JP6852397B2 - 分析用試料の調製方法および分析方法 - Google Patents
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Description
第二反応は、糖鎖のシアル酸のカルボキシ基を修飾可能な反応であり、α2,3‐シアル酸のカルボキシ基とα2,6‐シアル酸のカルボキシ基に対して異なる反応(誘導体化)が生じる。その結果、α2,3‐シアル酸から生成する誘導体とα2,6‐シアル酸から生成する誘導体は異なる質量を有する。
本発明では、第二反応の前に、糖タンパク質または糖ペプチドに対して第一反応が行われ、ペプチド部分に含まれる少なくとも1つの第一級アミノ基が修飾または除去される。ペプチド部分に含まれるアミノ基が修飾または除去されることにより、その後の第二反応においてアミノ基とカルボキシ基との分子内脱水等の副反応が生じないため、ピークスプリットを抑制し、質量分析による分析精度を向上できるとともに、データ解析が容易となる。
第一反応および第二反応を行った試料は、必要に応じて、精製、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理を行ってもよい。これらの処理は、公知の方法を利用して行うことができる。
上記方法により調製後の分析用試料を質量分析に供することにより、シアル酸の結合様式の識別や、結合様式の比率、シアル酸の有無等の糖鎖構造情報が得られる。質量分析のイオン化法としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)やナノエレクトロスプレーイオン化(nano−ESI)法等が挙げられる。特に、MALDI法が好適である。本発明の方法により得られる分析用試料は、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれでも、シアル酸の結合様式を識別できる。
実施例1では、α2,3‐SGPおよびα2,6‐SGPの誘導体化を行い、質量分析によるシアル酸結合様式の識別可否について検討を行った。α2,3‐SGPおよびα2,6‐SGPは、いずれも株式会社伏見製薬所の糖ペプチド標準品(2865.8Da)を用いた。水に溶解したSGPを1 nmolずつ分注して、遠心濃縮(SpeedVac)により溶媒を除き乾固させ、誘導体化を行った。
(脱水縮合剤存在下でのイソプロピルアミンとの反応)
乾固したSGPに、イソプロピルアミン塩酸塩(iPA-HCl)、1‐エチル‐3‐(3‐(ジメチルアミノ)プロピル)カルボジイミド(EDC)塩酸塩、および1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を、終濃度がそれぞれ2M、500mM、および500mMとなるように調製したDMSO溶液を添加した。室温で1時間攪拌して反応させた後、130μLのアセトニトリル(ACN)、および30μLの80%ACN, 0.4%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて希釈した。
精製用の担体として、GL-Tip Amide (GLサイエンス製)を用いた。GL-Tip Amideを遠心アダプタに装着し、100μLの90%ACN, 0.1%TFAを加え、遠心により排出した。その後、水100μLを加え、遠心により排出することを3回繰り返した。さらに100μLの90%ACN, 0.1%TFAを加え、遠心により排出して担体の平衡化を行った。次いで希釈した反応溶液180μLを加えて担体に試料を吸着させ、遠心した。その後、180μLの90%ACN, 0.1%TFAを加え、遠心により排出することを3回繰り返し、洗浄を行った。最後に水10μLを加え,遠心により排出することを2回繰り返し、さらに10μLの0.1%TFA水溶液を加え遠心により排出し、試料を溶出させた。3回分の溶出液を合わせたものに、40%メチルアミン水溶液を適量加えてメチルアミン濃度を1%とし、SpeedVacにより乾固させた。
乾固した試料に、メチルアミン塩酸塩(MA-HCl)、ベンゾトリアゾール‐1‐イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyBOP)、およびN-メチルモルホリン(NMM)を、終濃度がそれぞれ1M、250mM、および15%となるように調製したDMSO溶液を添加した。室温で1時間攪拌して反応させた後、130μLのACN、および30μLの80%ACN, 0.4%TFAを加えて希釈した。その後、GL-Tip Amideを用いて、イソプロピルアミンとの反応後と同様に精製および溶出を行い、溶出液をSpeedVacにより乾固させた。
乾固した試料を10μLの水に再溶解させ、1μL(100pmol)をフォーカスプレートに滴下し、マトリックスとして、50% ACNに溶解させた10mg/mL 2,5‐ジヒドロキシ安息香酸(DHBA),0.1%メチレンジホスホン酸(MDPNA)を0.5μL加えた。自然乾燥により溶媒を除去した後、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos)により、正イオンモードで質量分析を行った。α2,3‐SGPの反応物のマススペクトルを図1(A)、α2,6‐SGPの反応物のマススペクトルを図1(B)に示す。
(SGPのリジン残基のグアニジル化)
乾固したSGPに、10.5μLの3.5N水酸化アンモニウム、および1.5μLの50% O‐メチルイソ尿素水溶液を加え、ボルテックスにより溶解させた後、65℃のヒートブロック上で10分間加熱して反応させた。
反応溶液に、15μLの10%TFA水溶液および水を加えて約50μLに希釈し、カーボンカラムを用いて脱塩精製した。カーボンカラムとして、エムポアディスクカーボン(3M製)を、直径約1mmに切り抜き、200μLのチップに詰めたStage Tip Carbonを用いた。Stage Tip Carbonに100μLのACNを加えた後、遠心により排出した。その後、100μLの1M NaOH、100μLの1M HCl、100μLの水、100μLの80% ACN, 0.1%TFA(2回)、および100μLの水(2回)を用いて、同様の操作を順に行い、カラム担体の洗浄と平衡化を行った。希釈後の反応溶液を平衡化後のカラムに加え、遠心により溶液を排出した。さらに150μLの水を加え、遠心により排出することを3回繰り返し、洗浄を行った。最後に、20μLの80%ACN, 0.1%TFAを加え、遠心により排出することを2回繰り返し、試料を溶出させた。2回分の溶出液を合わせて、SpeedVacにより乾固させた。
O‐メチルイソ尿素との反応後の試料を用い、実験例1−1と同様に、イソプロピルアミンとの反応、およびメチルアミンとの反応による誘導体化を行い、正イオンモードで質量分析を行った。α2,3‐SGPの反応物のマススペクトルを図2(A)、α2,6‐SGPの反応物のマススペクトルを図2(B)に示す。
(アミノ基のジメチル化)
乾固したSGPに、20μLの100mM重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝溶液(pH 8.5)を加えた。ボルテックスにより溶解させた後、1.6μLの2% ホルムアルデヒド水溶液を加え、軽くボルテックスしてスピンダウンした。1.6μLの300mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を加え、室温で軽くボルテックスしながら1時間反応させた。その後、3.2μLの1%アンモニア水を加えてクエンチし、軽くボルテックスしてスピンダウンした。1.6μLのギ酸を加え、軽くボルテックスしてスピンダウンした後、72μLの水を加え、実験例1−2と同様に、カーボンカラムによる脱塩精製を行った。
上記の還元的アミノ化反応を行った試料を用い、実験例1−1と同様に、イソプロピルアミンとの反応、およびメチルアミンとの反応による誘導体化を行い、正イオンモードで質量分析を行った。α2,3‐SGPの反応物のマススペクトルを図3(A)、α2,6‐SGPの反応物のマススペクトルを図3(B)に示す。
還元的アミノ化反応後の試料のイソプロピルアミンとの反応時間を1時間から3時間に変更したこと以外は、実験例1−3と同様にして試料を調製し、正イオンモードで質量分析を行った。α2,3‐SGPの反応物のマススペクトルを図4(A)、α2,6‐SGPの反応物のマススペクトルを図4(B)に示す。
図1(A)では誘導体化前のSGPよりも67Da大きいm/z 2932にピークが確認され、図1(B)では誘導体化前のSGPよりも123Da大きいm/z 2988にピークが確認された(図中の▼)。これらのピークの56Daの差は、イソプロピル基とメチル基との差の2倍である。α2,3‐SGPの2個のα2,3‐シアル酸のカルボキシ基がメチルアミド化されたのに対して、α2,6‐SGPの2個のα2,6‐シアル酸のカルボキシ基がイソプロピルアミド化されたことにより、m/zに差が生じていることが分かる。
実施例2では、α2,6‐シアリル糖鎖が主成分であるヒトトランスフェリン由来の糖ペプチドの誘導体化を行い、質量分析によるシアル酸結合様式の識別可否について検討を行った。
SIGMAより購入したトランスフェリンを、6M 尿素、50mM 重炭酸アンモニウム、および5mM トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)の存在下、室温で45分反応させ、変性および還元を行った。次いで、10mM ヨードアセトアミド(IAA)の存在下、室温遮光条件下で45分反応させアルキル化を行った後、10mM ジチオスレイトール(DTT)存在下、室温遮光条件で45分反応させ、余剰のIAAを不活性化した。その後、トリプシンを加え、37℃で一夜反応させ、プロテアーゼ消化を行った。プロテアーゼ消化後、液体クロマトグラフィーにより消化後のペプチドを分離して、図5(A)の正イオンマススペクトルを示す糖ペプチドを得た。
上記実験例1−1と同様の手順で、イソプロピルアミン存在下での反応およびメチルアミン存在下での反応を順に実施し、正イオンモードで質量分析を行った。マススペクトルを図5(B)に示す。
上記実験例1−3と同様の手順で、還元的アミノ化反応によるアミノ基のジメチル化を行った後に、イソプロピルアミン存在下での反応およびメチルアミン存在下での反応を順に実施し、正イオンモードで質量分析を行った。マススペクトルを図5(C)に示す
実験例2−1(図5(B))では、2個のα2,6‐シアル酸のカルボキシ基、グルタミン酸残基のカルボキシ基、およびペプチドC末端のカルボキシ基(計4個のカルボキシ基)がイソプロピルアミド化された誘導体に由来するm/z 3845のピーク(誘導体化前の糖ペプチドよりも164Da大きい)が確認された。しかしながら、他にも副反応生成物に由来する多数の夾雑ピークが確認され、これらの夾雑ピークは帰属困難であった。
実施例3では、RNase B由来の糖ペプチドの誘導体化を行い、シアル酸を含まない糖ペプチドの誘導体化の影響を検討した。
SIGMAより購入したRNase Bを試料として、実施例2と同様の手順で還元アルキル化を行った後、リジルエンドペプチダーゼ(Lys-C)を加え、37℃で一夜反応させ、プロテアーゼ消化を行った。プロテアーゼ消化後、カーボンカラムによる脱塩精製を行い、次いでGL-Tip Amideを用いて精製および濃縮を行い、図6(A)に示す正イオンマススペクトルを示すハイマンノース型の5種類のグライコフォーム(マンノース数:5〜9、162Da間隔)からなる糖ペプチドを得た。
上記実験例1−1と同様の手順で、イソプロピルアミン存在下での反応およびメチルアミン存在下での反応を順に実施し、正イオンモードで質量分析を行った。マススペクトルを図6(B)に示す
上記実験例1−3と同様の手順で、還元的アミノ化反応によるアミノ基のジメチル化を行った後に、イソプロピルアミン存在下での反応およびメチルアミン存在下での反応を順に実施し、正イオンモードで質量分析を行った。マススペクトルを図6(C)に示す
実験例3−1(図6(B))では、反応前(図6(A))のm/z 1935のピーク強度が減少し、分子内環化により生じた誘導体由来のm/z 1917(−18)のピーク、およびイソプロピルアミド化により生じた誘導体由来のm/z 1976(+41)のピークが確認された。他のグライコフォームについても、未反応、分子内環化、およびイソプロピルアミド化が混在していた。このように、複数のグライコフォームのそれぞれが副反応に起因するピークスプリットを生じると、スペクトルが極めて煩雑となり、どのグライコフォームからどのピークが生じているかを帰属することは容易ではない。そのため、シアル酸の有無やシアル酸の結合様式を判別することも困難である。
Claims (12)
- 糖ペプチドまたは糖タンパク質の分析用試料の調製方法であって、
糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド部分に含まれる少なくとも1つの第一級アミノ基を修飾または除去する第一反応;および糖鎖のシアル酸のカルボキシ基を修飾可能な第二反応、を順に実施し、
前記第二反応は、α2,3‐シアル酸とα2,6‐シアル酸とが質量の異なる誘導体を生成する反応であり、
前記第一反応に用いる前記糖ペプチドまたは糖タンパク質は、ペプチド鎖のアミノ酸残基数が30以下であり、
前記第一反応は、前記第二反応において前記糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド部分に含まれる少なくとも1つの第一級アミノ基がカルボキシ基と反応しないように、前記糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド部分に含まれる少なくとも1つの第一級アミノ基を修飾または除去する反応である、分析用試料の調製方法。 - 前記第一反応は、第一級アミノ基の窒素原子に少なくとも1つの窒素炭素結合を生成させる反応を含む、請求項1に記載の試料の調製方法。
- 前記第一反応は、第一級アミノ基のグアニジル化およびジアルキル化の少なくとも一方を含む、請求項1に記載の試料の調製方法。
- 前記第一反応は、少なくともペプチド部分に含まれるリジン残基の第一級アミノ基を修飾または除去する反応である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第一反応は、少なくともペプチドのN末端の第一級アミノ基を修飾または除去する反応を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第一反応は、ペプチド部分に含まれるすべての第一級アミノ基を修飾する反応である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第一級アミノ基を修飾する反応が、ジアルキル化である、請求項6に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第二反応は、α2,3‐シアル酸を選択的にラクトン化し、α2,6‐シアル酸を選択的にアミド化またはエステル化する反応を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第二反応は、前記ラクトンと求核剤との反応により別の誘導体を生成する反応をさらに含み、
前記ラクトンから生成する誘導体と前記α2,6‐シアル酸から生成する誘導体とが異なる質量を有するように、前記求核剤が選択される、請求項8に記載の分析用試料の調製方法。 - 前記糖ペプチドまたは糖タンパク質が固相担体に固定された状態で前記第一反応が行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 前記第一反応後の糖ペプチドまたは糖タンパク質が固相担体に固定された状態で前記第二反応が行われる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の分析用試料の調製方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法により試料を調製し、さらに、調製した試料を質量分析することを特徴とする、糖ペプチドまたは糖タンパク質の糖鎖構造の分析方法。
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