JP2012519003A - 不妊症関連defb−126欠失多型 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全開示が参照により本明細書に組み入れられる、2009年2月26日に出願された米国特許仮出願第61/155,807号の恩典を主張する。
合衆国政府は、本発明における納付済みの実施権を有し、限られた状況において、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金第AI032738号および第AI050843号の条件によって規定されている妥当な条件において、特許所有者に対し、他者に実施許諾するよう求める権利を有する。
本出願は、DEFB-126表現型および遺伝子型の状態を評価することによって雄性個体の生殖能の状態を判定するための診断法を提供する。本出願はまた、不十分なレベルのDEFB-126を発現している個体からの精子において(たとえば受胎を達成するように)精子機能性を回復するための治療法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、DEFB-126遺伝子における多型を使用して、個体が不妊症の高いリスクまたは確率を有するかどうかを判定する方法および組成物も提供する。
ヒト不妊症とは、一般に、避妊なしの性交の1年後に妊娠を達成する能力がないことと定義される。この定義によると、世界の多くの国における不妊症の罹患率は約13〜14%である(Strickler et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 172:766-73 (1995)(非特許文献1))。男性における不妊症は、一般に、精液の質のパラメータ、たとえば射精物中の精子濃度、運動性精子の割合および正常な形態を有する精子の割合の分析によって評価されるが、これらの尺度のいずれも、不妊症を診断するものではない(Guzick et al, N. Engl. J. Med. 345:1388-93 (2001)(非特許文献2))。原因不明の不妊症の罹患率は不妊男女カップルの約17%であると推定されている(Collins, Unexplained Infertility. In: Infertility Evaluation and Treatment(Keye, Chang, Rebar, and Soules, eds.) WB Saunders, Philadelphia, pages 249-262 (1995)(非特許文献3))。これらのケースにおいては、男性または女性のいずれのパートナにおいても生殖機能の異常を立証することができない。
内の個体のDEFB-126対立遺伝子を決定する工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、部分配列内の位置6〜10における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示し、部分配列の位置6〜10における3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高いリスクまたは可能性を示す方法を提供する。
内のDEFB-126対立遺伝子を決定する工程を含み、部分配列内の位置11〜15における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示し、部分配列の位置11〜15における3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高いリスクまたは確率を示す。
内の対立遺伝子を識別する一つまたは複数のポリヌクレオチドを使用する増幅反応によって検出することができる。いくつかの態様において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ローリングサークル増幅(RCA)、T7ポリメラーゼ媒介増幅、T3ポリメラーゼ媒介増幅およびSP6ポリメラーゼ媒介増幅からなる群より選択される。
内の対立遺伝子を識別する一つまたは複数のポリヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションによって検出される。他の態様において、DEFB-126対立遺伝子は、核酸配列
を含む部分配列、DEFB-126の部分配列を配列決定することによって検出される。いくつかの態様において、DEFB-126対立遺伝子は制限酵素断片長多型によって検出される。他の態様において、DEFB-126対立遺伝子は蛍光共鳴エネルギー移動(「FRET」)によって検出される。
のC末端アミノ酸配列を有するDEFB-126ポリペプチドは不妊症の高いリスクを示す。
内の個体のDEFB-126対立遺伝子を識別する少なくとも一つのポリヌクレオチドと、部分配列内の位置6〜10における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示すことおよび部分配列の位置6〜10における3個の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高いリスクを示すことを述べている使用説明書とを含む、キットが提供される。
断りない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される術語ならびに以下に記載する細胞培養、分子遺伝子学、有機化学、核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手法は当技術分野において周知であり、一般に使用されている。核酸およびペプチド合成には標準的技術が使用される。一般に、酵素的反応および精製ステップは製造者の仕様書にしたがって実施される。技術および手法は、一般に、当技術分野および本明細書の至る所で提供される様々な一般的参考文献における従来法にしたがって実施される(一般に、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)およびAusubel, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Interscience, (1990-2008)を参照)。本明細書において使用される術語および以下に記載する分析化学および有機合成における実験手法は当技術分野において周知であり、一般に使用されている。標準的技術またはその変形が化学合成および化学分析に使用される。
の位置6〜10内に5個の連続するシトシン「CCCCC」を有する。
の通常スペーシングを有する6システインモチーフおよび多数の塩基性アミノ酸残基によって定義される。同様に、DEFB-126は、システイン残基の規範的コアおよび52のアミノ酸のC末端テールを有して、約12,000Daの分子量(推測アミノ酸配列に基づく)を生じさせるペプチドである。野生型ヒトDEFB-126のアミノ酸配列分析は、C末端テール内のO結合型グリコシル化のための少なくとも20の部位を識別する。霊長類DEFB-126ポリペプチドは高レベルの配列同一性を共有する(図12、Perry, et al, Biol. Reprod. 61:965-972 (1999); Schutte, et al., PNAS 99(4):2129-2133 (2002);およびRodriguez-Jimenez, Genomics 81 :175-183 (2003)を参照)。
によって定義される野生型DEFB-126ヌクレオチド配列の文脈的部分配列内の2ヌクレオチド「CC」欠失をいう。欠失多型を有するDEFB-126ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号:1の文脈的部分配列
の位置6〜10内に3個より多いシトシンを含有しない。図2も参照。DEFB-126欠失多型を有する例示的なDEFB-126核酸配列は、配列番号:13(GenBankアクセッション番号AK225987)、配列番号:14および配列番号:15(GenBankアクセッション番号CO408416)を含む。DEFB-126欠失多型フレームシフトが、天然の停止コドンの「リードスルー」を生じさせ、それにより、天然のタンパク質(たとえば配列番号:3、6〜12および図1)と比較してC末端領域が伸長したDEFB-126変異体ポリペプチド(たとえば配列番号:16〜18および図2および3)を生成する。
1)アラニン(A)、グリシン(G)、
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、
4)アルギニンI、リシン(K)、
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、および
7)セリン(S)、トレオニン(T)
(たとえばCreighton, Proteins (1984)を参照)。
I. 序文
本発明は、一部には、ある共通のDEFB-126欠失多型を有する個体が、野生型DEFB-126遺伝子型を有する個体と比較して、不妊症の高いリスクまたは可能性を示すという予想外の発見に基づく。遺伝子多型は、遺伝子の異なる対立遺伝子を区別するのに有用な方法を提供することができる。さらには、多型の存在が特定の表現型と対応することができる場合、その多型は、強力なマーカとして作用し、個体の遺伝子型構成に基づいて表現型結果を決定するために使用することができる。
本発明は、個体が低下した生殖能を有するかどうかを判定するために、DEFB-126をコードする遺伝子に関して該個体の遺伝子型を解析するための方法を提供する。そのような判定により、自身の遺伝子型が生殖能低下のリスクまたは可能性を伴うかどうかについて個別の知識が提供され、かつ該個体が適切な生殖能治療選択肢を受けることを可能にする。本発明はさらに、DEFB-126欠失多型の有無に基づいて不妊症の高いリスクを診断するのに有用であるキットを提供する。
受精能獲得が、受精に不可欠である最終的な精子成熟プロセスである。このプロセスの間、精子上に連続的な被膜を形成する一つの精巣上体由来タンパク質が放出される。このタンパク質は当初、ESP 13.2(精巣上体分泌タンパク質)と呼ばれていたが、しかし今は、βデフェンシンとのそのアミノ酸配列相同性および構造的類似に基づき、DEFB-126と呼ばれている(Lehrer et al, Mucosal Immunology, 3rd Ed., Academic Press: 95-110, (2004); Diamond and Bevins, Clin. Immunol. Immunopathol. 88:221-25 (1998))。DEFB-126は、そのCOOHテールがO結合型シアル酸によって高度にグリコシル化されている(Yudin et al., J. Membr. Biol. 207:119-29 (2005))。DEFB-126は、受精能獲得の前に、雌性生殖路による精子表面認識からの免疫保護シールドを提供すると考えられている(Yudin et al., Biol. Reprod. 73:1243-1252 (2005))。
によって定義される野生型DEFB-126ヌクレオチド配列の文脈的核酸部分配列内の2ヌクレオチド「CC」欠失である。DEFB-126欠失多型は、配列番号:1の文脈的部分配列
の位置6〜10内に3個より多いシトシンを含有しない(図2も参照)。欠失多型を有する例示的なDEFB-126核酸配列は、配列番号:13(GenBankアクセッション番号AK225987)、配列番号:14および配列番号:15(GenBankアクセッション番号CO408416)で提供されたヌクレオチド配列を有する。この欠失多型が存在するとき、新たに生成されたリーディングフレーム中には停止コドンが存在せず、それが伸長したポリリシンテールを生じさせる。野生型DEFB-126タンパク質は、C末端ドメインに負電荷を持ち込むO結合型糖質のためのアミノ酸残基を提供するが、DEFB-126突然変異体中のポリリシンテールはより正の電荷をこのドメインに持ち込む。
DEFB-126欠失多型は、非限定的に増幅、配列決定およびハイブリダイゼーション技術を含む、当技術分野において公知の任意の方法を使用して検出することができる。一つの塩基変化の存在に関して核酸を評価する検出技術は、分子遺伝学の分野において周知の手法を含む。核酸を増幅する方法が、本発明を実施する際に有用である。方法を実施するための十分な手引きが当技術分野において提供されている。例示的な参考文献は、マニュアル、たとえばPCR Technology: Principles And Applications For DNA Amplification(ed. H. A. Erlich, Freeman Press, New York, NY, (1992)); PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications (Innis, et al, eds., Academic Press, San Diego, CA, (1990)); Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel,(1990-2008。補遺改訂を含む); Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3rd Ed, 2001)を含む。
DEFB-126欠失多型は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して検出することができる。たとえば、DEFB-126野生型および変異体タンパク質は、発現した野生型および多型DEFB-126遺伝子のタンパク質産物の物理的違いを分析することによって検出することができる。
本発明はさらに、個体がDEFB-126欠失多型を有するかどうかを判定するのに有用な診断キットを提供する。キットは、DEFB-126座における個体の遺伝子型構成を分析する際に使用するためのポリヌクレオチドおよび/または個体のDEFB-126タンパク質産物を分析する際に使用するための抗体および/またはレクチンを含むことができる。キットは、DEFB-126ポリペプチド欠失もしくは突然変異または非発現性対立遺伝子を有する個体の治療に使用するためのポリペプチドを含むことができる。
一般に、個体の遺伝子型構成を試験する各キットは、一つまたは複数のポリヌクレオチド、たとえば本発明のDEFB-126欠失多型を含む遺伝子の部分を増幅するのに適したプライマー対、または野生型もしくは変異体DEFB-126核酸に選択的にハイブリダイズするプローブを含む。いくつかの態様において、キットは、個体から採取されたゲノムDNA試料の増幅に適したフォワードおよびリバースプライマーならびに使用のための使用説明書を含む。上記のように、生物学的試料は、ゲノムDNAが存在する任意の組織または流体からの試料であることができる。好都合には、試料は、血液、皮膚または毛球から採取することができる。
の位置6〜10における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示し、上述の部分配列の位置6〜10内の3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高いリスクまたは確率を示すということを示す。
一般に、個体が、野生型DEFB-126ポリペプチドを産生しているのか、変異体DEFB-126ポリペプチドを産生しているのかを試験する各キットは、上記のようにDEFB-126ポリペプチドを識別する少なくとも一つの抗体を含む。キットはさらに、使用のための使用説明書および所望の反応を実施するのに必要なコンポーネント、たとえばポリアクリルアミドゲル、二次抗体、緩衝液などを提供する。
いくつかの態様において、レクチン-DEFB126-抗体「サンドイッチ」手法を使用することもでき、そのような手法は、レクチンを「精子捕獲」戦略として使用することができる試験キットに非常に適合性であろう。たとえば、固体支持体に結合した適切なレクチンは、野生型DEFB126上のオリゴ糖を介して精子を拘束することができる。DEFB126の変異形態は、レクチンによって拘束されない、または低レベルで拘束される。DEFB126は、ホスホリパーゼCまたは高い塩およびpHの条件を用いる処理によって精子表面から放出させることができる(Yudin et al., (2003); Tollner et al., (2009))。DEFB126の比色検出の場合には、ビオチンまたは酵素にコンジュゲートしたモノまたはポリクロナール抗体を固相に適用することもできる。類似したサンドイッチアッセイ法が、モノクロナール抗体による、膵がんに伴う血清ムチンの検出の感度および特異性を大幅に高め(Neil Parker, (1998))、そのような方法は、本発明の方法に容易に適合することができる。
いくつかの態様において、ポリ-L-リシン(または類似したポリカチオン物質)を抗体とともに本明細書に記載するような「サンドイッチ」手法で使用することができる。
いくつかの態様において、本発明のキットはまた、男性不妊症の治療に使用するための、突然変異または非機能性DEFB-126ポリペプチドを発現する個体に対する、精子機能性の再構成(すなわち、受胎を達成する能力、たとえば頸管粘液(CM)浸透能力の再構成)のための機能性DEFB-126ポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様において、DEFB-126ポリペプチドは、非ヒト霊長類、たとえばカニクイザルから得られる。いくつかの態様において、DEFB-126はヒトから得られる。いくつかの態様において、DEFB-126は、組み換えDEFB-126であることができる(たとえば真核生物発現系、たとえば昆虫細胞中で発現する)。一般に、キットは、治療用「アドバック」法および薬学的組成物に関して本明細書に記載されるような、正常な生殖能の再構成を可能にする機能性DEFB-126ポリペプチドを含む。
a.欠陥DEFB-126ポリヌクレオチドの置換
不妊症評価の早期に個体がDEFB-126を有することを確証することにより、臨床医は、方向性のある治療介入、たとえば子宮内精子注入法(IUI)および体外受精(IVF)への速やかな移行を正当化するための科学的証拠を得ることができ、それにより、男女カップルにとって、長引く精密検査の時間および費用を節約する。
遺伝子治療処置に代えて、またはそれに加えて、野生型DEFB-126タンパク質を使用してDEFB-126突然変異または欠乏性精子を再構成して、同じく、不妊症に対する、より低廉でより非侵襲的な治療手法を提供することができる。欠陥または欠乏性DEFB-126ポリペプチドは、インビボ(たとえば膣内的に)またはインビトロで置換することができる。インビトロで機能的に回復させた精子は体外受精法において使用することができる。機能性DEFB-126ポリペプチドは、天然の供給源から(たとえば、機能性DEFB-126タンパク質を産生するヒトまたは非ヒト霊長類から)精製することもできるし、組み換え的に(たとえば真核生物発現系、たとえば昆虫細胞中で)産生することもできる。DEFB-126タンパク質は、本明細書および当技術分野において記載されているように精製することができる。
a. 可溶性DEFB-126の調製
DEFB-126を欠く、または突然変異体を含む精子は、頸管粘液(CM)浸透に関して欠陥があり、その結果、不妊症を生じさせる。DEFB-126をアドバックして、DEFB-126欠陥または欠乏性精子に対して精子機能性を再構成し(すなわち、受胎を達成する能力、たとえば頸管粘液(CM)浸透能力の再構成)、不妊症男性を潜在的に生殖可能にすることができる。
タンパク質アドバック実験は当技術分野において一般的かつ周知であり、十分に記載されている(Tollner et al., (2004, 2008a,b))。DEFB-126を、DEFB-126欠乏性の精子および突然変異または非機能性DEFB-126を有する精子に付加することができる。DEFB-126は、たとえば個体における非発現性対立遺伝子の存在のせいで、精子に存在しないこともある。DEFB-126は、たとえば、精子表面からDEFB-126ポリペプチドを取り出すための当技術分野において公知であるACTを使用して、精子から取り出すことができる(Tollner et al., (2004))。
頸管粘液(CM)ゲルは、周排卵期雌性カニクイザルから頸管粘液を採取することによって調製することができる。採取ののち、CMを、精子運動率実験における使用のために顕微鏡スライド上に調合することができる。このような実験は当技術分野において十分に記載されている(Tollner et al., (2008b))。
本発明はさらに、生理学的に許容可能な担体中に機能性DEFB-126ポリペプチドを含む組成物を提供する。一つの態様において、薬学的組成物は、受胎を達成するには不十分なDEFB-126しか発現していないヒト精子の機能性を回復または改善する際に使用するための、本明細書に記載されるような機能性非ヒトDEFB-126ポリペプチドまたはDEFB-126ポリペプチド模倣物を含む。
原核生物細胞系における組み換え発現のためにヒトDEFB-126をクローン化するとき、DEFB-126cDNAにおける配列変異が識別された。この特定のDEFB-126欠失多型は、ヒト集団において非常に一般的であると思われる。変異体DEFB-126のアミノ酸配列は、構造および機能の甚大な変化を生じさせる、有意に変化し、伸長したカルボキシル末端の糖質含有ドメインを有する。さらには、配列変異を有する精巣上体標本は、野生型精巣上体組織に比較して顕著に低いDEFB-126の発現を有する。
中国、安徽省(Anhui Province)の農村において妻とともに人口ベースの予測的生殖能・妊娠コホート研究に参加した638名の男性においてDEFB-126欠失多型を遺伝子型決定した。2003年7月から2005年2月の間の募集時、全員が最近結婚したところであり、登録時、妊娠中である女性はいなかった。生理不順および骨盤炎症をはじめとする女性側不妊要因に関して(n=81)、また、サブセット分析においては、慢性的細菌性前立腺炎の証拠をはじめとする男性側要因に関して(精液pH>8.0、n=110)、夫婦をこの分析から除外した。登録前1年以内に経口避妊薬またはIUDを使用したことのある59組の夫婦を除外した。追跡調査できなくなったさらに39組の夫婦に関してデータが不明であった。この分析は、残り355組の夫婦を含むものである。
wtおよび変異体遺伝子型を有するドナーからのヒト精子を、O結合型グリカンに特異的な構造であるガラクトース-GalNAc-セリン(またはトレオニン)を選択的に拘束するレクチンマッシュルーム(ABA)で標識した。DEFB126変異体(del/del)を有するドナーからの精子は、野生型ドナー(wt/wt、wt/del)に比べてABA関連蛍光の有意な低下を示した。ヒトDEFB126のアミノ酸配列分析が、O結合型グリコシル化のための少なくとも20の部位を識別する。ABAのための結合部位の有意な減少は、DEFB126が、DEFB-126欠失多型を有する男性からの精子の表面に吸着されない、またはそのオリゴ糖の、全部ではないとしても大部分を欠いていることのいずれかを示唆する。
精製されたDEFB126から切除されたO結合型オリゴ糖の質量スペクトルは、糖タンパク質の高度なアニオン性と合致する発見として、オリゴマーが高度にシアリル化されていることを示唆する。ヒト精子をノイラミニダーゼで処理し、パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドで処理し、FITCコンジュゲートしたレクチンABAとともにインキュベートした。DEFB126野生型ドナー(wt/wtおよびwt/del)からの精子とDEFB126遺伝子変異体のみを有するドナー(del/del)からの精子との間に蛍光における違いを明らかに見ることができる(図7A)。同じドナーからのレクチン標識された精子の強度をMetaMorph画像解析ソフトウェアで定量化した。36の精子/ドナーのデジタル画像をすべての処理に関して同じレベルに閾値設定し、平均画素強度を測定した(図7B)。予備的結果のためのタンデム型MSを実施するには不十分な量のオリゴ糖しかなかった。しかし、タンデム型MSによる構造解明および単糖組成分析を可能にする、本明細書で提案される後続の実験においては、より多くのオリゴ糖が得られる。
精巣上体体中でのDEFB-126の発現は、哺乳動物精子成熟の保存された特徴であると思われる。精巣上体体末端部中のDEFB-126の発現が以前にカニクイザル(Perry, et al., Biol. Reprod. 61:965-972 (1999))およびヒト(Rodriguez-Jimenez et al., Genomics 81:175-83 (2003))において記載されている。DEFB126の精巣上体体発現がカニクイザルにおいて立証された(図9A、Yudin et al., Biol. Reprod. 69:1118-1128 (2003))。DEFB-126オルソログ(Defb22)の精巣上体体発現がマウスにおいて立証された(図9BおよびC)。DEFB126(およびマウスオルソログDefb22)は、尾部への移動中に精子表面全体に吸着されるようになる。
DEFB-126は、交尾した雌性カニクイザルの上生殖路から回収されたカニクイザル精子上に保持される(Tollner et al, Hum. Reprod. 23:2523-34 (2008))。カニクイザル精子表面上のDEFB-126は、この部位への精子輸送中の多数の主要イベントにとってきわめて重要であると思われる。抗DEFB-126Igで処理されたカニクイザル精子は、周排卵期頸管粘液に浸透する能力の大幅な低下を示した(図10A)。阻害の相対的大きさは、DEFB-126を除去するために精子を処理した場合に類似していた(図9B; Yudin et al., Biol. Reprod. 69:1118-28 (2003))。DEFB126の「アドバック」がカニクイザル精子の粘液浸透能力を完全に回復させる(図10B)。ノイラミニダーゼによる精子の処理(末端シアル酸残基を除去する)がDEFB126の正味負電荷を急激に低下させ(Yudin et al., Biol. Reprod. 73:1243-1252 (2005))、粘液浸透を有意に阻害する。図10C。同様に、ポリ-L-リシンの添加によってカニクイザル精子の負表面電荷が中和されると、粘液浸透は阻害される。図10D。さらには、DEFB-126の損失は、多数の精子特異的表面タンパク質を抗体認識に暴露し(Yudin et al, Biol. Reprod. 73(6):1243-52 (2005))、卵管上皮に結合する精子の親和力を低下させる(Tollner et al., Biol. Reprod. 78:400-412 (2008))。それにもかかわらず、精子頭部からのDEFB126の損失は、精子が透明帯に結合するためには不可欠である(Tollner et al., Mol. Reprod. Dev. 69:325-37 (2004))。
精子機能のインビトロ試験のために、HAで構成された媒体を使用してCMを模倣した。CMは、子宮頸部で生成される少なくとも五つの別々のムチン分子に由来する複雑な生物物理学的性質を有するが(Gipson et al., 1997、Lagow et al., 1999)、HAから調製された溶液は、特に粘度および電荷に関して粘液の性質のいくつかを共有する(Gatej et al., 2005))。HAゲルは、ヒト精子による浸透性においてCMに非常に似ている(Tang et al., (1999); Neuwinger et al., (1991); Aitken et al., (1992))。ヒトCMの限られた利用性および高い変異性のため、精子機能の臨床評価においてはHAゲルが粘液代用物として使用されている(Aitken, (2006))。
レクチンおよびHA浸透実験のために遺伝子型決定された14名のドナーのうち、10名は、パートナとで受胎を試みたことがない、または非意図的に受胎を達成したことがない学生である。3名のドナー(2人はwt/del、1人はwt/wt)は、自然な手段によって子供をもうけており、1人のドナー(del/del)は、ART(Assisted Reproductive Technologies)プログラムにおける臨床治療介入後に子供をもうけていた。正常精液パラメータのWHO基準値(表2)は、ドナー#10(D10、del/del)が正常値を有し、生殖能ありと分類されるであろうことを示す。実際には、D10は不妊症である。このドナーおよびその配偶者(いずれも、臨床精密検査の時点では検出可能な不妊問題を有しなかった)は、数年にわたり受胎を試み、6サイクルの子宮内精子注入法(IUI)ののち、はじめて受胎した。対照的に、ドナー#12(D12、wt/wt)は、基準値未満の精子形態を有し、非常に低い精子数を有する。WHO標準による、このドナーは、不妊性または低受胎性である可能性が非常に高いと分類されるであろう。D12およびそのパートナは、避妊の使用における失敗の間に自発的に受胎した。表2は、一般に受け入れられている診断基準が不妊症を予測することができない状況を強調している。D10およびD12のいずれの場合でも、遺伝子型決定およびレクチン標識の結果(図16)が精子機能の試験(図17)および実際の生殖能状態と強く合致している。
DEFB126多型に関する遺伝子型決定は、不妊症プログラムにおいて実行される一連の標準診断試験の一つとして有用である。不妊症評価の早期において患者のDEFB126遺伝子型を確証することにより、臨床医は、方向性のある治療介入、たとえばIUIおよびIVFへの速やかな移行を正当化するための科学的証拠を得ることができ、それにより、男女カップルにとって、長引く精密検査の時間および費用を節約する。
レクチンおよび/または抗体を、精液試料中のDEFB126糖タンパク質の検出のための家庭用診断キットに用いられる利用可能な技術とともに使用することができる。本発明者らのデータは、del/delドナーからの精子が、野生型遺伝子を有するドナーからの精子よりも有意に少ないFITC-ABA標識を有するということを示す(図8および9)。標識強度における違いは、DEFB126「陽性」男性とDEFB126「陰性」男性とを区別することができる閾値の決定にとって十分に大きいと思われる。本発明者らは、以前、カニクイザルにおいて、レクチンABAおよび麦芽アグルチニン(WGA)が、無傷の(かつ生育可能な)精子およびウエスタンブロットにおいてDEFB126を強力に認識するということを実証した(Yudin et al., (2005))。ABAによる標識は、生きている精子および固定された精子で実施することができるステップとして、精子がはじめにシアリダーゼによって処理されることを要する(Yudin et al., (2005); Tollner et al., (2008))。
DEFB126は、精子から選択的に放出させ、精製し、濃縮し、そして、受精能獲得条件におけるインキュベーションののち、表面被膜を失った精子の表面にアドバックすることができる(図18、Tollner et al., (2004))。DEFB126を精子から放出させるための2mMカフェインによる処理後のカニクイザル精子の頭部の免疫蛍光標識強度およびDEFB126を含有するアドバック溶液の添加後のカフェイン処理された精子の評価。カフェインはDEFB126を頭部および中片から除去するが、受精能獲得を誘発することはない。抗DEFB126Igで標識された精子頭部の免疫蛍光画像は、すべての処理に関して同じ閾値レベルにあり、精子頭部ごとに、定量的画素解析を使用して平均画素面積およびグレー値を決定した。バーの高さが、処理された精子頭部の平均画素強度を表し、エラーバーがSEMを表す。カラムの上の文字(a、b)は処理の間の有意な差を示す(p≦0.05)(図は、Tollner, (2004)を修正したもの)。
本発明者らのデータは、Del/Delドナーからのヒト精子の表面へのカニクイザルからのDEFB126の付加が、これらの欠乏性精子の機能のレベルを、野生型遺伝子を有する男性からの精子に関して認められるレベルまで高めるということを実証する(図18)。この発見は非常に刺激的であり、非常に予想外である。このデータが暗示するところは明白である。本発明者らは、Del/Del遺伝子型を有する男性またはDEFB126精子被覆タンパク質を欠損していると診断される男性に対し、治療を提供することができる。より費用効果的な臨床医療介入を求める低受胎性男女カップルの場合、グリコシル化組み換えタンパク質を精液試料に加えたのち、人工的膣内精液注入を実施して「del/del」精子の生殖能を高めることができる。最終的に、組み換えペプチドは、精子表面へのペプチドの吸着を促進するように製剤化された膣泡沫またはゲルに濃縮することができる。ゲルは、家で簡単に適用することができ、男女カップルが受胎をより自然に達成することを可能にする。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金第AI032738号および第AI050843号のもとに、政府支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
[請求項1001]
DEFB-126をコードする核酸の部分配列
内の個体のDEFB-126対立遺伝子を決定する工程を含む、該個体が不妊症の高いリスクを有するかどうかを判定するための方法であって、該部分配列内の位置6〜10における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示し、該部分配列の位置6〜10内の3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高い確率を示す、方法。
[請求項1002]
前記部分配列が
であり、該部分配列内の位置11〜15における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示し、該部分配列の位置11〜15内の3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高い確率を示す、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
前記個体がヒトである、請求項1001記載の方法。
[請求項1004]
前記個体が雄性である、請求項1001記載の方法。
[請求項1005]
前記核酸がDNAである、請求項1001記載の方法。
[請求項1006]
前記核酸がRNAである、請求項1001記載の方法。
[請求項1007]
DEFB-126をコードする前記核酸が配列番号:4に対して少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1001記載の方法。
[請求項1008]
前記DEFB-126対立遺伝子が、DEFB-126をコードする核酸の部分配列
内の対立遺伝子を識別する一つまたは複数のポリヌクレオチドを使用する増幅反応によって検出される、請求項1001記載の方法。
[請求項1009]
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ローリングサークル増幅(RCA)、T7ポリメラーゼ媒介増幅、T3ポリメラーゼ媒介増幅およびSP6ポリメラーゼ媒介増幅からなる群より選択される、請求項1008記載の方法。
[請求項1010]
前記DEFB-126対立遺伝子が、DEFB-126をコードする核酸の部分配列
内の対立遺伝子を識別する一つまたは複数のポリヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションによって検出される、請求項1001記載の方法。
[請求項1011]
前記DEFB-126対立遺伝子が、DEFB-126の部分配列を配列決定することによって検出され、該部分配列が、核酸配列
を含む、請求項1001記載の方法。
[請求項1012]
前記DEFB-126対立遺伝子が制限酵素断片長多型によって検出される、請求項1001記載の方法。
[請求項1013]
前記DEFB-126対立遺伝子が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって検出される、請求項1001記載の方法。
[請求項1014]
個体から生物学的試料を得る工程、および該試料中のDEFB-126ポリペプチドの存在を決定する工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示し、DEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示す方法。
[請求項1015]
配列番号:12に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項1014記載の方法。
[請求項1016]
配列番号:6に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項1014記載の方法。
[請求項1017]
C末端アミノ酸配列PVSPTG(配列番号:3)を有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項1014記載の方法。
[請求項1018]
配列番号:16に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが不妊症の高い確率を示す、請求項1014記載の方法。
[請求項1019]
n=1〜50であるC末端アミノ酸配列
を有するDEFB-126ポリペプチドが不妊症の高い確率を示す、請求項1014記載の方法。
[請求項1020]
前記DEFB-126ポリペプチドが、該ポリペプチドのC末端に特異的に結合する抗体を使用して決定される、請求項1014記載の方法。
[請求項1021]
前記DEFB-126ポリペプチド変異体が、ELISA、免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質アレイ、レクチン結合、等電点電気泳動またはウエスタンブロットによって決定される、請求項1020記載の方法。
[請求項1022]
個体から精子試料を得る工程、および該試料を、ガラクトース-GalNAcまたはシアル酸を選択的に拘束するレクチンと接触させる工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、正常な対照と比較した該レクチンの低い結合レベルが不妊症の高い確率を示す、方法。
[請求項1023]
前記レクチンが、マッシュルーム(Agaricus bisporus)(ABA)、パラミツ(Artocarpus integrifolia)(Jacalin)、アメリカカブトガニ(Limulus polphemus)(LPA)、イヌエンジュ(Macackia amurenesis)(MAL II)またはコムギ胚芽(Triticum vulgaris)(WGA)およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1022記載の方法。
[請求項1024]
個体から精子試料を得る工程、および該試料をポリ-L-リシンと接触させる工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、正常な対照と比較した該ポリ-L-リシンの低い結合レベルが不妊症の高い確率を示す、方法。
[請求項1025]
個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、部分配列
内の該個体のDEFB-126対立遺伝子を識別する少なくとも一つのポリヌクレオチドと、該部分配列内の位置6〜10における5個の連続するシトシン「CCCCC」の存在が正常な生殖能を示すことおよび該部分配列の位置6〜10内の3個以下の連続するシトシン「CCC」の存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
[請求項1026]
個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、DEFB-126ポリペプチドを認識する少なくとも一つの抗体と、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
[請求項1027]
非機能性DEFB-126ポリペプチドに起因する生殖能低下を有する雄性個体を治療するための方法であって、該個体からの精巣上体細胞に、機能性DEFB-126ポリペプチドをコードする核酸を導入する工程を含む、方法。
[請求項1028]
個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、DEFB-126に特異的に結合する少なくとも一つのレクチンと、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
[請求項1029]
前記レクチンがガラクトース-GalNAcまたはシアル酸を選択的に拘束する、請求項1028記載のキット。
[請求項1030]
前記レクチンが、マッシュルーム(ABA)、パラミツ(Jacalin)、アメリカカブトガニ(LPA)、イヌエンジュ(MAL II)またはコムギ胚芽(WGA)およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1028記載のキット。
[請求項1031]
前記レクチンが検出可能な標識を含む、請求項1028記載のキット。
[請求項1032]
個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、ポリ-L-リシンと、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
[請求項1033]
前記ポリ-L-リシンが検出可能な標識を含む、請求項1032記載のキット。
[請求項1034]
受胎を達成するのに不十分なレベルの機能性DEFB-126を発現している個体からの精子の機能性を回復させるための方法であって、該個体から得られた精子試料を機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる工程を含む、方法。
[請求項1035]
前記精子をインビトロで機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる、請求項1034記載の方法。
[請求項1036]
前記精子を膣内で機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる、請求項1034記載の方法。
[請求項1037]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、デフェンシンコアモチーフおよびデフェンシンカルボキシル伸長モチーフを含む、請求項1034記載の方法。
[請求項1038]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:49のアミノ酸配列を有するデフェンシンコアモチーフ、および、配列番号:50のアミノ酸配列を有するデフェンシンカルボキシル伸長モチーフまたはそのより短い長さを含む、請求項1034記載の方法。
[請求項1039]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1034記載の方法。
[請求項1040]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1039記載の方法。
[請求項1041]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1039記載の方法。
[請求項1042]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:6を含む、請求項1039記載の方法。
[請求項1043]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:12に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1039記載の方法。
[請求項1044]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:12を含む、請求項1039記載の方法。
[請求項1045]
前記個体がヒトであり、前記ポリペプチドが非ヒトDEFB-126ポリペプチドである、請求項1039記載の方法。
[請求項1046]
機能性DEFB-126ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
[請求項1047]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドがデフェンシンコアモチーフおよびデフェンシンカルボキシル伸長モチーフを含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1048]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:49のアミノ酸配列を有するデフェンシンコアモチーフ、および、配列番号:50のアミノ酸配列を有するデフェンシンカルボキシル伸長モチーフまたはそのより短い長さを含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1049]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1050]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1051]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1052]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:6を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1053]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:12に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1054]
前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:12を含む、請求項1046記載の組成物。
[請求項1055]
泡沫である、請求項1046記載の組成物。
Claims (55)
- 前記個体がヒトである、請求項1記載の方法。
- 前記個体が雄性である、請求項1記載の方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項1記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項1記載の方法。
- DEFB-126をコードする前記核酸が配列番号:4に対して少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1記載の方法。
- 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ローリングサークル増幅(RCA)、T7ポリメラーゼ媒介増幅、T3ポリメラーゼ媒介増幅およびSP6ポリメラーゼ媒介増幅からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- 前記DEFB-126対立遺伝子が制限酵素断片長多型によって検出される、請求項1記載の方法。
- 前記DEFB-126対立遺伝子が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって検出される、請求項1記載の方法。
- 個体から生物学的試料を得る工程、および該試料中のDEFB-126ポリペプチドの存在を決定する工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示し、DEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示す方法。
- 配列番号:12に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項14記載の方法。
- 配列番号:6に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項14記載の方法。
- C末端アミノ酸配列PVSPTG(配列番号:3)を有するDEFB-126ポリペプチドが正常な生殖能を示す、請求項14記載の方法。
- 配列番号:16に対して少なくとも95%の配列同一性を共有するDEFB-126ポリペプチドが不妊症の高い確率を示す、請求項14記載の方法。
- 前記DEFB-126ポリペプチドが、該ポリペプチドのC末端に特異的に結合する抗体を使用して決定される、請求項14記載の方法。
- 前記DEFB-126ポリペプチド変異体が、ELISA、免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質アレイ、レクチン結合、等電点電気泳動またはウエスタンブロットによって決定される、請求項20記載の方法。
- 個体から精子試料を得る工程、および該試料を、ガラクトース-GalNAcまたはシアル酸を選択的に拘束するレクチンと接触させる工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、正常な対照と比較した該レクチンの低い結合レベルが不妊症の高い確率を示す、方法。
- 前記レクチンが、マッシュルーム(Agaricus bisporus)(ABA)、パラミツ(Artocarpus integrifolia)(Jacalin)、アメリカカブトガニ(Limulus polphemus)(LPA)、イヌエンジュ(Macackia amurenesis)(MAL II)またはコムギ胚芽(Triticum vulgaris)(WGA)およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- 個体から精子試料を得る工程、および該試料をポリ-L-リシンと接触させる工程を含む、該個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定する方法であって、正常な対照と比較した該ポリ-L-リシンの低い結合レベルが不妊症の高い確率を示す、方法。
- 個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、DEFB-126ポリペプチドを認識する少なくとも一つの抗体と、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
- 非機能性DEFB-126ポリペプチドに起因する生殖能低下を有する雄性個体を治療するための方法であって、該個体からの精巣上体細胞に、機能性DEFB-126ポリペプチドをコードする核酸を導入する工程を含む、方法。
- 個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、DEFB-126に特異的に結合する少なくとも一つのレクチンと、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
- 前記レクチンがガラクトース-GalNAcまたはシアル酸を選択的に拘束する、請求項28記載のキット。
- 前記レクチンが、マッシュルーム(ABA)、パラミツ(Jacalin)、アメリカカブトガニ(LPA)、イヌエンジュ(MAL II)またはコムギ胚芽(WGA)およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項28記載のキット。
- 前記レクチンが検出可能な標識を含む、請求項28記載のキット。
- 個体が不妊症の高い確率を有するかどうかを判定するためのキットであって、ポリ-L-リシンと、DEFB-126ポリペプチドの存在が正常な生殖能を示すことおよびDEFB-126ポリペプチドの非存在が不妊症の高い確率を示すことを述べている使用説明書とを含む、キット。
- 前記ポリ-L-リシンが検出可能な標識を含む、請求項32記載のキット。
- 受胎を達成するのに不十分なレベルの機能性DEFB-126を発現している個体からの精子の機能性を回復させるための方法であって、該個体から得られた精子試料を機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる工程を含む、方法。
- 前記精子をインビトロで機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる、請求項34記載の方法。
- 前記精子を膣内で機能性DEFB-126ポリペプチドと接触させる、請求項34記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、デフェンシンコアモチーフおよびデフェンシンカルボキシル伸長モチーフを含む、請求項34記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:49のアミノ酸配列を有するデフェンシンコアモチーフ、および、配列番号:50のアミノ酸配列を有するデフェンシンカルボキシル伸長モチーフまたはそのより短い長さを含む、請求項34記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項34記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:6を含む、請求項39記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:12に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の方法。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:12を含む、請求項39記載の方法。
- 前記個体がヒトであり、前記ポリペプチドが非ヒトDEFB-126ポリペプチドである、請求項39記載の方法。
- 機能性DEFB-126ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドがデフェンシンコアモチーフおよびデフェンシンカルボキシル伸長モチーフを含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:49のアミノ酸配列を有するデフェンシンコアモチーフ、および、配列番号:50のアミノ酸配列を有するデフェンシンカルボキシル伸長モチーフまたはそのより短い長さを含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6および配列番号:12からなる群より選択される配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:6に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:6を含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが、配列番号:12に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項46記載の組成物。
- 前記機能性DEFB-126ポリペプチドが配列番号:12を含む、請求項46記載の組成物。
- 泡沫である、請求項46記載の組成物。
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