KR20070018987A - 수용체 ｇｐｒ86의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제인지 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법을 개시한다.
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GPR86, 폴리펩타이드, 수용체, 작용제, 길항제, 염증성 질환, 통증

Description

수용체 ＧＰＲ86의 용도{Use of the receptor GPR86}
본 발명은 신규하게 확인된 핵산, 이들에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 및 그의 제조 및 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 핵산 및 폴리펩타이드는 이하 "GPR86"로 표기되는 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 및 GPCR 퓨리노셉터(purinoceptor) 패밀리의 멤버에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 핵산 및 폴리펩타이드의 작용을 억제하거나 활성화하는 것에 관한 것이다.
의학적으로 유의적인 많은 생물학적 과정은 G-단백질 및/또는 cAMP와 같은 2차 메신저를 포함한 신호 전달 경로에 참여하는 단백질에 의해서 매개됨은 잘 수립되어 있다(Lefkowitz, Nature, 1991, 351 : 353-354). 이들 단백질은 G-단백질 또는 "PPG 단백질"과 함께 경로에 참여하는 단백질로서 표기된다. 이들 단백질의 일부 예는 아드레날린제 및 도파민에 대한 수용체와 같은 GPC 수용체(Kobilka, B. K., et al., Proc. Natl Acad. ScL, USA, 1987, 84: 46-50; Kobilka B. K., et al., Science, 1987, 238: 650-656; Bunzow, J. R., et al., Nature, 1988, 336: 783-787), G-단백질 자체, 포스포리파제 C, 아데닐레이트 사이클라제 및 포스포디에스테라제와 같은 효과기(effector) 단백질 및 단백질 키나제 A 및 단백질 키나제 C와 같은 작동기(actuator) 단백질(Simon, M. I., et al., Science, 1991, 252: 802-8)를 포함한다.
예를 들어 신호 전달의 한 형태로서 호르몬 결합의 효과는 세포 내 효소 아데닐레이트 사이클라제의 활성화이다. 호르몬에 의한 효소 활성화는 뉴클레오타이드, GTP의 존재에 의존적이다. 또한 GTP는 호르몬 결합에 영향을 미친다. G-단백질은 호르몬 수용체를 아데닐레이트 사이클라제에 연결시킨다. G-단백질은 GTP를 호르몬 수용체에 의한 활성화시 결합된 GDP와 교환하는 것으로 나타났다. 이후 GTP 운반 형태는 활성화된 아데닐레이트 사이클라제에 결합된다. G-단백질 자체에 의해 촉매되는 GTP에서 GDP로의 가수분해는 G-단백질을 그의 기초적인 불활성화 형태로 복귀시킨다. 따라서 G-단백질은 수용체로부터 효과기로 신호를 교대시키는 중개자로서 또한 신호의 지속기간을 제어하는 시계로서의 이중 작용을 한다.
G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 막단백질 유전자 수퍼패밀리는 7개의 추정 막횡단 도메인을 지님을 특징으로 한다. 상기 도메인은 세포외 또는 세포질 루프(loop)에 의해 연결된 막횡단 α-헬릭스를 나타내는 것으로 간주된다. G-단백 질 결합 수용체는 호르몬, 바이러성, 생장 인자 및 신경수용체(neuroreceptor)와 같은 광범위한 생물학적 활성 수용체를 포함한다.
G-단백질 결합 수용체(7TM 수용체로도 알려짐)는 적어도 8개 이상의 분기 친수성 루프를 연결하는 약 20∼30개 아미노산의 7개의 보존된 소수성 스트레치(stretch)를 포함함을 특징으로 한다. 수용체에 결합된 G-단백질 패밀리는 정신이상 및 신경계장애의 치료에 사용되는 신경이완제에 결합하는 도파민 수용체를 포함한다. 이러한 패밀리 멤버의 다른 예는 칼시토닌, 아드레날린제, 엔도텔린, 키닌, 난포 자극 호르몬, 옵신, 내피세포 분화 유전자-1, 로돕신, 취기제 및 거대세포바이러스 수용체를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
대부분의 G-단백질 결합 수용체는 기능성 단백질 구조를 안정화시키는 것으로 판단되는 이황결합을 형성하는 첫 번째 2개 세포외 루프 각각에 단일 보존 시스테인 잔기를 지닌다. 7개 막횡단 영역은 TMl, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 및 TM7으로 명명된다. TM3은 신호 전달에 관련된다.
시스테인 잔기의 인산화 및 지질화(파미틸레이션(pamitylation) 또는 파네실레이션(farnesylation))는 일부 G-단백질 결합 수용체의 신호 전달에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 G-단백질 결합 수용체는 세 번째 세포질 루프 및/또는 카르복시 말단 내에 잠재적인 인산화 사이트를 포함한다. β-아드레날린수용체와 같은 일부 G-단백질 결합 수용체의 경우 단백질 키나제 A 및/또는 특정 수용체 키나제에 의한 인산화는 수용체 탈민감화를 매개한다. 일부 수용체의 경우 G-단백질 결합 수용체의 리간드 결합 사이트는 일부 G-단백질 결합 수용체 막횡단 도메인에 의해 형성된 친수성 소켓(socket)을 포함하는 것으로 판단되고, 이러한 소켓은 G-단백질 결합 수용체의 소수성 잔기에 의해 둘러싸인다. 각각의 G-단백질 결합 수용체 막횡단 헬릭스의 친수성 측면은 내향하고 극성 리간드 결합 사이트를 형성하는 것으로 판단된다. TM3은 TM3 아스파르트산 잔기와 같은 리간드 결합 사이트를 지닌 일부 G-단백질 결합 수용체 수용체에 관련된다. TM5 세린, TM6 아스파라긴 및 TM6 또는 TM7 페닐알라닌 또는 티로신도 리간드 결합에 관련된다.
G-단백질 결합 수용체는 이형삼량체 G-단백질에 의해 다양한 세포내 효소, 이온 채널 및 전달체에 세포내적으로 결합될 수 있다(Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10: 317-331 참조). 다른 G-단백질 α-서브유니트는 특정 효과기를 우선적으로 자극하여 세포 내의 다양한 생물학적 기능을 조절한다. G-단백질 결합 수용체의 세포질 잔기의 인산화는 일부 G-단백질 결합 수용체의 G-단백질 결합의 조절에 중요한 메커니즘으로 확인되었다. G-단백질 결합 수용체는 포유류 숙주 내의 뉴런 사이트에서 내에서 발견된다. 지난 15년 간 7개 막횡단(7 TM) 수용체를 타겟으로 하는 약 350개 치료제가 시장에 성공적으로 도입되었다.
따라서 G-단백질 결합 수용체는 치료제 타겟으로서 수립되고 입증된 역사를 지닌다. 명백하게는 기능장애 또는 질환을 예방하거나 개선하거나 교정하는데 중요한 역할을 할 수 있는 또다른 수용체의 확인 및 특성화에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명자는 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제인지 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법을 제공한다.
바람직하게는 GPR86 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열에 의해 인코드된다.
바람직하게는 상기 방법은 후보 분자를 GPR86 폴리펩타이드에 노출시키는 단계 및 후보 분자가 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 작용제는 GPR86 부여된 G-단백질 Gi와 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 접촉시키고 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉의 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정함으로서 확인된다.
바람직하게는 길항제는 GPR86 부여된 G-단백질 Gi와 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 접촉시키고 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉의 결과에 의해 증가되는지 여부를 측정함으로서 확인된다.
바람직하게는 작용제는 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 접촉시키고 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉의 결과에 의해 증가되는지 여부를 측정함으로서 확인된다.
바람직하게는 길항제는 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 접촉시키고 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉의 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정함으로서 확인된다.
바람직하게는 상기 방법은 (a) 야생형 동물 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물을 제공하는 단계; (b) 상기 야생형 또는 형질전환 비-인간 동물을 후보 분자에 노출시키는 단계; 및 (c) 상기 접촉의 결과로 상기 동물의 생물학적 파라미터가 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 생물학적 파라미터는 자극 반응, 열 반응, 광 반응, 면역 반응, 염증 반응, 통증 반응, 바람직하게는 통증 반응으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 상기 방법은 (a) 야생형 세포 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 포함한 세포, 바람직하게는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물로부터 분리된 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 세포를 후보 분자에 노출시키는 단계; 및 (c) GPR86 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 상기 접촉의 결과로 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에 이용하기 위한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에 있어서 야생형 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물의 이용이 제공된다.
GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증에 대한 모델로서 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물 또는 그의 분리된 세포 또는 조직의 이용이 제공된다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 바람직하게는 GPR86 유전자 또는 그의 일부의 결실을 포함한 기능적으로 분열된 GPR86 유전자를 포함한다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형의 변화를 나타낸다: 자극 반응, 열 반응, 광 반응, 면역 반응, 염증 반응, 통증 반응, 바람직하게는 통증 반응.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 적어도 하나 이상의 하기를 나타낸다: (a) 통증에 대한 증가되거나 감소된 민감도의 변화된 통증 감수성; 및 (b) 염증성 통증에 대한 감수성이 증가되거나 감소된 변화된 염증성 통증 감수성.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게는 마우스이다.
본 발명자는 본 발명의 세 번째 관점에 따라 후보 화합물을 상기 기술된 바와 같이 야생형 또는 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 생물학적 파라미터의 변화를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법을 제공한다.
본 발명의 네 번째 관점에 따라 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위해 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 이용이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리뉴클레오타이드의 이용을 제공한다.
바람직하게는 통증은 급성 통증, 만성 통증, 피부 통증, 체성 통증, 내장 통증, 심근허혈을 포함한 연관 통증, 환상 통증, 신경병증성 통증(신경통), 상처, 질환, 두통, 편두통, 암 통증으로부터 유발된 통증, 파킨슨병과 같은 신경계 장애로부터 유발된 통증, 척추 및 말초신경 수술, 뇌종양, 외상성 뇌손상(TBI), 척수 외 상으로부터 유발된 통증, 만성통증증후군, 만성피로증후군, 삼차신경통, 설인신경통, 대상포진후신경통 및 작열통과 같은 신경통, 낭창, 유육종증, 지주막염, 관절염, 류마티스관절염으로부터 유발된 통증, 주기성 통증, 배통, 요통, 관절통, 복통, 흉통, 분만 진통, 근골격 및 피부 질환, 두부 외상 및 섬유근육통으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 염증성 질환은 바람직하게는 염증성 장애(즉, 류마티스관절염, 다발경화증, 길랑-바레 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 이식편대숙주병, 전신홍반루푸스 또는 인슐린-의존성 당뇨병), 자가면역질환(즉, 독소충격증후군, 골관절염, 당뇨병 또는 염증성 내장 질환), 급성 통증, 만성 통증, 신경성 통증, 접촉피부염, 죽상동맥경화증, 사구체신염, 재관류 손상, 골 흡수 질환, 천식, 뇌졸중, 심근경색증, 열손상, 성인성 호흡곤란증후군(ARDS), 외상후 2차 다발 기관 손상, 급성 염증성 성분 동반 피부병, 급성 화농성 수막염, 괴사성 장결장염, 혈액투석 관련 증후군, 패혈쇼크, 류코페리시스(leukopherisis), 과립세포 수혈, 연기 흡입에 의해 유발된 폐의 급성 또는 만성 염증, 자궁내막증, 베체트병, 포도막염, 강직성 척추염, 췌장염, 암, 라임 질환, 경피경혈관확장술후 재협착, 알츠하이머병, 외상성 관절염, 패혈증, 만성폐쇄성폐질환, 울혈성심장기능상실, 골다공증, 악액질, 파킨슨병, 치주질환, 통풍, 알레르기 질환, 연령관련황반변성, 감염 및 낭성섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 본 발명의 여섯 번째 관점에 따라 기술된 바와 같은 방법 또는 이용에 의해 확인된 GPR86의 작용제 또는 길항제를 제공한다.
본 발명의 일곱 번째 관점에 있어서 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에서의 이러한 분자의 이용이 제공된다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 따라 본 발명자는 하나 이상의 하기를 포함한 염증성 질환 또는 통증 또는 이에 대한 감수성에 대한 진단 키트를 제공한다: GPR86 폴리펩타이드 또는 그의 일부; GPR86 폴리펩타이드의 항체; 또는 이를 인코드하는 것이 가능한 핵산.
본 발명자는 아홉 번째 관점에 따라 개체 내 GPR86 폴리펩타이드의 활성 또한 함량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한 염증성 질환 또는 통증의 증세를 나타내는 개체의 치료 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 방법은 GPR86 폴리펩타이드, GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 GPR86에 대한 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 열 번째 관점에 따라 (a) 염증성 질환 또는 통증의 증세를 나타내는 동물 또는 이러한 질병의 증세를 나타낼 것으로 의심되는 동물에서의 GPR86 폴 리펩타이드의 발현 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함한 염증성 질환 또는 통증의 진단 방법이 제공된다.
방법 및 이용
본 발명의 실행은 특별히 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 내에 설명된다. J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James OD. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson Immunocytochemistry: Theory and Practice, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); Immunochemical Protocols, vol 80, in the series: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons) 참조. 이들 일반 문헌 각각은 참고문헌으로 포함된다.
GPR86
본 발명은 일반적으로 G-단백질 결합 수용체(GPCR), 특히 GPR86로 표기되는 퓨리노셉터(purinoceptor) 형태 G-단백질 결합 수용체뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 개시한다.
본 발명자는 기능성 GPR86을 상실한 형질전환 동물이 야생형 동물과 비교시 통증에 대한 변화된 감수성을 나타냄을 확인하였다. 특히 GPR86 넉아웃은 통증에 덜 민감하다. 더욱이 이러한 동물은 염증성 통증에 변화된 감수성, 특히 염증성 통증에 대한 감소된 감수성을 나타낸다.
따라서 본 발명자는 통증의 치료, 경감 또는 진단에 있어서 GPR86, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체 또는 그의 조절제의 이용을 개시한다. 본 발명의 실시태양은 하기에 더욱 상세히 기술될 것이다.
GPR86의 발현 프로파일
GPR86 cDNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 인가 유래 조직의 골수, 흉선, 림프절, 백혈구, 골모세포, 연골세포 내 다량의 GPR86 발현을 검출한다. 또한 모두 T-세포로부터 유래한 인간 유래 세포주 Jurkat CD4+ 및 Myla CD8+ 내에서도 발견되었다. 낮은 발현 수준이 백혈구 유래의 Colo720 및 단핵세포 유래의 THP1 세포에서 관찰되었다(실시예 4; 도 7).
더욱이 GPR86 발현은 마우스 조직의 비장, 침샘, 척수, 혀, 지방, 고환, 심장, 눈, 폐, 신장, 흉선, 위장 및 소장, 뇌, 간 및 쓸개, 혈액, 방광 및 부신에서도 검출된다(실시예 4; 도 8).
GPR86의 발현 프로파일은 도 3에 나타나 있다.
BLASTN에 의한 인간 EST 데이터 소스를 검색에 서열번호: 1의 GPR86 cDNA를 이용하여 동일성이 인간 심장, 태반, 결장 및 마우스 피부, 유방 및 시상하부 기원의 라이브러리 유래의 cDNA 내에서 발견되었다. 이는 GPR86이 이들 정상 또는 비정상 조직 내에서 발현됨을 나타낸다. 따라서 GPR86 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 이들 및 다른 조직 내 GPR86의 과-, 저- 및 비정상 발현과 관련된 질환의 검출, 진단, 치료 및 다른 분석에 유용하다.
GPR86 관련 질환
여기서 기술된 방법 및 조성물에 있어서, GPR86 GPCR은 광범위한 질환을 치료하고 진단하는데 유용하다. 이들 질환은 편의상 "GPR86 관련 질환"으로 표기된다.
따라서 GPR86 결함 동물은 GPR86 관련 질환에 대한 모델로서 이용된다. GPR86, 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체뿐만 아니라 특히 작용제 및 길항제를 포함한 조절제는 GPR86 관련 질환을 진단하거나 치료하는데 이용된다. 특히 GPR86은 그의 기능에 영향을 미치는 것이 가능한 분자를 선별하는데 이용되고 GPR86 관련 질환을 치료하는데 이용된다.
본 발명자는 인간 GPR86은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 염색체 3q24에 지도화된 것으로 나타났다. 따라서 특정한 실시태양에서 GPR86은 이러한 좌위, 염색체 밴드, 영역, 팔(arm) 또는 동일한 염색체에 지도화된 질환을 치료하거나 진단하는데 이용된다.
GPR86의 염색체 위치(즉, 호모 사피엔스 염색체 3q24)와 동일한 좌위, 염색체 밴드, 영역, 팔 또는 염색체에 결합된 것으로 측정된 알려진 질환은 하기를 포함한다: 급성 골수성 백혈병(3q24), 헤르만스키-푸들라크 증후군(3q24), 혈소판 ADP 수용체 결함(3q24-q25) 및 댄디워커 증후군(3q24).
따라서 바람직한 실시태양에 따라 GPR86 및 그의 조절제(작용제 및 길항제와 같은)는 본 출원서에 기술된 방법에 의해 파킨슨병과 같은 도파민 관련 질환, 상실성 및 심실성 부정맥, 저혈압, 구토, 뚜렛증후군, 스트레스 및 통증을 진단하거나 치료하는데 이용된다.
GPR86 결함 넉아웃 마우스는 실시예에서 증명된 바와 같이 광범위한 표현형을 나타낸다.
특히, 실시예 5 및 도 4는 꼬리 튀기기 시험으로 시험시 기능성 GPR86 결함 넉아웃 동물은 야생형 동물보다 외부 자극 및 통증에 덜 민감함을 증명한다. 유사하게는 실시예 7 및 도 6은 본 프라이 헤어(Von Frey Hair) 시험으로 시험시 기능성 GPR86 결함 넉아웃 마우스는 야생형 동물보다 외부 자극 및 통증에 덜 민감함을 나타낸다.
따라서 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라 GPR86 및 그의 조절제(작용제 및 바람직하게는 길항제와 같은)는 본 출원서에 기술된 방법에 의해 통증 및 암을 진단하거나 치료하는데 이용된다. 특히 통증은 신경성 통증, 대상포진후 신경통, 당뇨병성 신경통, 삼차신경통, 알코올(에탄올) 관련 신경병증, 나병의 신경통, 혈관염성 신경통, 요독성 신경통, 길랑-바레 증후군, 다발 경화증, 급성 면역 신경병증, 흉곽출구증후군, 수근관증후군, 족근관증후군, 마비성 대퇴 신경통, 복합국소동통증후군, 턱관절 증후군, 비정형적인 얼굴 통증, 요통, 허리뼈관협착증, 디스크질환, 경추염성 신경병증, 경추증, 경추 디스크 질환, 경추 척수안면 통증인 경추 통증, 골관절염, 류마티스관절염, 염증성 장질환인 염증성 통증을 포함한다. 암 통증은 특히 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암 및 골암을 포함한다. 두통, 편두통, 긴장성 두통, 군발성 두통, 만성 발작성 편두통이 포함되고, 내장 통증으로는 월경통, 비-소화성 소화불량, 비-심장성 흉통, 과민성대장증후군, 환상 직장 통증이 있다. 열성 통각과민 및 수술후 통증.
더욱이 본 발명자는 실시예에서 GPR86이 면역 반응성세포 유래의 세포 내에서 발현됨을 증명하였다(실시예 3 및 4). 실시예 6 및 도 5에 나타난 바와 같이 기능성 GPR86을 상실한 형질전환 동물은 염증에 대한 감소된 경향 나타낸다. 이는 GPR86이 통증의 염증성 및 신경병증성에 관련된 것을 포함한 염증성 반응에 관련됨을 증명한다.
또다른 관점에 따라 GPR86 및 그의 조절제(작용제 및 길항제와 같은)는 본 출원서에 기술된 방법에 의해 염증성 질환(즉, 류마티스관절염, 다발경화증, 길랑-바레 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 이식편대숙주병, 전신홍반루푸스 또는 인슐린-의존성 당뇨병), 자가면역질환(즉, 독소충격증후군, 골관절염, 당뇨병 또는 염증성 내장 질환), 급성 통증, 만성 통증, 신경성 통증, 접촉피부염, 죽상동맥경화증, 사구체신염, 재관류 손상, 골 흡수 질환, 천식, 뇌졸중, 심근경색증, 열손상, 성인성 호흡곤란증후군(ARDS), 외상후 2차 다발 기관 손상, 급성 염증성 성분 동반 피부병, 급성 화농성 수막염, 괴사성 장결장염, 혈액투석 관련 증후군, 패혈쇼크, 류코페리시스(leukopherisis), 과립세포 수혈, 연기 흡입에 의해 유발된 폐의 급성 또는 만성 염증, 자궁내막증, 베체트병, 포도막염, 강직성 척추염, 췌장염, 암, 라임 질환, 경피경혈관확장술후 재협착, 알츠하이머병, 외상성 관절염, 패혈증, 만성폐쇄성폐질환, 울혈성심장기능상실, 골다공증, 악액질, 파킨슨병, 치주질환, 통풍, 알레르기 질환, 연령관련황반변성, 감염 및 낭성섬유증을 진단하거나 치료하는데 이용된다.
편의상 GPR86의 이용에 의해 치료 가능하거나 진단 가능한 질환은 "GPR86 관련 질환"으로 표기된다. 특히 바람직한 실시태양에서 GPR86 관련 질환은 통증 증상(상기 항 참조)을 포함한 것으로 포함한다.
상기 주지된 바와 같이 GPR86 및 그의 조절제(작용제 및 길항제와 같은)는 여기서 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 이들 특정 질환을 진단하거나 치료하는데 이용된다.
특히 본 발명자는 상기 기입된 특정 질환의 치료 또는 진단을 위해 GPR86 핵산, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 폴리펩타이드, 약학적 조성물, 숙주 세포 및 GPR86 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함한 형질전환 동물의 이용을 상세히 조사하였다. 더욱이 본 발명자는 상기 기술된 특정 질환 및 장애 또는 이상의 진단 또는 치료시 GPR86과 상호작용하거나 결합하는 것이 가능하고, 내인성 cAMP의 수치를 저하시키는 것이 가능한 화합물의 이용뿐만 아니라 이들의 제조 또는 확인 방법을 조사하였다. 특히 본 발명자는 특정 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 제조시 이들 화합물, 조성물, 분자 등의 이용을 포함시켰다. 또한 본 발명자는 개체 내 특정 질환의 검출용 진단 키트를 개시한다.
GPR86의 이용에 의해 치료 가능하거나 진단 가능한 이러한 또는 다른 특정 질환을 확인하는 계통 지도화 방법은 당분야에 알려져 있고 또한 본 출원서에 기술되어 있다.
통증
급성 통증
급성 통증은 단-기간 통증 또는 용이하게 확인 가능한 원인을 지닌 통증으로 정의된다. 급성 통증은 조직 또는 질환에 대한 현존하는 손상의 신체 경고이다. 이는 신속하고 날카로우며 쑤시는 통증이 동반된다. 급성 통증은 확장되기 전에 한 구역에 집중된다.
만성 통증
만성 통증은 6개월 이상 지속된 통증으로 의학적으로 정의된다. 이러한 일정하거나 간헐적인 통증은 신체가 손상을 방지하도록 돕지 않기 때문에 그의 목적을 오래 견디게 한다. 만성이 된 통증의 치료를 위해서는 일반적으로 전문적인 치료가 필요하다. 오피오이드가 장기간 약물 내성에 대해 사용되는 경우 화학적 의존 및 정신적 중독이 발생한다. 약물 내성 및 화학적 의존이 오피오이드 사용자들간에 일반적이나 정신적 중독은 드물다.
정신적 통증의 경험은 근원 및 관련 통각수용체(통증 감지 신경)에 따른 4가지 카테고리로 분류될 수 있다.
피부 통증
피부 통증은 피부 또는 표면 조직의 손상에 의해 유발된다. 피부 통각수용체는 피부 바로 아래에서 종결되고, 신경 말단의 높은 집중도에 기인하여 짧은 지속기간의 잘-정의되고 국부화된 통증을 생성한다. 피부 통증을 생성하는 손상의 예는 종이에 벰, 미약한(첫 번째 등급) 화상 및 열상을 포함한다.
체성 통증
체성 통증은 인대, 건, 뼈, 혈관 및 신경 자체로부터 유발되고 체성 통각수용체로 감지된다. 이들 구역 내 통증 수용체의 결핍은 피부 통증보다 더 긴 지속기간의 무디고 불충분하게-국부화된 통증을 생성하고; 예는 발목 염좌 및 탈골을 포함한다.
내장 통증
내장 통증은 신체 기관 내장 통각수용체로부터 유발되고 신체 기관 및 내부 공간 내에 위치한다. 이러한 구역 내 통각수용체의 훨씬 더 큰 결핍은 체성 통증보다 일반적으로 더 아프고 더 긴 지속기간의 통증을 생성시킨다. 내장 통증은 집중시키기 매우 어렵고 내장 조직의 일부 손상은 감각이 손상 위치와 완전하게 관련되지 않은 구역에 국부화되는 "연관통"을 나타낸다. 심근허혈(심근 조직 일부로의 혈류의 손실)은 연관통의 가장 잘 알려진 예이고; 감각은 한정된 지각으로서 또는 좌측 어깨, 팔 또는 손의 통증과 같은 흉부 위에서 발생할 수 있다.
다른 형태의 통증
환지통은 더 이상 물리적인 신호를 받지 않는 사지로부터의 통증 감각이다 - 절단 수술 및 사지마비에 의해 거의 일반적으로 보고되는 경험. 신경병증성 통증("신경통")은 신경 조직 자체의 손상 또는 질환의 결과로서 발생할 수 있다. 이는 시상으로 정확한 정보를 전달하는 감각 신경의 능력을 분열시킬 수 있고, 따라서 통증에 대한 명확하거나 문서로 증명된 물리적 원인이 없더라도 뇌는 통증 자극을 판단한다.
삼차신경통("동통 티크")은 삼차신경의 손상 또는 상해에 의해 유발된 통증을 나타낸다. 삼차신경은 3가지 분류를 지닌다: V1은 이마 및 눈 지역에 감각을 제공하고 V2는 코 및 얼굴에 감각을 제공하고 V3은 아래턱 및 턱 지역에 감각을 제공한다. 얼굴의 각 면은 감각을 제공하는 삼차신경을 지닌다. 삼차신경통의 편측성 통증은 볼, 입, 코 및/또는 턱 근육을 통해 확장된다. 젊은 사람 또는 다발경화증 환자도 삼차신경통을 경험하나 일반적으로 삼차신경통은 노인에 영향을 미친다.
삼차신경통의 초기 증후는 이마, 볼, 턱 또는 아래턱 윤곽의 통증이다. 중증인 경우 3구역 모두 또는 좌측 및 우측 모두를 포함한다. 통증 에피소드는 중증이고 경련성이며 간결하고 전기 쇼크시 느끼는 것과 유사한 것으로 기술된다. 통증은 이를 닦고, 말하고, 씹고, 마시고, 면도하고 심지어 키스하는 등의 일반적인 일상 생활에 의해 유발될 수 있다. 통증 에피소드의 빈도는 시간에 따라 증가하고 더욱 파괴적이고 무능력하게 한다.
설인신경통은 아홉 번째 두개골 신경의 감각 분포 내 통증의 폭발이 특징적인 임상적 실체이다. 통증의 위치 및 통증에 대한 자극을 제외하고 공격은 삼차신경통과 동일하다. 일반적인 통증은 한 면에서 편도선 또는 혀 뒤 구역 내에서의 극심한 찌르는 듯하고 반복적인 전기-유사 동통(stab)이다. 더욱이 통증은 귀에서 방출되거나 유발된다.
통증을 유도하는 감각 자극은 삼키기이고 강한 공격 동안 환자는 움직이지 않고 앉아 있고 머리를 앞으로 구부리고 침이 입에서 자유롭게 흐르게 한다. 심장정지, 기절(졸도) 및 발작은 설인신경통의 공격과 관련되었다. 대부분의 경우 설인신경통의 원인은 알려져 있지 않다. 그러나 특정한 경우의 수는 종양, 척추 동맥에 의한 아홉 번째 신경의 압축 및 혈관성 기형에 의한 것이다.
대상포진후 신경통은 대상포진 바이러스 감염 후 지속되는 만성 통증을 나타낸다. 대상포진은 수두대상포진(수두) 바이러스 감염의 재발 감염이다. 바이러스는 환자의 면역력이 감퇴될 때까지 신경 내에 잠복상태로 존재한다. 대상포진의 급성 손상은 일반적으로 사라지는 통증을 유발할 수 있다. 그러나 많은 환자에서 통증은 만성적으로 지속된다 - 대상포진후 신경통.
대상포진의 증후는 찌르는 듯하고 깊고 지속적인 통증을 포함한다: 통증은 흉부 지역 65% 및 얼굴 20%에서 나타난다. 얼굴이 포함되는 경우 바이러스는 삼차신경의 안구 부분(눈썹 위 얼굴 상단)에 대한 편애를 나타낸다. 일반적으로 통증은 2∼4주간 자발적으로 사라진다. 그러나 일부 환자는 지속적인 통증을 지닐 것이다. 통증은 앞선 발진 구역 내에 나타나고 영향 받은 피부를 약하게 쓰다듬으면 악화되고 그 구역에 압력을 가함으로서 경감된다. 의류 마찰은 매우 고통스럽다. 이러한 지속적인 통증은 대상포진후 신경통이라고 명명된다. 얼굴을 포함한 대상포진의 경우 더 높은 발병률의 대상포진후 신경통이 존재한다.
작열통은 부분적 말초 신경 손상을 동반하는 드문 증후이다. 화상 통증, 자율신경계 기능장애 및 영양 변화의 삼징후가 특징적이다. 심한 경우는 대작열통이라고 명명한다. 소작열통은 반사교감신경(RSD)과 유사한 덜 심한 형태를 나타낸다. RSD는 x-선 상에 일반적인 골다공증을 지닌 우세한 근육 및 관절 증후이다.
작열통은 말초신경 손상, 일반적으로 상완신경총에 의해 유발된다. 신경제거는 증가된 통증을 유발하는 과민증을 유발하고 증가된 노르에피네프린 방출은 교감신경 발견을 유발한다. 증후는 통증: 일반적으로 화상을 포함하고 손과 발에 우세하다. 중추, 척골 및 좌골 신경이 가장 일반적으로 포함된다. 대부분의 감각 자극은 통증을 악화시킨다. 혈관 변화: 혈관확장에 의한 증가된 혈액(따뜻한 분홍색) 또는 혈관수축에 의한 감소된 혈액(차갑고 얼룩진 청색). 영양 변화: 건조/각질이 벗겨지는 피부, 경직된 관절, 가늘어지는 손가락, 융기된 자르지 않은 손톱, 길고/거친 머리카락 또는 탈모, 발한 변화.
GPR86의 동일성 및 유사성
인간 GPR86을 인코드하는 증폭된 cDNA 생성물의 서열분석의 결과에 나타난 바와 같이 GPR86은 G-단백질 결합 수용체 패밀리의 다른 단백질에 구조적으로 관련된다. 서열번호: 1에 나타난 cDNA 서열은 서열번호: 3에 나타난 354개 아미노산의 폴리펩타이드를 인코드하는 오픈 리딩 프레임(서열번호: 2, 뉴클레오타이드수 19∼1084)을 포함한다. 인간 GPR86은 호모 사피엔스 염색체 3q24에 지도화된 것으로 나타난다. 서열번호: 6의 대안적 cDNA 서열은 서열번호: 7에 나타난 폴리펩타이드를 인코드한다.
P2Y12 혈소판 ADP 수용체[호모 사피엔스] 동일성 = 154/316(48%), 양성 = 211/316(66%)
KIAAOOOl 추정 G-단백질 결합 수용체; UDP-포도당용 G 단백질 결합 수용체; 동이리성 = 140/295(47%), 양성 = 193/295(64%)
혈소판 활성화 수용체 상동체 [호모 사피엔스]; 동일성 = 42/144(29%), 양성 = 78/144 (54%)
pfam HMM 구조 예측 소프트웨어(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ search.shtml)를 이용한 GPR86 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석은 GPR86 펩타이드가 7TM-1 구조적 분류의 GPCR임을 확인시킨다(도 1 참조).
인간 GPR86의 마우스 상동체가 클론되었고 그의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 5에 나타나 있다. 서열번호: 4의 마우스 GPR86 cDNA는 인간 GPR86(서열번호: 2)과 높은 정도의 동일성을 나타내고, 마우스 GPR86의 아미노산 서열(서열번호: 5)은 인간 GPR86(서열번호: 3 및 서열번호: 7)과 높은 정도의 동일성 및 유사성을 나타낸다.
따라서 인간 및 마우스 GPR86은 많은 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 패밀리의 멤버이다.
GPR86 폴리펩타이드
여기서 사용된 "GPR86 폴리펩타이드"라는 용어는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 나타낸다. 바람직하게는 폴리펩타이드는 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 나타난 서열의 상동체, 변이체 또는 유도체이거나 이를 포함한다. 더욱 바람직하게는 폴리펩타이드는 서열번호: 7에 나타난 서열의 상동체, 변이체 또는 유도체이거나 이를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 서로 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합 즉, 등가근(isostere)에 의해 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로 표현되는 짧은 체인과 일반적으로 단백질로 표현되는 더 긴 체인 모두를 나타낸다. 폴리펩타이드는 20 유전자-인코드된 아미노산 이상의 아미노산을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 후-번역 과정과 같은 자연적 과정에 의해 또는 당분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산을 포함한다. 이러한 변형은 일반 교본 및 더욱 상세한 모노그래프뿐만 아니라 여러 권의 연구 논문 내에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 백본(backbone), 아미노산 사이드-체인 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩타이드의 어떤 곳에서도 발생할 수 있다. 동일한 형태의 변형은 제공된 폴리펩타이드 내의 동일하거나 여러 사이트의 다양한 정도 내에 존재함이 인식될 것이다. 또한 제공된 폴리펩타이드는 다양한 형태의 변형을 포함한다.
폴리펩타이드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지되고, 이들은 분지가 있거나 또는 없이 환형일 수 있다. 환형, 분지된, 분지된 환형 폴리펩타이드는 후-번역 자연 과정으로부터 유발되거나 합성적 방법에 의해 제조된다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실레이션(ribosylation), 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 반족의 공유결합 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합 부착, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 교차-결합, 순환, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유결합 교차-결합 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀레이션(formylation), 감마-카르복실화, 글리코실레이션, GPI 앵커(anchor) 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일레이션(myristoylation), 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일레이션(selenoylation), 황산화, 아르기닌화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질로 아미노산의 전이-RNA 매개 첨가. 예를 들어, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter, et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan, et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 참조.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", "유도체" 또는 "단편"이라는 용어는 서열로부터 또는 그에 대한 하나(또는 그 이상의) 아미노산의 치환, 변이, 변형, 교체, 삭제 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "GPR86" 및 "GPR86 GPCR"에 대한 표기는 GPR86의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 GPR86에 적용시 수득된 아미노산 서열은 GPCR 활성을 지니고, 더욱 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 GPR86 서열과 동일한 활성을 지닌다. 특히 "상동체"라는 용어는 수득된 아미노산 서열이 GPCR 활성을 지니는 조건으로 구조 및/또는 기능의 동일성을 포함한다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90% 이상의 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 GPR86 핵산 서열의 대립유전자 변이인 아미노산 유래의 폴리펩타이드도 포함한다.
표기가 GPR86과 같은 수용체의 "수용체 활성" 또는 "생물학적 활성"에 대해 이루어진 경우 이들 용어는 유사한 활성 또는 증가된 활성 또는 감소된 바람직하지 않은 부작용을 지닌 활성을 포함한 GPR86 수용체의 대사적 또는 생리적 기능을 나타낸다. 또한 GPR86 수용체의 항원성 및 면역원성 활성도 포함된다. GPCR 활성의 예 및 이들 활성을 분석하고 질량화하는 방법은 당분야에 알려져 있고, 본 문서에 상세히 기술되어 있다.
여기에 사용된 "결실"은 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화로서 정의된다. 여기에 사용된 "삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적인 물질과 비교시 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 유발한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내의 변화이다. 여기에 사용된 "치환"은 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의한 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체를 유발한다.
또한 본 발명에 따른 GPR86 폴리펩타이드는 무증후 변화를 생성하고 기능적으로 동일한 아미노산 서열을 유발하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지닌다. 인공 아미노사 치환은 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 상의 유사성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성을 지닌 하전되지 않은 극성 두부(polar head group)를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
예를 들어 보존적 치환은 하기에 따라 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내 동일한 줄 내의 아미노산은 서로 치환된다:
Figure 112006090691612-PCT00001
GPR86 폴리펩타이드는 일반적으로 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 이형성 아미노산 서열을 더욱 포함한다. 이형성 서열은 세포내 또는 세포외 단백질 타겟팅에 영향을 미치는 서열(리더 서열과 같은)을 포함한다. 또한 이형성 서열은 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키고/또는 폴리펩타이드의 식별, 추출 및/또는 정제를 촉진시키는 서열을 포함한다. 특히 바람직한 또다른 이형성 서열은 바람직하게는 N-말단인 폴리히스티딘과 같은 폴리아미노산 서열이다. 적어도 10개 이상, 바람직하게는 적어도 17개 이상의 아미노산이나 50개 이하의 아미노산의 폴리히스티딘 서열이 특히 바람직하다.
GPR86 폴리펩타이드는 "성숙" 단백질의 형태이거나 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부이다. 분비 또는 리더 사열, 전(pro)-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제 촉진 서열 또는 재조합 생성동안 안정성에 대한 추가 서열을 포함한 추가 아미노산 서열을 포함한다.
GPR86 폴리펩타이드는 알려진 기술을 이용한 재조합 방법에 의해 유리하게 이루어진다. 그러나 또한 이는 고형상 합성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 합성 방법에 의해 이루어진다. 여기서 기술된 폴리펩타이드는 예를 들어 추출 및 정제를 촉진시키는 융합 단백질로서 제조되기도 한다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 이는 트롬빈 분열 사이트와 같이 융합 단백질 파트너와 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하는 목적 단백질 서열 사이의 단백질 분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 목적 서열의 단백질 기능을 저해하지 않을 것이다.
GPR86 폴리펩타이드는 실질적으로 분리된 형태이다. 이러한 용어는 자연 상태로부터 인공적인 변화를 나타낸다. "분리된" 조성물 또는 물질이 자연적으로 발생하는 경우 그의 본래 환경으로부터 변화되거나 제거되었다. 예를 들어 생존 동물 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니나 그의 자연 상태의 동시 존재 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 여기서 사용된 용어와 같이 "분리된" 것이다.
그러나 GPR86 단백질이 단백질의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합되고 실질적으로 분리되는 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 여기서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된 형태이고, 이러한 경우 일반적으로 90% 이상, 예를 들어 제제 내 단백질의 95%, 98% 또는 99%가 GPR86 폴리펩타이드인 제제 내 단백질을 포함한다.
또한 본 발명은 GPR86 폴리펩타이드의 일부를 포함한 펩타이드에 관한 것이다. 따라서 GPR86의 단편 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 포함된다. 펩타이드는 2∼200개 길이의 아미노산, 바람직하게는 4∼40개 길이의 아미노산이다. 펩타이드는 예를 들어 트립신과 같은 적당한 효소로의 분해에 의해 여기서 사용된 GPR86 폴리펩타이드로부터 유래된다. 대안으로 펩타이드, 단편 등은 재조합 방법으로 제조되거나 합성적으로 합성된다.
"펩타이드"라는 용어는 레트로인벌소(retroinverso) D 펩타이드와 같은 당분야에 알려진 다양한 합성 펩타이드 변이를 포함한다. 펩타이드는 항원 결정소 및/또는 T-세포 에피토프이다. 펩타이드는 생체 내에서 면역원이다. 바람직하게는 펩타이드는 생체 내 중화 항체를 유도하는 것이 가능하다.
다른 종으로부터의 GPR86 서열을 정렬시킴으로서 어떤 아미노산 서열 구역이 다른 종간에 보존되는지("상동성 구역") 및 어떤 구역이 다른 종간에 변화하는지("이형성 구역")를 측정하는 것이 가능하다.
따라서 GPR86 폴리펩타이드는 상동성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 상동성 구역은 적어도 2종간의 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 예를 들어 상동성 구역은 여기서 기술된 시험을 이용하여 아미노산 수치의 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 상동성 구역에 상응하는 서열을 포함한 펩타이드는 하기 더욱 상세히 설명된 치료 전략 내에서 사용된다. 대안으로 GPR86 펩타이드는 이형성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 이형성 구역은 적어도 2종간의 낮은 정도의 상동성을 나타낸다.
GPR86 폴리뉴클레오타이드 및 핵산
또한 본 발명자는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 GPR86 폴리뉴클레오타이드, GPR86 뉴클레오타이드 및 GPR86 핵산, 그의 제조방법 및 이용을 개시한다.
"GPR86 폴리뉴클레오타이드", "GPR86 뉴클레오타이드" 및 "GPR86 핵산"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 서열번호: 6에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리뉴클레오타이드/핵산을 나타낸다. 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드/핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 6, 가장 바람직하게는 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열을 포함하거나 이의 상동체, 변이체 또는 유도체이다.
또한 이들 용어는 여기서 기술된 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 즉, GPR86 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 핵산 서열을 포함한다. 따라서 GPR86 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 GPR86 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한 없이 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 포함하나 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 특정 염기를 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 이루어지고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 자연 내에서 일반적으로 발견되는 폴리펩타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드로 표기되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 퇴화 결과로 동일한 폴리펩타이드를 인코드할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 나타난 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 올리고뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합에 관계없이 이중-나선 또는 단일-나선인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA이다. 뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 재조합 DNA 기술(예를 들어 재조합 DNA)의 이용에 의해 제조된다.
바람직하게는, "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", 유도체" 또는 단편"이라는 용어는 GPR86 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 그에 대한 하나의(또는 그 이상의) 핵산의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "GPR86" 및 "GPR86 GPCR"에 대한 표기는 GPR86의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 수득된 뉴클레오타이드 서열은 GPCR 활성, 바람직하게는 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 GPCR과 적어도 동일한 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드한다. 바람직하게는 "상동체"라는 용어는 구조 및/또는 기능에 대해 동일성을 포함하여 수득된 뉴클레오타이드 서열이 GPCR 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하게 된다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 서열의 대립유전자 변이를 포함한다.
서열 상동성의 계산
따라서 여기서 제공된 서열에 대한 서열 동일성은 다른 서열이 예를 들어 서열에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지니는지 여부를 관찰하기 위한 하나 이상의 서열을 또다른 서열과의 단순한 "안구" 비교(즉, 엄격 비교)에 의해 측정될 수 있다.
또한 상대 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 동일성을 측정하기 위한 적당한 알고리즘을 이용한 2 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수 있는 통상적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 일반적인 예는 CLUSTAL이다. 2 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 다른 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12:387) 및 FASTA(Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410)을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
% 상동체는 인접 서열에 대해 계산된다 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내 각 아미노산은 다른 서열 내 상응하는 아미노산과 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일정한 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍이 아닌 경우 하나의 삽입 또는 결실이 하기 아미노산 잔기를 정렬에서 제거하게 하고 따라서 전제 정렬이 수행될 때 % 상동성 상의 큰 감소를 잠재적으로 유발한다는 점을 고려하지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점을 부당하게 패널티를 과하지 않기 위해 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 가능한 적은 갭을 지닌 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 서열 정렬은 - 2개의 비교 서열 사이의 더 큰 관련성을 반영 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 매우 높은 비용을 부과하고 갭 내의 부차적 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부가하는데 일반적으로 "아핀(affine) 갭 비용"이 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교시 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 수치를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지 사용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려할 때 최적 정렬의 생성을 먼저 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tool이나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al 1999, 7-58 내지 7-60 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전무(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 득점을 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다. 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
유리하게는 디폴트 수치에 맞춰진 파라미터를 지닌 BLAST 알고리즘이 사용된다. BLAST 알고리즘은 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 상세히 기술되어 있고 이는 참고문헌에 포함되어 있다. 검색 파라미터는 한정될 수 있고 한정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 맞춰질 수 있다.
유리하게는 BLAST에 의한 평가시 "실질적인 동일성"은 적어도 약 7 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 이상, 가장 바람직하게는 적어도 10 이상의 EXPECT 수치로 매치된 서열과 동등하다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견적 검색 알고리즘이고; 이들 프로그램은 적은 증강으로 Karlin and Altschul(Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html 참조)의 통계법을 이용하여 그들의 발견에 대한 유의성을 유추한다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동체를 확인하기 위해 서열 유사성 검색을 위해 주문 제작된다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색 내 기본적인 이슈의 논의를 위해 Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129 참조.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 구입가능한 5개 BLAST 프로그램은 하기 태스크를 수행한다: blastp - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 아미노선 사열 비교; blastn - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열을 비교; blastx - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열(양쪽 나선 모두)의 6-프레임 개념 번역 생성물을 비교; tblastn - 모든 6개 리딩 프레임(양쪽 나선 모두) 내에서 역동적으로 번역된 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 단백질 서열을 비교; tblastx - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열의 6-프레임 번역을 비교.
BLAST는 하기 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM(막대그래프) - 각각의 검색에 대한 득점의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참조).
DESCRIPTIONS(설명) - 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션이다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참조).
EXPECT(예상) - 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에 대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참조).
CUTOFF(컷오프) - 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 득점을 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 득점을 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참조). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
ALIGNMENTS(정렬) - 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참조).
MATRIX(매트릭스) - BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유용한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) - TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) - Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참조)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미 있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, "NNNNNNNNNNNNN"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, "XXXXXXXXX") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해 마스크된 어떤 것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발한다.
가장 바람직하게는 서열비교는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 수행된다. 일부 실시태양에서 서열 동일성 측정시 어떠한 갭 패널티도 사용되지 않는다.
하이브리디제이션
또한 본 출원서는 여기서 제공된 서열 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 상기 서열의 상보체에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하이브리디제이션은 "염기 짝짓기를 통해 핵산 나선이 상보적 나선과 결합하는 과정"(Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) 뿐만 아니라 Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)에 개시된 중합효소 연쇄 반응 기술로 수행된 증폭 과정을 의미한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 25개 또는 30개 이상, 예를 들어 적어도 40개, 60개, 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드 구역에 있어서 여기서 제공된 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동성일 것이다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2 또는 4에 대해 상동적인, 바람직하게는 상기 서열 중의 하나에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동적인 구역을 포함할 것이다.
"선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한"이라는 용어는 프로브로 사용된 뉴클레오타이드 서열이 타겟 뉴클레오타이드 서열이 배경 수준보다 유의적으로 상위의 수준에서 프로브에 하이브리다이즈하는 것으로 나타나는 조건 하에서 사용됨을 의미한다. 배경 하이브리디제이션은 예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 선별시 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열로 인해 발생한다. 이러한 경우 배경은 타겟 DNA에서 관찰되는 특이적 상호작용에 비해 10배 이하, 바람직하게는 100배 이하의 강도인 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버와 프로브 사이의 상호작용을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 프로브 즉, 32P를 방사선표지함으로서 측정된다.
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열이 본 출원서의 범위 내에 포함된다. 하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브 Tm의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 Tm의 5℃∼10℃ 이하에서; 중간 스트린전시는 Tm의 10℃∼20℃ 이하에서; 및 낮은 스트린전시는 Tm의 20℃∼25℃ 이하에서 발생한다. 당업자에 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있고 중간(또는 낮은) 스트린전시 하이브리디제이션은 유사하거나 관련된 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명자는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 하나 이상의 GPR86 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 뉴클레오타이드 서열이 이중-나선인 경우 이중 나선의 두 스트랜드 모두, 개별적으로 또는 결합된 형태 모두 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-나선인 경우 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열도 이용됨이 이해된다.
또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 유사하게 본 발명은 상기 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열의 형태는 변이체 뉴클레오타이드 서열의 예이다. 이러한 관점에서 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
GPR86 및 상동체의 클로닝
본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 상기 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 상기 서열은 다른 생물체 내의 유사한 GPPCR 서열을 확인하고 클론하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 인간 및 쥐, 돼지, 양 등의 다른 종으로부터의 GPR86, 그의 상동체 및 다른 구조적으로 또는 기능적으로 관련된 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 적당한 라이브러리로부터 GPR86을 인코드하는 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하기 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4에 포함된 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 충분히 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편이 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리디제이션 프로브로서 사용된다. 또한 이러한 프로브는 GPR86 유전자에 대해 서열 유사성, 바람직하게는 높은 서열 유사성을 지닌 다른 유전자(인간 이외의 종으로부터의 상동체 및 오르쏠로그(orthologue)를 포함)의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는데 사용된다. 하이브리디제이션 선별, 클로닝 및 서열분석 기술은 당업자에게 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(상동)에 기술되어 있다.
일반적으로 프로브로 사용하기 적당한 뉴클레오타이드 서열은 대상 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 일반적으로 프로브는 적어도 15개 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는 이러한 프로브는 적어도 30개 뉴클레오타이드를 지닐 것이고 적어도 50개 뉴클레오타이드를 지닌다. 특히 바람직한 프로브는 150∼500개, 더욱 특별하게는 약 300개 뉴클레오타이드 범위일 것이다.
하나의 실시태양에서 인간 이외의 종으로부터 상동체 및 오르쏠로그를 포함한 GPR86 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 트린전트 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 그의 단편을 지닌 표지된 프로브로 적당한 라이브러리를 선별하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 하이브리디제이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 스트린전트 조건은 상기 한정된 바와 같거나 대안으로 50% 포름아마이드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5XDenhardt 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 ㎍/ml 변성 절단 연어 정자 DNA를 포함한 용액 내에서 42℃에서의 밤새 인큐베이션한 후 약 65℃에서 0.1XSSC 내에서 필터를 세척하는 조건이다.
GPR86의 기능적 분석
클론된 추정 GPR86 폴리뉴클레오타이드는 서열 분석 또는 기능적 분석에 의해 증명된다. 예를 들어 추정 GPR86 또는 상동체는 하기와 같이 수용체 활성에 대해 분석된다. GPR86 수용체 cDNA를 인코드하는 선형화 플라스미드 주형으로부터의 캡결합된(capped) RNA 전사체가 표준 절차에 따라 RNA 중합효소로 시험관 내에서 합성된다. 시험관 내에서 전사체는 0.2 mg/ml의 최종 농도로 물에 현탁된다. 난소엽은 성체 암컷 두꺼비로부터 제거되고, 단계 Ⅴ 탈난포화 난모세포가 수득되고 RNA 전사체(10 ng/난모세포)가 현미주사 기구를 이용하여 50 nl 환약으로 주입된다. 2개의 전극 전압 클램프가 작용제 노출에 대한 제노푸스 난모세포 개체로부터 전류를 측정하는데 사용된다. 기록은 상온에서 (mM 농도로) NaCl 115, KCl 2.5, CaCl2 1.8, NaOH-HEPES 10, pH 7.2로 구성된 표준 배지 내에서 이루어진다. 또한 제노푸스 시스템은 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 알려진 리간드 및 리간드 활성화용 조직/세포 추출물을 선별하는데 사용된다.
GPR86에 대한 발현 분석
GPR86 관련 질환을 치료하기에 유용한 치료제를 고안하기 위해 GPR86(야생형 또는 특정 돌열변이)의 발현 프로파일을 측정하는 것이 유용하다. 따라서 당분야에 알려진 방법은 GPR86이 발현되는 기관, 조직 및 세포 형태를 측정하는데 이용된다. 예를 들어 통상의 또는 "전자적" 노던(Northern)이 수행된다. 또한 역-전사효소 PCR(RT-PCR)는 GPR86 유전자 또는 돌연변이체의 발현을 분석하는데 이용된다. GPR86의 발현 프로파일의 더욱 민감한 측정 방법은 당분야에 알려진 바와 같이 RNAse 보호 분석을 포함한다.
노던 분석은 유전자의 전사체의 존재를 검출하는데 이용되는 실험 기술이고 특정 세포 형태 또는 조직으로부터의 RNA가 결합된 멤브레인으로의 표지된 뉴클레오타이드 서열의 하이브리디제이션을 포함한다(Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, F. M. et al. supra, ch. 4 and 16). BLAST를 적용하는 유사한 컴퓨터 기술("전자적 노던")은 GenBank 또는 LIFESEQ 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals)와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이스와 동일하거나 관련된 분자를 검색하는데 이용된다. 이러한 형태의 분석은 다수의 멤브레인-기반 하이브리디제이션보다 더 빠르다는 점에서 유리하다. 더욱이 컴퓨터 검색의 민감도는 어떠한 특정 매치가 정확하거나 상동성인 것으로 분류되는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 프로브를 포함하여 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 동물 및 인간 질환의 치료 및 진단의 발견을 위한 연구 시약 및 재료로서 이용된다.
GPR86 폴리펩타이드의 발현
또한 본 발명자는 GPR86 폴리펩타이드의 제조 방법을 포함시킨다. 본 방법은 일반적으로 적당한 조건(즉, GPR86 폴리펩타이드가 발현되는 조건) 하에서 GPR86 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
생물학적으로 활성인 GPR86을 발현하기 위해 GPR86을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 적당한 발현 벡터 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 또는 번역을 위해 필요한 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 GPR86을 인코드하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구축하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내에서의 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내에서의 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J. et al.(1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) 및 Ausubel, F. M. et al.(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템은 GPR86을 인코드하는 서열을 포함하고 발현시키는데 사용된다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(즉, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터(즉, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이는 사용되는 숙주 세포에 의해 제한되지 않는다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역되는 구역이다(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 구역). 이러한 요소는 그의 강도 및 특이성이 다양하다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 달리 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 적당한 전사 및 번역 요소가 사용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내에서 클로닝시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(GIBCO/BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 사용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포에 사용된다. 식물 세포의 게놈 유래(즉, 열충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스 유래(즉, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열) 프로모터 또는 인핸서가 벡터 내로 클론된다. 포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자 유래 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터가 바람직하다. GPR86100 GPCR을 인코드하는 서열의 다수 카피를 포함한 세포주를 생성할 필요가 있는 경우 SV40 또는 EBV 기반 벡터가 적당한 선택성 마커와 함께 사용된다.
박테리아 시스템에서 많은 발현 벡터는 GPR86에 대한 용도에 따라 다르게 선택된다. 예를 들어 많은 양의 GPR86이 항체 유도를 위해 필요한 경우 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 지시하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 다기능성 E. coli 클로닝 및 GPR86을 인코드하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열에 인프레임으로 벡터 내로 라이게이트되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등과 같은 발현 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 글루타티온 부재시 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 프로테아제 분열 사이트를 포함하도록 고안되어 클론된 목적 폴리펩타이드는 GST 모이어티로부터 유리될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레시비에(Saccharomyces cerevisiae)에서 알파 인자, 알코올 산화제 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 많은 벡터가 사용된다. Ausubel (상동) 및 Grant et al.(1987; Methods Enzymol. 153:516-544) 참조.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우 GPR86을 인코드하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해서도 작동된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 결합하여 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로 RUBISCO의 작은 서브유니트와 같은 식물 프로모터 또는 열충격 프로모터가 사용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원균-매개 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 많은 이용 가능한 문헌에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한 곤충 시스템이 GPR86을 발현시키는데 사용된다. 예를 들어 이러한 시스템 내에서 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충 내 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. GPR86을 인코드하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 구역 내로 클론되고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. GPR86의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성이 되게 하고 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 재조합 바이러스는 예를 들어 GPR86이 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포에서 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 사용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우 GPR86을 인코드하는 서열은 후반 프로모터 3부 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 감염된 숙주 세포 내에서 GPR860 GPCR을 발현할 수 있는 생존 가능한 바이러스를 수득하기 위해 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 구역 내로의 삽입이 이용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서는 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 사용된다.
따라서 예를 들어 GPR86 수용체는 인간 진핵성 신장 293(HEK293) 세포 또는 점착성 dhfr CHO 세포에서 발현된다. 발현을 최대화하기 위해 일반적으로 모든 5' 및 3' 비번역 구역(UTR)이 pCDN 또는 pCDNA3 벡터 내로의 삽입 전에 수용체 cDNA로부터 제거된다. 세포는 리포펙션(lipofection)에 의해 개체 cDNA으로 트랜스펙트되고 400 mg/ml G418의 존재하에서 선택된다. 선택 3주 후 개체 클론이 채취되고 또다른 분석을 위해 확장된다. 벡터 단독으로 트랜스펙트된 HEK293 또는 CHO 세포는 음성 대조군으로 작용한다. 개체 수용체를 안정하게 발현하는 세포주를 분리하기 위해 일반적으로 약 24개 클론이 선택되고 노던 블럿 분석에 의해 분석된다. 수용체 mRNA는 일반적으로 분석된 G4-18-저항성 클론의 약 50%로 검출 가능하다.
또한 인간 인공 염색체(HAC)는 플라스미드 내에서 포함되고 발현될 수 있는 것보다 더 큰 DNA 단편을 전달하는데 이용된다. 약 6 kb 내지 10 Mb의 HAC가 구축되고 치료를 목적으로 통상의 전달 방법(리포솜, 다양이온 아미노 폴리머 또는 소포)을 통해 전달된다.
또한 특이적 개시 신호는 GPR86을 인코드하는 서열의 더욱 효율적인 번역을 달성하는데 사용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. GPR86을 인코드하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우 추가적인 전사 또는 번역 조절 신호는 필요하지 않다. 그러나 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 안전하게 하기 위해 정확한 리딩 프레임 내에 존재해야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원이고 자연적 및 합성적인 것 모두가 된다. 발현의 효율은 문헌에서 기술된 바와 같이 사용된 특정 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 형태로 발현된 단백질을 처리하는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 분열시키는 후-번역 처리도 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 촉진시키는데 사용된다. 후-번역 활성에 대한 특이적 세포 가동기구 및 특성적 메커니즘을 지닌 다른 숙주 세포(즉, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)는 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)로부터 입수 가능하고 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 안전하게 하도록 선택된다.
재조합 단백질의 장기간의 높은 수율 제조를 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 GPR86을 안정하게 발현하는 것이 가능한 세포주는 동일하거나 별개의 벡터 상에 복제의 바이러스 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택성 배지로 교체되기 전 영양강화 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택 가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환 세포주를 회수하는데 사용된다. 이들은 각각 tk- 또는 arp- 세포에서 사용될 수 있는 단순포진바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택에 대한 근거로서 사용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉세이트(methotrexate)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)에 저항성을 부여하고; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노트리신(phosphinotricin) 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 예를 들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD와 같은 추가적인 선택 가능한 유전자가 기술되었다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 시각적으로 표시되는 마커의 이용이 대중적이 되고 있다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 의한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 목적 유전자도 존재함을 나타내더라도 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 GPR86을 인코드하는 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입된 경우 GPR86을 인코드하는 서열을 포함한 형질전환 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 GPR86을 인코드하는 서열과 일렬로 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 일반적으로 일렬 유전자의 발현을 나타낸다.
대안으로 GPR86을 인코드하는 핵산 서열을 포함하고 GPR86을 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 처리에 의해 확인된다. 이들 처리는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화에 대한 멤브레인, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 단백질 생물학적 검정 또는 면역측정 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
GPR86을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 프로브 또는 GPR86을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 단편들을 이용한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 또는 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석은 GPR86을 인코드하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위한 GPR86을 인코드하는 서열을 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
단백질에 대해 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 사용한 GPR86의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소면역측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광표지세포세포분리(FACS)를 포함한다. GPR86 상에 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론-기반 면역측정법이 바람직하나 경합성결합분석법도 이용된다. 이들 및 다른 분석은 예를 들어 Hampton, R. et al.(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 Maddox, D. E. et al.(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)과 같이 당분야에 잘 알려져 있다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용된다. GPR86을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리디제이션 또는 PCR 프로브의 제조 방법은 올리고표지, 틈(nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로 GPR86을 인코드하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 제조용 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고 통상적으로 구입 가능하고 T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용된다. 이들 처리는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), GE Healthcare(UK) 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 구입된 것과 같은 다양한 통상적으로 구입 가능한 키트를 사용하여 수행된다. 검출에 용이하게 이용되는 적당한 수용체 분자 또는 표지는 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 핵원체뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
GPR86을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터의 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환 세포에 의해 생성된 단백질은 세포막에 위치하고 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내적으로 분비되거나 포함된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 GPR86을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 GPR86의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구성은 GPR86을 인코드하는 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩타이드 도메인을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시키는데 이용된다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash)에 사용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제 도메인과 GPR86 인코딩 서열 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 분열가능 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 촉진시키는데 이용된다. 이러한 발현 벡터는 타이오레독신 또는 엔테로키나제 분열 사이트 바로 앞에 GPR86 및 6개 히스티딘 잔기를 인코드하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상에서의 정제를 촉진시키고, 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 GPR86의 정제 방법을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에 제공되어 있다.
GPR86의 단편은 재조합 제조뿐만 아니라 고형상 기술을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 제조된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화된 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. GPR86의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
생체센서
GPR86 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 생체센서로서(또는 그의 제조에) 유용하다.
Aizawa (1988), Anal. Chem. Symp. 17: 683에 따라 생체센서는 예를 들어 고정된 항체 또는 GPR86 G-단백질 결합 수용체와 같은 수용체를 지닌 선택층과 같은 분자 인식용 수용체 및 측정된 수치를 전송하기 위한 변환기의 특정한 결합으로 한정된다. 일군의 이러한 생체센서는 수용체의 주변 매체와의 상호작용에 의한 표면층의 광학적 성질에 기인한 변화를 감지할 것이다. 이러한 기술 중에서 특히 엘립소-메트리(ellipso-metry) 및 표면 플라스몬 공명이 논의된다. GPR86을 도입시킨 생체센서는 GPR86 리간드의 존재 또는 수치를 검출하는데 사용된다. 이러한 생체센서의 구축은 당분야에 잘 알려져 있다.
따라서 GPR86 수용체를 발현하는 세포주는 [3H]이노시톨 포스페이트 또는 다른 2차 메신저의 수용체-촉진 형성을 통한 ATP와 같은 리간드의 검출을 위한 수용체 시스템으로서 사용된다(Watt et al., 1998, J Biol Chem May 29;273(22):14053-8). 또한 수용체-리간드 생체센서는 Hoffman et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A Oct 10;97(21):11215-20에 기술되어 있다. 또한 GPR86을 포함한 광학적 및 다른 생체센서는 예를 들어 Figler et al, 1997, Biochemistry Dec 23;36(51):16288-99 및 Sarrio et al., 2000, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(14):5164-74)에 기술된 바와 같이 G-단백질 및 다른 단백질과의 상호작용의 수준 또는 존재를 검출하는데 사용된다. 생체센서용 센서 유니트는 예를 들어 미국특허 제5,492,840호에 기술되어 있다.
선별 분석
천연 또는 재조합에 관계없이 상동체, 변이체 및 유도체를 포함한 GPR86 폴리펩타이드는 수용체에 결합하고 GPR86의 활성화를 활성화시키거나(작용제) 억제하는(길항제) 화합물의 선별 방법에 사용된다.
따라서 이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 세포, 무-세포 제제, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물 내의 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용된다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 또는 리간드이거나 구조적 또는 기능적 모방물질이다. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991) 참조.
GPR86 폴리펩타이드는 "GPR86 관련 질환"으로 상기 기술된 바와 같은 많은 병리학을 포함한 많은 생물학적 기능에 중요하다. 따라서 한편으로는 GPR86을 자극하고 다른 한편으로는 GPR86의 기능을 억제할 수 있는 화합물 및 약물을 발견하는 것이 바람직하다. 일반적으로 작용제 및 길항제는 파킨슨병과 같은 도파민 관련 질환, 상실성 또는 심실성 부정맥과 같은 심장 질환, 저혈압, 구토, 뚜렛 증후군, 스트레스 및 통증과 같은 이상에 대한 치료 또는 예방 목적으로 사용된다.
작용제는 GPR86 수용체를 어느 정도 활성화시킨다. 유사하게는 길항제는 GPR86의 활성화를 어느 정도 비활성화시키거나 억제한다. 따라서 GPR86 수용체는 길항제에 의해 활성의 고유의 기초 또는 백그라운드 수준에 어느 정도 부분적으로(부분적 길항제) 또는 이러한 수준에 전체적으로(길항제 또는 완전한 길항제) 비활성화된다. 길항제는 예를 들어 0의 활성까지(역길항제) 수용체를 비활성화시킨다. 따라서 "길항제"라는 용어는 상세하게는 전체 길항제, 부분적 길항제 및 역길항제를 포함한다.
또한 전사 수준 및 번역 수준에서 GPR86의 발현을 조절할 뿐만 아니라 그의 활성을 조절하는 분자도 "작용제" 및 "길항제"라는 용어에 포함된다.
GPR86 단백질과 상호작용하는 것이 가능한 후보 화합물의 추론적 고안은 폴리펩타이드의 분자 형태의 구조적 연구에 기반한다. 어떤 사이트가 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 여부를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 구조 측정 즉, X-선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 어떤 아미노산 잔기가 분자적 접촉 구역을 형성하는지에 대한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조적 측정의 상세한 설명을 위해 Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York 참조.
추론적 고안의 대안으로 일반적으로 GPR86을 후보 조절제에 접촉시키는 단계 및 그의 효과를 검출하는 단계를 포함한 선별 절차를 이용하는 것이다. 일반적으로 이러한 방법은 그의 표면 상에서 선택적으로는 파트너 단백질과 함께 GPR86 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 적당한 세포를 생성하는 단계 및 상대 분자의 세포내 수치의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
그의 농도가 GPCR 특히 GPR86의 활성에 영향을 미치고 GPR86 활성의 마커로 이용되는 분자는 당분야에 알려져 있다. 이들은 편의상 "GPCR 민감성 마커"로 표기된다. 이러한 GPCR 민감성 마커의 예는 칼슘 수치, 칼슘 유량, 아데닐레이트 사이클라제 수치 및 환상 AMP(cAMP) 수치를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 GPCR 민감성 마커는 세포내 환상 AMP(cAMP)를 포함하고, 선별은 환상 AMP의 세포내 수치 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
특히 바람직한 실시태양에서 GPR86은 파트너 단백질의 존재시 선별되고; 파트너 단백질은 GPR86 수용체 폴리펩타이드와 함께 바람직하게는 세포내적으로 동시-발현된다. 파트너 단백질은 바람직하게는 GPR86 부여된 G-단백질, Gi 또는 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질을 포함한다.
선별시 GPR86를 포함한 세포 및 GPR86 부여된 G-단백질, Gi 작용제는 세포내 cAMP 농도의 수준을 저하시키고 길항제는 세포내 cAMP 농도를 증가시킨다.
선별이 GPR86 및 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질을 이용하는 경우 작용제는 세포내 cAMP 농도를 증가시키는 반면 길항제는 cAMP 농도를 저하시킨다.
따라서 본 발명자는 GPR86 수용체를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과로 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 부여된 G-단백질, Gi에 결합시 GPR86의 작용제의 확인 방법을 개시한다. 대안으로 GPR86은 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 함께 동시-발현되고 본 방법은 GPR86 및 Gα16을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 세포 내 환상 AMP의 수치가 상기 접촉 결과로 증가되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명자는 GPR86 수용체를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 세포 내 환상 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과로 증가되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 부여된 G-단백질, Gi에 결합시 GPR86의 길항제의 확인 방법을 개시한다. 대안으로 GPR86이 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 함께 동시-발현되는 경우 GPR86 및 Gα16을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 세포 내 환상 AMP의 수치가 상기 접촉 결과로 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
선별에 이용되는 세포는 다양한 형태이다. 이러한 세포는 동물, 효모, 초파리(Drosophila) 또는 E. coli 유래의 세포를 포함한다. 이후 수용체를 발현하는 세포(또는 발현된 단백질을 함유하는 세포막)는 결합 또는 기능적 반응의 자극 또는 억제를 관찰하기 위해 시험 화합물에 접촉된다. 예를 들어 하기 상세히 설명된 바와 같이 제노푸스 난모세포는 GPR86 mRNA 또는 폴리펩타이드가 주입되고 시험 화합물로의 노출에 의해 유도된 전류는 전압 클램프를 사용하여 측정된다.
더욱이 마이크로피지오메트릭 에세이(microphysiometric assay)가 GPR86 수용체 활성을 분석하는데 이용된다. 다양한 2차 메신저 시스템의 활성화는 세포로부터의 소량의 산의 배출을 유발한다. 형성된 산은 크게는 세포내 신호전달 과정에 연료를 공급하는데 필요한 증가된 대사 활성의 결과이다. 세포 주변의 배지 내 pH 변화는 매우 적으나 예를 들어 CYTOSENSOR 마이크로피지오미터(Molecular Devices Ltd., Menlo Park, Calif.)에 의해 검출 가능하다. 따라서 CYTOSENSOR는 G-단백질 결합 수용체와 같은 세포내 신호전달 경로를 이용하는 에너지에 결합되는 수용체의 활성화를 측정하는 것이 가능하다.
GPR86 수용체로 각각의 후보 화합물을 개별적으로 시험하는 대신 후보 리간드의 라이브러리 또는 뱅크가 유리하게 제조되고 선별된다. 따라서 예를 들어 200개 이상의 추정 리간드의 뱅크가 선별을 위해 수집되었다. 상기 뱅크는 인간 7개 막횡단(7TM) 수용체; 인간 7TM 수용체에 대한 추정 작용제인 자연 발생적 화합물, 포유류 대응물이 아직 확인되지 않은 비-포유류 생물학적 활성 펩타이드; 및 자연상태에서 발견되지 않으나 알려지지 않은 천연 리간드로 7TM 수용체를 활성화시키는 화합물을 포함한다. 이러한 뱅크는 다른 문헌에서 더욱 상세히 설명된 바와 같이 기능적 분석(즉 칼슘, cAMP, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리학 등)뿐만 아니라 결합 분석을 이용하여 알려진 리간드에 대한 수용체를 선별하는데 이용된다. 그러나 아직 동족 활성화 리간드(작용제) 또는 불활성화 리간드(길항제)가 없는 것으로 남아 있는 많은 포유류 수용체가 존재한다. 따라서 이들 수용체에 대한 활성화 리간드는 현재 확인된 리간드 뱅크 내에 포함되지 않는다. 따라서 GPR86 수용체도 천연 리간드를 확인하기 위해 조직 추출물에 대해 기능적으로 선별된다(칼슘, cAMP, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리학 등을 이용, 기능적 선별). 양성 기능적 반응을 생성하는 추출물은 활성화 리간드가 분리되고 확인될 때까지 여기서 기술된 바와 같이 분석되는 분획으로 연속적으로 하위분획화될 수 있다.
HEK 293 세포 내에서 발현되는 7TM 수용체는 PLC의 활성화 및 칼슘 동원 및/또는 cAMP 자극 또는 억제에 기능적으로 결합된 것으로 나타났다. 따라서 하나의 선별 기술은 수용체 활성화에 의해 유발된 세포외 또는 세포내 pH 또는 세포내 칼슘 변화를 측정하는 시스템 내 GPR86 수용체(예를 들어 트랜스펙트된 제노푸스 난모세포 CHO 또는 HEK293 세포)를 발현하는 세포의 이용을 포함한다. 이러한 기술에서 화합물은 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 접촉된다. 이후 2차 메신저 반응 즉, 신호 전달, pH 변화 또는 칼슘 수치 변화가 잠재적인 화합물이 수용체를 활성화시키거나 억제시키는지 여부를 결정하기 위해 측정된다.
이러한 실험에서 수용체-트랜스펙트된 세포 또는 벡터 대조군 세포 내 HEK 293 세포의 기초 칼슘 수치는 100 nM 내지 200 nM의 정상으로 관찰된다. GPR86 또는 재조합 GPR86을 발현하는 HEK 293 세포는 fura 2와 함께 로드되고 1일 내에 150개 이상의 선택된 리간드 또는 조직/세포 추출물이 작용제 유도된 칼슘 동원에 대해 평가된다. 유사하게는 GPR86 또는 재조합 GPR86을 발현하는 HEK 293 세포는 표준 cAMP 정량 분석을 이용하여 cAMP 생성의 자극 또는 억제가 평가된다. 칼슘 과도현상 또는 cAMP 변동을 나타내는 작용제는 반응이 수용체를 발현하는 트랜스펙트된 세포에서 유일한 것인지 여부를 측정하기 위해 벡터 대조군 세포에서 시험된다.
또다른 방법은 GPR86 수용체-매개 cAMP의 억제 또는 자극 및/또는 아데닐레이트 사이클라제 축적의 억제 또는 자극의 측정에 의한 수용체 억제제에 대한 선별을 포함한다. 이러한 방법은 수용체로 진핵성 세포를 트랜스펙트시켜 세포 표면 상에서 수용체를 발현시키는 단계를 포함한다. 이후 세포는 수용기의 존재하에 잠재적인 길항제에 노출된다. 이후 cAMP 축적의 양이 측정된다. 잠재적인 길항제가 수용체에 결합하면 수용체 결합을 억제하게 되고 수용체-매개 cAMP의 수치 또는 아데닐레이트 사이클라제, 활성이 감소되거나 증가될 것이다.
GPR86 수용체의 작용제 또는 길항제를 검출하기 위한 또다른 방법은 참고문헌에 포함된 미국특허 제5,482,835호에 기술된 효모 기반 기술이다.
후보 화합물이 단백질, 특히 항체 또는 펩타이드인 경우 후보 화합물의 라이브러리는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선별된다. 파지 디스플레이는 재조합 박테리오파지를 이용하는 분자적 선별 프로토콜이다. 본 기술은 후보 화합물의 라이브러리로부터의 하나의 화합물을 인코드하는 유전자로 박테리오파지를 형질전환시켜 각각의 파지 또는 파지미드가 특정 후보 화합물을 발현하게 하는 단계를 포함한다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 지지대에 고정된)는 적당한 후보 화합물을 발현하고 그의 파지 외부 상에 이를 디스플레이한다. GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 결합하는 것이 가능한 특정 후보 화합물은 친화성 상호작용에 기반한 선택 전략에 의해 강화된다. 이후 성공적인 후보 약제가 특성화된다. 파지 디스플레이는 표준 친화성 리간드 선별 기술보다 유리하다. 파지 표면은 그의 자연 발생적 입체형태와 더욱 밀접하게 유사한 3차원 입체형태로 후보 약제를 디스플레이한다. 이는 선별 목적에 있어서 더욱 특이적이고 더욱 높은 친화성 결합을 가능하게 한다.
화합물 라이브러리를 선별하는 또다른 방법은 화합물 라이브러리를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 이러한 생존 가능하거나 고정된 형태의 세포는 표준 결합-파트너 분석에 사용될 수 있다. 세포 반응을 검출하는 민감성 반응을 기술한 Parce et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87;4007-4011을 참조. 화합물 라이브러리를 발현하는 세포가 125I-항체와 같은 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려진 표지된 항체 및 결합 조성물에 대한 결합 친화력이 측정된 후보 화합물과 같은 시험 표본과 접촉되거나 인큐베이트되는 경우 경합 분석은 특히 유용하다. 이후 상기 폴리펩타이드에 대해 결합되고 자유 표지된 결합 파트너가 분리되어 결합 정도를 평가한다. 결합된 시험 표본의 양은 폴리펩타이드에 결합한 표지된 항체의 양에 역비례한다.
많은 기술 중 어느 하나도 결합 정도를 평가하기 위해 자유 결합 파트너로부터 결합된 것을 분리시키는데 이용될 수 있다. 이러한 분리 단계는 일반적으로 필터로의 부착 후 세척, 플라스틱으로의 부착 후 세척 또는 세포막의 원심분리와 같은 처리를 포함한다.
또다른 접근은 예를 들어 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포로부터 추출된 용해되고 정제되지 않거나 용해되고 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 능력 및 높은 약물 시험 작업 처리량의 이점으로 "분자적" 결합 분석을 가능하게 한다.
후보 화합물 선별을 위한 또다른 기술은 적당한 즉, GPR86 폴리펩타이드에 대한 결합 친화성을 지닌 신규한 화합물에 대한 높은 처리 작업량의 선별을 제공하는 접근을 포함하고, 1984년 9월 13일 공보된 국제특허출원 WO 84/03564(Commonwealth Serum Labs.)에 상세히 기술되어 있다. 먼저, 많은 다른 작은 펩타이드 시험 화합물이 고형 기질 즉, 플라스틱 핀 또는 일부 다른 적당한 표면 상에서 합성된다; Fodor et al.(1991) 참조. 이후 모든 핀은 합성된 폴리펩타이드와 반응되고 세척된다. 다음 단계는 결합된 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함한다. 따라서 상기 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 화합물이 확인될 것이다.
리간드 결합 분석은 약물학의 직접적인 확인 방법을 제공하고 높은 작업 처리량 포맷으로 개조 가능하다. 정제된 리간드는 결합 조사를 위해 높은 특이적 활성(50∼2000 Ci/mmol)으로 방사선표지된다. 이후 방사선표지 과정이 그의 타겟에 대한 리간드 활성을 감소시키지 않도록 측정이 이루어진다. 완충액, 이온, pH 및 뉴클레오타이드와 같은 다른 조절제에 대한 분석 조건은 멤브레인과 전체 세포 수용체 근원에 대한 잡음 비율에 대한 작업 가능한 신호를 수립하도록 최적화된다. 이들 분석을 위해 특정한 결합은 총 결합 방사성에서 과도한 표지되지 않은 경합 리간드의 존재시 측정된 방사성을 감하는 것으로 한정된다. 가능한 경우 하나 이상의 경합 리간드가 잔여 비특이적 결합을 한정하는데 사용된다.
분석은 수용체를 지닌 세포에 대한 부착이 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 후보 화합물의 간단한 결합 시험이거나 다른 분석의 경우 표지된 경쟁자와 경합시키는 단계를 포함한다. 또한 이들 분석은 그의 표면에서 타겟을 지닌 세포에 적당한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 타겟의 활성에 의해 생성된 신호를 유발하는지 여부를 시험한다. 활성화 억제제는 일반적으로 알려진 길항제의 존재시 분석되고 후보 화합물의 존재시 작용제에 의한 활성화의 효과가 관찰된다.
또한 분석은 후보 화합물을 GPR86 폴리펩타이드를 포함한 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계, 혼합물 내의 GPR86 활성을 측정하는 단계 및 혼합물의 GPR86 활성을 표준물질과 비교하는 단계를 간단하게 포함한다.
또한 GPR86 cDNA, 단백질, 단백질에 대한 항체는 세포 내 GPR86 mRNA 및 단백질의 생성 상의 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 방법을 형성하는데 사용된다. 예를 들어 당분야에 알려진 표준 방법에 의해 단일클론 및 폴리클론 항체를 이용하여 GPR86 단백질의 분비 수치 또는 세포 결합 수치를 측정하기 위해 ELISA가 구축되고, 이는 적당하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 GPR86의 생성을 억제하거나 증가시키는 약제(또한 각각 길항제 또는 작용제로 명명됨)를 발견하는데 이용될 수 있다. 선별 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 당분야에서 잘 이해된다.
잠재적 GPR86 길항제의 예는 항체 또는 일부의 경우 퓨린 및 퓨린 아날로그를 포함한 뉴클레오타이드 및 그의 아날로그, GPR86의 리간드와 밀접하게 관련된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 즉, 리간드의 단편 또는 수용체에 결합하나 반응을 유도하지 않아서 수용체의 활성이 방지되는 소분자를 포함한다.
따라서 본 발명자는 GPR86 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물을 제공한다.
"화합물"이라는 용어는 생물학적 대분자(즉, 핵산, 단백질, 비-펩타이드 또는 유기 분자)와 같은 화학적 화합물(자연 발생적 또는 합성) 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유류)의 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 제조된 추출물 또는 무기 원소 또는 분자를 나타낸다. 바람직하게는 화합물은 항체이다.
이러한 선별이 수행되는데 필요한 물질은 선별 키트로 포장된다. 이러한 선별 키트는 GPR86 폴리펩타이드 또는 GPR86 폴리펩타이드의 생성을 감소시키거나 증가시키는 화합물에 대한 작용제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소 등을 확인하는데 유용하다. 선별 키트는: (a) GPR86 폴리펩타이드; (b) GPR86 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포; (c) GPR86 폴리펩타이드를 발현하는 세포막; 또는 (d) GPR86 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다. 선별 키트는 선택적으로는 사용 지침을 포함한다.
형질전환 동물
또한 본 발명자는 정상적인 발현 수준과 비교시 정상적이거나 증가되거나 감소된 수준으로 천연 또는 재조합 GPR86 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 발현하는 것이 가능한 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 형질전환 동물은 돼지, 양 또는 설치류와 같은 비-인간 포유류이다. 가장 바람직하게는 형질전환 동물은 마우스 또는 래트이다.
본 발명자는 고유의 GPR86 유전자의 전부 또는 일부가 또다른 생물체 유래의 GPR86 서열로 대치된 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 생물체는 또다른 종, 가장 바람직하게는 인간이다. 매우 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 인간 GPR86 유전자로 대치된 전체 GPR86 유전자를 실질적으로 지닌 마우스를 개시한다. 이러한 형질전환 동물뿐만 아니라 GPR86에 대해 야생형인 동물은 GPR86의 작용제 및/또는 길항제를 선별하는데 이용된다.
예를 들어 이러한 분석은 야생형 또는 형질전환 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 형질전환 동물의 세포, 조직 또는 기관을 후보 물질에 노출시키는 단계 및 통증 및 염증과 같은 GPR86 관련 표현형을 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 세포내 환상 AMP 농도 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다.
또한 본 발명자는 본 출원서에 개시된 GPR86의 하나 이상의 기능이 부분적으로 또는 전체적으로 제거된, 기능적으로 분열된 GPR86 유전자를 포함한 형질전환 동물을 개시한다. GPR86 유전자의 결실을 포함한 하나 이상의 돌연변이 기능 손실의 결과로 기능적 GPR86을 발현하지 않는 형질전환 동물("GPR86 넉아웃")이 포함된다.
또한 기능적 GPR86을 상실한 형질전환 동물(GPR86 넉아웃)은 야생형 동물과 비교시 변화된 통증 감수성을 나타낸다. 상세하게는 GPR86 넉아웃은 통증에 덜 민감하다. 더욱이 GPR86 넉아웃 동물은 염증성 통증에 대해 변화된 감수성 특히 감소된 염증성 통증 감수성을 나타낸다.
또한 예를 들어 GPR86 유전자의 선택된 부분이 결실된 일부 기능-손실 돌연변이체 즉, 불완전 넉아웃이 포함된다. 이러한 동물은 예를 들어 기능적으로 중요한 단백질 도메인과 같은 GPR86 서열의 관련 부분을 선택적으로 대치하거나 결실함으로서 생성된다.
이러한 기능의 완전 또는 일부 손실 돌연변이체는 GPR86 관련 질환, 특히 통증 또는 염증성 질환을 위한 모델로서 유용하다. 일부-기능-손실을 나타내는 동물은 후보 물질에 노출되어 표현형을 증가시키는 즉, 관찰되는 통증 표현형에 대한 감소된 민감성을 증가시키는(GPR86의 경우) 물질을 확인한다. 또한 세포내 환상 AMP 수치 변화와 같은 다른 파라미터는 본 출원서에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
또한 일부 및 완전 넉아웃은 GPR86의 선택적 작용제 및/또는 길항제를 확인하는데 이용된다. 예를 들어 작용제 및/또는 길항제는 야생형 및 GPR86 결함 동물(넉아웃)에 투여된다. GPR86의 선택적 작용제 및/또는 길항제는 야생형 동물에는 효과적이나 GPR86 결함 동물에는 그렇지 않은지에 대해 관찰될 것이다. 더욱 상세하게는 GPR86의 부재시 생리적 반응을 생성하는지 여부를 측정하기 위해 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)을 평가하도록 특정 분석이 고안된다. 이는 상기 기술된 바와 같이 형질전환 동물에 약물을 투여한 후 특정 반응에 대해 동물을 분석함으로서 달성된다. 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 세포내 환상 AMP 농도 상의 효과를 분석하는 유사한 세포-기반 방법도 수행된다. 또한 이러한 동물은 본 출원서에 기술된 선별에 의해 확인된 약물의 효능을 시험하는데 이용된다.
또다른 실시태양에서 일부 기능-손실 표현형을 지닌 형질전환 동물이 선별을 위해 이용된다. 이러한 실시태양에서 선별은 야생형 표현형으로의 일부 또는 완전 복구 또는 복귀에 대해 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 세포내 cAMP 농도 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다. 이와 같이 가능한 것으로 판별된 후보 화합물은 GPR86 작용제 또는 아날로그로 간주될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 통증과 같은 자극에 대한 민감도를 복구시키거나 증가시키는데 사용된다.
바람직한 실시태양에서 형질전환 GPR86 동물, 특히 GPR86 넉아웃(완전 기능 손실)은 실시예에 나타난, 바람직하게는 여기에 나타난 시험에 의해 측정된 표현형을 나타낸다. 따라서 GPR86 동물, 특히 GPR86 넉아웃은 바람직하게는 하나 이상의 하기를 나타낸다: 저하된 민감도(통각감퇴), 저하된 염증 감수성.
매우 바람직한 실시태양에서 형질전환 GPR86 동물, 특히 GPR86 넉아웃은 상응하는 야생형 마우스와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상 더 높거나 더 낮은(케이스에 따라서) 측정된 파라미터를 나타낸다. 따라서 예를 들어 GPR86 넉아웃은 야생형 마우스와 비교시 1초, 2초, 5초, 10초, 30초 이상 또는 5%, 10%, 20%, 50% 이상으로 실시예에 나타난 꼬리 튀기기(Tail Flick) 시험에 반응한 증가된 통증 역치를 지닌다.
GPR86의 기능-손실에 대한 유사한 효과를 유발하는 화합물을 검출하기 위해 GPR86 결함 형질전환 동물에 대해 현재 개시된 표현형이 야생형 동물을 이용한 선별에 유용하게 이용됨이 명백해질 것이다. 즉, GPR86 기능의 조절제 특히 길항제를 확인하기 위해 야생형 동물이 후보 화합물에 노출되고 통감감퇴, 통증에 대한 민감도 감소 등과 같은 관련된 GPR86 표현형의 변화가 관찰된다. 또한 세포내 환상 AMP 수치 변화와 같은 세포성 표현형이 본 출원서 내에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
이러한 선별에 의해 확인된 화합물은 특히 GPR86 관련 질환의 치료 또는 경감을 위해 GPR86의 길항제 즉, 진통제로서 사용될 수 있다.
상기 기술된 선별은 행동적, 생리적 또는 생화학적 반응과 같은 적당한 파라미터의 관찰을 포함한다. 바람직한 반응은 생리적 반응을 포함하고 하나 이상의 하기를 포함한다: 질병 저항성 변화; 변화된 염증성 반응; 변화된 종양 감수성; 혈압 변화; 신혈관생성; 식이 행동 변화; 체중 변화; 골밀도 변화; 체온 변화; 인슐린 분비; 식샘자극호르몬 분비; 비강 및 기관지 분비; 혈관수축; 기억 상실; 불안; 반사감퇴 또는 반사이상항진; 통증 또는 스트레스 반응.
GPR86 넉아웃 동물 유래의 조직은 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)이 GPR86 수용체에 결합하는지 여부를 측정하기 위한 결합 분석에 사용된다. 이러한 분석은 GPR86 수용체 제조시 결함이 있도록 설계된 형질전환 동물로부터 첫 번째 수용체 제제를 수득하고 어떠한 확인된 GPR86 리간드 또는 화합물에 결합하는 것으로 알려진 원료로부터 두 번째 수용체 제제를 수득함으로서 수행될 수 있다. 일반적으로 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제는 수득되는 원료를 제외하고 모든 면에서 유사할 것이다. 예를 들어 형질전환 동물로부터의 뇌 조직(상기 및 하기 기술된 바와 같은)이 분석에 사용되는 경우 정상(야생형) 동물로부터의 비교 가능한 뇌 조직은 두 번째 수용체 제제의 원료로서 사용된다. 각각의 수용체 제제는 단독 및 후보 리간드 또는 화합물의 존재시 모두에 대해 GPR86 수용체에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 인큐베이트된다. 바람직하게는 후보 리간드 또는 화합물은 일부 다른 농도에서 조사될 것이다.
알려진 리간드에 의한 결합이 시험 화합물에 의해 표시되는 정도는 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제 모두에 대해 측정된다. 형질전환 동물 유래의 조직은 분석에 직접 사용되거나 조직은 그 자체로 분석에 사용되는 막 또는 막 단백질을 분리하도록 처리된다. 바람직한 형질전환 동물은 마우스이다. 리간드는 결합 분석에 적합한 방법을 이용하여 표지된다. 이는 방사선, 효소, 형광 또는 화학발광 표지(뿐만 아니라 상기 더욱 상세히 설명된 다른 표지 기술)를 포함하나 한정적인 것은 아니다.
더욱이 GPR86 수용체의 길항제는 후보 화합물 등을 기능적 GPR86을 발현하는 동물 및 GPR86 수용체 기능의 감소되거나 제거된 발현과 관련된 표현형적 특성을 나타내는 것으로 확인된 동물에 투여함으로서 확인된다.
비-인간 형질전환 동물을 생성하는 상세한 방법은 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 형질전환 유전자 컨스트럭트는 동물의 생식계 내로 도입되어 형질전환 포유류를 생성할 수 있다. 예를 들어 하나 또는 일부의 컨스트럭트 카피가 표준 형질전환 기술에 의해 포유류 배아의 게놈 내로 도입된다.
예시적 실시태양에서 형질전환 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식계 내로 트랜스유전자를 도입시킴으로서 생성된다. 다양한 발달 단계의 배아성 타겟 세포는 트랜스유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배아성 타겟 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법이 이용된다. 동물의 특정 계통(들)이 일반적인 우수한 건강, 우수한 배아 산출량, 우수한 배아내 전핵 가시도 및 우수한 재생 적합성에 대해 선택된다. 더욱이 일배체형은 유의적인 인자이다.
트랜스유전자의 배아 내로의 도입은 예를 들어 현미주사, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션과 같은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 컨스트럭트 카피가 발달 포유류(들)의 세포 내에서 유지되게 하기 위해 포유류 수정란(들)의 전핵 내로 컨스트럭트의 현미주사에 의해 GPR86 수용체 트랜스유전자가 포유류 내로 도입될 수 있다. 수정란 내로 트랜스유전자 컨스트럭트의 도입 후 수정란은 다양한 시간 동안 시험관 내에서 인큐베이트되거나 대리 숙주 내로 재이식되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 시험관 내의 성숙을 위한 인큐베이션도 수행된다. 일반적인 하나의 방법에서 종에 따라 다르게 약 1∼7일간 시험관 내에서 배아를 인큐베이트한 후 대리 숙주 내로 이를 재이식한다.
형질전환적으로 조작된 배아의 자손은 조직 세그먼트의 서던 블럿 분석에 의해 컨스트럭트의 존재에 대해 시험되었다. 하나 이상의 외인성 클론된 컨스트럭트 카피가 이러한 형질전환 배아의 게놈 내로 안정하게 도입되어 유지되는 경우 형질전환적으로 첨가된 컨스트럭트를 지닌 영구적 형질전환 포유류 계통을 수립하는 것이 가능하다.
형질전환적으로 변화된 포유류 자손은 자손의 게놈 내로의 컨스트럭트 도입에 대해 출생 후 분석될 수 있다. 바람직하게는 이러한 분석은 자손으로부터의 염색체 물질 상에서 원하는 재조합 단백질 생성물 또는 그의 세그먼트를 코드하는 DNA 서열에 상응하는 프로브를 하이브리다이즈함으로서 달성된다. 그의 게놈 내에 적어도 하나 이상의 컨스트럭트 카피를 포함한 것으로 나타난 이들 포유류 자손은 생장하여 성숙된다.
본 출원서의 목적으로, 접합자는 완전한 생물체 내로 발달하는 것이 가능한 이배체 세포의 형태이다. 일반적으로 접합자는 생식세포 또는 생식세포들로부터의 2개의 반수체 핵의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함한 난으로 구성될 것이다. 따라서 생식세포 핵은 자연적으로 적합한 것 즉, 분화를 착수하고 기능적 생물체로 발달하는 것이 가능한 생존 가능한 접합자를 유발하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수체 접합자가 바람직하다. 이수배수체 접합자가 수득되는 경우 염색체 수는 기원된 생식세포 생물체의 정배수체 수에 있어서 하나 이상까지 차이가 나지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 더하여 물리적인 고찰도 접합자의 핵 또는 접합자 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양(즉, 부피)을 제어한다. 어떠한 유전 물질도 제거되지 않은 경우 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 분열되지 않고 흡수되는 양으로 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가의 물리적 효과는 접합자의 생존율을 물리적으로 분열시키는 정도로 크지 않아야 한다. 수득되는 접합자의 외인성 유전 물질을 포함한 유전 물질은 접합자의 기능적 생물체로의 분화 및 발달을 생물학적으로 개시하고 유지시키는 것이 가능하여야 하기 때문에 DNA 서열의 수 및 종류의 생물학적 제한 특정한 접합자 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라 달라질 것이고 당업자에게 용이하게 명백화될 것이다.
접합자에 첨가되는 트랜스유전자 컨스트럭트의 카피 수는 첨가되는 외인성 유전 물질의 총량에 따라 달라지고 유전적 형질전환을 발생하게 할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로는 하나의 카피만이 필요하다; 그러나 일반적으로 하나의 카피가 기능적임을 보증하기 위해 예를 들어 트랜스유전자 컨스트럭트의 1,000∼20,000개 카피와 같은 많은 카피가 사용된다. 외인성 DNA 서열의 표현형적 발현을 증가시키기 위해 삽입된 외인성 DNA 서열 각각의 하나 이상의 기능성 카피를 지니는 것이 종종 유리하다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전성 구조물을 파괴하지 않는 한 외인성 유전 물질의 핵 유전 물질 내로의 첨가를 가능하게 하는 어떠한 기술도 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 현미주사에 의해 핵 유전 물질 내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 현미주사는 알려져 있고 당분야에 이용된다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 달성된다. 일반적으로 대리 숙주가 마취되고 배아가 난관 내로 삽입된다. 특정 숙주 내로 이식된 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이나 일반적으로 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수에 비교 가능할 것이다.
대리 숙주의 형질전환 자손은 적당한 방법에 의해 트랜스유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 선별된다. 선별은 종종 적어도 일부의 트랜스유전자에 상보적인 프로브를 이용한 서던 블럿 또는 노던 블럿 분석에 의해 달성된다. 트랜스유전자에 의해 인코드되는 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석이 트랜스유전자 생성물의 존재에 대한 대안적 또는 추가적 선별 방법으로 이용된다. 일반적으로 DNA는 꼬리 조직으로부터 준비되고 트랜스유전자에 대한 서던 블럿 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안으로 어떠한 조직 또는 세포 형태도 본 분석에 사용되나 최대 수준으로 트랜스유전자를 발현하는 것으로 판단되는 조직 또는 세포가 서던 분석 또는 PCR을 이용하여 트랜스유전자의 존재 및 발현에 대해 시험된다.
트랜스유전자의 존재를 평가하는 대안적 또는 추가적 방법은 효소 및/또는 면역 분석과 같은 적당한 생화학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유속 세포분석 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 혈액 분석이 혈액 내 트랜스유전자 생성물의 존재를 검출할 뿐만 아니라 다양한 형태의 혈액 세포의 수준 및 다른 혈액 구성물 상의 트랜스유전자의 효과를 조사하는데 유용하다.
형질전환 동물의 자손은 적당한 파트너와의 형질전환 동물의 교미 또는 형질전환 동물로부터 수득된 난자 및/또는 정자의 시험관 내 수정에 의해 수득된다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우 파트너는 형질전환 및/또는 넉아웃이거나 그렇지않고; 형질전환인 경우 동일하거나 다른 트랜스유전자 또는 이 둘 모두를 포함한다. 대안으로 파트너는 모계이다. 시험관 내 수정이 이용되는 경우 수정된 배아는 대리 숙주 내로 이식되거나 시험관 내에서 인큐베이트되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 이들 방법을 이용하여 자손은 상기 기술된 방법 또는 다른 적당한 방법을 이용하여 트랜스유전자의 존재에 대해 조사된다.
본 출원서에 따라 생성된 형질전환 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 상기 나타난 바와 같이 외인성 유전 물질은 특정한 실시태양에서 GPR86 수용체의 생성을 유발하는 DNA 서열이다. 또한 이러한 실시태양에서 서열은 바람직하게는 특정한 형태의 세포 내에서 트랜스유전자 생성물의 발현을 가능하게 하는 전사 조절 요소 즉, 프로모터에 부착될 것이다.
또한 레트로바이러스 감염이 비-인간 동물 내로 트랜스유전자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 발달하는 비-인간 배아는 시험관 내에서 배반포 단계로 배양될 수 있다. 이러한 기간 동안 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 타겟이 될 수 있다(Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 유효 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)). 트랜스유전자를 도입시키는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스유전자를 운반하는 복제-결함 레트로바이러스이다(Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스-생산 세포의 단일층 상에 할구를 배양함으로서 용이하고 효과적으로 수득된다((Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). 대안으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포가 포배강 내로 주입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 도입이 형질전환 비-인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조물질은 트랜스유전자의 모자이크가 될 것이다. 또한 시조물질은 일반적으로 자손에서 격리되는 게놈 내 다른 위치에서 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스성 삽입을 포함한다. 더욱이 미드게스테이션(midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 생식 계열 내로 트랜스유전자를 도입시키는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982) 상동).
트랜스유전자 도입을 위한 타겟 세포의 세 번째 형태는 배아줄기세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양되고 배아와 융합된 이식-전 배아로부터 수득된다(Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448). 트랜스유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 유효하게 도입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는 이후 비-인간 동물로부터의 배반포와 결합될 수 있다. 이후 ES 세포는 배아를 집락화하고 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다. Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474 참조.
또한 본 발명자는 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이 GPR86 수용체 기능에 대한 모델로서 변화된 GPR86 유전자를 지님으로서 특성화된 비-인간 형질전환 동물 제공한다. 유전자의 변화는 결실 또는 기능 손실 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이화된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 도입, 다른 종으로부터의 외인성 유전자의 도입 또는 그의 결합을 포함한다. 형질전환 동물은 변이에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다. 이로부터 유래된 동물 및 세포는 GPR86 수용체 기능을 조절하는 생물학적으로 활성인 약제를 선별하는데 유용하다. 선별 방법은 통증 및 골관절염, 류마티스관절염, 천식, 과민성대장증후군 및 알레르기와 같은 염증성 장애에 대한 잠재적 치료제의 특이성 및 작용을 측정하는데 특히 유용하다. 상기 동물은 정상 뇌, 심장, 비장 및 간 기능시 GPR86 수용체의 역할을 조사하는 모델로서 유용하다.
또다른 관점은 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지니고 그의 게놈 내에서 운반되고 이형성 GPR86 단백질(즉, 또다른 종으로부터의 GPR86)를 인코드하는 트랜스유전자를 발현하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다. 바람직하게는 동물은 마우스이고 이형성 GPR86은 인간 GPR86이다. 인간 GPR86으로 재구성된 동물 또는 이러한 동물 유래의 세포주는 생체 내 및 시험관 내에서 인간 GPR86을 억제하는 약제를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 인간 GPR86을 통해 신호전달을 유도하는 자극은 시험되는 약제의 존재 및 부재시 동물 또는 세포주에 투여될 수 있고, 동물 또는 세포주의 반응이 측정될 수 있다. 생체 내 및 시험관 내에서 인간 GPR86을 억제하는 약제는 약제의 부재시 반응 대비 약제의 존재시 반응을 감소시키는지에 따라 확인될 수 있다.
또한 본 발명자는 GPR86 결함 형질전환 비-인간 동물("GPR86 넉-아웃")을 제공한다. 이러한 동물은 바람직하게는 내인성 GPR86 게놈 서열이 분열되거나 결실됨으로서 저하되거나 전혀 없는 GPR86 활성을 발현하는 것이다. 바람직하게는 이러한 동물은 GPCR 활성을 발현하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 동물은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 GPR86의 활성을 발현하지 않는다. GPR86 넉-아웃은 하기 더욱 상세히 기술된 바와 같이 당분야에 알려진 다양한 방법으로 생성된다.
또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 GPR86 유전자를 기능적으로 분열시키기 위한 핵산 컨스트럭트에 관한 것이다. 핵산 컨스트럭트는: a) 비-상동성 대치 부분; b) 첫 번째 GPR86 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지닌, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 c) 두 번째 GPR86 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연 발생적 내인성 GPR86 유전자 내의 첫 번째 GPR86 유전자의 다운스트림 위치를 지닌, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역. 더욱이 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입시 첫 번째 및 두 번째 상동성 구역은 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포 내 내인성 GPR86 유전자 사이의 상동적 재조합에 충분한 길이다. 바람직한 실시태양에서 비-상동성 대치 부분은 바람직하게는 lacZ 및 양성 선택 발현 카세트를 포함하고, 바람직하게는 조절 요소(들)에 실시 가능하게 결합되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한 발현 수용체를 포함한다.
바람직하게는 첫 번째 및 두 번째 GPR86 유전자 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체로부터 유래한다.
또다른 관점은 상기 기술된 핵산 컨스트럭트가 도입되는 재조합 벡터에 관한 것이다. 또다른 관점은 핵산 컨스트럭트가 도입되어 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포의 내인성 GPR86 유전자 사이의 상동적 재조합을 가능하게 하여 내인성 GPR86 유전자의 기능적 분열을 유발하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 간, 뇌, 비장 또는 심장 또는 마우스 배아줄기세포와 같은 다기능성 세포로부터의 GPR86을 정상적으로 발현하는 포유류 세포가 될 수 있다. 또한 핵산 컨스트럭트가 도입되고 내인성 GPR86 유전자로 상동적으로 재조합된 배아줄기세포의 발달은 배아줄기세포로부터 유전되고 따라서 그의 게놈 내에 GPR86 유전자를 운반하는 세포를 지닌 형질전환 비인간 동물을 생성한다. 이후 그의 생식 계열 내에 GPR86 유전자 분열을 운반하는 동물이 선택되고 모든 체세포 또는 생식 세포 내 GPR86 유전자 분열을 지닌 동물이 번식될 수 있다. 이후 이러한 마우스가 GPR86 유전자 분열에 대한 동형접합성으로 번식될 수 있다.
항체
본 출원서의 목적에 있어서, "항체"라는 용어는 상세한 기술이 없는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 단편은 타겟 물질에 대한 결합 활성을 보유한 전체 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')2 단편뿐만 아니라 단일 사슬 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질을 포함한다. 항체 및 그의 단편은 예를 들어 EP-A-23900에 기술된 바와 같은 인간화 항체이다. 더욱이 예를 들어 미국특허 제5,545,807호 및 6,075,181호에 기술된 바와 같이 전체 인간 변이가능 구역(또는 그의 단편)을 지니 항체도 이용된다. 중화 항체 즉, 아미노산 서열 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단제 및 치료제로서 특히 바람직하다.
항체는 면역법 또는 파지 디스플레이 라이브러리의 이용과 같은 표준 기술에 의해 생성된다.
GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 알려진 기술에 의해 항체를 발달시키는데 사용된다. 이러한 항체는 GPR86 단백질 또는 상동체, 단편 등에 특이적으로 결합하는 것이 가능하다.
폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한 면역원성 조성물로 면역된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄과 같은 Freund 미네랄 겔 및 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루론산 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 전신 방어를 자극하는 목적으로 면역학적으로 절충된 개체에 투여되는 아미노산 서열 물질을 정제시 이용되는 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.
면역된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. GPR86 폴리펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 포함한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함하는 경우 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이러한 항체가 제조되기 위해서는 본 발명자는 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용하기 위한 또다른 아미노산 서열로 합텐화된(haptenised) GPR86의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 항체가 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 영구적 항체-생성 세포주는 세포 융합 및 발암성 DNA로의 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 에브스타인-바 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체의 패널은 다양한 특성 즉, 동형 및 에피토프 친화성에 대해 선별될 수 있다.
단일클론 항체는 배양액 내 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술도 이용하여 제조된다. 이는 Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
더욱이 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위해 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술, 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454). 대안으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 설명된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정 단일 사슬 항체 물질을 생성하도록 개조될 수 있다.
GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 단일클론 항체 및 폴리클론 항체 모두 진단에 특히 유용하고, 중화된 것은 수동 면역화에 유용하다. 특히 단일클론 항체는 항-유전형 항체를 유발하는데 사용된다. 항-유전형 항체는 보호가 바람직한 물질 및/또는 약제의 "내부 이미지"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-유전형 항체를 유발하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이들 항-유전형 항체는 치료에도 유용하다.
또한 항체는 림프구 집단 내에서 생체 내 생성을 유도하거나 Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 Winter G and Milstein C(1991; Nature 349:293-299)에 개시된 매우 특이적 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 선별함으로서 생성된다.
또한 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이적 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리가 구축되어 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 한다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281).
또한 단일 사슬 항체의 생성 기술(미국특허 제4,946,778호)이 GPR86 폴리펩타이드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한 형질전환 마우스 또는 다른 포유류를 포함한 다른 생물체가 인간화 항체를 발현시키는데 사용된다.
상기-기술된 항체는 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하기 위해 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하기 위해 사용된다.
또한 GPR86 폴리펩타이드에 대한 항체는 통증 및 골관절염, 류마티스관절염, 천식, 과민성대장증후군 및 알레르기와 같은 염증성 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.
진단 분석
또한 본 발명은 진단 시약으로서의 진단 또는 유전자 분석에 이용하기 위한 GPR86 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 및 유도체)의 이용에 관한 것이다. 또한 GPR86 핵산에 상보적이거나 이에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 핵산(상동체, 변이체 및 유도체 포함)뿐만 아니라 GPR86 폴리펩타이드에 대한 항체가 이러한 분석에 유용하다.
기능장애와 관련된 GPR86 유전자의 돌연변이화된 형태의 검출은 GPR86의 저-발현, 과-발현 또는 변화된 발현으로부터 유발된 질병의 진단 또는 감수성의 진단에 첨가되거나 이를 한정할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. GPR86 유전자(대조군 서열을 포함) 내 돌연변이를 지닌 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출된다.
예를 들어 DNA는 환자로부터 분리되고 GPR86의 DNA 다형성 패턴이 측정된다. 확인된 패턴은 GPR86의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 대조군과 비교된다. 이후 GPR86 관련 질환과 관련된 유전자 다형성 패턴을 발현하는 환자가 확인된다. GPR86 유전자 분석은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행된다. 예를 들어 개체는 RFLP 또는 SNP 분석 등에 의해 GPR86 대립유전자의 DNA 서열을 측정함으로서 선별된다. 환자는 GPR86에 대한 유전자 서열 또는 그의 발현을 조절하는 어떠한 서열 내 DNA 다형성의 존재를 검출함으로서 GPR86의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환에 대한 유전자 소인을 지닌 것으로 확인된다.
이후 이렇게 확인된 환자는 GPR86 관련 질환의 발생을 예방하도록 또는 더욱 적극적으로는 GPR86 관련 질환의 초기 단계에서 질환의 발생 또는 발달을 예방하도록 치료될 수 있다. GPR86 관련 질환은 파킨슨병과 같은 도파민 관련 질환, 상실성 또는 심실성 부정맥과 같은 심장 질환, 저혈압, 구토, 뚜렛 증후군, 스트레스 및 통증을 포함한다.
또한 본 발명자는 GPR86 관련 질환과 관련된 환자의 유전자 다형성 패턴의 확인용 키트를 개시한다. 상기 키트는 DNA 표본 수집기 및 환자의 GPR86 관련 질환에 대한 감수성을 측정하기 위해 대조군 표본에 비교되는 유전자 다형성 패턴을 측정하는 기구를 포함한다. 또한 GPR86 폴리펩타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드(또는 그의 단편)에 대한 항체를 포함한 GPR86 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 생검 또는 부검 조직 물질과 같은 피험자의 세포로부터 수득된다. 바람직한 실시태양에서 DNA는 환자의 손가락을 찔러 흡수지 상에서 수집된 혈액으로부터 수집된 혈액 세포로부터 수집된다. 또다른 바람직한 실시태양에서 혈액은 AmpliCardTM(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF) 상에서 수집될 것이다.
DNA는 검출을 위해 직접적으로 이용되거나 분석 전 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용함으로서 효소적으로 증폭된다. 목적 유전자 내 특정 다형성 DNA 구역을 타겟하는 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머가 제조되어 타겟 서열의 PCR 반응 증폭이 달성되게 된다. 또한 RNA 또는 cDNA는 유사한 형태로 주형으로 사용된다. 이후 주형 DNA으로부터 증폭된 DNA 서열이 제한효소를 이용하여 분석되어 증폭된 서열 내에 존재하는 유전자 다형성을 측정하여 환자의 유전자 다형성 프로파일을 제공한다. 제한 단편 길이는 겔 분석에 의해 확인된다. 대안으로 또는 그와 결합하여 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 분석과 같은 기술이 이용된다.
결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교시 증폭된 생성물 크기 상의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 GPR86 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈시킴으로서 확인될 수 있다. 완벽하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 분해 온도 상의 차이에 의해 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 또한 DNA 서열 차이는 변성제와 함께 또는 변성제 없이 겔 내에서의 DNA 단편의 전기영동 이동 상의 변화 또는 직접적인 DNA 서열분석에 의해 검출된다. Myers et al, Science (1985)230:1242 참조. 특정 위치에서의 서열 변화는 RNAse 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 분열방법에 의해 판명된다. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401 참조. 또다른 실시태양에서 GPR86 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 포함한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이가 구축되어 유전자 돌연변이의 유효한 선별을 수행할 수 있게 한다. 어레이 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적인 적용 가능성을 지니고 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함한 다양한 분자유전학 상의 의문을 설명하는데 사용될 수 있다(예를 들어 M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996) 참조).
단일 나선 구조 다형성(SSCP)은 돌연변이와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동 상의 차이를 검출하는데 이용된다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, see also Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 표본 및 대조군 핵산의 단일-나선 DNA 단편은 변성되고 복원을 가능하게 한다. 단일-나선 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다르고 결과적인 전기영동 이동 상의 차이는 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편은 표지되거나, 표지된 프로브로 검출된다. 분석 민감도는 RNA(DNA 보다는)를 이용하여 증가되고, 2차 구조는 서열 변화에 더욱 민감하다. 바람직한 실시태양에서 주된 방법은 전기영동 이동 상의 변화를 기반으로 이중 나선 이질이중나선 분자를 분리하는 이질이중나선 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
진단 분석은 기술된 방법에 의한 GPR86 유전자 돌연변이의 검출을 통해 감염 감수성을 진단하거나 측정하는 방법을 제공한다.
GPR86 폴리펩타이드 및 핵산의 존재는 표본 내에서 검출된다. 따라서 상기 기입된 감염 및 질병은 피험자 유래의 표본으로부터 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준의 GPR86 폴리펩타이드 또는 GPR86 mRNA를 측정하는 단계를 포함한 방법에 의해 진단될 수 있다. 표본은 증가되거나 감소되거나 비정상적인 GPR86 발현과 관련된 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체로부터의 세포 또는 조직 표본을 포함한다. 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체의 GPR86 발현 수준 또는 패턴은 질환의 진단에 의해 정상 생물체 내 발현 수준 또는 패턴과 유용하게 비교된다.
따라서 일반적으로 본 발명자는 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 표본을 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한 표본 내 GPR86 핵산을 포함한 핵산 존재의 검출 방법을 개시한다. 예를 들어 핵산 프로브는 GPR86 핵산 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하고 그 둘 사이의 결합이 검출되고; 복합체 자체의 존재도 검출된다. 더욱이 본 발명자는 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 항체에 세포 표본을 접촉시키고 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터함으로서 GPR86 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이는 항체와 폴리펩타이드 사이에 형성된 복합체의 존재를 모니터하거나 폴리펩타이드와 항체 사이의 결합을 모니터함으로서 편리하게 달성된다. 두 실체 사이의 결합의 검출 방법은 당분야에 알려져 있고 FRET(형광 공명 에너지 전달), 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
감소되거나 증가된 발현은 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNAse 보호, 노던 블럿팅 및 다른 하이브리디제이션 방법과 같은 폴리뉴클레오타이드의 정량화를 위한 당분야에 잘 알려진 어떠한 방법을 이용하여도 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주 유래의 표본 내 GPR86과 같은 단백질 수준을 측정하는데 이용되는 분석 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석 방법은 방사면역측정법, 경합-반응분석, 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA 분석을 포함한다.
또한 본 발명자는 예를 들어 파킨슨병과 같은 도파민 관련 질환, 상실성 또는 심실성 부정맥과 같은 심장 질환, 저혈압, 구토, 뚜렛 증후군, 스트레스 및 통증과 같은 질병(감염을 포함) 또는 이러한 질병에 대한 감수성용 진단 키트를 개시한다. 진단 키트는 GPR86 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편; 상보성 뉴클레오타이드 서열; GPR86 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 GPR86 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다.
염색체 분석
또한 GPR86 뉴클레오타이드 서열은 염색체 확인에 유용하다. 상기 서열은 인간 개체 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 타겟되고 이와 하이브리다이즈할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 인간 GPR86은 호모 사피엔스 염색체 3q24에 지도화된 것으로 나타났다.
염색체로의 관련 서열의 지도화는 이들 서열을 유전자 관련 질환과 연관시키는 중요한 첫 번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 상호관련될 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어 V. McKusick, Mendelian heritance in Man(온라인 상의 Johns Hopkins University Welch Medical Library에서 이용 가능)에 나타나 있다. 이후 동일한 염색체 구역으로 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계는 계통 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인된다.
또한 영향 받은 개체와 영향 받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열 상의 차이가 측정될 수 있다. 돌연변이가 영향 받은 개체의 일부 또는 전부에서 관찰되나 정상 개체에서는 관찰되지 않는 경우 돌연변이는 질병의 유발 요인으로 간주된다.
예방 및 치료 방법
또한 본 발명자는 과도한 양 및 불충분한 양의 GPR86 활성 모두에 관련한 비정상적 이상의 치료 방법을 제공한다.
GPR86 활성이 과도한 경우 일부 접근이 이용 가능하다. 하나의 접근은 상기 기술된 억제제 화합물(길항제)을 GPR86에 대한 리간드의 결합을 차단하거나 두 번째 신호를 억제하여 비정상적 이상을 완화시킴으로서 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 약학적으로 수용 가능한 담체와 함께 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 GPR86과 경합하는 리간드에 결합하는 것이 가능한 용해성 형태의 GPR86 폴리펩타이드가 투여된다. 이러한 경합제의 일반적인 실시태양은 GPR86 폴리펩타이드의 단편을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 GPR86을 인코드하는 유전자의 발현이 발현 차단 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 알려진 기술은 내부적으로 생성되거나 별도로 투여되는 안티센스 서열의 이용을 포함한다. 예를 들어 O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988) 참조. 대안으로 유전자와 함께 삼중 헬릭스를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 보충될 수 있다. Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360 참조. 이들 올리고머는 그 자체로 투여될 수 있거나 관련 올리고머가 생체 내에서 발현될 수 있다.
GPR86의 저-발현 및 그의 활성과 관련한 비정상적 이상을 치료하기 위해 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 GPR86을 활성화시키는 화합물 즉, 상기 기술된 작용제를 약학적으로 수용 가능한 담체와 결합하여 피험체에 투여하여 비정상적 이상을 완화시키는 것을 포함한다. 대안으로, 피험체 내의 관련 세포에 의한 GPR86의 내인성 생성에 효과를 나타내지 위해 유전자 치료가 이용된다. 예를 들어 GPR86 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 바와 같이 복제 결함 레트로바이러스 벡터 내 발현을 위해 설계된다. 이후 레트로바이러스 발현 컨스트럭트가 분리되고 GPR86 폴리펩타이드를 인코드하는 RNA를 포함한 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 팩키징 세포 내로 도입되어 팩키징 세포가 목적 유전자를 포함한 감염성 바이러스 입자를 생성하게 된다. 이들 생산자 세포는 생체 내 세포의 설계 및 생체 내 폴리펩타이드의 발현을 위해 피험체에 투여된다. 유전자 치료의 개요를 위해 Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,(및 참고문헌) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 참조.
포뮬레이션 및 투여
용해성 형태의 GPR86 폴리펩타이드와 같은 펩타이드 및 작용제 및 길항제 펩타이드 또는 소분자가 적당한 약학적 담체와 결합하여 포뮬레이트된다. 이러한 포뮬레이션은 치료적으로 효과적인 양의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 포뮬레이션은 투여 형태를 만족시켜야 하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 본 발명자는 하나 이상의 상기 기술된 조성물 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함한 약학적 팩 및 키트를 기술한다.
GPR86 폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 이용된다.
약학적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복막내와 같은 다른 경로 주사도 이용될 수 있다. 전신 투여의 대안적 수단은 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세정제를 포함한다. 더욱이 창자용 또는 캡슐화된 포뮬레이션으로 적당히 포뮬레이트되는 경우 구강 투여도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국부적이 되고/또는 집중화된다.
필요한 용량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 경로, 포뮬레이션 성질, 피험체 조건의 특성 및 주치의의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 용량은 피험체의 0.1∼100 ㎍/kg의 범위이다. 그러나 유용한 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 다른 효율의 견지에서 필요한 용량 내의 광범위한 변화가 예측된다. 예를 들어 구강 투여는 정맥주사에 의한 투여보다 더 높은 용량을 요구한다. 이들 용량 수준 상의 차이는 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 최적조건을 위한 표준 경험상 관례를 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 사용되는 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 "유전자 치료"로 표기되는 치료 양상으로 피험체 내에서 내인적으로 생성될 수 있다. 따라서 예를 들어 피험체 유래의 세포는 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터의 이용에 의해 생체 외에서 폴리펩타이드를 인코드하기 위해 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다. 이후 세포는 피험체 내로 도입된다.
약학적 조성물
또한 본 발명자는 약학적으로 효과적인 양의 GPR86 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 벡터 또는 그의 항체 및 선택적으로는 약제적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합을 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 개시한다.
약학적 조성물은 인간 및 가축 약물에서 인간 또는 동물 용도가 되고 일반적으로 하나 이상의 약학적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료제로서 수용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도된 경로 및 표준 약학적 실습에 따라 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약학적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르빈산, p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/포뮬레이션 필요조건이 존재한다. 예로서 여기서 기술된 약학적 조성물은 조성물이 미니-펌프를 이용하거나 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능 용액에 의해 또는 조성물이 전달을 위해 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주사형태로 포뮬레이트된 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 대안으로 포뮬레이션은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 고안된다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통과하는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질 분해성 분해에 저항적이고 산 pH에 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리 형태로 흡입에 의해, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말 형태 및 피부 패취의 이용에 의해 국부적으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 포함한 정제 형태 또는 캡슐 또는 오불(ovule) 단독 또는 부형제와 결합된 형태 또는 향미제 또는 착색제를 함유한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액 형태로 투여될 수 있거나, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하와 같은 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 예를 들어 혈액과 등장액을 생성기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 함유한 멸균 수용액 형태로 사용되는 것이 최상이다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 편리한 형태로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge) 형태로 투여된다.
백신
또다른 실시태양은 GPR86 관련 질환으로부터 상기 동물을 보호하기 위해 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기에 충분한 GPR86 폴리펩타이드 또는 그의 단편으로 포유류를 접종시키는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 질병으로부터 상기 동물을 보호하도록 이러한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 GPR86 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 GPR86 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 GPR86 폴리펩타이드 또는 GPR86 유전자를 포함한 조성물이 포유류 숙주 내로 도입시 GPR86 폴리펩타이드에 대해 포유류 내에서 면역 반응을 유도하는 면역적/백신 포뮬레이션(조성물)에 관한 것이다. 백신 포뮬레이션은 적당한 담체를 더욱 포함한다.
GPR86 폴리펩타이드가 위에서 분해되기 때문에 바람직하게는 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 피내 등의 주사를 포함) 투여된다. 비경구적 투여에 적당한 포뮬레이션은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 포뮬레이션이 수용체의 혈액과 등장성을 이루게 하는 용질을 함유한 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 농화제를 포함한 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위-투여 또는 다중-투여 용기로 제공되고, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체의 첨가가 필요한 동결-건조 조건으로 보관된다. 또한 백신 포뮬레이션은 오일-인 워터 시스템 및 당분야에 알려진 다른 시스템과 같은 포뮬레이션의 면역원성을 증가시키기 위한 보강 시스템을 포함한다. 용량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이고 일반 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
백신은 하나 이상의 GPR86 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 제조된다.
활성 성분(들)로서 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 펩타이드(들)을 포함한 백신의 제조는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 똔느 현탁액과 같은 주사제로서 제조되고; 주사 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태로도 제조된다. 또한 제제는 에멀젼화되거나 리포솜 내에 캡슐화된 단백질이다. 활성 면역원성 성분은 약학적으로 수용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 유효성을 증가시키는 보조제와 같은 최소량의 보조 물질을 포함한다. 효과적인 보조제의 예는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 표기), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴록시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 표기), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 내에 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디마이콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함한 RIBI.
보조제 및 다른 약제의 또다른 예는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄(백반), 황산베릴리움, 실리카, 카올린, 탄소, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 무라밀 디펩타이드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르붐(프로피오노박테리움 아크네스(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오타이드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포솜, 레바미솔, DEAE-덱스트란, 차단된 코폴리머 또는 다른 합성 보조제를 포함한다. 이러한 보조제는 예를 들어 Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는 Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)와 같은 다양한 원료로부터 상업적으로 구입 가능하다.
일반적으로 Amphigen(오일-인-워터), Alhydrogel(수산화알루미늄) 또는 Amphigen과 Alhydrogel의 혼합물과 같은 보조제가 사용된다. 수산화알루미늄만이 인간 용도로 승인된다.
면역원 및 보조제의 비율은 효과적인 양으로 존재하는 한 광범위한 범위로 변화될 수 있다. 예를 들어 수산화알루미늄은 백신 혼합물의 약 0.5%의 양으로 존재할 수 있다(Al2O3 기초). 편리하게는 백신은 0.2∼200 ㎍/ml, 바람직하게는 5∼50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 15 ㎍/ml 범위의 최종농도의 면역원을 포함하도록 포뮬레이트된다.
포뮬레이션 후 백신은 멸균 용기에 포함된 후 밀봉되고 예를 들어 4℃와 같은 저온에서 보관되거나 동결-건조된다. 동결건조는 안정한 형태로 장기간 보관을 가능하게 한다.
백신은 통상적으로 피하로 또는 근육내로 같은 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약을 포함하고, 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
환자로의 구강 투여를 위한 캡슐, 정제 및 환약은 예를 들어 Eudragit "S", Eudragit "L", 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함한 장 코팅제와 함께 제공된다.
GPR86 폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 포뮬레이트된다. 약학적으로 수용 가능한 염은 산 첨가 염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)을 포함하고 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 수산, 주석산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된다. 또한 자유 카르복실기로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래된다.
투여
일반적으로 의사는 피험 개체에 가장 적당한 실질적인 용량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 하기 용량은 평균 사례의 예이다. 물론 더 높거나 더 낮은 용량 범위가 적당한 개인적 경우도 존재한다.
여기서 기술된 약학적 및 백신 조성물은 직접 주입에 의해 투여된다. 조성물은 비경구적, 점막, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내 또는 경피성 투여를 위해 포뮬레이트된다. 일반적으로 각각의 단백질은 0.01∼30 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg 체중의 용량으로 투여된다.
"투여된"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스성 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜 리포펙틴, 양이온 안면 양친매성물질(CFA) 및 이들의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메커니즘의 경로는 점막, 비강, 구강, 비경구, 위장, 국부 또는 설하 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투여된"이라는 용어는 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취 용액과 같은 점막 경로; 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주입 가능 형태에 의해 전달되는 비경구 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여된"이라는 용어는 예를 들어 GPR86 폴리펩타이드 및 보조제와 같은 추가 실체 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역체계의 필요한 조절이 달성되게 하는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 보조제가 동일한 순간 및 동일한 사이트에 투여되는 경우 폴리펩타이드를 보조제와 다른 시간 및 다른 사이트에 투여하는 것보다 이점이 있다. 폴리펩타이드 및 보조제는 동일한 전달 운반체 내에서 전달되고 - 폴리펩타이드 및 항원은 결합되고/또는 결합되지 않고/또는 유전적으로 결합되고/또는 결합되지 않는다.
GPR86 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 그의 항체 및 선택적으로는 보조제는 단일 투여 또는 다수 투여로 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
백신 조성물 및 약학적 조성물은 주입(비경구, 피하 및 근육내 주입), 비강내, 점막, 구강, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 많은 다른 경로에 의해 투여된다.
여기서 기술된 백신 및 약학적 조성물은 통상적으로 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약 및 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
또다른 관점
본 발명의 또다른 관점 및 실시태양은 하기 항에 나타나 있고; 본 발명이 이들 관점을 포함함이 이해되어야 한다.
1항. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 GPR86 폴리펩타이드
2항. 1항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
3항. 2항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
4항. 1항에 따른 폴리펩타이드의 단편을 포함한 폴리펩타이드
5항. 3항에 있어서, 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 상동적인 하나 이상의 영역을 포함하거나 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 이형적인 하나 이상의 영역을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드
6항. 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
7항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산을 포함한 벡터
8항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 숙주 세포
9항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 형질전환 비-인간 동물
10항. 9항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
11항. G 단백질 결합 수용체와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드의 이용
12항. G 단백질 결합 수용체와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 9항 또는 10항에 따른 형질전환 비-인간 동물의 이용
13항. 후보 화합물에 GPR86 수용체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 세포 내 환상 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 증가되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 세포 내 환상 AMP의 내인성 수치를 증가시키는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
14항. 후보 화합물에 GPR86 수용체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 세포 내 환상 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 세포 내 환상 AMP의 내인성 수치를 저하시키는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
15항. 후보 화합물에 GPR86 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
16항. 11항 내지 15항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물
17항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물
18항. 항체의 제조 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산의 이용
19항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체
20항. 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 하나 이상의 하기를 포함한 약학적 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
21항. 하나 이상의 하기를 포함한 백신 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
22항. 하나 이상의 하기를 포함한 질병 또는 질병 감수성에 대한 진단 키트: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
23항. 환자에게 GPR86의 길항제를 투여하는 단계를 포함한 증가된 GPR86 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
24항. 환자에게 GPR86의 작용제를 투여하는 단계를 포함한 감소된 GPR86 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
25항. 23항 또는 24항에 있어서, 상기 GPR86은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 방법
26항. 하나 이상의 하기를 환자에게 투여하는 단계를 포함한 환자 질병의 치료 및/또는 예방 방법: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 19항에 따른 항체; 20항에 따른 약학적 조성물; 및 20항에 따른 백신
27항. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 이용하기 위한 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체를 포함한 약제
28항. 질병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 제조시 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체의 이용
29항. 형질전환 동물이 변화된 GPR86 유전자를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 동물
30항. 29항에 있어서, 상기 변화는 GPR86의 결실, 기능 손실을 유발하는 GPR86의 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이를 포함한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 GPR86 내로의 도입, 또다른 종으로부터의 외인성 유전자의 GPR86 내로의 도입 및 이들의 결합으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물
31항. 형질전환 동물이 그의 게놈 내에서 이형성 GPR86 단백질을 인코드하는 트랜스유전자를 포함하고 발현하는, 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 비-인간 형질전환 동물
32항. (a) 비-상동성 대치 부분; (b) 첫 번째 GPR86 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 (c) 두 번째 GPR86 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연발생적 내인성 GPR86 유전자 내에서 첫 번째 GPR86 유전자 서열의 다운스트림 위치를 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함한, 숙주 세포 내 GPR86 유전자를 기능적으로 분열시키는 핵산 컨스트럭트
33항. GPR86 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산이 발현되는 조건 하에서 8항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 제조 방법
34항. 표본을 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 존재의 검출 방법
35항. 표본을 19항에 따른 항체에 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 존재의 검출 방법
36항. GPR86의 증가되거나 감소되거나 비정상적인 발현에 의해 유발되거나 이에 관련된 질환의 진단 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 동물 내에서의 GPR86 발현 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
36항. 제 22항에 따른 키트, 제 23항 내지 제 26항의 어느 한 항에 따른 방법, 제 27항에 따른 약제, 제 28항에 따른 이용 또는 제 36항에 따른 방법에 있어서, 상기 질환은 염증성 장애, 바람직하게는 염증성 질환(즉, 류마티스관절염, 다발경화증, 길랑-바레 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 이식편대숙주병, 전신홍반루푸스 또는 인슐린-의존성 당뇨병), 자가면역질환(즉, 독소충격증후군, 골관절염, 당뇨병 또는 염증성 내장 질환), 급성 통증, 만성 통증, 신경성 통증, 접촉피부염, 죽상동맥경화증, 사구체신염, 재관류 손상, 골 흡수 질환, 천식, 뇌졸중, 심근경색증, 열손상, 성인성 호흡곤란증후군(ARDS), 외상후 2차 다발 기관 손상, 급성 염증성 성분 동반 피부병, 급성 화농성 수막염, 괴사성 장결장염, 혈액투석 관련 증후군, 패혈쇼크, 류코페리시스(leukopherisis), 과립세포 수혈, 연기 흡입에 의해 유발된 폐의 급성 또는 만성 염증, 자궁내막증, 베체트병, 포도막염, 강직성 척추염, 췌장염, 암, 라임 질환, 경피경혈관확장술후 재협착, 알츠하이머병, 외상성 관절염, 패혈증, 만성폐쇄성폐질환, 울혈성심장기능상실, 골다공증, 악액질, 파킨슨병, 치주질환, 통풍, 알레르기 질환, 연령관련황반변성, 감염 및 낭성섬유증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트, 방법, 약제 또는 이용
도 1은 pfam의 HMM 구조 예측 소프트웨어(http://www.sanger.ac.uk/Software /Pfam/search.shtml)를 이용한 인간 GPR86 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 넉아웃 플라스미드의 도면이다.
도 3은 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 생성된 인간 GPR86의 발현 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 4는 GPR86 넉아웃 마우스 대비 야생형 동물로부터의 결과를 나타내는 꼬 리 튀기기 시험(Tail Flick Test) 데이터의 그래프이다.
도 5는 GPR86 넉아웃(백색) 대비 야생형 동물(흑색)로부터의 발 폭의 증가 비율로 표기된 결과를 나타낸 포르말린 시험 데이터의 그래프이다.
도 6은 전자 본 프라이(Von Frey) 시험 결과의 그래프이다(-/- 넉아웃 동물; =/= 야생형 대조군).
도 7은 많은 인간 유래 조직에서의 GPR86 발현의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다. 레인 1: 골수; 레인 2; 흉선; 레인 3: 림프절; 레인 4; Jurkat CD4+; 레인 5: Myla CD8+; 레인 6: Colo 720; 레인 7: THP1; 레인 8: 골모세포; 레인 9: 연골세포; 레인 10: 음성 대조군; 레인 11: 양성 대조군(뇌).
도 8은 많은 마우스 유래 조직에서의 GPR86 발현의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다. 레인 1: 비장; 레인: 2: 타액선; 레인 3: 척수; 레인 4: 근육; 레인 5: 혀; 레인 6: 난소; 레인 7: 췌장; 레인 8: 지방; 레인 9: 고환; 레인 10: 심장; 레인 11: 눈; 레인 12: 폐; 레인 13: 신장; 레인 14: 흉선; 레인 15: 위장+SI; 레인 16: 뇌; 레인 17: 간+Gb; 레인 18: 혈액; 레인 19: 방광; 레인 20: 부신; 레인 21: G57BL6J 게놈 DNA; 레인 22: 129SvEv 게놈 DNA.
서열목록
서열번호: 1은 인간 GPR86의 cDNA 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 서열번호: 1 유래의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 3은 인간 GPR86의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 4는 마우스 GPR86 cDNA의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 5는 마우스 GPR86의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 6은 인간 GPR86의 대안적 cDNA 서열을 나타낸다. 서열번호: 7은 인간 GPR86의 대안적 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 8-20은 넉아웃 플라스미드 프라이머 서열을 나타낸다. 서열번호: 21은 넉아웃 플라스미드 서열을 나타낸다.
(실시예 1) 형질전환 GPR86 넉아웃 마우스: GPR86 유전자 타겟 벡터의 구축
GPR86 유전자를 포함한 PAC는 코딩 서열 섹션 유래의 방사성동위원소 표지 프로브를 이용하여 PAC 라이브러리로부터 확인된다. 8.0 kb 게놈 컨티그(contig)는 GeneWalker(Clontech)와 유사한 인-하우스(in-house) 제한 사이트 고정 PCR 방법을 이용하여 조립되었다. 또한 생물정보학적 작업은 컨티그 크기를 300 kb로 증가시켰다. 이러한 컨티그는 상동성 팔의 고안이 타겟 벡터 내로 클론될 수 있게 하는 충분한 측면 서열 정보를 제공하였다.
쥐과 GPR86 유전자는 1개 코딩 엑손을 지닌다. 타겟 전략은 주요 막횡단 도메인 전체를 포함한 코딩 서열 대부분을 제거하도록 고안된다. 구역의 측면에 위치한 3.9 kb 5'상동성 팔 및 1.2 kb 3' 상동성 팔은 PCR에 의해 증폭되고 단편은 타겟 벡터 내로 클론된다. 팔을 증폭시키는데 사용되는 각 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단은 절단이 드문 제한 효소에 대한 다른 인식 사이트를 포함하고 벡터 폴리링커의 클로닝 사이트와 양립 가능하고 팔 자체가 결손되도록 합성된다. GPR86의 경우 프라이머는 Sal/Not의 5' 팔 클로닝 사이트 및 Asc/Mfe의 3' 팔 클로닝 사이트(관련 제한 사이트를 포함한 사용된 타겟 벡터의 구조가 도 2에 나타나 있다)를 지니고 하기 프라이머 표에 기입된 바와 같이 고안된다.
팔 프라이머쌍(5'armF/5'armR) 및 (3'armF/3'armR)에 더하여 GPR86 좌위에 대해 특이적인 또다른 프라이머가 하기 목적으로 고안된다: 분리된 추정 타겟 클론 내에서 타겟된 좌위의 서던 분석을 가능하게 하기 위해 각 팔 외부 및 그 이상으로 연장된 비-반복 게놈 DNA의 2개의 짧은 150∼300 bp 단편을 증폭시키는 5' 및 3' 프로브 프라이머쌍(5'prF/5'prR 및 3'prF/3'prR); 벡터 특이적 프라이머, 이러한 경우에는 Asc350과 함께 다중 PCR에 사용시 야생형, 이형접합성 및 동형접합성 마우스 사이의 구별을 가능하게 마우스 유전형 프라이머쌍(hetF 및 hetR); 및 마지막으로 벡터(TK5IBLMNL)의 3' 말단에 특이적인 프라이머, 이러한 경우 Asc236과 쌍을 이룰 때 3' 팔 구역 말단의 다운스트림을 어닐하고(anneal) 타겟 이벤트 특이적 1.25 kb 증폭기를 생성하는 타겟 선별 프라이머(3'scr). 바람직한 게놈 변화가 발생하고 무작위로 통합된 벡터 카피를 포함한 클론 배경으로부터 정확히 타겟된 세포의 확인을 가능하게 하는 경우 이러한 증폭기는 세포 유래의 주형 DNA로부터 유래될 수 있다. 타겟 전략에 사용된 이들 프라이머의 위치 및 GPR86 좌위 구역의 게놈 구조는 서열번호: 21에 나타나 있다.
Figure 112006090691612-PCT00002
상동성 팔의 위치는 GPR86 유전자를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 타겟 벡터는 결실되는 GPR86 영역이 GPR86 유전자와 동일한 방향으로 배열된 촉진된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내인성 유전자 발현 수용체(프레임 독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 대치되도록 제조된다.
5' 및 3' 상동성 팔이 타겟 벡터 TK5IBLMNL 내로 클론되면(도 2 참조) 표준 분자생물학 기술을 이용하여 크고 매우 순수한 DNA 제제가 제조된다. 신선하게 준비된 무-내독소 DNA 20 ㎍이 암피실린 저항성 유전자와 박테리아의 복제 기원 사이의 벡터 백본 내에 특정 사이트에 존재하는 또다른 절단이 드문 제한효소 SwaI로 제한된다. 이후 선형화된 DNA가 침전되고 일렉트로포레이션을 위해 100 ㎕의 인산 완충 식염수 내에 재현탁된다.
일렉트로포레이션 24시간 후 트랜스펙트된 세포는 200 ㎍/ml 네오마이신을 함유한 배지 내에서 9일간 배양된다. 상동성 재조합이 내인성 GPR86 유전자와 타겟 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 클론은 96웰 플레이트 내로 수집되고 PCR(상기 기술된 프라이머 3'scr 및 Asc236을 사용하여)에 의해 선별되기 전에 복제되고 팽창된다. 양성 클론은 1∼5%의 비율로 확인될 수 있다. 이들 클론은 팽창되어 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 이용하여(Russ et al, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99) 제조된 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 복사체가 동결되고 충분히 우수한 질의 DNA게 제조될 수 있게 한다. 진단 제한효소로 분해된 DNA의 서던 블럿이 외부 프로브와 하이브리다이즈되면 상동적으로 타겟된 ES 세포 클론은 돌연변이 밴드뿐만 아니라 변화되지 않은 야생형 밴드의 존재에 의해 증명된다. 예를 들어 5' 프로브를 이용하여 HindⅢ으로 분해된 게놈 DNA는 14.9 kb 야생형 밴드 및 12.0 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이고; 3' 프로브를 이용하여 HinDⅢ 절단 DNA는 14.9 kb 야생형 밴드 및 7.0 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이다.
(실시예 2) 형질전환 GPR86 넉-아웃 마우스: GPR86 결함 마우스의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포가 임신 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포 당 주입되고 7∼8개 배반포가 가임신된 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 일부 높은 수준(100%까지)의 아구티 수컷(아구티 외피색은 타켓된 클론으로부터 유전된 세포의 기여를 나타냄)을 포함하여 태어난다. 이들 수컷 키메라는 암컷 MF1 및 129 마우스와 교미되고 생식계열 전달은 각각 아구티 외피색 및 PCR 유전형에 의해 측정된다.
PCR 유전형분석은 세 번째 벡터 특이적 프라이머(Asc350)와 함께 프라이머 hetF 및 hetR을 이용하여 용해된 꼬리 클립 상에서 수행된다. 이러한 다중 PCR은 207 bp 밴드를 제공하는 프라이머 hetF 및 hetR로부터 야생형 좌위(존재하는 경우)로부터의 증폭을 가능하게 한다. hetF에 대한 사이트는 넉아웃 마우스 내에서 결실되고, 따라서 이러한 증폭은 타겟된 대립유전자로부터 실패될 것이다. 그러나 Asc350 프라이머는 3' 팔의 바로 내부의 영역을 어닐하는 hetR 프라이머와 결합하여 타겟된 좌위로부터 380 bp 밴드를 증폭시킬 것이다. 따라서 이러한 다중 PCR은 하기와 같은 새끼의 유전형을 나타낸다: 야생형 표본은 단일 207 bp 밴드를 나타내고; 이형접합성 DNA 표본은 207 bp 및 380 bp의 2개 밴드를 산출하고; 동형접합성 표본은 타겟 특이적 380 bp 밴드만을 나타낼 것이다.
(실시예 3) 생물학적 데이터: RT-PCR 유전자 발현 패턴
RT-PCR을 이용하여 유전자 발현이 간 및 백혈구에서 관찰되었다(도 3)
(실시예 4) 생물학적 데이터: RT-PCR에 의한 GPR86의 발현
GPR86 mRNA의 발현은 인간 및 마우스 유래의 cDNA 라이브러리를 이용한 RT-PCR을 이용하여 조사되었다. 인간 서열의 경우 하기 프라이머
전방 5'-GGTGTTTGTTCACATCCCCAGC-3'
역방 5'-TGGTGTTGCTTCCTTGTTGCTC-3'
가 364 bp의 생성물을 제공하는데 이용될 수 있다.
반응 조건은 하기와 같다:
85℃ 뜨겁게 시작
94℃ 15초
60℃ 30초 40 사이클
72℃ 60초
4℃ 정치
생성물은 에티듐 브로마이드를 함유한 Tris 아세트산 EDTA 아가로스 겔 상에서 분리되고 UV 광원을 이용하여 관찰되었다.
인간 유래 조직 및 세포 내 발현(도 7)은 골수, 흉선, 림프절, 골모세포 및 연골세포에서 관찰되었다. 또한 모두 T-세포 유래인 인간 유래 세포주 Jurkat CD4+ 및 Myla CD8+에서도 관찰되었다. 낮은 수준의 발현은 백혈구 유래의 Colo720 및 단핵세포 유래의 THP1 세포에서 관찰되었다.
마우스 조직에서(도 8) 발현은 비장, 침샘, 척수, 혀, 지방, 고환, 심장, 눈, 폐, 신장, 흉선, 위장 및 소장, 뇌, 간 및 쓸개, 혈액, 방광 및 부신에서도 관찰되었다.
GPR86의 발현은 면역 반응성 세포 유래의 세포를 포함하였고 이는 GPR86이 통증의 염증성 측면 및 신경성 측면에 관련된 면역 세포 기능에 관련됨을 의미한다.
(실시예 5) GPR86 넉-아웃 마우스 내 외부 자극 및 통증(무통 시험)에 대한 민감도 시험: 꼬리 튀기기 시험
꼬리 튀기기 무통 시험은 꼬리-튀기기 무통 측정기를 이용하여 수행된다. 이러한 장치는 설치류에서 통증 민감도를 정확하고 재현가능하게 측정하는 방법에 이용 용이성을 제공한다(D'Amour, F.E. and D.L. Smith, 1941, Expt. Clin. Pharmacol., 16: 179-184). 이러한 기구는 열원으로서 셔터-제어되는 램프를 지닌다. 램프는 덜 제한적인 환경을 제공하기 위해 동물 아래에 위치한다. 꼬리 튀기기는 자동 검출 회로에 의해 검출되고 이는 동물을 손으로 조종하지 않게 한다. 동물은 환기되는 튜브 내에 감금되고 그의 꼬리는 장치의 상부 상의 검출 홈에 위치한다.
셔터의 개방을 통한 꼬리로의 강한 광의 활성화는 동물이 광선 외부로 꼬리를 튀기는 경우 일부 지점에서 불쾌감을 유발한다. 자동화 방식에서 광-감지기는 시계가 정지되게 하고 셔터가 폐쇄되게 하는 꼬리 움직임을 감지한다. 셔터의 개방과 동물의 반응 사이에 경과된 총 시간이 기록된다.
돌연변이 형질전환 마우스의 반응은 연령 및 성 매치된 야생형 마우스와 비교된다. 단일 동물은 55℃ 이하의 꼬리 온도내 증가를 생성하기 위해 다른 열로 셋팅된다.
넉아웃 및 야생형 대조군 동물은 꼬리 튀기기 장치에서 시험된다. 야생형 대조군(5.95±0.28초)과 비교시 넉아웃 동물(6.88±0.26초)에서 꼬리 철수 잠복기 사이에 유의적인 차이가 존재한다. 따라서 넉아웃 동물은 야생형 동물보다 덜 민감하다(도 4).
(실시예 6) GPR86 넉-아웃 마우스 내 외부 자극 및 통증(무통 시험)에 대한 민감도 시험: 포르말린 시험
포르말린 시험은 뒷발에 유독성 물질 주입에 대한 반응을 측정한다. 5% 포르말린 용액 20 ㎕ 부피가 뒷발등 표면에 피하로 미세 게이지 주사를 통해 주입된다. 뒷발은 핥거나 흔들거나 물어뜯는 행동의 누적 초수로서 측정된다. 평가 등급이 이용된다: 1 = 포르말린 주입된 발이 적은 중량의 바닥 위에 가볍게 놓임; 2 = 주입된 발이 올려짐; 3 = 주입된 발이 핥아 지거나 물어뜯기거나 흔들림.
반응의 2가지 양상이 포르말린 시험에서 관찰된다. 양상 1은 주입 직후 시작되고 약 10분간 지속되고 이는 통증 섬유로부터의 급성 폭발을 나타낸다. 양상 2는 주입후 약 20분에 시작되고 약 1시간 동안 지속된다. 이러한 양상은 염증성 통각과민을 포함한 조직 손상에 대한 반응을 나타낸다.
GPR86 돌연변이는 포르말린 시험으로 시험되고 주입된 발의 핥기, 물어뜯기 또는 흔들기 횟수에 의해 측정시 덜 반응적인 것으로 나타났다. 또한 주입된 포르말린에 반응한 발의 염증성 부종도 야생형 부종과 비교시 KO 마우스에서 12%까지 감소된다(도 5).
(실시예 7) GPR86 넉-아웃 마우스 내 외부 자극 및 통증(무통 시험)에 대한 민감도 시험: 본 프라이 헤어 시험
통증 역치를 측정하는데 이용되는 접촉 시험은 본 프라이 헤어(Von Frey hair)를 이용한다. 이들 헤어는 매우 미세한 규격의 눈금이 정해진 철사 세트이다. 기계적 자극에 대한 철수 역치가 측정된다. 동물은 표면이 넓은 규격의 철사 그물인 상승된 플랫폼에 세워진다. 뒷발의 하부표면을 찌르기 위해 본 프라이 헤어는 그물 구멍을 통해 아래에서 위로 삽입된다. 역치에서 마우스는 헤어로부터 그의 발을 튀김으로서 반응한 후; 일반적으로 발을 들어 올리거나 발을 핥거나 발성을 한다. 기계적 철수 역치는 시도의 2/3으로 철수 반응을 유도하는 최소 규격 철사 자극으로 정의된다.
넉아웃 및 야생형 대조군 동물은 전자 본프라이(Electronic Vonfrey)(뒷발 각각 5회 시험)로 시험된다. 야생형 대조군(5.2±0.2초)과 비교시 넉아웃 동물(5.9±0.2초)은 발 철수 잠복기 사이에 유의적인 차이(p=0.03, t 테스트)가 존재한다. 따라서 넉아웃 동물은 야생형보다 덜 민감하다(도 6).
(실시예 8) GPR86 넉-아웃 마우스 내 외부 자극 및 통증(무통 시험)에 대한 민감도 시험: 신경성 통증
신경성 통증은 마비된 마우스의 L5 척수신경을 단단하게 결찰함으로서 유도될 수 있다(Kim and Chung 1992). 이후 신경성 통증의 회복 전개 및 유지는 이질통증(무해성 자극에 대한 통증 인지) 또는 통각과민(유해성 자극에 대한 증가된 반응)의 관점에서 측정될 수 있다.
이질통증은 4주간의 기간에 걸쳐 본 프라이 필라멘트(실시예 7에 기술된 바와 같은)를 이용하여 측정된다. 뒷발 각각이 시험되고 동측성(손상면) 및 대측성(경험이 없는 면) 발 반응이 넉아웃 및 야생형 마우스 사이에서 비교되었다. 통각과민은 유해성 열, 유해성 냉기 및 유해성 기계 자극으로 시험될 수 있다. 두 시험 모두에서 마우스는 야생형 대조군보다 덜 민감한 것으로 나타났다.
본 출원서에서 언급된 각각의 출원 및 특허 및 심사중인 출원 및 특허를 포함한 상기 출원 및 특허 각각의 인용되거나 참고된 문헌("출원 인용 문헌") 및 각 출원 및 특허 및 출원 인용 문헌에서 인용되거나 언급된 생성물에 관한 제조하의 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서 내에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서 내에 인용된 문헌 내에서 인용되거나 참고된 모든 문헌 및 본 명세서 내에서 인용되거나 언급된 생성물의 제조사 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다.
상기 명세서에 기술된 모든 문헌은 참고문헌에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않고 이에 대한 많은 변형 및 추가가 본 발명의 범위 내에서 이루어짐이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 청구범위 내에 존재한다.
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360 atcgtgctgt tagggctcat agcctttgac agattcctca agatcatcag acctttgaga 420 aatatttttc taaaaaaacc tgtttttgca aaaacggtct caatcttcat ctggttcttt 480 ttgttcttca tctccctgcc aaatatgatc ttgagcaaca aggaagcaac accatcgtct 540 gtgaaaaagt gtgcttcctt aaaggggcct ctggggctga aatggcatca aatggtaaat 600 aacatatgcc agtttatttt ctggactgtt tttatcctaa tgcttgtgtt ttatgtggtt 660 attgcaaaaa aagtatatga ttcttataga aagtccaaaa gtaaggacag aaaaaacaac 720 aaaaagctgg aaggcaaagt atttgttgtc gtggctgtct tctttgtgtg ttttgctcca 780 tttcattttg ccagagttcc atatactcac agtcaaacca acaataagac tgactgtaga 840 ctgcaaaatc aactgtttat tgctaaagaa acaactctct ttttggcagc aactaacatt 900 tgtatggatc ccttaatata catattctta tgtaaaaaat tcacagaaaa gctaccatgt 960 atgcaaggga gaaagaccac agcatcaagc caagaaaatc atagcagtca gacagacaac 1020 ataaccttag gctgacaact gtacataggg ttaacttcta tttattgatg agacttccgt 1080 agataatgtg gaaatcaaat ttaaccaaga aaaaaagatt ggaacaaatg ctctcttaca 1140 ttttattatc ctggtgtaca gaaaagatta tataaaattt aaatccacat agatctattc 1200 ataagctgaa tgaaccatta ctaagagaat gcaacaggat acaaatggcc actagaggtc 1260 attatttctt tctttctttt tttttttttt aatttcaaga gcatttcact ttaacatttt 1320 ggaaaagact aaggagaaac gtatatccct acaaacctcc cctccaaaca ccttctcaca 1380 ttcttttcca caattcacat aacactactg cttttgtgcc ccttaaatgt agatatgtgc 1440 tgaaagaaaa aaaaaacgcc caactcttga agtccattgc tgaaaactgc agccaggggt 1500 tgaaagggat gcagacttga agagtctgag gaactgaagt gggtcagcaa gacctctgaa 1560 atcctgggta aaggattttc tccttacaat tacaaacagc ctctttcaca ttacaataat 1620 ataccatagg aggcacaagc accattatta agccactttg cttacacctt aagtgtgtac 1680 aattcaagtg tgagaatgct gtgttaacta ttctttggaa ttctccttct gtccagcaaa 1740 tactctaatg atggttaaac atggcaccta ctcagcaatg ccttcctgga ccacaacccc 1800 tatccccctg ccccaccctc ctcattaaaa acaaatactt ctactgtttg ggtgtgtgat 1860 agggttctca atgcagatct cccttttcta gttagctata ttcttgactg catccgctaa 1920 aaatgttaaa gcttcttgag agacagacat gccagatttt cttggtatct cccataatac 1980 gacctacagt ccatggtcta cagatgtttt aaatagaatt gctattctcg atacatacaa 2040 agacgtaatt gctgacccac aatcagtaac atccatattg ggagattttt caaaggatgg 2100 tgaccctgct tgtatttatt taccttggta ttttttcttg catccttctg tgattcaaaa 2160 aagtaaaatg tggctttctg aaatgatgga taagagtcta catcttctag aaaaaataca 2220 taaaggagta gttaagctct gtaaatgtgc cacgagctcc aacacgacca tcgtagggtg 2280 aagcccacgt tttcttccat ggcctcaaag gccctagaac ttgcctacct ttctggcctt 2340 acctcctagc tacttatcca tctcttgaac tttatactct tgtataaatt tctaactttc 2400 agaaaatgcc atactctgtt ttggcaccac acatgtatat ttccccctgg tacacttgga 2460 agactcttat ccatctgtga aaccctatgt tgtcatcact tggtccatga aatattacct 2520 ggccaatatc ccaccatcac ctcaaaccca atcaccccct cctctgtatg ctgtcacacc 2580 tatattatta aacttatcac attgcattgt aattacttcc tgacctttgt atctactctt 2640 ttagtaactg atgtatatat ctgaaaggag agattgtttc attgtgcaat caataaatgt 2700 ttgataaaat aaagccc 2717 <210> 7 <211> 333 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Asn Thr Thr Val Met Gln Gly Phe Asn Arg Ser Glu Arg Cys Pro 1 5 10 15 Arg Asp Thr Arg Ile Val Gln Leu Val Phe Pro Ala Leu Tyr Thr Val 20 25 30 Val 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cctgtatcaa tcattgactc ttggcataag gacttcagga tgaagtgaac 2460 cactccagct gctctctcag gggtgtggtg gggttgggac cgaagaaaaa ggacatagtt 2520 agtaactgag aaccgtattc ctgaagtcct acttcacttg gtgaggtcga cgagagagtc 2580 cccacaccac cccaaccctg aaggcaggct ctaagtgcaa attctagggc ccagtggtaa 2640 gttagtggtg gtctctatta ccactatttt gggaaggtgc ttaatttctt cattttgatt 2700 ttccgtccga gattcacgtt taagatcccg ggtcaccatt caatcaccac cagagataat 2760 ggtgataaaa cccttccacg aattaaagaa gtaaaactaa ttcacatcta aaataagact 2820 ggactatgtt gttattgtaa gggctgtgat aacatagtta cctataatac catagctatt 2880 tttattttat tactttgagt aagtgtagat tttattctga cctgatacaa caataacatt 2940 cccgacacta ttgtatcaat ggatattatg gtatcgataa aaataaaata atgaaactca 3000 ctattcttag tgcataaaag aattccagtc tttaatttat tccagtcttt aaattattca 3060 gcaggctcct aaacactgaa acttttcaat gcatggggtt gataagaatc acgtattttc 3120 ttaaggtcag aaattaaata aggtcagaaa tttaataagt cgtccgagga tttgtgactt 3180 tgaaaagtta cgtaccccaa tttttgtttg tttgtttgtt tgtttgtttt tgtttgtttt 3240 ttgtttttta gttcttcctt cccggccttc gtgaactaat aagcccacag tattcctatt 3300 aaaaacaaac aaacaaacaa acaaacaaaa acaaacaaaa aacaaaaaat caagaaggaa 3360 gggccggaag cacttgatta ttcgggtgtc ataaggataa ttctttttca ttgactgagg 3420 aagctcgcat gacatcgtcc atgacaggcc tcactgtgag catatgatgg acgttctttt 3480 acccctaact atatgaaaag aagaaaaagt aactgactcc ttcgagcgta ctgtagcagg 3540 tactgtccgg agtgacactc gtatactacc tgcaagaaaa tggggattga tatacttttc 3600 gacactgttg tgtatttcat cataaaaagg gggcaagtat ttcagagtga gtataaataa 3660 cttcccaaat gaggggaaca aaaagcgaca ggtggacaag ctgtgacaac acataaagta 3720 gtatttttcc cccgttcata aagtctcact catatttatt gaagggttta ctccccttgt 3780 ttttcgctgt ccacctgttc cccttggagc tacggcccgc agcttggaga tggcacttcc 3840 acacaggcct agggagcagc gtgcagagag gcccttccaa gaggaacagg ctttccaaca 3900 gggaacctcg atgccgggcg tcgaacctct accgtgaagg tgtgtccgga tccctcgtcg 3960 cacgtctctc cgggaaggtt ctccttgtcc gaaaggttgt aatatcagct aaggaactta 4020 ccaaggggag ctctcattta acaagtgtgt agtagttatg aagatgactc agctagagaa 4080 gaccaaccat gaccatgcag ttatagtcga ttccttgaat ggttcccctc gagagtaaat 4140 tgttcacaca tcatcaatac ttctactgag tcgatctctt ctggttggta ctggtacgtc 4200 agctcaatcc atgaaaccca catgttggaa agatataact aacccactga aggaaaacac 4260 acacacacat acacacacac tcacacactc acaataaata tcgagttagg tactttgggt 4320 gtacaacctt tctatattga ttgggtgact tccttttgtg tgtgtgtgta tgtgtgtgtg 4380 agtgtgtgag tgttatttat tgtatttcac aaccaaaaga atgtaccttt gtgaccctag 4440 aaatgtccat tgctgatcag ttcctctttt caaagtttcc cacatttggc attttgaaat 4500 acataaagtg ttggttttct tacatggaaa cactgggatc tttacaggta acgactagtc 4560 aaggagaaaa gtttcaaagg gtgtaaaccg taaaacttta ttgaccaaaa tgtgatttct 4620 acttctcata ttatgaaatt atcctgtaca gaatttccct tgtttaaagt aaaaatttcc 4680 agaccttcaa tgttatattg aactggtttt acactaaaga tgaagagtat aatactttaa 4740 taggacatgt cttaaaggga acaaatttca tttttaaagg tctggaagtt acaatataac 4800 gattgggggc tattgagaaa tttaaaattg actgtgttta tggttaaaat taacaataaa 4860 cctactttaa aatattgatt ttgctaggtt tttatcctct ctaacccccg ataactcttt 4920 aaattttaac tgacacaaat accaatttta attgttattt ggatgaaatt ttataactaa 4980 aacgatccaa aaataggaga tataaagcaa aaggatatat atttaagtta aggggcatta 5040 catcagtaaa tcctaacata ttttagccaa aaagaaaatt tttacaatgt gccatttatt 5100 atatttcgtt ttcctatata taaattcaat tccccgtaat gtagtcattt aggattgtat 5160 aaaatcggtt tttcttttaa aaatgttaca cggtaaataa ccctagagtt aaccaacgtt 5220 ccctggaaac acagtacatt tcattttaaa atgttcaaat gtggaatcaa tggattccaa 5280 attctcaacc aagtaatata gggatctcaa ttggttgcaa gggacctttg tgtcatgtaa 5340 agtaaaattt tacaagttta caccttagtt acctaaggtt taagagttgg ttcattatat 5400 ggaattacta gttagccaaa ccctgaagac ggtccatctc tacggtaagc gcgtggcaag 5460 aacggtgaag tgaaacttgc catagagaac cacacatcct ccttaatgat caatcggttt 5520 gggacttctg ccaggtagag atgccattcg cgcaccgttc ttgccacttc actttgaacg 5580 gtatctcttg gtgtgtagga ccccaggatc atctgatttc ctctttccct tcatctgtcg 5640 ggcagggaag cagactgtca cacattgtaa ctttctgcac actccctgag atttaaaacg 5700 ggggtcctag tagactaaag gagaaaggga agtagacagc ccgtcccttc gtctgacagt 5760 gtgtaacatt 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gcactggatt caatactcag aacacgcaac caataactac tggtaaatgc 7500 tggtgtacaa ttcttatacc gcaccaccgc acggacgtct cggccactgt cgtgacctaa 7560 gttatgagtc ttgtgcgttg gttattgatg accatttacg tccaaaggtc taaagacaaa 7620 gaggttctag aaaatgtggg tattacagaa gcccacaagg ggaaatgagg aaggaaaagc 7680 agtataagaa agcagaacct aggtttccag atttctgttt ctccaagatc ttttacaccc 7740 ataatgtctt cgggtgttcc cctttactcc ttccttttcg tcatattctt tcgtcttgga 7800 ttacttcaca agctattcgt gggttgagct agtaactgcc acaactcata cagctgagtc 7860 tcttccaaaa caaaggtcag tttaattttt cttatgaatt aatgaagtgt tcgataagca 7920 cccaactcga tcattgacgg tgttgagtat gtcgactcag agaaggtttt gtttccagtc 7980 aaattaaaaa gaatacttaa tgcttgctat aaaaggtaaa aggtggttaa attttctaga 8040 aatctaaata taatattctg taatcacggg ctgcaagcat aaggtacttc ataacgcatg 8100 acgaacgata ttttccattt tccaccaatt taaaagatct ttagatttat attataagac 8160 attagtgccc gacgttcgta ttccatgaag tattgcgtac acacactacc ctgtactctt 8220 acatcttaaa ttaggttctg tcaccgccgt gtagtgattg gtgcttgcta tttggacttc 8280 acaagggtag 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gggccaagag atatgacacc agaaggaccg tccgtaggac gacttgtggc 9180 accgggagac ccacaagcag cacatcccca gcaattccac ctttatcgtc tacctcaaga 9240 acactctggt ggcagacttg ataatggcac tcatgctgcc tttcaaaatc ctttccgact 9300 gtgtaggggt cgttaaggtg gaaatagcag atggagttct tgtgagacca ccgtctgaac 9360 tattaccgtg agtacgacgg aaagttttag gaaaggctga cacaccttgc gccctggcag 9420 ctccgaggat ttgtgtgcac gctctcctcc gtggtcttct atgagacgat gtatgtgggt 9480 atcatgatgc tgggcctcat gtgtggaacg cgggaccgtc gaggctccta aacacacgtg 9540 cgagaggagg caccagaaga tactctgcta catacaccca tagtactacg acccggagta 9600 cgctttcgac aggttcctca agatcatcat gccgttcagg aaaacctttg tcaaaaagac 9660 ggctttcgca aaaacagtct ccatttccgt ctggtccctg gcgaaagctg tccaaggagt 9720 tctagtagta cggcaagtcc ttttggaaac agtttttctg ccgaaagcgt ttttgtcaga 9780 ggtaaaggca gaccagggac atgttcttca tctccctgcc aaacatgatc ttgaacaagg 9840 aggcaacgcc atcatccgtg aagaagtgtg catctttgaa gagtcccctt gggctgtggt 9900 tacaagaagt agagggacgg tttgtactag aacttgttcc tccgttgcgg tagtaggcac 9960 ttcttcacac gtagaaactt ctcaggggaa cccgacacca ggcatcaggt ggtcagtcac 10020 acctgccagt tcattttctg ggctgtgttt attctgatgc ttctgtttta tgcggtgatt 10080 accaaaaagg tgtacaactc ccgtagtcca ccagtcagtg tggacggtca agtaaaagac 10140 ccgacacaaa taagactacg aagacaaaat acgccactaa tggtttttcc acatgttgag 10200 ctataggaag tttaggagta aggacagcag gcacaagcgg ctggaggtga aggtatttat 10260 cgtcatggct gtcttctttg tctgctttgc cccactgcat gatatccttc aaatcctcat 10320 tcctgtcgtc cgtgttcgcc gacctccact tccataaata gcagtaccga cagaagaaac 10380 agacgaaacg gggtgacgta tttgtcagaa taccatacac ttacagtcaa accaccaata 10440 agactgactg taggttagaa aaccagctgt ttattgctaa agaagcaact ctctttctgg 10500 aaacagtctt atggtatgtg aatgtcagtt tggtggttat tctgactgac atccaatctt 10560 ttggtcgaca aataacgatt tcttcgttga gagaaagacc caacaactaa catttgtatg 10620 gaccccttaa tatacataat tttatgcaag aagttcacac aaaaggtgcc atgtgtgaga 10680 tggggaaagg caagaacagc gttgttgatt gtaaacatac ctggggaatt atatgtatta 10740 aaatacgttc ttcaagtgtg ttttccacgg tacacactct acccctttcc gttcttgtcg 10800 aggatcaagc gaagaccacc acagtagtca gacagacaac atcaccctag cctgaccact 10860 gtgtcccaca ggttaatttc acgcatggcc tcacgtctat tcctagttcg cttctggtgg 10920 tgtcatcagt ctgtctgttg tagtgggatc ggactggtga cacagggtgt ccaattaaag 10980 tgcgtaccgg agtgcagata ttatggatgg gatttcaaaa gatcatttat gtggagacct 11040 catttaagca ttacaggaaa aaagagggga acaaacagtt ccctacattt tattatccta 11100 aatacctacc ctaaagtttt ctagtaaata cacctctgga gtaaattcgt aatgtccttt 11160 tttctcccct tgtttgtcaa gggatgtaaa ataataggat gtgtatggaa aaacattatg 11220 cccattttaa ccacatagac gtatttataa gcaggataaa ttaagagacc atgtaataca 11280 gcaaatggcc actagatgtc cacatacctt tttgtaatac gggtaaaatt ggtgtatctg 11340 cataaatatt cgtcctattt aattctctgg tacattatgt cgtttaccgg tgatctacag 11400 accttttcaa gggcattcat gtactatgga aaaggttaat gggaaacagg tttgcctgaa 11460 aaatcttcct tctagttacc accccaccat ctcttcacac tggaaaagtt cccgtaagta 11520 catgatacct tttccaatta ccctttgtcc aaacggactt tttagaagga agatcaatgg 11580 tggggtggta gagaagtgtg atatattccc taaaacacca ggctggcttt tacagccttc 11640 agaatgctga cacttgtgaa cagaaaccaa ccaacttgca tatccagtgc ctgtgtggaa 11700 tatataaggg attttgtggt ccgaccgaaa atgtcggaag tcttacgact gtgaacactt 11760 gtctttggtt ggttgaacgt ataggtcacg gacacacctt aggctaaggt gggggctcaa 11820 agagatgcag tctgaggaac caaagtgggt tggtcaaaat aaccccaggc atctcaaaag 11880 atttcctcct tacaagtgca tccgattcca cccccgagtt tctctacgtc agactccttg 11940 gtttcaccca accagtttta ttggggtccg tagagttttc taaaggagga atgttcacgt 12000 aagggctgct cctacatcta aacagagcac cagaagagag gcacatgcaa caggcaaagc 12060 cagttcacag ccatgtgcaa tccagagagg ggaagtgttt ttcccgacga ggatgtagat 12120 ttgtctcgtg gtcttctctc cgtgtacgtt gtccgtttcg gtcaagtgtc ggtacacgtt 12180 aggtctctcc ccttcacaaa agtcagcaaa accttcctgg gcaacagcat ctgcatcctg 12240 ttggaaaata cttatttccc tcactgttta tctataaatt aggttccttg ctacacactg 12300 tcagtcgttt tggaaggacc cgttgtcgta gacgtaggac aaccttttat gaataaaggg 12360 agtgacaaat agatatttaa tccaaggaac gatgtgtgac tcttatatta actgctttca 12420 ttcttagcca catttcccaa aaacagggtt cgtaaaaaga cagcaaaatc acacattttt 12480 acaaaagaaa tggggtaagg agaatataat tgacgaaagt aagaatcggt gtaaagggtt 12540 tttgtcccaa gcatttttct gtcgttttag tgtgtaaaaa tgttttcttt accccattcc 12600 atatcctaga cgggatgttt gttgtacact atccttagtg catgtgagca aggggatggt 12660 tggcctggca ttagtaatat tcatgtggga agatttttca tataggatct gccctacaaa 12720 caacatgtga taggaatcac gtacactcgt tcccctacca accggaccgt aatcattata 12780 agtacaccct tctaaaaagt aagcctgatt cattttattt gggcctatct acttccctgg 12840 atctcattat gggtttaaga aaattaaaat atgtggctgg tgatgctggg ttttctggag 12900 ttcggactaa gtaaaataaa cccggataga tgaagggacc tagagtaata cccaaattct 12960 tttaatttta tacaccgacc actacgaccc aaaagacctc aacacgacga ctcttcccct 13020 aaccgcgcct gtaatgtgaa atcctggctt ctctctttcc atagcctcag aagccacaga 13080 ggcaagagaa cttccttgtc ttgtgctgct gagaagggga ttggcgcgga cattacactt 13140 taggaccgaa gagagaaagg tatcggagtc ttcggtgtct ccgttctctt gaaggaacag 13200 ttcctggaat cacttgctaa tcttgacctt tacaaactcc atttaatatg gcacatttgg 13260 tccgcactgc actgtacata gaaccttcca tctgacccac aaggacctta gtgaacgatt 13320 agaactggaa atgtttgagg taaattatac cgtgtaaacc aggcgtgacg tgacatgtat 13380 cttggaaggt agactgggtg tttgtaagtt cctattgatt agtgacaccc aaagttgctg 13440 tcccttactc caggtaacct tacctgccca acctcctccg agtcctccag cccagtcact 13500 aaacattcaa ggataactaa tcactgtggg tttcaacgac agggaatgag gtccattgga 13560 atggacgggt tggaggaggc tcaggaggtc gggtcagtga tcctcatctg tgtgacatca 13620 ttcctcatct acttatcgaa ttgatttagg ataatttgct aaatatgcac tgtgcaatta 13680 ataaattttg ctaaaacaaa aggagtagac acactgtagt aaggagtaga tgaatagctt 13740 aactaaatcc tattaaacga tttatacgtg acacgttaat tatttaaaac gattttgttt 13800

Claims (28)

  1. 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제인지 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 GPR86 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 핵산 서열에 의해 인코드됨을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 후보 분자를 GPR86 폴리펩타이드에 노출시키는 단계 및 상기 후보 분자가 GPR86 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 작용제는 GPR86 부여된 G-단백질 Gi 와 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 노출시키고 상기 세포 내의 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정함으로서 확인됨을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 길항제는 GPR86 부여된 G-단백질 Gi와 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 노출시키고 상기 세포 내의 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 증가되는지 여부를 측정함으로서 확인됨을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 작용제는 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 노출시키고 상기 세포 내의 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 증가되는지 여부를 측정함으로서 확인됨을 특징으로 하는 방법
  7. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 길항제는 Gα16과 같은 혼성 자극성 G-단백질과 결합된 GPR86 수용체를 포함한 세포를 후보 화합물에 노출시키고 상기 세포 내의 환상 AMP(cAMP)와 같은 GPCR 민감성 마커의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정함으로서 확인됨을 특징으로 하는 방법
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, (a) 야생형 동물 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물을 제공하는 단계; (b) 상기 야생형 또는 형질전환 비-인간 동물을 후보 분자에 노출시키는 단계; 및 (c) 상기 접촉의 결과로 상기 동물의 생물학적 파라미터가 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  9. 제 8항에 있어서, 생물학적 파라미터는 자극 반응, 열 반응, 광 반응, 면역 반응, 염증 반응, 통증 반응, 바람직하게는 통증 반응으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, (a) 야생형 세포 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 포함한 세포, 바람직하게는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물로부터 분리된 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 세포를 후보 분자에 노출시키는 단계; 및 (c) GPR86 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 상기 접촉의 결과로 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  11. GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화에 이용하기 위한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서의 야생형 또는 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물의 이용
  12. GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증에 대한 모델로서 기능적으로 분열된 내인성 GPR86 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물 또는 그의 분리된 세포 또는 조직의 이용
  13. 제 8항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 바람직하게는 GPR86 유전자 또는 그 일부의 결실을 포함한 기능적으로 분열된 GPR86 유전자를 포함함을 특징으로 하는 이용 또는 방법
  14. 제 8항 내지 제 13항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형의 변화를 나타냄을 특징으로 하는 이용 또는 방법: 자극 반응, 열 반응, 광 반응, 면역 반응, 염증 반응, 통증 반응, 바람직하게는 통증 반응
  15. 제 8항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 적어도 하나 이상의 하기를 나타냄을 특징으로 하는 이용 또는 방법: (a) 통증에 대한 증가되거나 감소된 민감도의 변화된 통증 감수성; 및 (b) 염증성 통증에 대한 증가되거나 감소된 감수성의 변화된 염증성 통증 감수성
  16. 제 8항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게는 마우스임을 특징으로 하는 이용 또는 방법
  17. 후보 화합물을 제 4항 또는 제 16항에 따른 야생형 또는 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 제 9항에 나타난 생물학적 파라미터의 변화를 측정하는 단계를 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법
  18. GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위해 서열번호: 3 또는 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 나타난 아미노산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리펩타이드의 이용
  19. GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열, 그의 단편 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 GPR86 폴리뉴클레오타이드의 이용
  20. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 통증은 급성 통증, 만성 통증, 피부 통증, 체성 통증, 내장 통증, 심근허혈을 포함한 연관 통증, 환상 통증, 신경병증성 통증(신경통), 상처, 질환, 두통, 편두통, 암 통증으로부터 유발된 통증, 파킨슨병과 같은 신경계 장애로부터 유발된 통증, 척추 및 말초신경 수술, 뇌종양, 외상성 뇌손상(TBI), 척수 외상으로부터 유발된 통증, 만성통증증후군, 만성피로증후군, 삼차신경통, 설인신경통, 대상포진후신경통 및 작열통과 같은 신경통, 낭창, 유육종증, 지주막염, 관절염, 류마티스관절염으로부터 유발된 통증, 주기성 통증, 배 통, 요통, 관절통, 복통, 흉통, 분만 진통, 근골격 및 피부 질환, 두부 외상 및 섬유근육통으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  21. 상기한 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 바람직하게는 염증성 장애(즉, 류마티스관절염, 다발경화증, 길랑-바레 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 이식편대숙주병, 전신홍반루푸스 또는 인슐린-의존성 당뇨병), 자가면역질환(즉, 독소충격증후군, 골관절염, 당뇨병 또는 염증성 내장 질환), 급성 통증, 만성 통증, 신경성 통증, 접촉피부염, 죽상동맥경화증, 사구체신염, 재관류 손상, 골 흡수 질환, 천식, 뇌졸중, 심근경색증, 열손상, 성인성 호흡곤란증후군(ARDS), 외상후 2차 다발 기관 손상, 급성 염증성 성분 동반 피부병, 급성 화농성 수막염, 괴사성 장결장염, 혈액투석 관련 증후군, 패혈쇼크, 류코페리시스(leukopherisis), 과립세포 수혈, 연기 흡입에 의해 유발된 폐의 급성 또는 만성 염증, 자궁내막증, 베체트병, 포도막염, 강직성 척추염, 췌장염, 암, 라임 질환, 경피경혈관확장술후 재협착, 알츠하이머병, 외상성 관절염, 패혈증, 만성폐쇄성폐질환, 울혈성심장기능상실, 골다공증, 악액질, 파킨슨병, 치주질환, 통풍, 알레르기 질환, 연령관련황반변성, 감염 및 낭성섬유증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  22. 상기한 어느 한 항에 따른 방법 또는 이용에 의해 확인된 GPR86의 작용제 또 는 길항제
  23. GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 치료, 예방 또는 완화를 위한 제 22항에 따른 분자의 이용
  24. 하나 이상의 하기를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증 또는 그의 감수성에 대한 진단 키트: GPR86 폴리펩타이드 또는 그의 일부; GPR86 폴리펩타이드의 항체; 또는 이를 인코드하는 것이 가능한 핵산
  25. 개체 내 GPR86 폴리펩타이드의 활성 또한 함량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 증세를 나타내는 개체의 치료 방법
  26. 제 25항에 있어서, 상기 방법은 GPR86 폴리펩타이드, GPR86 폴리펩타이드의 작용제 또는 GPR86에 대한 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  27. (a) GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 증세를 나타내는 동물 또는 이러한 질환 증세를 나타낼 것으로 의심되는 동물에서의 GPR86 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함한 GPR86 관련 질환, 특히 염증성 질환 또는 통증의 진단 방법
  28. 수반된 도 1 내지 7에 나타난 바와 같고 이를 참고로 실질적으로 전술된 방법 또는 이용
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Cited By (3)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Cited By (4)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029004B1 (ko) * 2009-08-06 2011-04-14 강원대학교산학협력단 염증성 관절염 마커로서의 ｐｒｄｍ10 단백질 및 이를 포함하는 염증성 관절염 진단키트
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