JP7010061B2 - 試料の調製方法および分析方法 - Google Patents
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Description
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応の後、前記試料から前記ラクトン化反応に用いたラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことをさらに備える。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない。
さらに好ましい実施形態では、前記試料に 前記アミド化反応溶液を加えた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は30分より短い。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンは第一級アミンである。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンはアルキル基を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アルキル基は分枝を有しない。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンはアリル基およびヒドロキシ基の少なくとも一つを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液のpHは、8.0以上である。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応を行う際に、前記試料に、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化する。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられた前記アンモニアおよび前記アミンとは質量が異なり、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応において、α2,3-シアル酸、α2,8-シアル酸、およびα2,9-シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つの前記シアル酸がラクトン化される。
さらに好ましい実施形態では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α2,3-シアル酸をラクトン化し、α2,6-シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記試料と前記アミド化反応溶液との接触は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含む。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の試料の調製方法により試料を調製することと、調製した前記試料を分析することとを備える。
さらに好ましい実施形態では、調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。
なお、上記ペプチド鎖の切断処理は、本実施形態の試料の調製方法により糖鎖に含まれるラクトンをアミド化した後に行ってもよい。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。
ステップS1001が終了したら、ステップS1003に進む。
ステップS1003において、試料をラクトン化のための反応溶液(以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う(以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1003のラクトン化反応を指す)。ラクトン化反応では、α2,3-シアル酸、α2,8-シアル酸およびα2,9-シアル酸が好適にラクトン化される。ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤を含む。
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤(いわゆるBOP試薬)やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、N,N’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、N‐(3‐ジメチルアミノプロピル)‐N’‐エチルカルボジイミド(EDC)、N,N’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1‐tert‐ブチル‐3‐エチルカルボジイミド(BEC)、N,N’‐ジ‐tert‐ブチルカルボジイミド、1,3‐ジ‐p‐トルイルカルボジイミド、ビス(2,6‐ジイソプロピルフェニル)カルボジイミド、ビス(トリメチルシリル)カルボジイミド、1,3‐ビス(2,2‐ジメチル‐1,3‐ジオキソラン‐4‐イルメチル)カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1‐ヒドロキシ‐7‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、4‐(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、2‐シアノ‐2‐(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル(CHA)、N‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、6‐クロロ‐1‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、N‐ヒドロキシ‐3,4‐ジヒドロ‐4‐オキソ‐1,2,3‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
求核剤として用いられるアミンは、炭素原子を2個以上含む第一級および/または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、sec‐ブチルアミン、tert‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α2,3-シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α2,6-シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
なお、求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。
ラクトン化反応は、液相でも固相でも実施できる。液相で反応を行う場合、ジメチルスルホキシド(DMSO)やジメチルホルムアミド(DMF)等の非水系溶媒中で反応を行うことが好ましい。非水溶媒中で反応を行うことにより、副反応が抑制される傾向があり、糖ペプチドや糖タンパク質を試料とする場合に好適である。液相反応における各成分の濃度は特に限定されず、脱水縮合剤やアミンの種類等に応じて適宜に決定できる。ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、1mM~5Mが好ましく、10mM~3Mがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、0.01~20Mが好ましく、0.1M~10Mがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、-20℃~100℃程度が好ましく、-10℃~50℃がより好ましい。
なお、ラクトン化反応後の試料からラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことが好ましい。ラクトン化反応溶液を除去するための操作は、固相担体に結合させた糖鎖から遠心等により反応溶液を分離し、洗浄溶液を用いて洗浄したり、遠心濃縮により試料を乾固させたり等、ラクトン化反応に必要な成分の濃度が十分低くなれば適宜特に限定されない。
ステップS1005において、試料を、ラクトンをアミド化するための反応溶液(以下、アミド化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、ラクトン化されているシアル酸のラクトンをアミド化するアミド化反応(以下、アミド化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1005のアミド化反応を指す)が行われる。発明者らは、従来行われていた、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は後述のように無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノリシスと考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップS1003で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応では、簡便な操作でラクトンを安定化させ得る。
アミド化反応溶液に含まれるアミンは、第一級アミンが好ましく、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンは、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が10以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が7以下の第一級アミンがより好ましく、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝(以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す)を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的にラクトンがアミド化されるため好ましい。
なお、アミド化反応溶液は、上述のアミンの塩を含んでもよい。
アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度は、0.1M(Mはmol/l)以上が好ましく、0.3M以上がより好ましく、0.5M以上がさらに好ましく、1.0M以上がさらに好ましく、3.0M以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニアまたはメチルアミン等の第一級アミンの濃度は、0.1M以上が好ましく、0.3M以上がより好ましく、0.5M以上がさらに好ましく、1.0M以上がさらに好ましく、3.0M以上が最も好ましい。アミド化反応溶液の濃度が高いほど、より確実にラクトンのアミド化を行うことができる。
アミド化反応溶液の溶媒は、水系溶媒でも有機溶媒でもよいが、ラクトンの加水分解を防いで迅速なアミド化を確実に起こす観点から水含有量が少ない方が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、水含有量を抑える脱水操作が加えられた脱水溶媒が好ましく、無水溶媒がさらに好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、メタノールおよびアセトニトリルの少なくとも一つを含むことが好ましい。
なお、アミド化反応溶液は水を相当量含んでいてもよく、アミド化反応溶液の溶媒は水でもよい。
アミド化反応溶液のpHは、7.7以上が好ましく、8.0以上がより好ましく、8.8以上がさらに好ましく、10.3以上が最も好ましい。アミド化反応溶液のpHが高くなると、より確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
アミド化反応は、数秒~数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間(以下、反応時間と呼ぶ)は、1時間未満が好ましく、30分未満がより好ましく、15分未満がさらに好ましく、5分未満がさらに好ましく、1分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。また、試料とラクトン化反応溶液との接触が終了した後、試料とアミド化反応溶液との接触が終了するまでの時間は、1時間半未満が好ましく、1時間未満がより好ましく、30分未満がさらに好ましい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを防ぐことができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
アミド化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とアミド化反応溶液を接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されないが、試料に含まれる糖鎖を固相担体に結合または吸着された状態でアミド化反応溶液を接触させることが好ましい。
なお、ラクトン化した試料をHILICにより精製して溶出させた後にアミド化反応に供してもよい。加水分解が起こりにくいようにHILIC用の担体を洗浄する溶媒を適宜調整することが好ましい。
ステップS1005が終了したら、ステップS1007に進む。
ステップS1007が終了したら、処理を終了する。
糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖や、主鎖の末端にあるアミノ基やカルボキシ基との間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
試料としてα2,3-シアル酸が結合されたシアリルグライコペプチド(α2,3-SGP;伏見製薬所)からPNGase Fにより糖鎖を切り出して遊離させたものを用いた。シアリルグライコペプチドは、数残基のペプチドに糖鎖が結合されたものである。試料はヒドラジド基をリガンドとして有するビーズからなる固相担体(BlotGlyco; 住友ベークライト)に結合させた。糖鎖の固相担体への結合は、糖鎖精製キットBlotGlycoの標準プロトコールに準じて行った。
図4は、アミン濃度についての上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液としてそれぞれ3Mのアンモニア水またはアルキルアミン水溶液(メチルアミンの場合、10%濃度に相当)を用いてアミド化反応を行った際の生成比を示すグラフである。
図5は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として90% ACNに溶解した1.2Mメチルアミン、メタノールに溶解した3Mメチルアミン、または、ACNに溶解した3M エタノールアミン等を用いた場合の生成比を示すグラフである。
図6は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として3M メチルアミン水溶液と 3M メチルアミン塩酸塩水溶液を任意の割合で混合した溶液を用いた場合の生成比を示すグラフである。図6の”MA”はメチルアミン水溶液、”MA-HCl”はメチルアミン塩酸塩水溶液をそれぞれ示す。
糖タンパク質のフェツインを、20mM 重炭酸アンモニウム、10mM DTT, 0.02% SDSに溶解し、100℃で3分間処理して、変性・還元させた。その後、室温に冷却し、PNGase Fを加えて、37℃で終夜インキュベーションし、糖鎖を遊離させた。翌日、100℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。
試料としてスフィンゴ糖脂質であるHuman Disialoganglioside(ジシアロガングリオシド)GD1a および GD1b(HyTest)を使用した。0.2% Tritonx100 を含む 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)45μLに上記糖脂質を溶解し、60℃で20分間温置した後、Endoglycoceramidase I (以下の文献を参考に放線菌から精製したもの;Ishibashi Y, Nakasone T, Kiyohara M, Horibata Y, Sakaguchi K, Hijikata A, Ichinose S, Omori A, Yasui Y, Imamura A, Ishida H, Kiso M, Okino N, and Ito M. “A novel endoglycoceramidase hydrolyzes oligogalactosylceramides to produce galactooligosaccharides and ceramides,” Journal of Biological Chemistry, 2007年, Volume 282, pp.11386-11396)を 5μL加え、37℃で16時間糖鎖脱離反応を行った。
α2,3-SGPを20mM 重炭酸アンモニウムに溶解し、PNGase Fを加えて37℃で終夜インキュベーションすることで糖鎖を遊離させた。翌日、100℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。その後、StageTip Carbonにて脱塩処理を行い、SpeedVacによりエッペンドルフチューブ内に乾固させた。
上記検討と同様の操作によりα2,3-SGPから糖鎖を切りだして遊離させ、当該糖鎖にイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液を加え反応させ、ACNを加えて希釈しHILIC担体上に吸着させた。その後、90% ACN 0.1% TFA溶液100μLを2回通液させることで洗浄し、最後にH2O 20μLを2回通液して糖鎖を溶出させた。ここに、40%メチルアミン水溶液6.7μLを加え終濃度10%となるメチルアミンのアミド化反応溶液とし、軽く攪拌したあと室温で2分間静置してアミド化反応を行った。その後、SpeedVacにより溶媒を除き、さらにStage Tip Carbonで脱塩操作を行い、上記検討のようにオンターゲット3AQ化を用いて質量分析を行った。
Claims (17)
- 糖鎖を含む試料の調製方法であって、
前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことと、
前記試料に、ラクトン化されている前記シアル酸と反応させるアンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくも一つを含む、アミド化反応溶液を加え、前記ラクトン化されている前記シアル酸のラクトンをアミノリシスによりアミド化するアミド化反応を行うことと、
を備え、
前記アミンが第一級アミンであり、
前記アミド化反応溶液のpHが7.7以上であり、
前記ラクトン化反応において、シアル酸のうち、2,3-シアル酸、2,8-シアル酸、および2,9-シアル酸からなる群から選択される少なくとも1つがラクトン化される、試料の調製方法。 - 請求項1に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応の後、前記試料から前記ラクトン化反応に用いたラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことをさらに備える試料の調製方法。 - 請求項1または2に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる試料の調製方法。 - 請求項1から3までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない、試料の調製方法。 - 請求項1から4までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記試料に前記アミド化反応溶液を加えた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない、試料の調製方法。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は30分より短い試料の調製方法。 - 請求項1から6までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミンはアルキル基を含む、試料の調製方法。 - 請求項7に記載の試料の調製方法において、
前記アルキル基は分枝を有しない、試料の調製方法。 - 請求項1から8までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミンはアリル基およびヒドロキシ基の少なくとも一つを含む、試料の調製方法。 - 請求項1から9までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液のpHは、8.0以上である、試料の調製方法。 - 請求項1から10までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応を行う際に、前記試料に、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化する、試料の調製方法。 - 請求項11に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、
前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられた前記アンモニアおよび前記アミンとは質量が異なり、
前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる、試料の調製方法。 - 請求項12に記載の試料の調製方法において、
前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α2,3-シアル酸をラクトン化し、α2,6-シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる、試料の調製方法。 - 請求項1から13までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記試料と前記アミド化反応溶液との接触は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる、試料の調製方法。 - 請求項1から14までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含む、試料の調製方法。 - 請求項1から15までのいずれか一項の試料の調製方法により試料を調製することと、
調製した前記試料を分析することと
を備える分析方法。 - 請求項16に記載の分析方法において、
調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。
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