KR102452510B1 - 구강건조증을 진단하기 위한 타액 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

구강건조증을 진단하기 위한 타액 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

구강건조증 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 구강건조증의 진단 방법을 제공한다. 이에 따르면, 구강건조증을 간편하고 객관적이고, 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.

Description

구강건조증을 진단하기 위한 타액 바이오마커 및 이의 용도{Salivary biomarker for diagnosing xerostomia and use thereof}
구강건조증을 진단하기 위한 타액 바이오마커, 이를 이용한 구강건조증 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 바이오마커의 검출 방법에 관한 것이다.
타액선 기능은 여러가지 상태에 따라 영향을 받게 된다. 구강건조증은 입 안에 침이 없어, 주관적으로 구강 건조함을 느끼는 것이다. 구강건조증으로 인하여 타액선의 기능이 감소하고 윤활 작용 또는 항균 작용의 기능이 떨어지면, 구강에 나타나는 이차 질환으로 치아 우식과 치주 질환이 나타날 수 있다. 구강건조증은 타액 분비 기능 저하 초기 단계에서는 인지하기가 어렵고, 일시적인 구강건조증과 기질적인 구강건조증과 구분이 어려워서, 기질적인 타액선기능저하로 인한 구강건조증은 빠른 진단이 어렵다. 노화에 의한 노인성 구강건조증도 기질적인 타액선 기능저하에 기인한다. 타액선 기능저하에 의한 구강건조증은 병이 진행된 이후에 완치가 어렵고, 치료법 또한 질병을 완전히 치료하는 것이 아니라 증상을 완화해주는데 중점을 두고 있다.
구강건조증은 쇼그렌 증후군, 빈혈, 당뇨, 노화, 약물복용, 신경계 질환 등 다양한 원인으로 발생할 수 있다. 최근, 구강건조증을 갖는 개체의 타액 시료에서 바이오마커를 검출하여 쇼그렌 증후군을 진단 및 치료하는 방법이 개발된 바 있다(미국 특허공고 US9,833,519B2). 그러나, 구강건조증을 진단하기 위한 바이오마커는 개발된 바가 없다.
따라서, 구강건조증을 신속하고 객관적이고 간편하고 비용이 저렴하게 진단할 수 있고, 진단의 정확도 및 특이도가 높은 바이오마커를 개발할 필요가 있다.
구강건조증 진단용 조성물을 제공한다.
구강건조증 진단용 키트를 제공한다.
구강건조증의 진단 방법을 제공한다.
일 양상은 NUCB2(Nucleobindin-2), PDCD6IP(Programmed cell death 6-interacting protein), PTGR1(Prostaglandin reductase 1), FAM3D, 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 구강건조증 진단용 조성물을 제공한다.
용어 "구강건조증(xerostomia 또는 dry mouth)"은 침 분비가 줄어들거나 그외 다른 다양한 원인에 의해 입 안이 마르는 증상을 말한다. 구강건조증은 타액선 기능 저하(salivary gland hypofunction)로도 불릴 수 있다. 구강건조증은 쇼그렌 증후군, 빈혈, 당뇨, 영양소 결핍, 노화, 약물 복용(예, 항히스타민제, 정신신경계 작용 약물, 고혈압 치료제), 신경계 질환, 정신적 질환(예, 우울증), 및 방사선요법 등의 원인에 의해 야기될 수 있다. 구강건조증이 유발되면, 건조감 자체로 인하여 음식물을 삼키기가 곤란하고, 말을 하기 어려운 불편감을 느낄 수 있고, 충치(치아우식증) 및 풍치(치주염)의 발생이 증가하고 악화되기 쉽고, 구강 내 곰팡이 감염, 혀 통증, 구취, 미각 이상 등이 유발될 수 있다. 구강건조증은 구강궤양과 같은 구강질환의 발생에도 영향을 미칠 수 있다. 구강건조증은 타액분비량 측정(휴식시 타액 분비량이 0.1 mL/분 이하), 타액 조영술, 조직 검사, 또는 핵의학 검사 방법으로 진단될 수 있다. 또한 타액선 조직검사를 통해서도 진단할 수 있는데, 타액선 조직에서 타액선 실질의 퇴축의 정도로 진단할 수 있다. 쇼그렌 증후군 증후군에서 타액선기능저하에 대한 평가로 타액선 조직내의 면역세포의 침투 양상을 측정하여, 면역세포의 침투가 많은 정도에 따라 스코어 0 내지 6으로 분류할 수 있다.
상기 조성물은 타액 시료에서 검출하기 위한 것일 수 있다. 상기 발현 수준은 정상 대조군의 발현 수준에 비해 감소하는 것일 수 있다.
NUCB2(Nucleobindin-2)는 칼슘 항상성에 기능을 수행할 수 있는 칼슘-결합 단백질로서, HEL-S-109 또는 NEFA으로도 불릴 수 있다. NUCB2 단백질은 NUCB2 유전자에 의해 코딩되는 단백질일 수 있다. NUCB2는 인간에서 Uniprot 번호 P80303의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. NUCB2는 마우스에서 Uniprot 번호 P81117의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PDCD6IP(Programmed cell death 6-interacting protein)는 세포내도입(endocytosis) 또는 예정 세포사(programmed cell death)에 기능을 하는 단백질로서, AIP1, ALIX, DRIP4, 또는 HP95로도 불릴 수 있다. PDCD6IP의 과발현은 세포자살(apoptosis)를 차단할 수 있다. PDCD6IP는 인간에서 Uniprot 번호 Q8WUM4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. PDCD6IP는 마우스에서 Uniprot 번호 Q9WU78의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PTGR1(Prostaglandin reductase 1)은 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(leukotriene) 및 리포신(lipoxin)의 염증성 및 항염증성 에이코사노이드(eicosanoid)의 대사 불활성화에 관여하는 NAD(P)H-의존성 산화환원효소이다. PTGR1는 PRG-1, 15-옥소프로스타글란딘 13-환원효소(15-oxoprostaglandin 13-reductase), 디티오에티온-유도성 유전자 1 단백질(dithiolethione-inducible gene 1 protein), DIG-1, 류코트리엔 B4 12-히드록시탈수소효소(leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase: LTB4DH), 또는 NAD(P)H-의존성 알켄/온 산화환원효소(NAD(P)H-dependent alkenal/one oxidoreductase)로도 불릴 수 있다. PTGR1은 인간에서 Uniprot 번호 Q14914의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. PTGR1 마우스에서 Uniprot 번호 P48758의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FAM3D는 사이토카인 활성에 기능할 수 있고, 글루카곤 분비 또는 인슐린 분비에서 음성 조절을 담당할 수 있다. FAM3D는 인간에서 Uniprot 번호 Q96BQ1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. FAM3D는 마우스에서 Uniprot 번호 P97805의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)는 탄수화물 결합 또는 망막 항상성에 기능을 담당할 수 있다. ZG16B는 EECP, HRPE773, JCLN2, PAUF, PRO1567, 또는 LOC124220으로도 불릴 수 있다. ZG16B는 인간에서 Uniprot 번호 Q96DA0의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. ZG16B는 래트에서 Uniprot 번호 A0A0G2K7Y9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 단편(fragment)은 상기 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.
상기 유전자는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 말한다. 상기 유전자의 발현 수준은 상기 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현 수준일 수 있다. mRNA의 발현 수준은 mRNA의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준은 상기 단백질 또는 이의 단편의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다. 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 것은 상기 단백질 또는 이의 단편의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 앱타머는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이나 펩티드일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
상기 조성물은 KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC21(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8)은 면역글로불린 경쇄의 가변 부위일 수 있다. KV108은 IGKV18, L9, 또는 IGKV1-8로도 불릴 수 있다. KV108은 인간에서 Uniprot 번호 A0A0C4DH67의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
GSLG1(Golgi apparatus protein 1)은 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor)와 E-selectin에 결합할 수 있다. GSLG1은 CFR-1(Cysteine-rich fibroblast growth factor receptor), ESL-1(E-selectin ligand 1), 또는 Golgi sialoglycoprotein MG-160으로도 불릴 수 있다. GSLG1은 인간에서 Uniprot 번호 Q92896의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GSLG1은 마우스에서 Uniprot 번호 Q61543의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FAM3B(Protein FAM3B)는 췌장에서 알파 세포 및 베타 세포의 세포자살을 유도할 수 있다. FAM3B는 Cytokine-like protein 2-21 또는 PANDER(Pancreatic-derived factor)로도 불릴 수 있다. FAM3B는 인간에서 Uniprot 번호 P58499의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. FAM3B는 마우스에서 Uniprot 번호 Q9D309의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
MUC21(Mucin-21)은 폐암종의 바이오마커일 수 있다. MUC21은 Epiglycanin으로도 불릴 수 있다. MUC21은 인간에서 Uniprot 번호 Q5SSG8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. MUC21은 마우스에서 Uniprot 번호 D9N008 또는 A8QW50의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
RB11A(Ras-related protein Rab-11A)는 세포내 막 이동을 조절하는 small GTPase Rab일수 있다. RB11A는 Rab-11 또는 YL8으로도 불릴 수 있다. RB11A 인간에서 Uniprot 번호 P62491의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RB11A는 마우스에서 Uniprot 번호 P62492의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LYSC(Lysozyme C)는 가수분해와 당전이에 기능을 효소이다. LYSC는 1,4-beta-N-acetylmuramidase C로도 불릴 수 있다. LYSC는 인간에서 Uniprot 번호 P61626의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. LYSC는 마우스에서 Uniprot 번호 P17897 또는 P08905의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CALL3(Calmodulin-like protein 3)는 미오신-10의 특정 경쇄로서 기능할 수 있다. CALL3는 CLP(CaM-like protein) 또는 Calmodulin-related protein NB-1로도 불릴 수 있다. CALL3는 인간에서 Uniprot 번호 P27482의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CALL3는 마우스에서 Uniprot 번호 의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 양상은 NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, 및 ZG16B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 구강건조증 진단용 키트를 제공한다.
NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, ZG16B, 및 구강건조증은 전술한 바와 같다.
상기 키트는 구강건조증 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
상기 키트는 KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC2(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 구강건조증이 의심되는 개체로부터 분리된 타액 시료에서 NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, 및 ZG16B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 감소한 경우, 구강건조증으로 결정하는 단계를 포함하는, 구강건조증 진단 방법 또는 구강건조증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, ZG16B, 및 구강건조증은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 구강건조증이 의심되는 개체로부터 분리된 타액 시료에서 NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, 및 ZG16B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 구강건조증 장애를 앓고 있거나 구강건조증에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
상기 타액 시료는 상기 개체로부터 수득된 타액 시료를 말한다. 상기 타액 시료는 원심분리, 여과 등의 전처리를 거친 시료일 수 있다. 상기 타액 시료는 타액 시료로부터 수득된 단백질 시료 또는 핵산 시료를 포함한다.
상기 측정하는 단계는 상기 타액 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키거나, 또는 상기 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 중합효소 연쇄 반응, 노던 블로팅(Northern blotting), 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 방법은 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 NUCB2, PDCD6IP, PTGR1, FAM3D, 및 ZG16B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 감소하였는지 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 정상 대조군은 구강건조증에 걸리지 않은 군으로서 음성 대조군을 의미한다. 상기 방법에서, 측정된 타액 시료의 발현 수준의 양이 정상 대조군의 발현 수준에 비해 감소할 수 있다. 예를 들어, 검출된 바이오마커의 양이 정상 대조군의 양 보다 적은 경우, 상기 개체는 구강건조증에 걸리거나 걸릴 확률이 높은 것으로 진단될 수 있다. 구강건조증으로 진단된 개체에 구강 관리, 약물 투여 조절, 타액 대체제 투여, 구강보습제 투여, 구강의 전기 자극 또는 침 등의 치료를 수행할 수 있다.
상기 방법은 KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC2(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 구강건조증 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 구강건조증의 진단 방법에 따르면, 구강건조증을 간편하고 객관적이고, 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.
도 1은 정상 대조군과 구강건조증 환자 그룹의 타액 시료의 SDS-PAGE 겔 이미지이다.
도 2는 타액 시료에서 동정된 단백질과 p-값이 0.05 미만으로 통계적으로 유의한 단백질을 분석하여 개수를 나타낸 벤다이어그램이다.
도 3a 내지 도 3e는 Nucleobindin-2, Programmed cell death 6-interacting protein, Prostaglandin reductase 1, Protein FAM3D, 및 Zymogen granule protein 16 homolog B의 정상대조군과 구강건조증 환자군의 스코어에 따른 발현 수준을 나타내는 그래프이다(y 축: 형광 강도, N: 정상대조군, S1: 스코어 1, S2: 스코어 2, S345: 스코어 3 이상).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 구강건조증 환자의 타액 시료에서 차등 발현된 바이오마커의 확인
1. 구강건조증 환자의 타액 시료의 준비
한양대학교로부터 정상 대조군(n=3)과 구강건조증으로 진단된 환자에서 타액 시료를 수집하였다. 구강 건조증은 타액선 분비와 구강 점막 상태에 대한 임상 검사와 타액선 스캔에서 타액선 기능을 평가하여 진단하였다. 타액선 기능은 타액선 조직 검사를 시행하여 타액선 조직의 상태와 타액선 실질 주변에 림프구의 침투 여부에 따라서 스코어 1 내지 스코어 5로 분류하였다. 스코어 1, 스코어 2, 및 스코어 3 내지 5의 3 군으로 분류하여 타액 샘플링을 시행하였다.
타액 시료의 단백질 분해 또는 변형을 막기 위해, 혈청을 수득한 직후에 수득된 타액 시료에 단백질 분해효소 저해제로서 cOmplete, Mini EDTA-free 프로테아제 저해제 칵테일(Roche) 및 포스파타아제 저해제로서 PhosSTOP(Roche)을 첨가하였다. 상기 저해제는 제조자의 프로토콜에 따라 1개의 정제를 200 ㎕의 인산완충식염수(phosphate bufffered saline: PBS)에 녹여 50 X로 만든 후, 각 시료에 저해제의 최종 농도 1.5 X가 되도록 첨가하였다. 저해제를 첨가한 타액 시료를 정량한 후, 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
2. 타액 시료의 농축 및 정량
4개의 그룹의 총 12개의 타액 시료를 3k 원심분리 필터(Amicon Ultra, Millipore)를 사용하여 농축하였다. 3k 원심분리 필터에 400 ㎕의 물(HPLC 등급, J.T Baker)로 2회 및 400 ㎕의 0.1%(w/v) SDS가 포함된 10 mM Tris 완충액(pH 8.0)을 2회 가하여 필터를 준비하였다.
타액 시료를 0.1%(w/v) SDS가 포함된 10 mM Tris 완충액으로 2배 희석하고, 볼텍싱(vortexing)하여 침전물을 제거하였다. 희석된 시료를 준비된 필터에 가한 후, 14000x g의 속도로 10℃에서 약 10분 동안 원심분리하여 시료를 농축하였다. 그 후 시료가 포함된 필터를 0.05%(w/v) SDS가 포함된 10 mM Tris 완충액으로 5회 세척하였다. 새로운 튜브에 세척 후 농축된 시료가 함유된 필터를 뒤집어서 끼운 후, 3000x g의 속도로 10℃에서 약 2분 동안 원심분리하여 농축된 시료를 회수(recovery)하였다.
회수된 시료는 비신크로니닉산(bicinchoninic acid: BCA) 분석법으로 정량하였다.
3. 질량 분석을 위한 시료의 준비 및 젤 내 분해(In-gel digestion)
프로테옴 분석을 위해, 2.에서 수득된 4개의 그룹의 12개의 개별 시료 55 ㎍을 NuPAGE 겔(4% 내지 12%의 Bis-Tris 겔, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분자량에 따라 분리하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brillant Blue R-250)로 염색하였다(도 1). 12개의 개별 시료에 대하여 염색된 젤을 12개의 조각(slice)으로 나누고, 각각의 젤 조각을 마이크로 원심분리 튜브에 옮겼다. 각각의 겔 조각에 함유된 단백질을 56℃에서 이황화 결합을 환원시킨 후, 25℃의 어두운 환경에서 알킬화시키고, 트립신으로 밤새 분해하였다. 이어서, 67%(v/v)의 아세토니트릴(acetonitrile: ACN)/5%(v/v)의 포름산(formic acid: FA)(Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) 용액에서 펩티드를 추출하였다. 추출된 펩티드는 Speedvac에서 건조시킨 후 20 ㎕의 0.4%(v/v) 아세트산에 용해시켰다.
4. 질량 스펙트럼 분석
3.에서 수득한 각각의 시료 10 ㎕를 Eksigent MDLC 시스템(Eksigent Technologies Dublin, CA, USA) 상에서 역상 Magic C18AQ 컬럼(15 cm X 75 ㎛)에 주입하였다. 상기 컬럼을 95%의 완충액 A(0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 100%(v/v)의 물)와 5%(v/v)의 완충액 B(0.1%(v/v)의 포름산을 함유하는 100%(v/v)의 ACN)를 혼합한 완충액으로 평형화시켰다. 작업 유속은 다음의 구배 조건에서 0.35 ㎕/분(min)으로 하였다:
0분 내지 5분에서 100% 완충액 A; 5분 내지 85분에서 92% 완충액 A 및 8% 완충액 B; 85분 내지 90분에서 70% 완충액 A 및 30% 완충액 B; 90분 내지 95분에서 30% 완충액 A 및 70% 완충액 B; 95분 내지 100분에서 30% 완충액 A 및 70% 완충액 B; 및 100분 내지 110분에서 98% 완충액 A 및 2% 완충액 B.
나노 HPLC 시스템을 LTQ XL-Orbitrap 질량 스펙트로미터(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)에 장착하였다. 분무 전압(spray voltage)은 2.5 kV로 설정하였고, 가열된 모세관의 온도는 250℃로 설정하였다. 조사 전체-스캔 MS 스펙트라(Survey full-scan MS spectra)(300 내지 1,800 m/z)를 1 마이크로스캔(microscan) 및 60,000의 해상도(resolution)로 수득하여, 선도물질(precursor)을 선별하고 전하 상태 측정을 위한 미리보기 모드를 설정하였다. 미리보기 조사 스캔으로부터 10 개의 가장 강력한 이온에 대한 MS/MS 스펙트라를 하기와 같은 옵션으로 전체 스캔에 대한 이온 트랩에서 수득하였다: 분리 간격(isolation width), 2 m/z(질량 대 전하); 표준화된 충돌 에너지(collision energy), 35%; 동적 배제 시간(dynamic exclusion duration), 360 초(sec). +1 전하 및 전하 상태가 정해지지 않은 갖는 선도 물질은 데이터-종속적으로(data-dependent) 수득하는 동안 폐기하였다.
각각의 LC-MS/MS 파일을 MaxQunat1.5.8.3의 Andromeda 알고리즘을 이용하여 분석하였다. MS 및 MS/MS 데이터를 SwissProt 인간 데이터 베이스(January 2019)와 비교 조사하였다. 조사는 두개의 미절단(missed cleavages) 트립신 분해된 펩티드 (tryptic peptide)를 허용하는 것으로 제한하였다. 시스테인(cysteine)의 카르보아미도메틸화(carboamidomethylation)를 고정된 수식화 (+57.021 Da)로, 메티오닌 산화를 유동형 수식화(+15.995 Da)로 설정하였다. 질량 허용 범위 (mass tolerance)를 MS/MS 데이터에 대하여 0.5 Da 및 MS 데이터에 대하여 15 ppm로 설정하였다. 디코이(decoy) 데이터 베이스 조사를 위해, 0.01의 엄격한 오류 발견 비율(False Discovery Rate: FDR)과 0.05의 완화된 FDR, 총 두개의 목표 수치를 적용하였다. 모든 단백질은 2개 이상의 일치하는 펩티드를 이용하여 동정하였다.
5. 라벨 프리(Label-free) 정량 분석
정상 대조군과 구강건조증 환자군의 3개의 그룹에서 타액 시료를 각각 3개씩 수집한 총 12개의 샘플에 존재하는 단백질들의 상대적인 존재량을 라벨 프리 정량 강도 분석법(Label-free quantification intensity: LFQ 강도)에 기초하여 산출하였다. MaxQunat1.5.8.3을 사용하여 강도를 추출하였다. 이어서, 각각의 단백질에 대한 LFQ 강도를 Perseus를 이용하여, 상대적인 정량분석을 수행하였다. 단백질이 존재하지 않거나 또는 검출 한계 이하인 경우에도, 영점(null) 수치를 보상하였다. 정상 대조군과 구강건조증에 따른 환자군의 그룹 사이의 배수 차이를 계산하기 위하여 normal distribution에서 넓이 0.3 그리고 1.8만큼을 downshift하여 missing value를 채웠다. 통계적인 유의성은 정상 대조군과 구강건조증에 따른 환자군의 3개의 개별 시료로 ANOVA 검정으부터 얻은 LFQ 강도에 대하여 수행하여, p-값이 0.05미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
6. 구강건조증에 따른 환자군과 관련된 타액 단백질의 동정 및 차등 발현된 단백질의 확인
LFQ 강도 분석으로부터, 정상 대조군과 구강건조증에 따른 그룹의 12개의 개별 시료에서 총 703종의 단백질을 동정하였다. 동정된 단백질 중에서, p-값이 0.05 미만인 단백질이 51종을 확인하였다. 동정된 단백질과 p-값이 0.05 미만으로 통계적으로 유의한 단백질을 분석하여 개수를 벤다이어그램으로 나타낸 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, p-값이 0.05 미만으로 통계적으로 유의한 단백질을 표 1에 나타내었다.
UniProt Accession No. 유전자 이름 단백질 명칭 p-값
P04217 A1BG Alpha-1B-glycoprotein 8.1694E-07
P02763 A1AG1 Alpha-1-acid glycoprotein 1 0.0004
P27797 CALR Calreticulin 0.001
P40199 CEAM6 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 0.002
A0A0C4DH67 KV108 Immunoglobulin kappa variable 1-8 0.002
P01008 ANT3 Antithrombin-III 0.004
Q8TAX7 MUC7 Mucin-7 0.005
Q16778 H2B2E Histone H2B type 2-E 0.005
P04196 HRG Histidine-rich glycoprotein 0.005
Q14914 PTGR1 Prostaglandin reductase 1 0.007
P02751 FINC Fibronectin 0.007
O75131 CPNE3 Copine-3 0.008
P0DOX5 IGG1 Immunoglobulin gamma-1 heavy chain 0.009
P60842 IF4A1 Eukaryotic initiation factor 4A-I 0.009
P25705 ATPA ATP synthase subunit alpha, mitochondrial 0.009
Q92896 GSLG1 Golgi apparatus protein 1 0.012
P00747 PLMN Plasminogen 0.014
P58499 FAM3B Protein FAM3B 0.016
Q16610 ECM1 Extracellular matrix protein 1 0.016
P08133 ANXA6 Annexin A6 0.016
O15511 ARPC5 Actin-related protein 2/3 complex subunit 5 0.018
P01009 A1AT Alpha-1-antitrypsin 0.020
Q05315 LEG10 Galectin-10 0.021
A0A0A0MS15 HV349 Immunoglobulin heavy variable 3-49 0.022
Q96DA0 ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B 0.025
P20591 MX1 Interferon-induced GTP-binding protein Mx1 0.025
O75083 WDR1 WD repeat-containing protein 1 0.026
P30740 ILEU Leukocyte elastase inhibitor 0.028
Q99880 H2B1L Histone H2B type 1-L 0.028
Q5SSG8 MUC21 Mucin-21 0.030
P02765 FETUA Alpha-2-HS-glycoprotein 0.032
Q12792 TWF1 Twinfilin-1 0.033
P62491 RB11A Ras-related protein Rab-11A 0.035
P13473 LAMP2 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 0.036
Q8WUM4 PDCD6IP Programmed cell death 6-interacting protein 0.037
P62244 RS15A 40S ribosomal protein S15a 0.038
A0A0C4DH33 HV124 Immunoglobulin heavy variable 1-24 0.039
Q12913 PTPRJ Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta 0.039
P41218 MNDA Myeloid cell nuclear differentiation antigen 0.042
P14780 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 0.042
P80188 NGAL Neutrophil gelatinase-associated lipocalin 0.042
P80303 NUCB2 Nucleobindin-2 0.043
P30046 DOPD D-dopachrome decarboxylase 0.043
Q9BWD1 THIC Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 0.043
Q92876 KLK6 Kallikrein-6 0.043
P16401 H15 Histone H1.5 0.043
P61626 LYSC Lysozyme C 0.044
P22894 MMP8 Neutrophil collagenase 0.047
Q96BQ1 FAM3D Protein FAM3D 0.048
Q15365 PCBP1 Poly(rC)-binding protein 1 0.049
P27482 CALL3 Calmodulin-like protein 3 0.049
p-값이 0.05 미만으로 통계적으로 유의한 단백질 중에서 정상 대조군에 비해 발현 수준이 감소하는 단백질을 표 2에 나타내었다.
UniProt Accession No. 유전자 이름 단백질 명칭 차등발현 비율
(스코어1/정상군)		 차등발현 비율
(스코어2/정상군)		 차등발현 비율
(스코어3 이상/정상군)
P80303 NUCB2 Nucleobindin-2 0.38 0.06 0.11
Q8WUM4 PDCD6IP Programmed cell death 6-interacting protein 0.00 (정상군에서만 검출) 0.00 (정상군에서만 검출) 0.00 (정상군에서만 검출)
Q14914 PTGR1 Prostaglandin reductase 1 0.00 0.00 0.13
Q96BQ1 FAM3D Protein FAM3D 0.22 0.00 0.12
Q96DA0 ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B 0.87 0.34 0.53
A0A0C4DH67 KV108 Immunoglobulin kappa variable 1-8 0(정상군에서만 검출) 0
(정상군에서만 검출)		 0
(정상군에서만 검출)
Q92896 GSLG1 Golgi apparatus protein 1 0.46373 0 0.346157
P58499 FAM3B Protein FAM3B 0.580505 0 0
Q5SSG8 MUC21 Mucin-21 0.053745 0 0.239191
P62491 RB11A Ras-related protein Rab-11A 0.531124 0.802295 0.512411
P61626 LYSC Lysozyme C 0.577288 0.394294 0.332109
P27482 CALL3 Calmodulin-like protein 3 0.433622 0.859402 0.341424
표 2에 기재된 단백질들의 정상대조군과 구강건조증 환자군의 스코어에 따른 발현 수준을 도 3a 내지 도 3e에 나타내었다(N: 정상대조군, S1: 스코어 1, S2: 스코어 2, S345: 스코어 3 이상).
도 3a 내지 도 3e에 나타난 바와 같이, Nucleobindin-2, Programmed cell death 6-interacting protein, Prostaglandin reductase 1, Protein FAM3D, 및 Zymogen granule protein 16 homolog B는 구강건조증에서 유의하게 발현 수준이 감소하고, 구강건조증의 스코어에 따라 발현 수준이 달라짐을 확인하였다.

Claims (13)

  1. PDCD6IP(Programmed cell death 6-interacting protein) 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 구강건조증 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 타액 시료에서 검출하기 위한 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 수준은 정상 대조군의 발현 수준에 비해 감소하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는
    상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, NUCB2(Nucleobindin-2), PTGR1(Prostaglandin reductase 1), FAM3D, ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC21(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인 조성물.
  8. PDCD6IP 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 구강건조증 진단용 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, NUCB2(Nucleobindin-2), PTGR1(Prostaglandin reductase 1), FAM3D, ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC2(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인 키트.
  10. 구강건조증이 의심되는 개체로부터 분리된 타액 시료에서 PDCD6IP 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 발현 수준이 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 감소한 경우, 구강건조증으로 결정하는 단계를 포함하는,
    구강건조증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 바이오마커를 검출하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 타액 시료와, 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키거나, 또는 상기 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 중합효소 연쇄 반응, 노던 블로팅(Northern blotting), 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 10에 있어서, NUCB2(Nucleobindin-2), PTGR1(Prostaglandin reductase 1), FAM3D, ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), KV108(Immunoglobulin kappa variable 1-8), GSLG1(Golgi apparatus protein 1), FAM3B(Protein FAM3B), MUC2(Mucin-21), RB11A(Ras-related protein Rab-11A), LYSC(Lysozyme C), 및 CALL3(Calmodulin-like protein 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준, 또는 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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