WO2023243136A1

WO2023243136A1 - 分析用試料の調製方法および分析方法

Info

Publication number: WO2023243136A1
Application number: PCT/JP2023/003906
Authority: WO
Inventors: 隆司西風; 潤一古川; 久寿花松
Original assignee: 株式会社島津製作所
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2023-02-07
Publication date: 2023-12-21

Abstract

シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する方法であって、前記Ｏ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含むサンプルに、前記Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する修飾ステップと、前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を、前記糖タンパク質から遊離させる遊離ステップと、遊離された前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する分析ステップと、を含む方法が提供される。

Description

分析用試料の調製方法および分析方法

　本発明は、分析用試料の調製方法および分析方法に関する。

　シアル酸は生体内において糖タンパク質にも含まれ、その場合、主に糖鎖の末端に存在する。シアル酸は糖タンパク質分子の外側に配置されやすいため、他の分子からの認識に関与しやすい。シアル酸は、隣接する糖との間の結合様式が異なる場合がある。例えば、ヒトのＮ－結合型糖鎖では主にα２，３－およびα２，６－、Ｏ－結合型糖鎖及びスフィンゴ糖脂質ではこれらに加えてα２，８－およびα２，９－の結合様式が知られている。結合様式の違いによってシアル酸は異なる分子から認識され、異なる役割を有し得るため、シアル酸の結合様式の解析は重要である。

　しかしながら、シアル酸は負電荷を有すること及びシアル酸は分解しやすいことから、シアル酸を含有するシアリル糖鎖を解析することは容易ではない。また、シアル酸の結合様式の違いによって糖鎖の質量は変わらないため、質量分析により結合様式を区別して解析することはできない。

　シアル酸の結合様式を区別して解析するため、シアル酸に結合様式特異的な修飾を行う方法が提案されている。この方法では、α２，３－シアル酸がα２，６－シアル酸よりも脱水縮合剤により分子内脱水を起こしやすい性質を利用し、α２，３－シアル酸を分子内脱水によりラクトン化すると同時に、α２，６－シアル酸をアルコールまたはアミン等の求核剤と反応させる。これによりシアル酸の結合様式に依存して異なる質量の分子が生成されるから、質量分析によりシアル酸の結合様式を区別して解析することができる。非特許文献１では、遊離したＮ－結合型糖鎖にイソプロピルアミンと脱水縮合剤とを含む溶液を加えて、α２，３－シアル酸をラクトン化し、α２，６－シアル酸をアミド化する、質量分析に用いられる試料の調製方法が開示されている。

Nishikaze　T.,　Tsumoto　H.,　Sekiya　S.,　Iwamoto　S.,　Miura　Y.,　Tanaka　K.,　Analytical　Chemistry,　2017,　89,　2353-2360.

　本発明者らは、シアル酸の結合様式を解析する際、α２，６－シアル酸とα２，３－シアル酸との判別精度が低下する場合があることを見出した。これは、糖タンパク質から遊離したＯ－結合型糖鎖に対して、シアル酸に結合様式特異的な修飾（アミド化）を行うと、Ｏ－結合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に結合したα２，６－シアル酸が正しく修飾されず、一部α２，３－シアル酸と同様の反応が進行するためと考えられる。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｏ－結合型糖鎖に付加したα２，６－シアル酸とα２，３－シアル酸とを区別して修飾を行うことができ、結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を糖タンパク質から遊離させて精度よく分析することを目的とする。

　本発明は、
　シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する方法であって、
　前記Ｏ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含むサンプルに、前記Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する修飾ステップと、
　前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を、前記糖タンパク質から遊離させる遊離ステップと、
　遊離された前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する分析ステップと、を含む方法、に関する。

　本発明によれば、Ｏ－結合型糖鎖に付加したα２，６－シアル酸とα２，３－シアル酸とを区別して修飾を行うことができ、結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を糖タンパク質から遊離させて精度よく分析することが可能となる。

本発明の一実施形態に係る分析方法を示すフローチャートである。実験１において、血清および脳脊髄液由来の糖タンパク質に含まれる糖鎖の質量分析スペクトルである。Ｉ．Ｓ．は内部標準を示す。上段は、実験２において、血清由来の糖タンパク質に含まれる糖鎖の質量分析スペクトルである。下段は、実験３において、血清由来の糖タンパク質に含まれる糖鎖の質量分析スペクトルである。上段は、実験４において、Ｏ－結合型糖鎖を有する糖タンパク質を用いてＭＴＴ法により糖鎖修飾を行ったときの糖鎖の質量分析スペクトルである。下段は、実験４において、Ｏ－結合型糖鎖を有する糖タンパク質から糖鎖を遊離後にシアル酸の結合様式特異的修飾を行ったときの糖鎖の質量分析スペクトルである。実験５において、Ｏ－結合型糖鎖を有する糖タンパク質に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行った後、β脱離反応により遊離させた糖鎖の質量分析スペクトルである。実験５において、メチルアミン濃度を変化させたときに、メチルアミド化されなかったシアリルＴの割合を示すグラフである。上段は実験６において、β脱離反応におけるｐＨを変化させたときのＯ－結合型糖鎖の回収量（縦軸：内部標準に対する相対値）を示すグラフである。下段は、実験６において、β脱離反応におけるｐＨを変化させたときの回収された糖鎖の種類とその存在割合を示すグラフである。実験６において、β脱離反応におけるｐＨを変化させたときのメチルアミド化されたシアリルＴの分解物の割合を示すグラフである。大きいグラフと小さいグラフとは、縦軸のスケールが異なっているだけであり、同じ実験データを示している。小さいグラフにおいて、Ｅｎｔｒｙ３～Ｅｎｔｒｙ５は縦軸の上限値を示しているが、実際の割合は大きいグラフにおいて示されている。実験６において、β脱離反応におけるｐＨを変化させたときのピーリング反応の割合を示すグラフである。大きいグラフと小さいグラフとは、縦軸のスケールが異なっているだけであり、同じ実験データを示している。小さいグラフにおいて、Ｅｎｔｒｙ３～Ｅｎｔｒｙ５は縦軸の上限値を示しているが、実際の割合は大きいグラフにおいて示されている。

　本発明の一実施形態に係るシアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する方法は、
　前記Ｏ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含むサンプルに、前記Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する修飾ステップと、
　前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を、前記糖タンパク質から遊離させる遊離ステップと、
　遊離された前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する分析ステップと、
を含む。

　シアル酸の結合様式特異的な修飾を行うために糖鎖に対して脱水縮合剤を添加したとき、遊離したＯ－結合型糖鎖はα２，３－シアル酸だけでなく、アミド化されるべきα２，６－シアル酸もラクトン化されてしまい、α２，３－シアル酸とα２，６－シアル酸との区別が困難となる場合があった。本発明者らは、タンパク質から遊離していない糖鎖に対してラクトン化反応を行うことにより、α２，６－シアル酸の予期せぬラクトン化を抑制し、α２，６－シアル酸に対してα２，３－シアル酸とは異なる修飾をすることができることを見出した。Ｏ－結合型糖鎖に対して結合様式特異的なシアル酸の修飾ができると、シアル酸の結合様式の判別精度を向上させることができる。糖鎖がＮ－結合型糖鎖である場合であっても、タンパク質から遊離していない糖鎖に対してラクトン化反応を行うことにより、α２，３－シアル酸と、α２，６－シアル酸とで異なるシアル酸の修飾を行うことができる。本発明によれば、糖タンパク質がＯ－結合型糖鎖を含んでいても、シアル酸を結合様式特異的に修飾することができ、シアル酸の結合様式を精度良く判別することができる。ここで、「シアル酸の結合様式特異的な修飾」及び「結合様式特異的なシアル酸の修飾」とは、シアル酸に対して作用する修飾反応であって、当該シアル酸がα２，３－シアル酸である場合とα２，６－シアル酸である場合とで、当該修飾反応によって生成される化学構造が異なっている反応を意味する。

　シアル酸は他の分子から認識されやすい糖鎖末端に位置するため、シアル酸の結合様式を判別することで、ウイルス感染、又は細胞表面でのタンパク質間の相互作用を解明することができる。また、がん化に伴い、糖タンパク質におけるシアル酸の結合様式が変化することも知られており、がんのバイオマーカーとしてのシアル酸の利用も期待される。バイオ医薬品の効果は糖鎖修飾によって異なるため、シアル酸の結合様式を精度良く判別することで、バイオ医薬品の品質管理を補助することもできる。

　本発明の一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートを図１に示す。ステップＳ１１０において、サンプルを準備する。

　（サンプル）
　分析対象となるサンプルは特に限定されず、生体または細胞由来であってよい。サンプルは糖タンパク質を含み、遊離糖鎖または糖脂質をさらに含んでいてもよい。本発明に係る分析方法は、糖鎖中のシアル酸の結合様式の解析に好適に用いられる。そのため、サンプルは、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましく、当該糖鎖が結合する糖タンパク質を含むことがより好ましい。本発明に係る分析方法は、Ｏ－結合型糖鎖においてα２，６－シアル酸がラクトン化される場合があるという問題を解決することができる。そのため、サンプル中の糖鎖は、Ｏ－結合型糖鎖を含むことが好ましく、α２，６－シアル酸を備えるＯ－結合型糖鎖を含むことがより好ましい。すなわち、サンプルはこれらの糖鎖が結合する糖タンパク質を含むことが好ましい。本発明に係る分析方法は、サンプルがＯ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含んでいる場合に好適に用いられるが、サンプルはＮ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含んでいてもよい。結合様式特異的なシアル酸の修飾の精度を向上させる観点から、サンプルは遊離したＯ－結合型糖鎖を含まないことが好ましい。

　本明細書において、タンパク質は２以上のアミノ酸がペプチド結合した分子の総称を指す。本明細書において、タンパク質はアミノ酸残基数が少ない、例えばアミノ酸残基数が５０未満であるペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。）およびアミノ酸残基数が多い、例えばアミノ酸残基数が５０以上であるタンパク質を含んでよい。本明細書において、糖タンパク質は糖ペプチドを含んでよい。

　糖タンパク質のペプチド鎖のアミノ酸の残基数が多いものは、酵素等によりペプチド鎖を切断してもよい。例えば、質量分析用の試料を調製する場合、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は３０以下が好ましく、２０以下がより好ましく、１５以下がさらに好ましい。糖鎖が結合しているペプチドの由来を明確とすることが求められる場合には、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は２以上が好ましく、３以上がより好ましい。

　糖タンパク質のペプチド鎖を切断する場合の消化酵素としては、トリプシン、Ｌｙｓ‐Ｃ、アルギニンエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ等が用いられる。これらの消化酵素の２種以上を組み合わせて用いてもよい。ペプチド鎖の切断の際の条件は特に限定されず、使用する消化酵素に応じた適宜のプロトコールが採用される。ペプチド鎖の切断の前に、サンプル中のタンパク質に変性処理又はアルキル化処理が行われてもよい。変性処理又はアルキル化処理の条件は特に限定されない。ペプチド鎖の切断処理は、後述する第１反応の前後または第２反応後に行ってもよい。酵素的切断ではなく、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。

　サンプル中の糖タンパク質中のアミノ基をブロックするための処理を適宜行ってもよい。このような処理としては、糖タンパク質のジメチルアミド化及びグアニジル化等が挙げられる。これにより、第１反応または第２反応を行った際にタンパク質の主鎖の末端にあるアミノ基又はカルボキシ基との間での生じ得る分子内脱水縮合等の副反応を抑制することができる。

　＜修飾ステップ＞
　修飾ステップでは、Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する。シアル酸の結合様式特異的修飾は、好ましくはシアル酸をラクトン化する第１反応を含む。シアル酸の結合様式特異的修飾は、好ましくは第１反応により得られたラクトン構造をアミド化する第２反応をさらに含む。本実施形態の一側面において、上記修飾剤は、ラクトン化反応溶液及びアミド化反応溶液を含むことが好ましい。ラクトン化反応溶液及びアミド化反応溶液については、後述する。

　（第１反応）
　ステップＳ１２０において、糖鎖が結合している糖タンパク質に対してシアル酸をラクトン化するための第１反応を行う。第１反応においては、糖タンパク質にシアル酸が結合している場合、結合様式に応じて選択的にシアル酸がラクトン化される。第１反応においては、好ましくは糖鎖中のα２，３－シアル酸に加えてα２，８－シアル酸およびα２，９－シアル酸がラクトン化される。

　第１反応は、サンプルにシアル酸の結合様式特異的ラクトン化を行うための溶液（以下、ラクトン化反応溶液とも呼ぶ。）を接触させて行うことができる。接触方法の一例は、ラクトン化溶液をサンプルに添加すればよい。ラクトン化反応溶液は、好ましくは脱水縮合剤を含む。第１反応と同時に、α２，６－シアル酸はラクトン化とは異なる修飾、好ましくはアミド化が行われることが好ましい。この場合、ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤に加え、さらにアルコール、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含む求核剤を含むことが好ましい。

　シアル酸の結合様式に基づいて選択的に脱水反応または求核反応を起こすように、脱水縮合剤および求核剤の種類及び濃度が調整されればよい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水で生じるラクトンは六員環であり、α２，６－シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水により生じ得るラクトンは七員環となる。七員環より安定な六員環を生じるα２，３－シアル酸はα２，６－シアル酸よりラクトン化されやすい。また、α２，３－シアル酸のカルボキシ基はα２，６－シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、大きな分子は、α２，６－シアル酸と比べてα２，３－シアル酸とは反応しづらい。シアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾がされるように脱水縮合剤および求核剤の種類及び濃度が調整される。

　脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるＢＯＰ試薬）又はウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’－ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド（ＢＥＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド、１，３－ジ－ｐ－トルイルカルボジイミド、ビス（２，６－ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３－ビス（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）およびこれらの塩（塩酸塩等）が挙げられる。

　脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザ－ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＨＯＳｕ）、６－クロロ－１－ヒドロキシ－ベンゾトリアゾール（Ｃｌ－ＨｏＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）等が好ましく用いられる。

　求核剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級および／または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３－シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。

　求核剤として用いられるアルコールは、特に限定されず、例えばメタノールおよびエタノール等を用いることができる。ラクトン化反応溶液の求核剤にアルコールを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６－シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がエステル化される。求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。

　ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば１ｍＭ以上５Ｍ以下であり、好ましくは１０ｍＭ以上３Ｍ以下である。カルボジイミドとＯｘｙｍａ、ＨＯＡｔまたはＨＯＢｔ等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤の濃度は、例えば０．０１Ｍ以上２０Ｍ以下であり、好ましくは０．１Ｍ以上１０Ｍ以下である。第１反応の反応温度は、－２０℃以上１００℃以下程度であってよく、好ましくは－１０℃以上５０℃以下である。

　第１反応は、液相でも固相でも実施できる。液相で反応を行う場合、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の非水系溶媒中で反応を行うことが好ましい。非水溶媒中で反応を行うことにより、副反応が抑制される傾向がある。液相反応における各成分の濃度は特に限定されず、脱水縮合剤及びアミンの種類等に応じて適宜に決定できる。

　固相で第１反応を行う場合、固相担体は糖タンパク質を固定可能であれば特に限定されない。糖タンパク質を固定するためには、例えばエポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。ヒドラジド基、アミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いて、糖鎖を含む糖タンパク質を固定してもよい。サンプルを固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応後の反応溶液の除去が容易となり、効率よくシアル酸の修飾を行うことができる。固相担体として磁気ビーズを用いた場合は、糖タンパク質が結合した磁気ビーズを磁石で集め、過剰な試薬を除去したり、ビーズを溶媒で洗浄することができる。固相担体として樹脂を用いた場合は、フィルタを通すことで過剰試薬を除去した後、樹脂を回収してもよく、遠心操作により樹脂を沈殿させて上清の過剰試薬を除去してもよい。液相で第１反応を行った場合は、限外濾過により過剰試薬を除去してもよい。

　第１反応後のサンプルは、必要に応じて、公知の方法により精製、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理を行い、ラクトン化反応溶液を除去またはラクトン化反応溶液の濃度を低下させてもよい。

　（第２反応）
　ステップＳ１３０において、上記第１反応によって生じたラクトン構造をアミド化するための第２反応を行うことが好ましい。第２反応は、第１反応後のサンプルをアミド化のための溶液（以下、アミド化反応溶液とも呼ぶ）と接触させることにより行えばよい。上記第１反応によってシアル酸のα２，３－結合とα２，６－結合とを区別して修飾することができるが、α２，３－シアル酸から生じるラクトン構造は不安定な場合があり、加水分解により元のカルボン酸構造に戻る場合があった。第２反応によって、ラクトン構造を特異的にアミド化することで、ラクトン構造を安定化することができる。同時に、第２反応によって結合様式特異的にシアル酸は質量が異なる修飾を受けることで、α２，３－シアル酸とα２，６－シアル酸とを区別することができる。第２反応を行うことにより、より特異性が高く、かつ迅速にシアル酸を結合様式特異的に修飾することができる。第２反応の一例は、アミノリシスであってよい。アミノリシスは、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づく反応であり、無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応である。本明細書では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。第２反応の他の一例として、強力な脱水縮合剤を用いてラクトン構造をアミド化してもよい。第２反応に使用される脱水縮合剤としては、ホスホニウム系縮合剤、ウロニウム系縮合剤が挙げられ、具体的にはベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（１－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）等が挙げられる。これらの強力な脱水縮合剤によるアミド化の前に、ラクトンの開裂操作を挟んでもよい。

　アミド化反応溶液は、アンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。アミンを用いる場合、ラクトン化反応溶液に用いたアミンと異なるアミンを用いるか、安定同位体による修飾等で質量を変化させることが好ましい。第１反応と第２反応とで質量が異なるアミンを用いることで、結合様式によって質量が異なるようにシアル酸をアミド化することができる。本実施形態の一側面において、上記第２反応は、アミノリシス反応であることが好ましい。アミノリシスには脱水縮合剤は必要でなく、アミド化反応溶液は脱水縮合剤を含まなくてよい。アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよく、例えば第１反応でサンプルに添加したラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。第２反応では、このような簡便な操作でラクトン構造を安定化させ得る。

　アミド化反応溶液に含まれるアミンは、第一級アミンが好ましく、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンは、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が１０以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が７以下の第一級アミンがより好ましく、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミンまたはペンチルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。より効率的にラクトン構造をアミド化する観点からは、アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝（以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す）を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ないことが好ましい。

　アミド化反応溶液に含まれるアミンが不飽和鎖式炭化水素基を有する第一級アミンの場合、不飽和鎖式炭化水素基は二重結合を含むことが好ましく、不飽和鎖式炭化水素基はアリル基を含むことがより好ましく、アミンはアリルアミンであることが好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンは、ヒドロキシ基を含む第一級アミンでもよく、エタノールアミンであってよい。アミド化反応溶液に含まれるアミンはアルキル基以外の様々な官能基を含んでもよい。アミド化反応溶液は、上述のアミンの塩を含んでもよい。アミド化反応の結果、糖鎖がこのような官能基を含むように修飾されることにより、当該修飾を受けた糖鎖は質量分析だけではなく、クロマトグラフィ等によってもより分離しやすくなる。

　アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニアまたはメチルアミン等の第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度が高いほど、より効率よくラクトン構造をアミド化できる。アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度の上限値は、特に制限されないが例えば、１６Ｍ以下であってもよい。

　アミド化反応溶液の溶媒は、水系溶媒でも有機溶媒でもよいが、ラクトンの加水分解を防いで迅速なアミド化を確実に起こす観点から水含有量が少ない方が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、水含有量を抑える脱水操作が加えられた脱水溶媒が好ましく、無水溶媒がさらに好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、メタノールおよびアセトニトリルの少なくとも１つを含むことが好ましい。アミド化反応溶液は水を含んでいてもよく、アミド化反応溶液の溶媒は水であってもよい。

　アミド化反応がアミノリシスである場合、その溶液は、好ましくはｐＨ７．７以上であり、より好ましくはｐＨ８．０以上であり、さらに好ましくはｐＨ８．８以上であり、最も好ましくはｐＨ１０．３以上である。アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、より効率良くラクトン構造をアミド化できる。アミド化反応溶液のｐＨの上限値は、特に制限されないが例えば、１４以下であってもよい。強力な脱水縮合剤を用いてラクトン構造をアミド化する場合、そのｐＨは特に限定されず、用いる脱水縮合剤に応じてｐＨを調整して良い。

　第２反応がアミノリシスである場合、その反応は、数秒～数分以内に完了できる。ラクトン構造をアミド化するためにサンプルをアミド化反応溶液と接触させる時間は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、サンプルをアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されているサンプルに対して一時的にアミド化反応溶液を通液するだけでもよい。ラクトン構造をアミド化するためにサンプルをアミド化反応溶液と接触させる時間の下限値は、特に制限されないが例えば、１秒以上であってもよい。強力な脱水縮合剤を用いてラクトン構造をアミド化する場合、その反応時間は特に限定されず、用いる脱水縮合剤に応じて反応時間を調整して良い。例えば、３０分以上が好ましく、１時間以上がさらに好ましく、２時間以上が最も好ましい。サンプルとラクトン化反応溶液との接触が終了した後から、サンプルとアミド化反応溶液との接触が終了するまでの時間は、１時間半未満が好ましく、１時間未満がより好ましく、３０分未満がさらに好ましい。第２反応は短時間に完了するため、不安定なラクトン構造が分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを防ぐことができる。また、第２反応の反応時間を短く設定することで、より効率的にサンプルの解析を行うことができる。サンプルとラクトン化反応溶液との接触が終了した後から、サンプルとアミド化反応溶液との接触が終了するまでの時間の下限値は、特に制限されないが例えば、１秒以上であってもよい。

　第２反応は、液相でも固相でも行うことができる。サンプルとアミド化反応溶液を接触させることができれば、アミド化反応を起こす際のサンプルの状態は特に限定されないが、糖タンパク質を固相担体に結合または吸着された状態でアミド化反応溶液を接触させることが好ましい。第２反応に用いられる固相担体は、糖タンパク質を固定可能なものであれば特に限定されず、第１反応に用いられ得る固相担体が挙げられる。

　第２反応後のサンプルは、必要に応じて、公知の方法により精製、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理を行い、アミノ化反応溶液を除去またはアミノ化反応溶液の濃度を低下させてもよい。第２反応後の過剰試薬の除去は、固相または液相の反応方法に応じて第１反応の欄に記載の方法で行うことができる。

　（糖タンパク質の精製）
　ステップＳ１４０において、糖タンパク質を精製することが好ましい。この工程により、第１反応および／または第２反応に使用された溶液を除去し、下流の工程の効率を向上させることができる。糖タンパク質の精製方法および条件は、糖タンパク質の種類、性質、分子量等によって適宜選択することができる。糖タンパク質の精製は、タンパク質沈殿法によって行ってもよい。沈殿剤としては硫酸アンモニウム（硫安）等の塩；アセトン、アセトニトリル、及びクロロホルム等の有機溶媒；メタノール、プロパノール、及びエタノール等のアルコール；トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、塩酸、及びメタリン酸等の酸；ポリエチレングリコール、及びデキストラン等の水溶性ポリマー、並びに、これらの組み合わせ等を用いることができる。タンパク質沈殿法においては、例えば糖タンパク質を含むサンプルに沈殿剤を添加し、－２０℃以上３０℃以下で適当な時間静置する。その後、静置したサンプルを遠心分離することで生じた沈殿物を回収すればよい。糖タンパク質の精製は、固相担体に糖タンパク質を固定して行ってもよく、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を利用してもよい。

　＜遊離ステップ＞
　ステップＳ１５０において、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる。糖鎖を糖タンパク質から遊離させる方法としては、Ｏ－グリコシダーゼ、Ｎ－グリコシダーゼ、エンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理及び、ヒドラジン分解、β脱離等の化学的遊離法を用いることができる。糖鎖を遊離させる処理の前に、糖タンパク質のペプチド鎖の切断を行ってもよい。３－アミノキノリン（３ＡＱ）、アントラニル酸（２ＡＡ）、１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）等により糖鎖の還元末端のラベル化等の修飾を糖鎖の遊離とともに行ってもよい。

　糖タンパク質のペプチド鎖からＮ－結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ　Ｆ）、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＡ（ＰＮＧａｓｅ　Ａ）、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ　Ｍ）等による酵素処理が好適に用いられる。糖タンパク質のペプチド鎖からＯ－結合型糖鎖を遊離させる場合は、化学的遊離法が好適に用いられる。ヒドラジン分解法は、公知の方法に従って行えばよいが、例えば無水ヒドラジンまたは含水ヒドラジンを糖タンパク質を含むサンプルに添加し、加熱する。β脱離法は、公知の方法に従って行えばよいが、例えばカルバミン酸アンモニウム、飽和アンモニア、炭酸アンモニウム、無水トリフルオロメタンスルホン酸（無水ＴＦＭＳ）、水酸化ナトリウム、ジメチルアミン等を糖タンパク質を含むサンプルに添加し、アルカリ条件下で加熱する。ピーリングによる副反応を抑制する観点からは、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩粉末を使用してＯ－結合型糖鎖を遊離させることが好ましい。アルカリ条件下で反応させる際にＰＭＰ等のピラゾロン試薬類を共存させておき、Ｏ－結合型糖鎖を遊離させると同時にラベル化し、ピーリングによる副反応を抑えてもよい。第２反応においてメチル化されたシアル酸のカルボン酸への転換を防ぐ観点から、および、Ｏ－結合型糖鎖の遊離効率の観点から、β脱離反応のｐＨは、好ましくはｐＨ１１．０以下であり、より好ましくはｐＨ１０．０以下である。シアル化糖鎖の分解およびピーリング反応を抑制する観点からは、β脱離反応のｐＨは、ｐＨ９．５以下であることが好ましい。β脱離反応を行う際のｐＨは、通常、ｐＨ７．５以上である。

　糖鎖の遊離は、液相で行ってよく、固相で行ってもよい。例えば、固相担体に固定された糖タンパク質に対して上述の糖鎖の切断処理を行い、糖鎖を回収してもよい。ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖タンパク質に対して、糖鎖の切断処理を行ったあと、弱酸性溶液により糖鎖を遊離させて回収してもよい。サンプルを固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応溶液の除去又は脱塩精製がより容易となり、サンプルの調製を簡素化できる。

　遊離糖鎖は公知の方法に従って精製してよく、例えばクロロホルム等の有機溶媒を利用した液液抽出によってタンパク質と糖鎖とを分離してよい。遊離糖鎖は固相担体（カラム）によって簡便に精製することもできる。遊離糖鎖は、ヒドラジド基、アミノオキシ基を有する固相担体に結合させて、回収することもできる。ヒドラジド基を有する固相担体としては、住友ベークライト社製「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ」等が挙げられる。親水性相互作用クロマトグラフィ（以下、ＨＩＬＩＣとも呼ぶ）用の担体に糖鎖を吸着させて精製してもよい。ＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことが好ましい。遊離糖鎖は、カーボンカラムの他、Ｃ１８等の逆相系の担体を用いて精製してもよい。ラベル化した糖鎖をカーボン又はＣ１８に吸着させて精製してもよい。

　＜分析ステップ＞
　ステップＳ１６０において、遊離された糖鎖を分析する。分析される糖鎖には、好ましくは遊離されたシアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖が含まれる。分析方法としては、質量分析、クロマトグラフィー、電気泳動またはこれらの組合せを行うことができる。上述のラクトン化反応により、シアル酸は結合様式特異的に修飾され、α２，６－シアル酸のようにラクトン化されにくい糖鎖と、α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸、及びα２，９－シアル酸等のラクトン化されやすい糖鎖とでは質量が異なっている。従って、質量分析、クロマトグラフィー、電気泳動等によりこれらの糖鎖をシアル酸の結合様式に基づいて分離することができる。

　質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＬＳＩ）法等を用いることができるが、好ましくはＭＡＬＤＩ法である。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、多段階で行ってもよい。これによりシアル酸の結合様式以外の糖鎖の構造又は、ペプチド鎖の構造を好適に解析することができる。

　第１反応および第２反応の結果生じた修飾体の特性に基づいて、クロマトグラフィ、電気泳動等の質量分析以外の分析方法等でシアル酸の結合様式の分析を行ってもよい。液体クロマトグラフィに用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、及びＣ４等の疎水性逆相カラム、カーボンカラム、並びに、ＨＩＬＩＣ用の順相カラムなどを適宜用いることができる。液体クロマトグラフィを行った後、質量分析により測定を行うことがより精密にサンプル中の成分の分析を行う上で好ましい。この場合、液体クロマトグラフからの溶出液をオンライン制御で質量分析計において直接ＥＳＩ等によりイオン化することがより好ましい。電気泳動は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、キャピラリー電気泳動法、マイクロチップ電気泳動、二次元電気泳動法等であってよいが、好ましくはキャピラリー電気泳動である。

　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。％の記載は特に言及が無い限り質量％を示す。

　＜実験１＞
　まず、糖タンパク質から糖鎖を遊離せずに第１反応および第２反応を行った。次に、タンパク質沈殿を行い過剰試薬を除去した。その後、糖タンパク質からＯ－結合型糖鎖を遊離させ、質量分析により糖鎖の分析を行った。具体的な手法を以下に示す。

　１）血清および脳脊髄液の凍結乾燥物を糖タンパク質を含むサンプルとして準備した。
　２）２Ｍ　イソプロピルアミン塩酸塩（求核剤）、５００ｍＭ　Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（脱水縮合剤）、５００ｍＭ　１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（求核性の高い添加剤）および溶媒としてジメチルスルホキシドを含むラクトン化反応溶液１００μＬをサンプルに加えて、室温で１時間反応させた（第１反応）。
　３）１０％メチルアミンを１００μＬ加えて撹拌した（第２反応）。
　４）２．５％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および溶媒としてアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む溶液８００μＬを加えてタンパク質を沈殿させた。
　５）上清を除き、沈殿させたタンパク質を回収した。
　６）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、糖タンパク質を還元アルキル化した。
　７）エタノール沈殿を行い、タンパク質を精製した。
　８）糖タンパク質から糖鎖の遊離およびラベル化を行った。終濃度０．１４Ｍ　水酸化ナトリウム、終濃度０．２Ｍ　１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）および４０％メタノールを含む溶液５０μＬを加えて８５℃で１６時間反応させた。
　９）クロロホルムを加えて激しく撹拌して液液抽出を行い、クロロホルム層を破棄した。この操作を３回繰り返し、サンプルからＰＭＰを除いた。
　１０）糖鎖が含まれる水層を回収し、グラファイトカーボンカラム（ＳＰＥＬＣＯ社製、「Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ^ＴＭ　ＥＮＶＩ－Ｃａｒｂ^ＴＭ　Ｂｕｌｋ　Ｐａｃｋｉｎｇ」）で糖鎖を精製した。水、１０％　ＡＣＮ，０．０５％　ＴＦＡ、および２０％　ＡＣＮ，０．０５％　ＴＦＡでカラムを洗浄後、５０％　ＡＣＮ，０．０５％　ＴＦＡで溶出した。
　１１）溶出物を減圧濃縮し、イアトロビーズ（順相担体、シリカベース）で精製した。具体的には、９５％　ＡＣＮに調製したサンプルを担体に吸着させ、９５％ＡＣＮ，１％酢酸、および９８％　ＡＣＮ，２％酢酸で洗浄後、５０％　ＡＣＮで溶出した。
　１２）溶出物を乾固した後、水に再溶解し、分析用試料を調製した。２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）マトリックスを用いて、飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）（ブルカー社製、製品名「Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ　ＩＩ）により、正イオンモードで質量分析を行った。
　なお、上述の２）及び３）が修飾ステップに相当し、上述の８）～１１）が遊離ステップに相当する。また、上述の１２）が分析ステップに相当する。

　血清および脳脊髄液由来の糖タンパク質に含まれる糖鎖の質量分析スペクトルを図２にそれぞれ示す。α２，３－シアル酸を有する糖鎖（ｍ／ｚ１０４０．４９）とα２，６－シアル酸を有する糖鎖（ｍ／ｚ１０６８．６０）の間に約２８Ｄａの差が見られ、シアル酸が結合様式特異的な修飾を受けており、質量分析によりその区別が可能であることが示された。α２，３－シアル酸およびα２，６－シアル酸の両方を有するジアリル糖鎖について、α２，３－シアル酸がメチルアミド化、α２，６－シアル酸がイソプロピルアミド化されたｍ／ｚ１３７２．８６のピークが確認されたが、このピークから２８Ｄａ少ない位置にはピークが見られなかった。従って、α２，６－シアル酸はラクトン化されず、α２，３－シアル酸とα２，６－シアル酸とが異なる修飾を受けていることが確かめられた。

　＜実験２＞
　比較実験として、糖タンパク質からＮ－結合型糖鎖を遊離させ、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズを用いて遊離糖鎖を回収し、ビーズに結合した糖鎖に対して第１反応および第２反応を行ってシアル酸を修飾し、その後ビーズから回収した遊離糖鎖について質量分析を行った。得られた質量分析スペクトルを図３の上段に示す。

　＜実験３＞
　まず、糖タンパク質から糖鎖を遊離せずに液相で第１反応および第２反応を行った。次に、タンパク質沈殿を行い過剰試薬を除去した。その後、糖タンパク質からＮ－結合型糖鎖を遊離させ、質量分析により糖鎖の分析を行った。得られた質量分析スペクトルを図３の下段に示す。具体的な手法は以下に示す。

　１）血清を凍結乾燥したものをサンプルとして準備した。
　２）２Ｍ　イソプロピルアミン塩酸塩（求核剤）、５００ｍＭ　Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（脱水縮合剤）、５００ｍＭ　１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（求核性の高い添加剤）および溶媒としてジメチルスルホキシドを含むラクトン化反応溶液１００μＬをサンプルに加えて、１時間撹拌した（第１反応）。
　３）１０％メチルアミンを１００μＬ加えて撹拌した（第２反応）。
　４）２．５％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および溶媒としてアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む溶液８００μＬを加えてタンパク質を沈殿させた。
　５）上清を除き、沈殿させたタンパク質を回収した。
　６）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、糖タンパク質を還元アルキル化した。
　７）エタノール沈殿を行い、タンパク質を精製した。
　８）トリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ）でタンパク質を消化した。
　９）ＰＮＧａｓｅＦ（Ｒｏｃｈｅ社製、２Ｕ）でＮ－結合型糖鎖を遊離させた。
　１０）ヒドラジド基をリガンドとして有するビーズからなる固相担体（住友ベークライト株式会社製、「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ」）を用いて、プロトコルに従ってＮ－結合型糖鎖を精製した。
　１１）担体からの遊離と同時に高感度化試薬ａｏＷＲを用いて糖鎖の還元末端を標識し、分析用試料を調製した。
　１２）ＤＨＢマトリックスを用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ブルカー社製、「製品名Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ　ＩＩ」）により、正イオンモードで質量分析を行った。

　図３に示すように、実験２と実験３とでほぼ同一の質量分析スペクトルが得られた。Ｎ－結合型糖鎖においては、遊離糖鎖に対して第１反応および第２反応を行った場合と、糖タンパク質に対して第１反応および第２反応を行い、その後糖鎖を遊離させた場合とで、シアル酸は同じように結合様式特異的な修飾を受け、質量分析により区別可能であることがわかった。本発明によれは、糖タンパク質の糖鎖がＮ－結合型シアル酸を含んでいる場合であっても、Ｏ－結合型シアル酸を含んでいる場合であっても、迅速にかつ精度よくシアル酸の結合特異性を判別することができることが示された。

　＜実験４＞
　比較実験として、Ｏ－結合型糖鎖を有する糖タンパク質を用いて、シアル酸の結合様式特異的修飾を行わなかった実験および糖鎖を遊離後にシアル酸の結合様式特異的修飾を行った実験を示す。糖タンパク質であるフェツイン（１００μｇ）に５０％ヒドロキシルアミン２０μＬと０．５Ｍ水酸化ナトリウム２０μＬとを加え、５０℃で１時間反応させて糖鎖を遊離させた。反応終了後、１Ｍ塩酸１０μＬを加えてクエンチし、アセトン２００μＬを加えて遠心エバポレーターで濃縮した。濃縮後、５０μＬの水で再溶解し、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズで遊離糖鎖を捕捉した。固相上でメチルエステル化法（ＭＴＴ法）、または第１反応および第２反応（シアル酸結合様式特異的アルキルアミド化法；本明細書において「ＳＡＬＳＡ法」ともいう。）を行い、シアル酸を修飾した。ＭＴＴ法によれば、結合様式非特異的な修飾が行われるため、全てのシアル酸はエステル化される。第１反応および第２反応は、実験１と同じ方法で行った。高感度化試薬ａｏＷＲを用いて糖鎖の還元末端を標識したあと、ＨＩＬＩＣカラムにより精製した。精製したａｏＷＲ標識糖鎖を２，５－ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ブルカー社製、製品名「Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ　ＩＩ」）により解析を行った。

　得られた質量分析スペクトルを図４に示す。ＭＴＴ法ではシアル酸がメチルエステル化され、シアリルＴはｍ／ｚ　１１１８．６［Ｍ＋Ｈ］^＋、ジシアリルＴはｍ／ｚ　１４２４．０［Ｍ＋Ｈ］^＋に検出された。ＳＡＬＳＡ法ではα２，３結合のシアル酸を持つシアリルＴはｍ／ｚ　１１１７．６［Ｍ＋Ｈ］^＋にメチルアミド体として検出された。一方、α２，３とα２，６結合のシアル酸を持つジシアリルＴはｍ／ｚ　１４４９．８［Ｍ＋Ｈ］^＋にメチルアミドとイソプロピルアミドの修飾を受けたシグナルが観測されたが、α２，６結合のシアル酸がメチルアミドで修飾されたｍ／ｚ　１４２１．９［Ｍ＋Ｈ］^＋も検出された。いずれの方法によっても、Ｏ－結合型糖鎖のシアル酸の結合様式特異的な修飾が達成されなかった。

　＜実験５＞
　メチルアミンの濃度を変化させて、Ｏ－結合型糖鎖のシアル酸の結合様式特異的修飾の効率を調べた。まず、フェツイン（１００μｇ）に対して、第１反応および第２反応を行った。具体的には、フェツインに、ラクトン化反応溶液（２Ｍ　ｉＰＡ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＥＤＣ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＨＯＢｔ）を１００μＬ加え、室温で１時間攪拌した（第１反応）。続いて反応溶液に１０％、１６．６％または４０％のメチルアミン水溶液を１００μＬ加えて攪拌した（第２反応）。その後、２．５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを１ｍＬ加え、温度－３０℃で１時間静置した。１４０００ｇで２０分遠心分離し、上清を除去してＳＡＬＳＡ反応溶液を除去した。さらに残渣にアセトニトリルを１ｍＬ加え１４０００ｇで２０分遠心分離し、上清を除いた。得られたタンパク質を含む残渣を１０ｍＬの水で再溶解した。糖タンパク質から糖鎖を遊離させるためのβ脱離反応溶液を準備した。β脱離反応溶液は、６０％メタノール水溶液に水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（終濃度０．７Ｍ）および３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）（終濃度１Ｍ）を溶解した溶液である。シアル酸が結合様式特異的に修飾されたフェツインに、β脱離反応溶液を４０μＬ加え、サーマルサイクラーにより温度８５℃に維持し、１６時間反応させた。反応終了後、５０ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオースを添加した後、４Ｍの塩酸１０μＬで中和した。クロロホルムを加えて激しく撹拌し、液液抽出した。クロロホルム層を除去し、これを３回繰り返した。糖鎖が含まれる水層を回収してグラファイトカーボンカラムおよびイアトロビーズを用いて精製した。精製方法は実験１と同じであった。精製されたｂｉｓＰＭＰ標識糖鎖を１０％２，５－ジヒロド安息香酸ナトリウムを含む２，５－ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより解析を行った。

　質量分析スペクトルの結果を図５に示す。すべての反応においてα２，３結合のシアル酸を持つシアリルＴのほとんどはｍ／ｚ　１０４０．７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に観測され、α２，３とα２，６結合のシアル酸を２つ持つジシアリルＴはｍ／ｚ　１３７３．１［Ｍ＋Ｎａ］^＋に観測された。糖タンパク質上の糖鎖に対して直接ＳＡＬＳＡ法を行ってシアル酸の修飾を行った後、β脱離反応により糖鎖を遊離させることで、結合様式特異的な誘導化が進行し、かつ、β脱離反応によって誘導化されたまま糖タンパク質から糖鎖が切断されることが確認できた。さらに、メチルアミンの濃度の影響について検討した。メチルアミド化修飾によりｍ／ｚ　１０４０．７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に検出されるα２，３結合のシアリルＴは、カルボン酸が未修飾の場合、ｍ／ｚ　１０２７．６［Ｍ＋Ｎａ］^＋に検出される。メチルアミド化修飾されたシアリルＴに対する未修飾のシアリルＴの割合は、メチルアミンが１０％のときは４．６％、メチルアミンが４０％のときは２．６％であった。同様に、メチルアミド化修飾されたジシアリルＴに対する未修飾のジシアリルＴの割合は、メチルアミンが１０％のときは１．５％、メチルアミンが４０％のときは０．８％であった（図６）。アミノリシス反応において、アミン濃度が高いほどシアル酸のメチルアミド化の効率が高かった。

　＜実験６＞
　β脱離反応時のｐＨを変化させて、遊離されるＯ－結合型糖鎖を解析した。実験５と同じ方法で、ヒト血漿（１０μＬ）に対して、シアル酸の結合様式特異的修飾を行った。第２反応には、４０％メチルアミン水溶液を用いた。実験５と同じ方法で糖タンパク質を洗浄後、沈殿に０．１ｍＬの水を加え、水浴型超音波処理器を用いて懸濁した。懸濁液に予め調製したβ脱離反応溶液を０．４ｍＬ加え混和した。β脱離反応溶液は、６０％のアセトニトリル溶液に、ＰＭＰ（終濃度１Ｍ）およびＮａＯＨ（終濃度０．７－０．９７５Ｍ）に溶解して調製した。ＮａＯＨは濃度を変えて、５種類のｐＨを設定した。組成およびｐＨは表１に示す。温度８５℃で１６時間反応させ、Ｏ結合型糖鎖のβ脱離と同時にＰＭＰ標識を行った。反応終了後に４Ｍ　ＨＣｌを０．４ｍＬ加えて中和した。クロロホルムを０．４ｍＬを加え激しく攪拌し、液液抽出によりクロロホルム層を破棄する操作を四回繰り返した。標識糖鎖を含む水層を回収してグラファイトカーボンカラムおよびイアトロビーズを用いて精製した。ＰＭＰ標識糖鎖を２，５－ジヒロド安息香酸と混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより解析を行った。精製および解析方法は、実験５と同じである。

　解析結果を図７～図９に示す。Ｏ結合型糖鎖の回収量はＥｎｔｒｙ３で最も高かった（図７）。一方、Ｅｎｔｒｙ３～５では、Ｅｎｔｒｙ１，２に比べてメチルアミド化されたシアリルＴの分解物の割合が増加していた（図８）。Ｅｎｔｒｙ３～５では、Ｅｎｔｒｙ１，２に比べてβ脱離反応の分解物（ピーリング反応）の割合が増加していた（図９）。

　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

　（第１項）
　一態様に係る試料に含まれるシアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する方法は、前記Ｏ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含むサンプルに、前記Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する修飾ステップと、前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を、前記糖タンパク質から遊離させる遊離ステップと、遊離された前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する分析ステップと、を含む。第１項に記載の方法によれば、糖鎖がＯ－結合型シアル酸を含んでいても、精度よくシアル酸の結合様式を判別することができる。

　（第２項）
　第１項に記載の方法において、前記シアル酸の結合様式特異的修飾は、シアル酸をラクトン化する第１反応を含む。第１反応によって、結合様式に応じて選択的にシアル酸がラクトン化される。第１反応においては、好ましくは糖鎖中のα２，３－シアル酸がラクトン化される。

　（第３項）
　第２項に記載の方法において、前記シアル酸の結合様式特異的修飾は、前記第１反応によって生じたラクトン構造をアミド化するための第２反応をさらに含む。第３項に記載の方法によれば、結合様式特異的なシアル酸の修飾をより精度よく行うことができる。

　（第４項）
　第３項に記載の方法において、アンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む溶液を用いて前記第２反応を行う。第４項に記載の方法によれば、結合様式特異的なシアル酸の修飾を効率よく行うことができる。

　（第５項）
　第３項または第４項に記載の方法において、前記第２反応は、アミノリシス反応である。

　（第６項）
　第３項～第５項のいずれかに記載の方法において、前記第２反応後のシアル酸は、結合様式によって質量が異なる修飾を受けている。第６項に記載の方法によれば、結合様式特異的な修飾がされたシアル酸を質量分析等の分析方法で区別することができる。

　（第７項）
　第６項に記載の方法において、前記シアル酸の結合様式はα－２，３シアル酸およびα－２，６シアル酸を含む。第７項に記載の方法によれば、α－２，３シアル酸とα－２，６シアル酸とを区別することができる。

　（第８項）
　第２項～第７項のいずれかに記載の方法において、脱水縮合剤を含む溶液を前記サンプルに添加して前記第１反応を行う。第８項に記載の方法によれば、シアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾をすることができる。

　（第９項）
　第２項～第８項のいずれかに記載の方法において、α－２，６シアル酸は前記第１反応後にアミド化されている。

　（第１０項）
　第２項～第９項のいずれかに記載の方法において、前記第１反応より後に、タンパク質沈殿法により前記糖タンパク質を精製することをさらに含む。第１０項に記載の方法によれば、上流の工程で用いた溶液を除き、下流の工程の反応効率を向上させることができる。

　（第１１項）
　第１項～第１０項のいずれかに記載の方法において、β脱離反応またはヒドラジン分解反応によって、前記糖タンパク質から前記糖鎖を遊離させる。第１１項に記載の方法によれば、化学的に糖鎖を糖タンパク質から遊離させることができる。

　（第１２項）
　第１１項に記載の方法において、前記β脱離反応をｐＨ１１．０以下で行う。第１２項に記載の方法によれば、効率よくＯ－結合型糖鎖を遊離させることができる。

　（第１３項）
　第１項～第１２項に記載の方法において、前記遊離させた糖鎖を固相担体により精製することをさらに含む。第１３項に記載の方法によれば、簡便に遊離糖鎖をタンパク質と分離することができる。

　（第１４項）
　第１項～第１３項のいずれかに記載の方法において、前記分析は、質量分析、クロマトグラフィーおよび電気泳動からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。第１４項に記載の方法によれば、結合様式特異的に生じた質量の差や、クロマトグラフィーまたは電気泳動による分離への影響に基づいて、シアル酸の結合様式を区別して糖鎖を解析することができる。

Claims

　シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する方法であって、
　前記Ｏ－結合型糖鎖が結合する糖タンパク質を含むサンプルに、前記Ｏ－結合型糖鎖に対してシアル酸の結合様式特異的修飾を行う修飾剤を添加する修飾ステップと、
　前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を、前記糖タンパク質から遊離させる遊離ステップと、
　遊離された前記シアル酸の結合様式特異的修飾が行われたＯ－結合型糖鎖を分析する分析ステップと、を含む方法。
　前記シアル酸の結合様式特異的修飾は、シアル酸をラクトン化する第１反応を含む、請求項１に記載の方法。
　前記シアル酸の結合様式特異的修飾は、前記第１反応により得られたラクトン構造をアミド化するための第２反応をさらに含む、請求項２に記載の方法。
　アンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む溶液を用いて前記第２反応を行う、請求項３に記載の方法。
　前記第２反応は、アミノリシス反応である、請求項３または４に記載の方法。
　前記第２反応後のシアル酸は、結合様式によって質量が異なる修飾を受けている、請求項３または４に記載の方法。
　前記シアル酸の結合様式はα－２，３シアル酸およびα－２，６シアル酸を含む、請求項６に記載の方法。
　脱水縮合剤を含む溶液を前記サンプルに添加して前記第１反応を行う、請求項２または３に記載の方法。
　α－２，６シアル酸は前記第１反応後にアミド化されている、請求項２または３に記載の方法。
　前記第１反応より後に、タンパク質沈殿法により前記糖タンパク質を精製することをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
　β脱離反応またはヒドラジン分解反応によって、前記糖タンパク質から前記糖鎖を遊離させる、請求項１または２に記載の方法。
　前記β脱離反応をｐＨ１１．０以下で行う、請求項１１に記載の方法。
　前記遊離させた糖鎖を固相担体により精製することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
　前記分析は、質量分析、クロマトグラフィーおよび電気泳動からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の方法。