KR101029004B1

KR101029004B1 - 염증성 관절염 마커로서의 ｐｒｄｍ10 단백질 및 이를 포함하는 염증성 관절염 진단키트

Info

Publication number: KR101029004B1
Application number: KR1020090072354A
Authority: KR
Inventors: 김근철; 박진아; 정유진; 김태환
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2009-08-06
Publication date: 2011-04-14
Also published as: KR20110014812A

Abstract

본 발명은 염증성 관절염 마커로서 사용 가능한 PRDM10 단백질에 관한 것으로서, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염과 같은 염증성 관절염 환자의 혈액 또는 활막액에서는 PRDM10 단백질 발현이 현저히 감소하여 이를 염증성 관절염 진단에 이용할 수 있다.

염증성 관절염, 마커, PRDM10, 류마티스 관절염, 강직성 척추염

Description

염증성 관절염 마커로서의 ＰＲＤＭ10 단백질 및 이를 포함하는 염증성 관절염 진단키트{PRDM10 as a marker of inflammatory arthritis and an inflammatory arthritis diagnostic kit using thereof}

본 발명은 염증성 관절염 환자의 혈액 또는 활막액에서 PRDM10이 저발현됨을 이용하여 정량 분석을 통해 염증성 관절염 진단의 정확성을 높인 마커 및 이를 이용한 염증성 관절염 진단 키트에 관한 것이다.

염증성 관절염은 유전, 환경, 호르몬 등 다양한 요인에 의하여 인체 면역체계에 이상이 발생함으로써 관절에 염증이 생기는 자가면역질환으로서, 류마티스 관절염과 강직성 척추염 등이 이에 해당된다. 반면, 골관절염등과 같은 퇴행성관절염은 노화, 외상 등으로 인해 발병하는 비염증성 관절염으로 분류되며, 염증성 관절염과는 증상은 물론 발병기전에 있어 확연한 차이가 있다.

류마티스 관절염(RA: Rheumatis Arthritis)은 우리나라 전체 인구 중 대략 1%가 환자군으로 추정되고 있는 대표적인 만성질환이다. 류마티스 관절염을 일으키는 병인은 마이코플라즈마(Mycoplasma), 스태필로코커스(Staphylococcus) 또는 스트렙토코커스(Streptococcus) 등의 세균 감염, 엡스타인-바 바이러스(Ebstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 파보바이러스(Parvo virus), 루벨라(Rubella) 와 같은 바이러스 감염 등으로 인한 외인성, 또는 제2형 콜라겐, 류마티스 인자, MHC 유전자 중 HLA-DR4 등의 내인성으로 인한 발병 등이 제시되어지고 있지만, 정확한 발병기전은 아직 불분명하다. 류마티스 관절염에 의한 관절의 기능 손실은 개인적으로는 일상생활의 장애와 사회적 노동력 상실, 의료비 지출 증대 등 사회적, 경제적으로 막대한 손실을 끼칠뿐 아니라, 질병의 진행과정에서 수명의 단축 및 만성 합병증 등의 심각한 문제를 일으킬 수 있다.

류마티스 관절염은 발병 초기에는 항원-특이적 또는 항원-비특이적 기전으로 종양괴사인자(TNF-a) 등의 사이토카인 분비에 의해 자극받은 T임파구가 연골조직주변의 활막내 세포들을 활성화시켜 일어나는 염증반응이라는 것이 지배적인 의견이다. 그러나 질환 말기로 진행되면 T임파구 세포의 영향력은 감소하고 활성화된 활막세포의 비정상적인 증식으로 판누스라는 이상 조직을 형성하고 파골세포를 분화 및 활성화시켜 결국 관절 파괴가 진행된다. 따라서, 활막세포가 염증반응 과정의 중심에 있고 파골세포의 활성화 기전을 이해하고 이에 따른 관절파괴의 기전을 이해하는 것이 근래 연구 동향의 주요 흐름이며, 염증성 관절염 치료제의 개발도 이 부분에 촛점이 맞춰져 있다.

강직성 척추염(AS: Ankylosing Spondylitis)은 척추와 천장관절의 골성 강직을 주요 병변으로 하는 염증성 관절염으로서, HLA-B27 유전자가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 5% 정도는 다른 원인일 가능성이 있다. 장내세균, 클라미디아 등의 감염에 의한 발병이 원인으로 제시되고 있지만, 류마티스 관절염 과 마찬가지로 발병 원인이 아직 불분명한 상태이다. 우리나라의 경우 강직성 척추염 발병률은 류마티스 관절염에 비해 적지만 사회, 경제 활동이 왕성한 젊은 사람에게 주로 발병하고, 이로 인해 심각한 경제 손실을 일으킨다. 강직성 척추염 발병기전은 류마티스 관절염에 비해 연구가 많이 부족한 상태이다. 류마티스 관절염에는 활막, 파골세포가 주역할을 하여 관절 파괴를 일으키는 질환이라면 강직성 척추염은 골부착부염을 시작으로 골파괴와 골형성을 반복하고 골수에 염증을 일으키는 질환으로 인정되고 있다.

이와 같이 염증성 관절염은 발병 기전 등이 매우 다양하기 때문에 치료를 위해서는 항염증제와 항류마티스 제재들이 적용되고 있지만 치료 효과는 불완전할 수밖에 없다. 초기 발견을 통한 약제 치료를 시작하여도 약 4분의 1의 경우에서만 증상이 호전되지만, 일정한 기간이 지나면 대부분 재발한다. 뿐만 아니라, 사용되고 있는 치료약제의 부작용으로 상부 위장관 출혈, 신장 및 간장 기능장애, 감염, 면역기능장애 등이 야기된다고 알려져 있기 때문에 염증성 관절염 발병기전을 이해하고, 관련 단백질 등의 기능 및 신호전달, 유전자 발현조절체계 등에 대한 연구를 통해 새로운 치료기술을 확보하는 것은 사회적, 경제적으로 중요한 의미가 있을 것이다.

연골의 제일 바깥층은 연골막(perichondrium)에 의해 둘러싸여 있으며, 연골의 성장은 내부에서는 간질성장(interstitial growth), 표면 쪽에서는 부가성장 (appositional growth)의 두 가지 방법으로 일어난다. 연골의 기질이 단단하기 때 문에 연골 내부의 연골세포가 분열할 경우 가까운 곳에 모여 있게 되는데 이를 동형세포집단(isogenic cell group)이라고 한다. 섬유연골에서 동형세포집단은 아교섬유의 방향을 따라 세포로 줄을 지어 있다. 연골은 동물의 배발생단계에서 중배엽으로부터 형성되기 시작하는데, 중배엽의 중간엽세포 (mesenchymal cell)는 연골모세포(chondroblast)로 분화하며, 이 세포는 II형 콜라겐과 콘드로넥틴 등 기질 성분을 분비한다. 연골은 비교적 단단하고 빨리 자라므로 배(embryo)의 뼈대구조를 형성하기에 적당한 구조이며, 대부분의 뼈조직(bony tissue)은 연골로 구성된 뼈대의 모형(cartilage model)이 만들어진 후, 괴사한 연골조직에 의해 생긴 공간에 뼈발생싹(osteogenic bud)과 혈관이 들어와 증식하여 발생된다.

활막내의 활막액층에는 T 임파구, B 임파구, 대식세포(macrophages) 들이 존재하며, 대식세포는 류마티스 관절염 발병초기에 많이 관찰되는 세포로서 주로 혈관 주변에 침윤된 T 세포와 인접하여 존재하며 이들 T 세포에 의해 자극되어 병태생리에 중요한 사이토카인, 주로 IL-1, TNF-a 등을 생성하고 MMP 등을 분비한다. TNF-a는 연골과 뼈의 흡수를 촉진하고 대식세포나 말초혈액의 단핵구에 TNF-a와 M-CSF등을 분비하여 파골세포 분화를 유도하며, 최종적으로 관절 파괴에 관여한다고 보고되었다. 또한 TNF-a는 섬유아세포형활막세포(FLS)에 작용하여 활막세포의 증식을 촉진함으로써 활막 과형성(synovial hyperplasia)과 섬유화를 유도하며 류마티스 관절염에서 혈관형성(angiogenesis)에 중요한 역할을 한다. 이와 같이, 염증성 관절염 발병부위의 연골조직 및 관련세포들은 면역체계의 상호반응을 통해 조절되고 있다.

PR/SET 패밀리는 SET 도메인(SET(Su(var)3-9, Enhancer-of-zeste, and Trithorax) 또는 PR 도메인(PRDI-BF-1, RIZ1)을 포함하며, 히스톤 내의 특정 라이신 잔기의 메틸화를 유도할 수 있는 단백질군으로 알려져 있다. PR 도메인은 SET 도메인과 20-30%의 유사도를 보이며, SET 패밀리 단백질의 경우 SET 도메인이 C 말단 부위에 존재하는 반면, PRDM 패밀리의 경우 N 말단 부위에 PR 도메인이 존재하는 것이 특징이다. 이러한 PR/SET 단백질은 징크 핑거 모티프(C2H2)와 같은 DNA 결합 모티프를 포함하는 핵단백질로서 염색질 재배열(chromatin remodeling)을 통한 유전자 발현등의 기능을 담당할 것으로 추정되고 있다.

PRDM10(NM_020228)은 2000년에 Huang 등에 의해 동정된 유전자로서, 인간PRDM10의 경우 103130뉴클레오타이드의 게놈 DNA, 22개의 엑손으로 구성되어 있다. 3482뉴클레오타이드의 mRNA ORF(open reading frame)로부터 1160개의 아미노산으로 구성된 단백질을 발현하며, N 말단에 PR 도메인과 전부위에 걸쳐 7개의 C2H2 타입 징크 핑거 모티프를 포함하고 있다. 인간 PRDM10의 경우에는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 통해 4가지의 아이소폼이 존재한다고 보고되고 있다.

2002년 Siegel, 2008년 Kinameri 등의 발표논문에 따르면, PRDM10은 중추신경계 발생과정 및 신경저장 관련 질환에서 역할을 가지고 있을 것으로 추정하고 있다. 또한 본 발명자들의 연구결과에 따르면, PRDM10은 히스톤 H3K9 트리 메틸화를 조절하는 새로운 HMTase 활성을 가진 것으로 사료되며, 세포주기과정에서 염색체 응축, DNA 회복(repair)에서 조절기능을 가진 Ku70/Ku80 헤테로다이머와 결합하는 등의 유전체 품질 보존 또는 유전자 발현등에 중요한 기능을 담당하고 있다는 연구 결과물을 얻고 있다. 따라서 PRDM10은 유전적 이상 (genome instability) 과 관련된 질환의 발병과 밀접한 관련이 있을 것으로 추정하고 있다.

염증성 관절염 연구는 1950년대 초기 류마티스인자의 발견으로 류마티스 관절염 발병 기전에 대해 자가항체와 면역복합체에 초점을 두었다가 이후 T 임파구에 의한 항원특이반응, 사이토카인 네트워크, 류마티스 활액막 세포의 종양세포와 같은 공격적 활동 등에 대한 연구가 진행되면서 류마티스 관절염 발병 기전에 대한 이론도 다양한 면역계 세포의 반응으로 바뀌고 있다. 그러나 B세포나 T세포를 목표로 한 치료제들이 좋은 효과를 보여 다시 이들 세포들의 역할이 관심의 대상으로 부각되는 순환적인 현상이 일어나고 있다.

최근의 연구들은 활막세포와 활막의 이상 증식 조절에 초점을 맞추고 있으며, 다양한 염증성 사이토카인이 관절염에 중추 역할을 하리라고 보는 연구들이 진행되고 있다. 또한, 염증성 관절염의 발병 기전 및 진행과정 등은 종양형성(carcinogenesis)과 분자적인 기전이 아주 유사하기 때문에, 종양에서 언급된 유전인자들이 염증성 관절염 등의 발병 및 조절에도 관여할 것으로 예측되고 있다.

활막 및 주변 세포에서 분비되고 있는 TNF-a, IL-1, IL-11, RANKL/ODF, M-CSF 등과 같은 분비성 단백질들은 관절 주변부의 파골세포, 활막세포, 면역세포의 성장 및 사멸을 상호 조절한다고 잘 알려져 있다. 그러나 염증성 관절염 발병 기전에서 분비성 단백질들의 발현을 조절하는 전사조절단백질(transcriptional regulators)의 조절작용에 대해서는 연구가 부족한 상태이다.

본 발명은 종래 염증성 관절염 치료제의 문제점을 극복한 새로운 염증성 관절염 치료제를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 염증성 관절염을 조기에 진단할 수 있는 마커 및 이를 이용한 진단키트를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들의 연구 결과에 따르면, 마우스 배 발생과정에서 PRDM10은 특이적으로 뼈 및 연골 조직 등의 형성과 관련하여 높은 발현 양상을 보이는 것으로 확인된다. 또한, 염증성 관절염 환자의 활막액으로부터 채취한 시료들을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과 모든 염증성 관절염 환자의 활막액에서 PRDM10 발현이 현저하게 감소하고 있음을 확인하였다.

이러한 결과로부터 본 발명자들은 PRDM10이 뼈 형성 등과 관련된 매우 중요한 기능을 담당하는 전사인자이며, 염증성 관절염 발병과정에서 PRDM10을 억제함으로써 PRDM10의 목표 유전자들의 발현의 변화를 유도하고 있다고 추론할 수 있었다. 즉, 염증성 관절염과 관련하여 PRDM10은 관절조직에서 활막세포 등의 증식 및 분화와 관련된 기작을 수행하는 것으로 추정된다.

본 발명은 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 염증성 관절염 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 정상 대조군과 비교하여 PRDM10 단백질 양의 감소로 염증성 관절염을 진단하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

또한, 본 발명은 PRDM10 mRNA를 정량적으로 검출하는 염증성 관절염 진단 키트를 제공한다. 상기 mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등을 선택할 수 있다. 상기 mRNA 정량 검출 염증성 관절염 진단 키트는 PRDM10 mRNA에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 mRNA 정량 검출 염증성 관절염 진단 키트는 PRDM10 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 연골 조직, 연골 세포, 활막액, 활막, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 염증성 관절염 마커로서 PRDM10을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 염증성 관절염 마커 검출 방법은

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 PRDM10 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 PRDM10 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료용 또는 억제용 타겟 유전자 PRDM10을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료용 또는 억제용 타겟 PRDM10 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 타겟 유전자 PRDM10 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 약학적으로 허용된 담체를 포함하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 PRDM10 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 관절염 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 PRDM10 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 염증성 관절염 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "마커"는 염증성 관절염 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, PRDM10 유전자에 대한 핵산 마커 및 PRDM10 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 염증성 관절염 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.

본 발명에서 "진단"은 염증성 관절염 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 인간 염증성 관절염 마커 유전자인 PRDM10은 서열번호 1로 나타낸 바와 같이 103130bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 22개의 엑손으로 구성되어 있다. 3482nts의 mRNA 전사 해독 프레임(open reading frame)으로부터 1160개의 아미노산으로 이루어져 있는 단백질을 발현한다(서열번호 2). 그러나 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 발암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 PRDM10 유전자로부터 발현되는 단백질은 1160개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호 2와 같은 서열을 가진다.

본 발명의 PRDM10 유전자 및 단백질은 사람의 활막액을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, 이를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

본 발명의 PRDM10 유전자는 RT-PCR 분석 방법에서 활막액 조직에서 발현율이 낮기 때문에 PRDM10이 뼈 형성 등과 관련된 매우 중요한 기능을 담당하는 전사인자이며, 염증성 관절염과 관련하여 관절조직에서 활막세포 등의 증식 및 분화와 관련된 기작을 수행하는 것으로 추정된다.

따라서, 본 발명의 PRDM10 유전자는 염증성 관절염 발병에 관여하는 것으로 판단되며, 염증성 관절염의 진단, 형질전환 동물의 제조, 염증성 관절염 특이적 치료제 탐색, siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 PRDM10 유전자를 이용한 염증성 관절염 진단방법은, 예를 들어, 상기 유전자가 코드한 PRDM10 단백질의 항체를 이용한 방법과 상기 PRDM10 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 조직으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던 블롯팅(Northern blotting)등으로 이를 검출함으로써 대상자가 본 발명의 PRDM10 유전자를 발현하는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하거나 항체를 이용한 면역학적 분석법은 용이하게 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 PRDM10 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 염증성 관절염 진단용 키트를 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 PRDM10 유전자를 포유동물, 예를 들어, 마우스 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 염증성 관절염 유발 물질 또는 상기 유전자 저해물질 및 염증성 관절염 치료제 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 PRDM10 유전자로부터 유도되는 PRDM10 단백질을 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 PRDM10 유전자로부터 발현된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클론항체(Monoclonal antibody) 또는 폴리클론항체(polyclonal antibody)로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 또는 조직 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 염증성 관절염을 진단할 수 있다.

생물학적 시료 중의 PRDM10 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 PRDM10 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 활막액, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 PRDM10 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 PRDM10 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 염증성 관절염 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, PRDM10 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 염증성 관절염 의심 환자의 실제 염증성 관절염 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 PRDM10 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 PRDM10 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 내지 50bp의 길이, 좀더 바람직하게는 약 10 내지 30bp의 길이이다. 또한, 대조군 유전자의 핵산서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머레이저 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 PRDM10 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 PRDM10 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기 영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 염증성 관절염 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, PRDM10 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 염증성 관절염 의심환자의 실제 염증성 관절염 발병 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 PRDM10 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한 되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀 더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. PRDM10 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 염증성 관절염 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 PRDM10 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 PRDM10에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따 라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 발병 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 염증성 관절염 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질의 수준은 PRDM10 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 염증성 관절염 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 염증성 관절염 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 PRDM10 단백질이 염증성 관절염 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 PRDM10 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 PRDM10 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 PRDM10 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 PRDM10 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 PRDM10 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트 는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 PRDM10 유전자 및 단백질은 사람의 활막액을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, PRDM10 유전자가 삽입된 동물 발현용 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 PRDM10 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 염증성 관절염 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 PRDM10 단백질 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상 기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.01 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.1 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 염증성 관절염 치료 및 예방용 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 PRDM10 단백질 또는 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 히스톤 후생유전학(histone epigenetics) 분야에서 라이신 메틸화와 관련된 PR/SET 단백질의 기능연구에 대한 많은 경험을 가지고 있으며, PR/SET 도메인을 포함하는 PRDM10의 HMTase 활성을 알아보고자 293T 세포에 진핵세포 발현벡터 pCMV-tag 4A-FLAG-PRDM10을 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 통해PRDM10의 발현을 확인한 후 FLAG 항체로 면역침강하여 HMTase 분석을 수행하였다. 그 결과, PRDM10은 히스톤 단백질의 메틸화에 관여하는 것을 확인하였다(도 1A). 또한, 트랜스펙션 효율이 떨어지는 A549 세포를 이용하여 플라스미드를 부분적으로 트랜스펙션시킨 후, 다양한 메틸화 특이적 항체들을 이용하여 면역염색을 수행한 결과, H3K9의 트리메틸화(tri-methylation)만이 특이적으로 증가하는 현상으로 보아 PRDM10은 H3K9 특이적 HMTase로 사료된다(도 1B). 한편 사이토카인 신호전달에 관여하는 PI3 카이네이즈 또는 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 저해제를 처리한후 PRDM10 발현을 조사하였을때 발현이 증가하는 현상을 확인하였다(도 1C). H3K9의 메틸화는 유전자 억제(gene repression)를 유도하는 대표적인 형태의 히스톤 메틸화로 알려져 있으므로 이러한 실험결과들을 종합하여 보면, HMTase 활성을 포함하는 PRDM10은 전사 억제제로서 기능할 것으로 사료되며, 세포성장 및 염증반응등과 관련된 신호전달에서 PRDM10이 음성 조절(negative regulation)을 받고 있는 조절단백질이라고 추정할 수 있다.

핵단백질인 PRDM10의 발현과 트리메틸화된 H3K9은 세포주기진행 동안 동반적으로 증가하는 것으로 보아 PRDM10은 염색체 응축과정에서 기능할 수 있을 것으로 사료된다(도 2A). 또한 노코다졸(nocodazole), 콜세마이드(colcemid) 등과 같은 다양한 세포주기 조절 약제를 이용하여 세포를 특정 단계에 고정시킨 후 웨스턴 블랏을 수행한 결과 H3K9 모노-, 디-, H3K4 디-메틸화의 변화는 보이지 않았지만, H3K9 트리메틸화가 확연히 증가하는 것을 확인하였다(도 2B,C). 또한 전유사분열중기(pro/metaphase)로 유도된 세포들에서 PRDM10이 증가한 것을 RT-PCR을 통해 확인하였다(도 2D). 이 결과를 종합해 보면, PRDM10은 세포주기 진행과정에서 염색체가 응축되는 단계에서 H3K9 트리메틸화를 조절하는 염색질 재배열(chromatin remodeling) 기능이 있는 것으로 예측된다.

마우스 배 발생 단계에서 PRDM10의 발현 양상을 알아보고자 ICR 마우스를 이용하여 교배실험을 수행하여 여러 시기의 태아를 꺼내어 10% 중성 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀 블록을 제조하여 절편에 면역조직화학염색을 수행하였다.

일차적으로 PRDM10 IgG의 특이성을 확인하고자 IgG 음성 대조군을 비교 분석하였다(도 3A,B). 발생초기(E8.5)의 PRDM10은 주로 측엽중배엽성 세포들에서 높은 발현 양상을 보였다(데이터 나타내지 않음). 또한 체절(somite) 등의 기관형성이 진행되는 E13.5의 태아 마우스에서 PRDM10의 발현은 체절 부위 및 연결조직인 근육, 연골, 진피 등에서 매우 높게 발현하고 있음을 확인하였다(도 4). 이러한 부위들은 모두 중배엽성 유래 조직들로 E8.5의 결과와 일치되는 경향임을 확인할 수 있었다.

한편 장기 및 척추의 분화가 거의 완성되는 E16.5의 경우에는 PRDM10의 발현은 분화된 뼈를 중심으로 연골 조직 등에서 매우 특이적인 발현양상을 보였다(도 5). 이러한 결과는 포유동물 발생과정에서 PRDM10이 연골 및 뼈분화 등에 중요한 조절 기능을 하는 전사인자임을 말해주는 것이다.

또한, 본 발명자들은 한양대학교 병원에 내원했던 골괄절염, 류미티스 관절염 환자들의 동의를 얻은 후 혈액, 활막액 등을 채취하여 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 이용하여 PRDM10의 발현을 비교 조사하였다. 비염증성 질환인 골관절염 환자들의 말초혈액(peripheral blood)에서 PRDM10이 대부분 정상적으로 발현되고 있음을 확인하였지만, 염증성 질환인 류마티스 관절염 환자들의 말초혈액에서는 PRDM10 발현이 현저히 저하되어 있음을 확인하였다. 흥미로운 것은 류마티스관절염 환자들의 관절부위 활막액 세포들을 조사한 결과, PRDM10 발현이 급격히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(도 6A,B). 이러한 결과는 연골조직에서 정상기능을 하고 있던 PRDM10의 유전자 발현조절능력이 소실됨으로써 염증성 관절염 발병이 진행될 수 있음을 말한다.

본 발명은 염증성 관절염 진단 및 치료용 마커에 관한 것으로서 형질 전환 세포주와 동물의 제조, 염증성 관절염 특이적 치료제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

<재료와 방법>

항체와 시약

폴리클론 PRDM10 항체는 Abgents사(캘리포니아, 미국)에서 구입하였고, 이차항체는 산타크루즈사(캘리포니아, 미국)에서 입수하였다. 면역조직화학 분석을 위한 시약은 벡터 래보래토리즈사(미국)에서 입수하였고, DAB는 발색기질로 이용되었고, 헤마토자일린으로 역염색되었다.

동물

8주된 ICR 마우스를 동양바이오사(한국)에서 입수하였고, 짝짓기는 암: 수= 3:1 비율로 수행한 후 질 플러그 형성으로 임신을 체크하였다. 배 상태는 짝짓기 후 질 플러그 형성에 따라 0.5씩 표시하였다. 배, 태아 및 출생 후 마우스는 E8.5, E13.5 및 E16.5로부터 마련하였다. 동물을 다루는 것은 강원대학교 실험동물 배양과 이용에 관한 가이드에 따랐다.

면역조직화학

포란 마취 후 배는 모체 자궁에서 떼어내어 중성 포르말린에 이틀 동안 고정하고, 반으로 절단한 후 중성 포르말린에 3일 동안 고정 처리하였다. 고정된 시료는 면역조직화학 분석용으로 4㎛로 절단하기 전에 알콜 구배, 자일렌 및 파라핀 침지 공정을 순차적으로 진행하였다. 절편은 사이트러스 제거 용매에서 20분간 파라핀을 제거하였다. 내부의 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위하여 절편은 메탄올에 녹인 3% 과산화수소로 15분간 처리하였다. 1차 PRDM10 항체는 1:100으로 희석하여 두 시간 동안 배양한 다음 2차 항체 처리하였다. 발색물질인 DAB를 기질로 사용한 다음 헤마토자일린으로 역염색하였다. 최종적으로 슬라이드는 알콜로 수화처리한 다음 사이트러스 제거 용매 내에서 제거하고 퍼마운트 마운팅 배지(Fisher Scientific Inc., 미국)로 올려놓았다.

HMTase 분석

FLAG-PRDM10 발현벡터를 293T 세포로 트랜스펙션시킨 후 단백질 추출물에 FLAG 항체로 면역침전(immunoprecipitation) 하여 효소원으로 이용하였다. 코어 히 스톤 단백질을 기질로 사용하였으며, 메틸기 주게(methyl donor)로 아데노실-L-메티오닌(adenosyl-L-methionine), S-[메틸-¹⁴C](NEC 363), 1X M 완충액(20mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, 0.4mM EDTA, 1mM DTT)에 30℃에서 2시간 배양한 후 SDS-PAGE를 수행하였다. 쿠마시 블루 염색을 통하여 히스톤을 확인한 후, 젤을 건조하여 필름에 감광시킨 다음 며칠 후에 현상하였다.

RT-PCR

A549 또는MCF7 세포에 사이토카인 신호전달에 관여하는 PI3 카이네이즈 또는 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 저해제인 LY294002 20μmol/ml, SP800126 50μmol/ml을 3시간 처리한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 다음 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 또한 세포주기를 고정시키기 위해서 사이토칼라신(cytochalasin) B, 노코다졸(nocodazole), 콜세미드(colcemid) 등을 처리한 후 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.

한양대학교 류마티스연구소로부터 퇴행성 류마티스 관절염 환자의 혈액 또는 활막액을 얻고, 이를 추출하여 RNA를 얻었으며, cDNA를 합성하여 PCR을 수행하였다. 개시체는 인간 PRDM10 S: 5'-GAG CAG TTG CAA CAG CAT CTC AA-3' 인간 PRDM10 AS: 5'-TAA ACA GAT GCT GAA GAG CTG CA-3', 인간 GAPDH S: 5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3', 인간 GAPDH AS: 5'-TTG ATT TGG AGG GAT CTC CG-3' 를 사용하였다.

면역염색(Immunostaining)

A549 세포에 FLAG가 붙은 PRDM10을 트랜스펙션시킨 후 H3K9의 메틸화를 동시면역염색(co-immunostaining)을 통하여 확인하였다. 단일클론 FLAG 항체는 1:140, H3K9 모노-, 디-, 트리- 메틸화는 각각 1:50으로 희석하여 세포에 3시간씩 배양하였다. 2차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 결합된 염소 항래빗, 마우스 1:100으로 희석하여 1시간 30분 배양하였다. 대조군으로써 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 1:5000으로 희석하여 2분간 짧게 배양한 후 마운팅하여 형광현미경으로 관찰하였다.

FACS 분석

A549 세포에 사이토칼라신 B, 노코다졸, 콜세미드를 처리하여 특정 세포주기에 고정시킨 후 세포를 회수하여 75% 에탄올에 24시간 처리한 후 PI(Propidium Iodide) 50μg/ml로 30분간 처리하고, 세포주기별 분포는 벡턴 디킨슨의 프로토콜(Becton Dickinson's protocol; Mountain View, CA)에 따라 수행하였다.

히스톤 추출 및 웨스턴 블랏 분석

히스톤 추출은 세포회수 후 0.2M H₂SO₄ 산성 용액에 4℃에서 하루 동안 배양한 후 핵 펠렛에 100% TCA 용액을 첨가하였다. 이후 HCl/아세톤 용액에 세척한 후 펠렛을 증류수에 녹였다. 히스톤 단백질은 15% SDS-PAGE로 분리하였다. 전기 영동 상에 분리된 히스톤 단백질을 나이트로셀룰로스 막에 옮긴 후 다양한 히스톤 변형 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

도 1은 PRDM10의 H3K9 트리메틸화 HMTase 활성 및 신호전달과정에서의 조절을 나타내는 결과이다. (A) 293T 세포에 pCMV-tag 4A-FLAG-PRDM10을 트랜스펙션을 통해 PRDM10을 발현시켜 HMTase 분석을 수행한 결과이다. (B) A549 세포에 낮은 농도의 PRDM10 플라스미드를 부분적으로 트랜스펙션시킨 후, 여러 종류의 메틸화 특이 항체(methylation specific antibody)들을 이용하여 면역염색을 수행한 결과이다. (C) 사이토카인 신호전달에 관계하는 PI3 키나아제 또는 JNK 등의 저해제를 처리한 후 PRDM10의 발현을 RT-PCR을 통하여 확인한 것이다.

도 2는 염색체 응축과 관련된 H3K9 트리메틸화와 PRDM10의 관련성을 나타내는 결과이다. (A) PRDM10의 H3K9 트리메틸화 HMTase 활성 및 신호전달 과정을 동시면역염색(co-immunostaining)을 통하여 확인하였다. (C), (B) A549 세포에 세포 아사(cell starvation), 노코다졸, 콜세미드 등을 통하여 특정 세포주기에 고정시키고 FACS 분석(그림 C)으로 확인한 후 히스톤을 추출하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(그림 B). (D) 특정 세포주기에서의 PRDM10의 mRNA 발현량을 RT-PCR을 통하여 확인하였다.

도 3은 수정 후 8.5일(E8.5)에 배의 두부에서 PRDM10 단백질 발현을 나타낸다. 배 두부 가로절편을 준비하고 PRDM10 항체를 이용한 면역조직화학으로 염색하였다. 중배엽 및 신경관 부분에서 염색되었다. 갈색: PRDM10, 자주색: 헤마토자일린 역염색.

도 4는 발생단계 E13.5에서 PRDM10 발현을 나타낸다. 마우스 배 시상봉합 절 편은 수정 후 13일째(E13.5) 준비하였다. PRDM10 단백질은 두개안면, 체절(somite) 및 척색 부위에서 주로 탐지되었다. 면역반응성은 PRDM10 항체와 함께 배양하여 결정하였다. 음성대조군에서는 아무런 반응도 일어나지 않았다. NC: 척색, TG: 혀, VT: 공동(ventricle), S: 체절, L: 간.

도 5는 E16.5에 얻은 배의 다양한 조직에서 PRDM10의 발현을 나타낸다. (A) 머리 피부, (B) 아래턱 피부, (C) 부신 수질, (D) 연골. 갈색: PRDM10, 자주색: 헤마토자일린 역염색.

도 6은 퇴행성 관절염 환자, 류마티스 관절염 환자의 관절염 조직 및 활막액 시료에서 PRDM10 발현을 RT-PCR로 실험한 결과이다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> PRDM10 as a marker of inflammatory arthritis and an inflammatory arthritis diagnostic kit using thereof <130> KNU-kkc-PRDM10 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6341 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (233)..(3712) <400> 1 actctgcggc gggaagaacc acctggaggt ggcggggggg gttgatttct atcaccccta 60 gggagagagg atcggggacc cgctgatctt ccagctcccc tcacccaacg tcgtgcatgc 120 tgcagacaga cctttccgtc cttcatgaac acacgtgtgg tagacagatg actgtcctgt 180 accctgtgct gctctaggtg tgccagacgt ggagctgtcc agttgggaga ag 232 atg gat tcc aaa gat gaa agc tcg cat gtg tgg ccg aca tct gca gag 280 Met Asp Ser Lys Asp Glu Ser Ser His Val Trp Pro Thr Ser Ala Glu 1 5 10 15 cat gaa cag aat gcc gca cag gtg cac ttt gtt ccg gac aca gga aca 328 His Glu Gln Asn Ala Ala Gln Val His Phe Val Pro Asp Thr Gly Thr 20 25 30 gtg gct cag att gtc tat acc gat gac cag gtt cgc ccc cca cag cag 376 Val Ala Gln Ile Val Tyr Thr Asp Asp Gln Val Arg Pro Pro Gln Gln 35 40 45 gtg gtg tac acg gca gat ggt gcc tcc tac aca tca gtg gat ggt cca 424 Val Val Tyr Thr Ala Asp Gly Ala Ser Tyr Thr Ser Val Asp Gly Pro 50 55 60 gag cac acg ctg gtg tac atc cac ccg gtg gaa gct gca cag act ctg 472 Glu His Thr Leu Val Tyr Ile His Pro Val Glu Ala Ala Gln Thr Leu 65 70 75 80 ttt aca gac ccc ggc cag gta gct tat gtc caa cag gat gct aca gct 520 Phe Thr Asp Pro Gly Gln Val Ala Tyr Val Gln Gln Asp Ala Thr Ala 85 90 95 cag cag gcc tca ttg cca gtt cat aac cag gtg ctg cct tcc atc gag 568 Gln Gln Ala Ser Leu Pro Val His Asn Gln Val Leu Pro Ser Ile Glu 100 105 110 agt gta gat ggg tcc gac cct ttg gca act ctg cag acc cct cta ggc 616 Ser Val Asp Gly Ser Asp Pro Leu Ala Thr Leu Gln Thr Pro Leu Gly 115 120 125 aga ctg gag gcc aaa gag gaa gag gat gag gat gag gac gag gac act 664 Arg Leu Glu Ala Lys Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Thr 130 135 140 gag gaa gat gag gaa gaa gac ggt gag gac acg gat ctg gat gac tgg 712 Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Gly Glu Asp Thr Asp Leu Asp Asp Trp 145 150 155 160 gag cca gac ccg ccc cgg ccc ttc gac cca cac gac ttg tgg tgt gag 760 Glu Pro Asp Pro Pro Arg Pro Phe Asp Pro His Asp Leu Trp Cys Glu 165 170 175 gag tgc aat aac gcg cat gct tca gtg tgt ccg aag cac ggc ccc ttg 808 Glu Cys Asn Asn Ala His Ala Ser Val Cys Pro Lys His Gly Pro Leu 180 185 190 cac ccg atc ccc aac cgg ccg gtg ctc acc cgg gcc agg gcg agc ctc 856 His Pro Ile Pro Asn Arg Pro Val Leu Thr Arg Ala Arg Ala Ser Leu 195 200 205 ccc ctg gtg ctc tac ata gac agg ttt ctg ggc ggg gtg ttc tcc aag 904 Pro Leu Val Leu Tyr Ile Asp Arg Phe Leu Gly Gly Val Phe Ser Lys 210 215 220 cgg cgc atc ccc aag cgc acc cag ttt ggc ccc gtg gag ggg cct ctc 952 Arg Arg Ile Pro Lys Arg Thr Gln Phe Gly Pro Val Glu Gly Pro Leu 225 230 235 240 gtc agg ggc tcg gag ctg aaa gac tgt tac att cac ctc aag gtt tct 1000 Val Arg Gly Ser Glu Leu Lys Asp Cys Tyr Ile His Leu Lys Val Ser 245 250 255 ctt gat aaa ggg gac agg aaa gaa agg gat tta cat gaa gac cta tgg 1048 Leu Asp Lys Gly Asp Arg Lys Glu Arg Asp Leu His Glu Asp Leu Trp 260 265 270 ttt gag ttg tct gat gag acg ctt tgt aac tgg atg atg ttt gta cgg 1096 Phe Glu Leu Ser Asp Glu Thr Leu Cys Asn Trp Met Met Phe Val Arg 275 280 285 cca gcc cag aat cac ctg gag cag aac ctg gtg gct tac cag tat ggc 1144 Pro Ala Gln Asn His Leu Glu Gln Asn Leu Val Ala Tyr Gln Tyr Gly 290 295 300 cac cat gtg tat tat aca acc ata aaa aat gtg gag ccc aag cag gaa 1192 His His Val Tyr Tyr Thr Thr Ile Lys Asn Val Glu Pro Lys Gln Glu 305 310 315 320 ctg aag gtg tgg tat gcc gca tcc tat gct gag ttc gtg aac cag aaa 1240 Leu Lys Val Trp Tyr Ala Ala Ser Tyr Ala Glu Phe Val Asn Gln Lys 325 330 335 att cat gac att tct gag gaa gaa agg aaa gtt ctt cga gag caa gag 1288 Ile His Asp Ile Ser Glu Glu Glu Arg Lys Val Leu Arg Glu Gln Glu 340 345 350 aag aat tgg ccc tgc tat gaa tgt aac cgc cga ttt ata agc tcg gag 1336 Lys Asn Trp Pro Cys Tyr Glu Cys Asn Arg Arg Phe Ile Ser Ser Glu 355 360 365 cag ttg caa cag cat ctc aat tct cat gat gag aaa cta gat gtg ttt 1384 Gln Leu Gln Gln His Leu Asn Ser His Asp Glu Lys Leu Asp Val Phe 370 375 380 agc aga aca aga ggc aga gga agg gga cga ggc aag agg cga ttc ggt 1432 Ser Arg Thr Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Lys Arg Arg Phe Gly 385 390 395 400 cca ggt cga cgg ccg ggg cgt cct cca aaa ttt atc cgc ctg gaa atc 1480 Pro Gly Arg Arg Pro Gly Arg Pro Pro Lys Phe Ile Arg Leu Glu Ile 405 410 415 acc agc gaa aat ggg gaa aag agt gac gat ggg aca cag gac ttg cta 1528 Thr Ser Glu Asn Gly Glu Lys Ser Asp Asp Gly Thr Gln Asp Leu Leu 420 425 430 cat ttt ccc aca aag gag caa ttt gat gag gct gaa cca gcc act ctg 1576 His Phe Pro Thr Lys Glu Gln Phe Asp Glu Ala Glu Pro Ala Thr Leu 435 440 445 aat ggg ctg gat caa cca gaa cag acc act atc cca atc cct cag ctg 1624 Asn Gly Leu Asp Gln Pro Glu Gln Thr Thr Ile Pro Ile Pro Gln Leu 450 455 460 cca cag gaa acc cag tct tcc ctg gaa cat gaa cca gaa act cac acc 1672 Pro Gln Glu Thr Gln Ser Ser Leu Glu His Glu Pro Glu Thr His Thr 465 470 475 480 ctg cac ctg cag ccg cag cat gaa gag agc gtg gtg ccc acc cag agc 1720 Leu His Leu Gln Pro Gln His Glu Glu Ser Val Val Pro Thr Gln Ser 485 490 495 acg ctg aca gcc gac gac atg cgc aga gcc aag cgc atc cga ttg gag 1768 Thr Leu Thr Ala Asp Asp Met Arg Arg Ala Lys Arg Ile Arg Leu Glu 500 505 510 ctg cag aat gca gct ctt cag cat ctg ttt att cgg aag tcc ttc cgg 1816 Leu Gln Asn Ala Ala Leu Gln His Leu Phe Ile Arg Lys Ser Phe Arg 515 520 525 cct ttt aaa tgc ttg cag tgt ggg aag gcc ttc cgg gaa aag gac aaa 1864 Pro Phe Lys Cys Leu Gln Cys Gly Lys Ala Phe Arg Glu Lys Asp Lys 530 535 540 ctg gac cag cac tta cgc ttc cat ggg cgg gag ggg aac tgc cca ctg 1912 Leu Asp Gln His Leu Arg Phe His Gly Arg Glu Gly Asn Cys Pro Leu 545 550 555 560 acc tgt gat ctc tgt aac aag ggc ttc atc agc agc aca tcc ttg gag 1960 Thr Cys Asp Leu Cys Asn Lys Gly Phe Ile Ser Ser Thr Ser Leu Glu 565 570 575 agc cac atg aag ctc cac tca gac cag aag act tac tct tgc att ttt 2008 Ser His Met Lys Leu His Ser Asp Gln Lys Thr Tyr Ser Cys Ile Phe 580 585 590 tgc cca gaa tcc ttt gac cgc ctt gat ttg ttg aaa gat cat gtg gcc 2056 Cys Pro Glu Ser Phe Asp Arg Leu Asp Leu Leu Lys Asp His Val Ala 595 600 605 att cat atc aat gat ggc tac ttc acc tgc cca act tgt aag aaa cgg 2104 Ile His Ile Asn Asp Gly Tyr Phe Thr Cys Pro Thr Cys Lys Lys Arg 610 615 620 ttc cca gat ttt atc cag gtg aaa aaa cac gtg cgc agc ttc cac tca 2152 Phe Pro Asp Phe Ile Gln Val Lys Lys His Val Arg Ser Phe His Ser 625 630 635 640 gaa aag atc tac cag tgc aca gag tgt gac aag gcc ttc tgt cgc ccc 2200 Glu Lys Ile Tyr Gln Cys Thr Glu Cys Asp Lys Ala Phe Cys Arg Pro 645 650 655 gat aaa ctg cga ctc cac atg ctc cgg cat tcg gac cgc aaa gac ttc 2248 Asp Lys Leu Arg Leu His Met Leu Arg His Ser Asp Arg Lys Asp Phe 660 665 670 ctg tgt tcc acc tgt ggg aag caa ttt aag cga aaa gac aaa cta cgg 2296 Leu Cys Ser Thr Cys Gly Lys Gln Phe Lys Arg Lys Asp Lys Leu Arg 675 680 685 gaa cac atg cag agg atg cat aat cct gag agg gag gcc aag aaa gcc 2344 Glu His Met Gln Arg Met His Asn Pro Glu Arg Glu Ala Lys Lys Ala 690 695 700 gac cgc atc agc cgc tcc aag acg ttc aag ccc cgc atc acg tcc aca 2392 Asp Arg Ile Ser Arg Ser Lys Thr Phe Lys Pro Arg Ile Thr Ser Thr 705 710 715 720 gac tac gac agc ttc acg ttc aag tgc cgc ctg tgc atg atg ggc ttc 2440 Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Phe Lys Cys Arg Leu Cys Met Met Gly Phe 725 730 735 cgg cgg cgc ggc atg ctg gta aat cac tta tcg aag aga cac cca gac 2488 Arg Arg Arg Gly Met Leu Val Asn His Leu Ser Lys Arg His Pro Asp 740 745 750 atg aag ata gaa gag gtg cca gag tta act cta ccc atc ata aaa ccc 2536 Met Lys Ile Glu Glu Val Pro Glu Leu Thr Leu Pro Ile Ile Lys Pro 755 760 765 aat cgt gat tac ttt tgt cag tat tgc gat aag gtt tat aaa agt gcc 2584 Asn Arg Asp Tyr Phe Cys Gln Tyr Cys Asp Lys Val Tyr Lys Ser Ala 770 775 780 agc aag cgc aaa gcc cac att ctg aag aac cac cca gga gca gag ctc 2632 Ser Lys Arg Lys Ala His Ile Leu Lys Asn His Pro Gly Ala Glu Leu 785 790 795 800 cca ccg agc att cgg aag ctc cga ccc gct ggt cct gga gag cca gac 2680 Pro Pro Ser Ile Arg Lys Leu Arg Pro Ala Gly Pro Gly Glu Pro Asp 805 810 815 ccc atg ctg agc aca cac acc cag ctg acg ggc acc atc gcc acc cct 2728 Pro Met Leu Ser Thr His Thr Gln Leu Thr Gly Thr Ile Ala Thr Pro 820 825 830 ccc gtc tgc tgt ccc cac tgc tcc aag cag tac agc agc aag acc aag 2776 Pro Val Cys Cys Pro His Cys Ser Lys Gln Tyr Ser Ser Lys Thr Lys 835 840 845 atg gtc cag cac att cga aag aag cat cca gag ttc gcc cag ctc tcc 2824 Met Val Gln His Ile Arg Lys Lys His Pro Glu Phe Ala Gln Leu Ser 850 855 860 aac acc ata cac aca cca ctg acg aca gct gtg atc agt gcc acc cca 2872 Asn Thr Ile His Thr Pro Leu Thr Thr Ala Val Ile Ser Ala Thr Pro 865 870 875 880 gcg gtt ttg act aca gac agc gcc act gga gag act gtg gtg acg acg 2920 Ala Val Leu Thr Thr Asp Ser Ala Thr Gly Glu Thr Val Val Thr Thr 885 890 895 gac ctg ctc acc caa gca atg aca gaa ctg tcc cag acc tta acg aca 2968 Asp Leu Leu Thr Gln Ala Met Thr Glu Leu Ser Gln Thr Leu Thr Thr 900 905 910 gac tac cga acg cca caa ggg gat tac cag aga att cag tac atc cct 3016 Asp Tyr Arg Thr Pro Gln Gly Asp Tyr Gln Arg Ile Gln Tyr Ile Pro 915 920 925 gtg tcg cag tcg gcg tct ggc ctc cag cag cct cag cac ata cag ctg 3064 Val Ser Gln Ser Ala Ser Gly Leu Gln Gln Pro Gln His Ile Gln Leu 930 935 940 caa gtg gtt caa gtg gcc tcg gcc act tcc cct cac cag tca cag cag 3112 Gln Val Val Gln Val Ala Ser Ala Thr Ser Pro His Gln Ser Gln Gln 945 950 955 960 tcc act gtg gat gtt ggc cag ctc cat gat cct cag ccc tac ccc cag 3160 Ser Thr Val Asp Val Gly Gln Leu His Asp Pro Gln Pro Tyr Pro Gln 965 970 975 cac gcc atc cag gtg cag cac atc cag gtc agc gag cct acc gcc tcg 3208 His Ala Ile Gln Val Gln His Ile Gln Val Ser Glu Pro Thr Ala Ser 980 985 990 gcc ccg tcc tcc gcc cag gta tct ggg cag ccg ttg agt ccc tca gcc 3256 Ala Pro Ser Ser Ala Gln Val Ser Gly Gln Pro Leu Ser Pro Ser Ala 995 1000 1005 cag cag gct cag cag ggg ctc agc ccc tcc cac atc cag ggc agt tct 3304 Gln Gln Ala Gln Gln Gly Leu Ser Pro Ser His Ile Gln Gly Ser Ser 1010 1015 1020 tcc aca cag ggg cag gct ctg cag cag cag cag cag cag cag cag aat 3352 Ser Thr Gln Gly Gln Ala Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn 1025 1030 1035 1040 tcc tct gtg cag cac acg tac ctg ccc agt gct tgg aat tcc ttc cgt 3400 Ser Ser Val Gln His Thr Tyr Leu Pro Ser Ala Trp Asn Ser Phe Arg 1045 1050 1055 ggc tat tca tct gag att caa atg atg acg ctt cct ccg ggt cag ttt 3448 Gly Tyr Ser Ser Glu Ile Gln Met Met Thr Leu Pro Pro Gly Gln Phe 1060 1065 1070 gtg att aca gac agt ggt gtg gca act cca gtt act act ggc cag gtg 3496 Val Ile Thr Asp Ser Gly Val Ala Thr Pro Val Thr Thr Gly Gln Val 1075 1080 1085 aag gcg gtt act tcg ggt cat tat gtg tta tca gaa agt caa tca gaa 3544 Lys Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Val Leu Ser Glu Ser Gln Ser Glu 1090 1095 1100 ttg gaa gaa aag caa act tct gcc ctc tct ggt gga gtc cag gtc gag 3592 Leu Glu Glu Lys Gln Thr Ser Ala Leu Ser Gly Gly Val Gln Val Glu 1105 1110 1115 1120 cca cct gca cac agt gac tcc ctg gac ccc cag acc aac agc caa cag 3640 Pro Pro Ala His Ser Asp Ser Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser Gln Gln 1125 1130 1135 cag acc aca cag tac atc atc acc acc acc acc aac ggg aac gga agc 3688 Gln Thr Thr Gln Tyr Ile Ile Thr Thr Thr Thr Asn Gly Asn Gly Ser 1140 1145 1150 agc gaa gtg cat atc acc aaa cca tgacttcc accctggagc ttgaatccag 3740 Ser Glu Val His Ile Thr Lys Pro 1155 1160 cacccacctc atgtctgttc tcataagtct gaaagctctg acacgtagag ctcttttgta 3800 agatttatta ttcactcaag agttcggaaa ccacagtttt gtctctcatc catacactgg 3860 ggtttatttt gccaaggtca tctttatcaa attgactctt caaaccctcg gtttttgcca 3920 cagaacagag atctttcagg ggaaagtaga tttcgaggtg gagagaattt gccttgctct 3980 tgagctggtc ttttaacata ctgacgagcc ttacttttcc tttgtggaaa tattaagtgg 4040 catattgtgt tcataccaaa ggtggagaca ggatgtgcca agttcatggt tactggactt 4100 cttattccaa gccatggcac caaaggagaa ggggcatttt gtgggtgtgc attaggtctg 4160 aactgcttta tcttgtttta gttttcagta atttaacaaa gggagcctgc tgaataacaa 4220 aattaaaatg atgaaacaaa agtttgacag tgatattctg aagcaaaaac tgtcatctaa 4280 atttttcttg ctgatttttt ttaacttccc tattttagaa aactattgtt gggctgttgg 4340 tagtgctttc cacagatgct ggtcctcagt ggattaggtc agaagctcat gttctgatag 4400 ttcttcatta tttcacaaag gtggacaacc tgaaagagaa aaggctgctt gatgtcagca 4460 gaatctaaac ccctacatta aagctttgcc tcccattctg tggttgtggt ggtggtaaga 4520 aggagatatt ggtaccaaga aaaatttcca aaactattga gagagagaga gagaaagtat 4580 tgaaattttg ttctgccttg caggatccat ttatcattca ttggtaaagg atatattcct 4640 tgttcttacc aagtgtacat ttaactcttg ctgacatgtt cagtgtattt tattactttt 4700 aatgctgtct taaaatgaac attctttaaa gttggacagg aaggtggcat ttcttattta 4760 ttaacatttt taactttaaa catattgtga ctcatctaga ccttttaata agacgatcaa 4820 cttcacactt agggaaaaaa ttaaaatgtg atggccactt ctaataattc aggtagttat 4880 aagggatctg gaagaaatcc agtctttatg aatatactat tagttgggca ttaaaaaatc 4940 agtatatatt ttaacttttt gtgacatgct aacacatttt cagaataatt attgcatagt 5000 agaatttatt actccagaac agaaagacct tacttcattt caaatgaagt taattaattt 5060 acatttctgg gtaaaaactg gttctataaa ttaagtagag tagcttcttt atgataaaga 5120 caattttctg aaaagtgaac aattctgtta aaagaacttt attgatgtgt agatttcgca 5180 ctttatttct gagactgcgt tcatgtagtt gttccccaat gtttgagtac taagagaact 5240 tgagaaaatt acttcataaa catatggaaa ctgaaaatgg actctctttg tgacaaagat 5300 attcaacaga aaatattgac cctgcattgc aaaacacagg ttcgggttcc ctaagtccca 5360 cagtgtaatg attacaaata tcctagtgtc cggtctagaa agactttcta ggagaagact 5420 agtggaattt tctaaaggtt cagttttagc ttttataact taaatttggc cctgttacgt 5480 tctttttaat ttgaaccata aggtatctcc cctcccttca ggaataactt attggaaaac 5540 tgaaaagaat cactgaatgg aatgttcatt ttatggcagt tgttttaagt tttaaaatac 5600 acagaggaaa atattgtgga aggacctctt tgttgctttc ccttctaagt tgtcttcttc 5660 ttcttcttct tcttcttctt ctttggtcct taagtgaaat aaagactcta aaactaattt 5720 gtatattatc agccagagat gcggatggca gtcgagccaa atcgcatggc tttcagatca 5780 ggtattctgc acattcattc caaggtcata gatttttaaa aggacctgga tttgaagaga 5840 tggcaaatga tgagccatca gaaaacttaa tttggaaaac atgtatgtag ccagtgtgga 5900 tattgtggcc tctctcaaga cacattgaca ctgtagactt cattcagtcc agtgtgagta 5960 ttttggagta ggttggatgt agattttgtt tttatcattg atttgtaccg acagaaatag 6020 acatttcatc atgtaaaatt cctgttattc tggaaaaacc tattgttttg atcttcttgt 6080 tttctgactt ggaagtatcc tttcaaaaaa actcttaaga tatctaggtc taaaaagcac 6140 ttcatgagat gctaaagctg acccactggt tgaaaatgtt gaccctatcc tgttatttaa 6200 atgtgaacat ttattgtaca ttcagtgagt tatagtgtta atagtcttgt gctatgcagc 6260 aggtgtaaaa attaataaat atatttttta ataaacatgt ttgtatgtgt gaagctacaa 6320 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 6341 <210> 2 <211> 1160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Lys Asp Glu Ser Ser His Val Trp Pro Thr Ser Ala Glu 1 5 10 15 His Glu Gln Asn Ala Ala Gln Val His Phe Val Pro Asp Thr Gly Thr 20 25 30 Val Ala Gln Ile Val Tyr Thr Asp Asp Gln Val Arg Pro Pro Gln Gln 35 40 45 Val Val Tyr Thr Ala Asp Gly Ala Ser Tyr Thr Ser Val Asp Gly Pro 50 55 60 Glu His Thr Leu Val Tyr Ile His Pro Val Glu Ala Ala Gln Thr Leu 65 70 75 80 Phe Thr Asp Pro Gly Gln Val Ala Tyr Val Gln Gln Asp Ala Thr Ala 85 90 95 Gln Gln Ala Ser Leu Pro Val His Asn Gln Val Leu Pro Ser Ile Glu 100 105 110 Ser Val Asp Gly Ser Asp Pro Leu Ala Thr Leu Gln Thr Pro Leu Gly 115 120 125 Arg Leu Glu Ala Lys Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Thr 130 135 140 Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Gly Glu Asp Thr Asp Leu Asp Asp Trp 145 150 155 160 Glu Pro Asp Pro Pro Arg Pro Phe Asp Pro His Asp Leu Trp Cys Glu 165 170 175 Glu Cys Asn Asn Ala His Ala Ser Val Cys Pro Lys His Gly Pro Leu 180 185 190 His Pro Ile Pro Asn Arg Pro Val Leu Thr Arg Ala Arg Ala Ser Leu 195 200 205 Pro Leu Val Leu Tyr Ile Asp Arg Phe Leu Gly Gly Val Phe Ser Lys 210 215 220 Arg Arg Ile Pro Lys Arg Thr Gln Phe Gly Pro Val Glu Gly Pro Leu 225 230 235 240 Val Arg Gly Ser Glu Leu Lys Asp Cys Tyr Ile His Leu Lys Val Ser 245 250 255 Leu Asp Lys Gly Asp Arg Lys Glu Arg Asp Leu His Glu Asp Leu Trp 260 265 270 Phe Glu Leu Ser Asp Glu Thr Leu Cys Asn Trp Met Met Phe Val Arg 275 280 285 Pro Ala Gln Asn His Leu Glu Gln Asn Leu Val Ala Tyr Gln Tyr Gly 290 295 300 His His Val Tyr Tyr Thr Thr Ile Lys Asn Val Glu Pro Lys Gln Glu 305 310 315 320 Leu Lys Val Trp Tyr Ala Ala Ser Tyr Ala Glu Phe Val Asn Gln Lys 325 330 335 Ile His Asp Ile Ser Glu Glu Glu Arg Lys Val Leu Arg Glu Gln Glu 340 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975 His Ala Ile Gln Val Gln His Ile Gln Val Ser Glu Pro Thr Ala Ser 980 985 990 Ala Pro Ser Ser Ala Gln Val Ser Gly Gln Pro Leu Ser Pro Ser Ala 995 1000 1005 Gln Gln Ala Gln Gln Gly Leu Ser Pro Ser His Ile Gln Gly Ser Ser 1010 1015 1020 Ser Thr Gln Gly Gln Ala Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Val Gln His Thr Tyr Leu Pro Ser Ala Trp Asn Ser Phe Arg 1045 1050 1055 Gly Tyr Ser Ser Glu Ile Gln Met Met Thr Leu Pro Pro Gly Gln Phe 1060 1065 1070 Val Ile Thr Asp Ser Gly Val Ala Thr Pro Val Thr Thr Gly Gln Val 1075 1080 1085 Lys Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Val Leu Ser Glu Ser Gln Ser Glu 1090 1095 1100 Leu Glu Glu Lys Gln Thr Ser Ala Leu Ser Gly Gly Val Gln Val Glu 1105 1110 1115 1120 Pro Pro Ala His Ser Asp Ser Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser Gln Gln 1125 1130 1135 Gln Thr Thr Gln Tyr Ile Ile Thr Thr Thr Thr Asn Gly Asn Gly Ser 1140 1145 1150 Ser Glu Val His Ile Thr Lys Pro 1155 1160 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PRDM10 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Claims

PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 염증성 관절염 진단 키트.
제1항에 있어서,

정상 대조군과 비교하여 PRDM10 단백질 양의 감소로 염증성 관절염을 진단하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트.
제1항에 있어서,

상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트.
PRDM10 mRNA를 정량적으로 검출하는 염증성 관절염 진단 키트.
제4항에 있어서,

mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트.
제4항에 있어서,

LCN2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 진단 키트.
PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 연골 조직, 연골 세포, 활막액, 활막, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 염증성 관절염 마커 검출 방법.
제7항에 있어서,

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 PRDM10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 마커 검출 방법.
PRDM10 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 PRDM10 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료제의 스크리닝 방법.
서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 타겟 유전자 PRDM10.
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 타겟 PRDM10 단백질.
서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 타겟 유전자 PRDM10 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 약학적으로 허용된 담체를 포함하는 염증성 관절염 치료 또는 억제용 약학 조성물.