JP2008506361A - イオンチャネル - Google Patents

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Abstract

配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列、ならびにそのホモログ、変異体および誘導体を含むＫｖ９．２ポリペプチドを開示する。Ｋｖ９．２ポリペプチドをコードすることができる核酸、特に配列番号１、配列番号２または配列番号４に示す核酸配列を含んでなるもの、ならびにＫｖ９．２ノックアウト動物も開示する。

Description

本発明は、新規に同定された核酸、それによりコードされるポリペプチド、ならびにその生成および使用に関する。より詳しくは、本発明の核酸およびポリペプチドは、以下「Ｋｖ９．２」と称するイオンチャネルサブユニットに関する。本発明はまた、かかる核酸およびポリペプチドの作用の阻害または活性化に関する。
イオンチャネルは、細胞機能において必須の役割を果たす複数サブユニットの膜結合型タンパク質である。それらは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩化物イオンおよびカルシウムイオンをはじめとする多数のイオンの細胞膜通過を調節する。イオンは電荷を運ぶため、イオンチャネルは、細胞静止電位などの基本的な細胞の電気的特性の重要なメディエーターである。その機能不全および欠損は、てんかん、高血圧および嚢胞性線維症を含む多数の病的症状に関連づけられている。
カリウムチャネルは細胞の表面膜内に分布しており、それを通るカリウムイオンの選択的通過を可能にし、細胞の膜電位の制御において重要な役割を果たすと考えられている。特に、神経および筋細胞においては、それは、活動電位の頻度、持続性などを制御することにより中枢および末梢神経の神経伝達、心臓の脈拍調整、筋肉の収縮などに寄与する。また、それはホルモンの分泌、細胞体積の調節、細胞の増殖などにも関連していることが示されている。
カリウムチャネル遺伝子ファミリーは、最大かつ最も多様なイオンチャネルファミリーであると考えられている。それらは、膜貫通ドメインの数（例えば、２個、４個または６個のドメイン）に基づいて多数のサブファミリーに分類されている。２個のドメインを有するものには、高度に保存されたポアドメインを有するＧＩＲＫ、ＩＲＫ、ＣＩＲおよびＲＯＭＫが含まれる。Ｔｗｉｋ−１およびＴｗｉｋ様チャネルは、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ−１および２ならびにＴＲＡＡＫと共に、４個の膜貫通ドメインを有し、膜を介する定常状態カリウムイオン電位の維持に関与している。Ｓｈａｋｅｒ様およびｅａｇ型チャネルは６個のドメインを有し、最大のサブファミリーである。Ｓｈａｋｅｒ型は、著しく高い多様性を有するファミリーであり、いくつかのサブファミリー、すなわちＫｖ１、Ｋｖ２、Ｋｖ３およびＫｖ４に更に分類することができる。一方、ｅａｇ型は、ｅａｇ、ｅａｇ関連遺伝子およびｅｌｋにより構成され、それに関連した遺伝子には、ＫＡＴ遺伝子クラスターに対応する過分極活性化型カリウムチャネル、および環状ヌクレオチドにより活性化されるカチオンチャネルが含まれる。
Ｋｖチャネルをコードする最初の完全なヌクレオチド配列はＳｈａｋｅｒチャネル（Ｋｖ１）のクローニングにより１９８７年に報告された。Ｓｈａｋｅｒ ｃＤＮＡでのｃＤＮＡライブラリーの低ストリンジェンシーのスクリーニングは、３つの異なる遺伝子に由来するＫ＋チャネルｃＤＮＡである、Ｓｈａｂ（Ｋｖ２）、Ｓｈａｗ（Ｋｖ３）およびＳｈａｌ（Ｋｖ４）の単離をもたらした。それらの配列はＳｈａｋｅｒに相同であり、〜４０％の同一性を有する。Ｋｖ１ファミリーはコア領域においてＳｈａｋｅｒに対して＞６０％の相同性を有し、少なくとも７つのメンバーを有する最大のチャネルファミリーである。Ｓｈａｋｅｒ、Ｓｈａｂ、ＳｈａｌおよびＳｈａｗに関連した４種の哺乳動物サブファミリーに加えて、５種の更なるサブファミリー（Ｋｖ５〜９）も記載されている。現在、３０種を超えるＫｖチャネルがクローニングされ異種発現系において発現されている。これらのチャネルは、しばしば、電位感受性、電流カイネティクスならびに定常状態活性化および不活性化における相違を示す。
Ｋｖチャネルは、一緒になって機能性チャネルを形成する４つの６回膜貫通サブユニットにより形成される四量体として存在する。同一サブユニットが一緒になって機能性チャネルを形成しうるのみならず、異なるサブユニット同士も、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、一緒になって機能性ヘテロマー型チャネルを形成しうる。これらのヘテロマー型チャネルは、対応するホモマー型チャネルについて観察される特性が合わさった特有の特性を有する。さらに、いくつかのＫｖサブユニットは、単独で発現された場合には非機能性である。例えば、哺乳動物Ｋｖファミリーの最も最近に特定されたメンバーであるＫｖ９．３サブユニットは単独では機能性ホモマー型チャネルを形成せず、ヘテロマー複合体においてのみ機能し、この場合、それは電位感受性およびカイネティクスの変化をもたらす。
補助サブユニットはＫｖサブユニットと一緒になって、Ｋｖチャネル機能に更に著しい多様性を付加しうる。現在、４種のＫｖサブユニット遺伝子ファミリーが記載されている。それらはすべて、細胞質タンパク質であり、約４０ｋＤａの質量を有し、保存されたコア配列および多様なＮＨ２末端を有する。Ｋｖサブユニットは、迅速な不活性化（inactivation）および緩慢な不活性化、電位感受性の変化ならびに非活性化（deactivation）の遅延を含む、サブユニットに対する機能的な効果を及ぼすことが示されている。また、該サブユニットは細胞酸化還元センサーとしての役割を果たしうる。なぜなら、それは異種発現系においてＫｖ４．２チャネルに対してＯ２感受性を付与するらしいからである。
カリウム電位依存性チャネル、遅延整流型、サブファミリーＳ、メンバー２（Ｋｖ９．２）ｍＲＮＡは膵島において発現されることが既に示されているが、それはインスリンと共局在せず、このことは、それがインスリン分泌の制御に関与しないことを示唆している（Yan, L.ら. Diabetes 2004,53,597-607）。
本発明者らは、Ｋｖ９．２カリウムチャネルが血糖の維持において重要であることを見出した。Ｋｖ９．２ノックアウト動物においては、血中グルコースレベルが野生型動物のものとは著しく異なる（すなわち、より低い）。したがって、該遺伝子は糖および脂肪の代謝を制御し調節している。
Yan, L.ら. Diabetes 2004,53,597-607
概要
本発明の第１の態様においては、Ｋｖ９．２遺伝子が配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、機能的に破壊された内在性遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
好ましくは、該トランスジェニック非ヒト動物はＫｖ９．２遺伝子またはその一部分の中に欠失を有する。好ましくは、該トランスジェニック非ヒト動物は、野生型動物と比較して、以下の表現型：（ａ）血中グルコースレベルの低下；（ｂ）好ましくはオープンフィールド試験および／またはプラス型迷路試験において測定される、不安の増大のいずれかまたはこれらの組み合わせを示す。
本発明の第２の態様においては、トランスジェニック非ヒト動物であって、該動物のＫｖ９．２遺伝子の少なくとも一部分またはその全体が、別の動物の、好ましくは別の種の、より好ましくはヒトのＫｖ９．２遺伝子に由来する配列と置き換えられている動物を提供する。
好ましくは、該トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。
好ましくは、該トランスジェニック非ヒト動物は、機能的に破壊されたＫｖ９．２遺伝子、好ましくはＫｖ９．２遺伝子中の欠失を含んでなり、該Ｋｖ９．２遺伝子は配列番号４に示す核酸配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる。
本発明の第３の態様においては、本発明の第１または第２の態様の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞または組織を提供する。
本発明の第４の態様においては、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、機能的に破壊された内在性Ｋｖ９．２遺伝子を有する細胞を提供する。
本発明の第５の態様においては、不安または糖尿病のモデルとしての、記載されているトランスジェニック非ヒト動物、記載されている細胞もしくは組織、または記載されている細胞の使用を提供する。
第６の態様においては、本発明は、Ｋｖ９．２関連疾患のモデルとしての、記載されているトランスジェニック非ヒト動物、記載されている細胞もしくは組織、または記載されている細胞の使用を提供する。
本発明の第７の態様においては、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを特定する方法における、記載されているトランスジェニック非ヒト動物、記載されている細胞もしくは組織、または記載されている細胞の使用を提供する。
本発明の第８の態様においては、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを特定する方法を提供し、該方法は、候補化合物を動物に、好ましくは野生型動物または本発明の第１の態様のトランスジェニック非ヒト動物に投与するステップと、以下の表現型：（ａ）血中グルコースレベル；および（ｂ）好ましくはオープンフィールド試験および／またはプラス型迷路試験において測定される、不安のうちのいずれかにおける変化を測定するステップとを含む。
好ましくは、該方法はＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストを特定し、前記動物が前記表現型（ａ）（ｂ）のうちいずれかにおける増大を示すようにすることが可能な候補化合物を特定するステップを含む。
その代わりにまたはそれに加えて、該方法はＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストを特定し、前記動物が前記表現型（ａ）（ｂ）のうちいずれかを示すかまたはかかる表現型における低下を示すようにすることが可能な候補化合物を特定するステップを含む。
本発明の第９の態様においては、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを特定する方法を提供し、該方法は、候補化合物を細胞もしくは組織に、好ましくは野生型細胞もしくは組織あるいは記載されている細胞もしくは組織または記載されている細胞に曝露するステップと、該細胞もしくは該組織の細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスにおける変化を測定するステップとを含む。
好ましくは、該方法はＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストを特定し、前記細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスを増大させることが可能な候補化合物を特定するステップを含む。
その代わりにまたはそれに加えて、該方法はＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストを特定し、前記細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスを低下させることが可能な候補化合物を特定するステップを含む。
本発明の第１０の態様においては、不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療または軽減に好適な化合物を特定する方法を提供し、該方法は、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドを候補化合物に曝露するステップと、該候補化合物が該Ｋｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するステップとを含む。
本発明の第１１の態様としては、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリヌクレオチドの、不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のためのそのアゴニストまたはアンタゴニストの特定における使用を提供する。
本発明の第１２の態様においては、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドの、不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のためのそのアゴニストまたはアンタゴニストの特定における使用を提供する。
本発明の第１３の態様においては、個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療方法での使用のための、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストを提供する。
本発明の第１４の態様においては、個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のための医薬組成物の調製における、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストの使用を提供する。
本発明の第１５の態様においては、Ｋｖ９．２のアンタゴニストを個体に投与するステップを含む、不安または糖尿病に罹患した、好ましくはＫｖ９．２関連疾患に罹患した個体の治療方法を提供する。
本発明の第１６の態様においては、個体またはその細胞もしくは組織でのＫｖ９．２の発現、レベルまたは活性における変化を検出するステップを含む、個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の診断方法を提供する。
好ましくは、Ｋｖ９．２関連疾患は以下のもの：Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害をはじめとする糖尿病合併症、ならびに原発性または糖尿病に対して二次的な、低血糖、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）、異常脂質血症の治療、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖からなる群より選択される。
それらの代わりにまたはそれらに加えて、Ｋｖ９．２関連疾患は以下のもの：社会的不安、心的外傷後ストレス障害、恐怖症、対人恐怖症、特定のものに対する恐怖症、パニック障害、強迫神経症、急性ストレス障害、分離不安障害、全般性不安障害、大うつ、気分変調、双極性障害、季節性情動障害、出産後うつ病、躁うつ病、双極性うつ病、不安、不安障害、不安関連行動および全般性不安障害、広場恐怖症、急性ストレス障害、およびＤＳＭ−ＩＶに挙げられているパニック障害、ならびに抑うつからなる群より選択される。
本発明の第１７の態様においては、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドを提供する。
本発明の第１８の態様においては、本発明の第１８の態様のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
好ましくは、該核酸は、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含む。
図面の簡潔な説明
図１は、Ｋｖ９．２欠損マウスを作製するためのノックアウトベクターを示す概要図である。
図２はヒトＲＴ−ＰＣＲスクリーニングからのＫｖ９．２遺伝子発現の結果を示す。
図３は、血中グルコースレベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）の分析の結果を示すグラフである。
図４はノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列を示す。
図５は、オープンフィールド試験の結果の分析を示すグラフである。図５Ａ：辺縁区画（左）および中央区画（右）内を移動した総距離（黒いカラムはノックアウト動物）。図５Ｂ：辺縁区画（左）および中央区画（右）内を移動した時間（黒いカラムはノックアウト動物）、ならびに図５Ｃ：フィールド区画内への進入の回数（黒いカラムはノックアウト動物）。
図６は、迷路のクローズドアームおよびオープンアームにおいて費やされた時間を示すプラス型迷路試験の結果の分析のグラフである（黒いカラムはノックアウト動物、斜線のカラムは野生型動物）。
配列表
配列番号１はヒトＫｖ９．２のｃＤＮＡ配列を示す。配列番号２は、配列番号１から導き出されたオープンリーディングフレームを示す。配列番号３はヒトＫｖ９．２のアミノ酸配列を示す。配列番号４はマウスＫｖ９．２のｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを示す。配列番号５はマウスＫｖ９．２のアミノ酸配列を示す。配列番号６〜１８は、ノックアウトプラスミドを構築するために使用した遺伝子型決定用プライマーを示す。配列番号１９はノックアウトプラスミドベクター配列を示す。
本発明の実施は、特に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を用い、それらは当業者の能力の範囲内である。かかる技術は文献中に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. FritschおよびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.ら (1995および定期的な補遺; Current Protocols in Molecular Biology, 第９、１３および１６章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. CrabtreeおよびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. PolakおよびJames O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (編), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. LilleyおよびJ. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (編), David Lane (編) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson “Immunocytochemistry: Theory and Practice”, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (編); “Immunochemical Protocols, vol 80”, in the series: “Methods in Molecular Biology”, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes編 (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Jane RoskamsおよびLinda Rodgers編, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; ならびにThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy (第１７版, Beers, M. H.およびBerkow, R編, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons)を参照されたい。これらの一般的な教科書のそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。
詳細な説明
Ｋｖ９．２サブユニット
本発明は、全般的には、イオンチャネルおよびそのサブユニット、特に電位依存性カリウムチャネルのＫｖ９．２サブユニットならびにそのホモログ、変異体または誘導体の、糖尿病もしくは不安をはじめとするＫｖ９．２関連疾患の治療、軽減または診断における使用に関する。本発明のこの実施形態および他の実施形態を以下に更に詳しく説明する。
Ｋｖ９．２サブユニットの発現プロファイル
実施例に示すとおり、Ｋｖ９．２ ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、前立腺、肝臓、生殖器、筋肉および脳を含む多数の器官における種々の存在量のＫｖ９．２の発現を検出する。
ＢＬＡＳＴＮによりヒトＥＳＴデータソースを検索するために配列番号１のＫｖ９．２ ｃＤＮＡを使用すると、ｃＤＮＡライブラリー中で同一性が見出される。これは、Ｋｖ９．２が、例えば以下の正常または異常組織において発現されることを示している：
Ｕ６９１９２ ヒト乳児脳
ＡＡ７７６７０３ ヒト精巣
Ａ１６８１４９９ ヒト肺
ＡＷ２９２８２６ ヒト卵巣
したがって、Ｋｖ９．２ポリペプチド、核酸、プローブ、抗体、発現ベクターおよびリガンドは、これらの組織その他の組織におけるＫｖ９．２サブユニットの過剰、過少および異常発現に関連した疾患の検出、診断、治療その他のアッセイに有用である。
Ｋｖ９．２サブユニット関連疾患
本明細書に記載の方法および組成物においては、Ｋｖ９．２サブユニットは、ある範囲の疾患の治療および診断に有用である。これらの疾患を、便宜上、Ｋｖ９．２関連疾患と呼ぶ。
本発明者らは本明細書において、ヒトＫｖ９．２がヒト染色体８ｑ２２にマッピングされることを示す。したがって、特定の実施形態においては、Ｋｖ９．２サブユニットは、この遺伝子座、染色体バンド、領域、アームもしくは同一染色体にマッピングされる疾患を治療または診断するために使用することができる。Ｋｖ９．２サブユニットの染色体位置（すなわち、ヒト染色体８ｑ２２）と同じ遺伝子座、染色体バンド、領域、アームまたは染色体と連鎖していることが確認されている公知疾患には、腎尿細管性アシドーシス−大理石骨病症候群、ジヒドロピリミジン尿症、コーエン症候群、および喉頭奇形を伴うクリッペル−ファイル症候群が挙げられる。しかし、現在のところ、チャネルがアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションしていることが見出された、該チャネルに関連づけられた特定の疾患はない。
Ｋｖ９．２欠損ノックアウトマウスは、実施例に示されているとおり、一定範囲の表現型を示す。
特に、実施例５は、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスにおける血中グルコースレベルが、対応する野生型マウスより著しく高いことを示している。したがって、Ｋｖ９．２活性の欠損は血糖値の低下と相関している。
したがって、本発明者らは、個体におけるＫｖ９．２のレベルまたは活性を低下させるステップを含む、その個体における血糖値を低下させるための、好ましくは糖尿病の治療のための方法を開示する。記載されているとおり、これは、Ｋｖ９．２の発現のダウンレギュレーションにより、またはＫｖ９．２のアンタゴニストの使用により達成することができる。
特に、かかる手段による血中グルコースのモジュレーションは、限定的なものではないがＩ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害をはじめとする糖尿病合併症を含む疾患の治療に、ならびに低血糖の治療に用いることができる。さらに、それは、原発性または糖尿病に対して二次的な高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）および異常脂質血症、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖の治療にも用いることができる。したがって、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスは更に、これらの疾患のいずれかのモデルとして使用することができる。
さらに、実施例６はオープンフィールド試験を記載しており、この場合、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスは、それらの野生型対応体より不安となっていることが示されている。したがって、Ｋｖ９．２活性の欠損はストレスの増大と相関している。
したがって、本発明者らは、個体におけるＫｖ９．２のレベルまたは活性を増大させるステップを含む、その個体におけるストレスもしくは不安またはそれらの両方を低下させるための方法を開示する。記載されているとおり、これは、Ｋｖ９．２の発現のアップレギュレーションにより、またはＫｖ９．２のアゴニストの使用により達成することができる。
Ｋｖ９．２およびＫｖ９．２活性のモジュレーター（特に、Ｋｖ９．２のアンタゴニストを含む）は、ストレスおよび不安により特徴づけられる疾患もしくは症候群を治療または軽減するために使用することができる。かかる疾患には、社会的不安、心的外傷後ストレス障害、恐怖症、対人恐怖症、特定のものに対する恐怖症、パニック障害、強迫神経症、急性ストレス障害、分離不安障害、全般性不安障害、大うつ、気分変調、双極性障害、季節性情動障害、出産後うつ病、躁うつ病、双極性うつ病が含まれる。したがって、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスは更に、これらの疾患のいずれかのモデルとして使用することができる。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２関連疾患は、ストレスまたは不安が症状である疾患を含む。非常に好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２疾患は、不安およびストレスに関連した疾患の上記の一覧を含む。
また、該遺伝子は、神経障害、例えば不安、不安障害、不安関連行動および全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖症、対人恐怖症、強迫神経症、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、およびＤＳＭ−ＩＶに挙げられているパニック障害ならびに抑うつに影響を及ぼすことも判明している。
前記のとおり、Ｋｖ９．２サブユニットは、本明細書に記載の方法および組成物のいずれかを使用してこれらの特定の疾患のいずれかを診断および／または治療するために使用することができる。
特に、Ｋｖ９．２核酸を含む核酸、ベクター、ポリペプチド（そのホモログ、変異体または誘導体を含む）、医薬組成物、宿主細胞およびトランスジェニック動物（Ｋｖ９．２核酸および／またはポリペプチドを含むもの）の、前記で挙げた特定の疾患の治療または診断のための使用が特に予想される。さらに、前記の特定の疾患の診断または治療における、Ｋｖ９．２と相互作用または結合しうる化合物、好ましくは、Ｋｖ９．２のアンタゴニストまたはヘテロマー型もしくはホモマー型イオンチャネル、好ましくは、該チャネルのカイネティクスをモジュレートするかまたは該チャネルのコンダクタンスを低下させることができる化合物、Ｋｖ９．２サブユニットに対する抗体の使用ならびにこれらを生成または特定するための方法が予想される。特に、本発明は、それらの特定の疾患の治療または予防のためのワクチンの製造における、これらの化合物、組成物、分子などのいずれかの使用を含む。また、個体におけるそれらの特定の疾患の検出のための診断キットも開示する。
Ｋｖ９．２サブユニットの使用により治療可能または診断可能なかかるまたは更なる特定の疾患を特定するための連鎖マッピングの方法は当該技術分野で公知であり、本明細書中に記載されている。
不安およびストレス
不安およびストレス、ならびにこれらが現れる障害、例えばＫｖ９．２関連疾患は、当該技術分野でよく知られている。その概要を以下に説明する。
不安およびストレスは、張りつめた意識状態、緊張、神経質、および心配とも称される。ストレスは、個体に失望、怒りまたは不安を感じさせるいかなる状況または観念からも生じうる。ある人にとってストレスとなることが必ず他の人にとってもストレスとなるわけではない。
不安は心配または恐怖の感情である。この不快の原因は常に明らかというわけではなく、あるいは常に認識されるわけでもなく、このことが、その個体が感じる苦悩を増大させうる。
ストレスは、生きている限りは避けられないものである。少量の場合には、ストレスは有益であろう。すなわち、それは、より生産的となるよう個体に動機づけしうるものである。しかし、ストレスが過大になったり、ストレスに対する応答が強いと、それは有害となる。それは、全身健康状態の悪化、および感染、心臓疾患もしくは抑うつのような特定の肉体的または精神的疾患を引き起こしうる。持続的で和らぐことのないストレスは、しばしば、不安、ならびに過食およびアルコールまたは薬物の乱用のような不健康な行動を招く。
深い苦悩または抑うつのような感情状態、および甲状腺機能亢進、低血糖または心臓発作のような健康状態も、ストレスを引き起こしうる。
不安は、痙攣または震え、筋肉の緊張、頭痛、発汗、口腔乾燥、嚥下困難、腹痛（これは、特に子供の場合には、ストレスの唯一の症状でありうる）などの身体症状を伴うことが多い。
時には、不安は、眩暈、速いかまたは不規則な心拍、速い呼吸、下痢または頻尿、疲労、怒りっぽい（立腹を含む）、不眠および悪夢、集中低下ならびに性的な問題のような他の症状を伴う。
Ｋｖ９．２およびそのモジュレーターは、これらの症状のいずれかを治療または軽減するために使用することができる。
不安障害は、過剰な不安を含む精神状態の一群である。それらには、全般性不安障害、特定のものに対する恐怖症、強迫神経症および対人恐怖症が含まれる。前記のＫｖ９．２関連疾患も参照されたい。
ある種の薬物（嗜好品および医薬の両方）は、副作用または該薬物の禁断により、不安の症状を招きうる。かかる薬物には、カフェイン、アルコール、ニコチン、風邪薬、充血除去薬、喘息用の気管支拡張薬、三環系抗うつ薬、コカイン、アンフェタミン、やせ薬、ＡＤＨＤ薬および甲状腺薬が含まれる。本発明者らは、そのような薬物と組み合わされたＫｖ９．２およびそのモジュレーターの、そのストレスおよび／または不安誘発作用を軽減するための使用を開示する。
栄養不良（例えば、低レベルのビタミンＢ１２）もストレスまたは不安を引き起こしうる。達成不安は、受験または人前での発表のような特定の状況に関連している。心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）は、戦争、身体的もしくは性的暴行または自然災害のような心的外傷事象後に現れるストレス障害である。
非常に稀な場合に、副腎の腫瘍（褐色細胞腫）が不安の原因となりうる。これは、不安の感情および症状をもたらすホルモンの過剰産生により生じる。
（Medline Plus, http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003211.htmを参考にした）
Ｋｖ９．２サブユニットの同一性および類似性
ヒトＫｖ９．２をコードする増幅されたｃＤＮＡ産物の配列決定の結果から示されるとおり、Ｋｖ９．２はイオンチャネルファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列は、配列番号３に示す１１０４アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２、ヌクレオチド番号４１−３３５２）を含有する。ヒトＫｖ９．２はヒト染色体８ｑ２２にマッピングされることが判明している。
ｐｆａｍのＨＭＭ構造予測ソフトウェア（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml）を用いたＫｖ９．２ポリペプチド（配列番号３）の解析は、Ｋｖ９．２ペプチドがイオンチャネルサブユニットであることを裏づけている。
ヒトＫｖ９．２サブユニットのマウスホモログがクローニングされており、その核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４および配列番号５に示す。配列番号４のマウスＫｖ９．２サブユニットｃＤＮＡは、ヒトＫｖ９．２サブユニット（配列番号２）配列に対して高い同一性を示しており、一方、マウスＫｖ９．２サブユニットのアミノ酸配列（配列番号５）はヒトＫｖ９．２サブユニット（配列番号３）に対して高い同一性および類似性を示している。したがって、ヒトおよびマウスＫｖ９．２イオンチャネルサブユニットは、大きなイオンチャネルファミリーのメンバーである。
Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチド
本明細書中で用いる「Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチド」なる語は、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列またはそれらのホモログ、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドを意味すると意図される。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号３に示す配列のホモログ、変異体もしくは誘導体を含むか、または配列番号３に示す配列のホモログ、変異体もしくは誘導体である。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチド等価体（isoster））により互いに連結された２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと一般に称される短い鎖、およびタンパク質と一般に称される、より長い鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。
「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスにより、または当該技術分野で周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は基本的な教科書およびより詳細なモノグラフならびに多数の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端をはじめとする、ポリペプチド内の任意の位置において生じうる。同じタイプの修飾が、所与のペプチド内の数ヶ所の部位に同程度に、または様々な程度で存在しうることは理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは多数のタイプの修飾を含有しうる。
ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝していることが可能であり、また、分枝を伴うかまたは伴わない環状でありうる。環状、分枝状および分枝状環状ポリペプチドは翻訳後の天然のプロセスにより生じることが可能であり、または合成法により生成することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニン化、およびユビキチン化が挙げられる。例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 第２版, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983; Seifterら, “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 およびRattanら, “Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照されたい。
本明細書中で用いる「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「断片」なる語は、配列からのまたは配列への１個（または数個）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。例外であることが文脈から明らかである場合を除き、「Ｋｖ９．２」、「Ｋｖ９．２サブユニット」および「Ｋｖ９．２イオンチャネル」に対する言及は、Ｋｖ９．２のそのような変異体、ホモログ、誘導体および断片に対する言及を含む。
好ましくは、Ｋｖ９．２に適用されるのと同様に、得られるアミノ酸配列は、ホモマー型チャネルを形成するように、または他のＫｖファミリーメンバーと組み合わされてヘテロマー型チャネルを形成するように発現された場合に、イオンチャネル活性を有するものである。好ましくは、得られる核酸は、配列番号３または配列番号５に示すＫｖ９．２イオンチャネルサブユニットと同じ活性（または示されているとおりの他のチャネルと組み合わされた場合の潜在的活性）を有する。
特に、「ホモログ」なる語は、示されている他のチャネルと組み合わされた場合に、得られるアミノ酸配列がイオンチャネル活性、好ましくはＫｖ９．２イオンチャネル活性を有する限り、構造および／または機能に関する同一性を包含する。配列同一性（すなわち、類似性）に関しては、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性が存在する。これらの語は、Ｋｖ９．２サブユニット核酸配列の対立遺伝子変異であるアミノ酸から誘導されたポリペプチドをも含む。
Ｋｖ９．２含有イオンチャネルのようなイオンチャネルの「チャネル活性」または「生物活性」に言及されている場合、これらの語は、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの代謝機能または生理機能、例えば、類似した活性もしくは改善した活性、または望ましくない副作用の軽減を伴うこれらの活性を意味すると意図される。Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの抗原活性および免疫原性活性も含まれる。イオンチャネル活性の具体例、ならびにこれらの活性のアッセイおよび定量方法は当該技術分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載されている。
本明細書中で用いる「欠失」は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が失われている、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列内の変化と定義される。本明細書中で用いる「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較した場合に、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらす、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列内の変化である。本明細書中で用いる「置換」は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸で置き換えることにより生じる。
本明細書に記載のＫｖ９．２ポリペプチドは、サイレント変化をもたらし機能的に同等のアミノ酸配列を与える、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換をも有しうる。意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて施すことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ、類似した親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
例えば以下の表に従い保存的置換が施すことができる。第２欄の同一枠内、好ましくは第３欄の同一行内のアミノ酸を互いに置換することができる。
Figure 2008506361
Ｋｖ９．２ポリペプチドは更に、典型的にはＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に異種アミノ酸配列を含みうる。異種配列は、細胞内または細胞外タンパク質標的化に影響を及ぼす配列（例えば、リーダー配列）を含みうる。異種配列は、該ポリペプチドの免疫原性を増強する配列、ならびに／または該ポリペプチドの特定、抽出および／もしくは精製を容易にする配列をも含みうる。特に好ましい別の異種配列は、好ましくはＮ末端に位置するポリヒスチジンのようなポリアミノ酸配列である。少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１７アミノ酸で５０アミノ酸未満のポリヒスチジン配列が特に好ましい。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形態であることが可能であり、あるいは融合タンパク質のようなより大きなタンパク質の一部分であることが可能である。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列、例えば複数のヒスチジン残基を含有する追加的なアミノ酸配列、または組換え産生中の安定性のための追加的な配列を含めることが、しばしば有利である。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは、公知技術を用いる組換え手段により有利に生成される。しかし、それは、当業者に周知の技術、例えば固相合成を用いる合成手段によっても生成することができる。かかるポリペプチドは、例えば抽出および精製を補助するための融合タンパク質としても生成させることができる。融合タンパク質の相手方の具体例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質の相手方と対象となるタンパク質配列との間にタンパク質切断部位（例えば、トロンビン切断部位）を含有させることも好都合であろう。好ましくは、該融合タンパク質は、対象となるタンパク質配列の機能を妨げない。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは実質的に単離された形態でありうる。この語は、天然の状態からの人為的な改変を意味するものと意図される。「単離（された）」組成物または物質が天然に存在する場合には、それはその元の環境から変化しているか、もしくは取り出されているか、またはその両方である。例えば、生きた動物において天然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、本明細書中でその語が用いられるとおりに「単離」されている。
しかし、Ｋｖ９．２イオンチャネルタンパク質は、該タンパク質の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合されることが可能であり、この場合にも尚、実質的に単離されているとみなすることができることは理解されるであろう。また、本明細書に記載のポリペプチドは実質的に精製された形態であること可能であり、この場合、それは一般には、調製物中のタンパク質の９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％がＫｖ９．２ポリペプチドである該調製物中の該タンパク質を含むであろう。
さらに、本発明者らは、Ｋｖ９．２ポリペプチドの一部分を含むペプチドを記載する。したがって、Ｋｖ９．２サブユニットならびにそのホモログ、変異体または誘導体の断片が含まれる。該ペプチドは２〜２００アミノ酸長、好ましくは４〜４０アミノ酸長でありうる。該ペプチドは、例えば、トリプシンのような適当な酵素での消化により、本明細書中に開示されているＫｖ９．２ポリペプチドから誘導することができる。あるいは、該ペプチド、断片などは組換え手段により生成されるか、または合成法により合成することができる。
「ペプチド」なる語は、当該技術分野で公知の種々の合成ペプチドの変型、例えばレトロインバーソ（retroinverso）Ｄペプチドを含む。該ペプチドは抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープでありうる。該ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性でありうる。好ましくは、該ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏで中和抗体を誘導可能なものである。
異なる種のＫｖ９．２サブユニット配列をアライメントすることにより、異なる種間で該アミノ酸配列のどの領域が保存されているのか（「相同領域」）および異なる種間でどの領域が異なるのか（「非相同領域」）を決定することが可能である。
したがって、Ｋｖ９．２ポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部分に対応する配列を含みうる。相同領域とは少なくとも２つの種の間で高い度合の相同性を示すものである。例えば、相同領域は、前記の試験を用いた場合にアミノ酸レベルで少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を示しうる。相同領域に対応する配列を含むペプチドは、以下で更に詳細に説明するとおり、治療方法において使用することができる。あるいは、Ｋｖ９．２サブユニットペプチドは、非相同領域の少なくとも一部分に対応する配列を含みうる。非相同領域は少なくとも２つの種の間で低い度合の相同性を示すものである。
Ｋｖ９．２ポリヌクレオチドおよび核酸
本発明者らは、本明細書中に更に詳細に記載するとおり、Ｋｖ９．２ポリヌクレオチド、Ｋｖ９．２ヌクレオチドおよびＫｖ９．２核酸、これらの生成方法、これらの使用などを記載する。
「Ｋｖ９．２ポリヌクレオチド」、「Ｋｖ９．２ヌクレオチド」および「Ｋｖ９．２核酸」なる語は互換的に使用することが可能であり、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列またはそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含むポリヌクレオチド／核酸を意味すると意図される。好ましくは、該ポリヌクレオチド／核酸は、核酸配列配列番号１または配列番号２、最も好ましくは配列番号２の核酸配列のホモログ、変異体または誘導体を含むか、あるいはそれらそのものである。
また、これらの語は、ポリペプチドおよび／またはペプチド、すなわち、Ｋｖ９．２ポリペプチドをコードしうる核酸配列を含むと意図される。したがって、Ｋｖ９．２ポリヌクレオチドおよび核酸は、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸またはそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードしうるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、Ｋｖ９．２ポリヌクレオチドおよび核酸は、配列番号３に示すアミノ酸配列またはそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードしうるヌクレオチド配列を含む。
「ポリヌクレオチド」は一般には、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」としては、限定的なものではないが一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子（一本鎖でありうる、またはより典型的には二本鎖である、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物である）が挙げられる。また、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を意味する。また、ポリヌクレオチドなる語は、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性その他の理由により修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾（された）」塩基には、例えばトリチル化塩基および特異塩基、例えばイノシンが含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡについては種々の修飾が存在し、したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然で典型的に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドとしばしば称される比較的短いポリヌクレオチドも含む。
遺伝暗号の縮重の結果として多数のヌクレオチド配列が同一ポリペプチドをコードしうることは当業者に理解されるであろう。
本明細書中で用いる「ヌクレオチド配列」なる語は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列ならびにそれらの変異体、ホモログ、断片および誘導体（例えば、それらの一部分）を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはそれらの組み合わせのいずれを表すかには無関係に、二本鎖または一本鎖でありうるゲノム由来もしくは合成由来または組換え由来のＤＮＡもしくはＲＮＡでありうる。ヌクレオチド配列は、（例えば組換えＤＮＡのように）組換えＤＮＡ技術の利用により調製することができる。
好ましくは、「ヌクレオチド配列」なる語はＤＮＡを意味する。
本明細書中で用いる「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「断片」なる語は、Ｋｖ９．２ヌクレオチド配列の配列からのまたは配列への１個（または数個）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。例外であることが文脈から明らかである場合を除き、「Ｋｖ９．２」、「Ｋｖ９．２サブユニット」および「Ｋｖ９．２イオンチャネル」に対する言及は、Ｋｖ９．２のそのような変異体、ホモログ、誘導体および断片に対する言及を含む。
好ましくは、得られるヌクレオチド配列は、Ｋｖ９．２サブユニット活性を有するポリペプチドをコードしており、好ましくは配列番号３または配列番号５に示すＫｖ９．２サブユニットと少なくとも同じ活性を有するポリペプチドをコードしている。好ましくは、「ホモログ」なる語は、構造および／または機能に関する同一性を包含する。したがって、好ましくは、得られるヌクレオチド配列は、ホモマー型チャネルを形成するように、または他のＫｖファミリーメンバーと組み合わされてヘテロマー型チャネルを形成するように発現された場合に、イオンチャネル活性を有するポリペプチドをコードしている。配列同一性（すなわち、類似性）に関しては、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性が存在する。これらの語は該配列の対立遺伝子変異をも包含する。
配列相同性の計算
本明細書に記載の配列のいずれかに関する配列同一性は、該配列の任意の１以上と別の配列との簡単な「凝視」比較（すなわち、厳密な比較）により決定することが可能であり、それにより、該配列に対してその別の配列が例えば少なくとも７０％の配列同一性を有するかどうかを調べることが可能である。
相対的な配列同一性は、例えばデフォルトパラメータを用いて、同一性決定用の任意の好適なアルゴリズムを使用して２以上の配列間の同一性（％）を計算しうる市販のコンピュータプログラムによっても決定することができる。そのようなコンピュータプログラムの典型例として、ＣＬＵＳＴＡＬが挙げられる。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための他のコンピュータプログラム法には、限定的なものではないがＧＣＧプログラムパッケージ（Devereuxら 1984 Nucleic Acids Research 12: 387）およびＦＡＳＴＡ（Atschulら 1990 J Molec Biol 403-410）が含まれる。
相同性（％）は連続的な配列の全体にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアライメントし、一方の配列内の各アミノ酸を他方の配列内の対応アミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは「非ギャップ化（ungapped）」アライメントと称される。典型的には、そのような非ギャップ化アライメントは、比較的短い残基数にわたって行われるに過ぎない。
これは非常に簡便かつ堅実な方法ではあるが、それは、例えば、１つの挿入または欠失が存在する以外は同一の配列ペアの場合に、かかる１つの挿入または欠失が存在することにより後続のアミノ酸残基がアライメントされず、大域アライメントを行った場合に相同性（％）の大きな低下を引き起こす可能性があることを考慮していない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアが不当に損なわれることなく、考えられうる挿入および欠失を考慮して、最適なアライメントをあたえるよう設計されている。これは、局所相同性を最大にするように配列アライメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、アライメント内に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割当てて、同数の同一アミノ酸について、可能な限り少数のギャップを有する配列アライメント（これは、２つの比較配列間の、より高い関連性を表す）が、多数のギャップを有するものより高いスコアを得るようにする。ギャップの存在に関しては比較的大きな代償を、ギャップにおける各後続残基に関してはより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的には用いられる。これは、最もよく用いられているギャップスコアリングシステムである。もちろん、高いギャップペナルティは、より少数のギャップを有する最適化アライメントを与えるであろう。ほとんどのアライメントプログラムではギャップペナルティの改変が可能である。しかし、かかるソフトウェアを配列比較のために使用する場合には、デフォルト値を使用するのが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合には、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティは１つのギャップにつき−１２であり、各伸長につき−４である。
したがって、最大相同性（％）の計算には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アライメントの生成を要する。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereuxら, 1984, Nucleic Acids Research 12:387）が挙げられる。配列比較を行いうる他のソフトウェアの具体例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubelら, 1999 前掲-第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Atschulら, 1990, J. Mol. Biol., 403-410）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールの一式が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共に、オフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ausubelら, 1999 前掲, p. 7-58〜7-60）。
最終的な相同性（％）は同一性に関して測定することができるが、アライメント過程自体は、典型的には、オール・オア・ナッシング（all-or-nothing）ペア比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割当てる基準化（scaled）類似性スコアマトリックスが一般には使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラム一式のためのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般には、公になっているデフォルト値、または供給される場合には特別記号比較表（custom symbol comparison table）を用いる。ＧＣＧパッケージには公になっているデフォルト値を、他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用するのが好ましい。
有利には、パラメータをデフォルト値に設定してＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはhttp://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlに詳細に記載されており、それを参照により本明細書に組み入れることとする。検索パラメータを定義し、所定のデフォルトパラメータよりも有利に設定することが可能である。
有利には、ＢＬＡＳＴにより評価した場合の「実質的な同一性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値でマッチする配列に相当する。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴに関するデフォルト閾値は通常は１０である。
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘプログラムにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは有意性を、少数の改良を伴うKarlinおよびAltschul（KarlinおよびAltschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlを参照されたい）の統計学的方法を用いたそれらの発見に帰する。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索のために、例えば、問い合わせ配列に対するホモログを特定するために適合化されている。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察には、Altschulら (1994) Nature Genetics 6:119-129を参照されたい。
http://www.ncbi.nlm.nih.govにおいて利用可能な５種類のＢＬＡＳＴは以下のタスクを行う：ｂｌａｓｔｐはアミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースに対して比較する；ｂｌａｓｔｎはヌクレオチド問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；ｂｌａｓｔｘはヌクレオチド問い合わせ配列（両鎖）についての６つのフレームでの仮想的翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較する；ｔｂｌａｓｔｎはタンパク質問い合わせ配列を、全６リーディングフレームにおいてダイナミックに翻訳されたヌクレオチド配列データベース（両鎖）に対して比較する；ｔｂｌａｓｔｘはヌクレオチド問い合わせ配列の６つのフレームでの翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６つのフレームでの翻訳物に対して比較する。
ＢＬＡＳＴは以下の検索パラメータを使用する：
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索に関するスコアのヒストグラムを示す。デフォルトはｙｅｓである（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＨを参照されたい）。
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−報告されたマッチ配列の短い説明の数を、特定された数に限定する。デフォルト制限は１００この説明である（マニュアルページのパラメータＶを参照されたい）。
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値である。デフォルト値は１０であり、KarlinおよびAltschul (1990)の確率モデルによると１０個のマッチは単に偶然に見出されると予想される。マッチの結果とされる統計的有意性がＥＸＰＥＣＴ閾値より大きい場合には、該マッチは報告されない。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値はより厳格であり、より少数の偶然的マッチの報告につながる。分数値が許容される（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＥを参照されたい）。
ＣＵＴＯＦＦ−高スコアセグメントペアを報告するためのカットオフスコアである。デフォルト値はＥＸＰＥＣＴ値（前記を参照されたい）から計算される。ＨＳＰがデータベース配列に関して報告されるのは、それらの結果とされる統計的有意性が少なくとも、カットオフ値に等しいスコアを有する単独（lone）ＨＳＰの結果であると考えられるのと少なくとも同程度に高い場合のみである。より高いカットオフ値はより厳格であり、より少数の偶然的マッチの報告につながる（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＳを参照されたい）。典型的には、有意性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを使用して、より直観的に管理される。
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−データベース配列を、高スコアセグメントペア（ＨＳＰ）が報告される特定された数に限定する。デフォルト制限は５０である。これより多数のデータベース配列が報告のための統計的有意性閾値を満たした場合には（上記ＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦを参照されたい）、最大統計的有意性の原因とされるマッチのみが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＢを参照されたい）。
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸのための択一的（alternate）スコアリングマトリックスを特定する。デフォルトマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２（Henikoff & Henikoff, 1992）である。有効な選択肢には、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹが含まれる。ＢＬＡＳＴＮには択一的スコアリングマトリックスは利用できず、ＢＬＡＳＴＮのリクエストにおいてＭＡＴＲＩＸ指令を特定すると、エラー応答が返される。
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮ検索をデータベース配列の上鎖または下鎖のみに限定するか、あるいはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸ検索を問い合わせ配列の上鎖または下鎖上のリーディングフレームのみに限定する。
ＦＩＬＴＥＲ−Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のＳＥＧプログラムによる判定で低い組成複雑度を有する問い合わせ配列のセグメント、またはClaverie & States (1993) Computers and Chemistry 17:191-201のＸＮＵプログラムもしくはＢＬＡＳＴＮの場合にはTatusovおよびLipmanのＤＵＳＴプログラムによる判定で短い周期性内部反復からなるセグメントをマスクする（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。フィルタリングは、ｂｌａｓｔ出力からの統計的には有意であるが生物学的には興味を引かれない報告（例えば、一般的な酸性領域、塩基性領域またはプロリンに富む領域に対するヒット）を排除して、データベース配列に対する特異的マッチに関して入手可能な、問い合わせ配列の、より生物学的に興味を引かれる領域を残す。
フィルタープログラムにより見出される低い複雑性の配列は、ヌクレオチド配列においては文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）を、タンパク質配列においては文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置換される。
フィルタリングは問い合わせ配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはＢＬＡＳＴＮに対してはＤＵＳＴ、他のプログラムに対してはＳＥＧである。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおいて配列に適用された場合には、ＳＥＧ、ＸＮＵまたはそれらの両方によっては何も全くマスクされないことは珍しいことではなく、したがって、フィルタリングが常に有効であると期待すべきではない。さらに、場合によっては、配列がそれらの全体においてマスクされることがあり、このことは、未フィルター問い合わせ配列に対する報告されたいずれのマッチの統計的有意性も疑わしいことを示している。
ＮＣＢＩ−ｇｉは登録番号よび／または遺伝子座名のほかにＮＣＢＩ ｇｉ識別子を出力において表示する。
最も好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにおいて提供される単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して配列比較を行う。いくつかの実施形態においては、配列同一性を決定する際にギャップペナルティを使用しない。
ハイブリダイゼーション
本明細書は、本明細書に記載の配列またはそのいずれかの断片もしくは誘導体または前記のいずれかの相補体にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列をも記載する。
ハイブリダイゼーションとは、「核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する過程」（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）、ならびにDieffenbach CWおよびGS Dveksler（1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）に記載のポリメラーゼ連鎖反応技術で行われる増幅の過程を意味する。
ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）において教示されているとおり、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、後記のとおり、一定の「ストリンジェンシー」をもたらす。
本明細書に記載のヌクレオチド配列またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列は、一般には、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５もしくは３０、例えば少なくとも４０、６０もしくは１００個またはそれ以上の連続的なヌクレオチドの領域にわたって、本明細書に記載の対応するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％または９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％または９８％相同である。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１、２または４に相同な領域を含み、好ましくは、それらの配列の１つに対して少なくとも７０％、８０％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同な領域を含む。
「選択的にハイブリダイズしうる」なる語は、バックグラウンドを著しく超えるレベルで標的ヌクレオチド配列がプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で、該プローブとして使用されるヌクレオチド配列を使用することを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばスクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー内に存在する他のヌクレオチド配列が原因となって生じうる。この事象においては、バックグラウンドは、標的ＤＮＡとの間で観察される特異的相互作用の１０分の１未満、好ましくは１００分の１未満の強度の、該プローブと該ライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用により生じたシグナルのレベルを示す。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば３２Ｐで放射標識することにより測定することができる。
中等度から最高のストリンジェンシーの条件下で本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列も本明細書の範囲内に含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）において教示されているとおり、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、以下に説明するとおり、一定の「ストリンジェンシー」をもたらす。
最高のストリンジェンシーは、典型的には、およそＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）の温度でもたらされ、高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度でもたらされ、中等度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度でもたらされ、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度でもたらされる。当業者に理解されるとおり、最高のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一ヌクレオチド配列を特定または検出するために用いることができる。一方、中等度（または低い）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似もしくは関連したヌクレオチド配列を特定または検出するために用いることができる。
好ましい実施形態においては、本発明者らは、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃かつ０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で、Ｋｖ９．２サブユニットヌクレオチド配列の１以上にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を記載する。該ヌクレオチド配列が二本鎖である場合には、該二重鎖の両鎖が、個々にまたは組み合わせて包含される。該ヌクレオチド配列が一本鎖である場合には、そのヌクレオチド配列の相補配列も本明細書の範囲内に含まれると理解されるべきである。
本発明者らは更に、本明細書に記載の配列に相補的な配列またはそのいずれかの断片もしくは誘導体にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を記載する。同様に、本明細書に記載の配列にハイブリダイズしうる配列に相補的なヌクレオチド配列も包含される。これらのタイプのヌクレオチド配列が変異体ヌクレオチド配列の具体例である。この点において、「変異体」なる語は、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる配列に相補的な配列を包含する。しかし、好ましくは、「変異体」なる語は、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃かつ０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる配列に相補的な配列を含む。
Ｋｖ９．２サブユニットおよびホモログのクローニング
本発明者らは更に、本明細書に記載の配列またはその任意の断片もしくは誘導体に相補的なヌクレオチド配列を記載する。該配列がその断片に相補的である場合には、その配列は、他の生物などにおける類似サブユニット配列を特定しクローニングするためのプローブとして使用することができる。
したがって、本明細書の開示は、ヒトおよび他の種、例えばマウス、ブタ、ヒツジなどからのＫｖ９．２、そのホモログおよび他の構造的または機能的に関連した遺伝子のクローニングの達成を可能にする。配列番号１、配列番号２、配列番号４またはそれらの断片に含まれるヌクレオチド配列に同一であるまたは十分に同一であるポリヌクレオチドは、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする部分的または完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを適当なライブラリーから単離するためのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。そのようなプローブは、Ｋｖ９．２遺伝子に対して配列類似性、好ましくは高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からのホモログおよびオルソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するためにも使用することができる。ハイブリダイゼーションスクリーニング、クローニングおよび配列決定技術は当業者に公知であり、例えばSambrookら（前掲）に記載されている。
典型的には、プローブとしての使用に適したヌクレオチド配列は対象のヌクレオチド配列に対して７０％同一、好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一、より一層好ましくは９５％同一である。該プローブは一般には、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０ヌクレオチドを有し、少なくとも５０ヌクレオチドを有しうる。特に好ましいプローブは１５０〜５００ヌクレオチドの範囲であり、さらに特に好ましくは約３００ヌクレオチドである。
１つの実施形態においては、ヒト以外の種からのホモログおよびオルソログをはじめとするＫｖ９．２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号４またはそれらの断片を有する標識プローブで適当なライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに該ポリヌクレオチド配列を含有する部分的または完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップを含む。そのようなハイブリダイゼーション技術は当業者に周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは前記で定義されているとおりであるか、あるいは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストランおよび２０マイクログラム／ｍｌ 変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーションならびにそれに続く０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄という条件である。
Ｋｖ９．２含有イオンチャネルに関する機能アッセイ
クローニングされた推定Ｋｖ９．２イオンチャネルポリヌクレオチドは配列解析または機能アッセイにより確認することができる。特に、後記のスクリーニングアッセイに有用なＫｖ９．２活性を測定および定量する手段として、記載されているとおりにトランスフェクトされたツメガエル（Xenopus）卵母細胞のコンダクタンスを検出することができる。かかるツメガエル卵母細胞電気生理学的アッセイを、便宜上、「Ｋｖ９．２の機能アッセイ（電気生理学）」と称する。
推定Ｋｖ９．２イオンチャネルサブユニットまたはホモログは「Ｋｖ９．２の機能アッセイ（電気生理学）」において活性に関して以下のとおりにアッセイすることができる。Ｋｖ９．２ ｃＤＮＡをコードする線状化プラスミド鋳型からのキャップ化ＲＮＡ転写産物を、標準的な手順に従い、ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物を０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水に懸濁する。卵巣葉（ovarian lobe）を成体雌カエルから摘出し、第Ｖ期脱卵胞化卵母細胞を得て、マイクロインジェクション装置を使用してＲＮＡ転写産物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌのボーラスで注入する。ヘテロマー型チャネルを形成させるために、他のＫｖサブユニット、例えばＫｖ２．１、Ｋｖ４．２をコードするＲＮＡも注入する。二電極電位クランプを使用して、アゴニストの曝露に応答した個々のツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。電流の記録は、ＮａＣｌ １１５、ＫＣｌ ２．５、ＣａＣｌ２ １．８、ＮａＯＨ−ＨＥＰＥＳ １０（ｐＨ７．２）（ｍＭ単位）からなる標準培地中、室温で行う。後記で更に詳しく説明するとおり、該ツメガエル系は、公知リガンドおよび組織／細胞抽出物をリガンド活性化に関してスクリーニングするためにも使用することができる。
代替的な機能アッセイには、パッチクランプ電気生理学、Ｒｂフラックス、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分析およびＦＬＩＰＲ分析、例えば、細胞の膜電位を調べるための電位感受性色素の使用が含まれる。ＦＬＩＰＲアッセイはWhiteakerら, J Biomol Screen. 2001 Oct;6(5):305-1に記載されており、ＦＲＥＴに基づくアッセイはFalconerら, J Biomol Screen. 2002 Oct;7(5):460-5に記載されている。
特に、本発明者らは、Ｒｂフラックスを検出するアッセイ、ならびにＫｖ９．２のアゴニストおよびアンタゴニストを特定するためにＲｂフラックスにおける変化を検出するスクリーニングを開示する。放射標識Ｒｂフラックスを測定するための方法はRezazadehら J Biomol Screen. 2004 Oct;9(7):588-97に概説されており、非放射標識ＲｂフラックスアッセイはAssay Drug Dev Technol. 2004 Oct;2(5):525-34に概説されている。好ましくは、該アッセイにおいてはＲｂ流出（％）を測定する。
かかる機能アッセイは本明細書においては「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（Ｒｂフラックス）」と称される。
特に、本発明は、Ｋｖ９．２のアンタゴニストが、適切にトランスフェクトされた細胞のＲｂ流出（％）を低減させる方法を開示する。好ましくは、Ｒｂ流出（％）は、Ｋｖ９．２のアンタゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上低下する。
本発明者らは更に、適切にトランスフェクトされた細胞のＲｂ流出（％）を、Ｋｖ９．２のアゴニストが増大させる方法を開示する。好ましくは、Ｒｂ流出（％）は、Ｋｖ９．２のアゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上増加する。
細胞からの流出Ｒｂ＋のカイネティクス分析は、以下の式：
Ｒ＝［Ｒｂライセート／（Ｒｂ上清＋Ｒｂライセート）］×１００
を用いて、残留の比率Ｒ（％）として表される。
種々の時点における脱分極およびアゴニスト刺激Ｒｂ＋流出（Ｒｓ）は
Ｒｓ＝（１−［（Ｒｔｏｔ−Ｒ−Ｒ基底）／−Ｒ基底］）×１００
に従い決定することができる。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは更に、活性化（activation）、非活性化（deactivation）および不活性化（inactivation）を含むそのカイネティクスに関してアッセイすることができる。活性化時間は、標準的な条件下でＫｖ９．２含有チャネルを通過する全電流を達成するのに要する時間であり、非活性化時間は、標準的な条件下で全電流がゼロになるまでに要する時間である。Ｋｖ９．２カイネティクスのモジュレーション、増大または低減に言及されている場合には、これは、好ましくはＫｖ９．２活性化時間またはＫｖ９．２非活性化時間またはそれらの両方のモジュレーション、増大または低減に言及されていると解釈されるべきである。
好ましい実施形態においては、活性化時間の尺度として活性化時間定数を用い、非活性化時間の尺度として非活性化時間定数を用いる。Ｋｖ９．２含有チャネルに関する典型的な活性化時間定数は２１ｍｓである。典型的な半不活性化電位Ｖ１／２不活性化は−３３ｍＶであり、Ｖ１／２不活性化は、不活性化の更なるまたは代替的なカイネティクスパラメータとしてアッセイすることができる。
Ｋｖ９．２含有チャネルのモジュレーター、例えば開口剤（オープナー）、アゴニスト、ブロッカーおよびアンタゴニストは、Ｋｖ９．２含有チャネルのカイネティクス、好ましくは、活性化時間、不活性化時間、非活性化時間、非活性化カイネティクス、半不活性化電位などののうちのいずれか１以上を変化させる、すなわち、増大または低減させることができる。
特に、アゴニストおよび開口剤は、活性化時間および／または非活性化時間（好ましくは活性化時間および／または非活性化時間定数）を好ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低減させることができる分子であり、これはすなわち、活性化時間を例えば２０ｍｓ、１８ｍｓ、１６ｍｓもしくは１５ｍｓまたはそれ未満にまで低減させることによる。
同様に、Ｋｖ９．２のアンタゴニストまたはブロッカーは、活性化時間および／または非活性化時間を好ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上増大させることができる分子であり、これはすなわち、活性化時間を例えば２２ｍｓ、２５ｍｓもしくは２７ｍｓまたはそれ以上にまで増大させることによる。
カイネティクス、特に活性化時間は、好ましくは、「Ｋｖ９．２の機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定することが可能であり、この場合、電流の時間経過を測定し、全電流の達成に要した時間を確定する。同様に、不活性化時間は、「Ｋｖ９．２の機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定し、この場合、電流の時間経過を測定し、全電流が０まで低下するのに要した時間を確定する。
あるいは、前パルス（例えば、＋５０ＭＶ、５００ｍｓ）後の再分極パルス（例えば、−４０ｍＶまで）後に該チャネルが非活性化するのに要する時間の尺度である非活性化カイネティクスをアッセイすることができる。Ｋｖ９．２含有チャネルの非活性化カイネティクスに関する典型的な値は４４ｍｓである。
Ｋｖ９．２に関する発現アッセイ
Ｋｖ９．２関連疾患を治療するための有用な治療剤を設計するためには、Ｋｖ９．２（野生型または特定の突然変異体）の発現プロファイルを決定することが有用である。例えば、Ｋｖ９．２が発現する器官、組織および細胞型（および発生段階）を決定するためには、当該技術分野で公知の方法が用いられる。例えば、従来のまたは「電子的」なノーザン法を行うことができる。Ｋｖ９．２遺伝子または突然変異体の発現をアッセイするために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）も用いることができる。Ｋｖ９．２の発現プロファイルを決定するための、より高感度な方法には、当該技術分野で公知のＲＮアーゼプロテクションアッセイが含まれる。
ノーザン分析は、遺伝子の転写産物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞型または組織からのＲＮＡが結合しているメンブレンへの標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む（Sambrook, 前掲, 第７章ならびにAusubel, F. M.ら, 前掲, 第４章および第１６章）。ヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Incyte Pharmaceuticals）内の同一または関連分子を検索するためには、ＢＬＡＳＴを適用する同様のコンピュータ技術（「電子的ノーザン」）を用いることができる。このタイプの分析は、複数のメンブレンに基づくハイブリダイゼーションより迅速でありうるという利点を有する。また、いずれかの特定のマッチが厳密マッチとして分類されるのか相同マッチとして分類されるのかを決定するために、該コンピュータ検索の感度を改変することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書中に更に詳しく説明されているとおり、動物およびヒトの疾患の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用することができる。
Ｋｖ９．２ポリペプチドの発現
本発明者らは更に、Ｋｖ９．２ポリペプチドの生成方法を開示する。該方法は、一般には、他のＫｖファミリーメンバーの存在下または非存在下にＫｖ９．２ポリペプチドまたはそのホモログ、変異体もしくは誘導体をコードする核酸を含む宿主細胞を適当な条件（すなわち、Ｋｖ９．２ポリペプチドが発現される条件）下で培養するステップを含む。
生物学的に活性なＫｖ９．２含有イオンチャネルを発現させるためには、Ｋｖ９．２サブユニットまたはそのホモログ、変異体もしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有するベクター）内に挿入する。
Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列と適当な転写および翻訳制御エレメントとを含有する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。そのような技術はSambrook, J.ら（1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第４、８および１６−１７章, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.）およびAusubel, F. M.ら（1995および定期的補遺; Current Protocols in Molecular Biology, 第９、１３および１６章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）に記載されている。
Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列を含有させ発現させるためには、種々の発現ベクター／宿主系を使用することができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系が含まれるが、これらに限定的されるものではない。かかる使用は、用いる宿主細胞によっては限定されない。
「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行わせる、ベクターの非翻訳領域（すなわち、エンハンサー、プロモーターならびに５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントはそれらの強度および特異性において様々でありうる。使用するベクター系および宿主に応じて、構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む多数の適当な転写および翻訳エレメントを使用することができる。例えば、細菌系におけるクローニングの場合には、誘導性プロモーター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Stratagene, La Jolla, Calif.）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（GIBCO/BRL）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどを使用することができる。昆虫細胞においてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを使用することができる。植物細胞ゲノム由来（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯおよび貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルス由来（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）のプロモーターまたはエンハンサーを該ベクター内にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列の複数のコピーを含有する細胞株を作製することが必要な場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
細菌系においては、Ｋｖ９．２サブユニットに対して意図される用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の誘導のために大量のＫｖ９．２サブユニットが必要な場合には、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現をもたらすベクターを使用することができる。そのようなベクターには、多機能性大腸菌（E.coli）クローニングおよび発現ベクター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene）（この場合、ハイブリッドタンパク質が産生されるよう、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列をβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基の配列とインフレームで該ベクター内にライゲーションする）、ｐＩＮベクター（Van Heeke, G.およびS. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、ｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）も使用することができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着およびそれに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製することができる。対象となるクローン化ポリペプチドを随意にＧＳＴ部分から遊離させることができるよう、かかる系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビンまたはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）においては、構成性または誘導性プロモーター、例えばα因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含有する多数のベクターを使用することができる。総説としては、Ausubel（前掲）およびGrantら（1987; Methods Enzymol. 153:516-544）を参照されたい。
植物発現ベクターを使用する場合には、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列の発現は多数のプロモーターのいずれかにより駆動することができる。例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを単独でまたはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と共に使用することができる（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311）。あるいは、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを使用することができる（Coruzzi, G.ら (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.ら (1984) Science 224:838-843; およびWinter, J.ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの構築物は直接的なＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入することができる。そのような技術は、一般に入手可能な多数の総説に記載されている（例えば、Hobbs, S.またはMurry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196を参照されたい）。
Ｋｖ９．２サブユニットを発現させるために、昆虫系も使用することができる。例えば、１つのそのような系においては、ヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファ・カルフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用することができる。Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列は該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置することができる。Ｋｖ９．２サブユニットの挿入が成功すれば、ポリヘドリン遺伝子は不活性になり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生される。ついで、該組換えウイルスを使用して、例えばヨウトガ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させ、そこでＫｖ９．２含有イオンチャネルを発現させることができる（Engelhard, E. K.ら (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。
哺乳動物宿主細胞においては、ウイルスに基づく多数の発現系を使用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合には、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列を、後期プロモーターと三つ組リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳制御複合体に連結させることが可能である。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域内の挿入を用いて、感染宿主細胞内でＫｖ９．２サブユニットを発現しうる生存可能な組換えウイルスを得ることができる（Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。また、哺乳動物宿主細胞内での発現を増強するために、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを使用することができる。
かようにして、例えば、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着ＣＨＯ細胞内でＫｖ９．２含有チャネルを発現させる。チャネルの発現を最大限にするために、典型的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクター内への挿入の前に、すべての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去する。該細胞をリポフェクションにより個々のチャネルｃＤＮＡでトランスフェクトし、４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下で選択する。３週間の選択の後、個々のクローンを拾い、更なる分析のために増殖させる。該ベクターのみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を陰性対照として使用する。個々のチャネルを安定に発現する細胞株を単離するために、典型的には約２４個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析により分析する。チャネルｍＲＮＡは、一般には、分析したＧ４１８耐性クローンの約５０％において検出可能である。
プラスミドに保持させて発現させることができるＤＮＡ断片より大きなＤＮＡ断片を送達するために、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）も使用することができる。約６ｋｂから１０ＭｂのＨＡＣを構築し、治療目的のために通常の送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノ重合体または小胞）で送達する。
Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列の、より効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルも使用することができる。かかるシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列ならびにその開始コドンおよび上流配列を適当な発現ベクター内に挿入する場合には、追加的な転写または翻訳制御シグナルは必要でない場合がある。しかし、コード配列またはその断片のみを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを付与すべきである。さらに、インサート全体の翻訳が保証されるよう、開始コドンは、適切なリーディングフレームで存在すべきである。外来性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方を含む種々の起源に由来しうる。発現の効率は、文献（Scharf, D.ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-16）に記載されているものなどの、使用する特定の細胞系に適したエンハンサーの含有により増強することができる。
また、宿主細胞株は、所望の様式で挿入配列の発現をモジュレートするかまたは発現タンパク質をプロセシングするその能力に関して選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な挿入、フォールディングおよび／または機能を促進するために、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングも利用することができる。特定の細胞内装置および翻訳後活性のための特徴的なメカニズムを有する種々の宿主細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Bethesda, Md.）から入手可能であり、外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングが保証されるよう選択することができる。
長期的な組換えタンパク質の高収率産生のためには、安定発現が好ましい。例えば、発現ベクター（ウイルス複製起点および／または内在性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同一または別々のベクター上に含有しうる）を使用して、Ｋｖ９．２ホモマー型またはヘテロマー型イオンチャネルを安定に発現しうる細胞株を形質転換することが可能である。該ベクターの導入後、細胞を富化培地内で約１〜２日間増殖させ、ついで選択培地への変更を行うことが可能である。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された耐性クローンは、該細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることが可能である。
形質転換細胞株を回収するために、多数の選択系を使用することができる。これらには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler, M.ら (1977) Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I.ら (1980) Cell 22:817-23）（それらは、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、選択の基礎として、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を付与し（Wigler, M.ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）、ｎｐｔは、アミノグリコシド系であるネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere-Garapin, F.ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）、ａｌｓまたはｐａｔは、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murry, 前掲）。以下のような他の選択遺伝子も記載されている。例えば、ｔｒｐＢは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にし、ｈｉｓＤは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする（Hartman, S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーを用いる可視マーカーの利用が盛んに行われている。これらのマーカーは、形質転換体を特定するためだけではなく、特定のベクター系による一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するためにも使用することができる（Rhodes, C. A.ら (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、対象となる遺伝子も存在することを示唆するが、該遺伝子の存在および発現を確認することが必要な場合もある。例えば、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合には、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列を含有する形質転換細胞はマーカー遺伝子機能の非存在により特定することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下に、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列と直列に配置することができる。誘導または選択に対して応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、直列遺伝子の発現をも示す。
あるいは、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする核酸配列を含有しＫｖ９．２サブユニットを発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法により特定することができる。これらの方法には、核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量のためのメンブレン、溶液もしくはチップに基づく技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
Ｋｖ９．２サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、Ｋｖ９．２サブユニットをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイは、Ｋｖ９．２サブユニットをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する形質転換体を検出するための、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を伴う。
該タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、Ｋｖ９．２サブユニットの発現を検出し測定するための種々のプロトコールが、当該技術分野で公知である。かかる技術の具体例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光標示式細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。Ｋｖ９．２サブユニット上の２つの非妨害エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する、２部位モノクローナル抗体イムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらおよび他のアッセイは、当該技術分野において、例えばHampton, R.ら（1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.）およびMaddox, D. E.ら（1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）に十分に記載されている。
多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。Ｋｖ９．２サブユニットをコードするポリヌクレオチドに関連した配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生成するための手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅（標識ヌクレオチドを使用するもの）が含まれる。あるいは、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクター内にクローニングすることができる。そのようなベクターは当該技術分野で公知であり、市販されており、適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６および標識ヌクレオチドの添加によりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。これらの方法は、Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, Mich.）、Promega（Madison, Wis.）およびU.S. Biochemical Corp.（Cleveland, Ohio）により供給されているものを含む種々の市販のキットを使用して行うことができる。検出を容易にするために使用することができる適当なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光または発色剤および基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが含まれる。
Ｋｖ９．２サブユニットをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、該タンパク質の発現および細胞培養からのその回収に適した条件下で培養することができる。形質転換細胞により産生されたタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに応じて、細胞膜に存在するか、分泌されるか、あるいは細胞内に含まれる場合がある。当業者に理解されるとおり、Ｋｖ９．２サブユニットをコードするポリヌクレオチドを保持する発現ベクターは、原核または真核細胞膜を介したＫｖ９．２サブユニットの分泌をもたらすシグナル配列を含有するように設計することができる。他の構築物を使用して、Ｋｖ９．２サブユニットをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結することが可能である。かかる精製促進ドメインには、金属キレート化ペプチド、例えば、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp., Seattle, Wash.）において使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製ドメインとＫｖ９．２サブユニットコード配列との間に、切断可能なリンカー配列、例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Invitrogen, San Diego, Calif.）を含有させて、精製を容易にすることが可能である。１つのかかる発現ベクターは、Ｋｖ９．２サブユニットと、６個のヒスチジン残基をコードする核酸と、その後ろにチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位とを含有する融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＩＡＣ；Porath, J.ら (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載）上での精製を促進し、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からＫｖ９．２サブユニットを精製するための手段となる。融合タンパク質を含有するベクターについての考察はKroll, D. J.ら（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に記載されている。
Ｋｖ９．２サブユニットの断片は、組換え生産によってだけでなく、固相技術を用いる直接的なペプチド合成（Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154）によっても生成することができる。タンパク質合成は手動技術または自動化により行うことができる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を使用して達成することができる。Ｋｖ９．２サブユニットの種々の断片を別々に合成し、ついでそれをつなげて完全長分子を得ることが可能である。
バイオセンサー
Ｋｖ９．２ポリペプチド、核酸、プローブ、抗体、発現ベクターおよびリガンドはバイオセンサーとして（およびその作製に）有用である。
Aizawa (1988), Anal. Chem. Symp. 17: 683によると、バイオセンサーとは、分子認識のための標的、例えば固定化抗体またはチャネル（例えばＫｖ９．２）を含有する選択層と、測定された値を送信するトランスデューサとの特有の組み合わせと定義される。かかるバイオセンサーの一群は、該チャネルとその周囲の培地との相互作用により表面層の光学的特性において生じる変化を検出する。そのような技術のなかでは特に、偏光解析および表面プラズモン共鳴が挙げられる。Ｋｖ９．２リガンドの存在またはレベルを検出するために、Ｋｖ９．２を組み込んだバイオセンサーを使用することができる。かかるバイオセンサーの構築は当該技術分野で周知である。
したがって、［３Ｈ］イノシトールリン酸または他の二次メッセンジャーの受容体誘発性形成によるリガンド（例えば、ＡＴＰ）の検出のためのレポーター系として、Ｋｖ９．２を発現する細胞株を使用することができる（Wattら, 1998, J Biol Chem May 29;273(22):14053-8）。受容体−リガンドバイオセンサーもHoffmanら, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A Oct 10;97(21):11215-20に記載されている。例えばFiglerら, 1997, Biochemistry Dec 23;36(51):16288-99およびSarrioら, 2000, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(14):5164-74に記載されているとおり、Ｇタンパク質と他のタンパク質との相互作用のレベルまたは存在を検出するために、Ｋｖ９．２を含む光学的および他のバイオセンサーも使用することができる。バイオセンサーのためのセンサーユニットは例えばＵＳ ５，４９２，８４０に記載されている。
スクリーニングアッセイ
ホモログ、変異体および誘導体をはじめとするＫｖ９．２ポリペプチドは、天然体であるか組換え体であるかには無関係に、Ｋｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネルに結合しＫｖ９．２を活性化（アゴニスト）またはその活性化を抑制（アンタゴニストまたはブロッカー）する化合物に関するスクリーニング法において使用することができる。例えば、そのようなポリペプチドは、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然物混合物における小分子基質ならびにリガンドの結合を評価するためにも使用することができる。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガンドであることが可能であり、あるいは構造的または機能的ミメティック（模擬体）であることが可能である。Coliganら, Current Protocols in Immunology 1(2): 第５章(1991)を参照されたい。
Ｋｖ９．２イオンチャネルポリペプチドは、多数の病態を含む多数の生物学的機能をもたらす。したがって、一方ではＫｖ９．２含有イオンチャネルを刺激しうる化合物および薬物を見出すことが望ましく、他方ではＫｖ９．２イオンチャネルの機能を抑制しうる化合物および薬物を見出すことが望ましい。一般に、不安、ストレス、抑うつまたは糖尿病のような症状の治療および予防目的には、アゴニストおよびアンタゴニストが使用される。
Ｋｖ９．２イオンチャネルタンパク質と相互作用しうる可能性のある候補化合物の理論的設計はポリペプチドの分子形状の構造研究に基づくものでありうる。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するのかを決定するための１つの手段は、物理的構造決定、例えばＸ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術である。これらは、どのアミノ酸残基が分子の接触領域を形成するのかに関する指針を与えるであろう。タンパク質構造決定の詳細な説明に関しては、例えばBlundellおよびJohnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New Yorkを参照されたい。
理論的設計に代わる手段は、一般には、細胞表面上でＫｖ９．２イオンチャネルポリペプチドを発現する適当な細胞を作製することを含むスクリーニング法を用いるものである。かかる細胞には、動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌（E. coli）に由来する細胞が含まれる。ついで、Ｋｖ９．２を発現する細胞（または発現された該タンパク質を含有する細胞膜）を試験化合物と接触させて、結合を、または機能的応答の刺激もしくは抑制を観察する。例えば、ツメガエル卵母細胞にＫｖ９．２ ｍＲＮＡまたはポリペプチドを注入し、試験化合物への曝露により誘導された電流を、さらに詳しく記載されているとおり測定する電位クランプの使用により測定することが可能である。
各候補化合物をＫｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネルを用いて個々に試験する代わりに、候補リガンドのライブラリーまたはバンクを有利に作製しスクリーニングすることができる。したがって、例えば、スクリーニングのために２００種を超える推定リガンドのバンクが構築されている。該バンクは、イオンチャネルを介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン；イオンチャネルの推定アゴニストでありうる天然に存在する化合物、哺乳動物対応物が未だ特定されていない非哺乳動物生物活性ペプチド；ならびに天然には存在しないが未知天然リガンドによりイオンチャネルを活性化する化合物を含む。
機能アッセイ（例えば、Ｒｂフラックスアッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、ＦＬＩＰＲアッセイ、全細胞電気生理学、卵母細胞電気生理学など；他の箇所を参照されたい）および他の箇所に更に詳しく説明されている結合アッセイの両方を用いて既知リガンドに関してＫｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネルをスクリーニングするために、このバンクを使用することができる。しかし、対応する活性化リガンド（アゴニスト）または非活性化リガンド（アンタゴニスト）が現在までに依然として見出されていない多数の哺乳動物チャネルが存在する。したがって、これらの受容体の活性リガンドは、現在までに特定されたものとしてはリガンドバンク内に含まれていない可能性がある。したがって、天然リガンドを特定するために、組織抽出物に対してＫｖ９．２を機能的にスクリーニングする（卵母細胞電気生理学など、機能的スクリーニングを用いて）ことも可能である。ポジティブな機能的応答を与える抽出物を連続的に分画することが可能であり、活性化リガンドが単離され特定されるまで、本明細書に記載のとおりにそれらの画分をアッセイすることが可能である。
もう１つの方法は、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの抑制または刺激を測定することによるイオンチャネルインヒビターに関するスクリーニングを含む。かかる方法は、ホモマー型チャネルを形成させるためにＫｖ９．２サブユニットのみで、またはヘテロマー型チャネルを形成させるために他のＫｖチャネルサブユニットと共に真核細胞をトランスフェクトして、細胞表面上に該イオンチャネルを発現させることを含む。ついで該細胞を、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの存在下、潜在的アンタゴニストに曝露する。電流のコンダクタンスまたはカイネティクスにおける変化を測定するために全細胞電気生理学的方法を用いて、該細胞を試験することが可能である。
Ｋｖ９．２のアゴニストまたはアンタゴニストを検出するためのもう１つの方法は、米国特許第５，４８２，８３５号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されている、酵母に基づく技術である。
好ましい実施形態においては、該スクリーニングは、Ｋｖ９．２のアゴニストおよびアンタゴニストに関してスクリーニングするためにコンダクタンスにおける変化の検出を用いる。特に、本発明者らは、適切にトランスフェクトされた細胞のコンダクタンスをＫｖ９．２のアンタゴニストが低減させる方法を開示する。好ましくは、コンダクタンスは、Ｋｖ９．２のアンタゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上低減する。好ましくは、コンダクタンスは、Ｋｖ９．２のアンタゴニストの存在下で、１ｐＳ、２ｐＳ、３ｐＳ、４ｐＳ、５ｐＳ、１０ｐＳ、１５ｐＳ、２５ｐＳ、３５ｐＳ、４５ｐＳ、６０ｐＳ、７０ｐＳまたはそれ以上低減する。
本発明者らは更に、適切にトランスフェクトされた細胞のコンダクタンスをＫｖ９．２のアゴニストが増大させる方法を開示する。好ましくは、コンダクタンスは、Ｋｖ９．２のアゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上増大する。好ましくは、コンダクタンスは、Ｋｖ９．２のアゴニストの存在下で、１ｐＳ、２ｐＳ、３ｐＳ、４ｐＳ、５ｐＳ、１０ｐＳ、１５ｐＳ、２５ｐＳ、３５ｐＳ、４５ｐＳ、６０ｐＳ、７０ｐＳまたはそれ以上増大する。
別の好ましい実施形態においては、該スクリーニングは、Ｋｖ９．２のアゴニストおよびアンタゴニストに関してスクリーニングするために、放射標識Ｒｂフラックス、好ましくはＲｂ流出（％）における変化の検出を用いる。好ましくは、該スクリーニングは、「Ｋｖ９．２の機能アッセイ（Ｒｂフラックス）」として前記で説明した機能アッセイを用いる。
特に、本発明者らは、適切にトランスフェクトされた細胞のＲｂ流出（％）をＫｖ９．２のアンタゴニストが低減させる方法を開示する。好ましくは、Ｒｂ流出（％）は、Ｋｖ９．２のアンタゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上低減する。
本発明者らは更に、適切にトランスフェクトされた細胞のＲｂ流出（％）をＫｖ９．２のアゴニストが増大させる方法を開示する。好ましくは、Ｒｂ流出（％）は、Ｋｖ９．２のアゴニストの存在下で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上増大する。
候補化合物がタンパク質、特に抗体またはペプチドである場合には、ファージディスプレイ技術を用いて候補化合物のライブラリーをスクリーニングすることが可能である。ファージディスプレイは、組換えバクテリオファージを使用する分子スクリーニングのプロトコールである。該技術は、各ファージまたはファージミドが個々の候補化合物を発現するよう、候補化合物のライブラリーからの１つの化合物をコードする遺伝子でバクテリオファージを形質転換することを含む。形質転換されたバクリオファージ（これは、好ましくは、固相に連結されている）は適当な候補化合物を発現し、それを該バクテリオファージのファージコート上に提示する。Ｋｖ９．２ポリペプチドまたはペプチドに結合しうる特定の候補化合物を、アフィニティー相互作用に基づく選択法により富化する。ついで、条件を満たした候補物質の特性決定を行う。ファージディスプレイは、標準的なアフィニティーリガンドスクリーニング技術に対して利点を有する。ファージ表面は三次元立体配置で候補物質を提示し、天然で見出されるそのコンホメーションを、より厳密に模倣する。これは、スクリーニングを目的とした場合の、より特異的かつより高いアフィニティー結合を可能にする。
化合物のライブラリーをスクリーニングするためのもう１つの方法は、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された真核または原核宿主細胞を使用するものである。生存可能なまたは固定された形態のかかる細胞は、標準的な結合パートナーアッセイに使用することができる。Parceら (1989) Science 246:243-247; およびOwickiら (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87;4007-4011（これらは、細胞応答を検出するための高感度法を記載している）も参照されたい。競合アッセイは特に有用であり、この場合、化合物のライブラリーを発現する細胞を、Ｋｖ９．２ポリペプチドに結合することが知られている標識抗体（例えば、１２５Ｉ−抗体）、および試験サンプル（例えば、結合組成物に対する結合アフィニティーが測定されている候補化合物）と接触させ、またはそれらと共にインキュベートする。ついで該ポリペプチドに対する標識結合パートナーについて、結合しているものと遊離のものとを分離して、結合の度合を評価する。結合した試験サンプルの量は、該ポリペプチドに結合する標識抗体の量に反比例する。
結合の度合を評価するために、結合した結合パートナーを遊離結合パートナーから分離するには、多数の技術のいずれかを用いることができる。この分離ステップは、典型的には、フィルターへの接着およびそれに続く洗浄、プラスチックへの接着およびそれに続く洗浄、または細胞膜の遠心分離のような操作を含みうるであろう。
さらにもう１つのアプローチは、例えば形質転換された真核または原核宿主細胞から抽出された可溶化未精製もしくは可溶化精製ポリペプチドまたはペプチドを使用するものである。これは、特異性の増強、自動化することができることおよびハイスループットの薬物試験という利点を有する「分子」結合アッセイを可能にする。
候補化合物スクリーニングのためのもう１つの技術は、例えばＫｖ９．２ポリペプチドに対して適当な結合アフィニティーを有する新規化合物に関するハイスループットスクリーニングをもたらすアプローチを含み、１９８４年９月１３日付け公開の国際特許出願公開第ＷＯ ８４／０３５６４号（Commonwealth Serum Labs.）に詳細に記載されている。まず、多数の異なる小ペプチド試験化合物を固相支持体（例えば、プラスチックピンまたは何らかの他の適当な表面）上で合成する。Fodorら (1991)を参照されたい。ついで、すべてのピンを可溶化Ｋｖ９．２ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次のステップは結合ポリペプチドを検出することを含む。このようにして、該ポリペプチドと特異的に相互作用する化合物が特定される。
リガンド結合アッセイは、薬理学的性質を確認するための直接的な方法であり、ハイスループット形式に適合可能である。精製リガンドは、結合試験のために高い比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）にまで放射標識することができる。ついで、放射標識の過程が標的に対するリガンドの活性を損なわないことを確認する。バッファー、イオン、ｐＨおよび他の修飾要因、例えばヌクレオチドに関するアッセイ条件を最適化して、メンブレン（膜）および全細胞受容体またはイオンチャネル供給源の両方に関する実施可能なシグナル対ノイズ比を確立する。これらのアッセイの場合、特異的結合は、全結合放射活性から、過剰な未標識競合性リガンドの存在下で測定された放射活性を差し引いたものと定義される。可能な場合には、残留非特異的結合を明らかにするために、２以上の競合性リガンドを使用する。
該アッセイでは、単に候補化合物の結合を試験することが可能であり、この場合、候補化合物に直接的または間接的に結合した標識を使用して、あるいは標識競合体との競合を伴うアッセイにおいて、受容体またはイオンチャネルを有する細胞への接着を検出する。さらに、これらのアッセイは、細胞表面に標的を有する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物が、標的の活性化により生じるシグナルをもたらすかどうかを試験しうる。一般には、既知アゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイし、候補化合物の存在による、該アゴニストによる活性化に対する効果を観察する。
さらに、該アッセイは単に、Ｋｖ９．２ポリペプチドを含有する溶液と候補化合物とを混合して混合物を形成させ、該混合物におけるＫｖ９．２含有イオンチャネル活性を測定し、該混合物のＫｖ９．２イオンチャネル活性を標準と比較するステップを含むものでありうる。
Ｋｖ９．２サブユニットｃＤＮＡ、タンパク質、および該タンパク質に対する抗体は、細胞内でのＫｖ９．２サブユニットｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加化合物の効果を検出するためのアッセイを構築するためにも使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、当該技術分野で公知の標準的な方法によりモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用してＫｖ９．２サブユニットタンパク質の分泌または細胞結合レベルを測定するために構築することが可能であり、これは、適切に操作された細胞または組織からのＫｖ９．２サブユニットの産生を抑制または増強しうる物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも称される）を見出すために用いることができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当該技術分野でよく理解されている。
潜在的なＫｖ９．２イオンチャネルアンタゴニストおよびブロッカーの具体例には、抗体、または場合によってはヌクレオチドおよびそれらの類似体、例えばプリンおよびプリン類似体、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質（Ｋｖ９．２含有イオンチャネルのリガンドに密接に関連しているもの）、例えば該リガンドの断片、または該イオンチャネルに結合するが応答を惹起せず該チャネルの活性を妨げない小分子が含まれる。
したがって、ここで、本発明者らは、Ｋｖ９．２ポリペプチドおよび／またはペプチドに特異的に結合しうる化合物を提供する。
「化合物」なる語は、化学的化合物（天然に存在するものまたは合成されたもの）、例えば生物学的巨大分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）、あるいは細菌、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞または組織のような生物学的材料から調製された抽出物、または更には無機元素もしくは分子を意味する。好ましくは、化合物は抗体である。
実施対象のそのようなスクリーニングに必要な材料はスクリーニングキット内に同梱することができる。かかるスクリーニングキットは、Ｋｖ９．２ポリペプチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはＫｖ９．２イオンチャネルポリペプチドの産生を低減または増強する化合物を特定するのに有用である。該スクリーニングキットは、（ａ）Ｋｖ９．２ポリペプチド、（ｂ）Ｋｖ９．２ポリペプチドを発現する組換え細胞、（ｃ）Ｋｖ９．２ポリペプチドを発現する細胞膜、または（ｄ）Ｋｖ９．２ポリペプチドに対する抗体を含む。該スクリーニングキットは、所望により、使用説明書を含みうる。
トランスジェニック動物
本発明者らは更に、通常の発現レベルと比較して通常の、増大した、または減少したレベルで、天然もしくは組換えＫｖ９．２サブユニットおよび／もしくはＫｖ９．２含有イオンチャネル、またはホモログ、変異体もしくは誘導体を発現しうるトランスジェニック動物を開示する。好ましくは、かかるトランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、例えばブタ、ヒツジまたはげっ歯類動物である。最も好ましくは、該トランスジェニック動物はマウスまたはラットである。
本発明者らは、天然Ｋｖ９．２遺伝子の全体または一部分が別の生物由来のＫｖ９．２配列と置き換わっているトランスジェニック動物を開示する。好ましくは、この生物は別の種、最も好ましくはヒトである。非常に好ましい実施形態においては、本発明者らは、そのＫｖ９．２遺伝子全体が実質的にヒトＫｖ９．２遺伝子と置き換わっているマウスを開示する。かかるトランスジェニック動物、およびＫｖ９．２に関して野生型である動物は、Ｋｖ９．２のアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。
例えば、かかるアッセイは、野生型もしくはトランスジェニック動物またはその一部分、好ましくは該トランスジェニック動物の細胞、組織もしくは器官を候補物質に曝露し、Ｋｖ９．２関連表現型、例えば不安または血糖値の低下に関してアッセイすることを含みうる。対応する動物由来の細胞を使用し、コンダクタンスまたはカイネティクスに対する効果に関してアッセイする、細胞に基づくスクリーニングも行うことができる。
本発明者らは更に、本明細書に開示されているＫｖ９．２の機能の任意の１以上が部分的または全体的に損なわれた、機能的に破壊されたＫｖ９．２遺伝子を含むトランスジェニック動物を開示する。Ｋｖ９．２遺伝子の欠失を含む１以上の機能喪失突然変異の結果として機能的Ｋｖ９．２含有イオンチャネルを発現しないトランスジェニック動物（「Ｋｖ９．２ノックアウト」）が含まれる。
Ｋｖ９．２遺伝子の選択された一部分の中に例えば欠失を有する部分的な機能喪失突然変異体、例えば不完全ノックアウトも含まれる。かかる動物は、Ｋｖ９．２配列に対応する一部分、例えば機能的に重要なタンパク質ドメインを選択的に置き換えるかまたは欠失させることにより作製することができる。
かかる完全または部分的な機能喪失突然変異体は、Ｋｖ９．２関連疾患、特に不安および糖尿病のモデルとして有用である。部分的な機能喪失を示す動物を候補物質に曝露して、表現型を増強する物質、すなわち（Ｋｖ９．２の場合には）痛覚鈍麻の増強または観察されるストレスレベル表現型の低減をもたらす物質を特定することが可能である。コンダクタンスまたはカイネティクスにおける低減のような他のパラメータも、本明細書において特定されている方法を用いて検出することができる。
部分的および完全なノックアウトは、Ｋｖ９．２の選択的アゴニストおよび／またはアンタゴニストを特定するためにも使用することができる。例えば、アゴニストおよび／またはアンタゴニストを野生型およびＫｖ９．２欠損動物（ノックアウト）に投与することが可能である。Ｋｖ９．２の選択的アゴニストまたはアンタゴニストは、野生型動物には効果をもたらすがＫｖ９．２欠損動物においては効果をもたらさないことが認められるであろう。詳しくは、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの非存在下で生理的応答を生じるかどうかを決定するために、特定のアッセイを設計して、候補薬物（候補リガンドまたは化合物）を評価する。これは、該薬物を前記のトランスジェニック動物に投与し、ついで該動物を個々の応答に関してアッセイすることにより達成することができる。関連動物由来の細胞を使用し、コンダクタンスまたはカイネティクスに対する効果に関してアッセイする、細胞に基づく同様の方法も行うことができる。かかる動物は、本明細書に記載のスクリーニングにより特定された薬物の効力を試験するためにも使用することができる。
別の実施形態においては、部分的な機能喪失表現型を有するトランスジェニック動物をスクリーニングに使用する。かかる実施形態においては、該スクリーニングは、野生型表現型への部分的または完全な回復または復帰に関してアッセイすることを含みうる。対応する動物由来の細胞を使用し、コンダクタンスまたはカイネティクスに対する効果に関してアッセイする、細胞に基づくスクリーニングも行うことができる。そのような能力を有することが判明した候補化合物はＫｖ９．２アゴニストまたは類似体（アナログ）とみなすことができる。かかるアゴニストは、例えば、個体において血糖値を上昇させるために、あるいはストレスまたは不安レベルを低下させるために使用することができる。
好ましい実施形態においては、トランスジェニックＫｖ９．２動物、特にＫｖ９．２ノックアウト（完全な機能喪失体）は、好ましくは実施例に記載の試験により測定される、実施例に記載の表現型を示す。したがって、Ｋｖ９．２動物、特にＫｖ９．２ノックアウトは、好ましくは、血糖値の低下、不安の増大の任意の１以上を示す。
非常に好ましい実施形態においては、トランスジェニックＫｖ９．２動物、特にＫｖ９．２ノックアウトは、対応野生型マウスと比較して、（場合に応じて）少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％高いかまたは低い測定パラメータを示す。したがって、例えば、実施例に記載のオープンフィールド分析で試験した場合、Ｋｖ９．２欠損マウスは、好ましくは、野生型マウスと比較して統計学的に増大した不動性または減少した移動時間および／または増加した辺縁部滞在時間を示す。総移動距離における減少も見られる。
Ｋｖ９．２欠損トランスジェニック動物に関する、本明細書に開示する表現型は、Ｋｖ９．２の機能喪失に対する類似の効果をもたらす化合物を検出するために、野生型動物を使用するスクリーニングにおいて有用に用いられることが明らかであろう。すなわち、野生型動物を候補化合物に曝露し、不安レベル、血中グルコースレベルなどのような関連Ｋｖ９．２表現型における変化を観察して、Ｋｖ９．２の機能のモジュレーター、特にアンタゴニストを特定することが可能である。細胞表現型、例えば、コンダクタンスの低下またはカイネティクスにおける変化もしくは低減も、本明細書中に特定されている方法を用いて検出することができる。
かかるスクリーニングにより特定された化合物は、Ｋｖ９．２のアンタゴニストとして、例えば鎮痛薬またはストレス軽減薬として、特にＫｖ９．２関連疾患の治療または軽減のために使用することができるであろう。
前記のスクリーニングは、任意の適当なパラメータ、例えば行動的、生理学的または生化学的応答の観察を含みうる。好ましい応答としては生理学的応答が挙げられ、以下の１以上を含みうる：疾患抵抗性への変化；炎症応答の変化；腫瘍感受性の変化；血圧の変化；血管新生；摂食行動の変化；体重の変化；骨密度の変化；体温の変化；インスリン分泌；ゴナドトロピン分泌；鼻内および気管支分泌；血管収縮；記憶障害；不安；不安状態の変化；反射低下または反射亢進；あるいはストレス応答。
生化学的パラメータ、例えばコンダクタンスまたはカイネティクスにおける変化も用いることができる。好ましくは、コンダクタンスは、「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定され、カイネティクス（活性化および／または非活性化時間、好ましくは、活性化時間および／または非活性化時間定数）は、その節に記載されているとおりに測定される。これは、細胞に基づくスクリーニングにおいて特に有用である。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アゴニストに曝露された細胞（例えば、野生型または部分的機能喪失細胞）のコンダクタンスは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも＋３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％増大する。好ましい実施形態においては、これは、本明細書に記載の「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定される。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アゴニストに曝露された細胞（例えば、野生型または部分的機能喪失細胞）のカイネティクス、例えば活性化時間および／または非活性化時間、好ましくは活性化時間および／または非活性化時間定数は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも＋３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％増大する。好ましい実施形態においては、これは、本明細書に記載の「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定される。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アゴニストに曝露された野生型またはＫｖ９．２部分ノックアウト動物の血中グルコースレベルは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも＋３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％上昇する。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２のアンタゴニストにより、かかるアンタゴニストに曝露された野生型または部分的機能喪失動物は、少なくとも部分的な程度に、Ｋｖ９．２の部分的または完全機能喪失突然変異体と少なくとも部分的に同じ表現型を示す。すなわち、好ましいアンタゴニストは、不安の増大、または血糖値の減少、またはコンダクタンスの低減、またはカイネティクスにおける変化もしくは低減、または前記の任意の組み合わせをもたらすものである。好ましくは、対応する表現型は、Ｋｖ９．２ノックアウト動物と同じ程度に現れる。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アンタゴニストに曝露された野生型または部分的機能喪失細胞のコンダクタンスは、Ｋｖ９．２欠損細胞のコンダクタンスの＋８０％以内、好ましくは＋７０％以内、より好ましくは＋６０％以内、より好ましくは＋５０％以内、より好ましくは＋４０％以内、より好ましくは＋３０％以内、より好ましくは＋２０％以内、より好ましくは＋１０％以内、より好ましくは＋５％以内である。好ましい実施形態においては、これは、本明細書に記載の「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定される。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アンタゴニストに曝露された野生型またはＫｖ９．２部分的機能喪失細胞のカイネティクス、すなわち、活性化時間および／または非活性化時間、好ましくは活性化時間および／または非活性化時間定数は、Ｋｖ９．２欠損細胞のカイネティクス（または対応する時間）の＋８０％以内、好ましくは＋７０％以内、より好ましくは＋６０％以内、より好ましくは＋５０％以内、より好ましくは＋４０％以内、より好ましくは＋３０％以内、より好ましくは＋２０％以内、より好ましくは＋１０％以内、より好ましくは＋５％以内である。好ましい実施形態においては、これは、本明細書に記載の「Ｋｖ９．２に関する機能アッセイ（電気生理学）」を用いて測定される。
好ましい実施形態においては、Ｋｖ９．２アンタゴニストに曝露された野生型またはＫｖ９．２部分ノックアウト動物の血中グルコースレベルは、Ｋｖ９．２欠損トランスジェニック動物の血中グルコースレベルの＋８０％以内、好ましくは＋７０％以内、より好ましくは＋６０％以内、より好ましくは＋５０％以内、より好ましくは＋４０％以内、より好ましくは＋３０％以内、より好ましくは＋２０％以内、より好ましくは＋１０％以内、より好ましくは＋５％以内である。
候補薬物（候補リガンドまたは化合物）がＫｖ９．２に結合するかどうかを決定するための結合アッセイにおいて、Ｋｖ９．２ノックアウト動物由来の組織を使用することができる。かかるアッセイは、Ｋｖ９．２含有イオンチャネル産生を欠損するよう操作されたトランスジェニック動物から第１のイオンチャネル調製物を得、いずれかの特定されたＫｖ９．２リガンドまたは化合物に結合することが知られている供給源から第２のイオンチャネル調製物を得ることにより行うことができる。一般には、第１および第２のイオンチャネル調製物は、それらの入手源以外のすべての点において類似しているであろう。例えば、トランスジェニック動物（例えば、前記および後記のもの）からの脳組織をアッセイにおいて使用する場合には、正常（野生型）動物からの比較しうる脳組織を第２のイオンチャネル調製物源として使用する。該イオンチャネル調製物のそれぞれを、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルに結合することが知られているリガンドと共に（単独および該候補リガンドまたは化合物の存在下の両方で）インキュベートする。好ましくは、候補リガンドまたは化合物をいくつかの異なる濃度で調べる。
既知リガンドによる結合が試験化合物により置換される度合を、第１および第２のイオンチャネル調製物の両方に関して測定する。トランスジェニック動物由来の組織をアッセイにおいて直接使用することが可能であり、または膜もしくは膜タンパク質を単離するために該組織を処理し、それら自体をアッセイにおいて使用することが可能である。好ましいトランスジェニック動物はマウスである。リガンドは、結合アッセイに適合しうる任意の手段を用いて標識することができる。これには、限定的なものではないが放射標識、酵素標識、蛍光標識または化学発光標識（および前記で更に詳しく説明されている他の標識技術）が含まれるであろう。
更に、機能性Ｋｖ９．２を発現する野生型動物、およびＫｖ９．２機能の発現の低減または消失を伴う表現型特性のいずれかを示す特定された動物に、候補化合物を投与することなどにより、Ｋｖ９．２またはＫｖ９．２含有イオンチャネルのアンタゴニストを特定することが可能である。
非ヒトトランスジェニック動物を作製するための方法の詳細は後記で更に詳しく説明する。トランスジェニック哺乳動物を作製するために、トランスジェニック遺伝子構築物を動物の生殖系列内に導入することが可能である。例えば、該構築物のコピーの１つまたはいくつかを、標準的なトランスジェニック技術により、哺乳動物の胚のゲノム内に組込むことが可能である。
典型的な実施形態においては、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジーンを非ヒト動物の生殖系列内に導入することにより作製される。トランスジーンを導入するためには、種々の発生段階における胚標的細胞を使用することができる。胚標的細胞の発生段階に応じて種々の方法が用いられる。任意の動物の特定の系統は、全身的な良好な健康状態、良好な胚収量、胚における良好な前核可視性および良好な生殖適合性に関して選択される。また、ハプロタイプは重要な要因である。
胚内へのトランスジーンの導入は、当該技術分野で公知の任意の手段、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはリポフェクションにより達成することができる。例えば、Ｋｖ９．２トランスジーンを受精哺乳動物卵の前核内への該構築物のマイクロインジェクションにより哺乳動物に導入して、該構築物のコピーの１以上が、発生中の該哺乳動物の細胞内に保有されるようにすることが可能である。該受精卵内への該トランスジーン構築物の導入後、該卵をｉｎ ｖｉｔｒｏで種々の時間にわたってインキュベートするか、または代理宿主内に再移植するか、あるいはそれらの両方を行うことが可能である。成熟するまでｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションを行うことも可能である。１つの一般的な方法は、胚を、種に応じて約１〜７日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし、ついでそれらを代理宿主内に再移植することである。
トランスジェニック操作された胚の子孫を、組織の一部分のサザンブロット分析により該構築物の存在に関して試験することが可能である。該外来性クローン化構築物のコピーの１以上がかかるトランスジェニック胚のゲノム内に安定に組込まれたままである場合には、該トランスジェニック付加構築物を含有する永久的なトランスジェニック哺乳動物系統を確立することが可能である。
トランスジェニック改変哺乳動物の同腹仔を、誕生後、該仔のゲノム内への該構築物の組込みに関してアッセイすることが可能である。好ましくは、このアッセイは、所望の組換えタンパク質産物をコードするＤＮＡ配列またはその断片に対応するプローブを該後代からの染色体物質上にハイブリダイズさせることにより達成される。それらのゲノム内に該構築物の少なくとも１コピーを含有することが判明した哺乳動物子孫を、成熟するまで成長させる。
本明細書の目的においては、接合体とは、実質的には、完全な生物にまで発生しうる二倍体細胞の構造体である。一般には、接合体は、配偶子からの２つの一倍体核の融合により天然でまたは人工的に形成された核を含有する卵から構成される。したがって、配偶子核は、天然で適合性であるもの、すなわち、機能性生物への分化および発生を受けうる生存可能な配偶子をもたらすものでなければならない。一般には、正倍数体接合体が好ましい。異数体接合体が得られる場合には、染色体の数は、いずれかの配偶子が由来する生物の正倍数に対して２以上異なるべきではない。
同様の生物学的考慮事項に加えて、物理的考慮事項も、接合体の核に、または接合体核の一部分を形成する遺伝物質に加えることができる外来性遺伝物質の量（例えば、容量）を左右する。遺伝物質を取り出さない場合には、加えることができる外来性遺伝物質の量は、物理的に破壊されることなく吸収される量により限定される。一般に、導入される外来性遺伝物質の容量は約１０ピコリットルを超えないであろう。添加の物理的影響は、接合体の生存性を物理的に破壊するほど大きくてはならない。生じる接合体の、外来性遺伝物質を含む遺伝物質は、機能性生物への該接合体の分化および発生を生物学的に開始させ維持することができなければならないため、ＤＮＡ配列の数および多様性の生物学的限界は個々の接合体および外来性遺伝物質の機能に左右され、このことは当業者に容易に理解されるであろう。
接合体に加えられるトランスジーン構築物のコピー数は、加えられる外来性遺伝物質の総量に左右され、遺伝的形質転換を可能にする量であろう。理論的には１コピーのみが必要であるが、一般には、１コピーは確実に機能性となるよう、多数のコピー、例えば１，０００〜２０，０００コピーのトランスジーン構築物が利用される。外来性ＤＮＡ配列の表現型発現を増強するためには、多くの場合、導入する外来性ＤＮＡ配列のそれぞれの２以上の機能性コピーを有することが有利であろう。
核遺伝物質内への外来性遺伝物質の添加を可能にする任意の技術が、それが細胞、核膜または他の既存の細胞構造体もしくは遺伝的構造体に対して破壊的でない限り利用可能である。外来性遺伝物質はマイクロインジェクションにより核遺伝物質内に優先的に導入される。細胞および細胞構造体のマイクロインジェクションは公知であり、当該技術分野で用いられている。
標準的な方法を用いて再移植が達成される。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵管内に挿入する。個々の宿主内に移植される胚の数は種によって異なるが、通常は、その種が天然で生み出す後代の数に匹敵するものであろう。
代理宿主のトランスジェニック子孫は、トランスジーンの存在および／または発現に関して、任意の適当な方法によりスクリーニングすることができる。スクリーニングは多くの場合、トランスジーンの少なくとも一部分に相補的なプローブを使用するサザンブロットまたはノーザンブロット分析により達成される。トランスジーン産物の存在に関するスクリーニングのための代替的または追加的方法として、トランスジーンによりコードされるタンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析を用いることができる。典型的には、ＤＮＡを尾の組織から調製し、トランスジーンに関してサザンブロット分析またはＰＣＲにより分析する。あるいは、この分析にはいずれの組織または細胞型を使用してもよいが、トランスジーンを最高レベルで発現すると考えられる組織または細胞を、サザンブロット分析またはＰＣＲを用いて、トランスジーンの存在および発現に関して試験する。
トランスジーンの存在を評価するための代替的または追加的方法には、限定的なものではないが、適当な生化学的アッセイ、例えば酵素および／または免疫学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性に関する組織学的染色、フローサイトメトリー分析などが含まれる。血液中のトランスジーン産物の存在を検出するため、ならびに種々のタイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに対するトランスジーンの効果を評価するためには、血液の分析も有用であろう。
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適当なパートナーと交配させることにより、あるいはトランスジェニック動物から得た卵および／または精子のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精により得られる。パートナーとの交配を行う場合には、パートナーはトランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもそうでなくてもよい。それがトランスジェニックである場合には、同じトランスジーンもしくは異なるトランスジーンまたはそれらの両方を含有しうる。あるいは、パートナーは親系統でありうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を用いる場合には、受精胚を代理宿主内に移植し、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし、またはそれらの両方を行うことが可能である。いずれかの方法を用いて、トランスジーンの存在に関して子孫を評価することが可能であり、これは、前記の方法または他の適当な方法を用いて行うことが可能である。
本明細書に記載の方法に従い得られるトランスジェニック動物は外来性遺伝物質を含むであろう。前記のとおり、外来性遺伝物質は、ある実施形態においては、Ｋｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネルの産生をもたらすＤＮＡ配列である。さらに、かかる実施形態においては、該配列は、好ましくは特定の細胞型におけるトランスジーン産物の発現を可能にする転写制御エレメント、例えばプロモーターに連結される。
非ヒト動物内にトランスジーンを導入するために、レトロウイルス感染を用いることも可能である。発生中の非ヒト胚を胚盤胞期までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することが可能である。この期間中に、割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる（Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264）。割球の効率的感染は、透明帯を除去するための酵素処理により達成される（Manipulating the Mouse Embryo, Hogan編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986）)。トランスジーンを導入するために使用するウイルスベクター系は、典型的には、トランスジーンを有する複製欠損型レトロウイルスである（Jahnerら (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Puttenら (1985) PNAS 82:6148-6152）。ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することにより、トランスフェクションは容易かつ効率的に達成される（Van der Putten, 前掲; Stewartら (1987) EMBO J. 6:383-388）。あるいは、感染をより後の段階で行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は胞胚腔内へ注入することができる（Jahnerら (1982) Nature 298:623-628）。ファウンダー（創始体）のほとんどはトランスジーンに関してモザイクとなろう。なぜなら、取り込みは、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてしか起こらないからである。さらに、該ファウンダーは、ゲノム内の種々の位置にトランスジーンの種々のレトロウイルス挿入を含有し、それらは子孫において一般には分離する。また、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖系列にトランスジーンを導入することも可能である（Jahnerら (1982) 前掲）。
トランスジーン導入のための第３のタイプの標的細胞は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された着床前胚から得られ、胚と融合される（Evansら (1981) Nature 292:154-156; Bradleyら (1984) Nature 309:255-258; Gosslerら (1986) PNAS 83: 9065-9069; およびRobertsonら (1986) Nature 322:445-448）。トランスジーンは、ＤＮＡトランスフェクションによりまたはレトロウイルス媒介形質導入により、ＥＳ細胞内に効率的に導入することができる。ついで、かかる形質転換ＥＳ細胞は非ヒト動物由来の胚盤胞と合体することができる。ついで該ＥＳ細胞は胚に定着し、生じるキメラ動物の生殖系列に影響を及ぼす。総説としては、Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474を参照されたい。
本発明者らは、Ｋｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネル機能のモデルとしての、改変したＫｖ９．２遺伝子（好ましくは前記のもの）を有することを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物をも提供する。遺伝子に対する改変としては、欠失もしくは他の機能喪失突然変異、部位特異的もしくはランダム突然変異を伴うヌクレオチド配列を有する外来性遺伝子の導入、別の種からの外来性遺伝子の導入、またはそれらの組み合わせが挙げられる。トランスジェニック動物は該改変に関してホモ接合またはヘテロ接合でありうる。該動物およびそれに由来する細胞は、Ｋｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネル機能をモジュレートしうる生物学的に活性な物質をスクリーニングするのに有用である。該スクリーニング方法は、以下のもののための潜在的療法の特異性および作用を決定するのに特に有用である：血中グルコースのモジュレーション、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病合併症（例えば糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害）等の疾患の治療、ならびに低血糖の治療、また、原発性または糖尿病に対して二次的な、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）および異常脂質血症、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖の治療、また、不安、不安障害、不安関連行動および全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖症、対人恐怖症、強迫神経症、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、ＤＳＭ−ＩＶに挙げられているパニック障害および抑うつを含む神経障害の治療。
該動物は、正常な組織および器官、例えば脳、心臓、脾臓および肝臓におけるＫｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネルの役割ならびにそれらの機能に対する効果を研究するためのモデルとして有用である。
別の態様は、機能的に破壊された内在性Ｋｖ９．２遺伝子を有するが、異種Ｋｖ９．２タンパク質（すなわち、別の種由来のＫｖ９．２）をコードするトランスジーンをそのゲノム内に有しかつ発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、該動物はマウスであり、該異種Ｋｖ９．２はヒトＫｖ９．２である。動物またはかかる動物に由来する細胞株（ヒトＫｖ９．２を用いて改変されている）は、ヒトＫｖ９．２をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する物質を特定するために使用することができる。例えば、ヒトＫｖ９．２を介してシグナル伝達を誘導する刺激因子を、被検物質の存在下または非存在下で、該動物または細胞株に投与し、そして該動物または細胞株における応答を測定することが可能である。ヒトＫｖ９．２をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する物質は、該物質の非存在下の応答と比較した場合の該物質の存在下の応答の低下に基づいて特定することができる。
本発明者らはまた、Ｋｖ９．２欠損トランスジェニック非ヒト動物（「Ｋｖ９．２サブユニットノックアウト」）を提供する。かかる動物は、好ましくは内在性Ｋｖ９．２サブユニットゲノム配列の破壊または欠失の結果として、Ｋｖ９．２サブユニットまたはＫｖ９．２含有イオンチャネル活性の低下または喪失を示す動物である。好ましくは、かかる動物はＫｖ９．２サブユニット活性もＫｖ９．２含有イオンチャネル活性も示さない。より好ましくは、該動物は、配列番号３または配列番号５に示すＫｖ９．２含有イオンチャネルの活性を示さない。Ｋｖ９．２イオンチャネルノックアウトは、後記で更に詳しく説明するとおり、当該技術分野で公知の種々の手段により作製することができる。
また、本明細書の開示は、宿主細胞内のＫｖ９．２遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関する。該核酸構築物は、ａ）非相同性置換部分、ｂ）第１相同領域（Ｋｖ９．２遺伝子配列に対して実質的に同一なヌクレオチド配列を有し、該非相同性置換部分の上流に位置する）、およびｃ）第２相同領域（天然に存在する内在性Ｋｖ９．２遺伝子内の第１のＫｖ９．２遺伝子配列の下流に位置する第２のＫｖ９．２遺伝子配列に対して実質的に同一なヌクレオチド配列を有し、該非相同性置換部分の下流に位置する）を含む。また、第１および第２相同領域は、該核酸分子が宿主細胞内に導入された場合に該核酸構築物と宿主細胞内の内在性Ｋｖ９．２遺伝子との間の相同組換えに十分な長さを有する。好ましい実施形態においては、該非相同性置換部分は、発現レポーターを含み、これは好ましくはｌａｃＺおよびポジティブ選択発現カセットを含み、好ましくは調節エレメントに機能的に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
好ましくは、第１および第２のＫｖ９．２遺伝子配列は配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４またはそれらのホモログ、変異体もしくは誘導体に由来する。
別の態様は、前記の核酸構築物が組み込まれた組換えベクターに関する。更に別の態様は、該核酸構築物が導入された宿主細胞に関する。この場合、該導入は、該核酸構築物と該宿主細胞の内在性Ｋｖ９．２遺伝子との間の相同組換えを可能にし、該内在性Ｋｖ９．２遺伝子の機能的破壊を引き起こす。該宿主細胞は、肝臓、脳、脾臓もしくは心臓または多能性細胞（例えば、マウス胚性幹細胞）由来の、Ｋｖ９．２を正常に発現する哺乳動物細胞でありうる。該核酸構築物が導入され、内在性Ｋｖ９．２遺伝子と相同組換えされた胚性幹細胞の更なる発生は、該胚性幹細胞に由来し従ってゲノム内にＫｖ９．２遺伝子破壊を保持する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を作り出す。ついで、生殖系列内にＫｖ９．２遺伝子破壊を有する動物を選択および交配し、すべての体細胞および生殖細胞内にＫｖ９．２遺伝子破壊を有する動物を作り出すことが可能である。ついで、かかるマウスを交配し、Ｋｖ９．２遺伝子破壊に関するホモ接合体を得ることが可能である。
抗体
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、特に示さない限り、限定的なものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーから得られるフラグメントを包含する。かかるフラグメントとしては、標的物質に対する結合活性を保有する全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントならびに一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）、融合タンパク質、および該抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が挙げられる。抗体およびそのフラグメントはヒト化抗体、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されているものでありうる。さらに、完全ヒト可変領域を有する抗体（またはそのフラグメント）、例えば米国特許第５，５４５，８０７号および同第６，０７５，１８１号に記載されているものも使用することができる。中和抗体、すなわち、物質のアミノ酸配列の生物活性を阻害するものは、診断および療法に特に好ましい。
抗体は、標準的な技術、例えば免疫化により、またはファージディスプレイライブラリーを使用することにより生成することができる。
公知方法により抗体を生起させるためにポリペプチドまたはペプチドを使用することができる。かかる抗体はＫｖ９．２タンパク質またはホモログ、断片などに特異的に結合しうる。
ポリクローナル抗体が望まれる場合には、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、Ｋｖ９．２ポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物で免疫化することが可能である。免疫応答を増強するために、宿主種に応じて種々のアジュバントを使用することができる。かかるアジュバントとしては、フロイントアジュバント、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホール・リンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）は、全身防御を刺激する目的で免疫不全状態の個体に精製物質アミノ酸配列を投与する場合に使用することができる潜在的に有用なヒトアジュバントである。
免疫化動物からの血清を集め、公知方法に従い処理する。ポリペプチドから得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、該ポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ポリクローナル抗血清を生成し加工するための技術は当該技術分野で公知である。そのような抗体が製造可能となるよう、本発明者らは、動物またはヒトにおいて免疫原として使用するための、別のアミノ酸配列に対してハプテン化されたＫｖ９．２アミノ酸配列またはその断片も提供する。
Ｋｖ９．２ポリペプチドから得られるエピトープに対するモノクローナル抗体は当業者により容易に生成することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を生成するための一般的方法は周知である。不死化抗体産生細胞株は細胞融合により、および発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換またはエプスタインバーウイルスでのトランスフェクションのような他の技術によっても作製することができる。オービットエピトープ（orbit epitope）に対するモノクローナル抗体のパネルを種々の特性、例えばイソタイプおよびエピトープアフィニティーに関してスクリーニングすることが可能である。
モノクローナル抗体は、培養内の連続継代細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技術により調製することができる。これらには、KoehlerおよびMilstein（1975, Nature 256:495-497）により最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら, 1983, Immunol Today 4:72; Coteら, (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Coleら, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
また、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るための、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングによる「キメラ抗体」の生成のために開発された技術を用いることが可能である（Morrisonら (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neubergerら (1984) Nature 312:604-608; Takedaら (1985) Nature 314:452-454）。あるいは、物質特異的一本鎖抗体を生成するために、一本鎖抗体の生成に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７９号）を応用することができる。
Ｋｖ９．２ポリペプチドまたはペプチドから得られるエピトープに対する抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）は診断において特に有用であり、中和抗体は受動免疫療法において有用である。モノクローナル抗体は特に、抗イディオタイプ抗体を生起させるために使用することができる。抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれる物質および／または因子の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を産生させるための技術は当該技術分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も療法において有用であろう。
Orlandiら (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) ならびにWinter GおよびMilstein C (1991; Nature 349:293-299)に開示されているとおり、抗体は、リンパ球集団内でのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導することによるか、あるいは高特異性結合試薬のパネルまたは組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによっても生成することができる。
該ポリペプチドまたはペプチドに対する特異的結合部位を有する抗体フラグメントも作製することができる。例えば、かかるフラグメントとしては、限定的ではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（抗体分子のペプシン消化により得ることができる）、およびＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により得ることができる）が挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な特定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することが可能である（Huse WDら (1989) Science 256:1275-1281）。
一本鎖抗体の生成のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）も、Ｋｖ９．２ポリペプチドに対する一本鎖抗体の生成に応用することができる。トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳動物も、ヒト化抗体を発現させるために使用することができる。
前記抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離しまたは特定するために、あるいはアフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチドを精製するために使用することができる。
Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチドに対する抗体は、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病合併症（例えば、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害）を含む疾患の治療のために血中グルコースをモジュレートするために、ならびに原発性または糖尿病に対して二次的な、低血糖、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）、異常脂質血症、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖の治療のためにも使用することができる。
診断アッセイ
本発明者らは更に、診断試薬としての診断における使用または遺伝的分析における使用のための、Ｋｖ９．２サブユニットポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびにそれらのホモログ、変異体および誘導体）の使用を記載する。Ｋｖ９．２サブユニット核酸（ホモログ、変異体および誘導体を含む）に相補的かまたはそれにハイブリダイズしうる核酸、およびＫｖ９．２ポリペプチドに対する抗体も、かかるアッセイにおいて有用である。
機能不全に関連したＫｖ９．２サブユニット遺伝子の突然変異型の検出は、Ｋｖ９．２サブユニットの過少発現、過剰発現もしくは発現の変化により生じる疾患または疾患に対する感受性の診断を補足するかまたは定めうる診断手段となるであろう。Ｋｖ９．２サブユニット遺伝子（制御配列を含む）内に突然変異を有する個体は種々の技術によりＤＮＡレベルで検出することができる。
例えば、ＤＮＡを患者から単離し、Ｋｖ９．２のＤＮＡ多型パターンを決定することが可能である。特定されたパターンを、Ｋｖ９．２の過剰、過少または異常発現に関連した疾患に罹患していることが判明している患者の対照と比較する。ついで、関連疾患に伴う遺伝的多型パターンを示す患者を特定することが可能である。Ｋｖ９．２サブユニット遺伝子の遺伝的分析は、当該技術分野で公知の任意の技術により行うことができる。例えば、ＲＦＬＰまたはＳＮＰ分析などによってＫｖ９．２対立遺伝子のＤＮＡ配列を決定することにより、個体をスクリーニングすることが可能である。Ｋｖ９．２の遺伝子配列またはその発現を制御する任意の配列におけるＤＮＡ多型の存在を検出することにより、Ｋｖ９．２の過剰、過少または異常発現に関連した疾患に対する遺伝的素因を有する患者を特定することができる。
ついで、特定された患者を、Ｋｖ９．２関連疾患の発生を予防するために処置し、あるいはＫｖ９．２関連疾患の更なる発生または進行を予防するために、疾患の早期段階で、より積極的に処置することが可能である。該Ｋｖ９．２関連疾患には以下のものが含まれる：Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病合併症（例えば、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害）を含む疾患、ならびに原発性または糖尿病に対して二次的な、低血糖、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）および異常脂質血症、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖。また、不安、不安障害、不安関連行動および全般性不安障害、パニック障害、広場恐怖症、対人恐怖症、強迫神経症、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、ＤＳＭ−ＩＶに挙げられているパニック障害および抑うつを含む神経障害の治療も含まれる。
本発明者らは更に、Ｋｖ９．２関連疾患に伴う患者の遺伝的多型パターンの特定のためのキットを開示する。該キットは、ＤＮＡサンプル採取手段と、遺伝的多型パターンを決定するための手段とを含む。次いで、決定した遺伝的多型パターンを対照サンプルと比較して、Ｋｖ９．２関連疾患に対する患者の感受性を決定する。Ｋｖ９．２ポリペプチドおよび／またはかかるポリペプチドに対する抗体（またはそのフラグメント）を含む、Ｋｖ９．２関連疾患の診断のためのキットも提供する。
診断用の核酸は、対象の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から得ることができる。好ましい実施形態においては、患者の指穿刺（吸収紙上に血液を採取する）から得た血液細胞から、ＤＮＡを得る。もう１つの好ましい実施形態においては、AmpliCard.TM. (University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF)上に血液を集める。
該ＤＮＡは、検出のために直接的に使用されることが可能であり、あるいは分析前にＰＣＲまたは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。対象となる遺伝子内の特定の多型性ＤＮＡ領域を標的化するオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを調製して、ＰＣＲ反応において標的配列の増幅が達成されるようにすることが可能である。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも鋳型として同様に使用することができる。ついで鋳型ＤＮＡからの増幅ＤＮＡ配列を、制限酵素を使用して分析して、該増幅配列内に存在する遺伝的多型を決定し、それにより該患者の遺伝的多型プロファイルを得ることが可能である。制限断片長はゲル分析により特定することができる。その代わりに、またはそれと共に、ＳＮＰ（一塩基多型）分析のような技術を用いることができる。
欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識Ｋｖ９．２サブユニットヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより特定することができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ消化によりまたは融解温度における差により、ミスマッチ二本鎖から区別することができる。ＤＮＡ配列の相違は、変性剤の存在下または非存在下のゲル内のＤＮＡ断片の電気泳動移動度における変化によるか、あるいは直接的なＤＮＡ配列決定によっても検出することができる。例えば、Myersら, Science (1985)230:1242を参照されたい。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション、または化学的切断法によっても明らかにすることができる。Cottonら, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401を参照されたい。別の実施形態においては、例えば遺伝的突然変異の効率的なスクリーニングのために、Ｋｖ９．２サブユニットヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することが可能である。アレイ技法は周知であり、一般的な適用性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的可変性をはじめとする分子遺伝学における種々の疑問について検討するために用いることができる（例えば、M.Cheeら, Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)を参照されたい）。
一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、突然変異核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度における相違を検出するために用いることがある（Oritaら (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144およびHayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79も参照されたい）。サンプルおよび対照核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、復元（再生）させることが可能である。一本鎖核酸の二次構造は配列によって様々であり、それによって生じる電気泳動移動度における変化は、単一の塩基の変化でさえも検出することが可能である。該ＤＮＡ断片は標識プローブで標識または検出することができる。ＲＮＡの場合には、二次構造が配列内の変化により敏感であるため、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することによりアッセイの感度を増強することが可能である。好ましい実施形態においては、該対象方法は、電気泳動移動度における変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を用いる（Keenら (1991) Trends Genet 7:5）。
該診断アッセイは、記載されている方法によるＫｖ９．２サブユニット遺伝子内の突然変異の検出により、例えば不安または糖尿病のような疾患に対する感受性を診断または決定するための方法を提供する。
Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチドおよび核酸の存在をサンプル中で検出することができる。したがって、前記で挙げた感染および疾患は、対象に由来するサンプルから、Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチドまたはＫｖ９．２サブユニットｍＲＮＡの異常に低下または上昇したレベルを測定することを含む方法により診断することができる。該サンプルは、発現のレベルもしくはパターンにおける空間的または時間的変化を含む、Ｋｖ９．２サブユニット発現の上昇、低下またはその他の異常に関連した疾患に罹患したかまたは罹患している疑いのある生物からの細胞もしくは組織サンプルを含みうる。かかる疾患に罹患したかまたは罹患している疑いのある生物におけるＫｖ９．２の発現のレベルもしくはパターンを、通常、疾患の診断の手段として正常生物における発現のレベルもしくはパターンと比較することが可能である。
したがって、一般には、本発明者らは、サンプル中のＫｖ９．２サブユニット核酸を含む核酸の存在の検出方法を開示し、該方法は、サンプルを、該核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと接触させること、および該核酸の存在に関して該サンプルをモニターすることによるものである。例えば、該核酸プローブはＫｖ９．２サブユニット核酸またはその一部分に特異的に結合することが可能であり、それらの２つの間の結合が検出可能であり、該複合体自体の存在も検出することができる。さらに、本発明者らは、Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチドの存在の検出方法を開示し、該方法は、細胞サンプルを、該ポリペプチドに結合しうる抗体と接触させること、および該ポリペプチドの存在に関して該サンプルをモニターすることによるものである。これは、該抗体と該ポリペプチドとの間で形成された複合体の存在をモニターすること、または該ポリペプチドと該抗体との間の結合をモニターすることにより簡便に達成することができる。２つの物質の間の結合の検出方法は当該技術分野で公知であり、それらにはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）、表面プラズモン共鳴などが含まれる。
発現の低下または上昇は、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野で周知のいずれかの方法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット法および他のハイブリダイゼーション法）を用いてＲＮＡレベルで測定することができる。宿主由来のサンプル中の例えばＫｖ９．２サブユニットのようなタンパク質のレベルを測定するために使用することができるアッセイ技術は当業者に周知である。かかるアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合性結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
また、この開示は、例えば不安または糖尿病のような疾患（感染を含む）または疾患に対する感受性に関する診断キットに関する。該診断キットは、Ｋｖ９．２サブユニットポリヌクレオチドまたはその断片；相補的ヌクレオチド配列；Ｋｖ９．２サブユニットポリペプチドまたはその断片、あるいはＫｖ９．２サブユニットポリペプチドに対する抗体を含む。
染色体アッセイ
Ｋｖ９．２ヌクレオチド配列は染色体の特定のためにも有用である。該配列は個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、ハイブリダイズしうる。前記のとおり、ヒトＫｖ９．２サブユニットはヒト染色体８ｑ２２にマッピングされることが判明している。
染色体への対応する配列のマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾患と相関させる際の重要な第一歩である。配列を厳密な染色体位置にマッピングしたら、該染色体上の該配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させる。かかるデータは、例えばV. McKusick, Mendelian heritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能)に見出される。ついで、同一染色体領域にマッピングされた疾患と遺伝子との間の関係を連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により特定する。
罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における相違も決定することができる。罹患個体の一部または全部においては突然変異が観察されるがいずれの正常個体においても突然変異が観察されない場合には、該突然変異が該疾患の原因因子である可能性がある。
予防および治療方法
本発明者らは、Ｋｖ９．２サブユニット活性の過剰および不十分な量の両方に関連した異常な状態の治療方法を提供する。
Ｋｖ９．２サブユニットの活性が過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。１つのアプローチは、Ｋｖ９．２サブユニットへのリガンドの結合を遮断することにより、または二次シグナルを阻害することにより活性化を阻害するのに有効な量の前記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を製薬上許容される担体と共に対象に投与して、該異常状態を軽減することを含む。
もう１つのアプローチにおいては、内在性Ｋｖ９．２サブユニットと競合してもなおリガンドに結合しうるＫｖ９．２サブユニットポリペプチドの可溶性形態を投与することができる。かかる競合体の典型的な実施形態はＫｖ９．２サブユニットポリペプチドの断片を含む。
さらに別のアプローチにおいては、発現を遮断する技術を用いて、内在性Ｋｖ９．２サブユニットをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。公知のかかる技術は、内部で生成されるかまたは独立して投与されるアンチセンス配列の使用を伴う。例えば、O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)を参照されたい。あるいは、遺伝子と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給することができる。例えば、Leeら, Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360を参照されたい。これらのオリゴマー自体を投与することが可能であり、または対応するオリゴマーをｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。
また、Ｋｖ９．２サブユニットおよびその活性の過少発現に関連した異常状態を治療するためには、いくつかのアプローチが利用可能である。１つのアプローチは、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルを活性化する化合物（すなわち、前記のとおりのアゴニストまたは開口剤（オープナー））の治療上有効量を、製薬上許容される担体と共に対象に投与して、それにより、該異常状態を軽減することを含む。あるいは、対象内の該当する細胞によるＫｖ９．２サブユニットの内因性産生をもたらすために遺伝子治療を用いることが可能である。例えば、前記のとおり、複製欠損型レトロウイルスベクターにおいて発現させるために、Ｋｖ９．２ポリヌクレオチドを遺伝子操作することが可能である。ついで該レトロウイルス発現構築物を単離し、Ｋｖ９．２ポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞内に導入して、該パッケージング細胞が今度は、対象となる遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにすることが可能である。これらの産生細胞は、細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子操作および該ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現のために対象に投与することができる。遺伝子治療の総説としては、Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (およびそれにおいて引用されている参考文献) in Human Molecular Genetics, 第２０章, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)を参照されたい。
製剤および投与
ペプチド、例えばＫｖ９．２サブユニットポリペプチドの可溶性形態、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な製薬用担体と組み合わせて製剤化することができる。そのような製剤は、治療上有効量の該ポリペプチドまたは化合物と、製薬上許容される担体または賦形剤とを含む。かかる担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。製剤は投与方法に適したものであるべきであり、十分に当業者の技量の範囲内である。本発明者らは更に、前記組成物の成分の１以上が充填された１以上の容器を含む医薬パックおよびキットを開示する。
Ｋｖ９．２ポリペプチドおよび他の化合物は、単独で、または他の化合物、例えば治療用化合物と共に使用することができる。
医薬組成物の全身投与の好ましい形態には、注射、典型的には静脈内注射が含まれる。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内または腹腔内経路も用いることができる。全身投与のための代替的手段には、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤を使用する経粘膜および経皮投与が含まれる。また、腸溶またはカプセル化製剤に適切に製剤化された場合には、経口投与も可能である。また、これらの化合物の投与は軟膏、パスタ剤、ゲル剤などの形態での局所および／または局在化投与でありうる。
必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、対象の症状の性質および担当実施者の判断に左右される。しかし、適当な投与量は対象体重１ｋｇ当たり０．１〜１００μｇの範囲である。しかし、利用可能な種々の化合物および種々の投与経路の効率の相違を考慮すれば、必要な投与量での広範な変動が予想されるであろう。例えば、経口投与は、静脈内注射投与より大きな投与量が必要であると予想される。当該技術分野においてよく理解されているとおり、これら投与量レベルにおける変動は、最適化のための標準的な経験的常套手段を用いて調節することができる。
治療において使用するポリペプチドは、前記のとおり、多くの場合「遺伝子治療」と称される治療においては、対象内で内因的に生成させることも可能である。したがって、例えば、対象由来の細胞を、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡで操作して、それがｅｘ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするようにすることが可能である。ついで該細胞を該対象内に導入する。
医薬組成物
本発明者らは、治療的有効量のＫｖ９．２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ベクターまたは抗体と、場合によっては、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）とを含む医薬組成物も提供する。
該医薬組成物はヒト医学および獣医学においてヒトまたは動物に使用することが可能であり、典型的には、製薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤の任意の１以上を含む。治療用途のための許容される担体または希釈剤は製薬分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro 編 1985)に記載されている。製薬用担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬上の慣例に基づいて選択することができる。該医薬組成物は、該担体、賦形剤または希釈剤としてまたはそれらに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含みうる。
該医薬組成物には保存剤、安定剤、色素および更には香味剤を加えることができる。保存剤の具体例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁化剤も使用することができる。
送達系によって異なる組成物／製剤の必要条件が存在しうる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、小型ポンプ（mini-pump）を使用して、または粘膜経路により（例えば、鼻腔内スプレー剤もしくは吸入用エアロゾル剤もしくは内服液として）、または非経口的に（この場合、該組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射可能な形態として製剤化される）送達されるように製剤化することができる。あるいは、該製剤は、両方の経路により送達されるように設計することができる。
薬剤を胃腸粘膜から粘膜送達しようとする場合には、それは胃腸管内を通過する間、安定に維持することができるべきである。例えば、それはタンパク質分解に抵抗性であり、酸性ｐＨに安定であり、胆汁の界面活性化作用に抵抗性であるべきである。
適当な場合には、該医薬組成物は、吸入により、または坐剤もしくはペッサリーの形態で、またはローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤もしくは散布剤の形態で局所的に、または皮膚パッチの使用により、またはデンプンもしくはラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、またはカプセル剤もしくは膣坐剤として単独でまたは賦形剤と混合して、または香味剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液剤もしくは懸濁液剤の形態で投与することができる。あるいは、該医薬組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下に非経口的に注射することができる。非経口投与の場合には、該組成物は、他の物質（例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖）を含有しうる無菌水性溶液の形態で最も好ましく使用することができる。頬腔または舌下投与の場合には、該組成物は、通常の方法で製剤化することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
ワクチン
別の実施形態は、哺乳動物において免疫応答を誘導するための方法に関し、該方法はとりわけ、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病合併症（例えば、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害）、ならびに原発性または糖尿病に対して二次的な、低血糖、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）および異常脂質血症、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖（これらに限定されるものではない）による異常な血中グルコースレベルから哺乳動物を防御する抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生成させるのに適したＫｖ９．２サブユニットポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種することを含む。
さらに別の実施形態は、哺乳動物において免疫応答を誘導するための方法に関し、該方法は、免疫応答を誘導して哺乳動物を疾患から防御する抗体を生成させるために、Ｋｖ９．２サブユニットポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現をもたらすベクターを介してＫｖ９．２ポリペプチドを送達することを含む。
別の実施形態は、哺乳動物宿主に導入した場合に、その哺乳動物において、Ｋｖ９．２ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する、Ｋｖ９．２ポリペプチドまたはＫｖ９．２遺伝子を含む免疫／ワクチン製剤（組成物）に関する。該ワクチン製剤は更に、適当な担体を含みうる。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは胃内で分解される可能性があるため、好ましくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む）投与される。非経口投与に適した製剤には、水性および非水性無菌注射溶液（抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および該製剤を被投与者の血液と等張にする溶質を含有しうる）；ならびに水性および非水性無菌懸濁液剤（懸濁化剤または増粘剤を含みうる）が含まれる。該製剤は、単位投与容器または複数回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに含めて提供することができ、凍結乾燥状態で貯蔵することが可能であり、これは使用直前に無菌液体担体を添加するだけでよい。該ワクチン製剤は、該製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油系および当該技術分野で公知の他の系をも包含しうる。投与量は該ワクチンの比活性に左右され、通常の実験により容易に決定することができる。
ワクチンは１種以上のＫｖ９．２ポリペプチドまたはペプチドから製造することができる。
有効成分として免疫原性ポリペプチドまたはペプチドを含有するワクチンの調製は当業者に公知である。典型的には、かかるワクチンは注射剤として（溶液または懸濁液として）調製され、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態でも調製することができる。該製剤は乳化することも可能であり、または該タンパク質をリポソーム内に封入することができる。活性な免疫原性成分は、多くの場合、製薬上許容されかつ該有効成分に適合性の賦形剤と混合する。適当な賦形剤としては、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
また、所望により、該ワクチンは少量の補助物質、例えば湿潤化剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントを含有しうる。有効でありうるアジュバントの具体例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、およびＲＩＢＩ（これは、細菌から抽出された３成分、すなわち、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコラートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０エマルション中に含有する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
アジュバントおよび他の物質の更なる具体例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルション、水中油型エマルション、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、リピドＸ、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（アクネ菌 (Propionobacterium acnes)）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントが挙げられる。かかるアジュバントは種々の供給源から市販されており、例えば、Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）、またはフロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Michigan）がある。
典型的には、Amphigen（水中油型）、Alhydrogel（水酸化アルミニウム）、またはAmphigenとAlhydrogelとの混合物などのアジュバントが使用される。ヒト用には水酸化アルミニウムのみが承認されている。
免疫原とアジュバントとの比率は、両者が有効量で存在する限り、広い範囲にわたって変動しうる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約０．５％の量で存在しうる（Ａｌ２Ｏ３ベース）。簡便には、該ワクチンは、０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌの最終濃度の免疫原を含有するよう製剤化される。
製剤化後、該ワクチンを無菌容器内に入れ、ついで密封し、低温、例えば４℃で貯蔵することが可能であり、または凍結乾燥することができる。凍結乾燥は安定化形態での長期貯蔵を可能にする。
該ワクチンは、通常は、注射、例えば皮下または筋肉内注射により非経口投与される。他の投与方法に適した更なる製剤には、坐剤、および一部の場合には経口製剤が含まれる。坐剤用の通常の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。該ワクチン組成物を凍結乾燥させた場合には、該凍結乾燥物は投与前に、例えば懸濁液として再調製することができる。再調製は、好ましくはバッファー中で行う。
患者への経口投与用のカプセル剤、錠剤および丸剤には、例えばＥｕｄｒａｇｉｔ “Ｓ”、Ｅｕｄｒａｇｉｔ “Ｌ”、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングを施すことができる。
Ｋｖ９．２ポリペプチドは中性または塩形態としてワクチンに製剤化することができる。製薬上許容される塩としては、酸付加塩（該ペプチドの自由なアミノ基について形成されるもの）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸を用いて形成される。自由なカルボキシル基について形成される塩も、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄、ならびに有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインから誘導することができる。
投与
典型的には、個々の対象に最も適した実際の投与量は医師により決定され、それはその患者の年齢、体重および応答によって異なる。以下の投与量は平均的なケースの典型例である。もちろん、より大きいかまたはより小さい投与量範囲が有益である特定の場合が存在しうる。
該医薬およびワクチン組成物は直接的な注射により投与することができる。該組成物は非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮投与用に製剤化することができる。典型的には、各タンパク質は０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。
「投与」なる語はウイルスまたは非ウイルス技術による送達を含む。ウイルス送達メカニズムには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。非ウイルス送達メカニズムには、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン性表面（facial）両親媒性物質（ＣＦＡ）およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような送達メカニズムのための経路には、粘膜、鼻腔内、経口、非経口、胃腸、局所または舌下経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「投与」なる語は、例えば吸入用の鼻腔内スプレー剤もしくはエアロゾル剤または内服液としての粘膜経路による送達；注射可能な形態、例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下経路により送達を行う非経口経路による送達を含むが、これらに限定されるものではない。
「共投与」なる語は、例えばＫｖ９．２ポリペプチドおよび追加的物質（例えばアジュバント）のそれぞれの投与の部位および時間が、必要な免疫系モジュレーションを達成させうるものであることを意味する。したがって、該ポリペプチドと該アジュバントとは時間的に同時に同じ部位に投与することができるが、該アジュバントとは異なる時点および異なる部位に該ポリペプチドを投与することが好都合な場合もある。該ポリペプチドおよびアジュバントは、同じ送達ビヒクル中で送達されることさえ可能であり、該ポリペプチドと該抗原がカップリングされるかおよび／もしくはカップリングされなくてもよく、ならびに／または遺伝的にカップリングされるかおよび／もしくはカップリングされなくてよい。
Ｋｖ９．２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ヌクレオチド、抗体および場合によってはアジュバントを宿主対象に単回用量としてまたは複数回用量で別々に投与するかあるいは共投与することが可能である。
ワクチン組成物および医薬組成物は、多数の異なる経路、例えば注射（これは非経口、皮下および筋肉内注射を含む）、鼻腔内、粘膜、経口、膣内、尿道または眼投与により投与することができる。
ワクチンおよび医薬組成物は、通常は、注射、例えば皮下または筋肉内注射により非経口投与することができる。他の投与方法に適した更なる製剤としては、坐剤、および一部の場合には経口製剤が挙げられる。坐剤用の通常の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。かかる坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。ワクチン組成物を凍結乾燥させた場合には、該凍結乾燥物は投与前に、例えば懸濁液として再調製することができる。再調製は、好ましくはバッファー中で行う。
他の態様
本発明の他の態様および実施形態を以下の番号付き小項に記載する。本発明はこれらの態様を包含するものと理解されるべきである。
第１項 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列またはそれらのホモログ、変異体もしくは誘導体を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチド。
第２項 第１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
第３項 配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列またはそれらのホモログ、変異体もしくは誘導体を含んでなる、第２項に記載の核酸。
第４項 第１項に記載のポリペプチドの断片を含んでなるポリペプチド。
第５項 配列番号３と配列番号５との間で相同である１以上の領域を含んでなるか、または配列番号３と配列番号５との間で非相同である１以上の領域を含んでなる、第３項に記載のポリペプチド。
第６項 第４項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
第７項 第２、３または６項に記載の核酸を含んでなるベクター。
第８項 第２、３もしくは６項に記載の核酸または第７項に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
第９項 第２、３もしくは６項に記載の核酸または第７項に記載のベクターを含んでなるトランスジェニック非ヒト動物。
第１０項 マウスである、第９項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
第１１項 Ｋｖ９．２サブユニットと特異的に相互作用することが可能な化合物を特定する方法における第１、４または５項に記載のポリペプチドの使用。
第１２項 Ｋｖ９．２サブユニットと特異的に相互作用することが可能な化合物を特定する方法における、第９または１０項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
第１３項 Ｋｖ９．２を発現する細胞を候補化合物と接触させるステップと、該チャネルのカイネティクスおよびコンダクタンスが変化したかどうかを決定するステップとを含むＫｖ９．２含有イオンチャネルのアンタゴニストを特定するための方法。
第１４項 Ｋｖ９．２含有イオンチャネルを発現する細胞を候補化合物と接触させるステップを含む、該チャネルのコンダクタンスレベルを増大させることまたは該チャネルの電流カイネティクスをモジュレートすることが可能な化合物を特定するための方法。
第１５項 Ｋｖ９．２ポリペプチドを候補化合物と接触させるステップと、該候補化合物が該Ｋｖ９．２ポリペプチドに結合するかどうかを決定するステップとを含む、Ｋｖ９．２ポリペプチドに結合することが可能な化合物を特定する方法。
第１６項 第１１〜１５項のいずれか１項に記載の方法により特定された化合物。
第１７項 第１、４または５項に記載のポリペプチドに特異的に結合することが可能な化合物。
第１８項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドもしくはその一部分または第２、３もしくは６項に記載の核酸の、抗体の生成方法における使用。
第１９項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドもしくはその一部分または第２、３もしくは６項に記載のヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもしくはその一部分に特異的に結合することが可能な抗体。
第２０項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６または１７項に記載の化合物；および第１９項に記載の抗体、のうちの任意の１以上と、製薬上許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
第２１項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６または１７項に記載の化合物；および第１９項に記載の抗体、のうちの任意の１以上を含んでなるワクチン組成物。
第２２項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６または１７項に記載の化合物；および第１９項に記載の抗体、のうちの任意の１以上を含んでなる、疾患または疾患感受性に関する診断キット。
第２３項 Ｋｖ９．２含有イオンチャネルのアンタゴニストを患者に投与するステップを含む、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの活性の上昇に関連した疾患に罹患した患者の治療方法。
第２４項 Ｋｖ９．２含有イオンチャネルのアゴニストを患者に投与するステップを含む、Ｋｖ９．２含有イオンチャネルの活性の低下に関連した疾患に罹患した患者の治療方法。
第２５項 Ｋｖ９．２サブユニットが、配列番号３または配列番号５に示す配列を有するポリペプチドを含む、第２３または２４項に記載の方法。
第２６項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６または１７項に記載の化合物；第１９項に記載の抗体；第２０項に記載の医薬組成物；および第２０項に記載のワクチン、のうちの任意の１以上を患者に投与するステップを含む、患者における疾患の治療および／または予防方法。
第２７項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６もしくは１７項に記載の化合物；および／または第１９項に記載の抗体を含んでなる、疾患の治療または予防方法において使用するための薬剤。
第２８項 第１、４もしくは５項に記載のポリペプチドまたはその一部分；第２、３もしくは６項に記載の核酸またはその一部分；第７項に記載のベクター；第８項に記載の細胞；第１６もしくは１７項に記載の化合物；および第１９項に記載の抗体の、疾患の治療または予防用の医薬組成物の調製のための使用。
第２９項 改変されたＫｖ９．２遺伝子を含むことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
第３０項 該改変が、Ｋｖ９．２の欠失、機能喪失をもたらすＫｖ９．２における突然変異、部位特異的またはランダム突然変異を有するヌクレオチド配列を有する外来性遺伝子のＫｖ９．２への導入、別種由来の外来性遺伝子のＫｖ９．２への導入、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、第２９項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
第３１項 異種Ｋｖ９．２タンパク質をコードするトランスジーンをそのゲノム内に含み、かつ該トランスジーンを発現する、機能的に破壊された内在性Ｋｖ９．２遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物。
第３２項 宿主細胞内のＫｖ９．２遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物であって、（ａ）非相同性置換部分、（ｂ）第１のＫｖ９．２遺伝子配列に対して実質的に同一なヌクレオチド配列を有し、かつ該非相同性置換部分の上流に位置する、第１相同性領域、および（ｃ）天然に存在する内在性Ｋｖ９．２遺伝子内の第１のＫｖ９．２遺伝子配列の下流に位置する第２のＫｖ９．２遺伝子配列に対して実質に同一なヌクレオチド配列を有し、かつ該非相同性置換部分の下流に位置する第２相同性領域を含んでなる核酸構築物。
第３３項 Ｋｖ９．２ポリペプチドをコードする核酸が発現される条件下で第８項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、Ｋｖ９．２ポリペプチドの生成方法。
第３４項 サンプル中の第２、３または６項に記載の核酸の存在を検出する方法であって、サンプルを、該核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと接触させるステップと、該核酸の存在に関して該サンプルをモニターするステップとを含む方法。
第３５項 サンプル中の第１、４または５項に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、サンプルを、第１９項に記載の抗体と接触させるステップと、該ポリペプチドの存在に関して該サンプルをモニターするステップとを含む方法。
第３６項 Ｋｖ９．２サブユニットの発現の上昇、低下もしくはその他の異常により引き起こされるかまたはそれらに関連する疾患または症候群の診断方法であって、（ａ）かかる疾患に罹患したかまたは罹患している疑いのある動物におけるＫｖ９．２サブユニットの発現のレベルまたはパターンを検出するステップと、（ｂ）発現のレベルまたはパターンを正常動物の場合と比較するステップとを含む方法。
実施例
トランスジェニックＫｖ９．２ノックアウトマウス：Ｋｖ９．２遺伝子ターゲティングベクターの構築
ゲノムデータベースの相同性検索を用いるバイオインフォマティクス技術によりＫｖ９．２遺伝子を特定した。種々のデータベースから２２６ｋｂのゲノムコンティグを組み立てた。このコンティグは、ターゲティングベクター内へのクローニングのための相同アームの設計を可能にするのに十分な隣接配列情報をもたらした。
マウスＫｖ９．２遺伝子は１個のコーディングエクソンを有する。ターゲティング方法は、該コード配列の大部分を除去するよう設計されている。欠失させる領域に隣接する１．７ｋｂの５’相同アームおよび４．０ｋｂの３’相同アームをＰＣＲにより増幅し、該断片を該ターゲティングベクター内にクローニングする。該アームを増幅するために使用する各オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端は、該ベクターポリリンカーのクローニング部位に適合性であり該アーム自体には存在しない、稀切断制限酵素に対する異なる認識部位を含有するように合成する。Ｋｖ９．２の場合には、後記のプライマー表に挙げられているとおり、ＡｇｅＩ／ＮｏｔＩの５’アームクローニング部位およびＡｓｃＩ／ＦｓｅＩの３’アームクローニング部位を有するプライマーを設計する（対応する制限部位を含む、使用するターゲティングベクターの構造は、図１に示されている）。
アームプライマーペア（５’ａｒｍＦ／５’ａｒｍＲ）および（３’ａｒｍＦ／３’ａｒｍＲ）に加えて、Ｋｖ９．２遺伝子座に特異的な他のプライマーを以下の目的のために設計する：５’および３’プローブプライマーペア（５’ｐｒＦ／５’ｐｒＲおよび３’ｐｒＦ／３’ｐｒＲ）（各アームに対して外側にあり各アームを超えて伸長する非反復性ゲノムＤＮＡの、１５０〜３００ｂｐの２つの短い断片を増幅して、単離された推定上のターゲティングされたクローンにおいて、ターゲティングされた遺伝子座のサザン分析を可能にするため）；マウス遺伝子型決定用プライマーペア（ｈｅｔＦおよびｈｅｔＲ）（ベクター特異的プライマー（この場合はＡｓｃ４０３）と共にマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する場合に野生型マウス、ヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの間の識別を可能にする）；ならびに最後に、５’アーム領域の末端の上流にアニールするターゲティングスクリーニングプライマー（５’ｓｃｒ）（ベクター（ＴＫ５ＩＢＬＭＮＬ）の５’末端に特異的なプライマー（この場合はＤＲ１）とペアにした場合にターゲティング事象に特異的な２．０ｋｂの増幅物を作り出す。この増幅物は、所望のゲノム改変が生じている細胞からの鋳型ＤＮＡのみから誘導することが可能であり、該ベクターのランダムに組込まれたコピーを含有するクローンのバックグラウンドからの、適切にターゲティングがなされた細胞の特定を可能にする。）。これらのプライマーの位置、および該ターゲティング法において使用するＫｖ９．２遺伝子座の領域のゲノム構造を配列番号１９に示す。
相同アームの位置は、Ｋｖ９．２遺伝子を機能的に破壊するよう選択する。Ｋｖ９．２遺伝子と同じ方向に向いて配置された改良型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子により構成される選択カセットの上流の内在性遺伝子発現レポーター（フレーム非依存性ｌａｃＺ遺伝子）により構成される非相同配列で、欠失させるＫｖ９．２領域を置き換えることにより、ターゲティングベクターを得る。
５’および３’相同アームをターゲティングベクターＴＫ５ＩＢＬＭＮＬ中にクローニングしたら（図４を参照されたい）、標準的な分子生物学的技術を用いて、非常に純粋なＤＮＡ調製物を得る。新たに調製した内毒素非含有ＤＮＡ ２０μｇを、アンピシリン耐性遺伝子と細菌複製起点との間のベクターバックボーン内のユニーク部位で別の稀切断制限酵素であるＰｍｅＩで制限処理する。ついで、線状化されたＤＮＡを沈殿させ、１００μｌのリン酸緩衝食塩水に再懸濁して、エレクトロポレーションのために準備する。
エレクトロポレーションの２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、２００μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有する培地中で９日間培養する。クローンを９６ウェルプレート内に拾い入れ、複製させ、増殖させた後、ＰＣＲ（前記のプライマー５’ｐｒＦおよびＤＲ１を使用する）によるスクリーニングに付して、内在性Ｋｖ９．２遺伝子と該ターゲティング構築物との間で相同組換えが起こったクローンを特定する。陽性クローンは１〜５％の比率で特定することができる。これらのクローンを増殖させて、レプリカを凍結させ、前記のとおりに調製した５’および３’プローブを使用してターゲティング事象のサザンブロットでの確認のために十分な高品質ＤＮＡを調製する。これはすべて、標準的な方法（Russら, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99）を用いて行う。診断用制限酵素で消化したＤＮＡのサザンブロットを外側プローブとハイブリダイズさせると、相同的にターゲティングされたＥＳ細胞クローンが、突然変異体バンドおよび未改変野生型バンドの存在により確認される。例えば、ＡｆｌＩＩで消化した野生型ゲノムＤＮＡは、５’外側プローブとハイブリダイズした場合には６．２ｋｂのバンドを生じ、３’外側プローブでは７．０ｋｂのバンドを生じるが、一方、ターゲティングされた対立遺伝子を含有する同様に消化されたゲノムＤＮＡは、野生型バンドに加えて約１７ｋｂのノックアウト特異的バンドを生じるであろう。
トランスジェニックＫｖ９．２ノックアウトマウス：Ｋｖ９．２ ＧＰＣＲ欠損マウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６雌および雄マウスを交配させ、妊娠３．５日の時点で胚盤胞を単離する。選択されたクローンからの１０〜１２個の細胞（胚盤胞当たり）を注入し、７〜８個の胚盤胞を偽妊娠Ｆ１雌の子宮内に移植する。数匹の高レベル（１００％まで）のアグーチ雄（アグーチ色の外皮はターゲティングされたクローン由来の細胞の寄与を示している）を含むキメラ同腹子マウスが生まれる。これらの雄キメラを雌ＭＦ１の１２９匹のマウスと交配させ、それぞれアグーチ外皮色およびＰＣＲ遺伝子型決定により生殖系列遺伝を確認する。
ＰＣＲ遺伝子型決定は、プライマーｈｅｔＦおよびｈｅｔＲを第３のベクター特異的プライマー（Ａｓｃ４０３）と共に使用して、細胞溶解した尾断片に関して行う。このマルチプレックスＰＣＲは、プライマーｈｅｔＦおよびｈｅｔＲからの野生型遺伝子座（存在する場合）からの増幅を可能にして、２４１ｂｐのバンドを生じる。ノックアウトマウスにおいてはｈｅｔＦに対する部位が欠失しており、したがって、この増幅はターゲティングされた対立遺伝子からは生じないであろう。しかし、Ａｓｃ４０３プライマーは、３’アームのすぐ内側の領域にアニールするｈｅｔＲプライマーと組み合わされて、ターゲティングされた遺伝子座から４３４ｂｐのバンドを増幅するであろう。したがって、このマルチプレックスＰＣＲは以下のとおりに同腹子の遺伝子型を明らかにする：野生型サンプルは、単一の２４１ｂｐのバンドを示し、ヘテロ接合ＤＮＡサンプルは２４１ｂｐおよび４３４ｂｐの２つのバンドを生じ、ホモ接合サンプルは、ターゲティング特異的な４３４ｂｐのバンドのみを示すであろう。
Figure 2008506361
生物学的データ：遺伝子発現パターン（ヒトＲＴ−ＰＣＲ）
ヒト組織に対するＲＴ−ＰＣＲを用いて、該遺伝子の発現が肺、脳、脾臓において示され、また、より低い程度ではあるが前立腺、肝臓、生殖器および筋肉においても示された。
これを図２に示す。
生物学的データ：遺伝子発現パターン（ＬａｃＺ染色構造体）
ＬａｃＺ染色
解剖組織のＸ−ｇａｌ染色を以下の方法で行う。
大きな器官からは代表的な組織薄片を作製する。小さな器官および管状器官はその全体を切り開いて、固定液および染色液が浸透するようにする。組織をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で十分にすすいで血液および消化管内容物を除去する。組織を固定液（２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタールアルデヒド、０．０２％ＮＰ４０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、デオキシコール酸ナトリウム０．２３ｍＭを含有するＰＢＳ）中に３０〜４５分間置く。ＰＢＳ中での５分間ずつ３回の洗浄の後、組織をＸｇａｌ染色液（ＰＢＳ中の４ｍＭフェロシアン化カリウム、４ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ）中に３０℃で１８時間置く。組織をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルムアルデヒド中で２４時間にわたって後固定し、ＰＢＳで再び洗浄した後、７０％エタノール中で保存する。
Ｘｇａｌ染色組織を特定するために、脱水組織をワックス包埋し、７μｍ切片を作製し、０．０１％サフラニンで対比染色する（９〜１０分間）。
ＬａｃＺ染色を用いて、脳、特に皮質、海馬、カレハ（calleja）島、淡蒼球、中心扁桃核（ＣｅＬ）、視床核および皮質においてＫｖ９．２が発現していることがわかる。また、染色は心臓、脾臓、肺および精巣においても見られる。
生物学的データ：生理学／生化学（血中グルコース）
一晩（１４〜１６時間）絶食させた動物の尾静脈から採取した血液サンプルの血中グルコースの測定を行った。血中グルコースは、血中グルコースモニターを用いて測定した。
Ｋｖ９．２遺伝子がノックアウトされた動物を検査し、ノックアウトされていない（野生型）同腹子と比較した。ノックアウト動物は３．２４±２．１ｍｍｏｌ／ｌの血糖値を有し、一方、野生型動物は４．６９±０．３８ｍｍｏｌ／ｌの血糖値を有していた（Ｐ＝０．００６）。したがって、Ｋｖ９．２ノックアウト動物は、野生型動物に比べて低下した血糖値を示している。
結果を図３に示す。
生物学的データ：行動分析（オープンフィールド試験）
ノックアウトマウスおよび野生型対照マウスをオープンフィールド試験において試験した。Carola, V., F. D'Olimpioら, (2002). “Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice.”を参照されたい。
簡潔に説明すると、マウスを、透明な面を有するパースペックス（Perspex）箱の中央に置き、一定時間にわたる該マウスの移動をビデオに記録する。移動距離、移動時間および任意の時点におけるマウスの位置に関して該マウスを分析する。対照動物は、通常、中央区画を時々横切りつつも、時間のほとんどを該試験領域の辺縁区画を動き回ることに費やす。この正常パターンからの変化、特に、該試験領域の中央区画において費やした時間の長さ（その増加は、該動物がそれほど不安ではないことを意味しうる）を記録する。
一定時間にわたるマウスの移動をビデオに記録し、分析する。その結果は、ノックアウトマウスが、野生型対照ほどは移動しなかったことを示している（野生型：１１６１．３９±１７０．８ｃｍ；ノックアウト：６３６．８４±１９３．６２、ｐ＝０．０５ ＡＮＯＶＡ）。
（図５Ａ）．該ノックアウトマウスにおいては、野生型対照マウスの移動行動と比較して、辺縁区画および中央区画の両方において移動した合計時間がより短いこと、すなわち、それらはより長時間にわたって動かず（図５Ｂ）、フリーズしている傾向にあったことが、このデータの分析から示された。したがって、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスは不動性の増大を示している。
試験の合計時間は３００ｓであり、中央区画を移動するのに費やした時間は野生型５６．２±１２．７ｓ、ノックアウト２３．３±８．５ｓ（ｐ＝０．０１ ＡＮＯＶＡ）であり、辺縁区画を移動するのに費やした時間は野生型４４．３±４．４；ノックアウト２４．７±７．９であった。したがって、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスは更に、辺縁での静止時間の増加と共に、歩行時間の減少を示している。
辺縁区画および中央区画への進入の合計回数、すなわち、マウスがオープンフィールドを横切って移動した回数も、ノックアウトマウスにおいては著しく減少している（野生型７．３±２；ノックアウト２±１、ｐ＜０．０１ ＡＮＯＶＡ）（図５Ｃ）。
生物学的データ：行動解析（プラス型迷路）
ノックアウトマウスおよび野生型対照マウスをプラス型迷路において試験した。
簡潔に説明すると、高架になったプラス型迷路およびビデオ追跡を用いてマウスでの不安を測定する。この試験は、高さおよび開放状態の要素を追加して、新たな環境を探検するマウスの傾向と、明るく照らされたオープンフィールドを嫌う性質との対立の測定を用いる。２つの互い違いのアームは、黒っぽい高い壁で閉じられ、残りの２つは開いている。マウスは、閉じられたアーム（クローズドアーム）を好むが、開いたほう（オープンアーム）に思い切って進むであろう。Pellowら ‘Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.’ (1985)を参照されたい。
ノックアウトマウスは対照野生型マウスと同様の距離を移動したと記録されたが、データの分析は、それらが、対照マウスと比較して、有意に長い時間を、クローズドアーム（安全とみなされる）において費やし、オープンアーム（安全でないとみなされる）にはそれほど多くは進入しないことを示した。
このことは、Ｋｖ９．２ノックアウトマウスが不安表現型を有すること、したがって、Ｋｖ９．２が不安の障害に関与していることを示している。
本明細書中で言及されている出願および特許のそれぞれ、ならびに出願経過を含めた前記出願および特許のそれぞれにおいて引用または参照されている各文書（「出願引用文書」）、ならびに該出願および特許のそれぞれにおいておよびいずれかの出願引用文書において引用または言及されているいずれの製品に関するいずれの製造業者の説明書またはカタログも、参照により本明細書に組み入れることとする。さらに、本明細書中で引用されているすべての文書、および本明細書中で引用されている文書において引用または参照されているすべての文書、および本明細書中で引用または言及されているいずれの製品に関するいずれの製造業者の説明書またはカタログも、参照により本明細書に組み入れることとする。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法および系の種々の改変および変更が、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求されている本発明はかかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではなく、それらに対する多数の修飾および追加を本発明の範囲内で行うことができると理解されるべきである。実際、分子生物学および関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されている態様の種々の改変が、特許請求の範囲に含まれることが意図される。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、特許請求の範囲の後続従属項の特徴を、独立項の特徴と様々に組み合わせることができる。
Figure 2008506361
Figure 2008506361
Figure 2008506361
Figure 2008506361
Ｋｖ９．２欠損マウスを作製するためのノックアウトベクターを示す概要図である。 ヒトＲＴ−ＰＣＲスクリーニングからのＫｖ９．２遺伝子発現の結果である。 血中グルコースレベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）の分析の結果を示すグラフである。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 ノックアウトプラスミドベクターのヌクレオチド配列である。 オープンフィールド試験の結果の分析を示すグラフである。図５Ａ：辺縁区画（左）および中央区画（右）内を移動した総距離（黒いカラムはノックアウト動物）。 オープンフィールド試験の結果の分析を示すグラフである。図５Ｂ：辺縁区画（左）および中央区画（右）内を移動した時間（黒いカラムはノックアウト動物）。 オープンフィールド試験の結果の分析を示すグラフである。図５Ｃ：フィールド区画内への進入の回数（黒いカラムはノックアウト動物）。 迷路のクローズドアームおよびオープンアームにおいて費やされた時間を示すプラス型迷路試験の結果の分析のグラフである（黒いカラムはノックアウト動物、斜線のカラムは野生型動物）。

Claims (29)

  1. Ｋｖ９．２遺伝子が配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、機能的に破壊された内在性遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物。
  2. Ｋｖ９．２遺伝子またはその一部分の中に欠失を有する、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  3. 野生型動物と比較して、以下の表現型：
    （ａ） 血中グルコースレベルの低下；
    （ｂ） 好ましくはオープンフィールド試験および／またはプラス型迷路試験において測定される、不安の増大
    のいずれかまたはこれらの組み合わせを示す、請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  4. トランスジェニック非ヒト動物であって、該動物のＫｖ９．２遺伝子の少なくとも一部分またはその全体が、別の動物の、好ましくは別の種の、より好ましくはヒトのＫｖ９．２遺伝子に由来する配列と置き換えられている、上記動物。
  5. マウスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  6. 機能的に破壊されたＫｖ９．２遺伝子、好ましくはＫｖ９．２遺伝子中の欠失を含んでなり、該Ｋｖ９．２遺伝子は配列番号４に示す核酸配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、請求項５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞または組織。
  8. 配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなる、機能的に破壊された内在性Ｋｖ９．２遺伝子を有する細胞。
  9. 不安または糖尿病のモデルとしての、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項７に記載の細胞もしくは組織、または請求項８に記載の細胞の使用。
  10. Ｋｖ９．２関連疾患のモデルとしての、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物、請求項７に記載の細胞もしくは組織、または請求項８に記載の細胞の使用。
  11. 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを特定する方法における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物、請求項７に記載のその単離細胞もしくは組織、または請求項８に記載の細胞の使用。
  12. 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを特定する方法であって、候補化合物を動物に、好ましくは野生型動物または請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与するステップと、以下の表現型：（ａ）血中グルコースレベル；および（ｂ）好ましくはオープンフィールド試験および／またはプラス型迷路試験において測定される、不安、のうちのいずれかにおける変化を測定するステップとを含む、上記方法。
  13. 前記動物が前記表現型（ａ）（ｂ）のうちいずれかにおける増大を示すようにすることが可能な候補化合物を特定するステップを含む、請求項１２に記載のＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストを特定する方法。
  14. 前記動物が前記表現型（ａ）（ｂ）のうちいずれかを示すか、またはかかる表現型における低下を示すようにすることが可能な候補化合物を特定するステップを含む、請求項１２に記載のＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストを特定する方法。
  15. 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを特定する方法であって、候補化合物を細胞もしくは組織に、好ましくは野生型細胞もしくは組織あるいは請求項７に記載の細胞もしくは組織または請求項８に記載の細胞に曝露するステップと、該細胞もしくは該組織の細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスにおける変化を測定するステップとを含む、上記方法。
  16. 前記細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスを増大させることが可能な候補化合物を特定するステップを含む、請求項１５に記載のＫｖ９．２ポリペプチドのアゴニストを特定する方法。
  17. 前記細胞のコンダクタンスまたはカイネティクスを低下させることが可能な候補化合物を特定するステップを含む、請求項１５に記載のＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストを特定する方法。
  18. 不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療または軽減に好適な化合物を特定する方法であって、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドを候補化合物に曝露するステップと、該候補化合物が該Ｋｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するステップとを含む、上記方法。
  19. 配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリヌクレオチドの、不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のためのそのアゴニストまたはアンタゴニストの特定における使用。
  20. 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチドの、不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のためのそのアゴニストまたはアンタゴニストの特定における使用。
  21. 個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療方法での使用のための、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニスト。
  22. 個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の治療のための医薬組成物の調製における、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有してなるＫｖ９．２ポリペプチドのアンタゴニストの使用。
  23. Ｋｖ９．２のアンタゴニストを個体に投与するステップを含む、不安または糖尿病に罹患した、好ましくはＫｖ９．２関連疾患に罹患した個体の治療方法。
  24. 個体またはその細胞もしくは組織でのＫｖ９．２の発現、レベルまたは活性における変化を検出するステップを含む、個体における不安もしくは糖尿病、好ましくはＫｖ９．２関連疾患の診断方法。
  25. Ｋｖ９．２関連疾患が以下のもの：Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、過インスリン症、インスリン耐性、糖尿病関連血管疾患、糖尿病関連腎疾患および糖尿病関連神経障害をはじめとする糖尿病合併症、ならびに原発性または糖尿病に対して二次的な、低血糖、高脂血症（ＨＤＬ、ＬＤＬまたはＶＬＤＬ）、異常脂質血症の治療、甲状腺機能亢進／低下、末端肥大症、肝不全、腎不全、膵臓腫瘍、膵炎およびアルコール誘導性低血糖からなる群より選択される、請求項１０、１９、２０もしくは２２に記載の使用、請求項１８、２３もしくは２４に記載の方法、または請求項２１に記載のアンタゴニスト。
  26. Ｋｖ９．２関連疾患が以下のもの：社会的不安、心的外傷後ストレス障害、恐怖症、対人恐怖症、特定のものに対する恐怖症、パニック障害、強迫神経症、急性ストレス障害、分離不安障害、全般性不安障害、大うつ、気分変調、双極性障害、季節性情動障害、出産後うつ病、躁うつ病、双極性うつ病、不安、不安障害、不安関連行動および全般性不安障害、広場恐怖症、急性ストレス障害、およびＤＳＭ−ＩＶに挙げられているパニック障害、ならびに抑うつからなる群より選択される、請求項１０、１９、２０もしくは２２に記載の使用、請求項１８、２３もしくは２４に記載の方法、または請求項２１に記載のアンタゴニスト。
  27. 配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含んでなるＫｖ９．２ポリペプチド。
  28. 請求項２７に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  29. 配列番号１、配列番号２もしくは配列番号４に示す核酸配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するそのホモログ、変異体もしくは誘導体を含んでなる、請求項２８に記載の核酸。
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