgcatagt caaaaacaaa aacccctaaa aaacaaaaca aaacaaaaaa 14340 ccaacaaata ccacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacgtatca 14400 tacacatgtg tagaggttag ggttaatgtt ggatattttc ctcaactact ctgcacctta 14460 tatattcagg agtgatctct catttgaacc cagaccccag atgtgtacac atctccaatc 14520 ccaattacaa cctataaaag gagttgatga gacgtggaat atataagtcc tcactagaga 14580 gtaaacttgg gtctggggtc cggtcttgct agtctagctt gccagcttgc tttgggaatc 14640 attgcttctg cctccatggg ctgcgattat aggtagacac tcatcctgcc tcccatcctg 14700 gccagaacga tcagatcgaa cggtcgaacg aaacccttag taacgaagac ggaggtaccc 14760 gacgctaata tccatctgtg agtaggacgg agggtaggac ggtttgggga tctaaatgat 14820 ggtcttctca gccccaaggc tgagcagtga gtgagaaggg aaatttcctt cttagcaggc 14880 agctgaggaa ggagcctctg ccaaacccct agatttacta ccagaagagt cggggttccg 14940 actcgtcact cactcttccc tttaaaggaa gaatcgtccg tcgactcctt cctcggagac 15000 ctgagatctg gagctactgg gttacagaag cgatggttac attgtcttgg gaccccaggg 15060 gactggaggt tcctataaga ttttcttgct gctcagtgtc gactctagac ctcgatgacc 15120 caatgtcttc gctaccaatg taacagaacc ctggggtccc ctgacctcca aggatattct 15180 aaaagaacga cgagtcacag ccacattgag cctccatagc ctgctctgac caccctgttc 15240 tgtcccatag gaccaatcct tttgcaactc aagtggttag tgatagcaga gcaggtatgg 15300 ggtgtaactc ggaggtatcg gacgagactg gtgggacaag acagggtatc ctggttagga 15360 aaacgttgag ttcaccaatc actatcgtct cgtccatacc cgtggcatgt ccaggctggt 15420 tggctgtgaa cattgttaga ggatccctga acttggctcc ttgctctccc ttgctcgtcc 15480 actgctgcag agtgaggaat gcaccgtaca ggtccgacca accgacactt gtaacaatct 15540 cctagggact tgaaccgagg aacgagaggg aacgagcagg tgacgacgtc tcactcctta 15600 tggatggaat aattcataaa gccctgtcca cttgtttacc ttggtatgaa agcagaattt 15660 ctgtgtgcct ctccatgtcc tcatcatagc acgagagctc acctacctta ttaagtattt 15720 cgggacaggt gaacaaatgg aaccatactt tcgtcttaaa gacacacgga gaggtacagg 15780 agtagtatcg tgctctcgag ccccagcccc tgattgattt taaggaaggt agaaggactg 15840 tttacataca aggtcagaca gggacctgga gaaaggcttg ggcctactgt ctgcttcaag 15900 ggggtcgggg actaactaaa attccttcca tcttcctgac aaatgtatgt tccagtctgt 15960 ccctggacct ctttccgaac ccggatgaca gacgaagttc 16000

Claims (29)

  1. 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 Kv9.2 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물
  2. 제 1항에 있어서, Kv9.2 유전자 또는 그의 일부의 결실을 지님을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형을 표시함을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물:
    (a) 감소된 혈당 수치;
    (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험으로 측정시 감소된 불안;
  4. 동물의 Kv9.2 유전자의 적어도 일부 또는 전부가 또다른 동물, 바람직하게는 또다른 종, 더욱 바람직하게는 인간의 Kv9.2 유전자로부터의 서열로 대치된 형질전환 비-인간 동물
  5. 상기 어느 한 항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  6. 제 5항에 있어서, 기능적으로 분열된 Kv9.2 유전자, 바람직하게는 Kv9.2 유전자의 결실을 포함하고, 상기 Kv9.2 유전자는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함함을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  7. 상기 어느 한 항에 따른 비-인간 형질전환 동물로부터 분리된 세포 또는 조직
  8. 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 Kv9.2 유전자를 지닌 세포
  9. 불안 또는 당뇨병에 대한 모델로서 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  10. Kv9.2 관련 질환에 대한 모델로서 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  11. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서의 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 그의 분리된 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  12. 후보 화합물을 동물, 바람직하게는 야생형 동물 또는 제 1항 내지 제 6항에 따른 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 하기 표현형의 어느 하나 상의 변 화를 측정하는 단계를 포함한, 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드 작용제 또는 길항제의 확인 방법:(a) 혈당 수치; 및 (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험 및/또는 플러스 미로 시험으로 측정된 불안테론 수치
  13. 제 12항에 있어서, 상기 동물이 표현형 (a)∼(b)의 어느 하나의 증가를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 Kv9.2 폴리펩타이드 작용제의 확인 방법
  14. 제 12항에 있어서, 상기 동물이 표현형 (a)∼(b)의 어느 하나를 나타내게 하거나 이러한 표현형의 감소를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 Kv9.2 폴리펩타이드 길항제의 확인 방법
  15. 후보 화합물을 세포 또는 조직, 바람직하게는 야생형 세포 또는 조직 또는 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포에 노출시키는 단계 및 세포 또는 조직의 세포의 전도성 또는 동력학 상의 변화를 측정하는 단계를 포함한, 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드 작용제 또는 길항제의 확인 방법
  16. 제 15항에 있어서, 상기 세포의 전도성 또는 동력학을 증가시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 Kv9.2 폴리펩타이드 작용제의 확인 방법
  17. 제 15항에 있어서, 상기 세포의 전도성 또는 동력학을 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 Kv9.2 폴리펩타이드 길항제의 확인 방법
  18. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드를 후보 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 Kv9.2 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한, 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료 또는 완화에 적당한 화합물의 확인 방법
  19. 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료를 위해 그의 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리뉴클레오타이드의 이용
  20. 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료를 위해 그의 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 이용
  21. 개체 내 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료 방법에서의 이용을 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제
  22. 개체 내 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 치료용 약제 조 성물의 제조를 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드의 길항제의 이용
  23. Kv9.2의 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한, 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환 증세를 나타내는 개체의 치료 방법
  24. 개체 또는 그의 세포 또는 조직 내 Kv9.2의 발현, 수준 또는 활성 상의 변화를 감지하는 단계를 포함한, 불안 또는 당뇨병, 바람직하게는 Kv9.2 관련 질환의 진단 방법
  25. 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제에 있어서, 상기 Kv9.2 관련 질환은: 제1형 및 제2형 당뇨병, 고인슐린혈증, 고인슐린증, 인슐린저항, 당뇨병 관련 혈관질환, 당뇨병 관련 신장질환, 당뇨병 관련 신경병증을 포함한 당뇨병 합병증 및 저혈당증, 고지혈증(HDL, LDL 또는 VNDL이 되는) 및 디스리포이데미아(dyslipoidemia), 1차 원인 또는 2차적 당뇨병에 관계없이 갑상선기능항진증/갑 상선기능저하증, 선단비대증, 간부전증, 신부전증, 췌장 종양, 췌장염 및 알코올 유도성 저혈당증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제
  26. 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제에 있어서, 상기 Kv9.2 관련 질환은: 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증, 불안, 불안장애, 불안-관련 행동 및 범불안장애, 광장공포증, 급성 스트레스 장애 및 DSM-IV에 기입된 공황장애 및 우울증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제
  27. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 Kv9.2 폴리펩타이드
  28. 제 27항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
  29. 제 28항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
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