WO2021010221A1 - 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット - Google Patents

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preparing
sialic acid
analysis
amidation reaction
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PCT/JP2020/026489
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隆司 西風
潤一 古川
久寿 花松
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株式会社島津製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an analytical sample, an analytical method, and a kit for preparing an analytical sample.
  • Sialic acid is a sugar that exists in large numbers in the living body. Sialic acid is also contained in sugar chains bound to proteins in the living body, and is often present at the non-reducing end of sugar chains. Therefore, sialic acid plays an important role in such glycoprotein molecules because it is located outside the molecule and is directly recognized by other molecules.
  • Sialic acid may have a different linkage type with adjacent sugars.
  • N-type sugar chains mainly ⁇ 2,3- and ⁇ 2,6-binding modes
  • O-linked sugar chains O-type sugar chains
  • sialic acid Due to such differences in binding mode, sialic acid can be recognized by different molecules and have different roles.
  • sialic acid is modified as a pretreatment for sugar chains containing sialic acid. This is to eliminate the demerits such as suppression of ionization and elimination of sialic acid by neutralizing the carboxy group of sialic acid having a negative charge by esterification or amidation.
  • the stability of the lactone produced by the binding mode is different, and this difference in stability can be used to modify and analyze the sialic acid in a binding mode-specific manner.
  • the lactone is extremely unstable, easily hydrolyzed in water, and more rapidly hydrolyzed under acidic or basic conditions.
  • the first aspect of the present invention is to prepare a sample containing a sugar chain, and to prepare the sample, ammonia to react with the lactone contained in the sugar chain, and one or less carbon atoms in the carbon atom bonded to the amino group.
  • An amide having a pH of 7.7 or higher which comprises at least one first compound selected from the group consisting of directly bound primary amines, hydrazines, hydrazine derivatives and hydroxyamines and salts thereof and an alkalizing agent.
  • the alkalizing agent is an amine
  • the alkalizing agent comprises two or more carbon atoms bonded to an amino group, which comprises contacting a chemical conversion solution with an amidating reaction for amidating the lactone.
  • the present invention relates to a method for preparing a sample for analysis, which is at least one amine selected from the group consisting of branched primary amines, secondary amines and tertiary amines to which carbon atoms are directly bonded.
  • a second aspect of the present invention relates to an analytical method comprising preparing an analytical sample by the method for preparing an analytical sample of the first aspect and analyzing the prepared analytical sample.
  • a third aspect of the present invention relates to the method for preparing an analytical sample of the first aspect, or the kit for preparing an analytical sample used in the method of the second aspect.
  • the lactone contained in the sugar chain can be amidated more efficiently.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a flow of an analysis method according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the flow of the analysis method according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing the structure of the sugar chain produced in the examples.
  • FIG. 4 is a mass spectrum including a peak corresponding to the sugar chain shown in FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing the concentration of tert-butylamine and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction performed on the beads.
  • FIG. 6 is a graph showing the types of alkalizing agents and the ratio of amidated sialic acid in the amidation reaction performed on the beads.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a flow of an analysis method according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the flow of the analysis method according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing the structure of the sugar chain produced in the examples.
  • FIG. 4 is a mass spectrum including a peak corresponding
  • FIG. 7 is a graph showing the composition of the solution during the amidation reaction performed under acidic conditions on the beads and the ratio of the amidated sialic acid.
  • FIG. 8 is a graph showing the concentration of methylamine hydrochloride and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction performed on the beads.
  • FIG. 9 is a graph showing the type of solvent and the ratio of amidated sialic acid in the amidation reaction performed on the beads.
  • FIG. 10 is a graph showing the types of alkalizing agents and the ratio of amidated sialic acid in the amidation reaction performed in the liquid phase.
  • tert-butylamine is used as an alkaline agent, and an amidation reaction is carried out using a stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride (upper row) and a stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride (lower row). It is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the obtained analytical sample.
  • FIG. 12 shows an analytical sample obtained by mixing sugar chains obtained by performing an amidation reaction with an isotope-labeled ethylamine hydrochloride and a stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride. It is an enlarged view which shows the peak corresponding to A3 (left side) and A3F (right side) in the mass spectrum obtained by mass spectrometry.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a flow of an analysis method according to the method for preparing an analysis sample of the present embodiment.
  • the sialic acid of the sugar chain contained in the sample is lactonized based on the binding mode, and then the produced lactone is amidated.
  • step S1001 a sample containing a sugar chain is prepared.
  • the sample containing a sugar chain is not particularly limited, and may contain at least one molecule selected from the group consisting of a sugar chain, a free sugar chain, a glycopeptide and a glycoprotein, and a glycolipid.
  • the binding mode-specific modification of sialic acid contained in the sugar chain is performed.
  • the sugar chain in the sample preferably contains a sugar chain that may have sialic acid at the terminal, such as an N-linked sugar chain, an O-linked sugar chain, and a glycolipid type sugar chain.
  • the sugar chain in the sample contains or may contain at least one of ⁇ 2,3-sialic acid, ⁇ 2,8-sialic acid and ⁇ 2,9-sialic acid, in addition to this. It is more preferred that it contains or may contain ⁇ 2,6-sialic acid.
  • the sample contains free sugar chains, sugar chains released from glycoproteins, glycopeptides or glycolipids can be used.
  • a method such as enzyme treatment using N-glycosidase, O-glycosidase, endoglycoseramidelase or the like, hydrazine decomposition, ⁇ elimination by alkali treatment and the like can be used.
  • peptide-N-glycosidase F PNGase F
  • PNGase A peptide-N-glycosidase A
  • EndoM endo- ⁇ -N- Enzyme treatment with acetyl glucosaminidase
  • PA formation pyridyl amination
  • a treatment for suppressing the side reaction of the peptide portion can be appropriately performed as described in the section "Suppression of side reaction of glycopeptide and glycoprotein" described later.
  • a glycopeptide or a glycoprotein having a large number of amino acid residues in the peptide chain is preferably used by cleaving the peptide chain by enzymatic cleavage or the like.
  • the number of amino acid residues in the peptide chain is preferably 30 or less, more preferably 20 or less, still more preferably 15 or less.
  • the number of amino acid residues in the peptide chain is preferably 2 or more, and more preferably 3 or more.
  • a digestive enzyme for cleaving the peptide chain of a glycopeptide or a glycoprotein trypsin, Lys-C, arginine endopeptidase, chymotrypsin, pepsin, thermolysin, proteinase K, pronase E and the like are used. Two or more of these digestive enzymes may be used in combination.
  • the conditions for cleavage of the peptide chain are not particularly limited, and an appropriate protocol according to the digestive enzyme used is adopted. Prior to this cleavage, denaturation or alkylation of proteins and peptides in the sample may be performed. The conditions of the modification treatment or the alkylation treatment are not particularly limited. Further, the peptide chain may be cleaved by chemical cleavage or the like instead of enzymatic cleavage.
  • step S1003 the sample is brought into contact with a reaction solution for lactonization (hereinafter referred to as a lactonization reaction solution), and a lactonization reaction is carried out to lactonize at least a part of sialic acid contained in the sugar chain (hereinafter, referred to as a lactonization reaction solution).
  • a lactonization reaction it refers to the lactonization reaction of step S1003 unless otherwise specified).
  • a part of sialic acid is lactonized and the other part of sialic acid is modified differently from lactonization using a lactonization reaction solution.
  • ⁇ 2,3-sialic acid, ⁇ 2,8-sialic acid and ⁇ 2,9-sialic acid are preferably lactonized.
  • the lactonization reaction solution contains a dehydration condensing agent and a first reaction agent containing an alcohol, an amine or a salt thereof.
  • the first reactant is a reactant for performing modification by esterification or amidation by binding at least a part thereof to sialic acid.
  • the first reactant functions, for example, as a nucleophile.
  • the type and concentration of the dehydration condensing agent and the first reactant are adjusted so as to selectively cause a dehydration reaction or a modification reaction by esterification or amidation based on the binding mode of sialic acid.
  • the lactonization reaction solution contains the dehydration condensate and does not need to contain the first reactant.
  • the binding mode-specific lactonization will be described.
  • the lactone produced by the intramolecular dehydration of the carboxy group of ⁇ 2,3-sialic acid has a 6-membered ring
  • the lactone that can be produced by the intramolecular dehydration of the carboxy group of ⁇ 2,6-sialic acid has a 7-membered ring. Therefore, ⁇ 2,3-sialic acid, which produces a 6-membered ring that is more stable than the 7-membered ring, is more likely to be lactonized than ⁇ 2,6-sialic acid.
  • the carboxy group of ⁇ 2,3-sialic acid has a relatively large steric hindrance compared to the carboxy group of ⁇ 2,6-sialic acid, a large molecule has ⁇ 2 as compared with ⁇ 2,6-sialic acid.
  • 3-Difficult to react with sialic acid Based on such a difference in the molecular structure due to the binding mode of sialic acid, the types and concentrations of the dehydration condensing agent and the first reactant are adjusted so that different modifications are made depending on the binding mode of sialic acid.
  • the dehydration condensate preferably contains carbodiimide. This is because when carbodiimide is used, the carboxy group existing in the site where steric hindrance is large is less likely to be amidated than when a phosphonium-based dehydration condensing agent (so-called BOP reagent) or a uronium-based dehydration condensing agent is used as the dehydration condensing agent. is there.
  • a phosphonium-based dehydration condensing agent so-called BOP reagent
  • a uronium-based dehydration condensing agent is used as the dehydration condensing agent.
  • carbodiimides are N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (EDC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), 1, -Tert-Butyl-3-ethylcarbodiimide (BEC), N, N'-di-tert-butylcarbodiimide, 1,3-di-p-toluylcarbodiimide, bis (2,6-diisopropylphenyl) carbodiimide, bis (trimethylsilyl) ) Carbodiimide, 1,3-bis (2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-ylmethyl) carbodiimide (BDDC) and salts thereof.
  • DCC N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC N- (3-dimethyla
  • an additive having high nucleophilicity in addition to carbodiimide, it is preferable to use an additive having high nucleophilicity in order to promote dehydration condensation by the dehydration condensate agent and suppress side reactions.
  • Highly nucleophilic additives include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt), 4- (dimethylamino) pyridine (DMAP), and 2-cyano-2-.
  • the amine used as the first reactant preferably contains a primary or secondary alkylamine containing two or more carbon atoms.
  • a primary alkylamine ethylamine, propylamine, isopropylamine, butylamine, sec-butylamine, tert-butylamine and the like are preferable.
  • the secondary alkylamine dimethylamine, ethylmethylamine, diethylamine, propylmethylamine, isopropylmethylamine and the like are preferable.
  • an amine having a branched alkyl group such as isopropylamine from the viewpoint of making it difficult for the carboxy group existing in a site having a large steric hindrance such as the carboxy group of ⁇ 2,3-sialic acid to be amidated. ..
  • the carboxy group of some sialic acids such as ⁇ 2,6-sialic acid is amidated based on the binding mode of sialic acid.
  • the alcohol used as the first reactant is not particularly limited, and for example, methanol or ethanol can be used.
  • the carboxy group of some sialic acids such as ⁇ 2,6-sialic acid is esterified based on the binding mode of sialic acid.
  • the first reactant may contain the above-mentioned amine and alcohol salts.
  • the concentration of the dehydration condensing agent in the lactonization reaction solution is, for example, preferably 1 mM to 5 M (hereinafter, M represents mol / L), and more preferably 10 mM to 3 M.
  • M represents mol / L
  • the respective concentrations are preferably in the above range.
  • the concentration of amine in the lactonization reaction solution is preferably 0.01 to 20M, more preferably 0.1M to 10M.
  • the reaction temperature during the lactonization reaction is preferably about ⁇ 20 ° C. to 100 ° C., more preferably ⁇ 10 ° C. to 50 ° C.
  • the lactonization reaction can be carried out in either the liquid phase or the solid phase. As long as the sample and the lactonization reaction solution can be brought into contact with each other, the state of the sample when the lactonization reaction occurs is not particularly limited.
  • the solid phase carrier can be used without particular limitation as long as it can fix sugar chains, glycopeptides, glycoproteins and the like.
  • a solid phase carrier having an epoxy group, a tosyl group, a carboxy group, an amino group or the like as a ligand can be used.
  • a solid phase carrier having a hydrazide group, an aminooxy group or the like as a ligand can be used.
  • HILIC hydrophilic interaction chromatography
  • the sample By carrying out the reaction with the sample fixed on the solid phase carrier, the removal of the reaction solution and desalting and purification become easier, and the preparation of the sample can be simplified.
  • a solid phase carrier is used, if the sample is fixed in the state of glycoprotein or glycopeptide and cleaved with glycosidase such as PNGase F after the lactonization reaction, the sample after the lactonization reaction becomes a free sugar chain. It can also be collected.
  • the sample after the lactonization reaction may be subjected to treatments such as purification, desalting, and solubilization by a known method or the like, if necessary. The same applies before and after the amidation reaction described later.
  • step S1003 the process proceeds to step S1005.
  • step S1005 the sample is brought into contact with a reaction solution (hereinafter referred to as an amidation reaction solution), and an amidation reaction for amidating the lactonized sialic acid in step S1003 is carried out to obtain a sample for analysis.
  • an amidation reaction solution hereinafter referred to as an amidation reaction solution
  • an amidation reaction for amidating the lactonized sialic acid in step S1003 is carried out to obtain a sample for analysis. .
  • the inventors have found a method for rapidly and directly amidating a lactone, which is completely different from the technical common wisdom of ring-opening a lactone by hydrolysis and then amidating a carboxy group. Since this reaction is preferably carried out even under anhydrous conditions, it is a reaction different from hydrolysis, and is considered to be transamination based on the interaction between an amino group and a lactone.
  • aminolysis ring-opening and amidation of lactones with ammonia, amines or salts thereof, which are possible even under anhydrous conditions, will be referred to as aminolysis. Since this aminolysis reaction does not require a dehydration condensing agent, it is possible to selectively amidate only the lactonized sialic acid without affecting the normal sialic acid in which the lactone is not formed. It is possible. In the following embodiment, an example in which the amidation reaction is carried out by aminolysis except for the lactonization reaction and the amidation in the non-specific modification reaction described later will be described.
  • lactone formed on sialic acid when referring to a lactone for sialic acid, such as "lactone formed on sialic acid,” the lactone formed between the sialic acid and the monosaccharide adjacent to the sialic acid, as well as the sial. It also refers to lactones and the like formed inside the acid.
  • the amidation reaction solution contains a reactant containing ammonia, amines or salts thereof (hereinafter referred to as a second reactant), and an alkalizing agent (alkalizing reagent).
  • the second reactant is an amidation reactant for modifying by amidation by binding at least a part thereof to sialic acid.
  • the second reactant is, for example, a nucleophile.
  • the alkalizing agent is a compound for raising the pH of the amidation reaction solution.
  • the amidation reaction is carried out solely by contacting the sample with the amidation reaction solution and the lactone is stabilized by a simple operation.
  • the dehydration condensing agent is not required for the amidation reaction, the dehydration condensing agent may be contained in the amidation reaction solution.
  • the amidation reaction solution may be prepared by adding ammonia, amines or salts thereof, and an alkalizing agent without removing the lactonization reaction solution added to the sample in step S1003.
  • the lactone can be stabilized by a simple operation.
  • the operation of bringing the sample into contact with the amidation reaction solution and then reacting the sample with the dehydration condensing agent will be described, but it may be performed for other purposes, for example.
  • the second reactant contained in the amidation reaction solution is different from the first reactant.
  • the second reactant is selected so that the first reactant and the second reactant have different masses when the analytical sample obtained by the method for preparing the analytical sample of the present embodiment is analyzed by mass spectrometry.
  • the first reactant and the second reactant are selected so that mass separation can be performed accurately on the obtained two types of modified products.
  • the first reactant and the second reactant may be different types of substances, or may be the same type of substance having different masses due to stable isotopes. It may also be an isobaric tag such as iTRAQ.
  • the lactone can be identified by two or more steps of mass spectrometry such as tandem mass spectrometry (MS / MS).
  • mass spectrometry such as tandem mass spectrometry (MS / MS).
  • MS / MS tandem mass spectrometry
  • the modified products modified by the first and second reactants are mass-spectrometrically analyzed in two or more steps, these modified products are separated by different m / z at any of the steps. I wish I could.
  • the analytical sample obtained by the method for preparing the analytical sample of the present embodiment is analyzed by chromatography, the fact that the first reactant and the second reactant have different substituents facilitates separation from each other by chromatography. Is preferable.
  • the term "amine” is intended to include hydrazine, hydrazine derivatives and hydroxyamines, without ammonia and salts of ammonia.
  • the amines contained in the second reactant are primary amines, hydrazines, hydrazine derivatives and hydroxyamines in which one or less carbon atoms are directly bonded to the carbon atoms bonded to the amino group. And at least one compound selected from these salts.
  • the primary amine even if the carbon chain has a branch, if the branch is located at a position away from the amino group, the decrease in the efficiency of the amidation reaction can be suppressed, which is preferable.
  • a primary amine having a linear hydrocarbon group is more preferable, and a primary amine having a linear alkyl group is further preferable.
  • the secondary reactant is preferably a primary amine having 10 or less carbon atoms, and is a primary amine having 6 or less carbon atoms, that is, methylamine, ethylamine, and the like. Proxylamine, butylamine, pentylamine and hexylamine are more preferred, and methylamine is most preferred.
  • branch indicates a branch of a hydrocarbon chain
  • lactone is efficiently amidated.
  • the hydrazine derivative contained in the second reactant is not particularly limited.
  • hydrazines such as acetohydrazide, hydrazide acetate, benzohydrazide and hydrazide benzoate are also included in the hydrazine derivative and can be used as a second reactant.
  • the hydrazine derivative contained in the second reactant is selected from the group consisting of methylhydrazine, ethylhydrazine, propylhydrazine, butylhydrazine, phenylhydrazine and benzylhydrazine, and acetohydrazine, acetate hydrazide, benzohydrazide and benzoate hydrazine. It can be at least one compound. Hydrazine or a derivative thereof as the second reactant is preferably hydrazine or methylhydrazine from the viewpoint of increasing or maintaining the efficiency of the amidation reaction.
  • the second reactant is a primary amine having an unsaturated chain hydrocarbon group
  • the unsaturated chain hydrocarbon group preferably contains a double bond
  • the unsaturated chain hydrocarbon group is allyl
  • the second reactant may be a primary amine containing a hydroxy group, in which case ethanolamine is preferred.
  • the amine contained in the amidation reaction solution may contain various functional groups other than the alkyl group.
  • the second reactant can be ammonia and a salt of the amine described above as the second reactant.
  • Compounds whose properties such as mass and other properties such as stable isotopes have changed, and compounds which have been specifically modified so as to change their functions are often sold or distributed in the form of salts. Therefore, by using these salts as the second reactant, the analytical method can be selected more flexibly or appropriately. Further, when a salt is used, it may be difficult to raise the pH of the amidation reaction solution, but since the alkalizing agent is used in the method for preparing the analysis sample of the present embodiment, this demerit can be eliminated.
  • Examples of the salt of ammonia or amine contained in the second reactant include an inorganic or organic acid salt of ammonia or amine, and of carbonate, hydrochloride, nitrate, sulfate, phosphate or methanesulfonate. Such inorganic salts are preferred, carbonates, hydrochlorides and nitrates are more preferred, and hydrochlorides are even more preferred.
  • As the primary amine hydrochloride having a linear hydrocarbon group methylamine hydrochloride, ethylamine hydrochloride, propylamine hydrochloride, butylamine hydrochloride, and pentylamine hydrochloride are more preferable, and methylamine hydrochloride is further preferable. .. Even when the second reactant is not a salt, amidation can be performed more efficiently by raising the pH with an alkalizing agent.
  • the alkalizing agent contained in the amidation reaction solution is not particularly limited as long as it is a compound that raises the pH of the amidation reaction solution.
  • the alkalizing agent is an amine
  • the alkalizing agent may be bound to sialic acid by the amidation reaction as in the case of the second reactant. In this case, it is not preferable because the peak of the mass spectrum or chromatogram is split during mass spectrometry or chromatography described later. Therefore, when the alkalizing agent is an amine, it is preferable that it is less likely to bind to sialic acid than the second reactant.
  • the amine contained in the alkalizing agent can be an amine having a larger steric hindrance than the second reactant.
  • the alkalizing agent when the alkalizing agent is an amine, the alkalizing agent is a branched primary amine, a secondary amine and a secondary amine in which two or more carbon atoms are directly bonded to a carbon atom bonded to an amino group. At least one amine selected from the group consisting of tertiary amines. Again, "branched" means that the carbon chain has branches.
  • Examples of the branched primary amine can include isopropylamine, secondary butylamine (sec-butylamine), tertiary butylamine (tert-butylamine), 2-hexaneamine or 1,3-dimethylamylamine.
  • the branched primary amine is preferably a molecule having 3 to 7 carbon atoms from the viewpoint of easy availability, ease of handling, solubility, reactivity, water solubility, etc., and is preferably isopropylamine, sec-butylamine, or tert-Butylamine is more preferred.
  • the alkalizing agent may contain one kind of primary amine, or may contain two or more kinds of primary amines in an arbitrary ratio.
  • the secondary amine contained in the alkalizing agent can be a dialkylamine, a secondary cyclic alkylamine or a secondary aromatic amine.
  • the dialkylamine preferably has a total carbon number of 1 to 10, more preferably 1 to 6, and can be, for example, dimethylamine, diethylamine, or dibutylamine.
  • the secondary cyclic alkylamine preferably has a total carbon number of 1 to 10, more preferably 4 to 10, and may be, for example, piperidine or 2,2,6,6-tetramethylpiperidine. it can. Atoms other than carbon and hydrogen may be used as part of the cyclic structure, such as morpholine.
  • the secondary aromatic amine preferably has a total carbon number of 7 to 20, more preferably 7 to 15, and can be, for example, methylaniline, phenylmethylamine or diphenylamine.
  • the secondary amine is preferably dialkylamine, more preferably dimethylamine, diethylamine or dibutylamine from the viewpoints of availability, ease of handling, solubility, reactivity, water solubility and the like.
  • the alkalizing agent may contain one kind of secondary amine, or may contain two or more kinds of secondary amines in an arbitrary ratio.
  • the tertiary amine contained in the alkalizing agent can be a trialkylamine, a tertiary cyclic alkylamine, or a tertiary aromatic amine.
  • the total carbon number of the trialkylamine is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and can be, for example, trimethylamine, triethylamine or tributylamine.
  • the tertiary cyclic alkylamine preferably has a total carbon number of 1 to 10, more preferably 4 to 10, and can be, for example, N-methylpiperidine. Atoms other than carbon and hydrogen may be used as part of the cyclic structure, such as N-methylmorpholine.
  • the tertiary aromatic amine preferably has a total carbon number of 8 to 20, more preferably 8 to 15, and can be, for example, dimethylaniline, diphenylmethylamine or triphenylamine.
  • the tertiary amine is preferably trialkylamine or N-methylmorpholine, more preferably trimethylamine, triethylamine or tributylamine from the viewpoints of easy availability, ease of handling, solubility, reactivity, water solubility and the like.
  • the alkalizing agent may contain one kind of tertiary amine, or may contain two or more kinds of secondary amines in an arbitrary ratio.
  • the alkalizing agent is a quaternary ammonium cation, a tertiary amine, a secondary amine, and a primary amine or alkali metal in which two or more carbon atoms are directly bonded to a carbon atom bonded to an amino group.
  • the quaternary ammonium cation contained in the alkalizing agent is not particularly limited, and may be, for example, a tetraalkylammonium cation, a tetraalkylphosphonium cation, an imidazolium cation, a pyrazolium cation, a pyridinium cation, or a pyrimidinium cation. it can.
  • the alkalizing agent may contain one kind of quaternary ammonium cation, or may contain two or more kinds of quaternary ammonium cations in an arbitrary ratio.
  • the hydroxide contained in the alkalizing agent is not particularly limited as long as it is an alkali metal hydroxide, an alkaline earth metal hydroxide, or a tetraalkylammonium hydroxide.
  • Hydroxides of alkali metals include calcium hydroxide (Ca (OH) 2), lithium hydroxide (LiOH), sodium hydroxide (NaOH), potassium hydroxide (KOH), rubidium hydroxide (RbOH), and water. At least one selected from the group consisting of cesium oxide (CsOH) can be preferably used.
  • Hydroxides of alkaline earth metals include strontium hydroxide (Sr (OH) 2), barium hydroxide (Ba (OH) 2), thallium hydroxide (II) (Eu (OH) 2), and hydroxide. At least one selected from the group consisting of thallium (I) (TlOH) can be preferably used.
  • As the hydroxide of tetraalkylammonium at least one selected from the group consisting of tetramethylammonium hydroxide (N (CH3) 4OH) and tetraethylammonium hydroxide (N (C2H5) 4OH is preferably used. be able to.
  • the alkalizing agent may contain one kind of hydroxide, or may contain two or more kinds of hydroxides in an arbitrary ratio.
  • the guanidine derivative contained in the alkalizing agent is not particularly limited, and may be, for example, 1,1,3,3-tetramethylguanidine or 1,1,3,3-tetraethylguanidine.
  • the alkalizing agent may contain one kind of guanidine derivative, or may contain two or more kinds of guanidine derivatives in an arbitrary ratio.
  • Examples of the branched primary amine, secondary amine salt, tertiary amine salt, guadinin and guadinin derivative salt contained in the alkalizing agent include inorganic acid salts and organic acid salts, and carbonic acid. Inorganic salts such as salts, hydrochlorides, nitrates, sulfates, phosphates or methanesulfonates are preferred.
  • the type of the alkali buffer solution contained in the alkalizing agent is not particularly limited, but may be at least one selected from the group consisting of, for example, Tris buffer solution, Good buffer solution, borate buffer solution, and carbonate buffer solution. it can.
  • first and second cases when it is described as “adding the amidation reaction solution to the sample” or "contacting the sample with the amidation reaction solution”, it may be any of the following first and second cases. It shall include.
  • the solution containing the second reactant and the solution containing the alkalizing agent are prepared separately, and both solutions are added to the sample in order and mixed with either one first.
  • the second case is a case where an amidation reaction solution containing a second reactant and an alkalizing agent is prepared and added to a sample. The same applies to the above-mentioned lactonization reaction solution.
  • the concentration of the second reactant in the amidation reaction solution is not particularly limited, but is preferably 0.1 M (M is mol / l) or more, more preferably 0.3 M or more, still more preferably 0.5 M or more. 0M or more is more preferable, and 3.0M or more is most preferable.
  • the amidation reaction solution contains ammonia or the above-mentioned primary amine, particularly methylamine, and the concentration of the above-mentioned primary amine such as ammonia or methylamine is preferably 0.1 M or more, and is 0.
  • concentration of the alkalizing agent in the amidation reaction solution can be adjusted by making the pH of the amidation reaction solution higher than the desired value, and the alkalizing agent is analyzed by binding to sialic acid as a modified product different from the second reactant. It is not particularly limited as long as it does not adversely affect the accuracy of.
  • the concentration of the alkalizing agent, particularly tert-butylamine is preferably 0.10% or more in volume / volume%, more preferably 0.30% or more, and 1% from the viewpoint of efficiently causing amidation.
  • the above is even more preferable, and 3% or more is even more preferable.
  • the concentration of the alkalizing agent, particularly the concentration of tert-butylamine can be appropriately set to 80% or less, 60% or less, or the like.
  • the solvent of the amidation reaction solution is preferably an aqueous solvent or a mixed solvent of an aqueous solvent and an organic solvent from the viewpoint of reliably causing amidation.
  • the solvent of the amidation reaction solution can be, for example, water, methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or an aqueous acetonitrile solution.
  • the pH of the amidation reaction solution is 7.7 or higher.
  • the pH of the amidation reaction solution is preferably 8.0 or higher, more preferably 8.8 or higher, and even more preferably 10.3 or higher.
  • Higher pH of the amidation reaction solution is preferable because side reactions such as hydrolysis are suppressed and the lactone is more reliably amidated by using various second reactants.
  • reaction time the time for contacting the sample with the amidation reaction solution in order to amidate the lactone by the amidation reaction is preferably less than 1 hour, more preferably less than 30 minutes, and less than 15 minutes. Is more preferable, less than 5 minutes is more preferable, and less than 1 minute is most preferable.
  • the sample may be washed with an amidation reaction solution, or the sample may be temporarily passed through the sample held on a carrier or the like.
  • the time of contact between the sample and the amidation reaction solution is not particularly limited, but may be 0.1 second or longer or 1 second or longer as appropriate from the viewpoint of sufficiently completing the reaction.
  • the sample and the amidation reaction solution may be mixed and dried as they are without setting a reaction time.
  • the amidation reaction since the amidation reaction is completed in a short time, it is possible to prevent the unstable lactone from being decomposed and the quantification in the analysis of the sugar chain is impaired. Further, by setting the reaction time of the amidation reaction to be short, the sample can be analyzed more efficiently.
  • the state of the sample at the time of causing the amidation reaction is not particularly limited, and may be a solid phase or a liquid phase.
  • the amidation reaction solution may be added to the sample while leaving the solution after the lactonization reaction as described above, or purification, desalting, solubilization, etc. may be performed after the lactonization reaction. A known pretreatment may be performed.
  • the sample subjected to the lactonization reaction on the solid phase may be maintained in the state of being fixed on the solid phase and the amidation reaction may be carried out.
  • the sample may be subjected to a lactonization reaction and then fixed on a solid phase to carry out an amidation reaction.
  • the same solid phase carrier as described above can be used for the lactonization reaction.
  • the above-mentioned conditions for the lactonization reaction can be used.
  • a glycoprotein or glycopeptide immobilized on a carrier may be enzymatically cleaved and recovered by a glycosidase such as PNGase F or a digestive enzyme such as trypsin, and a sugar bound to a solid phase carrier having a hydrazide group.
  • the chain may be recovered by freeing it with a weakly acidic solution.
  • the amidation reaction can be carried out with an amidation reaction solution using acetonitrile or the like as a solvent, and the sample can be eluted with an aqueous solution such as water.
  • sialic acid having a binding mode that is difficult to be lactonized is the first in the lactonization reaction. 1 Modified with a reactant.
  • Sialic acids in a lactonized binding mode such as ⁇ 2,3-, ⁇ 2,8- and ⁇ 2,9-sialic acid, are lactonized in the lactonization reaction and modified by a second reactant in the amidation reaction.
  • step S1007 the analytical sample is analyzed by at least one of mass spectrometry and chromatography.
  • the ionization method in mass spectrometry is not particularly limited, and a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method, an electrospray (ESI) method, a nanoelectrospray ionization (nano-ESI) method, or the like can be used.
  • the MALDI method is particularly preferable as the ionization method.
  • positive ion mode or negative ion mode may be used.
  • the mass spectrometry may be performed in a single mass spectrometry or in multiple steps, whereby the structure of the sugar chain other than the binding mode of sialic acid and the structure of the peptide chain can be suitably analyzed.
  • mass spectrometer at least one or more arbitrary mass spectrometers such as a quadrupole type, an ion trap type, and a time-of-flight type can be used in combination. Dissociation of ions or addition of atoms or atomic groups to ions can also be performed as appropriate.
  • liquid chromatography When performing analysis by chromatography, liquid chromatography is preferable.
  • the column used for liquid chromatography is not particularly limited, and a hydrophobic reverse phase column such as C30, C18, C8, C4, a carbon column, a normal phase column for HILIC, or the like can be appropriately used.
  • LC-MS liquid chromatograph-mass spectrometer
  • the data obtained by mass spectrometry or chromatography is analyzed, and sialic acid in the sugar chain contained in the sample is analyzed. In this data analysis, it is possible to estimate the structure of the sugar chain including the binding mode of sialic acid.
  • the method of analyzing the data obtained by mass spectrometry or chromatography is not particularly limited. When step S1007 is completed, the process ends.
  • the inventors have clarified that the side reaction of the peptide moiety is mainly derived from the presence of the amino group, and the sialic acid modification is performed by first blocking the amino group by chemical modification or the like before the sialic acid modification. It was clarified that sometimes the side reaction of the peptide portion can be suppressed.
  • the side reaction of the peptide portion can be suppressed.
  • Modifications by the lactonization reaction or the like according to the present embodiment can also be used for glycopeptides and glycoproteins in the same manner.
  • a reaction that blocks an amino group such as dimethyl labeling or guanizylation with a glycopeptide or glycoprotein is carried out, and a lactonization reaction and an amidation reaction are carried out.
  • the binding mode of sialic acid can be identified by using a method of forming a lactone according to the binding mode of sialic acid.
  • sugar peptides are less likely to cause side reactions due to their characteristics based on the amino acid sequence.
  • a glycopeptide produced by digesting the Fc region of IgG with a digestive enzyme such as trypsin does not have lysine, and the N-terminal amino group is also rapidly cyclized and dehydrated in the presence of a dehydration condensing agent. Glutamylate.
  • the amino group is absent, so prior blocking of the amino group, such as dimethylamidization or guanidylation, is not required.
  • a kit for preparing an analytical sample (hereinafter, referred to as a preparation kit) which is suitably used for the method for preparing an analytical sample of the present embodiment.
  • the preparation kit describes a reagent or any consumable item other than the reagent used for mass spectrometry, a protocol for preparing a sample for analysis in the present embodiment, or a URL of a website on which the protocol is described.
  • the preparation kit can include an alkalizing agent or a solution containing an alkalizing agent in the amidation reaction.
  • the sample is not particularly limited, and the same sample as in the first embodiment described above can be used. It is known that lactones are present in the gangliosides of glycolipids and milk oligosaccharide chains. The polysialic acid structure that is often expressed in the brain contains sialic acid in the binding mode of ⁇ 2,8- and ⁇ 2,9-, and it is said that these are likely to form lactones. It is known that lactones are contained in sugar chains of biopharmacy, especially antibody drugs. For example, in order to quantify the lactone present in such a sample, or to investigate whether the lactone is present or not in an unknown sample, the method for preparing an analytical sample of the present embodiment is used. Can be used.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the flow of the analysis method according to the method for preparing the analysis sample of the present embodiment. Since step S2001 is the same as step S1001 in the above-described embodiment, the description thereof will be omitted. When step S2001 is completed, the process proceeds to step S2003.
  • step S2003 the sample is brought into contact with the amidation reaction solution, and an amidation reaction for amidating the sialic acid originally contained in the sample is performed to obtain a sample for analysis.
  • the amidation reaction can be carried out under the same conditions using the same amidation reaction solution as in the above-described embodiment.
  • step S2003 is completed, the process proceeds to step S2005. Since step S2005 is the same as step S1007 in the above-described embodiment, the description thereof will be omitted.
  • the lactonization reaction and the further amidation reaction in the above-described embodiment may be carried out.
  • the amidation reaction performed before the lactonization reaction is called the first amidation reaction
  • the amidation reaction performed after the lactonization reaction is called the second amidation reaction.
  • the lactone originally contained in the sample ⁇ 2,3-sialic acid, ⁇ 2,8-sialic acid, ⁇ 2,9-sialic acid, and ⁇ 2,6-sialic acid that were not originally lactonized in the sample. Can be modified with different modifiers.
  • the sialic acid lactone originally contained in the sample can be analyzed, and the binding mode-specific sialic acid can be analyzed.
  • a reaction for amidating or esterifying sialic acid non-specifically in a binding mode (hereinafter referred to as a non-specific modification reaction) may be performed.
  • the sample subjected to the amidation reaction is brought into contact with the reaction solution for the non-specific modification reaction (hereinafter referred to as the non-specific modification reaction solution) and contained in the sample before the amidation reaction in step S2003.
  • the sialic acid in which the lactone was not formed is modified.
  • each non-amided sialic acid contained in the sample is modified regardless of the binding mode of sialic acid to obtain a sample for analysis.
  • the non-specific modification reaction solution contains a dehydration condensate and a third reactant containing alcohol, ammonia, amines or salts thereof.
  • the third reactant is a reactant for modifying the esterification or amidation of sialic acid by binding at least a part thereof to sialic acid in a non-specific manner.
  • the third reactant functions, for example, as a nucleophile.
  • the third reactant is selected so that the modified product obtained by modification with the second reactant and the third reactant is detected separately by mass spectrometry or chromatography as described above.
  • the dehydration condensing agent in the non-specific modification reaction the phosphonium-based dehydration condensing agent or the uronium-based dehydration condensing agent used in the second reaction of Patent Document 1 described above can be used.
  • the third reactant in the non-specific modification reaction the amine used in the "second reaction" of Patent Document 1 described above or an alcohol such as methanol or ethanol can be used.
  • 1-Methyl-3-p-tolyltriazene and 1-Ethyl-3-p-tolyltriazene (1-Ethyl-3-) are non-specific esterification reactions. Esterifying agents such as p-tolyltriazene) can also be used.
  • the type of reaction or the composition of the reaction solution is not particularly limited as long as the modification different from the modification in the amidation reaction in step S2003 can be performed on the sialic acid contained in the sugar chain. ..
  • the method for preparing an analytical sample is to prepare a sample containing a sugar chain, and to react the sample with an lactone contained in the sugar chain, ammonia or carbon bonded to an amino group.
  • the alkalizing agent is a quaternary ammonium cation, a tertiary amine, and the like.
  • Branched primary amines in which two or more carbon atoms are directly bonded to secondary amines and carbon atoms bonded to amino groups, alkali metal hydroxides, alkaline earth metal hydroxides and tetraalkylammoniums.
  • the first compound is ammonia, amine, hydroxyamine, and the like.
  • the amidation reaction causes the sample to be used. This is done only by contacting with the amidation reaction solution. This makes it possible to easily prepare a sample for analysis.
  • the amidation reaction solution is the same as the lactone. Does not contain a dehydration condensing agent to react. Thereby, the amidation reaction solution can be prepared more easily.
  • the first compound is linearly hydrocarbonized. Contains hydrogen groups. As a result, the first compound can more reliably modify sialic acid.
  • the linear hydrocarbon group is an alkyl group.
  • the first compound can more reliably modify sialic acid.
  • the linear hydrocarbon group has any one of 1 to 6 carbon atoms. Is.
  • the first compound can modify sialic acid more reliably.
  • the lactone is a sialic acid of the sugar chain. It is formed in acid. This makes it possible to accurately analyze the lactone of sialic acid, which is unstable and difficult to analyze.
  • the lactone is the ⁇ 2 of the sugar chain.
  • 3-Sialic acid, ⁇ 2,8-Sialic acid and ⁇ 2,9-Sialic acid are formed in at least one of them. This makes it possible to perform a binding mode-specific analysis of the sialic acid lactone or sialic acid originally contained in the sample.
  • the prepared sample is reacted with the sialic acid. It further comprises contacting with a lactonization reaction solution containing a dehydration condensing agent to lactonize at least a portion of the sialic acid. This makes it possible to distinguish and analyze a part of sialic acid from another part based on the stability of the lactone.
  • the lactonization reaction solution is the same as the sialic acid contained in the sugar chain. It further comprises a reactant to be bound, the reactant having a different mass than the first compound, the sample being brought into contact with the lactonization reaction solution, and one of the sialic acids based on the binding mode of the sialic acid.
  • the moiety is lactonized and at least a portion of the reactant is attached to the other portion of the sialic acid. Thereby, a part of sialic acid and another part can be distinguished and analyzed based on the binding mode of sialic acid.
  • the sample is brought into contact with the lactonization reaction solution to cause ⁇ 2,3-sial.
  • the acid, ⁇ 2,8-sialic acid, or ⁇ 2,9-sialic acid is lactonized and a part of the reactant is bound to ⁇ 2,6-sialic acid. This makes it possible to distinguish and analyze ⁇ 2,3-sialic acid, ⁇ 2,8-sialic acid, and ⁇ 2,9-sialic acid and ⁇ 2,6-sialic acid.
  • the analysis method according to one aspect is to prepare a sample by the method for preparing an analysis sample according to any one of paragraphs 1 to 15, and to analyze the prepared sample. To be equipped. As a result, the lactone contained in the sugar chain can be amidated more efficiently.
  • the prepared sample is analyzed by at least one of mass spectrometry and chromatography. To. This makes it possible to separate and analyze sugar chains based on the modifications made during the preparation of the sample for analysis.
  • the kit for preparing an analytical sample according to one embodiment is described in any one of paragraphs 1 to 15 of the method for preparing an analytical sample, or in paragraph 16 or 17. It is used for the analysis method of. As a result, a sample for analysis can be efficiently prepared.
  • the present invention is not limited to the contents of the above embodiment. Other aspects conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included within the scope of the present invention.
  • a sugar chain A2 glycan (33A2) containing two ⁇ 2,3-sialic acids was prepared by the following method. Add 2.5 U of PNGase F (SIGMA) to a tube containing 20 ⁇ L of 1 nmol / ⁇ L ⁇ 2,3-sialyl glycopeptide ( ⁇ 2,3-SGP; Fushimi Pharmaceutical Co., Ltd.) and o / n (over) at 37 ° C. Nite, N-type sugar chain A2 glycan (33A2) was released by incubation. The free sugar chains were desalted with Stage Tip Carbon.
  • SIGMA PNGase F
  • the desalted sugar chain was redissolved in appropriate water and used as a sample.
  • this sample was directly reacted with beads.
  • the sample was dispensed into an Eppendorf tube and further removed with SpeedVac (Thermo Fisher Scientific) as a sample.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the structure of the sugar chain in the sample used in the following examples and the expected change in the structure.
  • the sugar chain 33A2 has a basic structure consisting of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) and mannose (Man), and two side chains. GlcNAc, galactose (Gal) and sialic acid (Neu5Ac) are bound to each of the two side chains.
  • GlcNAc, galactose (Gal) and sialic acid (Neu5Ac) are bound to each of the two side chains.
  • a lactone was formed at the binding portion between ⁇ 2,3-sialic acid at the non-reducing end and galactose to which the sialic acid is bound, and this point is shown by the double line B1.
  • the sugar chain 33A2 is lactonized by binding mode-specific sialic acid modification using a lactonization reaction solution (arrow A1). When this lactone is hydrolyzed, it returns to its original sialic acid structure (arrow A2). This lactone can be directly amidated by aminolysis (arrow A3).
  • the peak corresponding to the methylamided sugar chain is the peak corresponding to the sugar chain amidated by the primary aminolysis
  • the ethylamided peak is the sugar chain remaining as a lactone after the primary aminolysis. It can be read as the corresponding peak and quantitatively evaluated.
  • ⁇ Basic reaction conditions when performing aminolysis on beads> A sample containing a sugar chain was adsorbed on hydrazide beads (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., according to the standard protocol of BlotGlyco), and excess hydrazide groups were capped. Then, a lactonization reaction solution (2M isopropylamine (iPA) hydrochloride, 500 mM EDC-HCl, 500 mM HOBt) that specifically modifies the sialic acid bond mode is added to the sample, and the mixture is stirred for 1 hour to ⁇ 2,3-.
  • iPA isopropylamine
  • Sialic acid was lactonized (at this time, if ⁇ 2,6-sialic acid was present, it was isopropylamidated). Subsequently, the beads were washed 3 times with 200 ⁇ L of methanol (MeOH), 100 ⁇ L of the primary aminolysis solution (the components may differ in each of the following examples and will be described each time) was added to the beads, and the beads were lightly stirred and far away. The primary aminolysis solution was removed with care.
  • MeOH methanol
  • the beads are washed sequentially with MeOH (200 ⁇ L x 3), H2O (200 ⁇ L x 3) and MeOH (200 ⁇ L x 3), 17.5% ethylamine aqueous solution, which is a secondary aminolysis solution, is added, and after light stirring, the beads are far away. The solution was removed with care. Furthermore, the beads were washed with H2O (200 ⁇ L x 3), sugar chains were released from the beads according to the standard protocol of BlotGlyco, and then the measurement was performed by mass spectrometry described later.
  • acetonitrile (ACN) containing 2.5% trifluoroacetic acid (TFA) was added to return the pH to near neutral, and amide purification was performed in HILIC mode using GL-Tip Amide manufactured by GL Sciences to remove excess reagents. After that, the eluted sugar chains were dried with SpeedVac. Then, in order to amidate the remaining lactone, a 17.5% aqueous ethylamine solution was added to perform secondary aminolysis, dried with SpeedVac, and measured by mass spectrometry described later.
  • FIG. 4 shows 33A2 containing sialic acid in either the unmodified state (COOH), the amidated state (Amide), or the lactonized state (Lactone) after the primary aminolysis reaction. It is a figure which shows an example of the mass spectrum of the sample after performing the secondary aminolysis.
  • the horizontal axis shows m / z (corresponding to the mass-to-charge ratio), and the vertical axis shows the relative detection amount.
  • the condition of this secondary aminolysis is a condition in which the lactone is completely ethylamidized, the ethylamidated product can be read as a lactone body. If hydrolysis does not occur and the lactone can be converted to 100% methylamid by primary aminolysis, a peak is obtained only at m / z 2471.9.
  • the evaluation of the ratio of COOH, Amide and Lactone is based on the fact that one molecule contains two sialic acids, and the relative intensity of each peak is read from the mass spectrum to determine the ratio of COOH, Amide and Lactone. The peak intensity of each was calculated and normalized with the whole as 100%.
  • Example 1 ⁇ Examination of tert-butylamine concentration as an alkalizing agent (on beads)> The experiment was carried out according to the basic reaction conditions for performing aminolysis on beads as described above.
  • an amidation reaction solution for primary aminolysis 3M methylamine hydrochloride containing 0-50% tert-butylamine was used.
  • tert-butylamine is an alkalizing agent
  • 3M methylamine hydrochloride is a substance (second reactant) that constitutes a modified product in amidation.
  • FIG. 5 is a graph showing the concentration (volume / volume%) of tert-butylamine and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction of this example.
  • tert-butylamine In the absence of tert-butylamine, aminolysis was confirmed, but most of the sialic acid remained in the lactonized form and part of it was hydrolyzed.
  • tert-butylamine was added even in a small amount, aminolysis began to occur, and when the concentration of tert-butylamine was about 10%, almost 100% methylamide formation occurred. From this, it was found that when amine hydrochloride is used, aminolysis can be promoted by raising the pH of the amidation reaction solution with another base.
  • Example 2 ⁇ Examination of types of alkalizing agents (on beads)> The experiment was carried out according to the basic reaction conditions for performing aminolysis on beads as described above.
  • an amidation reaction solution for performing primary aminolysis 10% or 1M various alkalizing agents (10% aqueous ammonia, 10% isopropylamine (iPA), 10% tert-butylamine (t-BA), 10% dimethylamine) 3M methylamine hydrochloride solution containing any of (DMA), 10% trimethylamine (TMA), 10% methylmorpholine (NMM), 10% tetramethylguanidine (TMG), 1M sodium hydroxide solution (NaOH)) was used.
  • DMA dimethylamine
  • TMA trimethylamine
  • NMM 10% methylmorpholine
  • TMG tetramethylguanidine
  • NaOH sodium hydroxide solution
  • FIG. 6 is a graph showing the types of alkalizing agents and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction of this example. From FIG. 6, it can be seen that aminolysis can be caused regardless of the type of alkalizing agent used, and aminolysis can be promoted regardless of the type of alkalizing agent.
  • FIG. 7 is a graph showing the composition of the solution during the amidation reaction of this comparative example and the ratio of the amidated sialic acid. From FIG. 7, under the condition that trifluoroacetic acid was added instead of the base and the pH of the amidation reaction solution was lowered, the results were in agreement with the case where no acid was added, and 3M MA-HCl and high concentration amine hydrochloric acid. It was found that the use of salt did not promote aminolysis at all.
  • Example 3 ⁇ Examination of amine hydrochloride concentration as a second reactant (on beads)> The experiment was carried out according to the basic reaction conditions for performing aminolysis on beads as described above. A 10 mM to 3 M methylamine hydrochloride solution containing 10% tert-butylamine was used as the amidation reaction solution for performing primary aminolysis.
  • FIG. 8 is a graph showing the concentration of methylamine hydrochloride and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction of this example. From FIG. 8, it was found that although aminolysis and hydrolysis occur in competition, a higher concentration on the amine hydrochloride side is preferable.
  • Example 4 ⁇ Solvent study (on beads)> The experiment was carried out according to the basic reaction conditions for performing aminolysis on beads as described above.
  • Various solutions containing 10% tert-butylamine (t-BA) and 100 mM methylamine hydrochloride as an amidation reaction solution for performing primary aminolysis solvent: water (H2O), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) , Dimethyl sulfoxide (DMSO), 80% aqueous acetonitrile (ACN) solution
  • solvent water (H2O), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) , Dimethyl sulfoxide (DMSO), 80% aqueous acetonitrile (ACN) solution
  • FIG. 9 is a graph showing the type of solvent and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction of this example. From FIG. 9, it was found that an aqueous solvent is preferable from the viewpoint of efficiently causing aminolysis, but aminolysis proceeds without any problem even if a part of the organic solvent is mixed.
  • Example 5 ⁇ Examination of types of alkalizing agents (liquid phase)> The experiment was carried out according to the basic reaction conditions for performing aminolysis in the liquid phase described above.
  • an alkalizing agent contained in the amidation reaction solution tert-butylamine (t-BA), 50% dimethylamine aqueous solution (DMA), 28% trimethylamine aqueous solution (TMA), tetramethylguadinidine (TMG) or 1M sodium hydroxide
  • t-BA tert-butylamine
  • DMA 50% dimethylamine aqueous solution
  • TMA trimethylamine aqueous solution
  • TMG tetramethylguadinidine
  • NaOH 1M sodium hydroxide
  • FIG. 10 is a graph showing the types of alkalizing agents and the ratio of amidated sialic acid during the amidation reaction of this example. From FIG. 10, even when the (In-solution) amidation reaction was carried out in the liquid phase, the sialic acid in which aminolysis occurred remained at a certain ratio when the alkalizing agent was not added, but the alkalizing agent was added. It was found that the addition can promote aminolysis.
  • the order in which the solution containing the second reactant and the solution containing the alkalizing agent were added to the sugar chain having lactonized sialic acid was also examined. As a result, the solution containing the second reactant may be added and then the solution containing the alkalizing agent may be added, and the solution containing the second reactant and the solution containing the alkalizing agent are mixed and added to the sugar chain. However, the same result as above was obtained.
  • N-type sugar chains were excised from human serum-derived ⁇ -anti-trypsin (AAT) using PNGase F.
  • the excised N-type sugar chain was bound to hydrazide beads according to the protocol of BlotGlyco manufactured by Sumitomo Bakelite. After that, the capping of the excess hydrazide group was performed according to BlotGlyco's protocol.
  • a lactonization reaction solution (2M isopropylamine (iPA) hydrochloride, 500 mM EDC-HCl, 500 mM HOBt) that specifically modifies the sialic acid binding mode to the sugar chains on the beads was added to the 100 ⁇ L beads.
  • iPA isopropylamine
  • EDC-HCl 500 mM HOBt
  • ⁇ 2,6-sialic acid was isopropylamidated and ⁇ 2,3-sialic acid was lactonized with gentle stirring at 800 rpm for an hour.
  • the beads were then washed 3 times with 200 ⁇ L of MeOH, followed by a solution of ethylamine hydrochloride (EtNH2-HCl) or stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride (EtNH2-d5) supplemented with 10% tert-butylamine as an alkalizing agent.
  • -HCl both with a concentration of 3M 100 ⁇ L of the solution was added to the beads, stirred lightly, and centrifuged to remove this amidation reaction solution.
  • MALDI-MS mass spectrometry in which ionization is performed by MALDI.
  • FIG. 11 is a diagram showing a mass spectrum obtained in this example.
  • the horizontal axis shows m / z, and the vertical axis shows the strength at the time of detection.
  • the upper part is a mass spectrum when the amidation reaction is carried out using an ethylamine hydrochloride not labeled with a stable isotope
  • the lower part is an amidation using an ethylamine hydrochloride labeled with a stable isotope.
  • It is a mass spectrum when the reaction is carried out.
  • an enlarged view of the mass spectrum on the left side is shown on the right side (arrow A11).
  • the peak observed at m / z 2735.8 is an A2 type sugar chain with two additions of ⁇ 2,6-sialic acid, which are converted to isopropylamide at the time of sialic acid binding mode-specific modification. It did not react with the subsequent aminolysis and was observed at the same m / z using stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride EtNH2-d5-HCl.
  • the peak of 3419.4 observed when stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride EtNH2-HCl was used was a triple-stranded A3 containing one ⁇ 2,3-sialic acid and two ⁇ 2,6-sialic acid.
  • Example 7 In the same manner as in Example 6, sugar chains modified with each of the isotope-labeled ethylamine hydrochloride and the stable isotope-labeled ethylamine hydrochloride are mixed in equal amounts to prepare a sample for mass spectrometry. Prepared. The prepared mass spectrometric sample was mass-analyzed in the same manner as in Example 6.
  • FIG. 12 is an enlarged view of the mass spectrum obtained in this example.
  • peaks corresponding to A3 (left side of the figure) and A3F (right side of the figure), which are typical ⁇ 2,3-sialic acid-containing triple-chain sugar chains contained in AAT are shown.
  • the peaks of A3 and A3F were observed with a 5 Da shift by stable isotope labeling, but it was found that the ionic strengths were almost the same when mixed in equal amounts. This means that the ionization efficiency does not change depending on the presence or absence of stable isotope labeling after aminolysis, and even when stable isotope-labeled amine hydrochloride is used, the pH is forcibly increased to promote aminolysis. This indicates that it can be applied to comparative mass spectrometry.

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Abstract

分析用試料の調製方法は、試料を、糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、アルカリ化剤がアミンである場合、アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。

Description

分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット
　本発明は、分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キットに関する。
　シアル酸は生体内に数多く存在する糖である。シアル酸は、生体内においてタンパク質と結合された糖鎖にも含まれ、糖鎖の非還元末端に存在することが多い。従って、シアル酸は、このような糖タンパク質分子において分子の外側に配置され他の分子から直接認識されるため、重要な役割を担っている。
　シアル酸は、隣接する糖との間の結合様式（linkage type）が異なる場合がある。例えば、ヒトのＮ－結合型糖鎖（Ｎ型糖鎖）では主にα２，３－およびα２，６－の結合様式、Ｏ－結合型糖鎖（Ｏ型糖鎖）およびスフィンゴ糖脂質ではこれらに加えてα２，８－およびα２，９－の結合様式が知られている。このような結合様式の違いにより、シアル酸は異なる分子から認識され、異なる役割を有し得る。
　質量分析等においては、シアル酸を含有する糖鎖に対する前処理としてシアル酸の修飾が行われている。これは、負電荷を有するシアル酸のカルボキシ基をエステル化またはアミド化等により中性化することで、イオン化の抑制およびシアル酸の脱離等のデメリットを解消するものである。シアル酸のラクトン化では、結合様式により生成されるラクトンの安定性が異なるため、この安定性の違いを利用して結合様式特異的にシアル酸の修飾および解析を行うことができる。ここで、ラクトンはきわめて不安定であり、水中でも容易に加水分解され、酸性または塩基性条件でさらに迅速に加水分解される。従って、前処理における修飾により生成されたラクトンを、アミド化により安定化させることが報告されている（特許文献１、非特許文献１参照）。ラクトンは、生体における糖鎖および抗体医薬の糖鎖等においても存在し、これらの解析を行う際にも安定化を行うことができる。また、非特許文献２に記載されたラクトンのアミノ分解による直接アミド化は、ラクトンの迅速かつ特異的なアミド修飾を行うことができ、今後の利用が期待されている。
日本国特許第６１３５７１０号公報
Nishikaze T, Tsumoto H, Sekiya S, Iwamoto S, Miura Y, Tanaka K. "Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling" Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2017年2月21日、Volume 89, Issue 4, pp.2353-2360 Hanamatsu H, Nishikaze T, Miura N, Piao J, Okada K, Sekiya S, Iwamoto S, Sakamoto N, Tanaka K, Furukawa JI. "Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones" Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2018年10月29日、Volume 90, Issue 22, pp.13193-13199
　ラクトンの加水分解を起こりにくくし、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することが望ましい。
　本発明の第１の態様は、糖鎖を含む試料を用意することと、前記試料に、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液を接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである、分析用試料の調製方法に関する。
　本発明の第２の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析することとを備える分析方法に関する。
　本発明の第３の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法、または、第２の態様の分析方法に用いられる分析用試料の調製用キットに関する。
　本発明によれば、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
図１は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。 図２は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。 図３は、実施例で生成された糖鎖の構造を示す概念図である。 図４は、図３で示した糖鎖に対応するピークを含むマススペクトルである。 図５は、ビーズ上で行ったアミド化反応の際のtert-ブチルアミンの濃度と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図６は、ビーズ上で行ったアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図７は、ビーズ上酸性下で行ったアミド化反応の際の溶液の組成と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図８は、ビーズ上で行ったアミド化反応の際のメチルアミン塩酸塩の濃度と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図９は、ビーズ上で行ったアミド化反応の際の溶媒の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図１０は、液相で行ったアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。 図１１は、アルカリ剤としてtert-ブチルアミンを用い、安定同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩（上段）と、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩（下段）とを用いてアミド化反応を行って得られた分析用試料を質量分析して得たマススペクトルである。 図１２は、同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩と、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩とを用いてアミド化反応を行って得られた糖鎖を混合して得られた分析用試料を質量分析して得たマススペクトルにおける、Ａ３（左側）およびＡ３Ｆ（右側）に対応するピークを示す拡大図である。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。発明者らは、アルカリ化剤を用いてアミド化反応を行うことにより、より効率的に糖鎖に含まれるラクトンをアミド化することができることを見出した。
－第１実施形態－
　図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。本実施形態の分析用試料の調製方法では、試料に含まれる糖鎖のシアル酸を結合様式に基づいてラクトン化した後、生成されたラクトンをアミド化する。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。
（試料について）
　糖鎖を含む試料は、特に限定されず、糖鎖、遊離糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。本実施形態の分析用試料の調製方法では、糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式特異的な修飾が行われる。試料中の糖鎖は、Ｎ－結合型糖鎖やＯ－結合型糖鎖、糖脂質型糖鎖等、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。また、試料中の糖鎖は、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つを含むか、含む可能性があることがより好ましく、これに加えてα２，６－シアル酸を含むか、含む可能性があることがさらに好ましい。
　試料が遊離糖鎖を含む場合は、糖タンパク質、糖ペプチドまたは糖脂質から遊離させた糖鎖を用いることができる。当該遊離の方法としては、Ｎ‐グリコシダーゼ、Ｏ‐グリコシダーゼ、またはエンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。糖ペプチドおよび糖タンパク質のペプチド鎖からＮ‐結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ(PNGase F)、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＡ(PNGase A)、またはエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Endo M）等による酵素処理が好適に用いられる。また、糖鎖の還元末端のピリジルアミノ化（PA化）等の修飾を適宜行うことができる。酵素処理の前に、後述する糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖の切断を行ってもよい。
　試料が糖ペプチドまたは糖タンパク質を含む場合、後述の「糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について」の部分で述べるように、ペプチド部分の副反応を抑えるための処理を適宜行うことができる。また、糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖のアミノ酸の残基数が多いものは、酵素的切断等により、ペプチド鎖を切断して用いることが好ましい。例えば、質量分析用の試料を調製する場合、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は３０以下が好ましく、２０以下がより好ましく、１５以下がさらに好ましい。一方、糖鎖が結合しているペプチドの由来を明確とすることが求められる場合には、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は２以上が好ましく、３以上がより好ましい。
　糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖を切断する場合の消化酵素としては、トリプシン、Ｌｙｓ‐Ｃ、アルギニンエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、またはプロナーゼＥ等が用いられる。これらの消化酵素の２種以上を組み合わせて用いてもよい。ペプチド鎖の切断の際の条件は特に限定されず、使用する消化酵素に応じた適宜のプロトコールが採用される。この切断の前に、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理またはアルキル化処理が行われてもよい。変性処理またはアルキル化処理の条件は特に限定されない。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。
　ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
（ラクトン化反応）
　ステップＳ１００３において、試料をラクトン化のための反応溶液（以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う（以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００３のラクトン化反応を指す）。以下では、ラクトン化反応溶液を用いて、結合様式特異的に、シアル酸の一部をラクトン化し、シアル酸の他の一部をラクトン化とは異なる修飾をする例を説明する。しかし、このラクトン化とは異なる修飾を行わなくてもよい。ラクトン化反応において、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸が好適にラクトン化される。
　ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アミンまたはこれらの塩を含む第１反応剤とを含む。第１反応剤は、その少なくとも一部がシアル酸に結合することにより、エステル化またはアミド化による修飾を行うための反応剤である。第１反応剤は、例えば求核剤として機能する。シアル酸の結合様式に基づいて選択的に脱水反応またはエステル化またはアミド化による修飾反応を起こすように、脱水縮合剤ならびに第１反応剤の種類および濃度が調整される。
　なお、第１反応剤による、ラクトン化とは異なる修飾を行わない場合には、ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤を含み、第１反応剤を含まなくてよい。
　結合様式特異的なラクトン化について説明する。α２，３－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水で生じるラクトンは六員環であり、α２，６－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水により生じ得るラクトンは七員環となる。従って、七員環より安定な六員環を生じるα２，３－シアル酸はα２，６－シアル酸よりラクトン化されやすい。また、α２，３－シアル酸のカルボキシ基はα２，６－シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、大きな分子は、α２，６－シアル酸と比べると、α２，３－シアル酸とは反応しづらい。このようなシアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾がされるように脱水縮合剤ならびに第１反応剤の種類および濃度が調整される。
（ラクトン化反応における脱水縮合剤）
　脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるBOP試薬）やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド(EDC)、Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３‐エチルカルボジイミド(BEC)、Ｎ，Ｎ’‐ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボジイミド、１，３‐ジ‐ｐ‐トルイルカルボジイミド、ビス（２，６‐ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３‐ビス（２，２‐ジメチル‐１，３‐ジオキソラン‐４‐イルメチル）カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
（ラクトン化反応における添加剤）
　脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、１‐ヒドロキシ‐７‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、４‐（ジメチルアミノ）ピリジン(DMAP)、２‐シアノ‐２‐（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル(Oxyma)、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、Ｎ‐ヒドロキシ‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
（ラクトン化反応における反応剤（第１反応剤））
　第１反応剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の第１反応剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
　第１反応剤として用いられるアルコールは、特に限定されず、例えばメタノールまたはエタノール等を用いることができる。ラクトン化反応溶液の反応剤にアルコールを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がエステル化される。
　なお、第１反応剤は、上述のアミンおよびアルコールの塩を含んでもよい。
（脱水縮合剤およびアミンの濃度について）
　ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～５Ｍ(以下では、Ｍはｍｏｌ／Ｌを示す)が好ましく、１０ｍＭ～３Ｍがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、０．０１～２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ～１０Ｍがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、－２０℃～１００℃程度が好ましく、－１０℃～５０℃がより好ましい。
（ラクトン化反応を行う相）
　ラクトン化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とラクトン化反応溶液とを接触させることができれば、ラクトン化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されない。
　固相で反応を行う場合、固相担体としては、糖鎖、糖ペプチド、または糖タンパク質等を固定可能なものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質を固定するためには、エポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を固定するためには、ヒドラジド基やアミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、イオン化の効率等の観点から、糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィ（以下、ＨＩＬＩＣと呼ぶ）用の担体、すなわち固定相に吸着させることも好ましく、このＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことがさらに好ましい。
　試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応溶液の除去および脱塩精製がより容易となり、試料の調製を簡素化できる。また、固相担体を用いる場合、糖タンパク質または糖ペプチドの状態で試料を固定し、ラクトン化反応後に、PNGase F等のグリコシダーゼ等による切断を行えば、ラクトン化反応後の試料を遊離糖鎖として回収することもできる。
　ラクトン化反応後の試料は、必要に応じて、公知の方法等により精製、脱塩、可溶化等の処理が行われてもよい。後述するアミド化反応の前後においても同様である。
　固相担体からの試料の遊離については、後述のアミド化反応について述べる条件を採用できる。試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、ラクトン化反応後のラクトン化反応溶液の除去等が容易となり、効率よくシアル酸の修飾を行うことができる。　ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
（アミド化反応）
　ステップＳ１００５において、試料を、反応溶液（以下、アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ１００３でラクトン化されたシアル酸をアミド化するアミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。発明者らは、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノ分解（アミノリシス）と考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。このアミノリシス反応は実質的に脱水縮合剤を必要としないので、ラクトンが形成されていない通常のシアル酸には影響を及ぼすことなく、ラクトン化しているシアル酸のみを選択的にアミド化することが可能である。以下の実施形態では、ラクトン化反応および後述の非特異的修飾反応におけるアミド化を除き、アミノリシスによりアミド化反応を行う例を説明する。
　以下の実施形態において、「シアル酸に形成されているラクトン」のようにシアル酸についてのラクトンに言及する場合、シアル酸と当該シアル酸に隣接する単糖間に形成されたラクトンの他、シアル酸の内部に形成されたラクトン等も指す。
　アミド化反応溶液は、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む反応剤（以下、第２反応剤と呼ぶ）、および、アルカリ化剤（アルカリ化試薬）が含まれる。第２反応剤は、その少なくとも一部がシアル酸に結合することにより、アミド化による修飾を行うためのアミド化反応剤である。第２反応剤は、例えば求核剤である。アルカリ化剤は、アミド化反応溶液のｐＨを上昇させるための化合物である。好ましくは、アミド化反応は、試料をアミド化反応溶液と接触させることのみにより行われ、簡便な操作でラクトンが安定化される。
　なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップＳ１００３で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩、および、アルカリ化剤を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応では、簡便な操作でラクトンを安定化させ得る。アミド化反応では、試料とアミド化反応溶液とを接触させた後、試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わないとして説明するが、例えば他の目的のため行ってもよい。
　ラクトン化反応溶液が上記第１反応剤を含む場合、アミド化反応溶液に含まれる第２反応剤は、第１反応剤とは異なる。第２反応剤は、本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料を質量分析で分析する場合、第１反応剤と第２反応剤は質量が異なるように選択される。質量分析の質量分解能に応じて、得られた２種類の修飾体に対し精度よく質量分離が行われるように第１反応剤および第２反応剤が選択される。第１反応剤および第２反応剤は別の種類の物質でもよいし、安定同位体により質量を異ならせた同じ種類の物質でもよい。また、iTRAQに代表されるようなアイソバリック（isobaric）なタグでも良い。この場合、第１段階の質量分析と第２段階の質量分析の間に行われる開裂により得られるプロダクトイオンのｍ／ｚが異なるように当該タグが設計されているため、シアル酸の結合様式やラクトン体の識別はタンデム質量分析（MS/MS）等の二段階以上の質量分析により行うことができる。このように、第１反応剤および第２反応剤によりそれぞれ修飾された修飾体を２以上の段階により質量分析する際に、いずれかの段階で異なるｍ／ｚによりこれらの修飾体を分離することができればよい。本実施形態の分析用試料の調製方法で得られた分析用試料をクロマトグラフィで分析する場合、第１反応剤と第２反応剤とは異なる置換基を有することがクロマトグラフィで互いに分離しやすくするために好ましい。
（アミド化反応におけるアミン）
　以下の実施形態では、「アミン」の語は、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンを含み、アンモニアおよびアンモニアの塩を含まないものとする。アミド化反応においてアミンを用いる場合、第２反応剤に含まれるアミンは、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物である。上述のように、第一級アミンの場合、炭素鎖に分枝を有していても、アミノ基から離れた位置に分枝があればアミド化反応の効率の低下が抑えられるため好ましい。
　第２反応剤は、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。第２反応剤は、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が１０以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が６以下の第一級アミン、すなわち、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンおよびヘキシルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝（以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す）を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的にラクトンがアミド化されるため好ましい。
　第２反応剤に含まれるヒドラジン誘導体は、特に限定されない。以下の実施形態では、アセトヒドラジド、酢酸ヒドラジド、ベンゾヒドラジドおよび安息香酸ヒドラジド等のヒドラジドもヒドラジン誘導体に含まれ、第２反応剤として用いることができる。第２反応剤に含まれるヒドラジン誘導体は、メチルヒドラジン、エチルヒドラジン、プロピルヒドラジン、ブチルヒドラジン、フェニルヒドラジンおよびベンジルヒドラジン、ならびに、アセトヒドラジド、酢酸ヒドラジド、ベンゾヒドラジドおよび安息香酸ヒドラジドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物とすることができる。第２反応剤としてのヒドラジンまたはその誘導体は、アミド化反応の効率を高めるまたは維持する観点から、ヒドラジンまたはメチルヒドラジンが好ましい。
　第２反応剤が不飽和鎖式炭化水素基を有する第一級アミンの場合、当該不飽和鎖式炭化水素基は二重結合を含むことが好ましく、当該不飽和鎖式炭化水素基はアリル（Allyl）基を含むことがより好ましく、当該アミンはアリルアミン（Allylamine）がさらに好ましい。第２反応剤はヒドロキシ基を含む第一級アミンでもよく、この場合、エタノールアミンが好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンはアルキル基以外の様々な官能基を含んでもよい。糖鎖がアミド化反応の結果このような官能基を含むように修飾されることにより、当該修飾を受けた糖鎖を、質量分析だけではなく、クロマトグラフィ等によってもより分離しやすくなる。
　第２反応剤は、アンモニア、および第２反応剤として上述したアミンの塩とすることができる。安定同位体等の質量等の性質が変化した化合物および、機能が変化するように特定の修飾がされた化合物は、塩の状態で販売または流通していることが多い。従って、第２反応剤としてこれらの塩を用いることで、分析法をより柔軟または適切に選択できる。また、塩を用いるとアミド化反応溶液のｐＨを高くしづらい場合があるが、本実施形態の分析用試料の調製方法では、アルカリ化剤を用いるため、このデメリットも解消することができる。
　第２反応剤に含まれるアンモニアまたはアミンの塩としては、アンモニアまたはアミンの無機酸塩または有機酸塩が挙げられ、炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩のような無機塩が好ましく、炭酸塩、塩酸塩および硝酸塩がより好ましく、塩酸塩がさらに好ましい。直鎖炭化水素基を有する第一級アミンの塩酸塩としては、メチルアミン塩酸塩、エチルアミン塩酸塩、プロピルアミン塩酸塩、ブチルアミン塩酸塩、ペンチルアミン塩酸塩がより好ましく、メチルアミン塩酸塩がさらに好ましい。　なお、第２反応剤が塩でない場合でも、アルカリ化剤によりｐＨを上昇させることで、より効率的にアミド化を行うことができる。
（アミド化反応におけるアルカリ化剤について）
　アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤は、アミド化反応溶液のｐＨを上昇させる化合物であれば、特に限定されない。しかし、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤と同様にアミド化反応によりアルカリ化剤がシアル酸に結合してしまう可能性がある。この場合、後述する質量分析またはクロマトグラフィの際にマススペクトルまたはクロマトグラムのピークが分裂してしまうため好ましくない。従って、アルカリ化剤がアミンである場合、第２反応剤よりもシアル酸に結合しにくいことが好ましい。例えば、アルカリ化剤に含まれるアミンは第２反応剤よりも立体障害の大きいアミンとすることができる。この観点から、アルカリ化剤がアミンである場合、アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。ここでも、「分岐型」とは炭素鎖が分枝を有することを示す。
　上記分岐型第一級アミンの例は、イソプロピルアミン、セカンダリーブチルアミン（sec-ブチルアミン）、ターシャリーブチルアミン（tert-ブチルアミン）、２－ヘキサンアミンまたは１，３－ジメチルアミラミンを含むことができる。上記分岐型第一級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、炭素数が３～７の分子が好ましく、イソプロピルアミン、sec-ブチルアミンまたはtert-ブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第一級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第一級アミンを含んでもよい。
　アルカリ化剤に含まれる第二級アミンは、ジアルキルアミン、第二級環状アルキルアミンまたは二級芳香族アミンとすることができる。ジアルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、例えば、ジメチルアミン、ジエチルアミンまたはジブチルアミンとすることができる。第二級環状アルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、４～１０であることがより好ましく、例えば、ピペリジンや2,2,6,6-テトラメチルピペリジンとすることができる。モルホリンのように、環状構造の一部に炭素や水素以外の原子が使われていてもよい。二級芳香族アミンは、総炭素数が７～２０であることが好ましく、７～１５であることがより好ましく、例えば、メチルアニリン、フェニルメチルアミンまたはジフェニルアミンとすることができる。第二級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、ジアルキルアミンが好ましく、ジメチルアミン、ジエチルアミンまたはジブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第二級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第二級アミンを含んでもよい。
　アルカリ化剤に含まれる第三級アミンは、トリアルキルアミン、第三級環状アルキルアミン、または三級芳香族アミンとすることができる。トリアルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミンまたはトリブチルアミンとすることができる。第三級環状アルキルアミンは、総炭素数が１～１０であることが好ましく、４～１０であることがより好ましく、例えば、N-メチルピペリジンとすることができる。N-メチルモルホリンのように、環状構造の一部に炭素や水素以外の原子が使われていてもよい。三級芳香族アミンは、総炭素数が８～２０であることが好ましく、８～１５であることがより好ましく、例えば、ジメチルアニリン、ジフェニルメチルアミンまたはトリフェニルアミンとすることができる。第三級アミンは、入手の容易さ、取扱いの簡便さ、溶解性、反応性または水溶性等の観点から、トリアルキルアミンまたはＮ－メチルモルホリンが好ましく、トリメチルアミン、トリエチルアミンまたはトリブチルアミンがより好ましい。アルカリ化剤は、１種類の第三級アミンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第二級アミンを含んでもよい。
　一例として、アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびに、アルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つを含むことができる。
　アルカリ化剤に含まれる第四級アンモニウムカチオンは、特に限定されないが、例えば、テトラアルキルアンモニウムカチオン、テトラアルキルホスホニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオンまたはピリミジニウムカチオンとすることができる。アルカリ化剤は、１種類の第四級アンモニウムカチオンを含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の第四級アンモニウムカチオンを含んでもよい。
　アルカリ化剤に含まれる水酸化物は、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、またはテトラアルキルアンモニウムの水酸化物であれば、特に限定されない。アルカリ金属の水酸化物としては、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、および水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。アルカリ土類金属の水酸化物としては、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、水酸化ユウロピウム（ＩＩ）（Ｅｕ（ＯＨ）２）、および水酸化タリウム（Ｉ）（ＴｌＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。テトラアルキルアンモニウムの水酸化物としては、水酸化テトラメチルアンモニウム（Ｎ（ＣＨ３）４ＯＨ）、および水酸化テトラエチルアンモニウム（Ｎ（Ｃ２Ｈ５）４ＯＨ）からなる群から選択される少なくとも１種を好適に使用することができる。アルカリ化剤は、１種類の水酸化物を含んでもよいし、任意の割合で２種類以上の水酸化物を含んでもよい。
　アルカリ化剤に含まれるグアニジン誘導体は、特に限定されないが、例えば１，１，３，３‐テトラメチルグアニジンまたは１，１，３，３‐テトラエチルグアニジンとすることができる。アルカリ化剤は、１種類のグアニジン誘導体を含んでもよいし、任意の割合で２種類以上のグアニジン誘導体を含んでもよい。
　アルカリ化剤に含まれる、上記分岐型第一級アミン、第二級アミンの塩、第三級アミンの塩、グアジニン及びグアジニン誘導体の塩としては、無機酸塩または有機酸塩が挙げられ、炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩のような無機塩が好ましい。
　アルカリ化剤に含まれるアルカリ緩衝液の種類は特に限定されないが、例えばTris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つとすることができる。
　なお、以下の実施形態において、「試料にアミド化反応溶液を加える」または「試料とアミド化反応溶液とを接触させる」等と記載した際は、以下の第１および第２のいずれの場合も含むものとする。第１の場合は、第２反応剤を含む溶液と、アルカリ化剤を含む溶液とを別々に調製し、いずれかを先にして順々に両溶液を試料に加えて混合する場合である。第２の場合は、第２反応剤とアルカリ化剤とを含むアミド化反応溶液を調製し、試料に加える場合である。上述のラクトン化反応溶液でも同様である。
（アミド化反応溶液の濃度）
　アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度は、特に限定されないが、０．１Ｍ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは上記第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニア、またはメチルアミン等の上記第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上が一層好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。アミド化反応溶液における第２反応剤の濃度が高いほど、より確実にラクトンのアミド化を行うことができる。アミド化反応溶液のアルカリ化剤の濃度は、アミド化反応溶液のｐＨを所望の値以上にすることができ、アルカリ化剤が第２反応剤と異なる修飾体としてシアル酸に結合することで分析の精度に悪影響を与えたりすることがなければ特に限定されない。一例をあげると、アルカリ化剤、特にtert-ブチルアミンの濃度は、アミド化を効率よく起こす観点から、体積／体積％で０．１０％以上が好ましく、０．３０％以上がより好ましく、１％以上がさらに好ましく、３％以上がより一層好ましい。アルカリ化剤の濃度は、特にtert-ブチルアミンの濃度は、適宜８０％以下、６０％以下等にすることができる。
（アミド化反応溶液の溶媒）
　アミド化反応溶液の溶媒は、アミド化を確実に起こす観点から水系溶媒または水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリル水溶液とすることができる。
（アミド化反応溶液のｐＨ）
　アミド化反応溶液のｐＨは、７．７以上である。アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上が好ましく、８．８以上がより好ましく、１０．３以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、加水分解等の副反応が抑制されたり、様々な第２反応剤を用いてより確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
（アミド化反応を起こすための時間）
　アミド化反応は、数秒～数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間（以下、反応時間と呼ぶ）は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。試料とアミド化反応溶液とが接触する時間は、特に限定されないが、反応を十分完了させる等の観点から適宜０．１秒以上または１秒以上等とすることができる。また、試料とアミド化反応溶液を混合し、そのまま反応時間を設けずに乾固してもよい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを抑制することができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
（アミド化反応を行う相）
　試料とアミド化反応溶液とを接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されず、固相でも液相でもよい。液相でアミド化反応を行う場合、上述したようにラクトン化反応後の溶液を残したまま試料にアミド化反応溶液を加えてもよいし、ラクトン化反応後に精製、脱塩、可溶化等の公知の前処理を行ってもよい。固相に固定した状態でアミド化反応が行われる場合、固相でラクトン化反応に供した試料を、固相に固定した状態を維持して、アミド化反応を行ってもよい。また、試料をラクトン化反応に供した後、固相に固定してアミド化反応を行ってもよい。
　固相でアミド化反応を行う場合、固相担体としては、ラクトン化反応に関して上述したものと同様のものを使用できる。固相担体への試料の固定については、ラクトン化反応に関して上述した条件を用いることができる。アミド化反応を固相で行う場合、固相担体に固定された試料に、アミド化反応溶液を作用させてアミド化を行った後は、化学的手法または酵素反応等により、担体から試料を遊離させて回収すればよい。例えば、担体に固定された糖タンパク質や糖ペプチドを、PNGase F等のグリコシダーゼやトリプシン等の消化酵素により酵素的に切断し回収してもよく、ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖を、弱酸性溶液により遊離させて回収してもよい。ＨＩＬＩＣでは、アセトニトリル等を溶媒としたアミド化反応溶液によりアミド化反応を行い、水等の水系溶液により試料を溶出することができる。
　上述した調製方法により得られた分析用試料では、ラクトン化反応溶液に第１反応剤を含めた場合、α２，６－シアル酸等のラクトン化されにくい結合様式のシアル酸はラクトン化反応において第１反応剤により修飾される。α２，３－、α２，８－およびα２，９－シアル酸等のラクトン化されやすい結合様式のシアル酸はラクトン化反応においてラクトン化され、アミド化反応において第２反応剤により修飾される。
　ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
　ステップＳ１００７において、分析用試料を質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析する。
　上述のラクトン化反応およびアミド化反応により、各反応で修飾を受けた糖鎖はそれぞれ質量が異なっている。従って、質量分析によりこれらの糖鎖を、シアル酸の結合様式に基づいて分離することができる。
　質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＥＳＩ）法等を用いることができる。イオン化の方法は特にＭＡＬＤＩ法が好ましい。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、シングル質量分析でも多段階で行ってもよく、これによりシアル酸の結合様式以外の糖鎖の構造や、ペプチド鎖の構造を好適に解析することができる。質量分析計としては、四重極型、イオントラップ型および飛行時間型等の任意の質量分析器を少なくとも一つ以上組み合わせて用いることができる。イオンの解離またはイオンへの原子若しくは原子団の付加等も適宜行うことができる。
　クロマトグラフィで分析を行う場合、液体クロマトグラフィが好ましい。液体クロマトグラフィに用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水性逆相カラムまたはカーボンカラム、ＨＩＬＩＣ用の順相カラムなどを適宜用いることができる。液体クロマトグラフィを行った後、質量分析により測定を行うことが複数回の分離により精密に試料中の成分の分析を行う上で好ましい。この場合、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）により、液体クロマトグラフからの溶出液をオンライン制御で質量分析計において直接ＥＳＩ等によりイオン化することがより好ましい。
　質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータが解析され、試料に含まれていた糖鎖におけるシアル酸の解析等が行われる。このデータ解析では、シアル酸の結合様式を含む糖鎖の構造の推定等を行うことができる。質量分析またはクロマトグラフィにより得られたデータの解析方法は特に限定されない。
　ステップＳ１００７が終了したら、処理を終了する。
（糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について）
　糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖、主鎖の末端にあるアミノ基およびカルボキシ基の間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
　発明者らは、ペプチド部分の副反応は主にアミノ基の存在に由来することを明らかにし、シアル酸修飾の前にアミノ基を化学修飾などで先にブロックしておくことで、シアル酸修飾時にペプチド部分の副反応を抑制出来ることを明らかにした。詳細は、以下の文献を参照されたい：Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091。本実施形態に係るラクトン化反応等による修飾もこれと同様に糖ペプチドおよび糖タンパク質に用いることができる。例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質に対してジメチルラベル化またはグアニジル化などのアミノ基をブロックする反応を行い、ラクトン化反応およびアミド化反応を行う。このとき、シアル酸の結合様式に応じてラクトンを形成させる手法を用いれば、シアル酸の結合様式を識別することもできる。
　なお、糖ぺプチドの中にはアミノ酸配列に基づく特性上副反応を生じ難いものがある。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域をトリプシン等の消化酵素により消化することによって生成した糖ペプチドは、リジンを有さず、Ｎ末端のアミノ基も脱水縮合剤の存在下で速やかに環化脱水してピログルタミル化する。その結果、アミノ基が存在しなくなるので、ジメチルアミド化またはグアニジル化など事前のアミノ基のブロッキングは必要ない。このような糖ペプチドに関しては、アミノ基のブロッキングを行わずにラクトン化反応およびアミド化反応を行うことにより解析に足るマススペクトルを得ることが可能となる。
（分析用試料の調製用キットについて）
　本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット（以下、調製用キットと呼ぶ）が提供される。調製用キットは、試薬若しくは、試薬以外の質量分析に用いられる任意の消耗品または、本実施形態における分析用試料を調製するためのプロトコル若しくは当該プロトコルが記載されているＷｅｂサイトのＵＲＬ等が記載された文書を含むことができる。例えば、調製用キットは、アミド化反応におけるアルカリ化剤またはアルカリ化剤を含む溶液を含むことができる。調製用キットを用いて分析用試料を調製することにより、より効率的に分析用試料を調製することができる。
－第２実施形態－
　第２実施形態の分析用試料の調製方法は、第１実施形態の分析用試料の調製方法と同様のアミド化反応が行われるが、ラクトン化反応を行わず、試料に元々含まれていたラクトンをアミド化反応によりアミド化する点が第１実施形態と異なっている。
（試料について）
　試料は、特に限定されず、上述の第１実施形態と同様の試料を用いることができる。糖脂質のガングリオシドおよびミルクオリゴ糖鎖にラクトンが存在することが知られている。脳内によく発現しているポリシアル酸構造は、α２，８－やα２，９－の結合様式のシアル酸を含むが、これらはラクトンが形成されやすいとも言われている。バイオ医薬品、特に抗体医薬品の糖鎖にラクトンが含まれることが知られている。例えば、このような試料において存在するラクトンを定量したり、あるいはラクトンが存在するか未知の試料に対してラクトンが存在するか否かを調べるために、本実施形態の分析用試料の調製方法を用いることができる。
　図２は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１は、上述の実施形態におけるステップＳ１００１と同様であるため説明を省略する。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
　ステップＳ２００３において、試料を、アミド化反応溶液と接触させ、試料に元々含まれていたシアル酸をアミド化するアミド化反応が行われ、分析用試料が取得される。アミド化反応は、上述の実施形態と同様のアミド化反応溶液を用い、同様の条件で行うことができる。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。ステップＳ２００５は、上述の実施形態におけるステップＳ１００７と同様であるため説明を省略する。
　なお、ステップＳ２００３でアミド化反応を行った後、上述の実施形態におけるラクトン化反応およびさらなるアミド化反応を行ってもよい。ラクトン化反応の前に行ったアミド化反応を第１アミド化反応、ラクトン化反応の後に行ったアミド化反応を第２アミド化反応と呼ぶ。第１アミド化反応、ラクトン化反応および第２アミド化反応において、シアル酸と結合させる反応剤の種類を異ならせることが好ましい。この場合、試料に元々含まれていたラクトンと、試料で元々ラクトン化されていなかったα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸と、α２，６－シアル酸とを異なる修飾体により修飾することができる。これにより、試料に元々含まれていたシアル酸ラクトンの解析を行うことができる他、結合様式特異的なシアル酸の解析を行うことができる。
　あるいは、ステップＳ２００３でアミド化反応を行った後、結合様式非特異的にシアル酸をアミド化またはエステル化する反応（以下、非特異的修飾反応と呼ぶ）を行ってもよい。この場合、アミド化反応に供した試料を、非特異的修飾反応のための反応溶液（以下、非特異的修飾反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ステップＳ２００３のアミド化反応の前に試料に含まれていた、ラクトンが形成されていないシアル酸が修飾される。非特異的修飾反応では、シアル酸の結合様式に関係なく、試料に含まれるアミド化されていない各シアル酸が修飾され、分析用試料が得られる。
　非特異的修飾反応溶液は、脱水縮合剤と、アルコール、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を含む第３反応剤とを含む。第３反応剤は、その少なくとも一部が結合様式非特異的にシアル酸と結合することによりシアル酸のエステル化またはアミド化の修飾を行うための反応剤である。第３反応剤は、例えば求核剤として機能する。第３反応剤は、第２反応剤および第３反応剤による修飾で得られた修飾体が、上述のように質量分析またはクロマトグラフィで区別されて検出されるように選択される。非特異的修飾反応における脱水縮合剤は、上述の特許文献１の第二反応で用いられるホスホニウム系脱水縮合剤またはウロニウム系脱水縮合剤を用いることができる。非特異的修飾反応における第３反応剤は、上述の特許文献１の「第二反応」で用いられるアミンまたは、メタノール若しくはエタノール等のアルコールを用いることができる。また、非特異的エステル化反応として１－メチル－３－ｐ－トリルトリアゼン（1-Methyl-3-p-tolyltriazene）や１－エチル－３－ｐ－トリルトリアゼン（1-Ethyl-3-p-tolyltriazene）のようなエステル化剤を用いることもできる。このようなエステル化剤を用いる場合は脱水縮合剤は必要ではない。
　なお、非特異的修飾反応では、ステップＳ２００３のアミド化反応での修飾とは異なる修飾を糖鎖に含まれるシアル酸に行うことができれば、反応の種類または反応溶液の組成等は特に特に限定されない。
（態様）
　上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様に係る分析用試料の調製方法は、糖鎖を含む試料を用意することと、前記試料を、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである。これにより、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
（第２項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項に記載の分析用試料の調製方法において、前記アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである。これにより、より確実にアミド化反応溶液のｐＨを上昇させ、糖鎖に含まれるラクトンをアミド化することができる。
（第３項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項または第２項に記載の分析用試料の調製方法において、前記第１化合物は、アンモニア、アミン、ヒドロキシアミン、ヒドラジンおよびヒドラジン誘導体から選択される少なくとも一つの化合物の炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩である。これにより、分析法をより柔軟または適切に選択できる。
（第４項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第３項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる。これにより、簡便に分析用試料の調製を行うことができる。
（第５項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第４項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない。これにより、より簡便にアミド化反応溶液を調製することができる。
（第６項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応では、前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない。これにより、分析用試料の調製の際の工程を減らすことができ、より簡便に当該調製を行うことができる。
（第７項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第６項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い。これにより、より短時間で効率的に分析用試料を調製することができる。
（第８項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第７項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記第１化合物は、直鎖炭化水素基を含む。これにより、第１化合物により、より確実にシアル酸を修飾することができる。
（第９項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第８項に記載の分析用試料の調製方法において、前記直鎖炭化水素基はアルキル基である。第１化合物により、さらに確実にシアル酸を修飾することができる。
（第１０項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第９項に記載の分析用試料の調製方法において、前記直鎖炭化水素基の炭素数は１から６までのいずれかである。これにより、第１化合物により、より一層確実にシアル酸を修飾することができる。
（第１１項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第１０項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトンは、前記糖鎖のシアル酸に形成されている。これにより、不安定で解析しづらいシアル酸のラクトンを正確に解析することができる。
（第１２項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第１０項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトンは、前記糖鎖のα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つに形成されている。これにより、試料に元々含まれていたシアル酸ラクトンまたはシアル酸の結合様式特異的な解析等を行うことができる。
（第１３項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１１項または第１２項に記載の分析用試料の調製方法において、用意された前記試料を、前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化することをさらに備える。これにより、ラクトンの安定性に基づいて、シアル酸の一部と他の一部とを区別して解析することができる。
（第１４項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１３項に記載の分析用試料の調製方法において、前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と結合させる反応剤をさらに含み、前記反応剤は、前記第１化合物とは質量が異なり、前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記反応剤の少なくとも一部を結合させる。これにより、シアル酸の結合様式に基づいて、シアル酸の一部と他の一部とを区別して解析することができる。
（第１５項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１４項に記載の分析用試料の調製方法において、前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、またはα２，９－シアル酸をラクトン化し、α２，６－シアル酸に前記反応剤の一部を結合させる。これにより、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、およびα２，９－シアル酸とα２，６－シアル酸とを区別して解析することができる。
（第１６項）一態様に係る分析方法は、第１項から第１５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法により試料を調製することと、調製した前記試料を分析することとを備える。これにより、糖鎖に含まれるラクトンをより効率的にアミド化することができる。
（第１７項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１６項に記載の分析用試料の調製方法において、調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。これにより、分析用試料の調製の際に行った修飾に基づいて、糖鎖を分離して解析することができる。
（第１８項）一態様に係る分析用試料の調製用キットは、第１項から第１５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法、または、第１６項または第１７項に記載の分析方法に用いられる。これにより、効率よく分析用試料を調製することができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
　以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り体積／体積％を示す。
（実施例１～５および比較例）
＜評価用糖鎖試料の作成＞
　以下の方法によりα2,3-シアル酸を二つ含む糖鎖A2 glycan (33A2)を作成した。1 nmol/μＬのα2,3-シアリルグリコペプチド（α2,3-SGP; 伏見製薬所）を20 μＬ含むチューブに対して、PNGase F(SIGMA)を2.5 U分加え37℃でo/n(オーバーナイト、以下同様)インキュベーションすることでＮ型糖鎖A2 glycan (33A2)を遊離した。遊離した糖鎖はStage Tip Carbonで脱塩処理した。
　脱塩処理した糖鎖を適当な水に再溶解したものを試料とした。ビーズ上(On-beads)でアミド化反応等を行う場合は、この試料をそのままビーズと反応させた。チューブ内での液相中での(in-solution)反応として実験を行う場合は、エッペンドルフチューブに分注し、さらにSpeedVac(Thermo Fisher Scientific)で溶媒を除いたものを試料とした。
　図３は、以下の実施例で用いた試料における糖鎖の構造と、想定される構造の変化とを模式的に示す図である。糖鎖33A2は、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）およびマンノース（Man）からなる基本型の構造と、2つの側鎖とを備える。2つの側鎖にはそれぞれGlcNAc、ガラクトース（Gal）およびシアル酸（Neu5Ac）が結合されている。非還元末端にあるα2,3-シアル酸と当該シアル酸が結合しているガラクトースとの結合部分には、ラクトンが形成されており、この点を二重線Ｂ１で示した。糖鎖33A2はラクトン化反応溶液を用いた結合様式特異的なシアル酸の修飾によりラクトン化する（矢印Ａ１）。このラクトンが加水分解されると元のシアル酸構造に戻る（矢印Ａ２）。このラクトンはアミノリシスにより直接アミド化することができる（矢印Ａ３）。
＜以下の各実施例での基本的な反応条件＞
　以下の実施例１～５および比較例では、アミノリシスを行ってもアミド化されず、一部ラクトンのまま残る場合がある。しかしながら、ラクトンは不安定であるために、実験結果の定量性に影響を与える可能性がある。従って、以下の実験では、アミノリシス(一次アミノリシスと呼ぶ)としてアミド化反応を行った後、一次アミノリシスで用いたアミンとは別のアミンを含むアミド化反応溶液でもう一度アミノリシス(二次アミノリシス)した。これにより、一次アミノリシスで反応しなかったラクトンを、一次アミノリシスで生成するアミドとは異なるアミドに変換することで定量評価した。以下では、一次アミノリシスにはメチルアミン塩酸塩、二次アミノリシスにはエチルアミンを用いた。このため、マススペクトルにおいて、メチルアミド化された糖鎖に対応するピークは一次アミノリシスでアミド化された糖鎖に対応するピーク、エチルアミド化されたピークは一次アミノリシス後にラクトンのまま残っていた糖鎖に対応するピークと読み替えて定量評価できる。
＜ビーズ上でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件＞
　糖鎖を含む試料をヒドラジドビーズ（住友ベークライト社製、BlotGlycoの標準プロトコルに準ずる）に吸着させ、余剰ヒドラジド基のキャッピングを行った。その後、シアル酸結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を試料に加えて、１時間撹拌することでα2,3-シアル酸をラクトン化した（この際、α2,6-シアル酸が存在していればイソプロピルアミド化される）。続いて、ビーズを200 μＬのメタノール(MeOH)で3回洗浄し、一次アミノリシス溶液100 μＬ（成分は以下の各実施例で異なり得るためその都度記載する）をビーズに加えて軽く攪拌し、遠心して一次アミノリシス溶液を除去した。次にビーズを順次MeOH（200 μＬ x 3）、H2O（200 μＬ x 3）及びMeOH（200 μＬ x 3）で洗い、二次アミノリシス溶液である17.5% エチルアミン水溶液を加え、軽く攪拌した後は遠心して溶液を除去した。さらにビーズをH2O（200 μＬ x 3）で洗い、BlotGlycoの標準プロトコルに準じて糖鎖をビーズから遊離した後、後述する質量分析による測定を行った。
＜液相でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件＞
　乾固された糖鎖を含む試料を含むチューブに、上記のシアル酸結合様式特異的な修飾を行うラクトン化反応溶液20 μＬを加えて、１時間撹拌しながら、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、3Mのメチルアミン塩酸塩水溶液からなる一次アミノリシス溶液を20 μＬ加え、ボルテックスにより均一に混合した。その後、アルカリ化剤としての塩基を5 μＬ加えてボルテックスにより均一に混合した。次いで、2.5% トリフルオロ酢酸（TFA） を含むアセトニトリル（ACN）を加えてpHを中性付近に戻し、GL Science社製のGL-Tip Amideを用いてHILICモードでアミド精製し、余剰試薬を除いた後、溶出された糖鎖をSpeedVacで乾固した。その後、残存しているラクトンをアミド化するために17.5% エチルアミン水溶液を加えて二次アミノリシスを行い、SpeedVacで乾固し、後述する質量分析による測定を行った。
＜質量分析の条件＞
　質量分析による測定は全てオンターゲット(on-target)3AQラベル化により行った。乾固した糖鎖は10 μＬの水によく再溶解した。0.5 μＬをμフォーカスプレート（Hudson Surface Technology）に滴下し、マトリックスとして50% ACNに溶解させた100mM 3AQ/CA(3-アミノキノリン/p-クマル酸)および2mM ADP (リン酸二水素アンモニウム)を0.5 μＬ加え、上記プレートごと75℃のヒートブロック上で1.5時間反応させた(3AQで糖鎖の還元末端がラベル化される)。反応終了後、プレートを室温まで戻し、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos)を用い、負イオンモードで測定した。
＜データ解析における評価法＞
　図４は、一次アミノリシス反応を行った後に、修飾されていない状態(COOH)、アミド化された状態(Amide)、ラクトン化された状態(Lactone)のいずれかの状態のシアル酸を含む33A2に二次アミノリシスを行った後の試料のマススペクトルの一例を示す図である。横軸はm/z（質量電荷比に対応）、縦軸は相対的な検出量を示す。
　評価に用いた試料である33A2はシアル酸を二つ含んでいるため、結合様式特異的修飾（iPA化）によってまずラクトン化するが、その後の一次アミノリシス後にはそれぞれが加水分解したカルボン酸型（COOH）、アミノリシスしたアミド型(Amide)、ラクトンのまま残っていたラクトン型(Lactone)を取りうるので、その組み合わせによりマススペクトルにおいていくつかのピークが検出されうる。ここでは、アミノリシスの後にラクトンのまま残っているシアル酸の量を正確に評価するために、エチルアミンを用いてもう一度アミノリシス(二次アミノリシス)してエチルアミドに変換している。この二次アミノリシスの条件は、ラクトンが完全にエチルアミド化する条件である為、エチルアミド化体をラクトン体と読みかえることが出来る。加水分解が起こらず、ラクトンが一次アミノリシスによって100%メチルアミド化体に変換できると、m/z 2471.9のみにピークが得られる。
　COOH体、Amide体およびLactone体の割合の評価は、一分子にシアル酸が二つ含まれることを考慮し、それぞれのピークの相対強度をマススペクトルから読み取り、COOH体、Amide体およびLactone体のそれぞれのピーク強度を算出し、全体を100%としてノーマライズした。
（実施例１）
＜アルカリ化剤としてのtert-ブチルアミン濃度の検討（ビーズ上）＞
　上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスのためのアミド化反応溶液としてtert-ブチルアミンを0～50％含む3Mのメチルアミン塩酸塩を用いた。ここで、tert-ブチルアミンがアルカリ化剤、3Mメチルアミン塩酸塩がアミド化において修飾体を構成する物質（第２反応剤）である。
　図５は、本実施例のアミド化反応の際のtert-ブチルアミンの濃度（体積／体積％）と、アミド化されたシアル酸の割合とを示すグラフである。tert-ブチルアミンを含まない場合は、アミノリシスが確認されたものの、シアル酸のほとんどがラクトン化体のままであり一部が加水分解していた。少量でもtert-ブチルアミンを添加するとアミノリシスが起きるようになり、tert-ブチルアミンの濃度が10％程度でほぼ100%メチルアミド化が起こるようになった。これにより、アミンの塩酸塩を用いた場合に、別の塩基でアミド化反応溶液のｐＨを上昇させることでアミノリシスを促進できることが判明した。
（実施例２）
＜アルカリ化剤の種類の検討（ビーズ上）＞
　上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、10％または1Mの各種アルカリ化剤(10％ アンモニア水、10％ イソプロピルアミン(iPA)、10％ tert-ブチルアミン(t-BA)、10％ ジメチルアミン(DMA)、10％ トリメチルアミン(TMA)、10％ メチルモルフォリン(NMM)、10％ テトラメチルグアニジン(TMG)、1M 水酸化ナトリウム溶液(NaOH))のいずれかを含む3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
　図６は、本実施例のアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図６から、アルカリ化剤としてどの塩基を用いた場合でもアミノリシスを起こすことができ、アルカリ化剤の種類に関係なくアミノリシスを促進できることがわかる。
（比較例）
＜酸条件でのアミノリシスの検討（ビーズ上）＞
　上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として、塩基ではなく酸(0.1％または2％ トリフルオロ酢酸(TFA))を含む3M メチルアミン塩酸塩(MA-HCl)溶液を用いた。
　図７は、本比較例のアミド化反応の際の溶液の組成と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図７から、塩基の代わりにトリフルオロ酢酸を添加してアミド化反応溶液のｐＨを下げた条件では、酸を加えない場合と結果が一致しており、3M MA-HClと高い濃度のアミン塩酸塩を用いても全くアミノリシスが進行しないことが判明した。
（実施例３）
＜第２反応剤としてのアミン塩酸塩濃度の検討（ビーズ上）＞
　上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミンを含む10mM～3Mのメチルアミン塩酸塩溶液を用いた。
　図８は、本実施例のアミド化反応の際のメチルアミン塩酸塩の濃度と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図８より、アミノリシスと加水分解が競合して起こるが、アミン塩酸塩側の濃度は高い方が好ましいことが判明した。
（実施例４）
＜溶媒の検討（ビーズ上）＞
　上述した、ビーズ上でアミノリシスを行う基本的反応条件に従って実験を行った。一次アミノリシスを行うためのアミド化反応溶液として10％のtert-ブチルアミン(t-BA)と100mMのメチルアミン塩酸塩を含む各種溶液（溶媒：水(H2O)、メタノール(MeOH)、エタノール(EtOH)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、80% アセトニトリル(ACN)水溶液）を用いた。
　図９は、本実施例のアミド化反応の際の溶媒の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図９からアミノリシスを効率的に起こす観点からは水溶媒が好ましいが、一部有機溶媒が混じっていても問題なくアミノリシスが進行することが判明した。
（実施例５）
＜アルカリ化剤の種類の検討（液相）＞
　上述した、液相でアミノリシスを行う場合の基本的な反応条件に従って実験を行った。アミド化反応溶液に含まれるアルカリ化剤としてtert-ブチルアミン(t-BA)、50%　ジメチルアミン水溶液(DMA)、28％トリメチルアミン水溶液(TMA)、テトラメチルグアジニジン(TMG)または1M　水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を用いた。
　図１０は、本実施例のアミド化反応の際のアルカリ化剤の種類と、アミド化されたシアル酸の割合を示すグラフである。図１０から、液相中で(In-solution)アミド化反応を行ったときも、アルカリ化剤を加えない場合はアミノリシスが起きたシアル酸は一定程度の割合に留まったが、アルカリ化剤を加えることでアミノリシスを促進できることが判明した。
　なお、ラクトン化されたシアル酸を有する糖鎖に対して、第２反応剤を含む溶液とアルカリ化剤を含む溶液を加える順序も検討した。その結果、第２反応剤を含む溶液を加えてからアルカリ化剤を含む溶液を加えてもよく、第２反応剤を含む溶液とアルカリ化剤を含む溶液とを混合して当該糖鎖に加えても上記と同等の結果が得られた。
（実施例６）
＜安定同位体標識アミン塩酸塩を用いたアミノリシスの検討＞
　ヒト血清由来α-anti-trypsin (AAT)から、PNGase Fを用いてN型糖鎖を切り出した。切り出したN型糖鎖は、住友ベークライト社製BlotGlycoのプロトコルに従ってヒドラジドビーズに結合させた。その後、BlotGlycoのプロトコルに従って余剰ヒドラジド基のキャッピングまで行った。ビーズ上の糖鎖に対して、シアル酸の結合様式特異的に修飾を行うラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン(iPA)塩酸塩, 500mM EDC-HCl, 500mM HOBt）を100 μＬビーズに加え、一時間800rpmで緩く攪拌しながらα2,6-シアル酸をイソプロピルアミド化、α2,3-シアル酸をラクトン化した。その後、ビーズをMeOH 200μＬで三回洗浄し、次いでアルカリ化剤として10％のtert-ブチルアミンを添加した、エチルアミン塩酸塩（EtNH2-HCl）溶液もしくは安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩（EtNH2-d5-HCl、いずれも濃度3M）溶液 100μＬをビーズに加えて軽く攪拌し、遠心してこのアミド化反応溶液を除去した。さらに、MeOH 200 μＬで三回、水200μＬで三回ビーズを洗浄し、その後はBlotGlycoプロトコルに順じてMALDI-MS用高感度ラベル化を行い、糖鎖を回収し、2,5-ジヒドロキシ安息香酸を用いて正イオンモードにてマススペクトルを取得した。ここで、MALDI-MSは、MALDIによりイオン化を行う質量分析を指す。
　図１１は、本実施例で得られたマススペクトルを示す図である。横軸はm/z、縦軸は検出された際の強度を示す。図１１において、上段は、安定同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩を用いてアミド化反応を行った場合のマススペクトルであり、下段は、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩を用いてアミド化反応を行った場合のマススペクトルである。上段および下段において、左側のマススペクトルの拡大図を右側に示した（矢印Ａ１１）。m/z 2735.8に観測されているピークはA2型糖鎖でα2,6-シアル酸が二つ付加したものであり、これらはシアル酸結合様式特異的修飾の時点でイソプロピルアミドに変換されるため、後のアミノリシスには反応せず、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩EtNH2-d5-HClを用いても同一のm/zに観測された。一方で、安定同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩EtNH2-HClを用いた場合に観測される3419.4のピークはα2,3-シアル酸ひとつとα2,6-シアル酸を二つ含む三本鎖A3型の糖鎖であるが、安定同位体標識されたエチルアミン塩酸塩EtNH2-d5-HClを用いた場合に5Daのシフトが観測された（m/z 3565.5から3570.5）。これらの結果は、通常塩酸塩でしか入手できないような同位体標識された第一級アミンでも、アルカリ化剤を用いてpHを強制的に上げることでアミノリシスを促進することが出来ることを示している。
（実施例７）
　実施例６と同様の方法で、同位体標識されていないエチルアミン塩酸塩および安定同位体標識されているエチルアミン塩酸塩のそれぞれを用いて修飾した糖鎖を等量で混合し、質量分析用試料を調製した。調製された質量分析用試料を、実施例６と同様の方法で質量分析した。
　図１２は、本実施例で得られたマススペクトルの拡大図である。図１２では、AATに含まれる代表的なα2,3-シアル酸含有三本鎖糖鎖であるA3（図の左側）およびA3F（図の右側）に対応するピークを示した。A3およびA3F のピークは安定同位体標識によりそれぞれ5Daシフトして観測されるが、等量で混合した場合イオン強度はほぼ同等であることが判明した。これは、アミノリシス後に安定同位体標識の有無によりイオン化効率が変わらないことを意味しており、安定同位体標識されたアミン塩酸塩を用いた場合でも、pHを強制的に上げてアミノリシスを促進することで、比較質量分析解析への応用が可能であることを示している。
　次の優先権基礎出願（１）および本明細書で参照した文献（２）の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
（１）日本国特願２０１９－１３０１８８号（２０１９年７月１２日出願）
（２）Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091

Claims (18)

  1. 　糖鎖を含む試料を用意することと、
    　前記試料を、前記糖鎖に含まれるラクトンと反応させるアンモニア、アミノ基に結合した炭素原子に１以下の炭素原子が直接結合している第一級アミン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびヒドロキシアミンならびにこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの第１化合物とアルカリ化剤とを含む、ｐＨが７．７以上のアミド化反応溶液と接触させ、前記ラクトンをアミド化するアミド化反応を行うこととを備え、
    　前記アルカリ化剤がアミンである場合、前記アルカリ化剤は、アミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミンである、分析用試料の調製方法。
  2. 　請求項１に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記アルカリ化剤は、第四級アンモニウムカチオン、第三級アミン、第二級アミンおよびアミノ基に結合した炭素原子に２以上の炭素原子が直接結合している分岐型第一級アミン、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物およびテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、グアニジンおよびグアニジン誘導体、ならびにこれらの塩、ならびにアルカリ緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含み、
    　前記アルカリ緩衝液は、Tris緩衝液、Good緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸塩緩衝液からなる群から選択される少なくとも一つである、分析用試料の調製方法。
  3. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記第１化合物は、アンモニア、アミン、ヒドロキシアミン、ヒドラジンおよびヒドラジン誘導体から選択される少なくとも一つの化合物の炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはメタンスルホン酸塩である、分析用試料の調製方法。
  4. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる分析用試料の調製方法。
  5. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない、分析用試料の調製方法。
  6. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記アミド化反応では、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない、分析用試料の調製方法。
  7. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い、分析用試料の調製方法。
  8. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記第１化合物は、直鎖炭化水素基を含む、分析用試料の調製方法。
  9. 　請求項８に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記直鎖炭化水素基はアルキル基である、分析用試料の調製方法。
  10. 　請求項９に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記直鎖炭化水素基の炭素数は１から６までのいずれかである、分析用試料の調製方法。
  11. 　請求項１または２に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記ラクトンは、前記糖鎖のシアル酸に形成されている、分析用試料の調製方法。
  12. 　請求項１１に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記ラクトンは、前記糖鎖のα２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸の少なくとも一つに形成されている、分析用試料の調製方法。
  13. 　請求項１１に記載の分析用試料の調製方法において、
    　用意された前記試料を、前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化することをさらに備える、分析用試料の調製方法。
  14. 　請求項１３に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と結合させる反応剤をさらに含み、
    　前記反応剤は、前記第１化合物とは質量が異なり、
    　前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記反応剤の少なくとも一部を結合させる、分析用試料の調製方法。
  15. 　請求項１４に記載の分析用試料の調製方法において、
    　前記試料を前記ラクトン化反応溶液と接触させ、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、またはα２，９－シアル酸をラクトン化し、α２，６－シアル酸に前記反応剤の一部を結合させる、分析用試料の調製方法。
  16. 　請求項１から１５までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、
    　調製した前記分析用試料を分析することとを備える分析方法。
  17. 　請求項１６に記載の分析方法において、
    　調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。
  18. 　請求項１から１５までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法、または、請求項１６または１７に記載の分析方法に用いられる分析用試料の調製用キット。
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