KR101789910B1

KR101789910B1 - 쇼그렌 증후군 진단 마커로서 ｓｉｇｌｅｃ５의 용도

Info

Publication number: KR101789910B1
Application number: KR1020160007527A
Authority: KR
Inventors: 곽승기; 박성환; 이주하; 이재선; 고정희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2017-11-20
Also published as: KR20170087670A

Abstract

본 발명에 따른 쇼그렌 증후군 마커 단백질인 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)는 정상 대조군 타액에 비해 쇼그렌 증후군 환자의 타액에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있어, 환자의 체내 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 것이 조기에 쇼그렌 증후군을 객관적이고 정확하게 진단할 수 있게 하여 효과적으로 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다. 따라서 상기 본 발명에서 발굴한 SIGLEC5는 쇼그렌 증후군의 진단을 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

쇼그렌 증후군 진단 마커로서 ＳＩＧＬＥＣ５의 용도{Use of SIGLEC5 as a marker for the diagnosis of Sjogren's syndrome}

본 발명은 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)을 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 마커, 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물, 진단 또는 예후 분석용 키트 및 상기 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 마커를 이용한 쇼그렌 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.

쇼그렌 증후군은 외분비선의 만성 염증성 질환으로, 특히 침샘과 눈물샘의 정상 조직이 파괴되어 눈물과 침의 생성이 줄어드는 것이 특징인 질환이다. 이 질환은 1888년에 Johann Mikulicz에 의해 처음 보고 되었으며, 1933년에 스웨덴의 안과의사인 Henrik Sjogren이 류마티스 관절염이 있는 환자에서 본 질환을 기술하여 이와 같이 명명되게 되었다.

쇼그렌 증후군은 주로 눈과 침이 마르는 것이 주 증상이지만 침샘과 눈물샘의 침범 외에도, 샘외 증상(extraglandular manifestation)으로서 피부 및 기관지, 여성의 질의 점막과 폐와 신장도 침범하여 여러 증상을 야기하여 피로감, 통증이 심하며 삶의 질이 떨어지는 대표적인 질환이다. 쇼그렌 증후군은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증이나 피부근염 같은 다른 류마티스 질환과 동반되어 나타나기도 하는데 이 경우를 이차성 쇼그렌 증후군(Secondary Sjogren's syndrome)이라 칭한다. 반면 특정한 류마티스 질환이 없이 쇼그렌 증후군의 여러 증상이 나타나는 경우를 일차성 쇼그렌 증후군(Primary Sjogren's syndrome, PSS)이라고 한다. 이차성 쇼그렌 증후군을 동반하는 가장 흔한 질환은 류마티스 관절염으로 15% 정도가 쇼그렌 증후군과 동반된다. 쇼그렌 증후군은 남자보다 여자에서 9배정도 높게 발생되고, 중년 여성에서 잘 발생되며, 발생율은 여성 인구 만 명당 8명 정도로 추정된다.

쇼그렌 증후군의 원인은 아직까지 완전히 밝혀지지 않았지만 여러 가지 요인들이 관련할 것으로 여겨지며, 현재까지 가족력과 같은 유전적 요인과 바이러스, 사이토카인, 자가면역 항체들이 그 원인으로 보고되고 있다.

쇼그렌 증후군은 외분비선 조직을 파괴하는 전신적인 자가면역 질환으로 조직 검사에서 T 림프구의 침윤이 발견된다. 가장 흔하게 침범하는 외분비선은 침샘과 눈물샘으로 조직 검사하기가 비교적 쉬우며 조직에서 림프구의 침윤이 관찰되면 쇼그렌 증후군으로 진단할 수 있다. 환자들의 거의 대부분은 신체 표면의 외분비선에 염증이 있고, 25% 정도에서는 내부 장기도 침범될 수 있다. 염증이 생긴 외분비선에서는 악성 림프종이 발생가능한 것으로 알려져 있다.

이러한 쇼그렌 증후군은 서서히 발병하고 장기간 지속되므로 꾸준히 치료해야한다. 현재로서는 완치시키는 방법이 없으므로 치료의 주목적은 증상의 완화와 합병증의 방지에 있다. 치료는 증상의 중등도에 따라, 그리고 일차성이냐 이차성이냐에 따라 다른데, 일차성 쇼그렌 증후군은 눈에 인공 눈물을 정기적으로 넣고 식사 때와 평상시 물을 자주 마시는 보존적 치료를 수행하고, 이차성 쇼그렌 증후군은 그 원인 질환을 치료하면서 보존적 치료를 병행한다. 감기약과 항우울제 같은 일부 약물들은 이 질환의 증상을 악화시킬 수 있으므로 반드시 의사와 상의한 후 복용해야 하며, 건조한 환경을 피하고 호흡기를 자극할 수 있는 담배 연기 등도 피하고 정기적인 치과 검진과 치석 제거 등 치아 관리를 지속적으로 해야 한다.

따라서 주요 장기의 손상을 막는 가장 좋은 방법은 이를 조기에 진단하여 적절한 치료를 시행하는 것이다.

일반적으로 진단은 환자의 증상, 외분비선의 분비능의 객관적인 평가, 침샘과 눈물샘의 조직 소견, 자가면역 항체의 존재 유무를 종합하여 이루어지는데, 지난 40여 년 동안 쇼그렌 증후군의 진단 기준이 수차례 바뀌었으나 환자의 질병활성도를 평가하는 객관적인 지표가 없었다. 이에 몇 년 전 부터 유럽 류마티스 학회(European League against Rheumatism, EULAR)를 중심으로 질병활성도를 평가하는 지표들이 개발되었다. 이는 의사가 평가하는 질병의 활성도(EULAR Sjogrens Syndrome Disease Activity Index, ESSDAI)와 환자가 자각하는 증상으로 느끼는 지표(EULAR Patient Reported Index, ESSPRI)로 이루어진다. ESSDAI는 신증상과 림프절 병증, 샘 침범, 피부호흡기, 신장, 근육, 신경계, 혈액계, 그리고 생물학 이상으로 나어서 각각의 항목에 대한 활성도를 평가하여 합산하는 방식으로 수행되며, ESSPRI는 건조함, 통증, 피로감 세 가지 항목에 하여 환자가 호소하는 0부터 10까지의 visual analog scale의 평균값으로 측정한다.

그러나 이러한 진단방법은 다수 증상의 관찰 또는 입증을 요하기에 판단에 적지 않은 시간과 비용을 요구하며, 환자의 주관적인 판단이 상당부분 관여하여 이루어지기에 객관성이 확보되지 않는 것이 문제이다.

이에 본 발명자들은 쇼그렌 증후군의 진단 또는 예후의 분석에 있어 효율적이면서도 높은 정확성을 갖춘 객관적인 표지가 존재하는지 심도 있게 연구하였으며, 그 결과 일차성 쇼그렌 증후군의 발병 여부와 타액 등에 존재하는 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)의 양에 유의미한 관련성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국공개특허 2013-0052160A1

따라서 본 발명의 목적은 쇼그렌 증후군을 진단하거나 예후를 분석할 수 있는 마커로서 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5) 단백질 또는 SIGLEC5의 mRNA를 이용한 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 위와 같이 SIGLEC5 단백질 또는 SIGLEC5의 mRNA를 이용한 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 쇼그렌 증후군 마커인 SIGLEC5의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 쇼그렌 증후군의 발병을 진단 또는 예측하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SIGLEC5의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIGLEC5 단백질은 서열번호 2의 펩타이드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 쇼그렌 증후군의 진단은 타액 또는 혈청 및 말초혈액 단핵구 세포의 검체를 이용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SIGLEC5의 mRNA의 수준을 측정하는 물질은 SIGLEC5의 mRNA 또는 이의 상보적인 염기서열에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 물질은 SIGLEC5 단백질에 대한 항체, 기질, 수용체 또는 리간드일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), 인시튜(in situ) 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법, 질량분석법(mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 물질을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물들에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계;

(b) 상기 대상 생물학적 시료로부터 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 측정된 값을 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 쇼그렌 증후군의 발병을 진단 또는 예측하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 추가적으로 혈청 면역글로불린 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석, 인시튜 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법, 질량분석법 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 타액 또는 혈청일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타액에서 SIGLEC5을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되고, 상기 혈청 면역글로불린 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되거나 점수가 높아진 경우 쇼그렌 증후군 양성으로 판정될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 대상 생물학적 시료로부터 ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타액에서 SIGLEC5을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되고, 상기 ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 더 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대된 경우 쇼그렌 증후군 양성으로 판정될 수 있다.

본 발명에 따른 쇼그렌 증후군 마커 단백질인 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)은 정상 대조군 타액에 비해 쇼그렌 증후군 환자의 타액에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있어, 환자의 체내 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 것이 조기에 쇼그렌 증후군을 객관적이고 정확하게 진단할 수 있게 하여 효과적으로 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다. 따라서 상기 본 발명에서 발굴한 SIGLEC5는 쇼그렌 증후군의 진단을 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 전신성 자가면역질환 환자들의 혈청 내 SIGLEC5 수준을 비교한 것이다.
도 2는 일차성 쇼그렌 증후군 환자들의 증가된 타액 내 SIGLEC5 수준을 나타낸다.
도 3은 혈청 및 타액 내 SIGLEC5 간의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 4는 타액 내 SIGLEC5에 대하여 도시한 ROC 곡선이다.
도 5는 기준 값에 따라 구분된 타액 내 SIGLEC5 수준에 따라 나타나는 기타 임상 지표들을 표시한 것이다.
도 6은 쇼그렌 증후군 환자들의 혈청(좌) 및 타액(우) 내 CCR2 수준을 나타낸 것이다.
도 7은 쇼그렌 증후군 환자들의 혈청(좌) 및 타액(우) 내 ISG15 수준을 나타낸 것이다.

본 발명은 SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 쇼그렌 증후군을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 새로운 마커를 연구하던 중, 쇼그렌 증후군 환자의 타액에서 정상에 비해 특이적으로 발현이 증가되는 SIGLEC5 단백질을 발굴하였고, 이를 쇼그렌 증후군 진단을 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명은 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 쇼그렌 증후군 진단 마커로의 신규 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

SIGLEC5(sialic acid binding Ig-like lectin 5)은 SIGLEC5 유전자로 인코딩된 인간 단백질이다. SIGLEC5은 CD170(cluster of differentiation 170)으로도 알려져 있다. SIGLEC5 유전자는 시알산-결합 면역글로불린-유사 렉틴, 즉, SIGLEC 패밀리 중 하나를 인코딩한다. 이들 세포의 표면 렉틴은 면역글로불린(Ig)-유사 도메인 및 제1 Ig V 세트 도메인의 시알산 인지부의 구조적 모티프로 특징지어진다. 인코딩된 단백질은 SIGLEC의 CD33-관련 집합의 일원이며 단핵구, 마크로파지 및 호중구를 포함하는 몇몇 세포 종류의 활성화를 억제한다. 위 인코딩된 단백질에 대한 B군 연쇄상구균(group B Streptococcus, GBS)의 결합은 GBS 면역 회피의 역할을 한다. [RefSeq, Feb 2012] SIGLEC5와 같이 SIGLEC들은 단백질-탄수화물 상호작용을 매개하는 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리의 하위 집단이다. 이들은 특히 당단백질 및 당지질의 시알산과 상호작용하는 것으로도 알려져 있지만, 쇼그렌 증후군과 관련하여 SIGLEC5의 상호작용이나 발현의 상관성에 대해서는 지금까지 알려진 바가 없다.

본 발명에서는 다른 자가면역질환 환자들과는 다르게 일차성 쇼그렌 증후군 환자의 혈청에서는 SIGLEC5의 증가가 나타나지 않으나, 타액에서는 SIGLEC5이 동시에 과발현됨을 확인하였고, 또한 쇼그렌 증후군 환자의 타액 내 SIGLEC5의 증가와 혈청 내 IgG 수치 증가, 및 안구 염색 점수(ocular stain score, OSS) 증가가 상호간 유의한 상관관계가 있음을 최초로 규명하였다. 따라서 기존에 보고된 바 있는 SIGLEC5의 당단백질 및 당지질 상호작용의 역할과는 전혀 상이한 새로운 결과를 확인하였다.

본 발명의 하기 실시 예1에서는, 쇼그렌 증후군 환자의 혈청에서의 SIGLEC5 발현 양상을 조사한 결과, 일반적인 자가면역 질환인 류마티스 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스 환자들에서 나타나는 SIGLEC5 과발현양상과는 다르게, 쇼그렌 증후군 환자들의 경우 정상 대조군과 유사한 수준의 SIGLEC5이 발현된 한편; 쇼그렌 증후군 환자의 타액에서의 SIGLEC5 발현은 정상 대조군과 비교하여 현저하게 과발현됨을 확인하였다(도 1, 2 참조).

또한, 본 발명의 하기 실시예2에서는 측정된 혈청 및 타액 내의 SIGLEC5의 수준이 서로 강한 양의 상관관계가 있음을 발견하였으며, 다른 패러미터와의 관련성을 연구하기 위하여 ROC 곡선을 그려 기준 값을 설정하고, 기준 값 이상의 타액 SIGLEC5을 나타내는 환자는 혈청 면역글로불린 값도 높게 나타나며, 안과적인 지표인 OSS가 높게(보다 각막 및 결 막 표면에 미란이 많은 상태) 상호관련하며 이들과 함께 쇼그렌 증후군의 지표로 사용할 잠재력이 있음을 확인하였다(도 3 내지 5 참조).

따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 마커 단백질인 SIGLEC5의 발현 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 양을 측정함을 통해 쇼그렌 증후군의 여부를 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 더 나아가 환자의 혈청 면역글로불린 수치와 안구 염색 점수에 의하여 진단의 정확성을 한층 더 높일 수 있다는 점을 파악했다.

그러므로 본 발명은 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 SIGLEC5 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체, 기질, 수용체 및 리간드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 mRNA의 수준은, 단백질로 번역되기에 앞선 mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 mRNA 또는 이의 상보적인 염기서열에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 SIGLEC5의 mRNA 또는 이의 상보적인 염기서열에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 앱타머는 상기 mRNA로 전사되기 이전의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당 업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 바람직하게 상기 SIGLEC5의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 SIGLEC5 단백질은 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 항체는 당해 기술 분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 마커 또는 상기 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트는 상기 마커 단백질인 SIGLEC5의 발현 수준 또는 상기 단백질로 번역되기 위한 mRNA의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 SIGLEC5 단백질의 발현수준 또는 SIGLEC5의 mRNA을 측정하는 방법을 통해 쇼그렌 증후군을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 제1항에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계; (b) 상기 대상 생물학적 시료로부터 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 측정된 값을 기준치와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 SIGLEC5 단백질의 발현수준 또는 SIGLEC5의 mRNA의 양을 측정하는 방법은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석, 인시튜 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법, 질량분석법 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 공지의 기술로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

ISG15 유전자는 인간에서 인터페론-유도 17kDa 단백질로 번역되는 유전자이다.(Blomstrom DC, et al. J Biol Chem 261 (19): 8811-6) ISG15는 기타 유비퀴틴-유사 분자(ubiquitin-like molecules, UBLs)와 몇 가지 공통점을 공유하는데, 이의 활성은 타고난 면역성에 대해 역할을 가지는 특이적 신호경로에 의하여 엄격하게 규제된다. ISG15는 이의 발현이 제I형 인터페론 또는 리포폴리사카라이드 처치에 대응하여 유도되어서 인터페론 자극 유전자(interferon stimulated gene, ISG)로 확인되었다. 인터페론 처치에 의해, ISG15의 자유 및 공명된 형태가 모두 검출될 수 있으며, 단핵구 및 림프구에서 분비되어 이것이 사이토카인으로 작용된다.

C-C 케모킨 수용체 2(C-C chemokine receptor type 2, CCR2) 또는 분화 클러스터 192(cluster of differentiation 192, CD192)는 인간 내에서 CCR2 유전자로 인코딩되는 단백질이다. CCR2는 케모킨 수용체로 작용한다. 이러한 CCR2 유전자는 케모킨 수용체 융전자 클러스터 영역 내에 위치한다. 이 유전자에 의해 두개의 선택적으로 나누어진 전사 변이체가 발현된다.

이 유전자는 단핵구 주화성을 특이적으로 매개하는 케모킨으로서, 단핵구 화학주성 단백-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1, MCP-1)을 위한 두개의 수용체 아형을 인코딩한다. 단핵구 화학주성 단백-1은 종양에 대한 항염증 반응 못지 않게 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환의 단핵구 침윤에 관여한다. 이 유전자에 의해 인코딩된 수용체는 작용제-의존성 칼슘 동원(agonist-dependent calcium mobilization) 및 아데닐 시클라아제의 억제를 매개한다. 야생형 마우스와 비교하여 CCR2가 결여된 마우스에서 알츠하이머-유사 병리가 발달됨을 보여줌이 당업계에 공지된 바 있다.(El Khoury J, et al. Nat. Med. 13 (4): 432-8, Philipson O, et al. FEBS J. 277 (6): 1389-409).

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 쇼그렌 증후군의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 단백질의 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군과는 다를 수 있는 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 상기 기술된 방법으로 mRNA의 수준을 측정하는 것이다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, 유세포분석법, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 단백질의 양 또는 mRNA 발현 양과 쇼그렌 증후군 환자 또는 쇼그렌 증후군 의심환자에서의 마커 단백질의 양 또는 mRNA 발현 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 쇼그렌 증후군의 발병 여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 쇼그렌 증후군의 발병을 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군 마커 단백질인 SIGLEC5의 발현 수준 또는 양이 생물학적 시료 중 타액에 있어서 정상 대조군보다 증가되었을 경우, 쇼그렌 증후군이 유발된 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에서, (a) 단계는 추가적으로 혈청 면역글로불린, 특히 IgG의 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정할 수 있다.

안구 염색 점수(ocular stain score, OSS)는 리사민 그린(lissamine green)으로 결막을 염색하고 형광(fluorescein)으로 각막을 염색하여 안구의 손상 정도를 평가하는 절차로서, 점수가 높을수록 보다 각막 및 결 막 표면에 미란이 많은 상태임을 의미한다. 미국 류마티스 학회에서는 OSS가 3점 이상을 기록할 경우 쇼그렌 증후군의 진단의 지표로 활용한다.

본 발명의 하기 실시 예2에서는 설정된 기준 값 이상의 타액 SIGLEC5을 나타내는 환자는 혈청 면역글로불린 값도 높게 나타나며, 안과적인 지표인 OSS가 높게 나타나는 바, 이들이 상호관련하며 SIGLEC5와 함께 쇼그렌 증후군의 지표로 사용할 잠재력이 있음을 확인하였다(도 5 참조).

따라서 이러한 결과를 통해, 타액에서 SIGLEC5 측정 시 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되고, 혈청 면역글로불린 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정 시 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되거나 점수가 높아진 경우 쇼그렌 증후군 양성으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 명세서에서 용어앱타머는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자로서 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하여 작용을 나타내는 것을 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000);Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 "siRNA"라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 마커 단백질의 발현 및 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 ROC 곡선(receiver operative characteristic curve)은 검사 방법의 유용성 및 절단 값(cut-off value)를 판단을 위하여 사용하는 것으로서, 진단 테스트의 각각 다른 가능한 절단 점에 대한 위양성율(1-특이도; x축)와 그에 대한 실제 양성율(민감도; 1-위음성율, y축)을 그래프로 표현한 것이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시 예1>

혈청( serum ) 검체 준비

서울성모병원 류마티스 내과에 내원한 126명의 일차성 쇼그렌 환자(PSS), 20명의 류마티스 관절염 환자, 20명의 전신성 홍반성 루푸스 환자, 그리고 나이 및 성별이 비슷한 69명의 건강인 대조군(healthy control)의 혈액을 채취하여, 혈청을 통상적인 방법에 의해 원심분리한 후 분리된 혈청을 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

타액( saliva ) 검체 준비

상기 혈청 검체 준비 과정에 참여한 환자 및 대조군 중 일차성 쇼그렌 환자 106명, 전신성 홍반성 루푸스 환자 11명, 및 나이 및 성별이 비슷한 건강인 대조군 24명을 상대로 타액 검체를 수집하였다.

타액 검체를 얻기 위해서 뚜껑이 있는 50mL 튜브를 준비하였다. 환자에게는 12시간 동안 필로카르핀(pilocarpine)과 같은 타액 분비에 영향을 주는 부교감신경계 작용 약제를 중단하였고, 인공 타액의 경우 타액 수집 3시간 전에는 중단하였으며, 검사 전 90분에는 수분의 섭취를 금지하였고, 입도 헹구지 않도록 사전에 안내하였다. 타액을 수집하는 동안 환자는 앉아서 침을 뱉도록 하였으며, 얼굴과 입을 움직여 침을 모으는 동작을 가급적 하지 않도록 안내하였다. 총 5분간 수집한 침은 비자극 타액 검체로서 수집되었다.

비자극 타액 검체를 수집한 후, 쇼그렌 증후군 환자의 경우에는, 비자극 타액 검체의 양이 부족하여 자극성 타액을 수집하였다. 쇼그렌 증후군 환자는 파라핀 검을 분당 약 70회의 속도로 씹으면서 처음 1분 동안 생긴 침은 뱉어서 버리게 하고, 다음 5분 동안은 매 1분마다 입안에 생긴 침을 검사용 튜브에 뱉도록 하여 타액을 수집하고, 파라핀 검은 따로 뱉어서 버리게 하였다.

타액 검체는 8000rpm, 4℃에서 1분 간 원심분리 후 상등액을 취해 분주하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

상기 수집한 혈청과 타액 검체를 SIGLEC5의 측정에 사용하기 위하여 각각 1% 우혈청 알부민이 포함된 인산완충액(pH7.4)으로 10배 희석하였다.

SIGLEC5 의 측정

총 SIGLEC5의 양은 human SIGLEC-5 Duoset ELISA development system (R&D systems, 제품번호 DY1072, Minneapolis, MN)를 이용해 측정하였다. 측정방법은 이하와 같다.

0.05M 농도의 sodium carbonate(sigma) 용액(pH 9.6)에 180μg/ml의 anti-SIGLEC5 항체를 180배 희석하여 1μg/ml의 농도로 ELISA용 96웰플레이트(Nunc)에 100μl/well로 분주한 후 실온에서 16시간 동안 방치하였다. 0.05% Tween20(amresco)가 포함된 인산완충용액(pH7.4)으로 4회 세척한 다음, 1% 우혈청 알부민이 포함된 인산완충용액(pH 7.4)을 200μl/well로 분주한 후 실온에서 2시간 동안 방치하여 비특이 반응을 억제시켰다. 세척용 완충용액으로 4회 세척한 다음 재조합 SIGLEC5 3000 pg/ml로 희석한 용액(희석액: 1% 우혈청 알부민이 포함된 인산완충용액)을 2배 단계 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 희석된 혈청 또는 침 검체를 표준용액과 함께 플레이트에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 4회 세척 후 비오틴이 부착된 anti-SIGLEC5 항체를 0.5μg/ml의 농도로 희석한 뒤 플레이트에 100μl/well로 분주하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 4회 세척 후 streptavidin-HRP 용액을 200배 희석하여 플레이트에 100μl/well로 분주하고 실온에서 20분간 반응시켰다. 4회 세척 후 Tetramethyl-benzidine substrate 용액 (ebioscience, San Diego, CA)을 50μl/well씩 넣고 약 10분간 반응시킨 후 2N H₂SO₄를 50μl/well씩 넣어 반응을 멈추고, 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 농도의 표준용액에 대한 흡광도 값으로 대조하여 정량하였다.

그 결과, 혈청에 존재하는 SIGLEC5의 양은 69명의 건강 대조군에서 평균(median) 3313.0 pg/ml (726.7 내지 4764.8 pg/ml, 이는 제25-75 백분위 수를 의미하며, 이하 동일하다), 126명의 쇼그렌 증후군 환자에서 3263.9 pg/ml, (14.2 내지 4340.8 pg/ml), 20명의 류마티스 관절염 환자에서 6769 pg/ml (7.038 내지 13218 pg/ml), 20명의 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 7760 pg/ml (6569 내지 9192 pg/ml)의 분포를 보였다(도 1 참조). 따라서 쇼그렌 증후군 환자의 혈청 내 SIGLEC5는 다른 자가면역 질환 대조군인 류마티스 관절염 환자 및 전신성 홍반성 루푸스 환자에 비해 건강 대조군과 유사하게 낮은 혈청 내 SIGLEC5 분포를 보임을 확인할 수 있었다.

반면, 타액 검체의 SIGLEC5의 양은 25명의 건강 대조군에서 평균 52.84 pg/ml (0 내지 196.4 pg/ml), 106명의 쇼그렌 증후군 환자에서 평균 189.3 pg/ml (44.3 내지 465.9 pg/ml)의 분포를 보였다(도 2 참조). 도 2에 도시된 바와 같이, 타액 검체에서 정상대조군에 비해 쇼그렌 증후군 환자는 현저히 많은 양의 SIGLEC5를 검출할 수 있었다. 이는 통계적으로도 유의하게 (P=0.005) 증가한 수준이었다.

CCR2 의 측정

총 CCR2의 양은 ELISA kit for Chemokine C-C-Motif Receptor 2 (USCN, 제품번호 SEA914Hu, Houston, TX)를 이용해 측정하였다. 측정방법은 제조사의 제공 방법에 따라 수행하였고 구체적으로 기재하면 다음과 같다.

제공된 검체 희석용액으로 혈청을 10배 희석하였으며 타액은 희석하지 않고 그대로 사용하였다. 제공된 재조합 CCR2를 10 ng/ml로 희석한 용액을 2배 단계 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 희석된 혈청 또는 타액 검체를 표준용액과 함께 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 제공된 검출A용액을 플레이트에 100μl/well씩 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 제공된 세척 용액으로 4회 세척 후, 제공된 검출B용액을 100μl/well씩 넣은 뒤 37℃에서 30분간 동안 반응시켰다. 4회 세척 후 Tetramethyl- benzidine substrate 용액을 90μl/well씩 넣고 약 15분간 반응시킨 후 1N H₂SO₄를 50μl/well씩 넣어 반응을 멈추고, 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 농도의 표준용액에 대한 흡광도 값으로 대조하여 정량하였다.

그 결과, 혈청에 존재하는 CCR2의 양은 28명의 건강 대조군에서 평균(median) 317 pg/ml (0.0 내지 1219 pg/ml, 이는 제25-75 백분위 수를 의미한다) 검출되었으나, 52명의 쇼그렌 증후군 환자에서는 거의 검출되지 않았다. 따라서 쇼그렌 증후군 환자의 혈청 내 CCR2는 건강 대조군에 비해 낮은 혈청 내 CCR2 분포를 보임을 확인할 수 있었으며 이는 통계적으로 유의한 수준이었다(***, p=0.0002). 반면, 타액 검체의 CCR2의 양은 25명의 건강 대조군에서 평균 1876 pg/ml (173 내지 7809 pg/ml), 84명의 쇼그렌 증후군 환자에서 평균 2533 pg/ml (1031 내지 11490 pg/ml)의 분포를 보였으며, 11명의 질환대조군인 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 평균 6951 pg/ml (4284 내지 10070 pg/ml)의 분포를 보였다. 타액 검체에서 정상대조군에 비해 쇼그렌 증후군 및 전신성 홍반성 루푸스 환자는 현저히 많은 양의 CCR2를 검출할 수 있었다. 이는 통계적으로도 유의하게 (HC 대 SS; *, P=0.0.041, HC 대 SLE;*, P=0.039) 증가한 수준이었다(도 6 참조).

ISG15 의 측정

총 ISG15의 양은 CircuLex Human ISG15 ELISA kit (MBL, 제품번호 CY-8085, Woburn, MA)를 이용해 측정하였다. 측정방법은 제조사의 추천을 따랐으며 간단히 기술하면 다음과 같다. 제공된 검체 희석용액으로 혈청과 타액을 10배 희석하여 사용하였다. 제공된 재조합 ISG15을 12 ng/ml로 희석한 용액을 2배 단계 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 희석된 혈청 또는 타액 검체를 표준용액과 함께 플레이트에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 제공된 세척 용액으로 4회 세척 후 비오틴이 부착된 anti-ISG15 항체분말을 12ml의 희석용액에 녹인 뒤 플레이트에 100μl/well로 분주하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 4회 세척 후 Tetramethyl-benzidine substrate 용액을 100μl/well씩 넣고 약 10분간 반응시킨 후 1N H₂SO₄를 100μl/well씩 넣어 반응을 멈추고, 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 농도의 표준용액에 대한 흡광도 값으로 대조하여 정량하였다.

그 결과, 혈청에 존재하는 ISG15의 양은 20명의 건강 대조군에서 평균(median) 1.5 pg/ml (0.0 내지 297.5 pg/ml, 이는 제25-75 백분위 수를 의미하며, 이하 동일하다), 60명의 쇼그렌 증후군 환자에서 964.5 pg/ml, (0.0 내지 2346 pg/ml)의 분포를 보였다. 따라서 쇼그렌 증후군 환자의 혈청 내 ISG15은 건강 대조군에 비해 높은 혈청 내 ISG15 분포를 보임을 확인할 수 있었다.

또한, 타액 검체의 ISG15의 양은 25명의 건강 대조군에서 평균 69.0 pg/ml (0 내지 230 pg/ml), 124명의 쇼그렌 증후군 환자에서 평균 484.0 pg/ml (0 내지 1245 pg/ml)의 분포를 보였으며, 11명의 질환대조군인 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 평균 580.8 pg/ml (186 내지 1444 pg/ml)의 분포를 보였다. 타액 검체에서 정상대조군에 비해 쇼그렌 증후군 및 전신성 홍반성 루푸스 환자는 현저히 많은 양의 ISG15을 검출할 수 있었다. 이는 통계적으로도 유의하게 (**; P<0.01, ***; P<0.001) 증가한 수준이었다(도 7 참조).

< 실시예 2>

통계 유의성 검증

데이터는 GraphPad Prism (Version 5 for Windows; GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 분석되었다. 실험결과는 평균±표준 오차로 나타냈으며, 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test 혹은 one-way analysis of variance (ANOVA)-bonferronis multiple comparison tests를 이용하여 분석하였다. 혈청 검체와 타액 검체의 상관관계를 관찰하기 위해서 Spearmans correlation analysis를 시행하였다.

또한, 쇼그렌 증후군 환자와 정상인을 구분하는 타액 SIGLEC5 값을 정하기 위해서 ROC 곡선을 그리고, 이 곡선에서 민감도와 특이도가 높은 값을 기준 값으로 설정한 후 이를 기준으로 타액의 SIGLEC5이 기준 값보다 높고 낮음을 구분하여 임상적인 의미가 있는지를 판단하였다. 연속성 변수의 경우, Mann-Whitney U test로, 범주형 변수의 경우, X2 test로 분석하였다.

모든 통계적 분석에서 P 값이 0.05보다 이하일 때 유의하다고 기술하였다.

정상대조군 또는 쇼그렌 증후군 환자군인지의 여부와 상관없이, 혈청과 타액의 SIGLEC5는 Spearman 계수로 0.708으로 강한 양의 상관관계를 보였고, 이는 통계적으로 유의한 (P < 0.001) 수준이었음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

실시 예1에서 구한 타액 데이터를 토대로 산출한 ROC 곡선에 의하여 high SIGLEC5와 low SIGLEC5을 나누는 기준 값을 210 pg/ml로 정하였다(도 4 참조).

나아가 구한 타액 내 SIGLEC5 기준 값에 대하여 환자들의 나이, 신체질량지수(body mass index, BMI), 환자의 샘외 증상과 관련된 ESSDAI 지표, 환자 본인의 주관적인 불편감을 나타내는 ESSPRI 지표, 혈청 내 IgG(mg/dL) 값, 안구 염색 점수, 구강 건조의 주관적인 지표인 xerostomia inventory나 15분간 비자극 타액이 1.5 mL 이하를 보이는 경우의 다른 8가지 패러미터들과 비교해보았다.

그 결과, 기준 값 이상의 타액 SIGLEC5을 나타내는 환자의 경우 대다수가 높은 혈청 내 IgG(mg/dL) 값과 안구 염색 점수를 나타내는 것으로 나타났으며(도 5 참조), 실제로 이들 패러미터에 대한 p-값도 0.05 미만으로 나타나 높은 혈청 면역글로불린 값 및 OSS 값과 유의한 관련성이 있는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of SIGLEC5 as a marker for the diagnosis of Sjogren's syndrome <130> pn1507-196 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2523 <212> DNA <213> SIGLEC5 DNA sequence <400> 1 gtgcgcgtcc acagctctca ctcaccctcc ggcttcctgt cggggctttc tcagccccac 60 cccacgtttg gacatttgga gcatttcctt ccctgacagc cggacctggg actgggctgg 120 ggccctggcg gatggagaca tgctgcccct gctgctgctg cccctgctgt ggggggggtc 180 cctgcaggag aagccagtgt acgagctgca agtgcagaag tcggtgacgg tgcaggaggg 240 cctgtgcgtc cttgtgccct gctccttctc ttacccctgg agatcctggt attcctctcc 300 cccactctac gtctactggt tccgggacgg ggagatccca tactacgctg aggttgtggc 360 cacaaacaac ccagacagaa gagtgaagcc agagacccag ggccgattcc gcctccttgg 420 ggatgtccag aagaagaact gctccctgag catcggagat gccagaatgg aggacacggg 480 aagctatttc ttccgcgtgg agagaggaag ggatgtaaaa tatagctacc aacagaataa 540 gctgaacttg gaggtgacag ccctgataga gaaacccgac atccactttc tggagcctct 600 ggagtccggc cgccccacaa ggctgagctg cagccttcca ggatcctgtg aagcgggacc 660 acctctcaca ttctcctgga cggggaatgc cctcagcccc ctggaccccg agaccacccg 720 ctcctcggag ctcaccctca cccccaggcc cgaggaccat ggcaccaacc tcacctgtca 780 gatgaaacgc caaggagctc aggtgaccac ggagagaact gtccagctca atgtctccta 840 tgctccacag accatcacca tcttcaggaa cggcatagcc ctagagatcc tgcaaaacac 900 ctcatacctt ccggtcctgg agggccaggc tctgcggctg ctctgtgatg ctcccagcaa 960 cccccctgca cacctgagct ggttccaggg ctcccctgcc ctgaacgcca cccccatctc 1020 caataccggg atcttggagc ttcgtcgagt aaggtctgca gaagaaggag gcttcacctg 1080 ccgcgctcag cacccgctgg gcttcctgca aatttttctg aatctctcag tttactccct 1140 cccacagttg ctgggcccct cctgctcctg ggaggctgag ggtctgcact gcagatgctc 1200 ctttcgagcc cggccggccc cctccctgtg ctggcggctt gaggagaagc cgctggaggg 1260 gaacagcagc cagggctcat tcaaggtcaa ctccagctca gctgggccct gggccaacag 1320 ctccctgatc ctccacgggg ggctcagctc cgacctcaaa gtcagctgca aggcctggaa 1380 catctatggg tcccagagcg gctctgtcct gctgctgcaa gggagatcga acctcgggac 1440 aggagtggtt cctgcagccc ttggtggtgc tggtgtcatg gccctgctct 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Leu Glu Pro Leu Glu Ser Gly Arg Pro Thr 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ser Leu Pro Gly Ser Cys Glu Ala Gly Pro Pro Leu 165 170 175 Thr Phe Ser Trp Thr Gly Asn Ala Leu Ser Pro Leu Asp Pro Glu Thr 180 185 190 Thr Arg Ser Ser Glu Leu Thr Leu Thr Pro Arg Pro Glu Asp His Gly 195 200 205 Thr Asn Leu Thr Cys Gln Met Lys Arg Gln Gly Ala Gln Val Thr Thr 210 215 220 Glu Arg Thr Val Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Pro Gln Thr Ile Thr 225 230 235 240 Ile Phe Arg Asn Gly Ile Ala Leu Glu Ile Leu Gln Asn Thr Ser Tyr 245 250 255 Leu Pro Val Leu Glu Gly Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Pro 260 265 270 Ser Asn Pro Pro Ala His Leu Ser Trp Phe Gln Gly Ser Pro Ala Leu 275 280 285 Asn Ala Thr Pro Ile Ser Asn Thr Gly Ile Leu Glu Leu Arg Arg Val 290 295 300 Arg Ser Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu 305 310 315 320 Gly Phe Leu Gln Ile Phe Leu Asn Leu Ser Val Tyr Ser Leu Pro Gln 325 330 335 Leu Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Arg 340 345 350 Cys Ser Phe Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ser Leu Cys Trp Arg Leu Glu 355 360 365 Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Gly Ser Phe Lys Val Asn 370 375 380 Ser Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ile Leu His Gly 385 390 395 400 Gly Leu Ser Ser Asp Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Trp Asn Ile Tyr 405 410 415 Gly Ser Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Leu Gln Gly Arg Ser Asn Leu 420 425 430 Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Met Ala 435 440 445 Leu Leu Cys Ile Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Leu Ile Val Lys Ala 450 455 460 Arg Arg Lys Gln Ala Ala Gly Arg Pro Glu Lys Met Asp Asp Glu Asp 465 470 475 480 Pro Ile Met Gly Thr Ile Thr Ser Gly Ser Arg Lys Lys Pro Trp Pro 485 490 495 Asp Ser Pro Gly Asp Gln Ala Ser Pro Pro Gly Asp Ala Pro Pro Leu 500 505 510 Glu Glu Gln Lys Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Ser Glu Met 515 520 525 Lys Ser Arg Glu Pro Lys Asp Gln Glu Ala Pro Ser Thr Thr Glu Tyr 530 535 540 Ser Glu Ile Lys Thr Ser Lys 545 550

Claims

SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SIGLEC5의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIGLEC5 단백질은 서열번호 2의 펩타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 쇼그렌 증후군의 진단은 타액 또는 혈청 및 말초혈액 단핵구세포의 검체를 이용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SIGLEC5의 mRNA의 수준을 측정하는 물질은 SIGLEC5의 mRNA 또는 이의 상보적인 염기서열에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 물질은 SIGLEC5 단백질에 대한 항체, 기질, 수용체 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석(RNase protection assay, S1 nuclease assay), 인시튜(in situ) 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법, 질량분석법(mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 물질을 추가적으로 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 키트.
(a) 제1항에 따른 쇼그렌 증후군 진단 또는 예후 분석용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계;
(b) 상기 대상 생물학적 시료로부터 SIGLEC5의 mRNA 또는 SIGLEC5 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 측정된 값을 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 쇼그렌 증후군의 발병을 진단 또는 예측하기 위해 정보를 제공하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 (a) 단계는 추가적으로 혈청 면역글로불린 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석, 인시튜 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법, 질량분석법 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 SIGLEC5의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIGLEC5 단백질은 서열번호 2의 펩타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 타액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 타액에서 SIGLEC5를 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되고, 상기 혈청 면역글로불린 수준 또는 안구 염색 점수를 더 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되거나 점수가 높아진 경우 쇼그렌 증후군 양성으로 판정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
(d) 상기 대상 생물학적 시료로부터 ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 타액에서 SIGLEC5를 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대되고, ISG15 유전자의 mRNA, ISG15의 단백질, CCR2의 mRNA 및 CCR2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 더 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 수준이 증대된 경우 쇼그렌 증후군 양성으로 판정되는 것을 특징으로 하는 방법.